NO303391B1 - FremgangsmÕte for fast-fasesyntese av et peptid - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fast-fasesyntese av et peptid inneholdende en aminosyre som inneholder en tert-butyloksygruppe i sin sidekjede og et C-terminalt aza-glycin. Nærmere bestemt angår den en fast-fasemetode for peptidsyntese hvor man blant annet kan fremstille dekapeptidet goserelin.

Fast-fasesyntesen av peptider har vært kjent i nesten 30 år etter Merrifields banebrytende arbeid, som først ble publisert i 1962. Det generelle prinsipp bak denne type syntese er som følger: (a) En N-beskyttet aminosyre (den beskyttende gruppen er vanligvis t-butoksykarbonyl, forkortet Boe) festes til et fast, ikke-oppløselig underlag (vanligvis en polystyren-harpiks) ved sin karboksyliske ende via en forbindende gruppe (vanligvis en benzylester). (b) Den N-beskyttende gruppen fjernes ved hjelp av midler eller fremgangsmåter som ikke løsner aminosyren fra det faste underlaget, og en annen N-beskyttet aminosyre kobles til den som allerede er tilfestet (vanligvis ved hjelp av et karbodiimid-koblingsmiddel). (c) Denne sekvens gjentas ved å bruke så mange N-beskyttede aminosyrer som er ønskelig eller nødvendig inntil man har fått dannet det forønskede peptidet, som stadig er festet ved sin karboksylende til det faste underlaget. (d) Den avsluttende N-beskyttende gruppen fjernes, og peptidet skilles fra det faste underlaget ved å spalte den bindende gruppen (vanligvis ved å bruke en sterk syre).

Hele syntesen kan maskinstyres og i visse tilfeller kan peptidet dannes uten manuell innblanding. De Boc-beskyttende gruppene fjernes ved hjelp av trifluoreddiksyre, og peptid-kjeden kan fjernes fra det faste underlaget med en sterkere syre, f.eks. hydrofluorsyre.

Etter at denne teknikken ble oppfunnet er det innført mange modifikasjoner, men selve fremgangsmåten er generelt i alt vesentlig den samme som da den ble beskrevet. To større forbedringer har vært bruken av et polyamid som det faste underlaget og bruken av en N-fluoren-9-ylmetoksykarbonyl- (Fmoc) beskyttende gruppe for Na-gruppen i aminosyren. Fmoc-gruppen erkarakterisert vedå være labil overfor baser (vanligvis piperidin). For ytterligere detaljer henvises det til Atherton and Sheppard, "Solid phase peptide synthesis - a practical approach", IRL Press ved Oxford University Press, 1989; Barany et al., "Solid phase peptide synthesis: a silver anniversary report", Int. J. Peptide Protein Res., 1987, 3_p_, 705-739 og Fields et al., ibid. 1990, 35, 161-214.

I den foreliggende beskrivelse vil man bruke standardforkortelser for aminosyrene, de beskyttende grupper, koblings-midlene og lignende. For å unngå tvil og dette gjelder også de Boc-grupper og Fmoc-grupper som er definert ovenfor, så vil man i det etterfølgende bruke følgende standardforkortelser:

Arg arginin

Azgly azaglycin (H2N-NH-COOH)

D-Ser D-serin

Gip pyroglutaminsyre

His histidin

Leu leucin

Pro prolin

Ser serin

Trp tryptofan

Tyr tyrosin

DIPC di-isopropylkarbodiimid

HOBt 1-hydroksybenzotriazol

DMF N,N-dimetylformamid

BrZ 2-brombenzyloksykarbonyl

Bu~ tert-butyl

Bzl benzyl

Goserelin er en LHRH-analog som brukes ved behandling av kreft i prostata og bryst og i forbindelse med visse gynekolo-giske tilstander. I den førstnevnte behandlingen virker peptidet som et kjemisk kastrasjonsmiddel. Dets struktur er følgende:

Det fremgår at det er to trekk ved denne strukturen som er inkompatible med den vanlige faste fasepeptidsyntesen. Det første avviket er den Azgly-karboksyterminale aminosyren, og fremgangsmåter for å binde en slik gruppe til et fast underlag er ikke kjent, skjønt Knolle et al., Peptides 1990, 414-415, beskriver tilfestingen av dipeptidet Pro-Azgly til en amino-metylharpiks ved hjelp av en substituert fenylpropionsyre-forbindende gruppe. Fri azaglycin har selvsagt en terminal

-NH-COOH-gruppe, som er en ustabil karbaminsyre.

Det andre avviket i goserelin som er uforenelig med tradisjonell fast-fasesyntese, er den tert-butyl<g>ruppen som er festet til D-seringruppen. For å beholde denne gruppen kan man ikke bruke de tradisjonelle metoder for å fjerne det fullsten-dige peptidet fra det faste underlag, dvs. man kan ikke bruke en sterk syre.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstilling åv goserelin og andre peptider som inneholder C-terminale aza-aminosyrer ved fast-fasesyntese.

Ifølge oppfinnelsen tilveiebringes en fremgangsmåte for fast-fasesyntese av et peptid som inneholder en aminosyre som inneholder en tert-butyloksygruppe i sin sidekjede og et C-terminalt aza-glycin,karakterisert vedat den omfatter: (i) å sette sammen alle aminosyrene i peptidet unntatt den C-terminale aza-glycingruppen ved vanlig kjent fast-fasesyntese og bruke en linkergruppe for å binde aminosyren inneholdende tert-butyloksygruppen i sin sidekjede til den faste fasen hvilken linkergruppe er labil ved bruk av hydrazin; og (ii) avspalte peptidet fra underlaget ved hjelp av hydrazin eller et substituert hydrazin; og (iii) reagere det således frigjorte hydrazid med et cyanation for derved å få fremstilt det nevnte peptid.

De to første trinnene i denne fremgangsmåten danner først et peptid med en karboksylende med følgende formel: hvor R er hydrogen (i Azgly) eller en slik gruppe at I^N-NR-COOH er en aza-analog av en aminosyre, og deretter et peptid med følgende karboksylende:

Avspaltingen av peptidet fra underlaget kan utføres ved å bruke hydrazin eller et substituert hydrazin i en oppløsning iDMF, N-metylpyrrolidon eller et tilsvarende oppløsningsmiddel.

Et egnet cyanation kan tilveiebringes ved hjelp av et alkalimetallcyanat, f.eks. kalium- eller natriumcyanat. Reaksjonen kan utføres under vandige sure betingelser.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre en fremgangsmåte for fast-fasesyntese av et peptid som inneholder en aminosyre som i sin sidekjede har en tertiær butyloksygruppe, som erkarakterisert vedat man bruker en bindende gruppe som forbinder aminosyren til det faste underlaget, og som er labil under betingelser som ikke spalter en 0-tert-butylgruppe.

En egnet bindende gruppe er en som kan spaltes ved å bruke hydrazin og som ikke spalter den tertiære butyleteren, f.eks. benzylesteren. Egnede betingelser som vil fjerne peptidet fra harpiksen uten også å fjerne den tertiære butylgruppen i sidekjeden, er f.eks. hydrazin.

Aminosyrer som inneholder en tertiær butyloksygruppe i sidekjeden er f.eks. serin, D-serin-treonin, tyrosin og hydroksyprolin.

Mer spesielt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for fast-fasesyntese av goserelin som innbefatter fremgangsmåte-trinnene som angitt i krav 1.

Oppfinnelsen er illustrert av det følgende eksempelet:

Eksempel

( a) Fast fasefremstillinq av nonapeptid

Den faste fasesyntesen ble utført automatisk i et Applied Biosystems 43OA peptidsyntesizerapparat ved å bruke en Boc-Pro-OBzl-polystyrenharpiks 1% tverrbundet med divinylbenzen (Peninsula Laboratories, 1,25 g, 0,38 meq/g, nominelt 0,7 meq/g). De følgende beskyttede aminosyrer ble omdannet til benzo-triazolylestere ved en reaksjon med HOBt og DIPC i DMF umiddel-bart før bruk. De beskyttede aminosyrer ble koblet i følgende sekvens:

Operasjonsrekkefølgen for de to første trinnene (ved å bruke nevnte Boc-beskyttede aminosyrer) var som følger: fjerning av Boe med 45% trifluoreddiksyre i diklormetan;

10% DIEA/DMF vasking;

kobling (2 ekvivalenter av den beskyttede aminosyre HOBt-ester);

fjerning av Boe som angitt ovenfor.

Operasjonsrekkefølgen for de siste seks trinnene (ved å bruke Fmoc-beskyttede aminosyrer) var som følger: fjerning av Fmoc med 20% piperidin/DMF; 0,5 molar HOBt/DMF vasking; kobling (1 ekvivalent av den beskyttede aminosyre HOBt-ester). Alle koblingsreaksjonene, unntatt når man brukte Boc-Arg(HCl)-OH varte 1 time, mens Boc-Arg(HCl)-OH-koblingen varte 2 timer. Man fikk på denne måten fremstilt nonapeptidharpiksen (1,7 g; 0,29 mmol peptid pr. gram) hvor Tyr-gruppen var beskyttet av BrZ.

( b) Avspalting av peptidet fra harpiksen

Peptidharpiksen fremstilt som beskrevet ovenfor, ble behandlet med 20 gangers overskudd av vannfri hydrazin i 20 ml DMF ved 20°C i 24 timer, hvoretter blandingen ble filtrert og fordampet til tørrhet. Denne fremgangsmåten fjernet også den BrZ-beskyttende gruppen fra Tyr-gruppen. Fordampningsresten ble renset ved gelfiltrering på en kolonne (LH 20 Sephadex) ved å bruke en 20:1 v/v-blanding av vann og eddiksyre som eluerings-middel. Man fikk på denne måten fremstilt:

hvis struktur ble bekreftet ved en aminosyreanalyse og en FAB-massespektroskopi (M+H)<+>= 1226.

( c) Fremstilling av goserelin

En oppløsning av 11 mg kaliumcyanat i 1,36 ml vann ble porsjonsvis i løpet av 1 time tilsatt en oppløsning av 118 mg av det ovennevnte hydrazid i 10 ml av en 20:1 v/v-blanding av vann og eddiksyre. Blandingen ble frysetørket, og resten ble renset ved en reversert f asekolonnekromatograf i (Dynamax 60Å, C-, Q, en diameter på 2,5 cm) ved å bruke en gradient fra 10 til 40 volum-% acetonitril i vann inneholdende 0,1% trifluoreddik-syre.- Man fikk således fremstilt 100 mg goserelin (25% utbytte), og-strukturen ble bekreftet ved FAB-massespektro-skopi, som ga et karakteristisk masseion ved 1269.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte for fast-fasesyntese av et peptid inneholdende en aminosyre som inneholder en tert-butyloksygruppe i sin sidekjede og et C-terminalt aza-glycin,karakterisert vedat den omfatter: (i) å sette sammen alle aminosyrene i peptidet unntatt den C-terminale aza-glycingruppen ved vanlig kjent fast-fasesyntese og bruke en linkergruppe for å binde aminosyren inneholdende tert-butyloksygruppen i sin sidekjede til den faste fasen hvilken linkergruppe er labil ved bruk av hydrazin; og (ii) avspalte peptidet fra underlaget ved hjelp av hydrazin eller et substituert hydrazin; og (iii) reagere det således frigjorte hydrazidet med et cyanation for derved å få fremstilt det nevnte peptid.

2. Fremgangsmåte for fast-fasesyntese av et peptid i henhold til krav 1,karakterisert vedat peptidet er goserelin.