CN107561294A - 新生儿ABO、RhD血型检测卡及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种新生儿ABO、RhD血型检测卡及其制备方法。所述新生儿血型检测卡由六个微柱凝胶管组成,第1‑4管分别充以抗A凝胶、抗B凝胶、抗AB凝胶和抗D凝胶,用以确定新生儿红细胞抗原,第5管为不含任何抗体的中性胶,作为阴性对照,第6管中含有抗人球蛋白凝胶,用以检测新生儿红细胞在体内是否被不完全抗体致敏。本发明采用的凝胶悬浮缓冲液缓冲作用强,悬浮能力好,减缓凝胶沉降速度,克服灌装难度大的问题,且具有广谱抗菌活性,不会影响与酶或抗体的相关反应,成分简单,易于配制,并使用真空抽滤排除气泡,在凝胶灌装时,使凝胶颗粒之间无气泡和异物,提高检测准确度。从而实现新生儿血型的检测,为新生儿溶血病的早期诊断提供条件。
Description
技术领域
本发明属于医用材料技术领域,涉及一种新生儿ABO、RhD血型检测卡制备方法及其应用。
背景技术
新生儿溶血病(hemolytic disease of the newborn,HDN)是由于母婴血型不合引起的同种被动免疫性疾病。可发生于胎儿和新生儿早期,胎儿由父亲方面遗传抗原而恰为母亲所缺少,此抗原侵入母体,刺激母体而产生免疫抗体,此抗体可经过胎盘进入胎儿血液循环,胎儿红细胞与相应抗体结合而大量溶血造成贫血。在汉族人群中Rh HDN的发病率低于ABO HDN,但Rh HDN具有发病早、进展快、病情危重等特点,可导致胎儿流产、早产、死胎、新生儿贫血黄疸及胆红素性脑病等致残的后果,严重影响新生儿的生存质量。因此做好新生儿的血型鉴定对临床新生儿输血安全极为重要。
在新生儿血型鉴定中,因其红细胞抗原数量少,自身抗体还未产生,同时受母体抗体干扰等原因,血型鉴定难度相对较成人更大。同时,因为新生儿血容量小、耐受力差,输血过程中极弱的凝集可能带来很严重的后果,所以其输血需要非常慎重,对血型的准确鉴定至关重要,是输血的第一步。
传统的新生儿血型鉴定方法是采用玻片法和试管法,因新生儿红细胞抗原弱,2-4岁后成熟,该方法对新生儿血型鉴定敏感性差,不能正确鉴定新生儿血型。同时操作难以规范化、也受气候影响,气温在15度以下时红细胞冷凝聚常常影响血型鉴定结果。新生儿和6个月前幼儿其6个月之内由于血浆中ABO抗体活性太弱并且含有来自母体的抗体,免疫反应相对较弱,尤其是出生3~4个月时的生理性低γ球蛋白血症,使IgG水平相当于成人的35%左右,1~2岁时IgG水平也仅相当于成人的60%,直到13岁以后才基本达到成人水平,故血型反定型就没有明确的临床意义,所以新生儿血型只能由检测红细胞抗原正定型来检定其ABO血型。目前有大量文章报道使用微柱凝胶方法对新生儿血型鉴定报道,但都使用的是成人血型正反定卡进行研究。新生儿微柱凝胶ABO、RhD血型检测卡因其卡不同于成人血型卡,在卡中第四管有高效价抗AB抗体,这样就防止了因为新生儿血型抗原弱而漏检血型。
目前国内外已有一些厂家生产用于新生儿ABO、RhD血型检测的微柱凝胶卡,但存在一些不足:一是凝胶悬浮缓冲液的悬浮性差,在灌装时,凝胶沉降速度快,造成凝胶灌装时难度大,二是凝胶在灌装前,未进行排气泡操作,导致灌卡后成品合格率低。
因此,在本领域期望开发一种可以有效解决凝胶灌装时的悬浮性问题以及灌装后出现气泡问题的微柱凝胶检测卡。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种凝胶悬浮缓冲液、由其处理得到的凝胶、检测卡及其应用。
为达到此发明目的,本发明采用以下技术方案:
一方面,本发明提供一种凝胶悬浮缓冲液,所述凝胶悬浮缓冲液包括如下成分:
在本发明中,通过使用含有如上所述成分的凝胶悬浮缓冲液不仅缓冲作用强,而且更接近人体红细胞的存在环境,且咪唑溶液很稳定,而葡聚糖溶于水后,可提高其悬浮能力,减缓凝胶在其中的沉降速度,钠盐则保证了凝胶悬浮缓冲液的离子强度。采用Proclin300作为防腐剂,具有广谱抗菌活性,能在比较长的时间内抑制细菌、真菌和酵母菌等微生物的生长,同时,它又具有良好的与酶的相容性,不会影响与酶或抗体的相关反应,使用剂量少即可达到抑菌的目的,其使用剂量较低对人畜无害。采用吐温20作为润滑剂,它是非离子表面活性剂,具有乳化、扩散、增溶、稳定等作用,最主要使得红细胞通过凝胶间隙时获得合适的润滑能力,使无凝集的红细胞能完全通过凝胶颗粒间隙,而凝集的红细胞则被凝胶阻隔留在凝胶胶面以上或凝胶胶柱内。
在本发明中,所述凝胶悬浮缓冲液中咪唑的含量为0.7-0.99g/L,例如0.7g/L、0.73g/L、0.75g/L、0.78g/L、0.8g/L、0.83g/L、0.85g/L、0.88g/L、0.9g/L、0.93g/L、0.95g/L或0.99g/L。
在本发明中,所述凝胶悬浮缓冲液中NaCl的含量为0.6-0.9g/L,例如0.6g/L、0.63g/L、0.65g/L、0.68g/L、0.7g/L、0.74g/L、0.78g/L、0.8g/L、0.83g/L、0.85g/L、0.88g/L或0.9g/L。
在本发明中,所述凝胶悬浮缓冲液中Tween 20的质量百分含量为0.05-0.2%,例如0.05%、0.08%、0.1%、0.12%、0.14%、0.16%、0.18%或0.2%。
在本发明中,所述凝胶悬浮缓冲液中Proclin 300的质量百分含量为0.05-0.2%,例如0.05%、0.08%、0.1%、0.12%、0.14%、0.16%、0.18%或0.2%。
在本发明中,所述凝胶悬浮缓冲液中葡聚糖的质量百分含量为1%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、2%、2.3%、2.5%、2.7%、2.9%或3%。
在本发明中将如上所述成分溶解在纯化水中得到所述凝胶悬浮缓冲液。
优选地,所述凝胶悬浮缓冲液包括如下成分:
优选地,所述凝胶悬浮缓冲液的pH为7.2~7.4,例如7.2、7.25、7.3、7.35或7.4。
另一方面,本发明提供一种由如上所述的凝胶悬浮缓冲液处理得到的凝胶。
优选地,所述处理的方法为:将聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶离心,弃去上清后,使用等体积的纯化水清洗3-5次,除去凝胶破损碎片和聚集的凝胶颗粒以及凝胶中过多的盐离子,然后再使用等量的生理盐水清洗凝胶3次,再使用凝胶悬浮缓冲液清洗至少两次后,弃去上清,得到所述凝胶。
本发明处理得到的凝胶颗粒大小均匀且完整呈球形,利用所述凝胶悬浮缓冲液清洗后可以减缓凝胶的沉降速度,减少凝胶灌装时的难度,易于灌装。
另一方面,本发明提供一种检测卡,所述检测卡中包括如上所述的凝胶悬浮缓冲液处理得到的凝胶。
优选地,所述检测卡为血型检测卡,所述血型检测卡包含六个微管,第一个微管中含有如上所述的凝胶悬浮缓冲液处理得到的凝胶和抗A单克隆抗体,第二个微管中含有如上所述的凝胶悬浮缓冲液处理得到的凝胶和抗B单克隆抗体,第三个微管中含有如上所述的凝胶悬浮缓冲液处理得到的凝胶和抗AB单克隆抗体,第四个微管中含有如上所述的凝胶悬浮缓冲液处理得到的凝胶和抗D单克隆抗体,第五个微管中均为不含任何抗体的中性凝胶,第六个微管中含有如上所述的凝胶悬浮缓冲液处理得到的凝胶和抗人球蛋白多克隆抗体。
优选地,所述第一个微管中抗A单克隆抗体与凝胶悬浮缓冲液处理得到的凝胶的体积比为2:(2-5),例如2:2、2:2.3、2:2.5、2:2.8、2:3、2:3.3、2:3.5、2:3.8、2:4、2:4.3、2:4.5、2:4.7或2:5,优选2:3。
优选地,所述第二个微管中抗B单克隆抗体与凝胶悬浮缓冲液处理得到的凝胶的体积比为2:(2-5),例如2:2、2:2.3、2:2.5、2:2.8、2:3、2:3.3、2:3.5、2:3.8、2:4、2:4.3、2:4.5、2:4.7或2:5,优选2:3。
优选地,所述第三个微管中抗AB单克隆抗体与凝胶悬浮缓冲液处理得到的凝胶的体积比为2:(2-5),例如2:2、2:2.3、2:2.5、2:2.8、2:3、2:3.3、2:3.5、2:3.8、2:4、2:4.3、2:4.5、2:4.7或2:5,优选2:3。
优选地,所述第四个微管中抗D单克隆抗体与凝胶悬浮缓冲液处理得到的凝胶的体积比为2:(2-5),例如2:2、2:2.3、2:2.5、2:2.8、2:3、2:3.3、2:3.5、2:3.8、2:4、2:4.3、2:4.5、2:4.7或2:5,优选2:3。
优选地,所述第五个微管中中性凝胶的配制方法为:将如上所述的凝胶悬浮缓冲液与凝胶悬浮缓冲液处理得到的凝胶按照体积比2:(2-5)(例如2:2、2:2.3、2:2.5、2:2.8、2:3、2:3.3、2:3.5、2:3.8、2:4、2:4.3、2:4.5、2:4.7或2:5)混合得到所述中性凝胶。
优选地,所述第六个微管中抗人球蛋白多克隆抗体与凝胶悬浮缓冲液处理得到的凝胶的体积比为2:(2-5),例如2:2、2:2.3、2:2.5、2:2.8、2:3、2:3.3、2:3.5、2:3.8、2:4、2:4.3、2:4.5、2:4.7或2:5,优选2:3。
优选地,在灌装至第一至第六个微管前对所述利用凝胶悬浮缓冲液处理得到的凝胶以及中性凝胶进行真空抽滤,排出气泡。使得得到的凝胶颗粒之间无气泡和异物。
在本发明中对凝胶进行真空抽滤,排出气泡后,按照每管26~30微升的量分别加入到空白凝胶卡的六个微管中的相应位置,得到新生儿ABO、RhD血型检测卡。
本发明为了保证制备的新生儿ABO、RhD血型检测卡和抗人球蛋白检测卡的质量,对用于配置的抗体原料进行了筛选。
优选地,所述抗A单克隆抗体的工作液效价≥128。
优选地,所述抗A单克隆抗体的工作液由凝胶悬浮缓冲液稀释抗A单克隆抗体得到。
优选地,所述抗B单克隆抗体的工作液效价≥128。
优选地,所述抗B单克隆抗体的工作液由凝胶悬浮缓冲液稀释抗B单克隆抗体得到。
优选地,所述抗AB单克隆抗体的工作液效价≥128。
优选地,所述抗AB单克隆抗体的工作液由凝胶悬浮缓冲液稀释抗AB单克隆抗体得到。
优选地,所述抗D单克隆抗体的工作液效价≥64。
优选地,所述抗D单克隆抗体的工作液由凝胶悬浮缓冲液稀释抗D单克隆抗体得到。
优选地,所述抗人球蛋白多克隆抗体按照体积比进行1:4稀释后,必须与IgG和C3抗体致敏的红细胞形成肉眼可见的凝集。
相对于现有技术,本发明具有以下有益效果:
本发明的凝胶悬浮缓冲液的缓冲作用强,更接近人体红细胞的存在环境,提高了悬浮能力,减缓凝胶的沉降速度,克服灌装难度大的问题,并且本发明的凝胶悬浮缓冲液具有广谱抗菌活性,且不会影响与酶或抗体的相关反应,成分简单,易于配制,在制备血型检测卡时利用该凝胶悬浮缓冲液,使凝胶更易悬浮,延长沉降时间,同时使用真空抽滤方法排除凝胶中的气泡,然后进行凝胶灌装,得到凝胶颗粒之间无气泡和异物,提高检测准确度。
附图说明
图1为本发明的检测卡的结构示意图,其中1-6分别为第一个微管、第二个微管、第三个微管、第四个微管、第五个微管和第六个微管。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了,所述实施例仅仅是帮助理解本发明,不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
(1)在本实施例中,凝胶悬浮缓冲液的配方如下:
以上试剂用纯化水溶解,调整pH为7.2~7.4,得到凝胶悬浮缓冲液。
(2)利用本实施例得到的凝胶悬浮缓冲液制备凝胶,制备方法如下:
先将聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶离心,弃去上清后,使用等体积的纯化水清洗3-5次,除去凝胶破损碎片和聚集的凝胶颗粒以及凝胶中过多的盐离子,然后再使用等量的生理盐水清洗凝胶3次,再使用凝胶悬浮缓冲液清洗两次后,弃去上清,得到颗粒大小均匀且完整呈球形的凝胶。
(3)抗体的选择
选择IgM性质的抗A抗体,并使用凝胶悬浮缓冲液稀释使其效价≥128,得到抗A溶液。
选择IgM性质的抗B抗体,并使用凝胶悬浮缓冲液稀释使其效价≥128,得到抗B溶液。
选择IgM性质的抗AB抗体,并使用凝胶悬浮缓冲液稀释使其效价≥128,得到抗AB溶液。
选择IgM性质的抗D抗体,并使用凝胶悬浮缓冲液稀释使其效价≥64,得到抗D溶液。
选择抗人球蛋白多克隆抗体,按照体积比进行1:4稀释后,必须与IgG和C3抗体致敏的红细胞形成肉眼可见的凝集。
(4)凝胶的配制
特异性凝胶的配制:分别取步骤三抗A溶液、抗B溶液、抗AB、抗D溶液、抗人球蛋白多克隆抗体与步骤二制备的凝胶按照2:3比例混合均匀,然后在抗A溶液配制的凝胶中加入终浓度为0.02mg/mL的亚甲蓝,在抗B溶液配制的凝胶中加入终浓度为0.1mg/mL的酒石黄,即得分别含有抗A单克隆抗体、抗B单克隆抗体、抗AB单克隆抗体、D单克隆抗体、抗人球蛋白多克隆抗体的特异性凝胶。
中性凝胶的配制:取步骤一配制的凝胶悬浮缓冲液与步骤二制备的凝胶按照2:3比例混合均匀,即得中性凝胶。
(5)凝胶灌装
将步骤四配制的各半成品凝胶,均在分装前使用真空抽滤泵进行抽滤排出气泡,然后按照每管26~30μl的量分别加入到空白凝胶卡的六个微管中的相应位置,第一个微管中加入含有抗A单克隆抗体的特异性凝胶,第二个微管中加入含有抗B单克隆抗体的特异性凝胶,第三个微管中加入含有抗AB单克隆抗体的特异性凝胶,第四个微管中加入含有抗D单克隆抗体的凝特异性凝胶,第五个微管中加入不含任何抗体的中性凝胶,第六个微管中加入含有抗人球蛋白多克隆抗体的特异性凝胶,形成新生儿ABO、RhD血型检测卡。
(6)封口
使用铝箔对微柱凝胶卡的管口进行热力塑封,得到血型检测卡。
实施例2:
利用实施例1制备得到的新生儿ABO、RhD血型检测卡进行血型检测,方法如下:
新生儿ABO、RhD血型检测卡由聚丙烯塑料透明卡片,卡片上并排六支微柱型管中充填聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶,从左向右顺序第一支至第四支微管凝胶中分别充填抗A、抗B、抗AB、抗D单克隆抗体IgM试剂,称之为特异性凝胶,检测新生儿ABO、RhD抗原;第五支微管中只有凝胶,称之为中性凝胶,做为阴性对照,第六支微管填充抗人球蛋白多克隆抗体,用来确定新生儿红细胞是否在体内被不完全抗体致敏。
将微柱凝胶试剂卡的六支凝胶微管标号,如图1所示。
将待检新生儿0.5%~0.8%红细胞生理盐水悬液分别加入第一至第六支微管中,每管50μL。
即刻使用专用离心机离心5分钟(900rpm 2min,2500rpm 3min),取出肉眼判定结果。判定结果示于表1中。
结果判定的标准如下:
阳性结果:红细胞抗原与相应抗体在微柱凝胶中形成的特异性抗原抗体复合物浮在凝胶表面或胶中,为阳性反应。
反应强度:特异性红细胞抗原抗体复合物位于胶表面,为强阳性反应;复合物在胶中为弱阳性反应;愈靠近胶底部颗粒愈小,反应愈弱。
阴性结果:被检红细胞抗原无相应的抗体结合,不出现特异性抗原抗体复合物,红细胞沉于微柱凝胶的底部。
表1
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法,但本发明并不局限于上述工艺步骤,即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种新生儿ABO、RhD血型检测卡,其特征在于:由六个微柱凝胶管组成,第一个微管中含有由凝胶悬浮缓冲液处理得到的凝胶和抗A单克隆抗体,第二个微管中含有由凝胶悬浮缓冲液处理得到的凝胶和抗B单克隆抗体,第三个微管中含有由凝胶悬浮缓冲液处理得到的凝胶和抗AB单克隆抗体,第四个微管中含有由凝胶悬浮缓冲液处理得到的凝胶和抗D单克隆抗体,第五个微管为不含任何抗体的中性凝胶,第六个微管中含有由凝胶悬浮缓冲液处理得到的凝胶和抗人球蛋白试剂多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的新生儿ABO、RhD血型检测卡的制备方法,其特征在于,包括下列步骤:凝胶悬浮缓冲液的制备、特异性凝胶的制备、灌装。
3.根据权利要求2所述凝胶悬浮缓冲液的制备,其特征在于,所述凝胶悬浮缓冲液包括如下成分:
4.根据权利要求3所述的凝胶悬浮缓冲液,其特征在于,所述凝胶悬浮缓冲液包括如下成分:
5.根据权利要求3或4所述的凝胶悬浮缓冲液,其特征在于,所述凝胶悬浮缓冲液的pH为7.2~7.4。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的凝胶悬浮缓冲液处理得到的凝胶。
7.根据权利要求6所述的凝胶,其特征在于,所述处理的方法为:将聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶离心,弃去上清后,使用等体积的纯化水清洗3-5次,除去凝胶破损碎片和聚集的凝胶颗粒以及凝胶中过多的盐离子,然后再使用等量的生理盐水清洗凝胶3次,再使用凝胶悬浮缓冲液清洗至少两次后,弃去上清,得到所述凝胶。
8.一种检测卡,其特征在于,所述检测卡中包括如权利要求3-5中任一项所述的凝胶悬浮缓冲液处理得到的凝胶。
9.根据权利要求8所述的检测卡,其特征在于,所述检测卡为新生儿ABO、RhD血型检测卡,所述血型检测卡包含六个微管,第一个微管中含有由凝胶悬浮缓冲液处理得到的凝胶和抗A单克隆抗体,第二个微管中含有由凝胶悬浮缓冲液处理得到的凝胶和抗B单克隆抗体,第三个微管中含有由凝胶悬浮缓冲液处理得到的凝胶和抗AB单克隆抗体,第四个微管中含有由凝胶悬浮缓冲液处理得到的凝胶和抗D单克隆抗体,第五个微管为不含任何抗体的中性凝胶,第六个微管中含有由凝胶悬浮缓冲液处理得到的凝胶和抗人球蛋白多克隆抗体。
优选地,所述第一个微管中抗A单克隆抗体与凝胶悬浮缓冲液处理得到的凝胶的体积比为2:(2-5),优选2:3;
优选地,所述第二个微管中抗B单克隆抗体与凝胶悬浮缓冲液处理得到的凝胶的体积比为2:(2-5),优选2:3;
优选地,所述第三个微管中抗AB单克隆抗体与凝胶悬浮缓冲液处理得到的凝胶的体积比为2:(2-5),优选2:3;
优选地,所述第四个微管中抗D单克隆抗体与凝胶悬浮缓冲液处理得到的凝胶的体积比为2:(2-5),优选2:3;
优选地,所述第五管中性凝胶的配制方法为:将如上所述的凝胶悬浮缓冲液与凝胶悬浮缓冲液处理得到的凝胶按照体积比2:(2-5)混合得到所述中性凝胶;
优选地,所述凝胶悬浮缓冲液与凝胶悬浮缓冲液处理得到的凝胶按照体积比2:3混合;
优选地,所述第六个微管中抗人球蛋白多克隆抗体与凝胶悬浮缓冲液处理得到的凝胶的体积比为2:(2-5),优选2:3;
优选地,在灌装至第一至第六个微管前对所述利用凝胶悬浮缓冲液处理得到的凝胶以及中性凝胶进行真空抽滤,排出气泡;
优选地,所述抗A单克隆抗体的工作液效价≥128;
优选地,所述抗A单克隆抗体的工作液由凝胶悬浮缓冲液稀释抗A单克隆抗体得到;
优选地,所述抗B单克隆抗体的工作液效价≥128;
优选地,所述抗B单克隆抗体的工作液由凝胶悬浮缓冲液稀释抗B单克隆抗体得到;
优选地,所述抗AB单克隆抗体的工作液效价≥128;
优选地,所述抗AB单克隆抗体的工作液由凝胶悬浮缓冲液稀释抗AB单克隆抗体得到;
优选地,所述抗D单克隆抗体的工作液效价≥64;
优选地,所述抗D单克隆抗体的工作液由凝胶悬浮缓冲液稀释抗D单克隆抗体得到。
优选地,所述抗人球蛋白多克隆抗体按照体积比进行1:4稀释后,必须与IgG和C3抗体致敏的红细胞形成肉眼可见的凝集。
10.根据权利要求9中所述的各管凝胶,分别按照每管26-30μl的量灌注到凝胶卡相应的微柱中,形成新生儿ABO、RhD血型检测卡。
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