ES2352204T3

ES2352204T3 - Método de síntesis peptídica en fase sólida.

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Publication number: ES2352204T3
Application number: ES05796944T
Authority: ES
Inventors: Nicole Studer; Jasmine Schnidrig; Stephane Varray; Corinne Wenger; Anne-Sophie Droz; Oleg Werbitzky
Original assignee: Lonza AG
Current assignee: Lonza AG
Priority date: 2004-10-19
Filing date: 2005-10-19
Publication date: 2011-02-16
Anticipated expiration: 2025-10-19
Also published as: IL182698A0; EP1737889B1; EP1737889A1; US7939629B2; ATE480561T1; IL182698A; PT1737889E; WO2006045503A1; CN101094867B; DE602005023429D1; US20080287648A1; USRE46830E1; DK1737889T3; CN101094867A; CN102225966A; JP4903709B2; CN102225966B; JP2008517018A

Abstract

Conjugado de peptido-resina A-W, en el que A es P-X1-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-X2- en donde P es hidrogeno o un grupo protector seleccionado del grupo que consiste en Boc, Fmoc, Dde, Nps, Alloc y Z; X1 es un resto peptidilo de 0 a 200 aminoacidos, que comprende opcionalmente grupos protectores sobre cadenas laterales de aminoacidos individuales; R4, R5, R6, R7, R8 y R9 son grupos protectores de cadenas laterales de aminoacidos; X2 es un solo residuo de aminoacido que esta conectado al material compuesto en fase solida de formula (II) a traves de -O- y que opcionalmente esta protegido en la cadena lateral; y W es un material compuesto en fase solida de formula **Fórmula** en el que R1" es hidrogeno, 4-(alquilo C1-C4) o 4-(alcoxi C1-C4), R2" es cloro, hidrogeno, 4-(alquilo C1-C4) o 4-(alcoxi C1-C4), siendo R1" y R2" iguales o diferentes, con la condicion de que solo uno de R1", R2" pueda ser hidrogeno, y con la condicion de que R1" sea hidrogeno si R2" es 2-cloro; y R"' es una fase solida.

Description

La presente invención se refiere a un método mejorado de síntesis peptídica en fase sólida del péptido anticoagulante bivalirudina, el llamado ’hirulog’. Se refiere además a los respectivos productos conjugados de péptido-fase sólida que comprenden el péptido todavía protegido unido a la resina.

Los inhibidores de trombina se consideran antitrombóticos prometedores. El procesamiento proteolítico mediante trombina es fundamental en el control de la coagulación sanguínea. La hirudina, un potente inhibidor clínico de trombina procedentes de la sanguijuela chupadora se sangre Hirudo medicinalis, consiste en 65 aminoácidos. Análogos peptídicos más cortos del segmento peptídico 45-65 de hirudina, los llamados hirulogs, han resultado ser eficaces en el tratamiento de la trombosis, una afección que pone en peligro la vida.

Okayama et ál. (1996, Chem. Pharm. Bull. 44:1344-1350) y Steinmetzer et ál. (1999, Eur. J. Biochem. 265: 598-605) idean la síntesis en fase sólida de diferentes hirulogs sobre resina de Wang, esto es, usando el enlace éster del Fmoc-aminoácido C-terminal a una resina que está esterificada a un radical alcohol pbenciloxibencílico. La resina de Wang requiere la escisión del péptido desde la resina con ácido trifluoroacético concentrado, para lo cual la escisión desde la resina acarrea la desprotección global concomitante del péptido.

La escisión acidolítica desde la resina de Wang se aplica bajo condiciones fuertemente ácidas y se sabe que inevitablemente incurre en la alquilación no deseable de residuos de Trp como una reacción secundaria, a pesar del uso de reactivos eliminadores durante la acidólisis (Giraud et ál., 1999, J. Peptide Science 5:457-461). En particular, el Trp C-terminal es propenso a tal reacción secundaria (Atherton et ál., 1988, Tetrahedron 44:843-857). La alquilación está provocada por iones carbenio aromáticos generados a partir del resto fenoxi conector de la resina de Wang. Aunque los hirulogs no contienen residuos de Trp, sí comprenden en la posición Cproximal un residuo de Tyr. Se encuentra y presenta en la presente por primera vez que este residuo de Tyr es igualmente propenso a la alquilación errática durante la escisión de la resina de Wang, afectando negativamente a la pureza del producto.

Freund y Robinson divulgan el uso de la 2-clorotritil-resina para la elongación de la cadena siguiendo en protocolo de Alloc cuando se sintetiza el heptapéptido H-D-Leu-D-Try-L-Asn-Hpg-L-Tyr--Dhpg-OH (1999, Chem. Commun., 2509-2510). La divulgación no dice nada acerca de la alquilación errática de uno cualquiera de los

5 residuos de aminoácido, y no se sugiere que el uso de la 2-clorotritil-resina tenga un efecto positivo para suprimir esta reacción secundaria.

El objetivo de la presente invención es idear un método mejorado para sintetizar los péptidos de hirulog respectivos que carezca de las desventajas de la técnica anterior.

10 Este objetivo se resuelve mediante los conjugados de péptido-resina y el método de síntesis respectivo ideado por la presente invención.

De acuerdo con la presente invención, se idea un método para liberar y desproteger un conjugado de péptido-fase sólida para dar finalmente un péptido, preferiblemente un péptido de la fórmula -D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly

15 Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Dicho conjugado de péptido-fase sólida comprende un asa de 2-clorotritilo de fórmula

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en la que A = Boc-D-Phe-Pro-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-O-o A = Fmoc-D-Phe

20 Pro-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Olu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-O-o A = NH2-D-Phe-Pro-Arg(R2)-Pro-Gly-GlyGly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)Tyr(R9)-Leu-O-y en la que R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 son grupos protectores de cadenas laterales de aminoácidos y en la que R1 es una fase sólida insoluble. La se

25 cuencia peptídica anterior es la de hirulog-8 (descrita en EP-489 070). Es un derivado bivalente 20mero de hirudina (un 65mero), un potente inhibidor de trombina presente en la naturaleza. Está constituido por motivos estructurales conectados, funcionalmente importantes, procedentes de hirudina: El motivo de unión al sitio activo D-Phe-Pro-Arg-Pro y la secuencia carboxiterminal Asn9 a Leu20 procedente de hirudina, puenteados por un espaciador de tetraglicina. En la presente memoria, “-D-Phe-” significa D-fenilalanina, en oposición al enantiómero L presente en la naturaleza.

Opcionalmente, en un objetivo adicional de la presente invención, el radical A en la fórmula I puede ser cualquiera de los siguientes:

1. A es P-X1-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)Tyr(R9)-X2, en donde X1 es un resto peptidilo, que comprende opcionalmente grupos protectores sobre cadenas laterales de aminoácidos individuales, de 0 a 200, preferiblemente de 1 a 100, lo más preferiblemente de 2 a 50 aminoácidos, y en donde X2 es una sola cadena opcionalmente lateral o un residuo de aminoácido protegido C-terminalmente conectado a la fase sólida a través de -O-, en donde preferiblemente X2 no es Trp, Cys o Arg, y en donde P es H (es decir, da -NH2) o un grupo protector, preferiblemente el grupo protector es un grupo protector ortogonal o es uno retirable bajo condiciones fuertemente ácidas según se define posteriormente, más preferiblemente el grupo protector se selecciona del grupo que consiste en Boc, Fmoc, Dde, Nps, Alloc y Z. La conexión -O-puede ser bien un enlace éster o éter unido al asa

o el conector a través de una cadena lateral o bien un grupo carboxi Cα o una función hidroxi de la cadena lateral.

2. A es P-X1-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)Tyr(R9)-Leu-O Las definiciones para P, X1, X2 se aplican coherentemente a todas estas posi

bles realizaciones para A y los conjugados de péptido-fase sólida resultantes.

Se encuentra y presenta en la presente memoria por primera vez que dicho residuo de Tyr es igualmente propenso a la alquilación errática durante la escisión desde resina de Wang, afectando negativamente a la pureza del producto. En el caso del hirulog, tal modificación parece estar promovida por un efecto de proximidad similar al observado para Trp por Atherton et ál. Sin embargo, la alquilación de Tyr,

p. ej. en el caso de la desprotección de Arginina, nunca se ha presentado como un problema general, bastante en contraste con el Trp (Atherton et ál., 1989, Solid phase synthesis: A practical approach, IRL press, Oxford). Además, las observaciones de Atherton trataban el Trp C-terminal solamente, mientras que el residuo de Tyr en el péptido de hirulog, sintetizado en la dirección C a N-terminal, es solamente el yuxtaproximal, esto es, el segundo residuo próximo al extremo C de la cadena peptídica en crecimiento. En retrospectiva, sin querer limitarse por una teoría, esto puede explicarse por que los restos fenoxi son más reactivos que los compuestos arílicos promedio en la sustitución electrófila. En efecto, los fenoles se usan como agentes elimina-dores en la escisión acidolítica de la resina (D. S. King et ál., 1990, Int. J. Peptid Protein Res., 36, 255). Dicha reacción secundaria todavía no se ha descrito o sugerido. Hasta ahora se ha creído que solo el Trp terminal era vulnerable a este respecto. Por consiguiente, la resina de Wang se ha empleado ampliamente en la técnica anterior, hasta hace poco, para la síntesis de hirulog.

El conjugado de péptido-fase sólida de la presente invención puede sintetizar-se mediante métodos en fase sólida habituales bien conocidos en la técnica, y bien descritos y mencionados en Bodanszky et ál., Principles of Peptide Synthesis, 2ª ed., Springer Verlag Berlin Heidelberg 1989. Necesariamente, debido a la labilidad frente a los ácidos de la ligazón en fase sólida, tal estrategia sintética emplea la química del Fmoc para llevar a cabo las reacciones de acoplamiento durante la síntesis en fase sólida. Sólo el último residuo de D-Phe de terminación puede estar protegido bien por Boc o bien por Fmoc. Tal protección con Fmoc pede eliminarse todavía sobre la resina, mediante tratamiento estándar con, p. ej., piperidina al 20% u otro reactivo básico desprotector de Fmoc para dar el conjugado de péptido-resina de la presente invención, pero con un grupo amino N-terminal libre. Sin embargo, tal desprotección temprana de Fmoc, que expone tempranamente el extremo N, hace a dicho residuo de D-Phe N-terminal libre mucho más propenso a sufrir racemización cuando se somete a liberación de la resina mediante acidólisis o en particular desprotección global junto con liberación bajo una condición fuertemente ácida. De ahí que, más preferiblemente, el residuo de D-Phe de terminación esté protegido con Boc o esté protegido con otro grupo protector que puede retirarse fácilmente en una condición fuertemente ácida, evitando así la necesidad de una etapa de desprotección de Fmoc separada. Esto incluye, p. ej., el grupo protector Z (benciloxicarbonilo), que puede escindirse, entre otras cosas, mediante condiciones fuertemente ácidas según se define en el presente contexto, aunque se sabe que la escisión hidrogenolítica o promovida por HF es más eficaz. De nuevo, una etapa de desprotección de Fmoc separada sobre el residuo de D-Phe de terminación no es una opción tan buena aunque es otra realización factible de la presente invención. Dicha liberación o escisión en una etapa junto con la desprotección global puede llevarse a cabo en una mezcla de disolventes tal como TFA y DCM acuosos, por ejemplo.

En general, de acuerdo con la presente invención, es posible bien escindir el péptido protegido de fórmula I de la resina concomitantemente con, o, en una etapa inicial, entes de la desprotección o bien la desprotección global de cadenas laterales de aminoácido y, preferiblemente, el grupo protector N-terminal. En la última realización, se somete secuencialmente en primer lugar a una condición débilmente ácida para la escisión de la resina y en segundo lugar a una condición fuertemente ácida para la escisión de todos los grupos protectores restantes (desprotección global). De todos modos, en ambas condiciones, especialmente la 2-clorotritil-resina (CTCresina para abreviar), y, p. ej., la 4-metoxi-o 4-metiltritil-resina muy similar disponible comercialmente o, en una extensión igual o menor, las otras resinas reivindicadas por la presente invención, son muy adecuadas para evitar la modificación no deseada del residuo de tirosina yuxtaproximal durante la escisión y/o la desprotección. Evita la alquilación no deseable de una tirosina yuxtaproximal, cuando la tirosina se des-protege concomitantemente durante la escisión desde la resina. En virtud del sustituyente halógeno, opcionalmente, la CTC-resina permite efectuar la escisión de la resina del péptido todavía protegido bajo condiciones de reacción acidolítica muy suaves, p. ej. en ácido trifluoroacético (TFA) al 0,5 % en diclorometano (DCM). Esta es una condición a la que la mayoría de los grupos protectores de cadenas laterales y N-terminales normalmente no se verán afectados, y de ahí que se evite la alquilación mediante la segregación de los diferentes episodios de desprotección con el tiempo. En lo siguiente, las realizaciones a las que se hace referencia con respecto a la CTC-resina en particular como la realización más preferida para la fase sólida se refieren tácitamente a las otras resinas descritas y reivindicadas en la presente invención.

Por definición, de acuerdo con la presente invención, una condición fuertemente ácida, en oposición a una condición débilmente ácida, significa aplicar ácido trifluoroacético (TFA) al menos al 50% (v/v) en el disolvente. Un grupo protector que requiere una condición fuertemente ácida para la retirada es un grupo protector que puede retirarse, como mínimo, mediante TFA al 80%. Grupos protectores que requieren ácidos aún más fuertes tales como HF no entran bajo la definición mencionada anteriormente en el contexto de la presente invención. Una condición débilmente ácida se define por tener TFA del 0,01% (v/v) al < 50%, preferiblemente tener TFA del 0,1% al 30%.

El resto peptidilo de la presente invención muestra notablemente una ausencia inesperada de alquilación no deseable de la tirosina yuxtaproximal. Carece totalmente de reacción secundaria de dicetopiperazina, otra posible reacción secundaria que ocurre durante la escisión de la resina y que se sabe que es particularmente sensible a la naturaleza de los dos últimos aminoácidos C-terminales. Sin querer limitarse por una teoría, se especula que una tirosina en la posición 2 de la cadena peptídica próxima a la CTC-resina está justo a la distancia óptima para mostrar algún apilamiento hidrófobo estabilizante de los restos fenílicos aromáticos, evitando, p. ej., la disposición cíclica que es el preludio de la formación de dicetopiperazina.

La carga de la CTC-resina tiene lugar comúnmente mediante la sustitución nucleófila del difenil-(2-clorofenil)-clorometano (cloruro de clorotritilo) y se sabe que es eficaz. Como una opción, Fmoc-aminoácido-CTC-resinas precargadas están disponibles comercialmente.

Grupos protectores y su química son además muy conocidos y muy mencionados en la técnica (véase Bodanszky, anteriormente). Diferentes grupos protectores R2 a R9 son adecuados para la protección de cadenas laterales de aminoácidos individuales. Diferentes restos químicos requieren diferentes grupos protectores. Ejemplos son histidina que puede protegerse convencionalmente con tritilo o Boc, lisina que puede protegerse con Boc o aliloxicarbonilo y aspartato que pueden protegerse como éster terc-butílico o éster alílico. La treonina, la serina y la tirosina se protegen habitualmente como éter terc-butílico. La protección de arginina se analizará posteriormente. Pueden aplicarse diferentes modos de desprotección, p. ej. los grupos protectores alílicos se retiran laboriosamente mediante reacción de transferencia de alilo reductiva catalizada por Pd. Se emplean menos convenientemente grupos Z (benciloxicarbonilo) ya que requieren hidrogenolisis para una retirada eficaz. Preferiblemente, los grupos protectores R2 a R9 son lábiles frente a los ácidos, significando ’lábil’ una velocidad de escisión de al menos 20% de dicho grupo protector respectivo cuando se incuba en solución de DCM durante hasta 5 horas bajo condiciones bien débilmente o bien fuertemente ácidas. Más preferiblemente, de acuerdo con la presente invención, los grupos protectores R2 a R9 se retiran y solo pueden retirarse bajo una condición fuertemente ácida según se define anteriormente.

R1 es una fase sólida insoluble normalmente polímera, p. ej. un copolímero reticulado de poliestireno/divinilbenceno al 1%. Típicamente, pero no estrictamente requerido para hacer funcionar la presente invención, tal fase sólida R1 presentará además, por supuesto, múltiples restos 2-clorotritilo funcionalizados con el radical peptídico A más allá del mostrado explícitamente en la fórmula I. De forma más importante, para ser útil en la síntesis en fase sólida como fue ideado en primer lugar por Merrifield, la fase sólida polímera tendrá un tamaño de partícula mínimo para dar una suspensión verdadera de partículas fácilmente filtrables o nodulizables de tamaño suficiente, en lugar de un comportamiento coloidal. Aparte del polímero básico de poliestireno bien directamente derivado con un conector de CTC o conector de 4carboxitritilo de Bayer (Bayer et ál., 13th American Peptide Symposium, Hodges et ál., Ed. ESCOM, Leiden, 1994, página 156) o bien en el que restos benceno individuales del polímero básico se han derivado para formar parte de la función 2clorotritilo, otros polímeros básicos adicionales tales como resinas de PEG puras o mixtas u opcionalmente resinas híbridas o injertadas (p. ej. Tentagel®), en las que, p. ej., un conector de 2-CTC (tal como el conector de Bayer) se ha injertado en un polímero básico de poliestireno a través de un resto espaciador de PEG en lugar de haciendo reaccionar directamente el conector con el polímero básico de poliestireno. Incluir PEG en una resina proporciona una resina más anfifílica y de ahí mejor manejo, p. ej. en mezcla de DCM/TFA para la separación y la desprotección en una etapa, aunque la capacidad de carga puede convertirse entonces en un problema. Por supuesto, ha de apuntarse que hay resinas de PEG que son estrictamente insolubles. Sin embargo, Bayer et ál. (Nature 1972, vol. 237, página 512f) describieron una técnica transportada por polímero de PEG que imita el principio de separación en fase sólida mientras que funciona estrictamente en solución, siendo el conjugado de péptidoresina todavía soluble y proporcionando un sistema homogéneo en una fase. En su significado preferido, tal comportamiento de la resina se incluye mediante la presente definición de “insoluble”, puesto que permite esencialmente la separación rápida y simple basada en el tamaño mediante técnicas de micro-o ultrafiltración a nivel microscópico. En un significado más preferido, “insoluble”, en un sistema disolvente dado para la síntesis de péptidos, se refiere a un sistema monofásico, siendo una de las fases una fase suspendida verdaderamente sólida.

Preferiblemente, la fase sólida tiene una malla menor de 700 (malla según se define por the US Bureau of Standards, recuperable, p. ej., en Römpps Chemie-Lexikon, 7. Auflage, 1973, Franck’sche Verlagshandlung, W. Keller & Co. Stuttgart/Alemania).

Preferiblemente, la fase sólida funcionalizada con 2-clorotritilo de la presente invención tiene malla de 50 a 600, más preferiblemente malla de 60 a 400, lo más preferiblemente malla de 100 a 300.

La tirosina de la presente invención puede protegerse mediante diferentes grupos protectores, p. ej. éter terc-butílico o éteres de Z o más preferiblemente 2bromo-Z. Igualmente, es posible usar grupos protectores tritilo tales como grupos 2clorotritilo, 4-metoxi-o 4,4’-dimetoxitritilo. Preferiblemente, R9 es un grupo protector tritilo o terc-butilo. Más preferiblemente, R9 es un grupo protector terc-butilo (tBu), que significa que la cadena lateral de tirosilo está modificada hasta un éter terc-butílico. El grupo tBu sólo se retira eficazmente bajo una condición fuertemente ácida.

Preferiblemente, solo y en particular en combinación con las realizaciones preferidas adicionales, el grupo protector de arginina R2 se selecciona del grupo que consiste en pentametildihidrobenzofurano (Pbf), adamantiloxicarbonilo, isoborniloxicarbonilo, 2,2,5,7,8-pentametilcromano-6-sulfonilo (Pmc), 4-metoxi-2,3,6trimetilbencenosulfonilo (Mtr) y su homólogo de 4-terc-butil-2,3,5,6-tetrametilo (Tart) y Boc, que sólo se escinden bajo condiciones fuertemente ácidas según se define anteriormente. Más preferiblemente, R2 es Pbf, Pmc, Mtr, lo más preferiblemente, es Pbf. Durante la desprotección global de cadenas laterales bajo condiciones fuertemente ácidas en medio habitualmente acuoso, la alquilación de tirosina desprotegida no se observa con Pmc, Mtr y Pbf. La velocidad de escisión de Pbf es siempre la más alta.

Son muy conocidos grupos protectores de carboxi para Glu, Asp, p. ej. Mpe, O-1-adamantilo, O-bencilo e incluso simplemente pueden usarse ésteres alquílicos, aunque se usan menos comúnmente. Típicamente y preferiblemente, se usan grupos terc-butilo, independientemente, como grupos protectores R4, R5, R6, R7, R8.

El grupo protector R3 puede ser de una importancia fundamental debido a la presencia en la secuencia Gly-Asn anterior en hirulog-8, secuencia dipeptídica que es particularmente propensa a la formación de aspartimida como una reacción secundaria. La formación de aspartimida puede producirse en el péptido protegido a lo largo de cada ciclo subsiguiente de acoplamiento durante la síntesis lineal en una pequeña extensión (0,1-0,5%), teniendo un efecto acumulativo al final. Aunque se prefiere la protección de nuevo con un grupo protector tritilo o derivados de 2-cloro, 4-metilo o 4-metoxi del mismo, puede usarse asimismo el grupo protector adamantilo. Lo más preferiblemente, se emplea un grupo protector tritilo.

También ha de apuntarse que en lugar de acoplar tanto los aminoácidos de las cadenas laterales como los protegidos en Nα, pueden usarse módulos dipeptídicos protegidos con alquilo en Nα para el acoplamiento durante la síntesis lineal. Tales dipéptidos tienen un efecto de ruptura de la estructura secundaria, facilitando el rendimiento y la pureza de la síntesis. P. ej., Fmoc-Gly-(N-Hmb)Gly-OH y Fmoc-Gly(N-Dmb)Gly-OH están disponibles comercialmente de EMD Biosciences (Novabiochem). Ha de entenderse que tales grupos N-alquilo no se consideran grupos protectores en el sentido de la presente invención. Su uso o presencia es opcional y no está excluido por la estructura de la fórmula I.

En un método preferido para liberar y desproteger el conjugado peptídico de fórmula I, se aplica el esquema en dos etapas de efectuar en primer lugar una acidólisis bajo condiciones débilmente ácidas para escindir el péptido protegido de la CTC-resina y en segundo lugar retirar los grupos protectores restantes bajo condiciones fuertemente ácidas.

La razón es que una desprotección global en una etapa del conjugado de péptido-fase sólida de fórmula I sufre requerimientos de disolvente opuestos del producto completamente desprotegido y el material de partida hidrófobo. La necesidad del compromiso afecta negativamente tanto a la pureza como al rendimiento del producto. El enfoque por etapas secuencial elimina tales desventajas intrínsecas, permite controlar mejor las diferentes reacciones y de ahí que permita un rendimiento óptimo. De acuerdo con la presente invención, disfruta además del efecto sorprendente de suprimir completamente la formación de dicetopiperazina como una reacción secundaria.

De acuerdo con esto, se idea un método para liberar y desproteger el conjugado de péptido-fase sólida de fórmula I según se define anteriormente para dar un péptido de fórmula H-D-Phe-Pro-Arg-Pro--Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-GluGlu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH, caracterizado porque, en una primera etapa, el péptido protegido se escinde del asa de 2-clorotritilo bajo una condición débilmente ácida, preferiblemente con TFA del 0,1 al 10% en un disolvente aprótico polar, y porque, en una segunda etapa, los grupos protectores se retiran bajo una condición débilmente ácida según se define anteriormente.

Preferiblemente, la primera etapa se efectúa en un disolvente aprótico polar que es diclorometano. Este es el mejor disolvente para llevar a cabo dicha reacción, en contraste con otros disolventes tales como NMP (N-metilpirrolidona). Es posible, pero no necesario, incluir además un reactivo eliminador en el disolvente, especialmente en el sistema disolvente para la segunda etapa de desprotección, que está presente en una cantidad de 0,1 a 10% (p/p), en el caldo de reacción para evitar la alquilación no deseada del núcleo aromático de tirosina. Tal eliminador intercepta productos intermedios de ion alquilcarbenio reactivos que se generan durante la retirada de los grupos protectores (lo que puede haber ocurrido ya en una pequeña extensión durante la reacción de escisión en la primera etapa). Un eliminador es, p. ej., tioanisol que también tiene un segundo efecto promotor de la acidólisis. Tal papel secundarios y sustitutos para el tioanisol se analizan en Bodanszky M. et ál. (Int. J. Peptide Protein Res. 23:287). Otros ejemplos de eliminadores que no tienen efecto de acidólisis son fenol y/o trialquilsilanos (Stierandova et ál.. Int. J. Peptide Protein Res. 43, 1994, 31-38). Preferiblemente, después de la primera etapa de escisión o liberación desde la resina, la reacción se extingue directamente mezclando con piridina y subsiguientemente recuperando el producto de la etapa 1 mezclando con agua. De este modo, el producto se recupera de la forma más simple y eficaz.

En una realización adicional de la presente invención, se reivindica esencialmente el conjugado de péptido-fase sólida de fórmula I, con la única diferencia de que el -Arg(R2)-Pro-, que es el sitio de escisión de trombina, no es un enlace peptídico estándar sino un enlace pseudoescindible o “psi” químicamente modificado. La sustitución de un enlace amida está indicada por los átomos indicados en un corchete adicional precedidos por el acrónimo “psi” (véase Rudinger et ál., Drug Design, Vol. II, Ed. Ariens, E., Academic Press, Nueva York, p. 319, 1971). Más preferiblemente, tal sustitución psi es -Arg[psiCH2NH]Pro-(Kline, T. et ál., 1991, Hirulog peptides

5 with scissile bond replacements resistant to thrombin cleavage, Biochem. Biophys. Res. Commun. 177, 1049-1055). Lo más fácilmente, tal enlace psi se introduce, p. ej., durante la síntesis en fase sólida mediante acoplamiento normal del péptido conjugado en crecimiento con el psi-dipéptido protegido con Fmoc.

Un objetivo adicional de la presente invención es extender las realizaciones y

10 los métodos descritos anteriormente a conjugados de péptido-fase sólida que comprenden un resto de resina diferente de la CTC-resina mencionada anteriormente, lo que todavía permite de forma similar escindir el resto peptídico de la resina bajo condiciones débilmente o suavemente ácidas según se definen anteriormente. Las 2CTC-resinas y las tritil-, 4-metoxi-y 4-metiltritil-resinas relacionadas que se definen

15 posteriormente se consideran todavía la mejor realización de la presente invención, de acuerdo con lo mencionado anteriormente. Como un objetivo adicional, se idea un conjugado de péptido-resina de la fórmula A-W, en el que A puede ser cualquiera de las realizaciones definidas anteriormente para A, que comprende opcionalmente grupos protectores de cadenas late

20 rales de aminoácidos individuales, y en el que R2 a R9, cuando están presentes, son como se definen anteriormente, y en el que W es un material compuesto en fase sólida, preferiblemente insoluble, que permite escindir el resto peptídico bajo condiciones débilmente ácidas, y que comprende un conector de resina de fórmula

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25 en el que el residuo X2 de A está conectado a través de -O-a dicho conector, y en el que R”’ es la fase sólida, y en el que R1”, R2” son, independientemente, hidrógeno, 4-(alquilo C1-C4) o 4-(alcoxi C1-C4), y pueden ser iguales o diferentes, con la condición de que solo uno de R1”, R2” pueda se hidrógeno, y en el que R2” puede ser opcionalmente 2-Cl con la condición de que entonces R1” sea H, y en el que, lo más preferiblemente, el conector de fórmula II se selecciona del grupo que consiste en 2clorotritilo, 4-metoxitritilo, 4,4’-dimetoxitritilo y 4-metiltritilo.

La resina o la entidad compuesta de asa de resina puede ser en principio cualquier resina empleada para la síntesis, tal como, por ejemplo, una resina de poliestireno-divinilbenceno junto con restos conectores integrales, o tal como, por ejemplo, restos a los que pueden injertarse adicionalmente, p. ej., más conectores lábiles frente a los ácidos, o, alternativamente, los últimos conectores pueden estar conectados integralmente o directamente a la resina. En principio, una resina en fase sólida para el uso en la síntesis comprende necesariamente al menos un conector o asa integral que es parte del material del núcleo de la fase sólida; tal conector o asa puede considerarse un grupo protector inmovilizado (Guillier et ál., Chem. Rev. 100, 2091-2157, 2000). Ejemplos son, p. ej., resinas de poliestireno injertadas con PEG tales como Novasyn TG basados en tentagel (Novabiochem, Merck Biosciences, Alemania) que están disponibles con diferentes asas injertadas tales como 2-clorotritilo, o resinas que están constituidas por asas funcionales de injerto sobre un material de matriz tal como geles de sílice. Preferiblemente, tal resina es una 4-metoxi-o 4,4’dimetoxitritil-resina. Las resinas que se usan en la presente invención son de tamaño de malla estándar, lo que es aproximadamente una malla 50-500, más preferiblemente mallas de 100 a 400. Experimentos

1.: Síntesis de Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(tBu)-Phe-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ile-Pro-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-O-2-CTC (hirulog-8 protegido, descrito en EP-489 070, carboxiterminalmente conjugado en la conexión éster a 2-CTC-resina) Todos los reactivos se adquirieron de EMD Biosciences (Madison, WI/EE. UU. de A; marca Novabiochem). La 2-Cl-Trt (CTC)-resina basada en poliestireno (Cbl Patras, Grecia), precargada con Fmoc-Leu-OH, era de malla 100200 en lo que respecta al polímero básico y de malla 60-200 en lo que respecta al producto final de CTC-resina precargado. La densidad de carga era

aproximadamente 0,60 mmol/g. Los aminoácidos individuales se adquirieron bien como Fmoc-aminoácidos o bien, en el caso de D-Phe, como Boc-D-Phe ya protegido con Boc. Los acoplamientos se llevaron a cabo con TCTU en diclorometano/N-metilpirrolidona (NMP), en presencia de base de Hünig (N,N-diisopropiletilamina, DIEA). Habitualmente, se usaron 1,5 eq. del aminoácido protegido con Fmoc o Boc, excepto para el acoplamiento de Fmoc-Arg(Pbf), en el que se usaron 2,5 eq.. De forma similar, el tiempo de reacción de acoplamiento estándar de 60 min. (a 30˚C) se prolongó hasta 90 min. en el caso de Fmoc-Arg(Pbf). El control durante el procedimiento de la eficacia de acoplamiento se efectuó por medio de la prueba de Kaiser o la prueba del cloranilo. La desprotección de Fmoc se llevó a cabo con 3-4 ciclos de piperidina al 20% en NMP a 30˚C, con aumento adecuado con NMP entre medias.

2.: Síntesis de Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(tBu)-Phe-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ile-Pro-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-OH La escisión desde 48,3 g de resina (aproximadamente 100 de resina hinchada) que se generaba en el experimento 1 se alcanzó con 3 ciclos de 15 min. cada uno a 15˚C, TFA al 2% (p/p), trietilsilano (TES) al 1% (p/p) en diclorometano. La reacción se agitó mediante burbujeo con nitrógeno. El color de la reacción cambiaba de ciclo en ciclo de amarillo/naranja a pardusco. Después de cada ciclo, la reacción de escisión se extinguió directamente vertiendo todo el caldo de reacción en piridina diluida (piridina/etanol 1:9 (v/v)). La resina se retiró a continuación mediante filtración con una frita y se sometió al siguiente ciclo. Todos los filtrados se reunieron, se concentraron hasta un semilíquido naranja bajo vacío (RotaVap), se lavaron con DCM, se resuspendieron en 400 ml de agua doblemente destilada, se agitaron a temperatura ambiente, se filtraron, se lavaron con agua y se secaron. El rendimiento era 28,8 g de un polvo ligeramente amarillo de calidad analítica (<90% de pureza). El producto se analizó mediante HPLC y LC-MS.

3.: Desprotección global, síntesis de H-D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH Se llevó a cabo desprotección global en DCM diluido con cóctel de escisión (’CC’), DCM:’CC’ es 1:10 (v/v). El ’CC’ estaba constituido por

5 TFA/tioanisol/fenol/agua/TES en la relación de mezcladura (% p/p) 89:2,5:2,5:5,0:1,0. 1 g de producto seco procedente del experimento 2 se disolvió en 10 ml de DCM diluido como se menciona anteriormente con ’CC’ y se agitó durante 5 horas a temperatura ambiente. El producto se recuperó a continuación mediante la adición de 50 ml metil-terc-butil-éter (MTBE, Flu

10 ka Chemie, Buchs/Suiza), enfriando la reacción hasta 0˚C en un baño de agua durante 30 min. bajo agitación y separando por filtración el precipitado salino que se ha formado entre tanto. La torta filtrante se enjuagó con MTBE varias veces, que se secó a continuación a temperatura ambiente, dando 0,8 g de un producto en bruto de aproximadamente 55% de pureza según se determinaba

15 mediante HPLC. El rendimiento total conjuntamente a lo largo de las etapas 2 y 3 era aproximadamente 55%.

4. Experimentos de escisión comparativos y análisis de LC-MS para la síntesis de hirulog-8 o su fragmento tetrapeptídico C-terminal bien sobre resina de Wang o bien sobre CTC-resina.

20 Usando análisis de HPLC LC-MS, podría observarse que, durante la escisión de la resina y la desprotección global en condiciones fuertemente ácidas, 110% del producto peptídico se alquilaba en el caso de la resina de Wang, mientras que tal modificación no podía observarse durante la escisión desde la CTC-resina. El análisis de MS permitía cartografiar esa modificación en el

25 residuo de tirosilo. Procedimiento sintético como el descrito anteriormente.

Claims

1. Conjugado de péptido-resina A-W, en el que A es P-X1-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-X2en donde

5 P es hidrógeno o un grupo protector seleccionado del grupo que consiste en Boc, Fmoc, Dde, Nps, Alloc y Z; X1 es un resto peptidilo de 0 a 200 aminoácidos, que comprende opcional-mente grupos protectores sobre cadenas laterales de aminoácidos individuales;

10 R4, R5, R6, R7, R8 y R9 son grupos protectores de cadenas laterales de aminoácidos; X2 es un solo residuo de aminoácido que está conectado al material compuesto en fase sólida de fórmula (II) a través de -O-y que opcionalmente está protegido en la cadena lateral; y

15 W es un material compuesto en fase sólida de fórmula

imagen1

en el que R1” es hidrógeno, 4-(alquilo C1-C4) o 4-(alcoxi C1-C4), R2” es cloro, hidrógeno, 4-(alquilo C1-C4) o 4-(alcoxi C1-C4), siendo R1” y

20 R2” iguales o diferentes, con la condición de que solo uno de R1”, R2” pueda ser hidrógeno, y con la condición de que R1” sea hidrógeno si R2” es 2-cloro; y R”’ es una fase sólida.

2. Conjugado de péptido-resina de acuerdo con la reivindicación 1, caracteri25 zado porque R1” es hidrógeno y R2” es 2-cloro, 4-metoxi o 4-metilo.

3.: Conjugado de péptido-resina de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque tanto R1” como R2” son 4-metoxi.

4.: Conjugado de péptido-resina de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la fase sólida R”’ es una resina polímera.

5.: Conjugado de péptido-resina de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque X2 es Leu.

6.: Conjugado de péptido-resina de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque X2 no es Tip, Cys o Arg.

7.: Conjugado de péptido-resina de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque X1 comprende de 0 a 50 residuos de aminoácido.

8.: Conjugado de péptido-resina de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque R9 es terc-butilo.

9.: Conjugado de péptido-resina de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en el que A se selecciona de Boc-D-Phe-Pro-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-O-, Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-O-y H-D-Phe-Pro-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-O-, y en el que R2 y R3 son grupos protectores de cadenas laterales de aminoácidos y la fase sólida es insoluble.

10.: Conjugado de péptido-resina de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la fase sólida es polímera y tiene un tamaño de malla de malla 100 a 400 (US Bureau of Standards).

11.: Conjugado de péptido-resina de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque R2 es pentametildihidrobenzofurano, adamantiloxicarbonilo o isoborniloxicarbonilo; R9 es terc-butilo; y R3 a R8 son grupos protectores lábiles frente a ácidos.

12.: Conjugado de péptido-resina de acuerdo con las reivindicaciones 9 u 11, caracterizado porque R2 es Pbf y R4 a R9 son grupos protectores lábiles frente a ácidos que requieren ácido trifluoroacético al menos al 50% para la retirada.

13.: Conjugado de péptido-resina de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado porque R3 es tritilo; y R4, R5, R6, R7 y R8 son terc-butilo.

14.: Conjugado de péptido-resina de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque R9 es terc-butilo.

15.: Conjugado de péptido-resina de acuerdo con una de las reivindicaciones 9 u 11 a 14, caracterizado porque el resto -Arg(R2)-Pro- es -Arg[psiCH2NH]Pro-.