CZ285225B6 - Aprotininová analoga - Google Patents

Abstract

Aprotininová analoga se sníženou nefrotoxicitou, přičemž se zřetelem na dosažení snížení čistého kladného náboje je nejméně jeden zbytek kladně nabité aminokyseliny vně vazného místa proteasy odstraněn nebo nahrazen zbytkem neutrální nebo negativně nabité aminokyseliny, a/nebo se vsune či přidá nejméně jeden zbytek záporně nabité aminokyseliny, a/nebo se nahradí nejméně jeden zbytek neutrální aminokyseliny zbytkem záporně nabité aminokyseliny, a/nebo s zřetelem na dodažení snížené stálosti se jeden či více zbytků aminokyselin opomene, přidá nebo nahradí jedním či více zbytků jiných aminokyselin.ŕ

Description

Analog aprotininu, analog kódující DNA, expresní vektor a buňka obsahující expresní vektor, způsob přípravy analogu aprotininu a farmaceutický prostředek s jeho obsahem

Oblast techniky

Aprotinin, známý jako inhibitor hovězího pankreatického trypsinu (BPTI, bovine pancreatic trypsin inhibitor) je zásaditý protein, přítomný v některých hovězích orgánech a tkáních, jako jsou lymfatické uzliny, pankreas, plíce, příušní žlázy, slezina a játra. Je to polypeptid s jedním řetězcem s 58 aminokyselinovými zbytky s touto sekvencí aminokyselin:

Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gin Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala

Řetězec aminokyselin je zesítěn třemi disulfidickými můstky mezi Cys (5) a Cys (55), Cys (14) a Cys (38) i Cys (30) a Cys (51) v tom kterém případě.

Izoelektrický bod aprotininu je značně vysoký, přibližně pí 10,5. Je to způsobeno poměrně vysokým obsahem kladně nabitých aminokyselin lysinu a argininu. Trojrozměrná struktura molekuly aprotininu je velmi kompaktní a v důsledku tohoto stavu je velmi odolná proti denaturaci za vysokých teplot, nebo při působení kyselin, zásad nebo organických rozpouštědel, a i proti proteolytické degradaci, viz B. Kassell, Meth. Enzym. 19, 844-852 (1970).

Je známo, že aprotinin inhibuje četné proteásy sér, počítaje v to trypsin, chymotrypsin, plasmin akallikrein a využívá se terapeuticky při léčbě akutní pankreatitidy, četných stavů šokových syndromů, hyperfibrinolytické hemorrhagie i infarktů myokardu, viz například J. E. Trapnell a spol., Brit. Jeum. Surg. 6, 177 (1974); J. McMichan a spol., Circulatory Shock 9. 107 (1982); L. M. Auer a spol., Acta Neurochir. 49, 207 (1979); G. Sher, Am. J. Obstet. Gynecol. 129, 164 (1977) a B. Schneider, Arzneim-Forsch. 26, 1606 (1976). Podáváním aprotininu ve vysokém dávkování se významně sníží ztráta krve v souvislosti s chirurgickými zákroky na srdci, počítaje v to kardiopulmonámí operace, viz například B. P. Bidstrup a spol., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 97. 364-372 (1989) a W. van Oeveren a spol., Ann. Thorac. Surg. 44, 640-645 (1987).

Některá analoga (obdoby) aprotininu jsou známá, viz například americký patentový spis 4 595 674, popisující analoga a deriváty s nahrazením Lys (15) za Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Arg, L-a-aminomáselnou kyselinu, L-norvalin, L-norleucin, dehydroalanin nebo L-homoserin. Evropský patentový spis 238 993 uvádí analoga aprotininu za náhrady Lys (15) použitím Arg, Val, Ile, Leu, Phe, Gly, Ser, Trp, Tyr nebo Ala a kde Met (52) se navíc nahrazuje za Glu, Val, Leu, Thr nebo Ser. Evropský patentový spis 307 592 popisuje aprotininová analoga, kde jedna či více aminokyselin v polohách 15, 16, 17, 18, 34, 39 a 52 se nahradí jiným zbytkem aminokyseliny. WO 89/01968 popisuje způsob produkce aprotininu nebo jeho analog v kvasinkách a specificky uvádí obdoby, postrádající jeden či dva zbytky aminokyselin na N-koncích a kde Lys (41) a/nebo Arg (42) se nahradí jiným zbytkem aminokyseliny, zvláště pak Ser. Evropský patentový spis 339 942 popisuje analoga aprotininu, kde jedna či více z aminokyselin v poloze 1, 2, 12-19, 38, 41 a 42 se vyřadí a opomene nebo nahradí jinými aminokyselinovým zbytkem. Aminokyselinové substituce, popsané ve výše uvedených zdrojích, se hlavně zjišťují v proteázově-vazné oblasti molekuly aprotininu s úmyslem změnit proteázově-inhibiční profil aprotininu s výhradou náhrady Met (52) podle Evropského patentového spisu 238 993 a náhrady Lys (41) a/nebo Arg (42) podle WO 89/01968, což se provádí s úmyslem usnadnit produkci aprotininu v E.coli a kvasinkách. Evropský patentový spis uvádí analoga aprotininu modifikované v jedné či více z poloh 12-19 s úmyslem změnit jejich proteázově-vazné vlastnosti.

-1 CZ 285225 B6

Analoga mohou navíc postrádat jeden či dva zbytky aminokyselin na N-zakončení a lze nahradit Lys (41) a/nebo Arg (42) jiným zbytkem.

Dosavadní stav techniky

Bylo již dříve popsáno, že po intravenosní injekci nativního aprotininu zvířatům, nebo dobrovolníkům z řad lidí se hladina inhibitoru v plasmě snižuje spíše rychle v důsledku distribuce v extracelulámí kapalině s následující akumulací v ledvinách, viz I. Trautschold a spol. v K. Heinkel a H. Schon (vydavatelé): Pathogenese, Diagnostik, Klinik und Therapie der Erkrankungen des Exokrinen Pankreas, Schattauer, Stuttgart 1964, str. 289; E. Habermann a spol., Med. Welt 24 (29), 1163-1167 (1973); H. Fritz a spol., Hoppe-Seyler’s Z. physiol. Chem. 350, 1541-1550 (1969); H. Kaller a spol., Eur. J. Drug. Metab. Pharmacokin. 2, 79-85 (1978). Po glomerulové filtraci se aprotinin takřka kvantitativně váže na zvrásněnou membránu proximálních tubulových buněk. Potom se aprotinin reabsorbuje do mikropinocytických nosičů a fagosomů s následující velmi pomalou degradací v fagolysosomech. Tento typ přenosu byl navržen jako příkladný obecně pro peptidy, viz M. Just a E. Habermann, Naunyn-Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 280,161-176 (1973) a M. Just, Naunyn-Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 287, 85-95 (1975).

Makroskopické a histopathologické testování po podání aprotininu vedlo ke zjištění změn v ledvinových tkáních krys, králíků a psů po opakovaných injekcích poměrně vysokých dávek aprotininu, viz Bayer, Trasylol, Inhibitor of proteinase; E. Glaser a spol. v „Verhandlungen der Deutschen Gesellschaft fiir Innere Medizin, 78. Kongress“, Bergmann, Můnchen, 1972, str. 1612-1614. Nefrotoxicita, jevící se kromě jiného ve formě lesí, jak byla u aprotininu zjištěna, se může připsat na vrub hromadění se aprotininu v proximálních tubulámích buňkách ledvin.

V důsledku nefrotoxicity se jeví být aprotinin méně vhodný pro klinické účely, zvláště v případech, kdy je třeba přidávat velké dávky inhibitoru (jako jsou kardiopulmonámí operace).

Bylo by tedy vysoce žádoucí vyvinout aprotininová analoga se sníženou nefrotoxicitou ve srovnání s nativním aprotininem.

Podstata vynálezu

Tento vynález se týká aprotininových analog se sníženou nefrotoxicitou, přičemž k dosažení sníženého kladného náboje se nejméně jeden zbytek kladně nabité aminokyseliny vně proteázově-vazné strany odstraní nebo nahradí neutrálním či negativně nabitým zbytkem aminokyseliny, a/nebo se vsune či přidá nejméně jeden zbytek negativně nabité kyseliny, a/nebo se nejméně jeden zbytek neutrální aminokyseliny nahradí zbytkem negativně nabité aminokyseliny, a/nebo k dosažení snížené stálosti se jeden či více zbytků aminokyselin vyřadí, přidá či nahradí jedním či více zbytků aminokyselin.

V této souvislosti výraz „snížený kladný náboj“ jest chápat tak, že zahrazuje analoga s nižším kladným nábojem ve srovnání s původním aprotininem (který má kladný náboj +6), ale bez vlastního náboje nebo negativního vlastního náboje. Je třeba připomenout, že vlastní náboj aprotininu může kolísat v závislosti na pH, takže výrazy „vlastní positivní náboj“, „vlastní negativní náboj“, „positivně nabitý“ nebo „negativně nabitý“ se používají s ohledem na náboj molekuly za neutrální hodnoty pH.

Výrazem „proteázově-vazná část“ se míní označení aminokyselinových zbytků, které jsou důležité pro inhibování proteázy, tj. aminokyselinové zbytky, které jsou v bezprostředním styku sproteázou vazbou zbytků aminokyselin přímo na aktivní místo enzymu nebo v jeho blízkosti.

-2CZ 285225 B6

Běžně se má za to, že zahrnují (a tak je tomu i v souvislosti s tímto textem), aminokyselinové zbytky v polohách 12-18 a 34-39, viz H. Fritz a G. Wunderer, Arzneim. Forsch. 33 (1), 484 (1983). Je výhodné odstranit, vsunout či nahradit aminokyselinové zbytky vně proteázově-vazné strany pouze se zřetelem vyvarovat se podstatněji změn profilu inhibování proteázy u obdoby aprotininu podle tohoto vynálezu ve srovnání s původním aprotininem.

S překvapením bylo zjištěno, že aprotinonová analoga se sníženým vlastním kladným nábojem se vyznačují podstatně nižší nefrotoxicitou ve srovnání s nativním aprotininem. Jedním z důvodů nižší nefrotoxicity může být to, že aprotininová analoga s nižším vlastním kladným nábojem mají nižší vaznou aktivitu k povrchu proximálních tubulí (zvrásněná membrána), takže se z velké míry vylučují močí. Tento výklad je v souladu se zjištěním H. Fritz-e a spol., citace viz výše, kteří uvádějí, že chemicky modifikované aprotininové deriváty (tetramaleoyl- a pentamaleoylderiváty), které jsou ve srovnání s nativním aprotininem méně bazické, se nevážou na izolovanou zvrásněnou membránovou frakci, ale vylučují se kvantitativně do moči.

Na druhé straně se chemicky modifikovaný aprotinin liší velmi od aprotininu a dalších nativních proteinů tím, že obsahuje aminokyseliny, které nejsou k nalezení v žádném z přírodních makromolekulámích útvarů. Nelze tedy vyloučit možnost, že ztráta hromadění se chemicky modifikovaných derivátů v ledvinách se dá připsat změněným vlastnostem modifikovaných derivátů, než jenom snížení vlastního kladného náboje.

Bylo zjištěno, že jiné peptidy se vážou na zvrásněnou membránu s nižší afinitou a kapacitou než aprotinin navzdory tomu, že obsahují kladně nabité aminokyseliny a/nebo mají vlastní kladný náboj. Znamená to, že vlastní kladný náboj aprotininu není jediným vysvětleným pro vazbu a hromadění se aprotininu v proximálních tabulových buňkách, viz M. Just a spol., lst. Symp. Physiol. Prop. Pharmacol. Ration.: Kininogenases, Schattauer, Stuttgart, 1973, str. 1163-1167.

Dále pak bylo s překvapením zjištěno, že aprotininová analoga se sníženou tepelnou stálostí se nehromadí v ledvinových tkáních stejnou měrou, jako nativní aprotinin. Jak to bylo již zde uvedeno výše, trojrozměrné uspořádání aprotininu je velmi kompaktní a má se za to, že právě proto je inhibitor vysoce stálý proti denataraci i proteolytické degradaci. Takže hromadění se aprotininu v ledvinách může být též výsledkem mimořádné stability inhibitoru. Proto je tedy možné, že náhrada jednoho či více aminokyselinových zbytků v molekule aprotininu může vyústit v obdobě aprotininu s nižší stálostí ve srovnání s původní molekulou. V této souvislosti výraz „snížená stálost“ může znamenat snížení tepelné stálosti obdob ve vodných roztocích za hodnoty pH asi 4-10. Účinek takové snížené stálosti „in vivo“ se může projevit tak, že obdoby aprotininu se snáze odbourávají, například proteolyticky, což má za následek rychlejší eliminování takových obdob z proximálních tabulů.

Má se běžně za to, že snížená nefrotoxicita analog podle tohoto vynálezu může záležet v kombinaci snížení čistého kladného náboje a snížení stálosti molekuly.

Značně přispívající příčinou poškození ledvin v důsledku podávání nativního aprotininu může být to, že se aprotinin hromadí v glomerulámích membránách v důsledku afinity pro negativně nabité struktury na povrchu membrány. Může tak dojít k zvětšení velikosti pórů glomerul v důsledku toho ke zvýšené propustnosti větších molekul, například albuminu, což se v zápětí projeví proteinovým přetížením ledvin. Je pravděpodobné, že analoga aprotininu podle tohoto vynálezu se budou projevovat méně škodlivými účinky na velikost pórů glomerulové membrány než nativní aprotinin v důsledku snížené afinity takové membrány pro negativně nabité struktury.

Dále pak bylo pozorováno v některých případech, že podávání aprotininu vede k anafylaktické odezvě. Byla vyslovena domněnka, že taková anafylaktická odezva je ve vztahu k uvolnění histaminu, což mohlo být vyvoláno kladným vlastním nábojem aprotininu. Předpokládá se tedy,

-3CZ 285225 B6 že anafylaktická odezva, jež je připisována podávání nativního aprotininu, se může snížit nebo zcela odstranit podáváním aprotininového analogu podle tohoto vynálezu.

Podrobný popis vynálezu

Podle tohoto vynálezu se může kterýkoli z kladně nabitých aminokyselinových zbytků vně proteázově-vazné strany nahradit buď záporně nabitým aminokyselinovým zbytkem, jako je Glu, nebo Asp, nebo kterýmkoli z neutrálních aminokyselinových zbytků, jako je Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Glu, Ser, Thr, Val, Trp či Tyr. Avšak se zřetelem vyvarovat se neaktivních obdob nebo obdob s nevhodnou trojrozměrnou strukturou, vyvolanou nežádoucím složením molekuly je vždy výhodné zvolit substituce, jež jsou totožné s aminokyselinovými zbytky v odpovídajících polohách jiných inhibitorů proteázy nebo v oblasti širších struktur, vyznačujících se vysokým stupněm homologie se zřetelem k původnímu aprotininu. Jinak řečeno se volba náhradního aminokyselinového zbytku s výhodou zakládá na analýze molekul, které jsou homologní k aprotininu. Je třeba poznamenat, že současně s aminokyselinovou náhradou či náhradami, čímž se přímo přispívá k snížení kladného náboje lze provést náhradu jedné či více dalších aminokyselin, což se neprojeví jako snížení kladného náboje, ale může to být žádoucí se zřetelem na vznik aktivního analogu s vhodnou trojrozměrnou strukturou.

Podle toho se podle specifičtějšího aspektu týká tento vynález aprotininových obdob obecného vzorce I

R¹ Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro R² Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg

Ile Ile R³ Tyr Phe Tyr R⁴ Ala R⁵ Ala Gly Leu Cys R⁶ Thr Phe Val

Tyr Gly Gly Cys Arg R⁷ R⁸ R⁹ Asn R¹⁰ Phe R^1! Ser Ala Glu Asp Cys

Met R¹² Thr Cys Gly Gly Ala (I) kde

R* znamená dipeptid zvolený z dvojic Arg-Pro, Glu-Pro, Asp-Pro, Ala-Pro, Ile-Pro, Thr-Pro, His-Pro, Leu-Pro, Gly-Pro a Ser-Pro, Pro nebo peptidovou vazbu,

R² znamená zbytek aminokyseliny, jako je Tyr, Glu, Asp, Ser, Thr, Ala a Val,

R³ znamená zbytek aminokyseliny, jako je Arg, Glu, Asp, Leu, Ser, Ala, Gin a Thr,

R⁴ znamená zbytek aminokyseliny, jako je Asn, Glu a Asp,

R⁵ znamená zbytek aminokyseliny, jako je Lys, Glu, Asp, Thr, Val, Ala, Ser, Phe, Gin a Gly,

R⁶ znamená zbytek aminokyseliny, jako je Gin, Glu, Asp, Val a Ala,

R⁷ znamená zbytek aminokyseliny, jako je Ala, Asp, Glu a Gly,

R⁸ znamená zbytek aminokyseliny, jako je Lys, Glz, Asp, Asn, Ser, Thr a Ala,

R⁹ znamená zbytek aminokyseliny, jako je Arg, Glu, Asp, Ser, Asn, Leu, Gly, Gin, Met a Thr,

R¹⁰ znamená zbytek aminokyseliny, jako je Asn, Glu a Asp,

R¹¹ znamená zbytek aminokyseliny, jako je Lys, Glu, Asp, Leu, Tyr, Ala, Val, Thr, Ser, Pro, His a Ile,a

R¹² znamená zbytek aminokyseliny, jako je Arg, Glu, Asp, Gin, Ala, Asn, His, Gly, Ser a Thr, to za předpokladu, že nejméně jeden z aminokyselinových zbytků R’-R¹² je jiný, než je odpovídající aminokyselinový zbytek nativního aprotininu.

Kromě těchto vnitřních substitucí v molekule aprotininu je možné přidat na N- či C-konci molekuly aprotininu jeden či více negativně nabitých aminokyselinových zbytků se zřetelem na potřebné snížení kladného náboje. Dále pak je možné se zřetelem na snížení stability molekuly přidat na N- nebo C-konec molekuly jeden či více neutrálních aminokyselinových zbytků.

-4CZ 285225 B6

Takové úpravy se mohou provádět buď na nativní molekule aprotininu, nebo navíc v souvislosti s úpravami, jak o nich byla výše řeč.

Je-li žádoucí změnit proteázově-inhibiční vlastnosti analogu aprotininu kromě snížení nefrotoxicity, je možné navíc modifikovat takový analog aprotininu na proteázově-vazné straně. Například bylo již dříve prokázáno, viz H. R. Wenzel a H. Tschesche, Angew. Chem. Internát. Ed. 20, 295 (1981), že se aprotinin (1-58, Val-15) vyznačuje poměrně vysokou selektivitou na granulocytovou elastasu a inhibičním účinkem na kollagenasu, aprotinin (1-58, Ala-15) má slabý účinek na elastasu, a aprotinin (1-58, Gly-15) se vyznačuje mimořádnou antitrypsinovou účinností a překvapivě inhibuje kallikrein. Dále pak je možné modifikovat inhibiční účinek aprotininu současně se snížením kladného náboje tím, že se nahradí jedna či více z kladně nabitých aminokyselin v proteázově-vazné části neutrální nebo negativně nabitou aminokyselinou či aminokyselinami takového typu.

Takže vynález se dále týká analog aprotininu obecného vzorce II

R¹ Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro R² Thr Gly Pro Cys R¹³ R¹⁴ R¹⁵ R16 _rI7 _r3 _{Tyr phe Tyr R}4 _{Ala r}5 _{AJa G|y Leu Cys R}6 p_he R¹⁸ Tyr R¹⁹ Gly Cys R²⁰ R⁷ R⁸ R⁹ Asn R¹⁰ Phe R¹¹ Ser Ala Glu Asp Cys Met R¹² Thr Cys Gly Gly Ala (Π) kde R¹ a R¹² mají významy, jak zde byly uvedeny výše

R¹³ znamená zbytek aminokyseliny, jako je Lys, Arg, Glu, Leu, Met, Tyr a Phe,

R¹⁴ znamená zbytek aminokyseliny, jako je Ala a Gly,

R¹⁵ znamená zbytek aminokyseliny, jako je Arg, Ala, Gly, Lys, Leu, Met, Phe, Tyr, Ile a Asn,

R¹⁶ znamená zbytek aminokyseliny, jako je Ile, Met, Leu, Phe, Thr a Glu,

R¹⁷ znamená zbytek aminokyseliny, jako je Ile, Leu, Lys, Gin, Glu, Ser, Thr a Asn,

R¹⁸ znamená zbytek aminokyseliny, jako je Val, Thr, Leu, Ser, Tyr, Gin, His, Pro, Phe, Asn, Ile a Lys

R¹⁹ znamená zbytek aminokyseliny, jako je Gly, Thr a Ser, a

R²⁰ znamená zbytek aminokyseliny, jako je Gin, Lys, Met, Asn, Leu, Gly a Glu, to za předpokladu, že nejméně jeden z aminokyselinových zbytků R’-R¹² a nejméně jeden z aminokyselinových zbytků R¹³-R²⁰ se liší od odpovídajících aminokyselinových zbytků nativního aprotininu.

Jako příklady analog aprotininu obecného vzorce I, které jsou zvláště výhodné, lze označit ty, kde R¹ znamená Glu-Pro, R⁵ znamená Glu, R⁸ také Glu, R¹¹ rovněž Glu, a R², R³, R⁴, R⁶, R⁷, R⁹, R¹⁰ a R¹² odpovídají sledu v nativním aprotininu. Nebo kde R¹ znamená Glu-Pro, R⁹ i R¹¹ znamená Glu, a R², R³, R⁴, R⁶, R⁷, R⁸, R¹⁰ a R¹² jsou totožné, jako v sekvenci nativního aprotininu, nebo kde R⁹ a R¹¹ znamená Glu, a R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, R¹⁰ a R¹² jsou totožné, jako je tomu v sekvenci nativního aprotininu; nebo kde R² znamená Ser, R⁴ znamená Asp, R⁵ Thr, R⁶ Glu, R⁸ Asn, R¹² Glu a R¹, R³, R⁷, R⁹, R¹⁰ a R¹¹ mají významy, jak odpovídají nativní sekvenci aprotininu; nebo kde R² znamená Ser, R³ Leu, R⁷ Gly, R⁸ Asn, R⁹ Gly, R¹⁰ Gin, R¹¹ Tyr a R¹, R⁴, R⁵, R⁶ a R¹² mají významy, jako v sekvenci nativního aprotininu; nebo kde R¹ znamená peptidovou vazbu, R⁹ je Ser, R¹¹ Glu a R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, R¹⁰ a R¹² mají významy dle nativní sekvence aprotininu; nebo kde R¹ znamená peptidovou vazbu, R⁹ JE Ser, R¹¹ Ala, a R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, R¹⁰ a R¹² mají významy jako v nativní sekvenci aprotininu; nebo kde R¹ znamená peptidovou vazbu, R² je Ser, R⁴ je Asp, R⁵ je Thr, R⁶ Glu, R⁸ Asn, R¹² Glu, a R³, R⁷, R⁹, R¹⁰ a R¹¹ mají významy dle sekvence nativního aprotininu; nebo kde R¹ znamená peptidovou vazbu, R⁶ je Asp, R⁵ Thr, R⁶ Glu, R¹² Glu, a R², R³, R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰ a R¹¹ odpovídají

-5CZ 285225 B6 sekvenci nativního aprotininu; nebo kde R¹ znamená peptidovou vazbu, R² je Ser, R⁷ Gly, R⁸ Asn, R⁹ Gly, R¹² Glu, a R³, R⁴, R⁵, R^s, R¹⁰ a R¹¹ mají významy dle sekvence nativního aprotininu; nebo kde R¹ znamená peptidovou vazbu, R⁹ je Ser, R¹² Glu a R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, R¹⁰ a R¹¹ mají významy dle sekvence nativního aprotininu; nebo kde R¹ znamená peptidovou vazbu, R⁹ je Glu, R¹² je Glu a R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, R¹⁰ a R¹¹ jsou totožné se sekvencí nativního aprotininu; nebo kde R¹ znamená peptidovou vazbu, R⁵ je Glu, R⁹ Ser, R¹² je Glu a R², R³, R⁴, R⁶, R⁷, R⁸, R¹⁰ a R¹¹ odpovídají sekvenci nativního aprotininu; nebo kde R¹ znamená peptidovou vazbu, R⁵ Glu, R⁹ Glu, R¹² Glu a R², R³, R⁴, R⁶, R⁷, R⁸, R¹⁰ a R¹¹ odpovídají zbytkům v sekvenci nativního aprotininu.

Z jiného hlediska se vynález vztahuje ke konstrukci DNA se zakódovanou obdobou aprotininu podle tohoto vynálezu.

Konstrukce DNA podle tohoto vynálezu se dá připravit synteticky známými a běžnými postupy, například fosfoamiditovým způsobem, jak to popsali Beaucage S. L. a Caruthers Μ. H., Tetrahedron Letters 22, 1859-1869 (1981) nebo postupem, který popsal Matthes a spol., EMBO Joumal 3, 801-805 (1984). Podle fosfoamiditového způsobu se syntetizují oligonukleotidy například v automatickém DNA-syntetizátoru, čistí se, anelují, navazují a klonují ve vhodných reaktorech.

Jinak je možno použít genomovou nebo cDNA kódující nativní aprotinin (například jak se získá vyčleněním z genomové nebo cDNA sbírky za použití vzorků syntetických oligonukleotidů) a modifikovat sledovanou látku na jednom či více míst, odpovídajícím místu, případně místům, na kterých je žádoucí provést substituci aminokyselinou, například místně řízenou mutagenezí za použití syntetických oligonukleotidů se zakódovanou potřebnou aminokyselinovou sekvencí pro homologní rekombinaci ve shodě s dobře známými postupy.

Podle ještě dalšího aspektu se vynález vztahuje k rekombinantnímu expresnímu vektoru, který zahrnuje konstrukci DNA podle tohoto vynálezu. Rekombinantním expresním vektorem může být kterýkoli vektor, který lze s výhodou použít při postupech s rekombinantní DNA, a volba takového vektoru bude často závislá na buňce hostitele, kam se má zavést. Takže vektorem může být autonomní replikační vektor, to jest vektor, který existuje jako extrachromozomální celek, jehož replikace je nezávislá na chromozomálních replikacích, např. plasmid. Jinak vektor může být i takový, který při zavedení do buňky hostitele se integruje do genomu buněk hostitele a replikuje se s chromozomem, případně chromozomy, do kterých se integroval.

Ve vektoru má být DNA-sekvence se zakódovaným aprotininem, podle tohoto vynálezu operativně napojena na vhodnou sekvenci promotoru. Promotorem může být jakákoli sekvence DNA, jež se vyznačuje transkripční aktivitou ve zvolené buňce hostitele a může se odvozovat od genů kódujících proteiny buď homologní, nebo heterologní vůči buňce hostitele. Jako příklady vhodných promotorů při řízení transkripce DNA kódující analog aprotininu podle tohoto vynálezu do buněk savců lze uvést SV 40 promotor, viz Subramani a spol., Mol. Cell Biol. L 854-864 (1981), MT-1 promotor (metalothioneinový gen), viz Palmiter a spol., Science 222, 809-814 (1983) nebo adenovirový 2 pozdější promotor. Mezi vhodné promotory k použití v hostitelských buňkách kvasnic patří promotory z kvasnicových glykolytických genů, viz Hitzman a spol., J. Biol. Chem. 255, 12073-12080 (1980), dále Alber a Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1, 419-434 (1982), nebo geny alkohol-dehydrogenasy, viz Young a spol., Genetic Engineering of Microorganism for Chetnicals (Hollaender a spol., vydavatelé), Plenům Press, New York, 1982, nebo TPI1, viz Americký patentový spis 4 599 311) nebo ADH2-4c, viz Russell a spol., Nátuře 304, 562-564 (1983). Jako vhodné promotory k použití ve vláknitých hostitelských buňkách hub lze uvést například ADH3 promotor, viz McKnight a spol., The EMBO J. 4, 2093-2099 (1985) nebo tpiA promotor.

-6CZ 285225 B6

Sekvenci DNA kódující analog aprotininu podle tohoto vynálezu lze též operativně spojit s vhodným terminátorem, jako je terminátor lidského růstového faktoru, viz Palmiter a spol., citace viz výše, nebo (pro hostitelské buňky hub) TPI1, viz Alber a Kawasaki, citace zde výše, nebo ADH3, viz McKnight a spol., citace zde výše, vždy jako promotory. Vektor může dále obsahovat prvky jako je polyadenylační signál (například z SV 40 nebo adenovirové 5 Elb oblasti), dále transkripční podpůrné sekvence (například SV 40), a translační podpůrné sekvence (například kódující RNA adenoviru VA).

Rekombinantní expresní vektor podle tohoto vynálezu může obsahovat dále sekvenci DNA, umožňující replikaci vektoru v buňce hostitele. Jako příklady takových sekvencí (pokud hostitelská buňka je buňkou savce) je SV 40 origin replikace, nebo, je-li hostitelskou buňkou kvasinková buňka, replikační geny REP 1-3 i origin replikace kvasinkového plasmidu 2μ. Vektor může rovněž obsahovat zvolitelné značení, například gen, jehož produkt způsobí defekt v buňce hostitele, jako je gen se zakódovanou dihydrofolátovou reduktázou (DHFR) nebo jiný gen, který způsobuje resistenci vůči léku, například neomycinu, hygromycinu nebo methotrexatu, nebo gen Schizosaccharomyces pombe TPI, viz Russell P. R., Gene 40, 125-130 (1985).

Postupy, jak je možno je použít k navázání sekvencí DNA s kódováním pro obdoby aprotininu pole tohoto vynálezu, k navázání promotoru a terminátoru a k vsunutí těchto do vhodného vektoru či vektorů s obsahem informací, nutných pro replikaci, jsou odborníkům dobře známé, viz například Sambrook a spol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York 1989.

Hostitelskou buňkou, do které se zavádí expresní vektor podle tohoto vynálezu, může být kterákoli buňka, jež je schopná produkovat aprotininovou obdobu podle tohoto vynálezu, a s výhodou je to eukaryotická buňka, savčí, kvasinková nebo houbová.

Kvasinkovým organismem, který se použije jako hostitelská buňka podle tohoto vynálezu, může být kterýkoli kvasinkový organismus, který při kultivování produkuje velká množství obdoby aprotininu podle tohoto vynálezu. Jako příklady vhodných kvasinkových organismů lze uvést kmeny kvasinek Saccharonyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe nebo Saccharomyces uvarum. Transformaci kvasinkových buněk lze provést například tvorbou protoplastu s následující transformací, jež je jako taková známá.

Jako příklady vhodných savčích buněk lze uvést COS (ATCC CRL 1650), BHK (ATCC CRL 1632, ATCC CCL 10) nebo CHO (ATCCCCL61). Způsoby přeměny savčích buněk a expresních DNA sekvencí, zavedených do buněk, jsou popsány, viz například Kaufman a Sharp, J. Mol. Biol. 159, 601-621 (1982), dále Southem a Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1, 327341 (1982), dále Loyter a spol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79. 422-426 (1982), Wigler a spol., Cell 14, 725 (1978), Corsaro a Pearson, Somatic Cell Genetic 7, 603 (1981), Graham a van der Eb, Virology 52,456 (1973), posléze Neumann a spol., EMBO J. 1, 841-845 (1982).

Jinak se mohou použít jako hostitelské buňky podle tohoto vynálezu i buňky hub. Jako příklady vhodných buněk hub lze uvést vláknité houby, například Aspergillus spp. nebo Neurospora spp., zvláště pak kmeny Aspergillus oryzae nebo Aspergillus niger. Použití Aspergillus spp. s ohledem na proteiny je popsáno například v Evropském patentovém spise 272 277.

Tento vynález se dále vztahuje k způsobu výroby aprotininových analog podle tohoto vynálezu, k způsobu zahrnujícímu kultivování buňky, jak je to popsáno výše, za podmínek, vedoucích k vytvoření analogu aprotininu a pak získání vzniklého analogu z kultury.

Jako prostředí, jež se použije ke kultivování buněk, se může použít kterékoli běžné prostředí, hodící se pro růst savčích buněk nebo hubních organismů, to v závislosti na buňkách hostitele.

-7CZ 285225 B6

Aprotininová obdoba se vyloučí z hostitelské buňky do růstového prostředí a může se odtud získat jakýmkoli z běžně používaných postupů, počítaje v to oddělení buněk od prostředí odstředěním nebo filtrací, vysrážení složek proteinové povahy z kapalného podílu nad sedlinou nebo z filtrátu pomocí některé soli, například síranu amonného a dále čištěním za použití nejrůznějších chromatografických postupů, například iontoměničovou chromatografií, afinitní chromatografií apod.

Tento vynález zahrnuje také farmaceutické přípravky, obsahující obdobu aprotininu podle tohoto vynálezu spolu s farmaceuticky vhodným nosičem nebo ředidlem. V přípravcích podle tohoto vynálezu se může obdoba aprotininu upravovat do jakékoli formy za použití známých postupů výroby lékových forem, viz například Remington’s Pharmaceutical Sciences, 1985. Přípravek může být ve formě vhodné pro injikování nebo infuzi, to za použití sterilní vody, isotonického roztoku chloridu sodného nebo roztoku glukózy.

Podle dalšího aspektu tohoto vynálezu vede použití aprotininových analog podle tohoto vynálezu k výrobě léku se sníženou nefrotoxicitou ve srovnání s nativním aprotininem a/nebo lékem, který po podání vede k nižšímu výskytu anafylaktických reakcí ve srovnání se zkušenostmi s nativním aprotininem.

Jak to zde již bylo výše poznamenáno, nativní aprotinin, pokud se podává v dávkách blížících se klinickým dávkám se projeví účinky, silně poškozujícími ledviny. Tento účinek může být dán mimořádně vysokou stálostí a poměrně vysokým vlastním kladným nábojem molekuly aprotininu. Obdoby aprotininu podle tohoto vynálezu jsou proto pokládány za výhodné k použití při terapeutických aplikacích, míněných pro nativní aprotinin, zvláště pak tehdy, kdy je třeba použít skutečně vysokých dávek aprotininu. Terapeutické aplikace, pro které se hodní obdoby aprotininu podle tohoto vynálezu v důsledku inhibování lidských serinových proteáz, například trypsinu, plasminu, kallikreinu, elastasy a cathepsinu G, zahrnují, ale bez jakéhokoli omezování akutní pankreatitidu, záněty, thrombocytopenii, uchovávání funkce krevních destiček, ochranu různých orgánů, hojení poranění, šoky (počítaje v to plicní) a stavy, vyvolávající hyperfibrinolytickou haemorrhagii. Vysoké dávky aprotininu jsou předepisovány během a po kardiopulmonámích operacích; nižší nefrotoxicita obdob aprotininu podle tohoto vynálezu je proto zvláště zajímavá při podobných aplikacích, možná že i v četných dalších chirurgických zákrocích, spojených s velkou ztrátou krve, takže je zde snížené risiko anafylaktické odezvy, zřejmě právě pro nižší kladný vlastní náboj obdoby aprotininu.

Krátký popis obrázků

Vynález je blíže popsán formou připojených příkladů se zvláštním odvoláním na připojené obrázky, kde na

Obr. 1 je konstruování syntetického aprotininového genu z oligonukleotidových sekvencí,

Obr. 2 je konstruování plasmidu pKFN-1503,

Obr. 3 je graf inhibiční účinnosti v moči a ledvinách po podání obdob aprotininu s lišícími se vlastními náboji a tepelnou stálostí,

Obr. 4 je inhibiční účinnost v moči 3 hodiny po podání obdob aprotininu s různými vlastními náboji,

Obr. 5 je inhibiční účinnost v ledvinách 3 hodiny po podání obdob aprotininu s různými tepelnými stálostmi, a

-8CZ 285225 B6

Obr. 6 je kumulování inhibiční účinnosti v ledvinách po podání obdob aprotininu s různými tepelnými stálostmi. Akumulační index se propočte jako inhibiční účinnost po 3 hodinách děleno inhibiční účinností po jedné hodině.

Vynález je dále popsán formou připojených příkladů, které však v žádném případě neomezují rozsah vynálezu ve smyslu připojených patentových nároků.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Získání (Glu 1, Glu 26, Glu 41, Glu 46)aprotininu z kmene kvasinek KFN 1512.

Vazbou 10 oligonukleotidů bylo konstruováno syntetické genové kódování pro (Glu 1, Glu 26, Glu 41, Glu 46)-aprotinin. Oligonukleotidy byly syntetizovány na automatickém DNA syntezátoru za užití fosforamiditového postupu a na podkladu ze skla s kontrolovanou velikostí pórů, viz Beaucage S. L., Caruthers Μ. H., Tetrahedron Letters 22,1859-1869 (1981).

Bylo syntetizováno těchto dále uvedených oligonukleotidů:

NOR-1948: CATGGCTGAGAGATTGGAGAAGAGAGAGCTGATTTCTGTTTGGAACCT CCATACACTGGTCC

NOR-1947: TTACATGGACCAGTGTATGGAGGTTCCAAACAGAAATCAGGCTCTCTCT TCTCCAATCTCTCAGC

NOR-3 54: ATGTAAAGCTAGAATC ATC AGATACTTCTAC AACG

NOR-1939: TTCGGCGTTGTAGAAGTATCTGATGATTCTAGCT

NOR-1938: CCGAAGCTGGGTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGTGGCT

NOR-3 5 Ί: CTCTGCAGCC ACCGTAAACGAAAGTTTGACAC AAACC AGC

NOR-1940: GCAGAGCTGAAAGAAACAACTTCGAAT

NOR-1949: AGCAGATCCGAAGTTGTTTCTTTCAG

NOR-360: CTGCTGAAGACTGCATGAGAACTTGTGGTGGTGCCTAAT

NOR-361: CTAGCTTAGGCACCACCACAAGTTCTCATGCAGTCTTC

Celkem 5 duplexů A - E bylo připraveno zvýše uvedených 10ti oligonukleotidů, jak je to zachyceno na obr. 1.

ppmol každého z duplexů A-E bylo připraveno zodpovídajících párů 5’-fosforylovaných oligonukleotidů zahříváním na 90 °C 5 minut s následujícím vychlazením na teplotu místnosti během 75ti minut. Uvedených 5 duplexů bylo smícháno za působení T₄DNA ligázy. Syntetické geny byly izolovány jako pás 203 bp po elektroforesy směsi na gelu s 2 % agarosy. Takto získaný syntetický gen je na obr. 1.

-9CZ 285225 B6

Syntetický gen se naváže na fragment 209 bp EcoRI-NcoI zpLaC212spx3 a na fragment Kb EcoRI-Xbal z plasmidů pTZ19R, viz Maed D. A., Szczesna-Skorupa E a Kemper B., Prot. Engin L 67-74 (1986). Plasmid pLaC212spx3 je popsán v příkladu 3 mezinárodní patentové přihlášky č. PCT/DK88/00147.

Fragment 209 bp EcoRI-NCoI zpLaC212spx3 má zakódovaný syntetický kvasinkový signální peptid.

Ligační směs se použije k transformaci příslušného kmene E.coli r“ m⁺ se selekcí na ampicilinovou resistenci. Sledování sekvence DNA, viz Sanger F., Micklen S a Coulson A. R., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977) ukázalo, že plasmidy z vzniklých kolonií obsahovaly správné DNA-sekvence pro (Glu 1, Glu 26, Glu 41, Glu 46)-aprotinin.

Jeden plasmid pKFN-1503 byl určen k dalšímu použití. Konstruování plasmidů pKFN-1503 je zachyceno na obr. 2.

pKFN-1503 byl rozdělen pomocí EcoRI a Xbal a fragment 412 bp byl navázán na fragment 9,5 kb Ncol-Xbal zpMT636 a fragment 1,4 kb NcoI-EcoRI zpMT636, a výsledkem toho je plasmid pKFN-1508, viz obr. 3. Plasmid pMT636 je popsán v Mezinárodní patentové přihlášce PCT/DK88/00138.

Pod označením pMT636 je střídavý vektor E.coli-S.cerevisiae obsahující gen TPI Schizosaccharomyces pombe (POT), viz Russell P. R., Gene 40, 125-130 (1985), promotor a terminátor triosefosfát-izomerázy S.cerevisiae TPI_p a TPI_T, viz Alber T. a Kawasaki G., J. Mol. Appl. Gen. 1, 419-434 (1982). Plasmid pKFN-1508 obsahuje následující sekvence: TPILaC212spx3 vedoucí sekvence (l-47)-Glu(ArgLeuGluLysArg (Glu 1, Glu 26, Glu 41, Glu 46)— aprotininu-TPI_T, kde LaC212spx3 vedoucí sekvence je syntetická kvasinková sekvence popsaná v mezinárodní patentové přihlášce PCT/DK88/00147. DNA-sekvence fragmentu 412 bp EcoRIXbal z pKFN-1503 a pKFN-1508 je zachycena v sekvenčním údaji ID č. 1.

Kmen MT663 S.cerevisiae (E2-7B XE11-36 a/α, tpi/tpi, pep4-3/pep 4-3) byl pěstován na YPGaL (1% kvasnicový Bacto extrakt, 2% Bacto peptonu, 2% galaktózy, 1 % laktátu) až k O.D. při 600 nm 0,6.

Z kultury se 100 ml oddělí, odstředí a po promytí za použití 10 ml vody a dalším odstředění se materiál znovu suspenduje v 10 ml roztoku s obsahem 1,2 M sorbitolu, 25 mM disodné soli EDTA, pH 8,0, a 6,7 mg/ml dithiothreitolu. Suspenze se inkubuje při 30 °C po 15 minut, odstředí se a buňky se znovu suspendují v 10 ml roztoku s obsahem 1,2 M sorbitolu, 10 mM disodné soli EDTA, 0,1 M roztoku sodné soli kyseliny citrónové, pH 5,8, a 2 mgNovozym^R 234. Suspenze se inkubuje 30 minut při 30 °C, buňky se odstředí, promyjí se použitím 10 ml 1,2 M sorbitolu a 10 ml CAS (1,2 M sorbitol, 10 mM chloridu vápenatého, lOmM hydrochloridu pufru Tris (tj. tris-(hydroxymethyl)aminomethan), pH 7,8). Vše se znovu suspenduje v 2 ml CAS. Pro transformaci se 0,1 ml buněk po opětovném suspendování smíchá s asi 1 pg plasmidů pKFN-1508 a vše se ponechá 15 minut za teploty místnosti. Přidá se 1 ml směsi (20 % polyethylenglykol 4000, 10 mM chloridu vápenatého, 10 mM Tris.HCl, pH 7,5) a směs se ponechá dalších 30 minut za teploty místnosti. Potom se reakční směs odstředí a pelet se znovu suspenduje v 0,1 ml CAS (1,2 M sorbitolu, 33 % dle objemu YPD, 6,7 mM chloridu vápenatého, 14 pg/ml leucinu) a vše se inkubuje 2 hodiny při 30 °C. Suspenze se potom odstředí, pelet se suspenduje dále ještě v 0,5 ml 1,2 M sorbitolu, přidá se 6 ml kryjícího agaru (prostředí SC Sherman a spol., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) s obsahem 1,2 M sorbitolu plus 2,5 % agaru, to za teploty 52 °C, a suspenze se vlije na horní část destiček, obsahujících totéž prostředí se ztuhlým agarem, obsahujícím sorbitol.

-10CZ 285225 B6

Transformované kolonie se sklidí za 3 dny při 30 °C, znovu se izolují a použijí k nasazení kapalných kultur. Jedna z takto transformovaných kolonií KFN-1512 byla zvolena pro další charakterizování.

Další růst kmene kvasinek KFN-1512 byl sledován na prostředí YPD (1 % extrakt z kvasnic, 2 % pepton z „Difco Laboratories“ a 6 % glukózy). 200 ml kultury kmene bylo třepáno (250 kyvů za minutu) při 30 °C po 3 dny až k O.D. 600 nm asi 20. Po odstředění byla kapalina nad sedlinou analyzována HPLC-iontoměničovou chromatografii, tak, že kapalina nad sedlinou byla filtrována 0,22 pm filtračním zařízením Millex GV a 1 ml byl nanesen na katexovou kolonu MonoS (0,5 na 5 cm), uvedené do rovnovážného stavu použitím 20 mM kyseliny mravenčí, pH 3,7. Po promytí rovnovážným pufrem byla kolona eluována lineárním gradientem chloridu sodného (0,1 M) v rovnovážném pufru. Inhibiční trypsinová účinnost eluovaných frakcí byla vyhodnocena kvantitativně spektrofotometrickým testem, viz Kassel B., Methods Enzymol. 19, 844-852 (1970) a dále integrací absorpce při 280 nm ze vztahu

Ε^θ (aprotinin)=8,3.

S přihlédnutím k získání materiálu pro toxikologické studie byl pěstován kmen kvasinek KFN1512 ve větším měřítku. Aprotininová obdoba byla přečištěna kombinací iontoměničové chromatografie a vysokotlakové kapalinové chromatografie v reverzní fázi.

Příklad 2

Příprava (Glu 1, Glu 42, Glu 46)-aprotininu z kmene kvasinek KFN-1514

Syntetické genové kódovaní pro (Glu 1, Glu 42, Glu 46) bylo konstruováno z 10ti oligonukleotidů navázáním, jak to bylo popsáno v příkladu 1.

Od pTZ19R odvozený plasmid pKFN-1505, obsahující syntetický gen, zasazený do rámce syntetického hlavního peptidu kvasnic byl konstruován, jak to bylo popsáno v příkladu 1.

A za použití postupu z příkladu 1 byl získán kvasinkový expresní plasmid pKFN-1510, obsahující dále uvedenou konstrukci:

TPI_p-LaC212spx3 vedoucí sekvence (l-47)-GluArgLeuGluLysArg-(Ghi 1, Glu 42, Glu 46)— aprotinin-ΤΡΙτ.

Sekvence DNA fragmentu 412 bp EcoRI-Xbal z pKFN-1505 a pKFN-1510 je uvedena v sekvenční listině ID č. 3.

Plasmid pKFN-1510 byl transformován na kvasinkový kmen MT663, jak to bylo popsáno zde výše, to za vzniku kmene kvasinek KFN-1514.

Kultivování transformovaného kmene KFN-1514 na prostředí YPD, analýza (Glu 1, Glu 42, Glu 46)-aprotininu v kapalině nad sedlinou i získávání materiálu pro toxikologické studie byly provedeny, jak to bylo popsáno zde již dříve.

-11 CZ 285225 B6

Příklad 3

Získání (Glu 42, Glu 46)-aprotininu z kmene kvasinek KFN-1544

Fragment 144 bp Avall-Xbal se zakódovaným (Glu 42, Glu 46)-aprotininem(12-58) zpKFN1505 se použije k náhradě odpovídajícího fragmentu DNA se zakódovaným aprotininem(12-58) z plasmidu pKFN-1000, což vyústí v tvorbě plasmidu pKFN-1528. Plasmid pKFN-1000 je popsán v příkladu 4 mezinárodní patentové přihlášky, publikace č. WO 90/10075.

Za použití postupu z příkladu 1 byl získán kvasinkový expresní plasmid pKFN-1541, obsahující dále uvedenou konstrukci:

TPI_p-LaC212spx3 vedoucí sekvence (l-47)-GluArgLeuGluLysArg-(Glu 42, Glu 46)-aprotininTPI_T.

Sekvence DNA fragmentu 412 bp EcoRI-Xbai z pKFN-1528 a pKFN-1541 je uvedena v sekvenční listině ID č. 5.

Plasmid pKFN-1541 byl transformován na kvasinkový kmen MT663, jak to bylo popsáno zde výše, to za vzniku kmene kvasinek KFN-1544.

Kultivování transformovaného kmene KFN-1544 na prostředí YPD, analýza se zřetelem na (Glu 42, Glu 46) v kapalině nad sedlinou a získání materiálu pro toxikologické studie, to vše bylo provedeno, jak je to popsáno výše.

Příklad 4

Získání (Ser 10, Asp 24, Thr 26, Glu 31, Asn 41, Glu 53)-aprotininu z kmene kvasinek KFN1545

Syntetické genové kódování pro (Ser 10, Asp 24, Thr 26, Glu 31, Asn 41, Glu 53) bylo konstruováno z 10ti oligonukleotidů navázáním, jak to bylo popsáno v příkladu 1.

Od pTZ19R odvozený plasmid pKFN-1530, obsahující syntetický gen vsunutý do rámce syntetického kvasinkového signálního peptidu, resp. jeho sekvence, byl konstruován, jak to bylo popsáno v příkladu 1.

Za použití postupu z příkladu 1 byl získán kvasinkový expresní plasmid pKFN-1532, obsahující dále uvedenou konstrukci:

TPI_p-LaC212spx3 vedoucí sekvence (l-47)-GluArgLeuGluLysArg-(Ser 10, Asp 24, Thr 26, Glu 31, Asn 41, Glu 52)-aprotinin-TPI_T.

Sekvence DNA fragmentu 412 EcoRI-Xbai z pKFN-1530 a pKFN-1532 je uvedena v sekvenčním seznamu ID, č. 7.

Plasmid pKFN-1532 byl transformován na kmen kvasinek MT663 jak to bylo popsáno zde drive s výsledkem kmene kvasinek KFN 1545.

Kultivování transformovaného kmene KFN-1545 na prostředí YPD, analýza obsahu (Ser 10, Asp 24, Thr 26, Glu 31, Asn 41, Glu 53)-aprotininu v kapalině nad sedlinou a získání materiálu pro toxikologické studie, to vše bylo provedeno, jak to bylo popsáno zde výše.

- 12CZ 285225 B6

Příklad 5

Získání (Ser 10, Leu 20, Gly 40, Asn 41, Gin 44, Tyr 46)-aprotininu z kmene kvasinek KFN 1545

Syntetické genové kódování pro (Ser 10, Leu 20, Gly 40, Asn 41, Gly 42, Gin 44, Tyr 46)aprotinin bylo konstruováno z 10ti oligosacharidů navázáním, jak to bylo popsáno v příkladu.

Od pTZ19R odvozený plasmid pKFN-1534, obsahující syntetický gen, zasazený do rámce syntetického kvasinkového signálního peptidu, resp. jeho sekvence, byl konstruován, jak to bylo popsáno v příkladu 1.

Za použití postupu z příkladu 1 byl získán kvasinkový expresní plasmid pKFN-1537, obsahující dále uvedenou konstrukci:

TPI_p-LaC212spx3 vedoucí sekvence (l-47)-GluArgLeuGluLysArg-(Ser 10, Leu 20, Gly 40, Asn 41, Gly 42, Gin 44, Tyr 46)-aprotinin-TPI_T.

Sekvence DNA fragmentu 412 bp EcoRI-Xbal z pKFN-1534 a pKFN-1537 je uvedena v sekvenční listině ID č. 9.

Plasmid pKFN-1537 byl transformován na kmen kvasinek MT 663 jak to bylo popsáno zde výše s tím, že se získal kmen kvasinek KFN-1547.

Kultivování transformovaného kmene KFN-1547 v prostředí YPD, analýza se zřetelem na obsah (Ser 10, Leu 20, Gly 40, Asn 41, Gly 42, Gin 44, Tyr 46)-aprotininu v kapalině nad sedlinou a získání materiálu pro toxikologické studie, to vše bylo prováděno, jak je to popsáno zde výše.

Příklad 6

Získání des-Arg 1, des-Pro 2-(Ser 42, Glu 46)-aprotininu z kmene kvasinek KFN-1660

Fragment 1,4 kb Ahall-Styl a 1,8 kb AhaH-SalI, oba z plasmidu pKFN-306 se navážou na duplex ze dvou následujících syntetických oligonukleotidů:

NOR-2188: 5’ CAAGGCTGG TTTGTGCAAACTTTCGTTTACGGTGGCTGCAGAGCTAAGTCCAACAACTTCGAATCTGCTGAAGACTGCATGAGAACTTGTGGTGGTGCCTAATCTAGAG 3’

NOR-2189: 5’ TCGACTCTAGATTAGGCACCACCACAAGTTCTCATGCAGTCTTCAGCAGATTCGAAGTTGTTGGACTTAGCTCTGCAGCCACCGTAAACGAAAGTTTGACACAAACCAGC 3’

Plasmid pKFN-306 je plasmid, odvozený od pTZ19R a vsunutím 502 bp EcoRI-Xbal, obsahujícím souhlasný faktor Saccharomyces cerevisiae α-1-vedoucí sekvence (1-85) vsunutá do rámce se syntetickým genem pro des-Arg 1, des-Pro-2-(Ser 42)-aprotinin. Konstrukce plasmidu pKPN-306 je popsána ve WO 89/01968.

Vázaná směs se použije k transformaci příslušného kmene E.coli (f, m⁺), zvoleného k resistenci na ampicilin. Sekvencování DNA, viz Sanger F., Micklen S. a Coulsen A. R., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 4, 5463-5467 (1977) prokázalo, že plasmidy ze vzniklých kolonií obsahovaly správnou sekvenci pro des-Arg 1, Pro 2-(Ser 42, Glu 46)-aprotinin.

-13 CZ 285225 B6

Jeden plasmid pKFN-1629 byl vyčleněn pro další použití.

Sledováním postupu z příkladu 1 byl získán kvasinkový expresní plasmid pKFN-1656, obsahující dále uvedenou konstrukci:

TPIp-MF al vedoucí sekvence (l-85)-des Arg 1, des-Pro 2 (Ser 42, Glu 46)-aprotininu-TPI_T.

Sekvence DNA fragmentu 502 bp EcoRI-Xbal z pKFN-1629 a pKFN-1656 je uvedena v sekvenčním sdělení ID č. 11.

Plasmid pKFN-1656 byl transformován na kmen kvasinek MT663, jak to bylo zde již popsáno výše s výsledkem kmene kvasinek KFN -1660.

Kultivování transformovaného kmene KFN-1660 v prostředí YPD, analýza se zřetelem na desArg 1, des-Pro 2 -(Ser 42, Glu 46)-aprotinin v kapalině nad sedlinou a získávání materiálu pro toxikologické studie bylo prováděno, jak to bylo zde popsáno výše.

Příklad 7

Získání Des-Arg 1, des-Pro 2-(Ser 42, Ala 46)-aprotininu z kmene kvasinek KFN 1661.

Fragmenty 1,4 kb Ahall-Styl a 1,8 kb Ahall-Sall, oba zplasmidu pKFN-306 se navážou na duplex, sestavený z následujících dvou syntetických oligonukleotidů:

NOR-2196: 5’ CAAGGCTCGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTAGGGTGGCTGGAGAGCTAAGTCCAACAACTTCGTTCTGCTGAAGACTGCATGAGAACTTGTGGTGGTGCCTAATCTAGAG 3’

NOR-2197:5’ TCGACTCTAGATAGGCACCACCACAAGTTCTCATGCAGTCTTCAGCAGAAGCGAAGTTGTTGGACTTAGCTCTGCAGCCACCGTAAACGAAAGTTTGACACAAACCAGC 3’

Plasmid pKFN-306 je plasmidem odvozeným od pT719R s 502 bp EcoRI-Xbal jako vsunutou částí, obsahující sdružený faktor Saccharomyces cerevisiae α-1-vedoucí sekvence (1-85) jako gen, navázaný do rámce se syntetickým genem pro des-Arg-1, des-Pro-2-(Ser 42)-aprotinin. Konstrukce plasmidu pKFN-306 je popsána v WO 89/01968.

Vázaná směs se použije k transformaci odpovídajícího kmene E.coli (r, m⁺) selektovaného na ampicilinovou resistenci. Sekvenování DNA, viz Sanger F., Micklen S. a Coulsen A. R., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977) ukázalo, že plasmidy z vzniklých kolonií obsahovaly správné sekvence pro des-Arg-1, des-Pro-2-(Ser 42, Glu 46)-aprotinin.

Jeden z plasmidů pKFN-1631 byl zvolen k dalšímu použití.

Za použití postupu z příkladu 1 byl získán kvasinkový expresní plasmid pKFN-1657, obsahující dále uvedenou konstrukci:

TPIp-MF 1-vedoucí sekvence(l-85)-des Arg 1, des-Pro 2 -(Ser 42, Ale 46)-aprotinin-TPI_T.

Sekvence DNA v 502 bp EcoRI-Xbal fragmentu kKFN-1631 a pKFN-1657 je uvedena v sekvenční listině ID, č. 13.

-14CZ 285225 B6

Plasmid pKFN-1657 byl transformován na kvasinkový kmen MT663, jak to zde bylo popsáno výše, to za vzniku kmene kvasinek KFN-1661.

Kultivování transformovaného kmene KFN-1661 v prostředí YPD, analýza se zřetelem na obsah des-Arg 1, des-Pro 2-(Ser 42, Ala 46)-aprotininu v kapalině nad sedlinou a získání materiálu pro toxikologické studie, to vše bylo provedeno, jak to zde bylo popsáno výše.

Příklad 8

Získání des-Arg 1, des-Pro 2-(Ser 10, Asp 24, Thr 26, Glu 31, Asn 41, Glu 53)-aprotininu z kmene kvasnic KFN-1735.

Syntetické genové kódovaní pro des-Arg 1, des-Pro 2-Ser 10, Asp 24, Thr 26, Glu 31, Asn 41, Glu 53)-aprotinin bylo konstruováno z 10ti oligonukleotidů vázáním, jak to bylo popsáno v příkladu 1.

Plasmid pTZ19R zplasmidu pKFN-1707, obsahující syntetický gen, navázaný na rámec syntetického kvasinkového signálního peptidu byl konstruován, jak to bylo popsáno v příkladu 1.

Za použití postupu z příkladu 1 byl získán kvasinkový expresní plasmid pKFN-1709, obsahující dále uvedenou konstrukci:

TPI_p-LaCA12spx3 vedoucí sekvence(l-47)-GluArgLeuGluLysArg-des Arg-1, des Pro-2(Ser 10, Asp 24, Thr 26, Glu 31, Asn 41, Glu 53)-aprotinin-TPI_T.

Sekvence DNA fragmentu 406 bp AcoRI-Xbal z pKFN-1707 a pKFN-1709 je uvedena v sekvenční listině ID č. 15.

Plasmid pKFN-1709 byl transformován na kvasinkový kmen MT663, jak je to popsáno výše, za vzniku kmene kvasinek KFN-1735.

Kultivování transformovaného kmene KFN-1735 na prostředí YPD, analýza na obsah desArg 1, des-Pro 2-(Ser 10, Asp 24, Thr 26, Glu 31, Asn 41, Glu 53)-aprotinin v kapalině nad sedlinou a získání materiálu pro toxikologické studie, to bylo provedeno tak, jak to zde již bylo popsáno dříve.

Příklad 9

Získání des-Arg 1, des-Pro 2 -(Asp 24, Thr 26, Glu 31, Glu 53)-aprotininu z kmene kvasinek KFN-1737.

Fragment 1,8 kb Agall-Xbal a fragment 1,4 kb Ahall-Avall, v obou případech zplasmidu pKFN-306 (viz příklad 5) se naváže na syntetický fragment 141 bp Avall-Xbal se zakódovaným (Asp 24, Thr 26, Glu 31, Glu 53)-aprotininem.

Získaný plasmid, odvozený od pTZ19R byl pKFN-1711.

Za použití postupu z příkladu 1 byl získán kvasinkový expresní plasmid pKFN-1713, obsahující dále uvedenou konstrukci:

-15CZ 285225 B6

TPIp-MF a 1-vedoucí sekvence(l-85)-des Arg 1, desPro2 (Asp 24, Thr 26, Glu 31, Glu 53)aprotinin-TPI_T.

Sekvence DNA ve fragmentu 502 bp EcoRI-Xbal zpKFN-1711 a pKFN-1713 je uvedena v sekvenční listině ID č. 17.

Plasmid pKFN-1713 byl transformován na kmen kvasinek MT-663, jak je to uvedeno výše s výsledkem získání kmene kvasinek KFN-1737.

Kultivování transformovaného kmene KFN-1737 v prostředí YPD, analýza na obsah des-Arg 1, des-Pro 2-(Asp 24, Thr 26, Glu 31, Glu 53)-aprotininu v kapalině nad sedlinou, jakož i získání materiálu pro toxikologické studie, to vše provedeno, jak to bylo popsáno výše.

Příklad 10

Získání des-Arg 1, des Pro 2-(Ser 10, Gly 40, Asn 41, Gly 42, Glu 53)-aprotininu z kmene kvasinek KFN-1757

Syntetické genové kódování pro des-Arg 1, des-Pro 2-(Ser 10, Gly 40, Asn 41, Gly 42, Glu 53)-aprotinin bylo konstruováno z 10ti oligonukleotidů navázáním, jak je to popsáno v příkladu 1.

Od PTZ19R odvozený plasmid pKFN-1715, obsahující syntetický gen vsazený do rámce syntetického kvasinkového signálního peptidu byl konstruován, jak je to popsáno v příkladu 1.

Za použití postupu z příkladu 1 byl získán kvasinkový expresní plasmid pKFN-1718, obsahující dále uvedenou konstrukci:

TPI_p-L_aC212spx3 vedoucí sekvence (l-47)-GluArgLeuGluLysArg-des Arg 1, des-Pro 2(Ser 10, Gly 40, Asn 41, Gly 42, Glu 52)-aprotinin-TPI_T.

Sekvence DNA fragmentu 406 bp AcoRI-Xbal z pKFN-1715 a pKFN-1718 je uvedena v sekvenční listině ID č. 19.

Plasmid pKFN-1718 byl transformován na kmen kvasinek MT 663 jak to bylo popsáno výše se získáním kmene kvasinek KFN-1739.

Kultivování transformovaného kmene KFN-1739 na prostředí YPD, analýza na obsah desArg 1, Pro2-(SerlO, Gly 40, Asn 41, Gly 42, Glu 53)-aprotinin v kapalině nad sedlinou a získání materiálu pro toxikologické studie, to vše bylo provedeno, jak to bylo popsáno zde výše.

Příklad 11

Získání des-Arg 1, des Pro 2-(Ser 42, Glu 53)-aprotininu z kmene kvasinek KFN 1742

Fragment 1.8 kb Ahall-Xbal a fragment 1.4 kb Ahall-Avall, v obou případech z plasmidu pKFN-306 (viz příklad 5) byly navázány na syntetický fragment 141 bp Avall-Xbal kódující (Ser 42, Glu 53)-aprotinin.

Získán tak byl od pTZ19R odvozený plasmid pKFN-1721.

-16CZ 285225 B6

Za použití postupu z příkladu 1 byl získán kvasinkový expresní plasmid pKFN-1724, obsahující dále uvedenou konstrukci:

TPIp-MF al vedoucí sekvence (l-85)-des Arg 1, des Pro2-(Ser 42, Glu 53)-aprotinin-TPI_T.

Sekvence DNA fragmentu 502 bp EcoRI-Xbal z pKFN-1721 a pKFN-1724 je uvedena v sekvenční listině ID, č. 21.

Plasmid pKFN-1724 byl transformován na kmen kvasinek MT 663. Jak to bylo zde uvedeno výše a získán tak kmen kvasinek KFN 1742.

Kultivování transformovaného kmene KFN-1742 na prostředí YPD, analýza na obsah des Arg 1, des Pro 2-(Ser 42, Glu 53)-aprotinin v kapalině nad sedlinou a získávání materiálu pro toxikologické studie, to vše bylo provedeno, jak to bylo popsáno zde dříve.

Příklad 12

Získání des-Arg 1. des Pro 2-(Glu 42, Glu 53)-aprotininu z kmene kvasinek KFN 1752

Fragment 1.8 kb Anall-Xbal a fragment 1.4 kb Aha II-AvaII, v obou případech z plasmidu pKFN-306 (viz příklad 5) byly navázány na syntetický fragment 141 bp Ava II-XbaI zakódující (Glu 42, Glu 53)-aprotinin.

Získaný plasmid, odvozený od pTZ19R byl pKFN-1762.

Za použití postupu z příkladu 1 byl získán kvasinkový expresní plasmid pKFN-1765, obsahující dále uvedenou konstrukci:

TPIp-MF al vedoucí sekvence (l-85)-des Arg 1, des Pro 2 (Glu 42, Glu 53)-aprotinin-TPI_T.

Sekvence DNA fragmentu 502 bp AcoRI-Xbal zpKFN-1762 a pKFN-1765 je uvedena v sekvenční listině ID č. 23.

Plasmid pKFN-1765 byl transformován na kmen kvasinek 663 jak to bylo popsáno výše, to za vzniku kmene kvasinek KFN 1756 .

Kultivování transformovaného kmene KFN-1752 na prostředí YPD, analýza na obsah desArg 1, des-Pro 2-(Glu 42, Glu 53)-aprotinin v kapalině nad sedlinou a získávání materiálu pro toxikologické studie, to vše prováděno, jak to bylo popsáno zde dříve.

Příklad 13

Získání des-Arg 1, des Pro 2-(Glu 26, Ser 42, Glu 53)-aprotininu z kmene kvasinek KFN 1755

Fragment 1.8 kb AhaH-Xbal a 1.4 kb Ahall-Ava Π, oba z plasmidu pKFN-306 (viz příklad 5) byly navázány na syntetický fragment 141 bp Avall-Xbal zakóduj ící (Glu 26, Ser 42, Glu 53)— aprotinin.

Získaný, od pTZ19R odvozený plasmid byl pKFN-1768.

- 17CZ 285225 B6

Za použití postupu z příkladu 1 byl získán kvasinkový expresní plasmid pKFN-1770, obsahující dále uvedenou konstrukci:

TPIp-mF al vedoucí sekvence (l-85)-des Arg 1, des Pro 2-(Glu 26, Ser 42, Glu 53)-aprotininTPI_T.

Sekvence DNA fragmentu 502 bp EcoRI-Xbal zpKFN-1768 a pKFN-1770 je uvedena v sekvenční listině ID č. 25.

Plasmid pKFN-1770 byl transformován na kmen kvasinek MT 663 jak je to popisováno výše s tím, že vznikl kmen kvasinek KFN-1755.

Kultivování transformovaného kmene KFN-1755 na prostředí YPD, analýza na obsah desArg 1, des-Pro 2-(Glu 26, Ser 42, Glu 53)-aprotinin v kapalině nad sedlinou a produkce materiálu pro toxikologická studia, to vše provedena, jak to bylo popsáno zde výše.

Příklad 14

Získání des-Arg 1, des-Pro-2-(Glu 26, Glu 53)-aprotininu z kmene kvasinek KFN-1756

Fragment 1.8 kb Ahall-Xbal a fragment 1.4 kb Ahall-Avall, v obou případech z plasmidu pKFN-306 (viz příklad 5) se navážou na syntetický fragment 141 bp Avall-Xbai kódující (Glu 26, Glu 42, Glu 53}-aprotinin.

Získaný, od pTZ19R plasmid byl označen pKFN-1771.

Za použití postupu z příkladu 1 byl získán kvasinkový expresní plasmid pKFN-1773, obsahující dále uvedenou konstrukci TPI_p-NF al vedoucí sekvence (l-85)-des.Arg 1, des-Pro 2-(Glu 26, Glu 42, Glu 53)-aprotinin-TPI_T.

Sekvence fragmentu 502 bp EcoRi—Xbal zpKFN—1771 a pKFN—1773 je uvedena v sekvenční listině ID, č. 27.

Plasmid pKFN-1773 byl transformován na kmen kvasinek MT 663 jak to bylo popsáno výše za vzniku kmene kvasinek KFN-1756.

Kultivování transformovaného kmene KFN-1756 v prostředí YPD, analýza na obsah des-Arg 1, des-Pro 2-(Glu 26, Glu 42, Glu 53)-aprotinin v kapalině nad sedlinou a získávání materiálu pro toxikologické studie, to vše provedeno, jak to zde bylo popsáno dříve.

Příklad 15

Toxikologické vyhodnocení aprotininových analogů jednodávkovým intravenosním podáním kiysám rodu Wistar:

Materiál

Tyto dále uvedené aprotininové obdoby se sníženým vlastním kladným nábojem i sníženou tepelnou stálostí ve srovnání s rekombinantním aprotininem(l-58) byly vybrány pro toxikologické vyhodnocení:

-18CZ 285225 B6

KFN-1512, KFN-1514, KFN-1544, KFN-1545, KFN-1547, KFN-1660, a KFN-1661. Jejich hlavní charakteristické vlastnosti z toxikologického zřetele jsou uvedeny v tabulce 1. Údaje pro rekombinantní aprotinin jsou uváděny rovněž pro srovnání. Je rovněž uvedena denaturaČní teplota, jež je výrazem biologické stálosti.

Tabulka 1

Obecné informace

TypKNF	Délka řetězce	Vlastní náboj	DenaturaČní teplota °C
r-Aprotinin	1-58	+6	nad 100
1512	1-58	-2	87
1514	1-58	0	88
1544	1-58	+2	98
1545	1-58	0	93
1547	1-58	+2	86
1660	3-58	+2	77
1661	3-58	+3	79
1735	3-58	-1	68
1737	3-58	0	70
1739	3-58	+ 1	81
1742	3-58	+2	71
1752	3-58	+ 1
1755	3-58	0	68
1756	3-58	-1	70

Provedení:

Prvého dne testování každé z obdob se podá dvěma samcům a dvěma samičkám krys 33, 100, 300 nebo 900 mg aprotininové obdoby na kg hmotnosti těla. Dvěma obdobným kontrolním skupinkám se podá fysiologický roztok chloridu sodného, případně okyselený kyselinou chlorovodíkovou na pH asi 4,5. Posléze uvedený roztok se používá jako vehiculum. Objemová dávka byla ve všech případech 10 mg na kg tělesné hmotnosti. Krysy byly pozorovány po 7 dní, osmého dne usmrceny. Po pitvě byly ledviny zváženy a připraveny pro histopathologii. Kolísající odezvy jsou uvedeny v záhlaví tabulky 2. Tamže jsou shrnuty výsledky jednotlivých testů. Údaje pro rekombinantní aprotinin jsou uvedeny pro srovnání (dávkování: 11-300 mg/kg). V případě KFN-1512 bylo zjištěno, že nelze tuto látku rozpustit, jak by to bylo třeba pro podávání dávek nejvyšších (900 mg/kg).

Pouze jediné ze zvířat uhynulo při dávce 900 mg KFN/1545/kg. Kromě tohoto případu nebyly zjištěny žádné takové případy.

Nebyly patrné histologické změny po podávání (300 mg/kg hmotnosti těla) u KFN-1512, KFN1544, KFN-1545 a KFN-1660. Dále nebyly patrné histologické změny po podávání dávky 900 mg/kg hmotnosti těla u KFN-1514, KFN-1547 a KFN-1661. Takže v případě všech obdob bylo zjištěno, že nedochází k žádným toxickým jevům z hlediska histopathologických změn na ledvinách v dávkách 300 mg/kg i výše ve srovnání s dávkou 11 mg/kg pro aprotinin.

Se zřetelem k dalším měnitelným odezvám lze všechny obdoby pokládat za rovnocenné nebo i lepší ve srovnání s aprotininem.

-19CZ 285225 B6

Tabulka 2

Netoxické hladiny při měnitelných odezvách, mg/kg

TypKFN	Klinická pozorování Po podání látky	Úmrtnost	Makroskop. pozor.	Mikroskop, pozor.	Hmotnost těla 8. den	Hmotnost ledvin 8. den
0-30 min 2 h	denně
r-Aprotinin1,2	33	300	300	300	33	11	100	100
15121	33	300	300	300	300	300	300	300
1514	900	900	900	900	900	900	900	900
1544	33	100	100	900	300	300	900	900
1545	33	900	300	300	300	300	300	300
1547	33	300	900	900	900	900	900	900
1660	300	900	900	900	900	900	900	900
1661	100	900	900	900	900	900	900	900

^1,2 nejvyšší dávka 300 mg/kg ² nejnižší dávka 11/mg/kg

Závěr

Profil toxicity aprotininových obdob při vyhodnocení jednodávkovou intravenosní injekcí (krysy rodu Wistar) byl určitě zlepšený v různých stupních ve srovnání s profilem toxicity aprotininu. Všechny aprotininové obdoby byly prosté nefrotických účinků v hladině 300 mg/kg či více. KFN-1514 byl bez jakýchkoli toxických účinků v dávkování 900 mg/kg, což se rovná nejvyšší sledované dávce.

Příklad 16

Eliminování a distribuování rekombinantního aprotininu a aprotininových obdob

Materiály

Autentický rekombinantní aprotinin a jeho obdoby, jak byly připraveny v příkladech 1 až 7, se rozpustí v 0,9% roztoku chloridu sodného s úmyslem docílit tak dávkovači objem 1 μΐ/g krysy. Koncentrace injekčních roztoků byly analyticky kontrolovány postupy, které jsou uvedeny v metodické stati.

Metody

Použity byly samičky krys (Wistar) o hmotnosti 200-230 g. Aprotinin a jeho obdoby byly testovány dvěma různými způsoby ^{1 2}

1) v anestesi

2) bez anestese

Krysy v anestesi

Anestese krys byla provedena intraperitoneální injekcí sodné soli pentobarbitalu. Karotidní arterie a jugulámí véna byly obnaženy a kanulovány polyethylenovými katetry (PE-50, Intramedic). Karotidní katetr byl napojen na perfusor (B. Braun) pro infuzi 3,8 ml 0,9% roztoku chloridu sodného za hodinu, a na snímač krevního tlaku. Změny krevního tlaku byly zazname-20CZ 285225 B6 návány registračním zapisovačem (Kipp and Zonen, BD 9). Aprotininové obdoby byly podávány injekčně během 15 sekund jugulámím katetrem.

Z karotidního katetru byly odebrány vzorky krve za 3, 10, 20, 40 a 60 minut po podání. Vzorky (0,45 ml) byly jímány do zkumavek 3 ml s obsahem 50 μΐ 0,13 M roztoku sodné soli kyseliny citrónové; po odstředění bylo plasma uchováváno za chlazení na -20 °C až do analyzování. Za 60 minut po podání byly krysy usmrceny nadměrnou dávkou sodné soli pentobarbitalu, ledviny a játra byly vyjmuty, zváženy a uskladněny při -80 °C.

Krysy bez anestese

Před podáváním aprotininových obdob se orálně podá dávka 2 ml destilované vody, obdoby se potom podávají injekčně intravenosně do ocasní vény za použití intravenosního katetru (Venflon 22 G, Viggo-Spectramed, Helsingborg, Švédsko). Po podání se katetr propláchne za použití 0,5 ml 0,9% roztoku chloridu sodného a vyjme. V místě injekce se poranění překryje náplastí, aby se zabránilo krvácení z ocasu.

Krysa se potom umístí do metabolické klícky, aby se zachytila veškerá moč.

Po třech hodinách se krysa usmrtí podáním, resp. vpuštěním směsi oxidu uhličitého a kyslíku (9/1) do uzavřené klícky, vyjmou se ledviny a játra za uskladnění při -80 °C až do analýzy. Během vdechování oxidu uhličitého krysa vyprázdní svůj močový měchýř a po jejím vyjmutí se metabolická klícka vypláchne použitím 0,9% roztoku chloridu sodného tak, aby konečný objem moči a roztoku chloridu sodného činil 25 ml.

Příprava homogenních materiálů

Jedna ledvina (asi 1 g) a přibližně 2 g tkáně z jater se umístí odděleně v 10 ml zkumavkách z plastické hmoty, přidají se 2 ml 0,9% roztoku chloridu sodného. Tkáně se homogenizují 5 minut za použití ultrazvukového zařízení o vysoké intenzitě (High Intensity Ultrasonic Processor, Model VC50, Solics and Materials lne., Danbury CT, USA). Homogenizovaná ledvina i játra se pak zředí roztokem chloridu sodného na celkový objem 10-25, resp. 4 ml.

Analytické postupy

Hladina aprotininu a jeho obdob v plasmě, játrech (po homogenizaci) a injekčních roztoků se měří fotometricky za použití Cobas Fara II (Roche). Krátce řečeno, plasma, homogenáty nebo injekční roztoky se vysrážejí kyselinou a tak se odstraní jiné inhibitory kallikreinu než aprotinin. Inhibiční účinnost kallikreinu ve vzorku se změří za použití kallikreinu z prasečího pankreasu (Sigma K 3627) a chromogenického substrátu S2266 (Kabi).

Hladiny v homogenizátech ledvin a moči se měří stejným postupem s výjimkou toho, že se opomene srážecí stupeň; protože vnitřní inhibiční kallikreinová účinnost v zředěných homogenizátech a moči je zanedbatelná.

Oddělené standardní křivky byly použity pro každou obdobu v každém z prostředí.

Studijní provedení

Byly studovány skupiny 14 krys v anestesi a 14 kiys bez anestese. Vždy byla podána dávka 1,57 pmol (asi 10 mg) aprotininu či obdoby aprotininu na kg hmotnosti těla. Basální údaje o skupině 28 zvířat jsou v tabulce ΙΠ.

-21 CZ 285225 B6

Tabulka 3

Skupinky	n	těla(g)	Hmotnost ledvin (g)	jater (g)
Anestese
r-Aprotinin	5	251,8	0,98	9,9
KFN 1512	4	230,0	0,84	9,6
KFN 1514	4	220,5	0,85	8,6
KFN 1544	4	226,0	0,97	9,3
KFN 1545	4	224,8	0,92	9,2
KFN 1547	4	229,0	0,75	8,6
KFN 1660	4	220,5	0,93	9,7
KFN 1661	4	240,8	0,97	9,0
Bez anestese
r-aprotinin	4	192,5	0,77	9,8
KFN 1512	5	191,0	0,65	7,2
KFN 1514	6	188,3	0,69	7,3
KFN 1544	5	190,0	0,64	6,5
KFN 1545	6	185,8	0,66	7,3
KFN 1547	5	188,0	0,67	7,3
KFN 1660	6	205,0	0,77	8,5
KFN 1661	6	204,2	0,80	8,1

Statistické vyhodnocení

Pro tento účel byl použit Speermanův korelační test.

Tabulka 4

Obdoby aprotininu, stav inhibiční účinnosti v ledvinách a moči po i.v. podání krysám

Látka	Vlastní náboj	Denaturace2 teplota °C (max.)	Obsah v moči (3 h) % dávky	Obsah v ledvinách	Akumulační index'
(lh) % dávky	(3 h) % dávky
aprotinin	+6	nad 100	2	21	44	2,10
KFN 1512	-2	87	51	2	2	1
KFN1514	0	88	36	8	11	1,38
KFN 1544	+2	98	42	17	23	1,35
KFN1545	0	93	41	14	28	2
KFN1547	+2	86	45	4	5	1,25
KFN 1660	+2	77	23	6	3	0,5
KFN1661	+3	79	18	4	3	0,75

Ledvinový akumulační index se vypočte ze stavu inhibiční aktivity po 3 hodinách děleno 15 stavem po 1 hodině ²⁾ Měřeno diferenčním stupňovým kalorimetrem v 20 mM kyselině 2-(N-morfolino)ethansulfonové, pH 5,5

-22CZ 285225 B6

Výsledky

Obdoby v ledvinách a moči

Celkový obsah v ledvinách (v % dávky) po 1 a 3 hodinách a v moči za 3 hodiny jsou uvedeny na obr. 3 a v tabulce IV.

Zdá se, že mezi aprotininovými obdobami byly nalezeny velké rozdíly.

Pokud se aprotininu týká, pak obsah v ledvinách za hodinu po podání činil přibližně 20 % použité dávky, zatím co se obsah zvýšil na více než 40 % po 3 hodinách. Vylučování aprotininu v moči bylo zanedbatelné.

Se zřetelem na vyhodnocení, zda vylučování v moči za 3 hodiny bylo spojeno s vlastním nábojem aprotininové obdoby, byl propočten stupeň korelace mezi těmito dvěma údaji.

Bylo zjištěno, že obsah v moči lze velmi přesně korelovat s vlastními náboji aprotininových obdob (viz Obr. 4).

Tabulka 5

Látka	Index	Denaturační teplota °C
urychlující	ledvinový stabilizační
r-Aprotinin	2,10	0,90	100
KFN 1512	0,66	0,67	87
KFN 1514	1,32	0,87	88
KFN 1544	1,32	1,05	98
KFN 1545	1,99	0,71	93
KFN 1547	1,22	0,65	86
KFN 1660	0,50	0,55	77
KFN 1661	0,77	0,55	79

Stabilita aprotininových obdob

Se zřetelem na studium stability aprotininových obdob v tkáních ledvin byla jedna ledvina z 14 anestetizovaných kiys (jedna z každé skupiny) rozdělena na dvě části stejné hmotnosti. Jedna část byla uchovávána při 37 °C a další při 4 °C. Po čtyřech hodinách byly tkáně homogenizovány a byl zjištěn obsah obdob. Index stálosti byl definován jako obsah v oné části, jež byla uchovávána při 37 °C děleno obsahem v oné části, jež byla uchovávána při 4 °C. Indexy stálosti jsou uvedeny v tabulce VI, a je patrné, že r-aprotinin, KFN 1514, KFN 1544 se zdají být nejstálejšími látkami ve srovnání například s KFN 1660, který se jeví být jako méně stabilní.

Stabilita obdob byla rovněž studována zjištěním jejich denaturační teploty. Bylo zjištěno, že denaturační teploty lze vysoce porovnat s obsahem v tkáních ledvin za 3 hodiny po podání (obr. 5) i s akumulačním indexem (obr. 6), nikoli však s vylučováním moči.

Z uvedených údajů plyne, že vlastní náboj může být důležitý pro vylučování v moči, ale může být méně důležitý pro koncentrování a hromadění se v ledvinách. Na druhé straně se zdá, že renální akumulace může být ve vztahu k denaturační teplotě a ke stabilitě aprotininových obdob v ledvinových tkáních.

-23 CZ 285225 B6

Je však pravděpodobné, že koncentrace v ledvinových tkáních, měřeno hodinu po podávání, se změní v důsledku degradace nebo redistribuce. Takže je možné, že koncentrace změřené například 10 minut po podávání, budou porovnatelné s čistým nábojem.

Vývody:

Dospělo se k následujícím vývodům:

1) Všechna analoga testovaná byla převzata do ledvin, ale v různých stupních. Hromadění se v ledvinách se zdálo být ve vztahu k thermostabilitě a stabilitě v tkáni ledvin, nikoli však ve vztahu k vlastnímu náboji molekuly.

2) Vylučování v moči se zdá být ve spojitosti s vlastním nábojem analog, nikoli však s odpovídající stálostí.

Sekvenční listina (1) Obecné informace (i) autoři:Bjoem, Soeren Erik

Norris, Kjeld

Diness, Vigo

Noerskov-Lauritsen, Leif

Christensen, Niels Dyhr Bregengaard, Claus (ii) název vynálezu: Aprotininové obdoby (iii) počet sekvencí: 29 (iv) adresa pro korespondenci:

(A) Novo Nordisk A/S (B) Ulice: Novo Allé (C) Město: Bagsvaerd (D) Země: Dánsko (F) Číselné označení: 2880 (v) komputerově čitelná forma:

(A) střední typ: Floppy disk (B) komputer: IBM PC compatible (C) operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patent In Release # 1,0, verse # 1.25 (vi) údaje o přihlášce (A) číslo přihlášky:

(B) datum podání (C) klasifikace

-24CZ 285225 B6 (vii) Předchozí data přihlášky (A) číslo přihlášky: DK 2361/90 (B) datum podání: 01.10.1990 (vii) předchozí data přihlášky (A) číslo podání: DK 1118/91 (B) datum podání: 12.06.1991 (viii) Právní informace (A) Jméno: Thalsoe-Madsen, Birgit (B) referenční-seznamové číslo: 3465.204-WO (ix) Telekomunikační informace (A) Telefon: (212) 867-0123 (B) Telefax: (212) 867-0298 (2) Informace pro SEQ ID č. 1:

(i) charakteristiky sekvencí (A) délka: 418 základních párů (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (vi) původní zdroj (A) organismus: syntetická látka (ix) rys (A) jméno: CDS (B) umístění: 77.....409 (ix) rys (A) jméno: signální peptid (B) umístění: 77...235 (ix) rys (A) jméno: mat.peptid (b) umístění: 236...409 (xi) sekvenční popis: SEQ ID No.l

GAATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT

CATACACAAT

-25CZ 285225 B6

ATAAACGACC AAAAGA ATG AAGGCT GTT TTC TTG GTT TTG TCC TTG ATC109

Met LysAla Val Phr Leu Val Leu Ser Leu Ile

-53 -50-45

GGA TTC TGC TGG GCC CAA CCA GTC ACT GGC GAT GAA TCA TCT GTT GAG 15 7 Gly Phe Cys Trp Ala Gin Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu

-40 -35-30

ATT CCG GAA GAG TCT CTG ATC ATC GCT GAA AAC ACC ACT TTG GCT AAC 205

Ile Pro Glu Glu Ser Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn

-25 -20-15

GTC GCC ATG GCT GAG AGA TTG GAG AAG AGA GAG CCT GAT TTC TGT TTG 253 Val Ala Met Ala Glu Arg Leu Glu Lys Arg Glu Pro Asp Phe Cys Leu -10 -5 15

GAA CCT CCA TAC ACT GGT CCA TGT AAA GCT AGA ATC ATC AGA TAC TTC 301 Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ale Arg Tyr Phe

1520

TAC AAC GCC GAA GCT GGT TTG TGT CAA ACT TTC GTT TAC GGT GGC TGC 349 Tyr Asn Ala Glu Ala Gly Leu Cys Gin Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys

3035

AGA GCT GAA AGA AAC AAC TTC GAA TCT GCT GAA GAC TGC ATG AGA ACT 397 Arg Ala Glu Arg Asn Asn Phe Glu Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr

4550

TG TGGT GGT GCC TAA TCT AGA418

Cys Gly Gly Ala

Informace pro SEQ ID č. 2:

(i) charakteristiky sekvencí (A) délka: 111 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) molekulární typ: protein (xi) sekvenční popis: SEQ ID č. 2

Met Lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile Gly Phe Cys Trp Ala

-53 -50 -45-40

Gin Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu Ile Pro Glu Glu Ser -35 -30-25

Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn Val Ala Met Ala Glu -20 -15-10

-26CZ 285225 B6

Arg Leu Glu Lys Arg Glu Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr -5 1 510

Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Glu Ala

2025

Gly Leu Cys Gin Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Glu Arg Asn 30 3540

Asn Phe Glu Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala

4555 (2) Informace pro SEQ ID č. 3 (i) charakteristiky sekvencí (A) 418 základních párů (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (vi) původní zdroj (A) organismus: syntetická látka (ix) rys (A) jméno: CDS (B) umístění: 77... 409 (ix) rys (AI) jméno: signální peptid (B) umístění: 77....235 (ix) rys (A) jméno: mat. peptid (B) umístění: 236-409 (xi) sekvenční popis: SEQ ID č. 3

GAATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT CATACACAAT

ATAAACGACC AAAAGA ATG AAG GCT GTT TTC TTG GTT TTG TCC TTG ATC

Met Lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile -53 -50 -45

109

-27CZ 285225 B6

GGA TTC TGC TGG GCC CAA CCA GTC ACT GGC GAT GAA TCA TCT GTT GAG 157 Gly Phe Cys Trp Ala Gin Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu

-40 -35-30

ATT CCG GAA GAG TCT CTG ATC ATC GCT GAA AAC ACC ACT TTG GCT AAC 205 Ile Pro Glu Glu Ser Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn

-25 -20-15

GTC GCC ATG GCT GAG AGA TTG GAG AAG AGA GAG CCT GAT TTC TGT TTG 253 Val Ala Met Ala Glu Arg Leu Glu Lys Arg Glu Pro Asp Phe Cys Leu -10 -5 15

GAA CCT CCA TAC ACT GGT CCA TGT AAA GCT AGA ATC ATC AGA TAC TTC 301 Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe

1520

TAC AAC GCC AAG GCT GGT TTG TGT CAA ACT TTC GTT TAC GGT GGC TGC 349 Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gin Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys

3035

AGA GCT AAG GAA AAC AAC TTC GAA TCT GCT GAA GAC TGC ATG AGA ACT 397 Arg Ala Lys Glu Asn Asn Phe Glu Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr 40 4550

TGT GGT GGT GCC TAATCTAGA418

Cys Gly Gly Ala (2) Informace pro SEQ ID č. 4 (i) charakteristiky sekvencí:

(A) délka: 111 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) sekvenční popis: SEQ ID č. 4

Met Lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile Gly Phe Cys Trp Ala

-53 -50 -45-40

Gin Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu Ile Pro Glu Glu Ser

-35 -30-25

Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn Val Ala Met Ala Glu -20 -15-10

Arg Leu Glu Lys Arg Glu Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr -5 1 510

Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala

2025

-28CZ 285225 B6

Gly Leu Cys Gin Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Glu Asn

35 40

Asn Phe Glu Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala

50 55 (2) Informace pro SEQ ID č. 5:

(i) charakteristiky sekvencí (A) délka: 418 základních párů (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (vi) původní zdroj (A) organismus: syntetická látka (ix) rys (A) jméno: cDS (B) umístění: 77...409 (ix) rys (A) jméno: sig.peptid (B) umístění: 77...225 (ix) rys (A) jméno: mat.peptid (B) umístění: 236-409 (xi) sekvenční popis: SEQ ID č. 5

GAATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT CATACACAAT

ATAAACGACC AAAAGA ATG AAG GCT GTT TTC TTG GTT TTG TCC TTG ATC Met Lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile -53 -50-45

GGA TTC TGC TGG GCC CAA CCA GTC ACT GGC GAT GAA TCA TCT GTT GAG Gly Phe Cys Trp Ala Gin Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu -40 -35-30

ATT CCG GAA GAG TCT CTG ATC ATC GCT GAA AAC ACC ACT TTG GCT AAC Ile Pro Glu Glu Ser Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn -25 -20-15

109

157

205

-29CZ 285225 B6

GTC GCC ATG GCT GAG AGA TTG GAG AAG AGA AGG CCT GAT TTC TGT TTG 253 Val Ala Met Ala Glu Arg Leu Glu Lys Arg Arg Pro Asp Phe Cys Leu -10 -5 15

GAA CCT CCA TAC ACT GGT CCA TGT AAA GCT AGA ATC ATC AGA TAC TTC 301 Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe

1520

TAC AAC GCC AAG GCT GGT TTG TGT CAA ACT TTC GTT TAC GGT GGC TGC 349 Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gin Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys

3035

AGA GCT AAG GAA AAC AAC TTC GAA TCT GCT GAA GAC TGC ATG AGA ACT 397 Arg Ala Lys Glu Asn Asn Phe Glu Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr 40 4550

TGT GGT GGT GCC TAATCTAGA418

Cys Gly Gly Ala

Informace pro SEQ ID č. 6 (i) charakteristiky sekvencí (A) délka: 111 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) sekvenční popis: SEQ ID No. 6.

Met Lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile Gly Phe Cys Trp Ala

-53 -50 -45-40

Gin Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu Ile Pro Glu Glu Ser

-35 -30-25

Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn Val Ala Met Ala Glu

-20 -15-10

Arg Leu Glu Lys Arg Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr

-5 1 510

Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala

2025

Gly Leu Cys Gin Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Glu Asn

3540

Asn Phe Glu Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala

5055

-30CZ 285225 B6 (2) Informace pro SEQ ID č. 7 (i) charakteristiky sekvencí (A) délka: 418 základních párů (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (vi) původní zdroj (A) organismus: syntetická látka (ix) rys (A) jméno: CDS (B) umístění: 77...409 (ix) rys: signální peptid (B) umístění: 77...235 (ix) rys: mat.-peptid (B) umístění: 236-..409 (xi) sekvenční popis: SEQ ID č. 7.

GAATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT

CATACACAAT60

ATAAACGACC AAAAGA ATG AAG GCT GTT TTC TTG GTT TTG TCC TTG ATC 109 Met Lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile -53 -50-45

GGA TTC TGC TGG GCC CAA CCA GTC ACT GGC GAT GAA TCA TCT GTT GAG 157

Gly Phe Cys Trp Ala Gin Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu

-40 -35-30

ATT CCG GAA GAG TCT CTG ATC ATC GCT GAA AAC ACC ACT TTG GCT AAC 205

Ile Pro Glu Glu Ser Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn

-25 -20-15

GTC GCC ATG GCT GAG AGA TTG GAG AAG AGA AGG CCT GAT TTC TGT TTG 253

Val Ala Met Ala Glu Arg Leu Glu Lys Arg Arg Pro Asp Phe Cys Leu

-10 -5 15

GAA CCT CCA TCT ACT GGT CCA TGT AAA GCT AGA ATC ATC AGA TAC TTC 301

Glu Pro Pro Ser Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe

1520

-31 CZ 285225 B6

TAC GAC GCC ACT GCT GGT TTG TGT GAA ACT TTC GTT TAC GGT GGC TGC 349 Tyr Asp Ala Thr Ala Gly Leu Cys Glu Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys 25 3035

AGA GCT AAC AGA AAC AAC TTC AAG TCT GCT GAA GAC TGC ATG GAA ACT 397 Arg Ala Asn Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Glu Thr 40 4550

TGT GGT GGT GCC TAATCTAGA418

Cys Gly Gly Ala (2) Informace pro SEQ ID č. 8 (i) charakteristiky sekvencí (A) délka: 111 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) sekvenční popis: SEQ ID č. 8

Met Lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile Gly Phe Cys Trp Ala

-53 -50 -45-40

Gin Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu Ile Pro Glu Glu Ser

-35 -30-25

Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn Val Ala Met Ala Glu

-20 -15-10

Arg Leu Glu Lys Arg Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr

-5 1 510

Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asp Ala Thr Ala

2025

Gly Leu Cys Glu Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Asn Arg Asn

3540

Asn Phe Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala

5055 (2) Informace pro SEQ ID č. 9 (i) charakteristiky sekvencí (A) délka: 418 základních párů (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární

-32CZ 285225 B6 (ii) typ molekuly: cDNA (vi) původní zdroj (A) organismus: syntetická látka (ix) rys:

(A) jméno: CDS (B) umístění: 77...409 (ix) iys:

(A) jméno: signální peptid (B) umístění: 77...235 (ix) rys:

(A) jméno: mat.peptid (B) umístění 236...409 (xi) sekvenční popis: SEQ ID č. 9

GAATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT

CATACACAAT60

ATAAACGACC AAAAGA ATG AAG GCT GTT TTC TTG GTT TTG TCC TTG ATC 109 Met Lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile -53 -50-45

GGA TTC TGC TGG GCC CAA CCA GTC ACT GGC GAT GAA TCA TCT GTT GAG 157

Gly Phe Cys Trp Ala Gin Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu

-40 -35-30

ATT CCG GAA GAG TCT CTG ATC ATC GCT GAA AAC ACC ACT TTG GCT AAC 205

Ile Pro Glu Glu Ser Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn

-25 -20-15

GTC GCC ATG GCT GAG AGA TTG GAG AGG AGA AGG CCT GAT TTC TGT TTG 253

Val Ala Met Ala Glu Arg Leu Glu Lys Arg Arg Pro Asp Phe Cys Leu

-10 -5 15

GAA CCT CCA TCT ACT GGT CCA TGT AAA GCT AGA ATC ATC TTG TAC TTC 301

Glu Pro Pro Ser Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Leu Tyr Phe

1520

TAC AAC GCC AAG GCT GGT TTG TGT CAA ACT TTC GTT TAC GGT GGC TGC 349

Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gin Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys

3035

AGA GGT AAC GGT AAC CAA TTC TAC TCT GCT GAA GAC TGC ATG AGA ACT 397

Arg Gly Asn Gly Asn Gin Phe Tyr Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr

4550

-33 CZ 285225 B6

TGT GGT GGT GCC TAATCTAGA

Cys Gly Gly Ala (2) Informace pro SEQ ID č. 10 (i) charakteristiky sekvencí (A) délka: 111 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) sekvenční popis: SEQ ID č. 10

Met Lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile Gly Phe Cys Trp Ala -53 -50 -45-40

Gin Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu Ile Pro Glu Glu Ser -35 -30-25

Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn Val Ala Met Ala Glu

-20 -15-10

Arg Leu Glu Lys Arg Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr -5 1 510

Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Leu Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala

2025

Gly Leu Cys Gin Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Asn Gly Asn

3540

Gin Phe Tyr Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala

5055 (2) Informace pro SEQ ID č. 11 (i) charakteristiky sekvencí (A) délka: 508 základních párů (B) : typ: nukleová kyselina (C) : řetězec: jednoduchý (D) : topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDBA (vi) původní zdroj:

(A) organismus: syntetická látka

418

-34CZ 285225 B6 (ix) rys (A) jméno: CDS (B) umístění: 77...499 (ix) rys (A) jméno: signální peptid (B) umístění: 77...331 (ix) rys (A) jméno: mat.peptid (B) umístění: 332...499 (xi) sekvenční popis: SEQ ID č. 11.

GAATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT

CATACACAAT60

ATAAACGATT AAAAGA ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT ACT GCA GTT TTA 109 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu -85 -80-75

TTC GCA GCA TCC TCC GCA TTA GCT GCT CCA GTC AAC ACT ACA ACA GAA 15 7 Phe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu

-70 -65-60

GAT GAA ACG GCA CAA ATT CCG GCT GAA GCT GTC ATC GGT TAC TCA GAT 205

Asp Glu Thr Ala Gin Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp

-55 -50-45

TTA GAA GGG GAT TTC GAT GTT GCT GTT TTG CCA TTT TCC AAC AGC ACA 253

Leu Glu Gly Asp Phe Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr

-40 -35-30

ATT AAC GGG TTA TTG TTT ATA AAT ACT ACT ATT GCC AGC ATT GCT GCT 301

Asn Asn Gly Leu Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala

-25 -20-15

AAA GAA GAA GGG GTA TCT TTG GAT AAA AGA GAT TTC TGT TTG GAA CCT 349

Lys Glu Glu Gly Val Ser Leu Asp Lys Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro

-10 -5 15

CCA TAC ACT GGT CCA TGT AAA GCT AGA ATC ATC AGA TAC TTC TAC AAC 397

Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn

1520

GCC AAG GCT GGT TTG TGT CAA ACT TTC GTT TAC GGT GGC TGC AGA GCT 445

Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gin Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala

3035

-35CZ 285225 B6

AAG TCC AAC AAC TTC GCT TCT GCT GAA GAC TGC ATG AGA ACT TGT GGT Lys Ser Asn Asn Phe Ala Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly 40 45 50

GGT GCC TAATCTAGA

Gly Ala (2) Informace pro SEQ ID č. 12 (i) charakteristiky sekvencí (A) délka: 141 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) sekvenční popis SEQ ID č. 12

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

-85 -80 -75-70

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gin

-65 -60-55

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

-50 -45-40

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

-35 -30-25

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

-20 -15-10

Ser Leu Asp Lys Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro

-5 1 510

Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu

2025

Cys Gin Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Ser Asn Asn Phe

3540

Ala Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala

5055 (2) Informace pro SEQ ID č. 13 (i) charakteristiky sekvencí (A) délka: 508 základních párů

493

508

-36CZ 285225 B6 (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (vi) původní zdroj (A) organismus: syntetická látka (ix) rys (A) jméno: CDS (B) umístění: 77...499 (ix) rys (A) jméno: signální peptid (B) umístění: 77... 331 (ix) rys (A) jméno: mat.peptid (B) : umístění: 332...499 (xi) sekvenční popis: SEQ ID č. 13.

GAATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT

CATACACAAT60

ATAAACGATT AAAAGA ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT ACT GCA GTT TTA 109 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu -85 -80-75

TTC GCA GCA TCC TCC GCA TTA GCT GCT CCA GTC AAC ACT ACA ACA GAA 157

Phe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu

-70 -65-60

GAT GAA ACG GCA CAA ATT CCG GCT GAA GCT GTC ATC GGT TAC TCA GAT 205

Asp Glu Thr Ala Gin Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp

-55 -50-45

TTA GAA GGG GAT TTC GAT GTT GCT GTT TTG CCA TTT TCC AAC AGC ACA 253

Leu Glu Gly Asp Phe Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr

-40 -35-30

AAT AAC GGG TTA TTG TTT ATA AAT ACT ACT ATT GCC AGC ATT GCT GCT 301

Asn Asn Gly Leu Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala

-25 -20-15

AAA GAA GAA GGG GTA TCT TTG GAT AAA AGA GAT TTC TGT TTG GAA CCT 349

Lys Glu Glu Gly Val Ser Leu Asp Lys Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro

-10 -5 15

-37CZ 285225 B6

CCA TAC ACT GGT CCA TGT AAA GCT AGA ATC ATC AGA TAC TTC TAC AAC 397 Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn

1520

GCC AAG GCT GGT TTG TGT CAA ACT TTC GTT TAC GGT GGC TGC AGA GCT 445 Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gin Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala

3035

AAG TCC AAC AAC TTC GAA TCT GCT GAA GAC TGC ATG AGA ACT TGT GGT 493 Lys Ser Asn Asn Phe Glu Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly

4550

GGT GCC TAATCTAGA

Gly Ala

508 (2) Informace pro SEQ ID č. 14 (i) charakteristiky sekvencí:

(A) délka: 141 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) sekvenční popis SEQ ID č. 14

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser -85 -80 -75-70

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gin

-65 -60-55

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

-50 -45-40

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu -35 -30-25

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

-20 -15-10

Ser Leu Asp Lys Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro -5 1 510

Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu

2025

Cys Gin Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Ser Asn Asn Phe 30 3540

Glu Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala

5055

-38CZ 285225 B6 (2) Informace pro SEQ ID č. 15 (i) charakteristiky sekvencí (A) délka: 412 základních párů (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (vi) původní zdroj (A) organismus: syntetická látka (ix) rys (A) : jméno: CDS (B) umístění: 77... 403 (ix) rys (A) jméno: signální peptid (B) umístění: 77...235 (ix) rys (A) jméno: mat.peptid (B) umístění 236...403 (xi) sekvenční popis: SEQ ID č. 15.

GAATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT

CATACACAAT60

ATAAACGACC AAAAGA ATG AAG GCT GTT TTC TTG GTT TTG TCC TTG ATC 109 Met Lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile -53 -50-45

GGA TTC TGC TGG GCC CAA CCA GTC ACT GGC GAT GAA TCA TCT GTT GAG 157

Gly Phe Cys Trp Ala Gin Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu

-40 -35-30

ATT CCG GAA GAG TCT CTG ATC ATC GCT GAA AAC ACC ACT TTG GCT AAC 205

Ile Pro Glu Glu Ser Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn

-25 -20-15

GTC GCC ATG GCT GAG AGA TTG GAG AAG AGG GAT TTC TGT TTG GAA CCT 253

Val Ala Met Ala Glu Arg Leu Glu Lys Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro

-10 -515

CCA TCT ACT GGT CCA TGT AAA GCT AGA ATC ATC AGA TAC TTC TAC GAC 301

Pro Ser Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asp

15 20

-39CZ 285225 B6

GCC ACT GCT GGT TTG TGT GAA ACT TTC GTT TAC GGT GGC TGC AGA GCT 349 Ala Thr Ala Gly Leu Cys Glu Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala

25	30	35
AAC AGA AAC AAC TTC AAG TCT GCT GAA GAC TGC ATG GAA ACT TGT GGT 397
Asn Arg Asn Asn Phe Lys	Ser Ala Glu Asp	Cys Met Glu Thr Cys Gly
40	45	50
GGT GCC TAATCTAGA		412

Gly Ala (2) Informace pro SEQ ID č. 16 (i) charakteristiky sekvencí (A) délka: 109 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) sekvenční popis: SEQ ID č. 16

Met Lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile Gly Phe Cys Trp Ala -53 -50 -45-40

Gin Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu Ile Pro Glu Glu Ser

-35 -30-25

Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn Val Ala Met Ala Glu

-20 -15-10

Arg Leu Glu Lys Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr Gly Pro -5 1 510

Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asp Ala Thr Ala Gly Leu

2025

Cys Glu Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Asn Arg Asn Asn Phe

3540

Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala

5055 (2) Informace pro SEQ ID č. 17 (i) charakteristiky sekvencí (A) dílka: 508 základních párů (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) : topologie: lineární

-40CZ 285225 B6 (ii) typ molekuly: cDNA (vi) původní zdroj (A) organismus: syntetická látka (ix) rys (A) jméno: CDS (B) umístění: 77... 499 (ix) rys (A) jméno: signální peptid (B) umístění: 77...331 (ix) rys (A) jméno: mat.peptid (B) umístění: 332...499 (xi) sekvenční popis: SEQ ID č. 17

GAATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT

CATACACAAT60

ATAAACGATT AAAAGA ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT ACT GCA GTT TTA 109 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu -85 -80-75

TTC GCA GCA TCC TCC GCA TTA GCT GCT CCA GTC AAC ACT ACA ACA GAA 157

Phe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu

-70 -65-60

GAT GAA ACG GCA CAA ATT CCG GCT GAA GCT GTC ATC GGT TAC TCA GAT 205

Asp Glu Thr Ala Gin Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp

-55 -50-45

TTA GAA GGG GAT TTC GAT GTT GCT GTT TTG CCA TTT TCC AAC AGC ACA 253

Leu Glu Gly Asp Phe Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr

-40 -35-30

AAT AAC GGG TTA TTG TTT ΑΤΑ AAT ACT ACT ATT GCC AGC ATT GCT GCT 301

Asn Asn Gly Leu Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala

-25 -20-15

AAA GAA GAA GGG GTA TCT TTG GAT AAA AGA GAT TTC TGT TTG GAA CCT 349

Lys Glu Glu Gly Val Ser Leu Asp Lys Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro

-10 -5 15

CCA TAC ACT GGT CCA TGT AAA GCT AGA ATC ATC AGA TAC TTC TAC GAC 397

Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asp

15 20

-41 CZ 285225 B6

GCC ACT GCT GGT TTG TGT GAA ACT TTC GTT TAC GGT GGC TGC AGA GCT 445 Ala Thr Ala Gly Leu Cys Glu Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala 25 3035

AAG AGA AAC AAC TTC AAG TCT GCT GAA GAC TGC ATG GAA ACT TGT GGT 493 Lys Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly 40 4550

GGT GCC TAATCTAGA508

Gly Ala (2) Informace pro SEQ ID č. 18 ...

(i) charakteristiky sekvencí (A) délka: 141 aminokyselin (B) typ: aminokyseliny (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) sekvenční popis: SEQ ID č. 18

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

-85 -80 -75-70

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gin

-65 -60-55

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

-50 -45-40

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

-35 -30-25

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

-20 -15-10

Ser Leu Asp Lys Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro

-5 1 510

Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asp Ala Thr Ala Gly Leu

2025

Cys Glu Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe

3540

Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala

5055

-42CZ 285225 B6 (2) Informace pro SEQ ID č. 19 (i) charakteristiky sekvencí (A) délka: 412 základních párů (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (vi) původní zdroj (A) organismus: syntetická látka (ix) rys (A) jméno: CDS (B) umístění: 77...403 (ix) rys (A) jméno: signální peptid (B) umístění: 77...235 (ix) rys (A) jméno: mat.peptid (B) umístění: 236...403 (xi) sekvenční popis: SEQ ID č. 19

GAATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT

CATACACAAT60

ATAAACGACC AAAAGA ATG AAG GCT GTT TTC TTG GTT TTG TCC TTG ATC 109 Met Lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile -53 -50-45

GGA TTC TGC TGG GCC CAA CCA GTC ACT GGC GAT GAA TCA TCT GTT GAG 157

Gly Phe Cys Trp Ala Gin Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu

-40 -35-30

ATT CCG GAA GAG TCT CTG ATC ATC GCT GAA AAC ACC ACT TTG GCT AAC 205

Ile Pro Glu Glu Ser Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn

-25 -20-15

GTC GCC ATG GCT GAG AGA TTG GAG AAG AGG GAT TTC TGT TTG GAA CCT 253

Val Ala Met Ala Glu Arg Leu Glu Lys Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro

-10 -5 15

CCA TCT ACT GGT CCA TGT AAA GCT AGA ATC ATC AGA TAC TTC TAC AAC 301

Pro Ser Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn

15 20

-43 CZ 285225 B6

GCC AAG GCT GGT TTG TGT CAA ACT TTC GTT TAC GGT GGC TGC AGA GGT 349 Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gin Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Gly

25	30	35
AAC GGC AAC AAC TTC AAG TCT GCT GAA GAC TGC ATG GAA ACT TGT GGT 397
Asn Gly Asn Asn Phe Lys Ser	Ala Glu Asp	Cys Met Glu Thr Cys Gly
40 45		50
GGT GCC TAATCTAGA		412

Gly Ala (2) Informace pro SEQ ID č. 20 (i) charakteristiky sekvencí (A) délka: 109 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D): topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) sekvenční popis: SEQ ID č. 20

Met Lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile Gly Phe Cys Trp Ala -53 -50 -45-40

Gin Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu Ile Pro Glu Glu Ser

-35 -30-25

Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn Val Ala Met Ala Glu

-20 -15-10

Arg Leu Glu Lys Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr Gly Pro -5 1 510

Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu

2025

Cys Gin Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Asn Gly Asn Asn Phe

3540

Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala

5055 (2) Informace pro SEQ ID č. 21 (i) charakteristika sekvencí (A) délka: 508 základních párů (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární

-44CZ 285225 B6 (ii) typ molekuly: cDNA (vi) původní zdroj (A) organismus: syntetická látka (ix) iys (A) jméno: CDS (B) umístění: 77... 499 (ix) iys (A) jméno: signální peptid (B) umístění: 77...331 (ix) rys (A) jméno: mat.peptid (B) umístění: 332..499 (xi) sekvenční popis: SEQ ID č. 21:

GAATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT

CATACACAAT60

ATAAACGATT AAAAGA ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT ACT GCA GTT TTA 109 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu -85 -80-75

TTC GCA GCA TCC TCC GCA TTA GCT GCT CCA GTC AAC ACT ACA ACA GAA 157

Phe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu

-70 -65-60

GAT GAA ACG GCA CAA ATT CCG GCT GAA GCT GTC ATC GGT TAC TCA GAT 205 Asp Glu Thr Ala Gin Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp

-55 -50-45

TTA GAA GGG GAT TTC GAT GTT GCT GTT TTG CCA TTT TCC AAC AGC ACA 253 Leu Glu Gly Asp Phe Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr

-40 - -35-30

AAT AAC GGG TTA TTG TTT ΑΤΑ AAT ACT ACT ATT GCC AGC ATT GCT GCT 301 Asn Asn Gly Leu Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala

-25 -20-15

AAA GAA GAA GGG GTA TCT TTG GAT AAA AGA GAT TTC TGT TTG GAA CCT 349 Lys Glu Glu Gly Val Ser Leu Asp Lys Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro -10 -5 15

CCA TAC ACT GGT CCA TGT AAA GCT AGA ATC ATC AGA TAC TTC TAC AAC 397

Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn

15 20

-45 CZ 285225 B6

GCC AAG GCT GGT TTG TGT CAA ACT TTC GTT TAC GGT GGC TGC AGA GCT 445 Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gin Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala

3035

AAG TCC AAC AAC TTC AAG TCT GCT GAA GAC TGC ATG GAA ACT TGT GGT 493 Lys Ser Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly

4550

GGT GCC TAATCTAGA508

Gly Ala (2) Informace pro SEQ ID č. 22 (i) charakteristiky sekvencí (A) délka: 141 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) sekvenční popis: SEQ ID č. 22

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

-85 -80 -75-70

Ala Leu Ala Ala Pro Via Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gin

-65 -60-55

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

-50 -45-40

Aso Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

-35 -30-25

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

-20 -15-10

Ser Leu Asp Lys Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro

-5 1 510

Cys Kys Aka Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu

2025

Cys Gin Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Ser Asn Asn Phe

3040

Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala

5055

-46CZ 285225 B6 (2) Informace pro SEQ ID č. 23 (i) charakteristiky sekvencí (A) délka: 508 základních párů (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iv) původní zdroj (A) organismus: syntetická látka (ix) rys (A) jméno: CDS (B) umístění: 77 ... 499 (ix) rys (A) jméno: mat. peptid (B) umístění: 332 ... 499 (xi) sekvenční popis: SEQ ID č. 23

GAATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT

CATACACAAT60

ATAAACGATT AAAAGA ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT ACT GCA GTT TTA 109 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu -85 -80-75

TTC GCA GCA TCC TCC GAA TTA GCT GCT CCA GTC AAC ACT ACA ACA GAA 157

Phe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu

-70 -65-60

GAT GAA ACG GCA CAA ATT CCG GCT GAA GCT GTC ATC GGT TAC TCA GAT 205

Asp Glu Thr Ala Gin Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp

-55 -50-45

TAT GAA GGG GAT TTC GAT GTT GCT GTT TTG CCA TTT TCC AAC AGC ACA 253

Leu Glu Gly Asp Phe Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr

-40 -35-30

AAT AAC GGG TTA TTG TTT ATA AAT ACT ACT ATT GCC AGC ATT GCT GCT 301

Asn Asn Gly Leu Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala

-25 -20-15

AAA GAA GAA GGG GTA TCT TTG GAT AAA AGA GAT TTC TGT TTG GAA CCT 349

Lys Glu Glu Gly Val Ser Leu Asp Lys Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro

-10 -5 15

-47CZ 285225 B6

CCA TAC ACT GGT CCA TGT AAA GCT AGA ATC ATC AGA TAC TTC TAC AAC 397 Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn

1520

GCC AAG GCT GGT TTG TGT CAA ACT TTC GTT TAC GGT GGC TGC AGA GCT 445 Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gin Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala 25 3035

AAG GAA AAC AAC TTC AAG TCT GCT GAA GAC TGC ATG GAA ACT TGT GGT 493 Lys Glu Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly 40 4550

GGT GCC TAATCTGA508

Gly Ala (2) Informace pro SEQ id č. 24 (i) charakteristiky sekvencí (A) délka: 141 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) sekvenční popis: SEQ ID č. 24

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

-85 -80 -75-70

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr The Glu Asp Glu Thr Ala Gin

-65 -60-55

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

-50 -45-40

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

-35 -30-25

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

-20 -15-10

Ser Leu Asp Lys Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tys Thr Gly Pro

-5 1 510

Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu

2025

Cys Gin Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Glu Asn Asn Phe

3540

Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala

5055

-48CZ 285225 B6 (2) Informace pro SEQ ID č. 25 (i) charakteristika sekvencí (A) délka: 508 základní párů (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (vi) původní zdroj (A) organismus: syntetická látka (ix) rys (A) jméno: CDS (B) umístění: 77 ... 499 (rys) (A) jméno: signální peptid (B) umístění: 77 ... 331 (ix) rys (A) jméno: mat. peptid (B) umístění: 332 ...499 (xi) sekvenční popis: SEQ ID č. 25

GAATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT

CATACACAAT60

ATAACGATT AAAAGA ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT ACT GCA GTT TTA109

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu -85 -80-75

TTC GCA GCA TCC TCC GCA TTA GCT GCT CCA GTC AAC ACT ACA ACA GAA 157

Phe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu

-70 -65-60

GAT GAA ACG GCA CAA ATT CCG GCT GAA GCT GTC ATC GGT TAC TCA GAT 205

Asp Glu Thr Ala Gin Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp

-55 -50-45

TTA GAA GGG GAT TTC GAT GTT GCT GTT TTG CCA TTT TCC AAC AGC ACA 253

Leu Glu Gly Asp Phe Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr

-40 -35-30

AAT AAC GGG TTA TTG TTT ΑΤΑ AAT ACT ACT ATT GCC AGC ATT GCT GCT 301

Asn Asn Gly Leu Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala

-25 -20-15

-49CZ 285225 B6

AAA GAA GAA GGG GTA TCT TTG GAT AAA AGA GAT TTC TGT TTG GAA CCT 349 Lys Glu Glu Gly Val Ser Leu Asp Lys Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro -10 -5 15

CCA TAC ACT GGT CCA TGT AAA GCT AGA ATC ATC AGA TAC TTC TAC AAC 397 Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tys Asn

1520

GCC GAA GCT GGT TTG TGT CAA ACT TTC GTT TAC GGT GGC TGC AGA GCT 445 Ala Glu Ala Gly Leu Cys Gin Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala

3035

AAG TCC AAC AAC TTC AAG TCT GCT GAA GAC TGC ATG GAA ACT TGT GGT 493 Lys Ser Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly

4550

GGT GCC TAATCTAGA508

Gly Ala (2) Informace pro SEQ ID č. 26 (i) charakteristika sekvencí (A) délka: 141 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) sekvenční popis: SEQ ID č. 26

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser -85 -80 -75-70

Ala Ale Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gin -65 -60-55

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

-50 -45-40

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

-35 -30-25

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val -20 -15-10

Ser Leu Asp Lys Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro -5 1 510

Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Glu Ala Gly Leu 15 2025

-50CZ 285225 B6

Cys Gin Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Ser Asn Asn Phe

35 40

Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala

50 55 (2) Informace pro SEQ ID č. 27 (i) charakteristiky sekvencí (A) délka: 508 základních párů (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (vi) původní zdroj (A) organismus: syntetická látka (ix) rys:

(A) : jméno: CDS (B) : umístění: 77 ... 499 (ix) rys (A) : jméno: signální peptid (B) : umístění: 77 ... 331 (ix) rys (A) : jméno: mat. peptid (B) : umístění: 332 ... 499 (xi) sekvenční popis ID NO:27:

GAATTCCAT GAAGAATAGT TCAAACAGA AGATTACAAA CTATGAATTT

CATACACAAT60

ATAAACGATT AAAAGA ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT ACT GCA GTT TTA 109 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu -85 -80-75

TTC GCA GCA TCC TCC GCA TTA GCT GCT CCA GTC AAC ACT ACA ACA GAA 157

Phe Ala Ale Ser Ser Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu

-70 -65-60

GAT GAA ACG GCA CAA ATT CCG GCT GAA GCT GTC ATC GGT TAC TCA GAT 205

Asp Glu Thr Ala Gin Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp

-55 -50-45

-51 CZ 285225 B6

TTA GAA GGG GAT TTC GAT GTT GCT GTT TTG CCA TTT TCC AAC AGC ACA 253 Leu Glu Gly Asp Phe Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr

-40 -35-30

AAT AAC GGG TTA TTG TTT ATA AAT ACT ACT ATT GCC AGC ATT GCT GCT 301 Asn Asn Gly Leu Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala

-25 -20-15

AAA GAA GAA GGG GTA TCT TTG GAT AAA AGA GAT TTC TGT TTG GAA CCT 349 Lys Glu Glu Gly Val Ser Leu Asp Lys Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro

-10 -5 15

CCA TAC ACT GGT CCA TGT AAA GCT AGA ATC ATC AGA TAC TTC TAC AAC 397 Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn

1520

GCC GAA GCT GGT TTG TGT CAA ACT TTC GTT TAC GGT GGC TGC AGA GCT 445 Ala Glu Ala Gly Leu Cys Gin Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala

3035

AAG GAA AAC AAC TTC AAG TCT GCT GAA GAC TGC ATG GAA ACT TGT GGT 493 Lys Glu Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly

4550

GGT GCC TAATCTAGA508

Gly Ala (2) Informace pro SEQ ID č. 28 (i) charakteristiky sekvencí (A) délka: 141 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) sekvenční popis: SEQ ID č. 28

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

-85 -80 -75-70

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gin

-65 -60-55

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

-50 -45-40

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asp Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

-35 -30-25

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

-20 -15-10

-52CZ 285225 B6

Ser Leu Asp Lys Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro -5 1 510

Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Glu Ala Gly Leu

2025

Cys Gin Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Glu Asn Asn Phe 30 3540

Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala

5055 (2) Informace pro SEQ ID č. 29 (i) charakteristiky sekvencí (A) délka: 58 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D): topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) sekvenční popis: SEQ ID č. 29

Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala 15 1015

Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gin Thr

2530

Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala 35 4045

Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala

Claims (23)

1. Analog aprotininu obecného vzorce II

R’ Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro R² Thr Gly Pro Cys R¹³ R¹⁴ R¹⁵ R¹⁶ R¹⁷ R³ Tyr Phe Tyr R⁴ Ala R⁵ Ala Gly Leu Cys R⁶ Thr Phe R¹⁸ Tyr R¹⁹ Gly Cys R²⁰ R⁷ R⁸ R⁹ Asn R¹⁰ Phe R¹¹ Ser Ala Glu Asp Cys Met R¹² Thr Cys Gly Gly Ala, kde

R¹ je dipeptid, zvolený ze skupiny Arg-Pro, Glu-Pro, Asp-Pro, Ala-Pro, Ile-Pro, Thr-Pro, HisPro, Leu-Pro, Gly-Pro a Ser-Pro, nebo R¹ znamená vodík,

R² je aminokyselinový zbytek ze skupiny Tyr, Glu, Asp, Ser, Thr, Ala a Val,

R³ je aminokyselinový zbytek ze skupiny Arg, Glu, Asp, Leu, Ser, Ala, Gin a Thr,

R⁴ je aminokyselinový zbytek ze skupiny Asn, Glu a Asp,

R⁵ je aminokyselinový zbytek ze skupiny Lys, Glu, Asp, Thr, Val, Ala, Ser, Phe, Gin a Gly,

R⁶ je aminokyselinový zbytek ze skupiny Gin, Glu, Asp, Val a Ala,

R⁷ je aminokyselinový zbytek ze skupiny Ala, Asp, Glu a Gly,

R⁸ je aminokyselinový zbytek ze skupiny Lys, Glu, Asp, Asn, Ser, Thr a Ala,

R⁹ je aminokyselinový zbytek ze skupiny Arg, Glu, Asp, Ser, Asn, Leu, Gly, Gin, Met a Thr,

R¹⁰ je aminokyselinový zbytek ze skupiny Asn, Glu a Asp,

R¹¹ je aminokyselinový zbytek ze skupiny Lys, Glu, Asp, Leu, Tyr, Ala, Val, Thr, Ser, Pro, His a Ile,

R¹² je aminokyselinový zbytek ze skupiny Arg, Glu, Asp, Gin, Ala, Asn, His, Gly, Ser a Thr

R¹³ je aminokyselinový zbytek ze skupiny Lys, Arg, Glu, Leu, Met, Tyr a Phe,

R¹⁴ je aminokyselinový zbytek ze skupiny Ala a Gly,

R¹⁵ je aminokyselinový zbytek ze skupiny Arg, Ala, Gly, Lys, Leu, Met, Phe, Tyr, Ile a Asn,

R¹⁶ je aminokyselinový zbytek ze skupiny Ile, Met, Leu, Phe, Thr a Glu,

R¹⁷ je aminokyselinový zbytek ze skupiny Ile, Leu, Lys, Gin, Glu, Ser, Arg, Thr a Asn,

R¹⁸ je aminokyselinový zbytek ze skupiny Val, Thr, Leu, Ser, Tyr, Gin, His, Pro, Phe, Asn, Ile a Lys,

R¹⁹ je aminokyselinový zbytek ze skupiny Gly, Thr a Ser, a

R²⁰ je aminokyselinový zbytek ze skupiny Lys, Gin, Met, Asn, Leu, Gly a Glu s výjimkou aprotininových analogů, kterými jsou nativní aprotinin, aprotinin (3-58, 42 Ser), aprotinin (3-58, 17 Ala + 42 Ser), aprotinin (3-58, 17 Ala + 19 Glu + 42 Ser), aprotinin (3-58, 15 Arg +17 Ala + 42 Ser), aprotinin (3-58, 17 Ala), aprotinin (3-58, 17 Ala + 19 Glu), aprotinin (3-58, 15 Arg +17 Ala), aprotinin (15 Arg +17 Ala + 42 Ser), aprotinin (17 Ala), aprotinin (17 Ala +19 Glu),

-54CZ 285225 B6 aprotinin (15 Arg +17 Ale), nebo aprotinin (3-58, 15 Arg + 42 Ser).

2. Analog aprotininu obecného vzorce II podle nároku 1, kde R¹ až R¹² mají významy uvedené v nároku 1 a R¹³ až R²⁰ mají význam jako v sekvenci nativního aprotininu.

3. Analog aprotininu obecného vzorce Π podle nároku 1, kde R¹ znamená Glu-Pro, R⁵ znamená Glu, R⁶ znamená Glu, R¹¹ znamená Glu a R², R³, R⁴, R⁶, R⁷, R⁹, R¹⁰ a R¹² mají významy, jako v sekvenci nativního aprotininu.

4. Analog aprotininu obecného vzorce Π podle nároku 1, kde R¹ znamená Glu-Pro, R⁹ znamená Glu, R¹¹ znamená Glu, a R², R³, R⁴, R⁶, R⁷, R⁸, R¹⁰ a R¹² mají významy, jako v sekvenci nativního aprotininu.

5. Analog aprotininu obecného vzorce II podle nároku 1, kde R⁹ znamená Glu, R¹¹ znamená Glu, a R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, R¹⁰ a R¹² mají významy, jako v sekvenci nativního aprotininu.

6. Analog aprotininu obecného vzorce II podle nároku 1, kde R² znamená Ser, R⁴ znamená Asp, R⁵ znamená Thr, R⁶ znamená Glu, R⁸ znamená Asn, R¹² znamená Glu, a R¹, R³, R⁷, R⁹, R¹⁰ a R¹¹ mají významy, jako v sekvenci nativního aprotininu.

7. Analog aprotininu obecného vzorce II podle nároku 1, kde R² znamená Ser, R³ znamená Leu, R⁷ znamená Gly, R⁸ znamená Asn, R⁹ znamená Gly, R¹⁰ znamená Gin, R¹¹ znamená Tyr a R¹, R⁴, R⁵, R⁶ a R¹² mají významy, jako v sekvenci nativního aprotininu.

8. Analog aprotininu obecného vzorce II podle nároku 1, kde R¹ znamená vodík, R⁹ znamená Ser, R¹¹ znamená Glu, a R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, R¹⁰ a R¹² mají významy jako v sekvenci nativního aprotininu.

9. Analog aprotininu obecného vzorce II podle nároku 1, kde R¹ znamená vodík, R⁹ znamená Ser, R¹¹ znamená Ala, a R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, R¹⁰ a R¹² mají významy jako v sekvenci nativního aprotininu.

10. Analog aprotininu obecného vzorce II podle nároku 1, kde R¹ znamená vodík, R² znamená Ser, R⁴ znamená Asp, R⁵ znamená Thr, R⁶ znamená Glu, R⁸ znamená Asn, R¹² znamená Glu, a R³, R⁷, R⁹, R¹⁰ a R¹¹ mají významy, jako v sekvenci nativního aprotininu.

11. Analog aprotininu obecného vzorce II podle nároku 1, kde R¹ znamená vodík, R⁴ znamená Asp, R⁵ znamená Thr, R⁶ znamená Glu, R¹² znamená Glu a R², R³, R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰ a R¹¹ mají významy jako v sekvenci nativního aprotininu.

12. Analog aprotininu obecného vzorce II podle nároku 1, kde R¹ znamená vodík, R² znamená Ser, R⁷ znamená Gly, R⁸ znamená Asn, R⁹ znamená Gly, R¹² znamená Glu, a R³, R⁴, R⁵, R⁶, R¹⁰ a R¹¹ mají významy, jako v sekvenci nativního aprotininu.

13. Analog aprotininu obecného vzorce II podle nároku 1, kde R¹ znamená vodík, R⁹ znamená

Ser, R¹² znamená Glu a R², R³, R⁴ R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, R¹⁰ a R¹¹ mají významy, jako v sekvenci nativního aprotininu.

14. Analog aprotininu obecného vzorce II podle nároku 1, kde R¹ znamená vodík, R⁹ znamená

Glu, R¹² znamená Glu a R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, R¹⁰ a R¹¹ mají významy, jako v sekvenci nativního aprotininu.

-55CZ 285225 B6

15. Analog aprotininu obecného vzorce II podle nároku 1, kde R¹ znamená vodík, R⁶ znamená Glu, R⁹ znamená Ser, R¹² znamená Glu a R², R³, R⁴, R⁶, R⁷, R⁸, R¹⁰ a R¹¹ mají významy jako v sekvenci nativního aprotininu.

16. Analog aprotininu obecného vzorce II podle nároku 1, kde R¹ znamená vodík, R⁶ znamená Glu, R⁹ znamená Glu, R¹² znamená Glu a R², R³, R⁴, R⁶, R⁷, R⁸, R¹⁰ a R¹¹ mají významy jako v sekvenci nativního aprotininu.

17. Konstrukce DNA, zahrnující sekvence DNA kódující analog aprotininu podle kteréhokoli z nároků 1 až 16.

18. Rekombinantní expresní vektor, obsahující konstrukci DNA podle nároku 17.

19. Buňka, obsahující expresní vektor podle nároku 18.

20. Způsob přípravy analogu aprotininu podle kteréhokoli z nároků lažl6, vyznačující se tím, že se buňka podle nároku 19 kultivuje za podmínek, vedoucích kexpresi analoga aprotininu a vzniklý analog aprotininu se izoluje z kultury.

21. Farmaceutický přípravek, obsahující analog aprotininu podle kteréhokoli z nároků 1 až 16 spolu s farmaceuticky vhodným nosičem nebo excipiens.

22. Použití analogu aprotininu podle kteréhokoli z nároků 1 až 16 k výrobě léčiva se sníženou nefrotoxicitou ve srovnání s nativním aprotininem.

23. Použití analogu aprotininu podle kteréhokoli z nároků 1 až 16 k výrobě léčiva, který je při podávání charakterizován snížením případů anafylaktických reakcí ve srovnání s nativním aprotininem.