JPH04507253A - トロンビンの新規インヒビター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 トロンビンの　インヒビター 聚コ」ＪＵＬ也！ 本発明は、トロンビンに結合して阻害する新規な生物学的活性分子に関する。特 に、トロンビンの外部のアニオン結合部位に結合する部分（ＡＢＥＡＭ）、少な くとも長さが１８オングストロームのリンカ一部分およびトロンビンの触媒部位 に特異的な部分（ＣＳＤＭ）によって特徴付けられる。さらに本発明は、治療、 予防および診断の目的のためにこれらの分子を用いる組成物、組合せおよび方法 に関する。

１１茨困 急性の血管性疾患、例えば、心筋梗塞、脳卒中、肺塞栓症、深部静脈血栓症、末 梢動脈閉塞、および他の血管系の血栓症は、主要な生命の危険要因である。この ような病気はフィブリンおよび血小板を含有する血液クロットで、血管が一部ま たは完全に閉塞することによって起こる。

血栓性疾患の現在の治療および予防法には、２つの異なる経路のうち一つに作用 する治療剤が含まれる。第一のタイプの治療剤は、トロンビン活性またはトロン ビン形成を阻害し、それによりクロット形成を防止する。これらの薬物はまた、 血小板の活性化および凝集をも阻害する。第二のカテゴリーの治療法は、血栓溶 解を促進して血液クロットを溶解し、それにより血管から血液クロットを除去し て面流の阻止を解く［Ｊ、Ｐ、Ｃａｚｅｎａｖｅら、Ａ　ｅｎｔｓ　Ａｃｔｉｏ ｎ、Ｉｓ、カ且超１．　ｐｐ、２４−４９　（１９８４月。

前述のクラスの化合物であるヘパリンは、静脈血栓塞栓症などのトロンビン活性 が血栓の発生および成長に原因する症状を処置するために広く用いられている。

効果的ではあるが、ヘパリンは、出血および血小板減少症を含む望ましくない多 くの副作用を生じる。このことは、さらに特異的な毒性の少ない抗凝固剤の研究 を導いている。

ヒルジン（Ｈｆｒｕｄｆｎ）は、血を吸うヒル［ｒｕｄｏ　ｍｅｄｉｃｆｎａｉ 」によって産生される天然のポリペプチドである。ヒルの唾液腺で合成されるこ の化合物は、血液凝固の最も強力な天然の阻害剤であることが知られている。ヒ ルジンは、１：１）化学量論的な複合体としてトロンビン（Ｋｄ＝２　Ｘ　１０ −”　Ｍ）　ト固く結合して血液が凝固するのを防ぐ［Ｓ、　Ｒ，５ｔｏｎｅお よびＪ、　Ｈｏｆｓｔｅｅｎｇｅ、−Ｋｔｎｅｔｆｃｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｉｎｈ ｉｂｉｔｆｏｎ　ｏｆ　Ｔｈｒｏｍｂｉｎ　ｂｙ）１ｉｒｕｄｉｎ”、Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｓｔｒ　、２５．　ｐｐ、４５２２−２８　（１９８５）］。次に、こ れは、他の全てのトロンビン媒介性の経路を阻害するのと同様に、トロンビンが フィブリノーゲンからフィブリン（クロット）に転換するのを阻害する［Ｊ、　 ’ｌ／、　Ｆｅｎｔｏｎ、　１１．　”Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｈｒｏ ｍｂｉｎ　Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ”、　Ｓｅ＋ａ ｉｎ、　Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈｅｍｏｓｔ、、　１４．　ｐｐ、　２３４７４０　 （１９８８）］。

ヒルジンとトロンビンとの実際の結合には２つの工程がある。

最初に、ヒルジンは、触媒部位とは異なるトロンビン分子の親和性の「低い」部 位（Ｋａ＝ｌＸ　１０−”Ｍ）に結合する。この結合には、トロンビンの［アニ オン結合外ＮＦｔ、位Ｊ　（Ａ３Ｂ）とのヒルジンＣ末端の構造の相互作用が含 まれる［Ｊ、　Ｗ、　Ｆｅｎｔｏｎ、　１１ら、＋Ｔｈｒｏｍｂｉｎ　Ａｎｉｏ ｎ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｅｘｏｓｉｔｅ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ　ｗｉｔｈＨ ｅｐａｒｉｎ　ａｎｄ　’／ａｒｉｏｕｓ　Ｐｏ１ｙａｎｉｏｎｓ−、Ａｎｎ、 　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ａｃａｄ。

江ｉ、、　５５６．　ｐｐ、　１５８−６５　＜１９８９）］。親和性の低い結 合後、ヒルジン−トロンビン複合体は、立体構造の変化を経て、次にヒルジンは トロンビンの親和性の「高い」部位に結合するＣＳ、　Ｎ。

ｎｏら、−Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　５ｅｃｏｎｄａｒｙ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ 　ｏｆ　Ｈｉｒｕｄｉｎ　ａｎｄｔｈｅ　Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ　Ｃｈ ａｎｇｅ　Ｕｐｏｎ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｔｈｒｏｍｂｉｎ− 、Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、、　２６７、　ｐｐ、１５ １１−８５　（１９８８ンフ。

後者の部位は、トロンビンの活性部位に相当する。

ヒルジンの単離、精製および化学組成は当分野には公知である［Ｐ、　Ｗａｌｓ ｍａｎｎおよびＦ、　Ｍａｒｋｖａｒｄｔ、　−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎ ｄ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｔｈｒ ｏｍｂｉｎ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｈｔｒｕｄｉｎ”、　Ｐｈａｒｍａｚｉｅ、 　３６．　ｐｐ、　６５３−６０　（１９８１）］。最近、そのポリペプチドの 全アミノ酸配列が明かにされた［Ｊ、　Ｄｏｄｔら、−ＴｈｅＣｏｍｐｌｅｔｅ 　Ｃｏｖａｌｅｎｔ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｈｉｒｕｄｉｎ：　Ｌｏｃａ ｌｉｚａｔｉｏｎｏｆ　ｔｈｅ　Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ　Ｂｏｎｄｓ”、　Ｂｉｏ ｌ、　Ｃｈｅｍ、　）ｌｏ　ｅ−３ｅ　Ｌｅｒ、　３６６、ｐｐ、３７９−８５ 　（１９８５）；　Ｓ、Ｊ、Ｔ、Ｍａｏら、−Ｒａｐｉｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔ ｔｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅｖｉｓｅｄ　Ａｍ１ｎｏ　Ｔｅｒｍｉｎａｌ　５ｅｑｕｅ ｎｃｅ　ｏｆ　Ｈｉｒｕｄｉｎ：　Ａ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　、Ｔｈｒｏｍｂｉｎ 　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂｌｏｏｄ−Ｓｕｃｋｉｎｇ　Ｌｅｅｃ ｈ−９八ｎａ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１６１．　ｐｐ、　５１４−１８　（１９ ８７）：およびＲ，Ｐ、　Ｈａｒｖｅｙら、”Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｅｘｐ ｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｃＤＮＡ　Ｃｏｄｉｎｇ　ｆｏｒ　Ｌｈｅ　Ａｎｔ ｉ−Ｃｏａｇｕｌａｎｔ　Ｈｉｒｕｄｉｎ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｂｌｏｏｄｓｕ ｃｋｉｎｇ　Ｌｅｅｃｈ。

旧ｒｕｄｏ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ”、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８３゜ｐｐ、１０８４−８８　（１９８６）］。

少なくとも１０個のヒルジンの同質異性体が配列分析されていて、アミノ酸配列 がわずかに異なることが示されている［Ｄ、　Ｔｒｔｐｉｅｒ、　”Ｈｉｒｕｄ ｉｎ：　Ａ　Ｆａｍｉｌｙ　ｏｆ　ｌ５ｏ−Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、　＋５ｏｌａｔ ｉｏｎ　ａｎｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｅ ｗ　Ｈｉｒｕｄｉｎｓ−、Ｆｏｌ、ｉａＨａｅｍａｔｏｌ、、　１１５．　ｐｐ 、　３０−３５　（ＪＪ８ｇ）］、全ての型のヒルジンは、アミノ末端に主に疎 水性アミノ酸、および典型的にはカルボキシ末端に極性アミノ酸を有する、６５ あるいは６６個のアミノ酸を含有する一本鎖のポリペプチドタンパク質を有する 。さらに詳細には、全ての型のヒルジンは、１−２．３−５および４−６の半シ ステイニルパターンでの３つのジスルフィド架橋により固定されたＮ末端ドメイ ン（１−３９残基）、および高度に酸性であるＣ末端セグメント（４０−６５残 基）によって特徴付けられる。さらに、ヒルジンのＣ末端セグメントは、アミノ 酸６３位の硫酸エステル化されているチロシン残基によって特徴付けられる。

動物での研究では、ヒルから精製されたヒルジンが、静脈血栓症、脈管シャント 閉塞およびトロンビン誘導性の播種住血管内凝固を防ぐ効力が示された。さらに 、ヒルジンは毒性が低く、抗原性がほとんどなく、循環からのクリアランスタイ ムが非常に短い［Ｆ、　Ｍａｒｋｗａｒｄｔら、−Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ ａｌ　５ｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ　Ａｃｔ ｉｏｎ　ｏｆ　Ｆｌｉｒｕｄｉｎ　ｔｎ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ａｎｉｍ ａｌｓ−、Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔ、、　４７．　ｐｐ、　２２６−２ ９　（１９８２）］。

ヒルジンを大量供給するために、組換えＤＮＡ法によってポリペプチドを生産す る試みがなされてきた。天然ヒルジンに〇−硫酸エステル化チロシン残基が存在 すること、および微生物が類似のタンパク質修飾を行う能力がないことは、生物 学的に活性なヒルジンを組換え産生ずる見込みを高度に思索的なものにしている 。しかし、脱硫酸エステル化されたヒルジンは硫酸エステル化されたものとほと んど同程度に活性である（米国特許第４．６５４．３０２号）との観察によって 、Ｅ、　ｃｏｌｉ　（ヨーロッパ特許出願第１５８．５６４号、第１６８．３４ ２号および第１７１．０２４号）および酵母（ヨーロッパ特許出願第２００．６ ５５号）でのヒルジンのクローニングおよび発現法が導かれた。このような利点 にもかかわらず、ヒルジンは生産するにはまだほどほどに高価であって、そう広 くには入手可能ではない。

最近、凝集する時間を延ばす効果もある天然ヒルジンのペプチドフラグメントの 同定に努力が払われてきた。硫酸エステル化されていないヒルジンの２１個のア ミノ酸のＣ末端フラグメントであるＮ−アセチルヒルジンｍ５−６５は、インビ トロでクロット形成を阻害する。さらに、ヒルジンのＣ末端１１あるいは１２個 のアミノ酸（５５−６５位および５４−６５位の残基）に相当する、数個の他の 小さな硫酸エステル化されていないペプチドもまた、インビトロでクロット形成 を阻害する効果が示された［Ｊ、Ｌ、Ｋｒ５ｔｅｎａｎｓｋｙら、＋Ａｎｔｉｔ ｈｒｏｍｂｉｎ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　Ｃ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ　ｏｆ　 Ｈｉｒｕｄｉｎ　Ｕｓｉｎｇ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｕｎｓｕｌｆａｔｅｄ　Ｎ −ａｃｅｔｙｌ−ｈｉｒｕｄｉｎａｓ−ａｓ”、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　２１ １．　ｐｐ、　１０−１６　（１９８７）］。しかし、このようなペプチドフラ グメントは、低活性であるために継続中の治療法において血液りσノドを溶解す るには十分満足のゆくものではあり得ない。例えば、Ｎ−アセチル−ヒルジン４ ｓ−ｅｓは、天然のヒルジンよりは比活性が４桁低い。

フィブリンクロットの形成を触媒するのに加えて、トロンビンは他にいくつかの 生体調節能を有する［Ｊ、　Ｗ、　Ｆｅｎｔｏｎ、　１１、−Ｔｈｒｏｍｂｉｎ 　Ｂｉｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ−、Ａｄｖ、　Ｃｌ１ｎ、 　Ｅｎｚ肌１．、６．　ｐＩ）、　１８６−９３　（１９８８）］。例えば、ト トロピンは血小板凝集および放出反応を直接活性化する。このことは、トロンビ ンが急性血小板依存性の血栓症の中心的役割をなしていることを意味している［ Ｓ、　Ｒ，Ｈａｎｓｏｎおよびり、　Ａ、　Ｈａｒｋｅｒ、　−１ｎｔｅｒｒｕ ｐｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｃｕｔｅ　Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｔｈ ｒｏｍｂｏｓｉｓ　ｂｙｔｈｅ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉ ｎ　Ｄ−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ−Ｌ−Ｐｒｏｌｙｌ−Ｌ−Ａｒｇｉｎｙｌｃ ｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙＬｋｅｔｏｎｅ”、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ。

８５、　ｐｐ、　３１８４−８８　（１９８８）］。トトロピンはさらに、内皮 細胞中の血小板活性化因子（ＰＡＦ）の合成を促進することによって炎症反応を 直接活性化し得る［Ｓ、　Ｐｒｅｓｃｏｔｔら、”　Ｈｕｍａｎ　Ｅｎｄ。

ｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅ１ｌｓ　ｉｎ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｐｒｏｄｕｃｅ　Ｐｌａ ｔｅｌｅｔ−Ａｃｔｔｖａｔｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ　（１−ａｌｋｙｌ−２−ａ ｃｅｔｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）　’ ＩＩｈｅｎ　Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　Ｗｉｔｈ　Ｔｈｒｏｍｂｉｎ−、Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

山、　８１．　ｐｐ、　３５３４−３８　（１９８４）］。ＰＡＦは、内皮細胞 表面にさらされて、好中球接着およびそれに続く脱顆粒化のためのリガンドとし て働＜　［Ｇ、　Ｍ、　ＶｅｒｃｏＬｌｅｔｔｉら、”Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ａｃ ｔｔｖａｔｉｅ　ｉｎ　Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ　Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ−Ｍｅｄｉ ａｔｅｄ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｄａｍａｇｅ”、胆ヱ説、　７１．　ｐｐ 、　１１００−０７　（１９８８）］。あるいは、トトロピンは、浮腫を導き得 る血管浸透性を増すことにより炎症を促進し得る［Ｐ、Ｊ、Ｄｅｌ　Ｖｅｃｃｈ ｉｏら、−Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ　Ｐｅｒｍｅａｂｉｌ ｉｔｙ　Ｔｏ　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ−、Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃ、、　４ ６．　ｐｐ、　２５１１−１ｓ　（１９８７）］。トトロピンの活性部位をブロ ックする、ヒルジンなどの薬剤は、血小板および内皮細胞の活性化を阻止する［ Ｃ，Ｌ、　Ｋｎｕｐｐ、　”Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｔｈｒｏｍｂｉｎ　Ｉｎｈｉ ｂｆｔｏｒｓ　ｏｎ　ＴｈｒｏＩＩｌｂｉｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｒｅ１ｅａｓｅ 　ａｎｄ　Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ”、　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅｓ、。

４９、　ｐｐ、　２３−３６　（１９８８）コ。

さらにトロンビンは、その天然の消化産物であるフィブリンの能力に基づいて、 腫瘍成長の基質として癌腫を促進するコトカ示唆されティる［Ａ、　Ｆａｌａｎ ｇａら、”ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　 ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ：　Ａ　Ｃｙｓｔｅｉｎｅ　Ｐ ｒｏｔｅｉｎａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ｍａｌｉｇｎａｎｔ　Ｔｉ５ｓｕｅ−、虹二± 荘」±Ｈ，２４，ｐｐ、　５５５８−６７　（１９８５）：　Ｓ、Ｇ、Ｇｏｒｄ ｏｎら、−Ｃｙｓｔｅｉｎｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎ ｔ　Ｆｒｏｍ　Ａｍｎ１ｏｎ−Ｃｈｏｒｉｏｎ−、Ｂｌｏｏｄ、　６６゜Ｉ）ｐ 、　１２６１−６５（１９８５）、モしてＡ、Ｆａｌａｎｇａら、”Ａ　Ｎｅｗ 　Ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ　Ｉｎ　Ａｃｕｔｅ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ−、Ｂｌｏ ｏｄ、７１．　ｐｐ、８７０−７５　（１９８ｇ）］。そして、トトロピンは神 経突起退縮を引き起こす能力に基づいて、神経変性性の疾患に関係していると示 唆されている［Ｄ、　Ｇｕｒｗｉｔｚら、”Ｔｈｒｏｍｂｉｎ　Ｍｏｄｕｌａｔ ｅｓ　ａｎｄ　Ｒｅｖｅｒｓｅｓ　Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ　Ｎｅｕｒｉｔ ｅＯｕｔｇｒｏｗｔｈ”、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　 ＵＳＡ、　８５．　ｐｐ、　３４４０−４４　（１９８８）］。従ッて、トロン ビンのインボでの活性を調節する能力は、多くの臨床上の意義を示唆している。

今日までの発展にもかかわらず、クロット形成、血小板活性化、および種々の他 のトロンビン媒介性の経路においてトロンビンの機能を効果的に阻害する分子で 、安価にそして商業的に実行可能な量で生産され得る分子の必要性がいまだに存 在する。

Ｒ朋ヱ８」監 本発明は、α−トロンビンの親和性の低いアニオン結合外部部位（ＡＢＥ）およ び触媒部位の両者に結合することによりヒルジン作用を模擬する分子を提供する ことによって、前記の問題を解決する。これらの分子は、ヒルジンよりも強力で あり、従って、ヒルジンに基づく治療法に要求されるよりも比較的少量の投与量 で虫者に投与され得る。本発明の分子は、トロンビン媒介性あるいはトロンビン 関連の、任意の機能あるいは経路を阻害するための組成物および方法に使用され 得る。

これらの分子を含有する薬学的組成物、およびそれらを用いる、血管性疾患、炎 症反応、癌腫および神経変性性の疾患の治療あるいは予防法もまた、本発明の一 部である。さらに、これらの分子は、エキソビボでの画像化、体外面の貯蔵およ び処置、並びに挿入装置の被覆用組成物および方法に用いられ得る。そして、本 発明の分子は、薬剤の所定量の効果を増すかあるいは血液クロットを溶解するよ うな効果に必要とされる薬剤の量を減少させるために、フィブリン溶解剤と組み 合わせて患者に投与され得る。

その強い効能とそれらが化学合成によって調製され得る事実のために、本発明の 分子は、費用をあまりかけずに商業的に実効可能な量に調製され得る。さらに、 本発明の分子は、ヒルジンよりも十分に小さいので、これを用いて処置される患 者において望ましくない免疫応答を促進することはありそうもない。従って、こ れらのトロンビンインヒビターの使用は、急性疾患の処置に限定されない。これ らの分子は、アテローム性動脈硬化症および血管形成術後の再狭窄などの慢性血 栓塞栓症の治療にも使用され得る。本発明の分子は、天然あるいは組換えヒルジ ンの代用として、他の種々の応用にも使用され得る。

下記の開示から明かになるように、本発明の分子、組成物、および方法は、トロ ンビンの望ましくない影響に起因する種々の疾患の処置および予防、並びに診断 の目的に有用である。

図面の簡単な説明 図１は、スルホ−Ｔｙｒｓ３−Ｎ−アセチル−ヒルジン５３−８４が存在するか 、あるいは存在しない場合の、ＤＮＦＢ−［３′’Ｓ］−スルホ−Ｔｙｒ　６３ ヒルジン５４−６４のヒトα−トロンビンへの結合を示す、　５ＤＳ−ポリアク リルアミドゲルのオートラジオグラフを示す。

図２は、ヒトα−トロンビンの三次元モデルを示す。

図３のパネルＡは、ヒトα−トロンビンによるスベクトロザイムＴＨ開裂におけ るヒルログ−８（Ｈｉｒｕｌｏｇ−８）およびスルホ−Ｔｙｒｓ３ヒルジン５３ −８４の効果を示す０図３のパネルＢは、ヒルログ−８あるいはスルホづＹｒ６ ３ヒルジン５３−８４のいずれかの存在下あるいは非存在下での、ヒトα−トロ ンビンによる、スペクトロザイムＴＨ開裂のＬｉｎｅｖｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋｅ プロットを示す。

図４は、正常ヒト血清の活性化された部分的トロンボプラスチンタイムに対する 、種々の濃度のヒルログ−８、ヒルジンあるいはスルホ−Ｔｙｒａ３−Ｎ−アセ チル−ヒルジン５３−６４の効果を示す。

図５のパネルＡは、ヒトα−トロンビンによる種々の濃度のヒルログ−８による 開裂の経時変化を示す。

図５のパネルＢは、ヒルログ−８の濃度と、ヒトα−トロンビンによるスベクト ロザイムＴＨ加水分解阻害の持続との関係を示す。

図６は、スペクトロザイムＴＨのトロンビン触媒による加水分解の阻害に対する 、本発明のトロンビンインヒビターのリンカ−の長さの影響を示す。

図７は、”Ｃ−ＤＦＰによるトロンビン修飾に対する、種々の濃度のヒルログ− ８あるいはスルホ−７ｙｒｓ３−Ｎ−７セチルーヒルジン！１３−６４の阻害効 果を示す。

図８は、ヒトのＡＰＴＴに対する、ヒルログ−８の種々の投与量のインビボでの 効果を示す。

図９は、可溶性トロンビンあるいはクロット結合トロンビンによる、フィブリノ ーゲンの加水分解に対する、ヒルログ−８あるいはヘパリンの阻害効果の比較を 示す。

図１０は、ヒトの大動脈の動脈内膜切除されたセグメント上の血小板沈着に対す る、ヒルログ−８の種々の投与量のインビボでの効果を示す。

図１１は、ヒトに挿入された、コラーゲン被覆されたチューブのセグメント上の 血小板沈着に対する、ヒルログ−８の種々の投与量のインビボでの効果を示す。

図１２は、ヒトのＡｔ／シャントに挿入された、コラーゲン被覆されたチューブ のセグメント上の血小板沈着に対する、ヘパリン、ヒルジンおよびヒルログ−８ のインビボでの効果の比較を示す。

図１３は、ヒトのＡＶシャントに挿入された、コラーゲン被覆されたチューブの セグメント上のフィブリン沈着に対する、ヒルログ−８の種々の投与量のインビ ボでの効果を示す。

図１４は、ヒルログ−８のヒトの静脈内ポーラス注射後の、ＡＰＴＴの経時変化 を示す。

図１５は、ヒルログ−８のヒトの皮下注射後の、ＡＰＴＴの経時変化を示す。

図１６は、うｙトモデルでの再潅流するまでの時間に対する、生理食塩水、ヘパ リン、ヒルジンあるいはヒルジン−８のいずれかを伴っての、組織プラスミノー ゲン活性化因子のインビボでの効果の比較を示す。

図１７は、う、トモデルでの、生理食塩水、ヘパリン、ヒルジンあるいはヒルロ グ−８のいずれかを伴っての、組織プラスミノーゲン活性化因子の再閉塞時間に 対するインビボでの効果の比較を示す。

図１８は、ラットモデルでの、生理食塩水、へ／＜リン、ヒリジンあるいはヒル ログ−８のいずれかを伴っての、組織プラスミノーゲン活性化因子のＡＰＴＴに 対するインビボでの効果の比較を示す。

図１９は、う、トモデルでの、生理食塩水、へ、＋ｆ　ＩＪ　ン、ヒルノンある いはヒルログ−８のいずれかを伴っての、組織プラスミノーゲン活性化因子の血 管の開通に対するインビボでの効果の比較を示す。

図２０は、ヒトモデルでの出血時間に対するヒルログ−８の種々の投与Ｉの効果 を示す。

良災ユ昆皿久五里 本明細書および特許請求の範囲を通して下記のアミノ酸の一般的な略号が用いら れている： （以下余白） ｏｒｎ　−才７１．−チンＧｌｙ　−７’す：／／Ａｌａ　−７うｚ＞　Ｖａｌ 　−／Ｙ！／７Ｌｅｕ　−ロイシン　エ１８−　イｙｏＩシンＰｒｏ−アＯす： ｙ　Ｐｈｅ　−７ｃ＝ルアうニアＴｒＰ　−１−リアトファン　Ｎｅｔ　−１チ オユ。

ｓａｒ　−’Ｑリシン　Ｔｈｒ−スし才“２Ａｓｐ　−アスハ・ラギンーに、− Ｇｌｕ　−７Ｈレダミン殻Ｌｙｓ　−リシン　ｐｘｑ　−フルギニンＨｉｓ　− じ又ナジーン　Ｎｌａ　−／ルロイシンＨＹＰ　−ヒト゛り″ｆシフ’ｅ）リン 　Ｐ９１−　７ｃ＝＋し’７−リシ／ｃｂｚ　−ｉ＋ｂπく杉へ；／　２’ｌ　 Ｌオキ；　Ｄ−Ａｌａ　−Ｄ−７ラニン本明細書に用いられている用語「任意の アミノ酸」には、天然のアミノペプチドの合成アナログを調製する際の、天然の アミン酸のし一異性体およびペプチド化学の分野の当業者（こ一般的に用いられ ている池の「非タンパク質」α−アミノ酸が含まれる。天然のアミノ酸には、グ リシン、アラニン、バリン、ロイシン、インロイシン、セリン、メチオニン、ス レオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システィン、プロリ ン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、 γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチンおよびリシンがある。「 非タンパク質」　α−アミノ酸の例には、ノルロイシン、ノルバリン、アロイソ ロイシン、ホモアルギニン、チアプロリン、デヒドロプロリン、ヒドロキシプロ リン（Ｈｙｐ）、ホモセリン、シクロへキシルグリシン（Ｃｈｇ）、α−アミ７ −ｎ−酪酸（Ａｂａ）、シクロへキシルアラニン（Ｃｈａ）　、アミノフェニル 酪酸（Ｐｂａ）、フェニル部分の、オルト、メタ、あるいはバラ位で、下記の１ つあるいは２つで置換されたフェニルアラニンが含まれる：　（Ｃ＋−Ｃ４）ア ルキル、（Ｃ＋−Ｃ４）アルコキシ、ハロゲンまたはニトロ基、あるいはメチレ ンジオキシ基による置換；β−２−および３−チェニラルーアラニン、β−２− および３−フラニルアラニン、β−２−１３−および４−ピリジルアラニン、β −（ベンゾチェニル−２−および３−イル）アラニン、β−（ｌ−および２−ナ フチル）アラニン、セリン、スレオニン、あるいはチロシンの０−アルキル化誘 導体、Ｓ−アルキル化システィン、Ｓ−アルキル化ホモシスティン、チロシンの 〇−硫酸エステル、０−リン酸エステルおよび〇−カルボキシルエステル、３− および５−スルホニルチロノン、３−およヒ５−カルポニルチロシン、３−およ び５−ホスホスホチロシン、４−メチルスルホニルチロシン、４−メチルホスホ ニルチロシン、４−フェニル酢酸、３．５−ショートチロシン、３−オヨヒ５− 二トロチロジン、ε−アルキルリシン、δ−アルキルオルニチン、および天然の アミノ酸のｑ−異性体。

本明細書で、硫酸化チロシン、Ｔｙｒ（ＯＳＯ３Ｈ）、およびチロシンの〇−硫 酸化エステルと称する化合物は同一のものであり、下記の構造式を有する。

本明細書で、スルホン化チロシン、Ｔｙｒ（Ｓ０３Ｈ）、３−スルホニルチロシ ンおよび５−スルホニルチロシンと称する化合物は同一のものであり、下記の構 造式を有する。

用語「患者」とは、本願においては任意の哺乳動物、特にヒトのことである。

本明細書で用いられている「アニオン性アミノ酸」とは、メタ、パラあるいはオ ルト位で、モノあるいはジ置換されたフェニルアラニン、シクロへキシルアラニ ンあるいはカルボキシル、ホスホリルあるいはスルホニル部分を有するチロシン 、およびＳ−アルキル化システィン、Ｓ−アルキル化ホモシスティン、γ−カル ボキシグルタミン酸、ε−アルキルリシン、δ−アルキルオルニチン、グルタミ ン酸およびアスパラギン酸を意味する。アニオン性アミノ酸の例には、ホスホス レオニン、ホスホセリン、ホスホチロシン、３−１４−アルいは５−スルホチロ シン、３−メチルホスホニルチロシンおよび３−メチルスルホニルチロシンが含 まれる。

本明細書で用いられている用語「触媒部位」、「活性部位」および「活性部位ポ ケット」は、それぞれ下記に示されるトロンビンの部位のいずれかあるいは全て のことである二基質結合あるいは「Ｓｌ」部位；疎水結合あるいは「油性」部位 ；および基質の開裂が実際に起こる部位（「電荷を受け渡す部位」）。

本明細書で用いられている用語「ＪＪＯｒｎＪとは、オルニチンの側鎖の窒素の ことである。用語ＩＴＮ’Ｊとは、アルギニンの側鎖の任意の窒素のことである 。用語「Ｎ″」とは、アミノ酸のα−アミノ基のことである。そして、本明細書 および特許請求の範囲に用いられている用語「ムユ」とは、Ｊ、　Ｒｕｄｉｎｇ ｅｒ。

Ｉｎ　Ｄｒｕ　Ｄｅｓｆ　ｎ、ｖｏｌ、目、Ｅ、　Ｊ、　Ａｒ１ｅｎｓｌａ、Ａ ｃａｄｅｒｓｉｃ　Ｐｒｏｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐ、　３１９　（１９ ７１）に記載の命名法に従って、括弧内に示した原子によるアミド結合の置換の ことである。

本明細書に用いられている用語「骨格路」とは、化学構造の一端から他の端にた どりつけ得る、最も数少ない連続した結合である化学構造の一部である。骨格路 をなす元素組成には、少な（とも２つの他の原子と結合を形成し得る任意の原子 が含まれ得る。

例えば、下記の各々の化学構造は、７個の原子（骨格路に含まれる原子はボール ド体で示されている）の骨格路によって特徴付られる。

本願で用いられている用語「計算上の長さ」とは、骨格路の原子間の結合の長さ の合計によって予測される長さのことである。任意の２つの原子間の結合の長さ は当分野では公知ｔｏｎ、　ＰＬ、　ｐｐ、　Ｆ−１５６−７０（１９８４）を 参照のと）。

本発明は、トロンビンに結合してそしてトロンビンを阻害する分子に関する。こ れらの分子は、３つのドメイン、すなわち、触媒部位特異的部分（”ＣＳＤＭ” ）、リンカ−領域、および外部のアニオン結合部位に結合する部分（“ＡＢＥＡ Ｍ”）によって特徴付けられる。

本発明による、最初のドメインＣＳＤＭは、５ｅｔ−１９５位あるいはその付近 のトロンビンの触媒部位に結合して、トロンビンのアミド結合分解活性あるいは エステル結合分解活性を阻害あるいは妨害する。好ましくは、本発明のＣ３ＤＭ は、下記の３つの一般的な基のうちの１つから選択される：　トロンビンに可逆 的に結合して徐々に開裂される基；　トロンビンに可逆的に結合して開裂されな い基；およびトロンビンに不可逆的に結合する基。可逆的なインヒビターは、ト ロンビンの活性部位に、イオン結合、疎水性相互作用あるいは水素結合のような 非共有的な相互作用によって結合する。不可逆的なＣＳＤＭは、トロンビンと共 有結合する。

好ましい実施態様では、可逆的にトロンビンに結合して徐々に開裂されるＣＳＤ Ｍは、下記の式を有する：Ｘ−ＡＩ−Ａ２−Ａ３−Ｙ ここでＸは水素であるか、あるいは１から３５個の原子からなる骨格鎖によって 特徴付けらる；Ａ１は、Ａｒｇ、　ＬｙｓあるいはＯｒｎである：Ａ２は、非ア ミド結合である；Ａ３は、１から９個の原子からなる骨格鎖によって特徴付けら れる：そしてＹは、結合手である。

この実施態様に従う非アミド結合成分は、アミド結合を化学的に修飾することに よって形成され得る。このことは、当分野に公知の方法によって達成され得る［ Ｍ、　５ｚｅｌｋｅら、“Ｐｏｔｅｎｔ　Ｎｅｗ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ 　Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｎ１ｎ−、Ｎａｔｕｒｅ、　２９９．　ｐｐ、　５５５−５ ７　（１９ｇ２）：　Ｄ、Ｈ，Ｃｏｙら、”Ｆａｃｉｌｅ　５ｏｌｉｄ　Ｐｈａ ｓｅ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　Ｃｏｎｔａｉｎｉｎ ｇ　ｔｈｅ　ＣＨ２−ＮＨＰｅｐｔｉｄｅ　Ｂｏｎｄ　ｌ５ｏｓｔｅｒｅ　ａｎ ｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｔｈｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｓｏ ｍａｔｏｓｔａｔｉｎ　（ＳＲＩＰ）　０ｃｔａｐｅｐｔｉｄｅ　Ａｎａｌｏｇ ｕｅｓ−、Ｐｅ　ｔｉｄｅｓ　１９８６．　Ｄ、　Ｔｈｅｏｄｏｒｏｐｏｕｌｏ ｓｇ、、１Ｖａｌｔｅｒ　ＤｅＧｒｕｙｔｅｒ　ａｎｄ　Ｃｏ、、　Ｂｅｒｌｉ ｎ、　ｐｐ、　１４３−４６　（１９８７）］。非アミド結合がこの様式で形成 される場合には、　ＣＳＤＭの他の成分あるいはトロンビンインヒビター分子の 化学修飾を行うのが好ましい。このような様式においては、ジペプチドＡｌ−Ａ ２−Ａ３は、１つのかたまりとして、１回の合成工程で分子の残りの部分に付加 される。

より好ましい実施態様では、Ａ１はＡｒｇであり、モしてＡ３はＰｒｏ、　Ｄ− ＰｒｏあるいはＳａｒである。この実施態様では、Ａ２は天然のイミド結合であ って、これは徐々にトロンビンによって開裂される。このことは、非アミド結合 の前もって形成する必要性をなくし、Ａ１およびＡ３は、かたまりとしてではな く順次に分子の残りの部分に付加することを可能にする。

前述のように、本発明のＣＳＤＭは、不可逆的にトロンビンに結合し得る。不可 逆的なＣＳＤＭの例には、フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ） 　、ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）　、ｌ−シルプロリルクロ ロメチルケトン（ＴＰＣＫ）およびトシルリシルクロロメチルケトン（ＴＬＣに ）などの一般的なセリンプロテアーゼインヒビター：イソクマリンなどのヘテロ サイクリックプロテアーゼインヒビター；　Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＣＨ Ｃ１２（ＰＰＡＣＫ）などのトロンビン特異的インヒビター；およびジフルオロ ケトメチレンなどの遷移状態のアナログが含まれる。しかしこれらには限定され ない。

本発明の他の実施態様では、開裂され得ない可逆的なＣＳＤＭは、下記の式から なる： Ｘ−Ｃ＋−Ｃ２−Ａ３−Ｙ ここで０１は、還元カルボキシル基あるいは１から１０個の原子の骨格鎖で特徴 付けられる化学構造によって、α−炭素で置換されるカルボキシル基によって特 徴付けられるＡｒｇ、　ＬｙｓあるいはＯｒｎの誘導体；Ｃ２は、開裂され得な い結合；およびＸ、ＹおよびＡ３は前記定義された通りである。自の成分の例に は、β−ホモアルギニン、Ａｒｇ［ＬｉＣＨｚＮＨ］などの還元カルボキル化部 分を含有するアルギニン；β−ホモリシンおよびβ−ホモオルニチンがある。

本発明のトロンビンインヒビターに用いられる他の開裂され得ない可逆的ＣＳＤ Ｍは、ベンズアミジン、ＤＡＰＡ％！ＪＡＰＡＰおよびアルガトロバン（ａｒｇ ａｔｒｏｂａｎ）　（アルギピジン（ａｒｇｉｐｉｄｉｎｅ））がある。

ＣＳ０Ｍ領域がＡ２結合あるいはＣ２結合によって特徴付けられる本発明のトロ ンビンインヒビターに対する、本明細書に用いられている用語ｒＰ＋−Ｐ＋’Ｊ 配列は、この結合によってつながれている２つの化学構造のことである。

ＣＳＤＭのＸ成分は、触媒部位への実際の結合にはかかわらないで、限定されな い長さで種々変えられ得る。しかし、実用的目的および合成の費用を減少させる ためには、Ｘは、１から３５個の原子の骨格鎖で、計算上の長さが３６オングス トロームを越えないのが好ましい。好ましくは、Ｘはペプチドであり、最も好ま しくは、込−Ｐｈｅ−Ｐｒｏである。この最も好ましい実施態様では、Ｘ成分は 、トロンビンの活性部位に隣接する溝にはまり得る［Ｓ、Ｂａｊｕｓｚら、−１ ｎｈｉｂｆｔｉｏｎ　ｏｆ’　Ｔｈｒｏｍｂｔｎ　ａｎｄ　Ｔｒｙｐｓｉｎｂｙ 　Ｔｒｉｐｅｐｔｆｄｅ　Ａｌｄｅｈｙｄｅｓ”、　Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｐｅ　ｔ ｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ。

、１２．　ｐｐ、２１７−２１　（１９７８）；　Ｃ，Ｋｅｔｔｎｅｒら、−Ｄ −Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＣＨ２Ｃｌ−Ａ　５ｅｌｅｃｔｉｖｅ　Ａｆｆｉｎ ｉｔｙ　Ｌａｂｅｌ　ｆｏｒ　Ｔｈｒｏｍｂｉｎ−、Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｒｅｓ、 、１４．　ｐｐ、　９６９−７３　（１９７９）］。これにより、ＣＤ５Ｍ成分 、従って本発明の分子は、有利に高度の親和性および最適な特Ｘ性でトロンビン に結合できる。

本発明による、本発明のトロンビンインヒビターの第二の成分は、リンカ−領域 である。分子のこの部分の役割は、Ｃ３ＤＭとＡＢＥＡＭとの間の架橋を提供す ることなので、構造よりもリンカ−の長さが最も重要である。リンカ−を特徴付 ける骨格鎖の計算上の長さは、トロンビンの触媒部位とアニオン結合外部部位と の間の距離であり、少なくとも約１８オングストロームでなければならず、約４ ２オングストロームを越えてはならない。

リンカ−の骨格鎖は、少な（とも２つの他の原子に結合し得る任意の原子を含有 し得る。好ましくは、骨格鎖は、酸素、炭素、窒素およびイオウから選択される 原子の化学的に可能な組合せからなる。当業者には、既知の種々の結合の距離に 基づいて、前記骨格鎖の原子のどのような組合せが必要な長さになるのか明かで ある［例えば、Ｒ，Ｔ、　ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＲｌＮ、　Ｂｏｙｄ、　Ｏｒ 　ａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ　３ｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、　Ａ１１ｙｎ　ａｎ ｄ　Ｂａｃｏｎ、Ｉｎｃ、、　Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　（ １９７７）を参照のこと］。

好ましい実施態様では、リンカ−は、アミノ酸配列ｃｌｙ−ｃｔｙ−Ｇｌｙ−Ａ ｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅを宵するペプチドである。好ましくは、ＡＢＥＡ Ｍ成分に結合するアミノ酸はＰｈｅである。

本発明のトロンビンインヒビターの第三のドメインは、トロンビンのアニオン結 合外部部位に結合するＡＢＲＡＭ成分である。

好ましくはＡＢＥＡＭは、下記の式を有する：ＩＶ−Ｂｔ−８２−Ｂｉ−Ｂａ− Ｂｓ−Ｂｅ−Ｂ７−Ｂｅ−ＺここでＷは、結合手であり；Ｂ１は、アニオン性ア ミノ酸であり；Ｂ２は、任意のアミノ酸であり；Ｂ３は、ｌｉｅ、　Ｖａｌ、° Ｌｅｕ、　ＮｌｅあるいはＰｈｅであり−Ｂ４は、Ｐｒｏ、８７ｐ、３．４−デ ヒド０Ｐｒｏ、チアゾリジン−４−カルボン酸、５ａｒｓ　任意のトメチルアミ ノ酸あるいはＤ−Ａｌａであり；Ｂ５は、アニオン性アミノ酸であり；Ｂ６は、 アニオン性アミノ酸であり；Ｂ７は、Ｔｙｒ％Ｔｒｐ、　ＰｈｅＳＬｅｕ、　Ｎ 　１ｅ、　Ｉ　ｌｅ、　Ｖａｌ、　Ｃｈａ、　Ｐｒｏでなる群から選択される脂 質親和性アミノ酸、あるいはこれらの脂質親和性アミノ酸の１つと任意のアミノ 酸とからなるジペプチドであり；Ｂ８は、結合手あるいは任意のアミノ酸の１か ら５残基を有するペプチドであり；およびｚは、ＯＬ　Ｃｔ−Ｃａアルコキシ、 アミノ、モノあるいはジー　（Ｃｔ−Ｃ４）アルキル置換アミノあるいはベンジ ルアミノから選択されるカルボキシ末端残基である。

ヒルジンのカルボキシ末端に相同であるペプチドは、トロンビンのアニオン結合 外部部位に結合することが報告されている〔係属中の同時出願である米国特許出 願第３１４．７５６号およびＪ、Ｍ、Ｍａｒａｇａｎｏｒｅら、”Ａｎｔｉｃｏ ａｇｕｌａｎｔ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｈｉｒｕｄｉ ｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”、　Ｊ、　Ｂｊｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６４．　ｐｐ、　 ８６９２−９８　（１９８９）；両者とも本明細書に参考として援用されている ］。

本発明の好ましい実施態様では、ＡＢＥＡＭは、ヒルジンの５６−６４位のアミ ノ酸に相同である。す違わち、Ｂ１はＧｌｕであり、Ｂ２はＧｌｕであり；Ｂ３ はｌｉｅであり；Ｂ４はＰｒｏであり；Ｂ５はＧｌｕであり；Ｂ６はＧｌｕであ り；Ｂ７はＴｙｒ−ＬｅｕＳＴｙｒ（ＳＯ２計）−ＬｅｕあるいはＴｙｒ（ＯＳ Ｏ３１（）−Ｌｅｕ、あるいは（３−，５−ショートＴｙｒ）−Ｌｅｕであり； Ｂ８は結合手であり；そして２はＯＨである。天然のヒルジンが６３位にＴｙｒ （ＯＳＯ３Ｈ）を有することは注目されるべきである・。しかし、Ｔｙｒ（Ｓ（ ｈ）Ｉ）を有するカルボキシ末端のヒルジンペプチドは、天然のＴｙｒ（ＯＳＯ ３Ｈ）を有するものと同じ抗凝固活性を有する［係属中の同時出願である米国特 許出願第３１４，７５６号を参照のこと］。

本発明の範囲内の他のＡＢＥＡＭ成分は、トロンビンのアニオン結合部位に結合 することが知られている任意の分子の一部を含み得る。これらには、第Ｖ因子の １６７５−１６８６位のアミノ酸、血小板糖タンパク質１ｂの２７２−２８５位 のアミノ酸、トロンボモジニリン（ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ）の４１５− ４２８位のアミノ酸、プロトロンビンの第二フラグメントの２４５−２５９位の アミノ酸、およびフィブリノーゲンＡα鎖の３０から４４位のアミノ酸が含まれ る。さらに、ＡＢＥＡＭ成分は、Ｊ、Ｌ、１［ｒｓｔｅｎａｎｓｋｙら、−Ｄｅ ｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　。

ｆ　ＭＤＬ−２８，０５０，Ａ　５ＩＩｌａｌｌ　５ｔａｂｌｅ　Ａｎｔｉｔｈ ｒｏｍｂｆｎ　Ａｇｅｎｔ　Ｂａ５ｅｄＯｎ　Ａ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｄｏ ｍａｉｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｌｅｅｃｈ　Ｐｒｏｔｅｆｎ、　Ｈｔｒｕｄｉｎ−。

Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、、　６３．　ｐｐ、　２０ｇ−１４（１ ９９０）に記載されているヒルジンペプチドの任意のアナログから選択され得る 。

本発明の好ましいトロンビンインヒビターは、ヒルログ（Ｈｉｒｕｌｏｇ）と呼 ばれ、次の実施例に記載されている。最も好ましいヒルログは、ヒルログ−８、 ヒルログ−１２、ヒルログ−１８ａ。

ヒルログ−ｔａｂおよびヒルログ−３３である。ヒルログ−８、−１２および− ３３は、可逆的なトロンビンインヒビターであって、徐々に開裂される。ヒルロ グ−１８ａおよび一１８ｂは、開裂されない可逆的なインヒビターである。

本発明のトロンビンインヒビターは、当分野には公知の種々の方法によって合成 され得る。これらには、天然ある一Ｎｅｔ組換えヒルジンの酵素的開裂、組換え ＤＮＡ法、固相ペプチド合成、液相ペプチド合成、有機化学合成法、あるいはこ れらの方法の組合せが含まれる。合成法の選択は、もちろん特定のインヒビター の組成に依存する。本発明の好ましい実施態様では、トロンビンインヒビターは 完全にペプチド性であって、固相ペプチド合成法、液相ペプチド合成法、あるい はこれらの分子を商業的な量で生産するためにコスト的に最も効率的な方法にな るこれらの組合せによって合成される。

「非タンパク質」アミノ酸がトロンビンインヒビター分子に含まれる場合には、 所望の「非タンパク質」アミノ酸の性質によってペプチド合成の間に作られる鎖 に直接に付加されるか、あるいは完全に合成されたペプチドに化学修飾して調製 され得る。化学合成分野の当業者には、「非タン、ｆり貫」アミノ酸が直接付加 され得ること、およびペプチド合成後に完全なペプチド鎖を化学修飾して合成さ れ得ることは明かである。

非アミノ酸およびペプチド性部分を含有する本発明のそれらのトロンビンインヒ ビターの合成は、好ましくは、異種混合／固相合成法によって達成される。この 方法には、分子のペプチド部分の全であるいはほとんどを固相合成し、その後、 液相合成法によって合成された非アミノ酸成分を付加する方法が含まれる。非ア ミノ酸は、固相あるいは液相法によってペプチド性部分にカップリングされ得る 。同様に、いかなる残りのペプチド性部分もまた固相あるいは液相法によって付 加され得る。

本発明の分子は、強力な抗凝固活性を示す。この活性は、従来の方法を用いてイ ンビトロでアッセイされ得る。好ましくは、抗凝固活性のアッセイには、分子の トロンビン阻害活性の直接測定が含まれる。このような方法は、トロンビン触媒 によるの比色用基質の開裂の阻害の測定、あるいは、さらに好ましくは、ヒト血 漿中のトロンビンタイムの増加あるいは活性化部分的トロンビンブラスチンタイ ムの増加を測定する。後者のアッセイでは、「内因性」の凝固経路におけるファ クターが測定される。あるいは、使用されるア、ッセイでは、ラジオイムノアッ セイあるいはＥＬＩＳＡによってフィブリノペプチドＡあるいはＢの放出の阻害 を測定するために、精製トロンビンおよびフィブリノーゲンが用いられ得る。

本発明の分子の抗血小板活性はまた、多くの従来からのいずれの血小板アッセイ によっても測定され得る。好ましくは、アッセイは、血小板の凝集の程度の変化 、あるいはトロンビン存在下での血小板分泌成分の放出の変化を測定する。前者 は、ａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｅｒで測定され得る。後者は、分泌される成分に特異 的なＲＩＡあるいはＥＬＩＳＡ法を用いて測定され得る。

本発明の分子は、トロンビン触媒性およびトロンビン関連の機能および経路に起 因する種々の疾患の治療および予防のための、組成物、組合せおよび方法に有用 である。これらには、心筋梗塞、脳卒中、肺動脈梗塞症、深部静脈血栓症、末梢 動脈閉塞、動脈損傷あるいは心臓への挿入手順後の再狭窄、急性または慢性のア テローム性動脈硬化症、浮腫、および炎症、種々の細胞調節過程（例えば、分泌 、形状の変化、増殖）、癌腫および転移、および神経変性性の疾患が含まれる。

本発明のトロンビンインヒビターは、薬学的に受容可能なキャリアーの添加など の、薬学的に有用な組成物を調製するための従来法を用いて処方され得る。それ らを用いるこれらの組成物および方法は、患者の血栓性疾患を処置あるいは予防 するために用いられ得る。

本発明の他の実施態様では、トロンビンインヒビターは、患者の、血栓性疾患を 処置するため、および再潅流の確立あるいは再閉塞の予防に必要とされる血栓溶 解剤投与量を減少させるための、組合せ、組成物および方法に用いられ得る。

さらに、本発明のトロンビンインヒビターは、血栓溶解剤で処置されている患者 の再潅流するまでの時間の減少あるいは再閉塞するまでの時間の増加のための組 合せ、組成物および方法に使用され得る。これらの組合せおよび組成物は、本発 明のトロンビンインヒビターの薬学的に有効な量、および血栓溶解剤の薬学的に 有効な量を含有し得る。

このような組合せおよび組成物においては、トロンビンインヒビターおよび血栓 溶解剤は、相捕的に作用して血液クロットを溶解し、その結果、それで処置され ている患者の再潅流するまでの時間の減少および再閉塞するまでの時間の増加を 図る。特に、血栓溶解剤は、クロットを溶解する一方、トロンビンインヒビター は、新たに曝され、クロットに捕らえられるトロンビン、あるいはクロットに結 合したトロンビンが、クロットを再発生させることを防ぐ。本発明の組合せおよ び組成物中のトロンビンの使用は、以前には、少なすぎてそれのみでは血栓溶解 効果が得られないと考えられてた投与量での血栓溶解剤の投与が有利に可能であ る。このことは、出庇合併症のような、血栓溶解剤の使用に伴う望ましくない副 作用のいくらかは避ける。

本発明の組合せおよび組成物に用いられ得る血栓溶解剤は、当分野では公知であ る。このような薬剤には、天然原料から精製された組織プラスミノーゲン活性化 因子、組換え組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼ、ウロキナ ーゼ、プロウロキナーゲ、単離されていないストレプトキナーゼプラスミノーゲ ン活性化因子複合体（ＡＳＰＡＣ）　、動物の唾液腺プラスミノーゲン活性化因 子、および公知である前述の任意の生物学的に活性な誘導体が含まれる。しかし これらには限定されない。

本明細書に用いられている用語「組み合わせ」には、少なくともｘＮの本発明の トロンビンインヒビターと、少なくとも１種の血栓溶解剤とを含有する単回投与 形式；　トロンビンインヒビターと血栓溶解剤とを同時ではなく、別々に投与す る複数回投与形式；あるいは２種の成分を連続して別々に投与する複数回投与が 含まれる。連続投与では、トロンビンインヒビターは、血栓溶解剤の投与の約５ 時間前から約５時間後のあいだの期間に患者に投与され得る。好ましくは、トロ ンビンインヒビターは、血栓溶解剤の投与の２時間前から２時間後の間に患者に 投与される。

アルいは、トロンビンインヒビターおよび血栓溶解剤は、単一の形態、すなわち 結合分子の形態であり得る。２つの成分の結合は、当分野では公知の標準的な架 橋結合法によって達成され得る。さらに単一分子は、トロンビンインヒビターと 血栓溶解剤との両方がペプチドであるときには、組換え融合タンパク質の形態を 取り得る。

種々の投与形式が、本発明の組成物および組み合わせを投与するために用いられ 得る。これらには、非経口投与、経口投与および局所施用が含まれるが、しかし これらには限定されない。本発明の組成物および組み合わせは、患者に薬学的に 受容可能な任意の投与形式で投与され得る：これには、静脈内へのポーラス単回 投与あるいは持続注入；を推労および関節周囲の筋肉内、皮下、皮肉、関節内、 滑液嚢内、包膜内、病巣内、骨膜；あるいは経口、経鼻、または局所経路によっ て投与され得る。このような組成物および組み合わせは、好ましくは、局所、経 鼻、経口および非経口投与に適応されるが、最も好ましくは、非経口投与用に処 方される。

非経口用の組成物は、最も好ましくはポーラス単回投与あるいは持続注入のいず れかで、静脈内に投与される。トロンビンインヒビターが抗血小板化合物として 用いられる時には、持続注入が好ましい。トロンビンインヒビターが抗凝固剤と して用いられるときには、皮下、あるいは静脈内ポーラス注射が好ましい。非経 口投与用には、本発明のトロンビンインヒビターと無菌のビヒクルとを含有する 、液状の単位投与形態に調製される。トロンビンインヒビターは、ビヒクルの性 質および特定のトロンビンインヒビターの性質によって、懸濁あるいは溶解され 得る。非経口用の組成物は、トロンビンインヒビターを、必要に応じて他の成分 とともにビヒクルに溶解し、そして適当なバイアルあるいはアンプルに詰める前 に濾過滅菌してシールして、通常は調製される。好ましくは、局所麻酔剤のよう なアジュバント、防腐剤および緩衝剤もまたビヒクル中に溶解される。次に、組 成物は安定性を増すために凍結乾燥され得る。

非経口用の懸濁液は、活性成分がビヒクルに溶解されるのではなく懸濁されるこ と以外は、実質的には同じ様式で調製される。組成物の滅菌は、好ましくは無菌 のビヒクルに懸濁され前に、エチレンオキサイドに曝すことによってなされる。

さらに、表面活性剤あるいは湿潤剤が、成分成分が均質に分散されるのを促進す るために組成物中に含有される。

経口投与用の錠剤およびカプセルには、結合剤、充填剤、希釈剤、錠剤形成剤、 潤滑剤、錠剤分解剤および湿潤剤などの従来の賦形剤が含まれ得る。錠剤は、当 分野では公知の方法によって被覆され得る。使用され得る適切な充填剤には、セ ルロース、マンニトール、ラクトースおよび他の類似の物質が含まれる。適切な 錠剤分解剤には、デンプン、ポリビニルピロリドン、およびソディウムスターチ グリコレートのようなデンプンの誘導体が含まれるが、これらには限定されない 。適切な潤滑剤には、例えばステアリン酸マグネシウムが含まれる。適切な湿潤 剤には、ラウリル硫酸ナトリウムが含まれる。

経口用液体の調製物は、水溶液、あるいは油状懸濁液、溶液、乳濁液、シロップ あるいはエリ牛シール（ｅｌｉｘｉｒ）　（Ｄ形態、または使用の前に水あるい は池の適切なビヒクルで再生できる乾燥産物であり得る。このような液体調製物 は、従来の添加物を含有し得る。これらには、ソルビトール、シロップ、メチル セルロース、ゼラチン、ヒドロ牛ジエチルセルロース、カルボキシメチルセルロ ース、ステアリン酸アルミニウムゲル、あるいは水素添加食用油脂などの懸濁剤 ；レシチン、ソルビタンモノオレイン酸、ポリエチレングリコール、あるいはア ラビアゴムなどの乳化剤；アーモンドオイル、分留ココナツツオイル、および油 状エステルなどの非水性ビヒクル；メチルあるいはプロピルｐ−ヒドロキシベン ゾエートあるいはソルビン酸などの防腐剤が含まれる。

局所投与用に処方される組成物は、例えば、水溶性ゼリー、油状懸濁液あるいは 乳液状の軟膏の形態に処方され得る。

トロンビンインヒビターの投与量および投与の割合は、患者の大きさ、使用され る特定の薬学的組成物、処置の目的、即ち治療あるいは予防、処置されるべき面 枠性疾患の性質、および処置を行う医者の判断などの種々の因子に依存する。

本発明による、本発明のトロンビンインヒビターの好マシい薬学的に有効な一日 当りの投与量は、約１μｇ／ｋｇ処置される患者の体重く「体重」）と、約５Ｂ ／ｋｇ体重との間である。

血栓溶解剤を含有する組合せでは、血栓溶解剤の薬学的に有効な一日当りの投与 量は、従来の投与量範囲の約１０％から８０％の間である。血栓溶解剤の「従来 の投与量範囲」は、その薬剤が単独で使用されるのに用いられる一日当りの投与 量である。［Ｐｈ　５ｉｃｉａｎ’ｓ　Ｄｅｓｋ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　１９８ ９．　４３ｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｅｄｗａｒｄ　Ｒ，Ｂａｒｎｈａｒｔ、　ｐ ｕｂｌｉｓｈｅｒ］、その従来の投与量範囲は、もちろん、用いられる血栓溶解 剤に依存して変化する。従来の投与量範囲の例を下記に示す：つロキナーゼーｓ ｏｏ、　ｏｏｏから６．２５’０．０００ユニット／患者；ストレプトキナーゼ −１４０，０００から２、５００．０００−Ｌ　ニット／！！、者；　ｔＰＡ− （１，５から５．　Ｑｒｒｒｇ／　ｋｇ体重；　ＡＳＰＡＣ−０，１から１０ユ ニット／ｋｇ体重。

最も好ましくは、本発明の治療およい予防用の組成物は、トロンビンインヒビタ ーの約１０μｇ／ｋｇ体重と約５００μｇ／ｋｇ体重との間の投与量を含有する 。最も好ましい組み合わせは、トロンビンインヒビターの同じ量と、従来の投与 量範囲の約１０％から約７０％の間の血栓溶解剤とを含有する。さらに、本発明 のトロンビンインヒビターあるいは本発明の組み合わせ中に存在する血栓溶解剤 のいずれかの一日当りの薬学的に有効な投与量は、前述の特定の範囲よりも少な い量あるいは多い量であり得ることは理解される。

患者の状態が一旦改善されると、必要であれば、本発明の組み合わせあるいは組 成物の、維持のための投与量が投与される。次に、投与量あるいは投与頻度、あ るいはその両方は、症状の相関的要素として、改善された症状が維持されるレベ ルに減量され得る。症状が所望のレベルにまで軽減されると、処置は終了される べきである。しかし、患者には、疾患症状の再発に対しては断続的な処置が必要 とされ得る。

本発明の他の実施態様では、トロンビンインヒビターは、挿入装置の表面を被覆 するための組成物および方法に用いられ得て、そのことによってこのような装置 を挿入した患者でのクロット形成あるいはｍ小板活性化の危険性を低くする。

本発明の組成物で被覆され得る表面には、例えば、人工装具、人工バルブ、血管 移植片、ステントおよびカテーテルが含まれる。これらの装置を被覆するための 方法および組成物は、当業者には公知である。これらには、トロンビンインヒビ ター含有組成物の装置表面への化学的架橋結合あるいは物理的吸着が含まれる。

さらに他の本発明の実施態様では、トロンビンインヒビターは、患者におけるエ キソビボでの面枠画像化に用いられ得る。この実施態様では、トロンビンインヒ ビターは、ラジオアイソトープで標識されている。ラジオアイソトープの選択は 、例えば、毒性、生物学的半減期および検出能のような多（の既知の因子に基づ いている。好ましいラジオアイソトープには、１２５■、１２３Ｉおよびｌ１ｌ Ｉｎが含まれるが、しかしこれらには限定されない。トロンビンインヒビターを 標識する方法は、当分野では公知である。最も好ましくは、ラジオアイソトープ は、１２３１テあって、標識は１２”Ｉ−Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ　Ｒｅａ ｇｅｎｔを用いて行われる。標識されたトロンビンインヒビターは、患者に投与 され、そしてクロット中のトロンビンに結合すれる。次にそのクロットは、コン ビニ−ターイメージングシステムを組み合わせた放射活性を検出し得るカメラな どの既知の検出方法を用いて観察される。さらに、この方法によす血小板−結合 トロンビンおよびメイゾトロンビン（ｍｅｉｚｏｔｈｒｏｍｂｆｎ）の画像を得 る。

さらに、本発明は、本発明のトロンビンインヒビター含有の組成物およびそのよ うな組成物を腫瘍の転移の処置に用いる方法に関する。本発明のトロンビンイン ヒビターの腫瘍の転移の処置に対する効力は、転移成長の阻害によって明かにさ れる。このことは、ある種の癌細胞には凝固促進酵素が存在することに基づいて いる。この酵素は、凝固カスケードにおける第Ｘ因子のｉＸａ因子への転換を活 性化し、その結果フィビリンの沈着がおこり、次に腫瘍の成長のための基質とさ れる。トロンビン阻害によってフィブリンの沈着を阻害することによって、本発 明の分子は、有効な抗転移膿瘍剤とされる。

本発明のトロンビンインヒビターによって処置され得る転移腫瘍の例には、脳腫 瘍、肝臓癌、肺癌、骨癌および膿瘍性プラズマ細胞癌が含まれるが、これらには 限定されない。

さらに、本発明は、前述のトロンビンインヒビターを用いてトロンビンに誘導さ れる内皮細胞活性化を阻害する方法および組成物に関する。この阻害には、内皮 細胞による血小板活性化因子（ＰＡＦ）の合成の抑制が含まれる。これらの組成 物および方法には、ＰＡＦに媒介されると考えられている、トロンビン誘導によ る炎症および浮腫に特徴がある疾患の処置という重要な適応がある。これらの疾 患には、成人呼吸困難症、敗血症性ショック、敗血症および再潅流の損傷が含ま れるが、これらには限定されない。

敗血症性ショックの初期段階には、散在性の急性炎症反応および凝固異常反応が 含まれる。Ｅ、　ｃｏｌｉ生菌の致死量をヒヒに注射することによって、好中球 の計数、血圧およびヘマトクリット値の著しい減少が起こることが、以前に示さ れた。

血圧およびヘマトクリ、ト値の変化は、ある程度は播種住血管内凝固（ＤＩＣ） の発生によるもので、それに平行するフィブリノーゲンの消耗が示された［Ｆ、 　Ｂ、　Ｔａｙｌｏｒら、−Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＣＰｒｅｖｅｎｔｓ　ｔｈｅ　Ｃ ｏａｇｕｌｏｐａｔｈｉｃ　ａｎｄ　Ｌｅｔｈａｌ　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｅ ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　１ｎｆｕｓｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｂａｂｏ ｏｎ−、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ。

、　７９．　ｐｐ、　９１８−２５　＜１９８７）］。好中球減少は、腫瘍壊死 因子レベルの著しい増加に至る、敗血症性ショックによる重篤な炎症反応による 。本発明のトロンビンインヒビターは、敗血症および他の疾患でのＤＩＣを処置 あるいは予防するための組成物および方法に用いられ得る。

さらに、本発明は、前述のトロンビンインヒビターあるいはそれらを含有する組 成物を、体外血液の抗凝固剤として使用することに関する。本明細書に用いられ ているように、用語「体外血液」には、患者から採血され、体外処置かほどこさ れ、そして透析、血液濾過あるいは手術中の血液バイノくスなどの方法によって 患者にもどされる血液が含まれる。さらにこの用語には、体外で保存され、最終 的には患者に投与される血液製剤、および患者から採血されて種々のアッセイに 用いられる血液が含まれる。このような製剤には、全血、血漿、あるいは凝固阻 害が望まれる任意の血液画分が含まれる。

このようなタイプの組成物中のトロンビンインヒビターの量あるいは濃度は、処 置される血液の容積、あるいは、より好ましくは、トロンビン含有量に基づく。

好ましくは、体外血液の凝固を阻害するための、本発明のトロンビンインヒビタ ーの有効量は、約１μｇ／体外血液６０ｍ１から約５ｍｇ／体外血液６０１１で ある。

本発明のトロンビンインヒビターは、さらにクロットの付着成長に寄与すると考 えられているクロット結合トロンビンの阻害に用いられ得る。このことは、ヘパ リンおよび低分子量ヘパリンのような通常用いられている抗トロンビン剤が、ク ロット結合トロンビンには効果がないので特に重要である。

最後に、本発明のトロンビンインヒビターは、神経変性性疾患を処置するための 組成物および方法に用いられ得る。トロンビンは、脳細胞の形状の変化での考え られるプロセスである、神経突起退縮を起こすことが知られており、アルツ／％ イマー症およびパーキンソン病などの神経変性性疾患に関与することが示唆され ている。

ここに開示されている本発明をさらに理解するために下記に実施例を示す。これ らの実施例は、例示することのみを目的とし、いかなる方法においても本発明を 限定するようには説明していないことは理解されるべきである。

（以下余白） 失１己１Ｌ スルホ−Ｔｒ６３ヒルジン５４−６４の合スルホーＴｙｒｅｓヒルジン５４−６ ４はアミノ酸：　トＧｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｐｒｏ −Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ（ＯＳＯ３）−Ｌｅｕ−ＯＨの構造式を有する。この ペプチドはアブライドバイオシステムズ４３０Ａ　ペプチド合成機（Ａｐｐｌｉ ｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ）を用いて固 相ペプチド合成法を用いて合成した。

詳しく述べると、０．２５９ｍｅｑのＢＯＣ−０−Ｌｅｕ樹脂（１％ＤＶＢ樹脂 ）を連続的に２ｍｍｏｌの保護したアミノ酸と反応させた。１０サイクルの反応 の後、ペプチドの保護基を脱離し、無水１（Ｆ：ｐ−クレゾール、エチルメチル 硫酸（１０・１　：　１．　ｖ／ｖ／ｖ）で処理してＤＶＢ樹脂から外した。ペ プチドは、さらに、０．１％ＴＦＡ水溶液で予め平衡化したビダＩり（Ｖｙｄａ ｃ）　Ｃ＋５ＦＩＰＬＣ逆相カラム（２２ｍｍｘ２５ｃｍ）を用いて精製した。

ペプチドをカラムにかける前に、ペプチドを２．０ｍｌの０．１％ＴＦＡ水溶液 に溶解した。必要に応じて、１ｍｌの６Ｍグアニジン塩酸を追加し、サンプルの 溶解性を増加させた。

サンプルをかけた後、４．０ｍｌ／分の速度で、０．１％ＴＦＡ中のアセトニト リルを４５分間で直線的に増加＜　０−ａＯ％）させる濃度勾配にかけてカラム を展開した。流出液は２２９ｎａ＋でモニターし、画分は手動で集めた。

生した精製ペプチドの１箇所のチロシン残基を通常の方法で硫酸エステル化した 。　［Ｔ、　Ｎａｋａｈａｒａら、’Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆＴｙｒｏｓ 　１ｎｅ−０−［３Ｓ幻５ｕｌｆａｔｅｄ　Ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ　 ０ｃｔａｐｅｐｔｉｄｅＦｒｏＩＩＡ　Ｎｏｎ−５ｕｌｆａｔｅｄ　Ｐｒｅｃｕ ｒｓｏｒ　ｐｅｐｔｉｄｅ−、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅ＋ｉ、。

１５４、　ｐｐ、１９４−９９　（１９８６）コ。スルホ−Ｔｙｒ６３ヒルジン ５４−８４は次に、ビダノクＣ１８カラム（４，６Ｘ２５ＣＩ１１）およびアプ ライドバイオシステムの液体クロマトグラフィーを用いる逆相ＨＰ１．Ｃで、他 のペプチドおよび反応組成物から精製した。カラムは［１，１％ＴＦＡ／水溶媒 で平衡化し、０．　！１ｍｌ／分の速度で、０．０８５％ＴＦＡを含有する溶媒 中のアセトニトリルを９０分間で直線的に０から３５％に増加させる濃度勾配に かけて、カラムを展開した。画分は２１４１ｍの吸収でアッセイした。

支五五呈 ヒトトロンビンとスルホ−ｒｙｒｇ３−ジニトコフルオロペンジルーヒルジンＡ −４との加スルホーｒｙｒａ３ヒルノン５４−８４　（２，０＋ｎｇ、実施例１ で調製）とｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）とをツメチルホ ルムアミド（ＤＭＦ）　中で１８時間室温で反応させて、スルホ−Ｔｙｒ６３− ジニトロフルオロベンジル−ヒルジン５４−ａ４（スルホ−Ｔｙｒｅｓ−ＤＮＦ Ｂ−ヒルジン＋３４−６４）を調製した。次に、サンプルを、アプライドバイオ ／ステムの１５０　Ａ液体クロマトグラフィーシステムを用いる分析用ＨＰＬＣ 分離にかけ、ついでブラウンシーぐＢｒｏｗｎｉｅｓ）　ＲＰ−３０００８カラ ム（０，４６ｘｌＯｃｍ）を用いて、誘導化の程度を測定した。カラムは０．１ ％ＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）で平衡化し、０．０８５％ＴＦＡ／７０％アセトニト リル（溶媒Ｂ）を用いて、４５分間で直線的に０−５０％に増加させ、ついで１ ５分間の５０−１００％の直線濃度勾配にかけて、カラムを展開した。１．０ｍ ｌ／分の一定流量を用いた。

流出液は２１４ｎｍおよび３１０ｎｍの吸収でモニターした。ジフルオロジニト ロベンゼン試薬で誘導体としたペプチドは３１０ｎｍに吸光を有する。上記の反 応で、スルホ−Ｔｙｒｅｓ−ＤＮＦＢ−ヒルジン５４−６．１がｌ５−３０％の 収率で生産されていた。合成の後、スルホ−Ｔ３’ｒ６３〜ＤＮＦＢ−ヒルジン ５４−８４は同じジメチルホルムアミド中、−２０℃で最高１月間保存した。

１０倍モル過剰のスルホづｙｒａ３−ＤＮＦＢ−ヒルジン５４−６４を、ヒトα −トロンビン（１２，５ｍｇ）とリン酸緩衝化した生理食塩水中で、室温で１８ 時間反応させた。架橋の程度を、反応混合物を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル 電気泳動分析で測定した。ＳＤＳ　−ＰＡＧＥでα−トロンビンバンドの相対的 な泳動度が減少し、分子量が１０００−２０００ダルトン（Ｄａ）増加している ことを反映していた。このソフトは、トロンビンとスルホ−Ｔｙｒｅｓ−ＤＮＦ Ｂ−ヒルジン５４−６４とか１ケ所で架橋していることと一致する。

スルホ−Ｔｙｒｅｓ−ＤＮＦＢ−ヒルジン５４−６４とヒトトロンビンとの間の 共有複合体の形成は、　［３５Ｓ］−スルホ−Ｔｙｒｓａ−ＤＮＦＢ−ヒルジン ５４−６４を用いて、特異的であることを確認した。　［３５ｓ］−スルホ−Ｔ ｙｒｅｓ−ＯＮＦＢ−ヒルジン５４−６４は、本質的には上述の方法で、Ｈａ　 〔３５Ｓ］　Ｏａを［（２Ｓｏ　ａの代わりに用いて、Ｎａｋａｈａｒａらの硫 酸エステル化法によって調製した［係属中の同時８願である米国特許出願番号１ ６４，１７８．２５１．１５０．２８０．６１８および３１４．７５６、および Ｊ、Ｍ、　Ｍａｒａｇａｎｏｒｅら、−Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ　Ａｃｔｉ ｖｔｔｙ　ｏｆ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｈｉｒｕｄｉｎ　Ｐｅｐｔｆｄｅｓ”、 　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２６４．　ｐｐ、　８６９２−９８　（１９８ ９）を参照。これらすべては本発明に引例として取り込まれるコ。

［３５Ｓ］−スルホ−Ｔｙｒ６３−ＤＮＦＢ−ヒルジン５４−６４とヒトα−ト ロンビンとは、　（トロンビン濃度に対して）５倍あるいは２０倍のモル過剰率 のスルホ−Ｔｙｒｅｓ−Ｎ−アセチル−ヒルジン５３−ｅａ　（実施例１のペプ チド合成の最終段階で、計アセチルアスパラギンを加えて調製した。）の存在下 で、あるいは非存在下で反応させた。室温でＬ８時間インキュベートした後、混 合物を５ＤＳ−ＰＡＧＥとオートラジオグラフィーとにかけた。結果（図１）は 、［３Ｓｓｌ−ラベルしたペプチドがトロンビンを表すバンドに取り込まれてい ることを示し、コールドのラベルされていないヒルジンペプチドの存在は共有複 合体形成の程度が１０％以下に減少していることを示した。このように、スルホ −ｒｙｒ６３−ＤＮＦＢ−ヒルジン５４−ａｉｌとトロンビンとの反応は、ヒル ジンペプチドと特異的な結合部位で、１．１の化学量論的な結合をもたらす。

スルホ−Ｔｙｒｅｓ−ＤＮＦＢ−ヒルノン５４−６４がトロンビンと結合する部 位を同定するため、トロンビン／スルホ−Ｔｙｒｅｓ−ジニトロベンジル（ＤＮ Ｂ）−ヒルジン５４−６４複合体（１，０ｍｇ）をセファデックスＧ−５０カラ ム（１，５ｘ４５ｃｍ）にかけた。カラムは７Ｍ尿素、２０ｍ１ｌリス、ｐＨ７ ，５で平衡化し、展開した。このクロマトグラフィーで未反応のスルホ−Ｔｙｒ ｅｓ−ＤＮＦＢ−ヒルジン５４−８４を除いた。

トロンヒ゛ン／スルホー丁ｙｒａ３−ＤＮＢ−ヒルジン５４−８４はボイドボリ ューム画分で単離され、プールして１０μｍのβ−メルカプトエタノールを添加 して還元した。

還元後、その複合体をヨード酢酸を用いて、Ｓ−カルボ手ジメチル化した。その 方法は既述した［Ｊ、　Ｍ、　Ｍａｒａｇａｎｏｒｅら”Ａ　Ｎｅｗ　Ｃ１ａｓ ｓ　ｏｒ　Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅｓ　Ａ２　ｗｉｔｈ　Ｌｙｓｉｎｅ　ｉ ｎ　Ｐｌａｃｅｏｆ　Ａｓｐａｒｔａｔｅ−４９−４Ｊ　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ 、、　２５９．　ｐｐ、１３８３９−４３　（１９８４）］。還元したＳ−アル キル化タンパク質は、次に、大量の３％酢酸に対して室温で透析した。透析に続 いて、複合体をベプ／ン（２％Ｗ／Ｖ）で、３７°Ｃ１４時間消化した。還元し たＳ−カルボ牛ジメチル化したトロンビン／スルホ−Ｔｙｒｅｓ−ＤＮＢ−ヒル ジン５４−６４の加水分解フラグメントは、アクアポアーＲＰ−３００Ｃｓ力５ ム（０，４６ｘｌＯｃｍ）を用いる逆相１１ＰＬｃ分離を行い、精製した。カラ ムは０．１％ＴＦＡ水溶液で平衡化し、０．０８５％ＴＦＡ／７０％アセトニト リル（０−６０％）を用いて、１．０ｍｌ／分の流速で、８０分間の直線的に増 加させる濃度勾配にかけて展開した。流出液は２１４止および３１０ｎｍの両方 の吸収で測定した。１．０ｍｌの画分を自動的に集めた。加水分解フラグメント のＨＰＬＣ分離で、２１４ｎｍおよび３１０ｎｕｎの両方に単一の大きなピーク を有する物質が分離された。

遠紫外線吸収から、このフラグメントは結合したスルホ−Ｔｙｒ６３−ＤＮＦＢ −ヒルジン５４−６４を有していた。

次に、このフラグメントを、９００Ａデータシステムを備えたアプライドバイオ ／ステムズ４７０Ａの気相配列決定装置で、自動化エドマン分解にかけた。フェ ニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸は、アプライドバイオ／ステムズ１２ ０Ａ　ＰＴＨ分析機およびＰＴ）ｌ−Ｃｔｓカラム（２，１ｘ２２０ｍＩ１１） を用いて、オンラインで分析した。以下に示したのは、配列分析からの反復的な 収率の表である。

ペプチドの配列は、ヒトα−トロンビンの１４４−１５４残基に一致した［Ｊ、 　Ｗ、Ｆｅｎｔｏｎ、　Ｉｌ、、　”Ｔｈｒｏｍｂｉｎ　Ａｃｔｉｖｅ　５ｉｔ ｅ　Ｒｅｇｉｏｎｓ”、　Ｓｅｍ１ｎ、　Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈｅｍｏｓｔａｓｉ ｓ、　１２．　ｐｐ、２００−０８　＜１９８６）］。ペプチドの開裂はロイシ ン−リシン結合およびバリン−ロイシン結合で起こり、この酵素の特異性と一致 した。

配列解析中に、リシン−１４９（サイクル１０）に対応するアミノ酸は同定され ず、定量もされなかった。これは、感らく、このアミノ酸のａ−Ｎｌ２基が、ス ルホ−Ｔｙｒｅ３−ＤＮＰＢ−ヒルジン５４−６４のジニトロフルオロベンジル 部位で誘導体化されていることによる。このように、リシン−１４９は、スルホ −Ｔｙｒａ３−ＤＮＦＢ−ヒルジン５Ａ−６４がα−トロンビンと反応する主な 部位である。

足血豆主 触媒部位をプロ／りすることおよび外側のアニオン結合部位に結合することが可 能なトロンビンインヒビターのｔ″″言 ヒルジンペプチドのカルボ牛シ末端は、効果的にトロンビンが触媒するフィブリ ノーゲン加水分解をプロ、りするが、発色基質の加水分解はブロックしない［Ｊ 、　Ｍ、　Ｍａｒａｇａｎｏｒｅ　ラ、Ｊ、Ｒｉａｌ、Ｃｈｅｍ、、２５４．　 ｐｐ、８６９２−９８　（１９８９）コ。さらに、ヒルジンペプチドは、トロン ビンが触媒°する策ｖ因子および第ＶＩ１１因子の活性化を中和しない［Ｊ、　 ’ｆ／、　Ｆｅｎｔｏｎ、　Ｉｌ、ら、”旧ｒｕｄｉｎ　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ 　ｂｙ　Ｔｈｒｏｍｂｉｎ”、　Ａｎ　ｉｏ、　Ａｒｃｈｉｖ、　Ｂｉａｌ、、 　１８゜ｐ、２７　（１９８９）］。

ヒルジンペプチド、例えば、スルホ−Ｔｙｒａ３−Ｎ−アセチル−ヒルジン５３ −６４は、インビトロでトロンビン誘発の血小板活性化に対して、潜在的な阻害 活性を表す［Ｊ、　Ａ、　ＪａｋｕｂｏｗｓｋｙおよびＪ、　Ｍ、　Ｍａｒａｇ ａｎｏｒｅ、　”Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｈｒｏｍｂｉｎ−Ｉｎｄｕｃ ｅｄ　ＰＩａｔｅｌｅＬ　Ａｃｔｉｖｆｔｉｅｓ　Ｂｙ　Ａ　５ｙｎｔｈｅｔｉ ｃ　ＬｚＡｍｉｎｏ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｉｄｕｅＳｕｌｆａｔｅｄ　Ｐｅｐｔｆ ｄｅ　（Ｈｉｒｕｇｅｎ）−、Ｂｌｏｏｄ、　ｐ、１２１３　（１９８９）］。

それにもかかわらず、活性部位をブロックできるトロンビンインヒビターは、仮 に、第Ｖ因子および第Ｖｌｌ　Ｉ因子の活性化が律速段階であれば、インビボで の血小板血栓症の阻害に要求され得る。この結論は、不可逆的なトロンビンイン ヒビター（Ｄ−Ｐｈｅ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＣＨ２Ｃｌで得られた結果ＣＳ、　 Ｒ，Ｈａｎｓｏｎおよびり、Ａ、Ｈａｒｋｅｒ、”Ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｏｎ　 ｏｆ　Ａｃｕｔｅ　Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓ ｉｓ　ｂｙ　ｔｈｅ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ　Ｄ−Ｐ ｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ−Ｌ−Ｐｒｏｌｙｌ−Ｌ−Ａｒｇｉｎｙｌ−Ｃｈｌｏｒ ｏｍｅＬｈｙｌ　Ｋｅｔｏｎｅ″、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　ＵＳＡ、　８５．　ｐｐ、　３１８４−８８　（１９８８）］および他の可 逆的なトロンビンインヒビター［Ｊ、　Ｆ、　Ｅｉｄｔら、”Ｔｈｒｏｍｂｉｎ 　ｉｓ　ａｎ　Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　Ｍｅｄｉａｔｏｒ　ｏｆ　Ｐｌａｔｅｌｅ ｔ　Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ　１ｎＳｔｅｎｏｓｅｄ　Ｃａｎ１ｎｅ　Ｃｏｒｏ ｎａｒｙ　Ａｒｔｅｒｉｅｓ　ｗｊｔｈ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｆａｌ　Ｉｎｊｕｒ ｙ”、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、　８４．　ｐｐ、１８−２７　（１９ ８９）］の結果から、証明される。

ヒルジンペプチドのＮＨ２末端はりシン−１４９に近いという上記知見を使用し て、トロンビンの３次元モデル（図２）を使用して　［Ｂ、Ｆｕｒｉｅら、−Ｃ ｏｍｐｕｔｅｒ−Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ　Ｍｏｄｅｌｓ　ｏｆ　Ｂｌｏｏｄ　Ｃ。

ａｇｕｌａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　Ｘａ、　Ｆａｃｔｏｒ　ＩＸａ、　ａｎｄ 　Ｔｈｒｏｍｂｉｎ　Ｂａ５ｅｄ　Ｕｐｏｎ　５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ　Ｈｏｍｏ ｌｏｇｙ　ｗｉｔｈ　０ｔｈｅｒ　５ｅｒｉｎｅ　Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ＼ＬＢｉ ｏ１．　Ｃｈｅｍ、、　２５７．　ｐｐ、３８７５−８２　（１９８２）］、１ ）トロンビンの外側のアニオン結合部位に結合し、および２）トロンビンの活性 部位ポケットをブロックでき、その中に含まれる触媒残基の機能を阻害できる、 薬剤を設計した。

リンンー１４９のε−ＮＨ２基からセリン−１９５のβ−ヒドロキシルまでの最 小の距離は１８−２０オングストロームであることを決定した。３オングストロ ーム／アミノ酸残基長に基づいて、少なくとも約４−７アミノ酸が、ヒルジンペ プチド、たとえば、スルホ−Ｔｙｒｓ３ヒルジン５３−６４と活性部位阻害構造 を包含するドメインとを結合するのに必要であると計算した。リンカ−の組成は グリシンであるように設計した。グリシンは、これらの予備的な研究から、最も 柔軟性があるリンカ−を設計するために選択された。しかし、他の、もっと硬い バイオポリマーのリンカ−もまた使用され得ることも理解される。

（堕−Ｐｈｅ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ配列を、活性部位インヒビターとして 選択した。これはトロンビンが、基質の開裂において、Ｐ１アミノ酸としてアル ギニンに特異性を有するからである。アルギニンに続くプロリンは、トロンビン によって非常に緩慢に開裂される。プロリン（ｈアルギニンの後）をサルコシル −アラニンアミノ酸あるいはに一メチルーアラニンアミノ酸で置換スの化学的還 元によって、別のペプチドを設計した。

ヒルログ−８は次の構造式を有する二Ｈ−＜Ｄ−Ｐｈｅ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐ ｒｏ−（Ｇ　ｌｙ）　ａ−Ａｓｎ−Ｇ　１ｙ−Ａｓ　ｐ−Ｐ　ｈｅ−Ｇ　１ｕ− Ｇ　１ｕ−１１ｓ−Ｐｒｏ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｇ　１ｕ−Ｔｙｒ−k ｅ　ｕ　−０Ｈａ　ヒルログ−８はアブライドバイオシステムズ４３０Ａ　ペプ チド合成機を用いて、一般的な固相ペプチド合成を行った。

このペプチドはＢＯＣ−ｊ、−ロイシン−９−ジビニルベンゼン樹脂を用いて合 成した。使用した追加のｔ−ＢＯＣ−アミノ酸（Ｐｅｎ１ｎｓｕｌａＬａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ、　Ｂｅ１ＩＩＩｏｎｔ、ＣＡ）は、ＢＯＣ−０−２，６−ジク ＯＯ”Ｃ７ジルチロシン、ＢＯＣ−Ｌ−グルタミン酸（γ−ベンジルエステル） 、ＢＯＣ−Ｌ−プロリン、ＢＯＣ−Ｌ−インロイシン、ＢＯＣ−！、−フェニル アラニン、ＢＯＣ−ｊ、−アスパラギン酸（β−ベンジルエステル）、ＢＯＣ− グリシン、ＢＯＣ−Ｌ−アスパラギン、ＢＯＣ−Ｄ−フェニルアラニン、および ＢＯＣ−Ｌ−アルギニンを包含した。より高い合成収率を達成するために、（Ｇ ｌｙ）４リンカ−セグメントは、ＢＯＣ−グリシルグリシン（Ｂｅｃｋｍａｎ　 Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｐｈ目ａｄｅｌｐｈｆａ、　ＰＡ）ヲ マニュアルで加えて２回のサイクルでつけた。合成終了後、ペプチドは完全に脱 保護し、無水ＨＦ：１−クレゾール：エチルメチル硫酸（１０：ｌ・１．ｖ／ｖ ／ｖ）で処理してジビニルベンゼン樹脂から外した。樹脂からの脱離の後、ペプ チドは凍結乾燥して乾燥した。

ヒルログ−８粗製物は、アプライドバイオシステムズ１５１Ａ液体クロマトグラ フィーおよびビダソクＣ＋ｓカラム（２，２ｘ２５ｃＩ１１）を用いる逆相）Ｉ ＰＬＣにかけてｆＲ製した。カラムはＯ１％ＴＦＡ／水で平衡化し、０．１％Ｔ ＦＡ中のアセトニトリルを４．０ｍｌ／分の速度で、４５分の間に０から８０％ に直線的に増加させる濃度勾配にかけ、カラムを展開した。流出液は２２９ｒｖ の吸収でモニターし、画分は手動で集めた。ヒルログ−８粗製物２５−３０ｍｇ をＨＰｌ、、Ｃで精製し、１５−２０ｍｇの純粋なペプチドを得た。

精製したヒルログ−８の構造は、アミノ酸と配列分析とから確認した。アミノ酸 加水分解物はペプチドを６Ｎ　ＨＣＩで減圧下、１１０℃、２４時間処理して調 製した。次に、加水分解物をイオン交換クロマトグラフィーで分析し、引続きベ ックマン６３００自動分析機を用いて、ニンヒドリン誘導体検出にかけた。９０ ０Ａデータシステムを備えたアプライド／　（イオシステムズ４７ＯＡの気相配 列決定装置で、自動化エドマン分解にかけて配列を決定シタ。フェニルチオヒダ ントイン（ＰＴＦＩ）アミノ酸は、アプライドバイオシステムズ１２０Ａ　ＰＴ Ｈ分析機およびＰＴＨ−Ｃ＋　ｓカラム（２，１ｘ２２０ｍｎ＋）を用いて、オ ンラインで分析した。

Ｋ１兜ｌ 旦土三工」旦皇底 ヒｋ　Ｃｌグー９は次の構造式を有する：　Ｈ−（Ｄ−Ｐｈｅ）−Ｐｒｏ−Ａｒ ｇ−Ｄ−Ｐｒｏ−（Ｇｌｙ）ａ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌ　ｕ− Ｇ　１ｕ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌ　ｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ＯＨｏ　この ペプチドは、実施例４の記載と同じ方法で、第１５サイクルで、ＢＯＣ−Ｌ−プ ロリンの代わりにＢＯＣ−Ｄ−プロリン（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓ）を使用して、合成した０精製と同定は実施例４に記載の方法で行っ た。

支五五立 竺土三ｌヨユ二良底 ヒルログ−ＩＯは次の構造式を有するニド（込−Ｐｈｅ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｓ ａ　ｒ−（Ｇ　ｌｙ）　５−Ａｓｎ−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ａ　５ｐ−Ｐｈｅ−Ｇ　１ｕ −Ｇ　Ｉ　ｕ−Ｉ　１　ｅ７Ｐ　ｒｏ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｇ　１普|Ｔｙｒ− Ｌｅｕ−ＯＨ０このペプチドは、実施例４に記載の方法で、第１６サイクルで、 ＢＯＣ−サルコシン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏ ｕｉｓ。

Ｍｏ、　）を使用して合成した。精製と同定は実施例４に記載の方法で行った。

夾ｆ ヒルログ−１１の合成 ヒルログ−１１は次の構造式を有するニド（叶Ｐｈｅ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒ ｏ−（Ｇ　ｌｙ）　ａ−Ａｓｎ−Ｇ　Ｉｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　ｌ 　ｕ−ｌ　ｌ　ｅ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　Ｉ　ｕ−Ｇ　ｌｕ−（R。

５−ショートＴｙｒ）　−Ｌｅｕ−ＯＨｏ　このペプチドは、実施例４に記載の 方法で、第２サイクルで、ＢＯＣ−３，５−ショート化−Ｔｙｒ　（Ｓｉｇｍａ ）を使用して合成した。精製と同定は実施例４に記載の方法で行った。

夾１１（主 ヒルログ−１２のＡ ヒルログ−１２は次の構造式を有する：　Ｈ−＜Ｄ−Ｐｈｅ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ −Ｐｒｏ−（Ｇ　ｌｙ）　４−Ａｓ　ｎ−Ｇ　１ｙ−Ａ　５ｐ−Ｐｈｅ−Ｇ　１ ｕ−Ｇ　ｌ　ｕ−＋　１ｅ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　１　ｕ−Ｇ　１ｕ−sｙｒ　（ ＯＳＯ３）−Ｌｅｕ−ＯＨｏ　このペプチドは、１．　Ｏｍｇのヒルログ−８を ジメチルホルムアミド（８０μｍ）に溶解し、シンクロへキンル力ルポジイミド 溶液（１，２５８／ｍｌ、０．００７ｍ１）および濃硫酸（０，５μｌ）を、０ °Ｃ，１０分間反応させて合成した。反応は水（１，０ｍ１）を加えて止めた。

反応混合物をアプライドバイオシステムズ１５０Ａ液体りロマトグラフィー／ス テムおよびアクアポアーＲＰ−３００Ｃ８カラム（０、４６ｘ　ｌｏｃｍ）を用 いる逆相ＨＰＬＣにかけた。カラムは溶媒Ａ　（Ｏ１％ＴＦＡ水溶液）で平衡化 し、溶媒Ｂ　（０，０８５％ＴＦＡ／Ｔｏ％アセトニトリル）のａ度を、１．０ ｍｌ／分の流速で、４５分間、Ｏ力１ら５０％に増加させて、カラムを展開した 。流出液は２１４ｎｍの吸収でモニＩＩしたヒルログ−１２は、次に０．１Ｎ　 ＮａＯＨを加えてｐＨ７に中和し、凍結乾燥して、リン酸緩衝化生理食塩水に再 溶解した。

支五五主 ヒルログ−８による、ｐ−ニトロアニリド合成基　のトロンビンが触媒する　の 次に、スペクトロザイム（Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ）　ＴＨ（）シル−Ｇｌｙ− Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド；　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔ ｉｃａ、　Ｎｅｗ　Ｙ。

ｒｋ、　ＮＹ）の、ヒトα−トロンビンが触媒する加水分解に対するヒルログ− ８の効果を分析した。詳しく述べると、基質濃度が２．２から２２μＭまでの範 囲で、ヒルログ−８の存在下で、あるいは非存在下で初速度を測定した。トロン ビンの触媒速度はカーリ−（Ｃａｒｙ）　１９スペクトロメーターを用い、４０ ５止でモニターして時間の関数として連続的に記録した。反応は室温（２５±１ ℃）で、０．０５Ｍ　トリス、ｐ）１７．５、Ｏ，１Ｍ　ＮａＣ１緩衝液中で行 った。

典型的な酵素反応は、サンプルおよび対照の両方の牛ユベットに緩衝液を１．ｏ ｍｌ加えた。トロンビン（最終濃９３．２ｘｌＯ−９Ｍ）およびヒルログ−８（ ０−４ｘｌＯ−”Ｍ）をサンプルキュベツトに添加してから、スベクトロザイム ＴＩ（（２，２−２２μＭ）を加えた。

基質の添加直後に、プラスチノクビベ１トでサンプルキュベツトの内容物を混合 した。反応は分光光度計で５−１５分モニターした。

それぞれの基質濃度における初速度は、加水分解されたスベクトロザイムＴＩ（ のモル数７秒７１モルトロンビンで表すれる。これは、反応の初期の直線相の間 （基質のトータル加水分解が５１５％）の、加水分解反応の傾きを測定して、決 定した。初速度の逆数を基質濃度の逆数に対してプロットして、ラインウェー・ −バーーーバルクプロノトを作った。結果は、スペクトロザイムＴＨのヒトα− トロンビン触媒加水分解は、Ｖ　ＩＩａＸ＝１７モル／秒／１モルトロンビンで あり、ＫＩＩ値は１．１９ＸｌＯ−’Ｍであった。図３のパネルＡおよびＢは、 ヒルログ−８の濃度を増加すると、Ｋ、値が有意に、添加量に比例して増加する が、スペクトロザイムＴＨの加水分解のｖｌ、工がほとんど増加しないことを示 している。従って、ヒルログ−８による、トロンビンが触媒する反応の阻害は、 スペクトロザイムＴＨの加水分解に関する、拮抗／非拮抗混合機構によって行わ れた。トロンビンに対するヒルログ−８のに１は式： におけるトロンビン触媒反応の傾き；　［ヒルログ−８］はそのンビン触媒反応 ；およびに、はヒルログ−８のヒトα−トロンビンに対するモル阻害定数を表す 。ヒルログ−８のに１は１．９５±０、　ｌｌｘｌｏ−９Ｍと計算された。

大！ＦＩＩＯ ヒトα−トロンビンのヒルジンペプチド結合部位および汗　。　に・　るヒルロ グ−８の。

ヒルログ−８は、ヒトα−トロンビンにそのヒルジンペプチド結合部位を介して 結合する一方で、トロンビンの触媒部位をブロックするように設計された。以下 に述べる種々の研究を行って、ヒルログ−８がこれらの機能を発揮できるかにつ いて、検討した。

ヒトアートロンビンのヒルログ−８阻害の動力学を、本質的には実施例９でα− トロンビンについて上述した方法で検討した。

ヒトアートロンビンのスベクトロザイムＴＨに対する触媒反応はＶ　ａａｘ　＝ ７−１４モル／秒／１モルトロンビンであり、Ｋ、＝１．ｌＸ１０−６Ｍであっ た。この結果により、トロンビンのプロテアーゼ分解物であるγ−トロンビンは 、凝固活性を本質的に欠いている　［Ｓ、Ｄ、Ｌｅｖｉｓ　ら、−Ｃａｔａｌｙ ｔｉｃ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　ａ　−ａｎｄ　７−Ｔｈｒ ｏｍｂｆｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆｉｂｒｉｎｏｇ ｅｎ　ａｎｄ　Ｐａｃｔｏｒ　Ｘｌｌド、ＢｉｏｃｈｅｌＩＩｉｓｔｒ　、２６ ．　ｐｐ、７５９７−７６０３＜１９８７）］　が、はとんど完全な触媒能力を 示すことが確認された。γ−トロンビンのヒルログ−８による阻害を、ペプチド ａ度が２．７Ｘ１０−８から５．８ＸＩＯ−’Ｍまでの範囲で検討した。以下に 示すように、ヒルログ−８はα−トロンビンと比較してに１が３桁増大したこと を示した。γ−トロンビンに対するこの高いＫｌ値は、γ−トロンビン中に完全 な外側のアニオン結合部位（ＡＢＥ）がないことによる　［Ｊ、Ｗ、Ｆｅｎｔｏ ｎ　ＩＩ、ら、−Ａｎｉｏｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｅｘｏｓｉｔｅ　ｏｆ　Ｈｕｍ ａ１α−Ｔｈｒｏｍｂｉｎ　ａｎｄ　Ｆｉｂｒｉｎ（ｏｇｅｎ）　Ｒａｃｏｇｎ ｊｔｉｏｎ−、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ虫、２７、ｐｐ、７１０６−１２　（１９８ ８）］。］γ−トｏンビはａ−ｈａ７ビンのＢ−鎖のＬｙｓ−１４９およびＡｒ ｇ−７８でプロテアーゼ分解を受けて作られる。

ヒトα−トロンビンのヒルログ−８による阻害は、２．６ｘｌＯ””Ｍから１． ２９ｘｌＯ−５Ｍまでの濃度のスルホ−Ｔｙｒ６３−Ｎ−アセチル−ヒルジン５ ３−６４存在下、有意に減少した。これは、トロンビン中のＡＢＥへの結合を、 スルホ−Ｔｙｒｓ３−Ｎ−アセチル−ヒルジン５３−８４とヒルログ−８とが拮 抗することによる。

このことは、また、ヒルログ−８とヒトα−トロンビンとを、フェニルメチルス ルホニル−α−トロンビン（ＰＭＳ〜α−トロンビン、最終濃度１８ｎＭ）を添 加して反応させたときにも示された。

この修飾トロンビンの添加は、ヒルログ−８がα−トロンビンを阻害する能力を 実質的に減少させた。ＰＭＳ−α−トロンビンは、完全なＡＢＥを有しているが 、活性部位で共有結合的に修飾されている。この修飾トロンとンは、反応液中の ヒルログ−８の活性を抑え、これにより、完全な、触媒活性を有するヒトα−ト ロンビンの阻害に使用できるペプチド量を減少させる。

サラニ、ヒルログ−８のトロンビンに対するに１に与える塩濃度の影響を、上記 実施例９の方法で測定した。ヒルログ−ａ（ｔｌ、　５ｘｌＯ−９Ｍ）を含む、 あるいは含まなし）緩衝液中で、Ｏ，１Ｍ、０、２５Ｍ１　および０．５Ｍ　Ｎ ａＣｌ１ｉＪＩ度で行った。下記の表に示すように、ヒルログ−８によるα−ト ロンビンの阻害は、低塩濃度で増加した。この結果は、ヒルログ−８の高度に陰 イオン化したペプチド部位とトロンビンのＬｙｓ−１４９付近の陽イオンにチャ ージした部位との相互作用か、トロンビンが触媒するスペクトロザイムＴＨの加 水分解をヒルログ−８が阻害するときの本質である。

酎し一一一」ｉ　条　件　しルａり−８，Ｋ　：、ｎＭヒトα−０，０５Ｍ　ト リス、ｐＦＩ７．５　１．９５トロンビン　Ｏ，１Ｍ　ＮａＣ１（緩衝液）ヒト γ−緩衝液　１．０８０ トロンビン ヒトα−緩衝液＋２．６μＭ トａンビン　スルホ−Ｔｙｒｅ３−Ｎ−アセチル　２５．５−ヒルジン５３−６ １１ ヒトα−緩衝液＋１２．９μＭ トロンビン　スルホ−Ｔｙｒ８３−計アセチル　＞　２．０００−ヒルジン５３ −１４ ヒトα−緩衝液＋ＰＭＳ−９，９０ トロンビン　α−トロンビン ヒトα−０，０５Ｍ　トリス、ｐＦＩ７．５　２．０９トロンビン　０．２５Ｍ 　ＮａＣ１（緩衝液）ヒトα−０，０５Ｍ　ｌ−リス、ｐｌ（７，５３，７２ト ロンビン　０．５Ｍ　ＮａＣ１（緩衝液）１直皿±上 ヒルログ−８の抗凝固活性：ヒルジンおよびスルホ−Ｔｒ　−Ｎ−アセチル−ヒ ルジン　−４との比較ヒルログ−８の抗凝固活性を、プールした正常ヒト血漿（ Ｇｅｏｒｇｅ　Ｋｒｎｇ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、　０ｖｅｒｌａｎｄ　Ｐａｒ ｋ、　ＫＡンおよびＣｏａｇ−Ａ−Ｍａｔｅ　ＸＣ装置（Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｄｉ ａｇｎｏｓｔｉｃｓ、　Ｏｒｇａｎｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｃａ、Ｏｋｌａｈｏｍａ 　Ｃ１ｔｙ、　ＯＫ）を用いて検討した。活性は、製造者から入手したＣａＣｌ ２およびリン脂質の溶液を用いて、活性化パーシャル　トロンボプラスチンタイ ム（ＡＰＴＴ）　アッセイ（ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｐａｒｔｉａｌ　ｔｈｒｏｍ ｂｏｐｌａｓｔｉｎ　ｔｉｍｅ　ａｓｓｅｙ）でモニターした。

ヒルログ−８、ヒルジン、あるいはスルホ−Ｔｙｒｅ３−Ｎ−アセチル−ヒルジ ン６３−６４を、ＡＰＴＴ測定ウェルに最終濃度がＩＯから３２．３００ｎｇ／ ｍｌで、トータル容量が２５μｍとなるように加えた後、１００μｌの血漿を加 えた。

コントロールのＡＰＴＴ　（インヒビターなし）は、２９．６秒（平均値、ｎ＝ ８、ＳＥＭ＜　０．５％）であった。図４は、これらの投与量依存効果の結果を 示した。ヒルログ−８は、ヒルジンよりも２から３倍効果があり、スルホ−Ｔｙ ｒｓ３−区−アセチルーヒルノン５３−６４よりも１００から１５０倍の効果を 有していた。ヒルログ〜８およびヒルジンの両方とも、血漿のＡＰＴＴを増加さ せ、高すぎて測定できなかった。これと対照的に、スルホ−Ｔｙｒ６３−Ｎ−７ セチルーヒルジン５３−８４は、ＡＰＴＴにおいて充分な投与依存効果を表し、 コントロール値の２００−２５０％であった［Ｊ、　Ｍ、　Ｍａｒａｇａｎｏｒ ｅ　ら、Ｌ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６４．　ｐｐ、　８６９２−９８ 　（１９８９）］。この結果は、ヒルログ−８が、ヒルジンと同様の方法で、イ ンヒトａでの発色アッセイと同様、血漿中のトロンビンの活性部位を阻害するこ とができることを示している。

亙１ＪＬＬ主 トロンビン　ハ　°　のヒルログ−８によるトロンビン誘発血小板活性化の実験 は、３７℃で、ＢｉｏｄａｔａＰＡＰａ血小板凝集器（Ａｇｇｒｅｇｏｉｅｔｅ ｒ）を用いて行った。高血小板含有血漿（ＰＲＰ）を、研究の少なくとも１週間 前に血小板の機能を変える治療を受けていない、正常で、健康なボランティアか ら採取した。ＰＲＰは、Ｊ、　Ａ、　Ｊａｋｕｂｏｗｓｋｉ　ら、−Ｍｏｄｉｆ ｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｕ＋ｏａｎ　Ｐｌａｔｅｌｅｔ　ｂｙ　ａ　Ｄｉｅｔ 　Ｅｎｒｉｃｈｅｄ　ｉｎ　５ａｔｕｒａｔｅｄ　ｏｒ　Ｐｏ１ｙｕｎｓａｔｕ ｒａｔｅｄ　Ｆａｔ−、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、　３１．ｐｐ、　３ ３５−４４　（１９７８）に記載の方法で調製した。種々の濃度（５０μｍの水 にＯｏ−５００ｎ／ｍｌ）のヒルログ−８を、温めて（３７°Ｃ）おいた０゜４ ｍｌのＰＲＰに添加した。１分後、血小板懸濁液にヒトα−トロンビンを最終濃 度Ｑ、　２．０．２５もしくはＯ，Ｓユニット／Ｉ】ドータルア７セイ容量とな るように加えた。凝集はトロンビンを添加してから５分間の光の伝導度の増加を モニターした。次に、％阻害を（％凝集ｓａｍｅ　ｌ。）／（％凝集。。。ｔ、 。Ｉ）　Ｘ１００で計算した。この実験の結果、ヒルログ−８は、インビトロで トロンビン誘発血小板活性化を阻害することを示す。

支皿立工主 イメージ化のためのヒルログ−８の　用ヒルログ−８は１２３１を保有する化学 基の共有結合により修飾される。詳述すると、ヒルログ−８（実施例４で作成） を。

０．１Ｍホウ酸ナトリウム、ｐＨ９，０中で、１２３１−ポルトンハンター試薬 （Ｎｅｖ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ：　Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈ ｕｓｅｔｔｓ）　と反応させた。１２３Ｉ−ラベルした分子（比活性〉５μＣｉ ／□ｇ）を、リン酸緩衝化した生理食塩水で平衡化したバイオゲル　Ｐ２カラム で脱塩した。

実験的な血栓の生体外イメージは、本質的にＴ、　Ｍ、　Ｐａ１ａｂｒｔｅａ　 ら、　＋Ｔｈｒｏｍｂｕｓ　［ｍａｇｉｎｇ　ｆｎ　ａ　Ｐｒｉｍａｔｅ　Ｍｏ ｄｅｌ　ｗｉｔｈ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ｆｏｒ　ａｎ　 Ｅｘｔｅｒｎａｌ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　Ａｃｔｉｖａｔ ｅｄ　Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ”、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ口、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳ Ａ、　８６．　ｐｐ１０３６−４０＜１９８９）に記載の方法で行った。さらに 詳しくは、イメージ化は、ヒトの大腿動脈および大腿静脈間の外部にチコフレノ クスシャント（Ｔｉｃｏｆｌｅｘ　５ｈｕｎｔ）を用いて行った。実験的な血栓 は、シャントの中で、予め血栓を有するダルコン移植片（Ｄａｒｃｏｎ　ｇｒａ ｆｔ）を設置して形成させた。＋２３１−　ラベルしたトロンビンインヒビター をチコフレ／クスシャントの静脈部に注入した。　ＦＤＰ−１１／３４を備えた ○ｈｉｏ　Ｎｕｃｌｅａｒ　５ｅｒｉｅｓ　１００　Ｇａｍｍａ　Ｃａｍｅｒａ を用いて、０．５から１時間、連続的に先のイメージか得られた。グラフトおよ び血液のプールによる１２３Ｉ−トロンビン阻害剤の取り込みの動力学は、この ようにして得られた放射核種イメージから誘導されるものである。

同様の技術を、ヒトの大腿静脈の血行を静止して起こした深部静脈血栓の生体外 イメージを得るのに使用し得る。！２３１−ヒルログ８は高い特異性でトロンビ ンに結合するため、この分子を使用することにより、血栓の詳細な生体外イメー ジがわかる。さらに、ヒルログ−８は、天然のヒルジンあるいはトロンビンに対 する抗体と対照的にサイズが小さいので、放射能ラベルしたトロンビン阻害剤が 、フィプリンクロフトに含まれるトロンビンと同様、血小板に結合したトロンビ ンおよびメイゾトロンビンのイメージを明かにできる可能性を有している。

！ｍ土 トロンビンインヒビターの　−′ 本発明のトロンビンインヒビター、好ましくはヒルログ−８の抗転移活性は、Ｔ ２４１細胞肉腫（ｓａｒｃｏｎ＋ａ　Ｔ２４１　ｃｅｌｌｓ）　［Ｌ。

Ａ、　Ｌｉｏｔｔａら、Ｎａｔｕｒｅ、　２８４．　ｐｐ、　６７−６８　（１ ９８０＞］および先天的なＣ５７ＢＬ／６７ウス（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ、　Ｂａｒ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＭＥ）を用いてアッセイした。このマ ウスに静脈あるいは皮下注射で、実施例４で作成したヒルログ−８をＯｏ−２Ｓ Ｏ／ｋｇ投与し、その後、ｔｏ’−ｒｏ６のＴ２４１腫瘍細胞を注射した。１５ 日後、その動物を殺して、肺の腫瘍コロニーを数えた。ヒルログ−８の抗転移活 性をプラシーボ処理したコントロールマウスの腫瘍に対するコロニー数の減少％ で測定した。ヒルログ−８は、このア、ノセイで、抗転移活性を有することが示 された。

笈直丘上立 トロンビンインヒビターによる内抱の阻８本発明のトロンビンインヒビターが、 トロンビンが誘発する血小板活性化因子（ＰＡＦ）の合成を阻害する能力を有す るかを、ヒトＩＩＩＦ静脈内皮細胞培養細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いてア、ツセイ した。ＨＬＩＶＥＣｓは、ヒトａ帯からコラ−ゲナーゼ消化により抽出したが、 この方法は確立された方法である［Ｍ、　Ａ、　Ｇ１ｆｆ１ｂｏｒｎｅ、　Ｊｒ 、、　−Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ− 、江岨−肚旺ｓｔ、Ｔｈｒｏｍｂ、、３．　ｐｐ、１−２８　（１９７６）コ。

ＨＵＶＥＣは、９６ウエルのマイクロタイタープレートにコンフルエンスになる まで、ロ３Ｈ］−酢酸存在下、インキユベートした。この方法で、培養した細胞 は、　［ｆｆＨ］　−７セｆ　ル＝ＰＡＦを生産し、これは、ＨＵＩ／ＥＣ膜の リン脂質の抽出により定量し得る。

ヒルログ−８（０−１Ｈ１ｇ／ｍｌ）を［３Ｈ１−酢酸を有するＨＵＶＥＣｋ： 加え、１分後、トロンビン（最終濃度１０／ｍｌ）を添加した。細胞を５分間イ ンキュベートし、上清を除去した。０．１％ゼラチン、メタノールに溶解した５ ０ｍＭ酢酸（２：１　ｖ／ｖ）を含む培地を、次に、ＨＵＶＥＣに添加した。Ｐ ＡＦは、次に、一般的な手法で抽出し、定量した［Ｔ、　Ｍ、　Ｍｃｌｎｔｙｒ ｅ　ら、−Ｃｕｌｔｕｒｅｄ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅ１Ｉｓ　５ｙｎｔ ｈｅｓｉｚｅ　Ｂｏｔｈ　Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　Ｆａｃｔ ｏｒ　ａｎｄ　Ｐｒｏｓｔａｃｙｃｌｉｎ　ｉｎ　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ　ｔｏ　Ｈ ｉｓｔａｍｉｎｅ、Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ　ａｎｄ　Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ　Ｔｒ ｉｐｈｏｓｈａｔｅ”、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、−、７６、ｐｐ、２７１ −８０（１ｅｇ５）］。ＩＣ５ａ値を次に計算した。ヒルログ−８は、このアッ セイで、ＨＵＶＥＣによるＰＡＦの合成を阻害した。

トロンビン誘発による多形核白血球（ｐｉ＋ｎｏのＨ［ＩＶＥＣへの接着に対す るにヒルログ−８の効果は、以下のようであった。ＨＵＶＥＣは、２４ウエルク ラスタープレート中、１％ウソ胎児血清を含むＭＥＭ培地で、コンフルエントま で培養した。次に培地を除き、新鮮な無血清培地で２回洗浄し、同じ培地で３７ °Ｃ，ｔｏ−３０分インキュベートし、血清生産物を取り除いた。予め３７°Ｃ にしておいたＰＭＮＣ１ｍｌ中２．５ＸＬＯ’）を、各ウェルに添加した。ＰＭ Ｎは、２分間ＨＵＶＥＣの単層上に置いておき、ヒルログ−８（５μｇ／ｍｌ） あるいは生理食塩水をそれぞれのウェルに添加し、その直後にα−トロンビン（ ０，１あるいはＩＵｌｏｌ）を加えた。細胞を３７°Ｃ１５分間インキュベート し、２回洗浄し位相差顕微鏡で調査した。

接着したＰＭＮは直接カウントした。ヒルログ−８とインキュベートしたサンプ ルは、生理食塩水処理したＰＭＮの細胞接着に比べて、有意に少なかった。

ヒルログ−１３は、次の構造式を有するニド（込−Ｐｈｅ）　−Ｐｒｏ−Ａｒｇ −Ｐｒｏ−（ＧＩｙ）　２−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ −１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−ＧＩｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ＯＨ，このペプチドの合 成、精製、同定は、実施例４と実質的に同様に行ったが、ジグリノンセグメント を作るためにＢＯＣ−グリシルグリシンのサイクルを一回行ったことのみが異な る。

夾１」ＬＬＬ ヒルログ−１４の合 ヒルログ−１４は、次の構造式を有する：Ｈ−（旦−Ｐｈｅ）　−Ｐｒｏ−Ａｒ ｇ−Ｐｒｏ−（Ｇ　１ｙ）５−Ａ　５ｎ−Ｇ　１ｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇ　１ｕ −Ｇ　ｌ　ｕ−ｌ　１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　１ｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−０） １０　このペプチドの合成、精製、同定は、実施例４と実質的に同様に行ったが 、ペンタグリシンセグメントを作るためにＢＯＣ−グリシルグリシンのサイクル を２回行った後に、ＢＯＣ−クリシンを添加のサイクルを１回行った。

支１匠工主 ヒルログ−１５の４ ヒルログ−１５は、次の構造式を有する：　Ｈ−（Ｑ−Ｐｈｅ）−Ｐｒｏ−Ａｒ ｇ−Ｐｒｏ−（Ｇ　Ｉｙ）ａ−Ａｓｎ−Ｇ　１ｙ−Ａｓ　ｐ−Ｐｈｅ−Ｇ　１ｕ −Ｇ　ｌｕ−１１ｅ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　１ｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ＯＨａ 　ヒルログ−１５の合成、精製、同定は、実施例４と実質的に同様に行ったが、 へ牛すグリノンセグメントを作るためにＢＯＣ−グリシルグリシンのサイクルを ３回行った。

大１目独工」− ヒルログ−１６は、次の構造式を育する：　ト（Ｄ−Ｐｈｅ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ −Ｐｒｏ−（Ｇ　ｌ　ｙ）　Ｂ−Ａｓｎ−Ｇ　１ｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇ　１ｕ −Ｇ　ｌｕ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌ　ｕ−Ｇ　１ｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ＯＨｏ　 ヒルログ−１６の合成、精製、同定は、実施例４と実めにＢＯＣ−グリシルグリ シンのサイクルを４回行った。

ヒルＯグー１７は、次の構造式を有する：　Ｅｌ−（込−Ｐｈｅ）−Ｐｒｏ−Ａ ｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇ　１ｙ−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　１ｕ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｈ１ｓ−Ｇ　１ ｙ−Ａｓｎ　−Ｇ　１ｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇ　Ｉｕ−Ｇｔ　ｕ|［ １ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇ　１ｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ＯＨｏ　ヒルログ−１７の 合成は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙをヒルログ−８に存 在するＧｌｙ４セグメントと置換した以外は、実施例４と実質的に同様に行った 。この配列は、伸長しているペプチドに、ＢＯＣ−グリシン、ＢＯＣ−Ｌ−ヒス チジン、ＢＯＣ−グリシン、ＢＯＣ−１−グルタミン酸およびＢＯＣ−グリシル グリシンを第１３−１７サイクルの合成で、連続的に付加した。

ヒルログ−１７の精製、同定は、実施例４と実質的に同様に行った。

ヒルログ−１８ａは、ト（Ｄ−Ｐｈｅ）−Ｐｒｏ−（β−ホモアルギニン）−（ Ｇ　ｌｙ）　ｓ−Ａ　５ｎ−Ｇ　１ｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｇ　ｌ　 ｕ−１１ｅ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　１ｕ−Ｔｙ　ｒ−kｅｕ −０）Ｉの構造式を宵する。ヒルログ−１８ｂは、Ｈ−（Ｄ−Ｐｈｅ）−Ｐｒｏ −（β−ホモアルギニン）　−Ｐｒｏ−（Ｇｌｙ）４−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ −Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ −０）ｆの構造式を有する。ヒルログ−１８０は、［（−（Ｄ−Ｐｈｅ）−Ｐｒ ｏ−（β−ホモアルギニン）　−Ｖａｌ−（Ｇｌｙ）ａ−Ａｓｎ−Ｇ　１ｙ−Ａ ｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　ｌ　ｕ−ｌ　１　ｅ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｇ 　ｌ　ｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ＯＦＩの構造式を有する。ヒルログ−１８８は、均 一／固相法を混合して行った。５−２０残基は、実施例４および１７の固相合成 法で調製した。

樹脂に結合した中間体と、β−ホモアルギニン−Ｇｌｙの保護すれた中間体とを 反応させた。β−ホモアルギニン−Ｇｌｙの保護中間体は、以下の図に示す多段 階の反応で合成し、この後すぐに説明する。

０−大王＃９） Ｎ”　−ＢＯＣ−Ｎ　Ｑ−Ｔｏｓ−アルギニンジアゾメチルケトンｌｏｇ　（１ ３，４ｍｍｏｌ）のＮ”−ＢＯＣ−Ｎ’−Ｔｏｓ−アルギニン（Ｂａｃｈｅｍ、 　Ｔ。

ｒｒａｎｃｅ、　ＣＡ）および２．１ｍｌ　（１９，１ｍｍｏｌｅ）のＮ−メチ ルモルフ１リン（Ａｌｄｒｉｃｈ、　Ｍｉｌｖａｕｋｅｅ、Ｗｉｓ、）をｌＱＯ ｍＪの無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中でアルゴン雰囲気下、５分、室温で 攪拌した。この溶液を−１５°Ｃに冷却し、２．８ｍｌ　（２１，６ｍｍｏｌ） のインブチルクロロホルメート（Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。この反応溶液を一 １５℃、５分間さらに攪拌を続けて、セライト／ＭｇＳＯ４パッドで濾過した。

次に、濾液にジアゾメタンの水冷エタノール溶液（１５０ｎＭ：　３２．４ｇの ジアザルド（Ｄｉａｚａｌｄ）から得た：　Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。溶液 を攪拌し、−昼夜放置して、室温に徐々に戻した。溶媒は減圧下除き、残渣を２ ０Ｏｎ＋　ｌのクロロホルムに溶解した。有機溶媒を、２００＋ｍ’ｌの飽和Ｎ ａＨＣＯａ、次に、２００＋ａｌの飽和ＮａＣ１で連続的に洗い、無水Ｍｇ５Ｏ ａで乾燥し、油状になるまで再度濃縮した。残渣は、４χ１７ｃｍのシリカゲル カラムのフラ。

シュクロマトグラフィーを行い、アセトンのクロロホルム溶液で段階的濃度勾配 （２１クロロホルム中ｌＯ％ア七トンに続いて、３１クロロホルム中２０％アセ トン）で精製した。２５ｍ１の画分を集め、それぞれの画分の一部を薄相りクマ トグラフィ−（ＴＬＣ）にかけた。所望の生成物を含む画分をプールし、エバボ レートして乾燥した。生成物であるジアゾメチルケトンが、淡黄色の泡末として 精製された（　６．５４ｇ）。

Ｎ“−ＢＯＣ−Ｎ　９−Ｔｏｓ−〜ホモアルギニンメチルエステル上ｆｆ１ｌ！ したジアゾメチルケトンを１００ｍ１の無水メタノールに溶解し、アルゴン雰囲 気下、還流しながら、安息香酸銀触媒溶液（４００μｍトリエチルアミン中、１ ６５ｍｇ）を滴下シタ。３０分後、還流溶液を室温まで冷却し、／　−’Ｊ　ノ ド（Ｎｏｒｉｔ）でスラリー化してセライトで濾過した。溶媒は次に減圧下除去 し、油状の残渣は、シリカゲルカラムのフラノシュクロマトグラフィーを行って 、精製した。溶呂は４１のクロロホルム０１０％アセトンｍｌで行い、所望の生 成物、β−ホモアルギニンメチルエステルが明黄褐色の泡末（６，４３ｇ）とし て得られた。

Ｎ　−ＢＯＣ−Ｎ　’−Ｔｏｓ−−ホモアルギニン上記のメチルエステルを全部 、１００ｍ１のメタノールに溶解し、Ｌ　ｉＯＨの水溶液（１，４８ｇ、５０ｍ １水）と、−昼夜、アルゴン雰囲気下、室温で連続的に攪拌しながら反応させた 。メタノールを減圧下で除き、残渣を水に溶解して、酢酸エチルで洗浄した。

次に、ｐＨが４になるまで飽和クエン酸を添加した。得られたカルボン酸を酢酸 エチル中に抽出した。抽出は、ｐＨ３で繰り返し、まとめた有機層はＭｇ５Ｏｎ で乾燥し、減圧下、濃縮した。粗生成物は白色の泡末（４，９ｇ）であった。こ の酸は、ビダノクＣ１１ｌ逆柑ＨＰＬＣカラムにかけて精製したが、流出液を２ １４ｎｍで測定する点を除いて、実施例４に記載した方法と間しである。所望の フラクションの凍結乾燥後、生成物のＮ”−ＢＯＣ−Ｎ’−ＴＯ３−β−ホモア ルギニンが、白色の無定形の結晶として得られた。

Ｎ”−ＢＯＣ−Ｎ’−Ｔｏｓ−β−ホモアルギニンは、）ＩＰ中で加水分解し、 アミノ酸分析のスタンダードとして用いた。β−ホモアルギニンの保持時間はア ルギニンのそれと同じであったが、ピークの強さは予想したようにかなり低かっ た。

Ｎ”　−ＢＯＣ−Ｎ　’−Ｔｏｓ−−ホモアルギニルグリシンベンジルエステ上 次に、上記カルボン酸の４．０６ｇ　（９，０２ｍｍｏｌ）を２５ｍ１無水ＴＨ Ｆ溶液に溶解したＮ−メチル−モルフォリン２．０４ｍ１とｉ合し、アルゴン雰 囲気下、−５℃で攪拌した。冷却したインブチルクロロフォルメート（２５ｍｌ ＴＨＦ中に２．４ｍ１）溶液を１０分間で、滴下した。この添加に続き、反応液 を一５°Ｃで１２分間攪拌した。ヒルログ−１８ａに対して、次にグリシンベン ジルエステル（４０ｍｌＴＨＦ中４．９ｇ：２７．６ｍｍｏｌ）の溶液を加え、 室温になるまで溶液を放置した。溶媒は減圧下除去し、生じた残渣は１００ｍ１ の酢酸エチ　。

ルに溶解した。溶液は、１００ｍ１の飽和ＮａＨＣＯ３、次に、１００＋ｏｌの 飽和ＮａＣ１で連続的に抽出し、無水ＭｇＳＱｇで乾燥し、減圧上濃縮した。生 じた粗ジペプチドエステルは、４χ２（１ｃｍのシリカゲルカラムを用い、１ｏ ｏｎ＋１当り１０？ａのＮＨ４ＯＨを含むクロロホルム中のメタノールの段階的 濃度勾配（２１クロロホルム中１％メタノールに続いて、３１クロロホルム中２ ％メタノール）にかけて精製した。画分（２５ｍｌ）を集め、ＴＬＣでアッセイ して、生成物を含むフラクションをプールして、溶媒を減圧下除去した。

生成物、　Ｎ−ＢＤＣ−Ｎｏ−Ｔｏｓ−β−ホモアルギニルグリシンベンジルエ ステルを、泡末として単離した（３．９ｇ）　。

ヒルログ−１８ｂおよびヒルログ−１８ｃに対しては、以下の修正を加えた以外 は、上記反応と同じであった。ヒルログ−１８ｂに対シては、グリシンベンジル エステルをプロリンベンジルエステルで置換して反応は１．８ｍｍｏｌｅスケー ルで行った。ヒル口り一１８ｃに対シては、グリシンベンジルエステルをバリン ベンジルエステルで置換して反応は３．０ｍｍｏｌｅスケールで行った。

Ｎ’−Ｂ匹Δとｌ口辷辷ぐ］１三と５ヱヱ上記ベンジルエステルを５０１のメタ ノールに溶解し、１０％パラジウム／カーボン１．０ｇを用いて、１７時間常圧 で水素化した。

反応溶液をセライト濾過し、溶媒を減圧下、除去した。反応で２．９ｇの粗Ｎ− ＢＯＣ−Ｎ’−Ｔｏｓ−β−ホモアルギニルグリシンを得て、上記のビダノクＣ ＋ａ）！ＰＬＣカラムにかけて精製した。

上記Ｎ−ＢＯＣ−Ｎｇ−Ｔｏｓ−β−ホモアルギニルグリノン（１，０２ｇ）を １ｍｌの無水ＤＭＦに溶解し、アイスバスで冷却した。この溶液に、ＤＭＦに溶 解した０、　５Ｍヒドロキシベンズトリアゾール（Ａｐｐｔ　ｉｅｄＢｉｏｓｙ ｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ）を５．５ｍＬ　続い て、ＣＨ２Ｃｌ２に溶解した０、５Ｍジ／クシへキ／ル力ルポジイミド（Ａｐｐ ｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を５．５＋ｎｌ加えた。１時間後、ジペプチ ドユニ。

トの対称的な無水物の冷却液をグラスウールを用いて素早く濾過し、シンクロへ 半シルウレアを取り除いた。

その間、Ｎ−ＢＯＣ−（Ｇ　ｌ　ｙ）ａ−Ａｓ　ｎ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ａ　５ｐ−Ｐ ｈｅ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　Ｉｕ−１１ｅ−Ｐｒ。

−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−０−ＰＡＭ　（Ｃ）１２Ｃ１２中０．２ｍ ｍｏｆ）を標準的なペプチド合成法で、活性化しておいた。生じた生成物のカイ ザーテストで、遊離のアミ／末端基が示された。

活性化されたβ−ホモアルギニルグリシンジベブチドヲ、樹脂に結合したヘキサ デカペプチドとカップルさせた。生じたオクタデカペプチドを引続き、Ｎ−ＢＯ Ｃ−ＰｒｏおよびＮ−ＢＯＣ−（Ｄ−Ｐｈｅ）を標準的なカップリング方法で結 合した。生じたペプチドのヒルログ−１８ａは実施例４の方法で精製した。

同様の方法をヒルログ−１８ｂおよびヒルログ−１８ｃの合成に用いた。

東ＩＬ虹ｌ ヒルログ−１９は、Ｈ−（Ｄ−Ｐｈｅ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−［部江ＣＨ２ＮＨ］ −（Ｇｌｙ）ｓ−Ａｓ　ｎ−Ｇ　１ｙ−Ａ　５ｐ−Ｐ　ｈｅ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｇ’ 、１　ｕ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　Ｉｕ−Ｔｙ　ｒ−Ｌｅｕ−ＯＨの構 ■ 式を有する。このペプチドの残基４−２０は、実施例４に記載の固相ペプチド合 成法で組み立てた。次に付加するＮ　−ＢＯＣ−Ｎ’−トシル−アルギニナルは 、以下に図示した。

ＣＩＡ）倉的 Ｎ’−ＢＯＣ−Ｎ”−Ｔｏｓ−アルギニナル■の無水ＴＨＦに加え、その懸濁液 をＯ−５℃に冷却した。次に、１．１−カルボニルジイミダゾール（Ａｌｄｒｉ ｃｈ；　３．５１ｇ）を一度に加え、２０分間攪拌を続けた。生じた清澄液は、 一部をドライアイス／アセトン浴につけ、温度を一２０℃から一３０℃に保ちな がら、リチウムアルミニウムハイドライド（Ａｆｄｒ（ｃｈ；　８０ｍ１ＴＨＦ 中１．８ｇ）の懸濁液を、連続的に攪拌しながら４５分間、滴下して添加した。

反応液は、さらに−２０℃で３０分攪拌腰−１０’ｃで６３ｍ１の２１１　）Ｉ ＣＩを滴下して反応を停止した。生じた液をガラスろうとを通して濾過し、減圧 下濃縮した。

生じた粗アルデヒドは、自互泡末（１１，５ｇ）として得られ、１００ｎ＋１の クロロホルムに懸濁して、水で洗浄しく５０ｍ１で２回）有機層を硫酸ナトリウ ムで乾燥し、減圧下、濃縮した。粗アルデヒド（７，７ｇ）は、１．０１ｍ１の クロロホルムに溶解し、３５０ｍ１のシリカゲル（Ｍｅｒｃｋ　Ｇｒａｄｅ　６ ０，２３０−４００ｍｅｓｈ、　６０オンダストローム）を含む５ｘ２０ｃｍの フラッシュカラムで精製した。溶出は、０５％メタノール含有のクロロホルム５ ００ｎ＋ｌ、１％メタノール含有のクロロホルム１１、および１．５％メタノー ル含有のクロロホルムＩ　１での段階的な濃度勾配を用いて行った。この方Ｎ− ＢＯＣ−Ｎ’−Ｔｏｓ−アルギニナル（２５８ｍｇ）を樹脂に結合したくＧ　１ ｙ）ｓ−Ａｓ　ｎ−Ｇ　１ｙ−Ａ　５ｐ−Ｐｈｅ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　Ｉ　ｕ−１１ ｅ−Ｐｒｏ−Ｇ　Ｉｕ−Ｇ　Ｉ　ｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ| ０−ＰＡＭに、Ｄ、　）１．　Ｃｏｙ　ら、−５ｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ　５ｙｎ ｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ＰｅｐｔｉｄｅＳ″Ｉｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、　Ｖｏｌ、 ８．　ｐｐ、　１１９−１２１　（１９７８）の方法を用いて、固相還元アルキ ル化条件下（４０ｍｇ、　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｒｆｄｅ、 ２４時間）で付加した。樹脂に結合したペプチド合成の後、ＢＯＣ−プロリンの 取り込みのサイクルおよびＢＯＣ−（ＩＱ−フェニルアラニン）取す込みのサイ クルでペプチド合成を完結した。合成終了後、実施例４に記載した方法で、ヒル ログ−１９を脱保護し、樹脂から離した。

ヒルログ−１９は、アブライドバイオシステムズ１５１Ａ［体クロマトグラツイ ーンステムおよびアクアボア０８カラム（ｌＱｘ２２ａｍ）を用いる逆相ＨＰＬ Ｃにかけて精製した。カラムは７０％アセトニトリル１０．８５％のＴＦＡを含 む３０％の水（緩衝液Ｂ）を１部と１％ＴＦＡを含む水（緩衝液Ａ）を４部とで 平衡化し、緩衝液Ｂの濃度を直線的に増加させるａ度勾配（２０−５０％）にか け、４．０ｍｌ／分の速度で、１２０分間展開した。流出液は２１４ｎｍの吸収 でモニターし、画分は手動で集めた。さらなる精製は、２０％緩衝液Ｂ／８０％ 緩衝液Ａの一定（１ｓｏｃｒａｔｉｃ）条件で行った。

ヒルログ−２１は、Ｈ−（Ｄ−Ｐｈｅ）−Ｐｒｏ−Ａ　ｒｇ−Ｐｒｏ−（Ｇ　ｌ ｙ）　ａ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−＾５ｐ−Ｐ　ｈｅ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｇ　ｌ　ｕ−１１ ｅ−Ｐｒｏ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｔｙ　ｒ−Ｌｅｕ−（Ｇ　ｌ　ｙ）２− Ｌｙｓ−nＨの 構造式を有する。ヒルログ−２１は、適当なりＯＣ−アミノ酸を用い定は、実施 例４に記載の方法によった。

夫］」［計上 オｏ　）　７０　＝　ｋグリシル−（Ｇｌｙ）ａ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐ ｈｅ”Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ”Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｏ Ｈの構造式を有する。ヘキサデカペプチドである、（Ｇｌｙ）　ａ−Ａｓｎ−Ｇ ｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−ＧＬｕ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔ ｙｒ−Ｌｅｕは、既に記載してあり、樹脂に結合したままである。次の残基、（ ３−アルギニル−２，２−ジフルオロ）マロニルグリ７ンは、下記に詳細に記載 したような反応式で合成される。

１−（２゛−カルボエトキシ−１’　、１’　−シフとエユエｘ５二四−３、１ ｇ　（７，１ｍｍｏｌ）　（Ｄ　Ｎ’−ＢＯＣ−Ｎ”ｎ−ヘｙ　シル−Ｎ”’− Ｃｂｚｔ　ルニチナー／ｌ／　［Ｆ、　５ａｌｉｔｕｒｏら、−Ｉｎｈｉｂｉｔ ｉｏｎ　ｏｆ　Ａｓｐａｒｔｉｃ　Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ　Ｂｙ　Ｐｅｐｔｉ ｄｅｓ　Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　Ｌｙｓｉｎｅ　ａｎｄ　０ｎｉｔｈｆｎｅ　５ ｉｄｅ　Ｃｈａｉｎ　Ａｎａｌｏｇｕｅｓ　ｏｆ　５ｔａｔｉｎｅ−、Ｊ、　Ｍ ｅｄ、　Ｃｈｅｎ＋、、　３０．ｐｐ、２８６−９５　（１９８７）］の溶液、 および１５ｍ１無水Ｔ）ＩＦ溶液中に溶解した１、５６ｍ１　（９，２３ｍｍｏ ｌ）のエチルブロモジフルオロアセテートを、７／ｌｚゴン雰囲気下、１５ｍ１ のＴｌ（Ｆに７８６ｍｇの亜鉛粉末（Ｆｌｕｋａ）を懸濁した溶液を還流しなが ら９０分にわたって添加した。還流を４時間行い、室温に２時間放置した後、混 合液を冷却し、それぞれ２００ＩＩｌｌの酢酸エチルおよび飽和ＮａＣ１／ＫＨ ＳＯ４に分配した。

有機層をとり、ＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧下濃縮した。生じた油状ノ残ｆｆｉに ！、Ｃ）ｌｃ１３　：　、’　９　／　−ル（９０：ＩＯ）ニ１ｏＯｉ’ｔｉ／ １（７）　ＮＨ４０ＦＩを加えｌ−２′−カルポエトキ／−１’　１’−ジフル オロ　エチルＮ”−ＢＯＣ−オルニチノール　ター／ヤリ−ブチルジメチルシリ ルエーテル 生じた化合物１−［（２’−カルボエト亭シー１−１−ジフルオロ）エチ”ＩＮ 　−ＢＯＣ−ＮＯ「”−ヘアジル−Ｎ”　’−Ｃｂｚオルニチノールを、次に、 ５当量のターンヤリ−ブチルジメチルシリルクロライドおよびｌＯ当量のイミダ ゾールと、３５°Ｃ，ＤＭＦ中で反応させた。反応は、Ｅ、Ｊ、Ｃｏｒｅｙ　ら 、”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｙｄｒｏｘｙｌ　Ｇｒｏｕｐｓ　ａｓ　ｔ ｅｒｔＢｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ　Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ−、Ｊ 、Ａｍｅｒ、Ｃｈｅｗ。

包虹、　９４．　ｐｐ、　６１９０−６１９１．　（１９７２）の方法に従った 。オルト位が保護されたアミンをメタノールに溶解し、Ｐｄ（ＯＨ）２を触媒と して３０　ｐｓｉで１８時間、水素化した。次に、触媒を濾過で除き、濾液を減 圧下濃縮して、１−［（２−カルボエト亭シー１−１−ジフルオロ）エチル］Ｎ 　−ＢＯＣ−オルニチノール　ターシャリ−ブチルジメチルシリルエーテルを得 た。

１−ｒ（２−カルボエトキシ−１’　、１’−ジフルオロ）エチルＮｃ′−ＢＯ Ｃ−Ｎ’−Ｔｏｓ−アルギ＝ｚ−ル　９−シ＋リーブｆルノメチルシリルエーテ ル 上記、調製した化合物を、次に、それぞれ６．８当量の１−グアニル−３，５− ジメチルピラゾールおよびトリエチルアミンと１０５℃の水中、２４時間反応さ せた。混合物は、凍結乾燥し、残渣を実施例４で述べた調製用）ＩＰＬｃにかけ た。所望のグアニジニウム化合物を（ＴＬＣでアッセイし）、プールして減圧下 、乾燥した。残渣は、Ｈ２Ｏ：アセトン（１４）に溶解し、アイス／イスで冷却 して、５０％Ｗ／Ｖ　ＮａＯＨでｐｉ（１２に調整した。この溶液に３当量のバ ラトルエンスルフォニルクロライドのアセトン溶液を６０分で加え、この間、Ｎ ａＯ［（でｐＨを１１−１２に保った。溶液は室温まで温め、−晩攪拌を続けた 。アセトンを減圧下除き、残りの水溶液をエーテルで洗った。エーテル層をとり 、飽和ＮａＨＣＯ３で逆に抽出した。水層を集め、２Ｎ　ＩＩｃＩでｐｉ（３ま で酸性化した。

生じた酸性液は、次に、酢酸エチルで２度抽出し、乾燥後、減１、−ｒ（２−カ ルホキ７−１’、１’　−ジフルオロ　エチル　Ｎ−Ｂ　ＯＣ−Ｎ’−Ｔ　ｏ　 ｓ−アルギニツール生じた化合物、Ｉ−［（２’−カルポエトキ／−１−１−ジ フルオロダ ）エチルＩＮ−ＢＯＣ−Ｎ’−’Ｔｏｓ−アルギニ／−ル　ターシャリ−ブチル ジメチルシリルエーテルの脱／リル化を、３当量のテトラ−ｎ−ブチルアンモニ ウムフルオライドを用いて、ＴＨＦ中、室温で処理した。この方法は、上記Ｅ、 　Ｊ、　Ｃｏｒｅｙらに記載されている。この過程で生じた化合物は、次に、メ タ／−ル／水中で２．５当量のＬｉＯＨて、アルゴン雰囲気下、室温で一晩処理 してけん化した。反応溶液は、酢酸エチルで洗浄し、クエン酸でｐＨ４まで酸性 化した。生じた酸を酢酸エチルに抽出し、有機層を乾燥し、減圧下濃縮した。粗 製の酸は、実施例４に記載の条件下、ビダックＣＩ８逆相ＨＰ　ＬＣカラムにか けて精製した。

土ユニ」ニュ三ポキシービ　ビージフルオロ　エチル　嵯−Ｂ　ｏ　ｃ　−Ｎｉ ｌ−Ｔ　ｏ　ｓ−アルギニノン上記化合物のアルコール基の、ケトンへの変換は 、モレキュラーンーブ存在下、０，５％水酢酸を含むＣＨ２Ｃｌ２中で、１当量 のピリジニウムジクロメートを添加して行った［Ｎ、　Ｐｅｅｔ　ら、１ｙｎｔ ｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｐｅｐｔｉｄｙｌ　ａｎｄ　Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ　Ｋ ｅｔｏｎｅｓ　ａｎｄＰｅｐｔｉｄｙｌ　ａ　−Ｋｅｔｏ　Ｅｓｔｅ、ｒｓ　ａ ｓ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆｏ　Ｐｏｒｃｉｎｅ　Ｐａｎｃｒｅａｔｉｅ　 Ｅｌａｓｔａｓｅ、　Ｈｕｍａｎ　Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　Ｅｌａｓｔａｓｅ、 　ａｎｄ　Ｒａｔ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　ＮｅｕＬｒｏｐｈｉｌ　Ｃａｔｈｅｐ ｓｉｎ　Ｇ−、Ｊ、Ｍｅｄ、Ｃｈｅｍ、、３３、ｐｐ、３９４−４０７　（１９ ９０）］。アルゴン下、１５時間攪拌後、反応液を濾過し、溶媒を真空下、除去 した。生じた１−ｃ（２′−カルボキシーｌ゛−１°−ジフルオロ）エチルＩＮ メーＢＯＣ−Ｎ”−Ｔｏｓ−アルギニノンは、油状の残渣として得られ、実施例 ４に記載の条件下、ＨＰＬＣカラムにかけて精製した。

遊離のカルボ牛ンル酸は、対称的な無水物に変換し、実施例２１に記載の樹脂に 結合したヘキサデカペプチドと反応させた。ヒルログ−２５の２つのＮ−末端ア ミノ酸である、ＢＯＣ−ＰｒｏおよびＢＯＣ−（Ｄ−Ｐｈｅ）は、標準的なペプ チド合成条件で付加し、生じたペプチドは、ＨＦで開裂した。

笈１五主ｌ ヒルログ−２６のム ヒルログ−２６は、Ｈ−（Ｄ−Ｐｈｅ）−Ｐｒｏ−アルゴオキソブロピオニルグ リシル−（Ｇ　ｌ　ｙ）ａ−Ａｓｎ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ａ　５ｐ−Ｐ　ｈｅ−Ｇ　ｌ 　ｕ−Ｇ　ｌｕ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　Ｉｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｏｆ （の構造式を有する。へ牛すデ力ペプチドである、（Ｇ　ｌ　ｙ）　４−Ａｓｎ −Ｇ　ｌ　ｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇ　ｍｕ−Ｇ　ｌ　ｕ−１１ｅ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ 　ｌ　ｕ−Ｇ　１ｕ−Ｔｙ　ｒ|Ｌｅｕ は、既に記載しであるように合成し、樹脂に結合したままである。次の残基、Ｎ −ＢＯＣ−アルグオ牛ソプロビオニルグリシンは、下記に詳細に記載したような 反応式で合成される。

（以下余白） Ｎ−Ｃｂｚ−Ｎ’−Ｔｏｓ−アルギニンジアゾメチルケトンを、実施例２１に記 載のＮ’−ＢＯＣ−Ｎ’−Ｔｏｓ−アルギニンジアゾメチルケトンの合成方法と 同様の方法で行ったが、Ｎ　−Ｃｂｚ−Ｎ’−Ｔｏｓ−アルギニンをＮｏ１−Ｂ ＯＣ−Ｎ’−Ｔｏｓ−アルギニンの代わりに用いた。４．５＋ｇのＮ“−Ｃｂｚ −Ｎ’−Ｔｏｓ−アルギニンジアゾメチルケトンを、フラスコ中で、２００ｍ１ のＣ）１２ｃ１２に溶解し、ドライアイス／アセトン浴中で攪拌しながら一７０ ℃に冷却した。無水ＨＢｒガスをその溶液に穏やかな速度で１５分間、吹き込ん だ。さらに１５分間、−７０℃で攪拌し、減圧上濃縮した。生じた生成物、Ｎ　 −Ｃｂｚ−Ｎ’−Ｔｏｓ−Ａｒｇ−ＣＯＣＨ２Ｂｒを黄色の結晶として５．０ｇ 回収した。

その間、１ｍｌのＤＭＦ中のＮａＯＨ（３６ｍｇ：油中８０％の分散ｅ＞およヒ １．２ｍｌのへキサメチルホスホルアミド（”ＨＭＰＡ”）を、ジターンヤリー ブト牛シマロ不−）　２５９ｍｇをＤＭＦ４ｍｌに溶解した液に加えた。混合物 を室温で４０分攪拌し、次に、２０分にわたって、１ｍｍｏｌのＮ’−Ｃｂｚ− Ｎ’−Ｔｏｓ−Ａｒｇ−ＣＯＣＨ２Ｂｒの１ｍｌ１０．１３ｍ１　ＨＭＰＡ溶液 に滴下した。反応を３時間続行し、その後、この溶液を５０ｍ１の水に注ぎ、５ ０ｍ１の酢酸で２回抽出した。有機層を単離し、乾燥し、減圧上濃縮して、油状 の残渣を得た。残渣は、３ｘｌＯｃｍの７リカゲルカラムで順次精製した。カラ ムは、４００ｍ１の５％アセトン−クロロホルム、４００ｍ１の１０％アセトン −クロロホルムおよヒ２００ｍ１の２０％アセトン−クロロホルムを連続的に流 して精製した。

画分（２５ｍｌ）を集め、ＴＬＣでアッセイした。所望の化合物を有する画分を プールし、濃縮して、３−（Ｃｂｚアミノ）−２−オキソ−３−ｆ３−［（Ｎ’ −Ｔｏｓ）グアニジニルプロピル）−ジ−ターンヤリ−ブチルマロネートを得た 。

５−（Ｎ−Ｃｂｚアミノ）−４−オキソ−５−３−（Ｎ’−Ｔｏｓ　グアニジニ ルプロピル）ペンタノイルグリシンベンジルエステル上記、ノーし一ブチルエス テルを１．２当量のＩＮ塩酸中で、室温で２時間攪拌し、次に過剰のピリジノを 加えて、１００°Ｃ１１５分処理して、脱力ルポキノルした。溶媒を減圧下除去 し、残渣を上記のノリ力ゲルクロマトグラフイーで精製した。生じたカルボン酸 は、実施例２１に記載の方法に従って、グリシンベンジルエステルでアシル化し た。

生じたエステルを５００ｍ１メタノールに溶解し、６００ｍｇの１０％０％パラ ／ラムカーポンを用いて、１気圧の水素雰囲気下、−晩、水素化した。反応混合 液は、次に、セライトで濾過し、減圧上濃縮して、固体の残ａ　（１５５ｍｇ） を得た。生じたアミノ酸は次に、実施例４に記載した条件で、ＨＰＬＣで精製し た。

上記アミノ酸を、ジオキサン／水（２：１、Ｖ／Ｖ）に溶解し、攪拌しながら０ ℃まで冷却して、対応するＢＯＣｍ導体に変換した。

ｐｉ（を０．ＩＮ　ＮａＯＨで１０に調整し、次に、１．１当量のジーターシャ リープチルジカーボネート（ジオキサン中）を添加した。反応はＯ′Ｃから２０ °Ｃで４時間、攪拌して行い、減圧下、工／Ｘ＋ポレートした。次に、残渣を、 酢酸エチル７１％クエン酸（２：１）で分配した。有機層をとり、１％クエン酸 で１回、飽和食塩水で３回抽出した。有機層はＭｇ５Ｏａで乾燥し、濾過して、 減圧上濃縮し、ＢＯＣ−保護された生成物を得た。

生じた、保護されたプソイドペプチドの遊離のカルボキシル基は、次に、標準的 なペプチド合成方法で、樹脂に結合したヘキサデカペプチドにカップリングした 。さらに、ＢＯＣ４−ＰｈｅおよびＢＯＣ−Ｐｒｏを、樹脂に結合したペプチド に連続的に付加した。完成したヒルログ−２６は、実施例４に記載のように、樹 脂から開裂し、脱保護、精製した。

（以下余白） 友嵐五ユ１゜ ヒルログ−２７の合 ヒルログ−２７は、構造式Ｈ−（Ｄ−Ｐｈｅ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ’−（Ｃｏ−Ｃ Ｈ２）−Ｐｒ。

−（Ｇ　Ｉｙ）　ａ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａ　５ｐ−Ｐｈ　ｅ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　１ ｕ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇ　１１ｌ−Ｇｌ　ｕ−Ｔｙｒ−Ｌａｕ−ＯＨを有する。

ヘキサデカペプチド（ＧＬｙ）ａ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ− Ｇ　１ｕ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇ　１ｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕは、先に述べた ように合成され、そして樹脂に結合したままにしておいた。分子の残りの部分を 、以下に図示、記載する反応の図式により、合成する。

Ｎ”−Ｃｂｚ−Ｎ’−Ｔｏｓ−アルギニンＣ０ＣＨプロリンベンジルエステル７ ２０ｍｇのプロリンベンジルエステル（ＨＣｌ塩）を２５ｍ１のＴＨＦに溶解し た。次に、この溶液を、アセトン／ドライアイスの入ったバスケット中で、攪拌 しながら、アルゴン雰囲気下で一７８℃に冷却した。次に、リチウムジイソプロ ピルアミド（８，０ｍｌの０．７５Ｍへ牛サン懸濁液）を加え、さらに５分間攪 拌した。これに、実施例２５に記載のように調製した、ｆｏｗｌのＴＨＦ中の１ ，０８ｇのＰＩ”　−Ｃｂ　ｚ　−Ｎ　’　−Ｔ　ｏ　ｓ−アルギニンブロモメ チルケトンを、２０分間にわたって滴下して加えた。反応液をさらに５分間攪拌 し、次いで溶液を攪拌しながら室温に暖めた。ＬＯｍｌの飽和ＮａＣ１を加えて 反応を止め、相を分離させて有機層を取り出した。次にこの相をＭｇ５ＯＡ上で 乾燥、濾過し、そして減圧下で蒸発させた。

Ｎ”−ＢＯＣ−Ｎ’−Ｔｏｓ−アルギニン　Ｃ０ＣＨプロリン上述のベンジルエ ステル（１，３ｇ）を、実施例２５に記載のパラジウム−カーボン法を用いて水 素化した。所望の生成物を得るために、得られたプソイドジペプチド（ｐｓｅｕ ｄｏｄｉ　ｐｅｐｔｉｄｅ）を実施例２５に記載−の方法でＢＯＣ保護した。

次に、精製し、保護したプソイドジペプチドを、ペプチド合成の標準法により、 ヘキサデカペプチドが結合している樹脂に結合させた。ヒルログ−２７の保護を はずし、樹脂から切り離し、そして実施例４に記載の方法で精製した。

裏五丘ｌ工 旦二二ｌ≦ｌ弘１底 ヒルログ−２８は、構造式Ｈ−（Ｑ−Ｐｈｅ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＣＨ２Ｎ）− Ｐｒｏ−（Ｇｌｙ）　ａ−Ａｓ　ｎ−Ｇ　１　ｙ−Ａ　５ｐ−Ｐｈｅ−Ｇ　Ｉｕ −Ｇ　Ｉ　ｕ−１１ｅ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｇ　Ｉ　ｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅａ| ＯＨ を有する。ヘキサデカペプチド（Ｇｌｙ）ａ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ −Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−０−Ｐ ＡＭは、先に述べたように合成し、そして樹脂に結合させたまましておいた。分 子の残りの部分を、以下に図示、記載する反応の図式により合成した。

１ｇの粉砕した３オングストロームのモレキュラーシープ（Ａｌｄｒｉｃｈ）を 、室温、アルゴン雰囲気下で、無水ＴＨＦ１Ｏｍｌ中の５．２５ｇのプロリンベ ンジルエステルの遊離の塩基（５ｃｈｖｅｉｚｅｒｈａｌｌ）および２ａ＋１の 無水エタノール溶液に攪拌しながら、加えた。１．４５＋ｍｌの５Ｎメタノール 化１’ｌＣ１および１．５ｇのＮ”−ＢＯＣ−Ｎ’−Ｔ。

混合液に加え、そして１時間攪拌した。８５Ｂのソディムシアノボロバイドライ ドをこの混合液に加え、そして１時間後、２度目の８５＋ｏｇのソディウムボロ ハイドライドを加えた。次に反応液を、２０時間攪拌し、そして濾過した。濾過 液に、１ｍｌの水および０．９＋＋＋１のＩＮ　ＨＣＩを、攪拌しながら加え、 次いで減圧下で濃縮して、Ｎ”−ＢＯＣ−Ｎ’−Ａｒｇ−［ｐｓ　１ｃＨａＮ］ −Ｐｒｏ−ベンジルエステルの清澄なオ・イル６．２ｇを得た。

３５０ｍ１のシリカゲル（Ｍｅｒｃｋ　Ｇｒａｄｅ　６０．２３０−４００　ｍ ｅｓｈ、　６０オンクストローム）を有する５ｃｍのカラムでのフラッシュクロ マトグラフィーにより、さらにオイルを精製した。クロロポルム中０．２５％、 ０．７５％および１．５％のメタノールで連続的に溶出して、産生物を得た。

Ｎ’−ＢＯＣ−Ｎ’−Ｔｏｓ−アルギニン　５ｉｃＨａプロリン得られたベンジ ルエステルを、実施例２５に記載のようにパラジウム−カーボン上で水素化し、 そして精製した。この工程で１６０ｎ＋ｇのＮ”−ＢＯＣ−Ｎ’−Ａｒｇ−［＋ ）ｓｉｃＨ２Ｎ］−プロリンの遊離の酸を生成した。これを、実施例４に記載の ＨＰＬＣクロマトグラフィーシステムを用いて、さらに精製した。ただし、溶出 は、先に実施例ｏで述べた、２６％バッファーＢ／７４％バッファーＡの一定の システムによってなされた。ジペプチドの最終収量は８６Ｉ１ｇであった。

次に、樹脂に結合しているヘキサデカペプチドに、ジペプチドを結合させ、次い でＢＯＣ−Ｐｒｏ導入サイクルおよびＢＯＣ−（Ｄ−Ｐｈｅ）導入サイクルを行 った。実施例４に記載の方法で、合成が完了したヒルログ−２８の保護をはずし 、樹脂から切り離し、そして精製した。

Ｋ直立ｌエ ヒルログ−２９の合 ヒルログ−２９は、構造式４−り００−インクマリノー３−カルボキシエトキシ −（Ｇｌｙ）ｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ− Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ＯＨを有する。ヘプタデカペプチド （Ｇｌｙ）ｓ−Ａｓｎ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ａ　５ｐ−Ｐ　ｈｅ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　ｌｕ −Ｉ　１　ｅ−Ｐｒｏ−Ｇ　１　ｕ−Ｇ　ｌ　ｕ”Ｔｙｒ−Ｌｅｕを、先に述べ たように合成し、樹脂に結合したままにした。４−クロロ−インクマリノー３− カルボキシアルコキシ部分を、以下に記載する反応図式および方法で合成した。

ホモフタル酸（１０，０ｇ）、２−ブロモエタノール（２ｔ、ｏｇ）およびベン ゼン（２００＋ｏｌ）を混合した。次に、！２−１５滴の硫酸を加え、そして、 ２．５時間加熱還流した。次に、溶液を濾過し、減圧下で濃縮した。残留物を２ ５０ｍ１のエーテル／ヘキサン（１：１）で洗浄し、そしてシンターグラスファ ンネルで濾過した。

得られた明褐色の固体を減圧下で乾燥して、約１５．０ｇの生成物を得た。

４−クロロ−３−２−ブロモエチルオキシ−インクマリン上述のように調製した エチル２−ブロモホモフタレート（４ｇ）を、五塩化リン（８，２ｇ）およびベ ンゼン（１００ｍｆ）とともに混合した。混合液を４．５時間還流し、熱いまま 濾過し、そして減圧下で蒸発させた。赤褐色の油性の残留物をすぐに、溶出液に ジクロロメタンを用いて、２４ｍｍｘ１７５ｍｍのシリカゲルカラムによるクロ マトグラフィーにかけた。２０ｍ１の画分を集め、ＴＬＣでアッセイした。４− クロロ−３−［２−ブロモエチルオキシ］−イソクマリンは、フラクシヨン２− ６に溶出した。画分をプールし、減圧下で蒸発させて、得られた残留物は、透明 の明黄色のオイル（２，２ｇ）であり、これを回収した。

４−クロロ−３−３−オキシプロパン　−インクマリノ、上記で調製した４−ク ロロ−３−［２−ブロモエチル］−イソクマリン（１，４ｇ）を無水ＴＨＦに溶 解し、アルゴン雰囲気下で攪拌している、マグネシウムターニング（ｔｕｒｎｉ ｎｇｓ）　（Ｌ７ｔ）ｏｇ）および１５ｍ１の無水ＴＨＦ中の数個のヨード結晶 の還流溶液に直接加えた。

混合液は、１．５時間還流した。次に、これを４００ｍ１のビーカー中で、過剰 のドライアイスに注いだ。すべての過剰のＣＯ２が昇華するまで混合液を２０’ に放置し、そしてジエチルエーテルおよびＴＨＦ各々約１００１ずつを、大量の 白色である目の荒い沈澱物を含有する黄色の溶液に加えた。

この混合液に無水塩酸を吹き込んだ。これにより、はとんどの沈澱物が溶解した 。次に溶液を濾過し、減圧下で蒸発して粗生成物を得た。次にこれをＤＣＭから 、−吹回結晶させた。

得られた４−クロロ−３−［３−オキシプロパン酸］−イソクマリンを、グリシ ンベンジルエステルに結合させ、そして得られた産生物を、実施例２５に記載の ように、パラジウム−カーボン上で触媒作用により水素化した。次いでプソイド ペプチドを、ヘキサデカペプチド（Ｇｌｙ）４−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈ ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−口ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕに、ペプ チド合成の標準法によって、結合させた。

ヒルログ−３０は、構造式４−クロロ−３−［２−アミノエタノール］−インク マリン−（Ｇｌｙ）ｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１ １ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕを有する。ヘキサデカペプチド （Ｇｌｙ）４−Ａｓｎ−Ｇｌ　ｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇ　１　ｕ−Ｇｌ　ｕ−１ １ｅ−Ｐｒｏ−Ｇ　１　ｕ−Ｇ　１ｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕは、先に述べたように合 成し、そして樹脂に結合させたままにする。

４−クロロ−３−［２−アミノエタノールゴー４フフフ９フ部分を、実施例２８ の記載と類似の方法により、４−クロロ−３−［２−ブロモエタノールゴーイン クマリンを合成して、調製したが、ホモフタル酸をエステル化する最初の工程で ２−ブロモエタノールに代わりに２−アミノエタノールを用いる点が異なる。

尿素結合は、４−クロロ−３−［２−アミノエタノール］−イソクマリンのアミ ノ基を活性化剤カルボニルジイミダゾール（”ＣＤＩ”）と反応させることによ り形成する。得られた中間体イミダゾールは単離しないで、樹脂に結合している ヘキサデカペプチドと反応させて、ヒルログ−３０を生成する。次に、ヒルログ −３０の保護をはずし、樹脂から切り離し、そして実施例４に記載の方法により 精製する。

支１五１立 竺土ヱｌ二圧二良底 ヒルログ−３１は、構造式アルギビジルー（Ｇｌｙ）　５−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａ ｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌ ｅｕ−ＯＨを有する。ヘキサデカペプチド（Ｇｌｙ）４−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓ ｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅ ｕは、先に述べたペプチド合成の標準法により合成し、そしてペプチドを樹脂に 結合させたままにしておく。

このヒルログのアルギビジルグリシン部分は、以下に図示、記載する反応図式に よって合成する。

（以下余白） デヒドロ−Ｎ９−ニトロアルギビジンを、実質的にアルギビジンを合成する方法 で合成する。これは、本願で参考文献として引用する米国特許Ｎｏ、　４．２５ １１．１９２に記載されている。異なるのは、グアニジニウム基がニトロ官能基 により保護され、牛ノリンの複素環が、不飽和のままであることのみである。こ の中間体を、実施例２１に記載の方法で１−ブチルグリシンをアシル化するのに 使用する。■−ブチルエステルは、標準的な酸性加水分解法により取り除く。得 られた遊離の酸を、標準的な結合法によりへ牛すデ力ペプチドと反応させる。得 られたペプチドの保護をはずし、樹脂から切り離し、そして実施例４に記載の方 法により精製する。

次に、ペプチドを、４．２５８．１９２号の特許に記載の水素化法を適用させ、 そして実施例４に記載のＦＩＰＬＣの手順で精製した。

Ｋ１匹上上 ヒルログ−３２のＡ ヒルログ−３２は、構造式Ｈ−（ｊｌ−Ｐｈｅ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−（Ｇｌｙ） ｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−目ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ −Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ＯＨを有する。

ヒルログ−３２を、２サイクルのＢＯＣ−グリシルグリシン付加後のサイクルで ＢＯＣ−プロリンの代わりにＢＯＣ−グリシンを使用したこと以外は実施例４に 記載の方法を用いて合成、精製し、そして同定した。

実ＡＬＬ亀 ヒルログ−３３のＡ ヒルログ−３３は、構造式Ｎ−アセチル−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａ ｌａ−Ｇｌ　ｕ−（Ｇ　１　ｙ）　３−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−（Ｇｌ　ｙ） 　ａ−Ａ　５ｎ−Ｇ　１ｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇ　１　ｕ−Ｇｌ@ｕ −Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ＯＦＦを有する。実施例 ４で使用したペプチド合成の標準法により、適切なりＯＣ−アミノ酸で置換して 、ヒルログ−３３を合成、精製、そして同定した。ヒルログ−３３のＣＳＤＭ部 分は、ヒトフィブリノーゲンのＡα鎖のフィブリノペプチドＡ配列のセグメント と同一のアミノ酸配列を有する。

ヒルログ−８によるトロンビンの阻害は、トロンビンがＡｒｇ−Ｐｒｏ結合を徐 々に開裂することにより、一過性であることがわかった。この開裂後、トロンビ ンが色素産生基質に対する完全な加水分解活性を回復することが観察された。従 って、ヒルログ−８を、トロンビンノ「遅性−基質（ｓｌｏｖ−ｓｕｂｓｔｒａ ｔｅ）　Ｊインヒビターと特徴付けた。

本発明の他のヒルログと同様に、ヒトα−トロンビンによるヒルログ−８の開裂 はインビトロのアッセイで証明された。ヒトα−トロンビン（１，６ｎＭ）およ び異なる濃度のヒルログ−８、ヒルログ−１０、ヒルログ−１８ａ１　ヒルログ −ｔ　ａｂ、ヒルログ−１８０゜ヒルロクー１９、ヒルログ〜３２あるいはヒル ログ−３３のいずれか（８０から１６０ｎＭ）を含有する反応混合液を、Ｏ，Ｌ Ｍ　ＮａＣ１を含有する２０＋ｏＭ　Ｔｒｆｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ７，４で調製し た。反応混合液の一部（０゜９７５ｍ１）を異なる時間で取り、Ｑ、　０２５ｍ １の色素産生基質スベクトロザイムＴ１１　（最終濃度１１μＭ）を含むキュベ ・ノド中で混合した。反応の初速塵を測定し、そしてヒルログを含まずトロンビ ンを含有するコントロール混合液に基づいて、％阻害を算出した。

別の方法では、逆相！ＴＰ　ＬＣを用いてヒルログ／トロンビン反応混合液の一 部を分離をした。このアッセイでは、ヒトα−トロンビン（最終濃度０．２５μ Ｍ）を、上述のヒルログの１つく最終濃度１２．５μＭ）を含有する反応容器に 加えた。トロンビンの添加の前および添加後の種々の時間に一部（５０μｌ）を 取った。

この一部の反応液は、フラノシニ凍結するか、あるいは直接ＨＰＬＣカラムにか けた。ＨＰＬＣシステムには、アクアポアＣ８カラム（０，４６Ｘ１０ｃｍ）を 装着したアブライドバイオシステムズ液体クロマトグラフィー・システムを用い た。カラムを７０％の溶ｍＡ（０，１％ＴＦＡ水溶液）および３０％の溶媒Ｂ（ ０，０８５％ＴＦＡ／７０％アセトアニリル）で平衡化し、そして流速１ｍ　１ ７分で３０分間、３０％から５０％への溶媒Ｂの直線濃度勾配にかけた。流出液 は、２１４ｎｍでモニターした。ペプチドの濃度は、ピークの高さを測ることに より決定した。

上述のアッセイのどちらによっても、トロンビンによるヒルログの加水分解速度 （Ｍ／分で表す）およびターンオーバー速度（ｋｃｓｔｉ分−１で表す）の測定 が可能である。どちらの方法も比較し得るｋ。。を値を示した。それらを以下の 表に示す。

インヒビター　Ｌｗヱヱニ【阻　ＫユＬユ工二Ｘヒルログ−８、Ａ−ｒｇ−Ｐｒ ｏ　０．３１−０．５ヒルログ−１０Ａｒｇ−Ｓａｒ　１０ ヒルログ−１８ａ　β−ＨｏｍｏＡｒｇ−Ｇｌｙ　＜　０．０１ヒルログ−ｉｇ ｂ　β−ＨｏｍｏＡｒｇ−Ｐｒｏ　＜　０．０１ヒルログ−１８ｃ　β−Ｈｏｍ ｏＡｒｇ−’／ａｌ　＜　０．０１ヒルログ−１９Ａｒｇ［トリ、Ｃ）！ａＮＨ ］−Ｇｌｙ　＜　０．０１ヒルログ−３２Ａｒｇ−Ｇｌｙ　５３５ヒルログ−３ ３Ａｒｇ−Ｐｒｏ　０．０５６上述のように、ヒルログ−８、ヒルログ−１ｏ１ 　ヒルログ−３２およびヒルミグ−３３は、０．０５６分−１（遅い開裂）がら ５３５分桐ぐ速い開裂）の範囲のｋ　ｃａｔで、トロンビンにより開裂された。

対照的に、ヒルログ−１８ａ、ヒルログ−１８ｂ１　ヒルログ−１８ｃおよびヒ ルログ−１９は、トロンビンによる開裂に抵抗性があるようである。

図５のパネルＡおよびＢは、トロンビンによるヒルログ−８の開裂のより詳細な 分析を示す。図５のパネルＡに示すように、ヒルログ−８の濃度がトロンビンよ りわずかに多い場合には、一過性の阻害活性を示したくヒルログの濃度によって １ｏ分間より長いか、あるいは１ｏ分間）。ヒルログ−８の濃度が高くなるに従 って、阻害効果が長引くことを示した。阻害の持続期間とヒルログ−８との直線 的相関を図５のパネルＢに示す。これらのデータから、ターンオーバ一時間、す なわち、ｋａｒｔを０．３７分−１と算出した。

上述の反応で生成したヒルログ−８由来の消化産物の精製および配列分析によっ て、ヒルログ−ａのＡｒｇ−Ｐｒｏ結合がトロンビンによって徐々に開裂される と決定した。これは、セリンプロテアーゼにとっては非常に異常な開裂部位であ り、ヒルログ−８においては、ペプチドがトロンビンに対して高い親和性を有す るために開裂にされやすくなっていると考えられる。

Ｋ嵐匹１土 ヒルログの活　に・するリンカ〜の　さの　果ヒルログ−８、ヒルログ−１３、 ヒルログ−１５およびヒルログ−１６は互いに、それらの各々のリンカ一部分の ポリグリシン部分の長さにおいてのみ異なる。リンカ−の長さが活性ｌことのよ うな効果を与えるかを知るために、これらのヒルログ各々によるヒトα−トロン ビンの阻害を比較した。次の表に、各々のヒルログのリンカ−の長さを列記する ： ペブチ　ド　リ　ンヵーの　さ　オンク゛ストロームヒルログ−８２４ ヒルログ−１３１８ ヒルログ−１５３０ ヒルログ−１６３に れらのヒルログのアンチトロンビン活性は、実質的に実施例９に記載のように、 トロンビンが触媒するスベクトロザイムＴＨの加水分解で測定した。図６は、リ ンカ−の長さとこのトロンビン触媒反応のヒルログによる阻害のＫｌの関係を示 す。この図は、ヒルログ−８、ヒルログ−１５およびヒルログ−１６は比較し得 る阻害活性を有するが、リンカ−の長さが１８オングストロームのヒルログーエ ３は、１０倍以上低い活性を有することを示す。このことは、リンカ−の長さが 〉１８オングストロームおよび＜４２オングストロームの場合は、ヒルログの活 性に影響しないことを確証する。仮説に縛られることは望まないが、出願人は、 これは溶液中に遊離している場合にもトロンビンに結合している場合と同等にヒ ルログリンカ−が無秩序になっているという事実によると考える。さらに、出願 人は、本発明のトロンビンインヒビターのＣＳＤＭおよびＡＢＥＡＭ部分のトロ ンビンへの結合にはほとんど共働性がないと考える。

爽血史主立 々のヒルログによるトロンビンが　る　のトリペプチジル−ｐ−ニトロアニリド 基質のトロンビンが触媒する加水分解に対する、本発明の種々のトロンビンイン ヒビターの阻害活性を比較した。ヒルログ−１０，ヒルログ−１８ａ、ヒルログ −１８ｂ１　ヒルログ−１８０１ヒルログ−１９、ヒルログ−３２およびヒルロ グ−３３の抗トロンビン活性を、実施例９に記載の方法で、スベクトロザイムＴ Ｈを基質として用いてアッセイした。

以下の表に、これらのトロンビンインヒビター各々の算出したＫｌ値ならびにＰ 　、−Ｐ　、’配列を列記する。

インヒビター　二、ヱｆ−【五　反り玩Ｕヒルログ−８Ａｒｇ−Ｐｒｏ　１．９ ±１．４ヒ）Ｌｔログ−１０Ａｒｇ−Ｓａｒ　＞２．０００ヒルログ−１８ａ　 β−ＨｏｍｏＡｒｇ−Ｇｌｙ　７．４ヒルログ−１８ｂ　β−ＨｏｍｏＡｒｇ− Ｐｒｏ　４．６ヒルログー１８ｃ　β−ＨｏｍｏＡｒｇ−Ｖａｌ　２０５．０ヒ ルログ−１９Ａｒｇ［ｐＬＬＬＣＨａＮＨ］−ＧＫｙ　２０．０ヒ／Ｌ／　ｏグ ー３２　Ａｒｇ−Ｇｌｙ　＞２．０００ヒルログ−３３Ａｒｇ−Ｐｒｏ　３．６ 上記に示すように、ヒルログ−１０およびヒルログ−３２はトロンビンが触媒す るスベクトロザイムＴＨの加水分解に対して活性の低いインヒビターであった。

これは、これらのインヒビター各々がトロンビンによってＰ　、−ｐ　、’結合 で開裂されるという事実と矛盾しない。ヒルログ−１９は、この結合が匹ユＣＨ ２−ＮＨに還元され、トロンビンにより開裂されなくなっているため、トロンビ ンによる加水分解の有効な阻害が観察された。

β−ホモアルギニンを有するインヒビター（ヒルログ−１８ａ１ヒルログ−１８ ｂ、およびヒルログ−１８０）での実験により、このアミノ酸誘導体が活性に影 響せずに本発明のインヒビターのアルギニンを置換し得ることがわかった。さら に、１つのメチレンによるアミド結合の置換は、トロンビン阻害活性を顕著に低 下させないことを示す。ヒルログ−１８ａおよびヒルログ−１８ｂ各々に比較し てヒルログ−１８ｃのＫｉが３０から５０倍に上昇したことは、Ｐ’ｌアミノ酸 の構造が阻害活性に重要であることを示唆する。

仮説に縛られることは望まないが、出願人は、Ｐ′１アミノ酸（ヒルログ−１８ ａのＧｌｙ；　ヒルログ−ｉｇｂのＰ　ｒｏ）のｐｈｉ−ｐｓｉの角度の存在な らびに構造的束縛（例えばヒルログ−１８ｂのプロリンに起因する）が、本発明 のインヒビターの効力に貢献すると考える。他の可能性は、立体的考察により、 ヒルログ−１８ｃのＰ’ｌアミノ酸Ｍａｌのβ分枝した側鎖が、この分子のＣＳ ＤＭ部分のトロンビンの活性中心への結合を損ない得ることである。

Ｋ皿匠１旦 トロンビンの活性。位へのヒルログ−ｐｏｐｅジイソプロピルフルオロホスフェ ート（ＤＦＰ）は、トロンビンを含むセリンプロテアーゼの周知のインヒビター であり、それは、共有結合で５ｅｒ−１９５のヒドロキシ基を修飾することによ って作用する。２７０倍過剰の”Ｃ−ＤＦＰを、０．１Ｍのホウ酸ナトリウム、 ｐｉ（８，０中のトロンビンに加えた。１０分間の反応後、トロンビン複合体の 形成を、５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびフルオログラフィーによる分析によって示した （図７、レーン１）。反応をスルホ−Ｔｙｒｓ３−Ｎ−アセチル−ヒルジン５３ −６４　（トロピンに対して３００倍および３０００倍モル過剰）の存在下で行 うと、トロンビンの［”ＣＦ−ＤＦＰによる修飾は、有意に変化しなかった（図 ７、レーン４および５）。しかし、その反応をヒルログ−８（トロンビンに対し て３倍あるいは３０倍モル過剰）の存在下で行うと、［”Ｃ１−ＤＦＰのトロン ビン触媒部位への取り込みは、完全に阻害された（図７、レーン２および３）。

これらのデータは、本発明のトロンビンインヒビターのＣＳＤＭがトロンビン触 媒速度に結合し、そして触媒活性を阻害し得ることを示す。

１嵐五１エ ヒルログ−８のアンチトロンビン活性およびΔ　。　、ペンタペプチド　Ｄ−Ｐ ｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒ　−Ｐｒｏ−Ｇｌ　の北口１に示すように、ヒルログ−８は トロンビンが触媒する小さい２−ニトロアニリド基質の加水分解を阻害し得たが 、その構成成分である外部（ｅｘｏｓｉｔｅ）にアニオン結合部位を伴う、スル ホ−Ｔ７ｒｅａ−Ｎ−アセチル−ヒルジン６３−６４と異なった。同様に、ペン タペプチド（Ｑ−Ｐｈｅ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙのトロンビン触媒 反応性の阻害能を試験した。

ペンタペプチドは実施ｆｌＡｆ４に記載のように、ＢＯＣ−グリシン−ジビニル ベンゼン樹脂を用いて合成した。ペンタペプチドは、実施例４に記載のように精 製し、同定した。

ヒルログ−８およびこのペンタペプチドの両方の、トロンビンが触媒するスベク トロザイムＴ）Ｉの加水分解に対する効果は、５０ｎＭあるいは１０ａＭ各々に 固定した濃度のペプチドを用いて実施例９に記載のように実験した。我々の結果 は、ナノモル濃度のヒルログ−８はトロンビン触媒反応を阻害し得るが、１（］ μＭの濃度のペンタペプチドはトロンビン触媒速度に有意な効果がないことを示 す。これらのデータは、本発明のトロンビンインヒビターのＣＳＤＭ成分それ自 体は、トロンビンの触媒機能の弱いインヒビターでしかないことを示す。

大ｍ ヒルログ−８のインビボでの　“ 我々は、ヒルログ−８のヒヒへのこのペプチドの静脈内投与後のインビボでの抗 凝固活性を測定した。０．００２から０．２ｍｇ／ｋｇ１分範囲のヒルログ−８ の種々の投与量を用いた。ヒヒ（雄、１０−１０−ｌ５を、ヒルログ−８投与前 に塩酸ケタミンで鎮静させた。

処置した動物およびコントロール動物の大腿静脈にいれたカテーテルから全血を 、３．８％のクエン酸ナトリウム中に採取した（血液：クエン酸ナトリウムが９ ：１）。血漿を標準法により得、実施例１０に記載の方法でＡＰＴＴを記録した 。図８に示すように、ヒルログ−８は、Ａ　ＰＴＴで投与量に依存する上昇を示 した。ＡＰＴＴの２００％の上昇（治療的範囲と考えられる）は、最も低いヒル ログの投与Ｉｔ　（Ｏｌ）０２ｍｇ／ｋｇ／分持続注入）で達成された。

丈ｍ ヒルログ−８によるクロットに　Ａしているトロンビンのトロンビンがフィブリ ンクロットに結合し得、そして一度吸収されると、さらに別のフィブリノーゲン を開裂してクロットが成長することが知られている。クロ・ノドに結合したトロ ンビン（クロ・ｙ　ｈ　結合トロンビン）は、ヘパリン−アンチトロンビンＩ［ Ｉ複合体による中和に対して耐性であることが示されている［Ｐ、Ｊ、　Ｈｏｇ ｇら、−Ｆｉｂｒｉｎ　Ｍｏｎｏｍｅｒ　Ｐｒｏｔｅｃｔｓ　Ｔｈｒｏ＋ｍｂｉ ｎ　Ｆｒｏｍ　Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　Ｂ７　Ｈｅｐａｒｆｎ−Ａｎｔｆｔ ｈｏｒｏ＋ａｂｆｎｆＩ［：１ｎｐｌｆｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　Ｅｆｆｉｃａ ｃｙ−、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｔ、　ＵＳＡ、　８６．　 ｐｐ、３６１９−２３　（１９８９）］。しかし、ＰＰＡＣＫ、ヒルジン、ある いはスルホ−Ｔｙｒｓｓ−Ｎ−アセチル−ヒルジン５ｓ−ｅａのようなアンチト ロンビンＩＩＩに依存しないインヒビターによって阻害し得る。クロ・ノド結合 トロンビンは、血栓の付着および血栓溶解性の治療後の再血栓症において役割を 演じると考えられている。

我々は、ヒルログ−８およびヘパリンのクロット結合トロンビンを阻害する能力 を、Ｊ、１．　ｆｅｉｔｚら、−Ｃ１ｏｔ−Ｂｏｕｎｄ　Ｔｈｒｏｗｂｉｎ　Ｉ ｓ　Ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｈｅｐａｒｉｎ　Ｉｎｈｔｂｉｔｉｏｎ− −Ａ　Ｐｏｔｅｎｔｉａ１Ｍｅｃｈａｎｉｓ＋ａ　ｆｏｒ　Ｒｅｔｈｒｏｍｂｏ ｓｆｓ　Ａｆｔｅｒ　Ｌｙｔｉｃ　Ｔｈｅｒａｐｙ”、　吐風、　７４．　ｐ、 　１３６ａ、　（１９８９）に記載の方法を用いて比較した。

ヘパリンの臨床的に妥当な投与量（０，１０／ｍｌ）は、可溶性トロンビンの触 媒によるフィブリノペプチドＡ　（ＦＰＡ）の放出を約７０％阻害した。しかし 、同様の投与量は、クロット結合トロンビンの触媒によるＦＰＡの放ａに何の効 果もなかった。対照的に、ヒルログ−８は、可溶性トロンビンあるいはクロット 結合トロンビンのいずれかの触媒によるＦＰＡの放出に対してほとんど同一の効 果があった（図９）。

この実験は、ヒルログ−８および本発明の他のトロンビンインヒビターが、血栓 溶解による再潅流率を増加し、血栓溶解処置後の再血栓症を防いで、血栓付着を 阻害することにおいて現在の薬物より有効であることを示す。

支１匠土立 ハ　へのインビボでのヒルログ−８の ヒトがヒトと類似の凝固および止血反応を有することが知られているので、ヒト モデルを使用して、ヒルログ−８の血小板依存性血栓症を妨げる能力を調べた。

詳細には、種々の血栓形成性表面を、動物の慢性的に体外に露出したＡＶシャン トに入れた。これらの表面には、動脈血管内膜切除したヒト大動脈のセグメント 、コラーゲンでコートしたサイラスチックチューブ、コラーゲン被覆したゴーテ ックス（Ｇｏｒｔｅｘ）およびダクロン（Ｄａｃｒｏｎ）血管移植片が含まれる 。シャント中に配置 した後、表面を天然の血流に曝して血栓形成を誘起した。血栓形成性表面上への 血小板の沈着をモニターすることにより、６０分間にわたって血栓の形成を測定 した。これらの測定は、■’Ｉｎ標識した自己血小板を試験動物に予め注入した 後、外部のガンマ−カメラによる映像で記録した。

動脈血管内膜切除したヒト大動脈の５ｃｍのセグメントを、ヒルログ−８を入れ ずに体外に露出したＡＶシャントに入れると、時間に伴・う血小板の沈着が起こ った。この堆積は６０分でプラトーに達し、プラトーでは、総量で１４．０±５ ．ＯＸＩＯ＠血小板／Ｃｍが動脈血管内膜切除したセグメント上に沈着していた 。０．００２およびｏ、　ｏｘｍｇ／ｋｇ／分の投与量のヒルログ−８は、血小 板の沈着を各々、５３．６％および７５．５％阻害した。これらの結果を図１０ に示す。このモデルシステムのヒルログ−８のＥＤｓａ　（血小板の沈着を５０ ％減少させるの必要な投与量）は０．００２＋ｇｇ／ｋｇ／分であった。

５ｃｍ片のコラーゲン被覆したサイラスティックチューブをＡＶシャントにいれ た場合には、ヒルログ−８を入れないと１２．６±５．０　ＸＩＱ”血小板／ｃ ｍが６０分後に沈着していた。ヒルログ−８を投与すると、投与量に伴う血小板 沈着の阻害が起こった。０．０４ｒＩ１ｇ／ｋｇ／分の投与量のヒルログ−８は 、血小板の沈着を完全に阻害した。実験のこの部分の結果を図１１に示す。この システムで算出されたヒルログ−８のＥＤｓｅは、０．００４ｍｇ／ｋｇ／分で あった。

コラーゲン被覆したゴーテックスあるいはダクロン血管移植片はどちらも、サイ ラスティックチューブより血栓形成性が強いことが知られている。ヒルログ−８ を入れないと、６０分間の天然の血流への露出後、総量で３５．０±６．ＯＸＩ Ｑ”血小板／Ｃｍが沈着した。ヒルログ−８が、血小板血栓形成に対して投与量 依存性の抗血栓効果を再度示したことを見い出した。０．２ｍｇ／ｋｇ／分の投 与量のヒルログ−８は、血小板の沈着を６２．９％阻害した。ゴーテックスシス テムでのヒルログ−８のＥＤｓｅｌ；ｔＯ１１３５／＋ｇ／ｋｇ／分であった。

ダクロン移植片についても同様の結果が得られた。これら２つの表面上での血小 板沈着を阻害するのに、高い投与量のヒルログ−８が必要であることは、それら の血栓形成性が高いことから、予想されたことであった。

さらに、よく剪断された、あるいはあまり剪断されていない血小板に依存する血 栓形成に対するヒルログ−８の効果を、デュアルチャンバー装置を用いて調べた 。この装置によって両方の剪断条件を同時に測定し得た。装置に、２ｃｍのコラ ーゲン被覆したゴーテックスを入れ、次いで直径が伸びた２ｃｍのセグメントを 入れた。この装置を使用して、コラーゲン被覆したゴーテックスのセグメントを 、高い剪断条件で天然の血流に露出することにより、血栓形成を開始させた。実 験手順のこの部分は、動脈様条件をシミユレートしている。直径が伸びたセグメ ントに血液が入ると、低い剪断、渦巻の条件が維持され、それによって静脈血栓 症をシミュレートする。コントロールの動物では、高い剪断条件および低い剪断 条件での各々のセグメントに、４０分後に総量で９．３±２．３　ＸｉＯ”およ び６．１±０．５　Ｘ１０８血小板／ｃｙ、が沈着した。ヒルログ−８は、高い 剪断条件および低い剪断条件でのセグメントの両方で、血小板の沈着を阻害した 。０．０５Ｂ／ｋｇ／分の投与量は、低い剪断条件で４２．６％、高い剪断条件 で２９．０％血小板の沈着を阻害した。

叉１を目」１ ５、ハ　依　住血　「の　についてのヒルログ−８と　のｍ１主旦亙旦孟蓋 実施例４０で述べたコラーゲン被覆したサイラスティックチューブ／体外に露出 したＡＶシャントのヒトモデルでの血小板沈着に対する、ヘパリン、低分子量の ヘパリンおよび組換えヒルジンの効果を調べた。

１６０Ｕ／ｋｇのヘパリンを１回で注射し、次いで１６０Ｕ／ｋｇ／時間を持続 注入すると、生理食塩水で処置したコントロールの動物で観察された血小板沈着 の約８０％のレベルにまで阻害されることが以前から知られていた。低分子量の ヘパリン５３抗Ｘａ　０７ｋｇを１回で注射し、次いで５３抗Ｘａ　Ｕ／ｋｇ／ 時間を持続注入すると、同様の結果が得られた［Ｙ、　Ｃａｄｒｏｙ、　”Ｉｎ 　Ｖｉｖｏ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆＴｈｒｏｍｂｕｓ　Ｆｏｒｍａｔｆｏｎ 、　５ｔｕｄｉｅｓ　Ｕｓｉｎｇ　ａ　Ｐｒｆｍａｔｅ　Ｍｏｄｅｌ″、匣ｔｏ ｒａｌ　Ｔｈｅｓｆｓ、　Ｌ’Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ　Ｐａｕｌ　５ａｂａｔｉ ｅｒ　ｄａ　Ｔｏｕｌｏｕｓｅ　（Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）　（１９８９）］ｏ　モ ル当量（５ｎｍｏｌｅ／ｋｇ／分）では、組換えヒルジン［Ａ、　Ｂ、　Ｋｅｌ ｌｙら、−Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｉｒｕｄｉｎ　Ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｏ ｎ　ｏｆ　Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｔｈｒｏ＋ｗｂｕｓ　Ｆｏ ｒｍａｔｉｏｎ−、Ｃ１ｒｃｕｆａｔＢ狙、７８゜ｐ、ｌｌ−３１１（１９８８ ）］および］ヒルログーはどちらも血小板依存性血栓形成を、コントロールに比 較して約６０−７０％阻害した。これらの結果を図１２に示す。他のトロンビン インヒビターは、ヒトモデルで以前に試験されている［Ａ、　Ｂ、Ｋｅｌｌｅｙ ら、−Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｒ　Ａｎｔｆｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ　ａｎｄ　 ＡｎｔｉｈｓｗｏｓｔａｔｉｃＥｆｆｅｃｔｓ　Ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　Ａｎ ｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎｓ　ｉｎ　Ｐｒｉｍａｔｅ　Ｍｏｄｅｌｓ　０ｆＡｒｔｅ ｒｉａｌ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｔｓ”、Ｔｈｒｏｍｂ、ａｎｄ　Ｈｅｍｏｓｔａｓ 、、６２．ｐ、４２　（１９１１９）］。コラーゲン被覆した表面でのそれらの 物質の報告されているＥＤＳ［ｌ投与１ならびに我々が調べたＥＤＳ　［１を、 以下の表にまとめた： 血ｌ　旦Ｊし１ ＰＰＡＣＫ　７５　ｎｍｏｌｅｓ／ｋｇ／分Ｇｙｋｉ　１４．４５１　５００ ベンズアミジン　３０００ アルギビジン（ＭＤ８０５）　５００ 組換えヒルジン　く５ ヒルログ−８＜５ 尖１」ＩＬｌ フィブリン沈　に・するヒルログ−８の効実施例４０で述べた動脈血管内膜切除 した大動脈およびコラーゲン被覆したサイラスティックチューブのセグメントの モデルシステムで形成された血栓中のフィブリン（フィブリノーゲン）の沈着に 対するヒルログ−８の効果を測った。フィブリン沈着は、上述の１０Ｉｎ−血小 板アッセイが完了した３０日後に１２５Ｉ−フィブリン（フィブリノーゲン）を 測定することにより、調べた。これは、１　ｔ　Ｉ　ｉｎ　ｆＩ識が影響しない レベルにまで崩壊させた。

図１３は、ヒルログ−８を使用しないと、実施例４０で述べたようにコラーゲン 被覆したチューブを血流に６０分間露出した後、０、１７ｍｇ／ａｍのフィブリ ンが沈着したことを示す。０．Ｏｌおよび０、０４ｍｇ／ｋｇ／分の投与量は、 完全にフィブリン（フィブリノーゲン）沈着を阻害した。動脈血管内膜切除した 大動脈のセグメントモデルでも同様な結果が得られた。これらの結果は、本発明 のトワンビンインヒビターが血栓に伴うフィブリン（フィブリノーゲン）沈着を 減少させる効果および急性の血小板依存性血栓形成を阻害する効果を有すること を示す。

Ｋ嵐匠土ｌ ヒルログ−８のクリアランス　日の油 ヒヒモデルを使用して、静脈内持続注入後、単回の静脈内ポーラス（ｈａｌｕｓ ）注射後および単回の皮下ポーラス注射後のヒルログ−８のクリアランス時間を 測定した。実施例１１に記載のように行ったＡＰＴＴアッセイを用いてクリアラ ンス時間をモニターした。

種々の投与量のヒルログ−８（０，００２−０，２ｏ＋ｇ／ｋｇ／分）を、全身 性の静脈内持続注入によって６０分間にわたってヒヒに投与した。６０分間の持 続注入後、およびそれ以後種々の時間毎にＡＰＴＴを測定した。測定したヒルロ グ−８のクリアランスの平均半減期は９．２±３，３分であった。

単回のポーラス注射後のクリアランス時間を測定するために、ＩＢ／ｋｇの投与 量のヒルログ−８をヒヒに静脈内注射あるいは皮下注射した。ＡＰＴＴ測定は、 注射後種々の時間毎に行った。

図１４は、ＡＰＴＴが静脈内注射後２分でピークのコントロールの値の５７０％ にまで増加したことを示す。静脈内注射後のヒルログ−８の半減期は１４分であ った。

図１５は、ヒルログ−８の皮下注射後量も早い時点（すなわち１５分後）で、Ａ ＰＴＴがコントロールの約２００％に増加したことを示す。皮下経路によるクリ アランスでは、半減期が３４０分に延びた。皮下投与によるヒルログ−８は、相 当量が吸着することがわかった。

丈１」ＩＬ土 ヒヒモデルの　管　１ＵＬｌＩＣに・　るヒルログ−８肱且 Ｐ、Ｂ、Ｔａｙｌｏｒら、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、？９．　ｐｐ、９１ ８−２５　（１９８７）に記載の方法に従って、致死量のＥ、　ｃｏｌｔ生菌を 注射して、ヒヒに敗血症を起こした。０．０８ｍｇ／ｋｇ／時間の投与量のヒル ログ−８を、Ｅ、　ｃｏは投与の１５分前から投与後最長６時間まで持続注入し た。ヒルログ−８を使用しないと、Ｅ、　ｃｏｌｉにより引き起こされた敗血症 性ショックは、好中球数、血圧およびヘマトクリットの顕著な低下を起こした。

コントロール動物では、３時間後にはへマドクリ・ットはベースラインの７０％ にまで低下し、血圧はベースラインの２０％にまで落ちた。ヒルログ−８の投与 によって、ヘマトクリットの低下は完全に減じ、そして血圧のピーク時の低下も ベースラインの６０％までにとどまった。

ヒルログ−８によるＤＩＣの減衰にもかかわらず、致死量のＬ皿の注入によって 、まだ致死を起こした。フントロールおよびヒルログ−８で処置した動物の両方 の剖検で、どちらの群でも大量の組織浮腫が見られた。しかし、コントロール群 のみに血管内血栓が見られた。剖検の結果は、敗血症の凝固障害の段階を妨げる だけでは敗血症性シヨツクによる死亡を防ぐには十分でないことを示す。

Ｌ直匠土旦 ゛　に・　るｔＰＡおよびヒルログ−８の　みＡわせのｔＰＡに誘起される血栓 溶解を強化するヒルログ−８の効果を調べるために、動脈血栓溶解のラットモデ ルを使用した。このモデルでは、バルーンカテーテルによる剥脱および高度（９ ５％）の狭窄後の実験的血栓を腹部大動脈に形成させた。血流および血圧は、損 傷および狭窄部位から遠い部位でから記録した。ラットを無作為に選んでｔＰＡ 　（Ｌ、Ｏｍｇ／ｋｇの単回投与後、１．０ｍｇ／ｋｇ／時間の涛続注入）とと もに次のうちの１つを投与した：すなわち生理食塩水、ヘパリン（ＩＱＵ／ｋｇ 単回投与後、１゜５Ｕ／ｋｇ／分の持続注入）、組換えヒルジン（１，０ｍｇ／ ｋｇの単回投与後、０．０２ｍｇ／ｋｇ／時間の持続注入）あるいはヒルログ− ８（０゜６ａ＋ｇ／ｋｇの単回投与後、ｏ、　ｏｚＢ／ｋｇ／時間の持続注入） である。

抗血栓剤あるいは生理食塩水をｔＰＡと同時に投与し、モしてｔＰＡの持続注入 終了後さらに５０分間投与した。

図１６にこれらの実験の結果を示す。ｔＰＡ十生理食塩水で処置した動物の再潅 流までの時間は１６．２分だった。ヘパリンは再潅流までの時間を１２．２分に 短縮し、一方、ヒルジンは１３．０分に短縮した。これらの短縮のどちらも統計 的に有意ではなかった（　ｐ＜０．　Ｏ５）。ヒルログ−８のｔＰＡとの組み合 わせは、再濯流までの時間を４．４分に有意（ｐ＜０．０１）に短縮し、そして ｔＰＡのフィブリン溶解効果を４倍に促進した。

ヘパリン、ヒルジンおよびヒルログ−８はすべて、生理食塩水で処置したコント ロールに比較して有意に再閉塞を防いだ（図１７）。これらの物質もまた、ＡＰ ＴＴを各々、コントロールの値の６００％、５００％および４００％の値に延ば したく図１８）。最後に、ヘパリン、ヒルジンおよびヒルログ−８はそれぞれ、 血管の開通性を各々、８０．２％、８２％および９３．１％に上げた（コントロ ール・４３．Ｈ）　（図１９）。これらの結果は、本発明のトロンビンインヒビ ターが、ｔＰＡの有効性を増すのに、池の既知の抗血栓剤より優れていることを 示す。

１皿五土ｌ ヒヒの　に・　るヒルログ−８および　の　斉のテンプレート（ｔｅｍｐｌａｔ ｅ）出血時間測定を用いて、止血に対するヒルログ−８の効果を調べた。

種々の投与量のヒルログ−８（０，００２からｏ、　２ｒａｇ／ｋｇ／分）の出 血時間に対する効果を分析した。Ｑ、　００２から０．０４＋ａｇ／ｋｇ／分の 投与量では、有意な出血時間の一延長は起こらなかった。この実験り結果を図２ ０に示す。Ｏ，１ｍｇ／ｋｇ／分の投与量では、ヒルログ−８は、出血時間をコ ントロール値の２倍にした。０．２ｍｇ／ｋｇ／分のヒルログ−６では、出血時 間はコントロール値の３倍に延びた。これらの結果は、血小板依存性血栓症を抑 制するのに必に有意な影響を与えないことを、明かに示している。

我々はさらに、種々の他の物質の、ヒヒのテンプレート出血時間に対する効果お よび全身性の抗凝固効果（ＡＰＴＴで測定）を試験した。これらの結果を以下に 要約する：韮　旺二二ｌヱ胆」と　棗１豆皿ユ丘Ｌヒルログ−８３００，６５， ５ 組換えヒルジン　３９３．９　１２．１ＰＰＡＣＫ　２８７．９　１２ Ｇｙｋｉ　１４，４５１　４３９．４　１４ベンズアミジン　７５７．６　１０ アルギビジン（ＭＤ８０５）　＞９００　＞３０ヘパリン　７０６．１　１０ 案１」［ＬＬ １丑」ヱーユ（Ｌ１戊 ヒルログ−３４は、構造式Ｈ−（Ｑ−Ｐｈｅ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−（テトラエチ レングリコリルスクシニル）　−Ａｇｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇ ｌｕ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−０）１を有する。デ カペプチドＡｓｎ−ＧＩＦ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌ　ｕ−１１ｅ−Ｐｒ ｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕは、先に述べたように合成して樹脂に結合 したままにしておく。分子の残りの部分を、以下に図示、記載する反応図式によ って合成する。

（以下余白） Ｎ”−ＢＯＣ−Ｄ−Ｐｈｅ　−Ｐｒｏ−Ｎ’　Ｎ’−Ｃｂｚ　−ＡｒＩＦ’−Ｂ ＯＣ−Ｎ’−（Ｃｂｚ）２−Ａｒｇ（Ｂａｃｈｅｍ、Ｉｎｃ、、　Ｔｏｒｒａｎ ｃｅ、　ＣＡ）を過剰のジアゾメタンのエーテル溶液と反応させ、次いで酸で処 理してＮ改−ＢＯＣ基を除（。次に、得られた生成物、Ｎ’、Ｎ’−（Ｃｂｚ） ２−アルギニンメチルエステルをＤＭＦに溶解し、水浴で冷却し、そして、２当 量のＮＣ１−ＢＯＣ−プロリン、１当量のブタノール、１当量のＥＤＣＩおよび １当量のジイソプロピルエチルアミンで順番に処理する。反応混合液は一晩攪拌 し、次いで５容量の冷水で希釈し、そして酢酸エチルで抽出する。有機層を回収 し、等量の飽和クエン酸、飽和ＮａＨＣＯ３および飽和ＮａＣ１で連続的に洗浄 する。次に生成物をＭｇ５Ｏａで乾燥させ、そして減圧下で濃縮する。得られた ジペプチド中間物質、Ｎ”−ＢＯＣ−プロリル−Ｎｇ、　Ｎ’−（Ｃｂｚ）２− アルギニンメチルエステルを、１０倍モル過剰の４Ｎ　ＨｃＩ／ジオキサンで３ ０分間処理する。遊離のＦＩＣＩを減圧下で除去し、そして残留物を無水ＤＭＦ に溶解する。次に、生成物を水浴で冷却し、そして上述のように、ブタノール、 ＥＤＣＩおよびジイソプロピルエチルアミンの存在下で２当量のＮ”−ＢＯＣ− （ｌｌ−Ｐｈｅ）と反応させる。直交的に（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｌｙ）保護さ れている粗製のトリペプチドを上述のように単離し、シリカゲルカラムにかけ、 ０．１％のＮＨＪＯＨを含有するクロロホルム：メタノール（９５：５）で溶出 して精製する。次に、Ｎ’（−ＢＯＣ−（Ｄ）−フェニルアラニルプロリル−Ｎ ’、　Ｎ’−（Ｃｂｚ）２−アルギニンメチルエステルを、メタノール：水（２ ：ｌ）中、２当量のＬｉＯＨテ、室温で３時間、けん化する。メタノールを減圧 下で除去し、そして水溶液を２容量のジエチルエーテルで洗浄する。次に、溶液 を飽和クエン酸でｐＨ３に酸性化する。得られた粗製トルペプチドの遊離酸を酢 酸エチル中に抽出する。有機層を３容量の飽和ＮａＣ１で洗浄し、無水ＭｇＳＯ ４で乾燥させ、そして減圧下で濃縮する。

得られたＮａ−ＢＯＣ−（込）−フェニルアラニルプロリル−Ｎ’、　Ｎ’−（ Ｃｂｚ）２−アルギニンを、実施例４に記載の条件下で逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃ，で精 製する。

ＮスーＢＯＣ−Ｄ）−フェニルアラニルプロリル−ＮＱＮｇ−Ｃｂｚ　−アルギ ニンテトラエチレングリコールエステル上述のトリペプチド溶液をＴＨＦに溶解 し、そして、ジエチルアゾジカルボキシレートおよびトリフェニルホスフィン各 々１当量の存在下で、１．５当量のテトラエチレングリコールでエステル化する 。これは、Ｏ，Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ、　−Ｔｈｅ　Ｕｓｅ　ｏｆ　Ｄｉｅｔｈｙ ｌＡｚｏｄｔｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ　ａｎｄ　Ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐ ｈｉｎｅ　ｉｎ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　 ｏｆ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ΣＬ１１丸免旦１且、ｐｐ。

ｘｉ−２８（１９８１）に記載のように行う。これに開示されているものを本願 の参考文献として引用する。

Ｎｃｉ−ＢＯＣ−Ｄ　−７エ＝　／ｌ／　７５　＝　／Ｉ／ブａ　１７　ルーＮ ’　Ｎ’−Ｃｂｚ　−フル＃ニンテトラエチレングリコールエステルヘミスクシ ネート得られた化合物をＤＭＦに溶解し、そして、１当量のジイソプロピルエチ ルアミンの存在下で１当量の無水コハク酸でエステル化する。揮発性の溶媒を減 圧下で除去し、そして、遊離の酸を、実施例４に記載の条件で逆相ＨＰＬＣで精 製する。

ＮベーＢＯＣ−Ｄ−フェニルアラニルプロリル−ＮｇＮｇ−Ｃｂｚ　−アルギギ ニンテトラエチレングリコールヘミスクシネートＮ−ヒドロ上述の酸の溶液を、 ＤＭＦ中の１当量のＮ−ヒドロキシスクシンイミドと混合し、水浴で冷却し、そ して、ＤＭＦ中の１当量のＤＣＣを滴下して混合する。反応液を室温で２４時間 攪拌し、沈澱したジシクロヘキシル尿素を濾過し、そして減圧下で濃縮する。次 ニ、溶液を冷やしたベンゼン／ヘキサンで濃縮して粗製ペプチド−グリコールが 結合したトヒドロキシスクシンイミドエステルを得る。

実施例２１に記載のように、上述の化合物を樹脂に結合しているドデカペプチド と反応させる。得られたヒルログ−３４を実施例４に記載のように、樹脂から切 り離し、精製し、そして同定した。

これまでに、本発明の多数の実施態様を示してきたが、我々の基本的な構築を変 えて、本発明の分子、組成物、組み合わせ、そして方法を使用する他の実施態様 を提供し得るのは明かである。従って、本発明の範囲は、これまでに実施例とし て述べてきた特定の実施態様よりもむしろ、ここに添付する請求の範囲によって 定義されることは、理解される。

４３ρｏ〇− Ｆ／に、３Ａ ※−ＴＩＭＥ ＩＧ　３Ｂ ｌ／口Ｓ：ｌ、Ｍ−’　ｘｌｏ−５ Ｂ℃４ ＩＱ　２０　３０　４０　５０　６０ 呵間、全 Ｆ／に、５８ ０　ＩＱ　２０　３０　４０　５０　６０ダーン才−ハ一　叫Ｌメト ＦＩ６．６ リンカ−Ｉり各−：！（幹Ｇｌｙ　グｙ羞　）４３．０００− ｍ−−−８８８１−喝一一 ２５．０００− 旧、０００− ＲＧ、８ ＃：Ｉレログー８ｊｉｆｆ、ｎｍｏｌａ／ｋｇ／６ＦＩ６．　９ 生物 ＦＩＧ、　１０ ３ルロフ゛’−８，ｎｍｏｌｅ／ｋｇ／　／２卜ＦＩＧ、　／／ １ｚｔｚｐグ−ヨ、ｎｍｏｌｅ／ｋｇ／　ｙ−ＪＦＩＧ、　／２ ＦＩＧ、／３ １９しＤブ’−８，ｎｍｏｌｅ／ｋｇ／　ｔｐｂυ１４ Ｅ蛇１５ 轄咋ｌ≧ ＦＩＧ、１６ ＦＩＧ、　／８ ＦＩＧ、　／９ ＦＩＧ、　２０ ｖしｏフ−−８型支１１ヒ、ｎｍｏｌｅ／ｋｇ／ろ〉補正書の写しく翻訳文）提 出書（特許法第１８４条の８）平成４年２月１８日膠

Claims (42)

【特許請求の範囲】
1. １．トロンビンインヒビターであって；ａ）トロンビンの活性部位に結合し、そ して阻害する触媒部位特異的部分； ｂ）計算上の長さが約１８オングストロームと約４２オングストロームとの間で ある骨格鎖で特徴付けられるリンカー部分；および ｃ）外部のアニオン結合部位に結合する部分；を含有し、該触媒部位特異的部分 は該リンカー部分に結合しており、該リンカ一部分は該外部のアニオン結合部位 に結合する部分に結合している、トロンビンインヒビター。
2. ２．前記外部のアニオン結合部位に結合する部分が次の構造式； Ｗ−Ｂ１−Ｂ２−Ｂ３−Ｂ４−Ｂ５−Ｂ６−Ｂ７−Ｂ８−Ｚからなる請求項１に 記載のトロンビンインヒビターであって、ここで、Ｗは結合手であり；Ｂ１はア ニオン性アミノ酸であり；Ｂ２は任意のアミノ酸であり；Ｂ３はＩｌｅ、Ｖａｌ 、Ｌｅｕ、ＮｌｅあるいはＰｈｅであり；Ｂ４はＰｒｏ、Ｈｙｐ、３．４−デヒ ドロＰｒｏ、チアゾリジン−４−カルボン酸塩、Ｓａｒ、任意のＮ−メチルアミ ノ酸、あるいはＤ−Ａｌａであり；Ｂ５はアニオン性アミノ酸であり；Ｂ８はア ニオン性アミノ酸であり；Ｂ７は、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、 Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｈａ、Ｐｒｏからなる群から選択される脂質親和性アミノ酸 、あるいは、これらの脂質親和性アミノ酸の１つとおよび任意のアミノ酸からな るジペプチドであり；Ｂ８は結合手、あるいは、１から５残基の任意のアミノ酸 の形態を有するペプチドであり；そしてＺは、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、ア ミノ、モノ（Ｃ１−Ｃ４）あるいはジ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル置換アミノあるい はベンジルアミノから選択されるカルボキシ末端残基である、トロンビンインヒ ビター。
3. ３．請求項２に記載のトロンビンインヒビターであって、ここで、Ｂ１はＧｌｕ であり；Ｂ２はＧｌｕであり；Ｂ３はＩｌｅであり；Ｂ４はＰｒｏであり；Ｂ５ はＧｌｕであり；Ｂ６はＧｌｕであり；Ｂ７はＴｙｒ−Ｌｅｕ、Ｔｙｒ（ＳＯ３ Ｈ）−Ｌｅｕ、Ｔｙｒ（ＯＳＯ３Ｈ）−Ｌｅｕあるいは（３−，５−ジョードＴ ｙｒ）−Ｌｅｕであり；Ｂ８は結合手であり；そしてＺはＯＨである、トロンビ ンインヒビター。
4. ４．前記リンカー部分の前記骨格鎖が、炭素、窒素、イオウおよび酸素からなる 群から選択される原子の任意の組み合わせからなる、請求項１に記載のトロンビ ンインヒビター。
5. ５．前記リンカーが、アミノ酸配列； Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅを含有する、請求項 ４に記載のトロンビンインヒビター。
6. ６．前記触媒部位特異的部分が、可逆的にトロンビンに結合し、そしてトロンビ ンによって徐々に開裂される、請求項１に記載のトロンビンインヒビター。
7. ７．前記触媒部位特異的部分が、可逆的にトロンビンに結合し、そしてトロンビ ンによって開裂され得ない、請求項１に記載のトロンビンインヒビター。
8. ８．前記触媒部位特異的部分が、不可逆的にトロンビンに結合する、請求項１に 記載のトロンビンインヒビター。
9. ９．請求項６に記載のトロンビンインヒビターであって、前記触媒部位特異的部 分が次の構造式からなり；Ｘ−Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ｙ ここで、Ｘは水素であるか、あるいは１から３５個の原子からなる骨格鎖によっ て特徴付けられ；Ａ１はＡｒｇ、ＬｙｓあるいはＯｒｎであり；Ａ２は非アミド 結合であり；Ａ３は、１から９個の原子からなる骨格鎖によって特徴付けられ； そしてＹが結合手である、トロンビンインヒビター。
10. １０．ＸがＤ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏであり；Ａ１がＡｒｇであり；そしてＡ３がＤ− Ｐｒｏ、ＰｒｏあるいはＳａｒである、請求項９に記載のトロンビンインヒビタ ー。
11. １１．前記トロンビンインヒビターが、ヒルログ−８およびヒルログ−１２から なる群から選択される、請求項１０に記載のトロンビンインヒビター。
12. １２．ＸがＮ−アセチル−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ− Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌであり；Ａ１がＡｒｇであり；そしてＡ３がＰ ｒｏであり、前記トロンビンインヒビターがヒルログ−３３である、請求項９に 記載のトロンビンインヒビター。
13. １３．請求項７に記載のトロンビンインヒビターであって、前記触媒部位特異的 部分が次の構造式からなり；Ｘ−Ｃ１−Ｃ２−Ａ３−Ｙ ここで、Ｃ１は、還元されたカルボキシル基あるいは１から１０個の原子の骨格 鎖によって特徴付けられる構造によってα位炭素で置換されているカルボキシル 基を有するＡｒｇ、ＬｙｓあるいはＯｒｎの誘導体であり；Ｃ２は開裂可能でな い結合であり；そしてＸ、ＹおよびＡ３は請求項９に定義されている通りである 、トロンビンインヒビター。
14. １４．ヒルログ−１８ａおよびヒルログ−１８ｂからなる群から選択される、請 求項１３に記載のトロンビンインヒビター。
15. １５．患者あるいは体外の血液中のトロンビンが介在する機能を阻害するための 薬学的に許容し得る組成物であって、請求項１から１４のいずれか１つに記載の トロンビンインヒビターの薬学的に有効な量および薬学的に許容し得る担体を含 有する、組成物。
16. １６．前記薬学的に有効な量が、約１μｇ／ｋｇ体重／日から約５ｍｇ／ｋｇ体 重／日の間である、請求項１５に記載の薬学的に許容し得る組成物。
17. １７．前語薬学的に有効な量が、約１０μｇ／ｋｇ体重／日から約５００μｇ／ ｋｇ体重／日の間である、請求項１６に記載の薬学的に許容し得る組成物。
18. １８．患者の血栓による疾患を治療あるいは予防するための方法であって、請求 項１５から１７のいずれか１つに記載の薬学的に許容し得る組成物を、該患者に 投与する工程を包含する、方法。
19. １９．前記インヒビターが放射性同位元素で標識されている、請求項１に記載の トロンビンインヒビター。
20. ２０．前記放射性同位元素が、１２１Ｉ、１２５Ｉおよび１１１Ｉｎからなる群 から選択される、請求項１９に記載のトロンビンインヒビター。
21. ２１．患者のフィブリンあるいは血小板血栓を生体外（ｅｘｖｉｖｏ）で画像に するための組成物であって、該組成物が、薬学的に許容し得るバッファーおよび 請求項１９あるいは２０に記載のトロンビンインヒビター。
22. ２２．患者のフィブリンあるいは血小板血栓を生体外で画像にするための方法で あって； （ａ）該患者に請求項２１に記載の組成物を投与する工程；および （ｂ）該組成物中に存在するトロンビンインヒビターを観察するために検出手段 を用いる工程；を包含する、方法。
23. ２３．患者に挿入するための挿入（ｉｎｖａｓｉｖｅ）装置の表面をコートする ための組成物であって、該組成物は適切なバッファーおよび請求項１から１４の いずれか１つに記載の少なくとも１つのトロンビンインヒビターを含有する、組 成物。
24. ２４．患者に挿入する挿入装置の表面をコートする方法であって、該方法が、請 求項２３に記載の組成物に該表面を接触させる工程を包含する、方法。
25. ２５．患者の血栓による疾患を治療あるいは予防するための、薬学的に有効な組 み合わせであって； ａ）請求項１から１４のいずれか１つに記載のトロンビンインヒビター； ｂ）血栓溶解剤；および ｃ）薬学的に許容し得る担体； を含有する、薬学的に有効な組み合わせ。
26. ２６．前記トロンビンインヒビターがヒルログ−８であり、前記血栓溶解剤がｔ ＰＡである、請求項２５に記載の薬学的に有効な組み合わせ。
27. ２７．請求項２５に記載の薬学的に有効な組み合わせであって、ここで前記トロ ンビンインヒビターの日用量は約１μｇ／ｋｇ体重と約５ｍｇ／ｋｇ体重との間 であり、そして前記血栓溶解剤の日用量は前記血栓溶解剤の従来の用量範囲の約 １０％と約８０％の間である、薬学的に有効な組み合わせ。
28. ２８．請求項２７に記載の組み合わせであって、ここで前記トロンビンインヒビ ターの日用量は約１０μｇ／ｋｇ体重と約５００μｇ／ｋｇ体重との間であり、 そして前記血栓溶解剤の日用量は、前記血栓溶解剤の従来の用量範囲の約１０％ と約７０％の間である、組み合わせ。
29. ２９．患者の再灌流を成立させるために、あるいは再閉塞を防ぐために要する血 栓溶解剤の用量を減らすための方法であって、該血栓溶解剤を請求項２６から２ ８のいずれか１つに記載の組み合わせの一部として該患者に投与する工程を包含 する、方法。
30. ３０．血栓溶解剤で処置した患者の再灌流するまでの時間を短縮し、再閉塞する までの時間を延長させる方法であって、請求項１５から１７のいずれか１つに記 載の組成物を該患者に投与する工程を包含し、該組成物は該患者に、該患者を該 血栓溶解剤で処置する約５時間前から約５時間後にわたる期間、投与される、方 法。
31. ３１．請求項３０に記載の方法であって、前記組成物が前記患者に、前記患者を 前記血栓溶解剤で処置する約２時間前から約２時間後にわたる期間、投与される 、方法。
32. ３２．患者の転移性腫瘍の成長を阻害する方法であって、該患者を、薬学的に許 容し得る様式で、請求項１５から１７のいずれか１つに記載の組成物で処置する 工程を包含する、方法。
33. ３３．前記腫瘍が、脳の癌、肺の癌、肝臓の癌、骨癌および新生細胞癌からなる 群から選択される、請求項３２に記載の方法。
34. ３４．患者のトロンビンに誘起された炎症を治療あるいは予防する方法であって 、該患者に、請求項１５から１７のいずれか１つに記載の組成物を投与する工程 を包含する、方法。
35. ３５．請求項３４に記載の方法であって、前記炎症が、成人呼吸困難症候群、敗 血症性ショック、敗血症および再灌流による損傷からなる群から選択される疾患 によって引き起こされる、方法。
36. ３６．患者の神経変性性疾患を治療する方法であって、請求項１５から１７のい ずれか１つに記載の組成物を該患者に投与する工程を包含する、方法。
37. ３７．患者あるいは体外血液の、トロンビンが媒介する、あるいはトロンビンに 付随する、機能あるいは経路を阻害する方法であって、該患者あるいは該体外血 液を、請求項１５から１７のいずれか１つに記載の組成物で処置する、方法。
38. ３８．クロットに結合しているトロンビンによって起こる、患者の血栓の付着成 長を阻害する方法であって、該患者を、請求項１５から１７のいずれか１つに記 載の組成物で処置する工程を包含する、方法。
39. ３９．患者の血小板依存性血栓症を阻害する方法であって、該患者を、請求項１ ５から１７のいずれか１つに記載の組成物で処置する工程を包含する、方法。
40. ４０．該患者を、請求項１５から１７のいずれか１つに記載の組成物で処置する 工程を包含する、患者の播種性血管内凝固を治療あるいは予防する方法。
41. ４１．前記患者がヒトである、請求項１８、２２あるいは２４のいずれか１つに 記載の方法。
42. ４２．前記患者がヒトである、請求項２９から４０のいずれか１つに記載の方法 。