NO310294B1

NO310294B1 - Nye inhibitorer for trombin

Info

Publication number: NO310294B1
Application number: NO19920616A
Authority: NO
Inventors: John M Maraganore; Ii John W Fenton; Toni Kline
Original assignee: Biogen Inc; Health Research Inc
Priority date: 1989-08-18
Filing date: 1992-02-17
Publication date: 2001-06-18
Also published as: EP0489070B1; ATE137246T1; KR920702372A; JPH04507253A; NO920616D0; NL300162I2; ES2086411T3; SG79180A1; DE122004000042I1; AU6284190A; DE69026715D1; KR100199534B1; LU91119I2; NL300162I1; JPH0768141B2; FI102183B1; CA2065150C; NO2004008I2; WO1991002750A1; HUT60285A

Description

Denne oppfinnelse vedrører en analog i fremgangsmåte ved fremstilling av nye biologisk aktive molekyler, som bindes til og hemmer trombin hvilke molekyler har strukket som angitt i krav l's ingress. Spesielt er disse molekyler særpreget ved en trombin-anion-bindende utad-rettet seteassosierende enhet (ABEAM); en bindingsdel på minst 18Å i lengde; og en trombin-katalytisk setterettet enhet (CSDM). Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er særpreget ved de trekk som går frem av krav l's karakteriserende del.

Bakgrunnsteknikk

Akutte vaskulære sykdommer, såsom myokardialt infarkt, slag, pulmonær embolisme, dyptliggende trombose, perifer arteriell okklusjon og andre blodsystem-tromboser utgjør en meget stor helserisiko. Slike sykdommer forårsakes enten ved partiell eller total okklusjon av et blodkar ved et blod- koagulat som inneholder fibrin og blodplater.

Nåværende metoder for behandling og forebygging av trombotiske sykdommer innebærer terapeutika som virker på en av to forskjellige måter. Den første type av terapeutika hemmer trombinaktiviteten eller trombindannelsen og for-hindrer således koagulatdannelse. Disse medikamenter hemmer også blodplateaktivering og -aggregasjon. Den andre katego-ri av terapeutika påskynder trombolysen og oppløser blod-koagulatet, og fjerner det derved fra blodkaret og avblok-kerer blodstrømmen [J.P. Cazenave et al., Agents Action, 15, Su<p>pl., s. 24-49 (1984)].

Heparin, en forbindelse av førstnevnte klasse, er blitt anvendt i stor utstrekning for å behandle tilfeller som venøs trombo-embolisme, hvor trombinaktiviteten er ansvar-lig for utviklingen eller utbredelsen av en trombe. Skjønt heparin er effektiv, frembringer det mange uønskede bivirkninger som omfatter blødning og trombocytopeni. Dette har ført til at det søkes etter et mer spesifikt og mindre

toksisk antikoagulerende middel.

Hirudin er et naturlig forekommende polypeptid som produseres av blodiglen Hirudo medicinalis. Denne forbindelse, som syntetiseres i spyttkjertlene hos iglen, er den kraf-tigste naturlige koagulasjonshemmer man kjenner. Hirudin hindrer blodet i å koagulere ved å binde seg tett til trombin (Kd = 2 x 10~1:LM) i et 1:1 støkiometrisk kompleks [S.R. Stone og J. Hofsteenge, "Kinetics of the Inhibition of Thrombin by Hirudin", Biochemistry, 25, s. 4622-28

(1986)].

Dette hemmer i sin tur trombinet i å katalysere omdannelsen av fibrinogen til fibrin (koagulat), samt hemmer alle andre trobinmedierte prosesser [J.W. Fenton, II, "Reguation of Thrombin Generation and Functions", Semin. Thromb. Hemost.. 14, s. 234-40 (1988)].

Den egentlige binding mellom hirudin og trombin er en to-trinnsprosess. Først bindes hirudin til et "lav"-affini-tetssete på trombinmolekylet (Kd = 1 x 10"<8>M) som er adskilt fra det katalytiske sete. Denne binding innebærer struktur-medvirkning fra C-terminusen i hirudin med et "anion-bindende utadrettet sete" (ABE) i trombin [J.W. Fenton, II et al., "Thrombin Anion Binding Exosite Interactions with Heparin and Various Polyanions", Ann. New York Acad. Sei., 556, s. 158-65 (1989)]. Etter lavaffinitetsbindingen undergår hirudin-trombin-komplekset en konforma-sjonsfor-andring, og hirudin bindes deretter til "høy"-affinitets-setet i trombin [S. Kono et al., "Analysis of Secondary Structure of Hirudin and the Conformational Change Upon Interaction with Thrombin", Arch. Biochem. Biophys.. 267, s. 158-66 (1988)]. Dette sistnevnte sete tilsvarer det aktive sete i trombin.

Isoleringen, rensingen og den kjemiske sammensetning av hirudin er kjent i faget. [P. Walsmann og F. Markwardt, "Biochemical and Pharmacological Aspects of the Thrombin Inhibitor Hirudin", Pharmazie, 36, s. 653-60 (1981)]. I den senere tid er polypeptidets fullstendige aminosyresekvens blitt belyst [J. Dodt et al., "The Complete Covalent Structure of Hirudin: Localization of the Disulfide Bonds", Biol. Chem. Hoppe- Seyler, 366, s. 379-85 (1985); S.J.T. Mao et al., "Rapid Purification and Revised Amino Terminal Sequence of Hirudin: A Specific Thrombin Inhibitor of the Blood-Sucking Leech", Anal. Biochem, 161, s. 514-18 (1987); og R.P. Harvey et al., "Cloning and Expression of a cDNA Coding for the Anti-Coagulant Hirudin from the Bloodsucking Leech", Hirudo medicinalis", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 83, s. 1084-88 (1986) ] .

I det minste ti forskjellige isomorfe former av hirudin er blitt sekvensert, og det har vist seg at de har en noe forskjellig aminosyresekvens [D. Tripier, "Hirudin: A Family of Iso-Proteins. Isolation and Sequence Determi-nation of New Hirudins", Folia Haematol., 115, s. 3 0-35

(1988)] . Alle former av hirudin består av en enkel polypep-tidproteinkjede som inneholder 65 eller 66 aminosyrer, hvor aminoterminusen primært består av hydrofobe aminosyrer, og karboksyter-minusen består normalt av polare aminosyrer. Nærmere bestemt er alle former av hirudin karakterisert ved et N-terminalt domene (restene 1-39) stabilisert av tre disul-fidbroer i et 1-2-, 3-5- og 4-6- halvcystenylmønster og et kraftig surt C-terminalt segment (restene 40-65). Dessuten karakteriseres det C-terminale segment i hirudin ved nærvær av en tyrosinrest ved aminosyreposisjon 63, som er sulfatert.

I dyrestudier har hirudin, isolert fra igler, vist god effekt når det gjelder å forhindre venøs trombose, vaskulær

omløpsledning-okklusjon og trombinindusert disseminert intravaskulær koagulasjon. I tillegg har hirudin lav toksisitet, liten antigenisitet og en meget kort utskillel-

sestid fra blodomløpet [F. Markwardt et al., "Pharmacological Studies on the Antithrombotic Action of Hirudin in Experimental Animals", Thromb. Haemost., 47, s. 226-29

(1982)] .

I bestrebelser på å fremskaffe et større forråd av hirudin er det blitt forsøkt å produsere polypeptidet ved hjelp av rekombinante DNA-teknikker. Nærvær av en O-sulfatert tyrosinrest av naturlig hirudin og mikroorganismenes manglende evne til å utføre en lignende proteinmodifikasjon gjorde utsiktene til rekombinant produksjon av biologisk aktivt hirudin meget spekulative. Iakttagelsen av at desulfatohirudiner er nesten like aktive som sine sulfa-terte motparter (US patent 4.654.302) førte imidlertid til kloning og uttrykning av hirudin i E. coli [EP-søknader 158.564, 168.342 og 171.024] og gjær [EP-søknad 200.655]. Til tross for disse fremskritt, er hirudin fremdeles forholdsvis dyrt å produsere, og det er ikke kommersielt tilgjengelig i særlig stor utstrekning.

I den senere tid er det blitt gjort anstrengelser for å identifisere peptidfragmenter i naturlig hirudin, hvilke også er effektive når de gjelder å forlenge levringstiden. Et usulfatert C-terminalt fragment med 21 aminosyrer i hirudin, N-acetylhirudin45.65, hemmer koaguleringsdannelse in vitro. I tillegg har flere andre mindre, usulfaterte peptider som tilsvarer de C-terminale 11 eller 12 aminosyrer i hirudin (restene 55-65 og 54-65) også vist god virkning når det gjelder å hemme koagulatdannelse in vitro [J. Krstenansky et al., "Antithrombin Properties of C-terminus of Hirudin Using Synthetic Unsulfated N-acetyl-hiru-din45.65", FEBS Lett, 211, s. 10-16 (1987)]. Slike peptidfragmenter har imidlertid ikke vært helt tilfreds-stillende når det gjelder å oppløse blodkoagulater i pågående terapeutiske kurer på grunn av lav aktivitet. For eksempel har N-acetyl-hirudin45.65 en spesifik aktivitet som er fire størrelsesordener lavere enn naturlig hirudin.

I tillegg til å katalysere dannelsen av et fibrinkoagulat har trombin flere andre bioregulerende roller [J. W. Fenton, II, "Thrombin Bioregulatory Functins", Adv. Clin. Enzvmol., 6, s. 186-93 (1988)]. F.eks. aktiverer trombin direkte blodplateaggregasjons- og frigjørelsesreaksjoner. Dette betyr at trombin spiller en sentral rolle i akutt blodplateavhengig trombose [S.R. Hanson og L.A. Harker, "Interruption of Acute Platelet-Dependant Thrombosis by the Synthetic Ant i thrombin D-Phenylalanyl-L-Prolyl-L-Arginylch-loromethylketone", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 85, s. 184-88 (1988)]. Trombin kan også aktivere en inflammatorisk respons direkte ved å stimulere syntesen av den blodplate-aktiverende faktor (PAF) i endotele celler [S. Prescott et al., "Human Endothelial Cells in Culture Produce Platelet-Activating Factor (l-alkyl-2-acetyl-sn-qlycero-3-phospho-choline) When Stimulated With Thrombin", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81, s. 3534-38 (1984)]. PAF eksponeres på overflaten av endotele celler og tjener som ligand for neutro-fil adhesjon og påfølgende degranulasjon [G.M. Vercolletti et al., "Platelet-Activating Factor Primes Neutrophil-Mediated Endothelial Damage", Blood, 71, s. 1100-07 (1988)-] . Alternativt kan trombin fremme inflammasjon ved å øke den vaskulære perme- abilitet som kan føre til ødem [P.J. Del Vecchio et al., "Endothelial Monolayer Permeability To Macromolecules", Fed. Proe., 46, s. 1511-15 (1987)] . Reagen-ser som blokkerer det aktive sete i trombin, såsom hirudin, avbryter aktiveringen av blodplater og endotele celler [CL. Knupp, "Effeet of Thrombin Inhibitors in Thrombin-Induced Release and Aggregation", Thrombosis Res., 49, s. 23-36 (1988)].

Trombin har også vært innblandet i å fremme kreft, basert på evnen hos dets naturlige spaltningsprodukt, fibrin, til å tjene som substrat for tumorvekst [A. Falanga et al., "Isolation and Characterization of Cancer Procoagulant": A Cysteine Proteinase from Malignant Tissue", Biochemistry, 24, s. 5558-67 (1985); S.G. Gordon et al., "Cysteine Proteinase Procoagulant From Amnion-Chlorion", Blood, 66, s. 1261-65 (1985)]; og A. Falanga et al., "A New Procoagulant In Acute Leukemia", Blood, 71, s. 870-75 (1988)]. Og trombin har vært innblandet i neurodegenerative sykdommer på grunn av dets evne til å fremkalle neuritt retraksjon [D. Gurwitz et al., "Thrombin Modulates and Reverses Neuroblastorna Neurite Outgrowth", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 85, s. 3440-44 (1988)] . Derfor har evnen til å regule-re in vitro-aktiviteten av trombin mange viktige kliniske implikasjoner.

Til tross for utviklingen opptil i dag, finnes det fremdeles et behov for et molekyl som effektivt hemmer trombin-funksjonen i koagulatdannelsen, blodplateaktiveringen og forskjellige andre trombinmedierte prosesser, og som kan produseres billig og gi kommersielt overkommelige mengder.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse løser problemene som er angitt ovenfor ved å frembringe molekyler som etterligner hirudins virkning ved å binde seg til både det lavaffinitets-anion-bindende utadrettede sete (ABE) og det katalytiske sete for 6-trombin. Disse molekyler er mer potente enn hirudin, og derfor kan de administreres til pasienter i doser som er forholdsvis lavere enn de doser som er nødvendig i hirudin-baserte terapeutiske kurer. Molekylene fremstilt ifølge denne oppfinnelse kan anvendes i sammensetninger og metoder som hemmer enhver trombinfrembragt eller trombinassosiert funksjon eller prosess. Disse molekyler kan også anvendes i sammensetninger og metoder for ex vivo-bildedannelse, for lagring og behandling av utenomlegemlig blod og for å belegge invasivt utstyr. Og molekylene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan administreres til en pasient sammen med et fibrinolytisk middel for å øke aktiviteten av en gitt dose av det middel, eller for å senke dosen av midlet som kreves for en gitt virkning, såsom å oppløse et blodkoagulat.

På grunn av deres høye potens og de faktum at de kan fremstilles ved kjemisk synteseteknikk kan de aktuelle molekylene fremstilles billig i kommersielt overkommelige mengder. Fordi molekylene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse er betydelig mindre enn hirudin, er det videre mindre sannsynlig at de stimulerer en uønsket immunrespons i pasienter som behandles med dem. Følgelig er anvendelsen av disse trombinhemmere ikke begreset til behandling av akutt sykdom. Disse molekyler kan også anvendes i terapi for kroniske tromboemboliske sykdommer, såsom arterosklerose og restenose etter angioplasti. Molekylene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan også anvendes for en rekke andre formål i stedet for naturlig eller rekombinant hirudin.

Som man vil forstå fra den følgende beskrivelse, er molekylene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse nyttige ved behandling og forebygging av forskjellige sykdommer som er forbundet med uønskede virkninger av trombin, samt for diagnostiske formål.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 viser et autoradiogram av en SDS-polyakrylamidgel som viser bindingen av DNFB- [<35>S] -Sulfo-Tyr63<h>irudin54.64

til humant 6-trombin i nærvær eller fravær av Sulf o-Tyr63-N-acetyl-hirudin53.64 .

Figur 2 viser en tredimensjonal modell av humant 6-trombin. Figur 3, fremstilling A, viser virkningene av Hirulog-8 og Sulfo-Tyr63hirudin53.64 på spaltningen av Spectrozyme TH ved humant 6-trombin. Figur 3, fremstilling B, viser et Lineweaver-Burke-plot av spaltningen av Spectrozyme TH ved humant 6-trombin i nærvær eller fravær av enten Hirulog-8 eller Sulfo-Tyr63hirudin53_64-Figur 4 viser virkningen av forskjellige konsentrasjoner av Hirulog-8, hirudin eller Sulfo-Tyr63-N-acetyl-hirudin53_64 på den aktiverte partielle tromboplastin-tiden i normalt menneskelig serum. Figur 5, fremstilling A, viser tidsforløpet for spaltningen av forskjellige konsentrasjoner av Hirulog-8 ved humant trombin. Figur 5, fremstilling B, viser forholdet mellom Hirulog-8-konsentrasjonen og variheten av hemmingen av Spectrozyme TH-hydrolyse ved humant 6-trombin. Figur 6 viser virkningen av forbindelseslengden av trombinhemmerne fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse på hemmingen av den trombinkatalyserte hydrolyse av Spectrozyme

TH.

Figur 7 viser den hemmende virkning av forskjellige konsentrasjoner av Hirulog-8 eller Sulfo-Tyr63-N-acetyl-hirudin53.64 på modifikasjonen av trombin ved <14>C-DFP. Figur 8 viser in vivo-virkningen av varierende doser av Hirulog-8 på APTT i bavianer. Figur 9 viser de sammenlignende hemmende virkninger av Hirulog-8 eller heparin på hydrolysen av fibrinogen ved løselig eller koagulatbundet trombin. Figur 10 viser in vivo-virkningene av forskjellige doser av Hirulog-8 på blodplateavleiringen i et endarterektomisert segment av bavianaorta. Figur 11 viser in vivo-virkningene av varierende doser av hirulog-8 på blodplateavleiringen på et segment av et

kolla-genbelagt rør innsatt i en bavian.

Figur 12 viser de sammenlignende in vivo-virkninger av hepa-rin, hirudin og Hirulog-8 på blodplateavleiringen på et segment av et kollagenbelagt rør innsatt i en AV-omløps-ledning hos en bavian. Figur 13 viser in vivo-virkningene av varierende doser av Hirulog-8 på fibrinavleiringen på et segment av et kollagenbelagt rør innsatt i en AV-omløpsledning hos en bavian. Figur 14 viser forandringen i APTT over tid etter intra-venøse bolusinjeksjoner av bavianer med Hirulog-8. Figur 15 viser forandringer i APTT over tid etter subkutan injeksjon av bavianer med Hirulog-8. Figur 16 viser de sammenlignende in vivo-virkninger av plasminogen vevaktivator sammen med enten saltvann, hepa-rin, hirudin eller Hirulog-8 på reperfusjonstiden i en rottemodell. Figur 17 viser de sammenlignende in vivo-virkninger av plasminogen vevaktivator sammen med enten saltvann, hepa-rin, hirudin eller Hirulog-8 på reokklusjonstiden i en rottemodell. Figur 18 viser de sammenlignende in vivo-virkninger av plasminogen vevaktivator sammen med enten saltvann, hepa-rin, hirudin eller Hirulog-8 på APTT i en rottemodell.

Fogur 19 viser de sammenlignende in vivo-virkninger av plasminogen vevaktivator sammen med enten saltvann, hepa-rin, hirudin eller Hirulog-8 på blodkaråpenheten i en rottemodell.

Figur 20 viser virkningen av varierende doser av Hirulog-8 på blødningstiden i en bavianmodell.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Følgende vanlige forkortelser for aminosyrene er anvendt i beskrivelsen og i kravene:

Uttrykket "enhver aminosyre" som anvendes heri omfatter L-isomerene av naturlig forekommende aminosyrer, samt andre "ikke-protein"-6-aminosyrer som normalt anvendes i faget peptidkjemi når det fremstilles syntetiske analoger av naturlig forekommende aminopeptider. De naturlig forekommende aminosyrer er glysin, alanin, valin, leucin, isoleucin, serin, metionin, treonin, fenylalanin, tyro^in, tryptofan, cystein, prolin, histidin, apartinsyre, asparagin, glutamsyre, glutamin, b-karboksyglutaminsyre, arginin, ornitin og lysin." Eksempler på "ikke-protein"-6-aminosyrer er norleucin, norvalin, alloisoleucin, homoarginin, tiapro-lin, dehydroprolin, hydroksyprolin (Hyp), homoserin, cykloheksylglycin (Chg), 6-amino-n-butyrsyre (Aba), cykloheksylalanin (Cha), aminofenylbutyrsyre (Pba), fenyla-laniner substituert i orto-, meta- eller parastilling av fenyldelen med en eller to av de følgende; (C1-C4)-alkyl, (C^CJ -alkoksy, halogen- eller nitrogrupper eller substituert med en metylendioksygruppe; fi-2- og 3-tienylal-alanin, S-2- og 3-furanylalanin, S-2-, 3- og 4-pyridylalanin, E-(benzotienyl-2- og 3-yl)alanin, S-(1- og 2-naftyl)alanin, O-alkylerte derivater av serin, treonin eller tyrosin, S-alkylert cystein, S-alkylert homocystein, O-sulfat-, 0-fosfat- og O-carboksylatestere av tyrosin, 3- og 5-car-bonyl-tyrosin, 3- og 5-fosfonyltyrosin, 4-metylsulfonylty-rosin, 4-metylfosfonyltyrosin, 4-fenyleddiksyre, 3,5-dijodtyrosin, 3- og 5-nitrotyrosin, "-alkyl-lysin, delta-alkylornitin og D-isomerene av de naturlig forekommende aminosyrer.

Forbindelsene som her omtales som tyrosinsulfat, Tyr(OS03H) og O-sulfatester av tyrosin er identiske og har strukturformelen:

Forbindelsene omtalt her som tyrosinsulfonat, Tyr(S03H), 3-sulfonyltyrosin og 5-sulfonyltyrosin er identiske og har strukturformelen:

Uttrykket "pasient" anvendt i denne søknad henviser til ethvert pattedyr, spesielt mennesket.

Betegnelsen "anionisk aminosyre" som anvendes heri, betyr et meta-, para- eller orto-, mono- eller disubstituert fenyl- alanin, cykloheksylalanin eller tyrosin som inneholder en karboksyl-, fosforyl- eller sulfonyl-del, samt S-alkylert cystein, S-alkylert homocystein, b-karboksyglutaminsyre,

~-alkyl-lysin, delta-alkyl-ornitin, glutaminsyre og aspartinsyre. Eksempler på anioniske aminosyrer er fosfotreonin, fosfoserin, fosfotyrosin, 3-, 4- eller 5-sulfotyrosin, 3-metyl-fosfonyltyrosin og 3-metyl-sulfonyltyrosin.

Betegnelsene "katalytisk sete", "aktivt sete" og "aktiv setelomme" som er anvendt her, henviser til ethvert av eller alle følgende seter i trombin: Subtratbindingssetet eller " S^-setet; det hydrofobe bindingssete eller "olje"-setet; og setet hvor spaltningen av substratet faktisk utføres ("ladningsoverføringssetet").

Betegnelsen "N0™" som er anvendt her, henviser til sidekjedenitrogen i ornitin. Betegnelsen "N<9>" betyr ethvert sidekjedenitrogen i arginin. Betegnelsen "N<6>" henviser til 6-aminogruppen i en aminosyre. Og betegnelsen " psi" som anvendt i beskrivelsen og kravene, henviser til erstatnin-gen av en amidbinding med atomene angitt i parentes, i henhold til nomenklaturen som er beskrevet i J. Rudinger, i Drug Design, Vol. II, E.J. Ariens, red., Academic Press, New York, s. 319 (1971).

Betegnelsen "ryggradkjede" som er anvendt her, henviser til den del av en kjemisk struktur som utgjør det minste antall påhverandre følgende bindinger som kan spores fra en ende av den kjemiske struktur til den annen. De atomiske komponenter som utgjør en ryggradkjede, kan bestå av ethvert atom som er i stand til å danne bindinger med minst to andre atomer.

For eksempel særpreges hver av de følgende kjemiske strukturer ved en ryggradkjede på 7 atomer (atomene som utgjør ryggradkjeden, er angitt med fete typer):

Betegnelsen "beregnet lengde" som er anvendt i denne søknad, henviser til et forutsett mål som er fremkommet ved å summere bindingslengdene mellom atomene som utgjør ryggradkjeden. Bindingslengder mellom to gitte atomer er velkjent i faget [se f.eks. CRC Handbook of Chemistry and Physics, 65th Edition, R.C. Weist, red., CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, s. F-166-70 (1984)].

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstilling av molekyler som bindes til og hemmer trombin. Disse molekyler karakteriseres ved tre domener: en katalytisk seterettet del ("CSDM"), et sammen-koblingsområde og en anionbindende utadrettet seteassosierende del ("ABEAM").

Det første domene, CSDM, bindes til det katalytiske sete i trombin, hvilket er lokalisert ved eller nær ca. Ser-195 og hemmer eller for- sinker den amidolytiske eller esteroly-tiske aktivitet av trombin. Fortrinnsvis velges CSDM'ene fra en av tre generelle grupper: De som bindes reversibelt til trombin og langsomt spaltes, de som bindes reversibelt til trombin og ikke kan spaltes, og de som bindes irreversibelt til trombin. Reversible inhibitorer bindes til det aktive sete i trombin ved ikke-kovalente vekselvirkninger, såsom ioniske bindinger, hydrofobe veksel-virkninger eller hydrogenbinding. Irreversible CSDM'er danner kovalente bindinger med trombin.

I henhold til en foretrukket utførelsesform har det CSDM som fremstilling og som bindes reversibelt til trombin og sakte spaltes, formelen:

X-Ai-Aa-Aj-Y,

hvor X er hydrogen eller en ryggradkjede som består av 1 - 35 atomer, A1 er Arg, Lys eller Orn, A2 er en ikke-amidisk binding, A3 er en ryggradkjede som består av fra 1-9 atomer, og Y er en binding.

Den ikke-amidiske bindingskomponent i henhold til denne utførelsesform kan dannes ved å kjemisk modifisere en amidbinding. Dette kan oppnås ved fremgangsmåter som er velkjent i faget. [M. Szelke et al., "Potent New Inhibitors of Human Renin", Nature, 299, s. 555-57 (1982); D.H. Coy et al., "Facile Solid Phase Preparation of Proteins Containing the CH2-NH Peptide Bond Isostere and Application to the Synthesis of Somatostatin (SRIF) Octapeptid Analogues", Peptides 1986, D. Theodoropoulos, red. Walter DeGruyter & Co., Berlin, s. 143-46 (1978)] . Når en ikke-amidisk binding dannes på denne måte, er det fortrukket at den kjemiske modifikasjon utføres før tilsetningen av dipeptidet som inneholder denne binding til de andre komponenter i CSDM eller til resten av trombinhemmermolekylet. På denne måte tilsettes dipeptid Al-A2-A3 på en gang, i ett eneste syntesetrinn, til resten av molekylet.

I henhold til en mer foretrukket utf ørelsesf orm er A1 Arg og A3 er Pro, D-Pro eller Sar. I denne utførelsesform er A2 en naturlig forekommende imidbinding som sakte spaltes av trombin. Med dette unngås at man må danne den ikke-amidiske binding på forhånd og gjør at Ax og A3 kan tilsettes til resten av molkylet sekvensielt og ikke på en gang.

Som angitt ovenfor, kan CSDMer fremstilt i henhold til denne oppfinnelse bindes irreversibelt til trombin. Eksempler på irreversible CSDMer omfatter, men er ikke begrenset til, generelle serinproteinase-hemmere, såsom fenylmetyl-sulfonylfluorid (PMSF), diisopropylfluorfosfat (DFP), tosylprolylklormetyl-keton (TPCK) og tosyllysylklormetyl-keton (TLCK); heterocykliske proteasehemmere, såsom D-Phe-Pro-Arg-CHCl2 (PPACK); og overgangsanaloger, såsom difluor-ketometylen.

I henhold^til en annen foretrukket utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse, fremstilles ikke-spaltbare, reversible CSDMer formelen

X-C1-C2-A3-Y,

hvori Cx er et derivat av Arg, Lys eller Orn, omfattende en karboksylatdel som er redusert eller forskøvet fra a-

karbonet med en ryggradkjede på fra 1 til 10 atomer; C2 er en ikke-spaltbar binding; og X, Y, og A2 er som tidligere definert. Eksempler på Cx-komponenter er S-homoarginin; arginin som inneholder en redusert karboksylatdel, såsom Arg [p_siCH2NH] ; fi-homolysin og S-homoornitin.

Andre ikke-spaltbare, reversible CSDMer som kan anvendes i trombinhemmerne fremstilt ifølge denne oppfinnelse, er benzamidin, DAPA, NAPAP og argatroban (argipidin).

For de trombinhemmere som har CSDM-regioner karakterisert ved en A2- eller C2-binding, betyr uttrykket "P-l-Pj/ "-sekvens som anvendes heri, de to kjemiske strukturer forbundet ved nevnte binding.

X-komponenten i CSDM, som ikke deltar ved faktisk å binde seg til det katalytiske sete, kan være av ubegrenset lengde og varierende sammensetning. Men for praktiske formål og reduserte kostnader av syntesen karakteriseres X fortrinnsvis ved en ryggradkjede som består av fra 1 til 35 atomer og som ikke overskrider en beregnet lengde på 3 6 Å. Det er foretrukket at X er et peptid, mest foretrukket D-Phe-Pro. Denne mest fortrukne utførelsesform gjør at X-komponenten passer inn i en fordypning i trombin som ligger i nærheten av det aktive sete. [S.Bajusz et al., "Inhibition of Thrombin and Trypsin by Tripeptide Aldehydes", Int. J. Peptide Protein Res., 12, s. 217-21 (1978)]; C. Kettner et al., "D-Phe-Prp-Arg-CH2C1 - A Selective Affinity Label for Thrombin", Thromb. Res., 14, s. 969-73 (1979)]. Dette gjør at CSDM-komponenten og derfor molekylene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan bindes til trombin med en fordelaktig høy grad av affinitet og optimal spesifisitet.

Den andre komponent i trombinhemmerne fremstilt ifølge denne oppfinnelse er et sammenkoblingsområde. Fordi rollen til denne del av mole- kylet er å frembringe en bro mellom CSDM og ABEAM, er det sammenkoblerens lengde, og ikke dens struktur, som er av primær viktighet. Den beregnede lengde på ryggradkjeden som karakteriserer sammenkobleren, må være minst ca. 18 Å - avstanden mellom det katalytiske sete og det anionbindende utadrettede sete i trombin - og mindre enn ca. 42 Å.

Ryggradkjeden i sammenkobleren kan bestå av ethvert atom som er i stand til å bindes til minst to andre atomer. Fortrinnsvis består ryggradkjeden av enhver kjemisk mulig kombinasjon av atomer valgt fra oksygen, karbon, nitrogen og svovel. En fagman er klar over at kobinasjon av de ovennevnte ryggradkjedeatomer faller innenfor den nødvendige lengde, basert på kjente avstander mellom forskjellige bindinger [se f.eks. R.T. Morrison og R.N. Boyd, Organic Chemistry, 3rd Edition, Allyn and Bacon, Inc., Boston, Massachusetts (1977)]. I henhold til en foretrukket ut-førel-sesform er sammenkobleren et peptid som består av aminosyresekvensen Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe. Fortrinnsvis er aminosyren som er bundet til ABEAM-komponenten Phe.

Det tredje domene i trombinhemmerne fremstilt ifølge denne oppfinnelse er det ABEAM som bindes til det anionbindende utadrettede sete i trombin. Fortrinnsvis har ABEAM formelen

W-B1~B2 — B3—B^ — Bg — Bg — B-j—Bq — Z ;

hvor W er en binding; B1 er en anionisk aminosyre; B2 er en hvilken som helst aminosyre; B3 er Ile, Val, Leu, Nie eller Phe; B4 er Pro, Hyp, 3,4-dehydroPro, tiazolidin-4-karboksylat, Sar, enhver N-metylaminosyre eller D-Ala; B5 er en anionisk aminosyre; B6 er en anionisk aminosyre; B7 er en lipofil aminosyre valgt fra gruppen som består av Tyr, Trp, Phe, Leu, Nie, Ile, Val, Cha, Pro, eller et dipeptid som består av en av disse lipofile aminosyrer og en hvilken som helst aminosyre; B8 er en binding eller et peptid som består av 1 til 5 rester av en hvilken som helst aminosyre; og Z er en karboksyterminell rest valgt fra OH, Cj^-Cg-alkoksy, amino, mono- eller di- (C1-C4)-alkylsubstituert amino eller benzylamino.

Peptider som er homologe med den karboksyterminale del i hirudin, har vist seg å bindes til det anioniske utadrettede bindingssete på trombin [samtidig svevende US patent-søknad

314.756 og J. M. Maraganore et al., "Anticoagulant Activity of Synthetic Hirudin Peptides", J. Biol. Chem., 264, s. 8692-98 (1989)] .

I henhold til en foretrukket utførelsesform er ABEAM homolog med aminosyrene 56-64 i hirudin, dvs. Bx er Glu, B2 er Glu, B3 er Ile, B4 er Pro, B5 er Glu, B6 er Glu, B7 er Tyr-Leu, Tyr (S03H)-Leu eller Tyr (OS03H)-Leu, eller (3-,5-dijodTyr) -Leu, B8 er en binding, og Z er OH. Man må merke seg at naturlig hirudin inneholder Tyr(OS03H) ved posisjon 63. Men karboksyterminaler som inneholder Tyr(S03H) har nøyaktig samme antikoagulerende aktivitet som peptider som inneholder det naturlige Tyr(OS03H) [se samtidig svevende US patentsøknad 314.756].

Andre ABEAM-komponenter kan omfatte de deler av ethvert molekyl som bindes til det anioniske bindingssete i trombin. Disse omfatter amino- syrene 1675-1686 i Faktor V, aminosyrene 272-285 av blodplateglycoproten Ib, aminosyrene 415-428 av trombomodulin, aminosyrene 245-259 av protrombin Fragment 2 og aminosyrene 3 0-44 av fibrinogen Aa-kjeden. I tillegg kan ABEAM-komponenten velges fra enhver av de hirudinpeptidanaloger som er beskrevet av J.L. Krstenansky et al., "Development of MDL-28,050, A Small Stable Antithrombin Agent Based On A Functional Domain of the Leech Protein, Hirudin", Thromb. Haemostas., 63, s. 208-14

(1990) .

De foretrukne trombinhemmere fremstilt ifølge denne oppfinnelse har benevnelsen hiruloger, og de er beskrevet i de etterfølgende eksempler. De mest foretrukne hiruloger er Hirulog-8, Hirulog-12, Hirulog 18a, Hirulog 18b og Hirulog-33. Hirulog-8, -12 og -33 er reversible trombinhemmere som spaltes langsomt. Hirulog-18a og -18b er reversible hemmere som ikke spaltes.

Trombinhemmerne fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan syntetiseres ved hjelp av forskjellige teknikker som er velkjente i faget. Disse omfatter enzymatisk spaltning av naturlig eller rekombinant hirudin, rekombinante DNA-t.eknikker, fastfase-peptidsyntese, væskefase-peptidsyntese, organisk-kjemiske synteseteknikker eller en kombinasjon av disse teknikker. Valget av synteseteknikk vil natuligvis avhenge av sammensetningen av den spesielle hemmer. I en foretrukket utførelsesform ifølge denne oppfinnelse er trombinhemmeren helt peptidisk og syntetiseres ved fast-f ase-peptidsynteset eknikker,væskef ase-peptidsynteseteknikker eller en kombinasjon derav som utgjør den mest kost-nads-gunstige fremgangsmåte for å produsere kommersielle kvanti-teter av disse molekyler.

Når "ikke-protein"-aminosyrer forekommer i trobinhemmer-molekylet, kan de enten tilsettes direkte til den voksende kjede under peptidsyntesen eller fremstilles ved kjemisk modifikasjon av det fullstendig syntetiserte peptid, avhengig av den ønskede "ikke-protein"-aminosyres natur. De som er fagfolk på området kjemisk syntese, vil være klar over hvilke "ikke-protein"-aminosyrer som kan tilsettes direkte, og hvilke som må syntetiseres ved å kjemisk modifisere den komplette peptidkjede etter peptidsyntesen.

Syntesen av disse trombinhemmere ifølge oppfinnelsen, som inneholder både ikke-aminosyrer og peptidiske deler, erholdes med fordel ved en blandet heterolog/fastfase-teknikk. Denne teknikk innebærer fastfasesyntese av hele eller det meste av peptiddelen i molekylet, etterfulgt av tilsetning av de ikke-aminosyreholdige komponenter som syntetiseres ved væskefaseteknikker. Ikke-aminosyren kan kobles til den peptidiske del via fastfase- eller væske-fasemetoder. På lignende måte kan enhver gjenværende peptidisk del også tilsettes via fastfase- eller væske-fasemetoder.

Molekylene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse utøver kraftig antikoagulerende virksomhet. Denne virksomhet kan måles in vitro ved hjelp av enhver konvensjonell teknikk. Fortrinnsvis innebærer en bestemmelse av den antikoagulerende virksomhet direkte bestemmelse av den trombinhem-mende aktivitet av molekylet. Slike teknikker måler hemmingen av trombinkatalysert spaltning av kolorimetriske substrater eller, mer foretrukket, økningen i trombintidene eller økningen i de aktiverte partielle tromboplastintider i humant plasma. Sistnevnte undersøkelse måler faktorer i det "indre" koagulasjonsforløp. Alternativt kan det anvende assay bruke renset trombin og fibrinogen for å måle hemmingen av frigjørelsen av fibrinopeptidene A og B ved radioim-munoassay eller ELISA.

Antiblodplateaktiviteten hos molekylene fremstilt ifølge denne oppfinnelse kan også måles ved hjelp av en hvilken som helst av et antall konvensjonelle blodplateassays. Fortrinnsvis vil man i undersøkelsen måle forandringen i graden av aggregasjon av blodplater eller forandringen i frigjørelsen av en utskillelseskomponent fra blodplatene i nærvær av trombin. Førstnevnte kan måles i et aggregometer. Sistnevnte kan måles ved hjelp av RIA- eller ELISA-teknikker som er spesifikke for den utskilte komponent.

Molekylene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse er nyttige i sammensetninger, kombinasjoner og fremgangsmåter for behandling og profylakse av forskjellige sykdommer som tilskrives trombin-medierte og trombin-assosierte funksjoner og pro- sesser. Disse omfatter myokardialt infarkt, slag, pulmonær embolisme, dypåretrombose, perifer arteriell okklusjon, restenose etter arteriell skade eller kardio-logiske inngrepsprosedyrer, akutt eller kronisk arterosklerose, ødem og inflammasjon, forskjellige celleregulerende prosesser (f.eks. sekresjon, formforandringer, prolifera-sjon), kreft og metastase, og nevrogenerative sykdommer.

Trombinhemmerne fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan formuleres ved hjelp av konvensjonelle metoder for å danne farmasøytisk nyttige sammensetninger, såsom tilsetning av et farmasøytisk akseptabelt bærerstoff. Disse smmensetninger og fremgangsmåter ved bruk av dem kan anvendes for å behandle eller forebygge trombotiske sykdommer i en pasient.

Trombinhemmerne som fremstilles ifølge oppfinnelsen, kan anvendes i kombinasjoner, sammensetninger og metoder for å behandle trombotiske sykdommer og for å minske doseringen av et trombolytisk middel som er nødvendig for å opprette reperfusjon eller forhindre reokklusjon i en pasient. I tillegg kan trombinhemmerne fremstilt ifølge denne oppfinnelse anvendes i kombinasjoner, sammensetninger og metoder for å minske reperfusjonstiden eller øke reokklusjonstiden i en pasient som behandles med et trombolytisk middel. Disse kombinasjoner og sammensetninger omfatter en farma-søytisk effektiv mengde av en trombinhemmer fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse og en farmasøytisk effektiv mengde av et trombolytisk middel.

I disse kombinasjoner og sammensetninger virker trombinhemmeren og det trombolytiske middel på en komplementerende måte for å oppløse blodkoagulater, hvilket resulterer i minskede reperfusjonstider og økede reokklusjonstider i pasientene som behandles med dem. Det trombolytiske middel oppløser spesifikt koagulatet, mens trombinhemmeren forhin-drer nyeksponert, koagulat-omsluttet eller koagulat-bundet trombin i å regenerere koagulatet. Anvendelse av trombinhemmer i kombinasjoner og sammensetninger gjør at man på fordelaktig måte kan administrere et trombolytisk reagens i mengder som tidligere ble ansett for å være for lave for å gi trombolytiske virkninger hvis det ble gitt alene. Slik unngås noen av de uønskede bivirkninger som er forbundet med anvendelse av trombolytiske midler, såsom blødnings-komplikasjoner.

Trombolytiske midler som kan anvendes i kombinasjonene og sammensetningene, er slike som er kjent i faget. Slike midler omfatter, men er ikke begrenset til, vevplasminogen-aktivator renset fra naturlige kilder, rekombinant vevplas-minogen-aktivator, streptokinase, urokinase, prourokinase, anisolert streptokinase plasminogenaktivator-kompleks (ASPAC), plasminogenaktivatorer fra spyttkjertler i dyr og kjente, biologisk aktive derivater av alle ovennevnte.

Uttrykket "kombinasjon" som er brukt her, omfatter en enkelt doseringsform som inneholder minst en trombinhemmer fremstilt ifølge denne oppfinnnelse og minst ett trombolytisk middel; en multippeldoseringsform, hvor trombinhemmeren og det trombolytiske middel administreres separat, men samtidig; eller en multippel doseringsform hvor de to komponenter administreres separat, men sekvensielt. Ved sekvensiell administrering kan trombinhemmeren gis til pasienten i løpet av en tidsperiode som varierer fra ca. 5 timer før til ca. 5 timer etter administreringen av det trombolytiske middel. Fortrinnsvis administreres trombinhemmeren til pasienten i løpet av en periode på fra 2 timer før til 2 timer etter administrasjon av det trombolytiske middel.

Alternativt kan trombinhemmeren og det trombolytiske middel være i form av et enkelt, konjugert molekyl. Konjugasjon av de to komponenter kan oppnås ved standard tverrbindingstek-nikker som er velkjent i faget. Enkeltmolekylet kan også ha form av et rekombinant fusjonsprotein, hvis både trombinhemmeren og det trombolytiske middel er peptidiske.

Forskjellige doseringsformer kan anvendes for å administrere sammensetningene og kombinasjonene nevnt ovenfor. Disse omfatter, men er ikke begrenset til, parenteral administrasjon, oral administrasjon og topisk anvendelse. Sammensetningene og kombinasjonene kan administreres til pasienten i enhver farmasøytisk akseptabel doseringsform, inklusive former som kan administreres til en pasient intrave-nøst som bolus eller som kontinuert infusjon, intramus-kulært - inklusive paravertebralt og periartikulært subkutant, intrakutant, intraartikulært, intrasynovialt, intratekalt, intralesjonalt, periostalt eller på oral, nasal eller topisk vei. Slike sammensetninger og kombinasjoner tilpasses fortrinnsvis for topisk, nasal, oral og parenteral administrasjon, men fortrinnsvis formuleres de for parentereal administrasjon.

Parenterale sammensetninger administreres mest foretrukket intravenøst, enten i bolusform eller som konstant infusjon. Hvis trombinhemmeren anvendes som antiblodplateforbindelse, foretrekkes konstant infusjon. Hvis trombinhemmeren anvendes som et antikoagulerende middel, foretrekkes en subkutan eller intravenøs bolusinjeksjon. For parenteral administrasjon fremstilles flytende enhetsdoseformer, som inneholder en trombinhemmer fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse og et sterilt bærermateriale. Trombinhemmeren kan enten suspenderes eller oppløses, avhengig av bærerstoffets natur og den spesielle trombinhemmers natur. Parenterale sammensetninger fremstilles vanligvis ved å oppløse trombinhemmeren i et bærerstoff, eventuelt sammen med andre stoffer, og filtersterilisere før man fyller på egnede flasker eller ampuller og forsegler. Fortrinnsvis oppløses hjelpestoffer, såsom lokal-anestetika, konserveringsmidler og buffermidler også i bærerstoffet. Sammensetningene kan deretter fryses og frysetørkes for å forbedre stabiliteten.

Parenterale suspensjoner fremstilles på hovedsakelig samme måte, unntatt at den aktive komponent suspenderes heller enn oppløses i bærerstoffet. Sterilisering av sammensetningene oppnås fortrinnsvis ved å utsette dem for etylenoksyd før de suspenderes i det sterile bærerstoff. Med fordel tilsettes et overflatemiddel eller fuktemiddel til sammensetningen for å underlette ensartet fordeling av dens bestanddeler.

Tabletter og kapsler for oral administrasjon kan inneholde konvensjonelle hjelpestoffer, såsom bindemidler, fyllstoffer, fortynningsmidler, tabletteringsmidler, smøremidler, oppløsningsmidler og fuktemidler. Tabletten kan belegges i henhold til kjente metoder i faget. Egnede fyllstoffer som kan anvendes, omfatter cellulose, mannitol, laktose og andre lignende midler. Egnede disintegranter omfatter, men er ikke begrenset til, stivelse, polyvinylpyrrolidon og stivelses-derivater, såsom natriumstivelsesglykolat. Egnede smøremidler omfatter f.eks. magnesiumstearat. Egnede fuktemidler omfatter natriumlaurylsulfat.

Orale flytende preparater kan være i form av vandige eller oljeaktige suspensjoner, oppløsninger, emulsjoner, siruper eller eliksirer, eller kan presenteres som et tørt produkt for oppløsning med vann eller et annet egnet bærerstoff før bruk. Slike flytende preparater kan inneholder konvensjonelle tilsetningsstoffer. Disse omfatter suspensjonsmidler, såsom sorbitol, sirup, metylcellulose, gelatin, hydroksy-etylcellulose, karboksymetylcelllose, aluminiumstearatgel eller hydrogenerte spisefetter, emulgeringsmidler som omfatter lecitin, sorbitanmonooleat, polyetylenglykoler eller akasie, ikke-vandige bærerstoffer, såsom mandelolje, fraksjonert kokosnøttolje og oljelignende estere, og konserveringsmidler, såsom metyl- eller propyl-p-hydroksy-bensoat eller sorbinsyre.

Sammensetninger formulert for topisk administrasjon kan f.eks. være i form av vandig gelé, ojleaktig suspensjon eller emulgert salve.

Doseringen og dosehastigheten for trombinhemmeren vil avhenge av flere faktorer, såsom pasientens størrelse, den spesifikke farmasøytiske sammensetning som anvendes, formålet med behandlingen, dvs. terapi eller forebygging, naturen av den trombotiske sykdom som skal behandles, og den behandlende leges bedømmelse.

En foretrukken farmasøytisk effektiv daglig dose av trombinhemmeren fremstilt ifølge denne oppfinnelse er mellom ca. 1 //g/kg kroppsvekt hos pasi- enten som skal behandles og ca. 5 mg/kg kroppsvekt. I kombinasjoner som inneholder et trombolytisk middel er en farmasøytisk effektiv daglig dose av det trombolytiske middel mellom ca. 10% og 80% av det konvensjonelle doseringsområde. Det "konvensjonelle doseringsområde" av et trombolytisk middel er den daglige dosering som anvendes når dette middel brukes i monoterapi.

[ Physician' s Desk Reference 1989, 43. Utgave, Edward R. Barnhart, utgiver]. Dette konvensjonelle doseringsområde vil naturligvis variere, avhengig av det trombolytiske middel som anvendes. Eksempler på konvensjonelle doserings-områder er som følger: urokinase - 500.000 til 6.250.000 enheter/pasient, streptokinase - 140.000 til 2.500.000 enheter/pasient, tPA - 0,5 til 5,0 mg/kg kroppsvekt, ASPAC

- 0,1 til 10 enheter/kg kroppsvekt.

Mest foretrukket omfatter de terapeutiske og profylaktiske sammensetninger en dosering på mellom ca. 10 /xg/kg kroppsvekt og ca. 500 /xg/kg kroppsvekt av trombinhemmeren. Mest foretrukne kombinasjoner omfatter den samme mengde trombinhemmer og mellom ca. 10% og 79% av det konvensjonelle doseringsområde av et trombolytisk middel. Det bør også være underforstått at en daglig farmasøytisk effektiv dose av enten trombinhemmerne eller det trombolytiske middel som er tilstede i kombinasjonene ifølge oppfinnelsen, kan være mindre eller større enn de spesifikke områder som er nevnt ovenfor.

Når det har inntrått en forbedring i pasientens tilstand, administreres en opprettholdende dose av en kombinasjon eller sammensetning som nevnt ovenfor, hvis nødvendig. Deretter kan doseringen eller frekvensen for administras-jonen, eller begge deler, som funksjon av symptomene, reduseres til et nivå hvor den forbedrede tilstand opprett-holdes. Når symptomene er blitt lindret til det ønskede nivå, bør behandlingen opphøre. Pasientene kan imidlertid trenge intermitterene behandling dersom sykdomssymptomene dukker opp på nytt.

I henhold til en alternativ utførelsesform kan trombinhemmerne anvendes i sammensetninger og metoder for å belegge overflaten på invasivt utstyr, hvilket resulterer i en lavere risiko for koagulatdannelse eller blodplateaktivering i pasienter som mottar slikt utstyr. Overflater som kan belegges med sammensetningene, omfatter f.eks. prote-ser, kunstige ventiler, vaskulære podninger, stenter og katetere. Metoder og sammensetninger for å belegge dette utstyr er kjent av fagfolk. Disse omfatter kjemisk tverr-bindig eller fysikalsk adsorpsjon av de trombinhemmer-holdige sammensetninger til overflaten av utstyret.

I henhold til en ytterligere utførelsesform kan trombinhemmere anvendes for ex vivo-trombe i en pasient. I denne utførelsesform merkes trombinhemmeren med en radioisotop. Valget av radioisotop er basert på et antall velkjente faktorer, f.eks. toksisitet, biologisk halveringstid og påvisningsmulighet. Foretrukne radioisotoper omfatter, men er ikke begrenset til, <1>25T, 123I og <11>1In. Teknikker for å merke trombinhemmerne er velkjent i faget. Mest foretrukket er radioisotopen 123I, og merkingen oppnås ved hjelp av en <123>I-Bolton-Hunters reagens. Den merkede trombinhemmer administreres til en pasient og får bindes til trombinet som finnes i et koagulat. Koagulatet observeres deretter ved hjelp av velkjente påvisningsmidler, såsom et kamera som er istand til å påvise radioaktivitet koblet til et data-imaginasjonssystem. Denne teknikk gir også et bilde av

blodplate-bundet trombin og meizotrombin.

Virknignen av trombinhemmerne fremstilt ifølge oppfinnelsen for behandling av tumormetastaser blir bekreftet ved hemmingen av metastatisk vekt. Dette er basert på nærværet av et prokoagulerende enzym i visse kreftceller. Dette enzym aktiverer omdannelsen av faktor X til faktor Xa i koagula-sjonskaskaden, hvilket resulterer i fibrindeposisj-on, hvilket i sin tur tjener som substrat for tumorvekst. Ved å hemme fibrindeposisjonen ved hemming av trombin, tjener molekylene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse som effektive antimetastatiske tumormidler. Eksempler på metastatiske tumorer som kan behandles med trombinhemmerne fremstilt ifølge denne oppfinnelse omfatter, men er ikke begrenset til, karsinom i hjernen, karsinom i leveren, karsinom i lungene, osteo-karsinom og neoplastisk plasma-celle -karsinom.

De ovenfor beskrevne trombinhemmere kan også anvendes for å hemme trombinindusert endotelisk celleaktivering. Denne hemming omfatter undertrykking av syntesen av blodplate-aktiveringsfaktoren (PAF) ved endotele celler. Dette har viktig anvendelse ved behandling av sykdommer som er karakterisert ved trombinindusert inflammasjon og ødem, som man tror medieres av PAF. Slike sykdommer omfatter, men er ikke begrenset til, respiratorisk distress-syndrom hos voksne, septisk sjokk, septisemia og reperfusjonsskade.

Tidlige stadier av septisk sjokk omfatter diskrete, akutt inflammatoriske og koagulopatiske responser. Det er tidligere vist at injeksjon i bavianer med en dødelig dose av levende EL. coli fører til tydelig minskning av neutrofil-tall, blodtrykk og hematokrit. Forandringer i blodtrykket og hematokriten skyldes delvis at det dannes et disseminert intravaskulært koagulat (DIC) , og det har blitt vist at det har parallell konsumpsjon av fibrinogen [F. B. Taylor et al., "Protein C Prevents the Coagulopathic and Lethal Effeets of Escheveria coli infusion in the Baboon", J. Clin. Invest., 79, s. 918-25 (1987)]. Neutropeni skyldes den alvorlige inflammatoriske respons som forårsakes av septisk sjokk, hvilket resulterer i markert økning i nivåene for tumornekrosefaktoren. Trombinhemmerne fremstilt ifølge oppfinnelsen kan anvendes i sammensetninger og metoder for å behandle eller forebygge DIC i septikemi og andre sykdommer.

Mengden eller konsentrasjonen av trombinhemmer i sammensetninger til behandling av ekstrakorporlig blad er basert på volumet av blodet som skal behandles, eller mer foretrukket, dets trombininnhold. Fortrinnsvis er en effektiv mengde av en trombinhemmer fremstilt ifølge oppfnnelsen for å forhindre koagulering i ekstrakorporlig blod fra ca. l^g/60 ml ektrakorporlig blod til ca. 5 /xg/60 ml ekstrakorporlig blod.

Trombinhemmerne kan også anvendes til å hemme koagulat-bundet trombin, som man tror bidrar til koagulattilvekst. Dette er spesielt viktig, fordi vanlig brukte antitrombin-midler, såsom heparin og lavmolekylært heparin, er uvirk-somme mot koagulatbundet trombin.

Endelig kan trombinhemmerne fremstilt ifølge denne oppfinnelse anvendes i sammensetninger og metoder for behandling av nevrodegenerative sykdommer. Trombin er kjent for å forårsake nevritt retraksjon, en prosess som indikerer en avrunding av formen på hjerneceller og innblandet i nevrodegenerative sykdommer, såsom Alzheimers sykdom og Parkins-ons sykdom.

For at den beskrevne oppfinnelse skal kunne bli bedre for-stått, angis følgende eksempler. Det bør være underforstått at disse eksempler angis bare av illustrative grunner og må ikke på noen måte oppfattes som begrensende for denne oppfinnelse.

Eksempel 1

Syntese av Sulfo- Tyr63- N- acetyl- hirudin^-g,] Sulfo-Tyr63-N-acetyl-hirudin54.64 har aminosyreformelen: H-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr (0S03) -Leu-OH. Vi fremstilte dette peptid ved fastfasepeptidsyntese under anvendelse av en Applied Biosystems 43 0 A Peptide Syn-thetizer (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Nærmere bestemt omsatte vi 0,259 meq BOC-O-Leu-resin (1% DVB-resin) sekvensielt med 2 mmol beskyttede aminosyrer. Etter 10 syntesecykler avblokkerte vi peptidet og koblet det vekk fra DVB-resinet ved behandling med vannfritt HF : p-kresol : etylmetylsulfat (10:1:1), v/v/v). Peptidet ble ytterligere renset på en Vydac C18 HPLC-reversfasekolonne (22 mm x 25 cm) , som på forhånd var blitt ekvilibrert i 0,1% TFA i vann. Før peptidet ble satt på kolonnen ble det oppløst i 2,0 ml 0,1% TFA i vann. Hvis nødvendig, ble ytter-Oligere 1 ral 6 H guanidiniumklorid tilsatt til prøven for å øke løseligheten. Etter tilsetningen av prøven ble kolonnen fremkalt med en lineær gradient av økende acetonitril

(0 - 80%) i 0,1% TFA i løpet av 45 minutter ved en strøm-ningshastighet på 4,0 ml/min. Den utkommende strøm ble overvåket ved 229 nm, og fraksjonene ble oppsamlet manuelt.

Det resulterende rensede peptid ble sulfatert ved den eneste tyrosinresten under anvendelse av standard fremgangsmåte [T. Nakahara et al., "Preparation of Tyroseine-O-[<35>S] Sulfated Cholecystokinin Octapeptide From A Non-Sulfated Precursor Peptide", Anal. Biochem., 154, s. 194-99

(1986)] . Sulfo-Tyr63-N-acetyl-hirudin54.64 ble deretter renset for andre

peptider og reaksjonskomponenter ved reversfase-HPLC under anvendelse av en Vydac C18-kolonne (4,6 x 25 cm) og et Applied Biosystems væskekromatografi-system. Kolonnen ble ekvilibrert i et 0,1% TFA/vann løsningsmiddel og fremkalt med en lineær gradient av økende acetonitrilkonsentrasjon

fra 0 til 3 5% i løpet av 90 minutter ved en strømningshas-tighet på 0,8 ml/min med et 0,085% TFA-holdig løsningsmi-ddel. Fraksjonene ble målt med hensyn til absorpsjon ved 214 nm.

Eksempel 2

Tverrbinding av humant trombin med Sulfo- Tyr^- Dinitrof luorbenzyl- hirudin54 .64

Vi fremstilte Sulfo-Tyr63-dinitrofluorbenzyl-hirudinS4.64 (Sulf o-Tyr63-DNFB-hirudin54.64) ved å omsette Sulfo-Tyr63-hirudin54.64 (2 , 0 mg, fremstilt som i eksempel 1) med en støkiometrisk mengde av difluordinitrobenzen (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) i dimetylformamid (DMF) i 18 timer ved værelsestemperatur. Prøven ble så underkastet analytisk HPLC-separasjon under anvendelse av et Applied Biosystems 150 A væskekromatografisk system og en Brownlee RP-300 C8-kolonne (0,46 x 10 cm) for å bestemme graden av derivatisering. Kolonnen ble ekvilibrert i 0,1% TFA i vann (løsningsmiddel A) og fremkalt med en 0 - 5 0% lineær gradient av 0,085% TFA/70% acetonitril (løsningsmiddel B) i løpet av 45 min og deretter en 50-100% lineær gradient av løsningsmiddel B i 15 min. Vi anvendte en konstant strøm-ningshastighet på 1,0 ml/min.

Den utkommende strøm ble overvåket ved 214 nm og 310 nm med hensyn til absorpsjon. Peptid derivatisert med difluor-nitridbenzen-reagenset absorberer ved 310 nm. Vi fant at den ovenfor beskrevne reaksjon produserte Sul f o - Tyr63 - DNFB - hirudin54.64 i 15-30% utbytte. Etter syntesen ble Sulfo-Tyr63-DNFB-hirudin54.64 lagret i samme dimetylformamid-løsningsmiddel ved -20°C i opptil 1 måned.

Vi omsatte et tifoldig molart overskudd av Sulf o-Tyr63-DNFB - hirudin54.64 med humant a-trombin (12,5 mg) i 18 timer ved værelsestemperatur i fosfatbufret saltvann. Vi bestemte graden av tverrbinding ved å analysere reaksjonsblandingen på en SDS-polyakrylamidgel. SDS-PAGE viste en reduksjon i den relative bevegelighet av a-trombinbåndet, hvilket gjen-speilet en økning i molekylvekten på 1000-2000 Dalton. Denne forandring er i overensstemmelse med tverrbinding av trombin med Sulfo-Tyr63-DNFB-hirudin54.64 i en eneste posisjon .

Vi fikk bekreftet at dannelsen av et kovalent kompleks mellom Sulf o-Tyr63-DNFB-hirudin54_64 og humant trombin er spesifik ved å anvende [35S] -Sulf o-Tyr63-DNFB-hirudin54.64 .

[<35>S] -Sulfo-Tyr63-DNFB-hirudin54.64 ble fremstilt i alt vesentlig som beskrevet ovenfor under anvendelse av H2 [^<35>S] 04 i stedet for H2S04 i Nakahara-sulfateringsprosedyren [se også svevende US patentsøknader nr. 164.178, 251.150, 280.618 og 314.756, og J. M. Maraganore et al., "Anticoagulant Avtivity of Synthetic Hirudin Peptides'^ J. Biol. Chem., 264, s. 8692-98 (1989).

Vi omsatte [35S] -Sulfo-Tyr63-DNFB-hirudin54.64 med humant a-trombin, enten i nærvær eller fravær av et 5- eller 20-foldig molart overskudd (i relasjon til konsentrasjonen av trombin) av Sulfo-Ty<r>63-N-acetyl-hirudin53.64 (fremstilt som i eksempel 1 med tilsetning av N-acetyl-asparagin som et avsluttende trinn i peptidsyntesen). Etter inkubasjon ved værelsestemperatur i 18 timer underkastet vi blandingen SDA-PAGE og autoradiografi. Resultatene (figur 1) viste at [<35>S] -merket peptid ble innlemmet i båndet som representerer trombin, og at nærvær av kaldt, umerket hirudinpeptid svekket størrelsen av kovalent kompleksbinding til mindre enn 10%. Således rsulterer omsetning av Sulfo-Tyr63-DNFB-hirudin54.64 med trombin i 1:1 støkiometrisk binding av hirudinpeptidet ved et spesifikt bindingssete.

For å identifisere setet i trombin hvor Sulfo-Tyr63-DNFB-hirudin54.64 bindes, ble trombin/Sulf o-Tyr63-dinitrobenzyl-(DNB) -hirudin54.64-kompleks (1,0 mg) overført til en Sephadex G-50-kolonne (1,5 x 45 cm) , som var ekvilibrert og fremkalt med 7 M urea, 20 mM Tris, pH 7,5. Denne kromatografi fjernet alt uomsatt Sulf o-Tyr63-DNFB-hirudin54_64. En topp som inneholdt trombin/Sulfo-Tyr63-DNB-hirudin54_64 ble isolert i de ledige volumfraksjoner, slått sammen og redusert ved tilsetning av 10 /il S-merkaptoetanol.

Etter reduksjonen S-karboksymetylerte vi komplekset med jodeddiksyre som beskrevet tidligere [J. M. Maraganore et al., "A New Class of Phospholipases A2 with Lysine in Place of Aspartate-49", J. Bol. Chem., 259, s. 13839-43 (1984)]. Det reduserte, S-alkylerte protein ble deretter dialysert grundig mot 3% eddiksyre ved værelsestemperatur. Etter dialysen behandlet vi komplekset med pepsin (2% w/v) i 4 t ved 37°C. Peptidfragmenter av redusert, S-karboksymetylert trombin/Sulfo-Tyr63-DNB-hirudin54.64 ble renset ved reversfase-HPLC under anvendelse av en Aquapore RP-300 C8-kolonne (0,46 x 10 cm). Kolonnen ble ekvilibrert i 0,1% TFA i vann og fremkalt med en gradient av økende 0,085% TFA/70% acetonitril (0-60%) i 80 minutter ved en strømningshastig-het på 1,0 ml/min. Den utkommende strøm ble overvåket med hensyn til adsorpsjon ved både 214 og 310 nm. Fraksjoner på 1,0 ml ble oppsamlet automatisk. HPLC-separasjon av peptidfragmenter gjorde det mulig å oppløse en eneste hovedtopp ved både 214 og 310 nm-absorberende materiale. På grunn av sin fjerne UV-absorpsjon inneholdt dette fragment det bundne Sulf o-Tyr63-DNFB-hirudin54.64 .

Vi underkastet deretter fragmentet automatisk Edmandegra-dering med en Applied Biosystems 470A gassfasesekvenser utstyrt med et 900A datasystem. Fenyltiohydantoin (PTH)-aminosyrer ble analysert on-line ved hjelp av en Applied Biosystems 12OA PTH-analysator og en PTH-C18-kolonne (2,1 x 220 mm). Vist nedenfor er en tabell med gjentatte utbytter fra sekvensanalysen:

Det ble funnet at peptidsekvensen tilsvarte restene 144-154 i humant a-trombin [J. W. Fenton, II., "Thrombin Active Site Regions" Semin. Thromb. Hemostasis, 12, s. 200-08

(1986)]. Peptiske spaltninger skjedde ved en Leu-Lys- og Val-Leu-binding, i samsvar med dette enzyms spesifisitet.

I løpet av sekvensanalysen kunne aminosyren som tilsvarte Lys-149 (cyklus 10) ikke identifiseres eller kvantifiseres. Dette var sannsynligvis et resultat av derivatisering av

~-NH2-gruppen i denne aminosyre med dinitrofluorbenzyldelen i Sulf o-Tyr63-DNFB-hirudin54_64. Således er Lys-149 hovedsetet hvor Sulfo-Tyr63-DNFB-hirudin54_64 reagerer med a-trombin.

Eksempel 3

Fremstilling av en trombinhemmer som er i stand til å

blokkere det katalytiske sete og bindes til det utadrettede anioniske bindingssete

Karboksyterminale hirudinpeptider blokkerer effektivt trombinkatalysert fibrinogen hydrolyse, men ikke kromogen substrathydrolyse. [J. M. Maraganore et al., J. Biol. Chem.,

264, s. 8692-98)] . I tillegg nøytraliserer ikke hirudinpeptider trombinkatalysert aktivering av faktorene V og VIII [J. W. Fenton, II, et al., "Hirudin Inhibition by Thrombin" ,

Angio. Archiv. Biol.. 18, s.27 (1989)].

Hirudinpeptider, såsom Sulfo-Tyr63-N-acetyl-hirudirL53_S4, utviser kraftige hemmende virkninger overfor trombinindusert blodplateaktivitat in vitro [J. A. Jakubowsky and J. M. Maraganore, "Inhibition of Thrombin-Induced Platelet Activities By A Synthetic 12 Amino Acid Residue Sulfated Peptide (Hirugen)", Blood, s. 1213 (1989)]. Ikke desto mindre kan en trombinhemmer som er istand til å blokkere det aktive sete, være nødvendig for å hemme blodplatetrombose in vivo, hvis aktivering av Faktorene V og VIII er hastighetsbegrensende trinn. Denne konklusjon er underbygget utfra resultater erholdt med den irreversible trombinhemmer

(D-Phe)-Pro-Arg-CH2Cl [S. R. Hanson and L. A. Harker, "Interruption of Acute Platelet-Dependent Thrombosis by the Synthetic Antithrombin D-Fenylalanyl-L-Prolyl-L-Arginyl Chlorometyl Ketone", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 85, s. 3184-88 (1988)] og andre reversible trombinhemmere [J. F. Eidt et al., "Thrombin is an Important Mediator of Platelet Aggregation in Stenosed Canine Coronary Arteries with Endothelial Injury", J. Clin. Invest., 84, s. 18-27 (1989)-]

Under anvendelse av ovennevnte kunnskap om at NH2-terminusen i hirudinpeptider er ved siden av Lys-14 9, anvendte vi en tredimensjonal modell av trombin (figur 2) [B. Furie et al., "Computer-Generated Models of Blood Cogulation Factor Xa, Factor IXa, and Thrombin Based Upon Structural Homology with Other Serine Proteases", J. Biol. Chem., 257, s. 3875-82 (1982)] for å fremstille et middel som: 1) bindes til det utadrettede anioniske bindingssete i trombin, og 2) er istand til å blokkere de aktive setelommer i trombin og hemme funksjonen av katalytiske rester som finnes deri.

Vi bestemte at den minimale avstand fra ~-NH2 i Lys-149 til S-hydroksylatet i Ser-195 er 18-20 Å. Basert på en 3 Å/aminosyrerestlengde regnet vi at minst ca. 4 - 7 aminosyrer ville være nødvendig for å binde et hirudinpeptid, såsom Sulfo-Tyr63-hirudin53.64 , til et område som omfatter en aktivsetehemmende struktur. Sammensetningen av linkeren ble bestemt å være glysin. Glysin ble valgt for å ha størst mulig fleksibilitet hos forbindelsesmidlet for disse pre-liminære undersøkelser. Det bør imidlertid være underforstått at andre, mer rigide bipolymere forbindelsesmidler, også kan anvendes.

Vi valgte sekvensen (D-Phe)-Pro-Arg-Pro som den aktive setehemmer, fordi trombin utøver spesifisitet for Arg som Pj;-aminosyren ved spaltningen av substrater. En Pro etter Arg gir en binding som spaltes meget langsomt av trombin. Vi fremstilte alternative peptider ved å erstatte Pro (etter Pj-Arg) med en sarcosyl- eller N-metyl-alanin-aminosyre eller ved kjemisk reduksjon av en Arg-Gly spaltbar binding.

Eksempel 4

Hirulog- 8 - syntese

Hirulog-8 har formelenH- (D-Phe) -Pro-Arg-Pro- (Gly) 4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Vi syntetiserte

Hirulog-8 ved konvensjonell fastfase-peptidsyntese under anvendelse av en Applied Biosystems 430 A Peptide Synthe-tizer. Dette peptid ble syntetisert med BOC-L-Leucin-O-divinylbenzenharpiks. Ytterligere t-BOC-aminosyrer (Peninsula Laboratories, Belmont, CA) som ble anvendt, omfattet BOC-Q-2,6-diklorbenzyltyrosin, BOC-L-glutaminsyre (p-benzylester), BOC-L-prolin, BOC-L-isoleucin, BOC-L-fenylalanin, BOC-L-aspartinsyre (S-benzylester), BOC-glycin, BOC-L-asparagin, BOC-D-fenylalanin og BOC-L-arginin. For å oppnå høyere utbytter i syntesen, ble (Gly) 4-linkersegmentet til-knyttet i to cykler med manuell tilsetning av BOC-glycyl-

glysin (Beckman Biosciences, Inc., Philadelphia, PA). Etter at syntesen var ferdig, ble peptidet helt blokkert og koblet vekk fra divinylbenzenresinet ved behandling med

vannfritt HF : p_-kresol : etylmetylsulfat (10:1:1, v/v/v). Etter fjerning fra resinet ble peptidet frysetørket til tørrhet.

Ubehandlet Hirulog-8 ble renset ved reversfase-HPLC under anvendelse av et Applied Biosystems 151A væskekromatografisk system og en Vydac ■ C18 kolonne (2,2 x 23 cm) . Kolonnen ble ekvilibrert i 0,1% TFA/vann og fremkalt med en lineær gradient av økende acetonitrilkonsentrasjon fra 0 til 80% i løpet av 45 min i den 0,1% TFA ved en strømnings-hastighet på 4,0 ml/min. Den utkommende strøm ble overvåket med hensyn til absorpsjon ved 229 nm, og fraksjoner ble oppsamlet manuelt. Vi renset 25-3 0 mg av ubehandlet Hirulog-8 ved hjelp av HPLC og gjenvant 15-2 0 mg rent peptid.

Vi bekreftet strukturen for renset Hirulog-8 ved aminosyre-og sekvensanalyser. Aminosyrehydrolysater ble fremstilt ved å behandle peptidet med 6 N HC1 i vakuum ved 110°C i 24 timer. Vi analyserte deretter hydrolysatene ved ionebytte-kromatokrafi og påfølgende ninhydrinderivatisering/bestemmelse under anvendelse av en Beckman 63 00 automatisert analysator. Vi utførte sekvensanalyse ved hjelp av auto-mati-sert Edman-degradering på en Applied Biosystems 470A gassfasesekvenser utstyrt med et Model 900A datasystem. Fenyltiohydantoin (PTH)-aminosyrer ble analysert on line ved hjelp av en Applied Biosystems 12OA PTH-analysator og en PTH-C18-kolonne (2,1 x 220 mm) .

Eksempel 5

Syntese av Hirulog- 9

Hirulog-9 har formelen: H-(D-Phe)-Pro-Arg-D-Pro-(Gly) 4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Vi syntetiserte dette peptid på samme måte som beskrevet i eksempel 4,, idet vi anvendte BOC-D-prolin (Peninsula Laboratories) ved cyklus 15 i stedenfor BOC-L-prolin. Rensing og karakterisering ble utført som beskrevet i eksempel 4.

Eksempel 6

Syntese av Hirulog- 10

Hirulog-10 har formelen: H-(D-Phe)-Pro-Arg-Sar-(Gly) 5-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Peptidet ble syntetisert som i eksempel 4 under anvendelse av BOC-sarcosin (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) ved cyklus 16. Rensing og karakterisering ble utført som beskrevet i eksempel 4.

Eksempel 7

Syntese av Hirulog- 11

Hirulog-11 har formelen: H-(D-Phe)-Pro-Arg-Pro-(Gly) 4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-(3,5-dijodTyr)-Leu-OH. Dette peptid ble syntetisert som i eksempel 4 under anvendelse av BOC-3,5-dijod-L-tyrosin (Sigma) ved cyklus 2. Rensing og karakterisering ble utført som beskrevet i eksempel 4.

Eksempel 8

Syntese av Hirulog- 12

Hirulog 12 har formelen: H-(D-Phe)-Pro-Arg-Pro-(Gly) 4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr (OS03) -Leu-OH. Dette peptid syntetiseres ved å omsette 1,0 mg Hirulog-8 i dimetylf ormamid (80 /il) med dicykloheksylkarbodiimid-oppløsning (1,25 g/ml, 0,007 ml) og konsentrert svovelsyre (0,5 fil) ved 0°C i 10 minutter. Reaksjonen stoppes ved tilsetning av vann (1,0 ml).

Reaksjonsblandingen kan underkastes reversfase-HPLC, idet man anvender et Applied Biosystems 150A væskekromatografisk system og en Aquapore RP-300 C8-kolonne (0,46 x 10 cm). Kolonnen ekvilibreres i løsningsmiddel A (0,1% TFA/vann) og fremkalles med en økende konsentrasjon av løsningsmiddel B (0,085% TFA/70% acetonitril) fra 0 til 50% i løpet av 45 miutter ved et strømningshastighet på 1,0 ml/min. Den utkommende strøm overvåkes med hensyn til absorpsjon ved 214 nm.

Renset Hirulog-12 nøytraliseres deretter til pH 7 ved å tilsette 0,1 N NaOH. Det frysetørkes og rekonstitueres i fosfatbufret saltvann.

Eksempel 9

Hemming av trombinkatalysert hydrolyse av et p- nitroanilidsyntetisk substrat med Hirulog- 8

Vi analyserte deretter virkningene av Hirulog-8 på den human a-trombinkatalyserte hydrolyse av Spectrozym TH (tosyl-Gly-Pro-Arg-p-nitroanilid; American Diagnostica, New York, NY).

Især målte vi de initielle delhastigheter i nærvær eller fravær av Hirulog-8 over et område av substratkonsentra-sjoner fra 2,2 til 22 fiM. Den trombinkatalyserte verdi ble overvåket i et Cary 19 spekt rofotome ter ved 4 05 nm og nedtegnet kontinuerlig som fuksjon av tiden. Kinetikken ble utført ved værelsestemperatur (25 + 1°C) i en 0,05 M Tris, pH 7,5, 0,1 M NaCl-buffer.

For en typisk enzymreaksjon ble 1,0 ml buffer tilsatt til både prøve- og preferansekuvettene. Trombin (3,2 x IO"<9> M, sluttkonsentrasjon) og Hirulog-8 (0-4 x IO"<8> M) ble tilsatt til prøvekuvetten før tilsetning av Spectrozym TH (2,2 - 22 /xM) . Straks etter tilsetning av substrat ble innholdet i prøvekuvetten blandet ved hjelp av en plastpipette. Reaksjonen ble overvåket spektrofotometrisk i 5 - 15 minutter.

Initielle delhastigheter for hver substratkonsentrasjon ble uttrykt som mol Spectrozym TH-hydrolysert/sek/mol trombin. Dette ble bestemt under den initielle lineære fase av reaksjonen (<. 15% total hydrolyse av substratet) ved å måle stigningen av den hydrolytiske reaksjon. Linewater-Burke-grafiske fremstillinger ble laget i samsvar med dette ved å fremstille inversen av den initielle hastighet mot inversen av substratkonsentrasjonen. Resultatene viste at human a-trombinkatalysert hydrolyse av Spectrozyme TH hadde en vmax = 17 m°l hydrolysert/sek/mol trombin og en KM-verdi på 1,19 x 10~s M. Figur 3, områdene A og B, viser at økende konsentrasjoner av Hirulog-8 førte til signifikante, doseav-hengige øknnger av KM-verdien-, med små økninger i Vmax-verdien for Spectrozyme TH-hydrolyse. Derfor ble hemmingen av trombinkatalysert omsetning av Hirulog-8 utført ved blandede kompetitive/ikke-kompetitive komponenter med hensyn tilSpectrozym-TH-hydrolysen. Kj-verdien v Hirulog-8 for a-trombin ble bestemt ved hjelp av ligningen:

v max

V

hvor ( ) er stigningen av den trombinkatalyserte r^ M hemmet

omsetning i nærvær av Hirulog-8; [Hirulog-8] er den molare " max

V

konsentrasjon av peptid; ( ) er den trombin-IXK uhemmet

katalyserte omsetning i fravær av hemmeren; og KT er den molare hemningskonstant for Hirulog-8 med human a-trombin. Kj.-verdien for Hirulog-8 ble beregnet å være 1,95 + 0,11 x IO'<9> M.

Eksempel 10

Spesifisitet av Hirulog-8 for hirudinpeptidbindingssetet og det aktive sete i human a- trombin

Hirulog-8 ble fremstilt som en analog som binder human a-trombin via sitt hirudinpeptidbindingssete mens den blokkerer trombins katalytiske sete. Vi undersøkte evnen hos Hirulog-8 til å utføre disse funksjoner ved forskjellige studier som er beskrevet nedenfor.

Kinetikken i Hirulog-8 -hemmingen av menneskelig b-trombin ble studert i alt vesentlig som beskrevet ovenfor i eksempel 9 for humant a-trombin. Den p-trombinkatalyserte reaksjon overfor Spectrozyme TH viste en Vmax = 7,14 mol hydrolysert/sek/mol trombin og KM = 1,1 x 10"<6>M. Disse resultater bekrefter at b-trombin, en proteolytisk form av trombin, ut-viser nesten fullstendig katalytisk funksjon, skjønt denne form i alt vesentlig mangler koagulerende aktivitet. [S. D. Lewis et al., "Catalytic Competence of Human A- and p-Thrombins in the Activation of Fibrinogen and Factor XIII", Biochemistrv, 26, s. 7597-7603 (1987)]. Hemmingen av p-trombin med Hirulog-8 ble undersøkt over et område av peptidkonsentrasjoner fra 2,7 x 10"<8> til 6,8 x 10"e

M.

Som vist nedenfor, utøver Hirulog-8 en øket Kx på 3 størrel-sesordener i relasjon til a-trombin. Denne høye Kx-verdi overfor b-trombin skyldes fravær av et intakt anionbindende utadrettet sete (ABE) i p-trombin [J. W. Fenton, II, et al., "Anion-Binding Exosite of Human a-Thrombin and Fibrinogen) Recognition", Biochemistry, 27, s. 7106-12

(1988)].

b-Trombin dannes ved proteolyse av B-kjeden i a-trombin ved Lys-149 og Arg-78.

Hemmingen av menneskelig a-trombin med Hirulog-8 ble merkbart redusert i nærvær av Sulfo-Tyr63-N-acetyl-hirudin53.64 ved konentrasjoner på 2,6 x 10"<6>M til 1,29 x 10" <5>M. Dette er fordi Sulf o-Tyr63-N-acetyl-hirudin53_64 konkurrerer med Hirulog-8 om binding til ABE i trombin.

Dette ble også vist ved tilsetning av fenylmetylsulfonyl-a-trombin ("PMS-a-thrombin"; 18 nm, sluttelig) til om-setninger av Hirulog-8 med menneskelig a-trombin. Tilsetningen av dette modifiserte trombin resulterte i en vesentlig minskning i Hirulog-8s evne til å hemme a-trombin. PMS-a-trombin har et intakt ABE, men derivatiseres kovalent ved sitt aktive sete. Dette modifiserte trombin legger beslag på Hirulog-8 i reaksjonsblandingen og reduserer derfor mengden av peptid som er tilgjengelig for å hemme intakt, katalytisk aktivt menneskelig a-trombin.

Vi utførte også studier omkring virkningen av saltkonsentrasjoner på Kl-verdien for Hirulog-8 overfor trombin som beskrevet ovenfor i eksempel 9. Vi målte Kx-verdien i nærver eller fravær av Hirulog-8 (11,5 x IO"<9> M) i buffere som inneholdt 0,1, 0,25 og 0,5 M NaCl. Som vist i tabellen nedenfor økte hemmingen av a-trombin med Hirulog-8 ved lavere saltkonsentrasjoner Dette resultat bekreftet at virkningen av den meget anioniske hirudinpeptid-del i Hirudin-8 med det positivt ladede sete rundt Lys-149 i trombin er av avgjørende betydning for Hirulog-8-hemming i trombinkatalysert hydrolyse av Spectrozyme TH.

Eksempel 11

Antikoagulerende aktivitet av Hirulog-8: Sammenligning med

Hirudin og Sulfo- Tyr63- N- acetyl- hirudinrVC^

Vi studerte den antikoagulerende aktivitet av Hirulog-8 med oppsamlet, normalt menneskelig plasma (George King Biomedi-cal, Overland Park, KA) og et Coag-A-Mate XC-instrument

(General Diagnostics, Organon Technica, Oklahoma City, OK). Aktiviteten ble overvåket ved hjelp av den aktiverte partielle tromboplastintid(APTT)-test med kalsiumklorid og fosfolipidoppløsninger erholdt fra produsenten. Hirulog-8, hirudin, eller Sulf o-Tyr63-N-acetyl-hirudin53_64 ble deretter tilsatt til APTT-bestemmelsesbrønner ved en sluttelig konsentrasjon på 10 til 32.300 ng/ml i et totalt volum på 25 fil før tilsetning av 100 fj. 1 plasma.

APTT-kontrollen (fravær av hemmer) var 29,6 sek (gjennom-snitt, n=8, SEM < 0,5%). Figur 4 viser resultatene av disse doseavhengige undersøkelser. Hirulog-8 var 2 til 3 ganger kraftigere enn Hirudin og 100 til 150 ganger kraftigere enn Sulf o-Tyr63-N-acetyl-hirudin53_64. Både Hirulog-8 og hirudin økte APTT-verdien i plasma til verdier som var for høye til å kunne måles. Dette er i motsetning til Sulf o-Tyr63-N-acetyl-hirudin53„64/ som utøver en mettbar doserespons i APTT-verdien til 200-250% i forhold til kontrollene [J. M. Maraganore et al., J. Biol. Chem., 264, s. 8692-98, (1989)-] . Dette resultat viste at Hirulog-8 kan blokkere det aktive sete i trombin i plasma, også in vivo i kromogeniske undersøkelser, på lignende måte som hirudin.

Eksempel 12

Hemming av trombinindusert blodplateaktivering med Hirulog- 8 Trombinindusert blodplateaktiveringsstudier utføres ved 37°C ved hjelp av et Biodata PO, blodplate-aggregometer. Blodplaterikt plasma (PRP) erholdes fra normale, friske, frivillige personer som ikke har tatt noen medisinering som forandrer blodplatefunksjonen i minst én uke før undersø-kelsen. PRP fremstilles som beskrevet av J. A. Jakubowsky et al., "Modification of Human Platelet by a Diet Enriched in Saturated or Polyunsaturated Fat", Atherosclerosis. 31, s.335-44 (1978)]. Varierende konsentrasjoner av Hirulog-8

(0-500 ng/ml i 50 fil vann) tilsettes til 0,4 ml foropp-varmet (37°C) PRP. Ett miutt senere tilsetter vi menneske-

lig a- trombin til blodplatesuspensjonen til en sluttkonsentrasjon på 0,2, 0,25 eller 0,5 enheter/ml av det samlede undersøkelsesvolum. Aggregasjonen overvåkes som økning i lystransmisjonen i 5 minutter etter tilsetningen av trombin. Vi beregner deretter % hemming som (%aggregas j onprave) /

(%aggregasjonkontroll) x 100. Denne undersøkelse viser at Hirulog-8 blokkerer trombinindusert blodplateaktivering in vitro.

Eksempel 13

Anvendelse av Hirulog- 8 i trombe- avbildning

Hirulog-8 modifiseres ved kovalent tilkytning til en 123i-holdig kjemisk gruppe. Nærmere bestemt omsettes Hirulog-8 (fremstilt som i eksempel 4) med <123>I-Bolton Hunter Reagens (New England Nuclear, Boston, Mass.) i 0,1 M natriumborat, pH 9,0. Det 123 -1-merkede molekyl (med en spesifikk aktivitet på >5 iiCi//ig) avsaltes deretter i en Biogel P2-kolonne som ekvilibreres i et fosfatbufret saltvann.

Ex vivo-avbildning av ekperimentelle tromber utføres i alt vesentlig som beskrevet av T. M. Palabrica et al., "Thrombus Imaging in a Primate Model with Antibodies Specific for an External Membrane Protein of Activated Platelets", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 86, s. 1036-40 (1989) . Nærmere bestemt utføres avbildningen i bavianer ved hjelp av en ytre Ticoflex-omløpsledning mellom den femorale arterie og den femorale vene. En eksperimentell trombe dannes ved anbringelse av et segment av en på forhånd koagulert Dacron-pode i omløpsledningen. 123I-merket trombinhemmer injiseres i den venøse del av Tricoflex-omløpsledningen. Foranliggende

avbildninger i serie erholdes deretter i 0,5 - 1 time ved hjelp av et Ohio Nuclear Series 100 Gamma-kamera med en PDP-ll/34 datamaskin. Kinetikken for <123>I-trombinhemmer-opptaket med podeanordningen og blodforrådet avledes fra de således erholdte radionuklide avbildninger.

Den samme teknikk kan anvendes for å erholde ex vivo-avbildninger av en dyp venøs trombe forårsaket ved stase i den femorale åre hos bavianer. Fordi 123I-Hirulog-8 bindes til trombin med høy spesifisitet, kan man ved anvendelse av dette molekyl erholde presise ex vivo-avbildninger av tromber. Den lille størrelse på Hirulog-8 gir også, i motsetning til naturlig hirudin eller antistoffer til trombin, det potensial hvor den radioaktivt merkede trombinhemmer vil gi avbildninger av blodplatebundet trombin og meizotrombin, samt trombin som forekommer i fibrinkoagu-latet.

Eksempel 14

Antimetastatisk aktivitet hos trombinhemmere

Den antimetastatiske aktivitet hos trombinhemmerne ifølge denne oppfinnelse, fortrinnsvis Hirulog-8, undersøkes ved hjelp av sarcoma T241-celler [L.A. Liotta et al., Nature, 284, s. 67-68 (1980)] og syngeneiske C57BL/6-mus (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Musene injisres enten intra-venøst eller sukutant med 0 - 250 g/kg Hirulog-8, fremstilt som i eksempel 4, etterfulgt av injeksjon med IO<4> - 10<6> T241 tumorceller. Etter 15 dager avlives dyret, og lungetumor-koloniene kvantifiseres. Antimetastatisk aktivitet hos Hirulog-8 måles som prosentvis reduksjon i tumorkoloniene sammenlignet med placebo-behandlede kontrollmus. Hirulog-8 viser antimetastatisk aktivitet i denne assay.

Eksempel 15

Hemming av endotele celler med en trombinhemmer

Evnen hos trombinhemmer ifølge denne oppfinnelse til å forhindre trombinindusert syntese av den blodplateaktive-rende faktor (PAF) undersøkes under anvendelse av dyrkede menneskelige endotele celler fra den umbilikale åre

(HUVEC). HUVECene ekstraheres fra menneskelige umbilikale strenger ved kollagenase-omsetning i henhold til etablerte fremgangsmåter [M. A. Gimborne, Jr., "Culture of Vascular Endothelium", Prog. Hemost. Thromb., 3, s. 1-28 (1976)].

HUVECene dyrkes slik at de sammenløper i en 96-brønners mikrotiterplate i nærvær av [<3>H]-acetat. Celler som er dyrket på denne måte, fremkaller [<3>H]-acetyl-PAF, som kan kvantifiseres ved ekstraksjon av HUVEC-membran-fosfoli-pider.

Hirulog-8 (0-1 /tg/ml) tilsettes til de [3H] -acetat-tilsatte HUVECene 1 minutt før tilsetningen av trombin (sluttkonsentrasjon 1 U/ml). Cellene inkuberes i 5 minutter, og supernatanten fjernes deretter. Et medium som inneholder 0,1% gelatin, 50 mM eddiksyre i metanol (2:1 v/v) tilsettes deretter til HUVECene. PAF ekstraheres deretter og kvantifiseres ved hjelp av konvensjonelle teknikker [T. M. Mc-Intyre et al., "Cultured Endothelial Cells Synthesize Both Platelet-Activating Factor and Prostacyclin in Response to Histamine, Bradykinin and Adenosine Triphosphate", J. Clin. Invest., 76, s. 271-80 (1985)]. IC50-verdiene beregnes deretter. Hirulog-8 hemmer syntesen av PAF med HUVEC i denne undersøkelsen.

Virkningen av Hirulog-8 på trombinindusert polymorfonuklear leukocytt(PMN)-adhesjon til HUVEC kan vises som følger. HUVECene dyrkes til sammenløpning i MEM som inneholder 1% føtalt kalveserum i koloniplater med 24 brønner. Mediet fjernes deretter, cellene vaskes to ganger med friskt, serumfritt medium og inkuberes i samme medium i 10-3 0 minutter ved 37°C for å fjerne serumprodukter. PMNer (2,5 x IO<6> i 1 ml), som på forhånd er ekvilibrert ved 37°C, tilsettes deretter til hver brønn. PMNene får sette seg i HUVEC-monosjiktet i 2 minutter. Hirulog-8 (5 /zg/ml) eller saltvann tilsettes til hver brønn, umiddelbart etterfulgt av tilsetning av a-trombin (0,1 eller 1 U/ml). Cellene inkube- res i 5 minutter ved 37°C, vaskes to ganger og undersøkes deretter ved fasekontrastmikroskopi. Vedhengende PMNer telles direkte. Prøver inkubert med Hirulog-8 har signifikant færre vedhengende PMNer enn prøver behandlet med saltvann.

Eksempel 16

Syntese av Hirulog- 13

Hirulog-13 har formelen: H-(D-Phe)-Pro-Arg-Pro-(Gly) 2-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Vi syntetiserte, renset og karakteriserte dette peptid hovedsakelig som beskrevet i eksempel 4, med unntagelse av at bare én cyklus i BOC-glycylglycin ble anvendt for å produsere di-glycin-segmentet.

Eksempel 17

Syntese av Hirulog- 14

Hirulog-14 har formelen: H-(D-Phe)-Pro-Arg-Pro-(Gly) 5-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Hirulog-14 ble syntetisert, renset og karakterisert ved hjelp av metoder beskrevet i eksempel 4, unntatt at én cyklus av BOC-glycin-tilsetning ble anvendt etter de to cykler av BOC-glycylglycin-tilsetning for å fremstile pentaglycin-segmentet.

Eksempel 18

Syntese av Hirulog- 15

Hirulog-15 har formelen: H-(D-Phe)-Pro-Arg-Pro-(Gly)S-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Hirulog-15 ble syntetisert, renset og karakterisert ved hjelp av metoder beskrevet i eksempel 4, unntatt at tre cykler av BOC-glycylglycin-tilsetning ble anvendt for å fremstille heksaglycin-segmentet.

Eksempel 19

Syntese av Hirulog- 16

Hirulog-16 har formelen: H-(D-Phe)-Pro-Arg-Pro-(Gly)8-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Hirulog-16 ble fremstilt, renset og karakterisert som beskrevet i eksempel 4, unntatt at fire cykler av BOC-glycylglycin-tilsetning ble anvendt for å fremstille oktaglycin-segmentet .

Eksempel 20

Syntese av Hiruloq- 17

Hirulog-17 har formelen: H-(D-Phe)-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Glu-Gly-His-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH., Hirulog-17 ble syntetisert hovedsakelig som beskrevet i eksempel 4, unntatt at en Gly-Gly-Glu-His-Gly-sekvens erstattet Gly<4->segmentet som finnes i Hirulog-8. Denne sekvens ble addert til den voksende peptidkjede ved de påhverandre følgende addisjoner av BOC-glycin, BOC-L-histidin, BOC-glycin, BOC-L-glutaminsyre og BOC-glycylglycin ved cyklene 13-17 i syntesen. Rensing og karakterisering ble utført som beskrevet i eksempel 4.

Eksempel 21

Syntese av Hiruloq- 18a, - 18b og - 18c

Hirulog-18a har formelen: H-(D-Phe)-Pro-(iS-homoarginin)-(Gly) 5-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Hirulog-18b har formelen: H-(D-Phe)-Pro-(S-homoarginin)-Pro- (Gly) 4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Hirulog-18c har formelen: H-(D-Phe)-Pro-(S-homoarginin) -Val- (Gly) 4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Vi syntetiserte Hirulog-18a ved en blandet homo-gen/f astf ase -fremgangsmåte . Restene 5-20 ble fremstilt ved fastfase-syntese, som beskrevet i eksemplene 4 og 17. Det resulterende resinkoblede mellomprodukt ble omsatt med et BOC-S-homoarginin-Gly-beskyttet mellomprodukt, som ble syntetisert i det flertrinns reaksjonsskjerna som er avbildet nedenfor og beskrevet umiddelbart deretter.

N^-BOC-IvP-Tos-arginin-diazometylketon

Vi rørte 10 g (13,4 mmol) KP-BOC-KF-Tos-arginin-(Bachem, Torrance, CA) og 2,1 ml (19,1 mmol) N-metylmorfolin (Aldrich, Milwaukee, Wis.) i 100 ml vannfritt tetrahydrofuran (THF) under argon i 5 minutter ved romtemperatur. Løsningen ble deretter avkjølt til -15°C, og 2,8 ml (21,6 mmol) isobutyl-kloroformat (Aldrich) ble tilsatt. Vi fortsatte å røre reaksjonsblandingen ved -15°C i 5 minutter og filtrerte den deretter gjennom en dott av celitt/MgS04. Deretter tilsatte vi filtratet ti en isavkjølt eterisk løsning av diazometan (150 mM, fremstilt av 32,4 g Diazald; Aldrich). Løsningen ble omrørt og fikk gradvis oppnå omgivelsestem-peratur over natten. Løsningsmidlet ble deretter fjernet i vakuum, og residuet ble oppløst i 200 ml kloroform. Vi vasket deretter den organiske løsing etter hverandre med 200 ml mettet NaHC03, etterfulgt av 2 00 ml mettet NaCl, tørket den over vannfritt magnesiumsulfat, og konsentrerte den igjen til et oljeaktig residuum. Residuet ble deretter renset ved flash-kromatografi på en 4 x 17 cm kolonne av kiselgel, idet vi anvendte en trinngradient av aceton i kloroform (10% aceton i 2 1 kloroform, etterfulgt av 20% aceton i 3 1 kloroform) . Fraksjoner på 25 ml ble oppsamlet. Allikvoter av hver fraksjon ble undersøkt ved tynnsjikts-kromatografi (TLC). Fraksjoner som inneholdt det ønskede produkt, ble slått sammen og inndampet til tørrhet. Produktet, diazometylketon, ble renset som et lysegult skum (6,54 g) •

N"-BOC-lSF-Tos-£-homoarginin-metylester

Vi oppløste diazometylketonet som var fremstilt ovenfor, i 100 ml vannfri metanol og oppvarmet under tilbakeløp løsningen under argon mens en løsning av sølvbenzoatkata-lysator (165 mg i 400 /xl trietylamin) ble tilsatt dråpevis. Etter 3 0 minutter ble den oppvarmede løsning avkjølt til værelsestemperatur, oppslemmet med "Norit", og filtrert gjennom celitt. Løsningsmidlet ble deretter fjernet i vakuum, og det oljeaktige residuum ble renset ved flash-kromatografi over kiselgel. Eluering ble oppnådd med 4 1 10% aceton i kloroform. Det ønskede produkt, 13-homoarginin-metylester, ble således renset som et lysebrunt skum

(6,43 g).

Na<->BOC-ISP-Tos-S-homoarginin

Vi oppløste all ovennevnte metylester i 100 ml metanol og omsatte den deretter med en løsning av LiOH (1,48 g i 50 ml vann) over natten ved værelsestemperatur under argon med konstant omrøring. Vi fjernet metanolen i vakuum, oppløste residuet i vann og vasket det med etylacetat. Vi tilsatte deretter mettet sitronsyre inntil løsningen nådde en pH-verdi på 4. Vi ekstraherte den resulterende karboksylsyre i etylacetat. Ekstraksjonen ble gjentatt ved pH 3, og de kombinerte organiske faser ble tørket over magnesiumsulfat og konsentrert i vakuum. Den resulterende ubearbeidede syre ble gjenvunnet som et hvitt skum (4,9 g). Syren ble videre renset på en Vydac C18 reversfase HPLC-kolonne, som beskrevet i eksempel 4, unntatt at den utkommende strøm ble overvåket ved 214 nm. Etter lyofilisering av den ønskede fraksjon ble produktet, N^BOC-ISF-Tos-S-homoarginin, gjenvunnet som et hvitt amorft faststoff.

En prøve av ^-BOC-lSP-Tos-S-homoarginin ble hydrolysert i HF og anvendt som standard for aminosyreanalysen. Retensjonstiden for fi-homoarginin var identisk med retensjonstiden for arginin, men toppens intensitet var betraktelig lavere, som ventet.

N^BOC-N^Tos-S-homoargininylglycin-benzylester

Vi slo deretter sammen 4.06 g (9,2 mmol) av ovennevnte karboksylsyre med 2,04 ml N-metylmorfolin i 25 ml vannfritt THF. Blandingen ble omrørt under argon ved -5°C. En avkjølt oppløsning av isobutylklorformiat (2,4 ml i 25 ml THF) ble deretter tilsatt dråpevis til løsningen i løpet av 10 min. Etter denne tilsetning ble reaksjonsblandingen omrørt i 12 minutter ved -5°C. For Hirulog-18a tilsatte vi deretter en løsning av glycinbenzylester (4,9 g i 40 ml THF; 27,6 mmol), og lot reaksjonsblandingen anta værelsestemperatur. Løs- ningsmidlet ble deretter fjenet i vakuum, og det resulterende residuum ble oppløst i 100 ml etylacetat. Løsningen ble ekstrahert etter hverandre med 10 0 ml mettet NAHC03 og 100 ml mettet NaCl, tørket over magnesiumsulfat og konsentrert i vakuum. Den resulterende ubehandlede dipep-tidester ble renset på en 4 x 20 cm kiselgelkolonne med en metanoltrinngradient i kloroform som inneholdt 10 dråper NH4OH pr. 100 ml (2 1 1% metanol i kloroform, etterfulgt av 3 12% metanol i kloroform) . Fraksjoner (25 ml) ble oppsamlet, undersøkt ved hjelp av TLC, og de fraksjoner som inneholdt produktet, ble slått sammen, og løsningsmidlet ble fjernet i vakuum. Det resulterende produkt, Na<->BOC-Ng<->Tos-S-homoargininylglycin-benzylester, ble isolert som et hvitt skum (3,9 g).

For Hirulog-18b og -18c var ovennevnte reaksjon identisk, med unntagelse for følgende modifikasjoner: For Hirulog-18b ble glycinbenzylesteren erstattet med prolinbenzylester, og reaksjonen ble utført i en 1,8 mmol skala. For Hirulog-18c ble glycinbenzylesteren erstattet med valinbenzylester, og reaksjonen ble utført i en 3,0 mmol skala.

KT-BOC-lSP-Tos-6-homoargininylglycin

Ovennevnte benzylester ble oppløst i 50 ml metanol og hydrogenert ved atmosfærisk trykk over 1,0 g 10% palladium/karbon i 17 t. Den resulterende løsning ble filtrert gjennom celitt, og løsningsmidlet ble fjernet i vakuum. Reaksjonen gav 2,9 g ubehandlet Na<->B0C-N<3->Tos-S-homoargininylglycin, som ble renset på en Vydac C18-HPLC-kolonne som beskrevet ovenfor.

Ovennevnte N^BOC-ISF-Tos-S-homoargininylglycin (1,02 g) ble oppløst i 1 ml vannfritt DMF og avkjølt i et isbad. Vi tilsatte deretter til denne løsning etter hverandre 5,5 ml 0,5 M hydroksybenztriazol i DMF (Applied Biosystems Inc, Foster City, CA) og 5,5 ml 0,5 M dicykloheksylkarbodiimid i CH2C12 (Applied Biosystems) . Etter 1 time ble den kalde suspensjon av symmetrisk anhydrid i dipeptidenheten raskt filtrert gjennom en dott med glassull for å fjerne dicykloheksyl-urinstoffet.

I mellomtiden ble en suspensjon av N-BOC- (Gly) 4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-O-PAM (0,2 mmoli CH2C12) aktivert ved standard peptidsyntesemetoder. En Kaiser-test på det resulterende produkt indikerte en fri endestilt aminogruppe.

Det aktiverte S-homoarginylglycindipeptid ble deretter koblet til det resinbundne heksadekapeptid. Det resulterende oktadekapeptid ble deretter koblet etter hverandre med N-BOC-Pro og N-BOC-(D-Phe) idet man anvendte standard koblingsmetoder. Det resulterende peptid, Hirulog-18a, ble renset og karakterisert som beskrevet i eksempel 4.

En lignende prosedyre ble utført for syntesen av Hirulog-18b og Hirulog 18c.

Eksempel 22

Syntese av Hirulog- 19

Hirulog-19 har formelen: H- (D-Phe)-Pro-Arg- [p_siCH2NH] -

(Gly) 5-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Restene 4-20 av dette peptid ble sammensatt ved fastfase-peptidsyntetiske prosedyrer som beskrevet i eksempel 4. Den neste rest som ble tilsatt, N^-BOC-ISP-tosyl-argininal, ble fremstilt som avbildet og beskrevet nedenfor.

Na<->BOC-N<9->Tos-Argininal

ISP-BOC-ISF-Tos-arginin (Bachem Inc.; 10 g) ble tilsatt til 80 ml vannfritt THF, og suspensjonen ble avkjølt til 0-5°C. Vi tilsatte deretter 1, 1'-karbonyldiimidazol (Aldrich; 3,61g), alt på en gang, og fortsatte omrøringen i 20 minutter. Den resulterende klare løsning ble satt delvis ned i et tørris/aceton-bad for å opprettholde en temperatur på -20° til -30°C under den dråpevise tilsetning av en suspensjon av litiumaluminiumhydrid (Aldrich; 1,8 g i 80 ml THF) i løpet av 45 minutter med konstant omrøring. Blandingen ble omrørt i ytterligere 30 minutter ved -20°C, og den ble så kvalt ved dråpevis tilsetning av 63 ml 2N HC1 ved - 10°C. Vi filtrerte den resulterende løsning gjennom en middels sinterglasstrakt og konsentrerte det resulterende filtrat i vakuum.

Det resulterende ubehandlede aldehyd, gjenvunnet som et hvitt skum (11,5 g) , ble suspendert i 100 ml kloroform, vasket med vann (2 x 50 ml) , og det organiske sjikt ble deretter tørket over natriumsulfat og konsentrert i vakuum. Det ubehandlede aldehyd (7,7 g) , ble oppøst i 100 ml kloroform og renset ved flashkromatografi over en 5 x 20 cm flashkolonne som inneholdt 350 ml kiselgel (Merck Grade 60, 230-400 mesh, 60 Å) . Eluering ble oppnådd med en trinngradient på 0,5% metanol i 500 ml kloroform, 1% metanol i 1 1 kloroform og 1,5% metanol ill kloroform. Denne fremgangsmåte gav 8,9 g Na<->B0C-N<9->Tos-argininal.

N^-BOC-NS-Tos-argininal (258 ml) ble deretter tilsatt til den resinbundne (Gly) 5-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-O-PAM under fastfase reduktive alkylerings-betingelser (40 mg natriumcyanoborhydrid i 24 timer) under anvendelse av fremgangsmåten beskrevet av D. H. Coy et al., "Solid-Phase Synthesis of Peptides" i Peptides, Vol. 8, s. 119-121 (1978). Etter omsetning av det resinbundne peptid med det beskyttede argininal ble peptidsyntesen sluttført med en cyklus av BOC-prolin-innlemming og en cyklus av BOC-(D-fenylalanin)-innlemming. Etter at syntesen var fullstendig, ble Hirulog-19 avblokkert og avkoblet fra resinet som beskrevet i eksempel 4.

Hirulog 19 ble renset ved reversfase-HPLC under anvendelse av et Applied Biosystems 151A væskekromatografisk system og en Aquapore C8-kolonne (10 x 22 cm) . Kolonnen ble ekvilibrert i 1 del 70% acetonitril/30% vann inneholdende 0,85% TFA (Buffer B) og 4 deler vann inneholdende 1% TFA (Buffer A). Kolonnen ble fremkalt med en lineær gradient med økende Buffer B-konsentrasjon (20-50%) i løpet av 120 minutter ved en strømningshastighet av 4,0 ml/min. Den utkommende strøm ble overvåket med hensyn til absorpsjon ved 214 nm, og fraksjoner ble oppsamlet manuelt. Ytterligere rensing ble utført under isokratiske betingelser under anvendelse av 20% Buffer B/80% Buffer A.

Eksempel 23

Syntese av Hiruloq- 21

Hirulog-21 har formelen: H-(D-Phe)-Pro-Arg-Pro-(Gly) 4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu- (Gly) 2-Lys-0H. Hirulog-21 ble syntetisert ved hjelp av metoder beskrevet i eksempel 4, under anvendelse av de egnede BOC-aminosyrer. Rensing og karakterisering av Hirulog-21 ble oppnådd ved metodene beskrevet i eksempel 4.

Eksempel 24

Syntese av Hirulog- 25

Hirulog-25 har formelen: H-(D-Phe)-Pro-Arg-Pro-(4-Argi-ninyl-2, 2-dif luor) malonylglycyl- (Gly) 4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Heksadekapeptidet, (Gly)4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu, ble syntetisert som beskrevet tidligere og fikk være bundet til resinet. Den neste rest, (3-Argininyl-2,2-difluor)malonyl-glycin, syntetiseres i reaksjonsskjemaet som er avbildet og beskrevet nedenfor.

1- r( 2'- Karboetoksv- 1'. 1'- difluor) etvll

Na<->BOC-N°<rn->benzyl-N°<rn->Cbz-ornitinol

En løsning av 3,1 g (7,1 mmol) Na<->BOC-N<orn->benzyl-Norn-Cbz-ornitinal [F. Salituro et al, "Inhibition of Aspartic Proteinases By Peptides Containing Lysine and Onithine Side Chain Analogues of Statine", J. Med. Chem., 30, s. 286-95

(1987)], og 1,56 ml (9,23 mmol) etylbromdifluoracetat i vannfritt 15 ml THF ble tilsatt i løpet av 90 minutter til en tilbakeløpsoppvarmet suspensjon av 786 mg Zn-pulver (Fluka) i 15 ml THF under argon. Etter 4 timer med oppvar-ming under tilbakeløp og 2 timer ved værelsestemperatur, ble blandingen avkjølt og fordelt mellom 2 00 ml etylacetat og 200 ml mettet NaCl/KFS04. Den organiske fase ble isolert, tørket over magnesiumsulfat og konsentrert i vakuum. Det resulterende oljeaktige residuum ble renset på kiselgel, under anvendelse av CHC13:metanol (90:10) pluss 100 dråper/l NH4OH som elueringsmiddel.

1- r( 2'- Karboetoksv- 1'. 1'- difluor) etvll

Na<->BOC-ornitinol-tert-butyldimetylsilyl-eter

Den resulterende forbindelse, 1-[(2'-karboetoksy-1'-1'-dif luor) etyl]N<a->BOC-N<orn->benzyl-N<orn->Cbz-ornitinol, omsettes deretter med 5 ekvivalenter tert-butyldimetylsilylklorid og 10 ekvivalenter imidazol i vannfritt DMF ved 35°C, ifølge fremgangsmåten beskrevet av E. J. Corey et al., "Protection of Hydroxyl Groups as tertBut<y>ldimetylsilyl Derivatives", J. Amer. Chem. Soc., 94. s. 6190-91, (1972)]. Det ortogonalt beskyttede amin oppløses deretter i metanol og hydrogeneres over Pd(0H)2 ved 2 Atm i 18 timer. Katalysatoren fjernes deretter ved filtrering, og filtratet konsentreres i vakuum, hvilket gir 1-[(2'-karboetoksy-1'-1'-difluor)-etyl] Ng-BOC-ornitinol- tert-butyldimetylsilyl-eter.

1- r( 2 '- Karboetoksv- 1'. 1'- difluor) etvll

IST-BOC-ftF-Tos-argininol- tert-butyldimetylsilyl -eter

Den ovenfor fremstilte forbindelse omsettes deretter med 6,8 ekvivalenter av både l-guanyl-3,5-dimetylpyrazol og trietylamin i vann ved 105°C i 24 timer. Blandingen lyofi-liseres, og residuet underkastes preparativ HPLC som beskrevet i eksempel 4. Fraksjoner som inneholder den ønskede guanidinium-forbindelse (undersøkt ved TLC) slås sammen og tørkes i vakuum. Residuet oppløses i H20:aceton (1:4), avkjøles på et isbad og innstilles til pH 12 med 50% W7V NaOH. Til denne løsning tilsetter vi en løsning av 3 ekvivalenter paratoluen-sulfonylklorid i aceton i løpet av 60 minutter, mens pH-verdien holdes på 11-12 med NaOH. Løsningen får oppvarmes til værelsestemperatur og omrøres over natten. Acetonet fjernes deretter i vakuum, og den gjenværende vandige løsning vaskes med eter. Etersjiktet fjernes og tilbakeekstraheres med mettet NaHC03. De vandige faser slås sammen og surgjøres til pH 3 med 2 N HC1. Den resulterende sure løsning ekstraheres to ganger med etylacetat, tørkes og konsentreres i vakuum for å gi det ønskede produkt.

1- f( 2'- Karboksv- 1', 1'- difluor) etvll

N^BOC-NS<->Tos-argininol

Den resulterende forbindelse, 1-[(2'-karboetoksy-1'-1'-dif luor) etyl] N^BOC-ISF-Tos - arqininol - tert -butyldimetylsilyl - eter, desilyleres ved behandling med 3 ekvivalenter tetra-n-butylammoniumfluorid i THF ved værelsestemperatur, som beskrevet i E. J. Corey et al., ovenfor. Forbindelsen som er fremstilt ved denne fremgangsmåte, forsåpes deretter ved behandlig med 2,5 ekvivalenter av LiOH i metanol/vann ved værelsestemperatur over natten under argon. Reaksjonsblandingen vaskes deretter med etylacetat og surgjøres med sitronsyre til pH 4. Vi ekstraherer den resulterende syre i etylacetat, tørker den organiske fase og konsentrerer den i vakuum. Den ubehandlede syre renses deretter på en Vydac '-18

reversfase HPLC-kolonne under betingelsene som er beskrevet i eksempel 4.

1- f( 2'- Karboksv- 1', 1'- difluor) etvll

N^BOC-KF-Tos-argininon

Alkoholfunksjonen i ovennevnte forbindelse omdannes til ketonet ved tilsetning av en ekvivalent pyridiniumdikromat i CH2C12 som inneholder 0,5% iseddik, i nærvær av molekylsikt [N. Peet et al., "Synthesis of Peptidyl and Fluoro-methyl Ketones and Peptidyl a-Keto Esters as Inhibitors of Porcine Pancreatic Elastase, Human Neutrophil Elastase, and Rat and Human Neutrophil Cathepsin G", J. Med. Chem., 33, s.394-407 (1990)]. Etter omrøring under argon i 15 timer filtreres reaksjonsblandingen, og løsningsmidlet fjernes i vakuum. Det resulterende 1-[(2'-karboksy-1'-1'-difluor)-etyl] IST-BOC-lSF-Tos-argininon erholdes som en oljeaktig rest, og den renses deretter på HPLC i henhold til betingelsene beskrevet i eksempel 4.

Den frie karboksylsyre omdannes til det symmetriske anhydrid og omsettes med harpiksbundet heksadekapeptid som beskrevet i eksempel 21. De to N-terminale rester av Hirulog-25, BOC-Pro og BOC-(D-Phe), tilsettes under standard peptidsyntesebetingelser, og det resulterende peptid spaltes deretter med HF.

Eksempel 25

Syntese av Hiruloq- 26

Hirulog-26 har formelen: H-(D-Phe)-Pro-Argoksopropionyl-glycyl- (Gly) 4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Heksadekapeptidet, (Gly) 4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu, ble syntetisert som beskrevet tidligere og fikk forbli bundet til resinet. Den neste rest, Na<->BOC-Argoksopropionylglycin, syntetiseres ved reaksjons-

skjemaet som er avbildet og beskrevet nedenfor.

3- ( Cbz- amino) - 2- okso- 3- { 3- T ( Ng- Tos) guanidinyll propyl}-ditertbutylmalonat

Vi fremstilte en sats med N^-Cbz-N^Tos-arginindiazometyl-keton på samme måte som i fremstillingen av JT-BOC-lSP-Tos-arginindiazometylketon beskrevet i eksempel 21, med unntagelse av substitusjonen av N^-Cbz-lSP-Tos-arginin for N°-BOC-N<3->Tos-arginin. Vi oppløste 4,5 mg N°-Cbz-Ng<->Tos-arginindia-zometylketon i 200 ml CH2C12 i en kolbe og avkjølte løsnin-gen til -70°C i et tørris/acetonbad med omrøring. Vannfri HBr-gass ble deretter boblet gjennom løsningen med moderat strømningshastighet i 15 minutter. Løsningen ble omrørt i ytterligere 15 minutter ved -70°C og deretter konsentrert i vakuum. Det resulterende produkt, Na<->Cbz-N<9->Tos-Arg-C0CH2Br, ble gjenvunnet som 5,0 g gule krystaller.

I mellomtiden ble en suspensjon av natriumhydrid (36 mg; 80% dispersjon i olje) i 1 ml DMF og 1,2 ml heksametylfos-foramid ("HMPA") tilsatt til en oppløsning av 259 mg di tert-butoksy-malonat i 4 ml DMF. Blandingen ble omrørt ved værelsestemperatur i 40 minutter og ble deretter tilsatt dråpevis, i løpet av 20 minutter, til en oppløsning av 1 mmol N^Cbz-^-Tos-Arg-COCT^Br i 1 ml DNF/0,13 ml HMPA. Reaksjonen fikk fortsette i 3 timer, og etter denne tid ble oppløsningen helt i 50 ml vann og ekstrahert med 2 x 50 ml etylacetat. Den organiske fase ble isolert, tørket og konsentrert i vakuum til et oljeaktig residuum. Residuet ble deretter renset på en 3 x 10 cm kiselgelkolonne som ble eluert etter hverandre med 400 ml 5% aceton i kloroform, 400 ml 10% aceton i kloroform og 200 ml 20% aceton i kloroform. Frak-sjonene (25 ml) ble oppsamlet og undersøkt ved TLC. Frak-sjoner som inneholdt det ønskede produkt, ble slått sammen og konsentrert, hvilket gav 3-(Cbz-amino)-2-okso-3- {3- [ (N"-Tos) guanidinyl] propyl} -di- tert-butylmalonat.

5- (Na-Cbz-amino) -4-okso-5- {3- [ (N3-Tos) guanidinyl] propyl}

pentanoylglycin-benzylester

Ovennevnte di-tert-butylester omrøres i 1,2 ekvivalenter IN HC1 i 2 timer ved værelsestemperatur. Den dekarboksy-leres i overskudd av pyridin ved 100°C i 15 minutter. Løsningsmidlet fjernes deretter i vakuum, og residuet renses ved kiselgelkromatografi som beskrevet ovenfor. Den resulterende karboksylsyre acyleres med glycinbenzylester i henhold til fremgangsmåten beskrevet i eksempel 21.

5-(amino)-4-okso-5-{3- [ (NS-Tos)guanidinyl]propyl} pentanoylglycin

Den resulterende ester oppløses i 500 ml metanol og hydrogeneres over natten ved 1 atm hydrogengass over 600 ml 10% palladium-karbon-katalysator. Reaksjonsblandingen filtreres gjennom celitt og konsentreres i vakuum til et fast residuum (155 mg). Den resulterende aminosyre renses deretter ved HPLC, under anvendelse av de betingelser som er beskrevet i eksempel 4.

5- (Na-B0C-amino) -4-okso-5-{3- [KF-Tos)

guanidinyl]propyl}pentanoylglycin

Ovennevnte aminosyre omdannes til sitt tilsvarende BOC-derivat ved å oppløse det i dioksan/vann (2:1, v/v) og å avkjøle til 0°C under omrøring. pH-verdien justeres til 10 med 0,1 N NaOH, og deretter tilsettes 1,1 ekvivalent av di-tert-butyldikarbonat (i dioksan). Blandingen omrøres ved 0°C til 20°C i 4 timer, og den inndampes deretter i vakuum. Residuet fordeles mellom etylacetat/l% sitronsyre (2:1). Den organiske fase isoleres, ekstraheres én gang med 1% sitronsyre og deretter tre ganger med mettet NaCl. Den organiske fase tørkes over magnesiumsulfat, filtreres og konsentreres i vakuum for å gi det BOC-beskyttede produkt.

Det resulterende beskyttede pseudopeptidfrie karboksylat kobles deretter til det resinbundne heksadekapeptid ved hjelp av standard peptidsynteseteknikker. Dette etterfølges av den sekvensielle addisjon av BOC-D-Phe- og BOC-Pro til det resinbundne peptid. Den fullstendige Hirulog-26 spaltes deretter fra harpiksen, avblokkeres og renses som beskrevet i eksempel 4.

Eksempel 26

Syntese av Hirulog- 27

Hirulog-27 har formelen: H-(D-Phe)-Pro-Arg-(CO-CH2)-Pro-(Gly) 4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH.

(Gly) 4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-heksadekapeptidet ble syntetisert som tidligere beskrevet og fikk forbli bundet til resinet. Den resterende del av molekylet ble syntetisert ved reaksjonsskjemaet som er avbildet og beskrevet nedenfor.

N"-Cbz-Ng-Tos-arginin (COCH2) prolinbenzylester

Vi oppløste 720 mg prolinbenzylester (HCl-salt) i 25 ml THF. Denne løsning ble deretter avkjølt til -78°C i et aceton/

tørrisbad med omrøring under argon. Vi tilsatte deretter litium-diisopropylamid (8,0 ml av en 0,75 M heksansuspen-sjon) og rørte i ytterligere 5 minutter. Til dette tilsatte vi 1,08 g N^Cbz-ISF-Tos-argininbrometylketon i 10 ml THF,

fremstilt som beskrevet i eksempel 25, dråpevis i løpet av 20 minutter. Reaksjonen ble omrørt i ytterligere 5 minutter, og løsningen fikk deretter anta værelsestemperatur under omrøring. Vi kvalte reaksjonen ved å tilsette 10 ml mettet NaCl, lot fasene få separere seg og isolerte den organiske fase. Denne fase ble deretter tørket over magnesiumsulfat, filtrert og inndampet i vakuum.

IT-BOC-IP-Tos-arginin (C0CH2) prolin

Den ovennevnte benzylester (1,3 g) ble hydrogenert under anvendelse av palladiumkarbonprosedyren beskrevet i eksempel 25. Det resulterende pseudodipeptid ble BOC-beskyttet ved fremgangsmåten beskrevet i eksempel 25 for å frembringe

det ønskede produkt.

Det rensede, beskyttede pseudodipeptid ble deretter koblet med det resinbundne heksadekapeptid ved standard peptidsynteseteknikker. Hirulog-27 ble avblokkert, spaltet fra resinet og renset ved teknikker beskrevet i eksempel 4.

Eksempel 27

Syntese av Hirulocr- 2 8

Hirulog-28 har formelen: H-(D-Phe)-Pro-Arg- (CH2N)-Pro-(Gly) 4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH.

(Gly) 4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-0-PAM-heksadekapeptidet ble syntetisert som tidligere beskrevet og fikk forbli bundet til resinet. Den resterende del av molekylet ble syntetisert ved reaksjonsskjemaet som er avbildet og beskrevet nedenfor.

ISF-BOC-ISF-Tos-arginin [psiCH2N] ) prolinbenzylester

1 g av knust 3 Å molekylsikt (Aldrich) ble tilsatt til en omrørt oppløsning av 5,25 g prolinbenzylester-fri base (Schweizerhall, Inc.) i 10 ml vannfritt THF og 2 ml vannfri etanol unde argon ved værelsestemeratur. Vi tilsatte 1,45 ml 5 N metanolsk HC1 og 1,5 g N^BOC-ISF-Tos-argininal (fremstilt som beskrevet i eksempel 22) til denne blanding og omrørte i 1 time. En 85 mg porsjon natriumcyanoborhydrid ble tilsatt til blandingen, og deretter en time senere ble en annen 85 mg porsjon natriumcyanoborhydrid tilsatt. Reaksjonen ble omrørt i 20 timer og filtrert. Vi tilsatte 1 ml vann og 0,9 ml 1 N HCl til filtratet under omrøring og konsentrerte deretter løsningen i vakuum, hvilket gav 6,2 g

Na-BO C-N9-Arg [ psiCH-,N] -Pro-benzylester som en klar olje.

Oljen ble ytterligere renset ved flashkromatografi over en 5 cm flashkolonne som inneholdt 350 ml kiselgel (Merck Grade 60, 230-400 mesh, 60 Å) . Produktet ble erholdt ved påhverandre følgende eluering med 0,25%, 0,75% og 1,5% metanol i kloroform.

N^-BOC-N^Tos-arginin (psiCH2N) prolin

Den resulterende benzylester hydrogeneres over palladium-karbon og renses, som beskrevet i eksempel 25. Denne prosess gav 160 mg N^-BOC-ISF-Arg [p_siCH2N] -prolin fri syre, og den ble ytterligere renset ved hjelp av det HPLC-kroma-tografiske system som er beskrevet i eksempel 4, med unntagelse av at elueringen ble oppnådd med et isokratisk 26% Buffer B/74% Buffer A-system, som tidligere er beskrevet i eksempel 22. Det sluttelige utbytte av dipeptid var 86 mg.

Dipeptidet kobles deretter til det resinbundne heksadekapeptid, etterfulgt av en cyklus av BOC-Pro-innlemming og en cyklus av BOC-(D-Phe)-innlemming. Avblokkering, spaltning og rensing av den fullt syntetiserte Hirulog-28 oppnås ved fremgangsmåten beskrevet i eksempel 4.

Eksempel 28

Syntese av Hirulog- 29

Hirulog-29 har formelen: 4-klor-isocoumarino-3-karboksy-etoksy- (Gly) 5-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. (Gly) 5-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-heksadekapeptidet ble syntetisert som tidligere beskrevet og fikk forbli bundet til resinet. 4-klor-isocou-marino-3-karboksyalkoksy-delen ble syntetisert ved reaksjonsskjemaet og metodene beskrevet nedenfor.

Etvl- 2- brom- homoftalat

Vi blandet homoftalsyre (10,0 g), 2-brometanol (21,0 g) og benzen (200 ml). Deretter tilsatte vi 12-15 dråper svovelsyre og oppvarmet under tilbakeløp i 2,5 timer. Løsningen ble derettr filtrert og konsentrert i vakuum. Residuet ble vasket med 250 ml eter/heksan (1:1) og filtrert på en sintret glasstrakt. Det resulterende lysebrune faste stoff ble vakuumtørket og man fikk ca. 15,0 g av produktet.

4- Klor- 3- r2- brometvloksy]- isokumarin

Vi blandet etyl-2-bromhomoftalatet fremstilt som beskrevet ovenfor (4 g) sammen med f osf orpentaklorid (8,2 g) og benzen (100 ml). Blandingen ble oppvarmet under tilbakeløp i 4,5 timer, filtrert varm og inndampet i vakuum. Det rød-brune oljeaktige residuum ble straks kromatografert på en 24 mm x 175 mm kiselgelkolonne med diklormetan som el-uerings-

middel. Fraksjoner på 2 0 ml ble oppsamlet og undersøkt ved TLC. 4-Klor-3-[2-brometyloksy]-isokumarinet eluerte i fraksjonene 2-6. Fraksjonene ble slått sammen, inndampet i vakuum, og det resulterende residuum ble gjenvunnet som en klar, lysegul olje (2,2 g).

4- Klor- 3- r2- oksypropansyre]- isokumarin

4-Klor-3-[2-brometyl]-isokumarinet (1,4 g) fremstilt ovenfor ble oppløst i vannfritt THF og tilsatt direkte til en tilbakeløpende løsning av magnesiumspon (170 mg) og noen få krystaller jod i 15 ml vannfritt THF, som ble omrørt under argon. Blandingen ble oppvarmet under tilbakeløp i 1,5 timer. Den ble deretter helt i et overskudd av tørris i et 400 ml beger. Vi lot blandingen stå ved 20°C inntil over- skuddet av C02 hadde sublimert og tilsatte deretter ca. 100 ml av både dietyleter og THF til blandingen, som produserte en gul oppløsning som inneholdt en stor mengde av en hvit, grovkornet feining.

Vi boblet vannfritt HCl gjennom denne blanding ved 2 0°C, hvilket oppløste det meste av feiningen. Løsningen ble deretter filtrert og inndampet i vakuum for å erholde råproduktet. Dette ble deretter omkrystallisert over natten fra DCM.

Det resulterende 4-klor-3- [3-oksyproponsyre] - isokumarin ble koblet til en glycinbenzylester, og det resulterende produkt ble katalytisk hydrogenert over palladiumkarbon, som beskrevet i eksempel 25. Dette pseudodipeptid ble deretter koblet til det harpiksbundne heksadekapeptid, (Gly) 4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu ved standard peptidsynteseteknikker.

Eksempel 29

Syntese av Hirulog- 3 0

Hirulog-30 har formelen: 4-klor-3-[2-aminoetanol]-isokumarin- (Gly) 5-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu. Heksadekapeptidet, (Gly) 4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu, syntetiseres som tidligere beskrevet og får forbli bundet til resinet.

4-klor-3-[2-aminoetanol]-isokumarin-delen fremstilles ved en fremgangsmåte som er analog med den som er beskrevet i

eksempel 28 for å syntetisere 4-klor-3-[2-brometanol]-isokumarin, unntatt at 2-aminoetanol anvendes istedenfor 2-brometanol i det innledende trinn med å esterifisere homo f t a1syren.

Urinstoffbindingen dannes ved å omsette aminogruppen i 4-klor-3-[2-aminoetanol]-isokumarin med aktiveringsmidlet, karbonyldiimidazol ("CDI"). Det resulterende intermediære imidazolid isoleres ikke, men omsettes med det resinbundne heksdekapeptid for å produsere Hirulog-30. Hirulog-30 avblokkeres deretter, spaltes fra resinet og renses ved teknikkene som er beskrevet i eksempel 4.

Eksempel 3 0

Syntese av Hirulog- 31

Hirulog-31 har formelen: argipidyl-(Gly) S-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Vi syntetiserte heksadekapeptidet, (Gly) 4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu, ved standard peptidsynteseteknikker som tidligere beskrevet og lot peptidet forbli bundet til resinet. Argi-pidylglycin-delen i denne Hirulog syntetiseres ved reaksjonsskjemaet avtegnet og beskrevet nedenfor.

Et dehydro-ISF-nitroargipidin syntetiseres i alt vesentlig ved fremgangsmåten for å syntetisere argipidin, som er beskrevet i US patent nr. 4.258.192. De eneste forskjeller er at guanidiniumgruppen beskyttes med en nitrofunksjon, og den heterocykliske ring i kinolinet forblir umettet. Dette mellomprodukt anvendes til å acylere t-butylglycin ved frem-gangsmåten beskrevet i eksempel 21. t-Butylesteren fjernes ved standard syrehydrolyse-teknikker. Den resulterende frie syre omsettes med heksadekapeptidet ved hjelp av standard koplingsteknikker. Det resulterende peptid avblokkeres, spaltes fra resinet og renses ved teknikker beskrevet i eksempel 4.

Peptidet underkastes deretter hydrogeneringsprosedyrer beskrevet i det nevnte US patent 4.258.192 og renses ved HPLC-teknikken beskrevet i eksempel 4.

Eksempel 31

Syntese av Hirulog- 32

Hirulog-32 har formelen: H- (D-Phe)-Pro-Arg- (Gly) 5-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Hirulog-32 ble syntetisert, renset og karakterisert ved hjelp av metoder beskrevet i eksempel 4, unntatt at BOC-glycin ble anvendt istedenfor BOC-prolin i cyklusen etter de to cykluser med BOC-glycylglycin-addisj on.

Eksempel 32

Syntese av Hitulog- 33

Hirulog-33 har formelen: N-acetyl-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-(Gly) 3-Val-Arg-Pro- (Gly) 4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu- Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Hirulog-33 ble syntetisert, renset og karakterisert ved standard peptidsynteseteknikker anvendt i eksempel 4, med egnede BOC-aminosyresubstitusjoner. CSDM-delen i Hirulog-33 har en aminosyresekvens som er identisk med et segment i fibrinopeptid A-sekvensen av Aa-kjeden i menneskelig fibrinogen.

Eksempel 33

Spaltning av forskjellige Hiruloger ved trombin Hemmingen av trombin ved Hirulog-8 ble funnet å være ubestandig på grunn av langsom spaltning av Arg-Pro-bindingen ved trombin. Etter denne spaltning ble det iaktatt at trombin gjenvant full hydrolytisk aktivitet overfor et kromogent substrat. Derfor ble Hirulog-8 karakterisert som en "langsomsubstratisk" hemmer av trombin.

Spaltningen av Hirulog, såvel som ander hiruloger ifølge denne oppfinnelse, ved menneskelig a-trombin ble vist i

in vitro-undersøkelser. Reaksjonsblandinger som inneholdt menneskelig a-trombin (1,6 nM) og varierende konsentrasjoner av enten Hirulog-8, Hirulog-10, Hitulog-18a, Hirulog-18b,

Hirulog-18c, Hirulog-19, Hirulog-32 eller Hirulog-33 (80 til 160 nM) ble fremstilt i 20 mM Tris-HCl, pH 7,4 som inneholdt 0,1 M NaCl. Alikvoter (0,975 ml) av reaksjons-blandingene ble fjernet til forskjellige tider og blandet i en kuvette med 0,025 ml Spectrozyme TH (11 /xM sluttkonsentrasjon), et kromogent substrat. Reaksjonens begyn-nelses-hastighet ble bestemt, og basert på kontroll-blandinger som

inneholdt trombin i fravær av Hirulog, ble den prosentvise hemming beregnet.

En alternativ metode anvendte reversfase-HPLC-separasjon av alikvoter fra en Hirulog/trombin-reaksjonsblanding. I denne undersøkelse tilsatte vi menneskelig a-trombin (0,25 txM sluttkonsentrasjon) til et reaksjonskar som inneholdt en av de ovennevnte Hiruloger (12,5 /xM sluttkonsentrasjon). Alikvoter (50 /xl) ble tatt ut både før og ved forskjellige tidspunkter etter tilsetningen av trombin. Alikvotene ble enten flash-frosset eller injisert direkte på HPLC-kolonnen. HPLC-systemet anvendte et Applied Biosystems Liquid Chromatography System utstyrt med en Aquapore C8-kolonne

(0,46 x 10 cm) . Kolonnen ble ekvilibrert i 70% løsnings-middel A (0,1% TFA i vann) og 30% løsningsmiddel B (0,085% TFA/70% acetonitril og fremkalt med en lineær gradient av fra 3 0 til 50% løsningsmiddel B i 3 0 minutter ved en strømningshastighet av 1 ml/minutt. Den utkommende strøm ble overvåket ved 214 nm. Peptidkonsentrasjonene ble bestemt ved måling av høyden på prøvetoppene.

Begge de ovennevnte undersøkelser gjør det mulig å bestemme hastigheten av Hirulog-hydrolysen ved trombin (uttrykt i

M/min) og overgangshastigheten (kcat; uttrykt i min"<1>) . Begge metoder frembringer sammenlignbare kcat-verdier, hvilket er vist i tabellen nedenfor.

Som vist ovenfor ble Hirulog-8, Hirulog-10, Hirulog-32 og Hirulog-3 3 spaltet ved trombin med kcat-verdier som varierte fra 0,056 min"<1> (langsom spaltning) til 53 5 min"<1> (hurtig spaltning). I motsetning til dette synes Hirulog-18a, Hirulog-18b, Hirulog-18c og Hirulog-19 å være motstands-dyktige mot trombinspaltning.

Figur 5, områdene A og B, viser en mer detaljert analyse av spaltningen av Hirulog-8 ved trombin. Som avbildet i figur 5, område A, utøvde konsentrasjoner av Hirulog-8 i svakt overskudd over trombin en ubestandig hemmende aktivitet (større enn, eller lik 10 minutter, avhengig av hirulog-konsentrasjonen). Progressivt høyere konsentrasjoner av Hirulog-8 viste forlengede hemmende virkninger. Et lineært forhold mellom varigheten av hemmingen og Hirulog-8-konsentrasjonen er vist i figur 5, område B. Fra disse data beregnet vi overgangstiden, eller koat, til 0,37 min"<1>: Ved rensing og sekvensanalyse av de Hirulog-8-avledede reaksjonsprodukter som fremkom i reaksjonene ovenfor, påviste vi at Hirulog-8 ble langsomt spaltet ved trombin

ved Arg-Pro-bindingen. Dette er et høyst uvanlig spalt-ningssete for serin-proteaser, og vi tror at det er utsatt for spaltning i Hirulog-8 på grunn av peptidets høye affinitet for trombin.

Eksempel 34

Virkningen av koblerlengden

på aktiviteten av Hirulog

Hirulog-8, Hirulog-13, Hirulog-15 og Hirulog-16 er forskjellig fra hverandre bare ved lengden av polyglycindelen i deres respektive koblingssegmenter. For å bestemme hvilken effekt koblerlengden har på aktiviteten, sammenlignet vi hemmingen av menneskelig a-trombin på hver av disse Hiruloger. Følgende tabell angir koblerlengden på hver av disse Hiruloger.

Antitrombinaktivitetene av disse Hiruloger ble målt vedrø-rende trombinkatalysert hydrolyse av Spectrozym TH hovedsakelig som beskrevet i eksempel 9. Figur 6 avbilder forholdet mellom koblerlengden og Kx for Hirulog-hemming av denne trombinkatalyserte reaksjon. Denne figur viser at Hirulog-8, Hirulog-15 og Hirulog-16 har sammenlignbare hemmende aktiviteter, mens Hirulog-13, med en 18Å koblerlengde, har en aktivitet som er redusert til mindre enn 1/10. Dette bekrefter at koblerlengder på >18Å og <42Å ikke påvirker Hirulogaktiviteten. Selv om patentsøkerne ikke ønsker å være bundet av teori, tror de at dette skyldes det faktum at Hirulog-kobleren er like uordentlig når den er fri i løsning som når den er bundet til trombin. Søkerne tror også at det er lite samarbeide mellom CSDM- og ABEAM-delene av trombinhemmerne i bindingen til trombin ifølge denne oppfinnelse.

Eksempel 35

Hemming av trombinkatalysert

hydrolyse ved forskjellige Hiruloger

Vi sammenlignet den hemmende aktivitet av forskjellige trombinhemmere fremstilt ifølge foreliggende oppfinnnelse på trombinkatalysert hydrolyse av et tripeptidyl-p-nitro-anilidsubstrat. Antitrombinaktivitetene av Hirulog-10, Hirulog-18a, Hirulog-18b, Hirulog-18c, Hirulog-19, Hirulog-32 og Hirulog-33 ble undersøkt ved metoden beskrevet i eksempel 9, under anvendelse av Spectrozyme TH som substrat. Tabellen nedenfor viser de beregnede K:-verdier samt Pj^-Pj^'-sekvensen, for hver av disse trombinhemmere.

Som angitt ovenfor var Hirulog-10 og Hirulog-32 dårlige hemmere av trombinkatalysert hydrolyse av Spectrozyme TH. Dette var i samsvar med det faktum at hver av disse hemmere ble hurtig spaltet av trombin ved Pj;-Pi' -bindingen. I Hirulog-19, hvor denne binding ble redusert til psiCH?-NH-koblingen og gjort ikke-spaltbar ved trombin, ble det iakttatt effektiv hemming av trombinhydrolyse.

Studiene med £-homoarginin-holdige inhibitorer (Hirulogene 18a, -18b og -18c) viste at dette aminosyrederivat kan erstatte arginin i hemmerne fremstilt ifølge denne oppfinnelse uten å ha innflydelse på aktiviteten. Videre viser dette at er-statning av amidbidingen med en metylengruppe ikke reduserer i særlig grad trombinets hemmende aktivitet. Den 30- til 50-foldige økningen av Kx for Hirulog-18c, sammenlignet med henholdsvis Hirulog-18a og Hirulog-18b, antyder at strukturen for P'i-aminosyren er viktig når det gjelder hemmende aktivitet. Uten å ønske å være bundet av teorien, tror søkerne at nærvær av phi-psi-vinklene i P'<1->aminosyren (Gly i Hirulog-18a; Pro i Hirulog-18b) samt strukturmessig bundethet (som forårsakes av prolinet i Hirulog-18b) bidrar til kraften av hemmerne fremstilt ifølge denne oppfinnelse. En alter-nativ mulighet er at den S-forgrenede sidekjede i P'<1->aminosyren Val i Hirulog-18c kan svekke bindingen av CSDM-delen av det molekyl til det trombinreaktive senter på grunn av steriske betraktninger.

Eksempel 36

Binding av Hirulog-8 til

det aktive sete i trombin Diisopropylfluorfosfat (DFP) er en velkjent hemmer av serinproteaser, inklusive trombin, som virker ved kovalent å modifisere heksylgruppen i Ser-195. Vi tilsatte et 270-foldig overskudd av <14>C-DFPtil trombin, i 0,1 M natriumborat, pH 8,0. Etter 10 minutters reaksjon ble dannelse av et trombinkompleks vist ved SDS-PAGE og fluorografiske analyser (figur 7, bane 1) . Når reaksjonen ble utført i nærvær av Sulfo-Tyr63-N-acetyl-hirudin53.64 (ved 300- og 3000-foldig molart overskudd over trombin) , ble modifikasjonen av trombin ved [14C] -DFP ikke forandret signifikant (figur 7, banene 4 og 5). Men da vi utførte reaksjonen i nærvær av Hirulog-8 (ved 3- eller 3 0-foldig molart overskudd over trombin) , ble innlemmingen av [14C] -DFP inn i det trombinkatalyserte sete fullstendig blokkert (figur 7, banene 2 og 3) . Disse data viser at CSDM i trombinhemmerne fremstilt

ifølge denne oppfinnelse er i stand til å bindes til det katalytiske sete i trombin og hemme katalytisk aktivitet.

Eksempel 3 7

Sammenligning av antitrombinsk aktivitet

av Hirulog-8 og et syntetisk katalytisk seterettet pentapeptid ( D- Phe- Pro- Arg- Pro- Gly

Som vist i figur 1 var Hirulog-8, i motsetning til den anionbindende utadrettede seteassosierende enhet Sulfo-Tyr63-N-acetyl-hirudin53_64, som er en bestanddel av den, i stand til å hemme trobinkatalysert hydrolyse av små p_-nitroanilidsubstrater. På lignende måte har vi undersøkt et (D-Phe)-Pro-Arg-Pro-Gly-pentapeptids evne til å hemme trombinkatalytisk reaktivitet.

Pentapeptidet ble syntetisert som beskrevet i eksempel 4 under anvendelse av et BOC-lysin-divinylbenzenresin. Pentapeptidet ble renset og karakterisert som beskrevet i eksempel 4.

Virkningene av både Hirulog-8 og dette pentapeptid overfor trombinkatalysert hydrolyse av Spectrozyme TH ble undersøkt som beskrevet i eksempel 9, under anvendelse av fastsatte peptidkonsentrasjoner på henholdsvis 50 nM eller 10 /xM. Våre resultater viser at mens nanomolare konsentrasjoner av Hirulog-8 kan hemme den trombinkatalyserte reaksjon, har konsentrasjoner av pentapeptid så høye som 10 fiM ingen signifikant effekt på den trombinkatalyserte hastighet. Disse data viser at CSDM-komponenten i trombinhemmerne fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse er i seg selv bare en svak hemmer av trombinets katalytiske funksjon.

Eksempel 3 8

In vivo antikoagulerende aktivitet av Hiruloq- 8

Vi bestemte den in vivo-antikoagulerende aktivitet av Hirulog-8 etter intravenøs administrasjon av dette peptid til bavianer. Vi anvendte forskjellige doseringer av Hirulog-8 varierende fra 0,002 til 0,2 mg/kg/min. Bavianer (hanner, 10-15 kg) ble beroliget med ketamin-hydroklorid før administrering av Hirulog-8. Helblod fra behandlede dyr og kontrolldyr ble fjernet fra et kateter plassert i den femorale åre og oppsamlet i 3,8% natriumsitrat (9:1; blod: natriumsitrat). Plasma ble erholdt ved standardmetoder, og APTT ble nedtegnet ved metoder beskrevet i eksempel 10. Som vist i figur 8, gav Hirulog-8 en doseavhengig økning i APTT-verdien. En 200% økning i APTT-verdien (betraktet som terapeutisk område) ble oppnådd med den laveste Hirulogdose (infusjon 0,002 mg/kg/min).

Eksempel 39

Hemming av koaqulat- bundet trombin ved Hirulog- 8

Det er kjent at trombin kan bindes til et fibrinkoagulat, og når det først er absorbert, fortsetter det å spalte ytter- ligere fibrinogen, hvilket resulterer i vekst av koagulatet. Koagulatbundet trombin har vist seg å være motstandsdyktig overfor nøytralisasjon ved heparin-antitrombin II-komplekset [P. J. Hogg et al., "Fibrin Monomer Protects Thrombin From Inactivation By Heparin-Antithrombin III: Implications for Heparin Efficacy", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 86, s. 3619-23 (1989)], men det kan hemmes ved antitrombin III-uavhengige hemmere, såsom PPACK, hirudin eller Sulf o-Tyr63-N-acetyl-hirudin53.64 . Koagulatbundet trombin antas å spille en rolle i trombetilvekst og i gjendannelse av trombose etter trombolytisk terapi.

Vi sammenlignet Hirulog-8s og heparinets evne til å hemme koagulatbundet trombin og anvendte metoden beskrevet av J. I. Weitz et al., "Clot-Bound Thrombin Is Protected from Heparin Inhibition -- A Potential Mechanism for Rethrom-bosis After Lytic Therapy", Blood, 74, s. 136a, (1989).

En klinisk relevant dose av heparin (0,1 U/ml) hemmet fibrinopeptid A (FPA)-frigivelse katalysert av løselig trombin med tilnærmelsesvis 70%. En lignende dose hadde imidlertid ingen virkning på FPA-frigivelsen katalysert av koagulatbundet trombin. I motsetning til dette hadde Hirulog-8 en nesten identisk hemmende effekt på FPA-frigivelsen katalysert ved enten løselig eller koagulat-bundet trombin (figur 9).

Denne undersøkelse viste at Hirulog-8, såvelsom de andre trombinhemmere ifølge denne oppfinnelse, er mer effektive enn nåværende medisiner når det gjelder å blokkere trombe-aggregasjon, å øke hastigheten for trombolytisk reperfusjon og å forhindre gjendannelse av tromber etter trombolytisk behandling.

Eksempel 40

Virkningen av Hirulog-8 på in vivo blodplateavhengiq trombose

Fordi bavianer er kjent for å ha lignende koagulering og hemostatiske responser som mennesket, anvendte vi en bavianmodell for å bestemme Hirulog-8's evne til å avbryte blodplateavhengig trombose. Nærmere bestemt plasserte vi forskjellige trombogene overflater i en permanent utvendig AV-omløpsledning i dyrene. Disse overflater omfattet segmenter av ende-arterektomisert bavianaorta, kollagen-belagt silastisk slangemateriale, kollagenbelagt vaskulær innpodning av "Gortex" og "Dacron". Etter plassering av omløpsledningen ble overflatene utsatt for naturlig strøm-mende blod for å frembringe trombedannelse. Vi målte dannelsen av tromber over en periode på 60 minutter ved å overvåke avsondringen av blodplater på den trombogene overflate. Disse målinger ble nedtegnet ved ytre gamma-kameraavbildning etter pre-infusjon av forsøksdyret med autologe 1:L1In-merkede blodplater.

Plassering av et 5 cm segment segment av ende-arterektomisert bavianaorta i den utvendig plasserte AV-omløpsledn-ing i fravær av Hirulog-8 førte til en tidsavhengig avlei-ring av blodplater. Denne oppsamling nådde et platå i løpet av 60 minutter, og ved dette tidspunkt ble det funnet en samlet mengde av 14,0 + 5,0 x 10<8> blodplater avleiret på det ende-arterektomiserte segment. Doser på 0,002 og 0,01 mg/kg/min av Hirulog-8 hemmet blodplateutsondringen med henholdsvis 53,6% og 75,5%. Disse resultater er avbildet i figur 10. ED50-verdien for Hirulog-8 (den dose som er nødvendig for å redusere blodplateutsondringen med 50%) i dette system var 0,002 mg/kg/min.

Da vi plasserte 5 cm segmenter av kollagenbelagt silastisk slangemateriale i AV-omløpsledningen, ble 12,6 + 5,0 x IO<8 >blodplater/cm avleiret etter 60 minutter i fravær av Hirulog-8. Administrasjon av Hirulog-8 resulterte i en doseavhengig hemming av blodplateavleiringen. En dosering på 0,04 mg/kg/min av Hirulog-8 hemmet fullstendig blodplateavleiringen. Resultatene av denne del av eksperimentet er angitt i figur 11. ED50-verdien for Hirulog-8 i dette system ble beregnet å være 0,004 mg/kg/min.

Både kollagenbelagte vaskulære innpodninger av "Gortex" eller "Dacron" er kjent for å være mer trombogene enn silastisk slangemateriale. En totalmengde på 3 5,0 + 6,0 x IO<8> ble avleiret på "Gortex"-røret etter en 60 minutters eksponering for naturlig blod i fravær av Hirulog-8. Vi fant at Hirulog-8 igjen viste en doseavhengig antitrom-bevirkning overfor dannelse av blodplatetromber. En dose på 0,2 mg/kg/min Hirulog-8 forårsaket 62,9% hemming av blod-plateavleiring. ED50-verdien for Hirulog-8 i Gortex-systemet var 0,135 mg/kg/min. Et lignende resultat ble erholdt for Dacron-inpodninger. Den høyere dosering av Hirulog-8 som var nødvendig for å hemme blodplateutsondringen på disse to overflater, var å vente på grunn av deres høye trombogene aktivitet.

Vi bestemte også virkningen av Hirulog-8 overfor blodplateavhengig trombedannelse både ved høy og lav skjærkraft, idet vi anvendte en tokammeranordning som muliggjorde simultane målinger av begge skjærkraftbetingelser. Anord-ningen var sammensatt av et 2 cm segment av kollagen-belagt "Cortex", etterfulgt av 2 cm segmenter med utvidet diameter. Med denne anordning ble trombedannelsen initiert ved eksponering for naturlig flytende blod på et segment av det kollagenbelagte Gortex-rør ved høy skjærkraft. Denne del av den eksperimentelle fremgangsmåte simulerte arterielignende betingelser. Da blodet kom inn i segmentene med den utvide-de diameter, ble vortex-betingelser med lav skjærkraft opprettholdt, hvorved venøs trombose ble simulert. I kontrolldyr samlet det seg opp totalt henholdsvis 9,3 + 2,3 x IO<8> og

6,1 + 0,5 x IO<8> blodplater/cm etter 4 0 minutter i segmentene med høy og lav skjærkraft. Hirulog-8 hemmet blodplate-avleiring i både høy- og lavskjærkraft-segmenter på en doseavhengig måte. En dose på 0,5 mg/kg/min hemmet blod-plateoppsamling med 42,6% ved lav skjærkraft og med 29,0% ved høy skjærkraft.

Eksempel 41

Sammenligning av Hirulog-8 med andre antitrombotiske midler når det gjelder å hemme akutt blodplateavhengig trombose

Vi undersøkte virkningen av heparin, lavmolekylært heparin og rekombinant hirudin på blodplateavleiringen i den kollagenbelagte silastiske rørledningen/ytre AV-omløpsled-ning i bavianmodellen beskrevet i eksempel 40.

Det er tidligere blitt vist at heparin administrert som en 160 U/kg bolusinjeksjon etterfulgt av en 160 U/kg/t infusjon hemmet blodplateavleiringen til et nivå på ca. 8 0% av hva som var iakttatt i et saltvannbehandlet kontrolldyr. Lav-molekylært heparin, gitt som bolus-injeksjon på 53 anti-Xa U/kg, etterfulgt av infusjon ved 53 anti-Xa U/kg/t, gav lignende resultater. [Y. Cadroy, "In Vivo Mechanism of Thrombus Formation. Studies Using a Primate Model", Doc-toral Thesis, L'Universite Paul Sabatier de Toulouse

(Sciences)

(1989)]. Ved ekvivalente molare doser (5 nmol/kg/min), rekombinant hirudin [A. B. Kelley et al., "Recombinant Hirudin Interruption of Platelet-Dependent Thrombus Formation", Circulation, 78, s. 11-311 (1989)] hemmet begge blodplateavhengig trombedannelse med 60-70% sammenlignet med kontrollen. Disse resultater er avbildet i figur 12. Andre trombinhemmere er tidligere blitt undersøkt i bavianmodellen [A. B. Kelley et al., "Comparison of Antithrombotic and Antihemostatic Effects Produced by Antithrombins in Primate Models of Arterial Thrombosis", Thromb. and Hemostas., 62, s. 42 (1989)]. De rapporterte ED50-doser av disse midler på kollagenbelagte overflater, samt våre ED50-bestemmelser, er oppsummert i tabellen nedenfor.

Eksempel 42

Virkningen av Hirulog- 8 på fibrinavsondringen

Vi målte virkningen av Hirulog-8 på avleiringen av fibrinogen) i trombene som var dannet i det ende-arterekto-meriserte aortiske og kollagenbelagte silastiske rørseg-ment-modellsystem beskrevet i eksempel 40. Fibrinavleiringen ble bestemt ved måling av 125I-f ibrin (ogen) 3 0 dager etter at i:L1In-blodplateundersøkelsen som er beskrevet ovenfor, var sluttført. Dette gjorde at 111 - In-isotopen kunne nedbrytes til et ikke-forstyrrende nivå.

Figur 13 viser at i fravær av Hirulog-8 ble 0,17 mg/cm fibrin avleiret på det kollagenbelagte rørmateriale etter 60 minutters eksponering for flytende blod beskrevet i eksempel 40. Doser på 0,01 og 0,04 mg/kg/min hemmet fullstendig fibrin(ogen)-avleiring. Lignende resultater ble erholdt med den ende-arterektomiserte aortiske segment-modell. Disse resultater viser at trombinhemmerne fremstilt ifølge denne oppfinnelse er effektive når det gjelder å redusere fibrin(ogen)-avleiringer forbundet med en trombe, samt å blokkere akutt blodplateavhengig trombedannelse.

Eksempel 43

Måling av klareringstiden for Hirulog- 8

Vi anvendte en bavianmodell for å bestemme klareringstidene for Hirulog-8 etter intravenøs infusjon, intravenøs engangsbolusinjeksjon og subkutan engangsbolusinjeksjon. APTT-undersøkelser, utført som beskrevet i eksempel 11, ble anvendt for å overvåke klareringstidene.

Vi administrerte forskjellige doseringer av Hirulog-8 (0,002-0,2 mg/kg/min) til bavianer via systemisk intravenøs infusjon, over en periode på 60 minutter. APTT ble målt etter den 60 minutter lange infusjon og ved forskjellige tidsintervaller deretter. Vi beregnet at den gjennomsnitt-lige halveringstid for Hirulog-8-klarering var 9,2 + 3,3 minutter.

For å bestemme klareringstiden etter en engangsbolus-injeksjon, injiserte vi bavianer med en dose på 1 mg/kg Hirulog-8 intravenøst eller subkutant. APTT-målinger ble gjort ved forskjellige tidsintervaller etter injeksjonen. Figur 14 viser at APTT økte til en topp på 570% av kontroll-verdien 2 minutter etter intravenøs injeksjon. Halveringstiden for Hirulog-8 etter intravenøs injeksjon var 14 minutter. Figur 15 viser at ved det tidligste tidspukt etter subkutan injeksjon av Hirulog-8 (dvs. 15 minutter) var APTT øket til ca. 200% av kontrollen. Klarering ad subkutan vei ble forlenget til en halveringstid på 340 minutter. Hirulog-8 administrert subkutant ble funnet å bli kvantitativt ad-sorbert.

Eksempel 44

Virkning av Hirulog-8 i bavianmodeller

på disseminert intravaskulær koagulering

Vi foranlediget septikemi i bavianer ved injeksjon av en dødelig dose av levende E. coli i henhold til fremgangsmåten beskrevet av F. B. Taylor et al., J. Clin. Invest., 79, s. 918-25 (1987). Hirulog-8 ble infusert i en dose på 0,08 mg/kg/t fra 15 minutter før injeksjonen av EL. coli til opptil 6 timer etter injeksjonen. I fravær av Hirulog-8 førte Ej. coli-indusert septisk sjokk til en merkbar minskning i det neutrofile tall, blodtrykket og hematokrit-verdien. Kontrolldyrene utviste en reduksjon i hematokrit-verdien til 70% av basislinjen og et fall i blodtrykket til 2 0% av basislinjen etter 3 timer. Administrasjon av Hirulog-8 svekket fullstendig hematokritfallet og begrenset fallet i blodtrykk til 60% av basislinjen.

Til tross for svekkelse av DIC ved Hirulog-8 resulterte den dødelige infusjon av E_j_ coli allikevel i dødsfall. En autopsi av både kontrollen og de Hirulog-8-behandlede dyr avslørte massivt vevødem i begge grupper, men bare kon-trollgruppen utviste intravaskulær trombose. Resultatene av autopsiene viser at avbruddet i det koagulopatiske trinn i septikemi alene ikke er tilstrekkelig for å forhindre døds-fall på grunn av septisk sjokk. *

Eksempel 45

Virkningen av en kombinasjon av tPA

og Hirulog- 8 på trombolyse

For å bestemme virkningen av Hirulog-8 på forsterkende tPA-indusert trombolyses anvendte vi en rottemodell for arteriell trombolyse. I denne modell ble en eksperimentell trombe dannet i den abdominale aorta etter ballong-kateterdenu-dasjon og sterk (95%) stenose. Blodstrømmen og blodtrykket ble nedtegnet fjernt fra setet for skaden og stenosen.

Vi valgte tilfeldige rotter som skulle få tPA (0,1 mg/kg bolus etterfulgt av 1,0 mg/kg/t infusjon) sammen med ett av følgende: saltvann, heparin (10 U/kg bolus, etterfulgt av 1,5 U/kg/min infusjon), rekombinant hirudin (1,0 mg/kg bolus etterfulgt av 0,02 mg/kg/t infusjon) eller Hirulog-8 (0,6 mg/kg bolus etterfulgt av 0,02 mg/kg/t infusjon). Det anti-trombotiske middel og saltvann ble administrert samtidig med tPA og i ytterligere 50 minutter etter avslut-ningen av tPA-infusjonen.

Figur 16 viser resultatene av disse eksperimenter. Dyr behandlet med tPA pluss saltvann viste reperfusjonstider på 16,2 minutter. Heparin reduserte reperfusjonstiden til 12,2 minutter, mens rekombinant hirudin reduserte den til 13,0 minutter. Ingen av disse reduksjoner var statistisk signifikante (p < 0,05) . Kombinasjonen av Hirulog-8 og tPA reduserte signifikant reperfusjonstiden til 4,4 minutter

(p < 0,01), og påskyndet således den fibrinolytiske virkning av tPA med en faktor på fire.

Heparin, hirudin og Hirulog-8 forhindret alle signifikant reokklusjon, sammenlignet med saltvannbehandlede kontroller (figur 17). Hvert av disse midler forlenget også APTT til verdier på henholdsvis 600%, 500% og 400% i forhold til kntrollverdiene (figur 18) . Dessuten økte både heparin, hirudin og Hirulog-8 tiden for karåpenhet til verdier på henholdsvis 80,2%, 82% og 93,1% (kontroll = 43,6%) (figur 19) . Disse resultater viser at trombinhemmerne fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse er overlegne i forhold til kjente antitrobotika når det gjelder å øke virkningen av tPA.

Eksempel 46

Virkning av Hirulog-8 og andre antitrombotiske midler på blødnin<g>stiden i bavianer

Vi anvendte standard blødningstidmåling for å undersøke virkningene av Hirulog-8 på hemostase.

Forskjellige doseringer av Hirulog-8 )0,002 til 0,2 mg/kg/- min) ble analysert med hensyn til deres virkning på blød-ningstiden. Doser på 0,002 til 0,04 mg/kg/min forår-saket ingen signifikant økning i blødnngstidene. Resultatene i dette eksperiment er avbildet i figur 20. Ved en dose på 0,1 mg/kg/min forårsaker Hirulog-8 en tofoldig økning i blødningstiden i forhold til kontrollverdiene. Ved 0,2 mg/kg/min Hirulog-8 økte blødningstidene til 3 ganger kontrollverdiene. Disse resultater viser tydelig at doseringer som er nødvendige for å hemme blodplateavhengig trombose (0,002 mg/kg/min; se eksempel 40) ikke forårsaker en signifikant virkning på hematostatisk klumpdannelse.

Vi undersøkte også virkningene av et utvalg andre midler på standard blødningstiden i bavianer, samt på de systemiske antikoagulerende virkninger (målt ved APTT). Disse resultater er oppsummert nedenfor:

Eksempel 47

Syntese av Hirulog- 34

Hirulog 34 har formelen: H-(D-Phe)-Pro-Arg-(tetraetylen-glykolylsuccinyl)-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Dekapeptidet Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu syntetiseres som beskrevet tidligere og får forbli bundet til resinet. Den resterende del av molekylet syntetiseres ved reaksjonsskjemaet avbildet og beskrevet nedenfor:

Na<->BOC- (D-Phe) -Pro-N<9>,N9- (Cbz) 2-Arg

Na-B0C-N9-(Cbz) 2-Arg (Bachem, Inc., Torrance, CA) omsettes med et overskudd av eterisk diazometan og behandles deretter med syre for å fjerne N"-BOC-gruppen. Det resulterende produkt, N<9>,N<9->(Cbz)2-arginin-metylester, oppløses deretter 1 DMF, avkjøles i et isbad og behandles etter hverandre med 2 ekvivalenter N°-BOC-prolin, 1 ekvivalent butanol, 1 ekvivalent EDCI og 1 ekvivalent diisopropyletylamin. Reaksjonsblåndingen omrøres over natten, fortynnes deretter med 5 volumdeler kaldt vann og ekstraheres med etylacetat. Den organiske fase gjenvinnes og vaskes etter hverandre med like volumdeler mettet sitronsyre, mettet NaHC03 og mettet NaCl. Produktet tørkes dretter over magnesiumsulfat og konsentreres i vakuum. Det resulterende dipeptid-mellomprodukt, N"-BOC-prolyl-N9,N9- (Cbz) 2-argininmetylester, behandles med et tifoldig molart overskudd av 4 N HCl/dioksan i 3 0 minutter. Den frie HC1 fjernes i vakuum, og residuet oppløses i vannfri DMF. Produktet avkjøles deretter i et isbad og omsettes med to ekvivalenter ISP-BOC- (D-Phe) i nærvær av butanol, EDCI og diisopropyletylamin, som beskrevet ovenfor. Det ubehandlede, ortogonalt beskyttede tripeptid isoleres som beskrevet ovenfor og renses på en kiselgelkolonne eluert med kloroform:metanol (95:5) som inneholder 0,1% NH4OH. N<"-BOC- (D)-fenylalanylprolyl-N^I^-^bz) 2-arginin-metylesteren forsåpes med 2 ekvivalenter LiOH i metanol:vann (2:1) ved romtemperatur i 3 timer. Metanolen fjernes i vakuum, og den vandige løsning vaskes med 2 volumdeler dietyleter. Løsningen surgjøres til pH 3 med mettet sitronsyre. Det resulterende ubehandlede tripeptid som fri syre ekstraheres i etylactatet. Den organiske fase vaskes med 3 volumdeler mettet NaCl, tørkes over vannfritt magnesiumsulfat og konsentreres i vakuum. Det resulterende Na<->B0C- (D) -fenylalanylprolyl-N^N<9-> (Cbz) 2-arginin renses ved reversfase HPLC under betingelser beskrevet i eksempel 4.

Na-BOC- (D) -fenylalanylprolyl-N^N9- (Cbz)2-

arcrinin- tetraetylenglykol- ester

En løsning av det ovennevnte tripeptid oppløses i THF og esterifiseres med 1,5 ekvivalenter tetraetylenglykol i nærvær av 1 ekvivalent av både dietylazodikarboksylat og trifenylfosfin, som beskrevet i 0. Mitsunobu, "The Use of DiethylAzodicarboxylate and Triphenylphosfine in Synthesis and Transformation of Natural Produkts", Synthesis, s. xl-28 (1981) .

Na-B0C- (D) -fenylalanylprolyl-N^N3- (Cbz)2-arginin- tetraetylenglykol- hemisuccinat

Den resulterende forbindelse oppløses i DMF og esterifiseres med 1 ekvivalent ravsyreanhyrid i nærvær av 1 ekvivalent diisopropyletylamin. De flyktige løsningsmidler fjernes i vakuum, og den frie syre renses ved reversfase-HPLC under betingelser som er beskrevet i eksempel 4.

Na-B0C- (D) -f enylalanylprolyl-N^N9- (Cbz) 2-arginin-tetraetylenglykol-hemisuccinat-N-hydroksysuccinimid-ester

En løsning av ovennevnte syre blandes med 1 ekvivalent N-hydroksysuccinimid i DMF, avkjøles i et isbad og blandes med 1 ekvivalent DCC i DMF, tilsatt dråpevis. Reaksjonen omrøres ved romtemperatur i 24 timer, filtreres for å fjerne det utfelte dicykloheksyl-urinstoff og konsentreres i vakuum. Løsningen knsentreres med kald benzen/heksan for å gi den ubehandlede peptidglykol-konjugerte N-hydroksy-succinimidester.

Ovennevnte forbindelse omsettes med det resinbundne dodeka-peptid, som beskrevet i eksempel 21. Den resulterende Hirulog-34 spaltes fra resinet, renses og karakteriseres som beskrevet i eksempel 4.

Mens vi i det ovenstående har presentert et antall utførelsesf ormer av denne oppfinnelse, er det åpenbart at vår grunnleggende utførelse kan forandres for å gi andre utførelsesformer. Derfor vil det være underforstått at omfanget av denne oppfinnelse skal defineres av de medføl-gende krav og ikke av de spesifikke utf ørelsesf ormer som er blitt presentert ovenfor ved hjelp av eksempler.

Claims

1. Analogifremgangsmåte ved fremstilling av terapeutisk aktive peptider eller salter derav hvor peptidene omfatter: a) en katalytisk sete-rettet enhet som binder til og inhiberer det aktive sete av trombin; hvor nevnte katalytiske sete-rettede enhet er valgt fra enheter av formel X-A-l-Aj-Aj-Y eller X-C^-C^-Aj-Y, hvor X er hydrogen eller er en kjede omfattende fra 1 til 35 atomer; A1 er Arg, Lys eller Orn; A2 er en ikke-amidbinding; A3 er en stamme omfattende fra 1 til 9 atomer; Y er en binding; Cx er et derivat av Arg, Lys eller Orn omfattende en karboksylat-enhet som er redusert eller forskjøvet fra a-karbonat med en enhet som omfatter en stamme omfattende fra 1 til 10 atomer; og C2 er en ikke-spaltbar binding; b) en linker-enhet som omfatter en stamme med en utregnet lengde på mellom omkring 18Å og 42Å; og c) en anion-bindende eksosete-assosierende enhet som binder til det anion-bindende eksosete hos trombin, hvor den anion-bindende sete-rettede enhet er valgt fra enheter av formel: hvor W er en binding; Bx er en anionisk aminosyre; B2 er enhver aminosyre; B3 er Ile, Val, Leu, Nie eller Phe; B4 er Pro, Hyp, 3,4-dehydroPro, Tiazolidin-4-karboksylat, Sar, enhver N-metyl aminosyre eller D-Ala; B5 og B6 er enhver anionisk aminosyrer; B7 er en lipofil aminosyre valgt fra gruppen omfattende Tyr, Trp, Phe, Leu, Nie, Ile, Val, Cha, Pro eller et dipeptid omfattende en av disse lipofile aminosyrer eller og enhver aminosyre; B8 er en binding eller et peptid inneholdende fra ett til fem residuer av enhver aminosyrer; og Z er et karboksy-terminalt residuum valgt fra OH, Ci-Cg alkoksy, amino, mono- eller di-( C^- C^) alkyl-substituert amino eller benzylamino; hvor nevnte katalytiske sete-rettede enhet er bundet til nevnte linker-enhet som er bundet til nevnte anion-bindende eksosete-assosierende enhet, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter trinnet å syntetisere nevnte trombin-inhibitor ved fastfase-syntese, oppløsnings-fase syntese, blandet heterolog/- fastfase-syntese eller en kombinasjon derav.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, der B1 er Glu, B2 er Glu, B3 er Ile, B4 er Pro, B5 er Glu, B6 er Glu, B7 er Tyr-Leu, Tyr (S03H)-Leu, Tyr (OS03H)-Leu eller (3 , 5-diiodoTyr)-Leu, B8 er en binding og Z er OH karakterisert ved at tilsvarende utgangsma-teriale anvendes.

3.. Fremgangsmåte ifølge krav 1, der stammen hos nevnte linker-enhet består av enhver kombinasjon av atomer valgt fra gruppen omfattende karbon, nitrogen, svovel og oksygen karakterisert ved at tilsvarende utgangsma-teriale anvendes.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, der linkeren omfatter aminosyresekvensen Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe, karakterisert ved at tilsvarende utgangsma-teriale anvendes.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, der den katalytisk sete-rettede enhet omfatter formelen X-A1-A2-A3-Y, karakterisert ved at tilsvarende utgangsma-teriale anvendes.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, der X er D-Phe-Pro; A1 er Arg og A3 er D-Pro, Pro eller Sar, karakterisert ved at tilsvarende utgangsma-teriale anvendes.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, der trombininhibitoren er valgt fra gruppen omfattende Hirulog-8 (H- (D-Phe) -Pro-Arg-Pro- (Gly) 4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH) og Hirulog-12 (H-(D-Phe)-Pro-Arg-Pro- (Gly) 4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr(0S-03) -Leu-OH) , karakterisert ved at tilsvarende utgangsma-teriale anvendes.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 5, der X er N-acetyl-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val; A1 er Arg og A3 er Pro, hvor nevnte trombininhibitor er Hirulog-33 (N-acetyl-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu- (Gly) 3-Val-Arg-Pro (Gly) 4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH), karakterisert ved at tilsvarende utgangsma-teriale anvendes.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1, der den katalytisk sete-rettede enhet omfattes av formelen karakterisert ved at tilsvarende utgangsma-teriale anvendes.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1, der trombin-inhibitoren, er valgt fra gruppen omfattende Hirulog-18a (H- (D-Phe) -Pro- (/3-homoarginin) - (Gly) 5-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu_ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH) og Hirulog-18b (H (D-Phe) -Pro- (/3-homoarginin) - (Gly) 4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH), karakterisert ved at tilsvarende utgangsma-teriale anvendes.