JP3187044B2 - ヒルジン突然変異蛋白質及びヒルジンポリアルキレングリコール複合体 - Google Patents

ヒルジン突然変異蛋白質及びヒルジンポリアルキレングリコール複合体

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規ヒルジン突然変異タンパク質及びその
ヒルジンポリアルキレングリコール複合体、その製造並
びに心臓血管疾病の予防及び処置及び高分子担体の変性
のためのその使用に関する。
ヒルジンは、以前から公知の、天然に存在する血液凝
固抑制特性を有するタンパク質である。これは、最も強
力でかつ選択的な従来公知のトロンビン抑制剤である
(Naturwissenschaften,(1955)42,537;Hoppe−Seyler
s Z.fuer Biol.Chemie,(1985)366,379)。薬用水蛭
(Hirdo medicinalis)から単離可能なポリペプチド
は、アミノ酸65個からなり、ジスルフィド架橋3個を有
し、かつチロシン63の位置でスルフェート化されてい
る。更に、なお多くの天然に存在する異性体が存在し、
これらは、元のヒルジンとは、種々の箇所でのアミノ酸
交換により異なっている(Folia Haematol.(1988),11
5,39)。同様に、遺伝子技術で製造された変種は、公知
である(Biochemistry(1988),27,6517,FEBS−Lett.
(1988),229,87)。ヒルジン及び種々異なる変種は、
今日、遺伝子技術法で入手でき、その際、遺伝子技術法
を用いて製造されたヒルジンには、アミノ酸のTyr63
で、スルフェート基が欠けている(Biochemistry(198
9),28,2941,DNA(1986),5,511)。同様に、この凝固
抑制剤の良好な生理学的認容性は、相当以前から公知で
ある(Pharmazie(1981),10,653)。
良好な薬力学的特性にもかかわらず、ヒルジンは、約
50分の血中での僅かな半減時間に基づき、長時間の治療
的使用にはほとんど適さない。タンパク質の半減時間が
高分子との複合により延長しうることは公知である(J.
Biol.Chem.(1977),252,3582;Biochim.Biophys.Acta
(1981),660,293)。しばしば、このような例えばポリ
エチレングリコールを用いる誘導体化後には、酵素活性
の明らかな劣悪化が認められ、これは、これらの変性さ
れたタンパク質の使用可能性を著しく制限する(Cance
r.Treat.Rep.(1979),63,1127;Chemistry Lett.(198
0),773)。ヒルジンの場合、バルスマン(Walsmann)
によって、デキストランとの結合により、とりわけ著し
い活性の消失下で、約50分〜7時間以上までの明らかな
半減時間延長が達成されうることが最近明らかにされた
(Pharmazie(1989),44,72)。良好に変えられた半減
時間にもかかわらず、非常に僅かな収率の生成物、著し
く減少した特異活性並びにこれとおそらく結び付いた薬
力学的特性の変化は、このようなデキストラン−ヒルジ
ンの治療的使用を妨げている。
タンパク質と高分子とのの複合は、しばしば、アミノ
酸アスパラギン酸又はグルタミン酸のカルボキシル基の
反応を介して、アミノ酸システインのスルホヒドリル基
の反応を介して、又は相当するタンパク質のアミノ酸リ
シンの側鎖アミノ基の反応によって達成される。しかし
ながら、前記のアミノ酸は、しばしば、直接的に、相当
するタンパク質の機能にとって、極めて重要である。タ
ンパク質の誘導体化は、不活性化に至る物理学的/化学
的又は酵素的特性の変化と結び付きうる。ヒルジンは、
複数のアスパラギン酸−及びグルタミン酸基を、主に分
子のC−末端範囲に含有している。リシン基は、ヒルジ
ン分子中27、36及び47の位置に存在する。更に、分子の
C−末端又はN−末端を介する結合が考えられる。しか
しながら、C−末端範囲での酸性アミノ酸(FEBS.Lett.
(1983),164 307−313)も、塩基性リシン基も、殊に
分子中で著しく露出したリシン基No.47も、ヒルジンと
プロテアーゼ トロンビンとの相互作用に決定的に関与
している(Biol.Chem.Hoppe−Seyler(1985),366,379
−385)。N−末端の所での反応、例えば延長(Biochem
istry(1989),28,10079)は、ヒルジンの抑制作用の著
しい減少をもたらす。従って、ヒルジンの誘導体化は、
著しい活性消失なしに達成されることを期待できなかっ
た。この予想は、バルスマン(Pharmazie(1989),44,7
2)により実施されたデキストランを用いるヒルジンの
リシン基の誘導体化のための操作により裏付けされた。
多くの酸性アミノ酸の数に基づき、高分子とヒルジン
のカルボキシル側鎖との複合の際に、単一の生成物は期
待されない。ポリペプチドの塩基性官能基の誘導体化の
場合ですら、32までの異なる化合物から成る混合物が予
想される。モノ−、ジ−及びトリ−置換された誘導体に
おいては、その物理学的及び化学的特性においては十分
に同じであるが、その生物学的活性においては異なって
いる多くの位置異性体が考えられる。理論的に考えられ
る複合体の多くは、痕跡量範囲内でのみ全混合に寄与す
る場合ですら、不均一な生成物の分離の際の重大な問題
を計算に入れなくてはならない。
ところで、ポリアルキレングリコール誘導体の複合
は、適当はヒルジン−突然変異タンパク質の使用によ
り、非常に良好に制御され、容認可能な精製経費で、化
学的に単一のヒルジン−ポリマー誘導体が得られること
が判明した。意外にも、ポリアルキレングリコール又は
ポリアルキレングリコール誘導体と血液凝固抑制ヒルジ
ン−突然変異タンパク質とからの式I: [Z−(CH2−[O−(CH2−W−]pHir
(I) [式中、Zは、基−OH、−NH2、−NH−CO−R、−O−
R又は−O−CO−Rを表わし、ここでRは、C1〜C4−ア
ルキル基を表わし、nは、2、3又は4の数を表わし、
mは、50〜500の数を表わし、Wは、直接共有結合又は
リンカーを表わし、pは2を表わし、かつHirは、リシ
ン−側鎖のアミノ基を介してZ−(CH2−[O−(C
H2−W基に結合している一般式: のポリペプチドを表す]の複合体は、明らかに延長され
た生体有用性(Bioverfuegbarkeiten)を有し、その際
生物学的作用が完全に又は十分に得られることを発見し
た。
本発明において、ヒルジン−突然変異タンパク質は
式: H−Hir [式中、Hirは前記のものを表す]のポリペプチドであ
る。
前記ヒルジン突然変異蛋白質は、一般式II: (ここで、Aは、Val−Val、Ile−Thr、Leu−Thr又はPr
o−Valを表わし、Bは、Gln又はGluを表わし、Cは、Ly
s、Arg又はAsnを表わし、Dは、Lys、Arg、Asn又はGln
を表わし、Eは、Glu又はProを表わし、Fは、Asp又はG
lnを表わす)のポリペプチドであって、該ポリペプチド
II中で1種以上のアミノ酸が30〜38の位置で交換もしく
は欠失しており、かつ30〜38の位置中に存在する1個の
アミノ酸の置換により、1又は2個の付加的リシン基を
含有する化合物並びにその塩の1つである。
リシン30からグルタミン38の間の領域が変化したこの
ような突然変異タンパク質が、PEGとの複合に殊に適当
であることが判明した。この範囲中に、付加的リシン1
個又は2個を挿入することができ、これはリシン基27と
同様の効率で結合する。更に、より簡単な反応操作及び
化学的に単一な生成物のために、PEGとの反応が望まれ
ないリシン基を弱い求核性の他のアミノ酸に代えること
は、有利である。前記の突然変異タンパク質において、
Lys47のArg47又はGln47での交換は、殊に好適なもので
あることが分かった。相当するPEG−突然変異タンパク
質−結合生成物は、誘導体化されていない突然変異タン
パク質と同様に、高い特異活性を有する。存在するもし
くは新たに挿入されたリシン基の数により、結合可能な
ポリマーの割合に、かつ従って複合体の分子量に影響が
及ぼされる。
このようなヒルジン突然変異タンパク質は、遺伝子技
術的方法で、非常に良好に製造することができる。先
ず、それぞれの突然変異タンパク質をコードする核酸を
合成的に製造する。次いで、このような合成遺伝子に適
当な調節配列(プロモーター、ターミネーター等)を与
え、かつ異種系内に発現させることができる(FEBS−Le
tt.(1986)202,373(1986);Biol.Chem.Hoppe−Seyler
(1986)367,731)。この発現は、真核生物系(哺乳類
細胞、酵母又は糸状真菌類)又は原核生物系(E.コリ、
捍菌)中で行なうことができる。E.コリ中での発現は、
それからヒルジンを遊離させ、かつ引き続き活性化させ
ることができる融合タンパク質を介して行なうのが有利
である(DNA(1986)5,511)。次の例で、本発明により
請求する突然変異タンパク質のいくつかの製造のみを記
載するが、他の突然変異タンパク質も、同様に入手可能
である。
リンカーWとしては、次の基がこれに該当する: −X−CO−;−X−CO−NH−K−NH−CO−;−X−CO−
CH2−CH2−CO−;−X−CH2−CO−又は [式中、Xは、−S−、−O−、−NH−を表わし、かつ
Kは、C2〜C6−アルキレン基又はp−フェニレン基を表
わし、かつYは、−Cl、−OH又はHを表わす]。
この新規ヒルジンポリアルキレングリコール誘導体
は、一般式IIのヒルジン−突然変異タンパク質を、一般
式III: [Z−(CH2−[O−[CH2−M (III) [式中、Z、m及びnは、前記のものを表わし、かつM
は、基−X−CO−L、−X−CO−NH−K−N=C=O、
−X−CO−CH2−CH2−CO−L、−X−CH2−CO−L、 又は−O−SO2−Rを表わし、ここで、X、K及びY
は、前記のものを表わし、かつLは、 を表わし、Qは、ハロゲン原子1〜3個又はニトロ官能
基1〜2個又はアセチル−基1個を表わし、かつRは、
メチル、エチル、n−プロピル、i−プロピル、フェニ
ル、トリル又はトレシルを表わす]のポリアルキレング
リコール誘導体と反応させることにより製造することが
できる。
IIIとヒルジン−突然変異タンパク質との反応は、次
のようにして行なわれる: 式IIIの活性化されたポリアルキレングリコールを化
学量論量で又は過剰量で、適当な緩衝液(pH6〜10)
中、水中で、場合により補助塩基、例えば炭酸−又は炭
酸水素−ナトリウム又は−カリウム、水酸化アルカリ、
トリエチルアミン、N−メチルモルホリン、ジイソプロ
ピルアミン又はピリジンの添加下に、有機溶剤(メタノ
ール、エタノール、イソプロパノール、アセトニトリ
ル、ジメチルホルムアミド、N−メチルピロリドン、ジ
クロロメタン、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフ
ラン、1,4−ジオキサン、トルオール)又は前記溶剤の
混合物中で、−20℃〜+100℃の温度、有利には0℃〜
+60℃の温度で、ヒルジン、脱スルフェートヒルジン、
ヒルジン−突然変異タンパク質と反応させる。生じた複
合体を単離し、かつタンパク質化学における常法を用い
て精製し、特性付けする。
本発明に記載のポリアルキレン−ヒルジン−複合体
は、ヒルジンに比べてより有効な薬効的作用面を示す。
これは、ヒルジンの有利な薬力学的特性を有するだけで
なく、更に、著しく延長された生物学的作用及びより良
好な生体有用性を有する、更に、ポリアルキレングリコ
ール−ヒルジン−複合体は、ヒルジンに比べて、明らか
に低い抗原性を示す。この特性に基づいて、記載のポリ
アルキレン−複合体、ヒルジン、ヘポリン及び低分子量
ヘパリンは、血栓性塞栓疾病の治療及び予防において優
れている。これらは、例えば心筋梗塞、重い静脈血栓
症、末梢動脈閉塞症、肺塞栓症で、並びに対外循環、例
えば血液透析又は心肺バイパスにおいて使用することが
できる。更に、ポリアルキレングリコール−ヒルジン−
複合体は、機械的方法及び溶解による動脈血管の再開通
(Wiederoeffnung)後の再閉塞(Reocclusion)の抑制
のために使用することができる。更に、この新規ヒルジ
ン−ポリアルキレングリコール−誘導体は、代用血管及
び心臓血肺装置において、人工表面、例えば血液透析膜
及びこれに必要な管系を被覆するために有効に使用され
る。
本発明の化合物は、通常、経口又は非経口(皮下、静
脈内、筋内、腹膜内)で投与することができる。
配量は、患者の年齢、状態及び体重並びに適用方法に
依存する。それぞれの適用形及び症状に応じて、1日の
作用物質用量は、一般的にATU約20〜40000/体重kgであ
る。
新規化合物は、慣例のガレヌス式適用形で、固定又は
液体で、例えば溶液、軟膏、クリーム又はスプレーとし
て使用することができる。これは、常法で製造される。
その際、作用物質は、慣例のガレヌス式助剤、例えば充
填剤、貯蔵剤、流動調節剤、湿潤剤、分散剤、乳化剤、
溶剤及び/又は噴射ガスを用いて加工することができる
(H.Sucker等:Pharmazeutische Technologie,Thieme−V
erlag,Stuttgart,1978参照)。
例1 ヒルジン−突然変異タンパク質の製造 a)ベクターの構成 プロテインA−ベクターpRIT 2T(図1)は、市場で
得られ、かつ詳述されている(Pharmacia Bestll No.27
−4808−01)。これを用いて、ペプチド及びタンパク質
を黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)からのプ
ロテインAとの融合タンパク質として、E.コリ(E.col
i)中で、製造することができる。このために、発現す
べき核酸をプロテインA−レーゼラスター(Leseraste
r)の保持下に、ベクターpRIT 2Tのポリリンカー中に導
入すべきである。pRIT 2T DNAを制限エンドヌクレアー
ゼEco R I及びSal Iを用いて、製造者の指示に従って切
断し、切断バッチを低融点アガロースゲルを通して分離
し、かつこのゲルから、より大きなベクターフラグメン
トを純粋形で単離した。遺伝子技術の基本技術並びに詳
細な作業教示は、サンブローク(Sambrook)等の(198
9)「モレキュラー・クローニング(Molecular Clonin
g)」第2版、CSH−Press中に記載されている。
b)本発明に記載のヒルジン突然変異タンパク質に関し
てコードかする配列を、アプライド・バイオシステムズ
(Applied Biosystems)社のDNA−合成装置、モデル380
Aを用いて、その指示に従い、かつ製造者の化学薬品を
用いて合成した。その際、完全コード化領域を、3部分
配列から、相補的オリゴヌクレオチドそれぞれ2本に構
成した。互いに相補的なオリゴヌクレオチドを一緒に
し、90℃まで5分間加熱し、かつ室温まで30分間かかっ
て冷却した。その際生じる2本鎖フラグメントを、その
5′−末端でキナーゼ化(kinasieren)させ、かつ連結
させた。こうして形成されたヒルジン遺伝子を、線状化
された発現ベクターpRIT2TのEco R I及びSal I位置に、
正しい配向で、かつプロテインA−レーゼラスターの保
持下に、導入することができた。
種々異なる突然変異タンパク質を製造するために、次
の配列(図2)を互いに組み合わせた: 連結反応により生じるキメラプラスミド(pRIT 2T−H
ir)を、DNA増幅のために、ラムダ−溶原株中で形質転
換させ、DNAを単一クローンから単離し、かつDNA−配列
分析により、正しい配列の存在に関して検査する。
例2 融合タンパク質の発現 その都度の発現プラスミドpRIT 2T−HirをE.コリ(co
li)N4830−1(Pharmacia Bestell−No.27−4808−0
1)株中で形質転換させた。この株は、染色体的に、感
熱性のラムダ−リプレッサーCI857を含有している。
じゃま板を備えた1l三角フラスコ中で、MIM−媒体(M
IM=1l当たりトリプトン32g、酵母抽出物20g、Na2HPO46
g、KH2PO43g、NaCl0.5g、NH4Cl1g及びMgSO40.1mM並びに
FeCl30.001mM)100mlを滅菌し、かつアンピシリン(100
μg/mlまで)を添加した。この媒体に、pRIT 2T−Hir/N
4830−1株の新しい1晩経過培養液(Ueber−Nacht−K
ultur)1mlを接種し、かつ振動下に、550nmでの吸光度
が0.6になるまで、28℃で培養した。次いで、65℃の温
かい新製MIM/amp−媒体100mlを加え、かつ42℃で更に4
時間培養した。この時間内に、所望の融合タンパク質が
合成された。リソチーム75mg/の添加及びインキュベ
ーション(3時間、37℃)により、細胞壁を酵素的に除
去した。次いで、細胞を機械的に(マトン−ガウリン−
プレス(Manton−Gaulin−Presse)、凍結サイクル(Ei
nfrierzyklus)、激しい撹拌)、80℃までの熱ショック
又は低張性溶菌(hypotone Lyse)により溶解させ、か
つ可溶性融合タンパク質を媒体中に遊離させることがで
きた。
例3 融合タンパク質の精製 細胞破片を遠心分離により除去し、かつ澄明な上澄を
IgG−セファロース−カラム(IgG−Sepharose(R)6“Fas
t Flow",Pharmacia,Best.No.17−0969−01)を介してポ
ンプ導入する。カラム物質の成層、カラムの準備及び設
計、装入条件及び流速は、製造者の報告に従う。従っ
て、上澄6lのために、200mlのゲル層及び約3l/時間の流
速を使用した。この工程において、融合タンパク質をそ
のIgG−結合プロテインA−部を介して可逆的に、ゲル
マトリックスに結合させた(収率約95%)。装入後に、
カラムをTST(50mMトリス−HCl pH7.6;150mM NaCl及び
0.05%トゥイーン(Tween)(R)20)10床量を用いて洗浄
した。0.5M酢酸塩緩衝液pH2.8を用いて、溶離を行なっ
た。
例4 融合タンパク質の分解 例3からのカラム溶出物を凍結乾燥させ、かつ−20℃
で貯蔵した。これを、分解のために、70%アミノ酸中
に、約25g/のタンパク質濃度で入れた。アルゴンで掃
気の後に、ヒルジンの離脱のために、融合タンパク質1g
当たり固体としてのBrCN1gを添加した。この分解をアル
ゴン気下、37℃で約4時間行なった。過剰量のシアン化
臭素、溶剤及び他の揮発性成分を凍結乾燥により除去し
た。引き続き、水で3回洗浄した。
例5 ヒルジン又はヒルジン突然変異タンパク質の変性及び精
製 凍結乾燥物を1〜100mg/タンパク質mlで、6Mグアニジ
ン−HCl、0.1Mトリス/HCl pH8.5、0.2M DTT中に入れ
た。2時間のインキュベーション後に、プローブをG−
10−溶解(Ausschluss)クロマトグラフィー(10mM HCl
を用いて平衡させた)により、脱塩させた。この脱塩し
たプローブを0.1Mトリス/HCl、5mM GSH/0.5mM GSSG、1m
M EDTA、pH8.7中1:20で希釈し、かつ1時間インキュベ
ーションした(GSHは、還元グルタチオン及びGSSHは、
酸化グラタチオンである)。この処理により、ヒルジン
の特異的活性が3〜5倍上昇した。HClを用いてpH7.6ま
でpH値を調節し、NaCl150mMまで及びトゥイーン(R)20
0.05%まで添加した後に、IgG−セファロースを通すク
ロマトグラフィーを繰り返した(例3)。プロテインA
−融合成分及び分解されなかった融合タンパク質がカラ
ムに付着する一方、活性ヒルジンは、>90%の純度で流
液中に存在した。これは、典型的なタンパク質化学法に
より、臨床的純度になるまで更に精製することができ
た。
例6 メトキシ−ポリエチレングリコール(8000)−N−スク
シンイミド−カルボネートの製造 a)N−スクシンイミド−クロロホルミエート ジクロロメタン200ml中のホスゲン約30gの溶液中に、
0℃で30分かかって、N−ヒドロキシスクシンイミド−
カリウム塩21.0gを入れ、かつこの混合物を0℃で2時
間撹拌する。引き続き、過剰のホスゲンを放出するため
に、窒素を1時間、懸濁液に通した(洗浄塔)。この懸
濁液を濾過し、かつ濾液を真空中で濃縮乾固させる。N
−スクシンイミド−クロロホルミエート10.6gは、黄色
油状物として存在し、かつ無機塩及びジスクシンイミド
−カルボネートで汚染されている。粗生成物は、更に精
製せずに、ポリアルキレングリコールとの反応のために
使用することができるか、又はジエチルエーテル150ml
中での溶解、濾過及び新たな濃縮によって、無機塩から
遊離させることができる。
b)メトキシ−ポリエチレングリコール(8000)−N−
スクシンイミド−カルボネート メトキシ−PEG(8000)−OH10.0gを簡単な加温により
乾燥ピリジン20ml中に溶かす。室温まで冷却後に、溶液
にN−スクシンイミド−クロロホルミエート890mgを加
え、かつ1晩撹拌する。過剰量のジエチルエーテルの添
加後に、混合物を氷浴中で30分撹拌し、沈殿した固体を
濾別し、イソプロパノールから2回再結晶させ、ジエチ
ルエーテルから沈殿させ、濾別し、かつ乾燥させる。メ
トキシ−ポリエチレングリコール(8000)−N−スクシ
ンイミド−カルボネート8.10gが無色固体として生じ
る。
例7 メトキシ−ポリエチレングリコール(8000)−4−ニト
ロフェニル−カルボネートの製造 a)4−ニトロフェニル−クロロホルミエート トリオール60ml中のニトロフェノール20.0gの懸濁液
中に、0℃でホスゲン約43gをガス導入する。この混合
物を0℃で4〜5時間撹拌する。引き続き、−15℃でゆ
っくり、トリオール20ml中のトリエチルアミン20mlの溶
液を滴加し、かつ1晩、氷を溶かした冷却浴中で撹拌す
る。過剰のホスゲンを窒素により放出し、かつ引き続
き、反応混合物を濾過する。濾液を真空中で濃縮乾固さ
せる。油状の茶色残分33.7gは、4−ニトロフェノール
−クロロホルミエートの他に、溶剤及び塩を含有する。
混合物を冷蔵庫中で結晶化させ、かつこれは、更に精製
せずに使用することができる。
b)メトキシ−ポリエチレングリコール(8000)−4−
ニトロフェニル−カルボネート 製造及び精製を例6と同様に行なう。
例8 メトキシ−ポリエチレングリコール(8000)−2,4,5−
トリクロロ−フェニルカルボネートの製造 a)2,4,5−トリクロロフェニル−クロロホルミエート ジクロロメタン50ml中の2,4,5−トリクロロフェノー
ル10.0gの溶液中に、0℃でホスゲン約7gをガス導入
し、かつ混合物を0℃で15分撹拌する。ジクロロメタン
20ml中のキノリン7.2mlを30分かかって滴加し、かつ橙
色懸濁液を氷浴中で更に1時間撹拌する。引き続き、過
剰のホスゲンを放出するために、1時間、窒素を懸濁液
に通す(洗浄塔)。引き続き、混合物を濾過し、濾液を
水で2回洗浄し、乾燥させ、新たに濾過し、かつ真空中
で濃縮乾固させる。油状の茶色残分は、比較的きれいな
2,4,5−トリクロロフェニルクロロホルミエートであ
り、これを冷蔵庫中で結晶化させ、かつ更に精製せずに
使用することができる。
b)メトキシ−ポリエチレングリコール(8000)−2,4,
5−トリクロロ−フェニルカルボネート 製造及び精製を例6と同様にして行なう。
例9 メトキシ−ポリエチレングリコール(8000)−4−ニト
ロフェニルカルボネートとヒルジンとの反応によるPEG1
−ヒルジンの製造 脱スルフェートヒルジン(特異的活性:8000ATU/mg)4
0mgを0.1Mボレート緩衝液、pH8.0 20ml中に溶かし、か
つメトキシ−ポリエチレングリコール(8000)−4−ニ
トロフェニルカルボネート80mgを加え、かつ5℃で3時
間インキュベーションする。100倍モル過剰のトリス塩
基での反応の中断後に、反応バッチを20mMトリス/HCl、
pH8.0に対して透析させ、かつ生じる生成物混合物をHP
−Q−セファロース(R)−カラム(Pharmacia(R))上に
装入する。カラムを、20mMトリス/HCl、pH8.0中0〜400
mM NaClの直線NaCl勾配を用いて展開させる。PEG1−ヒ
ルジン−複合体は、200mM NaClで溶離する。
結合バッチ中のPEG−1付加生成物の収率は、約50%
であり、ヒルジンの残り50%は、PEG2−誘導体として、
又は誘導体化されずに存在する。
結合バッチから精製したPEG1−ヒルジン−複合体の特
異な活性は、8000U/タンパク質mg(発色基質S2238(Kab
i)、(FEBS−Lett.(1983)、164、307)を用いるトロ
ンビン抑制試験により測定、タンパク質は、標準(Pier
ce)として血清アルブミンを用いるBCA−試験により測
定する)、複合体の分子量15000Da(スペロース(Super
ose)(R)−12−クロマトグラフィー、Pharmacia)であ
った。
例10 PEG2−ヒルジンの製造 脱スルフェートヒルジン40mgを0.05Mホウ酸ナトリウ
ム−又は炭酸ナトリウム緩衝液、pH8.010ml中に溶か
し、かつH2O又は1,4ジオキサン中の2,4,5−トリクロロ
フェニル−又は4−ニトロフェニル−活性メトキシポリ
エチレングリコール(8000Da)240mgの溶液を加え、か
つ25℃で3時間インキュベーションする。100倍モル過
剰のトリス塩基での反応の中断後に、反応バッチを20mM
トリス/HCl、pH8.0に対して透析する。生じる生成物混
合物をHP−Q−セファロース(R)−カラム上に装入し、
次いでカラムを0〜400mM NaClの直線NaCl勾配を用いて
展開させる。PEG2−ヒルジン−錯体は、120〜130mM NaC
lで溶離する。
PEG2−ヒルジンの割合は、結合バッチ中約50%であ
り、残りのヒルジンは、結合PEG−基1及び3個を有す
るPEG−誘導体に分かれた。
精製したPEG2−複合体の特異な活性を、例9に記載の
ようにして測定すると、6200U/タンパク質mgであり、複
合体の分子量は、22000Da〜23000Daであった(スペロー
(R)−12)。
例11 ヒルジン突然変異タンパク質HL14Bとメトキシ−ポリエ
チレン−グリコール(8000)−4−ニトロフェニルカル
ホネートとの反応 ヒルジン突然変異タンパク質HL14B(特異な活性8900A
TU/mg)10mgを例10により、濃度20mg/mlまで、0.1M炭酸
ナトリウム、緩衝液pH8.0中に溶かし、1.4ジオキサン0.
5ml中に溶かした4−ニトロフェニル−活性化メトキシ
ポリエチレングリコール(8000Da)80mgを加え、かつ25
℃で3時間インキュベーションした。次いで、反応を10
0倍過剰量のトリス−塩基の添加によって中断させ、遊
離した4−ニトロフェノールを除去し、かつヒルジン−
PEG複合体をアニオン交換クロマトグラフィー(例9参
照)により精製する。
結合バッチ中の所望のPEG2−誘導体の割合は、約80〜
85%であり、不所望のPEG1−及びPEG3−の割合は、それ
ぞれ最大約5〜10%であった。精製したPEG2−HL 14B
−複合体の特異な活性は、8300U/タンパク質mgであっ
た。分子量は、スペロース(R)−ゲル濾過により、22000
−23000Daと測定された。
例12 PEG2−ヒルジン−複合体の薬剤作用(薬物動態学的作
用) 2群のイヌ(ピーグル犬、各群につき4匹)に、それ
ぞれPEG2−ヒルジン4000U/Kgを静脈内又は皮下適用した
(0.2ml Vol)。注射の0.25、0.5、1、2、3、4、
6、8、24、32、48、56、72及び80時間後に、血液各2m
lを0.1M Na−クエン酸塩中に取った。引き続き、血小板
の少ない血漿を10分の遠心分離(4000g)により製造
し、かつ血漿のPEG−ヒルジン濃度をトロンビン抑制に
より、S2238(Kabi)での発色基質検定において測定し
た。比較のために、同じイヌを他の実験において、ヒル
ジンで処理した。次いで、血漿−ヒルジン濃度の時間的
経過を前記のようにして測定した。
図3及び4に、PEG2−ヒルジン及び誘導体化されてい
ないヒルジンの静脈内及び皮下的後の抗−因子−II a−
活性の時間経過を示す。排出曲線(Eliminierungskurv
e)の絶対値及び時間的経過から、PEG2−ヒルジン−誘
導体の明らかに延長した生物学的作用時間並びに良好な
生物学的有用性が明らかになる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI C12R 1:19) (72)発明者 リュープザーメン,クラウス ドイツ連邦共和国 デー―6730 ノイシ ュタット カイザーシュトゥール 6 (72)発明者 シュミート,ベルンハルト ドイツ連邦共和国 デー―6710 フラン ケンタール タウヌスシュトラーセ 20 (72)発明者 ケルヴァー,ヴォルフガング ドイツ連邦共和国 デー―6718 グリュ ンシュタット アウフ デム ライメン 10 (72)発明者 シュヴェーデン,ユルゲン ドイツ連邦共和国 デー―6705 ダイデ スハイム ビュルガーマイスター―オー バーヘッティンガー―シュトラーセ 7 (72)発明者 ヘフケン,ハンス ヴォルフガング ドイツ連邦共和国 デー―6700 ルート ヴィッヒスハーフェン ダムシュテュッ カーヴェーク 101 (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C12N 15/00 - 15/90 C07K 1/00 - 19/00 C12P 21/00 - 21/08 A61K 31/00 - 48/00 WPI(DIALOG) BIOSIS(DIALOG) GenBank/EMBL/DDBJ(G ENETYX)

Claims (7)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】ポリアルキレングリコール又はポリアルキ
    レングリコール誘導体と血液凝固抑制ヒルジン−突然変
    異タンパク質とからの式I: [Z−(CH2−[O−(CH2−W−]pHir
    (I) [式中、Zは、基−OH、−NH2、−NH−CO−R、−O−
    R又は−O−CO−Rを表わし、ここでRは、C1〜C4−ア
    ルキル基を表わし、nは、2、3又は4の数を表わし、
    mは、50〜500の数を表わし、Wは、直接共有結合又は
    リンカーを表わし、pは2を表わし、かつHirは、リシ
    ン−側鎖のアミノ基を介してZ−(CH2−[O−(C
    H2−W基に結合している一般式: のポリペプチドを表す]の複合体。
  2. 【請求項2】ポリアルキレングリコールがポリエチレン
    グリコールである、請求項1記載の複合体。
  3. 【請求項3】ポリエチレングリコールの分子量が4000〜
    15000Daである、請求項1記載の複合体。
  4. 【請求項4】疾病を予防するための、請求項1から3ま
    でのいずれか1項記載の複合体。
  5. 【請求項5】表面被覆のための、請求項1から3までの
    いずれか1項記載の複合体。
  6. 【請求項6】式: H−Hir [式中、Hirは請求項1に記載したものを表わす]のヒ
    ルジン突然変異タンパク質。
  7. 【請求項7】表面被覆のための、請求項6記載のヒルジ
    ン突然変異タンパク質。
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