DE4117784A1 - Herstellung von protein-polyalkylenglykolkonjugaten - Google Patents

Herstellung von protein-polyalkylenglykolkonjugaten

Info

Publication number
DE4117784A1
DE4117784A1 DE4117784A DE4117784A DE4117784A1 DE 4117784 A1 DE4117784 A1 DE 4117784A1 DE 4117784 A DE4117784 A DE 4117784A DE 4117784 A DE4117784 A DE 4117784A DE 4117784 A1 DE4117784 A1 DE 4117784A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
protein
reaction
peg
activated
preparation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE4117784A
Other languages
English (en)
Inventor
Juergen Dr Schweden
Bernhard Dr Schmied
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Original Assignee
BASF SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Priority to DE4117784A priority Critical patent/DE4117784A1/de
Priority to PCT/EP1992/000979 priority patent/WO1992021381A1/de
Publication of DE4117784A1 publication Critical patent/DE4117784A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von Protein- Polyalkylenglykolkonjugaten durch Umsetzung eines aktivierten Poly­ alkylenglykolderivats mit einem Protein.
Protein-Polyalkylenglykolkonjugate sind wegen ihrer günstigen pharmakolo­ gischen Eigenschaften geschätzte Arzneimittel.
Die Modifikation von Proteinen mit Polyethylenglykolen (PEG) ist bekannt.
Die Herstellung der Protein-Polyethylenglykole geschieht bislang durch Reaktion eines aktivierten PEG-Derivats mit einem Protein in Wasser oder einer wäßrigen Pufferlösung.
Veronese et al. (Applied Biochemistry and Biotechnology, 11, 141-152, 1985) beschreiben die Herstellung von PEG-Konjugaten mit Superoxid- Dismutase oder Ribonuklease. Dazu wird das PEG mit Phenylchlorformiat aktiviert. Anschließend wird das aktivierte PEG mit einer wäßrigen Lösung des Proteins in Phosphat- oder Borat-Puffer umgesetzt.
In der US-Patentschrift 49 02 502 wird die Herstellung eines Inter­ leukin-2-PEG-Konjugats beschrieben. Dazu wird ein aktiviertes PEG-Derivat hergestellt und dieses mit Interleukin-2 umgesetzt. Die Umsetzung erfolgt in einer wäßrigen Lösung (100 mM Borat-Puffer) bei pH=9 und Raum­ temperatur.
Diese Verfahren führen zwar zu den gewünschten Protein-PEG-Konjugaten, jedoch ist die Reaktion wenig selektiv und führt daher in der Regel zu einer Vielzahl von Reaktionsprodukten.
Die Reaktion der aktivierten PEG-Derivate erfolgt bevorzugt mit Amino­ funktionen des Proteins, wie z. B. Amino-Terminus oder Lysin-Gruppen. Bei mehreren zur Verfügung stehenden Aminofunktionen erfolgt eine statistische Verteilung der PEG-Gruppen am Protein. Man erhält somit ein Gemisch von Isomeren, das sich nur schwer oder gar nicht in die Einzelbestandteile auftrennen läßt.
Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, ein Herstellverfahren für Protein-Polyalkylenglykolkonjugate bereitzustellen, das durch eine selek­ tive Reaktion zu einem möglichst homogenen Produkt führt.
Demgemäß wurde gefunden, daß das Verfahren zur Herstellung von Protein- Polyalkylenglykolkonjugaten durch Umsetzung eines aktivierten Polyalkylen­ glykolderivats mit einem Protein besonders selektiv erfolgt, wenn man die Umsetzung in einem Lösungsmittelgemisch aus Wasser mit 10 bis 80 Vol% organischem Lösungsmittel in Gegenwart von Carbonat durchführt.
Für die Umsetzung mit Polyalkylenglykolderivaten kommen alle Proteine in Betracht, die mindestens eine Aminofunktion besitzen. Bei der Amino­ funktion kann es sich entweder um den Amino-Terminus oder eine interne Aminofunktion, wie z. B. einen Lysinrest, handeln.
Die Molmasse des Proteins spielt für die Umsetzung keine Rolle. Die Bezeichnung Proteine umfaßt auch Oligopeptide, wie z. B. Tripeptide. Bevor­ zugt werden solche Proteine verwendet, die gegenüber Gemischen aus Wasser und den nachfolgend beschriebenen organischen Lösungsmitteln stabil sind, d. h. daß diese Proteine, nachdem sie mit einem Gemisch aus Wasser und einem organischen Lösungsmittel in Kontakt gekommen waren, keinen oder nur einen geringfügigen Verlust ihrer biologischen Aktivität erfahren.
Das Verhalten von Proteinen gegenüber organischen Lösungsmitteln kann aus der Literatur entnommen werden. Alternativ kann durch einfache Vorversuche der Einfluß eines Lösungsmittels festgestellt werden.
Proteine, die besonders gut mit diesem Verfahren modifiziert werden können, sind Hirudine. Hierunter sind das im medizinischen Blutegel vor­ kommende Hirudin, das davon abgeleitete Desulfato-Hirudin, weitere natür­ lich vorkommende Isohirudine sowie nicht in der Natur vorkommende Hirudin- Muteine zu verstehen. Bevorzugt werden solche Hirudine verwendet, bei denen die Anzahl oder die Position der Aminofunktionen gegenüber dem natürlichen Hirudin verändert worden ist.
Das Protein wird in einer Konzentration von 1 bis 50 mg/ml, bevorzugt von 5 bis 30 mg/ml eingesetzt.
Als Polyalkylenglykole kommen Moleküle mit einer Molmasse von 1000 bis 15000 in Betracht. Bevorzugt verwendet werden Polyalkylenglykole mit einer Molmasse von 2000-10000.
Die Polyalkylenglykole müssen vor ihrer Umsetzung mit dem Protein akti­ viert werden. Dies kann z. B. durch Umsetzen des Polyalkylenglykols mit 4-Nitrophenyl-chloro-formiat zum Polyalkylen-4-nitrophenyl-carbonat geschehen.
Als organische Lösungsmittel kommen Alkokole, Ether, Ketone, Nitrile, in Betracht. Es können auch Schwefel-enthaltende Lösungsmittel wie z. B. Dimethylsulfoxid verwendet werden. Auch Carbonsäureamide wie z. B. Dimethylformamid können eingesetzt werden.
Bevorzugt werden als Lösungsmittel kurzkettige aliphatische Alkohole wie z. B. Methanol, Ethanol, Isopropanol, n-Propanol, oder Butanol verwendet.
Bei den Ethern werden bevorzugt zyklische Verbindungen wie z. B. Tetra­ hydrofuran verwendet.
Es können auch Gemische dieser Lösungsmittel verwendet werden.
Lösungsmittel, die mit Wasser nicht homogen mischbar sind, werden bei der Umsetzung durch starkes Rühren mit der wäßrigen Phase in Kontakt gebracht.
Bevorzugt werden solche organischen Lösungsmittel verwendet, die mit Wasser mischbar sind.
Als Carbonat können Alkali- oder Ammoniumcarbonate eingesetzt werden. Bevorzugt werden Alkalicarbonate, besonders bevorzugt Natriumcarbonat oder Kaliumcarbonat.
Das Carbonat wird bei der Umsetzung bevorzugt in einer Endkonzentration von 25 bis 150 mM eingesetzt. Besonders bevorzugt ist eine Carbonat­ konzentration von 30 bis 90 mM.
Die Umsetzung des Proteins mit dem aktivierten Polyalkylenglykol wird durchgeführt, indem die wäßrige Lösung des Proteins mit einer Lösung des aktivierten Polyalkylenglykols in einem organischen Lösungsmittel gemischt wird. Es ist aber auch möglich, das Protein in einem Gemisch aus wäßrigem Puffer und organischem Lösungsmittel zu lösen und das aktivierte Poly­ alkylenglykol in fester Form zuzugeben.
Die Umsetzung ist auch möglich, indem das aktivierte Polyalkylenglykol in Wasser oder organischem Lösungsmittel oder einem Gemisch aus Wasser und organischem Lösungsmittel vorgelegt wird und das Protein in dem gegebenen­ falls noch fehlenden Lösungsmittel zugegeben wird.
Die Reaktion wird in einem Gemisch aus Wasser mit 10 bis 80 Vol%, bevor­ zugt 30 bis 60 Vol%, organischem Lösungsmittel durchgeführt.
Die Reaktionsdauer ist abhängig von der gewählten Temperatur. Bei Raum­ temperatur beträgt sie üblicherweise zwischen 1 und 10 Stunden.
Die Temperatur, bei der die Umsetzung durchgeführt wird, richtet sich nach der Temperaturempfindlichkeit des eingesetzten Proteins. Sie kann zwischen -20 und 80°C, bevorzugt zwischen 0 und 60°C betragen.
Der pH-Wert der Reaktion kann von 7,0 bis 10,5, bevorzugt von 7,5 bis 10,0 betragen.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich besonders gut zur Herstellung von Proteinen, die an genau definierten Positionen Polyalkylenglykol­ gruppen tragen. Auf dem Arzneimittelgebiet werden Protein-Polymerkonjugate wegen ihrer günstigen Eigenschaften, wie z. B. lange Halbwertszeit und fehlende Antigenität bevorzugt eingesetzt. Das neue Herstellverfahren liefert diese gewünschten genau definierten Protein-Polyalkylenglykol­ konjugate in hoher Ausbeute. Somit können wertvolle Arzneimittel in höherer Reinheit als bisher hergestellt werden.
Beispiel 1 Abhängigkeit des PEG2-Hirudin-Anteils von der Carbonat-Konzentration
10 mg eines Hirudin-Muteins (Pos. 27: Lys, Pos. 33: Lys, Pos. 36: Arg Pos. 47: Arg) werden in einem Lösungsmittelgemisch n-Propanol/50 mM Triethylaminpuffer (50/50, v/v) pH 10 gelöst, die Carbonatkonzentration auf die in der Figur angegebenen Werte durch Zusatz von Natriumcarbonat eingestellt und mit 35 mg p-Nitrophenylcarbonat-aktiviertem Monomethoxy­ polyethylenglykol5000 versetzt und bei 25°C 4 Stunden inkubiert. Die Reaktion wird durch Zusatz eines 10-fach molaren Überschusses (bezogen auf aktiviertes PEG) an Tris-Base abgestoppt und die Produktzusammensetzung durch FPLC-Ionenaustauschchromatographie (Mono Q, Pharmazia) analysiert. Dazu wird ein Aliquot des Reaktionsansatzes bei pH 8 aufgetragen und die Trennsäule anschließend mit einem Salzgradienten von 0 M NaCl nach 400 mM NaCl eluiert. PEG₁-Hirudin eluiert bei 230 mM NaCl, PEG2-Hirudin bei 210 mM und PEG3-Hirudin bei 190 mM NaCl.
Die Abhängigkeit der Ausbeute an PEG2-Hirudin von der Carbonatkonzentra­ tion ist in der Figur dargestellt.
Beispiel 2 Kopplung von PEG5000 an Hirudin in Anwesenheit von verschiedenen Lösungs­ mitteln
0,5 ml einer Desulfatohirudinlösung (20 mg/ml) in 100 mM Natriumcarbonat pH 10 werden mit 0,5 ml Wasser oder Lösungsmittel versetzt, danach 35 mg p-Nitrophenyl-aktiviertes Methoxypolyethylenglykol5000 zugegeben und der Kopplungsansatz bei 25°C für 4 Stunden inkubiert. Die Reaktion wird dann wie unter Beispiel 1 beschrieben mit Tris-Base abgestoppt und die Produkt­ zusammensetzung durch FPLC-Anionenaustausch-Chromatographie analysiert.
Die Ausbeuten an PEG2-Hirudin sind in folgender Tabelle zusammengefaßt:
Lösungsmittel
Anteil PEG₂-Hirudin
am Reaktionsansatz (%)
Wasser|51%
Acetonitril 72%
DMSO 69%
THF 73%
Aceton 69%
Butanol 70%
n-Propanol 82%
iso-Propanol 79%

Claims (3)

1. Verfahren zur Herstellung von Protein-Polyalkylenglykolkonjugaten durch Umsetzung eines aktivierten Polyalkylenglykolderivats mit einem Protein, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung in einem Lösungsmittelgemisch aus Wasser mit 10 bis 80 Vol% organischem Lösungsmittel, ausgenommen 1,4-Dioxan, in Gegenwart von Carbonat durchführt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Protein ein Hirudin verwendet wird.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittelgemisch Wasser mit 50 Vol% n-Propanol in Gegenwart von 50 mM Natriumcarbonat verwendet.
DE4117784A 1991-05-31 1991-05-31 Herstellung von protein-polyalkylenglykolkonjugaten Withdrawn DE4117784A1 (de)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4117784A DE4117784A1 (de) 1991-05-31 1991-05-31 Herstellung von protein-polyalkylenglykolkonjugaten
PCT/EP1992/000979 WO1992021381A1 (de) 1991-05-31 1992-05-05 Herstellung von protein-polyalkylenglykolkonjugaten

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4117784A DE4117784A1 (de) 1991-05-31 1991-05-31 Herstellung von protein-polyalkylenglykolkonjugaten

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE4117784A1 true DE4117784A1 (de) 1992-12-03

Family

ID=6432831

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE4117784A Withdrawn DE4117784A1 (de) 1991-05-31 1991-05-31 Herstellung von protein-polyalkylenglykolkonjugaten

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE4117784A1 (de)
WO (1) WO1992021381A1 (de)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2632518B2 (ja) * 1987-08-28 1997-07-23 天野製薬株式会社 ビリルビンオキシダーゼの化学修飾体
ES2037179T3 (es) * 1987-11-25 1993-06-16 American Cyanamid Company Sistema de liberacion sostenida (controlada) para bloqueadores de canales de calcio de dihidropiridina.
EP0333356A3 (de) * 1988-03-04 1990-12-19 Biogen, Inc. Hirudin-Peptide
JP3187044B2 (ja) * 1989-12-01 2001-07-11 ビーエーエスエフ アクチェンゲゼルシャフト ヒルジン突然変異蛋白質及びヒルジンポリアルキレングリコール複合体
EP0453621A1 (de) * 1990-04-28 1991-10-30 W.R. Grace & Co.-Conn. Polymermodifizierte Arzneimittel mit verbesserter biologischer und pharmakologischer Wirksamkeit

Also Published As

Publication number Publication date
WO1992021381A1 (de) 1992-12-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE60221201T2 (de) Polyoxyalkylen-derivate und Verfahren zu ihrer Herstellung
EP0347781B1 (de) Mini-Proinsulin, seine Herstellung und Verwendung
US20200138968A1 (en) Process for preparing intermediate of antibody drug conjugate
EP1631545A2 (de) Reagenzien zur modifikation von biopharmazeutika, deren herstellung und anwendung
EP0161504A1 (de) Herstellung von Polypeptiden mit Human-Gammainterferon-Aktivität
EP0002680B1 (de) 4-Spectinomycylamin und seine physiologisch verträgliche Salze, Verfahren zur Herstellung und diese Stoffe enthaltende Arzneimittel
WO1991008229A1 (de) Hirudinpolyalkylenglykolkonjugate
EP1919509B1 (de) Hoch verzweigte reagenzien zur modifikation von biopharmazeutika, deren herstellung und anwendung
WO2000063248A3 (en) Highly purified gonadotropin compositions and process for preparing them
DE4117784A1 (de) Herstellung von protein-polyalkylenglykolkonjugaten
DE2937012A1 (de) Mittel zur stabilisierung von enzymen und deren verwendung
DE2641388C3 (de) 3',4'-Didesoxykanamycin B-N-methansulfonsäuren und deren Alkalimetallsalze sowie diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Präparate
DE2618009C3 (de) 1-N-<a-Hydroxy-to-aminoacyl)- derivate des 3'-Deoxykanamycin A und diese enthaltende Arzneimittel
DE1811518B2 (de) Daunorubicinderivale, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen
DE60026708T2 (de) Verfahren zur entschützung von geschützten thiolen
DE3133077A1 (de) Neue cytostatisch wirksame epoxidgruppen tragende 1,3,2-oxazaphosphorin-verbindungen, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung in pharmazeutischen zubereitungen
DE3133215C2 (de) N-Methansulfonsäurederivate von Istamycin A oder B, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel
DE60127848T2 (de) T-Butoxycarbonylaminoethylamin für die Synthese von PNA-Monomereinheiten, Aminosäurederivaten, Zwischenprodukten davon und Verfahren für deren Herstellung
DE69736561T2 (de) Acyltransfer mit einem stabilisierten übergangskomplex unter verwendung eines katalysators mit einer katalytischen imidazolfunktion (z.b. histidin)
EP0367161B1 (de) Verfahren zur selektiven Spaltung von Fusionsproteinen
DE2203653B2 (de) 3-Carbamoyloxymethyl-7-(2-thienylacetamido)-3-cephem-4-carbonsäure und deren Salze, Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen und solche Verbindungen enthaltende Arzneimittel
EP0909182A2 (de) Herstellung polyether-aufweisender chlorine und bakteriochlorine
DE2428641C2 (de) 5"-Amino-4',5"-didesoxy-ambutyrosin A, dessen Hydrate und Salze, Verfahren zu deren Herstellung und diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Mittel
EP0360882A1 (de) Haar-Anregungs-, Anti-Schuppen- und Anti-Seborrhöe-Zusammensetzung für topische Anwendung
DE2917603C2 (de)

Legal Events

Date Code Title Description
8130 Withdrawal