KR20210084777A - 고상 합성법을 이용한 루프로라이드의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 일실시예는 고분자 지지체 수지를 이용하며, 펩타이드-수지로부터 수지를 분리하는 동시에 에틸아민을 커플링하는 고상(solid-phase) 합성법을 이용한 루프로라이드의 제조방법에 관한 것으로 분리 및 정제가 용이한 이점이 있다.

Description

고상 합성법을 이용한 루프로라이드의 제조방법 {METHOD FOR PREPARING LEUPROLIDE USING SOLID-PHASE SYNTHESIS}
본 발명은 고상(solid-phase) 합성법을 이용한 루프로라이드의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 고분자 지지체 수지를 이용하며, 펩타이드-수지로부터 수지를 분리하는 동시에 에틸아민을 커플링하여, 합성단계의 간소화와 수득률과 순도를 높일 수 있는 고상 합성법을 이용한 루프로라이드의 제조방법에 관한 것이다.
LHRH(황체형성호르몬 방출 호르몬, Luteinizing Hormone Releasing Hormone)은 GnRH(성선자극호르몬 방출 호르몬)으로도 알려져 있으며, 척추 동물의 생식계를 조절하는 시상하부 데카펩티드(pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2)이다. LH-RH 작용제는 뇌하수체에서 LHRH 수용체를 고갈시켜 LHRH 자극에 대하여 뇌하수체 수용체가 탈감되도록 유도하여 LH 분비를 억제한다. 또한, LHRH 작용제 및 길항제는 여성의 자궁내막증, 섬유종, 다낭난소증, 유방암, 난소암 및 자궁내막암, 의료-보조된 출산 프로토콜 동안의 성선자극 뇌하수체 탈감작증의 치료, 남성의 양성 전립선과 다형성증 및 전립선암의 치료, 및 남성 또는 여성의 성조숙증의 치료에 효과적인 것으로 나타났다. 이러한 LH-RH 작용제는 대표적으로 루프로라이드가 있다.
펩타이드를 화학적으로 합성하는 방법은 크게 용액상 합성법(solution-phase)과 고상 합성법(solid-phase)으로 나눌 수 있다. 용액상 합성법은 고전적인 화학 합성법으로 모든 시약을 용액에 녹인 상태에서 반응시키는 방법으로, 비용이 적게들고 빠른 반응 속도의 장점이 있지만, 반응 단계수가 많고, 각 단게별로 중간체를 유리해야 하고, 이성질체가 생길 가능성이 있어 분리 정제가 어렵다는 단점이 있다. 고체상 합성법은 메리필드(R. B. Merrifield)가 고체상 펩타이드 합성(solid phase peptide synthesis)에 관한 이론을 제기한 이래 발전해온 방법으로, 분리정제가 간편하며 자동화가 가능하다는 장점이 있다.
종래의 루프로라이드의 제조방법은 용액상 합성법만을 사용하거나, 용액상 합성과 고상합성을 결합한 방법을 사용하고 있었다. 미국특허 제4,008,209호, 미국특허 제6,448,031호, 유럽특허 제1790656호는 액상(solution-phase) 합성방법으로 루프로라이드를 제조하는 기술을 기재하고 있다. 그러나 상기 제조방법은 제조단계수가 많고 제조공정이 까다로울 뿐만 아니라 제조 수율이 낮아 상업적 대량생산 시 가격적 경쟁력이 떨어지는 단점이 있다. 미국특허 제20130060004호, 중국특허 제101195653호는 고상합성과 액상반응을 결합한 방법으로 루프로라이드를 제조하는 기술이 기재되어 있다. 그러나 상기 방법들은 액상반응이 내포되어 있어 상업적 대량생산에서 생산성이 떨어지는 단점이 있다. 미국특허 제5,602,231호, 미국특허 제6,897,289호, 유럽특허 제0518655호, 유럽특허 제1777232호는 루프로라이드와 같은 LH-RH계열의 펩타이드를 고상 (solid-phase)합성방법으로 제조하는 기술을 기재하고 있다. 상기 유럽특허 제1777232호에 기재되어 있는 방법으로 루프로라이드를 합성하는 경우, 1단계의 액상반응이 있을 뿐만 아니라 HPLC상 루프로라이드 피크(Peak)주위에 불순물이 많아서 정제가 매우 어려운 단점이 있다.
이에, 고체상 합성방법에 의한 루프로라이드의 제조방법의 개발이 요구되고 있으나, 분리하기 어려운 불순물, 예를 들어, 루프로라이드에 프롤린이 추가된 루프로라이드-프롤린이 생성된다. 상기 불순물은 HPLC 상 루프로라이드 피크에 근접한 위치에 피크를 나타내어 정제가 어려워 고순도의 루프로라이드를 얻으려면 수율이 많이 떨어지므로, 그동안 고체상 합성방법에 의한 루프로라이드의 제조방법이 개발되지 못한 실정이었다.
이에, 본 발명자들은 상기와 같은 문제를 해결하기 위해 연구하던 중 고분자 지지체 수지를 이용하며, 펩타이드-수지로부터 수지를 분리하는 동시에 에틸아민을 커플링하여, 합성단계의 간소화와 수득률과 순도를 높일 수 있는 고상(solid-phase) 합성법을 이용한 루프로라이드의 제조방법을 제안하였다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 고분자 지지체 수지를 이용하며, 펩타이드-수지로부터 수지를 분리하는 동시에 에틸아민을 커플링하여, 합성단계의 간소화와 수득률과 순도를 높일 수 있는 고상(solid-phase) 합성법을 이용한 루프로라이드의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일실시예는,
고분자 지지체 수지에 아미노산 또는 아미노산 유도체들을 순차적으로 결합시켜 하기 화학식 1로 표시되는 펩타이드-수지를 제조하는 제1단계;
상기 제1단계에서 얻은 펩타이드-수지에 에틸아민을 처리하여 수지에서 펩타이드를 분리하는 동시에 에틸아민이 커플링된 화학식 2로 표시되는 펩타이드를 수득하는 제2단계;
상기 제2단계에서 얻은 펩타이드를 탈보호화하는 제3단계를 포함하는,
고상(solid-phase) 합성법을 이용한 루프로라이드의 제조방법을 제공한다.
[화학식 1]
pGlu-His(R1)-Trp(R2)-Ser(R3)-Tyr(R3)-D-Leu-Leu-Arg(R4)-Pro-O-수지(resin)
[화학식 2]
pGlu-His(R1)-Trp(R2)-Ser(R3)-Tyr(R3)-D-Leu-Leu-Arg(R4)-Pro-NHEt
상기 화학식에서, R1은 수소이거나, t-부틸옥시카보닐기, 벤질옥시카보닐기, 메톡시메틸기, 벤질옥시메틸기, 트리페닐메틸기, 벤질기 및 알릴기로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기이고,
R2는 수소이거나, t-부틸옥시카보닐기, 벤질옥시카보닐기, 메톡시메틸기, 벤질옥시메틸기, 트리페닐메틸기, 벤질기 및 알릴기로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기이며,
R3는 수소이거나, p-메톡시벤질기, 메톡시메틸기, 벤질옥시메틸기, 테트라히드로피란기, 테트라히드로퓨란기, t-부틸기, 트리페닐메틸기, 벤질기, 알릴기, 트리메틸실릴기, t-부틸디메틸실릴기, 트리페닐실릴기, 트리이소프로필실릴기, t-부틸카르보닐기, 아세틸기 및 벤조일기로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기이며,
R4은 t-부틸옥시카보닐기, 벤질옥시카보닐기, 메톡시메틸기, 벤질옥시메틸기, 트리페닐메틸기, 벤질기, 알릴기, t-부틸디메틸실릴기, 트리페닐실릴기, 트리이소프로필실릴기, 니트로기, 2,2,5,7,8-펜타메틸크로멘-6-설포닐기, 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠설포닐기, 2,2,4,6,7-펜타메틸-디히드로벤조퓨란-5-설포닐기 및 토루엔설포닐기로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기이다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 제1단계에서의 수지는 PAM 수지, Wang 수지 또는 Hydroxymethyl 수지인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 R1, R2, R3, 및 R4는 각각 트리페닐메틸기, t-부틸옥시카보닐기, t-부틸기, 및 2,2,4,6,7-펜타메틸-디히드로벤조퓨란-5-설포닐기인 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 제1단계는 상기 고분자 지지체 수지에Boc-Pro-OH를 반응시킨 후 Boc기를 제거하여 펩타이드-수지를 수득하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 제1단계는 펩타이드-수지에 Fmoc-(AA)n-OH(n은 1 내지 8)를 반응시킨 후 Fmoc을 제거하는 단계를 1회 이상 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 제2단계는 상기 펩타이드-수지에 THF와 에틸아민(ethylamine)수용액의 혼합액을 처리하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 THF 와 에틸아민 수용액의 부피비는 1:2 내지 2:1인 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 본 발명은 고상(solid-phase) 합성법으로 루프로라이드(Leuprolide)를 제조할 수 있는 새로운 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 실시예에 따르면, 본 발명으로 제조된 루프로라이드는 분리 및 정제가 용이함으로써 상업적 대량 생산이 가능하다는 이점을 가질 수 있다.
더불어, 본 발명의 실시예에 따르면, 본 발명은 당업 기술 분야에서 이용하는 루프로라이드 제조방법보다 간단한 제조공정을 제공함으로써 생산 비용 면에서 매우 경제적인 효과를 나타낼 수 있다. 특히, 단일공정에 의해 루프로라이드-수지로부터 루프로라이드를 분리하며 동시에 에틸아민을 부가할 수 있어 생산 효율이 증가될 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본원 발명의 신규한 루프로라이드 제조 공정의 전체적인 개략도를 나타낸 것이다.
이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결(접속, 접촉, 결합)"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 부재를 사이에 두고 "간접적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다. 또한 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
이하 첨부된 도면을 참고하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하기로 한다.
본원의 제 1 측면은,
고상(solid-phase) 합성법을 이용한 루프로라이드의 제조방법을 제공한다.
이하, 본원의 제 1 측면에 따른 상기 고상(solid-phase) 합성법을 이용한 루프로라이드의 제조방법을 단계별로 상세히 설명한다.
[화학식 1]
pGlu-His(R1)-Trp(R2)-Ser(R3)-Tyr(R3)-D-Leu-Leu-Arg(R4)-Pro- 수지(resin)
[화학식 2]
pGlu-His(R1)-Trp(R2)-Ser(R3)-Tyr(R3)-D-Leu-Leu-Arg(R4)-Pro-NHEt
약어의 정리
본 명세서에서 특별한 표시가 없는 한, 아미노산 및 보호기의 지정에 사용되는 약어는 IUPAC-IUB의 생화학 용어 위원회(Commission of Biochemical Nomenclature)에서 권장하는 용어에 기초한다(Biochemistry, 11:1726-1732(1972)).
본 명세서에서 사용한 아미노산 및 보호기의 약어는 다음과 같다:
PAM: 4-히드록시메틸-페닐아세트아미도메틸 레진
(4-Hyroxymethyl-phenylacetamidomethyl Resin)
Tyr: 티로신(Tyrosin)
Glu: 글루타믹 애시드(Glutamic acid)
pGlu: 피로글루타믹 애시드(Pyroglutamic acid)
Ser: 세린(Serine)
Arg: 아르기닌(Arginine)
Pro: 프롤린(Proline)
Leu: 루신(Leucine)
His: 히스티딘(Histidine)
Ala: 알라닌(Alanine)
Trp: 트립토판(Tryptophane)
Et: 에틸(Ethyl)
Boc: t-부틸옥시카보닐(t-butyloxycarbonyl)
tBu: t-부틸(t-butyl)
Fmoc: 9-플루오레닐메톡시옥시카보닐(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)
Trt: 트리페닐메틸(triphenylmetyl)
Mtr: 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠설포닐(4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl)
Pmc: 2,2,5,7,8-펜타메틸크로멘-6-설포닐(2,2,5,7,8-pentamethyl-croman-6-sulfonyl)
Tos: 토루엔설포닐(toluensulfonyl)
Pbf: 2,2,4,6,7-펜타메틸-디히드로벤조퓨란-5-설포닐(2,2,4,6,7-Pentamethyl-dihydrobenzofuran-5-sulfonyl)
제1단계
우선, 본원의 일 구현예에 있어서, 고분자 지지체 수지에 아미노산 또는 아미노산 유도체들을 순차적으로 결합시켜 하기 화학식 1로 표시되는 펩타이드-수지를 제조하는 제1단계를 포함한다:
[화학식 1]
pGlu-His(R1)-Trp(R2)-Ser(R3)-Tyr(R3)-D-Leu-Leu-Arg(R4)-Pro-O-수지(resin)
본원에서 사용되는 용어 "고분자 지지체"는 사용되는 매질에서 실질적으로 불용성일 뿐만 아니라 본원에서 기술한 시약 및 반응 조건에 대해 불활성인 기판을 의미한다. 대표적인 고체 지지체에는 규조토, 실리카 겔 및 조절된 포어 유리; 유기 중합체, 예를 들어 1 내지 2% 코폴리스티렌 디비닐 벤젠(겔 형태) 및 20 내지 40%의 코폴리스티렌 디비닐 벤젠(거대 다공 형태)를 포함하는 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리아크릴아미드, 셀룰로스 등; 및 복합 무기/중합체성 조성물, 예를 들어 규조토 입자의 매트릭스내에 지지되어 있는 폴리아크릴아미드가 포함된다[참조 문헌: J.M. Stewart and J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd, Ed., PierceChemical Co.(Chicago, IL, 1984)].
본원에서 사용되는 용어 "수지(resin)"는 고체 지지체가 본원에서 정의한 바와 같은 아미노산, 펩타이드 또는 사이클릭 펩타이드 단편의 카복시 또는 N-말단과 커플링되도록 조절하는 반응성 그룹으로 변형시킨 고체 지지체를 의미한다. 대표적인 수지에는 메리필드(Merrifield) 수지(클로로메틸화 폴리스티렌), 하이드록시메틸 수지, 2-클로로트리틸 클로라이드 수지, 트리틸 클로라이드 수지, 링크(Rink) 산 수지(4-벤질옥시-2',4'-디메톡시벤즈하이드롤 수지), 트리틸 알콜 수지, PAM 수지(4-하이드록시메틸페닐아세트아미도메틸 수지), 왕(Wang) 수지(p-벤질옥시벤질 알콜 수지), MBHA 수지(p-메틸벤즈하이드릴아민 수지), BHA 수지(벤즈하이드릴아민 수지), 링크 아미드 수지(4-(2',4'-디메톡시페닐-Fmoc-아미노메틸)펜옥시 수지) 및 PAL 수지(5-(4-Fmoc-아미노메틸-3,5-디메톡시펜옥시)발레르산-MBHA 수지)가 포함된다. 바람직한 수지는 고체상 합성법에 사용되는 수지 중에서도 하이드록시기, 구체적으로 하이드록시메틸 벤젠을 포함하는 수지인 PAM 수지, Wang 수지, 및 하이드록시메틸 수지 중 선택된 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PAM 수지일 수 있다. 상기 바람직한 수지를 사용하는 경우 에틸아민을 이용한 수지 제거 및 커플링 반응이 높은 수율로 진행될 수 있으며, 고순도의 펩타이드를 획득할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 PAM 수지는 0.8 내지 1.2 mmol/g으로 로딩된 것일 수 있으며, 바람직하게는 1.0 내지 1.1mmol/g으로 로딩된 것일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어, “아미노산” 및 “아미노산 유도체”는 루프로라이드를 구성하는 아미노산 및 아미노산 유도체를 의미한다. 구체적으로 본 발명의 루프로라이드는 pGlu-His(R1)-Trp(R2)-Ser(R3)-Tyr(R3)-D-Leu-Leu-Arg(R4)-Pro-NHEt의 화학식을 가진다. 여기에서 pGlu는 피로글루타민산(pyroglutamic acid), His는 히스티딘, Trp는 트립토판, Ser는 세린, Tyr은 티로신, D-Leu는 D-형 광학활성의 루신, Leu는 루신, Arg는 아르기닌, Pro는 프롤린을 의미한다. 본원에서 사용되는 용어, 아미노산 "유도체"는 모 아미노산의 공유 부착에 의한, 예를 들어 알킬화, 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등에 의한 치환 또는 변형을 갖는 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 치환된 연결뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 변형을 갖는 아미노산의 하나 이상의 유사체가 "유도체"의 정의 내에 추가로 포함된다.
본원에서 사용되는 용어, "보호기"는 분자 내 반응성 기에 부착되는 경우에 그 반응성을 차폐하거나, 감소시키거나 또는 방지하는 모이어티를 지칭한다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 아미노산 및 아미노산 유도체는 N-아미노기 및 축쇄 작용기 중 전부 또는 일부가 보호화된 것일 수 있다. 한편, 적절한 보호기의 선택은 보호되는 작용기, 보호기가 노출되는 조건 및 그 분자내에 존재할 수 있는 다른 작용기에 따라 달라질 수 있다. 상기 보호기는 합성 각 단계에서 ㈀ α-아미노보호기를 제거하기 위해 선택한 반응조건 및 시약에 대해 안정해야 하고, ㈁ 커플링반응에서 탈보호화반응이 일어나지 않아야 하며, ㈂ 원하는 아미노산 사슬을 포함하는 합성이 완결되었을 때 레진과의 분해 조건에서 안정하여야 한다. 상기 보호기는 본 발명의 제조방법의 수율 및 순도 결정에 영향을 미치므로 적절한 보호기의 선택이 필요하다.
또한, 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 아미노산 및 이의 유도체는 측쇄보호기를 가질 수 있다. 상기 화학식 1및 2에서 R1은 당업계에서 통상적으로 이용하는 수소 또는 이미다졸 보호기이며, R2는 당업계에서 통상적으로 이용하는 수소 또는 인돌 보호기, R3은 당업계에서 통상적으로 이용하는 수소 또는 수산기 보호기 및 R4는 당업계에서 통상적으로 이용하는 구아니딘니딘니딘 보호기일 수 있다. 구체적으로, 상기 이미다졸 보호기는, t-부틸옥시카보닐기(Boc), 벤질옥시카보닐기(“Cbz”또는 “Z”), 메톡시메틸기, 벤질옥시메틸기, 트리페닐메틸기(또는 트리틸, Trt), 벤질기 및 알릴기로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기이다. 바람직하게는 트리페닐메틸기 또는 t-부틸옥시카보닐기일 수 있으며, 더 바람직하게는 트리페닐메틸기일 수 있다. 상기 인돌 보호기는 t-부틸옥시카보닐기, 벤질옥시카보닐기, 메톡시메틸기, 벤질옥시메틸기, 트리페닐메틸기, 벤질기 및 알릴기로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기이며, 바람직하게는 t-부틸옥시카보닐기 또는 벤질옥시카보닐기이며, 더 바람직하게는 t-부틸옥시카보닐기일 수 있다. 상기 수산기 보호기는 p-메톡시벤질기, 메톡시메틸기, 벤질옥시메틸기, 테트라히드로피란기, 테트라히드로퓨란기, t-부틸기, 트리페닐메틸기, 벤질기, 알릴기, 트리메틸실릴기, t-부틸디메틸실릴기, 트리페닐실릴기, 트리이소프로필실릴기, t-부틸카르보닐기, 아세틸기 및 벤조일기로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기이며, 바람직하게는 t-부틸기 또는 트리페닐메틸기이며, 더 바람직하게는 t-부틸기일 수 있다. 상기 구아니딘니딘니딘 보호기는 t-부틸옥시카보닐기, 벤질옥시카보닐기, 메톡시메틸기, 벤질옥시메틸기, 트리페닐메틸기, 벤질기, 알릴기, t-부틸디메틸실릴기, 트리페닐실릴기, 트리이소프로필실릴기, 니트로기, 2,2,5,7,8-펜타메틸크로멘-6-설포닐기(Pmc), 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠설포닐기(Mtr), 2,2,4,6,7-펜타메틸-디히드로벤조퓨란-5-설포닐기(Pbf) 및 토루엔설포닐기(Tos)로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기이며, 더 바람직하게는 Pbf 또는 Mtr기이며, 가장 바람직하게는 Pbf기일 수 있다. 상기 바람직한 보호기의 선택에 따라 본 발명의 제조방법은 고수율 및 고순도의 루프로라이드 제조가 달성될 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 아미노산 및 아미노산 유도체는 N-말단에 보호기를 가질 수 있다. 상기 N-말단의 보호기는 포르밀기, 아세틸기, 트리플루오로아세틸기, 벤질기, 벤질옥시카르보닐기(CBZ), tert-부톡시카르보닐기(Boc), 트리메틸 실릴기(TMS), 2-트리메틸실릴-에탄술포닐기(SES), 트리틸(Trt)기 및 치환된 트리틸기, 알릴옥시카르보닐기, 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기(FMOC), 니트로-베라트릴옥시카르보닐기(NVOC)의 보호기로부터 선택되며, 바람직하게는 Fmoc 또는 Boc 보호기로 보호된 것임을 특징으로 한다. Fmoc는 본 발명의 루프로라이드의 고체-상 합성과 관련하여 특히 유용한 N-말단 보호기로 활용될 수 있다.
펩타이드-수지는 1개 이상의 아미노산 또는 아미노산 유도체로 구성되는 펩타이드의 C-말단이 수지와 결합된 것으로, 당업계에서 통상적으로 사용되는 고상 합성방법에 의해 제조될 수 있다. 구체적으로, α-아미노기와 선택적으로 측쇄 작용기가 보호화된 1개 이상의 아미노산 또는 아미노산 유도체로 구성되는 펩타이드를 수지 또는 펩타이드-수지에 결합시킨 후, α-아미노 보호기를 제거하는 단계를 순차적으로 진행하여 펩타이드-수지를 제조할 수 있다. 제1단계는 가장 먼저 고체 지지체 수지에 α-아미노기와 선택적으로 측쇄 작용기가 보호화된 아미노산 또는 이의 유도체를 결합시킨 후 탈보호하여 펩타이드-수지를 수득하는 반응을 포함한다. 이어서, 펩타이드-수지의 아민기에 N-말단이 보호되어 있는 다음 아미노산의 C-말단인 카르복시그룹이 반응한다. 그 후, 탈보호시켜 그 다음 아미노산이 반응할 수 있도록 N-말단을 노출시킨다.
고체상 펩타이드 합성법은 Fmoc 및 Boc 보호기 두가지 방법이 주로 사용되며, 바람직하게는 최초로 수지에 아미노산을 결합시킬 때에는 Boc 보호기를 이용하며, 순차적으로 다음 아미노산을 결합시킬 때에는 Fmoc 보호기를 이용한다. 구체적으로, 상기 제1단계는 상기 고분자 지지체 수지에Boc-Pro-OH를 반응시킨 후 Boc기를 제거하여 펩타이드-수지를 수득하는 단계를 최초로 포함할 수 있다. 제1단계는 다음으로 펩타이드-수지에 Fmoc-(AA)n-OH(n은 1 내지 8이고, AA는 아미노산 또는 아미노산 유도체)를 반응시킨 후 Fmoc을 제거하는 단계를 1회 이상 포함하는 것일 수 있다.
Fmoc-AA 또는 Boc-AA의 보호기에 따라 탈보호 과정이 다르다. 그 중, 본 발명의 일 실시예에 따른 Boc 보호기의 경우, 산성의 조건에서 탈보호화가 가능하며, 예를 들어, TFA(트리플루오로아세트산)/DCM(디클로로메탄) 등의 약산성 분해(cleavage) 용액을 첨가할 수 있다. Fmoc 보호기의 경우, 염기의 조건에서 탈보호화가 가능하며, 예를 들어, 1,8-디아자비시클로[5.4.0]안데크-7-엔 (1,8-Diazabicyclo[5.4.0] undec-7-ene)이 포함된 N,N-디메틸포름아미드 등의 용액을 첨가할 수 있다.
제2단계
본 발명의 루프로라이드 제조방법은, 상기 수득한 펩타이드-수지에 에틸아민을 처리하여 수지에서 펩타이드를 분리하는 동시에 에틸아민이 커플링된 화학식 2로 표시되는 펩타이드를 수득하는 제2단계를 포함한다:
[화학식 2]
pGlu-His(R1)-Trp(R2)-Ser(R3)-Tyr(R3)-D-Leu-Leu-Arg(R4)-Pro-NHEt
본원의 일 구현예에 따르면, 에틸아민은 친핵체로 작용하여 펩타이드와 수지의 결합을 선택적으로 공격하여 절단하며, 동시에 에틸아민이 연결된 화학식 2로 표시되는 펩타이드를 수득할 수 있다. 본 발명에서는 상기 제2단계로 인해 펩타이드와 수지의 결합을 절단하는 단계와 펩타이드에 에틸아민을 결합하는 단계를 별도의 공정으로 포함하지 않아 높은 효율의 루프로라이드 제조방법을 제공할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 고상(solid-phase) 합성법을 이용한 루프로라이드의 제조방법은 상기 제1단계에서 얻은 펩타이드-수지에 테트라히드로퓨란(tetrahydrofuran, THF)과 에틸아민(ethylamine)수용액의 혼합액을 처리하여 수지에서 펩타이드를 분리하는 동시에 에틸아민(ethylamine)이 커플링될 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 제 1단계에서 에틸아민을 커플링시 상기 에틸아민은 테트라히드로퓨란(THF)과 에틸아민 수용액의 혼합액으로 처리할 수 있으며, 바람직하게는 THF와 에틸아민 수용액의 부피비는 1:2 내지 2:1일 수 있고, 더 바람직하게는 THF와 에틸아민 수용액의 부피비가 1:1일 수 있다. 만일 THF와 에틸아민 수용액의 부피비에서 THF의 부피가 상기 범위보다 높을 경우, 수지 분리 반응이 완결되지 않는 문제점이 있을 수 있으며, 에틸아민 수용액의 부피가 상기 범위보다 높을 경우, 보호화된 펩타이드의 용해성이 떨어져 수율이 감소되는 문제가 발생할 수 있다.
제3단계
본 발명의 루프로라이드 제조방법은, 상기 제2단계에서 얻은 펩타이드를 탈보호화하는 제3단계를 포함한다. 루프로라이드는 상기 제 2단계에서 얻은 펩타이드로부터 당업계에서 통상적으로 이용하는 반응 조건하에서 탈보호화반응을 수행하여 얻을 수 있다. 상기 탈보호화하는 과정은 산성 조건에서 반응이 이루어지며, 상기 2단계에서 얻은 펩타이드는 산에서 쉽게 제거되는 Trt, Boc, tBu 및 pbf의 보호기가 곁사슬을 보호하고 있어 탈보호화가 잘 이루어질 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 탈보호화반응의 반응 조건으로는 산성 조건이며, 사용가능한 산으로는 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 트리플루오로아세트산, 물, 페놀, 티오아니솔 및 에탄디티올의 혼합물, 트리플루오로아세트산, 트리이소프로필실렌 및 물의 혼합물 또는 트리플루오로아세트산, 트리이소프로필실렌, 물 및 에탄디티올의 혼합물 하에서 가능하며, 가장 바람직하게는 트리플루오로아세트산, 트리이소프로필실렌 및 물의 혼합물 하에서 수행될 수 있다.
상기 탈보호화반응이 완결되면, 유기용매를 사용하여 추출방법으로 유기 불순물을 제거할 수 있으며, 바람직하게는 t-부틸메틸에테르를 사용한 여과법을 이용할 수 있다. 추가적으로, 상기 추출 후에 추가적으로 분리 정제를 통해 루프로라이드의 순도를 높일 수 있으며, 바람직하게는 역상 HPLC 정제법을 이용할 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
실시예: 루프로라이드의 제조
제 1단계: 화학식 I로 표시되는 펩타이드-수지의 제조
[화학식 I]
pGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(pbf)-Pro-PAM 수지
단계 a: Boc-Pro-PAM수지의 제조
여과막이 장착된 고상(solid-phase)합성 반응기에 PAM 수지 19 g (f=1.05 mmol/g의 수지, 20 mmol) 및 디클로로메탄 200 ㎖를 넣고, 30분간 수지를 팽창시킨 후, 감압 하에서 여과막을 통하여 용매를 제거하였다. t-부틸옥시카보닐-Pro-OH 21.53 g, (100 mmol, 5.0 당량)이 포함된 디클로로메탄 200 ㎖을 상기 처리된 수지에 첨가하고, 이어서 피리딘 (pyridine) 23.73 g (300 mmol, 15 당량) 및 2,6-디클로로벤조일 클로라이드 (2,6-dichlorobenzoyl chloride) 20.9 g (100 mmol, 5 당량)을 첨가한 후, 실온에서 5시간 동안 반응시켰다. 감압 여과하여 반응액을 제거하고 수지를 디클로로메탄으로 3회 세척한 후, 진공 하에서 건조하여 t-부틸옥시카보닐-Pro-PAM 수지를 수득하였다. 치환율은 0.76 mmol/g이었다.
단계 b: 상기 수지의 Boc 기의 제거
여과막이 장착된 고상합성 반응기에 t-부틸옥시카보닐-Pro-PAM 수지 13.16 g (0.76 mmol/g, 10 mmol) 및 디클로로메탄 100 ㎖를 넣고, 15분간 수지를 팽창시킨 후, 감압 하에서 여과막을 통하여 용매를 제거하였다. 50% (v/v) 트리플루오로아세트산이 포함된 디클로로메탄 100 ㎖를 상기 수지에 넣은 후, 2시간 t-부틸옥시카보닐의 제거 반응을 수행한 후, 감압 여과하여 반응액을 제거하였다. 이어서 수지를 차례로 디클로로메탄로 1회, N,N-디메틸포름아미드로 1회, 5% N,N-디이소프로필에틸아민이 포함된 N,N-디메틸포름아미드로 2회, N,N-디메틸포름아미드로 5회 세척하여 H-Pro-PAM 수지를 수득하였다.
단계 c: Fmoc-Leu-Arg(pbf)-OH를 처리하여 Fmoc-Leu-Arg(pbf)-Pro-PAM 수지 제조
상기 단계 b에서 수득한 H-Pro-PAM 수지 (10 mmol)에, 9-플루오레닐옥시카보닐-Leu-Arg(Pbf)-OH 22.8 g, (30 mmol, 3 당량) 및 1-히드록시벤조트리아졸 4.45 g(33 mmol, 3.3 당량)의 N,N-디메틸포름아미드 100 ㎖를 넣고, 이어서 디이소프로필카르보디이미드 4.65 ㎖ (30 mmol, 3 당량)을 첨가한 후, 실온에서 4시간 동안 반응시켰다. 상기 반응 결과물을 감압 여과하여 반응액을 제거하고 수지를 N,N-디메틸포름아미드로 2회 세척하여 9-플루오레닐옥시카보닐-Leu-Arg(pbf)-Pro-PAM 수지를 얻었다.
단계 d: 단계c에서 얻은 Fmoc-Leu-Arg(pbf)-Pro-Pam수지에서 Fmoc 제거
상기 단계 c에서 수득한 9-플루오레닐옥시카보닐-Leu-Arg(pbf)-Pro-PAM 수지에 2% (v/v) 1,8-디아자비시클로[5.4.0]안데크-7-엔 (1,8-Diazabicyclo[5.4.0] undec-7-ene)이 포함된 N,N-디메틸포름아미드 100 ㎖를 넣어 5분간 9-플루오레닐옥시카보닐의 제거 반응을 수행한 후, 감압 여과하여 반응액을 제거하였다. 상기 9-플루오레닐옥시카보닐의 제거 반응을 반복하고 이어서 수지를 N,N-디메틸포름아미드로 6회 세척하여 H-Leu-Arg(pbf)-Pro-PAM 수지를 수득하였다.
단계 e: 단계 d에서 얻은 수지에 아미노산 유도체를 순차적으로 커플링
단계 d에서 수득한 수지에Fmoc-Leu-Arg(pbf)-OH 대신 하기 아미노산 유도체를 사용한 것을 제외하고는 단계c 및 d 과정을 동일하게 수행하였다. 하기 아미노산 유도체를 차례로 사용하며 단계 c 및 d과정을 반복적으로 수행하여, 하기 아미노산 유도체를 순차적으로 커플링하였다.
[아미노산 유도체]
9-플루오레닐옥시카보닐-D-Leu-OH 10.6 g (30 mmol, 3 당량)
9-플루오레닐옥시카보닐-Tyr(t-부틸)-OH 13.8 g (30 mmol, 3 당량)
9-플루오레닐옥시카보닐-Ser(t-부틸)-OH 11.5 g (30 mmol, 3 당량)
9-플루오레닐옥시카보닐-Trp(t-부틸옥시카보닐)-OH 15.8 g (30 mmol, 3 당량)
9-플루오레닐옥시카보닐-His(트리페닐메틸)-OH 18.6 g (30 mmol, 3 당량)
pGlu-OH 3.88 g (30 mmol, 3 당량)
단계 f: 단계 e에서 얻은 수지의 세척
상기 단계 e에서 수득한 수지를 차례로 N,N-디메틸포름아미드로 3회 및 테트라히드로퓨란 3회 세척하여 상기 화학식 1로 표시되는 펩타이드를 수득하였다.
제 2단계: 펩타이드-수지로부터 수지의 제거와 동시에 에틸아민을 커플링하여 화학식 II로 표시되는 펩타이드의 제조
[화학식 II]
pGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHEt
상기 제 1단계에서 수득한 상기 화학식 I로 표시되는 펩타이드-수지에 70% 에틸아민 수용액 : 테트라히드로퓨란 = 1:1 혼합액 150 ㎖를 넣고 24시간 동안 교반하였다. 감압 여과하여 수지를 제거하고, 여과액을 감압 농축하여 상기 화학식 II로 표시되는 크루드 펩타이드를 16 g 수득하였다.
제 3단계: 펩타이드의 탈보호화 및 정제 후 루프로라이드의 수득
[화학식 III]
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt
상기 제 2단계에서 수득한 상기 화학식 II로 표시되는 펩타이드 16 g에 트리플루오로아세트산:트리이소프로필실렌:물=95:2.5:2.5 혼합용액 500 ㎖을 넣고, 2시간 동안 탈보호화 반응을 수행하였다. 용매를 감압 증류하고 t-부틸메틸에테르 500 ㎖를 넣어 얻은 고체를 여과하여 크루드 루프로라이드 10.2 g을 수득하였다. 역상 HPLC (reversed-phase high performance liquid chromatography)로 정제하여 상기 화학식 III으로 표시되는 루프로라이드 4.8 g을 수득하였다. 총 수율은 40%, HPLC의 순도는 99%였다.
상기 내용을 바탕으로 루프로라이드를 제조하는 전체 공정을 요약하면 도1과 같다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (7)

  1. 고분자 지지체 수지에 아미노산 또는 아미노산 유도체들을 순차적으로 결합시켜 하기 화학식 1로 표시되는 펩타이드-수지를 제조하는 제1단계;
    상기 제1단계에서 얻은 펩타이드-수지에 에틸아민을 처리하여 수지에서 펩타이드를 분리하는 동시에 에틸아민이 커플링된 화학식 2로 표시되는 펩타이드를 수득하는 제2단계;
    상기 제2단계에서 얻은 펩타이드를 탈보호화하는 제3단계를 포함하는,
    고상(solid-phase) 합성법을 이용한 루프로라이드의 제조방법:
    [화학식 1]
    pGlu-His(R1)-Trp(R2)-Ser(R3)-Tyr(R3)-D-Leu-Leu-Arg(R4)-Pro-O-수지(resin)
    [화학식 2]
    pGlu-His(R1)-Trp(R2)-Ser(R3)-Tyr(R3)-D-Leu-Leu-Arg(R4)-Pro-NHEt
    상기 화학식에서, R1은 수소이거나, t-부틸옥시카보닐기, 벤질옥시카보닐기, 메톡시메틸기, 벤질옥시메틸기, 트리페닐메틸기, 벤질기 및 알릴기로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기이고,
    R2는 수소이거나, t-부틸옥시카보닐기, 벤질옥시카보닐기, 메톡시메틸기, 벤질옥시메틸기, 트리페닐메틸기, 벤질기 및 알릴기로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기이며,
    R3는 수소이거나, p-메톡시벤질기, 메톡시메틸기, 벤질옥시메틸기, 테트라히드로피란기, 테트라히드로퓨란기, t-부틸기, 트리페닐메틸기, 벤질기, 알릴기, 트리메틸실릴기, t-부틸디메틸실릴기, 트리페닐실릴기, 트리이소프로필실릴기, t-부틸카르보닐기, 아세틸기 및 벤조일기로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기이며,
    R4은 t-부틸옥시카보닐기, 벤질옥시카보닐기, 메톡시메틸기, 벤질옥시메틸기, 트리페닐메틸기, 벤질기, 알릴기, t-부틸디메틸실릴기, 트리페닐실릴기, 트리이소프로필실릴기, 니트로기, 2,2,5,7,8-펜타메틸크로멘-6-설포닐기, 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠설포닐기, 2,2,4,6,7-펜타메틸-디히드로벤조퓨란-5-설포닐기 및 토루엔설포닐기로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기이다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 제1단계에서의 수지는 PAM 수지, Wang 수지 또는 Hydroxymethyl 수지인 것을 특징으로 하는 루프로라이드의 제조방법.
  3. 제 1 항에 있어서, R1, R2, R3, 및 R4는 각각 트리페닐메틸기, t-부틸옥시카보닐기, t-부틸기, 및 2,2,4,6,7-펜타메틸-디히드로벤조퓨란-5-설포닐기인 것인, 루프로라이드의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제1단계는 상기 고분자 지지체 수지에Boc-Pro-OH를 반응시킨 후 Boc기를 제거하여 펩타이드-수지를 수득하는 단계를 포함하는 것인, 루프로라이드의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 제1단계는 펩타이드-수지에 Fmoc-(AA)n-OH(n은 1 내지 8이고, AA는 아미노산 또는 아미노산 유도체)를 반응시킨 후 Fmoc을 제거하는 단계를 1회 이상 포함하는 것인, 루프로라이드의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 제2단계는 상기 펩타이드-수지에 THF와 에틸아민(ethylamine)수용액의 혼합액을 처리하는 것을 특징으로 하는, 루프로라이드의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 THF 와 에틸아민 수용액의 부피비는 1:2 내지 2:1인 것인, 루프로라이드의 제조방법.

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