KR20120069288A

KR20120069288A - 수용성 당 알코올을 이용한 비바리루딘의 정제방법

Info

Publication number: KR20120069288A
Application number: KR1020100130776A
Authority: KR
Inventors: 김석인; 김도영; 임채영; 정기훈; 김주성; 주소경; 김완주
Original assignee: 주식회사 씨트리
Priority date: 2010-12-20
Filing date: 2010-12-20
Publication date: 2012-06-28

Abstract

본 발명은 고순도의 비바리루딘을 정제하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 비바리루딘 수용액에 수용성 당 알코올을 첨가하고, 상기 혼합물에 가성소다를 첨가하여 pH를 조절하고, 그리고 컬럼크로마토그래피에 적용시키는 것을 포함한다.
본 발명에 따르면, 펩타이드 원료 의약품의 생산에 있어서 가장 중요한 공정중에 하나인 정제공정에서 비바리루딘을 산업용 크로마토그래피에 적용시 펩타이드의 겔화가 이루어지지 않기 때문에, 고농도 고순도의 비바리루딘이 대량으로 제조되고, 원료, 용매, 폐기물 등의 절감으로 인해 펩타이드 원가 절감 효과를 가져올 수 있다.

Description

수용성 당 알코올을 이용한 비바리루딘의 정제방법{Purification method of bivalirudin using soluble sugar alcohol}

본 발명은 비바리루딘의 정제 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 수용성 당 알코올을 사용하여 고순도의 비바리루딘을 정제하는 방법에 관한 것이다.

비바리루딘(bivalirudin)은 항혈전성 펩타이드로서, 분자량 2180.29이고 20개의 아미노산으로 이루어져 있다.

비바리루딘의 아미노산 서열(Amino acid sequence)은 D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH 이다. 비바리루딘은 지용성 아미노산인 페닐알라닌, 프롤린, 루이신, 타이로신 등으로 이루어지므로, 물에 대한 용해성이 낮으며, 지용성 아미노산의 응집현상으로 인해 하이드로겔이 형성된다. 이와 같이, 비바리루딘은 용해성이 낮고 하이드로겔 발생하기 때문에, 산업용 크로마토그래피에 적용시켜 대량으로 정제하기 어려운 항혈전성 펩타이드로 알려져 있다.

종래에는 저농도의 비바리루딘을 장시간에 걸쳐 컬럼크로마토그래피 적용시키어 비바리루딘을 정제하는 방법이 이용되어 왔다. 그러나, 정제 공정 중, 비바리루딘의 안정성이 낮아져서 유연물질이 발생하고, 오랜 공정소요시간으로 인해 정제공정이 효율적이지 못하기 때문에, 펩타이드의 제조원가가 높아지는 단점이 있었다.

따라서, 정제공정 비용 효율적이고 대량으로 고순도의 비바리루딘을 분리할 수 있는 방법이 요구되어 왔다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 정제공정을 꾸준히 연구한 결과, 비바리루딘 수용액에 수용성 당 알코올을 첨가하고, pH를 조절할 경우, 비바리루딘의 용해도가 현저하게 증가하고, 펩타이드의 겔이 되는 현상이 없어지기 때문에, 컬럼크로마토그래피에 적용시 고순도의 비바리루딘이 분리될 수 있다는 것을 발견하였다.

본 발명에 따르면, 비용 효율적이고 대량으로 고순도의 비바리루딘이 분리될 수 있다.

본 발명은 고순도의 비바리루딘을 정제하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 비바리루딘 수용액에 수용성 당 알코올을 첨가하고, 상기 혼합물에 pH 조절제를 첨가하여 pH를 조절하고, 그리고 컬럼크로마토그래피에 적용시키는 것을 포함한다.

본 발명의 정제방법에 따르면, pH 조절제는 초산, 구연산, 젖산, 가성소다, 탄산나트륨, 수산화칼슘, 암모이아수로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 정제방법에 따르면, 수용성 당 알코올은 소비톨, 자일리톨, 만니톨, 에리스리톨, 말티톨, 락티톨로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 한 구현예에 따르면, 상기 수용성 당 알코올은 만니톨인 것이 바람직하다.

본 발명의 정제방법에 따르면, 비바리루딘 수용액과 수용성 당 알코올 혼합물의 pH는 가성소다에 의해 4.0 내지 10으로 조절될 수 있다. 본 발명의 한 구현예에 따르면, 상기 pH는 5 내지 6으로 조절되는 것이 바람직하다.

본 발명의 정제방법에 따르면, 상기 비바리루딘 수용액의 농도는 50mg/ml 내지 500mg/ml일 수 있다. 본 발명의 한 구현예에 따르면, 상기 비바리루딘의 농도는 350mg/ml 내지 450mg/ml인 것이 바람직하다.

본 발명의 정제방법에 따르면, 컬럼크로마토그래피의 온도는 10~30℃일 수 있다.

또한, 본 발명의 정제방법에 의해 정제된 고순도의 비바리루딘은 추가로 농축공정 방법으로 농축하여 동결건조될 수 있다.

본 발명의 정제방법에 따르면, 공정 중, 비바리루딘의 안정성이 증가하여 순도가 99.0% 이상이고 유연물질의 총함량이 1.0% 이하로 최소화된 고순도의 비바리루딘이 분리될 수 있다.

따라서, 고순도의 비바리루딘이 대량으로 제조되고, 원료, 용매, 폐기물 등의 절감으로 인해 펩타이드 원가 절감 효과를 가져올 수 있다.

도 1은 비바리루딘 수용액을 산업용크로마토그래피에 적용시킨 HPLC 정제 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 비바리루딘 수용액에 수용성 당 알코올을 첨가한 후 산업용크로마토그래피에 적용시킨 HPLC 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 비바리루딘 수용액에서 농도 증가시, 수용성 당 알코올 및 pH 조절제의 첨가 유무에 따른 겔 형성 결과의 차이를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명은 하기의 실시예에 의하여 구체적으로 설명될 것이다. 그러나, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

<사용 기기>

산업용 HPLC는 국내 영진바이오크롬 장비을 사용하였다.

분석용 HPLC는 씨마즈(Shimazu Model NO 20AVP) HPLC 시스템을 사용하였다.

<비바리루딘 순도 측정>

씨마즈(Shimazu Model No 60AVP) HPLC의 분석기기를 사용하여 ODS C-18 column을 사용하여 순도를 측정하였다.

<제조예>

비교예 1: 비바리루딘의 정제

비바리루딘을 100㎎/㎖, 30ml의 농도와 양으로 정제수에 용해하였다. 상기 수용액의 샘플을 컬럼크로마토그래피에 유속 200ml/min의 속도로 주입한 후, 아세토나이트릴을 순차적인 분배 증가 방법에 의해 60분 동안 흘려 보내 주었다.

그 다음, 컬럼크로마토그래피를 통과한 활성부위의 용액을 수집하고, 상기 용액을 동결건조를 하여, 비바리루딘의 목적 건조분말을 얻었다.

수득량 : 1.86g, 수율 : 62.0%, 순도: 95.4%

실시예 1: 만니톨을 이용한 비바리루딘의 정제

비바리루딘을 만니톨을 이용하여 비바리루딘의 절반의 농도로 녹인 후, 비바리루딘을 400㎎/㎖, 30ml의 농도와 양으로 정제수에 용해하고, 가성소다를 첨가하여 pH를 5~6으로 조절하였다. 그 다음, 상기 수용액 샘플을 컬럼크로마토그래피에 유속 200ml/min인 속도로 주입한 후, 아세토나이트릴을 순차적인 분배 증가 방법에 의해서 60분간 흘려보내 주었다.

수득량 : 7.8g, 수율 : 65.0%, 순도: 99.5%

실시예 2: 소비톨 이용한 비바리루딘의 정제

비바리루딘을 소비톨을 이용하여 비바리루딘의 절반의 농도로 녹인 후, 비바리루딘을 400㎎/㎖, 30ml의 농도와 양으로 정제수에 용해하고, 가성소다를 첨가하여 pH를 5~6으로 조절하였다. 그 다음, 상기 수용액 샘플을 컬럼크로마토그래피에 유속 200ml/min인 속도로 주입한 후, 아세토나이트릴을 순차적인 분배 증가 방법에 의해서 60분간 흘려보내 주었다.

수득량 : 7.36g, 수율 : 61.3%, 순도: 98.5%

실시예 3: 말티톨을 이용한 비바리루딘 정제

비바리루딘을 만티톨을 이용하여 비바리루딘의 절반의 농도로 녹인 후, 비바리루딘을 400㎎/㎖, 30ml의 농도와 양으로 정제수에 용해하고, 가성소다를 첨가하여 pH를 5~6으로 조정하였다. 그 다음, 상기 수용액 샘플을 컬럼크로마토그래피에 유속 200ml/min인 속도로 주입한 후, 아세토나이트릴을 순차적인 분배 증가 방법에 의해서 60분간 흘려보내 주었다.

수득량 : 7.64g, 수율 : 63.6%, 순도: 97.4%

<결과>

통상적인 방법에 의해 정제한 비교예 1에 따르면, 순도 95.4%의 비바리루딘이 1.86g 얻어졌으나, 본원발명의 실시예 1 내지 3에 따르면, 순도 98.1% 이상의 비바리루딘이 5.64g 얻어졌다. 특히, 수용성 당 알코올로서 만니톨을 사용한 실시예 2의 경우, 99.1%의 순도를 갖는 비바리루딘이 7.8g 얻어졌다. 이로부터, 수용성 당 알코올을 사용하는 것에 의해 고순도의 비바리루딘이 대량으로 정제가 가능함을 알 수가 있었다.

Claims

고순도의 비바리루딘을 정제하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:
비바리루딘 수용액에 수용성 당 알코올을 첨가하고,
상기 혼합물에 pH 조절제를 첨가하여 pH를 조절하고, 그리고
컬럼크로마토그래피에 적용시키는 것을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, pH 조절제는 초산, 구연산, 젖산, 가성소다, 탄산나트륨, 수산화칼슘, 암모이아수로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 수용성 당 알코올은 소비톨, 자일리톨, 만니톨, 에리스리톨, 말티톨, 락티톨로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 pH는 4.0 내지 10으로 조절되는 것인 방법.
제1항 있어서, 상기 비바리루딘 수용액의 농도는 50mg/ml 내지 500mg/ml인 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합물은 컬럼크로마토그래피에 유속 50ml 내지 500ml/min로 적용되는 것인 방법.