FI105036B - DNA-rakenne, jossa on aprotiniinianalogia koodaava DNA-sekvenssi, ja menetelmä aprotiniinianalogien tuottamiseksi - Google Patents

Description

105036 DNA-rakenne, jossa on aprotiniinianalogia koodaava DNA-sekvenssi, ja menetelmä aprotiniinianalogien tuottamiseksi 5 Tämä keksintö liittyy aprotiniinianalogeja koodaaviin DNA-rakenteisiin ja menetelmään analogien tuottamiseksi.

Aprotiniini (joka myös tunnetaan nimellä naudan haimatrypsiini-inhibiittori, BPTI, engl. bovine pancreatic trypsin inhibitor) on useissa naudan elimissä ja kudoksissa, esimer-10 kiksi imusolmukkeissa, haimassa, keuhkoissa, korvasylkirauhasessa, pernassa ja maksassa läsnä oleva emäksinen proteiini. Se on yksiketjuinen 58 aminohappojäämän poly-peptidi, jonka aminohappojärjestys on:

Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala 15 Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gin Thr

Phe Vai Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala

Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala

Aminohappoketjun silloittaa kolme disulfidisiltaa, jotka sijaitsevat väleissä Cys(5) ja 20 Cys(55), Cys(14) ja Cys(38) sekä Cys(30) ja Cys(51).

; ' ’ Aprotiniinin isoelektrinen piste on melko korkea (noin pl 10,5). Tämä johtuu pääasialli-• : : sesti suhteellisen suuresta positiivisesti varautuneiden aminohappojen lysiinin ja argi- ψ ..’ niinin pitoisuudesta. Aprotiniinimolekyyli on kolmiulotteiselta rakenteeltaan hyvin tiivis 'l ‘25 ja kestää erittäin hyvin korkeista lämpötiloista, hapoista, emäksistä tai orgaanisista liu-j ·*: ottimista johtuvaa denaturoitumista samoin kuin proteolyyttistä pilkkoutumista (vrt. B.

Kassell, Meth. Enzym. 19, s. 844-852, 1970).

Aprotiniinin tiedetään inhiboivan seriiniproteaaseja, trypsiini, kymotrypsiini, plasmiini .•;..30 ja kallikreiini mukaan lukien, ja sitä käytetään terapeuttisesti hoidettaessa akuuttia i i « - pankreatiittia, erilaisia sokkeja, hyperfibrinolyyttistä hemorragiaa ja sydäninfarktia (vrt.

·'.*·: esim. J. E. Trapnell et ai., Brit. J. Surg. 61, s. 177, 1974; J. McMichan et ai., Circulato- ry shock 9, s. 107, 1982; L. M. Auer et ai., Acta Neurochir. 49, s. 207, 1979; G. Sher, Am. J. Obstet. Gynecol. 129, s. 164, 1977 ja B. Schneider, Artzneim.-Forsch. 26, s. 35 1606, 1976). Antamalla aprotiniinia suuria määriä saadaan huomattavasti vähennettyä verenhukkaa sydänleikkausten yhteydessä, kardiopulmonaaliset ohitusleikkaukset mukaan lukien (vrt. esim. B. D. Bidstrup et ai., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 97, s. 364-372, 1989; W van Oeveren et ai., Ann. Thorac. Surg. 44, s. 640-645, 1987).

2 105036

Aprotiniinianalogeja tunnetaan, esim. US-4595674 tuo esiin aprotiniinianalogeja ja -johdannaisia, joissa Lys(15) on korvattu jollain seuraavista: Gly, Ala, Vai, Leu, Ile, Met, Arg, L-a-voihappo, L-norvaliini, L-norleukiini, dehydroalaniini ja L-homoseriini. EP-238993 kuvaa aprotiniinianalogeja, joissa Lys(15) on korvattu jollain seuraavista: 5 Arg, Vai, Ile, Leu, Phe, Gly, Ser, Trp, Tyr ja Ala, Met(52) on edelleen korvattu jollain seuraavista: Glu, Vai, Leu, Thr ja Ser. EP-307592 tuo esiin aprotiniinianalogeja, joissa yksi tai useampi aminohapoista asemissa 15, 16, 17, 18, 34, 39 ja 52 on korvattu toisella aminohappojäämällä. WO-89/01968 kuvaa menetelmää tuottaa aprotiniinia tai aprotiniinianalogeja hiivassa ja tuo erityisesti esiin analogit, joista puuttuu yksi tai kaksi ami-10 nohappojäämää N-terminaalissa ja joissa Lys(41) ja/tai Arg(42) on korvattu toisella aminohappojäämällä, erityisesti seniilillä. EP-339942 tuo esiin aprotiniinianalogeja, joissa yksi tai useampi aminohappo asemissa 1, 2, 12-19, 38, 41 ja 42 on deletoitu tai korvattu toisella aminohappojäämällä. Näissä lähteissä kuvatut aminohapposubstituutiot ovat löydettävissä aprotiniinimolekyylin proteaasisitoutumisalueelta tarkoituksena pro-15 teaasi-inhibitioprofiilin muuttaminen paitsi Met(52):n substituoiminen EP-238993:n mukaan ja Lys(41):n ja/tai Arg(42):n substituoiminen WO-89/01968:n mukaan, jotka toteutetaan helpottamaan aprotiniinin tuottamista E. colissa ja hiivassa.

Aiemmin on kuvattu, että kun natiivia aprotiniinia ruiskutetaan eläimiin tai vapaaehtoi-20 siin ihmisiin plasman inhibiittoripitoisuus vähenee melko nopeasti solunulkoiseen nesteeseen jakaantumisen ja myöhemmän munuaisiin kerääntymisen vuoksi (I. Trautschold et ai. teoksessa K. Heinkel and H. Schön (Eds.): Pathogenese, Diagnostik, Klinik und : Therapie der Erkrankungen des Exokrinen Pankreas, Schattauer, Stuttgart, s. 289, 1964; ,,'Γ E. Habermann et ai., Med. Welt 23(29), s. 1163-1167, 1973); H Fritz et ai., Hoppe- ':"Ö5 Seylers Z. Physiol. Chem. 350, s. 1541-1550, 1969 ja H. Kaller et ai., Eur. J. Drug Me-tab. Pharmacokin. 2, s. 79-85, 1978). Glomerulussuodatuksen jälkeen aprotiniini on si-toutunut hyvin suuressa määrin tubulussolujen ulokkeiden kalvoon. Aprotiniini uudel-leenabsorboituu sitten mikropinosyyttisiin rakkuloihin ja fagosomeihin ja sen jälkeen . ·:, seuraa erittäin hidas pilkkoutuminen fagolysosomeissa. Tämän tyyppisen kulkeutumisen • · · 30 on ajateltu olevan tyypillistä peptideille yleensä (M. Just and E. Habermann, Navnyn-Scmiedebergs Arch. Pharmacol. 280, s. 161-176, 1973; M. Just, Navnyn-Scmiedebergs Arch. Pharmacol. 287, s. 85-95, 1975).

> . ) , Aprotiniiniannon jälkeen suoritetuissa makroskooppisissa ja histopatologisissa kokeissa • € 4 35 on havaittavissa muutoksia rottien, kaniinien ja koirien munuaiskudoksessa kun aprotiniinia on annettu toistuvina suhteellisen suurina ruiskeina (Bayer, Transylol, Inhibitor of proteinase; E. Glaser et ai., Verhandlungen der Deutchen Gesellschaft fur Innere Medizin, 78. Kongress, Bergmann, Munchen, s. 1612-1614, 1972). Aprotiniinin havait- 3 105036 tu nefrotoksisuus (ilmenee esim. leesioina) saattaa johtua aprotiniinin kerääntymisessä munuaisten proksimaalisiin tubulussoluihin. Tämän nefrotoksisuuden vuoksi aprotiniini ei ole niin sopiva kliinisiin tarkoituksiin, erityisesti sellaisiin, jotka vaativat suuria in-hibiittoriannoksia (esimerkiksi kardiopulmonaaliset ohitusleikkaukset).

5

Olisi siis huomattavan edullista saada aikaan aprotiniinianalogeja, joiden nefrotoksisuus olisi pienempi kuin natiivilla aprotiniinilla.

Tämä keksintö liittyy vähemmän nefrotoksiseen aprotiniinianalogiin, jossa vähentyneen 10 positiivisen kokonaisvarauksen aikaansaamiseksi vähintään yksi positiivisesti varautunut aminohappojäämä proteaasisitoutumiskohdan ulkopuolella on poistettu tai korvattu neutraalilla tai negatiivisesti varautuneella aminohappojäämällä, ja/tai johon on insertoi-tu tai lisätty vähintään yksi negatiivisesti varautunut aminohappojäämä, ja/tai vähintään yksi neutraali aminohappojäämä on korvattu negatiivisesti varautuneella aminohappo-15 jäämällä ja/tai stabiiliuden vähentämiseksi yksi tai useampi aminohappojäämä deletoi-daan, lisätään tai korvataan yhdellä tai useamalla aminohappojäämällä.

Tässä yhteydessä termillä "vähentynyt positiivinen kokonaisvaraus" tarkoitetaan analogeja, joiden positiivinen kokonaisvaraus on pienempi kuin natiivilla aprotiniinilla (jonka 20 positiivinen kokonaisvaraus on +6), samoin kuin analogeja, joilla ei ole kokonaisvaraus-ta tai joilla on negatiivinen kokonaisvaraus. Huomattakoon, että aprotiniinin kokonais-·' " varaus voi vaihdella pH:n mukaan, ja että termit "positiivinen kokonaisvaraus", "ne-:: gatiivinen kokonaisvaraus", "positiivisesti varautunut" ja "negatiivisesti varautunut" tar- ..'koittavat molekyylin varausta neutraalissa pH-arvossa.

:··&5 Γ·\· Termillä "proteaasisitoutumiskohta" tarkoitetaan aminohappojäämiä, jotka ovat tärkeitä • · proteaasi-inhibition kannalta eli aminohappojäämiä, jotka ovat tiivisti kosketuksissa « proteaasiin sitoutuessaan aminohappojäämiin entsyymin aktiivisessa kohdassa tai lähel-lä sitä. Näihin luetaan nykyisin (ja tässä yhteydessä määritellään) aminohappojäämät .*.. 30 kohdissa 12-18 ja 34-39 (vrt. H. Fritz ja G. Wunderer, Artzneim.-Forsch. 33(1), p. 484, 1983). On suositeltavaa poistaa, insertoida tai korvata aminohappojäämiä proteaasisitou-tumiskohdan ulkopuolella vain siksi, että saataisiin estettyä keksinnön mukaisen analo-• " ‘' ί gin proteaasi-inhibitioprofiilin olennainen muuttuminen natiiviin aprotiniiniin verrattu-. . . na.

35

Yllättäen on havaittu, että positiiviselta kokonaisvaraukseltaan pienempien aprotiniini- analogien nefrotoksisuus on huomattavasti vähäisempi kuin natiivilla aprotiniinilla. Eräs syy vähentyneeseen nefrotoksisuuteen voi olla, että postiiviselta nettovaraukseltaan pie- 4 105036 nempien aprotiniinianalogien sitoutumisaktiivisuus proksimaalisten tubulusten pinnalla on vähentynyt, niin että niitä erittyy runsaasti virtsaan. Tämä selitys on yhdenmukainen tulosten kanssa, joita ovat saaneet H. Fritz et ai., op. cit. ja joiden mukaan kemiallisesti modifioidut aprotiniinijohdannaiset (tetramaleoyyli- ja pentamaleoyylijohdannaiset), 5 jotka ovat vähemmän emäksisiä kuin natiivi aprotiniini, eivät sitoudu erilliseen solujen ulokkeiden fraktioon, vaan niitä erittyy runsaasti virtsaan.

Toisaalta kemiallisesti modifioitu aprotiniini eroaa suuresti aprotiniinista ja muista na-tiiveista proteiineista siinä, että se sisältää aminohappojohdannaisia, joita ei löydy yh-10 desiäkään luonnossa ilmenevästä makromolekyylistä. Ei siis voida sulkea pois mahdollisuutta, että kemiallisesti modifioitujen johdannaisten munuaisiin kerääntymättä jääminen saattaa johtua modifioitujen johdannaisten muista muuttuneista ominaisuuksista kuin vähentyneestä positiivisesta kokonaisvarauksesta.

15 Muiden peptidien affiniteetin ja kyvyn sitoutua ulokekalvoon on havaittu olevan vähäisempi kuin aprotiniinilla huolimatta siitä, että ne sisältävät positiivisesti varautuneita aminohappoja ja/tai että ne ovat negatiivisesti varautuneita. Tämä viittaa siihen, että aprotiniinin positiivinen kokonaisvaraus ei ole ainoa selitys aprotiniinin sitoutumiseen ja kerääntymiseen proksimaalisiin tubulussoluihin (M. Just et ai., 1st. Symp. Physiol., 20 Prop. Pharmacol. Ration.: Kininogenases, Schattauer, Stuttgart, pp. 1163-1167, 1973).

; ' ‘ Lisäksi on yllättäen havaittu, että vähemmän lämpöstabiilit aprotiniinianalogit eivät ke-' : räänny munuaiskudokseen samassa määrin kuin natiivi aprotiniini. Kuten edellä tuli esiin, aprotiniinin kolmiulotteinen rakenne tekee siitä erittäin kompaktin ja sen uskotaan « ':" 25 tekevän inhibiittorista erittäin stabiilin denaturoitumista ja proteolyyttistä pilkkoutumis-ta vastaan. Aprotiniinin kerääntyminen munuaisiin voi siis johtua myös inhibiittorin ta-vattomasta stabiiliudesta. On siis mahdollista, että kun substituoidaan yksi tai useampi aminohappojäämä aprotiniinimolekyylissä muodostuu aprotiniinianalogeja, joiden sta-biilius on vähäisempi kuin natiivilla molekyylillä. Tässä yhteydessä "vähentynyt stabii-.•;..30 lius" voidaan selektiivisesti määritellä analogin vähentyneeksi lämpöstabiiliudeksi vesi-

• I I

liuoksissa pH-arvoissa 4-10. Tällaisen vähentyneen stabiiliuden vaikutus in vivo voi oi- • · la, että analogi helpommin pilkkoutuu, esimerkiksi proteolyyttisesti, niin että analogi ': ’'! nopeammin poistuu proksimaalitubuluksista.

«

« * I

• « « 35 Tällä hetkellä uskotaan, että keksinnön mukaisten analogien vähentynyt nefrotoksisuus * « johtunee vähentyneen positiivisen nettovarauksen ja molekyylin vähentyneen stabiiliu den yhteisvaikutuksesta.

105036 5

Osasyy natiivin aprotiniinin annon munuaisille aiheuttamiin vahinkoihin voi olla, että aprotiniini kerääntyy munuaiskerästen kalvoihin kalvon pinnan negatiivisesti varautuneisiin rakenteisiin kohdistuvan affiniteettinsa vuoksi. Tämä saattaa johtua munuaiskerästen laajentuneesta huokoskoosta ja sen myötä lisääntyneestä suurten molekyylien, 5 esimerkiksi albumiinin, permeabiliteetista, mikä puolestaan saattaa aiheuttaa munuaisten proteiiniylikuormittumista. On todennäköistä, että keksinnön mukaisen aprotiniini-analogin natiiviin aprotiniiniin verrattuna vähäisempi vahingollinen vaikutus munuaske-räskalvon huokoskokoon johtuu vähentyneestä affiniteetista negatiivisesti varautuneisiin rakenteisiin tuolla kalvolla.

10

Lisäksi on havaittu, että aprotiniinin anto aiheuttaa joissain tapauksissa anafylaktisen vasteen. On oletettu, että tämä anafylaktinen vaste liittyy histamiinin vapautumiseen, jonka aprotiniinin positiivinen kokonaisvaraus on käynnistänyt. Voidaan siis odottaa, että natiivin aprotiniinin antoon liittyvää anafylaktista vastetta voidaan vähentää tai se 15 voidaan jopa poistaa antamalla tämän keksinnön mukaista aprotiniinianalogia.

Keksinnön mukaan voidaan mikä tahansa positiivisesti varautunut aminohappojäämä proteaasisitoutumiskohdan ulkopuolella korvata joko negatiivisesti varautuneilla amino-happojäämillä Glu tai Asp tai millä tahansa neutraaleista aminohappojäämistä Ala, Cys, 20 Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Glu, Ser, Thr, Vai, Trp, Tyr. Kuitenkin molekyylin ei toivotusta laskostumisesta johtuvien inaktiivisten tai kolmiulotteiselta raken-; *' teeltaan vääränlaisten analogien muodostumisen välttämiseksi on kuitenkin suositelta- ' ’ : vaa valita substituutiot, jotka ovat samoja kuin muissa proteaasi-inhibiittoreissa vastaa- « .,Y vissa kohdissa tai laajempien rakenteiden alueilla, jotka ovat suuressa määrin homolo- *· -25 gisia natiivin aprotiniinin kanssa. Toisin sanoen substituenttiaminohappojäämien valinta {*·*: kannattaa perustaa aprotiniinin kanssa homologisten molekyylien analyysiin. Huomatta- koon, että suoraan positiivisen kokonaisvarauksen vähenemiseen johtavien yhden tai useamman aminohapposubstituution kanssa voidaan suorittaa yksi tai useampi muu aminohapposubstituutio, joka ei sinänsä saa aikaan pienempää positiivista kokonaisva- ,·:·.30 rausta vaan joka saattaa olla tarpeen, jotta saadaan aktiivinen analogi, jolla on oikean-• # · . lainen kolmiulotteinen rakenne.

· • * · • ·· « · ':' ‘: Tarkemmin sanoen tämä keksintö liittyy aprotiniinianalogiin, jolla on yleinen kaava I: t

I I « I I

, · · ’ t 35 R1 Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro R2 Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile R3 Tyr Phe Tyr R4 Ala R5 Ala Gly Leu Cys R6 Thr Phe Vai Tyr Gly Gly Cys Arg R7 R8 R9 Asn R10 Phe R11 Ser Ala Glu Asp Cys Met R12 Thr Cys Gly Gly Ala (I) 6 105036 jossa R1 on dipeptidi, joka valitaan ryhmästä Arg-Pro, Glu-Pro, Asp-Pro, Ala-Pro, Ile-Pro, Thr-Pro, His-Pro, Leu-Pro, Gly-Proja Ser-Pro, Projapeptidisidos, 5 R2 on aminohappojäämä, joka valitaan ryhmästä Tyr, Glu, Asp, Ser, Thr, Alaja Vai, R3 on aminohappojäämä, joka valitaan ryhmästä Arg, Glu, Asp, Leu, Ser, Ala, Gin ja Thr, 10 R4 on aminohappojäämä, joka valitaan ryhmästä Asn, Glu ja Asp, R5 on aminohappojäämä, joka valitaan ryhmästä Lys, Glu, Asp, Thr, Vai, Ala, Ser, Phe, GlnjaGly, 15 R6 on aminohappojäämä, joka valitaan ryhmästä Gin, Glu, Asp, Vai ja Ala, R7 on aminohappojäämä, joka valitaan ryhmästä Ala, Asp, Glu ja Gly, 20 R8 on aminohappojäämä, joka valitaan ryhmästä Lys, Glu, Asp, Asn, Ser, Thr ja Ala, R9 on aminohappojäämä, joka valitaan ryhmästä Arg, Glu, Asp, Ser, Asn, Leu, Gly, : :': Gin, Met j a Thr, t > · · · , q .... 25 R on aminohappojäämä, joka valitaan ryhmästä Asn, Glu ja Asp, •« · · « • · Il \.*t R on aminohappojäämä, joka valitaan ryhmästä Lys, Glu, Asp, Leu, Tyr, Ala, Vai, ’ Thr, Ser, Pro, His ja Ile ja • · • * * li *·* 30 R on aminohappojäämä, joka valitaan ryhmästä Arg, Glu, Asp, Gin, Ala, Asn, His, : Gly, Ser ja Thr, • · • · · • · · • · 1 10 ....: sillä ehdolla, että vähintään yksi aminohappojäämistä R -R on erilainen kuin vastaava aminohappojäämä natiivissa aprotiniinissa.

v.35

III

:: Näiden aprotiniinimolekyylin sisäisten substituutioiden lisäksi saattaa olla mahdollista lisätä yhden tai useamman negatiivisesti varautuneen aminohappojäämän (esim. Glu tai = Asp) sisältävä peptidi aprotiniinimolekyylin N- tai C-terminaaliin aiheuttamaan vaadittu ϋ i 7 105036 positiivisen kokonaisvarauksen väheneminen. Edelleen voi olla mahdollista molekyylin stabiiliuden vähentämiseksi lisätä yksi tai useampi neutraali aminohappojäämä molekyylin N- tai C-terminaaliin. Tällaiset lisäykset voidaan tehdä joko natiiville aprotinii-nimolekyylille tai muun modifikaation lisäksi kuten aiemmin esitettiin.

5

Jos halutaan muuttaa aprotiniinianalogin muita proteaasi-inhibitio-ominaisuuksia kuin vähentää sen nefrotoksisuutta on mahdollista modifioida analogia vielä sen proteaasisi-toutumiskohdassa. Aiemmin on esimerkiksi osoitettu (vrt. H. R. Wenzel and H. Tschesche, Angew. Chem. Intemat. Ed. 20, s. 295, 1981), että aprotiniini(l-58, Väli 15) 10 osoittaa suhteellisen suurta selektiivisyyttä granulosyyttielastaasia kohtaan ja inhibito-rista vaikutusta kollagenaasiin, aprotiniinilla (1-58, Ala 15) on heikko vaikutus ekstaasiin ja aprotiniini (1-58, Glyl5) osoittaa erittäin huomattavaa antitrypsiiniaktiviteettia ja yllävästi myös inhiboi kallikreiinia. Lisäksi saattaa olla mahdollista modifioida aproti-niinin inhibitorista vaikutusta samanaikaisesti kuin vähentää positiivista kokonaisvaraus-15 ta korvaamalla yksi tai useampi positiivisesti varautunut aminohappo proteaasisitoutu-miskohdassa neutraalilla tai negatiivisesti varautuneella yhdellä tai useammalla aminohapolla.

Tämä keksintö liittyy myös aprotiniinianalogiin, jolla on yleinen kaava Π: 20 R1 Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro R2 Thr Gly Pro Cys R13 R14 R15 R16 R17 R3 Tyr Phe :'1. · Tyr R4 Ala R5 Ala Gly Leu Cys R6 Thr Phe R18 Tyr R19 Gly Cys R20 R7 R8 R9 Asn R10 : : ‘: Phe R11 Ser Ala Glu Asp Cys Met R12 Thr Cys Gly Gly Ala (Π) • • f · t

Ml ....25 jossa I· * • · · • · I· ··, R'-R12 ovat samat kuin määritettiin edellä, • · · ... R13 on aminohappojäämä, joka valitaan ryhmästä Lys, Arg, Glu, Leu, Met, Tyr ja Phe, « · · ··* *30 • ♦ · v : R14 on aminohappojäämä, joka valitaan ryhmästä Alaja Gly, • · * · · · · • · , c R on aminohappojäämä, joka valitaan ryhmästä Arg, Ala, Gly, Lys, Leu, Met, Phe, Tyr, Ile ja Asn, '•:<:35 • »· ... · R16 on aminohappojäämä, joka valitaan ryhmästä Ile, Met, Leu, Phe, Thr ja Glu, 105036 g R17 on aminohappojäämä, joka valitaan ryhmästä Ile, Leu, Lys, Gin, Glu, Ser, Arg, Thuja Asn, R18 on aminohappojäämä, joka valitaan ryhmästä Vai, Thr, Leu, Ser, Tyr, Gin, His, Pro, 5 Phe, Asn, Ile ja Lys, R19 on aminohappojäämä, joka valitaan ryhmästä Gly, Thr ja Ser ja R20 on aminohappojäämä, joka valitaan ryhmästä Gin, Lys, Met, Asn, Leu, Gly ja Glu, 10 1 ίο sillä ehdolla, että vähintään yksi aminohappojäämistä R -R ja vähintään yksi amino-happojäämistä R13-R20 on erilainen kuin vastaava aminohappojäämä natiivissa aproti-niinissa.

15 Esimerkkejä tällä hetkellä suositeltavimmista yleisen kaavan (I) mukaisista aprotiniini-analogeista: analogi, jossa R1 on Glu-Pro, R5 on Glu, R8 on Glu ja R2, R3, R4, R6, R7, R9, R10 ja R12 ovat samat kuin natiivissa aprotiniinisekvenssissä; tai jossa R1 on Glu-Pro, R9 on Glu, R11 on Glu ja R2, R3, R4, R6, R7, R8, R10 ja R12 ovat samat kuin natiivissa aprotiniinisekvenssissä; tai jossa R9 on Ghi, R11 on Glu ja R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, 20 R8, R10 ja R12 ovat samat kuin natiivissa aprotiniinisekvenssissä; tai jossa R2 on Ser, R4 on Asp, R5 on Thr, R6 on Glu, R8 on Asn, R12 on Glu ja R1, R3, R7, R9, R10 ja R11 ovat : · · samat kuin natiivissa aprotiniinisekvenssissä; tai jossa R on Ser, R on Leu, R on Gly, • ,· : R8 on Asn, R9 on Gly, R10 on Gin, R11 on Tyr ja R1 R4, R5, R6 ja R12 ovat samat kuin >§;:· natiivissa aprotiniinisekvenssissä; tai jossa R1 on peptidisidos, R9 on Ser, R11 on Glu ja -: * · *25 R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R10 ja R12 ovat samat kuin natiivissa aprotiniinisekvenssissä; ·*·*: tai jossa R1 on peptidisidos, R9 on Ser, R11 on Alaja R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R10 ja R ovat samat kuin natiivissa aprotiniinisekvenssissä; tai jossa R on peptidisidos, R on Ser, R4 Asp, R5 on Thr, R6 on Glu, R8 on Asn, R12 on Glu ja R3, R7, R9, R10 ja R11 ... ovat samat kuin natiivissa aprotiniinisekvenssissä; tai jossa R1 on peptidisidos, R4 on *L. 30 Asp, R5 on Thr, R6 Glu, R12 on Glu ja R2, R3, R7, R8, R9, R10 ja R11 ovat samat kuin • · .

’ natiivissa aprotiniinisekvenssissä; tai jossa R1 on peptidisidos, R2 on Ser, R7 Gly, R8 on Asn, R9 on Gly, R12 on Glu, ja R3, R4, R5, R6, R10 ja R11 ovat samat kuin natiivissa •: ; aprotiniinisekvenssissä; tai jossa R1 on peptidisidos, R9 on Ser, R12 Glu ja R2, R3, R4, /. R5, R6, R7, R8, R10 ja R11 ovat samat kuin natiivissa aprotiniinisekvenssissä; tai jossa R1 ;!:’35 on peptidisidos, R9 on Glu, R12 on Glu ja R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R10 ja R11 ovat sa-*"·* mat kuin natiivissa aprotiniinisekvenssissä; tai jossa R1 on peptidisidos, R5 on Glu, R9 on Ser, R12 on Glu ja R2, R3, R4, R6, R7, R8, R10 ja R11 ovat samat kuin natiivissa apro- 105036 9 tiniinisekvenssissä; tai jossa R1 on peptidisidos, R5 on Glu, R9 on Glu, R12 on Glu ja R2, R3, R4, R6, R7, R8, R10 ja R11 ovat samat kuin natiivissa aprotiniinisekvenssissä.

Keksintö koskee erityisesti aprotiniinianalogia koodaavaa DNA-rakennetta. Keksinnön 5 mukainen DNA-rakenne voidaan syntetoida tunnetuin standardimenetelmin, esim. fos-foamidiittimenetelmällä, jota ovat kuvanneet S. L. Beaucage ja M. H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22, s. 1859-1869, 1981, tai menetelmällä, jota ovat kuvanneet Matthes et ai., EMBO Journal 3, s. 801-805, 1984. Fosfoamidiittimenetelmässä oligonukleotiditi syntetoidaan, esimerkiksi automaattisesti DNA-syntetisaattorissa, puhdistetaan, lämpö-10 käsitellään, ligatoidaan ja kloonataan sopiviin vektoreihin.

On myös mahdollista käyttää genomista tai cDNA.ta, joka koodaa natiivia aprotiniinia (saatuna esimerkiksi seulomalla genomista tai cDNA-kirjastoa syntetoiduilla oligonu-kleotidikoettimilla), modifioituna yhdessä tai useammassa kohdassa, joissa aminohap-15 posubstituutiot halutaan tuottaa, esimerkiksi suunnatun mutageneesin avulla syntetoiduilla oligonukleotideillä, jotka koodaavat haluttua aminohapposekvenssiä homologire-kombinaatiossa laajalti tunnettujen menetelmien mukaisesti.

Eräs keksinnön kohteista on yhdistelmäekspressiovektori, joka sisältää keksinnön mu- 20 kaisen DNA-rakenteen. Yhdistelmäekspressiovektori voi olla mikä tahansa vektori, jolle edullisesti voidaan suorittaa yhdistelmä-DNA-tekniikkaan liittyviä käsittelyjä, ja usein : " vektorin valinta riippuu isäntäsolusta, johon se aiotaan viedä. Vektori voi siis olla itse- :. · ; näisesti replikoituva vektori, siis vektori, joka on olemassa kromosominulkoisena koko- naisuutena, jonka replikoituminen ei riipu kromosomaalisesta replikoitumisesta, esimer- *: · i25 kiksi plasmidi. Vektori voi myös olla sellainen, joka isäntäsoluun vietynä integroituu :*·*: isäntäsolun genomiin ja replikoituu yhdessä kromosomin tai kromosomien kanssa, jo- * * hon tai joihin se on integroitu.

• ... Vektorissa keksinnön mukaista aprotiniinianalogia koodaava DNA-sekvenssi saisi edul-L. 30 lisesti olla liitetty promoottorisekvenssiin. Promoottori voi olla mikä tahansa DNA-sek-

I t I

’ venssi, joka osoittaa transkriptioaktiivisuutta valitussa isäntäsolussa, ja se voidaan joh- taa geeneistä, jotka koodaavat proteiineja, jotka ovat joko samanlaisia tai erilaisia kuin ·:·· isäntäsolu. Esimerkkinä nisäkkäiden solussa keksinnön mukaista aprotiniinianalogia Λ koodaavan DNA:n transkriptiota johtavista promoottoreista voidaan mainita SV 40 -pro-*: i; 35 moottori (Subramani et ai., Mol. Cell Biol. 1, s. 854-864, 1981), MT-1 (metallotioneii- * t ' "' nigeeni) promoottori (Palmiter et ai., Science 222, s. 809-814, 1983) sekä adenovirus 2 major myöhäispromoottori. Hiivaisäntäsoluissa käytettäväksi sopivia promoottoreita ovat esimerkiksi hiivaglykolyyttigeenien promoottorit (Hitzeman et ai., J. Biol. Chem.

10 105036 255, s. 12073-12080, 1980; Alber and Kawasaki, J. Mol. Appi. Gen. 1, s. 419-434, 1982), alkoholidehydrogenaasigeenien promoottorit (Young et al., Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, Hollander et al., toim. Plenum Press, New York, 1982) sekä TP 11 (US-4599311)-ja ADH2-4c (Russell et al., Nature 304, pp. 652-654, 5 1983) -promoottorit. Rihmasieni-isäntäsoluissa käytettäväksi sopivia promoottoreita ovat esimerkiksi ADH3-promoottori (McKnight et al., The EMBO J. 4, s. 2093-2099, 1985) sekä tpiA-promoottori.

Aprotiniinianalogia koodaava DNA-sekvenssi voidaan myös yhdistää sopivaan termi-10 naattoriin, esimerkiksi ihmisen kasvuhormoniterminaattoriin (Palmiter at al., op. cit.), tai (sieni-isännissä) TP11 (Alber and Kawasaki, op. cit.)- tai ADH3 (McKnight et al., op. cit.) -promoottoreihin. Vektori voi lisäksi sisältää sellaisia osia kuin polyadenylaa-tiosignaaleja (esim. SV 40 tai adenovirus 5 Elb -alue), transkriptionaalisia tehostinsek-venssejä (esim. SV 40 -tehostin) tai translationaalisia tehostinsekvenssejä (esim. adeno-15 virus VA RNAs:ää koodaavat).

Keksinnön mukainen yhdistelmäekspressiovektori voi edelleen sisältää myös DNA-sek-venssin, jonka ansiosta vektori voi replikoitua kyseessä olevassa isäntäsolussa. Esimerkkejä tällaisista sekvensseistä ovat (kun isäntäsolu on nisäkässolu) SV 40 -replikoitumis-20 alku ja (kun isäntäsolu on hiivasolu) hiivaplasmidin 2μ replikaatiogeenit REP 1-3 ja replikoitumisalku. Vektori voi sisältää myös selektiomarkkerin, geenituotteen, joka täy-: '.. dentää puutteen isäntäsolussa, esimerkiksi dihydrofolaattireduktaasia (DHFR) koodaa- : : van geenin tai sellaisen, joka antaa lääkkeelle resistanssia, esimerkiksi neomysiini, hyg- .:. romysiini tai metotreksaatti, tai Schizosaccharomyces pombe TPI -geeni (kuvanneet P. !!!! 25 R. Russell, Gene 40, s. 125-130, 1985).

• · · • · · • ·

Menetelmät, joilla ligatoidaan keksinnön mukaista aprotiniinianalogia koodaavat DNA- • · · ' sekvenssit, promoottori ja terminaattori ja insertoidaan ne replikoitumiseen tarvittavat tiedot sisältävään sopivaan vektoriin, ovat alan asiantuntijalle tuttuja (vrt. esim. Sam- • « · *•*30 brook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 0': 1989).

• · • ♦ · • · · • * ....: Isäntäsolu, johon keksinnön mukainen ekspressiovektori viedään, voi olla mikä tahansa solu, joka pystyy tuottamaan keksinnön mukaisesti aprotiniinianalogia, ja edullisesti * ·' 35 eukaryoottinen solu, esimerkiksi nisäkäs-, hiiva- tai sienisolu.

• f t * «

Keksinnön mukaan isäntäsoluna käytettävä hiivaorganismi voi olla mikä tahansa hiiva-organismi, joka viljeltäessä tuottaa suuria määriä aprotiniinianalogia. Esimerkkeinä so- 105036 11 pivista hiivaorganismeista ovat seuraavien hiivalajien kannat: Saccharomyces cerevi-siae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe ja Saccharomyces uvarum. Hiivasolujen transformaatio voidaan toteuttaa esimerkiksi protoplasmamuodostuksella ja sen jälkeisellä transformoinnilla sinänsä tunnettuun tapaan.

5

Esimerkkejä sopivista nisäkässolulinjoista ovat COS (ATCC CRL 1650), BHK (ATCC CRL 1632, ATCC CCL 10) ja CHO (ATCC CCL 61). Menetelmiä transformoida nisä-kässolujen transformoimiseksi ja soluihin vietyjen DNA-sekvenssien ekspressoimiseksi kuvaavat esimerkiksi Kaufman ja Sharp (J. Mol. Biol. 159, s. 601-621, 1982; Southern 10 and Berg, J. Mol. Appi. Genet. 1, s. 327-341, 1982; Loyter et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79, s. 422-426, 1982; Wigler et ai., Cell 14, s. 725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7, s. 603, 1981; Graham and van der Eb, Virology 52, s. 456, 1973 ja Neumann et ai., EMBO J. 1, s. 841-845, 1982).

15 Myös hiivasoluja voidaan käyttää keksinnön isäntäsoluina. Esimerkkeinä sopivista sie-nisoluista voidaan mainita rihmasienien, esim. Aspergillus Spp. tai Neurospora spp., erityisesti kantojen Aspergillus oryzae ja Aspergillus niger, solut. Aspergillus spp.:n käyttöä proteiinien ekspressioon kuvaa esimerkiksi EP-272277.

20 Tämä keksintö koskee vielä menetelmää keksinnön mukaisten aprotiniinianalogien tuottamiseksi. Menetelmässä viljellään soluja edellä kuvattuun tapaan olosuhteissa, jois- ' sa aprotiniinianalogi ekspressoituu, ja kootaan muodostuva analogi talteen viljelmästä.

f I

* I I I I

• I I I

·· Solujen viljelyyn käytettävä elatusaine voi olla mikä tahansa tavallinen elatusaine, jolla

i « · I

.... 25 voidaan kasvattaa nisäkässoluja tai hiivaorganismeja, valitun isäntäsolun mukaan. Apro-. tiniinianalogia erittyy isäntäsoluista elatusaineeseen, ja sitä voidaan koota siitä tavallisin menetelmin kuten erottamalla solut elatusaineesta sentrifugoimalla tai suodattamalla, • « * ' saostamalla proteiinipitoiset komponentit supematantista tai suodoksesta jonkin suolan, kuten ammoniumsulfaatin, avulla tai puhdistamalla erilaisin kromatografisin menetel- • · · *; * ^ 3 0 min kuten ioninvaihtokromatografian, affiniteettikromatografian tai vastaavien avulla.

• » · • · · m Tämä keksintö liittyy myös farmaseuttiseen koostumukseen, jossa on keksinnön mukai- • t ....: sesti saatua aprotiniinianalogia ja farmaseuttisesti hyväksyttävää kantaja-ainetta tai täy teainetta. Koostumuksessa aprotiniinianalogi voidaan valmistaa käyttämällä mitä tähän- * · < '•'35 sa vakiintunutta farmaseuttisten koostumusten valmistusmenetelmää, esimerkiksi niitä, • · f joita kuvataan teoksessa Remington's Pharmaceutical Sciences, 1985. Koostumus voi tyypillisesti olla esimerkiksi systeemiseen injektointiin tai infusointiin sopivassa muo- 105036 12 dossa, ja se voi sellaisenaan olla steriilissä vedessä, isotonisessa suolaliuoksessa tai glu-koosiliuoksessa.

Tämä keksintö liittyy vielä keksinnön mukaisesti saadun aprotiniinianalogin käyttöön 5 valmistettaessa lääkettä, jonka nefrotoksisuus natiiviin aprotiniiniin verrattuna on pienempi ja/tai lääkettä, jota annettaessa ilmenee vähemmän anafylaktisia reaktioita kuin natiivilla aprotiniinilla on havaittu.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

10

Kuten edellä on tullut esiin, kliinisiä annoksia lähellä olevina annoksina annettu natiivi aprotiniini vaikuttaa vahingollisesti munuaisiin. Tämä vaikutus johtunee aprotiniinimo-lekyylin tavattomasta stabiiliudesta ja suhteellisen suuresta positiivisesta kokonaisvara-uksesta. Keksinnön mukaisesti saadun aprotiniinianalogin arvioidaan sen vuoksi olevan 15 edullisempaa käytettäväksi natiiville aprotiniinille tavallisissa terapeuttisissa sovellutuksissa, erityisesti sellaisissa, joissa tarvitaan suuria aprotiniiniannoksia. Terapeuttisia sovellutuksia, joissa aprotiniinianalogin käyttö on indikoitu tulokseksi ihmisen seriini-proteaasien kuten trypsiinin, plasmiinin, kallikreiinin, elastaasin ja katepsin G:n inhibi-tioon, ovat (niihin rajoittumatta) mm. akuutti pankreatiitti, inflammaatio, trombosyto-20 peniä, verihiutaletoiminnan suojeleminen, elinten suojeleminen, haavan parantuminen, shokki (keuhkoshokki mukaan lukien) sekä tilat, joihin liittyy hyperfibrinolyyttistä he-! morragiaa. Kardiopulmonaalisten ohitusleikkausten aikana ja niiden jälkeen aprotiniinia M - käytetään suuria annoksia; keksinnön mukaisesti saatu aprotiniinianalogi on vähäisem-män nefrotoksisuutensa vuoksi erityisen kiintoisa tähän käyttökohteeseen ja mahdolli-·:··&5 sesti muihinkin leikkauksiin, joihin liittyy (huomattavaa) verenhukkaa, samoin kuin on ·*·’: mahdollinen vähentynyt vaara anafylaktisen vasteen muodostumiseen analogin alen- • · .·;·. tuneen positiivisen kokonaisvarauksen ansiosta.

... Keksintöä kuvataan nyt tarkemmin seuraavin esimerkein, joissa viitattavissa kuvioissa: • · · :..30 • · · ’·[ ' kuvio 1 esittää synteettisen aprotiniinigeenin kokoamista oligonukleotidisekvens-seistä, ·:·’· kuvio 2 esittääplasmidinpKNF-1503 kokoamista, kuvio 3 on kaavakuva inhibitorisesta aktiviteetista virtsassa ja munuaisissa kokonais- '; I; 35 varaukseltaan ja lämmönkestoltaan erilaisten aprotiniinianalogien annon jäi- < « ' · ·' keen, kuvio 4 esittää inhibitorista aktiviteettia virtsassa 3 tuntia kokonaisvaraukseltaan erilaisten aprotiniinianalogien annon jälkeen, 13 105036 kuvio 5 esittää inhibitorista aktiviteettia munuaisissa 3 tuntia lämmönkestoltaan erilaisten aprotiniinianalogien annon jälkeen ja kuvio 6 esittää inhibitorisen aktiviteetin akkumuloitumista munuaisissa lämmönkestoltaan erilaisten aprotiniinianalogien annon jälkeen. Akkumuloitumisindeksi 5 Jaksetaan inbibitorisena aktiviteettina 3 tunnin jälkeen jaettuna inhibitorisella aktiviteetilla 1 tunnin jälkeen.

Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä edelleen rajoittamatta sitä mitenkään.

10 Esimerkki 1 [Glul, Glu26, Glu41, Glu46]-aprotiniinin tuottaminen hiivakannasta KFN-1512 [Glul, Glu26, Glu41, Glu46]-aprotiniinia koodaava synteettinen geeni koottiin 10 oli-15 gonukleotidistä ligatoimalla. Oligonukleotidit syntetoitiin automaattisella DNA-synteti-saattorilla fosforamidiittikemian avulla kontrolloidulla huokoslasialustalla (Beaucage, S. L. and Caruthers, M. H., Tetrahedron Letters 22, pp. 1859-1869, 1981).

Syntetoitiin seuraavat 10 oligonukleotidiä: 20

NOR-1948: CATGGCTGAGAGATTGGAGAAGAGAGAGCCTGATTTCTGTTTGG-i ''·· AACCTCCATACACTGGTCC

« * t < I I • · · * NOR-1947: TTACATGGACCAGTGTATGGAGGTTCCAAACAGAAATCAGGCT-

·:··&5 CTCTCTTCTCCAATCTCTCAGC

·* · • · · • ·

!·:·*. NOR-354: ATGTAAAGCTAGAATCATCAGATACTTCTACAACG

t t »

NOR-1939: TTCGGCGTTGTAGAAGTATCTGATGATTCTAGCT

• * ♦ • « « >L.3°

. !\ ‘‘ NOR-1938: CCGAAGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGTGGCT

• · « · · · * m ·

·:··: NOR-357: CTCTGCAGCCACCGTAAACGAAAGTTTGACACAAACCAGC

• · 35 NOR-1940: GCAGAGCTGAAAGAAACAACTTCGAAT • · « · t * ·

NOR-1949: AGCAGATTCGAAGTTGTTTCTTTCAG

105036 14

NOR-360: CTGCTGAAGACTGCATGAGAACTTGTGGTGGTGCCTAAT

NOR-361: CTAGATTAGGCACCACCACAAGTTCTCATGCAGTCTTC

5 Edellä olevista 10 oligonukleotidistä muodostettiin 5 dupleksia A-E kuvion 1 osoittamalla tavalla.

Muodostettiin 20 pmoolia jokaista dupleksia A-E vastaavista 5'-fosforyloiduista oligo-nukleotidipareista kuumentamalla 5 minuutin ajan 90 °C:ssa ja jäähdyttämällä sen jäl-10 keen huoneen lämpöön 75 minuutin aikana. Kaikki viisi dupleksia sekoitettiin ja käsiteltiin T4 DNA -ligaasilla. Synteettinen geeni eristettiin 203 emäsparin nauhana kun li-gaatioseos oli elektroforesoitu 2-prosenttisen agaroosigeelin avulla. Saatu synteettinen geeni näkyy kuviossa 1.

15 Synteettinen geeni ligatoitiin 209 emäsparin EcoRI-NcoI-fragmenttiin pLaC212spx3:sta ja plasmidin pTZ19R 2,8 Kb:n EcoRI-Xbal-fragmenttiin (Mead, D. A., Szczesna-Skorupa, E. and Kemper, B., Prot. Engin. 1, s. 67-74, 1986). Plasmidia pLaC212spx3 kuvaa PCT/DK88/00147 esimerkissä 3.

20 pLaC212spx3:n 209 emäsparin EcoRI-NcoI-fragmentti koodaa synteettistä hiivajohto-peptidiä.

Ligaatioseosta käytettiin transformoimaan kompetentti E. coli kanta r", m+) ampisilliini- • i · resistenssiä valikoiden. DNA-sekvensointi (Sanger, F., Micklen, S., and Coulson, A. R., ·; · ;25 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, pp. 5463-5467, 1977) osoitti, että saatavien pesäkkeiden : \ \ plasmidit sisälsivät oikean DNA-sekvenssin [Glu 1, Glu26, Glu41, Glu46]-aprotiniinille.

• « • · · « « · • 9 ·

Yksi plasmidi pKFN-1503 valittiin edelleen käytettäväksi. Plasmidin pKFN-1503 ko- ,.. koamista kuvataan kuviossa 2.

• · « *·' '30 • · « ’j : pKFN-1503 pilkottiin EcoRLlla ja Xbaklla ja 412 emäsparin fragmentti ligatoitiin pMT636:n 9,5 kb.n NcoI-Xbal-fragmenttiin ja pMT636:n 1,4 kb.n NcoI-EcoRI-frag-menttiin, tuloksena plasmidi pKFN-1508, ks. kuvio 3. Plasmidia pMT636 kuvaa PCT/DK88/00138.

:·:·;35 * · ] pMT636 on E. coli - S. cerevisiae -sukkulavektori, joka sisältää Schizosaccharomyces I pombe TPI -geenin (POT) (Russell, P. R., Gene 40, pp. 125-130, 1985), S. cerevisiae trioosifosfaatti-isomeraasipromoottorin ja terminaattorin, TPIP ja ΤΡΙχ (Alber, T. and 105036 15

Kawasaki, G., J. Mol. Appi. Gen.l, s. 419-434, 1982). Plasmidi pKFN-1508 sisältää seuraavan sekvenssin: TPIp-LaC212spx3-signaalijohtaja (l-47)-Glu(ArgLeuGluLysArg [Glul, Glu26, Glu41, 5 Glu46]-aprotiniini-TPIT, jossa LaC212spx3 signaalijohtaja on synteettinen hiivajohtaja, jota kuvaa PCT/DK88/00147. 412 emäsparin EcoRI-Xbal-fragmentin DNA-sekvenssi pKFN-1503:sta ja pKFN-1508:sta näkyy sekvenssiluettelotiedoissa kohdassa SEKVENSSI ID.NRO 1.

10 S. cerevisiae -kantaa MT663 (E2-7B XE11-36 a/α, tpi/ tpi, pep 4-3/pep 4-3) kasvatettiin YPGaL:ssä (1 % Bacto-hiivauutetta, 2 % Bacto-peptonia, 2 % galaktoosia, I % laktaat-tia) optisella tiheydellä OD 0,6 600 nm:ssa.

100 ml viljelmää harvestoitiin sentrifugoimalla, pestiin 10 ml:lla vettä, sentrifugoitiin 15 uudestaan ja uudelleensuspendoitiin 10 ml:aan liuosta, joka sisälsi 1,2 M sorbitolia, 25 mM Na2EDTA pH = 8,0 ja 6,7 mg/ml ditiotreitolia. Suspensiota inkuboitiin 30 °C:ssa 15 minuuttia, sentrifugoitiin ja solut uudelleensuspendoitiin 10 inhaan liuosta, joka sisälsi 1,2 M sorbitolia, 10 mM Na2EDTA:ta, 0,1 M natriumsitraattia, pH = 5,8, ja 2 mg NovozymR 234:ää. Suspensiota inkuboitiin 30 °C:ssa 30 minuutin ajan, solut

20 koottiin sentrifugoimalla, pestiin 10 ml:lla 1,2 m sorbitolia ja 10 ml:lla CAS (1,2 M

sorbitolia, 10 mM CaCl2. 10 mM Tris HC1 (Tris=Tris(hydroksimetyyli)aminometaani) : " pH = 7,5) ja uudelleensuspendoitiin 20 ml:aan CAS:ää. Transformointia varten sekoi-• * ! · · tettiin 0,1 ml CAS-uudelleensuspendoituja soluja noin 1 pg:n kanssa plasmidia pKFN-1508 ja jätettiin huoneen lämpöön 15 minuutiksi. Lisättiin 1 ml (20 % polyetyleenigly-:”i25 kolia 4000, 20 mM CaCL, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris HC1, pH = 7,5) ja seoksen an-:*·*: nettiin olla vielä 30 minuuttia huoneen lämmössä. Seos sentrifugoitiin ja pallukka uudel- leensuspendoitiin 0,1 ml:aan SOS (1,2 M sorbitolia, 33 % v/v YPD, 6,7 mM CaCl2, 14 μg/ml leukiinia) ja inkuboitiin 30 °C:ssa 2 tunnin ajan. Sitten suspensio sentrifugoi-tiin ja pallukka uudelleensuspendoitiin 0,5 ml:aan 1,2 M sorbitolia. Seuraavaksi lisättiin • · · *;.30 6 ml pinta-agaria (SC-väliainetta (Sherman et ai., Methods in Yeast Genetics, Cold \ Spring Harbor Laboratory, 1982), joka sisältää 1,2 M sorbitolia plus 2,5 % agaria) ·,*·· 52 °C:ssa ja suspensio kaadettiin maljoihin, jotka sisälsivät samaa agar-vahvistettua, : . sorbitolipitoista väliainetta.

II

I I I

;.: 35 Transformanttipesäkkeet valikoitiin 3 päivän jälkeen 30 °C:ssa, eristettiin uudestaan ja ’ · ’ käytettiin aloittamaan nesteviljelmiä. Yksi tällainen transformantti, KFN-1512, valittiin lisäkarakterisointia varten.

105036 16

Hiivakantaa KFN-1512 kasvatettiin YPD-elatusaineessa (1 % hiivauutetta, 2 % peptonia (Difco Laboratories) ja 6 % glukoosia). 200 ml kannan viljelmää ravistettiin nopeudella 250 kierrosta minuutissa 30 °C:ssa 3 päivän ajan, OD 600 nm:ssa noin 20. Sentrifugoin-nin jälkeen supematantti analysoitiin FPLC-ioninvaihtokromatografian avulla. Hiivasu-5 pematantti suodatettiin läpi 0,22 μΜ Millex GC -suodatinyksikön ja 1 ml pantiin Mo-noS kationinvaihtokolonniin (0,5 x 5 cm) tasapainotettuna 20 mM:lla muurahaishappoa, pH 3,7. Tasapainottavalla puskuriaineella suoritetun pesun jälkeen kolonnia eluoitiin lineaarisella NaCl-gradientilla (0,1 M) tasapainopuskuriaineessa. Trypsiini-inhibiittoriak-tiviteetti kvantitoitiin eluoiduista fraktioista spektrofotometrisellä kokeella (Kassel, B., 10 Methods Enzymol. 19, s. 844-852, 1970) ja vielä absorptiointegraatiolla 280 nm:ssa, kaava: E1%28o (aprotiniini) = 8,3 15 Toksikologisia kokeita varten tarvittavaa materiaalia varten hiivakantaa KFN-1512 viljeltiin suuremmassa määrin. Aprotiniinianalogi puhdistettiin yhdistetyllä ioninvaihto-kromatografialla ja käänteisfaasi-HPLC:llä.

Esimerkki 2 20 [Glul, Glu42, Glu46]-aprotiniinin tuottaminen hiivakannasta KFN-1514 • * · : .·. [Glul, Glu42, Glu46]-aprotiniinia koodaava synteettinen geeni koottiin 10 oligonukeo-•«· · tidistä ligatoimalla esimerkin 1 tapaan.

;; ::,.25 • t _ :<v> pTZ19R-johdettu plasmidi pKFN-1505, joka sisälsi synteettisen geenin fuusioituna tu-kirakenteella synteettiseen hiivajohtajapeptidiin koottiin esimerkissä 1 kuvattuun tapaan.

• · · * · «

Esimerkin 1 tapaan saatiin hiivaekspressioplasmidi pKFN-1510, joka sisälsi rakenteen :30 TPIP-LaC212spx3-signaalijohtaja (1-47) - GluArgLeuGluLysArg [Glul, Glu42, Glu46]- :.· · aprotiniini-ΤΡΙτ.

• · • · · • · · ,:f>J 412 emäsparin EcoRI-Xbal-fragmentin DNA-sekvenssi pKFN-1505:stä ja pKFN- 1510:stä näkyy sekvenssiluettelotiedoissa kohdassa SEKVENSSI ID .NRO 3.

• · :.v35

Plasmidi pKFN-1510 transformoitiin hiivakannassa MT663, kuten edellä kuvattiin, ja 5 saatiin hiivakanta KFN-1514.

105036 17

Transformoidun kannan KFN-1514 viljely YPD-elatusaineessa, [Glul, Glu42, Glu46]-aprotiniinin analysointi supematantista ja materiaalin tuottaminen toksikologisia kokeita varten suoritettiin samaan tapaan kuin edellä kuvattiin.

5 Esimerkki 3 [Glu42, Glu46]-aprotiniinin tuottaminen hiivakannasta KFN-1544 144 emäsparin Avall-Xbal-fragmenttia koodaavaa [Glu42, Glu46]-aprotiniinia (12-58) 10 pKFN-15050:stä käytettiin korvaamaan vastaava DNA-fragmentti, joka koodaa aproti-niinia (12-58) plasmidista pKFN-1000, joka oli saatu plasmidista pKFN-1528. Plasmi-dia pKFN-1000 kuvaa WO 90/10075:n esimerkki 4.

Esimerkin 1 mukaisesti saatiin hiivaekspressioplasmidi pKFN-1541, joka sisälsi raken-15 teen TPIP-LaC212spx3-signaalijohtaja (1-47) - GluArgLeuGluLysArg [Glu42, Glu46]-aprotiniini-TPIT.

412 emäsparin EcoRI-Xbal-fragmentin DNA-sekvenssi pKFN-1528:sta ja pKFN-154 Estä näkyy sekvenssiluettelotiedoissa kohdassa SEKVENSSI ID.NRO 5.

20

Plasmidi pKFN-1541 transformoitiin hiivakannassa MT663, kuten edellä kuvattiin, ja saatiin hiivakanta KFN-1544.

« « « * « i · i

Transformoidun kannan KFN-1544 viljely YPD-elatusaineessa, [Glu42, Glu46]-aproti- < |" 25 niinin analysointi supematantista ja materiaalin tuottaminen toksikologisia kokeita var-• * ... ten suoritettiin samaan tapaan kuin edellä kuvattiin.

• I

• · • · · ’·* ' Esimerkki 4 • · · V 30 [SerlO, Asp24, Thr26, Glu31, Asn41, Glu53]-aprotiniinin tuottaminen hiivakannasta KFN-1545 » • · • · · • · · ! [SerlO, Asp24, Thr26, Glu31, Asn41, Glu53]-aprotiniinia koodaava synteettinen geeni . ' koottiin 10 oligonukleotidistä ligatoimalla esimerkin 1 tapaan.

pTZ19R-johdettu plasmidi pKFN-1530, joka sisälsi synteettisen geenin fuusioituna tukirakenteella synteettiseen hiivajohtajapeptidisekvenssiin koottiin esimerkissä 1 kuvattuun tapaan.

·:··:··35 105036 18

Esimerkin 1 tapaan saatiin hiivaekspressioplasmidi pKFN-1532, joka sisälsi rakenteen TPIP-LaC212spx3 signaalijohtaja (1-47) - GluArgLeuGluLysArg [SerlO, Asp24, Thr26, Glu31, Asn41, Glu53]-aprotiniini-TPlT.

5 412 emäsparin EcoRI-Xbal-fragmentin DNA-sekvenssi pKFN-1530:stä ja pKFN-1532:sta näkyy sekvenssiluettelotiedoissa kohdassa SEKVENSSI ID.NRO 7.

Plasmidi pKFN-1532 transformoitiin hiivakannassa MT663, kuten edellä kuvattiin, ja saatiin hiivakanta KFN-1545.

10

Transformoidun kannan KFN-1545 viljely YPD-elatusaineessa, [SerlO, Asp24, Thr26, Glu31, Asn41, Glu53]-aprotiniinin analysointi supematantista ja materiaalin tuottaminen toksikologisia kokeita varten suoritettiin samaan tapaan kuin edellä kuvattiin.

15 Esimerkki 5 [SerlO, Leu20, Gly40, Asn41, Gln44, Tyr46]-aprotiniinin tuottaminen hiivakannasta KFN-1547 20 [SerlO, Leu20, Gly40, Asn41, Gln44, Tyr46]-aprotiniinia koodaava synteettinen geeni koottiin 10 oligonukeotidistä ligatoimalla esimerkin 1 tapaan.

• ( · · « | ... pTZ19R-johdettu plasmidi pKFN-1534, joka sisälsi synteettisen geenin fuusioituna tu-• « · "V kirakenteella synteettiseen hiivajohtajapeptidisekvenssiin koottiin esimerkissä 1 kuvat- ’••:,25 tuun tapaan.

• * • · « : Esimerkin 1 tapaan saatiin hiivaekspressioplasmidi pKFN-1537, joka sisälsi rakenteen TPIp-LaC212spx3 signaalijohtaja (1-47) - GluArgLeuGluLysArg [SerlO, Leu20, Gly40, Asn41, Gly42, Gln44, Tyr46]-aprotiniini-TPIT.

: : :30 412 emäsparin EcoRI-Xbal-fragmentin DNA-sekvenssi pKFN-1534:stä ja pKFN-1537:stä näkyy sekvenssiluettelotiedoissa kohdassa SEKVENSSI ID.NRO 9.

• · · I * · I f <

Plasmidi pKFN-1537 transformoitiin hiivakannassa MT663, kuten edellä kuvattiin, ja :':': 35 saatiin hiivakanta KFN-1547.

ϊ f ί iM , , ,

Transformoidun kannan KFN-1547 viljely YPD-elatusaineessa, [SerlO, Leu20, Gly40, Asn41, Gly42, Gln44, Tyr46]-aprotiniinin analysointi supematantista ja materiaalin 19 105036 tuottaminen toksikologisia kokeita varten suoritettiin samaan tapaan kuin edellä kuvattiin.

Esimerkki 6 5

Des-Argl, des-Pro2-[Ser42, Glu46]-aprotiniinin tuottaminen hiivakannasta KFN-1660 1,4 kb:n Aha-Styl-fragmentti ja 1,8 kb:n Ahall-Sall-fragmentti, molemmat plasmidista pKFN-306, ligatoitiin dupleksiin, joka koostui seuraavista kahdesta synteettisestä oligo-10 nukleotidistä: NOR-2188: 5' CAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGTGGCTGCAGAGCTAAGT-CCAACAACTTCGAATCTGCTGAAGACTGCATGAGAACTTGTGGTGGTGCCTA 15 ATCTAGAG 3' NOR-2189: 5' TCGACTCTAGATTAGGCACCACCACAAGTTCTCATGCAGTCTTCAGCAGA-TTCGAAGTTGTTGGACTTAGCTCTGCAGCCACCGTAAACGAAAGTTTGACAC 20 AAACCAGC 3' ; '·· Plasmidi pKFN-306 on pTZ19R-johdettu plasmidi, jossa on 502 emäsparin EcoRI- : Xbal-insertti, joka sisältää Saccharomyces cerevisiae mating factor alpha 1 -signaalijoh- ··· taja (1-85) -geenin fuusioituna kehykseen synteettisen des-Argl, des-Pro2-[Ser42] • * * · ....25 -aprotiniinigeenin kanssa. Plasmidin pKFN-306 kokoamista kuvaa WO 89/01968.

·· ♦ i » « • m • » • · · • · · * * * · · + * Ligaatioseosta käytettiin transformoimaan kompetentti E. coli -kanta (r, m ) ampisillii- niresistenssiä valikoiden. DNA-sekvensointi (Sanger, F., Micklen, S., and Coulson, A. *·* 30 R., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, s. 5463-5467, 1977) osoitti, että saatavien pesäkkei- v : den plasmidit sisälsivät oikean DNA-sekvenssin des-Argl, Pro2-[Ser42, Glu46] -aproti- * ·*. ! niinille.

• · · • · <

• I

Yksi plasmidi pKNF-1629 valittiin edelleen käytettäväksi.

Esimerkin 1 tapaan saatiin hiivaekspressioplasmidi pKFN-1656, joka sisälsi rakenteen TPIp-MFal-signaalijohtaja (1-85) - des-Argl, Pro-[Ser42, Glu46] -aprotiniini-ΤΡΙτ.

:;;·;35 105036 20 502 emäsparin EcoRI-Xbal-fragmentin DNA-sekvenssi pKFN-1629:stä ja pKFN-1656:stä näkyy sekvenssiluettelotiedoissa kohdassa SEKVENSSI ID.NRO 11.

Plasmidi pKFN-1656 transformoitiin hiivakannassa MT663, kuten edellä kuvattiin, ja 5 saatiin hiivakanta KFN-1660.

Transformoidun kannan KFN-1660 viljely YPD-elatusaineessa, des-Argl, des-Pro2-[Ser42, Glu46] -aprotiniinin analysointi supematantista ja materiaalin tuottaminen toksikologisia kokeita varten suoritettiin samaan tapaan kuin edellä kuvattiin.

10

Esimerkki 7

Des-Argl, des-Pro2-[Ser42, Ala46] -aprotiniinin tuottaminen hiivakannasta KFN-1661 15 1,4 kb:n Ahall-Styl-fragmentti ja 1,8 kb:n Ahall-Sall-fragmentti, molemmat plasmidista pKFN-306, ligatoitiin dupleksiin, joka koostui seuraavista kahdesta synteettisestä oligo-nukleotidistä: NOR-2196: 20 5' CAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGTGGCTGCAGAGCTAAGT-CC AAC AACTT CGCTTCTGCT G AAGACT GC AT GAGAACTT GTGGTGGTGC CT A ATCTAGAG 3' "V NOR-2197: I « « 25 5' TCGACTCTAGATTAGGCACCACCACAAGTTCTCATGCAGTCTTCAGCAGA-

I;"1 AGCGAAGTTGTTGGACTTAGCTCTGCAGCCACCGTAAACGAAAGTTTGACAC

V AAACCAGC 3’ ♦ · · • · · I · · •

Plasmidi pKFN-306 on pTZ19R-johdettu plasmidi, jossa on 502 emäsparin EcoRI-:T:30 Xbal-insertti, joka sisältää Saccharomyces cerevisiae mating factor alpha 1 -signaalijoh-:T: taja (1-85) -geenin fuusioituna kehykseen synteettisen des-Argl, des-Pro2-[Ser42] / . -aprotiniinigeenin kanssa. Plasmidin pKFN-306 kokoamista kuvaa WO 89/01968.

« · · « f :V:35 Ligaatioseosta käytettiin transformoimaan kompetentti E. coli -kanta (r, m+) ampisillii-niresistenssiä valikoiden. DNA-sekvensointi (Sanger, F., Micklen, S., and Coulson, A.

· · R., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, s. 5463-5467, 1977) osoitti, että saatavien pesäkkei- 105036 21 den plasmidit sisälsivät oikean DNA-sekvenssin des-Argl, des-Pro2-[Ser42, Glu46] -aprotiniinille.

Yksi plasmidi pKNF-1631 valittiin edelleen käytettäväksi.

5

Esimerkin 1 tapaan saatiin hiivaekspressioplasmidi pKFN-1657, joka sisälsi rakenteen TPIp-MFal signaalijohtaja (1-85) - des-Argl, des-Pro2-[Ser42, Ala46] -aprotiniini-TPIt.

10 502 emäsparin EcoRI-Xbal-fragmentin DNA-sekvenssi pKFN-1631:stä ja pKFN-1657:stä näkyy sekvenssiluettelotiedoissa kohdassa SEKVENSSI ID.NRO 13.

Plasmidi pKFN-1657 transformoitiin hiivakannassa MT663, kuten edellä kuvattiin, ja saatiin hiivakanta KFN-1661.

15

Transformoidun kannan KFN-1661 viljely YPD-elatusaineessa, des-Argl, des-Pro2-[Ser42, Ala46] -aprotiniinin analysointi supematantista ja materiaalin tuottaminen toksikologisia kokeita varten suoritettiin samaan tapaan kuin edellä kuvattiin.

20 Esimerkki 8

Des-Argl, des-Pro2-[SerlO, Asp24, Thr26, Glu31, Asn41, Glu53] -aprotiniinin tuotta-·' <' · minen hiivakannasta KFN-1735 « « f • «« t ,,.,515 Des-Argl, des-Pro2-[SerlO, Asp24, Thr26, Glu31, Asn41, Glu53] -aprotiniinia koodaa- .. .# va synteettinen geeni koottiin 10 oligonukleotidistä ligatoimalla esimerkin 1 tapaan.

• · • ·

• M • · I

pTZ19R-johdettu plasmidi pKFN-1707, joka sisälsi synteettisen geenin fuusioituna tukirakenteella synteettiseen hiivajohtajapeptidiin koottiin esimerkissä 1 kuvattuun tapaan.

:7$o «· · v : Esimerkin 1 tapaan saatiin hiivaekspressioplasmidi pKFN-1709, joka sisälsi rakenteen : TPIp-LaC212spx3 signaalijohtaja (1-47) - GluArgLeuGluLysArg - des-Argl, des-Pro2- [SerlO, Asp24, Thr26, Glu31, Asn41, Glu53]-aprotiniini-TPIj.

:.:.·!35 412 emäsparin EcoRI-Xbal-fragmentin DNA-sekvenssi pKFN-1707:stä ja pKFN- :,,.: 1709:sta näkyy sekvenssiluettelotiedoissa kohdassa SEKVENSSI ID.NRO 15.

22 105036

Plasmidi pKFN-1709 transformoitiin hiivakannassa MT663, kuten edellä kuvattiin, ja saatiin hiivakanta KFN-1735.

Transformoidun kannan KFN-1735 viljely YPD-elatusaineessa, des-Argl, des-Pro2-5 [Ser 10, Asp24, Thr26, Glu31, Asn41, Glu53]-aprotiniinin analysointi supematantista ja materiaalin tuottaminen toksikologisia kokeita varten suoritettiin samaan tapaan kuin edellä kuvattiin.

Esimerkki 9 10

Des-Argl, des-Pro2-[Asp24, Thr26, Glu31, Glu53] -aprotiniinin tuottaminen hiivakan-nasta KFN-1737 1,8 kb:n Ahall-Xbal-fragmentti ja 1,4 kb:n Ahall-Avall-fragmentti, molemmat plasmi-15 dista pKFN-306 (ks. esimerkki 5), ligatoitiin synteettiseen 141 emäsparin Avall-Xbal-fragmenttia koodaavaan [Asp24, Thr26, Glu31, Glu53]-aprotiniiniin.

Saatava pTZ 19R-johdettu plasmidi oli pKFN-1711.

20 Esimerkin 1 tapaan saatiin hiivaekspressioplasmidi pKFN-1713, joka sisälsi rakenteen TPIp-MFal-signaalijohtaja (1-85) - des-Argl, des-Pro2-[Asp24, Thr26, Glu31, Glu53] . ·. -aprotiniini-TPIT.

III

"V 502 emäsparin EcoRI-Xbal-fragmentin DNA-sekvenssi pKFN-1711:stä ja pKFN- ,,,:,25 1713:sta näkyy sekvenssiluettelotiedoissa kohdassa SEKVENSSI ID.NRO 17.

• · ·· · ’ ·' Plasmidi pKFN-1713 transformoitiin hiivakannassa MT663, kuten edellä kuvattiin, ja *’ saatiin hiivakanta KFN-1737.

:T:30 Transformoidun kannan KFN-1737 viljely YPD-elatusaineessa, des-Argl, des-Pro2-[Asp24, Thr26, Glu31, Glu53] -aprotiniinin analysointi supematantista ja materiaalin . tuottaminen toksikologisia kokeita varten suoritettiin samaan tapaan kuin edellä kuvat- '· '1 tiin.

: : :35 Esimerkki 10 • I I * * f

V I

III

Des-Argl, des-Pro2-[SerlO, Gly40, Asn41, Gly42, Glu53] -aprotiniinin tuottaminen hiivakannasta KFN-173 9 23 105056

Des-Argl, des-Pro2-[SerlO, Gly40, Asn41, Gly42, Glu53] -aprotiniinia koodaava synteettinen geeni koottiin 10 oligonukleotidistä ligatoimalla esimerkin 1 tapaan.

5 pTZ19R-johdettu plasmidi pKFN-1715, joka sisälsi synteettisen geenin fuusioituna tukirakenteella synteettiseen hiivajohtajapeptidiin koottiin esimerkissä 1 kuvattuun tapaan.

Esimerkin 1 tapaan saatiin hiivaekspressioplasmidi pKFN-1718, joka sisälsi rakenteen TPIP-LaC212spx3-signaalijohtaja (1-47) - GluArgLeuGluLysArg des-Argl, des-Pro2-10 [SerlO, Gly40, Asn41, Gly42, Glu53] -aprotiniini-TPIT.

406 emäsparin EcoRI-Xbal-fragmentin DNA-sekvenssi pKFN-1715:stä ja pKFN-1718:sta näkyy sekvenssiluettelotiedoissa kohdassa SEKVENSSI ID.NRO 19.

15 Plasmidi pKFN-1718 transformoitiin hiivakannassa MT663, kuten edellä kuvattiin, ja saatiin hiivakanta KFN-1739.

Transformoidun kannan KFN-1739 viljely YPD-elatusaineessa, des-Argl, des-Pro2-[SerlO, Gly40, Asn41, Gly42, Glu53] -aprotiniinin analysointi supematantista ja mate-20 riaalin tuottaminen toksikologisia kokeita varten suoritettiin samaan tapaan kuin edellä kuvattiin.

• · V · : Esimerkki 11 • « • · ·

> I

....2-5 Des-Argl, des-Pro2-[Ser42, Glu53] -aprotiniinin tuottaminen hiivakannastaKFN-1742 • · • · · • · · 1,8 kb:n Ahall-Xbal-fragmentti ja 1,4 kb:n Ahall-Avall-fragmentti, molemmat plasmi- « « · dista pKFN-306 (ks. esimerkki 5), ligatoitiin synteettiseen 141 emäsparin Avall-Xbal-fragmenttia koodaavaan [Ser42, Glu53]-aprotiniiniin.

• · ·_ _ ·.· 30 . :.·'·* Saatava pTZ19R-johdettu plasmidi oli pKFN-1721.

« p · • · · t · · ..'..j Esimerkin 1 tapaan saatiin hiivaekspressioplasmidi pKFN-1724, joka sisälsi rakenteen . TPIp-MFal signaalijohtaja (1-85) - des-Argl, des-Pro2-[Ser42, Glu53] -aprotiniini- 0.:35 TPIT.

· * · • « 4 502 emäsparin EcoRI-Xbal-fragmentin DNA-sekvenssi pKFN-1721:stä ja pKFN- 1724:stä näkyy sekvenssiluettelotiedoissa kohdassa SEKVENSSI ID.NRO 21.

24 105036

Plasmidi pKFN-1724 transformoitiin hiivakannassa MT663, kuten edellä kuvattiin, ja saatiin hiivakanta KFN-1742.

5 Transformoidun kannan KFN-1742 viljely YPD-elatusaineessa, des-Argl, des-Pro2-[Ser42, Glu53] -aprotiniinin analysointi supematantista ja materiaalin tuottaminen toksikologisia kokeita varten suoritettiin samaan tapaan kuin edellä kuvattiin.

Esimerkki 12 10

Des-Argl, des-Pro2-[Glu42, Glu53] -aprotiniinin tuottaminen hiivakannasta KFN-1752 1,8 kb:n Ahall-Xbal-fragmentti ja 1,4 kb:n Ahall-Avall-fragmentti, molemmat plasmi-dista pKFN-306 (ks. esimerkki 5), ligatoitiin synteettiseen 141 emäsparin Avall-Xbal-15 fragmenttia koodaavaan [Glu42, Glu53]-aprotiniiniin.

Saatava pTZ19R-johdettu plasmidi oli pKFN-1762.

Esimerkin 1 tapaan saatiin hiivaekspressioplasmidi pKFN-1765, joka sisälsi rakenteen 20 TPIp-MFal-signaalijohtaja (1-85) - des-Argl, des-Pro2-[Glu42, Glu53] -aprotiniini-TPIT.

f I f : 502 emäsparin EcoRI-Xbal-fragmentin DNA-sekvenssi pKFN-1762:sta ja pKFN- .:. 1765:stä näkyy sekvenssiluettelotiedoissa kohdassa SEKVENSSI ID .NRO 23.

WW\25 c *

Plasmidi pKFN-1765 transformoitiin hiivakannassa MT663, kuten edellä kuvattiin, ja *..I saatiin hiivakanta KFN-1752.

• · * • · ·

Transformoidun kannan KFN-1752 viljely YPD-elatusaineessa, des-Argl, des-Pro2- :30 [Ghi42, Ghi53]-aprotiniinin analysointi supematantista ja materiaalin tuottaminen tok- v : sikologisia kokeita varten suoritettiin samaan tapaan kuin edellä kuvattiin.

• t · > · t · ·

Esimerkki 15 • · # · v.:35 Des-Argl, des-Pro2-[Glu26, Ser42, Glu53] -aprotiniinin tuottaminen hiivakannasta KFN-1755 105036 25 1.8 kb:n Ahall-Xbal-fragmentti ja 1,4 kb:n Ahall-Avall-fragmentti, molemmat plasmi-dista pKFN-306 (ks. esimerkki 5), ligatoitiin synteettiseen 141 emäsparin Avall-Xbal-fragmenttia koodaavaan [Glu26, Ser42, Glu53]-aprotiniiniin.

5 Saatava pTZ 19R-johdettu plasmidi oli pKFN-1768.

Esimerkin 1 tapaan saatiin hiivaekspressioplasmidi pKFN-1770, joka sisälsi rakenteen TPIp-MFctl signaalijohtaja (1-85) - des-Argl, des-Pro2-[Glu26, Ser42, Glu53}] -aproti-niini-TPIT.

10 502 emäsparin EcoRI-Xbal-fragmentin DNA-sekvenssi pKFN-1768:sta ja pKFN-1770:stä näkyy sekvenssiluettelotiedoissa kohdassa SEKVENSSI ID.NRO 25.

Plasmidi pKFN-1770 transformoitiin hiivakannassa MT663, kuten edellä kuvattiin, ja 15 saatiin hiivakanta KFN-1755.

Transformoidun kannan KFN-1755 viljely YPD-elatusaineessa, des-Argl, des-Pro2-[Glu26, Ser42, Glu53] -aprotiniinin analysointi supematantista ja materiaalin tuottaminen toksikologisia kokeita varten suoritettiin samaan tapaan kuin edellä kuvattiin.

20

Esimerkki 14 t · • · · » : Des-Argl, des-Pro2-[Glu26, Glu42, Glu53] -aprotiniinin tuottaminen hiivakannasta ·:· KFN-1756 • · 1.8 kb:n Ahall-Xbal-fragmentti ja 1,4 kb:n Ahall-Avall-fragmentti, molemmat plasmi-dista pKFN-306 (ks. esimerkki 5), ligatoitiin synteettiseen 141 emäsparin Avall-Xbal- • · · fragmenttia koodaavaan [Glu26, Glu42, Glu53]-aprotiniiniin.

• · ♦ *^*30 Saatava pTZ19R-johdettu plasmidi oli pKFN-1771.

• · · • · ·

Esimerkin 1 tapaan saatiin hiivaekspressioplasmidi pKFN-1773, joka sisälsi rakenteen TPIp-MFal-signaalijohtaja (1-85) - des-Argl, des-Pro2-[Glu26, Glu42, Glu53] -aproti-niini-TPIT.

• · i 502 emäsparin EcoRI-Xbal-fragmentin DNA-sekvenssi pKFN-1771:stä ja pKFN- 1773:stä näkyy sekvenssiluettelotiedoissa kohdassa SEKVENSSI ID.NRO 27.

35 105036 26

Plasmidi pKFN-1773 transformoitiin hiivakannassa MT663, kuten edellä kuvattiin, ja saatiin hiivakanta KFN-1756.

Transformoidun kannan KFN-1756 viljely YPD-elatusaineessa, des-Argl, des-Pro2-5 [Glu26, Glu42, Glu53] -aprotiniinin analysointi supematantista ja materiaalin tuottaminen toksikologisia kokeita varten suoritettiin samaan tapaan kuin edellä kuvattiin.

Esimerkki 15 10 Aprotiniinianalogien toksisuuden tutkiminen yhtenä intravenoosisena annoksena Wistar-rotille annettuna

Toksilogisiin tutkimuksiin valittiin seuraavat aprotiniinianalogit, joilla oli vähentynyt positiivinen kokonaisvaraus ja lämmönkesto yhdistelmä-aprotiniiniin (1-58) verrattuna: 15 KFN-1512, KFN-1514, KFN-1544, KFN-1545, KFN-1547, KFN-1660 ja KFN-1661. Niiden olennaisimmat piirteet toksikologian kannalta on koottu taulukkoon 1. Tiedot yhdistelmä-aprotiniinista on annettu vertailun vuoksi. Denaturaatiolämpötila on tuotu esiin indikoimaan biologista stabiiliutta.

20 Taulukko 1: yleistiedot

.·. KFN-tyyppi Ketjunpituus Kokonaisvaraus Denaturaatio t, °C

: rAprotiniini 1-58 +6 >100 ;'Y 1512 1-58 -2 87 * i i 1514 1-58 o 88 1544 1-58 +2 98 • · · : Y 1545 1-58 0 93 1547 1-58 +2 86 1660 3-58 +2 77 1661 3-58 +3 79 :T: 1735 3-58 -1 68 !* . 1737 3-58 0 70 • ♦ · ’· 1739 3-58 +1 81 ”'''1 1742 3-58 +2 71 :Y: 1752 3-58 +1 • « 1755 3-58 0 68 1756 3-58 -1 70 105036 27

Ensimmäisenä päivänä kaikkien analogien tutkimuksissa 2 urosrotan ja 2 naarasrotan ryhmä sai 33, 100, 300 tai 900 mg analogia/kg ruumiinpaino. Kaksi samaan tapaan koottua verrokkiryhmää sai fysiologista suolaliuosta tai kloorivetyhapolla pH-arvoon 4,5 hapotettua fysiologista suolaliuosta. Jälkimmäinen liuos toimi vehikkelinä. Annosti-5 lavuus oli 10 ml/kg ruumiinpaino kaikissa tapauksissa. Rottia tarkkailtiin 7 päivän ajan, kahdeksantena päivänä ne tapettiin. Autopsiassa munuaiset punnittiin ja valmistettiin histopatologisia tutkimuksia varten. Vastemuuttujat näkyvät taulukon 2 otsikossa.

Tulokset yksittäisistä tutkimuksista on koottu taulukkoon 2. Vertailua varten on lisätty 10 tiedot yhdistelmä-aprotiniinista (annostus: 11-300 mg/kg). KFN-1512:ta ei saatu liukenemaan vaadittuun korkeimpaan annokseen (900 mg/kg).

Yksi eläin kuoli annostuksella 900 mg KFN-1545/kg. Tämän lisäksi ei muuta kuolemaan johtavaa ollut havaittavissa.

15

Histopatologisia munuaismuutoksia ei ollut havaittavissa kun oli annettu (300 mg/kg ruumiinpaino) seuraavia: KFN-1512, KFN-1544, KFN-1545 ja KFN-1660. Histopatologisia munuaismuutoksia ei myöskään ollut havaittavissa kun oli annettu 900 mg/kg ruumiinpaino seuraavia: KFN-1514, KFN-1547, KFN-1661. Kaikilla analogeilla oli siis 20 histopatologisia munuaismuutoksia koskevat ei-toksisuus-tasot 300 mg/kg tai enemmän verrattuna aprotiniinin arvoon 11 mg/kg.

« r

I I I I

’< ;'; Muiden vastemuuttujien kohdalla analogit olivat yhtä hyviä tai parempia kuin aproti-

«Il I

.:. niini.

«IIT

....:25 I « M I • · · • · « ·

• M

• « * I · · •

Mf • 4 · • · · ··» » · I • · · • * • « I t ·· « t « « « «

I I I I 4 I I

« « I « I

< I

« « I

105036 28

Taulukko 2 Ei-toksisuustasot vastemuuttujilla, mg/kg Kliiniset havainnot KFN- 0-30 min 2 tuntia Päivit- Kuol- Makrosk. Mikrosk. Ruumiin- Munuais- tyyppi annon annon täin leisuus havainnot havainnot paino 8. ten paino jälkeen jälkeen pnä 8. pnä rAproti- 33 300 300 300 33 11 100 100 niini1,2 15121 33 300 300 300 300 300 300 300 1514 900 900 900 900 900 900 900 900 1544 33 100 100 900 300 300 900 300 1545 33 900 900 300 300 300 300 300 1547 33 300 300 900 900 900 900 900 1660 300 900 900 900 900 900 900 900 1661 100 900 900 900 300 900 900 900 5 1,2 Suurin annos = 300 mg/kg 2 Pienin annos = 11 mg/kg

Wistar-rotille kokeellisesti yhtenä annoksena intravenoosisesti annettujen aprotiniinia-nalogien toksisuusprofiili parani vaihtelevasti verrattuna aprotiniinin toksisuusprofiiliin. 10 Kaikilla aprotiniinianalogeilla oli ei-nefrotoksisuusvaikutustasot 300 mg/kg tai sitä suu-: " remmat. KFN-1514:llä yleinen ei-toksisuusvaikutustaso 900 mg/kg, mikä oli suurin an-

I

: nos.

• · · lii :··: Esimerkki 16 ΙΛ15 • · .'; . Yhdistelmä-aprotiniinin ja aprotiniinianalogien poistuminen ja jakautuminen '•ym Rekombinanttista autenttista aprotiniinia ja esimerkkien 1-7 mukaisia analogeja liuo-• · · I.. tettiin 0,9 % NaCkiin, niin että saatiin annostilavuudet 1 μΐ/g rotta. Injektioliuosten pi- *\ 20 toisuudet olivat verrokkeja, jotka analysoitiin menetelmillä, joita kuvataan seuraavaksi.

• · • · « • «· a « •: i Käytettiin 200-230 grammaa painavia naaraspuolisia Wistar-rottia. Aprotiniinia ja ana-<. \_ logeja testattiin kahdella eri tavalla, 1) anestesioiduilla ja 2) anestesioimattomilla rotilla.

• a · « « '•'25 Rotat anestesioihin intraperitoneaalisella ruiskeella pentobarbitaalinatriumia. Kaulavaltimo ja kaulalaskimo paljastettiin ja kanyloitiin polyeteenikatetreilla (PE-50, Intrame- 105036 29 die). Valtimokatetri yhdistettiin perfuusoriin (B. Braun), infuusio 3,8 ml 0,9 % NaCl/h, ja verenpainemuuntajaan. Verenpainemuutokset rekisteröitiin taulukkorekisteröintilait-teen avulla (Kipp & Zonen, BD 9). Analogit annettiin bolusinjektioina 15 sekunnissa laskimokatetrin kautta.

5

Verinäytteet otettiin valtimokatetrista 3, 10, 20, 40 ja 60 minuuttia annon jälkeen. Näytteet (0,45 ml) koottiin 3 ml:n koeputkiin, jotka sisälsivät 50 μΐ 0,13 M natriumsit-raattia, ja sentrifugoitiin. Plasmaa säilytettiin -20 °C:ssa analyysiin asti. Kuusikymmentä minuuttia annon jälkeen rotat tapettiin ylisuurella pentobarbitaalinatriumannoksella, 10 munuaiset ja maksa poistettiin, punnittiin ja säilytettiin -80 °C:ssa.

Ennen analogien antoa anestesioimattomat rotat saivat oraalisesti 2 ml tislattua H20:ta. Analogit annettiin intravenoosisesti bolusinjektioina häntälaskimoon intravenoosikatet-rin avulla (Venflon 22 G, Viggo-Spectramed, Helsingborg, Ruotsi). Annon jälkeen ka-15 tetri huuhdottiin 0,5 ml:lla 0,9-prosenttista NaClia ja poistettiin. Injektiokohtaan pantiin laastari estämään veren vuotoa hännästä.

Rotta pantiin tuotetun virtsan kokoamiseksi metabolismihäkkiin.

20 Kolmen tunnin jälkeen rotta tapettiin johtamalla häkkiin C02/C>2 (9/1), munuaiset ja maksa poistettiin ja säilytettiin -80 °C:ssa analyysiin asti. C02-annon aikana rotan virt-. sarakko tyhjeni, rotta otettiin pois ja metabolismihäkkiä huuhdottiin 0,9-prosenttisella

• I

: ' ‘ NaCklla, niin että kokonaistilavuus virtsaa/NaCl oli 25 ml.

• « * • » · I * · f .. 1:25 Homogenaattien valmistuksessa pantiin yksi munuainen (noin 1 g) ja noin 2 g maksaku-”’*·* dosta erillisiin 10 ml:n muovisiin koeputkiin ja lisättiin 2 ml 0,9-prosenttista NaCl. Ku-doksia homogenoitiin 5 minuutin ajan laitteena High Intensity Ultrasonic Processor (malli VC50, solics & Materials Inc. Danbury CT, USA). Munuais- ja maksahomo-genaatit laimennettiin sitten suolaliuoksella, niin että saatiin kokonaistilavuudet 10-25 ja ,*;*30 4 ml.

I f i » * · · • » · • * *

Analyyseissä mitattiin aprotiniinin ja analogien määriä plasmassa, maksahomogenaa- * t :,'': teissä ja injektioliuoksissa fotometrisesti (Cobas Fara Π, Roche). Lyhyesti sanoen plas ma, homogenaatit tai injektioliuokset saostettiin hapolla muiden kallikreiini-inhibiitto-35 rien kuin aprotiniinin poistamiseksi. Näytteen kallikreiinia inhiboiva aktiviteetti mitattiin käyttämällä sian haiman kallikreiinia (Sigma K 3627) ja kromogeenista substraattia S2266 (Kabi).

105036 30

Pitoisuudet munuaishomogenaateissa ja virtsassa mitattiin muutoin samalla menetelmällä, vain saostusvaihe jätettiin pois, sillä sisäinen kallikreiinia inhiboiva aktiviteetti laimennetuissa homogenaateissa ja virtsassa oli mitätöntä.

5 Kaikissa elatusaineissa kaikille analogeille käytettiin erillisiä standardikäyriä.

Tutkittiin 14 anestesioidun ja 14 anestesioimattoman rotan ryhmää. Jokaiselle rotalle annettiin 1,56 jjmoolia (noin 10 mg) aprotiniinia tai aprotiniinianalogia per kg ruumiinpaino. Perustiedot 28 ryhmästä on koottu taulukkoon ΠΙ.

10

Taulukko ΠΙ

Ryhmät n BW KW LW

rAprotiniini A 5 251,8 0,98 9,9 KFN1512A 4 230,0 0,84 9,6 KFN1514A 4 220,5 0,85 8,6 KFN 1544A 4 226,0 0,97 9,3 KFN 1545A 4 224,8 0,92 9,2 KFN 1547A 4 229,0 0,75 8,6 KFN 1660 A 4 220,5 0,93 9,7 KFN1661A 4 240,8 0,97 9,0 rAprotiniini U 4 192,5 0,77 9,8 V KFN 1512 U 5 191,0 0,65 7,2 · ' KFN 1514 U 6 188,3 0,69 7,3 :**· KFN 1544 U 5 190,0 0,64 6,5 i V KFN 1545 U 6 185,8 0,66 7,3 :T: KFN 1547 U 5 188,0 0,67 7,3 KFN 1660 U 6 205,0 0,77 8,5 KFN 1661U 6 204,2 0,80 8,1 • · · 77 7 • M • · · • · · .· . BW: ruumiin paino (g). KW: munuaisen paino (g) « · · *· *-15 LW: maksan paino (g). A: koe anestesioiduilla rotilla U: koe anestesioimattomilla rotilla.

« t • · « • · f « · :*": Statistisessa arvioinnissa käytettiin Spearmanin luokitussummakorrelaatiotestiä.

S · * · 105036 31

Taulukko 4 Aprotiniinianalogit:

Inhibitorisen aktiviteetin määrä munuaisissa ja virtsassa i.v. annon jälkeen rotille 5

Analogi Kokonais- Denatur.2 Pitoisuus Pitoisuus Pitoisuus Akkumu- ID paino l.tila virtsassa munuaisis- munuaisis- loitumis- °C (max) (3h) % sa (lh) % sa (3h) % indeksi1 annoksesta annoksesta annoksesta

Aproti- +6 >100 2 21 44 2,10 niini KFN -2 87 51 2 2 1 1512 KFN 0 88 36 8 11 1,38 1514 KFN +2 98 42 17 23 1,35 1544 KFN 0 93 41 14 28 2 1545 KFN +2 86 45 4 5 1,25 1547 KFN +2 77 23 6 3 0,5 1660 KFN +3 79 18 4 3 0,75 1661 I · • >1 : 1 Munuaisakkumulaatioindeksi lasketaan inhibitorisen aktiviteetin määränä 3 tunnin jäi- ., i:' keen jaettuna määrällä 1 tunnin jälkeen • · p;:10 2 Mittaus differentiaalipyyhkäisykalorimetrin avulla, 20 mM 2(N-morfolino)etaanisulfo-nihappo, pH 5,5

Tulokset • · · l..' Analogit munuaisissa ja virtsassa \ *15 Kokonaispitoisuus mummissa (prosentteina annoksesta) 1 ja 3 tunnin kuluttua sekä virt- m 9 . ·','·· sassa 3 tunnin kuluttua nähdään kuviossa 3 ja taulukossa IV.

Mill , v. Analogien välillä näyttää olevan suuria eroja.

i r i

I I

105036 32

Mitä tulee aprotiniiniin, sen pitoisuus munuaisissa 1 tunnin jälkeen oli noin 20 % annoksesta, mutta se oli lisääntynyt yli 40 prosenttiin 3 tunnin kuluttua. Aprotiniinin erittyminen virtsaan oli merkityksetöntä.

5 Arvioitaessa, liittyikö erittyminen virtsaan 3 tunnin kuluttua analogien kokonaisvarauk-seen, laskettiin näiden kahden luvun vastaavuusaste.

Pitoisuuden virtsassa havaittiin korreloivan vahvasti analogien kokonaisvarauksien kanssa (vrt. kuvio 4).

10

Taulukko V

Analogit Akk. indeksi Stab, indeksi munuaiset Denatur. It (°C) AprotiniiniA 2,10 0,90 100 KFN1512A 0,66 0,67 87 KFN1514A 1,32 0,87 88 KFN 1544A 1,32 1,05 98 KFN 1545A 1,99 0,71 93 KFN 1547A 1,22 0,65 86 KFN 1660A 0,50 0,55 77 KFN 1661A 0,77 0,55 79 • t ; ” Tutkittaessa analogien stabiiliutta munuaiskudoksessa yksi munuainen 14 anestesioidul- • :15 ta rotalta (yksi jokaisesta ryhmästä) jaettiin kahteen yhtä painavaan osaan. Toista osaa säilytettiin 37 °C:ssa ja toista 4 °C:ssa. 4 tunnin jälkeen kudokset homogenoitiin ja analogien määrät mitattiin. Stabiiliusindeksi määritettiin 37 °C:ssa säilytetyn osan pitoi-suutena jaettuna 4 °C:ssa säilytetyn osan pitoisuudella. Stabiiliusindeksit on annettu taulukossa VI, jonka mukaan rAprotiniini, KFN 1514 ja KFN 1544 näyttävät stabii-20 leimmilta yhdisteiltä verrattuna esimerkiksi KFN 1660:een, joka näyttää olevan epäs-tabiilein.

f · · « · · • · · • · ·

Analogien stabiiliutta tutkittiin myös määrittämällä niiden denaturaatiolämpötila. Dena-' f turaatiolämpötilojen havaittiin korreloivan erittäin selvästi pitoisuuden kanssa munuais-25 kudoksessa 3 tuntia annon jälkeen (kuvio 5) ja akkumulaatioindeksien kanssa (kuvio 6), muttei virtsanerityksen kanssa.

Tulokset viittaavat siihen, että kokonaisvaraus saattaa olla merkittävä erittymisessä virtsaan, mutta vähemmän merkittävä konsentroitumisessa ja akkumuloitumisessa munuai- 33 1050ό6 sissa. Toisaalta munuaisakkumulaatio näyttää olevan suhteessa denaturaatiolämpötilaan ja analogien stabiiliuuteen munuaiskudoksessa.

On kuitenkin todennäköistä, että pitoisuudet munuaiskudoksessa, mitattuna 1 tunti an-5 non jälkeen, muuttuivat degradoitumisen tai uudelleenjakautumisen vuoksi. On siis mahdollista, että pitoisuudet esimerkiksi 10 minuuttia annon jälkeen korreloisivat ko-konaisvarauksen kanssa.

Tehtiin seuraavat johtopäätökset: 10 1) Kaikki testattavat analogit tulivat munuaisiin, mutta vaihtelevin määrin. Akkumu-loituminen munuaisiin näytti olevan suhteessa lämpöstabiiliuteen ja stabiiliuteen munuaiskudoksessa, muttei molekyylien negatiiviseen kokonaisvaraukseen.

2) Erittyminen virtsaan näytti liittyvän analogien kokonaisvaraukseen, muttei stabii-15 liuteen.

f · · < « 4 4 4 t · « 4 4 4 4 4 · f 4 «444 • · • · 4 • · · * · • · 444 • · · • · 4 444 • 4 · 4 4 4 • · · 4 4 4 • · « • · 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 „ 105036 34 (1) YLEISTÄ TIETOA: (i) HAKIJAT: Bjoem, Soeren Erik

Norris, Kjeld Diness, Viggo Noerskov-Lauritsen, Leif Christensen, Niels Dyhr Bregengaard, Claus (ii) KEKSINNÖN NIMITYS: aprotiniinianalogit (iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 29 (iv) KIRJEENVAIHTO-OSOITE:

(A) VASTAANOTTAJA: Novo Nordisk A/S

(B) KATU: Novo Alle (C) KAUPUNKI: Bagsvaerd (E) MAA: Tanska (F) POSTINUMERO: 2880 (v) TIETOKONEELLA LUETTAVISSA OLEVA MUOTO: (A) VÄLINEEN MUOTO: Disketti, 5,25 tuumaa, (B) TIETOKONE: IBM tai IBM-yhteensopiva

(C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DOS/MS-DOS

(D) OHJELMISTO: Patentin Release #1.0, Version # 1.25 • · • · · : V (vi) HAKEMUKSEN TIEDOT: 0': (A) HAKEMUSNUMERO: 931457 (B) JÄTTÖPÄIVÄ: 11.3.1993 :T: (C) LUOKITUS: - * · · • · · i · · / . (vii) ETUOIKEUSHAKEMUKSEN TIEDOT: : ' j (A) HAKEMUSNUMERO: DK 2361/90 (B) JÄTTÖPÄIVÄ: 1.10.1990 • · < · · ; ’':: (vii) ETUOIKEUSHAKEMUKSEN TIEDOT: (A) HAKEMUSNUMERO: DK 1118/91 (B) JÄTTÖPÄIVÄ: 12.6.1991 105036 35 (viii) ASIAMIEHEN/EDUSTAJAN TIEDOT (A) NIMI: Thalsoe-Madsen, Birgit

(C VIITE/ASIAREKISTERINUMERO: 3465.204-WO

(ix) ASIAMIEHEN/EDUSTAJAN TELELHKENNETIEDOT: (A) PUHELIN: (212) 867-0123 (B) TELEFAX: (212) 867-0298 (C) TELEX: (2) SEKVENSSIN ID.NRO 1 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: (A) PITUUS: 418 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEK YYLIT Y YPPI: cDNA

(vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: .·. (A) ORGANISMI: synteettinen * • · « :'V (ix) PIIRTEET:

« < M

':; (A) NIMI/AVAINSANA: CDS

: V (B) SIJAINTI (sekvenssissä): 77..409 ··» • t * • · · (ix) PIIRTEET: « · · I I I « · · (A) NIMI/AVAINSANA: sig_peptidi .· . (B) SIJAINTI (sekvenssissä): 77..235 f «t < « * (ix) PIIRTEET: :'''; (A) NIMI/AVAINSANA: mat_peptidi (B) SIJAINTI (sekvenssissä): 236..409 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID.NRO I: 105036 36 GAATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATEACAAA CTATCAATIT CATACACAAT 6C>

ATAAAOGÄCC AAAAGA ATC AAG GCT GTT TTC TTC GIT TTC TCC TTC ATC 10S

Met Lys Ala Vai Fhe Leu Vai Leu Ser Leu Ile -53 -50 -45 GGA TTC TGC TGG GCC CAA CCA GTC ACT GGC GAT GAA TCA TCT GTT GAG 157

Gly Phe Cys Trp Ala Gin Pro Vai Thr Gly Asp Glu Ser Ser Vai Glu -40 -35 * -30 ATT CCG GAA GAG TCT CIG ATC ATC GCT GAA AAC ACC ACT TIG GCT AAC 20;

Ile Pro Glu Glu Ser leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn -25 -20 -15 GTC GCC ATG GCT GAG AGA TIG GAG AAG AGA GAG CCT GAT TTC TCT TTC 253

Vai Ala Met Ala Glu Arg Leu Glu Lys Arg Glu Pro Asp Fhe Cys Leu -10 -5 ,1 5 GAA CCT CCA TAC ACT C-GT CCA TCT AAA GCT AGA ATC ATC AGA TAC TTC 301

Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe 10 15 20

TAC AAC GCC GAA C-CT C-GT TTC TCT CAA ACT TTC GTT TAC GGT GGC TCC 34S

Tyr Asn Ala Glu Ala Gly Leu Cys Gin Thr Fhe Vai Tyr Gly Gly Cys 25 30 35 AGA GCT GAA AGA AAC AAC TTC GAA TCT GCT GAA GAC TCC ATC AGA ACT 397

Arg Ala Glu Arg Asn Asn Phe Glu Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr 40 45 50 • « • · · • · · • · TCT GGT GGT GCC TAATCTAGA 418

Cys Gly Gly Ala 55 • · « • · · • · · • · · • · · • · · • · • · · » · * i « i <11 I I 1 I «

I I I

1 ' l 105036 37 (2) SEKVENSSIN ID.NRO 2 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: (A) PITUUS: 111 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID.NRO 2:

Met Lys Ala Vai Fhe Leu Vai Leu Ser Leu Ile Gly Fhe Cys Trp Ala -53 -50 -45 -40

Gin Pro Vai Ihr Gly Asp Glu Ser Ser Vai Glu Ile Pro Glu Glu Ser -35 -30 -25 leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Ihr Leu Ala Asn Vai Ala Met Ala Glu -20 -15 -10

Arg Leu Glu Lys Arg Glu Pro Asp Fhe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Ihr -5 15 10

Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe iyr Asn Ala Glu Ala 15 20 25

Gly leu Cys Gin Ihr Fhe Vai Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Glu Arg Asn 30 35 40

Asn Phe Glu Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly. Ala 45 50 55 • · : 0 (2) SEKVENSSIN ID.NRO 3 TIEDOT:

i ·· N

• · • « « :T: (i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: • · · • · · t · · . (A) PITUUS: 418 emäsparia ' · '; (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen : V; (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ( I f < «

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: (A) ORGANISMI: synteettinen 105036 38

(ix) PIIRTEET

(A) NIMI/AVAINSANA: CDS

(B) SIJAINTI (sekvenssissä): 77..409 (ix) PIIRTEET: (A) NIMI/AVAINSANA: sig_peptidi (B) SIJAINTI (sekvenssissä): 77..235 (ix) PIIRTEET: (A) NIMI/AVAINSANA: mat_peptidi (B) SIJAINTI (sekvenssissä): 236..409 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID.NRO 3: GAATTCCATT CAAGAATACT TCAAACAAGA AGATEACAAA CTATCAATIT CATACACAAT 63 ATAAAOGACC AAAAGA ATG AAG GCT GIT TTC TIG GTT TTG TCC TIG ATC 109

Het Lys Ala Vai Phe Leu. Vai Leu Ser Leu Ile -53 -50 -45 C-GA TTC TGC TGG GCC CAA CCA GTC ACT GGC GAT GAA TCA TCT GTT GAG 15 7

Gly Phe Cys Trp Ala Gin Pro Vai Thr Gly Asp Glu Ser Ser Vai Glu ' , -40 -35 ‘ -30 < t ATT COG GAA GAG TCT CIG ATC ATC GCT GAA AAC ACC ACT TIG GCT AAC 205

Ile Pro Glu Glu Ser Leu Ile Ile Ala Glu Asn Ihr Ihr Leu Ala Asn -25 -20 -15 • · · : GTC GCC ATG GCT GAG AGA TIG GAG AAG AGA GAG CCT GAT TTC TGT TIG 253

Vai Ala Het Ala Glu Arg Leu Glu Lys Arg Glu Pro Asp Phe Cys Leu *.· · -10 -5 15 ... GAA CCT CCA TAC ACT GCT CCA TCT AAA GCT AGA ATC ATC AGA TAC TTC 301 : Glu Pro Pro Tyr Ihr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe 10 15 20 » « · t : TAC AAC GCC AAG GCT GCT TTG TCT CAA ACT TTC CTT TAC GCT GGC TGC 349 ’· ” Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gin Ihr Phe Vai Tyr Gly Gly cys : * ί 25 30 35 AGA GCT AAG GAA AAC AAC TTC GAA TCT GCT GAA GAC TGC ATG AGA ACT 397 '.! Arg Ala Lys Glu Asn Asn Phe Glu Ser Ala Glu Asp Cys Het Arg Thr : 40 45 50 TCT GCT GCT GCC TAATCIAGA 418

Cys Gly Gly Ala 55 (2) SEKVENSSIN ID.NRO 4 TIEDOT: 105036 39 (i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: (A) PITUUS: 111 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIKUVAUS: SEKVENSSI ID.NRO 4:

Met Lys Ala Vai Phe Leu Vai Leu Ser Leu Ile Gly Phe Cys Trp Ala -53 -50 -45 -40

Gin Pro Vai Thr Gly Asp Glu Ser Ser Vai Glu Ile Pro Glu Glu Ser -35 -30 -25

Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn Vai Ala Met Ala Glu -20 -15 -10

Arg Leu Glu Lys Arg Glu Pro Asp Fhe cys Leu Glu Pro Pro Tyr ihr -5 15 10

Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Fhe Tyr Asn Ala Lys Ala 15 20 25 < i

Gly Leu Cys Gin Thr Fhe Vai Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Glu Asn 30 35 40

Asn Fhe Glu Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala 45 50 55 « m • · •v : (2) SEKVENSSIN ID.NRO 5 TIEDOT: :T: (i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: M· 11« • · ·

. (A) PITUUS: 418 EMÄSPARIA

’· (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 1(1 I 4 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA (vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: 105036 40

(A) ORGANISMI: synteettinen (ix) PIIRTEET

(A) NIMI/AVAINSANA: CDS

(B) SIJAINTI (sekvenssissä): 77..409 (ix) PIIRTEET: (A) NIMI/AVAINSANA: sigjpeptidi (B) SIJAINTI (sekvenssissä): 77..235 (ix) PIIRTEET: (A) NIMI/AVAINSANA: mat_peptidi (B) SIJAINTI (sekvenssissä): 236..409 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID.NRO 5:

GAATTCCATT CAAGAATACT TCAAACAAGA AGAITACAAA CTATCAATIT CATACACAAT 6C

ATAAAOGACC AAAAGA ATG AAG GCT GTT TTC TIG GTT TTG TCC TIG ATC 109

Met Lys Ala Vai Fhe Leu Vai Leu Ser Leu Ile -53 -50 -45 ;'. t, GGA TTC TGC TGG GCC CAA CCA GTC ACT GGC GAT GAA TCA TCT CTT GAG 157

Gly Fhe Cys Trp Ala Gin Pro Vai Ihr Gly Asp Glu Ser Ser Vai Glu -40 -35 -30 ATT COG GAA GAG TCT CFG ATC ATC GCT GAA AAC ACC ACT TTG GCT AAC 205

Ile Pro Glu Glu Ser Leu Ile Ile Ala Glu Asn Ihr Thr Leu Ala Asn ,! -25 -20 -15 ♦ · GTC GCC ATG GCT GAG AGA TTG GAG AAG AGA AGG CCT GAT TTC TGT TTG 253 : Vai Ala Met Ala Glu Arg Leu Glu Lys Arg Arg Pro Asp Fhe Cys Leu -10 -5 1 5 :T: GAA CCT CCA TAC ACT GCT CCA TGT AAA GCT AGA ATC ATC AGA TAC TTC 301 .···. Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Fhe 10 15 20 • · '· " TAC AAC GCC AAG GCT GCT TTG TGT CAA ACT TTC GIT TAC GGT GGC TGC 349 ···· Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gin Thr Fhe Vai Tyr Gly Gly Cys 25 .30 35 ( I < '; |' AGA GCT AAG GAA AAC AA.C TTC GAA TCT C-CT GAA GAC TGC ATG AGA ACT 397 J Arg Ala Lys Glu Asn Asn Fhe Glu Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr „ 40 45 50 TGT GCT GCT GCC TAATCTAGA 418 = Cys Gly Gly Ala j 55 i* ii t| 105036 41 (2) SEKVENSSIN ID.NRO 6 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: (A) PITUUS: 111 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID.NRO 6:

Met Lys Ala Veil Fhe Leu Vai Leu Ser Leu Ile Gly Phe Cys Trp Ala -53 -50 -45 -40

Gin Pro Vai Thr Gly Asp Glu Ser Ser Vai Glu Ile Pro Glu Glu Ser -35 ' -30 -25

Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn Vai Ala Met Ala Glu -20 -15 -10

Arg Leu Glu Lys Arg Arg Pro Asp Fhe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Ihr -5 1 5 10 '" Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Fhe Tyr Asn Ala Lys Ala 15 20 25

Gly leu Cys Gin Ihr Fhe Vai Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Glu Asn 30 35 40

Asn Fhe Glu Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala 45 50 55 • · · • · · (2) SEKVENSSIN ID.NRO 7 TIEDOT: • · · • · » • · « / . (i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: • · · • · · * · * : (A) PITUUS: 418 emäsparia : V: (B) TYYPPI: nukleiinihappo ;'". (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

42 105036 (vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: (A) ORGANISMI: synteettinen

(ix) PIIRTEET

(A) NIMI/AVAINSANA: CDS

(B) SIJAINTI (sekvenssissä): 77..409 (ix) PIIRTEET: : . (A) NIMI/AVAINSANA: sig_peptidi (B) SIJAINTI (sekvenssissä): 77..235 (ix) PIIRTEET: (A) NIMI/AVAINSANA: mat_peptidi (B) SIJAINTI (sekvenssissä): 236..409 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID.NRO 7: GAATTCCA1T CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATIACAAA CTATCAATIT CATACACAAT 50 ATAAAOGACC AAAAGA ATG AAG GCT GTT TTC TTG GTT TTG TCC TIG ATC 109

Ket Lys Ala Vai Phe Leu Vai Leu Ser Leu Ile -53 -50 -45 • · ; " GGA TIC TGC TGG GCC CAA CCA GTC ACT GGC GAT GAA TCA TCT GIT GAG 157 : Gly Fhe cys Trp Ala Gin Pro Vai Thr. Gly Asp Glu Ser Ser Vai Glu "V -40 -35 -30 ATT CCG GAA GAG TCT CIG ATC ATC GCT GAA AAC ACC ACT TTG GCT AAC 205

Ile Pro Glu Glu Ser Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr leu Ala Asn -25 -20 -15 .

• · • · « V ; GTC GCC ATG C-CT GAG AGA TTG GAG AAG AGA AGG CCT GAT TTC TCT TTG 253

Vai Ala Met Ala Glu Arg Leu Glu Lys Arg Arg Pro Asp Phe Cys Leu -10 -5 i*5 IM ·*" *+ • · · • · » GAA CCT CCA TCT ACT GGT CCA TGT AAA GCT AGA ATC ATC AGA TAC TTC 301 *.* * Glu Pro Pro Ser Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe ·* · 10 15 20 • · · • TAC GAC GCC ACT GCT GGT TTG TGT GAA ACT TTC GTT TAC GGT GGC TGC 349

Tyr Asp Ala Thr Ala Gly Leu Cys Glu Thr Fhe Vai Tyr Gly Gly Cys 25 30 35 AGA GCT AAC AGA AAC AAC TTC AAG TCT GCT GAA GAC TGC ATG GAA ACT 397

Arg Ala Asn Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Glu Thr - 40 45 50 TGT GGT GGT GCC TAATCTAGA 418

Cys Gly Gly Ala 55 (2) SEKVENSSIN ED.NRO 8 TIEDOT: 105036 43 (i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: (A) PITUUS: 111 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ED.NRO 8:

Met Lys Ala Vai Phe Leu Vai Leu Ser Leu Ile Gly Fhe Cys Trp Ala -53 -50 -45 -40

Gin Pro Vai Ihr Gly Asp Glu Ser Ser Veil Glu Ile Pro Glu Glu Ser -35 -30 -25

Leu Ile Ile Ala Glu Asn Ihr Thr Leu Ala Asn Vai Ala Met Ala Glu -20 -15 -10

Arg leu Glu Lys Arg Arg Pro Asp Fhe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Ihr -5 15 10

> I

; , Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Fhe Tyr Asp Ala Ihr Ala 15 20 25

Gly Leu Cys Glu Ihr Fhe Vai Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Asn Arg Asn 30 35 .40

Asn Fhe Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Glu Ihr Cys Gly Gly Ala 45 50 55 • · · :T: (2) SEKVENSSIN ID.NRO 9 TIEDOT: • · · • · · • · · / . SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: • · · » · ♦ • · (A) PITUUS: 418 emäsparia :';'; (B) TYYPPI: nukleiinihappo ‘"; (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: (A) ORGANISMI: synteettinen 105036 44

(ix) PIIRTEET

(A) NIMI/AVAINSANA: CDS

(B) SIJAINTI (sekvenssissä): 77..409 (ix) PIIRTEET: (A) NIMI/AVAINSANA: sig_peptidi (B) SIJAINTI (sekvenssissä): 77..235 (ix) PIIRTEET: (A) NIMI/AVAINSANA: matjpeptidi (B) SIJAINTI (sekvenssissä): 236..409 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID.NRO 9:

GAATTCCATT CAAGAAIACT TCAAACAAGA AGATTACAAA CIATCAATIT CAIACACAAT 6C

AIAAAOGACC AAAAGA ATG AAG GCT GIT TTC TTG GTT TIG TCC TIG ATC 10S

Met Lys Ala Vai Fhe Leu Vai Leu Ser Leu Ile -53 -50 -45 GGA TIC IGC TGG GCC CAA CCA CTC ACT GGC GAT GAA TCA TCT GIT GAG 157 ! . Gly Phe cys Trp Ala Gin Pro Vai Thr Gly Asp Glu Ser Ser Vai Glu -40 -35 -30 ATT CCG GAA GAG TCT CIG ATC ATC GCT GAA AAC ACC ACT TIG GCT AAC 205

Ile Pro Glu Glu Ser Leu Ile Ile Ala Glu Asn Ihr Thr leu Ala Asn -25 -20 -15 » « » • ♦ • · GTC GCC AIG GCT GAG AGA TIG GAG AAG AGA AGG CCT GAT TTC TCT TIG 252

Vai Ala Met Ala Glu Arg Leu Glu Lys Arg Arg Pro Asp Phe Cys Leu -10 -5 1 5 .

• # · ** GAA CCT CCA TCT ACT GCT CCA TCT AAA GCT AGA ATC ATC TIG TAC TTC 301

Glu Pro Pro Ser Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Leu Tyr Phe 10 15 20 TAC AAC GCC AAG GCT GCT TIG TCT CAA ACT TTC GTT TAC GCT GGC TGC 349 I Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gin Thr Phe Vai Tyr Gly Gly Cvs 25 30 35 i :.V AGA GCT AAC GCT AAC CAA TTC TAC TCT GCT GAA GAC TGC ATG AGA ACT 397 '", Arg Gly Asn Gly Asn Gin Phe Tyr Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr 40 45 50 TCT GCT GCT GCC TAATCTAGA 413 I Cys Gly Gly Ala 55 45 105036 (2) SEKVENSSIN ID.NRO 10 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: (A) PITUUS: 111 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID.NRO 10:

Met Lys Ala Vai Fhe Leu Vai Leu Ser Leu Ile Gly Fhe Cys Trp Ala -53 -50 -45 -40

Gin Pro Vai Thr Gly Aso Glu Ser Ser Veil Glu Ile Pro Glu Glu Ser -35 ’ -30 -25

Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn Vai Ala Met Ala Glu -20 -15 -10

Arg Leu Glu Lys Arg Arg Pro Asp Fhe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr -5 15 10

Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Leu Tyr Fhe Tyr Asn Ala Lys Ala ; '· 15 20 25

Gly Leu Cys Gin Ihr Fhe Vai Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Asn Gly Asn 30 35 40

I I I

Gin Fhe Tyr Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala 45 50 55 • · • · • ·♦ • · t • » » (2) SEKVENSSIN ID.NRO 11 TIEDOT: • # t · · .’.‘.V (i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: • · · • (A) PITUUS: 508 emäsparia :··: (B) TYYPPI: nukleiinihappo ’. y: (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen I < ·

(ii) MOLEKYYLIT YYPPI: cDNA

(vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: (A) ORGANISMI: synteettinen 105036 46

(ix) PIIRTEET

(A) NIMI/AVAINSANA: CDS

(B) SIJAINTI (sekvenssissä): 77..499 (ix) PIIRTEET: (A) NIMI/AVAINSANA: sigjpeptidi (B) SIJAINTI (sekvenssissä): 77..331 (ix) PIIRTEET: (A) NIMI/AVAINSANA: mat_peptidi (B) SIJAINTI (sekvenssissä): 332..499 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID.NRO 11: GAATTCCAIT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATIACAAA CTATCAATTT CATACACAAT 60 AIAAAOGATT AAAAGA ATG AGA ITT CCT TCA ATT ITT ACT GCA GIT TTA 109

Met Arg Fhe Pro Ser Ile Fhe Thr Ala Vai leu -85 -80 -75 I . TTC GCA GCA TCC TCC GCA TTA GCT GCT CCA GTC AAC ACT ACA ACA GAA 157 :,: Phe Ala Ala Ser Ser Ala leu Ala Ala Pro Vai Asn Thr Thr Thr Glu -70 -65 -60 GAT GAA AOG GCA CAA ATT COG GCT GAA GCT GTC ATC GGT TAC TCA GAT 205 .. Asp Glu Thr Ala Gin Ile Pro Ala Glu Ala Vai Ile Gly Tyr Ser Asp : .· -55 -50 -45 · · » TTA GAA GGG GAT TTC GAT GTT GCT GTT TTG CCA TTT TCC AAC AGC ACA 253

Leu Glu Gly Asp Fhe Asp Vai Ala Vai Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr ... -40 * -35 -30 • · · • · · • AAT AAC GGG TTA TTG TTT AIA AAT ACT ACT ATT GCC AGC ATT GCT GCT 301 *·* * Asn Asn Gly Leu Leu Fhe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala .·.’ : -25 -20 -15 • · · • · ·:··? AAA GAA GAA GGG GTA TCT TTG GAT AAA AGA GAT TTC TGT TTG GAA CCT 349 . Ly s Glu Glu Gly Vai Ser leu Asp Ly s Arg Asp Fhe Cys Leu Glu Pro “10 -5 15

« I

• « I

l I

1 f * » < 105036 47 CCA TAC ACT GGT CCA TGT AAA GCT AGA ATC ATC AGA TAC TTC TAC- AAC 397

Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lvs Ala Arg lie lie Arg Tyr Fhe Tyr Asn 10 * 15 20 GCC AAG GCT GGT TIG TGT CAA ACT TTC GTT TAC GGT GC-C TGC AGA GCT 445

Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gin Thr fhe Veil Tyr Gly Gly Cys Arg Ala 25 30 35 AAG TCC AAC AAC TTC GAA TCT GCT GAA GAC TGC ATG AGA ACT TGT GGT 493

Lys Ser Asn Asn Fhe Glu Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly 40 45 50 GGT GCC TAATCIAGA 508

Gly Ala 55 (2) SEKVENSSIN ID.NRO 12 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: (A) PITUUS: 141 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: Lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID.NRO 12: ; Met Arg Phe Pro Ser Ile fhe Thr Ala Vai Leu Phe Ala Ala Ser Ser -85 -80 -75 -70 • · ·

Ala Leu Ala Ala Pro Vai Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gin ... "65 ”60 -55 • · «

« I I

.···, Ile Pro Ala Glu Ala Vai Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Aso fhe V ‘ -50 -45 -40 • » *.*·: Asp Veil Ala Vai Leu Pro fhe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu -35 -30 -25 '. . fhe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Vai ,v ”20 -15 -10 « c »

Ser Leu Asp Lys Arg Asp fhe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro -5 15 10

Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu 15 20 25 105036 48

Cys Gin Thr Fhe Vai Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Ser Asn Asn Fhe 30 * 35 40

Glu Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala 45 50 * 55 (2) SEKVENSSIN ED.NRO 13 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: (A) PITUUS: 508 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: (A) ORGANISMI: synteettinen

(ix) PIIRTEET

(A) NIMI/AVAINSANA: CDS

(B) SIJAINTI (sekvenssissä): 77..499 (ix) PIIRTEET: : (A) NIMI/AVAINSANA: sig_peptidi (B) SIJAINTI (sekvenssissä): 77..331 (ix) PIIRTEET: (A) NIMI/AVAINSANA: mat_peptidi / . (B) SIJAINTI (sekvenssissä): 332..499 · · • · · • · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID.NRO 13: 105036 49 GAATICCAIT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATIACAAA CTATCAATTT CATACACAAT 60 AIAAAOGATT AAAAGA ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT ACT GCA GIT ΊΤΑ 109

Met Arg Fhe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Vai Leu -85 -80 -75 TTC GCA GCA TCC TCC GCA TTA GCT GCT CCA GTC AAC ACT ACA ACA GAA 157

Phe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala Ala Pro Vai Asn Thr Thr Thr Glu -70 -65 ’ -60 GAT GAA AOG GCA CAA ATT CCG GCT GAA GCT GTC ATC GGT TAC TCA GAT 205

Asp Glu Thr Ala Gin Ile Pro Ala Glu Ala Vai Ile Gly Tyr Ser Asp -55 -50 -45 TEA GAA GGG GAT TTC GAT GTT GCT GTT TTG CCA TTT TCC AAC AGC ACA 253

Leu Glu Gly Asp Phe Asp Vai Ala Vai Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr -40 -35 -30 AAT AAC GGG TTA TTG TTT ΑΤΑ AAT ACT. ACT ATT GCC AGC ATT GCT GCT 301

Asn Asn Gly Leu Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala -25 -20 -15 AAA GAA GAA GGG GIA TCT TTG GAT AAA AGA GAT TTC TGT TTG GAA CCT 349

Lys Glu Glu Gly Vai Ser Leu Asp Lys Arg Asp Fhe cys Leu Glu Pro -10 -5*1 5 CCA TAC ACT GGT CCA TGT AAA GCT AGA ATC ATC AGA TAC TTC TAC AAC 397

Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn 10 15 20 GCC AAG GCT GGT TTG TGT CAA ACT TTC GIT TAC GGT GGC TCC AGA GCT 445 ;V. Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gin Thr Phe Vai Tyr Gly Gly Cys Arg Ala : .· 25 30 35 • ·· • · · AAG TCC AAC AAC TTC GCT TCT GCT GAA GAC TCC ATG AGA ACT TGT GGT 493

Lys Ser Asn Asn Phe Ala Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr cys Gly 40 45 50 • · · m :*·*: ggt gcc taatceaga 508

Gly Ala : 55 Ψ · · • · ( (2) SEKVENSSIN ID.NRO 14 TIEDOT: 105036 50 SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: (A) PITUUS: 141 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID.NRO 14:

Met Arg Fhe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Vai Lsu Phe Ala Ala Ser Ser -85 -30 -75 -70

Ala Leu Ala Ala Pro Vai Asn Thr Ihr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gin -65 -60 -55

Ile Pro Ala Glu Ala Veil Ile Gly Tyr Ser Asp leu Glu Gly Asp Phe -50 -45 -40

Asp Vai Ala Vai Leu Pro Phe Ser Asn Ser Ihr Asn Asn Gly Leu Leu -35 -30 -25

Fhe Ile Asn Ihr Ihr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Vai -20 -15 -10

Ser Leu Asp Lys Arg Asp Phe Cys leu Glu Pro Pro Tyr ihr Gly Pro -5 1 5 10

Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu 15 20 25

Cys Gin Ihr Fhe Vai Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Ser Asn Asn Phe : ·* 30 35 40 • · · t · · • « ·

Ala Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Ihr Cys Gly Gly Ala 45 50 55 • · « : (2) SEKVENSSIN ID.NRO 15 TIEDOT: • · · ' y

• · I

· · (i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: 9 9 r (A) PITUUS: 412 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo ...: (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 105036 51

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: (A) ORGANISMI: synteettinen

(ix) PIIRTEET

(A) NIMI/AVAINSANA: CDS

(B) SIJAINTI (sekvenssissä): 77..403 (ix) PIIRTEET: (A) NIMI/AVAINSANA: sigjpeptidi (B) SIJAINTI (sekvenssissä): 77..235 (ix) PIIRTEET: (A) NIMI/AVAINSANA: mat_peptidi (B) SIJAINTI (sekvenssissä): 236..403 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ED.NRO 15: GAATTCCAIT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATIACAAA CIÄTCAATIT CATACACAAT 60 AIAAACGACC AAAAGA ATG AAG GCT GTT TTC TTG GTT TTG TCC TTG ATC 109

Met Lys Ala Vai Fhe Leu Vai Leu Ser Leu Ile -53 -50 -45 GGA TTC TGC TGG GCC CAA CCA GTC ACT GGC GAT GAA TCA TCT GTT GAG 157

Gly Fhe Cys Trp Ala Gin Pro Vai Thr Gly Asp Glu Ser Ser Vai Glu .· . -40 -35 -30 · · • · m · ATT CCG GAA GAG TCT CIG ATC ATC GCT GAA AAC ACC ACT TTG GCT AAC 205 • Ile Pro Glu Glu Ser Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn -25 -20 -15

• M

V : GTC GCC ATG GCT GAG AGA TTG GAG AAG AGG GAT TTC TGT TTG GAA CCT 253

Vai Ala Met Ala Glu Arg Leu Glu Lys Arg Asp Fhe cys Leu Glu Pro -10 -5 15 • · • · · *· *: CCA TCT ACT GGT CCA TGT AAA GCT AGA ATC ATC AGA TAC TTC TAC GAC 301 • Pro Ser Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Fhe Tyr Asd 10 15 20 ( i GCC ACT GCT GGT TTG TGT GAA ACT TTC GIT TAC GGT GGC TGC AGA GCT 349 '...· Ala Thr Ala Gly Leu Cys Glu Thr Phe Vai Tyr Gly Gly Cys Arg Ala 25 30 35 105036 52 AAC AGA AAC AAC TTC AAG TCT GCT GAA GAC TGC ATG GAA ACT TUT GOT 1)97

Asn Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly 40 45 50 GGTT GCC TAATCIAGA 412

Gly Ala 55 (2) SEKVENSSIN ID.NRO 16 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: (A) PITUUS: 109 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID.NRO 16:

Met Lys Ala Vai Phe Leu Vai Leu Ser Leu Ile Gly Fhe Cys Trp Ala -53 -50 -45 -40

Gin Pro Vai Thr Gly Asp Glu Ser Ser Vai Glu Ile Pro Glu Glu Ser : -35 -30 -25

Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn Vai Ala Met Ala Glu -20 -15 -10

Arg Leu Glu Lys Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr Gly Pro -5 15 io « · a ' Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asp Ala Thr Ala Gly Leu 15 20 25 !,·’ '· Cys Glu Thr Fhe Vai Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Asn Arg Asn Asn Phe 30 35 40 • · · a . Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala \’·? 45 50 55

• < i » I

r c r (2) SEKVENSSIN ID.NRO 17 TIEDOT: 105036 53 (i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: (A) PITUUS: 508 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: (A) ORGANISMI: synteettinen

(ix) PIIRTEET

(A) NIMI/AVAINSANA: CDS

(B) SIJAINTI (sekvenssissä): 77..499 (ix) PIIRTEET: (A) NIMI/AVAINSANA: sig_peptidi (B) SIJAINTI (sekvenssissä): 77..331 (ix) PIIRTEET: (A) NIMI/AVAINSANA: mat_peptidi (B) SIJAINTI (sekvenssissä): 332..499 • · « • · · • · • · · * « « • n · • fll • · r· • · · • « · • « f « · · * « * · · • · · • · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID.NRO 17: 105036 54 GAAnCCATT CAAGAAIAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAAITT CATACACAAT 60 ATAAACGATT AAAAGA ATG AGA ΊΊΤ CCT TCA ATT TTT ACT GCA CTT TEA 109

Ket Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Vai Leu -85 -80 -75 TTC GCA GCA TCC TCC GCA TEA GCT GCT CCA GTC AAC ACT ACA ACA GAA 157

Phe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala Ala Pro Vai Asn Thr Thr Thr Glu -70 -65 -60 GAT GAA ACG GCA CAA ATT CCG GCT GAA GCT GTC ATC GGT TAC TCA GAT 205

Asd Glu Thr Ala Gin Ile Pro Ala Glu Ala Vai Ile Gly Tyr Ser Asp -55 -50 -45 TEA GAA GGG GAT TTC GAT GTT GCT GTT TTG CCA TTT TCC AAC AGC ACA 253

Leu Glu Gly Asp Phe Asp Vai Ala Vai leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr -40 -35 -30 AAT AAC GGG TEA TTG TTT ΑΤΑ AAT ACT ACT ATT GCC AGC ATT GCE GCT 201

Asn Asn Gly Leu leu Fhe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala -25 -20 -15 AAA GAA GAA GGG GTA TCT TTG GAT AAA AGA GAT TTC TGT TTG GAA CCT 349

Lys Glu Glu Gly Vai Ser Leu Asp Lys Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro -10 -5 15 CCA TAC ACT GGT CCA TCT AAA GCT AGA ATC ATC AGA TAC TTC TAC GAC 397

Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asp 10 15 20 GCC ACT GCT GCT TTG TCT GAA ACE TTC GTT TAC GCT GGC TGC AGA GCT 445 .. . Ala Thr Ala Gly Leu Cys Glu Thr Phe Vai Tyr Gly Gly Cys Arg Ala • 25 30 35 • « · • · · f < i AAG AGA AAC AAC TTC AAG TCT GCT GAA GAC TGC ATG GAA ACT TCT GCT 493

Lys Arg Asn Asn Fhe Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly 40 45 50 I I I • t · • GCT GCC TAATCEAGA 508 : Gly Ala ' 55 (2) SEKVENSSIN ID. NRO 18 TIEDOT: 105036 55 (i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: (A) PITUUS: 141 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITΥΎΡΡΙ: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID .NRO 18:

Met Arg Fhe Pro Ser Ile Fhe Ihr Ala Vai Leu Fhe Ala Ala Ser Ser -85 -80 -75 -70

Ala Leu Ala Ala Pro Vai Asn Ihr Ihr Ihr Glu Asp Glu Thr Ala Gin -65 -60 -55

Ile Pro Ala Glu Ala Vai Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Fhe -50 -45 -40

Asp Veil Ala Vai Leu Pro Fhe Ser Asn Ser Ihr Asn Asn Gly Leu Leu -35 "30 -25

Fhe Ile Asn Ihr Ihr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Vai -20 -15 -10

Ser Leu Asp Lys Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro ... -5 1 5 10 I ( I ·

Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg iyr Fhe Tyr Asp Ala Ihr Ala Gly Leu 15 20 25 ... Cys Glu Ihr Fhe Vai Tyr Gly Gly cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Fhe v : 30 35 40

*M

• : Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Glu Ihr Cys Gly Gly Ala .1 . 45 50 55 • · · • »· • · ’ t r i » i ' 1 » » i « · < · f « I a

* « I

(2) SEKVENSSIN ID.NRO 19 TIEDOT: 105036 56 (i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: (A) PITUUS: 412 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: (A) ORGANISMI: synteettinen

(ix) PIIRTEET

(A) NIMI/AVAINSANA: CDS

(B) SIJAINTI (sekvenssissä): 77..403 (ix) PIIRTEET: (A) NIMI/AVAINSANA: sig_peptidi (B) SIJAINTI (sekvenssissä): 77..235

I 1 I

(ix) PIIRTEET: (A) NIMI/AVAINSANA: matjpeptidi (B) SIJAINTI (sekvenssissä): 236..403 • · · • · • · : : (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID.NRO 19: ;··*; GAATTCCATT CAAGAAIACT TCAAACAAGA AGATIACAAA CTATCAATIT CA1ACACAAT 60 • AIAAAOGACC AAAAGA ATC AAG GCT GTT TTC TIG GIT TIG TCC TIG ATC 109 / _ Met Lys Ala Vai Fhe leu Vai Leu Ser Leu Ile -53 -50 -45 • · GGA TTC IGC TGG GCC CAA CCA GTC ACT GGC GAT GAA TCA TCT GTT GAG 157

Gly Fhe Cys Trp Ala Gin Pro Vai Ihr Gly Asp Glu Ser Ser Vai Glu :.V -40 -35 -30 iit , ATT COG GAA GAG TCT CIG ATC ATC GCT GAA AAC ACC ACT TIG GCT AAC 2C5

Ile Pro Glu Glu Ser Leu Ile Ile Ala Glu Asn Ihr Ihr Leu Ala Asn -25 -20 -15 105036 57 GTC GCC ATG GCT GAG AGA TIG GAG AAG AGG GAT TTC TGT TIG GAA CCT 253

Val Ala Met Ala Glu Arg Leu Glu Lvs Arg Asd Phe Cys Leu Glu Pro -10 -5 15 CCA TCT ACT GGT CCA TGT AAA C-CT AGA ATC ATC AGA TAC TIC TAC AAC 301

Pro Ser Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg lie lie Arg Tyr Phe Tyr Asn 10 15 20 GCC AAG GCT GGT TIG TGT CAA ACT TTC GIT TAC GGT GGC TGC AGA GGT 349

Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gin Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Gly 25 30 35 AAC GGC AAC AAC TTC AAG TCT GCT GAA GAC TGC ATG GAA ACT TGT GGT 397

Asn Gly Asn Asn Fhe Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly 40 * 45 50 GGT GCC TAATCIAGA 412

Gly Ala 55 (2) SEKVENSSIN ID. NRO 20 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: (A) PITUUS: 109 aminohappoa , (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini j‘\: (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID.NRO 20: • · · • « « • · · t ... Het Lys Ala Vai Phe Leu Vai leu Ser Ieu Ile Gly Phe Cys Trp Ala : : -53 -50 -45 -40 • · · V : Gin Pro Vai Thr Gly Asp Glu Ser Ser Vai Glu Ile Pro Glu Glu Ser -35 -30 -25 f · · • «« • · ....: leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn Vai Ala Met Ala Glu -20 -15 -10 ( r 1 1 r

Arg Leu Glu Lys Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr Glv Pro : : -5 1 5 10

Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu 15 20 25 105036 58

Cys Gin Thr Fhe Vai TVr Gly Gly Cys Arg Gly Asn Gly Asn Asn Fhe 30 35 40

Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala 45 50 55 (2) SEKVENSSIN ID .NRO 21 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: (A) PITUUS: 508 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: (A) ORGANISMI: synteettinen

(ix) PIIRTEET

'1 (A) NIMI/AVAINSANA: CDS

(B) SIJAINTI (sekvenssissä): 77..499 (ix) PIIRTEET: (A) NIMI/AVAINSANA: sig_peptidi (B) SIJAINTI (sekvenssissä): 77..331 ..... (ix) PIIRTEET: (A) NIMI/AVAINSANA: mat_peptidi V : (B) SIJAINTI (sekvenssissä): 332..499 • « « 4 · • · » • · r i | ( (

( I I

( «

( I

( I

_ r i f (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID.NRO 21: 105036 59 GAATTCCAIT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CIATCAATIT CATACACAAT 60 ATAAACGATT AAAAGA ATG AGA TTT OCT TCA ATT TIT ACT GCA GIT TEA 109

Met Arg Fhe Pro Ser Ile Phe Ihr Ala Vai Leu -85 -80 -75 TTC GCA GCA TCC TCC GCA TEA GCT GCT CCA GTC AAC ACT ACA ACA GAA 157

Fhe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala Ala Pro Vai Asn “Ihr Thr Thr Glu -70 -65 . -60 GAT GAA ACG GCA CAA ATT CCG GCT GAA GCT GTC AIC GGT TAC TCA GAT 205

Asp Glu Thr Ala Gin Ile Pro Ala Glu Ma Vai Ile Gly Tyr Ser Asp -55 -50 -45 TTA GAA GGG GAT TTC GAT GIT GCT GIT TIG CCA ΊΤΓ TCC AAC AGC ACA 253

Leu Glu Gly Asp Phe Asp Vai Ala Vai leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr -40 -35 -30 AAT AAC GGG ΊΤΑ TIG TTT ATA AAT ACT ACT ATT GCC AGC ATT GCT GCT 301

Asn Asn Gly Leu Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala -25 -20 -15 AAA GAA GAA GGG GTA TCT TIG GAT AAA AGA GAT TTC TGT TTG GAA CCT 349

Lys Glu Glu Gly Vai Ser leu Asp Lys Arg Asn Phe Cys leu Glu Pro -10 -5 i 5 CCA TAC ACT GGT CCA TGT AAA GCT AGA ATC ATC AGA TAC TTC TAC AAC 397

Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn 10 15 20 GGC AAG GCT GGT TTG TGT CAA ACT TTC GIT TAC GGT GGC TGC AGA GCT 445 ' Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gin Thr Phe Vai Tyr Gly Gly Cys Arg Ala : · : 25 . 30 35 « · « - AAG TCC AAC AAC TTC AAG TCT GCT GAA GAC TGC ATG GAA ACT TGT GGT 493

Lys Ser Asn Asn Fhe Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly 40 45 50 • « · GGT GCC TAATCIAGA -nc ·.· · Gly Ala • 55 • · • · · 9 * # • c ( { (2) SEKVENSSIN ID. NRO 22 TIEDOT: 105036 60 (i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: (A) PITUUS: 141 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID .NRO 22:

Met Arg Fhe Pro Ser Ile Ehe Thr Ala Vai Leu Phe Ala Ala Ser Ser -85 -80 -75 -70

Ala Leu Ala Ala Pro Vai Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gin -65 -60 -55

Ile Pro Ala Glu Ala Vai Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe -50 -45 -40

Asp Vai Ala Vai Leu Pro Fhe Ser Asn Ser Ihr Asn Asn Gly Leu Leu -35 -30 -25

Fhe Ile Asn Ihr Ihr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Vai -20 -15 -10

Ser Leu Asp Lys Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro -5 15 10

Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu 15 20 25 « · · • · ·

Cys Gin Thr Phe Vai Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Ser Asn Asn Phe 30 35 40 • · · i · <

Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala ·.· · 45 50 55 • · • * · • ·« • * (2) SEKVENSSIN ID.NRO 23 TIEDOT: 61 105Q36 (i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: (A) PITUUS: 508 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: (A) ORGANISMI: synteettinen

(ix) PIIRTEET

(A) NIMI/AVAINSANA: CDS

(B) SIJAINTI (sekvenssissä): 77..499 (ix) PIIRTEET: (A) NIMI/AVAINSANA: sig_peptidi (B) SIJAINTI (sekvenssissä): 77..331 (ix) PIIRTEET: (A) NIMI/AVAINSANA: mat_peptidi (B) SIJAINTI (sekvenssissä): 332..499 • · · i · » • · !·:·. (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID.NRO 23: • i * * GAATTCCAIT CAAGAAIAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CEATCAATIT CATACACAAT 60 »·« • · « ATAAAOSATT AAAAGA ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT ACT GCA GTT TEA 109

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Vai Leu -85 -80 -75 • · • · · ’’ *: TTC GCA GCA TCC TCC GCA TEA GCT GCT CCA GTC AAC ACT ACA ACA GAA 157

Fhe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala Ala Pro Vai Asn Ihr Ihr Ihr Glu -70 -65 -60 , GAT GAA AOG GCA CAA ATT COG GCT GAA GCT GTC ATC GGT TAC TCA GAT 205

Asp Glu Ihr Ala Gin. Ile Pro Ala Glu Ala Vai Ile Gly Tyr Ser Asp -55 -50 -45 TEA GAA GGG GAT TTC GAT GTT GCT GTE TTG CCA TTT TCC AAC AGC ACA 253

Leu Glu Gly Asp Phe Asp Vai Ala Vei. Leu Pro Phe Ser Asn Ser Ihr -40 -35 -30 105036 62 AAT AAC GGG TEA TTG TTT ΑΊΆ AAT ACT ACT ATT GCC ACC ATT GCT GCT 301

Asn Asn Gly Leu Leu Fhe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala -25 -20 -15 AAA GAA GAA C-GG GTA TCT TIG GAT AAA AGA GAT TTC TCT TIG GAA CCT 349

Lys Glu Glu Gly Vai Ser Leu Asp Lys Arg Asp Fhe Cys Leu Glu Pro -10 -5 15 CCA TAC ACT GCT CCA TCT AAA GCT AGA ATC ATC AGA TAC TTC TAC AAC 397

Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn 10 15 ‘20 GCC AAG GCT GCT TTG TCT CAA ACT TTC GTT TAC GCT GGC TGC AGA GCT 445

Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gin Thr Fhe Vai Tyr Gly Gly Cys Arg Ala 25 * * 30 '35 AAG GAA AAC AAC TTC AAG TCT GCT GAA GAC TGC ATG GAA ACT TCT GCT 493

Lys Glu Asn Asn Fhe Lys Ser Ala Glu Asp cys Met Glu Thr Cys Gly 40 45 50 GCT GCC TAATCIAGA 508

Gly Ala 55 (2) SEKVENSSIN ID. NRO 24 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: (A) PITUUS: 141 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen '; / (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini • · · • · • · 0 : (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID.NRO 24:

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Vai Leu Phe Ala Ala Ser Ser “85 -80 -75 -70 « · · • · · , Ala Leu Ala Ala Pro Vai Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gin : -65 -60 -55 c r t < <

Ile Pro Ala Glu Ala Vai Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe -50 -45 -40 4 " Asp Vai Ala Vai Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu -35 -30 -25

Fhe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Vai -20 -15 -10 105036 63

Sar Leu Asp Lys Arg Asp Fhe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro “5 15 10

Cys Lys Ala Arg Ile He Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu 15 20 25

Cys Gin Ihr Fhe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Glu Asn Asn Phe 30 35 40

Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Glu Thr cys Gly Gly Ala 45 50 55 (2) SEKVENSSIN ID.NRO 25 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: (A) PITUUS: 508 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: (A) ORGANISMI: synteettinen

(ix) PIIRTEET

;*::c (A) NIMI/AVAINSANA: CDS

(B) SIJAINTI (sekvenssissä): 77..499 • · · Y..: (ix) PIIRTEET: Y ; (A) NIMI/AVAINSANA: sig_peptidi (B) SIJAINTI (sekvenssissä): 77..331 « ( i I I < « < Λ (ix) PIIRTEET: ';';' (A) NIMI/AVAINSANA: mat_peptidi ' ·' (B) SIJAINTI (sekvenssissä): 332..499 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ED .NRO 25: 105036 64 GAATTCCAIT CAAGAAIAGT TCAAACAAGA AGA1TACAAA CTATCAAITT CATACACAAT 60 AIAAACGATT AAAAGA ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT ACT GCA GTT ΤΓΑ 10«'

Met Arg Phe Pro Ser Ile Fhe Thr Ala Vai Leu -85 -80 -75 TTC GCA GCA TCC TCC GCA TEA GCT GCT CCA GTC AAC ACT ACA ACA GAA 157

Fhe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala Ala Pro Vai Asn Thr Thr Thr Glu -70 -65 . -60 GAT GAA AOG GCA CAA ATT CCG GCT GAA GCT CTC ATC GCT TAC TCA GAT 205

Asp Glu Ihr Ala Gin Ile Pro Ala Glu Ala Vai Ile Gly Tyr Ser Asp -55 -50 -45 ΊΤΑ GAA GGG GAT TTC GAT GTT GCT GTT TIG CCA ITT TCC AAC AGC ACA 253

Leu Glu Gly Asp Phe Asp Vai Ala Vai. Leu Pro Fhe Ser Asn Ser Thr -40 -35 -30 AAT AAC GGG ΊΤΑ TIG TTT AIA AAT ACT ACT ATT GCC AGC ATT GCT GCT 301

Asn Asn Gly Leu Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala -25 -20 -15 AAA GAA GAA GGG CTA TCT TTG GAT AAA AGA GAT TTC TGT TIG GAA CCT 349

Lys Glu Glu Gly Veil Ser Leu Asp Lys Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro -10 -5 1 5 CCA TAC ACT GCT CCA TGT AAA GCT AGA ATC ATC AGA TAC TTC TAC AAC 397

Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn 10 15 20 GCC GAA GCT GCT TIG TCT CAA ACT TTC GTT TAC CCT GGC TGC AGA GCT 445

Ala Glu Ala Gly Leu Cys Gin Thr Fhe Veil Tyr Gly Gly Cys Arg Ala : .· 25 30 35 • · • 9 9 AAG TCC AAC AAC TTC AAG TCT GCT GAA GAC TGC ATG GAA ACT TCT GCT 493

Lys Ser Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly 40 45 50 • · · m • · ·

V : GCT GCC TAATCEAGA

.·. Gly Ala 508 55

I I

(2) SEKVENSSIN ID. NRO 26 TIEDOT: 105036 65 (i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: (A) PITUUS: 141 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID.NRO 26:

Met Arg Phe Pro Ser Ile Fhe Ihr Ala Vai Leu Fhe Ala Ala Ser Ser -85 -80 -75 -70

Ala leu Ala Ala Pro Vai Asn Ihr Ihr Ihr Glu Asp Glu Ihr Ala Gin -65 -60 -55

Ile Pro Ala Glu Ala Vai Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Fhe -50 -45 -40

Asp Vai Ala Vai Leu Pro Phe Ser Asn Ser Ihr Asn Asn Gly Leu leu -35 -30 -25 ; ''' Phe Ile Asn Ihr Ihr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Vai -20 -15 -10

Ser Leu Asp Lys Arg Asp Fhe Cys Leu Glu Pro Pro lyr Ihr Gly Pro ... -5 1 5 10 • · · • · cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Fhe Tyr Asn Ala Glu Ala Gly Leu ·.* * 15 ’ 20 25 ... cys Gin Ihr Fhe Vai Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Ser Asn Asn Fhe V 5 30 35 40

• M

** Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Glu Ihr Cys Gly Gly Ala .·* j 45 50 55 • · · e t i < i t « r (

< I

(2) SEKVENSSIN ID.NRO 27 TIEDOT: 105036 66 (i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: (A) PITUUS: 508 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: (A) ORGANISMI: synteettinen

(ix) PIIRTEET

(A) NIMI/AVAINSANA: CDS

(B) SIJAINTI (sekvenssissä): 77..499 (ix) PIIRTEET: (A) NIMI/AVAINSANA: sigjpeptidi (B) SIJAINTI (sekvenssissä): 77..331 (ix) PIIRTEET: (A) NIMI/AVAINSANA: mat_peptidi (B) SIJAINTI (sekvenssissä): 332..499 • · · • · · • « • · «M • · « • · β f • 1 1 • « · • · · * II# I · · I I t • a · • t · « · · * 1 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ED.NRO 27: 105036 67 GAATICCATE CÄAGAATAGT TCAAACAAGA AGATIACAAA CTAECAATEE CAIACACAAT 60 ATAAACGATE AAAAGA ATG AGA ΊΤΓ CCT TCA ATT TTT ACT GCA GTT TEA 109

Met Arg Fhe Pro Ser Ile Ftie Thr Ala Veil Leu -85 -80 -75 TEC GCA GCA TCC TCC GCA TEA GOT GCT CCA GTC AAC ACE ACA ACA GAA 157

Fhe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Hir Glu -70 -65 -60 GAT GAA ACG GCA CAA ATT COG GCT GAA GCT GTC ATC GGT TAC TCA GAT 205

Asp Glu Ihr Ala Gin lie Pro Ala Glu Ala Val lie Gly Tyr Ser Asp -55 -50 -45 TEA GAA GGG GAT TEC GAT GTT GCT GTT TEG CCA TEE TCC AAC AGO ACA 253

Ton Glu Gly Asp Fhe Asp Vail Ala Val Leu Pro Fhe Ser Asn Ser Thr -40 * -35 · -30 AAT AAC GGG TEA TEG TEE ΑΙΑ AAT ACE ACE ATT GCC AGC ATE GCT GCE 301

Asn Asn Glv Leu Leu Fhe Ile Asn Thr Thr He Ala Ser He Ala Ala -25 ' -20 -15 AAA GAA GAA GGG GTA TCE TEG GAT AAA AGA GAT TEC TGT TEG GAA CCE 349

Lys Glu Glu Gly Val Ser Leu Asp Lys Arg Asp Fhe Cys Leu Glu Pro -10 -5 15 CCA TAC ACE GC7E CCA TGT AAA GCE AGA ATC ATC AGA TAC TEC TAC AAC 397

Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg He He Arg Tyr Fhe Tyr Asn :,, 10 15 20 GCC GAA GCE GGT TEG TUE CAA ACE TEC GTE TAC GGE GGC TGC AGA GCE 445

Ala Glu Ala Glv Leu Cys Gin Thr Fhe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala 25 30 35 AAG GAA AAC AAC TEC AAG TCT GCT GAA GAC TGC AIG GAA ACT TGT GGT 493 • Lys Glu Asn Asn Fhe Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly 40 45 50 • · · * GGT GCC TAATCEAGA 506

Gly Ala V · 55 *·♦ . v. * (2) SEKVENSSIN ID. NRO 28 TIEDOT: • · t · · • · ·

• I

(i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT:

' I I

(A) PITUUS: 141 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 105036 68 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID.NRO 28:

Met Arg Fhe Pro Ser Ile Phe Ihr Ala Vai Leu Fhe Ala Ala Ser Ser ~85 -80 -75 -70

Ala Leu Ala Ala Pro Vai Asn Ihr Ihr Ihr Glu Asp Glu Ihr Ala Gin -65 -60 -55

Ile Pro Ala Glu Ala Vai Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe -50 -45 -40

Asp Vai Ala Vai Leu Pro Phe Ser Asn Ser Ihr Asn Asn Gly Leu Leu -35 -30 -25

Phe Ile Asn Ihr Ihr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Vai -20 -15 -10

Ser Leu Asp Lys Arg Asp Fhe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Ihr Gly Pro -5*1 5 10 .

cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Fhe Tyr Asn Ala Glu Ala Gly Leu 15 20 25

Cys Gin Ihr Phe Vai Tyr Gly Gly cys Arg Ala Lys Glu Asn Asn Phe 30 , ?5 40

Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Glu Ihr Cys Gly Gly Ala 45 50 55 • i » • · • « v’: (2) SEKVENSSIN ID. NRO 29 TIEDOT: :T: (i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: • · · • « · • · · .* . (A) PITUUS: 58 aminohappoa ’· (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID.NRO 29: 105036 69

Arg Pro Asp Phe Cys Lau Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala 1*5 10 15

Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gin Thr 20 25 30

Fhe Vai Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala 35 40 45

Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala 50 55 I f • * · • · • · « « « • · ♦ 9 9 9 · 9 9 4

9 9 V

9 9 « · 9 9 · 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 I « r f f r 4 4 r t

Claims (20)

105036

1. DNA-rakenne, jossa on aprotiniinianalogia koodaava DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että aprotiniinianalogilla on yleinen kaava (I) 5 R1 Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro R2 Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile R3 Tyr Phe Tyr R4 Ala R5 Ala Gly Leu Cys R6 Thr Phe Vai Tyr Gly Gly Cys Arg R7 R8 R9 Asn R10 Phe R11 Ser Ala Glu Asp Cys Met R12 Thr Cys Gly Gly Ala (I) 10 jossa R1 on dipeptidi, joka valitaan ryhmästä Arg-Pro, Glu-Pro, Asp-Pro, Ala-Pro, Ile-Pro, Thr-Pro, His-Pro, Leu-Pro, Gly-Pro ja Ser-Pro, Pro tai R1 on vety,

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-rakenne, jossa on aprotiniinianalogia koo-10 daava DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että siinä aprotiniinia koodaavan sekvenssin 5'- päähän lisätään yhtä tai useampaa negatiivisesti varautunutta tai neutraalia aminohappo-jäämää koodava DNA-sekvenssi.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-rakenne, jossa on aprotiniinianalogia koo-15 daava DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että siinä aprotiniinia koodaavan sekvenssin 3'- päähän lisätään yhtä tai useampaa negatiivisesti varautunutta tai neutraalia aminohappo-jäämää koodava DNA-sekvenssi.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-rakenne, jossa on aprotiniinianalogia koo-20 daava DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että aprotiniinianalogilla on yleinen kaava Π « : ,R1 Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro R2 Thr Gly Pro Cys R13 R14 R15 R16 R17 R3 Tyr Phe Tyr R4 Ala R5 Ala Gly Leu Cys R6 Thr Phe R18 Tyr R19 Gly Cys R20 R7 R8 R9 Asn R10 Phe R11 Ser Ala Glu Asp Cys Met R12 Thr Cys Gly Gly Ala (II) ' 25 jossa • · · • * • · ·· 112 R -R ovat samat kuin määritetään patenttivaatimuksessa 2, : T: R13 on aminohappojäämä, joka valitaan ryhmästä Lys, Arg, Glu, Leu, Met, Tyr ja Phe, - ·: · 3 0 • · · • 1 j ( R on aminohappojäämä, joka valitaan ryhmästä Alaja Gly, · · 9 9 R15 on aminohappojäämä, joka valitaan ryhmästä Arg, Ala, Gly, Lys, Leu, Met, Phe, : Y; Tyr, Ile ja Asn, ' ‘' .35 • « * * * 16 · R on aminohappojäämä, joka valitaan ryhmästä Ile, Met, Leu, Phe, Thr ja Glu, 105036 R17 on aminohappojäämä, joka valitaan ryhmästä Ile, Leu, Lys, Gin, Glu, Ser, Arg, Thr ja Asn, R18 on aminohappojäämä, joka valitaan ryhmästä Vai, Thr, Leu, Ser, Tyr, Gin, His, Pro, 5 Phe, Asn, Ile ja Lys, R19 on aminohappojäämä, joka valitaan tyhmästä Gly, Thr ja Ser ja R20 on aminohappojäämä, joka valitaan ryhmästä Gin, Lys, Met, Asn, Leu, Gly ja Glu, 10 sillä ehdolla, että vähintään yksi aminohappojäämistä R!-R12 ja vähintään yksi amino-happojäämistä RI3-R20 on erilainen kuin vastaava aminohappojäämä natiivissa aproti-niinissa, ja että kun R1 on vety, R15 ei ole Ala, R17 ei ole Glu ja R9 ei ole Ser ja että kun R15 on Ala, R9 ei ole Ser. 15

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että siinä on DNA-sekvenssi, joka koodaa aprotiniinianalogia, jossa R1 on Glu-Pro, R5 on Glu, R8 on Glu ja R2, R3, R4, R6, R7, R9, R10 ja R12 ovat samat kuin natiivissa aprotiniinisekvenssissä.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että siinä on DNA-,·, sekvenssi, joka koodaa aprotiniinianalogia, jossa R1 on Glu-Pro, R9 on Glu, R11 on Glu . ja R2, R3, R4, R6, R7, R8, R10 ja R12 ovat samat kuin natiivissa aprotiniinisekvenssissä. • · * · i ·

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että siinä on DNA-' 25 sekvenssi, joka koodaa aprotiniinianalogia, jossa R9 on Glu, R11 on Glu ja R1, R2, R3, : R4, R5, R6, R7, R8, R10 ja R12 ovat samat kuin natiivissa aprotiniinisekvenssissä. • · · • · · * · ·

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että siinä on DNA- :*·*: sekvenssi, joka koodaa aprotiniinianalogia, jossa R2 on Ser, R4 on Asp, R5 on Thr, R6 on ;’f 30 Glu, R8 on Asn, R12 on Glu ja R1, R3, R7, R9, R10 ja R11 ovat samat kuin natiivissa apro-: · • tiniinisekvenssissä. • · • · · • · · • 9 9

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että siinä on DNA-: ; sekvenssi, joka koodaa aprotiniinianalogia, jossa R2 on Ser, R3 on Leu, R7 on Gly, R8 on ;"' .35 Asn, R9 on Gly, R10 on Gin, R11 on Tyr ja R1, R4, R5, R6 ja R12 ovat samat kuin natiivissa aprotiniinisekvenssissä. 73 105036

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että siinä on DNA-sekvenssi, joka koodaa aprotiniinianalogia, jossa R1 on peptidisidos, R9 on Ser, R11 on Glu ja R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R10 ja R12 ovat samat kuin natiivissa aprotiniinisek-venssissä. 5

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että siinä on DNA-sekvenssi, joka koodaa aprotiniinianalogia, jossa R1 on peptidisidos, R9 on Ser, R11 on Ala ja R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R10 ja R12 ovat samat kuin natiivissa aprotiniinisek-venssissä. 10

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että siinä on DNA-sekvenssi, joka koodaa aprotiniinianalogia, jossa R1 on peptidisidos, R2 on Ser, R4 on Asp, R5 on Thr, R6 on Glu, R8 on Asn, R12 on Glu ja R3, R7, R9, R10 ja R11 ovat samat kuin natiivissa aprotiniinisekvenssissä. 15

13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että siinä on DNA-sekvenssi, joka koodaa aprotiniinianalogia, jossa R1 on peptidisidos, R4 on Asp, R5 on Thr, R6 on Glu, R12 on Glu ja R2, R3, R7, R8, R9, R10 ja R11 ovat samat kuin natiivissa aprotiniinisekvenssissä. 20

14. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että siinä on DNA- I . * sekvenssi, joka koodaa aprotiniinianalogia, jossa R1 on peptidisidos, R2 on Ser, R7 on "V Gly, R8 on Asn, R9 on Gly, R12 on Glu ja R3, R4, R5, R6, R10 ja R11 ovat samat kuin na- · · '> tiivissa aprotiniinisekvenssissä. ':"i>5 « f I : V 15. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että siinä on DNA-sekvenssi, joka koodaa aprotiniinianalogia, jossa R1 on peptidisidos, R9 on Ser, R12 on Glu ja R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R10 ja R11 ovat samat kuin natiivissa aprotiniinisek-venssissä. .::30 # · ·

15 R2 on aminohappojäämä, joka valitaan ryhmästä Tyr, Glu, Asp, Ser, Thr, Alaja Vai, R3 on aminohappojäämä, joka valitaan ryhmästä Arg, Glu, Asp, Leu, Ser, Ala, Gin ja Thr,

20 R4 on aminohappojäämä, joka valitaan ryhmästä Asn, Glu ja Asp, f | R5 on aminohappojäämä, joka valitaan ryhmästä Lys, Glu, Asp, Thr, Vai, Ala, Ser, Phe, Gin ja Gly,

25 R6 on aminohappojäämä, joka valitaan ryhmästä Gin, Glu, Asp, Vai ja Ala, t · · • · · _ R7 on aminohappojäämä, joka valitaan ryhmästä Ala, Asp, Glu ja Gly, : V: R8 on aminohappojäämä, joka valitaan ryhmästä Lys, Glu, Asp, Asn, Ser, Thr ja Ala, • · « f\ pO / . R9 on aminohappojäämä, joka valitaan ryhmästä Arg, Glu, Asp, Ser, Asn, Leu, Gly, ’· *i Gin, Met ja Thr, * I V: R10 on aminohappojäämä, joka valitaan ryhmästä Asn, Glu ja Asp, ;''':35 R11 on aminohappojäämä, joka valitaan ryhmästä Lys, Glu, Asp, Leu, Tyr, Ala, Vai, Thr, Ser, Pro, His ja Ile ja 71 105036 R12 on aminohappojäämä, joka valitaan ryhmästä Arg, Glu, Asp, Gin, Ala, Asn, His, Gly, Ser ja Thr, sillä ehdolla, että vähintään yksi aminohappojäämistä R'-R12 on erilainen kuin vastaava 5 aminohappojäämä natiivissa aprotiniinissa ja että kun R1 on vety vähintään yksi aminohappojäämistä R2-R12 on erilainen kuin vastaava aminohappojäämä natiivissa aprotiniinissa, paitsi että kun R1 on vety, R9 ei ole Ser.

16. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että siinä on DNA-:·’*· sekvenssi, joka koodaa aprotiniinianalogia, jossa R1 on peptidisidos, R9 on Glu, R12 on , : r; Glu ja R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R10 ja R11 ovat samat kuin natiivissa aprotiniinisek- .'.'. venssissä. « * < ,"',35

17. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että siinä on DNA-sekvenssi, joka koodaa aprotiniinianalogia, jossa R1 on peptidisidos, R5 on Glu, R9 on 105036 Ser, R12 on Glu ja R2, R3, R4, R6, R7, R8, R10 ja R11 ovat samat kuin natiivissa aprotinii-nisekvenssissä.

18. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että siinä on DNA-5 sekvenssi, joka koodaa aprotiniinianalogia, jossa R1 on peptidisidos, R5 on Glu, R9 on Glu, R12 on Glu ja R2, R3, R4, R6, R7, R8, R10 ja Rn ovat samat kuin natiivissa ap-rotiniinisekvenssissä.

19. Yhdistelmäekspressiovektori, tunnettu siitä, että se sisältää minkä tahansa patentit) ti vaatimusten 1-18 mukaisen DNA-rakenteen.

20. Solu, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 19 mukaisen ekspressio-vektorin.

21. Menetelmä aprotiniinianalogien tuottamiseksi, joita analogeja koodaa minkä tahansa patenttivaatimusten 1-18 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että siinä viljellään patenttivaatimuksen 20 mukaista solua olosuhteissa, jotka johtavat apro-tiniinianalogin ekspressioon, ja kootaan saatava analogi viljelmästä talteen.

20 Patentkrav