JPH05503223A - 抗凝固剤濃度測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗凝固剤濃度測定方法 本光里二分団 本発明は、サンプル中の抗凝固剤濃度を測定する方法に関する。

本主里Ω皇景 臨床において、抗凝固剤は、患者を血栓症、すなわち血管中の位塊の生成または 存在から保護するために使用される。最も頻繁に使用される抗凝固剤はアセチル サリチル酸（アスピリン）、クマリン誘導体およびヘパリンである。

トロンビンはフィブリノーゲンからフィブリンの形成を触媒し、このためトロン ビン濃度は血液もしくは血漿の凝固に責任がある。

しかしながら、ヘパリンの抗トロンビン■への結合により、それはトロンビンの タンパク分解活性に対する非常に強力な阻害剤となるそれ故、ヘパリンは血栓症 の危険をもって、ｇ者へしばしば投与される。ヘパリン濃度の精密な調節が極め て重要である。もしヘパリンの投与量が低すぎれば、血栓症または塞栓の危険が 存在し、他方投与量が多すぎれば出血を招来し得る。この理由のため、患者血漿 中の抗凝固性物質濃度はある抗凝固性物質の投与を決定する。

血漿中の抗凝固性物質の濃度を測定するための多数の方法が開発されている。一 方法は血液または血漿の凝固活性を測定することを含む。特に、活性化された部 分的トロンボプラスチン時間およびトロンビン時間が測定される。しかしながら これら方法は凝固因子の活性に依存し、そしてフィブリン分解産物の存在によっ て付加的に影響される。フィブリン分解産物は二つの理由で抗凝固作用を有する 。第１に、フラグメントＥは抗トロンビン作用を有し、このだトロンビン時間を 延長せしめる。第２に、フィブリノーゲンのいくつかのフラグメントは重合する ことができ、そのためフィブリン凝塊形成を遅延または防止することができる。

加えて、活性化され部分的トロンボプラスチン時間測定は、ヘパリンと組合せて 投与れるグリセロールトリナイトレートによって影響される。Ｐｉｚｕｌｉ　ｅ ｔ　ａｌ、、　Ｈｅｍｍｕｎ　ｄｅｒ　Ｈｅ　ａｒｉｎｗｉｒｋｕｎ　ｄｕｒｃ ｈ　Ｇｌ　ｃｅｒｏｌｔｒｉｎｉｔｒｌ工、Ｄｔｓｃｈ、Ｍｅｄ、Ｗｓｃｈｒ、 １１３．１８３７　（１９８８）さらに、これら方法は、特にヘパリンの低もし くは高濃度の状況において非常に精密でないことが観察されている。’ｒｈｒｏ ｍｂ、Ｒｅｓ、８，４１３　（１９７６）。

血ｔサンプル中のヘパリン濃度を測定するだめの他の方法は、トロンビンおよび Ｘａ因子よりなる群から選ばれたタンパク分解酵素を加え、該酵素に対する色素 原物質を加え、そして色素原物質から放出された色素を測定することを含む。ト ロンビンおよび因子Ｘａはヘパリンの存在下抗トロンビン■によって一層急速に 不活性化されるから、これら酵素の残存色素原活性は存在するヘパリン量の関数 である。Ｂａｒｔｌ　ｅｔ　ａｌ、、米国特許？Ｊａ４，２３４，６８２および ４，４０９．３２７；Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ、Ｃｌ１ｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１ ５，２３９　（１９７７）、Ｌかしながらこれら方法は、ヘパリンの低濃度に対 する悪魔を同様に欠いている。

Ｐｉｅｔｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｔｈｅ　Ｌｉｍ１ｔｅｄ　ｒｍｏｒｔａｎｃｅ 　ｏｆ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｘａ　Ｉｎｈｉｂｉｔｉ。

ｎ　ｔｏ　ｔｈｅ　Ａｎｔｉｃｏａ　ｕｌａｎｔ　Ｐｒｏ　ｅｒｔ−Ａｃｔｉｖ ａｔｅｄ　Ｐｌａｓｍａ、Ｂｌｏｏｄ　７２，２０４Ｂ　（１９８８）、Ｂｕｃ ｈａｎａｎ　ｅｔ　ａ　１．、Ｔｈｅ　Ｒｅｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｈｅ　ａｒｉｎ 、Ｂｌｏｏｄ　８６，１９８（１９８５）。

なお他の方法は、過剰の因子Ｘａを血漿と共にインキュベートすることによって ヘパリンの活性を測定することを含む。規定のインキュベーション時間後、リン 脂質、カルシウムイオンおよび種々の血漿タンパクが加えられ、凝固時間が測定 される。ＹｉｎＥ、。

Ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　Ｈｅｐａｒｉｎ　 Ａｓ５ａｙｓ、　ＥＰＡｏ、２１７，７６８．Ｌかしながら技術文献において、 抗因子Ｘａ活性の測定がヘパリンの臨床的力価に実際に相関するかどうかについ て争いがある。Ｈｅｍｂｅｒ　Ｈ，Ｃ，、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈａ ｅｍｏｓｔａｓｉｓ：Ｅｄｓ、Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ　Ｍ、ｅｔ　ａｌ、、Ｌｅ ｕｖｅｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ　１９８７．ｐｐ。

１７−３６゜ 標準的ヘパリン、それに低分子量ヘパリン、グリコサミノグリカン、硫酸デルマ タン、および抗ａ問活性を有する他の阻害剤の比較的小濃度をモニターするため には、活性な抗凝固物質のごく微量でさえも確実性をもって検出できる方法が必 要である。本発明の課題は、先行技術方法を上田る、悪魔および特異性に関する 利点を提供する、これら化合物のための試験システムを開発することであった。

木見肌立塁！ 本発明によれば、上で論じた目的は、過剰量の（すなわち患者サンプル中の濃度 より上の）内因性システムの精製した凝固因子と、凝固因子を安定化するのに充 分な量のカルシウムイオンと、反応を触媒するのに充分な量のリン脂質と、そし て弱いトロンビン阻害剤、例えば抗トロンビン■の組合せを使用することによっ て達成される。

これら反応剤は希釈した血漿サンプルと共にインキュベートされる。

次に因子ＩＸａおよびＣａＣ１ｚを含む、凝固カスケード賦活剤が混合物へ添加 される。カスケード賦活剤の作用より、痕跡量のトロンビンがゆっくり生成され る。助因子Ｖおよび因子■は非活性形で存在するので、トロンビン生成は最初非 常に遅く、そして非効果的プロセスである。しかしながら、もし血漿サンプルが 抗凝固物質を含んでいるならば、その時反応混合物中の弱いトロンビン阻害剤、 すなわち抗トロンビン■は、活性抗凝固性物質によって強化され、それと共にト ロンビン依存性反応が抑制される。これは一定時間内により少ないトロンビンが 生成する結果へ導く。トロンビン生成阻害とサンプル中の抗凝固活性物質の間の 比例関係は、サンプル中の抗凝固活性物質濃度の測定を許容する。ヒルジンまた は合成阻害剤のような多数の抗凝固剤も、上に述べた試薬混合物中の抗トロンビ ン■をパスすることによってトロンビンを直接阻害する。それ故もしこれら物質 がアッセイされるならば、抗トロンビン■を省略すること、前記サンプル中のト ロンビン生成を抑制するのに充分な量の凝固因子試薬を前記サンプルと合併する こと、トロンビンを複合化する緩衝化試薬の充分な量を加えること、そして前記 サンプル中のトロンビン濃度をある抗凝固剤の既知濃度と相関させることにより 前記サンプル中の前記抗凝固剤の濃度を決定することを含む、サンプル中のある 抗凝固剤の濃度を前記サンプル中のトロンビン生成阻害の関数として決定する方 法に関する。

前記方法中の前記凝固因子試薬は、サンプル中に存在する凝固因子濃度より大き い凝固因子の与えられた量と、前記因子を安定化するの充分な量のカルシウムイ オンと、反応を触媒するのに充分な量のリン脂質と、サンプル中の血小板因子４ を中和するのに充分な量のｇ酸デキストランと、そして前記サンプル中のトロン ビン生成を抑制するのに充分な量の弱いトロンビン阻害剤とよりなる。前記方法 において、抗凝固剤は、ヘパリン、α−ＮＡＰＡＰおよび硫酸デルマタンよりな る群から選ばれる。加えて前記方法において、弱いトロンビン阻害剤は、抗トロ ンビン■、ヘパリン助因子■、および抗凝固剤によって増強される、トロンビン の合成生理学的阻害剤よりなる群から選ばれる。

加えて、本発明は、前記凝固因子試薬が、サンプル中に存在する凝固因子濃度よ り大きい与えられた量の凝固因子と、前記因子を安定化するのに充分な量のカル シウムイオンと、反応を触媒するのに充分な量のリン脂質と、サンプル中の血小 板因子４を中和するのに充分な量の硫酸デキストランよりなる方法に関する。上 記方法において、抗凝固剤はヒルジンと、トロンビン生理学的阻害剤とよりなる 群から選ばれる。

なお加えて、本発明は、前記方法を実施するだめのテストキットに関する。

皿皿二呈里星脱ユ 第１図は、ヘパリン標準曲線を示す。

第２図は、低分子量ヘパリンのための標準曲線を示す。

第３図は、ヒルジン標準曲線を示す。

第４図は、固定吸光度アッセイのためのヘパリン標準曲線を示す。

第５図は、凝固アッセイのためのヘパリン標準曲線を示す。

第６図は、全血中の凝固アッセイのためのヘパリン標準曲線を示す。

第７図は、α−ＮＡＰＡＴ標準曲線を示す。

第８図は、硫酸デルマタンのための標準曲線を示す。

のｉ　な−日 このアッセイは以下の原理に基づく。サンプル中に存在する凝固因子濃度より大 きい与えられた量の凝固因子と、前記因子を安定するのに充分な量のカルシウム イオンと、反応を触媒するのに充分な量のリン脂質と、サンプル中の血小板因子 ４を中和するのに充分な量の硫酸デキストランと、そして前記サンプル中のトロ ンビン生成を抑制するのに充分な量の弱いトロンビン阻害剤とで混合物がつくら れる。ヒルジンや合成トロンビン阻害剤のような抗凝固性物質については、凝固 因子試薬中の弱い阻害剤は省略できることに注意すべきである。この凝固因子試 薬混合物へ、混合物中の弱いトロンビン阻害剤を増強するトロンビン阻害剤また は抗凝固性化合物が添加される。次に、それ以上のトロンとン生成を防止するた めのカルシウムキレート剤の存在下、活性化された凝固因子およびカルシウムイ オンが添加され、当初は遅いトロンビン生成を招来する凝固カスして凝血すなわ ちフィブリノーゲンのフィブリンへの転化が発生する。フィブリノーゲンを転化 するため、トロンビンの高濃度が必要であり、そしてこの反応は因子Ｖおよび■ を活性化できるトロンビンの最初の少痕跡量によっては開始されない。活性化さ れた因子Ｖおよび■は高濃度においてトロンビンの急速な生成を誘発し、フィブ リン／凝塊形成を招来し得る。

は阻止を発生させ、そのため多量のトロンビン生成は延期されるかまたは防止さ れる。

はヘパリン類に対して怒受性になるであろう。けだしこれら化合物はトロンビン 阻害剤として抗トロンとン■の力価に影響するからである。ヘパリンが多く存在 すればする程、抗トロンビン■はより強力にトロンビンを阻害し、そのためその ような場合、トロンビンの大量生成は遅延されるかまたは防止される。

やはり弱いトロンビン阻害剤であるヘパリン助因子■が混合物中に存在する時、 系は硫酸デルマタンに対し怒受性になるであろう。

けだし、この化合物はヘパリン助因子をトロンビンに対するより良い阻害剤にす るからである。

過剰量の凝固因子、および標準化された量の抗トロンビン■、リン脂質およびカ ルシウムイオンの使用と、同時にサンプルの高希釈により、ヘパリンまたはヘパ リン様抗凝固剤に対する高い特異性および感度が達成される。凝固因子の高過剰 はＫＨより数倍上の濃度を意味する。ＫＭはいわゆるミバエリス定数（濃度であ り）、そこでは酵素反応速度はその最高に可能速度の５０％である。もしそのよ うな過剰濃度が使用されるならば、反応速度はその最高に近く、そして凝固因子 濃度に依存しない。患者の血漿サンプルの凝固因子および阻害剤を使用する前に 述べた方法とは対照的に、この方法はすべての必要とする凝固因子を高度に過剰 にそしてコンスタントな濃度で使用することを提案する。この理由のため、この 測定系においては個々の凝固因子の活性の事故的な動這およびサンプル中のフィ ブリン分解産物および同様な因子の存在は、もはや何の役割も果たさない。

凝固因子は文献に記載されている既知方法に従ってウシ血液から単離される。（ 因子Ｘ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｊｒｙ　１上、４８８２　（１９７２）；因子Ｖｒ ｌ：Ｂ１ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　上９．４０１　（１９８０）；プロトロンビン ：Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２４ａｔｏ１．２３３　（１９７５））因子ＩＸａ は因子■の活性化によって調製された。（ＢｉｏｃｈｅｍｉｓＬｒｙ　１３，４ ５０Ｂ　（１９７４））ウシ血液のみならず、他の種の血液、特にヒト血液も凝 固因子源として適当であり、また組換え凝固因子も適当であることに注目すべき である。凝固因子については広いそして好ましい範囲は以下の通りである。因子 Ｘ、広い範囲１０〜ＬＯＯＯｎｍ、好ましい範囲３０ないし３００ｎｍ；因子■ 、広い範囲０．３５ないし２．５ｍｍ、好ましい範囲０．　７ないし１．４ｍｍ ；因子Ｖ、広い範囲０．　５〜２０ｎｍ、好ましい範囲１〜２．５ｍｍ；プロト ロンビン（抗トロンビンＩ［Ｉ）、広い範囲、２０〜１１０００ｎ、好ましい範 囲６０〜４００ｎｍ、ヘパリン助因子■はそれぞれ以下の範囲において使用し得 る。ヘパリン助因子■、広い範囲２０〜３５０ｎｍ、好ましい範囲、１４０ｎｍ ０ 加えて、凝固因子試薬は凝固因子を安定化させるのに充分な量のＣａＣ１，を含 む、ＣａＣ１，（Ｄ広い範囲５０〜１１００ｕ、好ましい範囲１００μＭが見出 された。

リン脂質ミセルの生成のため、フォスファチジルセリン、フォスファチジルコリ ンおよびコレステロールがクロロホルム溶液中種々の混合比で使用された。個の リン脂質は所望の重量比で混合され、そして溶媒は窒素気流によって蒸発された 。脂質の濃度は２ないし６μＭ、好ましくは９μＭである。超音波ｌこより、リ ン脂質の安定な懸濁液が確立され、そしてこれはリン脂質小粒源として使用され た。超音波処理時間は２＃間であった。上述のリン脂質問のモル比として、フォ スファチジルセリン２３％、フォスファチジルコリン６９％およびコレステロー ル８％が使用された。ワン脂質については、反応を触媒するのに有用な広い範囲 は９〜２５０μＭであるが、好ましい範囲は２０〜５０μＭである。

加えて、アルブミンのような不活性のタンパクが、ａ固因子が反応容器へ付着す るのを防止するために凝固因子試薬へ添加される。

不活性タンパク２〜２０■／ｉの広い範囲、しかし好ましくは１０〜２０■／ｄ が使用されることが判明した。アルブミンは溶液中にタンパクの全量にとどめる ために必要である。凝固因子試薬中囚子Ｖおよび■の濃度は非常に低い。担体タ ンパクが添加されなければ、因子Ｖおよび■は容器壁へ付着し、そのため活性が 小さくなるであろう。担体タンパクとして役立つため、任意の不活性タンパクが 適当であり、その例は血清アルブミンおよび卵アルブミンである。

加えて、サンプル中の血小板因子４の影響を阻害するため、凝固因子試薬へ硫酸 デキストランが添加される。硫酸デキストランの有用な広い範囲は０．３３〜１ ．９μｇ／ｄであるが、好ましい量は約０．４〜１■／−であることが判明した 。硫酸デキストランは、血小板からそれらが活性化される時に放出される血小板 因子４を中和するために必要である。血小板因子４はヘパリンを中和し、そして 血小板が活性化された場合、存在するヘパリンの一部または全量が中和されるで あろう。硫酸デキストランは、血小板因子４のこのヘパリン中和効果を防止する 。硫酸デキストランは１．６μｇ／ｄ以下では凝固反応を妨害しない。血小板因 子４によるヘパリン中和を防止する任意の他の化合物も使用することができる。

賦活剤試薬は凝固カスケードを開始せしめ、遅いトロンビン生成を招来する。好 ましい賦活剤は因子ＩＸａ、ＣａＣ１□および不活性タンパクである。因子ＩＸ ａは０．０２５〜４０ｎＭの範囲で添加することができるが、しかし約１−５　 ｎＭが好ましい。凝固カスケードは因子Ｘｒａまたは因子Ｘ［ａの添加によって 引金することができることに留意すべきである。この場合には、凝固因子試薬は 、約５０ｎＭの濃度範囲で因子■または因子ＸＩ複合体を含まなければならない 。有用であると判明したＣａＣｌ□の広い範囲は５〜ｌ０ｍＭであるが、約８〜 ３３　ｍ　Ｍの間が好ましい。試薬中の不活性タンパクの広い範囲は０．４ない し２０ｍｇ／ｄであるが、０．１〜１■／戚の間が好ましい。

検出試薬は色素原性、発色原性、螢光原性または電磁性化合物を含んでいる。も し検出試薬が色素性であれば、好ましい試薬は５２２３８（カビ）である。この 基質試薬の量は０．５ないし１ｍｍの範囲であるが、０．５ｍが好ましい。基質 試薬はそれ以上のトロンビン発生を防止するため、ＥＤＴＡのようなカルシウム キレート剤を含んでいる。カルシウムキレート剤の広い範囲はＣａＣ１ｚの過剰 であるが、好ましくは１０ｍＭ以上である。基質試薬は、凝固因子が反応容器へ 付着するのを防止するのに充分な量の不活性タンパクを含んでいる。この試薬中 の不活性タンパクは広くは０．４ないし２０■／ＩＩｆｌの範囲であるが、約０ ．５〜５■／ｄが好ましい。

抗凝固剤の色素原性基質測定のための典型的試薬が以下のように調製された。（ すべての溶液は１７５ｍＭ　ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，９中 に調製された。）凝固因子試薬： 因子Ｘ３０ｎＭ、因子■０．７ｎＭ、因子Ｖ１．４ｎＭ、プロトロンビン７０ｎ Ｍ、抗トロンビンＩＩ［７０ｎＭ、リン脂質９μｍ、ｃａｃＩｚ　ｏ、１ｍＭ、 アルブミン２０ｑ／ｉｄ、硫酸デキストラン０、　４μｇ／ｄ 賦活剤試薬；　゛ 因子ＩＸａ　１．　６μＭ、Ｃ−ａ　Ｃｌｘ　１５ｍＭ、アルブミン０．　５ｍ ｇ／ＭＩ Ｓｆ試薬ニ ア　／ｌ／ブミ７０．５ｍｇ／ｌｘｌ、ＥＤＴＡ３６ｍＭ、基質５２２３８　（ Ｋａｂｉ　Ｖｉｔ？ｕｍ　Ｃ，’ｏ、）’０．　８７５ｍＭトロンビンに対する 他の色素原物質も使用できることに留意すべきである。必要な濃度は物質の動力 学的定数に依存する。

このプロセスは凝固テストのような実施することができるが、しかしながらフィ ブリノーゲンが添加される。フィブリノーゲンはヒトまたはウソでよく、そして ４〜１０　、ｍｇ　／　ｔｕｌの範囲、しかし好ましくは約５■／ｄで添加され る。この変法は全血に本発明方法を通用する時に特に有利である。さらに、トロ ンビン生成速度をエンドポイントとして使用することができる。

同しプロセスは、ヒルジンまたは合成プロテアーゼ阻害剤のような、トロンビン に対す、る、またはトロンビン生成を招来するプロセスに向けた他の抗凝固活性 物質を測定するためにも使用できる。

Ｉ−色、７、法による　ゝ百ヘパリンの測上に記載した凝固因子試薬混合物２０ ０ｕｌと、あらかしめ生理食塩水１００部中１部に希釈した血漿１００μｐとを 混合した。上に記載した賦活剤試薬２００μ２の添加によって反応を開始させ、 混合物を３７゛Ｃで５分間インキュベートした。次に上に記載した検出試薬２０ ０μｉの溶液を加えた。生成したトロンビンを分光光度計で４　（１５ｎｍにお いて測定した。、その前ムこヘパリン（Ｌ　ｉ　ｑ　ｕ　ｅｍｉｎ、ホフマンー ラロシュ、ハーゼル）の既知量を血漿を加え、第１図の投与量依存曲線を得た。

【 トロンビンの量の測定である加水分解速度は、希釈しない血漿サンプル中ヘパリ ンＩＵ／ｄが存在するとき５０％阻害された。このテストの有効性を検証するた め、ヘパリン投与を受けている患者の血漿を２方法でテストした。第１に、それ は古典的なＡＰＴＴテストによって測定され、凝固時間５５．１秒が得られた。

この値はヘパリン０．９１Ｕ／ｄに相当する。第２に、患者の血漿を１００倍希 釈し、色素原アンセイで測定した。０．６６２Ａ／分の加水分解速度が得られ、 これはヘパリン０．８９Ｕ／−に相当した。第１［Ｊ血漿中の低分子量ヘパリン （Ｆｒａｇｍｉｎ、Ｋａｂｉ、ミュンヘン）の量を測定するため、実施例１に示 した色素原基質法を使用した。食塩水で１００倍Ｑこ希釈した血漿を、Ｆｒａｇ ｍｉｎ、（Ｋａｂｉ）の指示量と混合した。これらサンプルは実施例１に記載し たのと同し方法でテストされた。

血漿サンプルｄあたり低分子量ヘパリン６抗ＦＸａ単位（（Ｊ／ｄ）存在する時 、トロンビン生成は５０％阻害されたことが判明した。

第２図を見よ。

３−ヒルジンの ヒルジンの測定のため、ヒルジン（シグマ、ハイオケミカルズ、セントルイス） の増加量を持った血漿サンプルが調製された。血漿サンプルは生理食塩水で１０ ０倍希釈され、実施例１記載のようにテストされた。

血漿中ヒルジン５０　Ｕ／ｄが存在する時、トロンビン生成は５０％阻害される 。第３図を見よ。

表　３ た。修飾した賦活試薬２００μｌの添加によって反応を開始させた。

凝固因子試薬： 因子Ｘ５０ｎＭ、因子■１．２５μＭ、プロトロンビン１２５ｎＭ、因子Ｖ２． ５ｎＭ、抗トロンビア１］１１２５ｎＭ、リン脂質１５、ｕＭ、Ｃａ　Ｃｌｚ　 ０．１ｍＭ、アルブミン２０ｍｇ／ｄ、Ｃｈ　ｒ　ｏ　ｍｏｚｙｍ　ＴＨ（ヘー リンガーマンハイム）７０ｕＭ賦活剤試薬： 因子ＩＸａ２．５ｎＭ、ＣａＣＩｚ　１５ｍＭ、アルブミン０．　５ｍｇ／ｄ 色素原基質からのバラニトロアニリンの遊離を分光光度計で追跡し、吸光増加０ ．１（吸光単位）に達する時間を決定した。

０　０．０９　０．１　０．０９　０．０９２０．５　０．０９　０．１０２　 ０．０９２　０．０９４１　０．０９２　０．１０５　０．１６６　０．２６４ １．５　０．１０３　０．１３９　０．４３７　０．４３６２　０．１３１　０ ．２７４　０．４５１　０．４４２．５　０．１８１　０．４０７　０．４５５ 　０．４４３　０．２６１　０．４２５　０．４５５　０．４４３．５　０．３ ５４　０．４３　０．４５６　０．４４４　０．４１６　０．４３　０．４５６ 　０．４４Ｌ４．５　０．４２８　０．４３４　０．４５７　０．４４１５　０ ．４３　０．４３４　０．４５７　０．４４１第４図は、吸光増加０．１へ達す る時間は血漿中に存在するヘパリンの量に依存することを示している。

５−　アンセイによるヘパリンの一 実施例１に記載した凝固因子および凝固カスケードは、凝固テストを使用するヘ パリンの測定にも同様に使用することができる。この実施例においては、５■／ ｄ濃度のフィブリノーゲン（カビ）溶液が使用される。増加量のヘパリンを含有 する血漿サンプルが調製され、生理食塩水で１０倍希釈された。サンプル１００ μｌを凝固因子試薬１００μ２と混合した。反応は賦活試薬１００μｌの添加に より開始され、３７°Ｃにおける５分間インキュヘーション後、フィブリノーゲ ン１００μ２が溶液へ添加され、凝固時間が測定された。血漿サンプル中にヘパ リンが多く存在すればするほど凝固時間が増加することを示す投与量応答曲線が 得られる。第５図を見よ。

血漿中のヘパリン（Ｕ／ｄ）　凝固時間（秒）６−　のヘパリンのゞ 次第に増加する量のヘパリン（Ｌｉｑｕｅｍｉｎ、ホフマンラロシュ〕を含んだ クエン酸添加全血のサンプルが調製された。これらサンプルは生理食塩水中１０ 倍希釈され、実施例５に記載と同しにテストされた。凝固時間の測定はＫｏｌｌ ｅｒによるマニュアルフ７り技術（ＨｉａｅｋｅｌＬｅｃｈｎｉｋ）によって実 施された。

ここでも投与量応答曲線が見られた。第６図を見よ。

血中ヘパリン（Ｕ／ｄ）　凝固時間（秒）７−α−ＮＡＰＡＰの“ α−ＮＡＰＡＰ　（Ｎ　（α−ナフタレンスルホニルグリシル）−４−アミジノ −ＤＬ−フェニルアラミンピペリジン、シグマバイオケミカルズ、セントルイス ）の測定のため、増加量のα−ＮＡＰＡＮを含む血漿サンプルが調製され、実施 例１と同じ方法でテストが実施された。以下の応答曲線が得られた。第７図を見 よ。

（以下余白） 表　７ 、血漿中のα−ＮＡＰＡＰ　（ｍＭ）　加水分解速度（ΔＡ／分） ０、　２５　０．　３９ ８−硫−デルマタンの′ 硫酸デルマタン（シグマバイオケミカルズ、セントルイス）の測定のため、実施 例１に記載した凝固因子試薬を修飾した。抗トロンビン■はヘパリン助因子Ｕ　 （１４０ｎＭ）（ダイアグノスチ力、スタブ、フランス）で置きかえた。硫酸デ ルマタンの増加量を有する血漿サンプルが調製され、実施例１と同し方法でテス トが実施された。ここでも投与量応答曲線が得られた。第８図を見よ。

（以下余白） 表　８ ８．２５　１．、１日 本明細書および実施例は例証であり、本発明の限定ではないこと、および本発明 の精神および範囲内の他の具体例はそれ自体当業者に示唆されることを理解すべ きである。

加水分解速度（△Ａ／分） 加水分解速度（△Ａ／分） 刀口水分廟）土圧　（ΔＡ／力ゝ） ４０５ｎｍにおける吸収 凝固時間（秒） 一一−Ｎ）　ω　」 Ｏい　ｃ　ｃ’ｉ　ｏ　σ　Ｏ 凝固時間（秒） 加水分解速度（△Ａ／分） 加水分解速度（ΔＡ／分） 要　約　書 本発明は、抗凝固剤の濃度を、アッセイ混合物中のトロンビン生成の関数として 測定する方法に関する。アッセイ混合物は、２Ｍｌ類の試薬とそして希釈したサ ンプルよりなる。抗凝固性物質を含んでいる希釈した血漿サンプルは、内因系の 精製凝固因子の過剰量、リン脂質および抗凝固性物質によって増強できる弱いト ロンビン阻害剤の組合せである、凝固因子試薬と混合される。次に、賦活剤試薬 である、凝固カスケード賦活剤と塩化カルシウムが混合物へ添加され、そして選 択したインキュヘーンゴン時間後生成したトロンビンが測定される。トロンビン 生成■害と抗凝固活性成分との間の比例関係は、サンプル中の抗凝固活性成分の 濃度の測定を許容する。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．サンプル中の抗凝固剤の濃度を前記サンプル中のトロンビン生成阻害の関数 として測定する方法であって、ａ．前記サンプルを希釈するのに充分な量の緩衝 液を添加すること、 ｂ．前記サンプルを前記サンプル中のトロンビン生成を阻害するのに充分な量の 凝固因子試薬と混合すること、ｃ．凝固カスケードを開始させるのに充分な量の 賦活剤試薬を添加すること、 ｄ．トロンビンと複合体を形成するのに充分な量の緩衝化された検出試薬が添加 すること、 ｅ．前記サンプル中のトロンビン濃度を抗凝固剤の既知量と相関させ、前記サン プル中の抗凝固剤の濃度を決定すること、よりなる前記方法。
2. ２．前記凝固因子試薬は、サンプル中に存在する前記凝固因子の濃度より大きい 与えられた量の凝固因子と、前記因子を安定化するのに充分な量のカルシウムイ オンと、反応を触媒するのに充分な量のリン脂質と、前記サンプル中の血小板因 子４を中和するのに充分な量の硫酸デキストランと、前記サンプル中のトロンビ ン生成を抑制するのに充分な量の弱いトロンビン阻害剤とよりなる請求項１の方 法。
3. ３．前記抗凝固剤は、ヘパリン、α−ＮＡＰＡＰおよび硫酸デルマタンよりなる 群から選ばれる請求項２の方法。
4. ４．前記弱いトロンビン阻害剤は、抗トロンビンＩＩＩ，ヘパリン助因子ＩＩ、 または抗凝固剤によって増強される合成もしくは生理トロンビン阻害剤からなる 群から選ばれる請求項３の方法。
5. ５．前記凝固因子試薬は、サンプル中に存在する前記凝固因子の濃度より大きい 与えられた量の凝固因子と、前記因子を安定化するのに充分な量のカルシウムイ オンと、反応を触媒するのに充分な量のリン脂質と、前記サンプル中の血小板因 子４を中和するのに充分な量の硫酸デキストランとよりなる請求項１の方法。
6. ６．前記抗凝固剤は、ヒルジンおよび合成もしくは生理的トロンビン阻害剤より なる群から選ばれる請求項５の方法。
7. ７．前記凝固因子は、因子Ｘ，因子ＶＩＩＩ，因子Ｖ，因子ＩＩ，因子ＩＸまた は因子ＩＸ−因子ＸＩ複合体よりなる群から選ばれる請求項１の方法。
8. ８．前記賦活剤試薬は、凝固カスケードを活性化するのに充分な量の因子ＩＸａ ，ＣａＣｌ２および不活性タンパクを含んでいる請求項１の方法。
9. ９．前記緩衝化基質試薬は、色素原性、発光原性、螢光原性または電磁性である 請求項１の方法。
10. １０．前記緩衝化試薬はフィブリノーゲンである請求項１の方法。
11. １１．ａ．前記凝固因子試薬を含んでいる第１の容器と、ｂ．前記賦活剤試薬を 含んでいる第２の容器と、ｃ．前記緩衝化試薬を含んでいる第３の容器からなる 請求項１の方法を実施するためのキット。
12. １２．ａ．前記凝固因子試薬および緩衝化試薬を含んでいる第１の容器と、 ｂ．ある凝固因子試薬を含んでいる第２の容器からなる請求項１の方法を実施す るためのキット。