PL168250B1 - Spasób wydarzania analogu aprotyniny - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania analogu aprotyniny o wzorze ogólnym R1 Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro R2 Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile R3 Tyr Phe Tyr R4 Ala R5 Ala Gly Leu Cys R6 Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys ArgR7 R8 R9 Asn Rw Phe R11 Ser Ala Glu Asp Cys Met R”Thr Cys Gly Gly Ala, w którym Ri oznacza dipeptyd wybrany z grupy złozonej z Arg-Pro, Glu-Pro, Asp-Pro, Ala-Pro, Ile-Pro,Thr-Pro, His-Pro, Leu-Pro, Gly-Pro i Ser-Pro, Pro lub Ri oznacza atom wodoru, R2 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Tyr, Glu, Asp, Ser, Thr, Ala i Val, R3 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złozonej z Arg, Glu, Asp, Leu, Ser, Ala, Gin i Thr, R4 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złozonej z Asn, Glu i Asp, R5 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złozonej z Lys, Glu, Asp, Thr, Val, Ala, Ser, Phe, Gin i Gly, R6 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Gln, Glu, Asp, Val i Ala, r7 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Ala, Asp, Glu i Gly, R8 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Lys, Glu, Asp, Asn, Ser, Thr i Ala, R9 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Arg, Glu, Asp, Ser, Asn, Leu, Gly, Gln, Met i Thr, R1° oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Asn, Glu i Asp, R” oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Lys, Glu, Asp, Leu, Tyr, Ala, Val, Thr, Ser, Pro, His i Ile, a R oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Arg, Glu, Asp, Gin, Ala, Asn, His, Gly, Ser i Thr, z tym, że przynajmniej jedna z reszt aminokwasowych Ri do Ri2 jest inna niż odpowiadająca jej reszta aminokwasowa natywnej aprotyniny i że gdy Ri oznacza atom wodoru, wówczas przenajmniejjedna z reszt aminokwasowych od R2 do Ri2jest inna niż odpowiadającajej reszta aminokwasowa natywnej aprotyniny, z wyłączeniem analogów aprotyniny 3-58 i analogów aprotyniny (3-58, 42Ser), znamienny tym, że hoduje się komórkę zawierającą rekombinantowy wektor ekspresyjny stanowiący konstrukcję DNA zawierającą sekwencję DNA kodującą ten analog aprotyniny w warunkach umożliwiających ekspresję analogu aprotyniny i odzyskuje się z hodowli powstały analog.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania analogu aprotyniny, stosowanego do wytwarzania leków.

Aprotynina (znana także jako inhibitor trypsyny trzustki bydlęcej) jest zasdowym białkiem obecnym w kilku bydlęcych organach i tkankach, takich jak węzły chłonne, trzustka, płuca, ślinianka przyuszna, śledziona i wątroba. Jest ona jednołańcuchowym polipeptydem o długości 58 reszt aminokwasowych, o następującej sekwencji aminokwasowej:

Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Glu Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala.

Łańcuch aminokwasowy połączony jest trzema mostkami dwusiarczkowymi, tworzonymi odpowiednio pomiędzy Cys(5) i Cys(55), Cys(4) i Cys(38) oraz Cys(30) i Cys(51).

Punkt izoelektryczny aprotyniny jest bardzo wysoki (w przybliżeniu pl 10,5). Jest to głównie spowodowane stosunkowo wysoką zawartością aminokwasów o ładunku dodatnim - lizyny i argininy. Trójwymiarowa struktura cząsteczki aprotyniny jest bardzo zwarta, co czyni ją bardzo stabilną wobec denaturacji w wysokich temperaturach lub kwasami, zasadami i rozpuszczalnikami organicznymi, bądź wobec degradacji proteolitycznej (patrz B. Kassell, Meth. Enzym. 19,1970, str. 844-852).

Wiadomo, że aprotynina hamuje różne proteazy serynowe, włącznie z trypsyną, chymotrypsyną, plazminą i kalikreinę, i stosuje się ją w leczeniu ostrego zapalenia trzustki, różnych stanów zespołu wstrząsowego, krwotoku spowodowanego nadmierną fibrynolizą oraz uszkodzenia mięśnia sercowego (patrz, na przykład, J.E. Trapnell i in., Brit. J. Surg. 61,1974, str. 177; J. McMichan i in., Circulatory shock 9, 1982, str. 107; L.M. Auer i in., Acta Neurochir. 49, 1979, str. 207; G. Sher, Am. J. Obstet. Gynecol, 129, 1977, str, 164; i B. Schneider, Artzneim Forsch, 26, 1976, str. 1606). Podawanie aprotyniny w wysokich dawkach znacząco obniża utratę krwi towarzyszącą operacjom serca, włącznie z operacjami sercowopłucnymi polegającymi na zastosowaniu obejścia naczynia krwionośnego (patrz, na przykład, B.P. Bidstrup i in., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 97, 1989, st. 364-372; W. van Oeveren i in., Ann. Thorac. Surg. 44, 1987, str. 640-645).

168 250

Znane są pewne analogi aprotyniny, np. z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4595 674, ujawniającego analogi i pochodne aprotyniny, w których Lys(15) zastępuje się resztami Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Arg, kwasu L-a-masłowego, L-norwaliny, L-norleucyny, rlpki/rlrnobinndif luln T ncamirse lKn-r-Eur.oi o j-t ki roić notantnuru r 2 0 jC O Oj mon ima on οΙλπι a«fv\tv_

J VII UU1UU111 jr 1UU Α^^_1ΐνΐ11υθνΐ j 11 j . AjU1U|ZVJ01V1 Wpio J7UVVlilV łł j 111 _X S UJUłłlllU U11U1V^1 U|Z1 wij niny, w których Lys(15) zastępuje się resztami Arg, Val, Ile, Leu, Phe, Gly, Ser, Trp, Tyr lub Ala, i w których Met(52) zastępuje się ponadto resztami Glu, Val, Leu, Thr lub Ser.

Europejski opis patentowy nr 370 592 ujawnia analogi aprotyniny, w których jeden łub więcej aminokwasów w pozycjach 15, 16, 17, 18, 34 i 52 zastępuje się mną resztą aminokwasową. Opis patentowy nr WO 89/011968 ujawnia metodę wytwarzania aprotyniny lub analogów aprotyniny w drożdżach, a szczególnie ujawnia analogi pozbawionej jednej lub dwóch reszt aminokwasowych przy N-końcu, i w których resztę Lys(41) i /lub Arg(42) zastępuje się inną resztę aminokwasową, w szczególności resztę Ser.

Europejski opis patentowy nr 339 942 ujawnia analogi aprotyniny, w których jeden lub więcej aminokwasów w pozycjach 1,2, 12-19, 38,41 i 42 deletuje się lub zastępuje inną resztą aminokwasową. Poza podstawianiem Met(52) według europejskiego opisu patentowego nr 238 993 i podstawianiem Lys(41) i/lub Arg(42) według opisu patentowego nr 89/01968, które przeprowadza się w celu ułatwienia wytwarzania aprotyniny odpowiednio w E. coli i drożdżach, opisane w tych odnośnikach literaturowych podstawienia aminokwasowe leżą głównie w wiążącym proteazy regionie cząsteczki aprotyniny, a ich celem jest zmiana profilu hamowania proteazy przez aprotyninę.

Jak opisano we wcześniejszych publikacjach, po dożylnej iniekcji natywnej aprotyniny zwierzętom lub ochotnikom, poziom inhibitora w osoczu obniża się raczej szybko w skutek przechodzenia do płynu pozakomórkowego o później akumulacji w nerkach (I. Trautschold i in., w: K. Heinkel i H. Schon (red.), Pathogenese, Diagnostik, Klinik und Therepie der Erkrankungen des Exokrinen Pankreas, Schattauer, Stuttgart, 1964, str. 289; E. Habermann i in., Med Welt 24(29), 1973, str. 1163-1167; H. Fritz i in., Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem. 350, 1969, str. 1541-1550; i H. Kaller r m.. Eur J. Drug Metab. Pharmacokin. 2, 1978, rU. 79-85). Po filtracji aprotynina ulega prawie ilościowemu wiązaniu z błoną rąbka szczoteczkowego komórek kanalika bliższego nerek. Aprotynina ulega następnie ^absorbc^ do pęcherzyków mikropinocytarnych i fagosomó, a następnie bardzo wolnej degradacji w fagolizosomach. Sugerowano, że ten typ transportu jest reprezentatywny dla peptydów w ogóle (M. Just i E. Habermann, NavnynScmiedebergs Arch. Pharmacol. 280, 1973, str. 161-176; M. Just, Navnyn-Scmiedebergs Arch. Pharmacol. 287, 1975, str. 85-95.

Mikroskopowe i histopatologiczne badania po podawaniu aprotyniny ujawniają zmiany tkanek nerkowych u szczurów, królików i psów w następstwie iniekcji stosunkowo wysokich dawek aprotyniny (Bayer, Trasyloł, Inhibitor of proteinase; E. Glaser i in., w: „Verhandlungen der Deutschen Gesellschaft fur Innere Medizin, 78. Kongress, Bergmann, Monachium, 1972, str. 1612-1614). Obserwowaną nefrotoksyczność aprotyniny (np. przejawiającą się w postaci lezji) można przypisać akumulacji aprotyniny w komórkach kanalików blizszych nerek. Nefrotoksyczność ta czyni aprotyninę mniej odpowiednią dla celów klinicznych, szczególnie tych wymagających podawania dużych dawek inhibitora (takich jak operacje sercowopłucne z zastosowaniem obejścia naczynia krwionośnego).

Dlatego istotne byłoby wytwarzanie analogów aprotyniny o obniżonej, w porównaniu z natywną aprotymną, nefrotoksyczności.

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania analogu aprotyniny o obniżonej nefrotoksyczności, w którym w celu zapewnienia obniżonego wypadkowego ładunku dodatniego, przynajmniej jedną resztę aminokwasu o ładunku dodatnim, znajdującą się poza regionem wiązania proteazy, usuwa się lub zastępuje resztą aminokwasu obojętnego lub o ładunku ujemnym, i/lub w którym wstawia się lub dodaje przynajmniej jedną resztę aminokwasu o ładunku ujemnym, i/lub w którym przynajmniej jedną resztę aminokwasu obojętnego zastępuje się resztą aminokwasu o ładunku ujemnym, l/lub w którym, w celu zapewnienia obniżonej stabilności, jedną lub więcej reszt aminokwasowych deletuje się, dodaje lub zastępuje jedną lub większą liczbą innych reszt aminokwasowych.

168 250

W tym kontekście, określenie „obniżony dodatni ładunek wypadkowy oznacza ładunek analogów o niższym dodatnim ładunku wypadkowym od ładunku natywnej aprotyniny (o dodatnim ładunku wypadkowym + 6), jak również bez żadnego ładunku wypadkowego, bądź o ładunku nipmnwn NalpT-ν 7anwa7vć 7P ładnnpk wvnadVnwv anrntvmnv mnw rńżnip cip w TalpTnnćri nd ~-j .. ^-.w.,.pH i że określenia „dodatni ładunek wypadkowy, „ujemny ładunek wypadkowy, „o ładunku dodatnim lub „o ładunku ujemnym stosuje się do ładunku cząsteczki w pH obojętnym.

Przez określenie „miejsce wiązania proteazy rozumie się reszty aminokwasowe ważne dla hamowania proteazy, to znaczy reszty aminokwasowe, które są w bliskim kontakcie z proteazą przez wiązanie się z resztami aminokwasowymi w, lub blisko miejsca aktywnego enzymu. Obecnie za takie reszty uważa się (i, w tym kontekście, określa jako) reszty aminokwasowe w pozycjach 12-18 i 34-39 (patrz H. Fritz i G. Wunderer, Artzneim.-Forsch. 33(1), 1983, str. 484). Usunięcie, wstawienie lub zastąpienie reszt aminokwasowych poza miejscem wiązania proteazy jest korzystne tylko w celu uniknięcia zasadniczych zmian profilu hamowania proteazy przez analog wytwarzany sposobem według wynalazku, w porównaniu z profilem hamowania przez natywną aprotyninę.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że analogi aprotyniny o obniżonym dodatkim ładunku wypadkowym posiadają znacząco niższą nefrotoksyczność niż natywna aprotynina. Jedną z przyczyn nizszej nefrotoksyczności może być to, że analogi aprotyniny o niższym dodatkim ładunku wypadkowym mają obniżone powinowactwo wiązania z powierzchnią kanalików bliższych (błoną rąbka szczoteczkowego), tak że ulegają one w większym stopniu wydalaniu w moczu. Wyjaśnienie to jest zgodne ze stwierdzeniem H. Fritza i in., op. cit., którzy donoszą, że chemicznie zmodyfikowane pochodne aprotyniny (pochodne tetra- i pentamaleoilowe), które są w mniejszym stopniu zasadowe niż natywna aprotynina, nie wiążą się z wyizolowaną frakcją rąbka szczoteczkowego, ale są ilościowo wydalane w moczu.

Z drugiej strony, zmodyfikowana chemicznie aprotynina różni się znacznie od aprotyniny i innych natywnych białek tym, ze zawiera pochodne aminokwasów niestwierdzane w żadnych naturalnie występujących makrocząsteczkach. Nie powinno się dlatego wykluczyć możliwości, że brak akumulacji w nerkach chemicznie zmodyfikowanych pochodnych można przypisać innym zmienionym właściwościom zmodyfikowanych pochodnych, niż obniżony dodatni ładunek wypadkowy.

Stwierdzono, ze inne peptydy wiążą się z rąbkiem szczoteczkowym z mniejszym powinowactwem i wydajnością, niż aprotynina, pomimo zawartości aminokwasów o ładunku dodatnim i/lub posiadania dodatniego ładunku wypadkowego. Wskazuje to na to, ze dodatni ładunek wypadkowy aprotyniny nie jest jedynym wyjaśnieniem jej wiązania i akumulacji w komórkach kanalików blizszych (M. Just i in., 1st. Synmp. Physiol., Prop. Pharmacol. Ration.: Kininogenases, Schattauer, Stuttgart 1973, str. 1163-1167).

Ponadto, nieoczekiwanie stwierdzono, że analogi aprotyniny o obniżonej stabilności termicznej nie ulegają akumulacji w tkance nerki w tym samym stopniu co natywna aprotynina. Jak opisano powyżej, trójwymiarowa struktura aprotyniny jest bardzo zwarta, co jak się sądzi, nadaje inhibitorowi wysoką stabilność wobec denaturacji i degradacji proteolitycznej. A zatem, akumulacja aprotyniny w nerkach może być także wynikiem wyjątkowej stabilności inhibitora. Możliwe jest dlatego, ze wynikiem podstawienia jednej lub więcej reszt aminokwasowych w cząsteczce aprotyniny jest obniżona stabilność w porównaniu z natywną cząsteczką. W tym kontekście „obniżoną stabilność można dla wybranych celów wyrażać jako obniżoną stabilność termiczną analogu w wodnych roztworach o pH około 4-10. Wpływem in vivo takiej obniżonej stabilności może być nadanie analogowi większej podatności na degradację, na przykład degradację proteolityczną, której skutkiem jest szybsza eliminacja analogu z kanalików bliższych.

Obecnie uważa się, ze obniżona nefrotoksyczność analogów aprotyniny wytwarzanych sposobem według wynalazku może wynikać z połączenia obniżonego dodatniego ładunku wypadkowego i obniżonej stabilności cząsteczki.

Powodem przyczyniającym się do uszkodzeń nerek wynikających z podawania natywnej aprotyniny, może być to, że akumuluje się ona na błonach kłębuszków na skutek powinowactwa do ujemnie naładowanych struktur na powierzchni membrany. Wynikiem tego może być powiększona wielkość porów kłębuszka i, w konsekwencji, podwyzszona przepuszczalność większych

168 250 cząsteczek, na przykład albuminy, co może z kolei prowadzić do przeciążenia nerek białkami. Prawdopodobne jest, że analog aprotyniny wytwarzany sposobem według wynalazku może mieć, na skutek obniżonego powinowactwa do ujemnie naładowanych struktur błony kłębuszka, mniejszy w’j^ływ uwikai^k^adący na wielkość porow tej błony m natywna aprotynina.

Ponadto, w pewnych przypadkach obserwowano, ze podawanie aprotyniny prowadzi do odpowiedzi anafilaktoidalnej. Powstała hipoteza, ze ta odpowiedź anafilaktoidalna jest związana z uwalnianiem histaminy, które może być wywoływane przez dodatni ładunek wypadkowy aprotyniny. Dlatego założono, ze odpowiedź anafilaktoidalną przypuszczalnie związaną z podawaniem natywnej aprotyniny, można obniżyć, albo nawet wyeliminować, przez podawanie analogu aprotyniny wytwarzanego sposobem według wynalazku.

Według wynalazku, którąkolwiek z reszt aminokwasów o ładunku dodatnim, lezących poza miejscem wiązania proteazy, można zastąpić albo resztą aminokwasu o ładunku ujemnym - Glu lub Asp, albo którąkolwiek z reszt aminokwasów obojętnych - Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Glu, Ser, Thr, Val, Trp lub Tyr. Jednakże, w celu uniknięcia analogów nieaktywnych bądź analogów o niewłaściwej strukturze trójwymiarowej wynikającej z niepożądanej strukturyzacji cząsteczki, korzystne jest wybranie podstawników, które są identyczne z resztami aminokwasowymi w odpowiadających pozycjach innych inhibitorów proteaz, lub w domenach większych układów wykazujących wysoki stopień homologii do natywnej apfotyniny. Innymi słowy, wybór reszty aminokwasu podstawnika korzystnie opiera się na analizie cząsteczek homologicznych do aprotyniny. Należy zauważyć, ze jednocześnie z podstawieniem(ami) aminokwasowymi bezpośrednio przyczyniającymi się do obniżania dodatniego ładunku wypadkowego, można przeprowadzić jedno lub więcej podstawień innych aminokwasów, które same nie powodują obniżenia dodatniego ładunku wypadkowego, ale które mogą być wymagane do wytworzenia aktywnego analogu o odpowiedniej strukturze trójwymiarowej.

Sposób wytwarzania analogu aprotyniny o wzorze ogólnym IR¹ Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro R² Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile R³ Tyr Phe Tyr R⁴ Ala R⁵ Ala Gly Leu Cys R⁶ Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg R7 R⁸ R⁹ Asn R¹⁰ Phe R¹¹ Ser Ala Glu Asp Cys Met R¹2 Thr Cys Gly Gly Ala, w którym R1 oznacza dipeptyd wybrany z grupy złożonej z Arg-Pro, Glu-Pro, Asp-Pro, Ala-Pro, Ile-Pro, Thr-Pro, His-Pro, Leu-Pro, Gly-Pro i Ser-Pro, Pro lub R¹ oznacza atom wodoru, R2 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Tyr, Glu, Asp, Ser, Thr, Ala i Val, R3 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Arg, Glu, Asp, Leu, Ser, Ala, Gin i Thr, R4 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Asn, Glu i Asp, R5 oznacza’ resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Lys, Glu, Asp, Thi, Val, Ala, Ser, Phe, Gin i Gly, R6 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złozonej z Gin, Glu, Asp, Val i Ala, R7 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złozonej z Ala, Asp, Glu i Gly, R⁸ oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złozonej z Lys, Glu, Asp, Asn, Ser, Thr i Ala, R9 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Arg, Glu, Asp, Ser, Asn, Leu, Gly, Gin, Met ’i Thr, R” oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Asn, Glu i Asp, R” oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Lys, Glu, Asp, Leu, Tyr, Ala, Val, Thr, Ser, Pro, His i Ile, a R12 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złozonej z Arg, Glu, Asp, Gin, Ala, Asn, His, Gly, Ser i Thr, z tym, że przynajmniej jedna z reszt aminokwasowych od R” do R”jest inna niż odpowiadająca jej reszta aminokwasowa natywnej aprotyniny, i że gdy R” oznacza atom wodoru, wówczas przenajmniej jedna z reszt aminokwasowych od R2 do R” jest inna niż odpowiadająca jej reszta aminokwasowa natywnej aprotyniny, z wyłączeniem analogów aprotyniny 3-58 i analogów aprotyniny (3-58, 42 Ser), według wynalazku polega na tym, że hoduje się komórkę zawierającą rekombinanrowy wektor ekspresyjny stanowiący konstrukcję DNA zawierającą sekwencję DNA kodującą ten analog aprotyniny w warunkach umożliwiających ekspresję analogu aprotyniny i odzyskuje się z hodowli powstały analog.

Korzystnie stosuje się konstrukcję DNA obejmującą sekwencję DNA kodującą analog aprotyniny, zawierającą sekwencję DNA kodującą jedną lub większą liczbę reszt aminokwasowych o ładunku ujemnym lub obojętnym dodaną przy 5' - końcu sekwencji kodującej aprotyninę.

Korzystnie także stosuje się konstrukcję DNA obejmującą sekwencję DNA kodującą analog aprotyniny, zawierającą sekwencję DNA kodującąjedną lub większą liczbę reszt aminokwasowych o ładunku ujemnym lub obojętnym dodaną przy 3' - końcu sekwencji kodującej aprotyninę.

168 250

Poza wewnętrznymi podstawieniami w cząsteczce aprotyniny, możliwe jest dodanie peptydu zawierającego jeden lub więcej reszt aminokwasów o ładunkach ujemnych (to jest Glu lub Asp) przy N- lub C-końcu cząsteczki aprotyniny, w celu zapewnienia wymaganego obniżenia dodatniego ładunku UlVgV ΚΛ-νΐΙΛΙΑΙλΙΑ ιιχνι.

liwe jest dodanie jednego lub więcej obojętnych reszt aminokwasowych przy N- lub C-końcu cząsieczki. Takie dołączenia można wykonać albo do natywnej cząsteczki aprotyniny, albo do innych modyfikacji, jak wskazane wyżej.

Jeżeli pożądana jest zmiana właściwości hamowania proteaz analogu aprotyniny, poza obniżeniem jego nefrotoksyczności, możliwe są dodatkowe modyfikacje analogu w miejscu wiązania proteazy. Na przykład, wykonano uprzednio (patrz H. R. Wenzel i H. Tschesche, Angew. Chem. Internat. Ed. 20, 1981, str. 295), że aprotynina (1-58, Vall5) wykazuje stosunkowo wysoką specyficzność wobec elastazy granulocytów i hamujący wpływ na kolagenazę, aprotynina (1-58, Ala15) ma słaby wpływ na elastazę, a aprotynina (1-58, Gly 15) wykazuje dużą aktywność antytrypsynową i, nieoczekiwanie hamuje także kalikreinę. Ponadto, możliwe jest także zmodyfikowanie wpływu hamującego aprotyniny, jednocześnie z obniżeniem dodatniego ładunku wypadkowego, przez, zastąpienie jednego lub więcej aminokwasów o ładunku dodatnim w miejscu wiązania proteazy aminokwasem(mi) obojętnymi lub o ładunku ujemnym.

Korzystnie także stosuje się konstrukcję DNA obejmującą sekwencję DNA kodującą analog aprotyniny o wzorze ogólnym IIR” Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro R2 Thr Gly Pro Cys R” Ri4 r” Ri6 Ri7 R³ Tyr Phe Tyr R4 Ala R⁵ Ala Gly Leu Cys R6 Thr Phe R” Tyr R”9 Gly Cys r2° r7 R⁸ r9 Asn r1° Phe R”¹ Ser Ala Glu Asp Cys Met R” 2 Thr Cys Gly Gly Ala, w którym R ” oznacza dipeptyd wybrany z grupy złożonej z Arg-Pro, Glu-Pro, Asp-Pro, Ala-Pro, Ile-Pro, Thr-Pro, His-Pro, Leu-Pro, Gly-Pro i Ser-Pro, Pro lub R” oznacza atom wodoru, R2 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Tyr, Glu, Asp, Ser, Thr, Ala i Val, R3 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Arg, Glu, Asp, Leu, Ser, Ala, Gln i Thr, R4 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złozonej z Asn, Glu i Asp, R⁵ oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Lys, Glu, Asp, Thr, Val, Ala, Ser, Phe, Gln i Gly, R6 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Gln, Glu, Asp, Val i Ala, R7 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Ala, Asp, Glu i Gly, R⁸ oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Lys, Glu, Asp, Asn, Ser, Thr i Ala, R9 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złozonej z Arg, Glu, Asp, Ser, Asn, Leu, Gly, Gln, Met i Thr, R¹° oznacza resztę aminokwasową .wybraną z grupy złożonej z Asn, Glu i Asp, R” oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Lys, Glu, Asp, Leu, Tyr, Ala, Val, Thr, Ser, Pro, His i Ile, a R” oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Arg, Glu, Asp, Gln, Ala, Asn, His, Gly, Ser i Thr, z tym, ze przynajmniej jedna z reszt aminokwasowych R” do R” jest inna niż odpowiadająca jej reszta aminokwasowa natywnej aprotyniny i że gdy R” oznacza atom wodoru, wówczas przenajmniej jedna z reszt aminokwasowych od R2 do R”2 jest inna niż odpowiadająca jej reszta aminokwasowa natywnej aprotyniny z tym wyjątkiem, że gdy R” oznacza atom wodoru, wówczas R9 ma inne znaczenie niż Ser, R.” oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Lys, Arg, Glu, Leu, Met, Tyr i Phe, R”* oznacza resztę aminokwasową wabraną z grupy złozonej z Ala i Gly, Ri5 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złozonej z Arg, Ala, Gly, Lys, Leu, Met, Phe, Tyr, Ile i As, R¹6 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Ile, Met, Leu, Phe, Thr i Glu, Ri7 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Ile, Leu, Lys, Gln, Glu, Ser, Arg, Thr i Asn, R” oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Val, Thr, Leu, Ser, Tyr, Gln, His, Pro, Phe, Asn, Ile i Lys, R” oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Gly, Thr i Ser, a R2° oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złozonej z Gly, Lys, Met, Asn, Leu, Gly, Glu, z tym, ze przynajmniej jedna z reszt aminokwasowych od R do R i przynajmniej jedna z reszt aminokwasowych od R”3 do r2° jest inna niż odpowiadająca jej reszta aminokwasowa natywnej aprotyniny i ze gdy R” oznacza atom wodoru, wówczas R” ma inne znaczenie niz Ala, R” ma znaczenie mne niż Glu, a R9 inne niż Ser i że gdy R”5 oznacza Ala, wówczas R9 ma znaczenie mne niż Ser, z wyjątkiem aprotyniny (3-58, 17Ala), aprotyniny (3-58, 17Ala+ 19Glu), aprotyniny (3-58, 15Arg+17Ala), aprotyniny (3-58, 17Ala-42Ser), aprotyniny (3-58, 17Ala + 19Glu + 42Ser), aprotyniny (3-58, 15Arg+ 17Ala + 42Ser), aprotyniny (17Ala + 4-2Ser) i aprotyniny (15Arg+ 17Ala + 42Ser).

168 250

Przykładami korzystnych stosowanych konstrukcji DNA są konstrukcje obejmujące sekwencje DNA kodujące analogu aprotyniny o wzorze ogólnym (I), w którym R¹ oznacza Glu-Pro, R⁵ oznacza Glu, R8 oznacza Glu, R oznacza Glu, a R2, R³, R⁴, R⁶, r7, R^w i R1² są takie, jak w . i · ił τ·» 1 z—, i τ» τύ 9 i ta 1 1 _ z-i i _ »> 2 naiywnej sekwencji aprotyniny, luo r oznacza Glu-Pro, r oznacza Giu, r oznacza Glu, a r ,

R³, R4, R⁶, R', R8, r1 i R12 mają takie same znaczenie jak w natywnej sekwencji aprotyniny; lub w którym R1 oznacza Glu-Pro, R⁹ oznacza Glu, R^ oznacza Glu, a R1, r2, R³, r4, r5, r6, r7, r8, ro i R12 mają takie same znaczenie jak w natywnej sekwencji aprotyniny; lub w którym R2 oznacza Ser,

R4 oznacza Asp, R5 oznacza Thr, R6 oznacza Glu, R⁸ oznacza Asn, R12 oznacza Glu, a R1, R³, R7,

R9, r1° i R11 mają takie same znaczenie jak w natywnej sekwencji aprotyniny; lub w którym R2 oznacza Ser, R oznacza Leu, R oznacza Gly, R oznacza Asn, R oznacza Gly, R oznacza Gin,

R11 jest Tyr, a R1, R4, r5, r6 i r2 mają takie same znaczenie jak w natywnej sekwencji aprotyniny;

lub w którym R1 oznacza atom wodoru, R9 oznacza Ser, R oznacza Glu, a R2, R³, r4, r5, r6, r7,

R⁸, R¹⁰ i R12 mają takie same znaczenie jak w natywnej sekwencji aprotyniny; lub w którym R1 oznacza atom wodoru, R9 oznacza Ser, R oznacza Ala, a R2, R³, r4, R⁵, r6, r7, r8, rio i r12 _mają takie same znaczenie jak w natywnej sekwencji aprotyniny; lub w którym R oznacza atom wodoru,

R oznacza Ser, R oznacza Asp, R oznacza Thr, R oznacza Glu, R oznacza Asn, R oznacza

Glu, aR³, R⁷, R9, Ri^OiRii mają takie same znaczenie jak w natywnej sekwencji aprotyniny; lub w którym R oznacza atom wodoru, R4 oznacza Asp, R⁵ oznacza Thr, R6 oznacza Glu, Ri2 oznacza

Glu,aR , R ,R ,R ,R ,R iR mają takie same znaczenie jak w natywnej sekwencji aprotyniny;

2 7 8 9 lub w którym R oznacza atom wodoru, R oznacza Ser, R oznacza Gly, R oznacza Asn, R

3 4 5 0 10 11 oznacza Gly, R oznacza Glu,’ a R , R ,R ,R ,R iR mają takie same znaczenie jak w natywnej sekwencji aprotyniny; lub w którym R oznacza atom wodoru, R9 oznacza Ser, R oznacza Glu, a

R4, R³, R6, R7' r8, rio i^Rii mają takie same znaczenie jak w natywnej sekwencji

9 12 23 aprotyniny; lub w którym R oznacza atom wodoru, R oznacza Glu, R oznacza Glu, a R , R ,

R2, R³

R4, R⁵, r6, r7, r8, r1° i Ri 1 mają takie same znaczenie jak w natywnej sekwencji aprotyniny; lub w którym R oznacza atom wodoru, R5 oznacza Glu, R9 oznacza Ser, R oznacza Glu, a R2, r3, r4, R, IR , R R i R ‘ mają takie samo znaczenie jak w natywnej sekwencji aprotyniny; lub w którym R oznacza atom wodoru, R oznacza Glu, R oznacza Glu, R oznacza Glu, a R ,R ,R ,R ,R , R8, Rio i Ri mają takie same znaczenie jak w natywnej sekwencji aprotyniny.

Sekwencje aminokwasowe analogów aprotyniny otrzymywane sposobem według wynalazku zdefiniowane· w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych, odpowiednio, 2,4,6,8,10,12,14,16, 18, 20, 22, 24, 2(61 28. Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 29 definiuje skład aminokwasowy natwynej aprotyniny.

W sposobie według wynalazku stosuje się konstrukcję DNA kodującą analogi wytwarzane sposobem według wynalazku. Sekwencje DNA kodujące te analogi aprotyniny o wyżej podanych numerach identyfikacyjnych przedstawiają sekwencje o numerach identyfikacyjnych, odpowiednio, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 i 27. Taką konstrukcję DNA można przygotować syntetycznie znanymi standardowymi sposobami, na przykład metodą fosforynoamidową, opisaną przez S. L. Beauoage i M. H. Caruthersa, Tetrahedron Letters 22, 1981, str. 1859-1869, lub metodą opisaną 'przez Matthesa i in,. EMBO Journal .3, 1984, str. 801-805 . Według metody fosforynoamidowej, syntetyzuje się oligonukleotydy, na przykład w automatycznym syntezatorze DNA, oczyszcza, łączy, liguje i klonuje w odpowiednich wektorach.

Alternatywnie, można również stosować genomowe DNA lub cDNA kodujące natywną aprotynmę (na przykład otrzymane przez przeszukiwanie biblioteki genomowej lub cDNA z użyciem syntetycznych sond oligonukleotydowych) i modyfikację w jednym lub więcej miejscach, odpowiadających miejscu(om), w których pożądane jest wprowadzenie podstawień aminokwasowych, na przykład przez ukierunkowaną mutagenezę z zastosowaniem syntetycznych oligonukleotydów kodujących pożądaną sekwencję aminokwasową do rekombinacji homologicznej, zgodnie z dobrze znanymi procedurami.

W sposobie według wynalazku wykorzystuje się także rekombinowane wektory ekspresyjne, zawierające wspomnianą poprzednio konstrukcję DNA. Zrekombinowanym wektorem ekspresyjnym może być każdy wektor, który można dogodnie poddawać procedurom rekombinacji DNA,’ a wybór wektora często zależeć będzie od komórki gospodarza, do której ma zostać wprowadzony.

168 250

A zatem, wektorem może być wektor ulegający automatycznej replikacji, to jest wektor występujący jako jednostka pozachromosomalna, której replikacja jest niezalezna od replikacji chromosomalnej, np. plazmid. Alternatywnie, wektorem może być wektor, który po wprowadzeniu do komórki gospodarza, ulega integracji z jej genomem i ulega replikacji wraz z chromosomem(ami), z którymi został zintegrowany.

Sekwencję DNA, kodującą analog aprotyniny wytwarzany sposobem według wynalazku, powinno się w wektorze połączyć w sposób umożliwiający działanie z odpowiednią sekwencją promotorową. Promotorem może być każda sekwencja DNA, która wykazuje aktywność transkrypcyjną w wybranej komórce gospodarza, a można ją otrzymać z genów kodujących białka albo homologiczne, albo heterologiczne wobec komórki gospodarza. Przykładami promotorów odpowiednich do kierowania transkrypcją DNA kodującego analog aprotyniny wytwarzany sposobem według wynalazku w komórkach ssaków są promotor SV 40(Subramiiin., Mol. CellBiol. 1,1981, str. 854-864), promotor MT-1 (genu metalotioneiny) (Palmiter i in., Science 222,1983, str. 809-814 łub główny późny promotor adenowirusa 2. Promotory odpowiednie do stosowania w komórkach gospodarzy drożdżowych obejmują promotory genów glikolotycznych drożdży (Hitzeman i in., J. Biol. Chem. 255,1980, str. 12073-12080; Alber i Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1,1982, str. 419-434) lub genów dehydrogenaz alkoholowych (Young i in., Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (red. Hollaender i in.), Plenum Press, Nowy Jork, 1982), lub promotory TPIi (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 599 331) lub ADH2-4c (Russell i in., Nature 304, 1983, str. 652-654). Promotorami odpowiednimi do stosowania w komórkach grzybów nitkowatych są np. promotor ADH3 (McKnight i in., The EMBO J. 4, ”985, str. 2093-2099) lub promotor tpiA.

Sekwencję DNA kodującą analog aprotyniny wytwarzany sposobem według wynalazku można także połączyć w sposób umożliwiający działanie z odpowiednim terminatorem, takim jak terminator genu ludzkiego hormonu wzrostu (Palmiter i in., op. cit.) lub (dla gospodarzy grzybowych) promotory TPIi (Alber i Kawasaki, op. cit.) bądź ADH3 (McKnight i in., op. cit.). Wektory mogą ponadto obejmować takie elementy, jak sygnały poliadenylacji (np. z SV 40 lub regionu 5 Elb adenowirusa), sekwencje wzmacniające transkrypcję (np. enhancer SV 40) i sekwencje wzmacniające translację (np. kodująca RNA VA adenowirusa).

Zrekombinowany wektor ekspresyjny stosowany w, sposobie według wynalazku, może ponadto zawierać sekwencję DNA umożliwiającą replikację wektora w omawianej komórce gospodarza. Przykładami takich sekwencji (gdy komórka gospodarza jest komórką ssaka) jest miejsce początku replikacji SV 40 lub (gdy komórka gospodarza jest komórką drożdżową) geny replikacji REP 1-3 i miejsce początku replikacji plazmidu 2/j. Wektor może także zawierać marker selekcyjny, np. gen, którego produkt dopełnia defekt komórki gospodarza, taki jak gen kodujący reduktazę dihydrofolianową (DHFR), bądź gen, który nadaje oporność na lek, np. neomycynę, hygromycynę lub metoteksat, lub gen TPI Schizosaccharomyces pombe (opisany przez P.R. Rusella, Gene 40, 1985, str. ”25-130.

Sposoby postępowania stosowane do ligowania sekwencji DNA kodujących odpowiednio analog aprotyniny wytwarzany sposobem według wynalazku, promotor i terminator, oraz do wbudowywania ich do odpowiednich wektorów zawierających informację konieczną do replikacji, są dobrze znane fachowcom w tej dziedzinie (patrz np. Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nowy Jork, 1989).

Komórką gospodarza, do której wprowadza się wektor ekspresyjny stosowany w sposobie według wynalazku, może być każda komórka, która jest zdolna do wytwarzania analogu aprotyniny wytwarzanego sposobem według wynalazku i jest korzystnie komórką eukariotyczną, taką jak komórka ssaka, komórka drożdżową lub grzybowa.

Organizmem drożdżowym, stosowanym jako komórka gospodarza, może być każdy organizm drożdżowy, który podczas hodowli sposobem według wynalazku wytwarza duże ilości analogu aprotyniny. Przykładami odpowiednich organizmów drożdżowych są szczepy gatunków drożdży Saccharomyces cerevisia, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe i Saccharomyces uvarum. Transformację komórek drożdży można, np. osiągnąć przez utworzenie protoplastów, a następnie transformację w sposób znany jako taki.

168 250

Przykładami odpowiednich linii komórek ssaków są linie komórkowe COS (ATCC CRL 1650), BHK (ATCC CRL 1632, ATTC CCL 10) lub CHO (ATCC CCL 61). Metody transfekcji komórek ssaków i ekspresji sekwencji DNA wprowadzonych do komórek opisano np. w publika•-_ιτλ z* · m . τ^λ·_ιτ·. ....................-. . _ _ _ . ____ cjdcn kiiuirndu i auaip. j. ινιυι. mui. uy, hi. oui-όζι, duuuicm i ncig. j. ινιυι. ^ppi^jcnci.

i, 1982, str. 327-341; Loyter i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79,1982, str. 422-426; Wigier i in., Cell 14,1978, str.725; Corsaro i Pearson, Somatic Cell Genetics 7,1981, str. 603; Graham i van der Eb, Virology 52, 1973, str. 456 i Neuman i in., EMBO J. i, 1982, str. 841-845.

Alternatywnie, jako komórki gospodarza, w sposobie według wynalazku można zastosować komórki grzybowe. Przykładami odpowiednich komórek grzybowych są komórki grzybów nitkowatych, np. Aspergillus spp. lub Neurospora spp., szczególnie szczepy Aspergillus oryzae lub Aspergillus niger. Stosowanie Aspergillus spp. do ekspresji białek opisano np. w europejskim opisie patentowym nr 272277.

Podłożem stosowanym do hodowli komórek może być każde konwencjonalne podłoże odpowiednie do hodowania komórek ssaków lub organizmów drożdżowych, w zalezności od wyboru komórek gospodarza. Analog aprotyniny będzie wydzielany przez komórki do podłoża wzrostowego i można go z niego odzyskiwać w znany sposób, włącznie z oddzielaniem komórek od podłoża przez wirowanie lub sączenie, wytrącaniem białkowych składników supernatantu lub przesączu solą, np. siarczanem amonu, oczyszczaniem różnymi technikami chromatograficznymi, np. przez chromatografię jonowymienną lub chromatografię powinowactwa, lub podobnymi.

Analogi aprotyniny, wytwarzane sposobem według wynalazku, znajdują zastosowanie do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych, zawierających analog aprotyniny wytwarzany sposobem według wynalazku wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub rozczynnikiem. W kompozycji takiej analogowi aprotyniny można nadać postać, stosując każdą ze znanych metod nadawania postaci kompozycjom farmaceutycznym, np. jak opisano w Remington's Pharmaceutical Sciences, 1985. Kompozycja może mieć zazwyczaj postać odpowiednią do ogólnoustrojowej iniekcji lub infuzji i, jako taką, można ją utworzyć wraz z jałową wodą lub izotomcznym roztworem soli lub glukozy.

Ponadto, analog aprotyniny wytwarzany sposobem według wynalazku można stosować do produkcji leku o obniżonej, w porównaniu z natywną aprotyniną, nefrotoksyczności i/lub leku, który po podaniu, wywołuje mniej przypadków reakcji anafilaktoidalnych w porównaniu ze stwierdzonymi dla natywnej aprotyniny.

Jak wspomniano poprzednio, stwierdzono, że natywna aprotynina, podawana w dawkach zbliżonych do dawek klinicznych, wykazuje szkodliwy wpływ na nerki. Wpływ ten może wynikać z niezwykle wysokiej stabilności i stosunkowo wysokiego dodatniego ładunku wypadkowego cząsteczki aprotyniny. Dlatego też analog aprotyniny wytwarzany sposobem według wynalazku wydaje się korzystny do wykorzystywania w zastosowaniach leczniczych, sugerowanych dla natywnej aprotyniny, szczególnie tych, które wymagają stosowania dużych jej dawek. Zastosowania lecznicze, dla których stosowanie analogu aprotyniny wytwarzanego sposobem według wynalazku jest wskazane dzięki hamowaniu przez nią ludzkich proteaz serynowych, np. trypsyny, plazminy, kalikreiny, elastazy i katepsyny G, obejmują (ale nie są ograniczone tylko do nich ostre zapalenie trzustki, stany zapalne, trombocytopenię, ochronę funkcji płytek krwi, ochronę narządów, gojenie ran, wstrząs (włącznie ze wstrząsem płucnym) i stany obejmujące krwotok spowodowany nadmierną fibrynolizą. Wysoka dawka aprotyniny jest wskazana podczas i po operacjach sercowopłucnych, polegających na zastosowaniu obejścia naczynia krwionośnego; dlatego, w przypadku tego zastosowania, i być może przy innych operacjach, którym towarzyszy znaczna utrata krwi, szczególnie istotna jest nizsza nefrotoksyczność analogu aprotyniny wytwarzanego sposobem według wynalazku jak i być może zmniejszone ryzyko wywołania odpowiedzi anafilaktoidalnej, dzięki niższemu dodatniemu ładunkowi, wypadkowemu analogu.

Sposób według wynalazku zilustrowano w poniższych przykładach i na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia konstruowanie syntetycznego genu aprotyniny z sekwencji oligonukleotydowych; fig. 2 - skonstruowanie plazmidu pKFN-1503; fig. 3 - wykres słupkowy, obrazujący aktywność hamującą w moczu i nerkach po podawaniu analogów aprotyniny o różnych ładunkach wypadkowych i stabilności termicznej; fig. 4 - aktywność hamującą w moczu po 3 godzinach od podawania analogów aprotyniny o różnych ładunkach wypadkowych; fig. 5 - aktywność hamującą i2

OóS 25° w moczu po 3 godzinach od podawania analogów aprotyniny o różnych stabilnościach termicznych; a fig. 6 - akumulację aktywności hamującej w nerkach po podawaniu analogów aprotyniny o różnych stabilnościach termicznych. Wskaźnik alumulacji oblicza się jako aktywność hamującą νχ/Ά τ* ««-»//!·»

11ŁW11 ^VUĆj111UV11 .......

pXXVX XXXV xj» ππνον 1ΧΧΧΧΧΧ Vxjx.| VXX 1 ^KZVXZ.iXXXX V·.

Przykład I. Wytwarzanie (Glu1, Glu26, Glu41, Glu46)-aprotyniny w szczepie drożdży KFN-1512.

Z 10 oligonukleotydów zsyntetyzowano przez ligację syntetyczny gen kodujący (Glul, Glu26, Glu41, Glu46)-aprotynmę. Oligonukleotydy zsyntetyzowano w automatycznym syntezatorze, stosując metodę fosforynoamidową, na szklanym nośniku o kontrolowanej wielkości porów (Beaucage, S. L. i Caruthers, M. H., Tetrahedron Letters 22, (1981) 1859-1869).

Zsyntetyzowano 10 następujących oligonukleotydów:

NOR-1948; CATGGCTGAGATTGGAGGAGAGAGCCTGATTTATGTTTGGAACCTC CATACACTGGTCC

NOR-1947: TTACATGGACCAGTGTATGGAGGTTCCAAACAGAAATCAGGCTCTCTCTT CTCCAATCTCTCAGC

TOR-354: ATGTAAAGCTAGAATCATCAGATACTTCTACAACG

NOR-193 9: MCGGCGTTGTAGAAGTATCTGATGATTCTAGCT

NOR-1938: CCGAAGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGTGGCT

NOR-357: CTCTGCAGCCACCGTAAACGAAAGTTTGACACAAACCAGC

NOR-194O: GCAGAGCTGAAAGAAACAACTTCGAAT

NOR-194 9: AGCAGATTCGAAGTTGTTTCTTTCAG

NOR -360: CTGCTGAAGAGTGCATGAGAACTTGTGGTGGTGCCTAAT

NOR-361: CTAGATTAGGCACCACCACAAGTTCTCATGCAGTCTTC

Z powyższych 10 oligonukleotydów utworzono 5 dupleksów A - E, jak przedstawiono na fig. 1.

pmoli każdego z dupleksów A - E utworzono z odpowiadających par oligunukleotydów o ufosforylowanych końcach 5'przez ogrzewanie w ciągu 5 minut w temperaturze 90°C, a następnie schładzanie do temperatury pokojowej przez okres 75 minut. 5 dupleksów zmieszano i traktowano ligazą DNA T4. Po elektroforezie mieszaniny ligacyjnej na 2% zelu agarozowym, syntetyczny gen wyizolowano w postaci prążka odpowiadającego długości 203 par zasad. Otrzymany syntetyczny gen przedstawiono na fig. 1.

Syntetyczny gen zligowano z fragmentem EcoRI-Ncol o długości 209 bp plazmidu pLaC212spx3 i fragmentem EcoRI-XbaI o długości 2,8 kb plazmidu pTZi9R (Mead, D.A.

168 250 13

Szczesna-Skorupa, E. i Kemper, B., Prot. Engin. 1 (1986) 67-74). Plazmid pLaC212spx3 opisano w przykładzie III międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr PCT/DK88/óX)147.

Fragment EcoRI-NcoI o długości 209 bp z plazmidu pLaC212spx3 koduje syntetyczny peptyd tiderowy drożdży.

Mieszaninę ligacyjną zastosowano do transformacji kompetentnego szczepu E. coii (f^1-, m1⁺) stosując selekcję na oporność na ampicylinę. Sekwencjonowanie DNA (Sanger, F., Micklen, S. i Coulson, A.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 ()777) 54635467) wykazało, że plazmidy z powstałych kolonii zawierały poprawną sekwencję DNA [Glul, Glu26, Glu41, Glu46]-aprotyniny.

Do dalszego stosowania wyselekcjonowano jeden plazmid, pKFN-1503.

pKFN-1503 strawiono restryktazami EcoRI i XbaI i fragment o długości 412 bp zligowano z fragmentem NcoI-XbaI o długości 9,5 kb plazmidu pMT636 i fragmentem Ncol-EcoRI o długości 1,4 kb plazmidu pMY636, w wyniku czego otrzymano plazmid pKFN-1508, patrz fig. 3. Plazmid pMT636 opisano w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr PCT/DK88/(X)138.

pMT636 jest wektorem wahadłowym E. coli - S. ^κνϋδΐ»^ zawierającym gen TPI Schizosaccharomyces pombe (POT) (Russell, P.R., Gene 40(1985) 125-130), promotor i terminator izomerazy triozofosforanowej S. crrrvisiαr, TPIp i TPIt (Alber, T. i Kawasaki, G. J. Mol. Appl. Gen. i (1982), 419-434). Plazmid pKFN-1508 zawiera następującą sekwencję:

TPIp-sekwencja sygnałowo-liderowa LaC212spx3 (1-47)Glu(ArgLeuGluLysArg [Glul, Glu26, Glu41, Glu46]-apTotyninaTPlT, gdzie sekwencja sygnałowo-liderowa LaC212spx3 jest syntetycznym liderem drożdżowym, opisanym w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym numer PCT/DK88/00147. Sekwencję DNA fragmentu EcoRI-XbaI o długości 412 bp plazmidów pKFN-1503 i pKFN-1508 przedstawiono pod numerem identyfikacyjnym i w liście sekwencji.

Szczep MT663 S. cCTmsiae (E2-7B XEll-36 a/a, tpi/tpi, pep 4-3/pep 4-3) hodowano na YPGal (1% ekstrakt drożdżowy Bacto, 2% pepton Bacto, 2% galaktoza, 1% mleczan) do O.D. 0,6 przy długości fali 600 nm.

100 ml hodowli zebrano przez wirowanie, przemyto 10 ml wody, ponownie odwirowano i zawieszono w 10 ml roztworu zawierającego 1,2 M sorbitol, 25 mM NagEDTA, pH 8,0 i 6,7 mg/ml ditiotreitolu. Zawiesinę inkubowano w temperaturze 30°C przez 15 minut, odwirowano i komórki ponownie zawieszono w 10 ml buforu zawierającego 1,2 M sorbitol, 10 mM Na2EDTA, 0,1 M cytrynian sodu, pH 8,5 i 2 mg Novozym® 234. Zawiesinę inkubowano w temperaturze 30°C przez 30 minut, komórki zebrano przez wirowanie, przemyto Wml 1,2M sorbitolu i 10ml CAS(1,2M sorbitol, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris HCl (Tris = Tris(hydroksymetylo)aminometan), pH 7,5) i ponownie zawieszono w 2 ml CAS. Do transformacji, 0,1 ml komórek ponownie zawieszonych w CAS zmieszano z około 1 fig plazmidu pKFN-1508 i pozostawiono w temperaturze pokojowej na 15 minut. Dodano 1 ml roztworu zawierającego 20% glikol polietylenowy 4000, 20 mM CaCl2, 10 mM CaCb, 10 mM Tris HCl, pH 7,5) i mieszaninę pozostawiono na dalszych 30 minut w temperaturze pokojowej. Mieszaninę odwirowano i osad ponownie zawieszono w 0,1 ml SOS (1,2 M sorbitol, 33%, v/v YPD, 6,7 mM CaCle), 14pg/ml leucyny) i inkubowano w temperaturze 30°C przez 2 godziny. Zawiesinę następnie odwirowano i osad ponownie zawieszono w 0,5 ml 1,2 M sorbitolu. Następnie dodano w temperaturze 52°C 6 ml agaru powierzchniowego (Podłoże SC według Shermana i in., (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)), zawierające 1,2 M soTbitol plus 2,5% agar) i zawiesinę wylano na powierzchnię płytek zawierających takie samo, zestalone agarem, podłoże zawierające soTbitol.

Stransformowane kolonie przeszczepiono po trzech dniach w temperaturze 30°C, ponownie wyizolowano i użyto do założenia hodowli płynnych. Jeden taki transformant, KFN-1512, wybrano do dalszej charakterystyki.

Szczep drożdżowy KFN-1512 hodowano na podłożu YPD (1% ekstrakt drożdżowy, 2% pepton (Difco Laboratories) 6% glukoza). 200 ml hodowli szczepu wytrząsano przy 250 obrotach na minutę w temperaturze 30°C w ciągu 3 dni, do osiągnięcia O.D. około 20 przy długości fali 600 nm. Po odwirowaniu supernatant analizowano przez chromatografię jonowymienną FPLC. Supernatant drożdżowy. przesączono przez jednostkę filtrującą Millex GV o średnicy porów 0,22pm, i 1ml naniesiono na kolumnę kationowymienną .MonoS (0,5X5 cm) zrównoważoną 20 mM kwasem mrówkowym, pH 3,7. Po przepłukaniu buforem do równoważenia, kolumnę eluowano liniowym gradientem NaCl (0,1 M) w buforze do równoważenia. W wyeluowanych

168 250 frakcjach oznaczano spektrofotometrycznie aktywność inhibitora trypsyny (Kassel, B., Methods Enzymol. 19 (1970), 844-852), a ponadto inegrowano absorpcję przy długości fali 280 nm na podstawie współczynnika.

e” 280 (aprotynina) = 8,3

W celu otrzymania materiału do badań toksykologicznych, szczep drozdżowy KFN-1512 hodowano na duzą skalę. Analog aprotyniny oczyszczono przez połączenie chromatografii jonowymiennej i HPLC z odwróconymi fazami.

Przykład II. Wytwarzanie (Glul, Glu42, Glu46)-aprotyniny w szczepie drożdży KFN-1514.

Z 10 oligonukleotydów zsyntetyzowano przez ligację syntetyczny gen kodujący (Glu 1, Glu42, Glu46)-aprotyninę, jak to opisano w przykładzie I.

Plazmid pKFN-1505, otrzymany z plazmidu pTZ19R, zawierający syntetyczny gen połączony w ramce odczytu z syntetycznym drożdżowym peptydem liderowym, skonstruowano jak opisano w przykładzie I.

Postępując jak w przykładzie I, otrzymano drożdżowy plazmid ekspresyjny pKFN-1510, zawierający następującą konstrukcję: TPIp - sekwencja sygnałowo-liderowa LaC212spx3 (1-47) -GluArgLeuGluLysArg (Glul, Glu42, Glu46)-aprotynina - TPIt.

Sekwencję DNA fragmentu EcoRI-XbaI o długości 412 bp plazmidów pKFN-1505 i pKFN1510 podano pod numerem identyfikacyjnym 3 w liście sekwencji.

Plazmidem pKFN-1510 stransformowano, jak opisano powyżej, szczep drożdżowy MT663, otrzymując szczep drożdżowy KFN-1514.

Hodowlę stransformowanego szczepu KFN-1514 w podłożu YPD, analizę ilości (Glul, Glu42, Glu46)-aprotyniny w supernatancie i wytworzenie materiału do badań toksykologicznych przeprowadzono jak opisano wyżej.

Przykład III. Wytwarzanie (Glu42, Glu46)-aprotyniny w szczepie drożdży KFN-1544.

Fragment AvaII-XbaI o długości 144 bp, kodujący (Glu42, Glu46)-aprotyninę (12-58) z pKFN-1505 użyto do zastąpienia odpowiadającego fragmentu DNA kodującego aprotyninę (12-58) plazmidu pKFN-1000, w wyniku otrzymując plazmid pKFN-1528. Plazmid pKFN-1°0° opisano w przykładzie IV międzynarodowego zgłoszenia patentowego, publikacja nr WO 90/10075.

Postępując jak w przykładzie I, otrzymano drozdżowy plazmid ekspresyjny pKFN-154i, zawierający następującą konstrukcję: TPIp - sekwencja sygnałowo-liderowa LaC212spx3 (1-47) -GluArgLeuGluLysArg (Glu42, Glu46)-aprotynina - TPIt.

Sekwencję DNA fragmentu EcoRI-XbaI o długości 412 bp plazmidów pKFN-1528 i pKFN-1541 podano w liście sekwencji pod numerem identyfikacyjnym.

Plazmidem pKFN-1541 stransformowano, jak opisano wyżej, szczep drożdżowy MT663, otrzymując szczep drożdżowy KFN-1544.

Hodowlę stransformowanego szczepu KFN-1514 w podłożu YPD, analizę ilości (Glu42, Glu46)-aprotyniny w supernatancie i wytworzenie materiału do badań toksykologicznych przeprowadzono jak opisano wyżej.

Przykład IV. Wytwarzanie (SerlO, Asp24, Thr26, Glu31, Asn41, Glu53)-aprotyniny w szczepie drożdży KFN-1545.

Z 10 oligonukleotydów przez ligację skonstruowano syntetyczny gen kodujący (Serii, Asp24, Thr26, Glu31, Asn41, Glu53)-aprotyninę, jak opisano w przykładzie I.

Plazmid pKFN-1530, otrzymany z plazmidu pTZ19R, zawierający syntetyczny gen połączony w ramce odczytu z sekwencją syntetycznego drozdzowego peptydu liderowego, skonstruowano jak opisano w przykładzie I.

Postępując jak w przykładzie I, otrzymano drożdżowy plazmid ekspresyjny pKFN-1532, zawierający następującą konstrukcję: TPIp - sekwencja sygnałowo-liderowa LaC212spx3 (1-47) -GluArgLeuGluLysArg (Seri0, Asp24, Thr26, Głu31, Asn41, Glu53)-aprotynina - TPIt.

Sekwencję DNA fragmentu EcoRI-XbaI o długości 412 bp plazmidów pKFN-1530 i pKFN1532 podano w liście sekwencji pod numerem identyfikacyjnym 7.

Plazmidem pKFN-1532 stransformowano, jak opisano wyżej, szczep drozdżowy MT663, otrzymując szczep drożdżowy KFN-1545.

168 250

Hodowlę stransformowanego szczepu KFN-1545 w podłożu YPD, analizę ilości (Ser 10, Asp24, Thr26, Glu31, Asn41, Glu53)-aprotyniny w supernatancie i wytworzenie materiału do badań toksykologicznych przeprowadzono jak opisano wyżej.

P r ν V ł ** H Wytwwrąnie T «miOO ΓΊΚ/ΛΠ Acrt/ll ClnAA Tvr4A\_or>r/-\4-A7r»ir»*r W

X i £- J 1 U M » . 1 I J V TIUl ^kk.kkk^/ X V J XVVW4.V , »-_· kj r\Z J 1 ΧΜΧΧ-Τ X , »n5 Ty X J Χ^ V» f Upl \J\.J kkkkkj »» szczepie drożdży KFN-1547.

Z 10 oligonukleotydów zsyntety.zowano przez ligację syntetyczny gen kodujący (SerlO, Leu20, Gly40, Asp41, Gln44, Tyr46)-aprotyninę, jak opisano w przykładzie I.

Plazmid pKFN-1534, otrzymany z plazmidu pTZ19R, zawierający syntetyczny gen połączony w ramce odczytu z sekwencją syntetycznego drożdżowego peptydu liderowego, skonstruowano jak opisano w przykładzie I.

Stosując procedurę z przykładu I, otrzymano drozdżowy plazmid ekspresyjny pKFN-1537, zawierający następującą konstrukcję: TPIp - sekwencja sygnałowo-liderowa LaC212spx3 (1-47) -GluArgLeuGluLysArg (SerlO, Leu20, Gly40, Asn41, Gln44, Tyr46)-aprotynina - TPIt.

Sekwencję DNA fragmentu EcoRI-XbaI o długości 412 bp plazmidów pKFN-1530 i pKFN1537 podano w liście sekwencji pod numerem identyfikacyjnym 9.

Plazmidem pKFN-1537 stransformowano, jak opisano wyżej, szczep drożdżowy MT663, otrzymując szczep drożdżowy KFN-1547.

Hodowlę stransformowanego szczepu KFN-1547 w podłożu YPD, analizę ilości (SerlO, Leu20, Glu40, Asn41, Gln44, Tyr46)-aprotyninę w supernatancie i wytworzenie materiału do badań toksykologicznych przeprowadzono jak opisano wyżej.

Przykład VI. Wytwarzanie dez-Argl, dez-Pro2-(Ser42, Glu46)-aprotyniny w szczepie drożdży KFN-1660.

Dwa fragmenty plazmidu pKFN-306: fragment Ahall-Styl o długości 1,4 kb i fragment Ahall-Sall o długości 1,8 kb, zligowano z dupleksem złożonym z dwóch następujących syntetycznych oligonukleotydów:

NOR-2188: 5' CAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGTGGCTGCAGAGCTAAGTCCAACAACTTCGAATCTGCTGAAGACTGCATGAGAACTTGTGGTGGTGCCTAATCTAGAG 3'

NOR-2189: 5^J TCGACTCTAGATTAGGCACCACCACAAGTTCTCATGCAGTCTTCAGCAGATTCGAAGTTGTTGGACTTAGCTCTGCAGCCACCGTAAACGAAAGTTTGACACAAACCAGC 3'

Plazmid pKFN-306 jest plazmidem otrzymanym z pTZ19R z wstawką EcoRI-XbaI o długości 502 bp, zawierającą gen peptydu sygnałowo-liderowego czynnika koniugacyjnego alfa i Saccharomyces cerevisiae połączony w ramce odczytu z syntetycznym genem dez-Argl, dez-Pro2-[Ser42]aprotyniny. Konstruowanie plazmidu pKFN-306 opisano w opisie patentowym nr WO 89/01968.

Mieszaninę ligacyjną zastosowano do transformacji kompetentnego szczepu E. coli (r“, m ). stosując selekcję na oporność na ampicylinę. Sekwencjonowanie DNA (Sanger, F., Mieklen, S. i Coulsen, A.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) 5463-5467) wykazało, że plazmidy z powstałych kolonii zawierały poprawną sekwencję DNA dez-Argl, Pro2-[Ser42, Glu46]-aprotyniny.

Do dalszego stosowania wyselekcjonowano jeden plazmid, pKFN-1629.

Stosując procedurę z przykładu I, otrzymano drożdżowy plazmid ekspresyjny pKFN-1656, zawierający następującą konstrukcję: TPI_p - sekwencja sygnałowo-liderowa MFal (1-85) - dezArgl, dez-Pro2-[Ser42, Glu46]-aprotynina - TPIt16

168 250

Sekwencję DNA fragmentu EcoRI-XbaI o długości 502 bp plazmidów pKFN-1629 i pKFN1656 podano w IIścIj sekwencji pod numerem identyfikacyjnym 11.

Plazmidem pKFN-1656 stransformowano, jak opisano wyżej, szczep drożdżowy MT663, m n z, y m u.j(£V μαμ^μζ,μ™ j oLd-jo

Hodowlę stransformowanego szczepu KFN-1660 w podłożu YPD, analizę ilości dez-Arg1, dJz-Pro2-(SJr42, Glu46)-aprotyniny w supernatancie i wytworzenie materiału do badań toksykologicznych przeprowadzono jak opisano wyżej.

Przykład VII. Wytwarzanie dez-Arg1, dez-Pro2-(Ser42, Ala46)-^iiprotyniny w szczepie drożdży KFN-1661.

Dwa fragmenty plazmidu pKFN-306: fragment AhaII-StyI o długości 1,4kb i fragment AhaII-SalI o długości 1,8 kb, zligowano z dupleksem złożonym z dwóch następujących syntetycznych oligonukleotydów:

NOR-2196: 5' CAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGTGGCTGCA<GAGCTAAGTCCAACCAkCTTCGCTTCTGCTGAAGACTGCATGAGiAACTTGTGGTGGTGCCTAATCTAGAG 3'

NOR-2197: 5' TCGACTCTAGATTAGGCACCACCACCAAGTTCTCATGCAGTCTTCAGCAGAAGCG2AAGTTGTTGGACTTAGCTCTGCAGCCACCGTAAACG2AAAGTTTGACACAAACCAGC 3'

Plazmid pKFN-306 jest plazmidem otrzymanym z pTZ19R ze wstawką EcoRI-XbaI o długości 502 bp, zawierającą gen peptydu sygnałowo-liderowego czynnika koniugacyjnego alfa i Saccharomyces cerJvisiaJ połączony w ramce odczytu z syntetycznym genem dez-Argł, dez-Pro2[Ser42j-aprotvn.iny. Konstruowanie plazmidu pKFN-306 opisano w opisie patentowym nr WO 89/01968.

Mieszaninę ligacyjną zastosowano do transformacji kompetentnego szczepu E. coli (r , m+) stosując selekcję na oporność na ampicylinę. Sekwencjonowanie DNA (Sanger, F., Micklen, S. i Coulsen, A.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) 5463-5467) wykazało, że plazmidy z powstałych kolonii zawierały poprawną sekwencję DNA dez-Argl, dJz-Pto2-[SJt42, Glu46]-aprotyniny.

Do dalszego stosowania wyselekcjonowano jeden plazmid, pKFN-1631.

Stosując procedurę z przykładu I, otrzymano drożdżowy plazmid ekspresyjny pKFN-1657, zawierający następującą konstrukcję: TPIp - sekwencja sygnałowo-liderowa MFal (1-85) - dezArgl, dez-Pro2-[Ser42, Glu46]-aprotynina - TPIt.

Sekwencję DNA fragmentu EcoRI-XbaI o długości 502 bp plazmidów pKFN-1631 i pKFN1657 podano pod numerem identyfikacyjnym 13 w liście sekwencji.

Plazmidem pKFN-1657 stransformowano, jak opisano wyżej, szczep drożdżowy MT663, otrzymując szczep drożdżowy KFN-1661.

Hodowlę stransformowanego szczepu KFN-1661 w podłożu YPD, analizę ilości dez-Argl, dJz-Pro2-(Ser42, Ala46)-aprotyniny w sιŁpernatanciJ i wytworzenie materiału do badań toksykologicznych przeprowadzono jak opisano wyżej.

Przy kład VIII. Wytwarzanie dez-Argl, dez-Pro2-(SerlO, Asp24, Thrl6, Glu31, Asn41, Glu53)-aptotyniny w szczepie drożdży KFN-1735.

Z 10 oligonukleotydów przez ligację skonstruowano syntetyczny gen kodujący dez-Argl, dJz-Pro2-(Ser10, Asp24, Thr26, Glu31, Asn41, Glu53)-aprotyninę, jak opisano w przykładzie I.

Plazmid pKFN-1707, otrzymany z plazmidu pTZ19R, zawierający syntetyczny gen połączony w ramce odczytu z syntetycznym drożdzowym peptydem liderowym, skonstruowano jak opisano w przykładzie I.

Postępując jak w przykładzie I, otrzymano drożdżowy plazmid ekspresyjny pKFN-1709, zawierający następującą konstrukcję: TPIp - sekwencja sygnałowo-liderowa LaC212sp-3 (1-47) -GluArgLeuGluLysArg-dez-Argl, dJz-Pro2-(Ser10, Asp24, Thr26, Glu31, Asn41, Glu53)aprotynina - TPIt.

168 250 17

Sekwencję DNA fragmentu EcoRI-XbaI o długości 406 bp plazmidów pKFN-1707 i pKFN-1709 podano w liście sekwencji pod numerem identyfikacyjnym 15.

Plazmidem pKFN-1709 stransformowano, jak opisano wyżej, szczep drozdżowy MT663, ot_______: o_____j ______ΤΧΤΓΑΤ n-łc

ULizyiiiuj^c £>zcz,cp uiuzuzuw) 1^-1 uj.

Hodowlę stransformowanego szczepu KFN-1735 w podłożu YPD, analizę ilości dez-Argl, dez-Pro2-(Ser10, Asp24, Thr26, Glu31, Asn41, Glu53)-aprotyniny w supernatancie i wytworzenie materiału do badań toksykologicznych przeprowadzono jak opisano wyżej.

Przykład IX. Wytwarzanie dez-Arg 1, dez-Pro2-(Asp24, Thr26, Glu31, Glu53)-aprotyniny w szczepie drożdży KFN-1737.

Dwa fragmenty pKFN-306: fragment AhaII-XbaI o długości 1,8 kb i fragment Ahall-Avall o długości 1,4 kb (patrz przykład V) zligowano z syntetycznym fragmentem Avall-Xbal o długości 141 bp, kodującym (Asp24, Thr26, Glu31, Glu53)-aprotymnę.

Powstałym plazmidem, otrzymanym z plazmidu pTZ19R, był pKFN-1711.

Postępując jak w przykładzie I, otrzymano drożdżowy plazmid ekspresyjny pKFN-1713, zawierający następującą konstrukcję: TPIp - sekwencja sygnałowo-liderowa MF al (1-85) - dezArgl, dez-Pro2-(Asp24, Thr26, Glu31, Glu53)-aprotynina - TPIt.

Sekwencję DNA fragmentu EcoRI-XbaI o długości 502 bp plazmidów pKFN-1711 i pKFN-1713 podano w liście sekwencji pod numerem identyfikacyjnym 17.

Plazmidem pKFN-1713 stransformowano, jak opisano wyżej, szczep drożdżowy MT663, otrzymując szczep drozdżowy KFN-1737.

Hodowlę stransformowanego szczepu KFN-1737 w podłożu YPD, analizę ilości dez-Argl, dez-Pro2-(Asp24, Thr26, Glu31, Glu53)-aprotyniny w supernatancie i wytworzenie materiału do badań toksykologicznych przeprowadzono jak opisano wyżej.

Przykład X. Wytwarzanie dez-Argl, dez-Pro2-(Ser10, Gly40, Asp41, Gly42, Glu53)aprotyniny w szczepie drożdży KFN-1739.

Z 1° oligonukleotydów przez ligację skonstruowano syntetyczny gen kodujący dez-Argl, dez-Pro2-(Seri°, Gly40, Asn41, Gly42, Glu53)-aprotyninę, jak opisano w przykładzie I.

Plazmid pKFN-1751, otrzymany z plazmidu pTZ 19R, zawierający syntetyczny gen połączony w ramce odczytu z syntetycznym drożdżowym peptydem liderowym, skonstruowano jak opisano w przykładzie I.

Postępując jak w przykładzie I, otrzymano drożdżowy plazmid ekspresyjny pKFN-1718, zawierający następującą konstrukcję: TPIp - sekwencja sygnałowo-liderowa LaC212spx3 (1-47) -GluArgLeuGluLysArg - dez-Argl, dez-Pro2-(Scri0, Leu20, Gly40, Asp41, Gly42, Glu53)aprotynina - TPIt.

Sekwencję DNA fragmentu EcoRI-XbaI o długości 406 bp plazmidów pKFN-1715 i pKFN-1718 podano w liście sekwencji pod numerem identyfikacyjnym 19.

Plazmidem pKFN-1718 stransformowano, jak opisano wyżej, szczep drożdżowy MT663, otrzymując szczep drożdżowy KFN-1739.

Hodowlę stransformowanego szczepu KFN-1739 w podłożu YPD, analizę ilości dez-Argl, Pro2-(Seri°, Gly4°, Asn41, Gly42, Glu53)-aprotyniny w supernatancie i wytworzenie materiału do badań toksykologicznych przeprowadzono jak opisano wyżej.

Przykład XI. Wytwarzanie dez-Argl, dez-Pro2-(Ser42, Glu53)-aprotyniny w szczepie drożdży KFN-1742.

Dwa fragmenty plazmidu pKFN-306: AhaII-XbaI o długości 1,8 kb i fragment AhaII-AvaII o długości 1,4 kb (patrz przykład V) zligowano z syntetycznym fragmentem AvaII-XbaI o długości 141 bp, kodującym (Ser42, Glu53)-aprotyninę.

Powstałym plazmidem otrzymanym z plazmidu pTZ19R był pKFN-1721.

Postępując jak w przykładzie I, otrzymano drożdżowy plazmid ekspresyjny pKFN-1724, zawierający następującą konstrukcję: TPIp - sekwencja sygnałowo-liderowa MFal (1-85) - dez-Argl, dez-Pro2-(Ser42, Glu53)-aprotynina - TPIt.

Sekwencję DNA fragmentu EcoRI-XbaI o długości 502 bp plazmidów pKFN-1721 i pKFN-1724 podano w liście sekwencji pod numerem identyfikacyjnym 21.

Plazmidem pKFN-1724 stransformowano, jak opisano wyżej, szczep drożdżowy MT663, otrzymując szczep drożdżowy KFN-1742.

168 250

Hodowlę stransformowanego szczepu KFN-1742 w podłożu YPD, analizę ilości dez-Argl, dez-Pro2-(Ser42, Glu53)-aprotynmy w supernatancie i wytworzenie materiału do badań toksykologicznych przeprowadzono jak opisano wyżej.

Przykład XII. Wytwarzanie dez-Argl, dez-Pro2-(Glu42, Glu53)-aprotymny w szczepie drożdży KFN-1752. ' - - - Dwa fragmenty plazmidu pKFN-306: fragment AgaII-XbaI o długości 1,8 kb i fragment AhaII-AvaII o długości 1,4 kb (patrz przykład V) zligowano z syntetycznym fragmentem AvaII-Xbal o długości 141 bp, kodującym (Glu42, Glu53)-aptotyrlrę.

Powstałym plazmidem otrzymanym z plazmidu pTZ19R był pKFN-1762.

Postępując jak w przykładzie I. otrzymano drożdżowy plazmid ekspresyjny pKFN-1765, zawierający następującą konstrukcję: TPIp - sekwencja sygnałowo-liderowa MFα1 (1-85) - dez-Argl, dez-Pro2-(Ser42, Glu53)-aprotynina - TPIt.

Sekwencję DNA fragmentu EcoRI-XbaI o długości 502 bp plazmidów pKFN-1762 i pKFN-1765 podano w liście sekwencji pod numerem identyfikacyjnym 23.

Plazmidem pKFN-1765 stransformowano, jak opisano wyżej, szczep drozdżowy MT663, otrzymując szczep drożdżowy KFN-1752.

Hodowlę stransformowanego szczepu KFN-1574 w podłożu YPD, analizę ilości dez-Argl, dez-Pro2-(Ser42, Glu53)-aprotyniny w supernatancie i wytworzenie materiału do badań toksykologicznych przeprowadzono jak opisano wyżej.

Przykład XIII. Wytwarzanie dez-Argl, dez-Pro2-(Glu26, Ser42, Glu53)-aprotyniny w szczepie drożdży KFN-1755.

Dwa fragmenty plazmidu pKFN-306: AhaII-XbaI o długości 1,8 kb i fragment AhaII-AvaII o długości 1,4 kb (patrz przykład V) zligowano z syntetycznym fragmentem AvaII-XbaI o długości 141 bp, kodującym (Glu26, Ser42, Giu53)-aprotymnę.

Powstałym plazmidem otrzymanym z plazmidu pTZ19R był pKFN-1768.

Postępując jak w przykładzie I, otrzymano drożdżowy plazmid ekspresyjny pKFN-1770, zawierający następującą konstrukcję: TPIp - sekwencja sygnałowo-liderowa MFα1 (1-85) - dezArgl, dez-Pro2-(Glu26, Ser42, Glu53)-aprotynma - TPIt.

Sekwencję DNA fragmentu EcoRI-XbaI o długości 502 bp plazmidów pKFN-1768 o pKFN-1770 podano w liście sekwencji pod numerem identyfikacyjnym 25.

Plazmidem pKFN-1770 stransformowano, jak opisano wyżej, szczep drożdżowy MT663, otrzymując szczep drożdżowy KFN-1755.

Hodowlę stransformowanego szczepu KFN-1755 w podłożu YPD, analizę ilości dez-Argl, dez-Pro2-(Glu26, Ser42, Glu53)-aprotymny w supernatancie i wytworzenie materiału do badań toksykologicznych przeprowadzono jak opisano wyżej.

Przykład XIV. Wytwarzanie dez-Argl, dez-Pro2-(Glu26, Glu42, Glu53)-aprotyniny w szczepie drożdży KFN-1756.

Dwa fragmenty plazmidu pKFN-306: fragment AhaII-XbaI o długości 1,8kb i fragment AhaII-AvaII o długości 1,4 kb (patrz przykład V) zligowano z syntetycznym fragmentem AvaII-Xbal o długości 141 bp, kodującym (Glu26, Ser42, Glu53)-aprotyninę.

Powstałym plazmidem otrzymanym z plazmidu pTZ19R był pKFN-1771.

Postępując jak w przykładzie I, otrzymano drożdżowy plazmid ekspresyjny pKFN-1773, zawierający następującą konstrukcję: TPIp - sekwencja sygnałowo-liderowa MF α1 (1-85) - dez-Argl, dez-Pro2-(Glu26, Glu42, Glu53)-aprotynma - TPIt.

Sekwencję DNA fragmentu EcoRI-XbaI o długości 502 bp plazmidów pKFN-1771 i pKFN-1773 podano w liście sekwencji pod numerem identyfikacyjnym 27.

Plazmidem pKFN-1773 stransformowano, jak opisano wyżej, szczep drożdżowy MT663, otrzymując szczep drożdżowy KFN-1756.

Hodowlę stransformowanego szczepu KFN-1756 w podłożu YPD, analizę ilości dez-Argl, dez-Pro2-(Glu26, Ser42, Glu53)-aprotyniny w supematancie i wytworzenie materiału do badań toksykologicznych przeprowadzono jak opisano wyżej.

Przykład XV. Badania toksykologiczne analogów aprotyniny przy dożylnym podawaniu pojedynczej dawki szczurom Wistar.

Materiał.

168 250

Do badań toksykologicznych wybrano następujące analogi aprotyniny o obniżonym w porównaniu z rekombinowaną aprotyniną (1-58) dodatnim ładunku wypadkowym i stabilnością termiczną: KFN-1512, KFN-1514, KFN-1545, KFN-1547, KFN-1660, KFN-1661. Ich główne z toksylogicznegu punktu widzenia, cechy charakteiystyczne, pizedstawiono w tabeli 1. Dla porównania przedstawiono dane dla rekombinowanej aprotyniny. Jako wskaźnik stabilności bilogicznej przedstawiono temperaturę - denaturacji.

Tabela i Informacje ogólne

Typ KFN	Długość łańcucha	Ładunek wypadkowy	Temperatura denaturacji, °C
rAprotynma	1-58	+ 6	>100
1512	1-58	-2	87
1514	1-58	0	88
1544	1-58	+ 2	98
1545	1-58	0	93
1547	1-58	+ 2	86
1660	3-58	+ 2	77
1661	3-58	+ 3	79
1735	3-58	-1	68
1737	3-58	0	70
1739	3-58	+ 1	81
1742	3-58	+ 2	71
1752	3-58	+ 1
1755	3-58	0	68
1756	3-58	-1	70

Protokół badań.

Pierwszego dnia badań każdego analogu, grupy 2 samców i 2 samic szczurów otrzymywały 33, 100,300 lub 900 mg analogu/kg wagi ciała. Dwie podobnie utworzone grupy kontrolne otrzymały sól fizjologiczną lub sól fizjologiczną zakwaszoną kwasem solnym do pH około 4,5. Ten drugi roztwór służył jako podłoże. Objętość dawki wynosiła we wszystkich przypadkach 10 ml/kg wagi ciała. Szczury obserwowano przez 7 dni i zabijano ósmego dnia. Podczas sekcji ważono nerki i przygotowywano je do badań histopatologicznych. Obserwowane zmienne przedstawiono w nagłówku tabeli 2.

Wyniki.

Wyniki poszczególnych badań podsumowano w tabeli 2. Dla porównania włączono dane dla rekombinowanej aprotyniny (dawka: 11-300 mg/kg), KFN-1512 nie można było rozpuścić w stężeniu wymaganym do podawania najwyższej dawki (900 mg/kg). Jedno zwierzę padło przy dawce 900 mg KF'N-1545/kg. Poza tym nie obserwowano przypadków śmiertelnych.

Po podaniu KFN-1512, KFN-1544, KFN-1545 i KFN-1660 (300 mg/kg wagi ciała) nie obserwowano żadnych zmian histopatologicznych w nerkach. Ponadto, żadnych histopatologicznych zmian w nerkach nie obserwowano po podaniu 900 mg/kg wagi ciała KFN-1514, KFN-1547 i KFN-1661. A zatem, poziom braku wpływów toksycznych dla wszystkich analogów wynosił 300 mg/kg lub więcej, w porównaniu z 11 mg/kg dla aprotyniny. Odnośnie innych obserwowanych zmiennych, analogi były równe lub przewyższały aprotyninę.

068 25°

Tabela 2

Poziomy braku wpływów toksycznych obserwowanych zmiennych, mg/kg

Typ KFN
J	Śmiertelność	Obserwacje makroskopowe	Obserwacje mikroskopowe	Waga ciała Dzień 8	Waga nerek Dzień 8
0-30 min po dawce	2h po dawce	dzienne
rApro-
tymna12	33	300	300	300	33	U	100	100
1512’	33	300	300	300	300	300	300	300
1514	900	900	900	900	900	900	900	900
1544	33	100	100	900	300	300	900	300
1545	33	900	300	300	300	300	300	300
1547	33	300	900	900	900	900	900	900
1660	300	900	900	900	900	900	900	900
166’	100	900	900	900	300	900	900	900

^{1 2} Dawka naiwyzsza = 300 mg/kg ² Dawka najmzsza= 11 mg/kg

Wnioski.

Profil toksyczności analogów, oszacowany w badaniach szczurów Wistar z zastosowaniem pojedynczej dawki podanej ulegał w różnym stopniu poprawie w porównaniu z profilem toksyczności aprotyniny. Wszystkie analogi aprotyniny wykazywały poziom bez wpływu nefrotoksycznego równy 300 mg/kg lub więcej. Poziom bez wpływu toksycznego dla KFN-1514 wynosił 900 mg/kg i był równy najwyzszej dawce.

Przykład XVI. Eliminacja i rozmieszczenie rekombinowanej aprotyniny i analogów aprotyniny.

Materiały.

Rekombinowaną autentyczną aprotyninę oraz analogi przygotowane według przykładów I-VII rozpuszczano w 0,9% NaCl, w celu uzyskania objętości dawki równej 1 ^l/g wagi szczura. Stężenia roztworów do iniekcji aprawdzano analizując zgodnie z metodami podanymi w części „Metody“.

Metody.

Stosowano samice szczurów Wistar o wadze 200-300 g. Aprotyninę i jej analogi badano, stosując dwa różne modele: ’/ szczury usypiane i 2/ szczury meusypiane.

Szczury usypiane.

Szczury usypiane przez dootrzewnową iniekcję pentobarbitalu sodu. Tętnicę szyjną i żyłę szyjną odsłonięto i cewnikowano polietylenowymi cewkami (PE-50, lntramedic). Cewnik tętnicy szyjnej łączono z perfuzorem (B. Braun) w celu infuzji 3,8 ml 0,9% NaCl/h i z miernikiem ciśnienia krwi. Zmiany ciśnienia krwi rejestrowano stosując rejestrator BD9 (Kipp & Zonen). Analogi podawano w postaci iniekcji przez cewnik żyły szyjnej w ciągu 15 sekund.

- Z cewnika tętnicy szyjnej pobierano próbki krwi po 3, 10, 20, 40 i 60 minutach po podaniu. Próbki (0,45 ml) zbierano w 3 ml próbkach zawierających 50 μΐ 0,13 M cytrynianu sodowego i wirowano. Osocze przechowywano do chwili analizy w temperaturze -20°C. 60 minut po podaniu szczury zabijano nadmierną dawką pentobarbitalu sodu, a nerki i wątrobę usuwano, ważono i przechowywano w temperaturze -80°C.

Szczury nieusypiane.

Przed podawaniem analogów podawano doustną dawkę 2 ml H 2O destylowanej. Analogi podawano dożylnie jako iniekcje do żyły ogonowej stosując dożylny ceownik (Venflon 22 G, Viggo-Spectramet, Helsingborg, Szwecja). Po podaniu cewnik przepłukiwano 0,5 ml 0,9%. NaCl 1 usuwano. W celu uniknięcia krwawienia z ogona na miejsce iniekcji stosowano plaster.

W celu zebrania wytworzonego moczu, szczura umieszczano następnie w klatce do badań metabolicznych. Po 3 godzinach szczura zabijano przez podanie do klatki CO 2/O 2 (9/1), a nerki i wątrobę usuwano i do chwili analizy przechowywano w temperaturze -80°C. Podczas podawania CO 2 szczur opróżniał pęcherz moczowy 1, po usunięciu zwierzęcia, klatkę przemywano 0,9% NaCl w celu otrzymania całkowitej objętości moczu-NaCl równej 25 ml.

Przygotowywanie homogenatów.

Jedną nerkę (około 1 g) i około 2 g tkanki wątroby umieszczano w oddzielnych 10 ml plastikowych probówkach i dodawano 2 ml 0,9% NaCl. Tkanki homogenizowano 5 minut stosując High

168 250

Intensity Ultrasonic Processor (Model VC50, Solics & Materials Inc. Danbury CT, USA). Homogenaty nerki i wątroby rozcieńczano solą fizjologiczną w celu otrzymania całkowitej objętości, odpowiednio, 10-25 i 4 ml.

A Λat i τ n η li τ-ττ r*XVLVZVi.j UUailLy .

Stężenia aprotyniny i analogów w osoczach, homogenatach wątroby i roztworach do iniekcji mierzono fotometrycznie na Cobas Fara II (Roche). W skrócie, osocza, homogenaty i roztwory do iniekcji wytrącono kwasem w celu usunięcia innych od aprotyniny inhibitorów kalikreiny. Aktywność hamującą kalikreinę w próbce mierzono stosując kalikreinę z trzustki świni (Sigma K 3627)i chromogenny substrat S2266 (Kabi). Stężenia homogenatach nerki i w moczu mierzono tą samą metodą, z wyjątkiem pominięcia etapu wytrącania, ponieważ endogenna aktywność hamująca kalikreinę w rozcieńczonych homogenatach i moczu była nieistotana. Dla każdego analogu w każdym podłożu stosowano oddzielną krzywą wzorcową.

Protokół badań.

Badano 14 grup szczurów usypianych i 14 grup szczurów nie usypianych, każdemu szczurowi podawano dawkę i,56pmoli (około lOmg) aprotyniny lub analogu aprotyniny na kg wagi ciała. Podatawowe dane o 28 grupach podano w tabeli 3.

Tabela 3

Grupy	n	WC	WN	WW
rAprotymna U	5	251,8	0,98	9,9
KFN 1512 U	4	230,0	0,84	9,6
KFN 1514 U	4	220,5	0,85	8,6
KFN 1544 U	4	226,0	0,97	9,3
KFN 1545 U	4	224,8	0,92	9,2
KFN 1547 U	4	229,0	0,75	8,6
KFN 1660 U	4	220,5	0,93	9,7
KFN 1661 U	4	240,8	0,97	9,0
rAprotymna N	4	192,5	0,77	9,8
KFN 1512 N	5	191,0	0,65	7,2
KFN 1514 N	6	188,3	0,69	7,3
KFN 1544 N	5	190,0	0,64	6,5
KFN 1545 N	6	185,8	0,66	7,3
KFN 1547 N	5	188,0	0,67	7,3
KFN 1660 N	6	205,0	0,77	8,5
KFN 1661 N	6	204,2	0,80	8,1

WC waga ciała (g) WN waga nerki (g)

WW waga wątroby (g) U model usypianych szczurów N model nieusypianych szczurów

Analiza statystyczna.

Do analizy statystycznej zastosowano test korelacji kolejności sum Spearmana.

Tabela 4

Analogi aprotyniny zawartość aktywności hamującej w nerkach i moczu po dożylnym podaniu szczurom

Analog	Ładunek wypadkowy	Temperatura denaturacji2 °C (maks )	Zawartość w moczu (3 h) % dawki	Zawartość w nerkach (lh) % dawki	Zawartość w nerkach (3h) % dawki	Wskaźnik akumulacji”
Aprotynina	+ 6	>100	2	21	44	2,10
KFN 1512”	-2	87	51	2	2	1
KFN 1514	0	88	36	8	11	1,38
KFN 1544	+ 2	98	42	17	23	1,35
KFN 1545	0	93	4i	14	28	2
KFN 1547	+ 2	86	45	4	5	1,25
KFN 1660	+ 2	77	23	6	3	0,5
KFN 1661	+ 3	79	18	4	3	0,75

Wskaźnik akumulacji nerkowej obliczono jako zawartość aktywności hamującej po 3 godzinach podzieloną przez zawartość po i godzinie Mierzona przez roznicową kalorymetnę skaningową w 20 mM kwasie 2-(N-morfdlino)etanosulfonowym

168 250

Wyniki.

Analogi w nerkach i moczu.

Całkowitą zawartość w nerkach (w procentach dawki) po 1 i 3 godzinach oraz w moczu po 3 rodzinach przedstawiono na fig 3 i w tabeli 4, Okazuję się, że stwierdzono duże τóznlcr pomiędzy analogami.

W odniesieniu do aprotyniny, zawartość w nerkach 1 godzinę po podaniu wynosiła w przybliżeniu 20% dawki, natomiast zawartość ta wzrosła do ponad 40% po 3 godzinach. Wada^nie apTotynmy w moczu było nie znaczące.

W celu oszacowania, czy wydalanie w moczu po 3 godzinach było związane z ładunkiem wypadkowym analogów, obliczono stopień korelacji pomiędzy tymi wartościami.

Stwierdzono, że zawartość w moczu była silnie skorelowana z ładunkiem wypadkowym analogów (patrz fig. 4).

Tabela 5

Analogi	Wskaźnik akumulacji	Wskaźnik stabilności w nerkach	Temperatura denaturacji (°C)
rAprotynina A	2,10	0,90	100
KFN 1512 A	0,66	0,67	87
KFN 1514 A	1,32	0,87	88
KFN 1544 A	1,32	1,05	98
KFN 1545 A	1,99	0,71	93
KFN 1547 A	1,22	0,65	86
KFN 1660 A	0,50	0,55	77
KFN 1661 A	0,77	0,55	79

Stabilność analogów.

W celu zbadania stabilności analogów w tkance nerki, jedną nerkę od 14 usypianych szczurów (jedną z każdej grupy) dzielono na dwie części o identycznych wagach. Jedną część przechowywano w temperaturze 37°C, a drugą w temperaturze 4°C. Po czterech godzinach tkanki homogenizowano i mierzono zawartość analogów. Wskaźnik stabilności zdefiniowano jako zawartości w części przechowywanej w temperaturze 37°C podzieloną przez zawartość w części przechowywanej w temperaturze 4°C. Wskaźniki stabilności podano w tabeli 6. Wykazują one, że TApTotynina, KFN 1514 i KFN 1544 wydają się być najbardziej stabilnymi związkami, w porównaniu na przykład z KFN 1660, który okazał się być bardziej niestabiliny.

Stabilność analogów badano także przez określanie ich temperatury denatuTacji. Stwierdzono, że temperatury denaturacji były dobrze skorelowane z zawartością w tkance nerki po trzech godzinach po podaniu (fig. 5) oraz ze wskaźnikiem akumulacji (fig. 6), ale nie z wydalaniem w moczu. Dane te sugerują, że wypadkowy ładunek może być ważny dla wydalania w moczu, ale ma mniejsze znaczenie dla stężenia i akumulacji w nerkach. Z drugiej strony, akumulacja w nerkach wydaje się być związana z temperaturą denaturacji i stabilnością analogów w tkance nerki. Jednakże, jest prawdopodobne, że stężenia mierzone w tkance nerki 1 godzinę po podawaniu ulegały zmianie na skutek degradacji lub przemieszczania. A zatem, jest możliwe, że stężenia mierzone np. 10 minut po podaniu będą korelować z ładunkiem wypadkowym.

Wnioski. Wyciągnięto następujące wnioski:

1) Wszystkie testowane analogi były pobierane przez nerki, ale w różnym stopniu. Akumulacja w nerkach wydaje się być związana ze stabilnością termiczną i stabilnością w tkance nerki, ale nie z ładunkiem wypadkowym cząsteczki.

2) Wydalanie w moczu wydawało się być związane z ładunkiem wypadkowym analogów, ale nie ze stabilnością.

168 250

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJA OGOLNA:

(i)

ZGŁASZAJĄCY: Bjoern, Soeren Erik Noms, Kjeld Diness, Viggo Noerskov-Lauritsen, Leif Cłwistensen, Niels Dyhr Bregengaard, Claus (ll) TYTUŁ WYNALAZKU: Analogi aprotyniny (lii) LICZBA SEKWEENCI. 29 (1V) ABRES DO :

(A) ADRESAT: Novo Nordisk A/S (B) ULICA: Novo Alle (C) MIEJSCOWOSC: Bagsvaerd (D) KRAJ: Dania (E) KOD POCZTOWY: 2880 (v) ZAPIS KOMPUTEROWY (A) TYP NOŚNIKA: Dyskietka (B) KOMPUTER: K^i^maat^ł^J-lny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANE: Patentln Release #1.0, wersja 1. 25 (vi) DANE DOTYCZĄCE AKTUALNEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA:

(B) DATA ZŁOZENIA:

(C) KLASYFIKACJA:

(vii) DANE DOTYCZĄCE UPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: DK 2361/90 (B) DATA ZŁOŻENIA: 1 października 1990 (vii) DANE DOTYCZĄCE UPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: DK 1118/91 (B) DATA ZŁOŻENIA: 12 czerwca 1991 (vill) INFORMACJA O PEŁNOMOCHIKU/AGENCIE (A) NAZWISKO: Tłialsoe-Madsen, Bngit (C) NUMER ODNIEŚIENIA/REUESTRU: 3465. 204--W0 (ix) INFORMACJA TELEKOMUNIKACYJNA:(A) TELEFON: (212) 867-0123 (B) TELEFAX: (212) 0857-0298 (C) TELEKS:

(2) INFORMACJA O SEKWENNUI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWEENCI:

(A) DŁUGOŚĆ: 418 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOSC NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: lin.iowa

168 250

(11)	RODZAJ	CZĄSTECZKI: cDNA
(vi)	ZRODŁO ( A \ (Al	ORYGINALNE:
(1X)	CECHA: (A) (B)	NCZWA/KLUTZ: CDS LOKALIZACJA: 77..409
(1X)	CECHA: (A) (B)	NAZWA/KLUCZ. syg_peptyd. LOKALIZACJA: 77..235
(1X)	CECHA: (A) (B)	NAZWA/KLUCZ: mat peptyd LOKALIZACJA: 236..409
(X1)	OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 1:

GAATTCCATT TACGACTAGT TTCACCCMC CGMTCTCAA TCMTCACT CATCCCCCM 60

AIAAAOGACC ACCAGC CCG AAG GCT GCT CCC TTG GIT TTG TCC TTG CCT 109

Mat Lys Ma Val Phe Leu Val leu Ser Leu Ile

-53 -50 -45

GGA TTC CGT	TTG GCC CMC	CCC Pro	GTC CCC GGC GCT GAA CCA TCC GIC GAG	1^57
Gly	Phe	Cys -40	Trp Ala	dn	Val Thr -35	dy Asp	du	Ser Ser Val du -30
ATT	COG	dCC	(GA TT	CCTG	ATC	ATC GT	<GA MC	ACCC	ACT TC! GTT CCC	205
Ile	Pro -25	Gilu	Gilu Ser	Hau	Ile -20	Ile Ma	Gilu Asn	Cr -15	Bff Leu ALa Asn
GTT	GCC	ACG	(GCT dC	Ad	TT!	OA MA	Ad GCC	(TTT	dAT TCC TTT TCT	255
Val -10	ALa	Met	Ma du	Mg -5	Ilu	dlu Lys	Mg dlu 1	Pro	Mp Hie (Cys Leu 5
GAA	TTT	CTTC	TAC ACT	dT	CCCA	ICC? AA	dT Ad	ACTC	ACTC Ad TAC TCC	330
Glu	Pro		(Ty Kur 10	dy	fto	<Ts Lys 15	Ma Mg	Ile	Ile Mg Τ/τ Rh 20
TAC	AAC	GGT	GGA GGT	dT	TCG	TT CCA	act tc	GGIT	TAC GU dG TT	334
Tyr	Asn	Mat 25	du Ma	dy	Leu	cCy dn 30	TCr IPe	Val	ITs dy dy CTs 35
AGA	GCT	GGA	AAA ACC	;aa	TTC	GGA ITT	GCT GGA	GGC	TCT AAC Ad ACTT	33
Arg	Ala	du	Mg Mn	Acs	Phe	du See	Ma du	Acs	Cts MML Mg LCh

45 55

TGC GGT GGT GCC TACTTEAGC Cys Gly Gly Ala

168 250 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 2:

(l) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

	(A)	νιυϋυον: ni amino* waso w
	(B)	TYP· aminoKwasowa
	(D)	TOPOLOGIA: liniowa
(11)	RODZAJ	CZĄSTECZKI: DiałKo
(Xi)	OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE

IDENTYFIKACYJNYM 2:

Met Lys Ala Val Ehe Leu Val Leu Ser Leu Ile Gly Ehe Cys Trp Ala

-53 -50 -45 -40

Gln Pro Val Ihr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu Ile Pro Glu Glu Ser

-35 -30 -25

Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr leu Ala Asn Val Ala Met Ala Glu -20 -15 -10

Arg leu Glu Lys Arg Glu Pro Asp Phe Cys leu Glu Pro Pro Tyr Ihr

-5 1 5 10

Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Glu Ala

20 25

Gly Leu Cys Gln Thr Ehe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Glu Arg Asn 30 35 40

Asn Phe Glu Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Ihr Cys Gly Gly Ala 45 50 55 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI

O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 418 par zasad (B) TYP. Kwas nukleinowy (C) ILOSC NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa

(ii)	RODZAJ	CZĄSTECZKI: cDNA
(VI)	ZRODŁO (A)	ORYGINALNE: ORGANIZM: syntetyczna
(IX)	C c, C H A: (A) (B)	NAZWa/KLUCZ: CDS LOKALIZACJA: 7 7., 4 O9
(IX)	bC H A: tA) (B)	NAZWA/KLUCZ. syg_oeptya LOKALIZACJA: 77 .235

168 250 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: mat_pepTyd (B) LOKALIZACJA, 236,,409 (X1) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 3:

GAAnTCCAT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGUTACAAA CTAITAGTTT CATACACAAT 60

AIAAACGACC GGAGGA ATC AAG GTT GTT TTC TTT GIT TTT TCC TTT ATC 109

Mat Lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile

-53 -50 -45

GGA TTC Gly Phe	TCC Cys -40	TGG (GCC CCA CCA GTC ATT GGC	dG GZA TTT	TTC GGT dA See Vaa du	157
TTp Aa	dn Rro	Val -35	Thr Gly	Af)	du Ser -30
ATT CCG	GAA	dG TTC?	CCT ATT	ATC	ATT GAG ZAA	AAC AAT	TTC dT ZAA	205
Ile Pro	Glu	Gilu Ser	Leu Ile	Ile	ALa GLu	An	TTr	Ilu Aa Ζαπ
-25			-20				-15
GTC GTC	ATG	GCT dG	Ad TTC	sag	GAG AGA	GGA	CCT GGA	TTT TTT TTT	253
Val Ala	Mat	Αεί du	Ag Au	Gilu	Lys Arg	du	Pro Aas	EPh Ccs iLe
-10			-5			1		5
GAA CCT	CCA	tta AAT	GGT CTTA	TTTf	AGA ATT	AAG	AAT AAT	AAG TTA ITT	301
du Pro	Pro	Tyy Thr	dy EPo	CTs	Lys ALa	Aaj	Ile Ile	Aig Tts PPh
		10			15			20
TAC AAC	GCC	AGA GU1	GGC -TT	TTT	CAA ATT	TTC	CTT TTA	GCT GGG TTT	334)
Tyr Asn	Ala	Lls Al	dy ILU	CTs	Gin Thr	PPh	VVL Tyy dy dy Cys
	25			30			35
AGA GCT	AAG	GAA. AGA	AAA -TT	GGA	TTT GTT	dA	dG TT AAT Ad AAT	337
Arg ALa	Lys	du Aas	Aas ETt	du	Ser Aa	du	Aap Cys Met Aaj TTr
40			44				50
TGT GCT	GCT	GCC TAGTClAd						418

Cys Gly Gly Ala 55 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 4:

(I) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DLUGOSC: 111 am^noK—aso— (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (II) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (X1) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O MUMZEZE IDENTYFIKACYJNYM 4:

Me Lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile Gly Phe CCs Aa

-53 -50 -45 -₄₀

168 250

Gin

Pro

Val

Tm

dy

Asp

du

Ser

Sar

Val

du

Ile

Pro

du

du

Ser

-35

-30

-25

Leu

Ile

Ile

Ala

du

.Asn

Thr

Thi

Leu

Al a

Asn

Val

AIa tulu

Met

C Ti rtiŁi

du Glu

-20

-15

-10

Arg

Leu

Glu

Lys

Arg

Glu

Pro

Aro

Phe

Cys;

Ilu

Glu

Pro

Pro

Ty

Thr

-5

1

5

10

Gly

Pro

Cys

Lys

Ala

Aig

Ile

Ile

AAj

Ty

Phh

Ty

Asa

Ala

Las

Ca

15

20

25

dy

Leu

Cys

Gin

Thr

Phe

Val

Ty

dy

dy

Cys

Arg

Ala

Lys

du

Asn

30

35

40

Asn

Phe

du

Ser

Ala

du

Asp

Cys

Met

Arg

Ty

Cys

dy

dy

Ca

45

55)

55

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 5:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 418 par zasad.

(B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOSC NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (11) RODZAJ CZĄSTECZKI: CDNA

(V1)	ZRODŁO (A)	ORYGINALNE: ORGANIZM: syntetyczna
(1X)	CECHA: (A)	NTZWA/KLUCZ:	CDS
	(B)	LOKALIZACJA:	77..409
(1X)	CECHA: (A)	NTZWA/KLUCZ:	syg peptyd
	(B)	LOKALIZACJA :	77..235
(1X)	CECHA: (A)	NTZWA/KLUCZ:	mat_peptyd
	(B)	LOKALIZACJA:	236..409

(X1) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 5;

GAATTCCATT CAAGAATAGT TTCAA^CCA^GG. AGGALYCCAA. CCTACCATTT CTATCCCCAC

ATCCAdCCC CTACGC ATG ATT GGT GGT TTC ITT GGT ΊΊΓ TCC TTC ACT

Met Lyy Ma Val PPe Leu Val leu Ser Llu Ile

-53 -50 -45

GGC TTC TC TC <CC CTA CTA CGT ACC CCC CGA GGT TCC TT (GIT GAG

Gly Phe Q/s Τη? Ma Gin IPo VVL TTr Gil AAp Glu S&e Ser W Glu

-40 -35 -30

109'

157

168 250

ATT CCG GAG <GG TTG? CTG ATC ATC GG? GM MC ATC AIG TTC TCT MG	22^<5
Ile	Pro Glu Gilu Ser -25	Lu Ile -20	Ile Ma	Glu	Mn TCh T?r -15	Lu	Ma	ton
GTC	GCC ATC CGG GM	AG TTC	cm MG	ACH	ACH '(GG? GGA	TTTG	TTG?	TTG	253
Val	Ala Met Ma Glu	tog Leu	Glu Lys tog	7ATJ M top	Rie	CCS	leu
-10		-5			1		5
GAA	TCT GGG TTCG AAT	(Gd? CCA	TTG? MA	GG?	ACH AAC MT	AIG.	TTG	TTC	301
ilu	Pro Pro iyy TCh	Gly Pro	CG-’S Lys	Ma	Mg Ile Ile	.tor	TTs	Fhe
	10		15			20
TAC	AAC GCC MG GlG	απ’ ttg	TTG? CCA	AAG?	TTG GGT TTG	GGG	GGG	TTG	3319
Tyr	Asn ALa Lys Ma	Gly Leu	CCS Gin	T?r	Rie Val Tts Gly dy	Cgs
	25		30		35
AGA	GCC GGl GM MA	MC TTG	dA TTG?	<dT	CGA GGA TTG AAT	* HAG	* /—t-n HAG	o —t 03 9
Arg	Ma Lys Glu Mn	ton Phe	du Ser	Ma	du Aa? CCS Met Aa.	ITh
	40	45			55
TCT	GGT GGT GCC TAGTCHiG							418

Cys Gly Gly Ala 55 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 6:

(I) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: m aminokwasów (B) TYP: aminokwasowi (D) TOPOLOGIA: Umowa (II) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (X1) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE

IDE

NTY'

FIKGGYJ

'NYM

5:

Mer

Lys

Ma

Val

PPh

leu

Val

IrSL

Sst

Lsu

Lle

Gly

Phe

lys

Ehe

sr?

-53

-55

-45

-40

dn

Pro

W

Htt

Gly

Asp

gpg

ueS

Sst

Val

du

iue

Pro

Glu

Glu

Sei

-35

-30

-25

Lsu

Ile

Ma

du

Asn

The

Hcr

leu

Ma

Asn

VaA

Ma

Ael

Mi

Glu

-20

-15

-10

Arg

leu

du

Lls

Arg

Mg

Pro

Asp

Phe

CCS

Leu

Glu

Pro

Pro

TCs·

Uh

— 5

1

5

10

Gly

Pro

Cvs

Lyy

Ma

Arg

Ile

Arg

ITyr

Lhe

Tyr

Asn

ALa

Lys

Ml

15

20

25

dy

Leu

Cys;

Gin

TTr

Phe

VaV

T^c

Gly

Gly

Gys

Srg

Ma

.Lys

G1l

Ag

30

35

4(0

Asn

Fhe

du

See

Ma

Glu

ma)

CCS

Met

Mg

Thr

(Cyt

Gly

Gly

Ma

45

50

55

068 25° 29 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 7:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

	(A) (B) (C) (D)	DŁUGOŚĆ: 418 par zasad. AYP: Kwas nuk^e.^i^(^wy
ILOSC NICI: TOPOLOGIA: L	jedna iniowa
(11)	RODZAJ	CZĄSTECZKI: cDNA
(V1)	ZRCDŁO (A)	ORYGINALNE: ORGANIZM: syntetyczna
(1X)	CECHA: (A) (B)	NAZWA/KLUCZ: LOKALIZACJA:	CDS 77..409
(1X)	CECHA: (A) (B)	NAZWA/KLUCZ: LOKALIZACJA,	syg_peptyd ; 77..500
(1X)	CECHA: (A) (B)	NAZWA/KLUCZ: LOKALIZACJA:	mat_peptyd 236..409

(X1) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 7:

GAATTCGATT CAAGAATAGT TCAAACAATA ACAITACAAT CTATCAATTT CATACACAAT 60

AIAAACGACC AAAACA AAT AAC CCA GIT TAC TTG GIT TAC TCC TIT AAC 109

Met Lys ALa Val Ehe Leu VaL Leu Ser Leu Ile

-53 -50 -45

GGA TTC TCC TGS GC CAA ACA CCC ACT GGT CC AC TCTc ACTGIT TAG 157

GLy Hie Cys Trp ALa Gin Pro V<=V Ua Gic Asa GIt uer Ser Val Gic

-40 335 -30

ATT CCC CCA GA TTC CIG ICC ACA CCC TćT AAC Λ(Γ CCT TTC GCT AAC 22)^

Ile Pro Clu GGu Ser Leu Ile Ile ALa Gic A^ Ua Ua Leu AIc a^sc

-25 -20 -15

TAC CCC AAC (TC? <CC^ AGA TAG ATT TAC CGA AGA CCC TAC ATATCAATA 255

Val ALa Met Met GGu Arg Cpu Gic Lys Arc Acc Pro Asa G^p Cys Lsl

-10 -5 15

CCC CCA CCA TTU? AAT Gd GTA CAT A7A CCC ACA CIA CIA CCA TACA dC 300

Clu Pro Pro Ser Ua Gly IAo coc Lys sic Arc He Ile Arc U? Ehe

15 20

TAC GAC CGA ACC? <GC? CCC TAC TCT (GAC ACA? TTC CCT TAC (GC¹ CCC CTCC 349

Tyr Asp Aa TAh .Ala Gly Ietu Cys Glu Uir Rie Val T/y Gly Gly cyy

30 35

AGA GCT AA AAC ACC AAC TTC AAC TAC? CCC CGA GAC TC AAC GAC ACC? 337

Arg Aa Asi Ag Asn An Fhe Lys Ser Aa Glu Ap Cyy Met Glu Ua

45 50

168 250

418

TCT GCT GGT GCC TAATCIAGA Cys Gly Gly ALa (2) INFORMACJA O SEK^^^CCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 6:

(I) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 111 aminokwasów (3) TYP: aminoKwasowa (D) TOFOLOGIA: Hl^^C^wa (II) RODZAJ CZĄSTECZKI; białko (X1) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 8:

Met Lys Ala VAL Ehe Lsu Val Leu Ser Lsu Ile Gly Ehe Cys Trp Aa,

-53 -50 -45 -40

Gln Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser VA_ Glu Ile Pro GLu Glu Ser

-35 -30 -25

Lsu Ile Ile Ala Glu Asn Tir Thr Leu ALa Asn Val ALa Met Ala Glu

Arg	Lsu	GLu	Lys	Arg	Arg	Pro	Asp
-5					1
GLy	Pro	Cys	Lys	ALa	Arg	Ile	Ile
			15
GLy	Lsu	Cys	GLu	Tur	Phe	Val	Tyr
		30					35
Asn	Phe	Lys	Ser	ALa	Glu	As-	Cys

50 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI

Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr 5 10

Arg Tyr Phe Tyr Asp ALa Thr Ala 20 25

Gy Gly Cys Arg ALa Asn Arg Asn 44

Met Gl·- Thr (Cy Gy Gy -Aa 55

O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM

9:

(1)	CHARAKTE (A) (B) (C) (D)	RYSTYKA SEKWENCJI: DŁUGOSC: 418 par casad TTF: Kwas nukloinywy ILOSC NICI: jedna TOPOLOGIA: Liniowa
(11)	RODZAJ	CZĄSTECZKI: cDNA
(V1)	ZRODŁO (A)	ORYGINALNE: ORGANIZM: syntetyczna
(1X)	CECHA: (A) (B)	NAZWA/KLUCZ: CDS LOKALIZACJA: 77..409

168 250

(1X)	CECHA: (A) (B)	NAZWA/KLUCZ: LOKALIZACJA:	syg peptyd 77..235
(1X)	CECHA: (A)	NAZWA/KLUCZ:	mat peptyd
	(E)	LOKALIZACJA:	236.,409

(X1) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 9:

GAmATT JAAGAATAGΓ TCAmAACA AGAnACAAA CmAAFrT JaTAJAJAAΓ 60

AIAAAJGAJJ AAAAGA ATG AAG GCT GTT TTC TTC GIT TTC TCC TTG AU 109

Mat Lys Ala Val Phe Leu Val leu Ser Leu He

-53 -50 -45

GGA TTC TGC TTG! GC CAA ΟΓ, GTC ACT GGC GA GAA TTCA TC? (GIT GAG 157

Gly Phe Cys Τρ Ha Gln Eto VH Tut Gly Ηρ Glu Ser- Ser Val Glu

-40 -35 -30

ATT CCG GAA GA GCT CG AAG AU GCT GAA MC AU AAC HG CGT MC 205

Ile Pro Glu Glu Ser Leu Ile Ile Ala Glu Asn Tr Thr leu Ha ten

-25 -20 -15

GTC GCC ATC GCT GAG ACH TG dG MA AGA AG! CCC? CGT TU TU? TG 223

Val Ala Mat; Ha Glu Hg leu du Lys Hg Hg Eto Hp EPie CCS Ilu

-10 -5 1 *5

GAA CCT CCA TCT ACT dG CCA TTG AA (U TAA AAG TAG TG EA TG 301

Glu Pro Pro Ser Ttrr dy Eto O/s L^s Ha Hg Ile He leu Tyy EPie ”5 20

TAC AAC GCC AAG GCT GCT TT! ICT CCA ACT TG CTT UA GCT GGG TTG 344

Tyr Asn Ha Lys Ala CTy Leu Ccs GGn ITr Phr VH Tyr dy dy CCy ‘ 30 35 *

AGA GGT AAC GGT AAC CCA TG UA ITT GCT GGA GGA TTG AAG AAG ACT 339

Arg dy Hn dy Asn dn EPie Tyr See Ha du Asp Ccs Met Arg ITr

44 55

TCT GGT GGT GCC TArTCTrAr 418

Cys dy Gly Ha

INFORMACJA O SEKWENCJI O idEn t YF ik

KAC U

NYM 10:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DLUGOSC: 111 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (11) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko

168 250 (X1) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 10:

Met -53	Lys	ALa	Vai -50	Fhe Leu	Vai	Leu	Ser -45	Leu	Ile	Gly Fhe Cys -40	Trp Ala
Gln	Pro	Val -35	Thr	Gly Asp	Glu	Ser —30	Ser	Val	Glu	Ile Pro Glu -25	Glu Ser
Leu	Ile -20	Ilee	Aa	Glu Aah	(Tr -15	TTu-	ILeu	-Aa	,An	Val Aa Met -10	ALa Gu
Arg -5	Leu	CG’l	Lys Ag Arj 1	Pro	Ap	Rie	CCS 5	leu	Gu Pro Pro	Ser ‘Thr 10
GLy	Pro	Cys	Lys 15	ALa Arg	Ile	Ile	Leu 20	Tyr	Phe	Tyr Asn ALa 25	Lys ALa
GLy	Leu	Cys 30	Gln	Thr Phe	Val	Tyr Gly GLy Cys Arg Gy Asn 33 40	Gy Asn
Gln	Phe	Tyr	Sst	tAl Gu	tAp	Cyy Met tAg TTr tCy GGyGly	Aa

50 55 (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 11 (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

	(A) (3) CC) (D)	DŁUGOŚĆ: 508 par zasad TYP. kwas nukleinowy
ILOSC NICI: TOPOLOGIA: L	jedna imowa
(11)	RODZAJ	CZĄSTECZKI: cDNA
(vi)	ZRODŁO (A)	ORYGINALNE: ORGANIZM: syntetyczna
(1X)	.CECHA:' (A) - (B)	NAZWA/KLUCZ: LOKALIZACJA:	CDS 77..499
(IX)	CECHA: kA) (B)	NAZWA/KLUCZ: LOKALIZACJA	syg peptyd : 77..331
(1X)	CECHA: (A) (3)	NAZWA/KLUCZ: LOKALIZACJA:	mat_peptyd 332..499

(X1) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA. O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 11:

GAATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGAITA^CAAA CTATCAATIT CATACACAAT

168 250

ACACAOGCTT CCCAGC TTC TGT TCT CCC? TCT ATT ITT TCT GCC GTC TT lOi

Met Arg Phr Pro Ser Ile Pre Thr Tla Val Ten

	-85	-80	-75
TTC GCC GCC TKK	TCC CGC TTA GCT GCT	CCC CGTC AC ACC	1 ACC ACC (GCT 1157
PTe Ca Ma See	See JAit Teu Ca Ca -70	Ero Vh1 An TCr -65	Tr- Tr Glu -60
GTT GCC ΤΜ GCC	KCA ATT ΚΜ GCT GCT	GCT GTC ACC GGT	TAC CCC GTC 205
Aso du Tr Ca ‘ -55	dn eiP orc A1g uiA -50	Ca VaI Ulu GIt Tyr S ec Ap -45
CTA GAC GGG GCT	CCC GCT HT GCT GCC	CCC CCC CCT CCC	CCC CGC CCC 255
Leu du dy Asp -40	Fre Asp Val Ala Val -35	Leu Pro Pre Ser -30	Asn Ser Crr
ACC TAC GGG ICC.	TCC TCC ATT CCC ACT	CCC ACC GGC AAG	ACC GGC GGC 331
Asn Asn dy Ilu -25	Ilu Phr Ile Asn Thr -20	Thr Ile Ca Sn -15	Ile Ca Ca
TCA GAC GCT GGG	GIC CCC TTK GCT CCC CGC GAT TTK TCC	CCC GAC CCC 339
Lys du du Gly -10	Val Ser Leu Asp Lys Arg Asp PTe Cys -5 1	Leu du Pro 5
CCC TAC AKT Gd	CCC TGC CCT GC CGC	CCC CCC AGA CAC	CCC CCC CCC 397
Pro Tyr Tr dy 10	Pro Cys Lys ALa Arg 15	Ile Ile Arg Tyr	PTe Tyr Asn 20
GCC CAG GCT GGC	ttk ccc ccc akt πο	GTC CAC GGC GGC	CGC TGC GCT 445
ALa Lys ALa dy 25	Leu Cys Gin Trr Phe 30	Val Tyr dy Gly 35	Cys Arg ALa
TAG CCC CAC ACC	CCC GCT TCT GCT GCT	GCC CCC CCC AGC	ACC CCC GGT 493
Lys Ser Asn A=n	PTe du Ser ALa du	Csp Cys Met Arg	Crr Cys dy

44 50

GGC GCC TTAiaTGA 508

Gly Ca (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 12:

(I) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 141 aminokwasów (B) TYF: aminokwasc^a (D) COFOLOGIT: liniowa (II) RODZAJ CZĄSTECZKI: Tiaiko (X1) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 12:

Met Arg PPr Pro Ser Ile Fhu Tr Ca Val Ja Le Ala Phe Sec Ser

-85 -80 -75 -70

Ala Leu ACl Ala Prc Vd. Cn Tr Bt: Tr GIt Mą Glu Thr Ci Gin

-65 -60 -55

168 250

Ile

Pro

Ala

Glu

ALa

Val

Ile

Gly

Cyt

Ser

Asp

Leu

Glu

Gly

Asp

Phe

-50

-45

-40

Asp

Va!

ALa

Vai

Leu

Pro

Fiie

Ser

ΛΑΧ

:er

J.1TT

ΠΑί n

/ΑΠ i

Gly

ILau

T A 1LTŁ

-35

—30

-25

Fhe

Ile

Asn

Tłnr

Chr

Ile

ALa

Ser

IIe

AAa

AAa

lys

GIlu

Gier

Giy

Val

-20

-15

-10

Ser

Leu

Asp

Lys

ZAg

Ap

Rhe

Cys

Leu

Gilu

Poo

Pro

Tyr

TCh

Giy

EPto

-5

1

5

10

Cys

Lys

Ala

Arg

Ile

Ile

.Ag

Cyt

Phie

Ty

A=n

Ala

Lys

ZAa

Giy

Ilu

15

20

22

Cys

Gin

Thr

Phe

Val

Cyt

Gly

Gly

Cys

Aaj

Ala

Lys

Ser

Ain

Asn

Phe

30

35

40

Hu Ser Ala GLu Asp Cys Mat Arg Tłcr Cyy Gli Gly Ala 45 50 55 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 13:

(I) CHARAKTERYSTYKA SEEW^EN’]^:

	(A) (B) (C) (D)	DŁUGOŚĆ: 508 pao zasad CYP: Kwas nukleinowy ILOIC NICI: jedna TOPOLOGIA: liniowa
(n)	RODZAJ	CZĄSTECZKI: cDNA
(V1)	ZRODŁO (A)	ORYGINALNE: ORGANIZM: syntetyczna
(1X)	CECHA: (A) (B)	NAZWA/KLUCZ: CDI LOKALIZACJA: 77..499
(1X)	C^T^A: (A) (B)	NAZWA/KLUCZ: syg_pepTyd LOKALIZACJA: 77..331
(IX)	CECHA: (A) (B)	NAZWA/KLUCZ: mat_peptyd LOKALIZACJA: 35ε..-477

(X1) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 13:

GAATCCTATT CAAAAAAAT CCAAACAAGG AAATACAAA TTATCAACT ΤΑΤΑΤΑΤΑΑΤ

ACAAGOAACC AAAAGA ATG AGA CCT CCT CCA ATT -TTT ATT GTA GTT TTA

Mat Arg Fhr Pro Ser Ile Ehe Thr Ala Va! Leu

-85 -80 -75

109

068 25°

TTC GTA GCA TCA TCAC <GC TA CTT? CTCC CCA CTAC AAC CCT ACTA ACCC CGA

Ehe ALi ALi Ser S Aa Ilu Aa Aa Pro Val Asn The GAh TAh Glu

-70 -65 -60

CAT TAA ACG GCT. AA AAA CCO (CCA (GA CCC (GAC AAC GCA TAC TAA CCC

Asp Clu Anc Aa GIt Ile EPo Aa GGu Aa Vv1 Ile Cly Ί?/ Sss Acp

-5Ó -50 -45

AAA GCA TCC CAT ATT GAT CCT <GT? (TAC TAS CCA TAA TTC AAC ACCC AAA

Leu Tlu Cly A=p Phe Asp Vv1 Aa Vv1 Isei Pro Rte S^r An S<^ Uhc

-40 -35 -30

AAT AAT TCC ATT TIT AAA AAA AAA? ACC¹ AAT .AAA (TCC ACCC .AAA CCC CTC

Asn Asn Tly Leu Leu Phe Ile Asn Uir Tr Ile Aa Ser Ile Aa Aa

-25 -20 -15

AAA GCA CCC TTC TAA TCA TAA CCA? AA.A JAT. (CA? dAC TATA TAC CTAC CTT

Lys Tlu Tlu Cly Val Ssc Ilu Ap Lvs Ag Acs Re CCs Ilu Glu EPo

-10 -5 15

TCA TAC ACA GCA CCA ACA AAA CTT JAG AAC ACA AAA TAC dAC IAC AA

Pro Ayc Ahr Cly Pro Cys Lss Aa JAg LLe Ile Ag Tys Ehe 1?/ An

15 20

CCC AAC GCA GCA TAC TCA CCA ACC dAC dA TAA GGT CTG TAA AAT CCC

Al Lys Aa Cly Leu Cys GCn TAm Hm Vv1 TAs Gly' Gly CCs ^r Aa

33 33

AAT ACC AAC AAT TAC GTA TAC CTC GTA GCA TAT ACA AAC ACC HAT GCT

Lys Ser Asn Asn Phe Al See Aa Glu Aaą CCs MMe Acg TAr Cys Gly

44 55

CCA GTC TAATTAGA

Tly Aa 55

157

205

253

301

349

397

445

493

508 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 14:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 141 ammokwasow (B) AYP: rniiokkwasoia (Di TOPOLOGIA: liniowa (n) RODZAa’ CZĄSTECZKI: białko (X1) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA D NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 14:

Met Arg Phe EPo Sss Ile Ehe ISt Aa Val Ubu Rv Aa Ap Sa- Ser “85 -80 -75 -77

Al Leu Al Aa EPo Val Asn Ttr Thr hSir Glu As? Sic Thc Aa Gin

-65 -60 -55

Ile Pro ALw Tłu Alw Val Ile Gly Asc Ser Asp Lsu Glu Cly Asp Ohe -50 -45 -40

168 250

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu leu -35 -30 -25

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val -20 -15 -10

Ser Leu Asp Lys Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro

-5 1 5 10

Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu

20 25

Cys Gln Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Ser Asn Asn Phe 30 35 40

Ala Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala 45 50 55 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM l5:

(l) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI.

(A) DLUGOSC: 412 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOSC NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (li) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (vi) ZRODŁO ORYGINALNE:

	(A)	ORGANIZM: sy	ntetyczna
(IX)	C ύ C H A: (A)	NAZWA/KLUCZ:	CDS
	(B)	LOKALIZACJA:	77..403
(ix)	CECHA: (A)	NAZWA/KLUCZ:	syg_peptyd
	(B)	LOKALIZACJA	: 77..235
(ix)	CECHA: (A)	NAZWA/KLUCZ:	mat peptyd
	(B)	LOkALIZACJA:	: 236..403

(XI) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 15:

GAATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT CAIACACAAT

ATAAAOGACC AAAAGA ATC AAG GCT GTT TTC TTC GTT TTC TCC TTC ATC Met Lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile -53 -50 —45

GGA TTC TCC TCG GCC CAA CCA GTC ACT GGC GAT GAA TCA TCT GTT GAG Gly Phe Cys Trp Ala Gln Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu

-40 -35 -30

109

157

168 250

ATT CCG GAA GAG TCT	CTC Leu	ATC ATC GCT GAA AAC ACC ACT TTC GCT AAC	205
Ile Pro Glu -25	Glu Ser	Ile -20	Ile Ala Glu	Asn Ihr -15	Ihr	Leu	Ala Asn
GTC GCC ATS	GCT GAG	AGA	TTC	GAG AAG AGG	GAT TTC	TCT	TIG	GAA CCT	253
Val Ala Met	Ala Glu	Arg	Leu	Glu Lys Arg Asp Fhe	Cys	Leu	Glu Pro
-10		-5			1			5
CCA TCT ACT	GCT CCA	TCT	AAA	GCT AGA ATC	ATC AGA	TAC	TTC	TAC GAC	301
Pro Ser Ihr	Gly Pro	Cys	Lys	Ala Arg Ile	Ile Arg Tyr	Phe	iyr Asp
	10			15			20
GCC ACT GCT	GCT TTC	TCT	GAA	ACT TTC CTT	TAC GCT	GGC	TCC	AGA GCT	349
Ala Itr Ala	Gly Leu	Cys	Glu	Ihr Phe Val	Tyr Gly Gly	Cys Arg Ala
25				30		35
AAC AGA AAC	AAC TTC	AAG	TCT	GCT GAA GAC	TCC ATC	GAA	ACT TCT GCT	397
Asn Arg Asn	Asn Phe	Lys	Ser Ala Glu Asp	Cys Met	Glu	Ihr Cys Gly
40			45		50
GGT GCC TAATCIAGA								412
Gly Ala
55

(2' INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 16:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 109 aminokwasów tB) TYP: ammokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 16:

Met

Lys

Ala

Val

Phe

leu

Val

Leu

Ser

Leu

Ile

Gly

Phe

Cys

Trp

Ala

-53

-50

-45

-40

Gin

Pro

Val

Ihr

Gly

Asp

Glu

Ser

Ser

Val

Glu

Ile

Pro

Glu

Glu

Ser

-35

-30

-25

Leu

Ile

Ile

Ala

Glu

Asn

Ihr

Ihr

leu

Ala

Asn

Val

Ala

Met

Ala

Glu

-20

-15

-10

Arg

Leu

Glu

Lys

Arg

Asp

Phe

Cys

leu

Glu

Pro

Pro

Ser

Ihr

Gly

Pro

-5

1

5

10

Cys

Lys

Ala

Arg

Ile

Ile

Arg

Tyr

Phe

iyr

Asp

Ala

Ihr

Ala

Gly

leu

15

20

25

Cys

Glu

Ihr

Fhe

Val

Tyr

Gly

Gly

cys

Arg

Ala

Asn

Arg

Asn

Asn

Phe

30

35

40

Lys

Ser

Ala

Glu

Asp

Cys

Met

Glu

Ihr

Cys

Gly

Gly

Ala

45

50

55

168 250 (2) INFORMACJA Ο

SEKWENCJI Ο NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM

17:

(l) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 508 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOSC NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: Umowa (ii)

RODZAJ CZĄSTECZKI: cuNA (VI)

ZRODŁO ORYGINALNE:

(A) ORGANIZM: syntetyczna (A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) LOKALIZACJA: 77..499 (A) NAZWA/KLUCZ: syg_peptyd IB) LOKALIZACJA: 77..331 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: mar_peptyd lB) LOKALIZACJA: 332..499 (XI) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 17:

GAATTCCATT CAAGAAIAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT CAIACACAAT 60

ATAAAOGATT AAAAGA ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT ACT GCA GIT TTA 109

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu -85 -80 -75

TTC

GCA

GCA

TCC

TCC

GCA

TTA GCT

GCT

CCA GTC AAC

ACT ACA

ACA

GAA

157

Phe

Ala

Ala

Ser

Ser -70

Ala

Leu

Ala

Ala

Pro Val -65

Asn

Thr Thr

Thr -60

Glu

GAT

GAA

ACG

GCA

CAA

ATT

CCG

GCT

GAA

GCT GTC

ATC

GGT TAC

TCA

GAT

205

Asp

Glu

Thr

Ala Gin -55

Ile

Pro

Ala

Glu -50

Ala Vai

Ile

Gly Tyr -45

Ser

Asp

TTA

GAA

GGG

GAT

TTC

GAT

GTT

GCT

GTT

TTC CCA

TTT

TCC AAC

AGC

ACA

253

leu

Glu

Gly Asp -40

Phe

Asp

Val

Ala -35

Val

Leu Pro

Phe

Ser Asn -30

Ser

Thr

AAT

AAC

GGG

TTA

TTG

TTT

ΑΤΆ

AAT

ACT

ACT ATT

GCC

AGC ATT

GCT

GCT

301

Asn

Asn -25

Gly

Leu

leu

Phe

Ile -20

Asn

Thr

Thr Ile

Ala -15

Ser Ile

Ala

Ala

AAA

GAA

GAA

GGG

GTA

TCT

TTG

GAT

AAA

AGA GAT

TTC

TCT TTC

GAA

CCT

349

Lys -10

Glu

Glu

Gly

Val

Ser -5

Leu

Asp

Lys Arg Asp 1

Phe

Cys Leu

Glu 5

Pro

168 250

CCC TAC CCT Gd CCCA TCT AAA GCT AGA ATC ATC- JAGA TC TTC TC CC <dC

Pro Tyr Thr Gly JPro Cs Lys Ala Arg Ile Ile Ag Ty Rie Ts TAp

15 20

GCC ACT GCT GGT TTC TG (GAC CCT TTC GTT TAC CGG¹ CGG? TCC AGA (GC

ALa Thr ALa Gly Au C^s Glu Thr Phie Val Tyr Gly Gly Ccs Ag Aa

30 35

AAG AGA AAC CCC ΊΤΤΓ Al ITT? GCT GAA GAC TGC AT! GA ACT PTC CGG

Lys Arg Asn Asn LF.e Lvs Sm Ala Hu Asp Cys MmS du Tm CCs Gly

45 50 ggt Gyy tctcagc

GLy ALa 55 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 141 aminokwasów (B) TYP: aminoKwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (11) EODzAj CSĄSTECZ KI; białoo

977

445

493

508

18:

(X1) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NuMeRZe IDENTYFIKACYJNYM 18:

Met

ALa

Ile

Asp

Ehe

Ser

Cys

Cy^s

Lys

Arg Phe IPo Sst Ile Phe Thr Aa Val Leu Rie Aa Ala Sm Sss -80 “55 -70

Leu ALa Aa Pro Val -Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Tm Aa Gln -65 -60 -55

Pro

ALa

du

ALa

Val

Ile

GLy

Tyr

Ser

Asp

Leu

du

dy

Asp

Phe

-50

-45

-4(0

Val

Aa

Vaa

leu

Pro

roie

Ser

Ass

Sec

Tir

Asn

Asi

Gly

Lcu

Au

-35

•330

-25

Ile

TAs

PTu

Htt

Ile

ALa

Ser

lis

Ala

Aa

Lyc

Gic

Glu

GLy

Gau

-20 -15 '-10

Leu Asp Lyy Aaj Asp EhP eC^s Leu Glu ito Pro Ty Tr Gly to> 15 10

Lys Aa Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Τ^τ Asp ALa Tm ALa Gly Leu 15 20 25

GLu PTr FFh W. Tyr Gly Gly cys Ag Aa Lyc Aia asn Aen Aie 30 55 40

Ser ALa Glu Aa Cy^s CSsM Glu Thr Cys Gly Gly Aa 45 50 55

168 250 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 19:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ*. 412 par zils^ić!.

(B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOSC NICI: jedna (D) TOPOLOGIA liniowa

(11)	RODZAJ	CZĄSTECZKI: cDNA
(vi)	ZRODŁO (A)	ORYGINALNE: ORGANIZM: syntetyczna
(ix)	CECHA: (A) (B)	NAZWA/KLUCZ: CDS LOKALIZACJA: 77..403
(ix)	CECHA: (A) (B)	NAZWA/KLUCZ:, syg^peptyd LOKALIZACJA: 77..235
(ix)	CECHA: (A) (B)	NAZWA/KLUCZ: mat^peptyd LOKALIZACJA: 243..404
(X1)	OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE

IDENTYFIKACYJNYM 19:

GAATyccrTT JArGrryrly tcgaacaaaa αααπαεααα ttatjagttt catacacaat 60 ατααατιατε amasa atg aga gct gtt ttc ttg git ttg tcc ttg atc 109

Met Lys Ala VH Phe Leu VH Leu Ser Leu Ile

	-53	-50	-45
GGA	TTC TGC TTG! (GTC CCA	CCA GTC ACT GGT GAT	GAG TCC TCT MT (GAG 157
Gly	Phe Cys TT]? Ha Gln	Pro Val Hit Gly Hp	Glu Ser Ser Val Glu
	-40	-35	3°o
ATT	CJG GGA CUG TTC CJG	ATC ATC GCT GAA MC	ACCJ AAT TIG (GC? AAC 205
Ile	Pro Glu Glu Ser leu	Ile Ile Ha Glu Hn	Br ITr Leu Ha Hn
	-25	-20	-15
GTC	GCC ATC GCT GAG AGA	TTG GAA AAA AAG GGA	ttg ogj itt; cga cct 253
Val	Ha Met Ala Glu Aaj	Ilu Glu Lls 0aj Ars	Phe Cjs Ilu Glu EPo
-10	-5	1	5
CCA	TCT ACT GGT COC TCTT	AGA GAC AGA ATC AGC	AAG TTG ITT: TTG TAG 301
Pro	Ser Thr Gly Pro Cys	Lus Ha Arg Ile He	Arg iyr EPr TTs Hn
	10	15	20
GCC	AAA GCT GGT TTCTCT	TCA AAC TTCGGT TAG	GGT GGG ETC 0AA GGT 334
Ala	Lys Ha Gly Leu Cyc	GGi EG* Phe WL Tyr Gly Gly CJs Arg Gly
	25	30	35
AAC	GGC AAC AAC TTC AAG	TCCGCT GM GAC TGC AAT GAA AAC EGC GGG 339
Asn	Gly Hn Asn Phe Lye	ser Ala. Glu Ar? Cys Met Glu EG* Cjs Gly
	40	44	50

168 250

412

GGT GCC TAATCEAGA Gly Ala (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 20:

(I) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 109 aminokwasów (B) TYP: ammokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (II) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (XI) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 20:

Met

Lys

Ala

Val

Phe

Leu

Val

Leu

Ser

leu

Ile

Gly

Fhe

Cys

Trp

Ala

-53

-50

-45

-40

Gin

Pro

Val

Ihr

Gly

Asp

Glu

Ser

Ser

Val

Glu

Ile

Pro

Glu

Glu

Ser

-35

-30

-25

Leu

Ile

Ile

Ala

Glu

Asn

Thr

Thr

Leu

Ala

Asn

Val

Ala

Met

Ala

Glu

-20

-15

-10

Arg

Leu

Glu

Lys

Arg

Asp

Fhe

Cys

Leu

Glu

Pro

Pro

Ser

Ihr

Gly

Pro

-5

1

5

10

Cys

Lys

Ala

Arg

Ile

Ile

Arg

iyr

Phe

Tyr

Asn

Ala

Lys

Ala

Gly

leu

'15

20

25

Cys

Gin

Thr

Phe

Val

Tyr

Gly

Gly

Cys

Arg

Gly

Asn

Gly

Asn

Asn

Phe

30

35

40

Lys

Ser

Ala

Glu

Asp

Cys

Met

Glu

Ihr

Cys

dy

Gly

Ala

50 55 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 21:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 508 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOSC NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa

(11)	RODZAJ	CZĄSTECZKI: cDNA
(VI)	ZRODŁO (A)	ORYGINALNE: ORGANIZM: syntetyczna
(IX)	CECHA: (A) (B)	NAZWA/KLUCZ: CDS LOKALIZACJA: 77..499

168 250

(1x)	CECHA: (A) (B)	NAZWA/KLUCZ: LOKALIZACJA:	syg-Peptyd 77.331
(1X)	CECHA: (A)	NAZWA/KLUCZ:
	(B)	LOKALIZACJA:	332. .477

(X1) OPIS SEKWENCJI:· SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 21:

GGACCCCATT CAAGCCTAGT CCAGGCACUC CCATGCAAA CTCTCACCCC CATACCCACT 60

AIACACGAIC CCACGA CTG AGA TC? CCT TC? ATT KAT ACT GCC dT CCC 109

Met Arg Rie Pro Ser Ile FT.e CTr Ala Val Lu

	-85	-80	-75
CCC GCC	GCC CCC CCC GOC CCC GGC GGC	OKI CCC TAC AGC ACC? ACC GAC 115
Phe d	Ala Ser Ser Ala Ilu Ala Ala	Pro Val An Άττ TCr Crr Glu
	-70	-65	-60
GAC GCC	TCG GCGC ACA ATT (CC 11 Gl	GC CGTC GTC GGT CCC CCC GAC 205
Asp Glu	Crr Ala Gin Ile Pro Ma Glu Ma Val Ile Gly Tyr Ser Asp
	-55 -50		-45
CTA GCC	GGG GTC TTC (CCC CCT <GK dT	TCG CCC? TCT CCC AGC ACC ACC 253
Leu Glu	Gly As? Rie TAp Val TAa Val	luu Pro EPie Ser An Ser Crr
	-40 -35	-30
ATT ACC	GGG TUT ATT TCT TACA ATT ACT	AAC TGC CGC Ad	ATT CCT CCC 301
Asn Asn	dy Leu leu IKe He Asi ΊΤτ	ICr Ile TCa Sn	Ile ALa ALa
-25	-20	-15
ATT GCC	GAC GCC GGA TTT!CGCGAAAACUCCGITC’TCr	TCG GA? OK? 339
Lys Glu	du Glu Val Seu luu As -LUG Cg Aą PPr Cg	Lu Glu Pro
-H	-5	1	5
CCC CCC	ACC GGG CCC. ICC TCA GGC AAG ATT ACC AAG TAC	TTC TAC TAC 337
Pro Tyr	Thr Glu Ppo Ccg Ly d Aa.	Ile Ile AAr Άτ	Rie Ty An
	10 15		22
GCC AAG	GCT GGT CIG TCT TCA ACC TTC	cct tac: ccc cuuc	TGC ACA CCC 445
Ala Lys	Ala Gly Leu Cyc Gin Ucr Phe	Val TCg· Gly Gly	CKg Arg CLi
	25 30	335
AAG CCC	AAC CAC CCC Ad CCT (CTT GAA	CCC TGC ATI (GAC	ACC? TGT Gd 443
Lys Ser	Asn Asn Phu Lys Ser Ala Glu	Ap Cg MeU Glu	Tnr Cy Gly

45 50

GGC GCC CCTTCCAGA 558

Gly Ala

168 250 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM (i) CHARAKTERTYTYKA SEKWENCJI:

(A) DLUGOIC: 1 1U ίitΏlπoiów^.sow (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: linj^c^wa (11) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (X1) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 22:

22:

Mat Arg Fhe ryto -85	Ier	Ile Rre ΤΤοε Ala Val Leu Ehe Ala Ala Ser Ser
-80	-75	-70
ALa Leu A1a lAe	Pto	Vil	Aesn Tho Thir Thir Glu Aep Glu Thr ZAe. Gin
	-65		—tzr\ 6*0	-55
Ilr Poo ZAa Gier	Ala	VH	Ile Gly Cyr Sar Asp Leu Glu	Gly Asp Eh
-50			-45	-40 *
Asp Val ZAa Vćl1	TŁU	Eto	Ehe Ser Asn Gen Tar Tsn ZSsa	Gly Leu Elu
-35			-30 -25
Phr Ilr ZAn Thr	TCr	Ile	.Ala Sal- Ue Ala Ala Aya Gli	Uli Giy WI
-20			-15 -10
Ier Leu Ta? Lls Atg Aep	Ee Cys Ler Glu Ero Pro Ty	Thr Gly Eto
-5		1	5	10
Cys Lys ZAa ZAg	Ile	Ile	Arg Cyr Er Tyr Asn ALa Lys	ALa Gly Ilu
15			20	22
Cys Gin Hh Κτ	VVL	Tyr Gly Giy Gys Tyg Alg Aya Seę-	Asa Ααπ Ehh
30			35 40
Lys Ier ZAe Giu	aa?	Cys Met Glu Alu Cyr Tl? Gly GLSe
45			50 55
(2) INFORMACJA	O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJN'

23:

(e) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

	(A) (B) (C) (D)	DŁUGOSC: 508 par zasad TYP: kwas nukleinowy ILOSC NICI: jedna TOPOLOGIA: liniowa
(11)	RODZAJ	CZĄSTECZKI: cDNA
(V1)	ZRODŁO (A)	ORYGINALNE: ORGANIZM: syntetyczna
(1x)	CECHA: (A) (B)	NAZWA/KLUCZ: CDS LOKALIZACJA: 77..499

068 25°

(ix)	CECHA: (A) (B)	NAZWA/KLUCZ: syg_peptyd
LOKALIZACJA:	77..331
(IX)	CECHA: (A)	NAZWA/KLUCZ:	mat-peptyd.
	(B)	LOKALIZACJA:	332..499

(XI) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 23:

GAAAASAAAA CAATAAAATA ACAAACTACA AGAAACAAA CATATAAAAA TATACTTCTT 60

ATACACCAJA AAAACA AAA AAC TAA CCT TA? ATA CAT ACT GCA Ad? ATT 109

Mat Arg Phe Pro Ser Ile Ehe Thr Ala Val Seau

-85 -80 -75

TAC GCA	rcy Trr ta	GCA Ala	TAC ?CAA GCT	ATA (CC AAC ACT TTC ACA AAA Pro VaL Asn Tir dn Thc GIt	157
Re	ALa	JAa	Ser	Sete -70	Leu Ala	Ala
-65	-60
GAT	TAC	AOC	GTA	AAC	AAA	CCA GCT	GTA	GT?	GT? TCTC CTT TCC TAC CAT	205
Asp	Tlu	Arr ALa	Tin	Ile	Pro Ala	Glu Ala W ile Cly Tyr Ser Asp
			-55				-50		-45
AAA	GCA	GCT	GAT	AAC	CAA	GIA GCA	CIA	ATT	ACA TTA ACA AAC CCC CCA	253
Leu	Tlu	Cly Asp	Rs	Asp	Val ALa	Val	leu	Pro Re Ser Asn Ser Thr
		-40				-35			—30
AAA	AAC	GCT	AIA	ATA	TAA	AAC AAT	ACCC	ACCC	ΑΠ' ACCC ACCC AAA CCA TCA	301
Asn	Asn	Tly	Leu	Lsu	Re	Ile Asn	Hat	Ua-	Il(= JAa Ser Ile ALa ALa
	-25					-20			-15
AAA	GCA	TAC	CCC	TAA	TCA?	TAA GAT?	TJAA ΑΒΑ!	AAT AAA? ATC AAA TAA ACA	349
Sys	Clu	Clu	Cly Val	Sro	Lsu A?	Lys su? Aro Rr Cys Lsu Glu Pro
-10					-5				1 5
CCA	TAA	ATA	CCC	CAA	dAC	TTAA ACC?	TCA.	CTC	ATC CAT. AC TAC AC AAC	397
Pro	Tyr	Thr	Cly	Pro	Cys	Lys Alc	Ac?	His	Ile Jcg .Asc Re Άτ ^n
			10				15		22
GCA	ACC	TAA	GTA	AAA	ATA	CAA ATA	TAA	TTA	TAA GTC GTC TCA AGA GCA	445
Ala	Sys	ALa	Gly	Leu	Ays	GLn Anc	Re	Val	Ayc Cis CLy Tys Acg ALa
		25				30
AAC	GAC	ACA	ACC	AAT	AAG	CCT GCT?	GJG?	GAC?	TA cACAC CAA ATT TTA TCA	493
Sys	Clu	Asn	Asn	Rs	Lys	StS Ala	Gic	A?	Cys sMS Glu Arc Ays Cly

45 00

CCA CCC TATACIACA 508

Gly All (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 24:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DLUGOSC: 041 aminokwasów

168 250 (B) TYP: ammokwasowa (D) TOPOLOGIA: Umowa (11) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (XI) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 24:

Met Arg Fhe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

-85 -80 -75 -70

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gin —65 —60 —55

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Ehe -50 -45 -40

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu -35 -30 -25

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val -20 -15 -10

Ser Leu Asp Lys Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro ETO Tyr Thr Gly Pro

-5 1 5 10

Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg iyr Fhe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu

20 25 cys Gin Thr Phe Val iyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Glu Asn Asn Phe 30 35 40

Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala 45 50 55 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 25:

(l) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

	(A)	DŁUGOŚĆ: 508 par zasad
	(B)	TYP: kwas nukleinowy
	(C)	ILOSC NICI: jedna
	(D)	TOPOLOGIA: liniowa
(11)	RODZAJ	CZĄSTECZKI: cDNA
(VI)	ZRODŁO (A)	ORYGINALNE: ORGANIZM: syntetyczna
(IX)	CECHA: (A) (B)	NAZWA/KLUCZ: CDS LOKALIZACJA: 77..499
(IX)	CECHA: (A)	NAZWA/KLUCZ: syg_peptyd

168 250 (B) LOKALIZACJA: 77..331 (IX) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ-: mat_peptyd (B) LOKALIZACJA. 332..499 (XI) OPIS SEKWENCJI: .SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 25:

GAATTCCATT CAAGAAIAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT CAIACACAAT 60

ATAAAOGATT AAAAGA ATG AGA TIT CCT TCA ATT TTT ACT GCA GTT TTA 109

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu -85 -80 -75

TTC GCA

GCA TCC TCC GCA

TTA GCT GCT CCA GIC AAC ACT ACA ACA GAA

157

Phe

Ala

Ala Ser

Ser -70

Ala

leu

Ala

Ala Pro -65

Val

Asn

Thr

Thr Thr Glu -60

GAT

GAA

ACG GCA

CAA

ATT

COG

GCT

GAA GCT

GTC

ATC

GCT

TAC TCA GAT

205

Asp

Glu

Thr Ala -55

Gin

Ile

Pro

Ala

Glu Ala -50

Val

Ile

Gly

iyr Ser Asp -45

TTA

GAA

GGG GAT

TTC

GAT

CTT

GCT

CTT TTG

CCA

Tir

TCC

AAC AGC ACA

253

leu

Glu

Gly Asp -40

Phe

Asp

Val

Ala -35

Val Leu

Pro

Phe

Ser -30

Asn Ser Thr

AAT

AAC

GGG TTA

TTG

TTT

ΑΤΆ

AAT

ACT ACT

ATT

GCC

AGC

ATT GCT GCT

301

Asn

Asn -25

Gly Leu

Leu

Phe

Ile -20

Asn

Thr Thr

Ile

Ala -15

Ser

Ile Ala Ala

AAA

GAA

GAA GGG

CTA

TCT

TTG

GAT

AAA AGA

GAT

TTC

TCT

TTG GAA CCT

349

Lys -10

Glu

Glu Gly

Val

Ser -5

leu

Asp

Lys Arg Asp 1

Phe

Cys

Leu Glu Pro 5

CCA

TAC

ACT GGT

CCA

TCT

AAA

GCT

AGA ATC

ATC

AGA

TAC

TTC TAC AAC

397

Pro

Tyr

Thr Gly 10

Pro

Cys

Lys

Ala

Arg Ile 15

Ile

Arg

Tyr

Phe Tyr Asn 20

GCC

GAA

GCT GCT

TTG

TCT

CAA

ACT

TTC CTT

TAC

GCT

GGC

TGC AGA GCT

445

Ala

Glu

Ala Gly 25

Leu

Cys

Gin

Thr 30

Fhe Val

Tyr Gly Gly 35

cys Arg Ala

AAG

TCC

AAC AAC

TTC

AAG TCT

GCT

GAA GAC

TGC ATG

GAA

ACT TCT GCT

493

Lys

Ser

Asn Asn

Fhe

Lys Ser

Ala

Glu Asp Cys Met

Glu

Thr Cys Gly

45 50

GGT GCC TAATCIAGA Gly Ala (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 26:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DLUGOSC: 141 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (X1) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 26:

Mt Arg Rie -85	Pro	Sm	Ile Pie 'Th Aa VA Au Phe Aa Aa Sert Sm
-80	-75	-70
ALa Au Ma	Aa	Pro	Val	An Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala	Gln
		-65		-60 -55
Ile Pro TAa	Glu	Aa	Val	Ile Gly Ty Sm Ap Au Glu Gly Ap	Rie
	-50			-45 -40
Asp Val Aa	Vaa	Au	Pro	Phe Ser An Sm Thr Asn An Gly Au	Au
-35				-30 -25
Ehe He Acs	Tr	Tur	Ile	tAl Sse Ile tAl tAl Lls Glu Glu Gly Val
-20				-10
Ser Leu Asp Lys Ag spp	Rte cys Au Glu Pn Pt Ty Gly	Pro
-5			1	5 10
Cys Lys Al	Ag	Ile	He	Arg Ty Rie Tc An Aa Glu Al Gly	Au
	15			20 25
Ccs Gln Tr	PEh	Val	Tsr Gly Gy CCy Arg Aa Lys Sse tAs tAs	FFh
30				35 40
Lys Ses Aa	Glu	Asp	Cys Met Glu ICr CM Gly GTy As
45				55 55

(£) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM £7 (l) CHARAKKERYSTYKA SEKWENNCi;

	(C) (B) (C) (D)	DLUlOSC: 508 par zasad TYP: kwas nukleinowy· ILOSC NICI: jedna TOPOLOGIA: liniowa
(ii)	RODZAJ	CZĄSTECZKI: cDNA
(vi)	ZZODŁO	ORYYlNALNE:
	(C)	ORGANIZM: syntetyczna
(ix)	CECHA. (A) (B)	NAZWA/KLUCZ: CDS LOKALIZACJA: 77..499
(i X)	CECHA: (C) (B)	NAZWA/KLUCZ: sygyeptyd LOKALIZACJA: 77..331
(ix)	CECHA: (C)	NAZWA/KLUCZ: matjpeptyd

(B) LOKALIZACJA : 332..499 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 2-7:

GACTTCTCTT TACGACTAGT TTTCACTACG TAGCTACMM CCTATTAMTT CTMATATAC 6(0

MAAMOGCT CCACTC CCG TAG TCT CCT TCT iMC TCT? ACT¹ CGT CTT DCC 109

Mat: Mgr Ehe EPo See Ile Ehe TCh Ma Val Ilu

-85 -80 —75

CCT Phe	GCC GT ITT	CTT GTC TA GTT GTT TCC GTT ACC ACTT ACTC ACTC OM	157
MLi	Ma S^r	Ser -70	Ma Deu Ma	Ma	Ero -65	an	Mn Ήτ	Ώτ:-	TCh Gilu -60
GAC	GAA	ACTi GTC	TAC MS? CTT GTT	GCC	GTT	GCT MTT GCT	TAC	TTT. GA	205
Mp	Hu	ΐττ Ma	dn	ile EPo Ma	Glu M.a ad	He dy	iTy	See Ms>
		-55			-50				-45
CIA	GAC	GGG (GA	TTC	CGC CTT GT	(GIT	TT	TTC	TT? TT	JMC	ACG ACT	2^5
Leu	Glu	Gly Mp	Ehe	JMp Vv1 Ma	Vć^	leu	Pro	EPe Ser	Mn	Ssu 0?
		-40		-35				-30
MCC	MMC	HG TA	TTT	TTC MA CCT	ACT	MTT	ACC	gt: cgc	ACT	TCT GT?	3101
Mn	Mn	dy Leu	Lu	Phe Ile Mn	Cht	Thr	Ile	Ma Ser	Ile	CLa Ma
	-25			-20				-15
CAA	GAA	GAA TiT	dTC	CTT Td GM MCC Ad GA?	TTC CGT	CTG	TAC CTT	3^^S9
Lys	Glu	du dy	Val	Ser leu Mp Lys Arg Mp	IPie Cys	Leu	Glu EPo
-10				-5			1			5
CCC	TCC	ATT GCT	CTTC	CTC MCC GT?	ACTA ATT	MT	MG TCC	TTT	TAC MAC?	397
Pro	Cyt	Cht Gly	RTO	T/s Lys Ma	Mg	Ile	Ile	Pcg Ts-	Ehe	Cyt Mn
		10			15				22
GCT	GAA	GTT HT	TT	CGT CTCc AAC	TTT	GIT	ta:	di gg	tg:	AGA CGT	445
Ala	du	MLi dy	Iyu	Ts dn TCh	Ehe	Val	“Τγ	dy Gly	<TS Mg Ma
		25		33				35
CCT	GAA	CCT MMT	CTT	MC TT? GT	GA	GAT	TTT	AAC GAC	ACC? Td GGT	449
Lys	du	Mn Mn	IPe	See Mai	du	Mp	<Ts	MML Gilu	‘Th- <Ty Gly
	40			44				50

GGC GCC TAMTCCAGA 50S dy Ala (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 28:

(I) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 141 aminokwasów (B) TYP: ammokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (II) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (Xl) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 28:

Mat Arg Ełie EPro Ser Ile Fhe Ihr ALa leu He Ha ALa Ser Ser
-85	-80	-75	-70
ALa	Leu Ala Air Pro Vv1 Hn Gir Gir Tttro Alu Asą Glu Hr Ha	GGn
	-65	-60 -55
Ile	Pro ALa GIa Air Ή Ile Gly Tyr Ser Aą leu Glu Gly Hp	Phe
	-50	-45 -40
Asp	Val ALa Val Ilu Pro Phe See	Hn Ssu ITr Hn Hn Gly Hu	Hu
	-35 —30	-25
Fiu	Ile Asn Uh* Thr Ile Ala Ssu	Ile AGa AAa Lus GAu GAu GGy	wi
	-20 -15	-10
Ser	Leu Asp Lye An grp BEe Tys	Leu Alu Pro Pro Tyr Tir GGy	Pro
-5	1	5 11
cys	Lys ALa An Ιΐθ Ile Hg Ts*	Hee Tyr Asn Ala Alu Ala GGy	Hu
	15	20 25
Cys	Gln Ger Fhe Val Tyr GGy Gly Cys An Ala Lys Glu 0An Hn	Ehe
	30 35	44
Lys	Ser ALa GIa Aa? Cys; Mee Glu Ut* Cvs GIa. Gly Ma

55 55 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 29 (l) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(G)	DLUGOSC: 58	aminokwasom
(B)	TYP: aminok wasowa
(D)	TOPOLOGIA:	linoowa
(li) RODZAJ	CZĄSTECZKI:	białko

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 29:

Arg Eto Hp IF*e Cjs Lsu Alu Pro Pro Tyr Thr· Gly Pro Cys Lys Ha 15 10 15

Arg Ile Ile Hg Ty Rie Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Ty Gln ITr 20 25 30

Fhe VYl Gyr Gly G1g CJs Arg ALa Lys Grgo Asn Hn Phe Lys S^r AAa 35 40 45

Glu Asp Cys MeL· An The T/^s Gly Gly Ala 50 55

Fig. 2

Nerki lgoda-Nerki 3godi— Mocz 3gode.

Fig. 3 % dawki w moczu 20 τ-1-1-1-i-1-1-1-1-r

-3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6

Ładunek wypadkowy

Fig. 4 η

30 20 % dawki w nerkach po 3 godzinach fl

Ί-1-1-1-1—

70 80 90 100 temperatura denaturacji

Fig. 5

2,5 ί

1,5 1 wskaźnik akumulacji w nerkach

65 70 75 80 85 90 95 100 1 05 temperatura denaturacji

Fig. 6

5

MetAlaGluArgLeuGluLysArgGluProAspPheCysleuGluProProNcflI .

CATGGCTGAGAGATTGGAGAAGAGAGAGCCTGATTTCTGTTTGGAACCTCCACGACTCTTCAACCTCTTCTCTCTCGGACTAAAGACAAACCTTGGAGGT10 15 20 25

Ty rThrG 1 y Pr oCy sLy s A1 aAr g Ilell eArgTyrPheTyrAs nA1aG1uAvaII

TACACTGGTCClATGTAAAGCTAGAATCATCAGATACTTCTACAACdCCGAAATGTGACCAGGTACATifrCGATCTTAGTAGTCTATGAAGATGTTGCGGCrS30 35 40

AlaGlyLeuCysGlnThrPheValTyrGlyGlyCysArgAlaGluArgAsngctggtttgtgtcaaactttcgtttacggtggciJgcagagctgaaagaaacCGACCAAACACAGTTTGAAAGCAAATGCCACCGACGTCT^GACTTTCTTTG45 50 55 58

AsnPheGluSerAlaGluAspCysMetArgThrCysGlyGlyAlaStop

Xbal

AACTTCGAAljCTGCTGAAGACTGCATGAGAACTTGTGGTGGTGCCTAAT

TTGAAGCTTAGACG^TTCTGACGTACTCTTGAACACCACCACGGATTAGATC

Fig. 1

Departament Wyda—met— UP RP Nakład 90 egz

Cena 1,50 zł

Claims (18)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania analogu aprotyniny o wzorze ogólnym R¹ Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro R² Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile R³ Tyr Phe Tyr R⁴ Ala R⁵ Ala Gly Leu Cys R⁶ Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg R⁷ R⁸ R⁹ Asn R^w Phe R11 Ser Ala Glu Asp Cys Met R” Thr Cys Gly Gly Ala, w którym Ri oznacza dipeptyd wybrany z grupy złozonej z Arg-Pro, Glu-Pro, Asp-Pro, Ala-Pro, Ile-Pro, Thr-Pro, His-Pro, Leu-Pro, Gly-Pro i Ser-Pro, Pro lub Ri oznacza atom wodoru, R2 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Tyr, Glu, Asp, Ser, Thr, Ala i Val, R3 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złozonej z Arg, Glu, Asp, Leu, Ser, Ala, Gin i Thr, R⁴ oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złozonej z Asn, Glu i Asp, R5 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złozonej z Lys, Glu, Asp, Thr, Val, Ala, Ser, Phe, Gin i Gly, R6 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Gln, Glu, Asp, Val i Ala, r7 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Ala, Asp, Glu i Gly, R8 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Lys, Glu, Asp, Asn, Ser, Thr i Ala, R9 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Arg, Glu, Asp, Ser, Asn, Leu, Gly, Gln, Met i Thr, R¹° oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Asn, Glu i Asp, R” oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Lys, Glu, Asp, Leu, Tyr, Ala, Val, Thr, Ser, Pro, His i Ile, a R oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Arg, Glu, Asp, Gin, Ala, Asn, His, Gly, Ser i Thr, z tym, że przynajmniej jedna z reszt aminokwasowych Ri do Ri2 jest inna niż odpowiadająca jej reszta aminokwasowa natywnej aprotyniny i że gdy Ri oznacza atom wodoru, wówczas przenajmniej jedna z reszt aminokwasowych od R2 do Ri2 jest inna niż odpowiadająca jej reszta aminokwasowa natywnej aprotyniny, z wyłączeniem analogów aprotyniny 3-58 i analogów aprotyniny (3-58, 42Ser), znamienny tym, że hoduje się komórkę zawierającą rekombinantowy wektor ekspresyjny stanowiący konstrukcję DNA zawierającą sekwencję DNA kodującą ten analog aprotyniny w warunkach umożliwiających ekspresję analogu aprotyniny i odzyskuje się z hodowli powstały analog.
2. 2. Sposób według zastrz. i, znamienny tym, że stosuje się konstrukcję DNA obejmującą sekwencję DNA kodującą analog aprotyniny, zawierającą sekwencję DNA kodującą jedną lub większą liczbę reszt aminokwasowych o ładunku ujemnym lub obojętnym dodaną przy 5'- końcu sekwencji kodującej aprotyninę.
3. 3. Sposób według zastrz. i, znamienny tym, że stosuje się konstrukcję DNA obejmującą sekwencję DNA kodującą analog aprotyniny, zawierającą sekwencję DNA kodującą jedną lub większą liczbę reszt aminokwasowych o ładunku ujemnym lub obojętnym dodaną przez 3' - końcu sekwencji kodującej aprotyninę.
4. 4. Sposób według zastrz. i, znamienny tym, że stosuje się konstrukcję DNA obejmującą sekwencję DNA kodującą analog aprotyniny o wzorze ogólnym Ri Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro R2 Thr Gly Pro Cys R” R” Ri5 r16 r17 r3 Tyr Phe Tyr R4 Ala R⁵ Ala Gly Leu Cys r6 Thr Phe Ri 8 Tyr Ri9 Gly Cys r2° r7 r8 r9 Asn Ri° Phe R” Ser Ala Glu Asp Cys Met Ri2 Thr Cys Gly Gly Ala, w którym R¹ oznacza dipeptyd wybrany z grupy złożonej z Arg-Pro, Glu-Pro, Asp-Pro, Ala-Pro, He-Pro, Thr-Pro, His-Pro, Leu-Pro, Gly-Pro i Ser-Pro, Pro lub R” oznacza atom wodoru, R2 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Tyr, Glu, Asp, Ser, Thr, Ala i Val, R3 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Arg, Glu, Asp, Leu, Ser, Ala, Gin i Thr, R4 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złozonej z Asn, Glu i Asp, R⁵ oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Lys, Glu, Asp, Thr, Val, Ala, Ser, Phe, Gln i Gly, R6 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Gin, Glu, Asp, Val i Ala, R7 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złozonej z Ala, Asp, Glu i Gly, R⁸ oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złozonej z Lys, Glu, Asp, Asn, Ser, Thr i Ala, R9 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Arg, Glu, Asp, Ser, Asn, Leu, Gly, Gin, Met i Thr, R” oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Asn, Glu i Asp, R” oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Lys, Glu, Asp, Leu, Tyr, Ala, Val, Thr, Ser, Pro, His i

   168 250

   Ile, a R¹² oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Arg, Glu, Asp, Gin, Ala, Asn, His, Gly, Ser i Thr, z tym, ze przynajmniej jedna z reszt aminokwasowych R1 do jest inna niż odpowiadająca jej reszta aminokwasowa natywnej aprotyniny i ze gdy R1 oznacza atom wodoru, ..,λ—,—________---.—„„i—i,.,· —i o— .:„ id¹² wuwuzad ριζΛ/iiajnimvj jLUita z, ilółl αιιιιιιυκνναουνν jvtt mm ak mm ak jvol nuta mz, uMpu wiauaj4va jvj reszta aminokwasowa natywnej aprotyniny, R13 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Lys, Arg, Glu, Leu, Met, Tyr i Phe, R1⁴ oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Ala i Gly, R1⁵ oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złozonej z Arg, Ala, Gly, Lys, Leu, Met, Phe, Tyr, Ile i Asn, R¹⁶ oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Ile, Met, Leu, Phe, Thr i Glu, R¹⁷ oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złozonej z Ile, Leu, Lys, Gin, Glu, Ser, Arg, Thr i Asn, R¹⁸ oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Val, Thr, Leu, Ser, Tyr, Gin, His, Pro, Phe, Asn, Ile i Lys, R¹⁹ oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Gly, Thr i Ser, a R2⁰ oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Gly, Lys, Met, Asn, Leu, Gly i Glu, z tym, że przynajmniej jedna z reszt aminokwasowych R doR i przynajmniej jedna z reszt aminokwasowych od R doR jest inna niż odpowiadająca jej reszta aminokwasowa natywnej aprotyniny i że gdy R1 oznacza atom wodoru, wówczas R15 ma znaczenie inne niż Ala, R1 ma znaczenie inne niż Glu, a R9 ma znaczenie inne niż Ser i że gdy R^⁵ oznacza Ala, wówczas R9 ma znaczenie inne niż Ser, z wyjątkiem aprotyniny (3-58, 17Ala), aprotyniny (3-58, 17Ala + 19Glu), aprotyniny (3-58, 15Arg + 17Ala), aprotyniny (3-58, 17Ala-42Ser), aprotyniny (3-58, 17Ala + 19Glu + 42Ser), aprotyniny (3-58, 15Arg+ 17Ala + 42Ser), aprotyniny (17Ala + 42Ser) i aprotyniny (15Arg + 17Ala + 42Ser).
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się konstrukcję DNA obejmującą sekwencję DNA kodującą analog aprotyniny, w którym R1 oznacza Glu-Pro, R⁵ oznacza Glu, R⁸ oznacza Glu, R oznacza Glu a R2, R³, r4, R⁵, R⁶, r7, r9, r^w i r12 mają takie same znaczenie jak w natwynej sekwencji aprotyniny.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się konstrukcję DNA obejmującą sekwencję DNA kodującą analog aprotyniny, w którym R¹ oznacza Glu-Pro, R9 oznacza Glu, R11 oznacza Glu, a R ,R,R,R,R,R,R iR mają takie same znaczenie jak w natywnej sekwencji aprotyniny.
7. 7. Sposób według zastrz. 1 , aiamiemiy tym , że stosuje się konstrukcję DNA c^t^cjmŁjj^^ą sekwencję DNA kodującą analo aprotyniny, w którym R9 oznacza Glu, R11 oznacza Glu, a R1, R⁶, R⁷, R⁸, R¹⁰ i R¹² mają takie same znaczenie jak w natywnej sekwencji

   R, R, R⁴, R⁵ aprotyniny.
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się konstrukcję DNA zawierającą sekwencję DNA kodującą analog aprotyniny, w którym Ri oznacza Ser, R4 oznacza Asp, R⁵ oznacza Thr, R6 oznacza Glu, R^s oznacza Asn, R¹² oznacza Glu, a R1, R³, R7, r9, R¹⁰1R¹¹ mają takie same znaczenie jak w natywnej sekwencji aprotyniny.
9. 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się konstrukcję DNA zawierającą sekwencję DNA kodującą analog aprotyniny, w którym R2 oznacza Ser, R³ oznacza Leu, R7 oznacza Gly, R^a oznacza Asn, R9 oznacza Gly, R^w oznacza Gin, R11 oznacza Tyr, a R1, r4, R⁵, r6 i R12 mają takie same znaczenie jak w natywnej sekwencji aprotyniny.
10. 10. Sposób według zastrz. 1, znamiennyAym, że stosuje się konstrukcję DNA zawierającą sekwencję DNA kodującą analog aprotyniny, w którym R1 oznacza atom wodoru, R9 oznacza Ser,

    R4, R⁵, r6, r7, r⁸, r^w i rH mają takie same znaczenie jak w natywnej

    R oznacza Glu, a R , R‘ sekwencji aprotyniny.
11. 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się konstrukcję DNA zawierającą sekwencję DNA kodującą analog aprotyniny, w którym R1 oznacza atom wodoru, R9 oznacza Ser, R11 oznacza Ala a R2, R³, r4, R⁵, r6, r7, r⁸, r^w i r1 mają takie same znaczenie jak w natywnej sekwencji aprotyniny.
12. 12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje się konstrukcję DNA zawierającą sekwencję DNA kodującą analog aprotyniny, w którym R1 oznacza atom wodoru, R2 oznacza Ser, R oznacza Asp, R oznacza Thr, R oznacza Glu, R oznacza Asn, R oznacza Glu, a R , R ,R , R^w i Rn mają takie same znaczenie jak w natywnej sekwencji aprotyniny.
13. 13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje się konstrukcję DNA zawierającą sekwencję DNA kodującą analog aprotyniny, w którym R1 oznacza atom wodoru, R⁴ oznacza Asp,

    168 250

    R⁵ oznacza Thr, R⁶ oznacza Glu, R¹² oznacza Glu, a R², R³, R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰ i R¹¹ mają takie same znaczenie jak w natywnej sekwencji aprotyniny.
14. 14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się konstrukcję DNA zawierającą ~ ___; _ ta\t a i i______x— · — i_x x______________ x------ j _ t-»2_______o _ .

    sekwencję dna kodującą analog aprotyniny, w którym r oznacza atom wodoru, r oznacza Ser, R7 oznacza Gly, R8 oznacza Asn, R⁹ oznacza Gly, R1² oznacza Glu, a R3, R⁴, r5, R⁶, r10 i r¹¹ mają takie same znaczenie jak w natywnej sekwencji aprotyniny.
15. 15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się konstrukcję DNA zawierającą sekwencję DNA kodującą analog aprotyniny, w którym R¹ oznacza atom wodoru, R9 oznacza Ser, Ri2 oznacza Glu, a R2, r3, r4, r⁵, r®, Rr, r8, r10 i Rii mają takie same znaczenie jak w natywnej sekwencji aprotyniny.
16. 16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się konstrukcję DNA zawierającą sekwencję DNA kodującą analog aprotyniny, w którym Ri oznacza atom wodoru, R⁹ oznacza Glu, R oznacza Glu, aR,R,R,R,R,R,R,R iR mają takie same znaczenie jak w natywnej sekwencji aprotyniny.
17. 17. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się konstrukcję DNA zawierającą sekwencję DNA kodującą analog aprotyniny, w którym Ri oznacza atom wodoru, R5 oznacza Glu, R9 oznacza Ser, R^voznacza Glu, a R2, r3, r4,r®,r⁷,r8, Rio i Rii mają takie same znaczenie jak w natywnej sekwencji aprotyniny.
18. 18. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje się konstrukcję DNA zawierającą sekwencję DNA kodującą analog aprotyniny, w którym Ri oznacza atom wodoru, R5 oznacza Glu, R9 oznacza Glu, oznacza Glu, a R², R3, r4, r7, r8, Rio i Rii mają takie same znaczenie jak w natywnej sekwencji aprotyniny.