JP2012141310A - 凝固阻害剤の測定法 - Google Patents

Abstract

【課題】空間的に密に近接するが故に相互作用し且つ検出可能なシグナルを生成する２つの成分を用いる、抗凝固剤を測定するための改良された方法であって、任意のシグナル系成分との会合のための２以上の人工的な残基を有する必要がない低分子リガンドを使用し得る方法を提供する。
【解決手段】抗凝固剤を含有すると思われる試料の一部標本を、規定量のタンパク質分解活性凝固因子及びこのタンパク質分解活性凝固因子の活性部位に結合するが該因子によりペプチド結合において切断されないリガンドと、混合すること、並びに、前記活性化された凝固因子への前記リガンドの結合の結果として、シグナル生成系により発生されるシグナルを測定する。
【選択図】図１

Description

本発明は、凝固診断の分野の発明であり、試料中のタンパク質分解活性凝固因子の阻害剤（抗凝固剤）、特にトロンビン及び第Ｘａ因子に対する直接的阻害剤、を均質に測定するための方法、並びに、このような方法において使用される試験キットに関する。

一般的な抗凝固療法は、主として凝固促進因子トロンビン（第ＩＩａ因子、ＦＩＩａ）及び第Ｘａ因子（Ｆ Ｘａ）を阻害することを目的とする。例えば、凝固因子合成の阻害をもたらすクマディン等のビタミンＫアンタゴニストによる経口的抗凝固と、血流中の活性凝固因子の阻害による抗凝固とは、区別される。血流中の活性凝固因子を阻害又は不活性化する抗凝固剤のうちでは、直接的作用を有する抗凝固剤と、間接的作用を有する抗凝固剤とは、区別される。例えばリバロキサバン、ダビガトラン又はメラガトランといった、直接的作用を有する抗凝固剤は、トロンビン又は第Ｘａ因子に結合し、それ故、高度に特異的である。例えばヘパリン類等の、間接的作用を有する抗凝固剤は、例えばアンチトロンビン等の内因性凝固因子阻害剤に結合し、その抗凝固作用を何倍にも増幅する。

血流中で活性凝固因子を阻害する全ての抗凝固剤は、特定の不活性化パターンによって区別される。ある種類の物質、例えば、未分画の高分子ヘパリン、は、トロンビン及び第Ｘａ因子の双方を阻害する。別の物質は、非常に特異的に作用し、それ故、トロンビン（例えば、ヒルジン、ダビガトラン、メラガトラン）又は第Ｘａ因子（例えば、フォンダパリナックス、リバロキサバン等の五糖類）のいずれかを阻害する。

血液凝固系の中心的な凝固促進因子である第Ｘａ因子及びトロンビンの直接的又は間接的阻害剤は、心臓血管疾患及び血栓塞栓障害の治療及び予防においてますます大きな役割を果たしている。これらの阻害剤は、現在の確立されたアッセイ法では、非常に複雑な方法でのみ検出可能である。前記物質のための簡単で感度のよいアッセイが、治療のモニタリングにも、未知の患者試料中の前記物質の検出にとっても、重要となるであろう。これらのアッセイは、比較的多数の構造的に関連のないトロンビン又はＦ Ｘａ阻害剤を、非常に感度のよい方法で、検出し得る必要がある。

抗凝固剤の測定に現在使用されている発色アッセイは、通常、血漿からなる分析すべき患者試料を、凝固因子の基質と混合することを含む。殆どの血液凝固因子は、セリンエンドペプチダーゼ、即ち、ペプチド結合を切断し得る加水分解酵素、であることから、検出すべき血液凝固因子によって可能な限り特異的に切断され且つ検出可能なシグナル基を有するペプチド基質が、主として利用される。市販もされている確立された発色アッセイは、特に、４０５ｎｍに吸収ピークを有する発色団、パラ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）及び５−アミノ−２−ニトロ安息香酸（ＡＮＢＡ）、を用いる。生じた黄色を、通常、測光的に測定する。抗凝固剤の測定では、アッセイ混合物中の色濃度は、試料中の抗凝固剤濃度に反比例する。

血液凝固因子の活性を阻害する抗凝固剤を測定するために現在適用されている発色アッセイの第１のグループでは、検査すべき患者試料を、通常、規定量の活性化された凝固因子及びこの凝固因子の基質と混合する。試料中に抗凝固剤がより多く存在するほど、活性化された凝固因子は、より多く阻害され、基質の分解は、より少なくなる。このアッセイ原理に基づく市販のアッセイの例は、添加された第Ｘａ因子の阻害に基づくヘパリン測定のためのシーメンス ヘルスケア ダイアグノスティクス（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）によるベリクロム（Ｂｅｒｉｃｈｒｏｍ（登録商標））ヘパリンアッセイ、又は添加されたトロンビンの阻害に基づくヒルジン測定のためのシーメンス ヘルスケア ダイアグノスティクスによるヒルジン活性アッセイである。

抗凝固剤を測定するために現在適用されている発色アッセイの第２のグループでは、検査すべき患者試料を、不活性凝固因子、凝固活性化剤及び凝固因子用の発色性基質と、混合する。凝固活性化剤の添加により、最初に、添加された不活性凝固因子が活性化される。試料中に、より多くの抗凝固剤が存在するほど、活性化された凝固因子が、より多く阻害され、基質は、より分解されなくなる。このアッセイ原理に基づく市販のアッセイの例は、合成直接的トロンビン阻害剤のための、イエナフィン（ＪｅｎＡｆｆｉｎ）からのヘモシス（Ｈａｅｍｏｓｙｓ（登録商標））−ＥＣＡ Ｔアッセイ、又は、凝固活性剤としてのプロトロンビン及びエカリンの添加により試料中で生成されるトロンビン／メイゾトロンビンの阻害に基づきヒルジンを測定するための、イエナフィンからのヘモシス（Ｈａｅｍｏｓｙｓ（登録商標））−ＥＣＡ Ｈアッセイである。

特許文献１は、抗凝固剤を測定するための別のアッセイ原理を記載している。このアッセイ原理は、同様に、凝固因子特異的基質の切断を測定することを含むが、発色性基質を利用するよりも、むしろ、別の種類のシグナル生成系を利用する。前記系は２つの成分を含んでなり、これらの成分は、インタクトな基質に同時に結合するとき、空間的に密に近接するが故に相互作用して、検出可能なシグナル、例えば蛍光又は化学発光、を生じる。基質のペプチド結合の切断の結果、これら２つの成分は互いに離れ、それ故、何らシグナルは生成されない。試料中により多くの抗凝固剤が存在するほど、活性化された凝固因子は、より多く阻害され、基質は、より分解しなくなり、より多くのシグナルが生成される。蛍光又は化学発光に基づくアッセイの、発色アッセイを凌ぐ、利点は、基本的には、それらの感度がより良好で、また、全血中での測定を可能にすることである。

切断可能な基質が、前記シグナル系の２成分の間に、ある程度「マウント」されている上述の方法は、基質リガンドがシグナル系成分との会合のための領域を切断部位の両側に有する必要があるという点で、不利である。基質リガンドは、通常、合成された低分子ペプチド基質であり、シグナル系成分との結合のための２つの人工的な残基、例えばアミノ末端Ｆｌａｇタグ及びカルボキシ末端ビオチン残基、を有する。しかしながら、かかる残基の低分子量基質へのカップリングは、ペプチドの構造を、検出すべき酵素によってそれがもはや結合され又は切断されないように、変えてしまうリスクを常に有しており、それ故、適切な基質リガンドを提供することは技術的に複雑である。

欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ１−２１７７６２５

従って、空間的に密に近接するが故に相互作用し且つ検出可能なシグナルを生成する２つの成分を用いる、抗凝固剤を測定するための既知の方法を修正して、任意のシグナル系成分との会合のための２以上の人工的な残基を有する必要がない低分子リガンドを使用し得るようにすることが望ましい。

この目的は、抗凝固剤を含有すると思われる試料の一部標本を、規定量のタンパク質分解活性凝固因子及びこのタンパク質分解活性凝固因子の活性部位に結合するが該因子によりペプチド結合において切断されないリガンドと、混合すること、並びに、前記活性化された凝固因子への前記リガンドの結合の結果として、シグナル生成系により発生されるシグナルを測定することにより、達成される。試料中に存在する活性化された凝固因子の阻害剤、即ち抗凝固剤、は、濃度に依存して、タンパク質分解活性凝固因子の活性部位への結合に関して、リガンドと競合し、その結果、シグナル生成を阻害する。試料中に抗凝固剤がより多く存在するほど、生成されるシグナルは少なくなる。

それ故、本発明は、以下の工程を備える、試料中のタンパク質分解活性凝固因子の阻害剤、即ち抗凝固剤、を測定する方法に関する。
ａ）以下の成分
ｉ． 試料の一部標本、
ｉｉ． 規定量のタンパク質分解活性凝固因子、
ｉｉｉ． タンパク質分解活性凝固因子の活性部位に結合するが、該因子によりペプチド結合において切断されない、少なくとも１つのリガンド、並びに
ｉｖ． シグナル生成系の第１及び第２の成分であって、
前記シグナル生成系の前記第１及び第２の成分が互いに密に近接させられたときに、検出可能なシグナルが生成され、ここで、前記タンパク質分解活性凝固因子は、インキュベーション中に前記シグナル生成系の前記第１の成分と会合しているか又は会合し得るものであり、且つ、前記リガンドは、インキュベーション中にシグナル生成系の前記第２の成分と会合しているか又は会合し得るものである、第１及び第２の成分；
を含んでなる反応混合物を準備しインキュベートする工程；並びに
ｂ）前記シグナル生成系の前記シグナル−ここで、前記シグナルの振幅は試料中の抗凝固剤濃度に反比例するものである−を測定する工程。

用語「抗凝固剤」は、本発明の文脈においては、天然又は合成起源であってヒト又は動物におけるインビボの凝固系の阻害を意図して用いられるタンパク質分解活性凝固因子の阻害剤に対して、用いられる。これは、また、多数の結合部位において酵素と結合するヒルジン又はヘパリン等の高分子量の基質のみならず、酵素の活性部位に結合するのみであって結合反応性を阻害するにすぎない、リバロキサバン、ダビガトラン又はメラガトラン等の低分子量化合物をも、包含する。用語「抗凝固剤」及び「タンパク質分解活性凝固因子の阻害剤」は、本発明では同義的に使用される。

用語「リガンド」は、本発明の文脈においては、タンパク質分解活性凝固因子の活性部位中に結合し、それ故に、結合部位に関し阻害剤と競合する物質を、意味する。しかしながら、好適なリガンドは、タンパク質分解活性凝固因子によってペプチド結合において切断されない。その理由は、これらのリガンドが前記タンパク質分解活性凝固因子により切断可能なペプチド結合を欠くこと、即ち、それらがタンパク質分解活性凝固因子により加水分解され得る何らのペプチジル結合（Ｒ−ＣＯＮＨ−Ｒ、Ｒ＝アミノ酸残基）を持たないからである。可逆的及び不可逆的結合性のいずれのリガンドも好適である。

リガンドは、合成により、組換えにより若しくはバイオテクノロジーにより、生成された分子でもよく、又は天然に産出する分子でもよい。

リガンドは、酵素の天然の基質の配列に由来する配列を有するペプチド誘導体であってもよい。本発明のためのペプチド誘導体リガンドは、それがタンパク質分解活性凝固因子により加水分解的に切断されない点で、ペプチド基質とは異なるが、一方、ペプチド基質の切断によりフラグメントが生じ、これらのフラグメントは酵素の活性部位から遊離され、且つ、酵素は変化せずに反応から再出現する。

好適なペプチド誘導体は、好ましくは、３ないし約１５０アミノ酸残基を含んでなる。タンパク質分解活性凝固因子によって本発明のペプチド誘導体がペプチド結合において切断されるのを妨げ得るためには、後者のカルボキシ末端カルボキシル基は、アルデヒド（−ＣＨＯ）、ケトン（−ＣＯＲ；Ｒ＝アルキル又はアリール）、トリフルオロメチルケトン（−ＣＯＣＦ₃）、α−ケトカルボン酸（−ＣＯＣＯＯＨ）、α−ケトアミド（−ＣＯＣＯＮＨＲ；Ｒ＝アルキル又はアリール）、及びα−ケトエステル（−ＣＯＣＯＯＲ；Ｒ＝アルキル又はアリール）、エステル（−ＣＯＯＲ；Ｒ＝アルキル又はアリール）、ボロン酸（−Ｂ（ＯＲ）₂）、クロロメチルケトン（−ＣＯＣＨ₂Ｃｌ）、及びフッ化スルホニル（−ＳＯ₂Ｆ）からなる群から選ばれる官能基で置換されるのが好ましい。更に、ペプチド誘導体は、構造的に修飾されていても、例えば、天然産出Ｌ−アミノ酸の代わりに部分的にＤ−アミノ酸を使用しても、よい。

表１は、可逆的及び不可逆的結合性ペプチド誘導体リガンドのための、代表的な官能基の例を含む。

トロンビンの活性部位中に結合するが、該化合物によりペプチド結合において切断されることはない、ペプチド誘導体リガンドの例は：
・ Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｈ
・ Ｍｅ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｈ
・ Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｇｍ
・ Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＣＨ₂−Ｃｌ
・ Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＣＨ₂Ｆ
・ Ｂｏｃ−ＤＬ−Ｄｐａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｈ
・ Ａｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−ボロＡｒｇピナンジオールエステル
・ Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−ＮＨ−ＣＨ（メトキシプロピル）−Ｐ（Ｏ）（ＯＰｈ）₂
である。

第Ｘａ因子の活性部位中に結合するが、該因子によってペプチド結合において切断されることはない、ペプチド誘導体リガンドの例は：
・ Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｈ
・ ダンシル−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＣＨ₂Ｃｌ
である。

上述のペプチド誘導体リガンドについては、クレソン（Ｃｌａｅｓｏｎ，Ｇ）、「Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ」、１９９４年、第５巻、ｐ．４１１−４３６も参照。

リガンドは、また、例えば、アルギニンエステル、アミジノフェニルアラニンエステル、ｐ−グアニジノフェニルアラニンエステル、３−アミジノフェニルアラニンエステル、二塩基性（アミジノアリール）プロパン酸誘導体又はオキサゾリジノン誘導体といった、ペプチド化合物のグループに属さない化合物であってもよい。

トロンビンの活性部位中に結合するが、該化合物によってペプチド結合において切断されないアルギニン誘導体リガンドは、例えば、Ｎ−α−アリールスルホニルアルギニンアミド（Ｒ₁−ＳＯ₂−Ａｒｇ−Ｎ−Ｒ₂／Ｒ₃；Ｒ₁＝疎水性脂肪族又は芳香族基）（クレソン（Ｃｌａｅｓｏｎ，Ｇ）、「Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ」、１９９４年、第５巻、ｐ．４１１−４３６）である。

トロンビンの活性部位中に結合するが、該化合物によってペプチド結合において切断されないアミジノフェニルアラニン誘導体は、例えば、Ｎ−α−（β−ナフチルスルホニル−４−アミジノフェニルアラニンピペリジド又はＮ−α−（β−ナフチルスルホニル−グリシル）−４−アミジノフェニルアラニンピペリジド（クレソン（Ｃｌａｅｓｏｎ，Ｇ）、「Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ」、１９９４年、第５巻、ｐ．４１１−４３６）である。

トロンビンの活性部位中に結合するが、該化合物によってペプチド結合において切断されないｐ−グアニジノフェニルアラニン誘導体リガンドは、例えば、Ｔｏｓ−Ｇｐａ−ピペリジド（クレソン（Ｃｌａｅｓｏｎ，Ｇ）、「Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ」、１９９４年、第５巻、ｐ．４１１−４３６）である。

第Ｘａ因子の活性部位中に結合するが該因子によってペプチド結合において切断されない３−アミジノフェニルアラニンエステル誘導体リガンドは、例えば、Ｎ−α−（β−ナフチルスルホニル−グリシル）−３−アミジノフェニルアラニン（クレソン（Ｃｌａｅｓｏｎ，Ｇ）、「Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ」、１９９４年、第５巻、ｐ．４１１−４３６）である。

第Ｘａ因子の活性部位中に結合するが該因子によってペプチド結合において切断されない二塩基性（アミジノアリール）プロパン酸誘導体リガンドは、例えば、（２Ｓ）−２−［４−［［（３Ｓ）−１−アセトイミドイル−３−ピロリジニル］オキシ］フェニル］−３−（７−アミジノ−２−ナフチル）プロパン酸（ナガハラ（Ｎａｇａｈａｒａ，Ｔ．）ら、「Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．」、１９９４年、第３７巻、ｐ．１２００−１２０７）である。

第Ｘａ因子の活性部位中に結合するが該因子によってペプチド結合において切断されないオキサゾリジノン誘導体リガンドは、例えば、５−クロロ−Ｎ−（｛（５Ｓ）−２−オキソ−３−［４−（３−オキソモルホリン−４−イル）フェニル］−１，３−オキサゾリジン−５−イル｝メチル）チオフェン−２−カルボキサミド（ローリグ（Ｒｏｅｈｒｉｇ，Ｓ．）ら、「Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．」、２００５年、第４８巻、第１９号、ｐ．５９００−５９０８）である。

可逆的結合性リガンドとは、少なくとも１つの天然又は合成阻害剤により、濃度に依存して、タンパク質分解活性凝固因子の活性部位から、除去し得るリガンドを、意味する。

トロンビンに可逆的に結合する好適なリガンドの例は、例えば、Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｈ、Ｍｅ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｈ又はＨ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｇｍといった、ペプチド誘導体である。アグマチン（Ａｇｍ）のカルボキシル基は、水素で置換されている。可逆的にトロンビンに結合する他のリガンドは、Ｎ−α−アリールスルホニルアルギニンアミド（Ｒ₁−ＳＯ₂−Ａｒｇ−Ｎ−Ｒ₂／Ｒ₃）、又はアミジノピペリジン誘導体、例えばＮ−α−（β−ナフチルスルホニル）−４−アミジノフェニルアラニンピペリジン、又はｐ−グアニジノフェニルアラニン（Ｇｐａ）、アミジノフェニルアラニン（Ａｐａ）の誘導体、例えばＴｏｓ−Ｇｐａ−ピペリジド及びＴｏｓ−Ａｐａ−ピペリジド、又は他のペプチドアミノボロン酸又はペプチドアミノホスホン酸、例えばＡｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ₂−フェニル）−Ｂ−ＯＰｉｎ及びＤ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＮＨ−ＣＨ（メトキシプロピル）−Ｐ（Ｏ）（ＯＰｈ）₂である。

第Ｘａ因子へ可逆的に結合する好適なリガンドの例は、例えば、Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｈ又はベンズアミジン誘導体といったペプチド誘導体、及び、例えば、Ｎ−α−（β−ナフチルスルホニル−グリコリル）−３−アミジノフェニルアラニンといった３−アミジノフェニルアラニンエステルである。

不可逆的結合性リガンドとは、タンパク質分解活性凝固因子の活性部位に、濃度に依存せずに、結合し、それが酵素と例えば共有結合を形成しその活性部位が不可逆的に不活性化されるように酵素を変性するが故に、もはや除去することができないリガンドを意味する。典型的な不可逆的結合性リガンドは、酵素の活性部位内へそれらを導入するための部分及び酵素、即ち、タンパク質分解活性凝固因子の場合には活性部位中のセリンのヒドロキシル官能基、との間で共有結合を形成し得る化学的反応性基から構成される。酵素と共有結合を形成するためには、官能基の一部がリガンドから除去され、それが次に同一の反応工程で、酵素に共有結合する。

トロンビンに不可逆的に結合する好適なリガンドの例は、Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＣＨ₂−Ｃｌ及びＨ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＣＨ₂Ｆである。

第Ｘａ因子に不可逆的に結合する好適なリガンドの例は、ダンシル−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＣＨ₂Ｃｌである。

可逆的及び不可逆的結合性リガンドは、その反応速度論によって識別し得る。一定の基質濃度（Ｓ）において、ｖを反応速度として、１／ｖをリガンド濃度（ｉ）の関数としてプロットすることによって、直線が得られる。２つ以上の異なる基質濃度（Ｓ₁、Ｓ₂、、、Ｓ_N）を使用するとき、直線は単一の点で交差する。この点のｘ軸の値は、−Ｋ_iに相当し、Ｋ_iは、結合定数に相当する（図３、詳細参照）（ディクソン（Ｄｉｘｏｎ，Ｍ．）、「Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ」、１９５３年、第５５巻、ｐ．１７０−１７７）。不可逆的阻害については、曲線はｘ軸上の単一の点で交わり、これも、また、−Ｋ_iに相当する。

好適なリガンドは、タンパク質分解活性凝固因子に対して、測定すべき抗凝固剤の親和性に相当するか又はそれより低い、結合親和性を有する。抗凝固剤として用いるトロンビン阻害剤は、トロンビンに対して、２．７×１０^-14モル（ヒルジン）ないし１．９×１０^-8モル（アルガトロバン）の範囲の結合定数を示す（プラサ（Ｐｒａｓａ，Ｄ．）ら、「Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ」、１９９７年、第７７巻、ｐ．４９８−５０３）。トロンビン阻害剤は、トロンビンの他に、また、Ｆ Ｘａにも、但し実質的に低い親和性で、即ち、例えばアルガトロバンについては、２．１×１０^-4モルという、より大きい結合定数で結合する（プラサ（Ｐｒａｓａ，Ｄ．）ら、「Ｔｈａｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ」、１９９７年、第７８巻、ｐ．１２１５−１２２０）。Ｆ Ｘａ阻害剤は、８ｘ１０^-11モル（アピキサバン）ないし６．６×１０^-9モル（ＬＹ５１７７１７ジフマル酸エステル）の範囲内の結合定数を有し、前記Ｆ Ｘａ阻害剤は、また、トロンビンに対しある程度結合するが例えばリバロキサバンについては１０，０００倍まで弱く結合する（ペルズボーン（Ｐｅｒｚｂｏｒｎ，Ｅ．）、「Ｈaｍｏｓｔａｓｅｏｌｏｇｉｅ」、２００９年、第３巻、ｐ．２６０−２６７）。可逆的リガンドは、それ故、測定すべき阻害剤によって、タンパク質分解活性凝固因子の活性部位から除去され得る。従って、適切に選択された親和性を有する不可逆的リガンドは、測定すべき薬物を、タンパク質分解活性凝固因子の活性部位から、該当する時間内に除去することができない。一方、親和性は、低すぎてはならない。というのは、そうでなければ何らシグナルは生成され得ないからである。

好適なリガンドの結合定数は、それ故、好ましくは０．０００１ないし１００，０００ｎＭ（１０^-13ないし１０^-4Ｍ）の範囲内、特に好ましくは０．１ないし１０，０００ｎＭ（１０^-10ないし１０^-5Ｍ）の範囲内、極めて特に好ましくは、１ないし１，０００ｎＭ（１０^-9ないし１０^-6Ｍ）の範囲内である。

用語「試料」は、本発明の目的に関して、検出すべき抗凝固剤を含有すると思われる物質を意味する。用語「試料」は、血液、血漿、血清並びに他の体液、排泄物又は抽出物といった、特に、ヒト及び動物の生物学的液体又は組織を含んでなる。

本発明の方法は、試料の一部標本、規定量のタンパク質分解活性凝固因子、タンパク質分解活性凝固因子の活性部位に結合するが該因子によってペプチド結合において切断されない少なくとも１つのリガンド、並びに、シグナル生成系の第１及び第２の成分であって、互いに密に近接させられたときに、検出可能なシグナリングが生成されるような方法で相互作用する成分を含んでなる反応混合物を、準備しインキュベートすることを含んでなる。タンパク質分解活性凝固因子は、シグナル生成系の第１の成分と会合しているか又はインキュベーション中に会合するようになる。リガンドは、シグナル生成系の第２の成分と会合しているか又はインキュベーション中に会合するようになる。タンパク質分解活性凝固因子の活性部位へのリガンドの結合の結果として、シグナル生成系の成分が互いに密に近接させられ、それにより、反応混合物中のタンパク質分解活性凝固因子の活性と相関する検出可能なシグナルが生成される。試料中に存在する抗凝固剤は、濃度に依存して、タンパク質分解活性凝固因子の活性部位への結合に関して、ペプチド結合において切断され得ないリガンドと競合し、結果として、シグナル生成を阻害する。試料中に抗凝固剤がより多く存在するほど、シグナル生成はより少なくなる。シグナル生成は、試料中の抗凝固剤の濃度に反比例するシグナルの振幅で測定される。

本発明の方法は、タンパク質分解活性凝固因子、トロンビン（第ＩＩａ因子）、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩａ因子又は第ＸＩＩａ因子の阻害剤を測定するのに、好適である。

どの活性化凝固因子及びどのリガンドを反応混合物に添加するかは、測定すべき抗凝固剤の特異性に依存する。

トロンビンの添加又は第Ｘａ因子の添加、及び、トロンビン特異性又は第Ｘａ因子特異性を有するリガンドの添加は、ヘパリン、即ち高分子量未分画ヘパリン（ＨＭＭヘパリン）若しくは低分子量ヘパリン（ＬＭＷヘパリン）又はヘパリノイド、の測定に特に好適である。第ＩＩａ因子（トロンビン）の添加及びトロンビン特異性を有するリガンドの添加は、直接的トロンビン阻害剤、例えば、アルガトロバン、メラガトラン、キシメラガトラン、ビバリルジン、ダビガトラン、ヒルジン、レピルジン、ＭＣＣ−９７７、ＳＳＲ−１８２２８９、ＴＧＮ−２５５、ＴＧＮ−１６７、ＡＲＣ−１８３及びオジパルシルを測定するのに、特に好適である。第Ｘａ因子の添加及び第Ｘａ因子特異的リガンドの添加は、直接的第Ｘａ因子阻害剤、例えばリバロキサバン；アピキサバン；オタミキサバン（これらはキサバンの新規な活性基質クラスにまとめられる）；フォンダパリナックス；ＬＹ ５１７７１７；ＹＭ １５３；ＤＵ−１７６ｂ；ＤＸ−９０６５ａ及びＫＦＡ−１９８２、を測定するのに、特に好適である。

反応混合物に添加されたタンパク質分解活性凝固因子は、動物若しくはヒトの組織若しくは体液、例えば血液若しくは血漿、から単離された凝固因子であるか、或いは、動物若しくはヒトの細胞培養物又は真核細胞若しくは、例えば組換え凝固因子を発現する細菌若しくは真菌等の、微生物の培養物の上清若しくは溶解物から単離された凝固因子であってよい。種々の凝固因子の当初は不活性な酵素前駆体を活性化する方法は、当業者に周知である。どの活性化された凝固因子を反応混合物に添加するかは、測定すべき抗凝固剤に依存する。

本発明の方法の１実施態様においては、タンパク質分解活性凝固因子が結合ペアＸ／Ｙの第１の結合パートナーＸを有し、シグナル生成系の第１の成分が前記結合ペアＸ／Ｙの第２の結合パートナーＹと会合し、それにより、反応混合物のインキュベーション中に、タンパク質分解活性凝固因子は、結合パートナーＸ及びＹの結合に起因して、シグナル生成系の第１の成分に結合するか又はシグナル生成系の第１の成分に結合するようになる。

結合パートナーＸ及びＹは、互いに特異的に認識し結合する２つの異なる分子である。特異的認識及び結合の例は、抗体−抗原相互作用、ポリヌクレオチド相互作用等である。

好適な結合ペアＸ／Ｙは、特に抗原／抗体の組合せであり、結合パートナーＸは、タンパク質分解活性凝固因子の抗原エピトープである。抗原エピトープは、天然タンパク質の天然の配列エピトープ又は構造エピトープであってよい。抗原エピトープは、また、修飾された活性凝固因子の異種の配列エピトープ又は構造エピトープであってもよい。異種の配列又は構造エピトープの例は、ＦＬＡＧ、又はＨＩＳ又はフルオレセインタグであり、これらは特にペプチド又はタンパク質を標識するのに使用される。他の適切な結合ペアＸ／Ｙは、相補的なポリヌクレオチドＸ及びＹである。シグナル生成系の第１の成分と会合する結合パートナーＹは、タンパク質分解活性凝固因子が特異的に結合され得るよう選択されるべきである。結合パートナーＹは、好ましくは抗体又はその抗原結合フラグメントからなる。特に好適な結合ペアＸ／Ｙは、ＦＬＡＧタグ／抗ＦＬＡＧタグ抗体、ＨＩＳタグ／抗ＨＩＳタグ抗体、フルオレセイン／抗フルオレセイン抗体、ビオチン／アビジン、及びビオチン／ストレプトアビジンである。

本発明方法の別の実施態様においては、タンパク質分解活性凝固因子は、共有結合を介してシグナル生成系の第１の成分に連結される。

好ましい実施態様においては、反応混合物に添加されるリガンドは、シグナル生成系の第２の成分に結合するための、第１の結合ペアＡ／Ｂの第１の結合パートナーＡを有し、この第２の成分は、対応して、前記結合ペアＡ／Ｂの第２の結合パートナーＢを有する。特に好ましくは、リガンドは結合パートナーＡとして、少なくとも１つのビオチン残基を有する。

結合パートナーＡ及びＢは、互いに特異的に認識及び結合する２つの異なる分子である。特異的認識及び結合の例は、抗体−抗原相互作用、ポリヌクレオチド相互作用等である。

適切な結合ペアＡ／Ｂは、特に抗原／抗体の組合せであり、結合パートナーＡは、リガンドの抗原エピトープである。抗原エピトープは、天然タンパク質又はタンパク質フラグメントの、天然の配列エピトープ又は構造エピトープであってよい。抗原エピトープは、また、修飾されたペプチドの異種の配列エピトープ又は構造エピトープであってもよい。異種の配列又は構造エピトープの例は、ＦＬＡＧ、又はＨＩＳ又はフルオレセインタグであり、これらは特に、低分子量基質、ペプチド又はタンパク質を標識するのに使用される。更なる適切な結合ペアＡ／Ｂは、相補的なポリヌクレオチドＡ及びＢである。シグナル生成系の第２の成分と会合する結合パートナーＢは、リガンドが特異的に結合し得るよう選択されるべきである。好ましくは、結合パートナーＢは、抗体又はその抗原結合フラグメントからなる。特に好適な結合ペアＡ／Ｂは、ＦＬＡＧタグ／抗ＦＬＡＧタグ抗体、ＨＩＳタグ／抗ＨＩＳタグ抗体、フルオレセイン／抗フルオレセイン抗体、ビオチン／アビジン、及びビオチン／ストレプトアビジンである。

リガンドを第２のシグナリング成分と会合させるための可能な結合ペアＡ／Ｂは、原則的に、それがそれらの相互結合により、前記タンパク質分解活性凝固因子を第１のシグナリング成分と会合させるための可能な結合ペアＸ／Ｙを、妨げないように選択されるべきである。

本発明の１つの利点は、使用されるリガンドが、必須ではないが、結合ペアの第２の人工的な結合パートナーを有し得ることである。

用語「シグナル生成系」は、本発明の目的に関して、互いに密に近接させられたときに、検出可能なシグナルが生成されるように相互作用する、少なくとも第１及び第２の成分を含んでなる系を意味する。

１つの実施態様においては、シグナル生成系の成分は、微粒子状固相、例えばラテックス粒子、であり、その凝集は、比濁分析法又はネフェロメトリ法により測定される。この目的のために、シグナル生成系の第１の成分は、タンパク質分解活性凝固因子と会合しているか又は会合可能であるような性質を有する第１の微粒子状固相からなる。第１の微粒子状固相は、共有結合を介して若しくは結合ペアＸ／Ｙを介して、タンパク質分解活性凝固因子に連結されるか、又は、反応混合物中で、結合ペアＸ／Ｙを介して、それに連結し得るものとなる。更に、シグナル生成系の第２の成分は、リガンドと会合しているか又は会合可能であるような性質を有する第２の微粒子状固相からなる。第２の微粒子状固相は、共有結合を介して若しくは結合ペアＡ／Ｂを介して、リガンドに連結されるか、又は反応混合物中で、結合ペアＡ／Ｂを介して、それに連結し得るものとなる。微粒子増強光散乱の原理に基づくイムノアッセイは、１９２０年頃から知られている（概要については、ニューマン（Ｎｅｗｍａｎ，Ｄ．Ｊ．）ら、「Ｐａｒｔｉｃｌｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（微粒子増強光散乱イムノアッセイ），Ａｎｎ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ」、１９９２年、第２９巻、ｐ．２２−４２参照）。好ましくは直径０．１ないし０．５μｍの、特に好ましくは０．１５ないし０．３５μｍの、ポリスチレン粒子を使用する。カルボキシル又はアルデヒド官能基を有するポリスチレン粒子を使用することが好ましい。更に、シェル／コア粒子を使用することが好ましい。前記粒子の合成及びリガンドの共有結合性カップリングは、例えば、ポイラ（Ｐｅｕｌａ，Ｊ．Ｍ．）ら、「Ｃｏｖａｌｅｎｔ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｇｒｏｕｐｓ ｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒ ｃａｒｒｉｅｓ．（ポリマー担体上のアルデヒド基への抗体の共有結合性カップリング）、Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ：Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」、１９９５年、第６巻、ｐ．７７９−７８５に記載されている。

本発明方法の別の実施態様においては、シグナル生成系は、互いに密に近接させられ、それ故、互いに相互作用し得るときに、検出可能なシグナルが生成されるように相互作用する、少なくとも第１及び第２の成分を含んでなる。前記成分間の相互作用は、特に、エネルギー転移−即ち、例えば、光又は電子線放射による、そして、例えば、短寿命の一重項酸素等の反応性化学的分子を介する、成分間のエネルギーの直接的転移−を、意味する。エネルギーは、１つの成分から別の成分へ転移されてもよいが、種々の物質のカスケードがエネルギー転移を行なうことも可能である。例えば、前記成分は、例えば、光増感剤及び化学発光物質（ＥＰ−Ａ２−０５１５１９４、ＬＯＣＩ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ）、又は光増感剤と蛍光体（ＷＯ ９５／０６８７７）、又は放射性ヨウ素＜１２５＞と蛍光体（ユーデンフレンド（Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎｄ）ら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．」、１９８５年、第８２巻、ｐ．８６７２−８６７６）、又は蛍光体と蛍光クエンチャー（ＵＳ ３，９９６，３４５）といった、エネルギー供与体とエネルギー受容体とからなるペアでよい。

互いに相互作用し得る、シグナル生成系の第１の成分及び第２の成分のいずれか一方又は両方は、微粒子固相との共有結合により又は特異的相互作用により、微粒子固相と会合していてもよく、又は微粒子固相に埋め込まれていてもよい。用語「微粒子固相」は、例えば、金属ゾル、シリカ粒子、磁性粒子又は特に好適にはラテックス粒子、等の、懸濁可能な粒子を意味する。直径０．０１〜１０μｍの粒子が好ましく、直径０．１〜１μｍの粒子が特に好ましい。

互いに密に近接させられ、その結果、互いに相互作用し得るときに、検出可能なシグナルが生成されるように相互作用する複数の成分を有するシグナル生成系の第１の成分は、タンパク質分解活性凝固因子と会合しているか、又は会合し得るような性質を有するものである。シグナル生成系の第１の成分は、タンパク質分解活性凝固因子と直接的に会合しているか又は会合し得るものであってもよい。タンパク質分解活性凝固因子と間接的に会合しているか又は会合し得る、シグナル生成系の第１の成分が好ましい。この目的のためには、シグナル生成系の第１の成分は、微粒子固相と会合し、これが更に、共有結合的に又は結合ペアＸ／Ｙを介して、タンパク質分解活性凝固因子と会合しているか又は結合ペアＸ／Ｙを介してタンパク質分解活性凝固因子と会合し得る。

互いに密に近接させられ、その結果、互いに相互作用し得るときに、検出可能なシグナルが生成されるように相互作用する複数の成分を有するシグナル生成系の第２の成分は、リガンドと会合しているか又は会合し得る性質を有するものである。シグナル生成系の第２の成分は、リガンドと直接的に会合しているか又は会合し得るものであってもよい。リガンドと間接的に会合しているか又は会合し得る、シグナル生成系の第２の成分が好ましい。この目的のためには、シグナル生成系の第２の成分は、微粒子固相と会合し、これが更に、共有結合的に又は結合ペアＡ／Ｂを介して、リガンドと会合しているか又は結合ペアＡ／Ｂを介しリガンドと会合し得る。

タンパク質分解活性凝固因子の阻害剤を測定するための本発明方法の好ましい実施態様においては、試料は、更にフィブリン凝集阻害剤と混合される。フィブリン凝集阻害剤は、トロンビンによって誘起されたフィブリンモノマーの凝集を妨げる物質である。この物質は、フィブリン含有試料においてフィブリン塊の形成を妨げるが、そうでなければ、例えば拡散及びクエンチングを制限することにより測定に対し負のインパクトを与えることになる。好ましいフィブリン凝集阻害剤は、合成ペプチド、例えば、グリシン、プロリン、アルギニン、プロリン配列のペプチド（ペファブロック（Ｐｅｆａｂｌｏｃ（登録商標）ＦＧとして市販、ペンタファーム（Ｐｅｎｔａｐａｒｍ）、スイス）、である。フィブリン凝集阻害剤として使用してもよい更に好ましいペプチド、特にグリシン、プロリン、アルギン、プロリン、アラニン配列の好ましいペプチド、は、欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ２−４５６ １５２に記載されている。

タンパク質分解活性凝固因子の直接阻害剤を測定するための本発明方法の好ましい実施態様においては、更に、ポリブレン（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（登録商標））（臭化ヘキサジメトリン）等のポリアミン、スペルミン、又はポリリジンが反応混合物に添加される。ポリアミンは、ヘパリンによる凝固因子の間接的阻害を阻害する。この方法で、本発明の方法を用いて、ヘパリン誘起性の阻害と直接的阻害とを区別し得る。

試料、規定量のタンパク質分解活性凝固因子、タンパク質分解活性凝固因子の活性部位に結合するが該因子によってペプチド結合において切断されない少なくとも１つのリガンド、並びにシグナル生成系の第１及び第２の成分を含有する反応混合物が準備された後、反応混合物を一定時間インキュベートして、タンパク質分解活性凝固因子、抗凝固剤及びリガンド、並びに、必要に応じて、第１のシグナリング成分とタンパク質分解活性凝固因子との充分な会合及び第２のシグナリング成分とリガンドとの充分な会合のいずれか一方又はその両方を確実にする。用語「充分な」は、方法が、全体として、タンパク質分解活性凝固因子の阻害剤の定量的な方法による測定を可能にすることを意味していると理解されるべきである。特定のアッセイデザインの最適なインキュベーション時間は、実験的に決定し得る。反応混合物は、いくつかの個別の工程において、異なる順序で、かつ異なるインキュベーション時間を用いて準備してもよい。

反応混合物中で生成される、時間の関数としての、シグナル又はシグナル変化は、タンパク質分解活性凝固因子の阻害剤の活性又は量と相関する。タンパク質分解活性凝固因子の阻害剤の活性又は量は、前記相関により、前記シグナル及び時間経過によるシグナル変化を利用して確証し得る。この目的には、標準を用いてキャリブレーションを行なうことが好ましい。前記標準は、タンパク質分解活性凝固因子阻害剤の一定の活性又は量を有する。

本発明は、更に、本発明の方法の様々な実施態様を実行するための試験キットに関する。

第１の試験キットは、以下の個々の成分を含んでなる。
ｉ． 規定量のタンパク質分解活性凝固因子を含んでなる第１の試薬；
ｉｉ． タンパク質分解活性凝固因子の活性部位に結合するが該因子によりペプチド結合において切断されない少なくとも１つのリガンドを含んでなる第２の試薬；
ｉｉｉ． シグナル生成系の第１の成分であって、前記第１の試薬からのタンパク質分解活性凝固因子と会合可能な成分、を含んでなる第３の試薬；及び
ｉｖ． シグナル生成系の第２の成分であって、第２の試薬からのリガンドと会合可能な成分、を含んでなる第４の試薬。

かかる試験キットを使用する場合、各成分は、個別に試料又は反応混合物に添加され、タンパク質分解活性凝固因子とシグナル生成系の第１の成分との会合、及びリガンドとシグナル生成系の第１の成分との会合は、反応混合物のインキュベーション中に起こる。このことの利点は、タンパク質分解活性凝固因子及びリガンドが、それぞれ、通常の結合ペア、Ａ／Ｂ、及びＸ／Ｙを介して、例えばストレプトアビジン／ビオチン、アビジン／ビオチン、ＦＬＡＧタグ／抗ＦＬＡＧタグ抗体等を介して、各々会合する場合に、第３及び第４の試薬が、それぞれの場合に、普遍的に使用可能な検出試薬でよいことである。

別の試験キットは、以下の個々の成分を含んでなる。
ｉ． シグナル生成系の第１の成分と会合している規定量のタンパク質分解活性凝固因子を含んでなる第１の試薬；
ｉｉ． 前記タンパク質分解活性凝固因子の活性部位に結合するが該因子によりペプチド結合において切断されない少なくとも１つのリガンドを含んでなる第２の試薬；及び
ｉｉｉ． シグナル生成系の第２の成分であって第２の試薬からのリガンドと会合し得る成分、を含んでなる第３の試薬。

かかる試験キットを使用する場合、リガンドとシグナル生成系の第２の成分との会合のみが、反応混合物中でのインキュベーション中に起こる。タンパク質分解活性凝固因子は、既に、シグナル生成系の第１の成分と会合している。

別の試験キットは、以下の個々の成分を含んでなる：
ｉ． 規定量のタンパク質分解活性凝固因子を含んでなる第１の試薬；
ｉｉ． シグナル生成系の第１の成分であって第１の試薬からのタンパク質分解活性凝固因子と会合可能である成分、を含んでなる第２の試薬；及び
ｉｉｉ． 前記タンパク質分解活性凝固因子の前記活性部位に結合するが該因子によりペプチド結合において切断されない少なくとも１つのリガンドであってシグナル生成系の第２の成分と会合しているリガンドを含んでなる第３の試薬。

かかる試験キットを使用する場合、タンパク質分解活性凝固因子とシグナル生成系の第１の成分との会合のみが、反応混合物中でのインキュベーション中に起こる。リガンドは、既にシグナル生成系の第１の成分と会合している。

更に別の試験キットは、以下の個々の成分を含んでなる：
ｉ． タンパク質分解活性凝固因子であってシグナル生成系の第１の成分と会合している規定量のタンパク質分解活性凝固因子を含んでなる第１の試薬；
ｉｉ． タンパク質分解活性凝固因子の活性部位に結合するが該因子によりペプチド結合において切断されない少なくとも１つのリガンドであってシグナル生成系の第２の成分と会合している、リガンドを含んでなる第２の試薬。

かかる試験キットを使用する場合、タンパク質分解活性凝固因子及びリガンドの双方が、既にシグナル生成系の特定の成分と会合している。

中でも、タンパク質分解活性凝固因子及びリガンドのいずれか一方又は両方が既にシグナル生成系の特定の成分と会合している試験キットの利点は、用いるべき試薬の数が最小化され、それによりピペッティングの工程が回避され、ピペッティングエラーのリスクが低減されることである。

略語のリスト
ＡＣ アシル−
Ａｇｍ アグマチン
Ａｌａ アラニン
ＡＮＢＡ ５−アミノ−２−ニトロ−安息香酸
Ａｒｇ アルギニン
Ｂ−ｆ−Ｐ−Ｒ−Ｈ ビオチニル−Ｔｔｄｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｈ
Ｂｏｃ ｔｅｒｔ−ブチルカーボネート
Ｂ−ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｈ ビオチニル−Ｔｔｄｓ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｈ
Ｄｐａ β，β−ジフェニルアラニン
ｆ Ｄ−フェニルアラニン
Ｇｌｙ グリシン
Ｇｐａ グアニジノフェニルアラニン
Ｈｉｓ ヒスチジン
ＩＰＡ イソプロピルアミド
Ｋｉ 結合定数
Ｍｅ メチル−
Ｐｈ フェニル−
Ｐｈｅ フェニルアラニン
ｐＮＡ パラ−ニトロアニリン
Ｐｒｏ プロリン
ｒ Ｄ−アルギニン
Ｒ 相関係数
Ｔｏｓ トシル−
Ｔｔｄｓ ４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミノコハク酸
Ｚ−Ｄ−Ｌｅｕ カーボベンゾキシ−Ｄ−ロイシン

ＬＯＣＩテクノロジーによりトロンビン阻害剤を測定するための、本発明の方法の代表的なアッセイデザインの模式図である。タンパク質分解的活性トロンビンは、化学発光剤（ケミビーズ（Ｃｈｅｍｉｂｅａｄ）、ＣＢ）で被覆されている微粒子固相に結合されている。シグナル生成系の第２の成分は、光増感剤及びストレプトアビジン（センシビーズ（Ｓｅｎｓｉｂｅａｄ）、ＳＢ）で被覆されている微粒子固相からなる。トロンビンの活性部位に結合するが該化合物により切断されず、センシビーズストレプトアビジンに結合するビオチン標識を有するリガンドは、シグナル生成系の２つの成分を密に近接させる。光による光増感剤の励起は、化学発光剤を活性化し得る短寿命の一重項酸素の生成をもたらし、これにより発光シグナルが放出される。トロンビンへの結合に関して、切断されないビオチニル化されたリガンドと、競合するトロンビン阻害剤（坑凝固剤）が試料中に多いほど、発光シグナルの発生は少なくなる。 トロンビン特異的リガンドであるビオチニル−Ｔｔｄｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｈ及び第Ｘａ因子特異的リガンドであるビオチニル−Ｔｔｄｓ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｈの、アミノ末端、ビオチニル−４，７，１０−トリオキサ−１３−トリデカンアミンアミンコハク酸（ビオチニル−Ｔｔｄｓ）リンカーの構造式を示す図である。 ビオチニル−Ｔｔｄｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｈ（Ｂ−ｆ−Ｐ−Ｒ−Ｈ）のトロンビン結合定数の測定を示す図である。実施例２によるトロンビンアッセイにおいて、発色性基質濃度４、２及び０．５ｍＭでの反応速度の逆数をリガンド濃度の関数として表示したものである。 ビオチニル−Ｔｔｄｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｈ（Ｂ−ｆ−Ｐ−Ｒ−Ｈ）のトロンビン結合定数の測定を示す図である。図３の拡大詳細図である。 ビオチニル−Ｔｔｄｓ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｈ（Ｂ−ｒ−Ｇ−Ｒ−Ｈ）のトロンビン結合定数の測定を示す図である。実施例２によるトロンビンアッセイにおいて、発色性基質濃度４、２及び０．５ｍＭでの反応速度の逆数をリガンド濃度の関数として表示したものである。 ビオチニル−Ｔｔｄｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｈ（Ｂ−ｆ−Ｐ−Ｒ−Ｈ）のＦ Ｘａ結合定数の測定を示す図である。実施例３によるＦ Ｘａアッセイにおいて、発色性基質濃度４、２、及び０．５ｍＭでの反応速度の逆数をリガンド濃度の関数として表示したものである。 ビオチニル−Ｔｔｄｓ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｈ（Ｂ−ｒ−Ｇ−Ｒ−Ｈ）のＦ Ｘａ結合定数の測定を示す図である。実施例３によるＦ Ｘａアッセイにおいて、発色性基質濃度４、２及び０．５ｍＭでの反応速度の逆数をリガンド濃度の関数として表示したものである。 様々な濃度のトロンビン阻害剤；フラグミン、リケミン（ｌｉｑｕｅｍｉｎ）、アルガトロバン、メラガトラン及びレフルダン（ヒルジン）と、トロンビン被覆ケミビーズ及びストレプトアビジン被覆センシビーズと共に用いられるリガンド；ビオチニル−Ｔｔｄｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｈ（Ｂ−ｆ−Ｐ−Ｒ−Ｈ）とを、用いた標準ヒト血漿中の化学発光シグナル生成を示す図である。 様々な濃度のＦ Ｘａ阻害剤；フラグミン、リケミン及びリバロキサバン並びに様々な濃度のトロンビン阻害剤；レフルダン（ヒルジン）及びアルガトロバンと、抗Ｆ Ｘａ抗体被覆ケミビーズ、Ｆ Ｘａ、及びストレプトアビジン被覆センシビーズと共に用いられるリガンド；ビオチニル−Ｔｔｄｓ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｈ（Ｂ−ｒ−Ｇ−Ｒ−Ｈ）とを、用いた標準ヒト血漿中の化学発光シグナル生成を示す図である。

以下の実施例は、本発明を例証するためのものであり、相互結合により、限定するものとして理解されるべきではない。

実施例１：トロンビン及び第Ｘａ因子ビオチニル−Ｔｔｄｓ−ペプチドアルデヒドリガンドの合成
ペプチドアルデヒドである−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｈ（クレソン（Ｃｌａｅｓｏｎ，Ｇ）、「Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ」、１９９４年、第５巻、ｐ．４１７参照）、及び−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｈ（クレソン（Ｃｌａｅｓｏｎ，Ｇ）、「Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ」、１９９４年、第５巻、ｐ．４２６参照）を、固相上で合成し、Ｔｔｄｓスペーサー（Ｔｔｄｓ＝４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミノ−コハク酸（バルトス（Ｂａｒｔｏｓ，Ａ．）ら、「Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ」、２００９年、第９２巻、第２号、ｐ．１１０−１１５））で延長し、ビオチンを供給した。化合物、ビオチニル−Ｔｔｄｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｈ、は、９３０．１５ｇ／モルの分子量を有し、以後、Ｂ−ｆ−Ｐ−Ｒ−Ｈと略記する。ビオチニル−Ｔｔｄｓ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｈは、８９９．１０ｇ／モルの分子量を有し、以後、Ｂ−ｒ−Ｇ−Ｒ−Ｈと略記する。ペプチドアルデヒドは、トリフルオロ酢酸を用いて固相から除去した。化合物は、凍結乾燥された形状で−２０℃に保存した。ビオチンリンカーの構造を、図２に示す。

実施例２：ペプチドアルデヒドリガンドのトロンビン結合定数の測定
ペプチドアルデヒドリガンドの速度論的データは、発色アッセイにおいて、様々な基質濃度及びペプチドアルデヒドリガンド濃度で、特定の酵素の活性部位への結合に関してペプチドアルデヒドリガンドと競合する発色性ペプチド基質の加水分解速度を測定することにより、測定した。結合定数（Ｋｉ）は、既知の方法（ディクソン（Ｄｉｘｏｎ，Ｍ．）、「Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ」、１９５３年、第５５巻、ｐ．１７０−１７1）により測定した。

トロンビン結合定数は、シーメンス ヘルスケア ダイアグノスティクス（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）からの、ヒルジン活性アッセイの試薬を使用して測定した。ヒルジン活性アッセイは、ウシトロンビンからなる凍結乾燥されたトロンビン試薬、ヘパリンインヒビター及びアプロチニン、再構成後の濃度が４ミリモル／Lの、ｔｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＡＮＢＡ−ＩＰＡ（トシルグリシル−Ｌ−プロピル−アルギニル−５−アミノ−２−ニトロベンゾイルイソプロピルアミド）を含んでなる。トロンビン試薬は、緩衝溶液（トリスヒドロキシメチルアミノメタン、ＮａＣｌ、ｐＨ８．２）中で再構成された。基質試薬の希釈は、脱イオン水を用いて調製した。実施例１により調製されたペプチドアルデヒドリガンドを、水中に溶解し、試料として使用した。Ｂ−ｒ−Ｇ−Ｒ−Ｈリガンドは、２６．１ないし０．８１５μＭの濃度範囲で使用した。Ｂ−ｆ−Ｐ−Ｒ−Ｈリガンドは、２６．１ないし０μＭの濃度範囲で使用した。アッセイは、ＢＣＳ（登録商標）ＸＰ凝固分析機（シーメンス ヘルスケア ダイアグノスティクス、ドイツ、マールブルグ（Ｍａｒｂｕｒｇ））で自動的に行なった。

反応混合物は、以下のとおりに一緒に混合した：
３０μLの試料（ペプチドアルデヒドリガンドであるＢ−ｒ−Ｇ−Ｒ−Ｈ又はＢ−ｆ−Ｐ−Ｒ−Ｈ）、
１５０μLのトロンビン試薬、
５０μLの発色性基質試薬（ｔｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＡＢＮＡ−ＩＰＡ）。

ｍＥ／分で表した反応速度は、波長４０５ｎｍにおける反応混合物の光学密度の増加に基づき測定した。このために、反応混合物の光学密度は、Ｂ−ｆ−Ｐ−Ｒ−Ｈペプチドアルデヒドリガンドについては、１５ないし４０秒、Ｂ−ｒ−Ｇ−Ｒ−Ｈペプチドアルデヒドリガンドについては、５ないし１６秒の時間間隔で測定した。

可逆的及び不可逆的に結合するリガンドは、それらの反応速度論により識別し得る。切断可能な基質の一定濃度（Ｓ）において、１／ｖ（ここで、ｖは反応速度である）をリガンド濃度（ｉ）の関数としてプロットすることにより、直線が得られる。２つ以上の異なる基質濃度（Ｓ₁、Ｓ₂、、、Ｓ_N）を使用するとき、前記直線は単一の点で交差する。この点のｘ軸の値は、−Ｋ_iに相当し、Ｋ_iは、結合定数に相当する（例えば、クレーベ（Ｋｌｅｂｅ，Ｇ．）著、「Ｗｉｒｋｓｔｏｆｆｄｅｓｉｇｎ」、第２版、Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｃａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｙｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ、２００９年、ｐ．５２−６２、及びディクソン（Ｄｉｘｏｎ，Ｍ．）、「Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ」、１９５３年、第５５巻、ｐ．１７０−１７７）。不可逆的阻害では、曲線は、ｘ軸上の単一の点で交わり、これも、また、−Ｋ_iに相当する。

表２は、反応混合物中に用いたペプチドアルデヒドリガンドであるＢ−ｆ−Ｐ−Ｒ−Ｈの濃度と様々な濃度の発色性基質を用いて得られた反応速度の逆数とを、示す。

回帰曲線を、様々な基質濃度におけるリガンド濃度（Ｃ_B-f-P-R-H）の関数としての１／反応速度のグラフの直線領域においてプロットした（図３及び４）。Ｃ基質＝０．５ｍＭのとき、濃度０ないし０．０４０７６μＭは、直線領域に入らず、それ故、除外された。３つのＫ_i値が回帰曲線の交点から計算され、これらから、Ｋ_i値の平均値及びグラフの交点が次に計算された。この方法で得られたＫ_i値から、Ｋ_i値の平均値が計算された（表３）。回帰曲線の交点がｘ軸上にないことから、ペプチドアルデヒドとトロンビンとの結合は、可逆的である。ペプチドアルデヒドリガンドであるＢ−ｆ−Ｐ−Ｒ−Ｈの平均のトロンビン結合定数Ｋ_iMは、０．１３１マイクロモル（１．３１×１０^-7モル）である。関連する医薬（治療上有効で適切なトロンビン阻害剤）の結合定数が大きいことから、化合物は、トロンビンを活性凝固酵素として使用する上述の方法によって、高親和性のトロンビン阻害剤を検出するのに適している。

表４は、反応混合物中に用いたペプチドアルデヒドリガンドであるＢ−ｒ−Ｇ−Ｒ−Ｈの濃度と、様々な濃度の発色性基質を用いて得られた反応速度の逆数とを、示す。

回帰曲線を、様々な基質濃度におけるリガンド濃度（Ｃ_B-r-G-R-H）の関数としての１／反応速度のグラフの直線領域においてプロットした（図５）。３つのＫ_i値が回帰曲線の交点から計算され、これらから、次に、平均のＫ_i値及びグラフの交点が計算された。この方法で得られたＫ_i値から、平均Ｋ_i値が計算された（表５）。回帰曲線の交点がｘ軸上にないことから、ペプチドアルデヒドとトロンビンとの結合は、可逆的である。ペプチドアルデヒドリガンドであるＢ−ｒ−Ｇ−Ｒ−Ｈの平均のトロンビン結合定数Ｋ_iMは、２０．９マイクロモル（２．０９×１０^-5モル）である。該リガンドは、それ故、トロンビンを活性凝固酵素として使用する上述の方法によって、低親和性のトロンビン阻害剤を検出するのに適している。

実施例３：ペプチドアルデヒドリガンドのＦ Ｘａ結合定数の測定
Ｆ Ｘａ結合定数は、シーメンス ヘルスケア ダイアグノスティクスからのベリクロム（Ｂｅｒｉｃｈｒｏｍ（登録商標））ヘパリンアッセイの試薬を使用して測定した。ベリクロム（Ｂｅｒｉｃｈｒｏｍ（登録商標））ヘパリンアッセイは、
・ 第Ｘａ因子を含有する凍結乾燥された血漿画分と、トリス、ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ及び保存剤等の添加剤とから、なるＦ Ｘａ試薬、
・ 発色性基質試薬（Ｚ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＮＢＡ−メチル−アミド）、
・ 再構成用の希釈試薬、並びに
・ 凍結乾燥されたデキストラン硫酸からなるデキストラン硫酸試薬、
から構成される。

希釈試薬 １０ｍL中に再構成した後の、デキストラン硫酸濃度は０．０２ｇ／Lである。Ｆ Ｘａ試薬は、再構成されたデキストラン硫酸試薬で再構成する。基質試薬は、脱イオン水 ２ｍLで構成した後、４ミリモル／LのＺ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＮＢＡ−メチル−アミドを含有する。基質試薬の希釈は、脱イオン水で調製した。実施例１により調製されたペプチドアルデヒドリガンドを、水中に溶解し、試料として用いた。アッセイは、ＢＣＳ（登録商標）ＸＰ凝固分析機（シーメンス ヘルスケア ダイアグノスティクス、ドイツ、マールブルグ）で自動的に行なった。

反応混合物は、以下のとおり、混合した：
２０μLの水、
１５μLの試料（ペプチドアルデヒドリガンドであるＢ−ｒ−Ｇ−Ｒ−Ｈ又はＢ−ｆ−Ｐ−Ｒ−Ｈ）、
１５μLの水、
１５０μLのＦ Ｘａ試薬、
３０μLの発色性基質試薬（Ｚ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＮＢＡ−メチル−アミド）。

ｍＥ／分で表した反応速度は、波長４０５ｎｍにおける反応混合物の光学密度の増加に基づき測定した。このために、反応混合物の光学密度は、１０ないし７０秒間の時間間隔で測定した。

表６は、反応混合物中に用いたペプチドアルデヒドリガンドであるＢ−ｆ−Ｐ−Ｒ−Ｈの濃度と、様々な濃度の発色性基質を用いて得られた反応速度の逆数とを、示す。

回帰曲線を、様々な基質濃度におけるリガンド濃度（Ｃ_B-f-P-R-H）の関数としての１／反応速度のグラフの直線領域においてプロットした（図６）。３つのＫ_i値が回帰曲線の交点から計算され、これらから、次に、平均のＫ_i値及びグラフの交点が計算された。この方法で得られたＫ_i値から、平均Ｋ_i値が計算された（表７）。回帰曲線の交点がｘ軸上にないことから、ペプチドアルデヒドとＦ Ｘａとの結合は、可逆的である。ペプチドアルデヒドリガンドであるＢ−ｆ−Ｐ−Ｒ−Ｈの平均のＦ Ｘａ結合定数Ｋ_iMは、１６．９マイクロモル（１．６９×１０^-5モル）である。それ故、該リガンドは、Ｆ Ｘａを活性凝固酵素として使用する上述の方法によって、低親和性のＦ Ｘａ阻害剤を検出するのに適している。

表８は、反応混合物中に用いたペプチドアルデヒドリガンドであるＢ−ｒ−Ｇ−Ｒ−Ｈの濃度と、様々な濃度の発色性基質を用いて得られた反応速度の逆数とを、示す。

回帰曲線を、様々な基質濃度におけるリガンド濃度（Ｃ_B-r-G-R-H）の関数としての１／反応速度のグラフの直線領域においてプロットした（図７）。３つのＫ_i値が回帰曲線の交点から計算され、これらから、次に、平均のＫ_i値及びグラフの交点が計算された。この方法で得られたＫ_i値から、平均Ｋ_i値が計算された（表９）。回帰曲線の交点がｘ軸上にないことから、ペプチドアルデヒドとＦ Ｘａとの結合は、可逆的である。ペプチドアルデヒドリガンドであるＢ−ｒ−Ｇ−Ｒ−Ｈの平均のＦ Ｘａ結合定数Ｋ_iMは、０．３３２マイクロモル（３．３２×１０^-7モル）である。関連する医薬（治療上有効で適切なＦ Ｘａ阻害剤）の結合定数が大きいことから、該化合物は、Ｆ Ｘａを活性凝固酵素として使用する上述の方法によって、高親和性のＦ Ｘａ阻害剤を検出するのに適している。

実施例４：ＬＯＣＩ試薬により、トロンビン阻害剤を測定するための、本発明の方法
用いた試料は、標準ヒト血漿、及び、濃度を増していく直接的トロンビン阻害剤（ヒルジン、メラガトラン、アルガトロバン）又は間接的（リケミン、フラグミン）トロンビン阻害剤が添加された、標準ヒト血漿であった。

用いたシグナル生成系は、化学発光化合物（２−（４−Ｎ，Ｎ−ジ−テトラデシル）−アニリノ−３−フェニルチオキセン）及び光増感剤（ビス−（トリヘキシル）−シリコン−ｔ−ブチル−フタロシアニン）からなる、ＬＯＣＩ（登録商標）系であった。化学発光化合物及び光増感剤のいずれも、ラテックス粒子に結合されている。化学発光化合物で被覆された粒子についての用語「ケミビーズ」及び光増感剤で被覆された粒子についての「センシビーズ」もまた、以下の本明細書において使用される。本明細書において用いたＬＯＣＩテクノロジーは、分析物への結合により、互いに空間的に密に近接させられる、ラテックス粒子結合化学発光化合物（ケミビーズ）及びラテックス粒子結合光増感剤（センシビーズ）に基づくものであり、結果として光増感剤により生成された一重項酸素が、化学発光化合物を励起し得る。

本明細書で用いたケミビーズは、ウシトロンビンで更に被覆された。このために、ウシトロンビンを、共有結合的にラテックス粒子に連結した。本明細書で用いたセンシビーズは、ストレプトアビジンで更に被覆された。

用いたリガンドは、ビオチニル化ペプチドアルデヒド、ビオチニル−Ｔｔｄｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｈ（Ｂ−ｆ−Ｐ−Ｒ−Ｈ）であった。

トロンビン阻害剤の不在下では、リガンドは、そのビオチン残基によりストレプトアビジン被覆センシビーズに、また、そのペプチド成分によりトロンビン被覆センシビーズに、結合し、化学発光シグナルが発生される（図１をも参照）。トロンビン被覆ケミビーズへの結合に関してリガンドと競合するがセンシビーズには結合し得ないトロンビン阻害剤の存在下では、化学発光シグナルは、トロンビン阻害剤濃度に反比例する。

各場合において、２μLの試料、１０μLのフィブリン重合阻害剤ペプチドであるグリシン−プロリン−アルギニン−プロリン（１０ｍｇ／ｍL）、２０μLのケミビーズ（４００μｇ／ｍL）及び１０μLのリガンド（１．２５μＭ）を合一し、６分間インキュベートした。２０μLのセンシビーズ（６００μｇ／ｍL）の添加及び１０分間のインキュベーションの後、混合物に水を満たして２５０μLとし、化学発光シグナルを測定した。図８に示すとおり、化学発光シグナルは、量り入れた直接的トロンビン阻害剤のタイプ及び濃度の関数として、低減される。量り入れた、トロンビンを間接的に阻害するヘパリン（リケミン、フラグミン）も、また、化学発光シグナルの明確な減少をもたらす。

実施例５：ＬＯＣＩ試薬により、第Ｘａ因子阻害剤を測定するための、本発明の方法
用いた試料は、標準ヒト血漿、及び、濃度を増していく直接的トロンビン阻害剤若しくは間接的トロンビン阻害剤（ヒルジン、アルガトロバン、リケミン）又は第Ｘａ因子阻害剤（リバロキサバン、リケミン、フラグミン）が添加された、標準ヒト血漿であった。

用いたシグナル生成系は、実施例４によるＬＯＣＩ系であった。

本明細書で用いたケミビーズは、Ｆ Ｘａに対する市販のポリクローナル抗体で更に被覆された。このために、該抗体を、５０ｎｇの粒子に対し１０ｍｇの抗体のカップリング比で、共有結合的にラテックス粒子に連結した。本明細書で用いたセンシビーズは、ストレプトアビジンで更に被覆された。

用いたリガンドは、ビオチニル化ペプチドアルデヒドであるビオチニル−Ｔｔｄｓ−Ｄ−Ａｅｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｈ（Ｂ−ｒ−Ｇ−Ｒ−Ｈ）であった。

Ｆ Ｘａ阻害剤の不在下では、リガンドは、そのビオチン残基によりストレプトアビジン被覆センシビーズに、また、そのペプチド部分により、それ自体が抗体被覆ケミビーズに結合するＦ Ｘａに、結合し、化学発光シグナルが発生される（図１をも参照）。Ｆ Ｘａ被覆ケミビーズへの結合に関してリガンドと競合するが、センシビーズには結合し得ないＦ Ｘａ阻害剤の存在下では、化学発光シグナルは、Ｆ Ｘａ阻害剤濃度（例えば、リバロキサバン）に反比例する。しかしながら、トロンビン阻害剤（例えば、アルガトロバン又はヒルジン）の存在下では、トロンビン阻害剤がリガンドに置換し得ないことから、シグナルは低減されない。

ヒトＦ Ｘａ含有試薬（約１，０００ ＩＵ／L）１０μL及びフィブリン重合阻害剤ペプチドであるグリシン−プロリン−アルギニン−プロリン（１０ｍｇ／ｍL）を含有する試薬を、２μLの試料、２０μLのケミビーズ（４００μｇ／ｍL）及び１０μLのリガンド（６μＭ）と混合し、５分間インキュベートした。６０μLのセンシビーズ（２００μｇ／ｍL）の添加及び１０分間のインキュベーションの後、混合物に水を満たして２６０μLとし、化学発光シグナルを測定した。図９に示すとおり、化学発光シグナルは、量り入れた直接Ｆ Ｘａ阻害剤及びトロンビン阻害剤のタイプ及び濃度の関数として低減される。量り入れた、Ｆ Ｘａを間接的に阻害するヘパリン（リケミン、フラグミン）も、また、化学発光シグナルの明確な減少をもたらす。

Claims (20)

1. 以下の工程ａ）及びｂ）を備える、試料中のタンパク質分解活性凝固因子の阻害剤を測定する方法。
   ａ）以下の成分；
   ｉ． 試料の一部標本
   ｉｉ． 規定量のタンパク質分解活性凝固因子、
   ｉｉｉ． タンパク質分解活性凝固因子の活性部位に結合するが該因子によりペプチド結合において切断されない、少なくとも１つのリガンド、
   ｉｖ． シグナル生成系の第１及び第２の成分であって、
   前記シグナル生成系の前記第１及び第２の成分が互いに密に近接させられたときに、検出可能なシグナルが生成され、ここで、前記タンパク質分解活性凝固因子は、インキュベーション中に前記シグナル生成系の前記第１の成分と会合しているか又は会合し得るものであり、且つ、前記リガンドは、インキュベーション中に前記シグナル生成系の前記第２の成分と会合しているか又は会合し得るものである、第１及び第２の成分；
   を含んでなる反応混合物を準備しインキュベートする工程；並びに
   ｂ）前記シグナル生成系の前記シグナル−ここで、前記シグナルの振幅は試料中の抗凝固剤濃度に反比例するものである−を測定する工程。
2. 前記タンパク質分解活性凝固因子の活性部位に結合する前記リガンドが、前記タンパク質分解活性凝固因子に対しＫｉ＝１０^-13ないし１０^-4Ｍの結合定数を有する、請求項１に記載の方法。
3. 前記シグナル生成系の前記第１及び第２の成分が、各々、微粒子固相を有しており、反応混合物中の前記微粒子固相の凝集が測定される、請求項１及び２のいずれか１項に記載の方法。
4. 前記シグナル生成系の前記第１の成分が化学発光剤であり前記シグナル生成系の前記第２の成分が光増感剤であるか、又は、前記第１の成分が光増感剤であり前記シグナル生成系の前記第２の成分が化学発光剤であって、前記反応混合物中の化学発光が測定される、請求項１及び２のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記化学発光剤が第１の微粒子固相と会合しているか若しくは前記光増感剤が第２の微粒子固相と会合しているか又はその両方である請求項４に記載の方法。
6. 前記リガンドが第１の結合ペアＡ／Ｂの第１の結合パートナーＡを有しており、前記シグナル生成系の前記第２の成分が前記第１の結合ペアＡ／Ｂの第２の結合パートナーＢを有しており、前記リガンドが、前記結合パートナーＡ及びＢの結合に起因して、前記シグナル生成系の前記第２の成分と、会合しているか又はインキュベーション中に会合するようになる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記リガンドがペプチド誘導体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記リガンドが、アルデヒド、ケトン、トリフルオロメチルケトン、α−ケトカルボン酸、α−ケトアミド、α−ケトエステル、エステル、ボロン酸、クロロメチルケトン、及びフッ化スルホニルからなる群から選ばれるカルボキシ末端基を有するペプチド誘導体である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記結合パートナーＡ及びＢが、それらが、ＦＬＡＧタグ／抗ＦＬＡＧタグ抗体、ＨＩＳタグ／抗ＨＩＳタグ抗体、フルオレセイン／抗フルオレセイン抗体、ビオチン／アビジン、及びビオチン／ストレプトアビジンからなる群から選ばれる結合ペアＡ／Ｂを形成するように選択される、請求項６に記載の方法。
10. 前記タンパク質分解活性凝固因子が、第２の結合ペアＸ／Ｙの第１の結合パートナーＸを有しており、前記第２の結合ペアＸ／Ｙの第２の結合パートナーＹが前記シグナル生成系の前記第１の成分と会合しており、前記タンパク質分解活性凝固因子が、前記結合パートナーＸ及びＹの結合に起因して、前記シグナル生成系の前記第１の成分と会合しているか又はインキュベーション中にそれと会合するようになる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. トロンビン阻害剤を測定するための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法であって、規定量のタンパク質分解活性凝固因子であるトロンビンを含んでなる反応混合物を準備しインキュベートする方法。
12. トロンビンの活性部位に可逆的に結合するが該化合物により切断されないペプチドであるビオチニル−Ｔｔｄｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｈを含んでなる反応混合物を準備しインキュベートする、請求項１１に記載の方法。
13. ヘパリン、ヘパリン誘導体、ビバリルジン、ヒルジン、ダビガトラン、アルガトロバン、メラガトラン、キシメラガトラン、レピルジン、ＭＣＣ−９７７、ＳＳＲ−１８２２８９、ＴＧＮ−２５５、ＴＧＮ−１６７、ＡＲＣ−１８３及びオジパルシルからなる群から選ばれるトロンビン阻害剤を測定するための、請求項１１及び１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 規定量のタンパク質分解活性凝固因子である第Ｘａ因子を含んでなる反応混合物を準備しインキュベートする、第Ｘａ因子阻害剤を測定するための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
15. ヘパリン並びにフォンダパリナックス、リバロキサバン、アピキサバン、オタミキサバン、ＬＹ ５１７７１７、ＹＭ １５３、ＤＵ−１７６ｂ、ＤＸ−９０６５ａ、及びＫＦＡ−１９８２からなる群から選ばれるヘパリン誘導体第Ｘａ因子阻害剤を測定するための、請求項１４に記載の方法。
16. 第Ｘａ因子の活性部位に可逆的に結合するが該因子により切断されないペプチドであるビオチニル−Ｔｔｄｓ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｈを含んでなる反応混合物を準備しインキュベートする、請求項１４及び１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 請求項１〜１６のいずれか１項による方法を実施するための試験キットであって、以下の個々の成分：
    ｉ． 規定量のタンパク質分解活性凝固因子を含んでなる第１の試薬；
    ｉｉ． 前記タンパク質分解活性凝固因子の活性部位に結合するが該因子によりペプチド結合において切断されない少なくとも１つのリガンドを含んでなる第２の試薬；
    ｉｉｉ． シグナル生成系の第１の成分であって、前記第１の試薬からのタンパク質分解活性凝固因子と会合可能な成分、を含んでなる第３の試薬；及び
    ｉｖ． シグナル生成系の第２の成分を含んでなる第４の試薬であって、前記成分は、第２の試薬からの前記リガンドに会合可能である；
    を、含んでなり、
    前記シグナル生成系の前記第１及び第２の成分は、前記第１及び第２の成分が互いに密に近接させられたとき、検出可能なシグナルが発生されるように、互いに作用する、キット。
18. 請求項１〜１６のいずれか１項による方法を実施するための試験キットであって、以下の個々の成分：
    ｉ． シグナル生成系の第１の成分と会合している規定量のタンパク質分解活性凝固因子を含んでなる第１の試薬；
    ｉｉ． 前記タンパク質分解活性凝固因子の活性部位に結合するが該因子によりペプチド結合において切断されない少なくとも１つのリガンドを含んでなる第２の試薬；及び
    ｉｉｉ． シグナル生成系の第２の成分であって第２の試薬からのリガンドと会合し得る成分；
    を含んでなり、
    ここで、前記シグナル生成系の前記第１及び第２の成分が、前記第１及び第２の成分が互いに密に近接させられたとき、検出可能なシグナルが発生されるように互いに作用する、キット。
19. 請求項１〜１６のいずれかによる方法を実施するための試験キットであって、
    以下の個々の成分：
    ｉ． 規定量のタンパク質分解活性凝固因子を含んでなる第１の試薬；
    ｉｉ． シグナル生成系の第１の成分であって第１の試薬からの前記タンパク質分解活性凝固因子と会合可能である成分；及び
    ｉｉｉ． 前記タンパク質分解活性凝固因子の前記活性部位に結合するが該因子によりペプチド結合において切断されない少なくとも１つのリガンドであって前記シグナル生成系の第２の成分と会合しているリガンド；
    を含んでなり、
    ここで、前記シグナル生成系の前記第１及び第２の成分が、前記第１及び第２の成分が互いに密に近接させられたとき、検出可能なシグナルが発生されるように互いに作用する、キット。
20. 請求項１〜１６のいずれかによる方法を実施するための試験キットであって、前記キットが、以下の個々の成分：
    ｉ． シグナル生成系の第１の成分と会合している規定量のタンパク質分解活性凝固因子を含んでなる第１の試薬；
    ｉｉ． 前記タンパク質分解活性凝固因子の活性部位に結合するが該因子によりペプチド結合において切断されない少なくとも１つのリガンドであって前記シグナル生成系の第２の成分と会合している第２の試薬；
    を、含んでなり、
    ここで、前記シグナル生成系の前記第１及び第２の成分が、前記第１及び第２の成分が互いに密に近接させられたとき、検出可能なシグナルが発生されるように互いに作用する、キット。

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