CN103743911B - 一种纤维连接蛋白测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种医疗器材的技术领域，具体地说，涉及一种用于测定血清中纤维连接蛋白含量的纤维连接蛋白测定试剂盒及其使用方法。包括试剂R和参考校准品，所述试剂R包括下述原料：5~300mmol/l磷酸盐缓冲液、0.5~16mmol/l乙二胺四乙酸二钠、0.1~5g/l结合有抗人纤维连接蛋白抗体多克隆抗体的聚苯乙烯胶乳颗粒、浓度为1%的牛血清白蛋白、浓度为0.1%的脱脂奶粉、浓度为0.9%的叠氮化钠和纯化水；所述参考校准品包括下述原料：5~200mmol/l三羟甲基氨基甲烷缓冲液、160~180mmol/l乙二胺四乙酸二钠、2~5mmol/l广谱杀菌剂、重组人纤维连接蛋白纯品和纯化水。试剂为单一试剂，内含的抗体效价高，亲和力好，特异性强，稳定性好，批间差小，有效期长，试剂在2~8℃密闭避光可稳定贮存18个月，且灵敏度高，检测精度高。
Description
技术领域：
本发明涉及一种医疗器材的技术领域，具体地说，涉及一种用于测定血清中纤维连接蛋白含量的纤维连接蛋白测定试剂盒及其使用方法。
背景技术：
Fn是由二个亚基组成的一种α2糖蛋白，产生于肝细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞。在体内以可溶性与不溶性两种形式存在，前者分布于血浆与体液中，血液中Fn主要来自血管内皮细胞，此种Fn以PFn表示，后者分布在细胞表面及多种组织，特别是伴有上皮细胞及血管内皮的基底膜，是结缔组织的一种主要成分，用CFn表示。PFn是单核～巨噬细胞系统主要调理素，主要功能之一是作为巨噬细胞及网状内皮细胞吞噬作用的一种递质，促进网状内皮细胞对纤维蛋白、纤维蛋白原～纤维蛋白复合物、胶原碎片、受损细胞碎征、细菌及非细菌性毒性物质的调理与清除。CFn为结缔组织的基质蛋白质，在肝脏中和胶原纤维分布一起，肝纤维化时水平升高。PFn含量同时也是很多疾病的标志性判断依据，例如，多数急性乙型肝炎患者及少数慢性乙型肝炎患者住院期间血清PFn含量有上升过程及下降过程，意味着往往伴有血清e抗原转换或病情得到控制，血清中PFn含量检测为急性乙型肝炎与慢性乙型肝炎急性发作时的一钟鉴别方法之一，对预后的判断也有重要意义；肝硬化患者术后一天内血清中PFn含量一天内都明显低于手术前，术后7天又均有不同程度的回升，说明手术对血清中PFn含量变化有直接影响，血清中PFn含量回升是患者临床症状好转的指标；针对妊娠高血压综合症患者，多在孕20周以后出现临床症状，母婴已受到不同程度的损伤，如能加强产期监测，早于临床症状出现之前预测疾病的发生，对减少并发症，降低母婴死亡率具有重要意义，纤维连接蛋白在内皮细胞粘附、形态维护和迁移中起重要作用，已被确认是血管内皮细胞损伤的敏感指示之一；冠心病患者血清中PFn含量升高，这种高血清中PFn含量一方面促进坏死心肌的创伤修复，另一方面由于动脉血管的不良状态导致促进血小板粘附、聚集成血栓，进一步加重心肌的损害，血清中PFn含量的测定对判断血液中高凝状态和疾病预后的一定意义。
发明内容：
本发明要解决的技术问题是，提供一种灵敏度高，检测精度高，应用范围广的纤维连接蛋白测定试剂盒及其使用方法。
为解决上述技术问题，本发明采用这样一种纤维连接蛋白测定试剂盒：包括试剂R和参考校准品，所述试剂R包括下述原料：5～300mmol/l磷酸盐缓冲液、0.5～16mmol/l乙二胺四乙酸二钠、0.1～5g/l结合有抗人纤维连接蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯胶乳颗粒、浓度为1％的牛血清白蛋白、浓度为0.1％的脱脂奶粉、浓度为0.9％的叠氮化钠和纯化水；
所述参考校准品包括下述原料：5～200mmol/l三羟甲基氨基甲烷缓冲液、160～180mmol/l乙二胺四乙酸二钠、2～5mmol/l广谱杀菌剂、重组人纤维连接蛋白纯品和纯化水。
本发明与现有技术中的纤维连接蛋白测定试剂盒相比，具有以下优点：试剂为单一试剂，节约试剂位，内含的抗体效价高，亲和力好，特异性强，稳定性好，批间差小，有效期长，试剂在2～8℃密闭避光可稳定贮存18个月，且灵敏度高，检测精度高。
作为优选，所述试剂R包括下述原料：30～150mmol/l磷酸盐缓冲液、10～15mmol/l乙二胺四乙酸二钠、2～4g/l结合有抗人纤维连接蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯胶乳颗粒、浓度为1％的牛血清白蛋白、浓度为0.1％的脱脂奶粉、浓度为0.9％的叠氮化钠和纯化水；所述参考校准品包括下述原料：20～150mmol/l三羟甲基氨基甲烷缓冲液、165～170mmol/l乙二胺四乙酸二钠、2～4mmol/l广谱杀菌剂、重组人纤维连接蛋白纯品和纯化水，配比精确，产品灵敏度高。
作为又一优选，所述结合有抗人纤维连接蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯胶乳颗粒直径为50～150nm，成本较低，较为常见。
为解决上述技术问题，本发明采用这样一种纤维连接蛋白测定试剂盒的使用方法：它包括以下步骤：1)、试剂R的制备，在5～300mmol/l磷酸盐缓冲液中依次加入质量比为10:2～10:4的聚苯乙烯胶乳颗粒和抗人纤维连接蛋白多克隆抗体，混合均匀，并在室温下振荡1小时，形成第一胶乳，此间配制好封闭液，在第一胶乳中加入封闭液封闭1小时，然后离心去上清，形成半成品试剂R，配制好第二胶乳，用第二胶乳稀释半成品试剂R至浓度为0.25％，形成成品试剂R；2)、参考校准品的制备，根据需要的浓度将5～200mmol/l三羟甲基氨基甲烷缓冲液、160～180mmol/l乙二胺四乙酸二钠、2～5mmol/l广谱杀菌剂、重组人纤维连接蛋白纯品和纯化水混合均匀即可形成成品参考校准品。
本发明与现有技术中的纤维连接蛋白测定试剂盒的使用方法相比，具有以下优点：抗原纤维蛋白和特异性抗体抗人纤维连接蛋白多克隆抗体胶乳颗粒相结合，形成了不溶性免疫复合物，使反应产生浑浊，其浊度高低即透光度减少、吸光度增加反映血清样品中纤维蛋白的浓度，参照标准曲线即可计算出样本中纤维连接蛋白的含量。操作简单，适用于手工和自动化生化仪。采用多浓度校准品，定值可靠，使用方便，测定结果更可靠。精度度好，批内CV≤10.0％，批间CV≤10.0％。
作为设置，所述封闭液包括下述原料：5～300mmol/l磷酸盐缓冲液和1％的牛血清白蛋白。
作为进一步地设置，所述第二胶乳包括下述原料：5～300mmol/l磷酸盐缓冲液、0.5～16mmol/l乙二胺四乙酸二钠浓度为0.1％的脱脂奶粉、浓度为0.9％的叠氮化钠和纯化水。
作为优选，所述抗人纤维连接蛋白多克隆抗体包括羊抗抗人纤维连接蛋白多克隆抗体或兔抗抗人纤维连接蛋白多克隆抗体或鼠抗抗人纤维连接蛋白多克隆抗体，成本较低，较为常见。
附图说明：
图1是本发明的一种纤维连接蛋白测定试剂盒的实施例一的样本曲线图；
图2是本发明的一种纤维连接蛋白测定试剂盒的实施例二的样本曲线图；
图3是本发明的一种纤维连接蛋白测定试剂盒的实施例三的样本曲线图；
具体实施方式：
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明的一种纤维连接蛋白测定试剂盒，包括试剂R和参考校准品，所述试剂R包括下述原料：5～300mmol/l磷酸盐缓冲液、0.5～16mmol/l乙二胺四乙酸二钠、0.1～5g/l结合有抗人纤维连接蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯胶乳颗粒、浓度为1％的牛血清白蛋白、浓度为0.1％的脱脂奶粉、浓度为0.9％的叠氮化钠和纯化水；
所述参考校准品包括下述原料：5～200mmol/l三羟甲基氨基甲烷缓冲液、160～180mmol/l乙二胺四乙酸二钠、2～5mmol/l广谱杀菌剂、重组人纤维连接蛋白纯品和纯化水。
进一步地说，所述试剂R包括下述原料：30～150mmol/l磷酸盐缓冲液、10～15mmol/l乙二胺四乙酸二钠、2～4g/l结合有抗人纤维连接蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯胶乳颗粒、浓度为1％的牛血清白蛋白、浓度为0.1％的脱脂奶粉、浓度为0.9％的叠氮化钠和纯化水；所述参考校准品包括下述原料：20～150mmol/l三羟甲基氨基甲烷缓冲液、165～170mmol/l乙二胺四乙酸二钠、2～4mmol/l广谱杀菌剂、重组人纤维连接蛋白纯品和纯化水。所述结合有抗人纤维连接蛋白多克隆抗体的纳米微球直径为50～150nm。它包括以下步骤：1)、试剂R的制备，在5～300mmol/l磷酸盐缓冲液中依次加入质量比为10:2～10:4的聚苯乙烯胶乳颗粒和抗人纤维连接蛋白多克隆抗体，混合均匀，并在室温下振荡1小时，形成第一胶乳，此间配制好封闭液，在第一胶乳中加入封闭液封闭1小时，然后离心去上清，形成半成品试剂R，配制好第二胶乳，用第二胶乳稀释半成品试剂R至浓度为0.25％，形成成品试剂R；2)、参考校准品的制备，根据需要的浓度将5～200mmol/l三羟甲基氨基甲烷缓冲液、160～180mmol/l乙二胺四乙酸二钠、2～5mmol/l广谱杀菌剂、重组人纤维连接蛋白纯品和纯化水混合均匀即可形成成品参考校准品。
参考校准品:一种用来与样本比较，进行结果计算的纤维连接蛋白溶液，包括20～150mmol/l三羟甲基氨基甲烷缓冲液、165～170mmol/l乙二胺四乙酸二钠、2～4mmol/l广谱杀菌剂以及根据浓度要求确定的一定量的重组人纤维连接蛋白纯品，其余为纯化水；将重组人纤维连接蛋白纯品加入上述溶液中，获得所需浓度的纤维连接蛋白参考校准品(该纤维连接蛋白参考校准品为添加重组人纤维连接蛋白纯品的人血清或其它类似血清基质的液体)。
纤维连接蛋白参考校准品的浓度可以是高浓度单点参考校准品，在使用时用生理盐水稀释成多个不同浓度的参考校准品；也可以直接制备成多个不同浓度的参考校准品。这里没有特别的限制，只要制得的纤维连接蛋白参考校准品能够与样本比较，能够测定样本中纤维连接蛋白的含量即可。
实施例一：
试剂R的制备，在100mmol/l磷酸盐缓冲液中依次加入质量比为10:2的聚苯乙烯胶乳颗粒和抗人纤维连接蛋白多克隆抗体，混合均匀，并在室温下振荡1小时，形成第一胶乳，此间配制好封闭液(所述封闭液包括下述原料：100mmol/l磷酸盐缓冲液和1％的牛血清白蛋白)，，在第一胶乳中加入封闭液封闭1小时，然后离心去上清，形成半成品试剂R，配制好第二胶乳(所述第二胶乳包括下述原料：100mmol/l磷酸盐缓冲液、16mmol/l乙二胺四乙酸二钠浓度为0.1％的脱脂奶粉、浓度为0.9％的叠氮化钠和纯化水)，用第二胶乳稀释半成品试剂R至浓度为0.25％，形成成品试剂R；根据需要的浓度将100mmol/l三羟甲基氨基甲烷缓冲液、160mmol/l乙二胺四乙酸二钠、5mmol/l广谱杀菌剂、重组人纤维连接蛋白纯品和纯化水混合均匀即可形成成品参考校准品。
采用本实施例对样本进行测定，所得纤维连接蛋白的测定值与对照试剂盒(化学发光法)测定值进行比较(参见图1，并进行回归分析)；获得相关性r2＝0.9975(y＝0.9997x+0.359)；显示出本实施例与对照试剂盒(化学发光法)具有良好的相关性。
实施例二：
试剂R的制备，在300mmol/l磷酸盐缓冲液中依次加入质量比为10:4的聚苯乙烯胶乳颗粒和抗人纤维连接蛋白多克隆抗体，混合均匀，并在室温下振荡1小时，形成第一胶乳，此间配制好封闭液(所述封闭液包括下述原料：300mmol/l磷酸盐缓冲液和1％的牛血清白蛋白)，，在第一胶乳中加入封闭液封闭1小时，然后离心去上清，形成半成品试剂R，配制好第二胶乳(所述第二胶乳包括下述原料：300mmol/l磷酸盐缓冲液、10mmol/l乙二胺四乙酸二钠浓度为0.1％的脱脂奶粉、浓度为0.9％的叠氮化钠和纯化水)，用第二胶乳稀释半成品试剂R至浓度为0.25％，形成成品试剂R；根据需要的浓度将200mmol/l三羟甲基氨基甲烷缓冲液、180mmol/l乙二胺四乙酸二钠、2mmol/l广谱杀菌剂、重组人纤维连接蛋白纯品和纯化水混合均匀即可形成成品参考校准品。
采用本实施例对样本进行测定，所得纤维连接蛋白的测定值与对照试剂盒(化学发光法)测定值进行比较(参见图2，并进行回归分析)；获得相关性r2＝0.9987(y＝1.0017x～0.0344)；显示出本实施例与对照试剂盒(化学发光法)具有良好的相关性。
实施例三：
试剂R的制备，在200mmol/l磷酸盐缓冲液中依次加入质量比为10:3的聚苯乙烯胶乳颗粒和抗人纤维连接蛋白多克隆抗体，混合均匀，并在室温下振荡1小时，形成第一胶乳，此间配制好封闭液(所述封闭液包括下述原料：200mmol/l磷酸盐缓冲液和1％的牛血清白蛋白)，在第一胶乳中加入封闭液封闭1小时，然后离心去上清，形成半成品试剂R，配制好第二胶乳(所述第二胶乳包括下述原料：200mmol/l磷酸盐缓冲液、12mmol/l乙二胺四乙酸二钠浓度为0.1％的脱脂奶粉、浓度为0.9％的叠氮化钠和纯化水)，用第二胶乳稀释半成品试剂R至浓度为0.25％，形成成品试剂R；根据需要的浓度将150mmol/l三羟甲基氨基甲烷缓冲液、170mmol/l乙二胺四乙酸二钠、4mmol/l广谱杀菌剂、重组人纤维连接蛋白纯品和纯化水混合均匀即可形成成品参考校准品。
采用本实施例对样本进行测定，所得纤维连接蛋白的测定值与对照试剂盒(化学发光法)测定值进行比较(参见图3，并进行回归分析)；获得相关性r2＝0.9984(y＝1.0013x+0.058)；显示出本实施例与对照试剂盒(化学发光法)具有良好的相关性。
用对照试剂盒测出标本的值作为预期浓度值，本发明的试剂盒测定的值作为测定浓度值，共测定若干标本，用这若干标本的2组测定数据做散点图，即本发明涉及的三个附图。
本发明的测定条件及步骤:
结果的计算：
Fn(mg/l)＝ΔAT/ΔAs×Cs(mg/l)
ΔAT：测定管相对空白管吸光度值
ΔAs：校准管相对空白管吸光度值
Cs：校准品浓度值。
Claims (7)
1.一种纤维连接蛋白测定试剂盒，包括试剂R和参考校准品，其特征在于，所述试剂R包括下述原料：5～300mmol/l磷酸盐缓冲液、0.5～16mmol/l乙二胺四乙酸二钠、0.1～5g/l结合有抗人纤维连接蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯胶乳颗粒、浓度为1％的牛血清白蛋白、浓度为0.1％的脱脂奶粉、浓度为0.9％的叠氮化钠和纯化水；所述参考校准品包括下述原料：5-200mmol/l三羟甲基氨基甲烷缓冲液、160-180mmol/l乙二胺四乙酸二钠、2～5mmol/l广谱杀菌剂、重组人纤维连接蛋白纯品和纯化水。
2.根据权利要求1所述的一种纤维连接蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R包括下述原料：30～150mmol/l磷酸盐缓冲液、10～15mmol/l乙二胺四乙酸二钠、2～4g/l结合有抗人纤维连接蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯胶乳颗粒、浓度为1％的牛血清白蛋白、浓度为0.1％的脱脂奶粉、浓度为0.9％的叠氮化钠和纯化水；所述参考校准品包括下述原料：20-150mmol/l三羟甲基氨基甲烷缓冲液、165-170mmol/l乙二胺四乙酸二钠、2～4mmol/l广谱杀菌剂、重组人纤维连接蛋白纯品和纯化水。
3.根据权利要求1所述的一种纤维连接蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述结合有抗人纤维连接蛋白多克隆抗体的聚苯乙烯胶乳颗粒直径为50-150nm。
4.一种纤维连接蛋白测定试剂盒的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：1)、试剂R的制备，在5～300mmol/l磷酸盐缓冲液中依次加入质量比为10:2～10:4的聚苯乙烯胶乳颗粒和抗人纤维连接蛋白多克隆抗体，混合均匀，并在室温下振荡1小时，形成第一胶乳，此间配制好封闭液，在第一胶乳中加入封闭液封闭1小时，然后离心去上清，形成半成品试剂R，配制好第二胶乳，用第二胶乳稀释半成品试剂R至浓度为0.25％，形成成品试剂R；2)、参考校准品的制备，根据需要的浓度将5-200mmol/l三羟甲基氨基甲烷缓冲液、160-180mmol/l乙二胺四乙酸二钠、2～5mmol/l广谱杀菌剂、重组人纤维连接蛋白纯品和纯化水混合均匀即可形成成品参考校准品。
5.根据权利要求4所述的一种纤维连接蛋白测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述封闭液包括下述原料：5～300mmol/l磷酸盐缓冲液和1％的牛血清白蛋白。
6.根据权利要求4所述的一种纤维连接蛋白测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述第二胶乳包括下述原料：5-300mmol/l磷酸盐缓冲液、0.5～16mmol/l乙二胺四乙酸二钠、浓度为0.1％的脱脂奶粉、浓度为0.9％的叠氮化钠和纯化水。
7.根据权利要求4所述的一种纤维连接蛋白测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述抗人纤维连接蛋白多克隆抗体包括羊抗抗人纤维连接蛋白多克隆抗体或兔抗抗人纤维连接蛋白多克隆抗体或鼠抗抗人纤维连接蛋白多克隆抗体。
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