CN104914253A - 一种纤维蛋白原的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及凝血功能检测的技术领域，具体涉及了一种纤维蛋白原的检测方法。包括如下步骤：在纤维蛋白原基础试剂中依次加入固相试剂和血小板抑制剂；将纤维蛋白原激活试剂定量分装在样品杯中，并将分装后的样品杯置于西林瓶内；将纤维蛋白原激活试剂粘附在样品杯底；西林瓶做压盖密封操作；将样品杯从西林瓶中取出，置于血栓弹力图仪的杯槽中；将采集后的全血样本加入样品杯内；启动血栓弹力图仪对全血样本做纤维蛋白原功能检测。本发明一种纤维蛋白原的检测方法应用于临床检验时，操作方便，检测结果准确性高。

Description

一种纤维蛋白原的检测方法
技术领域
本发明涉及凝血功能检验技术领域，尤其涉及一种用于血栓弹力图仪检测纤维蛋白原的方法。
背景技术
血栓弹力图于1948年由德国人Harter发明。80年代开始广泛用于临床指导术中输血取得了良好效果，现已成为当今检测凝血功能的最重要指标。利用血栓弹力图对凝血功能检测时，需要使用血栓弹力图仪，血栓弹力图仪可对一份血样进行完整地监测，包括从凝血开始至血凝块形成及纤维蛋白溶解的全过程，可对凝血因子、纤维蛋白原、血小板聚集功能以及纤维蛋白溶解等方面进行凝血全貌的检测和评估。血栓弹力图仪检测血凝块的物理特性基于以下原理：将一特制静止且盛有血样的圆柱形杯以4°45′的角度旋转，每次转动持续10秒。通过一根螺旋丝悬挂且浸泡在血样中的针来检测血样的运动。纤维蛋白与血小板组成的复合物将杯和针粘在一起后，杯旋转所产生的旋转力传递至血样中的针。纤维蛋白与血小板组成的复合物的强度能影响针运动的幅度，以致血凝块能使针的运动与杯的运动同步进行。因此，针的运动幅度与已形成的血凝块的强度有直接关系。当血凝块回缩或溶解时，针与血凝块的联结解除，杯的运动不再传递给针。针的旋转被传感器转换成电子信号，这一电子信号通过计算机转化测得血栓弹力图。
目前，在利用血栓弹力图仪对血样中的纤维蛋白原功能检测时，传统做法：第一步，配制纤维蛋白原的激活试剂；第二步，将配制的纤维蛋白原激活试剂制备成冻干粉，冻干粉盛装在西林瓶中；第三步，检测时，需要称量出一定量的纤维蛋白原激活试剂的冻干粉；第四步，经计算加入定量的蒸馏水对冻干试剂进行复溶；第五步，取定量的复溶后的纤维蛋白原激活试剂加入在血样中；第六步，通过血栓弹力图仪进行检测，借助全血的动态凝固过程监测纤维蛋白网，从而定量计算出患者的纤维蛋白原的强度。
此种传统检测方法在对纤维蛋白原功能检测时,在血样检测过程中会伴随血小板形态和功能的变化，因血小板在检测中受到温度、血样储存时间、临床药物、实验操作等因素的影响，血小板会提前激活，导致在进行纤维蛋白原功能检测时，检测振幅会包含血小板因素，临床纤维蛋白原振幅超过实际振幅，影响实验结果的准确性和稳定性，在临床检测中会出现纤维蛋白原假阳性结果，给临床造成误判，指导患者药物治疗效果不佳；临床检测时，步骤繁琐，需要称量、计算、复溶、多次加样等繁琐操作，容易造成误差，导致纤维蛋白原激活试剂的稳定性差，测试结果不够准确；此种方法冻干的纤维蛋白原激活试剂为固体粉末状，在使用和运输过程中容易接触空气中的水分和养分导致试剂失效，造成不必要的浪费。
因此，针对以上不足，需要一种临床操作简单，测量结果准确性高的纤维蛋白原的检测方法。
发明内容
（一）要解决的技术问题
本发明要解决的技术问题是提供了一种纤维蛋白原的检测方法，使临床检验时操作方便，检测结果准确性高。
（二）技术方案
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种纤维蛋白原的检测方法，包括如下步骤：
S1、在纤维蛋白原基础试剂中依次加入固相试剂和血小板抑制剂，形成纤维蛋白原激活试剂；
S2、将纤维蛋白原激活试剂定量分装在样品杯中，并将分装后的样品杯置于西林瓶内；
S3、对S2中西林瓶进行冻干，将纤维蛋白原激活试剂粘附在样品杯底；
S4、将S3中冻干后的西林瓶在真空条件下做压盖密封操作，使样品杯处于真空环境；
S5、在肝素抗凝环境下采集全血样本；
S6、将样品杯从西林瓶中取出，置于血栓弹力图仪的杯槽中；
S7、通过加样枪将采集后的全血样本加入样品杯内；
S8、启动血栓弹力图仪对全血样本做纤维蛋白原功能检测。
其中，在步骤S1中的固相试剂在纤维蛋白原激活试剂的浓度为1-10g/L。
其中，固相试剂包括蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、聚乙二醇和甘油中的之一或其混合。
其中，在步骤S1中的血小板抑制剂在纤维蛋白原激活试剂中的浓度为0.1-10U/mL。
其中，血小板抑制剂包括阿西单抗、埃替非巴肽和替罗非班中的之一或其混合。
其中，在步骤S1中的纤维蛋白原基础试剂包括缓冲剂、蛋白保护剂、盐类物质、氨基酸、表面活性剂、防腐剂和纤维蛋白原交联剂的混合溶液。
其中，在步骤S2的样品杯中加入的纤维蛋白原激活试剂的体积为10-50ul。
其中，在步骤S3中将封装有样品杯的西林瓶直接放置在冻干机中，设定冻干机的真空度为1-15Pa，设定冻干机的冻干温度为-40℃至30℃。
其中，在步骤S5中的血样本加入肝素抗凝管中保存。
其中，在肝素抗凝管中取360ul血样加入到包被有纤维蛋白激活剂的样品杯中，通过血栓弹力图仪做纤维蛋白原功能检测。
（三）有益效果
本发明的上述技术方案具有以下有益效果：本发明纤维蛋白原的检测方法，在纤维蛋白原基础试剂中依次加入固相试剂和血小板抑制剂，形成纤维蛋白原激活试剂，提高了纤维蛋白原检测结果的准确性和稳定性，血小板抑制剂有效抑制了血小板在检测中受到温度、血样储存时间、临床药物、实验操作等因素的影响而提前激活的情况，避免了血小板对纤维蛋白原强度的干扰，提高了实验结果的准确性；该检测方法的纤维蛋白原激活剂直接包被在样品杯中，临床检测时简化了检测流程，只需将全血样本加入在样品杯中，不需要称量、计算、复溶、多次加样等繁琐操作步骤，减少了误差，增加了检测的可靠性；该检测方法在纤维蛋白原激活剂中加入了固相试剂，固相试剂不仅使纤维蛋白原激活试剂冻干后粘附在杯底部，而且与血样混合后还具有很好的扩散效果，使纤维蛋白原激活试剂在血液中溶解，保证了检测的稳定性；该检测方法，在纤维蛋白原激活试剂冻干后在真空条件下进行密封处理，避免了试剂因接触空气中的氧气和水分而失效，稳定了试剂的性能。
附图说明
图1为本发明实施例样品杯的装配示意图；
图2为本发明实施例纤维蛋白原的检测方法的流程图。
其中，1：西林瓶；2：样品杯；3：样品杯盖；4：密封塞；5：圆盖；6：易拉盖。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。
在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上；除非另有说明，“缺口状”的含义为除截面平齐外的形状。术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”、“前端”、“后端”、“头部”、“尾部”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
实施例一
如图2所示，一种纤维蛋白原的检测方法，包括如下步骤：
S1、在纤维蛋白原基础试剂中依次加入固相试剂和血小板抑制剂，形成纤维蛋白原激活试剂；
在步骤S1中的固相试剂在纤维蛋白原激活试剂的浓度为1-10g/L，起到对纤维蛋白原激活试剂的粘附作用，固相试剂包括蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、聚乙二醇和甘油中的之一或其混合。血小板抑制剂在纤维蛋白原激活试剂中的浓度为0.1-10U/mL，血小板抑制剂包括阿西单抗、埃替非巴肽和替罗非班中的之一或其混合。纤维蛋白原基础试剂包括缓冲剂、蛋白保护剂、盐类物质、氨基酸、表面活性剂、防腐剂和纤维蛋白原交联剂的混合溶液。实施过程：首先配制10-100mM缓冲液，用HCL或NaOH调整PH7.0-8.0；按照制定比例依次加入固相试剂、蛋白保护剂、盐类物质、氨基酸、表面活性剂、防腐剂，充分溶解均匀；然后依次加入纤维蛋白原交联剂至其完全溶解；然后加入血小板抑制剂至其完全溶解，避免固体试剂之间存在干扰，纤维蛋白原交联剂和血小板抑制剂为活性物质，会受到环境温度和储存时间的影响，在配制过程中要最后加入。
其中，缓冲剂：包括PBS、Tris-HCL、乙磺酸、柠檬酸钠中的之一或其混合；蛋白保护剂：包括牛血清白蛋白、酪蛋白、人血清白蛋白中的之一或其混合；盐类物质：包括氯化钠、氯化镁、氯化锰、氯化钙、氯化钾中的之一或其混合；氨基酸：包括赖氨酸、组氨酸、缩氨酸、甘氨酸中的之一或其混合；防腐剂：包括叠氮钠、硫酸庆大霉素、硫柳汞中的之一或其混合；纤维蛋白原交联剂：包括高岭土、凝血酶、蛇毒类凝血酶、巴曲酶、立止血的之一或其混合。
S2、将纤维蛋白原激活试剂定量分装在样品杯中，并将分装后的样品杯置于西林瓶内；将样品杯直立放入西林瓶中，将纤维蛋白原激活试剂用加样枪分装在样品杯底部，分装体积为10-50ul；
S3、对S2中西林瓶进行冻干，将纤维蛋白原激活试剂粘附在样品杯底；
具体为：将分装好的样品杯与西林瓶直接放置在冻干机托盘中，设定冻干机真空度1-15Pa，设定冻干机的冻干曲线，温度范围从-40℃至30℃，冻干曲线的设定为：首先，温度为-40℃，保存时间2-4小时；然后温度为-30℃，保存时间2-6小时；然后温度为-20℃，保存时间2-6小时；然后温度为-10℃，时间为2-4小时；然后温度为0℃，时间为2-4小时；然后温度为10℃，时间为2-4小时；然后温度为20℃，时间为2-4小时；然后温度为30℃，保存至取出。
S4、将S3中冻干后的西林瓶在真空条件下做压盖密封操作，使样品杯处于真空环境；冻干后，在真空条件下对西林瓶进行压盖处理，保证了冻干后的试剂与外界环境分离，避免了试剂因接触空气中的氧气和水分而失效，提高了试剂的稳定性。
S5、在肝素抗凝环境下采集全血样本；
具体为：在步骤S5中的血样本加入肝素抗凝管中保存，肝素抗凝管为绿色头盖，内添加有肝素。肝素直接具有抗凝血酶的作用，可延长凝血时间，适用于红细胞脆性试验，血气分析，红细胞压积试验，血沉及普能生化测定，为全血样本提供肝素抗凝环境。在肝素抗凝管中取360ul血样加入到包被有纤维蛋白激活剂的样品杯中，在凝血因子作用下使纤维蛋白单体交联成网状结构。在此过程中，血小板抑制剂有效抑制了血小板在检测中受到温度、血样储存时间、临床药物、实验操作等因素的影响而提前激活的情况，避免了血小板对纤维蛋白原强度的干扰，测定的血块强度仅有纤维蛋白的贡献。
S6、将样品杯从西林瓶中取出，置于血栓弹力图仪的杯槽中；
S7、通过加样枪将采集后的全血样本加入样品杯内；
S8、启动血栓弹力图仪对全血样本做纤维蛋白原功能检测。具体为：将样品杯托推至血栓弹力图仪的测试位置,点击电脑测试软件进行测试,包被在样品杯底部的纤维蛋白原激活试剂会快速释放与血样充分混匀，所检测的血栓弹力图振幅为特异的患者纤维蛋白原的功能振幅，检测值将与接下来的ADP或AA途径振幅对比，充分反映患者服药后血小板反应净值。
实施例二
如图2所示，本实施例二是在实施例一的基础上，公开了一种维蛋白原的检测方法的样品杯和西林瓶，本实施例二公开的样品杯和西林瓶作为一种维蛋白原的检测方法的优选实施方式，并不依赖与此，在不脱离本发明技术方案的基础上，其他装置也属于本发明的保护范围。
其中，样品杯2装在西林瓶1内，样品杯2上装有样品杯盖3，密封盖4压装在样品杯盖3上，西林瓶1上端装有易拉盖6，易拉盖6与密封盖4之间设有圆盖5，样品杯盖3内设有空腔，与样品杯2内的空腔相对设置。使用时，第一步，将样品杯2放置于西林瓶1中；第二步，将纤维蛋白原激活试剂定量加入到样品杯2内的空腔中，并将样品杯盖3装在样品杯2上；第三步，将样品杯2和西林瓶1放置于冻干机上进行冻干；第四步，在真空条件下压上密封塞4进行封装，然后装上圆盖5和易拉盖6。
综上所述，本发明纤维蛋白原的检测方法，在纤维蛋白原基础试剂中依次加入固相试剂和血小板抑制剂，形成纤维蛋白原激活试剂，提高了纤维蛋白原检测结果的准确性和稳定性，血小板抑制剂有效抑制了血小板在检测中受到温度、血样储存时间、临床药物、实验操作等因素的影响而提前激活的情况，避免了血小板对纤维蛋白原强度的干扰，提高了实验结果的准确性；该检测方法的纤维蛋白原激活剂直接包被在样品杯中，临床检测时简化了检测流程，只需将全血样本加入在样品杯中，不需要称量、计算、复溶、多次加样等繁琐操作步骤，减少了误差，增加了检测的可靠性；该检测方法在纤维蛋白原激活剂中加入了固相试剂，固相试剂不仅使纤维蛋白原激活试剂冻干后粘附在杯底部，而且与血样混合后还具有很好的扩散效果，使纤维蛋白原激活试剂在血液中溶解，保证了检测的稳定性；该检测方法，在纤维蛋白原激活试剂冻干后在真空条件下进行密封处理，避免了试剂因接触空气中的氧气和水分而失效，稳定了试剂的性能。
本发明的实施例是为了示例和描述起见而给出的，而并不是无遗漏的或者将本发明限于所公开的形式。很多修改和变化对于本领域的普通技术人员而言是显而易见的。选择和描述实施例是为了更好说明本发明的原理和实际应用，并且使本领域的普通技术人员能够理解本发明从而设计适于特定用途的带有各种修改的各种实施例。

Claims (10)

1.一种纤维蛋白原的检测方法，其特征在于，包括如下步骤： 
S1、在纤维蛋白原基础试剂中依次加入固相试剂和血小板抑制剂，形成纤维蛋白原激活试剂； 
S2、将纤维蛋白原激活试剂定量分装在样品杯中，并将分装后的样品杯置于西林瓶内； 
S3、对S2中的西林瓶进行冻干，将纤维蛋白原激活试剂粘附在样品杯底； 
S4、将S3中冻干后的西林瓶在真空条件下做压盖密封操作，使样品杯处于真空环境； 
S5、在肝素抗凝环境下采集全血样本； 
S6、将样品杯从西林瓶中取出，置于血栓弹力图仪的杯槽中； 
S7、通过加样枪将采集后的全血样本加入样品杯内； 
S8、启动血栓弹力图仪对全血样本做纤维蛋白原功能检测。 
2.根据权利要求1所述的纤维蛋白原的检测方法，其特征在于，在步骤S1中的固相试剂在纤维蛋白原激活试剂的浓度为1-10g/L。 
3.根据权利要求1所述的纤维蛋白原的检测方法，其特征在于，所述固相试剂包括蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、聚乙二醇和甘油中的之一或其混合。 
4.根据权利要求1所述的纤维蛋白原的检测方法，其特征在于，在步骤S1中的血小板抑制剂在纤维蛋白原激活试剂中的浓度为0.1-10U/mL。 
5.根据权利要求1所述的纤维蛋白原的检测方法，其特征在于，血小板抑制剂包括阿西单抗、埃替非巴肽和替罗非班中的之一或其混合。 
6.根据权利要求1所述的纤维蛋白原的检测方法，其特征在于，在步骤S1中的纤维蛋白原基础试剂包括缓冲剂、蛋白保护剂、盐类物 质、氨基酸、表面活性剂、防腐剂和纤维蛋白原交联剂的混合溶液。 
7.根据权利要求1所述的纤维蛋白原的检测方法，其特征在于，在步骤S2的样品杯中加入的纤维蛋白原激活试剂的体积为10-50ul。 
8.根据权利要求1所述的纤维蛋白原的检测方法，其特征在于，在步骤S3中将封装有样品杯的西林瓶直接放置在冻干机中，设定冻干机的真空度为1-15Pa，设定冻干机的冻干温度为-40℃至30℃。 
9.根据权利要求1所述的纤维蛋白原的检测方法，其特征在于，在步骤S5中的全血样本加入肝素抗凝管中保存。 
10.根据权利要求9所述的纤维蛋白原的检测方法，其特征在于，在肝素抗凝管中取360ul血样加入到包被有纤维蛋白激活剂的样品杯中，通过血栓弹力图仪做纤维蛋白原功能检测。 
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