PT99124B

PT99124B - Processo para a preparacao de analogos de aprotinina e de composicoes farmaceuticas que os contem

Info

Publication number: PT99124B
Application number: PT99124A
Authority: PT
Inventors: Kjeld Norris; Soren Erik Bjorn; Viggo Diness; Leif Norskov-Lauritsen; Niels Dyhr Christensen; Claus Bregengaard
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1990-10-01
Filing date: 1991-09-30
Publication date: 1999-03-31
Also published as: CZ285225B6; NO931220L; IL99585A0; ES2121787T3; CA2092920A1; NO931220D0; AU8546091A; JPH06501158A; SK26493A3; CZ51793A3; DE69129809D1; SK281540B6; IE913433A1; FI105036B; ATE168414T1; WO1992006111A1; HU219302B; FI931457A; KR100250391B1; JP3614850B2

Description

DIRECÇÃO DE SERVIÇOS DE PATENTES

CAMPO DAS CEBOLAS, 1100 LISBOA TEL.: 888 51 51 / 2/ 3 TELEX: 18356 INPI TELEFAX: 87 53 08

FOLHA DO RESUMO (Continuação)

Modalidade é n.° (ij) T D Data do pedido @

Classificação Internacional (51)

Resumo (continuação) (57)

-2resíduos aminoácidos por um ou mais resíduos aminoácidos diferen tes, para se obter uma estabilidade reduzida.

Aplicação em farmácia para a preparação de medicamentos.

NAO PREENCHER AS ZONAS SOMBREADAS

DSM-5 _.MOORE.“ ° ^Aaenfe °· '^Ι do Proorindnrie ln

(DrvOorge Garin)

PROCESSO PARA A PREPARAÇAO DE ANALOGOS DE APROTININAS

E DE COMPOSIÇOES FARMACÊUTICAS QUE OS CONTEM ¹¹

ÂMBITO DA PRESENTE INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a análogos de aprotinina, a um método para a preparação desses análogos e à sua utilização na preparação de medicamentos.

ANTECEDENTES DA PRESENTE INVENÇÃO

A aprotinina (também designada por inibidor da tripsina pancreática dos bovinos, BPTI) é uma proteína básica que se encontra presente em diversos órgãos e tecidos de bovinos, tais como os nódulos linfáticos, pâncreas, os pulmões, a glândula parótida, o baço e o fígado. E um polipéptido de cadeia única de 58 resíduos aminoácidos com a sequência de aminoácidos que se segue:

Arg

Pro

Asp

Phe

Cys

Leu

Glu Pro

Pro

Tyr

Thr

Gly Pro

Cys

Lys

Ala

Arg

Ile

Arg

Tyr

Phe

Tyr Asn

Ala

Lys

Ala

Gly Leu

Cys

Gin

Thr

Phe

Vai

Tyr

Gly

Cys

Arg Ala

Lys

Arg

Asn

Asn Phe

Lys

Ser

Ala

Glu

Asp

Cys

Met

Arg

Thr

Cys Gly

Gly

Ala

A cadeia

i de

aminoácidos

encontra

-se

reticularmente

liga

da por três pontes de dissulfureto formadas entre, respectivamente, Cys(5) e Cys(55), Cys(14) e Cys(38) e Cys(30) e Cys(51).

ponto isoeléctrico da aprotinina é bastante elevado (aproximadamente 10,5). Este facto é causado, principalmente pelo teor relativamente elevado dos aminoácidos carregados negativamente, lisina e arginina. A estrutura tridimensional da molécula da aprotinina é muito compacta, o que a torna altamen-2.te estável contra a desnaturação a temperaturas elevadas, ou r por ácidos, álcalis ou dissolventes orgânicos, ou contra a degradação proteólitica ( cf. B. Kassell, Mett. Enzym., 19 (1970) 844-852 ).

Sabe-se que a aprotinina inibe diversas proteases de serina, incluindo a tripsina, a quimiotripsina, a plasmina e a calicreína, sendo utilizada em terapia, no tratamento de pancreatite aguda, diversos estados de sindrome de choque, hemorragia hiperfibrinolítica e enfarte de miocárdio £cf., por exemplo, J.E. Trapnell et al., Brit. J. Surg.,61 (1974) 177;

J. McMichan et al., Circulatory shock, 2 (1982) 107; L.M. Auer et al., Acta Neurochir., 49 (1979) 207; 6. Sher, Am. J. Obstet. Gynecol, 129 (1977) 164; e B. Schneider, Artenzim.-Forsch.,26 (1976) 1606. A administração de aprotinina em doses elevadas reduz significativamente a perda sanguínea associada a cirurgia cardíaca, incluindo operações para derivação (bypass) cardiopulmonar (Cf., por exemplo, B.P. Bidtrup et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 97 (1989) 364-372; W. Van Oeveren et al., Ann, Thorac. Surg., 44 (1987) 640-645).

Determinados análogos de aprotinina foram divulgados, por exemplo, pela patente de invenção norte-america n-4 595674, que descreve análogos de aprotinina e derivados, em que Lys(15) é substituída por Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Arg, ácido L-OC -butírico, L-norvalina, L-norleucina, desidroalanina ou L-homosserina. Na patente de invenção europeia N²238993 descrevem análogos de aprotinina em que Lys(15) é substituída por Arg,

Val, Ile, Leu, Phe, Gly, Ser, Trp, Tyr ou Ala e em que Met(52) se encontra também substituído por Glu, Val, Leu, Thr ou Ser.

£

Na patente de invenção europeia n² 307 592 descrevem-se análogos de aprotinina em que um ou mais dos aminoácidos nas posições 15, 16, 17, 18, 34, 39 e 52 se encontram substituídos por outro resíduo aminoácido.Na W0 89/01968 descreve-se um método para produzir aprotinina ou análogos de aprotinina em levedura e descrevem-se especificamente análogos que não possuem um ou dois resíduos aminoácidos na extremidade N-terminal e nos quais Lys(41) e/ou Arg(42) se encontra substituído por outros resíduos aminoácidos, em particular Ser. Na patente de invenção n^s339 942 descreve-se análogos de aprotinina em que um ou mais aminoácidos nas posições 1, 2, 12-19, 38, 41 e 42 foram suprimidas ou substituídos por outros resíduos aminoácidos. As substituições de aminoácidos descritas nestas referências, situam-se principalmente na região de ligação à protease da molécula de aprotinina, tendo em vista a alteração das características de inibição de protease da aprotinina, excepto para a substituição de Met(52), de acordo com a patente de invenção europeia n² 238 993 e a substituição de Lys(41) e/ou de Arg(42), de acordo com W0 89/01968, que são efectuadas para facilitar a produção de aprotinina na E. coli e na levedura, respectivamente.

RAZÃO DA PRESENTE INVENÇÃO

Descreveu-se anteriormente que após a injecçâo intravenosa de aprotinina nativa, em animais ou voluntários humanos, o nível plasmático de inibidor decrescia de um modo suficientemente rápido permitindo a distribuição no fluído extracelular e subsequente acumulação nos rins (I. Trautschold et al., in

K. Heinkel e H. Schõn (Eds.): Pathogenese, Diagnostik, Klinik und Therapie der Erkrankungen des Exokrinen Pankreas, Stuttgart, Schattauer, 1964, p. 289; E. Habermann et el., Med. Welt, 24 (29) (1973) 1163-1167; H. Fritz et al., Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem., 350 (1969) 1541-1550; e H. Kaller et al., Eur. J. Drug Metab. Pharmacokin., 2^ ( 1978) 79-85). A seguir à filtração glomerular, a aprotinina encontra-se quase quantitativamente ligada à membrana do bordo ciliado das células dos tubos proximais.

A aprotinina é então reabsorvida nas vesículas micropinocíticas e nos fagossomas, seguindo-se uma degradação muito lenta nos fagolisossomas. Sugeriu-se que este tipo de transporte era representativo dos péptidos, em geral (M. Just e E. Habermann, Navnyn-Scmiedebergs Arch. Pharmacol., 280 (1973) 161-176; M.

Just, Navnyn-Schmiedebergs Arch. Pharmacol., 287 (1975) 85-95).

exame macroscópico e histopatológico a seguir à administração de aprotinina revela alterações no tecido renal das ratazanas, coelhos e cães após injecções repetidas de doses relativamente elevadas de aprotinina (Bayer, Trasylol, Inhibitor of proteínase; E. Glaser et al., in Verhandlungen der Deutschen Gesellschaft fur Innere Medizin, 78. Kongress, Munique, Bergmann, 1972, 1612-1614).

A nefrotoxicidade (que se manifesta, entre outras formas pelo aparecimento de lesões) observada para a aprotinina pode ser atribuível à acumulação de aprotinina nas células dos tubos proximais dos rins. Esta nefrotoxicidade torna a aprotinina pouco adequada para fins clínicos, em particular para aqueles em que se torna necessária a administração de grandes doses do inibidor (tais como nas operações para efectuar derivações ^s C% (bypass) cardiopulmonares).

Deste modo, reveste-se de considerável interesse a produção de análogos de aprotinina com nefrotoxicidade reduzida em comparação com a da aprotinina nativa.

SUMÁRIO DA PRESENTE INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um análogo de aprotinina com nefrotoxicidade reduzida, em que, para se proporcionar uma carga líquida positiva reduzida, se remove ou substitui pelo menos um resíduo aminoácido exterior ao sítio de ligação da protease, por um resíduo aminoácido neutro ou negativamente carregado e/ou em que se insere ou adiciona pelo menos um resíduo aminoácido carregado negativamente, e/ou se substitui pelo menos um resíduo aminoácido neutro por um resíduo carregado negativamente e/ou em que, para proporcionar uma estabilidade reduzida, se suprime, adiciona ou substitui um ou mais resíduos aminoácidos por um ou mais resíduos aminoácidos diferentes.

No presente contexto, considera-se que a expressão carga líquida positiva reduzida inclui os análogos com uma carga líquida positiva inferior à da aprotinina nativa ( que possui uma carga líquida positiva de +6) assim como sem carga líquida ou com carga líquida negativa. Deverá ter-se em atenção que a carga líquida da aprotinina pode variar, de acordo com o pH e que as designações carga líquida positiva, carga líquida negativa, carregado positivamente ou“carregado negativamente se utilizam em relação à carga da molécula, a pH neutro.

-6A designação sítio de ligação à protease, refere-se aos resíduos aminoácidos que são importantes para inibição da protease, isto é, os resíduos aminoácidos que se encontram em contacto íntimo com a protease ligando os resíduos aminoácidos ao sítio activo do enzima ou próximo deste. Considera-se que englobam, usualmente ( e são no presente contexto assim definidos) os resíduos aminoácidos nas posições 12-18 e 34-39 (cf. H. Fritz e G. Wunderer, Artzneim.-Forsch. , 33 ( 1 ) ( 1983) z

484). E preferível remover, inserir ou substituir resíduos aminoácidos fora do sítio de ligação à protease apenas com o objectivo de evitar alterações substanciais às características de inibição da protease do análogo da presente invenção, em comparação com as da aprotinina nativa.

Descobriu-se, surpreendentemente, que os análogos de aprotinina com uma carga líquida positiva reduzida possuem uma nefrotoxicidade significativamente inferior à da aprotinina nativa. Uma razão para a baixa nefrotoxi cidade pode residir no facto dos análogos de aprotinina com uma carga líquida positiva mais baixa possuírem uma reduzida afinidade de ligação para a superfície dos túbulos proximais ( membrana do bordo ciliado), pelo que são excretados em maior extensão pela urina. Esta explicação é consistente com as descobertas de H. Fritz e outros, op. cit que referem que os derivados de aprotinina modificados quimicamente (derivados tetramaleioílo e pentamaleioílo ), que são menos básicos do que a aprotinina nativa, não se ligam a uma fracção isolada da membrana do bordo ciliado mas são quantitativamente excretados na urina.

Por outro lado, aaprotinina modificada quimicamente di-

fere grandemente da aprotinina e de outras proteínas nativas pelo facto de conter derivados de aminoácidos que não se encontram em quaisquer macromoléculas naturais. Contudo, não se deverá excluir a possibilidade da falta de acumulação nos rins dos derivados modificados quimicamente poder ser atribuível a propriedades alteradas dos derivados modificados diferentes da carga líquida positiva reduzida.

Descobriu-se que outros péptidos se ligavam ao bordo ciliado com menor afinidade e capacidade do que a aprotinina, apesar de conterem aminoácidos carregados positivamente e/ou terem uma carga líquida positiva. Isto indica que a carga líquida positiva da aprotinina não constitui a única explicação para a ligação e acumulação de aprotinina nas células dos túbulos proximais (M. Just et al., 1st. Symp. Physiol. Prop. Pharmacol. Ration,: Kininogenases, Stuttgart , Schattauer,

1973, pp. 1163-1167).

Para além disto, descobriu-se surpreendentemente que os análogos de aprotinina com estabilidade térmica reduzida, não se acumulavam no tecido renal na mesma extensão da aprotinina nativa. Tal como se referiu anteriormente, o arranjo tridimensional da aprotinina é muito compacto, facto que se pensa ser o responsável pela elevada estabilidade do inibidor face à desnaturação e à degradação proteolítica. Deste modo, a acumulação de aprotinina nos rins pode ser também o resultado da extraordinária estabilidade do inibidor. Assim, é possível que a substituição de um ou mais resíduos aminoácidos na molécula da aprotinina possa originar a formação de análogos de aprotinina com uma estabilidade reduzida, em comparação com a da molécula natiζ% va. No presente contexto, a estabilidade reduzida pode, para fins selectivos, ser expressa como a estabilidade térmica reduzida do análogo em solução aquosa, e um pH de aproximadamente 4-10. 0 efeito in vivo desta estabilidade reduzida pode consistir em tornar o análogo mais acessível à degradação, por exemplo, à degradação proteolítica, daí resultando uma eliminação mais rápida do análogo dos túbulos proximais.

Pensa-se, dum modo geral, que a reduzida nefrotoxic idade dos análogos da presente invenção pode residir na combinação de uma carga líquida positiva reduzida e de uma estabilidade reduzida da molécula.

Uma causa que contribui para as lesões renais provenientes da administração de aprotinina nativa pode residir no facto de a aprotinina se acumular nas membranas dos glomérulos devido à afinidade para estruturas carregadas negativamente na superfície das membranas. Isto pode originar no alargamento dos poros do glomérulo e, por consequência, haver uma maior permeabilidade a grandes moléculas como, por exemplo, a albumina, que, por sua vez, pode conduzir à sobrecarga proteica dos rins. E provável que o análogo de aprotinina da presente invenção possa exercer um efeito menos prejudicial sobre as dimensões dos poros da membrana dos glomérulos do que a aprotinina nativa, devido a uma menor afinidade para estruturas carregadas negativamente na membrana.

Além disso, observou-se em alguns casos, que a administração de aprotinina conduz a uma reacção anafilactóide. Pôs-se a hipótese de que esta reacção anafi1actóide está associada à

C libertação de histamina que pode ter sido provocada pela carga líquida positiva da aprotinina. Assim, pensa-se que a reacção anafi1actóide presumivelmente associada à administração de aprotinina nativa poderia ser reduzida ou mesmo eliminada mediante a administração de um análogo de aprotinina da presente invenção.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA PRESENTE INVENÇÃO

De acordo com a presente invenção, quaisquer resíduos aminoácidos carregados positivamente fora do sítio de ligação à protease podem ser substituídos quer pelos resíduos aminoácidos carregados negativamente, Glu ou Asp, quer por qualquer dos resíduos aminoácidos neutros, Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Glu, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr. No entanto, com o objectivo de evitar análogos inactivos ou análogos com uma estrutura tridimensional inadequada, resultante de uma dobragem incorrecta da molécula, é preferível seleccionar as substituições que sejam idênticas aos resíduos aminoácidos nas posições correspondentes de outros inibidores de protease ou em domínios de estruturas maiores que exibam um elevado grau de homologia com a aprotinina nativa. Por outras palavras, a selecção de resíduos aminoácidos substituintes baseia-se preferencialmente numa análise de moléculas que são homólogas da aprotinina. Deverá ter-se em consideração que, concomitantemente com a(s) substituição (substituições) aminoácida(s) que contribuem directamente para uma redução da carga positiva líquida, podem efectuar-se uma ou mais substituições aminoácidas que não originam por si sós uma redução da carga líquida positiva, mas que podem ser

-10necessárias para se produzir um análogo activo com uma estrutura tridimensional adequada.

De acordo com o anteriormente exposto, num aspecto mais específico, a presente invenção refere-se a um análogo de aprotinina que possui a fórmula geral

R^ Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Rg Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg

Ile

^R3

Tyr

Phe

Tyr

^R4

Ala R₅

Ala

Gly

Leu

Cys

Rg Thr Phe

Vai

Tyr

Gly

Cys

Arg

^R7

^R8

Rg Asn

^R10

Phe

^R11

Ser

Ala Glu Asp

Cys

Met

^R12

Thr

Cys

Gly

Al

Ía

na qual o símbolo representa um dipéptido seleccionado no grupo constituido por Arg-Pro, Glu-Pro, Asp-Pro, Ala-Pro, Ile-Pro, Th*’ Pro, His-Pro, Leu-Pro, Gly-Pro, e Ser-Pro, Pro ou uma ponte peptídica, o símbolo Rg representa um resíduo aminoácido seleccionado no grupo constituído por Tyr, Glu, Asp, Ser; Thr,

Ala e Vai, o símbolo Rg representa um resíduo aminoácido seleccionado no grupo constituído por Arg, Glu, Asp, Leu, Ser, Ala, Gin e Thr, o sómbolo R₄ representa um resíduo aminoácido seleccionado no grupo constituido por Asn, Glu e Asp, o símbolo Rg representa um resíduo aminoácido seleccionado no grupo constituido por Lys, Glu, Asp, Thr, Vai, Ala, Ser, Phe, Glen e Gly, o símbolo Rg representa um resíduo aminoácido seleccionado no grupo constituído por Gin, Glu, Asp, Vai e Ala, o símbolo R₇ representa um resíduo aminoácido sei lecionado no grupo constituído por Ala, Asp, Glu e Gly o símbolo R_g representa um resíduo aminoácido seleccionado no grupo constituído por Lys, Glu, Asp, Asn, Ser, Thr, e Ala, o símbolo Rg representa um resíduo aminoácido seleccionado no grupo constituído por Arg, Glu, Asp, Ser, Asn, Leu, Gly, Gin, Met e Thr, o símbolo R^g representa um resíduo aminoácido seleccionado no grupo constituído por Asn, Glu e Asp, o símbolo representa um resíduo aminoácido seleccionado no grupo constituído por Lys, Glu, Asp, Leu, Tyr, Ala, Vai, Thr, Ser, Pro, His e Ile, e o símbolo R^ representa um resíduo aminoácido seleccionado no grupo constituido por Arg, Glu, Asp, Gin, Ala, Asn, His, Gly, Ser e Thr, desde que pelo menos um dos resíduos aminoácidos representados pelos símbolos R^ a R^ seja diferente do resí-12duo aminoácido correspondente da aprotinina nativa.

*

Além destas substituições internas na molécula da aprotinina, pode ser possível adicionar um péptido que contenha um ou mais resíduos aminoácidos carregados negativamente (isto é, Glu ou Asp) na extremidade N- ou C-terminal da molécula da aprotinina, com o objectivo de proporcionar a redução necessária da carga positiva líquida. Pode também ser possível adicionar um ou mais resíduos aminoácidos neutros à extremidade N- ou C-terminal da molécula, para reduzir a estabilidade da molécula. Estas adições podem ser efectuadas quer na molécula da aprotinina nativa quer em adição a outras modificações, tal como anteriormente se referiu.

Se se pretender alterar as propriedades de inibição da protease do análogo de aprotinina separadamente da redução da sua nefrotoxicidade, é possível modificar adicionalmente o análogo no sítio de ligação à protease. Por exemplo, demonstrou-se anteriormente (cf. H.R. Wenzel e H. Tschesche, Angew. Chem. Internet.

Ed. 20, 1981, p. 295) que a aprotinina (1-58, Val15) exibe uma selectividade relativamente elevada para a granulocito-elastase e um efeito inibidor sobre a colagenase, a aprotinina (1-58), Ala15) possui um reduzido efeito sobre a elastase e que a aprotinina (1-58, Gly15) exibe uma acentuada actividade anti-tripsina e inibe também surpreendentemente a calicreína. Além disso, pode ser possível modificar o efeito inibidor da aprotinina em simultâneo com a redução da carga positiva líquida substituindo um ou mais aminoácidos carregados positivamente, no sítio de ligação à protease, por aminoácidos neutros ou carregados negativamente.

Assim, a presente invenção refere-se também a um análogo de aprotinina que possui a fórmula geral

^R1	Asp	Phe	Cys	Leu	Glu Pro	Pro R£	Thr	Gly	Pro	Cys R₁₃ R₁₄	^R15 ^R16
^R17	^R3	Tyr	Phe	Tyr	R₄ Ala	R₅ Ala	Gly	Leu	Cys	Rq Thr Phe R	18 ^ΤΤ^{Γ R}
Gly	Cys	^R20	^R7	^R8	Rg Asn R	10 ^Phe	^R11	Ser	Ala	Glu Asp Cys	Met R₁₂
Cys	Gly	Gly	Ala

II na qual os símbolos a R^ possuem as significações anteriormente definidas, o símbolo R^ representa um resíduo aminoácido seleccionado no grupo constituído por Lys, Arg, Glu, Leu, Met, Tyr e Phe, o símbolo nado no grupo representa um resíduo constituído por Ala e aminoácido seleccioGly, o símbolo R^₅ representa um resíduo aminoácido seleccionado no grupo constituído por Arg, Ala, Gly, Lys, Leu, Met, Phe, Tyr, Ile e Asn, o símbolo R₁₆ representa um resíduo aminoácido seleccionado no grupo constituído por Ile, Met, Leu, Phe, Thr e Glu, o símbolo R₁₇ representa um resíduo aminoácido seleccionado no grupo constituído por Ile,. Leu, Lys, Gin , Glu, Ser, Arg, Thr e Asn,

-14o símbolo R^g representa um resíduo aminoácido seleccionado no grupo constituído por Vai, Thr, Leu, Ser, Tyr, Gin, His, Pro, Phe, Asn, Ile e Lys, o símbolo R^g representa um resíduo aminoácido seleccionado no grupo constituído por Gly, Thr e Ser e o símbolo R₂q representa um resíduo aminoácido seleccionado no grupo constituído por Gin, Lys, Met, Asn, Leu, Gly e Glu, desde que pelo menos um dos resíduos aminoácidos de R^ a R^ e pelo menos um dos resíduos aminoácidos de R^ a R_2q sejam diferentes do resíduo aminoácido correspondente da aprotinina nativa.

São exemplos dos análogos de aprotinina de fórmula geral I normalmente preferidos os análogos em que o símbolo representa Glu-Pro, o símbolo Rg representa Glu, o símbolo Rg representa Glu, o símbolo Rp representa Glu e os símbolos R₂, Rg, R^, R_g, Rg, R₁₀ e R-J2 têm o mesmo significado que na sequência da aprotinina nativa; ou em que o símbolo R₁ representa Glu-Pro, o símbolo Rg representa Glu, o símbolo Rp representa Glu e os símbolos R₂, Rg, R^, R_g, R₇, R_q,R₁₀ e R₁₂ têm os mesmos significados que na sequência da aprotinina nativa; ou em que o símbolo R_grepresenta Glu, o símbolo Rp representa Glu e os símbolos Rp ^R2’ R₃, Rp Rg, Rg, R₇, Rg, r_{1q e} r₁₂ têm os mesmos significados que na sequência da aprotinina nativa; ou em que o símbolo R₂ representa Ser, o símbolo R₄ representa Asp, o símbolo Rg ^,5<r representa Thr, o símbolo Rg representa Glu, o símbolo Rg representa Asn, o símbolo R^ representa Glu eos símbolos Rp Rg, R?,

Rg, R₁₀ e Rp têm os mesmos significados que na sequência da aprotinina nativa; ou em que o símbolo R₂ representa Ser, o símbolo Rg representa Leu, o símbolo R? representa Gly, o símbolo Rg representa Asn, o símbolo Rg representa Gly, o símbolo R^ representa Gin, o símbolo Rp representa Tyr e os símbolos Rp Rp Rg, Rg e R-j2 têm os mesmos significados que na sequência da aprotinina nativa; ou em que o símbolo R^ representa uma ponte peptídica, o símbolo R? representa Ser, o símbolo Rp representa Glu e os símbolos R₂, Rg, R₄ Rg, R_g, R?, R_g, R_1Q e R₁₂ se encontram em concordância com a sequência da aprotinina nativa; ou em que o símbolo R^ representa uma ponte peptídica, o símbolo Rg representa Ser, o símbolo Rp representa Ala e os símbolos ^R2’ ^R3’ ^R4’ ^R5’ ^R6’ ^R7’ ^R8’ ^R10 ^{e R}12 ^{se encon}’^):;r’^{am em} concordância com a sequência da aprotinina nativa; ou em que o símbolo R^ representa uma ponte peptídica, o símbolo R₂ representa Ser, o símbolo R^ representa Asp, o símbolo Rg representa Thr, o símbolo Rg representa Glu, o símbolo R_g representa Asn, o símbolo R^₂ representa Glu e os símbolos Rg^Rg, Rp se encontram em concordância com a sequência da aprotinina nativa; ou em que o símbolo R^ representa uma ponte peptídica, o símbolo R^ representa Asp, o símbolo Rg representa Thr, o símbolo Rg representa Glu, o símbolo r₁₂ representa Glu e os símbolos R₂, Rg, R?, R_g, R_g, R_1Qe Rp têm os mesmos significados que na sequência da aprotinina nativa; ou em que o símbolo R^ representa uma ponte peptídica, o símbolo R₂ representa Ser, o símbolo R? representa Gly, o símbolo Rg representa Asn, o símbolo Rg representa Gly, o símbolo R^₂

representa Glu e os símbolos Rg, R^, Rg, Rg, R_1Q e R^ se encontram em concordância com a sequência da aprotinina nativa; ou em que o símbolo R^ representa uma ponte peptídica, o símbolo R_g representa Ser, o símbolo ^R12 representa Glu e os símbolos R₂, Rg, R₄, Rg, Rg, Ry, Rg, R₁₀ e R^ se encontram em concordância com a sequência da aprotinina nativa; ou em que 0 símbolo R^ representa uma ponte peptídica, 0 símbolo Rg representa Glu, 0 símbolo R^ representa Glu e os símbolos R₂, Rg, R₄, Rg, Rg, Ry, Rg, R^e têm os mesmos significados que na sequência da aprotina nativa; ou em que 0 símbolo R₁ representa uma ponte peptídica, 0 símbolo Rg representa Glu, 0 símbolo R_g representa Ser, símbolo R₁₂ representa Glu e os símbolos R₂, Rg, R^, R_g, Ry, Rg, R_1q e R^ se encontram em concordância com a sequência da aprotinina nativa; ou em que 0 símbolo R^ representa uma ponte peptídica, 0 símbolo Rg representa Glu, 0 símbolo Rg representa Glu, 0 símbolo R^₂ representa Glu e os símbolos R₂, Rg, R^, Rg, Ry, Rg, R-,θ e R^ se encontram em concordância com a sequência da aprotinina nativa.

De acordo com um outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma construção de ADN que codifica um análogo de aprotinina, de acordo com a presente invenção. A construção de ADN, de acordo com a presente invenção, pode ser preparada por síntese de acordo com métodos normalizados, como, por exemplo, pelo método da fosforamidite descrito por S.L. Beaucage e M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 22 (1981) 1859-1869, ou pelo método descrito por Matthes et al., EMBO Journal, 2 (1984) 801-805. De acordo com 0 método da fosforamidite, sintetizam-se os oligonucleótidos, por exemplo, num sintetizador automático

-17de ADN, purificam-se, recozem-se, ligam-se e clonam-se em vectores adequados. Como alternativa, é possível utilizar ADNc genómico ou ADNc que codifique a aprotinina nativa (obtido, por exemplo, por restreio de uma biblioteca de ADNc genómico, utilizando sondas oligonucleotídicas de síntese) e modificá-lo num ou mais locais correspondentes ao(s) sítio(s) onde se pretende introduzir as substituições aminoácidas, por exemplo, por mutagénese comandada de um sítio, utilizando oligonucleótidos de síntese que codificam a sequência de aminoácidos desejada para recombinação homóloga, de acordo com os procedimentos bem conhec i dos.

De acordo, ainda, com um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um vector de expressão recombinante que engloba uma construção de ADN da presente invenção. 0 vector de expressão recombinante pode ser qualquer vector que possa ser convenientemente submetido a procedimentos de ADN recombinante, dependendo a escolha do vector muitas vezes da célula hospedeira na qual se pretende introduzi-lo. Deste modo, o vector pode ser um vector de replicação autónoma, isto é, um vector que existe como uma entidade extra-cromossómica, cuja replicação é independente da replicação cromossómica, por exemplo, um plasmídeo. Como alternativa, o vector pode ser tal que quando introduzido numa célula hospedeira seja integrado no genoma da célula hospedeira e possa replicar-se conjuntamente com o(s) cromossoma(s) no(s) qual (quais) foi (foram) integrado(s).

No vector, a sequência de ADN que codifica o análogo da aprotinina, de acordo com a presente invenção, deverá encontrar-^,8-_Α i, 5

-se funcionalmente associado a uma sequência promotora adequada^* 0 promotor pode ser qualquer sequência de ADN que apresente actividade transcricional na célula hospedeira escolhida e possa derivar do genes que codificam as proteínas homólogas ou heterólogas da célula hospedeira. Como exemplos de promotores adequados para o comando da transcrição do ADN que codifica o análogo de aprotinina, da presente invenção, nas células de mamíferos, referem-se o promotor SV40 /Tsubremani et al., Mol. Cell Biol., j_ ( 1981 ) 854-86437, o promotor MT-1 (gene da metalotioneína) £ Palmiter et al., Science,222 (1983) 809-814J7 θ o último promotor principal do adenovírus 2. Os promotores adequados para utilização nas células hospedeiras de levedura englobam os promotores provenientes de genes glicolíticos de leveduras £Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255 (1980) 12073-12080; Alber e Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. j_ ( 1982) 41 9-43437 ou genes de desidrogenase alcoólica £Young et al., em Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaender et al., eds) Nova Iorque, Plenum Press, 198237 ou os promotores TPI1 (patente de invenção norte-americana n^s 4 599 311) ou ADH2-4c £Russell et al., Nature, 304 ( 1983) 652-654 37. Os promotores adequados para utilização em células hospedeiras de fungos filamentosos são, por exemplo, o promotor ADH3 £McKnight et al.,

The Emb J., 4 ( 1 985) 2093-209937 ou o promotor tpiA.

A sequência de ADN que codifica o análogo de aprotinina da presente invenção pode também ser funcionalmente conectada a um terminador adequado, tal como o terminador da hormona do crescimento humano (Palmiter e outros, op cit ) ou (para hospedeiros fúngicos) os promotores TPI1 (Alber e Kawasaki, ” ζορ. cit) ou ADH3 (McKnight e outros op. cit). 0 vector pode englobar, ainda elementos, tais como sinais de poliadenilação (por exemplo, de SV 40 ou da região 5 Elb do adenovírus), sesuências que intensificam a transcrição (por exemplo, o intensificador SV40) e sequências de intensificação de tradução (por exemplo as que codificam os ARNs do adenovírus VA).

Um vector de expressão recombinante da presente invenção pode englobar ainda uma sequência de ADN que possibilite a replicação do vector na célula hospedeira em questão. Um exemplo de tal sequência (quando a célula hospedeira é uma célula de mamífero) é a origem de replicação de SV 40 ou (no caso da célula hospedeira ser uma célula de levedura) os genes de replicação REP 1-3 do plasmídeo ²Λ e a origem de replicação. 0 vector pode ainda abranger um indicador seleccionável, por exemplo um gene, cujo produto complemente um defeito na célula hospedeira, tal como o gene que codifica a desidrofolato-redutase (DHFR) ou um gene que confira resistência a um farmaco, como, por exemplo, a neomicina, a higromicina ou o metotrexato ou o gene TPI de Schizosaccharomyces pombe £ descrito por P. R. Russell, Gene, (1985) 125-13027Os procedimentos utilizados para ligar as sequências que codificam o análogo de aprotinina da presente invenção, o promotor e o terminador, respectivamente, e para as inserir em vectores adequados que contenham a informação necessária para replicação, são do conhecimento dos especialistas (cf., por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nova Iorque, Col Spring Harbor, 1989).

-20- Ç

A célula hospedeira no interior da qual se introduz o vector de expressão da presente invenção pode ser qualquer célula capaz de produzir os análogos de aprotinina da presente invenção, sendo preferencialmente uma célula eucariota, tal como uma célula de mamíferos, de levedura ou de fungos.

organismo levedura utilizado como célula hospedeira, de acordo com a presente invenção, pode ser qualquer célula de levedura que, em cultura, produza grandes quantidades de análogo de aprotinina, da presente invenção. São exemplos adequados de organismos de leveduras as estirpes de leveduras Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces Kluyveri, Schizosaccharomyces pombe ou Saccharomyces uvarum. Pode efectuar-se a transformação das células de levedura, por exemplo, por formação do protoplasto seguida de transformação de acordo com um método conhecido per se.

São exemplos de linhas de células de mamíferos adequadas as linhas de células COS (ATCC CRL 1650), BHK (ATCC CRL 1632, ATCC CCL 10) ou CHO (ATCC CCL 61). Foram descritos métodos para transfectar as células de mamíferos, por exemplo por Kaufman e Sharp, L. Mol. Biol., 159 ( 1982) 601-621; Southern e Berg, J. Mol. Appl. Genet., j_ (1982) 327-341; Loyter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79 (1982) 422-426; Wigler et al., Cell, 14 (1978) 725; Corsaro e Pearson, Somatic Cell Genetics, ]_ ( 1981 ) 603, Graham e van der Eb, Virology, 52 ( 1973) 456; e Neumann et al., EMBQ J., 1 (1982) 841-845.

Em alternativa, podem utilizar-se células fúngicas como células hospedeiras da presente invenção. São exemplos de célu-

las fúngicas adequadas as células dos fungos filamentosos, como, por exemplo, Aspergi 11us spp. ou Neurospora spp., em particular as estirpes de Aspergillus oryzae ou de Aspergillus niger.

A utilização de Aspergillus spp, para a expressão de proteínas encontra-se descrita, por exemplo, na patente de invenção europeia n^s 272 277.

A presente invenção refere-se ainda a um método para produzir um análogo de aprotinina, de acordo com a presente invenção, que consiste em fazer a cultura de um célula, tal como anteriormente descrito, sob condições que conduzam à expressão do análogo de aprotinina resultante da cultura.

meio utilizado para a cultura das células pode ser qualquer meio convencional adequado para o desenvolvimento de células de mamífero ou de leveduras, dependendo da célula hospedeira escolhida. 0 análogo de aprotinina será segregado pelas células hospedeiras para o meio de crescimento, podendo ser recuperado a partir deste, de acordo com procedimentos convencionais que incluem a separação das células do meio por centrifugação ou filtração, precipitação dos componentes proteináceos do sobrenadante ou filtração, através de um sal, como, por exemplo, o sulfato de amónio, purificação, mediante diversos procedimentos cromatográficos, por exemplo, a cromatografia de permuta iónica ou a cromatografia por afinidade, ou similares.

A presente invenção também se refere a uma composição farmacêutica que incorpore um análogo de aprotinina da presente invenção, conjuntamente com um veículo ou excipiente aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. Na composição da pre-

sente invenção, pode formular-se o análogo por quaisquer dos métodos estabelecidos para formulação de composições farmacêuticas, como, por exemplo, se descreve em Remington's Pharmaceutical Sciences, 1985. A composição pode apresentar-se tipicamente, numa forma adequada para injecção sistémica ou perfusão e pode como tal ser formulada com água esterilizada ou com uma solução isotónica salina ou de glucose.

Ainda de acordo com um outro aspecto, a presente invenção refere-se à utilização de um análogo de aprotinina, de acordo com a presente invenção, para a preparação de um medicamento com reduzida nefrotoxicidade comparativamente à da aprotinina nativa e/ou um medicamento que, quando administrado, origine uma menor incidência de reacções anafilactóides em comparação com as verificadas com a aprotinina nativa.

Tal como anteriormente se referiu, descobriu-se que a aprotinina nativa administrada em doses próximas das doses clínicas exibe um efeito prejudicial para os rins. Este efeito podia advir da estabilidade extraordináriamente elevada e da carga líquida positiva relativamente elevada da molécula de aprotinina. Por estes motivos, os análogos de aprotinina da presente invenção são considerados' vantajosos em aplicações terapêuticas, sugeridas para a aprotinina nativa, especialmente aquelas em que se torna necessária a utilização de grandes doses de aprotinina. As aplicações terapêuticas para as quais é indicada a utilização dos análogos de aprotinina da presente invenção como resultado da sua inibição das proteases de serina humanas, por exemplo, tripsina, plasmina, calicreína, elastase e catepsina G, englobam (embora não se limitem apenas a estas) a pancreatite aguda,

-23inflamações, trombocitopenia, conservação da função plaquetária, conservação de órgãos, cicatrização de feridas, choque (incluindo o choque pulmonar) e situações que envolvam hemorragia hiperfibrinolitica. Uma elevada dose de aprotinina é indicada durante e após operações para efectuar derivações (bypass) cardiopulmonares; a menor nefrotoxicidade dos análogos de aprotinina da presente invenção, reveste-se, por isso, de particular interesse nesta aplicação e possivelmente noutras operações cirúrgicas que envolvam (maior) perda de sangue, assim como reduzirá possivelmente o risco de reacções anafilactóides devidas à menor carga líquida positiva do análogo.

A presente invenção ê ainda ilustrada pelos exemplos que se seguem, os quais não poderão em circunstância alguma limitar o âmbito da mesma.

EXEMPLO 1

Produção de £ Glu1, Glu26, Glu41, Glu46_7-aprotinina a partir da estirpe de levedura KFN-1512

Construiu-se um gene de síntese que codifica a £Glu1, Glu26, Glu41, Glu4627-aprotinina, por ligação de 10 oligonucléotidos. Sintetizaram-se os oligonucleótidos num sintetizador automático de ADN, utilizando o método de fosforamidite, num suporte de vidro poroso controlado Z^Beaucage, S.L. e Caruthers, M.H. Tetrahedron Letters, 22 (1981) 1859-1869J.

Sintetizaram-se os dez oligonucleótidos que se seguem:

-24N0R-1948:

NOR-1947:

NOR-354

NOR-1939

NOR-1938

NOR-357 nor-1940

NOR-1949

N0R-360

NOR-361 *

CATGGCTGAGAGATTGGAGAAGAGAGAGCCTGATTTCTGTTTGGAACCTCCATACACTGGTCC

TTACATGGACCAGTGTATGGAGGTTCCAAACAGAAATCAGGCTCTCTCTTCTCCAATCTCTCAGCATGTAAAGCTAGAATCATCAGATACTTCTACAACG

TTCGGCGTTGTAGAAGTATCTGATGATTCTAGCT

CCGAAGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGTGGCT

CTCTGCAGCCACCGTAAACGAAAGTTTGACACAAACCAGC

GCAGAGCTGAAAGAAACAACTTCGAAT

AGCAGATTCGAAGTTGTTTCTTTCAG

CTGCTGAAGACTGCATGAGAACTTGTGGTGGTGCCTAAT

CTAGATTAGGCACCACCACAAGTTCTCATGCAGTCTTC

Formaram-se 5 duplexes A-E, a partir dos 10 oligonucleótidos anteriores, tal como se indica na Figura 1.

Formaram-se 20 pmoles de cada um dos duplexes A a E, formados a partir dos correspondentes pares de oligonucleótidos 5'-fosfori1ados, por aquecimento durante 5 minutos a 90°C, seguido de arrefecimento até à temperatura ambiente durante 75 minutos. Misturaram-se os cinco duplexes e trataram-se com ADN ligase T4. Isolou-se o gene de síntese sob a forma de uma banda de 203 pares de bases após electroforese da mistura de ligação sobre um gel de agarose a 2%. Na Figura 1 indica-se o gene de síntese obtido.

Ligou-se o gene de síntese a um fragmento EcoRI-Ncol de

209 pares de bases, de pLaC212spx3 e ao fragmento EcoRI-Xbal de 2,8 Kb do plasmídeo pTZ19R £Mead, D.A., Saczesna-Skorupa,

E. e Kemper, B., Prot. Engin., j_ ( 1986) §1~74j. No exemplo 3, do pedido de patente de invenção internacional N^Q PCT/DK88/00147, ²⁵ ζ descreve-se ο plasmídeo pLaC212spx3. 0 fragmento EcoRI-Ncol DE 209 pares de bases do plasmídeo pLaC212cpx3 codifica o péptido principal de sintese da levedura.

Utilizou-se a mistura de ligação para transformar uma E. coli competidora (estirpe, r“, m⁺) seleccionada pela sua resistência à ampicilina. A sequenciação do ADN £ Sanger, F., Micklen, S. e Coulson, A.R., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74 (1977) 5463-5467J demonstrou que os plasmídeos provenientes das colónias resultantes continham a sequência correcta de ADN para Z?Glu1, Glu26, Glu41, Glu46 J7-aprotinina.

Seleccionou-se um plasmídeo, PKFN-1503 para utilização posterior. A construção do plasmídeo PKFN-1503 está ilustrada na Figura 2.

Cortou-se PKFN-1503 com EcoRI e Xbal e ligou-se o fragmento de 412 pares de bases ao fragmento Ncol-Xbal de 9,5 Kb de pMT636 e ao fragmento NcoI-EcoRI de 1,4 Kb de pMT636, o que deu origem ao plasmídeo PKFN-1508, ver Figura 3. 0 plasmídeo pMT636 encontra-se descrito no pedido de patente de invenção internacional N^s PCT/DK88/00138.

plasmídeo pMT636 consiste num vector lançadeira (shuttle) de E. coli-5. cerevisiae, contendo o gene TPI de Schizosaccharomyces pombe (POT) £Russelll, P.R., Gene, 40 ( 1985) 125-130X7, o promotor e terminador de triose-fosfato —isomerase, ΤΡΙρ e ΤΡΙγ £Alber, T. e Kawasaki, G., J. Mol. Appl. Gen., (1982), 419-434J. 0 plasmídeo pKFN-1508 contém a sequência seguinte: TPIp- sequência inicial (leader) de sinal LaC212spx3 (1-47)-Glu(ArgLeuGluLysArgZ?Glu1, Glu26, Glu41, GIu46J7-aprotinina-TPI_t em que a sequência inicial de sinal LaC212spx3 é a

sequência inicial de síntese de levedura, descrita no pedido de patente de invenção internacional N⁹ PCT/DK88/00147. Na Figura 3 indica-se a sequência de ADN do fragmento EcoRI-Xbal de 412 pares de bases provenientes dos plasmídeos pKFN-1503 e pKFN-1508.

Desenvolveu-se em YPGaL (1% de extracto de levedura de Bacto, 2% de Peptona Bacto, 2% de galactose, 1% de lactato) até uma D.O. de 0,6 a 600 nm a estirpe MT663 de S. cerevisiae (E2-7B XE11-36 a/<>4, tpi/tpi, pep 4-3/pep 4-3).

Recolheu-se 100 ml da cultura, por centrifugação, lavou-se com 10 ml de água, efectuou-se nova centrifugação e efectuou-se uma suspensão em 10 ml de uma solução contendo sorbitol 1,2M, Na^EDTA 25mM, pH 8,0 e 6,7 mg/ml de ditiotreitol. Incubou-se a suspensão a 30°C durante 15 minutos, centrifugou-se e efectuou-se nova suspensão das células numa solução contendo sorbitol 1,2 M,

Na₂EDTA 10 mM, citrato de sódio, 0,1M, pH 5,8 e 2mg de NOVOZYM® 234. Incubou-se a suspensão a 30°C durante 30 minutos, recolheram-se as células por centrifugação, lavaram-se com 10 ml de sorbitol 1,2 M e 10 ml de CAS (sorbitol 1,2 M, CaCl₂ 10 mM, Tris HCl 10 mM (Tris= Tris( hidroximeti1)-aminometano), pH= 7,5) e efectuou-se nova suspensão em 2 ml de CAS. Para transformação, misturou-se 0,1 ml de células em suspensão em CAS com aproximadamente 1 yjg de plasmídeo pKFN-1508 e deixou-se à temperatura ambiente durante 15 minutos. Adicionou-se 1 ml de (polietilenoglicol 4000 a 20%, CaCl₂ 20 mM, CaCl₂ 10 mM, Tris HCl 10 mM, pH 7,5) e deixou-se a mistura em repouso à temperatura ambiente durante mais 30 minutos. Centrifugou-se a mistura e efectuou-se uma suspensão do sedimento em 0,1 ml de SOS ( sorbitol 1,2 M, 33% de YPD

-27(v/v), CaCl₂, 6,7 mM, 14jug/ml de leucina) e incubou-se a 30^C^ durante 2 horas. Centrifugou-se então a suspensão e efectuou-se nova suspensão do sedimento em 0,5 ml de sorbitol 1,2 M.

Em seguida, adicionou-se 6 ml de agar superior (meio SC de Sherman et al., (Methods in Yeast Genetics, Cold Sprin hatbor Laboratory, 1982) contendo sorbitol 1,2 M mais 2,5% de agar) a 52°C e, verteu-se a suspensão no topo das placas que continham o mesmo meio de agar solificado contendo sorbitol.

Decorridos 3 dias à temperatura de 30°C, recolheram-se as colónias de transformantes, re-isol aram-se e utilizaram-se para iniciar culturas líquidas. Seleccionou-se uma dessas colónias de transformantes, KFN-1512, para caracterização posterior.

Desenvolveu-se a estirpe de levedura KFN-1512 em meio YPD (1% de extracto de levedura, 2% de peptona ( de Difco Laboratories) e 6% de glucoses). Agitou-se 200 ml de cultura da estirpe a 250 rpm, a 30°C, durante 3 dias, até uma D.O. de cerca de 20, a 600 nm. Após a centrifugação analisou-se o sobrenadante por cromatografia de permuta iónica FPLC. Filtrou-se o sobrenadante de levedura através de um filtro Millex GV de 0,22^im e aplicou-se 1 ml sobre uma coluna de permuta de catiões MonoS (0,5 χ 5 cm) equilibrada com ácido fórmico 20 mM, a pH 3,7. Após lavagem com tampão de equilíbrio , eluiu-se a coluna com um gradiente linear de NaCl (0,1 M) em tampão de equilíbrio. Quantificou-se a actividade de inibição da tripsina, nas fracções eluídas, por análise espectrofotométrica /fKassel, B., Methods Enzymol., 19 (1970) 844-852J7 e posteriormente por integração da absorção a 280 nm de %

^E280 (aprotinina) = 8,3

-28¢%

Com o objectivo de obter material para estudos toxicológicos, desenvolveu-se a estirpe de levedura KFN-1512, em larga escala. Purificou-se o análogo de aprotinina por combinação de cromatografia de permuta iónica e HPLC de fase inversa.

EXEMPLO 2

Produção de Z?Glu1, Glu42, Glu46 J-aprotinina a partir da estirpe de levedura KFN-1514

Construiu-se um gene de síntese que codificava Jg1u1, Glu42, Glu46J7-aprotinina a partir de 10 oligonucleótidos, por ligação, tal como se descreveu no Exemplo 1.

Construiu-se, tal como se descreveu no Exemplo 1, o plasmídeo pKFN-1505 derivado de pTZ19R, que continha o gene de síntese estruralmente fundido com um péptido inicial sintético de levedura.

Seguindo o procedimento descrito no Exemplo 1, obteve-se um plasmídeo de expressão de levedura pKFN-1510 que continha a seguinte construção TPIp-sequência inicial de sinal LaC211spx3 (1 -47)-G1 uArgLeuGluLysArgJ G1 u1, Glu42, Glu45j-aprotinina-ΤΡΙγ.

Na Figura 4 indica-se a sequência de ADN do fragmento EcoRI-Xbal de 412 pares de bases de pKFN-1505 e de pKFN-1510.

Transformou-se o plasmídeo pKFN-1510 na estirpe de levedura MT663, tal como anteriormente se descreveu, e que originou a estirpe de levedura KFN-1514.

-29Tal como anteriormente descrito, efectuou-se a cultura da estirpe transformada KFN-1514 em meio YPD, a análise de £.Glu1, Glu42, Glu46^-aprotinina no sobrenadante e a produção de material para estudos toxicológicos.

EXEMPLO 3

Produção de £ Glu42, GIu46J-aprotinina a partir da estirpe de levedura KFN-1544

Utilizou-se o fragmento Avall-Xbal de 144 pares de bases que codifica ZTGlu42, G1u46Jf-aprotinina (12-58) de pKFN-1505 para substituir o fragmento correspondente de ADN que codificava a aprotinina (12-58), a partir do plasmídeo pKFN-1000, o que originou o plasmídeo pKFN-1528. 0 plasmídeo pKFN-1000 está descrito no Exemplo 4 do pedido de patente de invenção internacional publicação N? WO 90/10075.

De acordo com o procedimento do Exemplo 1, obteve-se um plasmídeo de expressão de levedura, pKFN-1541, contendo a seguinte construção TPIp-sequência inicial de sinal de LaC212spx3 (1-47)-GluArgLeuGluLysArg-JGlu42, G1u46.J-aprotinina-TPIy.

Na Figura 5 indica-se a sequência de ADN do fragmento EcoRIXbal de 412 pares de bases de pKFN-1528 e de pKFN-1541.

Transformou-se o plasmídeo pKFN-1541 na estirpe de levedura MT663, tal como se descreveu anteriormente, o que originou a estirpe de levedura KFN-1544.

A cultura da estirpe transformada KFN-1544 , em meio YPD, a análise de C Glu42, Glu46 J-aprotinina no sobrenadante e

Λ

-30a produção de material para estudos toxicológicos efectuou-se tal como anteriormente descrito.

EXEMPLO 4

Produção de /TSerlO, Asp24, Thr26, Glu31, Asn41,

Glu53 J7~.aprotinina a partir da estirpe de levedura KFN-1545

Construiu-se o gene de síntese que codifica ZSSerlO,

Asp24, Thr26, Glu31, Asn41, Glu53 J por ligação de 10 oligonucleótidos, tal como se descreveu no Exemplo 1.

Construiu-se, tal como se indica, no Exemplo 1, o plasmídeo pKFN-1530 derivado de pTZ19R que contém o gene de síntese estruturalmente fundido com uma sequência pêptidica inicial de levedura, de síntese.

Seguindo o procedimento descrito no Exemplo 1 obteve-se um plasmídeo de expressão de levedura, pKFN-1532, que continha a construção seguinte: TPI - sequência inicial de sinal LaC212spx3 r

(1-47)-GluArgLeuGluLysArg-Z?Ser 10, Asp24, Thr26, Glu31, Asn41, Glu52 .J-aprotinina-TPIy.

Na Figura 6 indica-se a sequência de ADN do fragmento EcoRI-Xbal de 412 pares de bases de pKFN-1530 e de pKFN-1532.

Transformou-se o plasmídeo pKFN-1532 na estirpe de levedura PT563, tal como se descreveu anteriormente, o que originou a estirpe de levedura KFN-1545.

Efectuou-se, tal como anteriormente se descreveu, a cultura da estirpe KFN-1545 de levedura em meio YPD, a análise

-31* de C. Ser10, Asp24, Glu31, Asn41, Glu53.7-aprotinina no sobrenadante e a produção de material para estudos toxicológicos.

EXEMPLO 5

Produção de fSerlO, Leu2Q, Gly40, Asn41, Gln44,

Tyr46.7-aprotinina a partir da estirpe de levedura

KFN-1547

Construiu-se o gene de síntese que codifica a ZÍSerlO, Leu20, Gly40, Asn41, Gly42, Gln44, Tyr46.7-aprotinina, por ligação de 10 oligonucleótidos, tal como se descreveu no Exemplo 1.

Tal como se descreveu no Exemplo 1, construiu-se o plasmídeo pKFN-1534 derivado de pTZ19R que contém o gene de síntese estruturalmente fundido com uma sequência peptídica inicial de levedura, de síntese.

Seguindo o procedimento descrito no Exemplo 1, obteve-se um plasmídeo de expressão de levedura, pKFN-1537, que continha a construção seguinte: TPI - sequência inicial de sinal LaC212spx3 (1-47)-G1uArgLeuGluLysArg-/?Ser10, Leu20, Asn41, Gly42, Gln44, Tyr46J7-aprotinina-TPIy.

A sequência de ADN do fragmento EcoRI-Xbal de 412 pares de bases de pKFN-1534 e de pKFN-1537, está indicada na Figura 7.

Transformou-se o plasmídeo pKFN-1537 na estirpe de levedura MT663, tal como se descreveu anteriormente, o que originou a estirpe de levedura KFN-1547.

-32Efectuou-se, tal como anteriormente se descreveu a cultura da estirpe KFN-1547 de levedura em meio YPD, a análise de £*Ser10, Leu20, Gly40, Asn41, Gly42, Gln44, Tyr46J7-aprotinina no sobrenadante e a produção de material para estudos toxicológicos.

EXEMPLO 6

Produção de Des-Arg1, des-Pro2-Z7 Ser42, Glu46 J-aprotinina a partir da estirpe de levedura KFN-1660

Ligaram-se os fragmentos Ahall-Styl de 1,4 Kb e Ahall-Sall de 1,8 Kb do plasmídeo pKFN-306, a um duplex constituído pelos dois seguintes oligonucleótidos de síntese:

N0R-2188: 5' CAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGTGGCTGCAGAGCTAAGTCCAACAACTTCGAATCTGCTGAAGACTGCATGAGAACTTGTGGTGGTGCCTAATCTAGAG 3'

NOR-2189: 5' TCGACTCTAGATTAGGCACCACCACAAGTTCTCATGCAGTCTTCAGCAGATTCGAAGTTGTTGGACTTAGCTCTGCAGCCACCGTAAACGAAAGTTTGACACAAACCAGC 3' plasmídeo pKFN-306 é um plasmídeo derivado de pTZ19R com uma inserção EcoRI-Xbal de 502 pares de bases que contém o gene da sequência inicial de sinal (1-85) do factor de acasalamento (mating) alfa 1 de Saccharomyces cerevisiae estruturalmente fundido com um gene de síntese para des-Arg1, des-Pro2-ΖΓSer42 J-aprotinina. Na patente de invenção WO 89/01968 descreve-se a construção do plasmídeo pKFN-306.

Utilizou-se a mistura de ligação para se transformar a estirpe competetidora de e. coli (r~, m⁺), seleccionada pela sua resistência à ampicilina. A sequênciação do ADN ISanger, F., *

Micklen, S. e Coulsen, A.R., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74 (1977) 5463-5467J demonstrou que os plasmideos das colónias resultantes continham a sequência correcta para des-Arg1, Pro2Ser42,Glu46 J-aprotinina.

Seleccionou-se um plasmídeo pKFN-1629 para utilização posterior.

De acordo com os procedimentos do Exemplo 1, obteve-se um plasmídeo de expressão de levedura, pKFN-1656, que continha a seguinte construção: TPI -sequência inicial de sinal MFQd r

(1-85)-des-Arg, des-Pro2-£ Ser42, Glu46J/-aprotinina-TPI_T.

Na Figura 8 indica-se a sequência de ADN do fragmento de EcoRI-Xbal de 502 pares de bases provenientes de pKFN-1629 e de pKFN-1656.

Transformou-se o plasmídeo pKFN-1656, na estirpe de levedura MT663, tal como se descreveu anteriormente, de que resultou a estirpe de levedura KFN-1660.

Efectuou-se, tal como anteriormente descrito, a cultura da estirpe transformada KFN-1660 em meio YPD, a análise de des-Arg1, des-Pro2-£Ser42, Glu46^7-aprotinina no sobrenadante e a produção de material para estudos toxicológicos.

EXEMPLO 7

Produção de des-Arg1, des-Pro2-£'Ser42, Ala46 ,7-aprotinina a partir da estirpe KFN-1661

Ligaram-se os fragmentos Ahall-Styl de 1,4 Kb e Ahall-Sall de 1,8 Kb do plasmídeo pKFN-306 a um duplex constituído

pelos dois oligonucleótidos de síntese seguintes:

NOR-2196: 5' CAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGTGGCTGCAGAGCTAAGTCCAACAACTTCGCTTCTGCTGAAGACTGCATGAGAACTTGTGGTGGTGCCTAATCTAGAG 3'

NOR-2197: 5' TCGACTCTAGATTAGGCACCACCACAAGTTCTCATGCAGTCTTCAGCAGAAGCGAAGTTGTTGGACTTAGCTCTGCAGCCACCGTAAACGAAAGTTTGACACAAACCAGC 3' plasmídeo pKFN-306 é um plasmídeo derivado de pTZ19R com uma inserção EcoRI-Xbal de 502 pares de bases que contém o gene da sequência principal (1-85) do factor de acasalamento 5mating) alfa 1 de Saccharomyces cerevisiae estruturalmente fundido com um gene de síntese para des-Arg1, des-Pro2-£Ser42J-aprotinina. Na patente de invenção W0 89/01968 descreve-se a construção do plasmídeo pKFN-306.

Utilizou-se a mistura de ligação para transformar a estirpe competetidora de E. coli (r₅ m⁺), seleccionada pela sua resistência à ampicilina. A sequênciação do ADN /^Sanger, F., Micklen, S. e Coulsen, A.R., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74 (1977) 5463-5467J7 demonstrou que os plasmídeos das colónias resultantes continham a sequência correcta para des-Arg1, Pro2-ZTser42,Glu46J7-aprotinina.

Seleccionou-se um plasmídeo pKFN-1631, para utilização posterior.

De acordo com os procedimentos do Exemplo 1, obteve-se um plasmídeo de expressão de levedura, pKFN-1657 que continha a seguinte construção: TPI -sequência inicial de sinal MF^1 (1-85)H

-desArg, des-Pro2-£Ser42, Ala46J-aprotinina-TPIy.

Na Figura 9 indica-se a sequência de ADN do fragmento * de EcoRI-Xbal de 502 pares de bases proveniente de pKFN-1631 e de pKFN-1657.

Transformou-se o plasmídeo pKFN-1657, na estirpe de levedura MT663, tal como se descreveu anteriormente, de que resultou a estirpe de levedura KFN-1661.

Efectuou-se, tal como anteriormente descrito, a cultura da estirpe transformada KFN-1661, em meio YPD, a análise de des-Arg1, des-Pro2-£* Ser42, Ala46_7-aprotinina no sobrenadante e a produção de material para estudos toxicológicos.

EXEMPLO 8

Produção de des-Arg1, des-Pro2-Z?Ser10, Asp24, Thr26,

Glu31, Asn41, Glu5327-aprotinina a partir da estirpe de levedura KFN-1735

Construiu-se o gene de síntese que codifica a des-Arg1, des-Pro2-£Ser10, Asp24, Thr26, Glu31, Asn41, G1u5327-aprotinina por ligação de 10 oligonucleótidos, tal como se descreveu no Exemplo 1.

Construiu-se, tal como se indica, no Exemplo 1, o plasmídeo pKFN-1707 derivado de pTZ19R que contém o gene de síntese estruturalmente fundido com uma sequência peptídica inicial de levedura, de síntese.

Seguindo o procedimento descrito no Exemplo 1, obteve-se um plasmídeo de expressão de levedura, pKFN-1709, que continha a construção seguinte: TPI_p-sequência inicial de sinal

LaC212spx3(1-47)-GluArgLeuGluLysArg- des-Arg1, des-Pro2-/TSer 10,

Asp24, Thr26, Glu31, Asn41, Glu53J7-aprotinina-ΤΟΡΙγ. *

A sequência de ADN do fragmento EcoRI-Xbal de 406 pares de bases de pKFN-1707 e de pKFN-1709 indica-se na Figura 10.

Transformou-se o plasmídeo pKFN-1709, na estirpe de levedura MT663, tal como se descreveu anteriormente, o que originou a estirpe de levedura KFN-1735.

Efectuou-se, tal como anteriormente se descreveu, a cultura da estirpe KFN-1735 de levedura em meio YPD, a análise de des-Arg1, des-Pro2-£Ser10, Asp24, Thr26, Glu31, Asn41, Glu53J7-aprotinina no sobrenadante e a produção de material para estudos toxicológicos.

EXEMPLO 9

Produção de des-Arg1, des-Pro2-£‘Asp24, Thr26, Glu31,

Glu53 ,7-aprotinina a partir da estirpe de levedura KFN-1737

Ligou-se o fragmento Ahall-Xbal de 1,8 Kb e o fragmento Ahall-Avall de 1,4 Kb, provenientes do plasmídeo pKFN-306 (ver Exemplo 5), a um fragmento de síntese, Avall-Xbal, de 141 pares de bases que codificava £Asp24, Thr26, Glu31, Glu35JZ-aprotinina.

Designou-se o plasmídeo resultante, derivado de pTZ19R, por pKFN-1711.

De acordo com o procedimento do Exemplo 1, obteve-se um plasmídeo de expressão de levedura, pKFN-1713, que continha a seguinte construção: TPI_p-sequência inicial de sinal MF©t1 - (1 -85) -37-de sArg1, des-Pro2-/S Asp24

Thr26, Glu31,

Glu53 Japrotinina-

-TPI

T*

Na

EcoRI-Xbal

Figura 11 indica-se a sequência de de 502 pares de bases de pKFN-1711

ADN do fragmento e de pKFN-1713.

Transformou-se o plasmídeo pKFN-1713, na estirpe de levedura MT663, tal como anteriormente se descreveu, originando deste modo, a estirpe de levedura KFN-1737.

Efectuou-se, tal como anteriormente se descrevreu, a cultura da estirpe transformada, KFN-1737, em meio YPD, a análise de des-Arg1, des-Pro2-ZTAsp24, Thr26, Glu31, G1u53J7-aprotinina no sobrenadante e a produção de material para estudos toxicológicos.

EXEMPLO 10

Produção de des-Arg1, des-Pro2-Z?Ser 10, Gly40, Asn41,

Gly42, GIu53J7-aprotinina a partir da estirpe de levedura KFN-1739

Construiu-se o gene de síntese que codifica a des-Arg1, des-Pro2-/Sser10, Gly40, Asn41, Gly42, Glu53J7-aprotinina por ligação de 10 oligonucleótidos, tal como se descreveu no Exemplo 1.

Construiu-se, do modo descrito no Exemplo 1, o plasmídeo pKFN-1715 derivado de pTZ19R que contêm o gene de síntese estruturalmente fundido com uma sequência peptídica inicial de levedura, de síntese.

Seguindo o procedimento descrito no Exemplo 1, obteve-se um plasmídeo de expressão de levedura, pKFN-1718, que con-38tinha a construção seguinte: TPI_p-sequência inicial de sinal LaC212spx3(1-47)-GluArgLeuGluLysArg-des-Arg1, des-Pro2-£ Ser 10, Gly40, Asn41, Gly42, Glu53 J-aprotinina-TPIy.

A sequência de ADN do fragmento EcoRI-Xbal de 406 pares de bases de pKFN-1715 e de pKFN-1718 está indicada na Figura 12.

Transformou-se o plamídeo pKFN-1718 na estirpe de levedura MT663, tal como se descreveu anteriormente, o que originou a estirpe de levedura KFN-1739.

Efectuou-se, tal como anteriormente se descreveu a cultura da estirpe KFN-1739 de levedura, em meio YPD, a análise de des-Arg1, des-Pro2-£ Ser 10, Gly40, Asn41, Gly42, Glu53 JZ-aprotinina no sobrenadante e a produção de material para estudos toxicológicos.

EXEMPLO 11

Produção de des-Arg1, des-Pro2-Z?Ser42, Glu53J7-aprotinina a partir da estirpe de levedura KFN-1742

Ligou-se o fragmento Ahall-Xbal de 1,8 Kb e o fragmento Ahall-Avall de 1,4 Kb, provenientes do plasmídeo pKFN-306 (ver Exemplo 5) a um fragmento de síntese, Avall-Xbal, de 141 pares de bases que codificava ZÍSer42, Glu53 _7-aprot inina.

Designou-se o plasmídeo resultante, derivado de pTZ19R, por pKFN-1721.

De acordo com o procedimento do Exemplo 1, obteve-se um plasmídeo de expressão de levedura, pKFN-1724, que continha a seguinte construção: TPI_p-sequência inicial de sinal MFQel-(1-85)-des-Arg1, des-Pro2-£“Ser42, GIu53J7-aprotinina-TPI * T·

Na Figura 13 indica-se a sequência de ADN do fragmento EcoRI-Xbal de 502 pares de bases de pKFN-1721 e de pKFN-1724.

Transformou-se o plasmídeo pKFN-1724, na estirpe de levedura MT663, tal como anteriormente se descreveu, originando, deste modo, a estirpe de levedura KFN-1742.

Efectuou-se, tal como anteriormente se descreveu, a cultura da estirpe transformada, KFN-1742, em meio YPD, a análise de des-Argí, des-Pro2-£Ser42, Glu53J7-aprotinina no sobrenadante e a produção de material para estudos toxicológicos,

EXEMPLO 12

Produção de des-Arg1, des-Pro2-£Glu42, Glu53 J-aprotinina a partir da estirpe de levedura KFN-1752

Ligou-se o fragmento Ahall-Xbal de 1,8 Kb e o fragmento Ahall-Avall de 1,4 Kb, provenientes do plasmídeo pKFN-306 (ver Exemplo 5) a um fragmento de síntese, Avall-Xbal, de 141 pares de bases que codificava £Glu42, G1u53 _7-aprotinina.

Designou-se o plasmídeo resultante, derivado de pTZ19R, por pKFN-1762.

De acordo com o procedimento do Exemplo 1, obteve-se um plasmídeo de expressão de levedura, pKFN-1765, que continha a seguinte construção: TPI_p-sequência inicial de sinal MFc<1 (1-85)-des-Arg1, des-Pro2-£ Glu42, Glu53 J*-aprotinina-TPI_T.

Na Figura 14, indica-se a sequência de ADN do fragmento

-40EcoRI-Xbal de 502 pares de bases de pKFN-1762 e de pKPí-1765.

Transformou-se o plasmídeo pKFN-1765 na estirpe de levedura MT663, tal como anteriormente se descreveu, originando, deste modo, a estirpe de levedura KFN-1752.

Efectuou-se, tal como anteriormente se descreveu, a cultura da estirpe transformada, KFN-1752 em meio YPD, a análise de des-Arg1, des-Pro2-Z? Glu42, Glu53J7-aprotinina no sobrenadante e a produção de material para estudos toxicolôgicos.

EXEMPLO 13

Produção de des-Arg1, des-Pro2-ZTGlu26, Ser42, Glu53j7-aprotinina a partir da estirpe de levedura KFN-1755

Ligou-se o fragmento Ahall-Xbal de 1,8 Kb e o fragmento Ahall-Avall de 1,4 Kb, provenientes do plasmídeo pKFN-306 (ver Exemplo 5) a um fragmento de síntese, Avall-Xbal, de 141 pares de bases que codificava £Glu26, Ser42, Glu53 j7-aprotinina.

Designou-se o plasmídeo resultante, derivado de pTZ19R, por pKFN-1768.

De acordo com o procedimento do Exemplo 1, obteve-se um plasmídeo de expressão de levedura, pKFN-1770, que continha a seguinte construção: TPI_p-seouência inicial de sinal MF<^1 (1-85)-desArgl, des-Pro2-ZTGlu26, Ser42, Glu53_7-aprotinina-TPI_T.

Na Figura 15, indica-se a sequência de ADN do fragmento EcoRI-Xbal de 502 pares de bases de pKFN-1768 e de pKFN-1770.

Transformou-se o plasmídeo pKFN-1770 na estirpe de leve-

dura MT663, tal como anteriormente se descreveu, aoriginando, deste modo, a estirpe de levedura KFN-1755.

Efectuou-se, tal como anteriormente se descreveu a cultura da estirpe transformada, KFN-1755, em meio YPD, a análise de des-Arg1, des-Pro2-£*G1u26, Ser42, Glu533Z-aprotinina no sobrenadante e a produção de material para estudos toxicológicos.

EXEMPLO 14

Produção de des-Arg1, des-Pro2-/Tfílu26, GIu42, Glu53 /-aprotinina a partir da estirpe de levedura KFN-i756

Ligou-se o fragmento Ahall-Xbal de 1,8 Kb e o fragmento Ahall-Avall de 1,4 Kb, provenientes do plasmídeo pKFN-306 (ver Exemplo 5) a um fragmento de síntese, Avall-Xbal, de 141 pares de bases que codificava £ Glu26, Glu42, Glu53j7-aprotinina.

Designou-se o plasmídeo resultante, derivado de pTZ19R, por pKFN-1771.

De acordo com o procedimento do Exemplo 1, obteve-se um plasmídeo de expressão de levedura, pKFN-1773, que continha a seguinte construção: TPI_p-sequência inicial de sinal MFVI (1-85)-des-Arg1, des-Pro2-£GIu26,Glu42,Glu53 J-aprotinina-ΤΡΙγ.

Na Figura 16, indica-se a sequência de ADN do fragmento EcoRI-Xbal de 502 pares de bases de pKFN-1771 e de pKFN-1773.

Transformou-se o plasmídeo pKFN-1773 na estirpe de levedura MT663, tal como anteriormente se descreveu, originando, deste modo, a estirpe de levedura KFN-1756.

Efectuou-se, tal como anteriormente se descreveu, a cultura da estirpe transformada, KFN-1756, em meio YPD, a análise de des-Arg1, des-Pro2-£G1u26, Glu42, G1u53J-aprotinina no sobrenadante e a produção de material para estudos toxicológicos.

-42EXEMPLO 15

Rastreio Toxicológico de Análogos de Aprotinina por

Administração Intravenosa de uma Onica Dose a Ratazanas

Ni star

MATERIAL:

Seleccionaram-se para rastreio toxicológico os análogos de aprotinina indicados a seguir com uma carga líquida positiva e estabilidade térmica reduzidas, em comparação com a aprotinina recombinante (1-58): KFN-1512, KFN-1514, KFN-1544, KFN-1545, KFN-1547, KFN-1660 θKFN-1661. No Quadro 1 apresentam-se as suas principais características sob o ponto de vista toxicológico. Apresentam-se os dados da aprotinina recombinante a título comparativo. Apresenta-se a temperatura de desnaturação como uma indicação da estabilidade biológica.

Quadro 1:

Informação Geral

Tipo de KFN	Comprimento da cadeia	Carga Líquida	Desnaturação T,°C
rAprotinina	1-58	+6	>100
1512	1-58	-2	87
1514	1-58	0	88
1544	1-58	+2	98
1545	1-58	0	93
1547	1-58	+2	86
1660	3-58	+2	77
1661	3-58	+3	79

ESQUEMA:

No 1^S dia de rastreio de cada um dos análogos, administrou-se a grupos de 2 ratazanas macho e 2 ratazanas fêmeas, 33, 100, 300 ou 900 mg de análogo/Kg de peso do corpo. Dois grupos de controlo identicamente constituídos receberam solução salina fisiológica ou solução salina fisiológica acidificada com ácido clorídrico a um pH aproximado de 4,5. A última solução serviu de veículo. Em todos os casos o volume de dose foi de 10 ml/Kg de peso de corpo. Observaram-se as ratazanas durante 7 dias e sacrificaram-se ao 8⁹ dia. Durante a autópsia pesaram-se os rins e prepararam-se para fins histopatológicos. Indicam-se, no topo do Quadro 2, respostas variáveis.

RESULTADOS;

No Quadro 2 estão resumidos os resultados dos rastreios individuais. Incluem-se, a título comparativo, dados referentes à aprotinina recombinante (dosagem: 11-300 mg/Kg). Não foi possível dissolver KFN-1512, tal como seria necessário para administração da dose mais elevada (900 mg/Kg).

Morreu apenas um animal para a dose de 900 mg de KFN-1545/Kg. Com excepção desta situação, não se observou qualquer outra mortalidade.

Após a administração (300 mg/Kg peso do corpo) de KFN-1512, KFN-1544, KFN-1545 e de KFN-1660 não se observaram quaisquer alterações histopatológicas do rim. Além disso, não se observaram quaisquer alterações histopatológicas do rim após a administração de 900 mg/Kg de peso do corpo, de KFN-1514, KFN-1547 e de KFN-1661. Deste modo, verifica-se que nenhum dos análogos possui níveis tóxicos, no que se refere às alterações histopatológicas do rim, quer com 300 mg/Kg quer com doses superiores, em comparação com os 11 mg/Kg para a aprotinina.

No que se refere a outro tipo de respostas, os análogos mostraram-se iguais ou superiores à aprotinina.

-45Quadro 2: Níveis de efeito não tóxico de acordo com respostas variáveis, mg/Kg

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CONCLUSÃO:

As características de toxicidade dos análogos da aprotinina confirmadas por rastreio de uma única dose, administrada por via intravenosa, em ratazanas Wistar, mostraram-se mais satisfatórias, em grau variável, por comparação com as características de toxicidade da aprotinina. Nenhum dos análogos de aprotinina apresentou níveis de nefrotoxicidade quer aos 300 mg/Kg, quer superiores. KFN-1545 não apresentou efeito nefrotóxico total para uma dose de 900 mg/Kg, que foi a dose máxima.

EXEMPLO 16

Eliminação e Distribuição de Aprotinina Recombinante e dos Análogos de Aprotinina

MATERIAIS:

Dissolveram-se em NaCl a 0,9%, aprotinina recombinante autêntica e os análogos produzidos de acordo com os Exemplos 1 a 7, com o objectivo de se obter um volume de dose de 1jul/g de ratazana. As concentrações das soluções injectáveis foram soluções de controlo analisadas de acordo com o método descrito na secção dos métodos.

MÉTODOS:

Utilizaram-se ratazanas fêmeas Wistar, com pesos compreendidos entre 200 e 230 g. Ensaiou-se a aprotinina e os seus análogos em dois modelos diferentes, 1) ratazanas anestesiadas e

2) ratazanas não anestesiadas.

RATAZANAS ANESTESIADAS ς

%

Anestesiaram-se as ratazanas por injecção intraperitoneal de pentobarbital de sódio. Expôs-se a artéria carótida e a veia jugular e introduziram-se cânulas que consistiam em cateteres de polietileno (PE-50, Intramedic). Ligou-se o cateter da carótida a um perfusor (B. Braun) para infusão de 3,8 ml de NaCl a 0,9%/ /hora e a'um transdutor de pressão sanguínea. As alterações na pressão sanguínea foram registados através de um dispositivo de registo gráfico (Kipp & Zonen, BD 9). Administraram-se os análogos na forma de comprimidos injectados, durante 15 segundos, através do cateter introduzido na jugular.

Recolheram-se amostras de sangue a partir do cateter da carótida decorridos 3, 10, 20, 40 e 60 minutos após a administração. Recolheram-se as amostras (0,45 ml) em tubos de ensaio de 3 ml, contendo 50yjl de citrato de sódio 0,13 M e centrifugaram-se. Armazenou-se o plasma a -20°C até posterior análise. Decorridos 60 minutos sobre a administração, sacrificaram-se as ratazanas com uma dose excessiva de pentobarbital de sódio, removeram-se os rins e o fígado, pesaram-se e armazenaram-se a -80°C.

RATAZANAS NAO ANESTESIADAS

Proporcionou-se uma dose de 2 ml de água destilada antes da administração dos análogos. Administraram-se os análogos por via intravenosa sob a forma de comprimidos injectáveis, na veia da cauda, utilizando um cateter intravenoso (Vneflon 22 G, Viggo-Spectramed, Helsingborg, Suécia). Após a administração, subme-48teu-se o cateter a um fluxo de 0,5 ml de NaCl a 0,9% e retirou-y^ -se. Colocou-se um penso no sítio da injecçâo para evitar hemorragia no local da injecçâo na cauda.

Colocaram-se então as ratazanas em compartimentos de metabolismo com o objectivo de se recolher a urina.

Decorridas 3 horas, sacrificaram-se as ratazanas, introduzindo nos compartimentos CO^/O^ (9/1) e retiraram-se os rins e o fígado que se armazenaram a -80°C até posterior análise. Durante a administração de CO^ as ratazanas esvaziaram as bexigas urinárias e, após a remoção das ratazanas, lavaram-se os compartimentos de metabolismo com NaCl a 0,9% no sentido de se obter o volume total de urina-NaCl de 25 ml.

PREPARAÇAO DE HOMOGENEIZADOS

Colocou-se um rim (aproximadamente 1 g) e aproximadamente 2 g de tecido hepático em tubos de plástico separados de 10 ml e adicionou-se 2 ml de NaCl a 0,9%. Homogeneizaram-se os tecidos durante 5 minutos, utilizando um Processador Ultra-sónico de Alta Intensidade (Modelo VC50, Solics & Materials Inc. Danbury CT, USA). Diluiram-se, então os homogeneizados de fígado e de rim com solução salina, com o objectivo de se obter um volume total de, respectivamente, 10-25 e 4ml.

MÉTODOS DE ANALISE

Os níveis de aprotinina e de análogos no plasma, homogeneizados hepáticos e soluções injectáveis mediram-se fotométricamente num dispositivo Cobas Fara II (Roche). Resumidamente,

efectuou-se a precipitação do plasma, homogeneizados ou soluções para injecção com ácido, com o objectivo de se removerem outros inibidores da calicreína diferentes da aprotinina. Mediu-se a actividade inibidora da calicreína nas amostras, utilizando a calicreína de pâncreas de suino {Sigma K 3627) e o substrato cromogénico S2266 (Kabi).

Determinaram-se os níveis dos homogeneizados renais e na urina pelo mesmo método, com excepção de se ter omitido o passo de precipitação, uma vez que a actividade intrínseca de inibição da calicreína nos homogeneizados diluídos e na urina era insignificante.

Para cada um dos análogos, em cada um dos meios, utilizaram-se curvas normalizadas separadas.

ESQUEMA DE ESTUDO

Estudaram-se 14 grupos de ratazanas anestesiadas e 14 grupos de ratazanas não anestesiadas. Administrou-se a cada uma das ratazanas uma dose de 1,56yjmoles (aproximadamente 10 mg) de aprotinina ou de análogos de aprotinina por Kg de peso do corpo. No Quadro III apresentam-se os dados base relativos aos 28 grupos.

Quadro 3

Grupos	n	PC	PR	PF
rAprotinina A	5	251,8	0,98	9,9
KFN 1512 A	4	230,0	0,84	9,6
KFN 1514 A	4	220,5	0,85	8,6
KFN 1544 A	4	226,0	0,97	9,3
KFN 1545 A	4	224,8	0,92	9,2
KFN 1547 A	4	229,0	0,75	8,6
KFN 1660 A	4	220,5	0,93	9,7
KFN 1661 A	4	240,8	0,97	9,0
rAprotinina U	4	192,5	0,77	9,8
KFN 1512 U	⁵	191,0	0,65	7,2
KFN 1514 U	6	188,3	0,69	7,3
KFN 1544 U	5	190,0	0,64	6,5
KFN 1545 U	6	185,8	0,66	7,3
KFN 1547 U	5	188,0	0,67	7,3
KFN 1660 U	6	205,0	0,77	8,5
KFN 1661 U	6	204,2	0,80	8,1

PC : Peso do Corpo (g)

PF : Peso do Fígado (g) ^DR : Peso do Rim (g)

A : Ratazanas modelo anestesiadas

U : Ratazanas modelo não anestesiadas

CALCULO ESTATÍSTICO:

Utilizou-se um ensaio de correlação aditiva (rank sum) de Spearman, para o cálculo estatístico.

51Quadro 4 Análogos do Aprotinina:

Teor de Actividade Inibidora nos Rins e na Urina após Administração i.v. a Ratazanas

z índice de , Acumu lação ι	O CO LD LT> LO «- ro co c\i m OJ — ^-c-CJ-c-oo
Teor Renal (3 h) % da Dose t i	'^-cj^-cocoldcoco Ν W
Teor Renal (1 h) % da Dose	c-wcorx^g-iDct CM τ- <-
Teor Urinário (3 h) % da Dose	CM^LOCJ^-LOCOCO LO CO <3- OJ
CO 1 í- 3 3 -P -Ρ (O (O c X í_ toc\] ro φ φ O ε 0.(3 t<0 ' ε oΦ Φ (0 o H XJ ί- O	or^cocococor^cn ocococncncor-x.r'^ Λ
Carga Líquida	IOCMC3CMOCMCMCO + 1 + + + +
Análogo ID	Aprotinina· KFN 1512 KFN 1514 KFN 1544 KFN 1545 KFN 1547 KFN 1660 KFN 1661

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Cálculo efectuado por rastreio colonimétrico diferencial em ácido 2-(N-morfolino)etano-sulfónico

CM

RESULTADOS :

Análogos nos Rins e na Urina teor total nos rins (em percentagem de dose) decorridas 1 e 3 horas e na urina após 3 horas, encontra-se indicado na Figura 17 e no Quadro IV.

Parece, portanto, que existem grandes diferenças entre os análogos.

No que se refere à aprotinina, o seu teor nos rins, 1 hora após a administração, foi de aproximadamente 20% da dose, enquanto o teor subiu para mais de 40% decorridas 3 horas. A excreção de aprotinina na urina foi insignificante.

Com o objectivo de determinar se a excreção urinária estava associada após 3 horas à carga líquida dos análogos, calculou-se o grau de correlação entre estes valores.

Descobriu-se que o teor na urina estava fortemente correlacionado com as cargas líquidas dos análogos (cf. Fig. 18).

Quadro V

Análogos	índice de Ac.	índice de Est. Renal	Temp.de Desnat. (°C)
rAprotinina A	2,10	0,90	100°
KFN 1512 A	0,66	0,67	87°
KFN 1514 A	1,32	0,87	88°
KFN 1544 A	1,32	1,05	98°
KFN 1545 A	1,99	0,71	93°
KFN 1547 A	1 ,22	0,65	86°
KFN 1560 A	0,50	0,55	77°
KFN 1661 A	0,77	0,55	79°

ESTABILIDADE DOS ANALOGOS

Tendo como objectivo o estudo da estabilidade dos análogos no tecido renal, dividiu-se em duas porções de idêntico peso um rim de 14 ratazanas anestesiadas ( um de cada um dos grupos). Armazenou-se uma das porções a 37°C e a outra porção a 4°C. Decorridas 4 horas, homogeneizaram-se os tecidos e determinou-se o teor de análogos.

Defeniu-se o índice de estabilidade como o teor da porção armazenada a 37°C dividido pelo teor da porção armazenada a 4°C. No Quadro V indicam-se os índices de estabilidade, demonstrando que a rAprotinina, KFN-1514e KFN-1544parecem ser compostos mais estáveis em comparação, por exemplo, com KFN-1660 que parece ser mais instável.

Também se estudou a estabilidade dos análogos, através da determinação da sua temperatura de desnaturação. Descobriu-se que as temperaturas de desnaturação estavam altamente correlacionadas com o teor no tecido renal, 3 horas após a administração (Fig. 19), e com os índices de acumulação (Fig. 20), mas não com a excreção na urina.

Estes dados sugerem que a carga líquida pode ser importante para a excreção na urina, mas é de menor importância para a concentração e acumulação nos rins. Por outro lado, a acumulação renal parece estar relacionada com a temperatura de desnaturação e com a estabilidade dos análogos no tecido tenal.

No entanto, é provável que as concentrações no tecido renal, quando determinadas 1 hora após a administração, se encontrassem alteradas devido à degradação ou redistribuição.

-54Deste modo, é possível que as concentrações determinadas, por exemplo, 10 minutos após a administração se correlacionassem com a carga líquida.

ς

CONCLUSÕES:

Tiraram-se as seguintes conclusões:

1) Todos os análogos ensaiados foram incorporados pelos rins mas em graus variáveis. A acumulação nos rins parecia estar relacionada com a termoestabi1 idade e com a estabilidade no tecido renal, mas não com a carga líquida das moléculas.

2) A excreção urinária parece estar associada à carga líquida dos análogos, mas não à estabilidade.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1.- Processo para a preparação de um análogo de aproti nina com reduzida nefrotoxicidade, caracterizado pelo facto de se remover ou substituir pelo menos um resíduo de aminoácido car regado positivamente, exterior ao sítio de ligação ã protease, por um resíduo de aminoácido neutro ou carregado negativamente, para se obter uma carga líquida positiva, e/ou se inserir ou adi cionar pelo menos um resíduo de aminoácido carregado negativamen te, e/ou se substituir pelo menos um resíduo de aminoácido neutro por um resíduo de aminoácido carregado negativamente e/ou se eliminar, adicionar ou substituir um ou mais resíduos de aminoácidos por um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes pa ra se obter uma estabilidade reduzida.
2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o análogo de aprotinina possuir a fórmula geral I

*1 Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro R₂ Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile ^R3 Tyr Phe Tyr R₄ Ala Rg Ala Gly Leu Cys Rg Thr Phe Vai Tyr Gly Gly Cys Arg R₇ Rg Rg Asn ^R10 ^{Riie R}11 Ser Ala Glu Asp Cys Met ^R12 Thr Cys Gly Gly Ala (I)

na qual o símbolo R^ representa um dipéptido seleccionado en tre o grupo constituído por Arg-Pro, Glu-Pro,

Asp-Pro, Ala-Pro, Ile-Pro, Thr-Pro, His-Pro, Leu-Pro, Gly-Pro e Ser-Pro, Pro ou uma ponte peptídica; o símbolo R^ representa um resíduo de aminoácido seleccionado entre o grupo constituído por Tyr, Glu, Asp, Ser, Thr, Ala e Vai;

o símbolo Rg representa um. resíduo de aminoácido seleccionado entre o grupo constituído por Arg, Glu, Asp, Leu, Ser, Ala, Gin e Thr;

o símbolo R^ representa um resíduo de aminoácido seleccionado entre o grupo constituído por Asn, Glu e Asp. o símbolo Rg representa um resíduo de aminoácido seleccionado entre o grupo constituído por Lys, Glu, Asp, Thr, Vai, Ala, Ser, Phe, Gin e Gly;

Ίο símbolo Rg representa um resíduo de aminoácido se leccionado entre o grupo constituído por Gin, Glu,

Asp, Vai e Ala;

o símbolo R-, representa um resíduo de aminoácido se leccionado entre o grupo constituído por Ala, Asp, Glu e Gly;

o símbolo Rg representa um resíduo de aminoácido se leccionado entre o grupo constituído por Lys, Glu, Asp, Asn, Ser, Thr e Ala;

o símbolo Rg representa um resíduo de aminoácido se leccionado entre o grupo constituído por Arg, Glu, Asp, Ser, Asn, Leu, Gly, Gin, Met e Thr;

o símbolo R_1q representa um resíduo de aminoácido seleccionado entre o grupo constituído por Asn, Glu e Asp;

o símbolo R^^ representa um resíduo de aminoácido seleccionado entre o grupo constituído por Lys, Glu, Asp, Leu, Tyr, Ala, Vai, Thr, Ser, Pro, His e

Ile; e o símbolo R^^ representa um resíduo de aminoácido seleccionado entre o grupo que consiste em Arg, Glu, Asp, Gin, Ala, Asn, His, Gly, Ser e Thr;

com a condição de pelo menos um dos resíduos de aminoácidos ^Rl^-^12 ^Ser diferente do resíduo de aminoácido correspondente da

58aprotinina nativa.
3. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de se adicionar um péptido contendo um ou mais resíduos de aminoácidos carregados negativamente ou neutros à extremidade N-terminal da molécula de aprotinina.
4. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de se adicionar um péptido contendo um ou mais resíduos de aminoácidos carregados negativamente ou neutros â extremidade C-terminal da molécula de aprotinina.
5. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado pelo facto de se modificar adicionalmente o análogo de aprotinina no sítio de ligação a protease.
6. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracte rizado pelo facto de o análogo de aprotinina possuir a fórmula geral II

Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro R₂ Thr Gly Pro Cys R₁₃ R^₄ R₁₅ R^ ^R17 ^R3 ^T^^{r T}^^{r Ala R}5 Leu ^CN^{S R}6 ^R18 ^T^^{r R}19

Gly, Cys R₂q R? Rg Rg Asn R-^θ Phe R^^ Ser Ala Glu Asp Cys Met Thr Cys Gly Gly Ala (II)

-59na qual os símbolos os significados definidos an tes na reivindicação 2;

o símbolo representa um resíduo de aminoácido seleccionado entre o grupo constituído por Lys,

Arg, Glu, Leu Met, Tyr e Phe;

o símbolo R^ representa um resíduo de aminoácido seleccionado entre o grupo constituído por Ala e Gly;

o símbolo representa um resíduo de aminoácido seleccionado entre o grupo constituído por Arg,

Ala, Gly, Lys, Leu, Met, Phe, Tyr, Ile e Asn; o símbolo R^g representa um resíduo de aminoácido seleccionado entre o grupo constituído por Ile,

Met, Leu, Phe, Thr e Glu;

o símbolo R^7 representa um resíduo de aminoácido seleccionado entre o grupo constituído por Ile,

Leu, Lys, Gin, Glu, Ser, Arg, Thr e Asn; o símbolo R^g representa um resíduo de aminoácido seleccionado entre o grupo constituído por Vai,

Thr, Leu, Ser, Tyr, Gin, His, Pro, Phe, Asn, Ile e Lys;

o símbolo R^g representa um resíduo de aminoácido seleccionado entre o grupo constituído por Gly, /-60Ζ

Thr e Ser; e o símbolo R₂g representa um resíduo de aminoácido seleccionado entre o grupo constituído por Gin, Lys, Met, Asn, Leu, Gly e Glu;

com a condição de pelo menos um dos resíduos de aminoácidos ^Rl^-R12 ^e P^el° ^{menos 11111} ^os resíduos de aminoácidos ^R2.3^_R20 ^se_rem diferentes dos resíduos de aminoácidos da aprotinina nativa.
7.- Processo de acordo com a reivindicação 2, carac terizado pelo facto de o símbolo R^ representar Glu-Pro, o sim bolo R^ representar Glu, o símbolo Rg representar Glu, o símbo 1° representar Glu e os símbolos R₂, Rg, R₄, R_g, R_?, Rg, RlO e R^ se encontrarem de acordo com a sequência da aprotini na nativa.
8,- Processo de acordo com a reivindicação 2, carac terizado pelo facto de o símbolo R^ representar Glu-Pro, o símbolo Rg representar Glu, o símbolo R^ representar Glu e os símbolos Rg, Rg, R^, R_g, R^, Rg, R-^θ e R^₂ se encontrarem em concordância com a sequência da aprotinina nariva.
9.- Processo de acordo com a reivindicação 2, carac terizado pelo facto de o símbolo Rg representar Glu, o símbolo ^R11 ^reP^{resentar G}-*-^{u e os} símbolos R^, Rg, Rg, R^, Rg, Rg, Rg, Rg, R_1q e R^g ^se encontrarem em concordância com a sequência nativa da aprotinina.
10. - Processo de acordo com a reivindicação 2, carac terizado pelo facto de o símbolo Rg representar Ser, o símbolo R^ representar Asp, o símbolo Rg representar Thr, o símbolo Rg representar Glu, o símbolo Rg representar Asn, o símbolo ^R12 ^raP^reaentar Glu e os símbolos R^, Rg, Rg, R^, R^q e R^^ se encontrarem em concordância com a sequência nativa da aprotini na.
11. - Processo de acordo com a reivindicação 2, carac terizado pelo facto de o símbolo Rg representar Ser, o símbolo Rg representar Leu, o símbolo Rg representar Gly, o símbolo Rg representar Asn, o símbolo Rg representar Gly, o símbolo R^ representar Gin, o símbolo R^^ representar Tyr e os símbolos R^, R^, Rg, Rg e R^g se encontrarem em concordância com a sequência da aprotinina nativa.
12,- Processo de acordo com a reivindicação 2, carac terizado pelo facto de o símbolo R^ representar uma ponte peptídica, o símbolo R representar Ser, o símbolo R.. reprey n sentar Glu, e os símbolos R_, R_, R., R_c, R^, R_, R_o, R. „

2 3' 4 5' 6' 7 8' 10

R^2 ^se encontrarem em concordância com a sequência da aprotinina nativa.
13.- Processo de acordo com a reivindicação 2, carac terizado pelo facto de o símbolo R^ representar uma ponte peptídica, o símbolo Rg representar Ser, o símbolo R^ representar Ala e os símbolos R₂, R_g, R₄, R , R_g, R_?, R_g, R_1Q e R₁₂ se encontrarem em concordância com a sequência da aprotini na nativa.
14. - Processo de acordo com a reivindicação 2, carac terizado pelo facto de o símbolo R^ representar uma ponte peptídica, o símbolo R₂ representar Ser, o símbolo R^ represen tar Asp, o símbolo R_g representar Thr, o símbolo R_g representar Glu, o símbolo R_g representar Asn, o símbolo R₁₂ representar Glu e os símbolos R , R?, Rg, R_1Q e R₁₁ se encontrarem em concordância com a sequência da aprotinina nativa.
15. - Processo de acordo com a reivindicação 2, carac terizado pelo facto de o símbolo R^ representar uma ponte peptídica, o símbolo R^ representar Asp, o símbolo R_g represen tar Thr, o símbolo R_g representar Glu, o símbolo R^₂ representar Glu e os símbolos R₂, R , R?, R_g, R , R-^θ e R^₁ se encontrarem em concordância com a sequência da aprotinina nativa.

ό3*
16.- Processo de acordo com a reivindicação 2, carac terizado pelo facto de o símbolo R^ representar uma ponte peptídica, o símbolo representar Ser, o símbolo R^ represen tar Gly, o símbolo Rg representar Asn, o símbolo Rg representar

Gly, o símbolo R^ representar Glu e os símbolos R_g, R^ , R_g,

Rg, R e R.^ se encontrarem em concordância com a sequência da aprotinina nativa.
17. - Processo de acordo com a reivindicação 2, carac terizado pelo facto de o símbolo R representar uma ponte peptídica, o símbolo Rg representar Ser, o símbolo R^₂ representar Glu, e os símbolos R₂, R₃, R₄, R_g, R_g, R₇, R_g, R_lg e R.^ se encontrarem em concordância com a sequência da aprotini na nativa.
18. - Processo de acordo com a reivindicação 2, carac terizado pelo facto de o símbolo R^ representar uma ponte peptídica, o símbolo Rg representar Glu, o símbolo R^₂ representar Glu e os símbolos R₂, Rg, r₄ , Rg, R_g, r_?, R_g, r_{1q e}R·^ se encontrarem em concordância com a sequência da aprotini na nativa.
19.- Processo de acordo com a reivindicação 2, carac terizado pelo facto de o símbolo R^ representar uma ponte peptídica, o símbolo Rg representar Glu, o símbolo Rg represen tar Ser, o símbolo R^ representar Glu e os símbolos Rg, Rg, R^, Rg, Ry, Rg, R_1q e R.^ se encontrarem em concordância com a sequência da aprotinina nativa.
20.- Processo de acordo com a reivindicação 2, carac terizado pelo facto de o símbolo R^ representar uma ponte peptídica, o símbolo Rg representar Glu, o símbolo Rg represen tar Glu, o símbolo R^ representar Glu e os símbolos Rg, Rg,

R^, Rg, Ry, Rg, Rg_g e R^^ se encontrarem em concordância com a sequência da aprotinina nativa.
21.- Construção de ADN, caracterizada pelo facto de englobar uma sequência de ADN que codifica um análogo de aprotinina obtido de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 20.
22.pelo facto de

Vector de expressão recombinante, caracterizado englobar uma construção de ADN de acordo com a reivindicação 21.
23.- Célula, vector de expressão de caracterizada pelo facto de conter um acordo com a reivindicação 22.
24.- Processo para a preparação de um análogo de apro tinina de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo facto de se fazer a cultura celular, de acordo com a reivindicação 23, sob condições que proporcionem a expressão de um análogo de aprotinina e de se recuperar o análogo resultante a partir da cultura.
25.- Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado pelo facto de se incorporar um aná logo de aprotinina obtido de acordo com uma qualquer das rei vindicações 1 a 20 com um veículo ou excipiente inertes sob o ponto de vista farmacêutico.