JPH08501682A

JPH08501682A - 定量トロンビン時間についての試験

Info

Publication number: JPH08501682A
Application number: JP6501586A
Authority: JP
Inventors: レイド，トーマス; アルビング，バーバラ
Original assignee: デパートメントオブジアーミー，ユー．エス．ガバメント
Priority date: 1992-06-05
Filing date: 1993-06-03
Publication date: 1996-02-27
Also published as: EP0643727A4; AU4768193A; WO1993025578A1; WO1993025220A1; CA2137342A1; EP0643727A1; AU4405293A

Abstract

(57)【要約】トロンビン特異的インヒビターの血漿レベルを測定するための定量方法は、血漿希釈液、過剰のフィブリノーゲンおよびトロンビンを用いる定量トロンビン時間に基づく。血漿希釈液、および過剰のフィブリノーゲンは、協調して作用し、標準凝固試験において凝固障害が及ぼす影響を除去する。本発明の方法は、比較的簡素であり、そして標準的な従来の方法に対して優れた結果を与える。本発明の方法は、市販の設備を用いる、臨床血液学検査室でのルーチン業務のために適切である。

Description

【発明の詳細な説明】定量トロンビン時間についての試験発明の分野本発明は、抗凝固剤治療のモニターの際に有用な検査室試験に関する。さらに詳細には、本発明は、酵素トロンビンを阻害することで知られる抗凝固剤についてのアッセイに関する。発明の背景現在、トロンビン特異的インヒビターは、動脈血栓症（冠状動脈血管形成後）および深在性静脈血栓症の治療ための抗凝固薬物として臨床試験中である。これらの薬物の特異性は、２ピコモル／Ｌ〜２ナノモル／Ｌの範囲の解離定数に反映される。トロンビン特異的インヒビターは、動脈血栓症および静脈血栓症の治療および予防の両方について、動物モデルで効果があることが証明されている。医薬用ヒルのHirudo medicinalis由来の組換えヒルジンは、最も研究されているトロンビン特異的インヒビターである。ヒトにおける治療上の血漿レベルの有効量および有効量の範囲が測定されている。この範囲の下限および上限は、それぞれ静脈血栓症および動脈血栓症について用いられる。いくつかの米国特許が、医薬として、または移植可能な材料に結合して使用するための抗トロンビン剤に関して発行されている。Eschenfelderらの米国特許第 4,944,943号は、血栓症治療のためのヒルジンおよびt-PAの使用を教示している。Kleinらの米国特許第4,952,562号は、抗血栓性ペプチドおよび偽ペプチド（pseudopeptide）を開示している。Itoらの米国特許第5,019,393号は、血栓形成インヒビターをその上に固定した移植可能な材料の使用を教示している。Kuの米国特許第5,053,453号は、血栓の形成を避けるために、支持材料に共有結合により結合されたヒルジンまたはヒルジン誘導体を開示している。Kleinらの米国特許第5,640,814号は、医薬として投与するための抗血栓性ペプチドを開示している。Courtneyらの米国特許第5,087,613号は、トロンビン活性のインヒビターとして使用するためのヒルジン変異体を開示している。米国特許第5,095,092号は、ヒルジンの単離および精製のための方法を開示している。引用した特許のいずれも、本明細書中で教示する定量トロンビン時間試験を開示していない。新規のトロンビン特異的インヒビターを摂取した患者が治療的に抗凝固化されているか否かを調べるために、いくつかの方法が現在用いられている。高速液体クロマトグラフィー（HPCL）により血漿トロンビン特異的インヒビターレベルを測定することが可能である。正確ではあるが、HPCLは一般に大きな委託病院（ referral hospital）および商業的検査室でのみ利用可能であり、そして従業員の高レベルの専門知識を必要とする。大きな委託病院で利用可能であるときでさえ、この手法には時間がかかる。このため、結果を得るのが遅れる。この遅れは、臨床の開業医が患者の経過を綿密にモニターし、そしてコントロールしようとしているときには、許容できない。他のアプローチは、活性化された部分的トロンボプラスチン時間（APTT）の延長をモニターすることてある。APTTは、凝固系の標準的なスクリーニング試験である。この試験は、通常、抗凝固性ヘパリンを受ける患者における抗凝固の程度を経過観察するために用いられる。しかし、特異的トロンビンインヒビターが存在しない場合には、種々の凝固障害（例えば、分離因子欠損症または重複因子欠損症、異常フィブリノーゲン、減少したフィブリノーゲン濃度または抗リン脂質抗体）によって、APTTの結果が延長する傾向がある。ネフローゼ症候群または狼瘡抗凝固（Iupus anticoagulant）に関連する凝固障害を有する患者のなかにはまた、抗凝固剤を用いる治療を必要とする血栓症を発病（develop）する者がいる。これらの場合には、APTTはすでに延長しており、そしてトロンビン特異的インヒビターを用いて抗凝固をモニターするために使うことはできない。他の凝固アッセイである、標準トロンビン時間は、ヘパリンおよび異常レベルまたは低レベルのフィブリノーゲンの存在を測定するために、臨床検査室で日常的に定性的に用いられる。標準トロンビン時間が、現在開発されているように、これらのインヒビター以外の因子に対して固有の感度を有するため、標準トロンビン時間は血中のトロンビン特異的インヒビター濃度を定量するためには有効ではなく、用いられていない（Walenga JMら、Seminars in Thrombosis Hemostasiｓ17:103,1991）。さらに、肝臓疾患、異常フィブリノーゲン血症、低フィブリノーゲン血症を有する患者、またはフィブリン溶解性治療を受けた患者から得られた血漿は、延長した標準トロンビン時間を生じ得る。 HPLCおよびAPTT以外には、トロンビンについてのアミドリティック（amidolyt ic）アッセイおよびヒルジン−トロンビン複合体についての免疫学的アッセイを包含する、さらなる方法が示唆されている。しかし、これらの技法は、臨床検査室では、容易に適用されない。トロンビン特異的インヒビターの潜在的な治療効力のため、現在利用可能な設備を有する臨床検査室で行い得る、血漿レベル測定のための、新規の改良された試験が必要である。さらに、臨床の開業医が容易に判断し得る結果を与え得る、このような新規な方法は、非常に有用である。発明の要旨トロンビン特異的インヒビター（TSI）治療において患者をモニターするための、新規の臨床的に有用な試験、TSIのトロンビンに対する特異性に基いた、トロンビン特異的インヒビターを用いて抗凝固を管理するための定量トロンビン時間（QTT）を、本明細書中で開示し、そして請求の範囲とする。本発明の目的は、標準的試験（APTTおよび標準トロンビン時間、前出参照）を延長させる異常血漿の存在に影響されないが、トロンビン特異的インヒビターの存在に対しては感受性があるトロンビン時間を測定する方法を提供することである。本発明の他の目的は、インヒビターの治療範囲についての標準曲線をQTTを用いて作成することにより、トロンビン特異的インヒビターの未知の血漿濃度を測定し得る方法を提供することである。関連する目的は、標準トロンビン時間を測定するために通常用いられる検査室の装置で、容易に行われ得る方法を提供することである。図面の簡単な説明図１は、血漿および異常血漿における定量トロンビン時間における精製フィブリノーゲン濃度の影響を示す。図２は、QTTにおけるヘパリン濃度の影響を示す。図３は、定量トロンビン時間を用いる、組換えヒルジンについての標準曲線である。図４は、APTTにおける組換えヒルジン濃度の影響を示す。発明の詳細な説明本発明は、外因性フィブリノーゲンおよびトロンビンの存在下で、トロンビン時間を特異的に測定することにより、トロンビン特異的インヒビターの血漿レベルを定量に測定する新規の方法を提供する。正常な血漿および凝固障害を有する血漿は、QTTにより試験されるときには、トロンビン特異的凝固時間に関して同じベースラインを有する。凝固障害を有する患者由来の血漿における因子の妨害している影響を除去することにより、QTTの延長は、サンプル中に存在する現出（presence）トロンビン特異的抗凝固剤にのみ依存し、従って、トロンビン時間に影響を与え得る他の血漿異常とは無関係に、抗凝固剤の評価のための方法を提供する。抗リン脂質抗体および因子欠損症のような異常の影響を除去するために、リン脂質に基づくAPTTを、リン脂質およびフィブリノーゲン以外の凝固因子とは無関係なトロンビンに基づくアッセイのために放棄した。血漿中に存在し得る、フィブリン分解生成物、ヘパリン、および異常フィブリノーゲンまたは減少したフィブリノーゲンのみが、アッセイを妨害し得た。これらの異常の影響は、緩衝液中に血漿を1:10に希釈し、そして過剰のフィブリノーゲンを添加することにより除去し得る。開発された本発明の試験は、他のトロンビン特異的インヒビターを用いるときも有効であることが示されたが、本明細書中で開示した試験で例示されるインヒビターは、組換えヒルジンであった。定量性を、既知の治療範囲内の種々の濃度で正常血漿に組換えヒルジンを添加することによって試験した。次いで、QTTをこれらの血漿を用いて試験し、そしてlog（QTT）と組換えヒルジン濃度との間に直線関係が示された。これにより、血漿中の組換えヒルジン濃度の測定が可能になった。QTTの特異性を、既知の濃度の組換えヒルジンを、凝固障害（延長したA PTTおよび／または標準トロンビン時間）を示す患者の血漿サンプルに添加することにより評価した。次いで、組換えヒルジンレベルの期待値および観測値を比較し、そして組換えヒルジンに関して患者を臨床モニターする際のQTTの使用に適合することが示された。比較評価により、APTTは、本発明の方法により与えられる特異性を与えないことが示された。本発明の方法は、２つの異なる市販の装置を用いて行われ、そして同等の結果を得た。方法および材料材料：血漿は異常な凝固のスクリーニングの研究の評価のために凝固検査室（coagul ation laboratory）に提出されたものであり、Human Use Committee of the Wal ter Reed Army Institute of Researchに承認されたプロトコルに基づくインフォームドコンセントを受けた健康なボランティア由来のものであった。ヒトα− トロンビン（比活性2,000〜4,000 NIHユニット／mgタンパク質）、組換えヒルジン（比活性8,500ユニット／mgタンパク質）、およびレプチラーゼ（reptilase ）（ATROXIN）はSigma Chemical Company （St Louis, MO）から購入した。ヒトフィブリノーゲンはKabiVitrum（Stockholm, Sweden）から入手した。APTT試薬はOrganon Teknika Corporation （Durham, NC）から購入した。ヘパリンナトリウム（1000 U/mL）はElkins-Sinn,Incorporated （Cherry Hill, NJ）から購入した。血液サンプルの調製：血液サンプルを、凝固剤として抗凝固剤１部に対して血液９部の割合で、秤量したクエン酸を入れたプラスチック試験管中に採取した。各サンプルを4℃で２０分間、10,000×ｇで遠心分離して、血小板の少ない血漿を得た。これを、次に、使用時まで−70℃で保存した。標準トロンビン時間：トロンビン時間は、血漿100μLおよびVS緩衝液（下記参照）100μLに5U/mLの α−トロンビン溶液100μLを添加した後、血餅形成までの時間を測定した。data clot-2 fibrometer（Helena Laboratories, Beaumont, TX）またはST4凝固装置（Diagnostica Stago, Parsippany, NJ）のいずれかを用いた。定量トロンビン時間（QTT）：ヒトα−トロンビンを、ベロナール−生理食塩水−カルシウム（VSC）緩衝液（ジエチルバルビツール酸ナトリウム2.8mM、塩化ナトリウム100mM、塩化カルシウム２５mM、pH7.35）（これは、ヒト血清アルブミンも１％含有する）で、2.5 〜20 U/mLの濃度に希釈した。フィブリノーゲン濃度（0．1〜18μM）をVS緩衝液（カルシウムを含まないこと、および塩化ナトリウム濃度が１44mMであること以外はvsc緩衝液と同様である）中で作製した。血漿サンプルはvs緩衝液中で1:10 に希釈した。この血漿希釈液、α−トロンビン溶液、およびフィブリノーゲン溶液を、使用前に、それぞれ別に、37℃で６分間インキュベートした。血漿サンプルおよびフィブリノーゲンの等量を混合し、37℃で１分間インキュベートした。この血漿−フィブリノーゲン混合物を200μL取り、アッセイウェルに入れた。トロンビン時間を、α−トロンビン溶液100μLを添加した後、血餅形成までの時間として測定した。標準トロンビン時間を測定するために用いた装置を、QTTを測定するためにも用いた。APTTアッセイ： APTTアッセイは、CP-8 photooptic coagulation profiler（BIODATA Corporat ion, Willow Grove, PA）を用いて行った。血漿100μLをAPTT試薬100μLと共に６分間インキュベートした。APTTは25mM CaCl₂を100μL添加した後、血餅形成までの時間として測定した。レプチラーゼ時間：レプチラーゼ時間はdataclot-2 fibrometerを用いて行った。再生レプチラーゼ100μLを血漿200μLに添加し、そして凝固時間を記録した。標準曲線の測定のための血漿サンプルの調製：組換えヒルジン（凍結乾燥調製）をプールした正常血漿で希釈して、濃度を50 μg/mLにした。正常血漿でさらに希釈して、治療範囲（0．1〜3μg/mL）内の濃度を得た。標準曲線： QTTの対数を計算し、そして組換えヒルジン濃度（μg/mL）に対してlog（QTT ）をプロットし、線形回帰を行って、標準曲線を作成した。この標準曲線から、組換えヒルジンの未知の血漿レベルを測定し得る。QTTにおけるヘパリン濃度の影響を測定するための血漿サンプルの調製：ヘパリン（初期濃度1000u/mL）をプールされた正常な血漿で希釈して、濃度を 10U/mLにした。血漿でさらに希釈して、0．１〜８U/mLのヘパリン濃度を得た。正常血漿サンプル中のQTT： 20人の正常な個体（男性10人、女性10人）由来のQTTの結果を表１に示す；すべて、正常な標準トロンビン時間およびAPTTを有していた。 QTTにおけるフィブリノーゲン濃度の影響：血漿および異常血漿における定量トロンビン時間における精製フィブリノーゲン濃度の影響を測定した。定量トロンビン時間において、異なるフィブリノーゲン濃度を用い、どの濃度で異常血漿の影響が排除されるかを測定した。手順：血漿を緩衝液で1:10に希釈した；この希釈した血漿１００μLを精製ヒトフィブリノーゲン100μLに異なる濃度（0．1〜18μM）で添加し、そして30秒間インキュベートした； 5U/mLのヒトα−トロンビン100μLを添加し、反応を開始させた；凝固時間を測定した。アッセイへの過剰量のフィブリノーゲンの添加により異常フィブリノーゲン（図１）および低フィブリノーゲン（図１、挿入）の影響が除去された。異常フィブリノーゲンの血漿（異常フィブリノーゲン血症：標準トロンビン時間＝45．2秒および18．5秒［正常は11〜14］、レプチラーゼ時間＝22．6秒および15．5秒［正常は8〜11］）、低フィブリノーゲン（低フィブリノーゲン血症：フィブリノーゲン＝38mg/dL［正常は200〜400］）の血漿、ならびに増加したフィブリン分解生成物（FDP＝1024μg/mL ［正常＜10μg/mL］）および低フィブリノーゲン（フィブリノーゲン＝112mg/dL）の血漿を評価した。最適フィブリノーゲン濃度は9〜18μMと測定された。この濃度は、異常血漿サンプルの影響を克服するためには充分以上であった。QTTにおける血漿の（緩衝液での）希釈の影響：血漿サンプルを緩衝液で1:10に希釈することで、フィブリン分解生成物の影響および治療上のヘパリンレベルが低減される（表２）。抗リン脂質抗体の存在はこのアッセイを妨害しなかった。手順：血漿を緩衝液で1:10に希釈した；希釈血漿100μLを9μMの精製ヒトフィブリノーゲン100μLに添加し、30秒間インキュベートした； 5U/m Lヒトα−トロンビン100μLを添加し、反応を開始した；凝固時間を測定した。 QTTにおけるヘパリンの影響種々の濃度のヘパリンを加えた正常血漿を、QTTについて試験した。手順：血漿に豚のヘパリンを異なる濃度（0.1-10U/mL）で加えた；これらの血漿を緩衝液で1:10に希釈した；この希釈血漿100μLに９μMの精製ヒトフィブリノーゲン100 μLを添加し、30秒間インキュベートした；5U/mLのヒトα−トロンビン100μLを添加して、反応を開始した；凝固時間を測定した。QTTは0．8U/mLでヘパリンに対して感受性を示した（図２）。ヘパリンの治療範囲は0．3〜0．5U/mLである。QTTを用いた組換えヒルジンの標準曲線：異なる既知の血漿中の組換えヒルジン濃度に関して、定量トロンビン時間を測定した。標準曲線は、組換えヒルジン濃度に対してLog（定量トロンビン時間）をプロットすることにより作成した。手順：血漿に精製組換えヒルジンを異なる濃度（0．1〜1．75μg/mL）で加えた；これらの血漿を緩衝液で1:10に希釈した；この希釈血漿100μLに９μMの精製ヒトフィブリノーゲン100μLを添加し、30 秒間インキュベートした；ヒトα−トロンビン（5U/mL）100μLを添加して、反応を開始した；凝固時間を測定した。組換えヒルジンのアッセイの開発において、いくつかのトロンビン濃度について試験を行った。低トロンビン濃度は、組換えヒルジンの治療上の高血漿レベルに対して感度が高すぎ、一方高トロンビン濃度は治療上の低レベルに対して感度が低かった。組換えヒルジンの治療範囲のすべてにわたって有効なトロンビン濃度はなかった。従って、組換えヒルジンの低治療範囲（0.1 〜1.75μg/mL）において感受性のトロンビン濃度（5U/mL）を選択した（図３）。ヒルジンを含まない血漿のデータの点は標準曲線には含まなかった。1.75μg/ mLより高濃度のヒルジンをアッセイするためには、アッセイにおいて1:10希釈する前に、プールした血漿で１：１希釈を行うことが必要であった。QTTのための最適条件は：１：10血漿希釈液１00μL、９〜18μMフィブリノーゲン100μL，およびα−トロンビン（5U/mL）100μLであった。組換えヒルジンの血漿濃度の測定におけるQTTの有効性：血漿組換えヒルジンレベルの測定におけるQTTの有効性を既知濃度の組換えヒルジンを異常および正常なプールした血漿に加えることにより評価した。QTTを測定し、そして上記の標準曲線から組換えヒルジン濃度を測定した。表３は、標準トロンビン時間を延長し得る多くの凝固障害が、QTTにより測定された組換えヒルジンレベルの測定を妨害しないことを示す。手法：血漿に異なる濃度の精製組換えヒルジンを加えた（0．1〜1．75μg/mL）；これらの血漿を緩衝液で1：10に希釈した；100μLの希釈血漿を100μLの９μM精製ヒトフィブリノーゲンに加え、そして30秒間インキュベートした；100μLの5U/m Lヒトα-トロンビンを加えて反応を開始した；凝固時間を測定した。APTTを用いる組換えヒルジンのための標準曲線：組換えヒルジン濃度のAPTTへの影響を測定した。正常血漿に種々の濃度の組換えヒルジンを加え、そしてAPTTを測定した。手法：血漿に異なる濃度（0．1〜4μg/mL）の精製組換えヒルジンを加えた；100μL のAPTT試薬を、組換えヒルジンを加えた100μLの血漿に加え、そして６分間インキュベートした； 100μLの２５ｍM CaCl₂を加えて反応を開始した；凝固時間を測定した。図４は、APTTが組換えヒルジンの治療範囲の下限では有用でないことを示す。手法：血漿に異なる濃度（0．1〜4μg/mL）の精製組換えヒルジンを加えた；100μL のAPTT試薬を、組換えヒルジンを加えた100μLの血漿に加え、そして６分間インキュベートした； 100μLの25mM CaCl₂を加えて反応を開始した；凝固時間を測定した。表４は、狼瘡性抗凝固因子、異常フィブリノーゲン、ヘパリン、およびフィブリン分解生成物の存在が、組換えヒルジンに対するAPTTアッセイを妨害することを決定的に示している。組換えヒルジンを加えた異常血漿を用いるQTTおよびAPTTの結果の比較 QTTを用いる異常血漿中の組換えヒルジンの濃度の測定についての平均誤差は、10％より低かった。これに対して、同じ血漿を用いて、標準APTTを用いた組換えヒルジンの測定濃度は、期待値との一致を示さなかった（表５）。トロンビン特異的インヒビターであるヒルジンおよびそのアナログが、前臨床研究において血栓症の予防に有効であることが証明されている。抗凝固効果は、 APTTによりモニターされた。なぜなら、標準トロンビン時間が試薬に対する感度が高すぎて臨床的に有用でないからである。APTTは、組換えヒルジンのモニターへの有用性を制限する２つの主要な問題を有する：１）長いベースラインAPTTを有する患者を追跡できない（これは、ヘパリン治療を受けている患者についても当てはまる）；および２）APTTに関して、低治療レベルの組換えヒルジンでは、非直線的な用量応答である（図４）。APTTを用いて低治療範囲における治療をモニターすることの臨床的重要性は、特定の臨床状態に対する過剰な抗凝固作用である。発明者らは、APTTおよび標準トロンビン時間に関連する固有の困難性を除いた定量的トロンビン時間が開発された。本発明が解決するように設計された問題は、治療上のヘパリンレベル、低レベルのフィブリノーゲン、異常フィブリノーゲンおよびフィブリン分解生成物、狼瘡性抗凝固因子（抗リン脂質抗体）、および低血漿因子レベルへの標準試験の感度である。本発明のいくつかの新規な局面は、１）異常または低フィブリノーゲンを補うための過剰なフィブリノーゲンの添加、および２）血漿サンプルを緩衝液で1:10 に希釈して、フィブリン分解生成物、異常フィブリノーゲンおよびヘパリンの妨害を効果的に防ぐこと、を含む。本発明のいくつかの異なった利点がある。この方法は、簡単であり、そしてトロンビン時間を日常的に測定する任意の検査室（ほとんどの病院）で行われ得る。この手順は、特に、臨床検査室で現在利用できる機器での使用に適している。トロンビン時間の測定に用いられる新しい自動化装置および方法は、本発明の実施に用いられ得る。この方法はまた、迅速であり、そして臨床検査室で既に利用されている上記の他の専門的技術を必要としない。少量の患者の材料が必要である（４回の試験につき25〜50μLの血漿）；標準試験では１回の試験につき100μLが必要である。この方法は、他のトロンビン特異的インヒビターと共に使用するための組換えヒルジンおよび他のトロンビン特異的インヒビターの血漿レベルの定量を可能にする（例えば、組換えヒルジンの合成または半合成アナログ）。平均誤差は、 10％より低い。標準曲線は治療範囲では直線である。標準試験は、低治療範囲で直線でないか（APTT）、または組換えヒルジンに対して感度が高すぎるか（標準トロンビン時間）のいずれかである。この方法は、組換えヒルジン濃度に対する凝固時間の応答により示されたように、標準試験に比べてトロンビン特異的インヒビターに対してより感度が高い。結局、この試験にはあまり費用がかからず、そしてHPLCに比べて速い。正常ヒトトロンビンを例として手法に用いたが、特定のトロンビン特異的インヒビターに対してその濃度を測定するために試験する場合には、代わりのトロンビンが信頼性のある用量曲線を提供する限りは、他の供給源由来の変異または正常トロンビンをQTTにおいて使用し得る。同様に、フィブリノーゲンは、TSIに対して試験される場合に信頼性のある用量曲線を提供する限りは、任意の供給源由来であり得る。 QTT用の材料は、キットとして販売され得る。以下の成分はキット中に提供され得た：１）硫酸プロタミンを含み得る既知量のトロンビン特異的インヒビター（TSI）を含有する凍結乾燥した血漿の１つまたはそれ以上のバイアルが提供されるべきである。TSIの最終濃度が、TSIについての系列希釈が治療範囲内で行われるように、バイアルの内容物を水で再構成し得る。硫酸プロタミンの添加は、反応液からヘパリンを効果的に除去するのに用いられ得る。硫酸プロタミンを用いる場合、最終希釈のTSI含有溶液中の好ましい濃度は、約120μg/mLである。しかし、例えば、TSIは貯蔵溶液として検査室で利用され得る。２）アルブミンなどの安定化剤と共に処方され得、そして緩衝液を含有し得る凍結乾燥したα-ロンビンの１つまたはそれ以上のバイアルが提供されるべきである。トロンビンは水で再構成されて、所望の濃度を提供され得た。３）約4．75μM（160mg/dL）の最終濃度に再構成されるべき凍結乾燥したフィブリノーゲンの１つまたはそれ以上のバイアル。血漿は、硫酸プロタミンなどの中和剤を含み得る。所望であれば、キットは別のバイアルの硫酸プロタミンを有し、患者がヘパリン治療中である場合にサンプルと共に用いられる。４）サンプルを希釈するための緩衝液のバイアルが含まれ得る。キットの品目を用いて、以下の手法が行われ得る。好ましい実施態様では、標準曲線が作成されて、以下の方法によりTSIの有効レベルを同定し得る：ａ．既知濃度での正常血漿中のトロンビン特異的インヒビターの系列希釈液を調製して、サンプルを提供する工程（しかし、適切な範囲内で種々の量のTSIを含むキットは、この手法を回避する）。ｂ．緩衝液で該サンプルを希釈して、1:10希釈液を提供する工程。ｃ．希釈液を精製ヒトフィブリノーゲンの９〜18μM溶液と混合して、サンプルを提供する工程。ｄ．精製ヒトα-トロンビンの5U/mL溶液を工程ｃのサンプルに加えて、溶液を提供する工程。ｅ．工程ｄの溶液の凝固時間を測定する工程。ｆ．工程ｅから得られた結果から標準曲線をプロットする工程。患者の血漿中のTSI濃度レベルを、以下の方法で試験して、患者のTSIレベルを測定した：１．トロンビン特異的インヒビターを投与されている患者からの血漿サンプルを緩衝液で希釈して、緩衝液に対して1:10の血漿の濃度を提供する工程。２．この患者のサンプルをフィブリノーゲンの溶液と混合する工程。３．工程２で調製した患者のサンプルにトロンビン溶液を加える工程。４．工程３の溶液の凝固時間を測定する工程。５．既に作成されている標準曲線を用いて患者のサンプル中のインヒビターの濃度を測定する工程。本発明はまた、患者の血漿よりもむしろ全血液を用いて実施され得る。標準曲線を作成するのに必要な種々の量のTSIを含むバイアルは、TSIを希釈することにより作られて、曲線を測定するのに用いる種々の希釈液を提供する。正常血漿は緩衝化水で希釈することにより再構成されて（または、緩衝液は希釈液中に添加され得る）、種々の濃度のTSIを提供する。血漿のみを含む第２のセットの容器を、比較のために調製する。第３の容器を、未知濃度のTSIと共に1mLの患者の血漿を含むように調製する。各サンプルに475μLの再構成化フィブリノーゲン溶液および50μLの再構成化トロンビンを加える。次いで、凝固時間を測定する。ａからｆの工程は、TSIの活性を評価するための調査手段として用いられ得る。しかし、種々の濃度の特定のTSIのQ TTへの影響についてよく知られるほど、曲線を得るための標準物の連続的分析（ running）は不必要であり得る。例えば、比較試験を行うことなくQTTのみで、従事者が血液中のTSI濃度を評価するのに十分である。代替のものとして、キットはフィブリノーゲンおよびトロンビンのみを含み得る。一方、血漿中に適切な濃度のTSIを含む１つまたはそれ以上の貯蔵溶液は、試験に用いるために維持される。（試験されるべき最も高いレベルの１つの貯蔵濃度を有することも可能であり、これは希釈して、適切な曲線を提供するのに用いるためにより低い濃度を提供する。）貯蔵溶液を用いること、または異なる量のTSIを含む多くのTSIのバイアルを提供することの範囲は、試験するサービスを提供するのに利用できる任意の特定のヘルスケアセンターおよび質の良い職員で行う多くの試験に依存する。すべての成分、血漿、トロンビン、およびフィブリノーゲンは、効力の損失を避けるために、新鮮なものを使用するべきであり、または凍結させるべきである。TSIを有する血漿、正常血漿、トロンビン、およびフィブリノーゲンを含む、使用されるすべての試薬は、再構成用のバイアル中に凍結乾燥材料として提供され得る。一旦再構成すると、活性成分は容易に不活性化する。本発明に適切な使用の中には、トロンビン特異的試薬で抗凝固化した患者を定量的に臨床モニターすることおよび血栓症の動物モデルでの実験室の研究を包含する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者レイド，トーマスアメリカ合衆国メリーランド 20850, ロックビル，カーネーションドライブ 1038 (72)発明者アルビング，バーバラアメリカ合衆国メリーランド 20817, ベセスダ，ニューボールドコート３

Claims

【特許請求の範囲】１．酵素トロンビンの特異的なインヒビターの血漿レベルを定量する方法であって、以下の工程を包含する方法：ａ．既知濃度のトロンビン特異的インヒビターの系列希釈液を調製して、サンプルを提供する工程、ｂ．工程ａで調製したサンプルを精製ヒトフィブリノーゲンと混合する工程、ｃ．精製ヒトα−トロンビンを工程ｂで調製したサンプルに加える工程、ｄ．工程ｃの溶液の凝固時間を測定する工程、ｅ．工程ｄから得られた結果に基づくTSIの効果から標準曲線をプロットする工程、ｆ．トロンビン特異的インヒビターを与えられた患者由来の血漿サンプルを希釈する工程、ｇ．患者サンプルを工程ｆのフィブリノーゲン溶液と混合する工程、ｈ．トロンビン溶液を工程ｇで調製した患者サンプルに加える工程；ｉ．工程ｈの溶液の凝固時間を測定する工程；ｊ．標準曲線を用いて患者サンプル中のインヒビターの濃度を測定する工程。２．前記工程ｆが、低治療レベルの前記インヒビターで感度（グラフの直線性）を維持することを包含する、請求項１に記載の方法。３．さらに、血漿中の治療上のヘパリンレベルの影響が、中和剤の添加により回避される、請求項１に記載の方法。４．前記中和剤が硫酸プロタミンである、請求項３に記載の方法。５．トロンビン特異的インヒビターの適切な用量を評価する方法であって、以下の工程を包含する方法：ａ．既知濃度のトロンビン特異的インヒビターの系列希釈液を調製して、サンプルを提供する工程、ｂ．工程ａで調製したサンプルを精製ヒトフィブリノーゲンと混合する工程、ｃ．精製ヒトα−トロンビンを工程ｂで調製したサンプルに加える工程、ｄ．工程ｃの溶液の凝固時間を測定する工程、およびｅ．工程ｄから得られた結果に基づくTSIの効果から標準曲線をプロットする工程。６．以下のものを含有するキット：１．少なくとも１本の凍結乾燥したフィブリノーゲンのバイアル、２．少なくとも１本のトロンビンを含むバイアル、および３．QTTを評価する指示書。７．さらに、少なくとも１本の血漿のバイアルを含む、請求項６に記載のキット。８．さらに、少なくとも１本のトロンビン特異的インヒビターのバイアルを含む、請求項６に記載のキット。９．定量的なトロンビン時間を測定する方法であって、以下の工程を包含する方法：（1）緩衝液中に血漿を含む組成物を調製して、緩衝液に対して約1:10の血漿の濃度を得る工程；（2）緩衝液中に約0.1μMから18μMの濃度のフィブリノーゲンを含むフィブリノーゲン混合物を調製する工程；（3）緩衝液中に約2.5U/mLから20U/mLの濃度のα−トロンビンを含む組成物を調製する工程；（4）工程（1）および（2）で得られた等量の組成物を含有する混合物を調製する工程；（5）工程（4）で調製した混合物のアリコットおよび工程（3）で調製した混合物のアリコットをアッセイウェル中に配置する工程；および（6）血餅形成に必要な時間を測定する工程。１０．前記工程（2）で調製した前記混合物が、緩衝液中で９μMから18μMのフィブリノーゲンの濃度である、請求項９に記載の方法。１１．緩衝液中に血漿、精製ヒトフィブリノーゲン、およびα−トロンビンを含む物質の組成物。１２．前記α−トロンビンが、ヒトα−トロンビンである、請求項１１に記載の組成物。１３．前記フィブリノーゲンが、0．1μMから18μMの濃度で存在する、請求項１１に記載の組成物。１４．前記フィブリノーゲンが、3μMと18μMとの間の濃度で存在する、請求項１３に記載の組成物。１５．前記工程（5）において、反応成分の割合が、前記工程（3）で得られた混合物１部に対して前記工程（4）で得られた混合物２部である、請求項９に記載の方法。