DE69129809T2 - Aprotininanaloga - Google Patents
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Description
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Aprotinin-Analoga, ein Verfahren zur Herstellung der Analoga und ihre Verwendung bei der Herstellung von Medikamenten.
- Aprotinin (auch als Rinder-Pancreas-Trypsin-Inhibitor, BPTI, bekannt) ist ein basisches Protein, das in mehreren Rinderorganen und -geweben vorhanden ist, wie Lymphknoten, Pancreas, Lungen, Ohrspeicheldrüse, Milz und Leber. Es ist ein einzelkettiges Polypeptid aus 58 Aminosäureresten mit der folgenden Aminosäuresequenz:
- Die Aminosäurekette ist durch drei Disulfidbrücken vernetzt, die zwischen Cys(5) und Cys(55), Cys(14) und Cys(38) bzw. Cys(30) und Cys(51) gebildet sind.
- Der isoelektrische Punkt von Aprotinin ist sehr hoch (ungefähr pI 10,5). Dies wird hauptsächlich durch einen relativ hohen Gehalt an den positiv geladenen Aminosäuren Lysin und Arginin bewirkt. Die dreidimensionale Struktur des Aprotininmoleküls ist sehr kompakt; dadurch ist es in hohem Maße stabil gegen Denaturierung bei hohen Temperaturen oder durch Säuren, Alkalien oder organische Lösungsmittel oder gegen proteolytischen Abbau (vgl. B. Kassell, Meth. Enzym. 19, 1970, S. 844,852).
- Es ist bekannt, daß Aprotinin verschiedene Serin-Proteasen einschließlich Trypsin, Chymotrypsin, Plasmin und Kallikrein hemmt, und es wird therapeutisch bei der Behandlung von akuter Pancreatitis, verschiedenen Zuständen des Schocksyndroms, hyperfibrinolytischer Blutung und Myokardinfarkt verwendet (vgl. zum Beispiel J.E. Trapnell et al., Brit. J. Surg. 61, 1974, S. 177; J. McMichan et al., Circulatory shock 9, 1982, S. 107; L.M. Auer et al., Acta Neurochir. 49, 1979, S. 207; G. Sher, Am. J. Obstet. Gynecol. 129, 1977, S. 164; und B. Schneider, Arzneim.-Forsch. 26, 1976, S. 1606). Die Verabreichung von Aprotinin in hohen Dosen reduziert erheblich den Blutverlust in Verbindung mit der Herzchirurgie einschließlich cardiopulmonalen Bypass-Operationen (vgl. zum Beispiel B.P. Bidstrup et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 97, 1989, S. 364-372; W. van Oeveren et al., Ann. Thorac. Surg. 44, 1987, S. 640-645).
- Bestimmte Aprotinin-Analoga sind bekannt, z.B. aus US 4,595,674, das Aprotinin-Analoga und -Derivate offenbart, bei denen Lys(15) durch Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Arg, L-α- Buttersäure, L-Norvalin, L-Norleucin, Dehydroalanin oder L- Homoserin ersetzt ist. EP 238 993 offenbart Aprotinin-Analoga, bei denen Lys(15) durch Arg, Val, Ile, Leu, Phe, Gly, Ser, Trp, Tyr oder Ala ersetzt ist und bei denen Met(52) weiterhin durch Glu, Val, Leu, Thr oder Ser ersetzt ist. EP 307 592 offenbart Aprotinin-Analoga, bei denen eine oder mehrere der Aminosäuren in Position 15, 16, 17, 18, 34, 39 und 52 durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt sind. WO 89/01968 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Aprotinin oder Aprotinin-Analoga in Hefe und offenbart insbesondere Analoga, denen eine oder zwei Aminosäurereste am N-terminalen Ende fehlen und bei denen Lys(41) und/oder Arg(42) durch einen anderen Aminosäurerest, insbesondere Ser, ersetzt ist. EP 339 942 offenbart Aprotinin-Analoga, bei denen eine oder mehrere der Aminosäuren in Position 1, 2, 12-19, 38, 41 und 42 deletiert oder durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt sind. Die in diesen Literaturstellen beschriebenen Aminosäuresubstitutionen sind im Hinblick auf eine Veränderung des Protease-Inhibitionsprofils von Aprotinin hauptsächlich im Protease-Bindungsbereich des Aprotininmoleküls zu finden, außer bei der Substitution von Met(52) gemäß EP 238 993 und der Substitution von Lys(41) und/oder Arg(42) gemäß WO 89/01968, die durchgeführt werden, um die Erzeugung von Aprotinin in E. coli bzw. Hefe zu erleichtern. EP 339 942 offenbart Aprotinin-Analoga, die im Hinblick auf eine Veränderung ihrer Protease-Bindungseigenschaften in einer oder mehreren der Positionen 12-19 modifiziert sind. Den Analoga können zusätzlich ein oder zwei Aminosäurereste am N-terminalen Ende fehlen, und Lys(41) und/oder Arg(42) können durch einen anderen Rest substituiert sein.
- Es wurde schon früher beschrieben, daß der Plasmaspiegel von nativem Aprotinin nach der intravenösen Injektion des Inhibitors in Tiere oder Freiwillige aufgrund einer Verteilung in der extrazellulären Flüssigkeit und anschließender Anhäufung in den Nieren ziemlich schnell abnimmt (I. Trautschold et al., in K. Heinkel und H. Schön (Hrsg.): Pathogenese, Diagnostik, Klinik und Therapie der Erkrankungen des Exokrinen Pankreas, Schattauer, Stuttgart, 1964, S. 289; E. Habermann et al., Med. Welt 24 (29), 1973, S. 1163-1167; H. Fritz et al., Hoppe- Seylers Z. Physiol. Chem. 350, 1969, S. 1541-1550; und H. Kaller et al., Eur. J. Drug Metab. Pharmacokin. 2, 1978, S. 79-85). Nach der Glomerulusfiltration ist Aprotinin fast quantitativ an die Bürstensaummembran der Zellen der proximalen Tubuli gebunden. Dann wird Aprotinin in mikropinocytische Vesikel und Phagosomen resorbiert, worauf ein sehr langsamer Abbau in Phagolysosomen erfolgt. Es wurde vorgeschlagen, daß dieser Transporttyp für Peptide im allgemeinen repräsentativ sei (M. Just und E. Habermann, Naunyn-Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 280, 1973, S. 161-176; M. Just, Naunyn-Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 287, 1975, S. 85-95).
- Die makroskopische und die histopathologische Untersuchung nach der Verabreichung von Aprotinin zeigen Veränderungen in den Nierengeweben von Ratten, Kaninchen und Hunden nach wiederholten Injektionen relativ hoher Aprotinindosen (Bayer, Trasylol, Inhibitor of proteinase; E. Glaser et al. in "Verhandlungen der Deutschen Gesellschaft für Innere Medizin, 78. Kongress", Bergmann, München, 1972, S. 1612-1614). Die für Aprotinin beobachtete Nephrotoxizität (die sich unter anderem in Form von Läsionen bemerkbar macht) könnte der Anhäufung von Aprotinin in den Zellen der proximalen Tubuli der Nieren zuzuschreiben sein. Wegen dieser Nephrotoxizität ist Aprotinin für klinische Zwecke, insbesondere solche, die eine Verabreichung hoher Dosen des Inhibitors erfordern (wie cardiopulmonale Bypass-Operationen), weniger gut geeignet.
- Es wäre daher von beträchtlichem Interesse, Aprotinin-Analoga mit einer im Vergleich zu nativem Aprotinin reduzierten Nephrotoxizität herzustellen.
- Die Erfindung bezieht sich auf ein Aprotinin-Analogon, wobei, um eine reduzierte positive Nettoladung zu erhalten, wenigstens ein positiv geladener Aminosäurerest außerhalb der Protease-Bindungsstelle entfernt oder durch einen neutralen oder negativ geladenen Aminosäurerest ersetzt ist und/oder wobei wenigstens ein negativ geladener Aminosäurerest insertiert oder hinzugefügt ist und/oder wobei wenigstens ein neutraler Aminosäurerest durch einen negativ geladenen Aminosäurerest ersetzt ist und/oder wobei, um eine reduzierte thermische Stabilität des Analogons in wäßrigen Lösungen bei einem pH-Wert von etwa 4-10 zu erhalten, ein oder mehrere Aminosäurereste außerhalb der Protease-Bindungsstelle, die an der Stabilisierung des Analogons beteiligt sind, deletiert oder durch einen oder mehrere andere Aminosäurereste ersetzt sind und/oder ein oder mehrere Aminosäurereste, die das Analogon destabilisieren, außerhalb der Protease-Bindungsstelle hinzugefügt sind, mit Ausnahme solcher Aprotinin-Analoga, bei denen die Aminosäure in Position 1 oder die Aminosäuren in den Positionen 1 und 2 deletiert sind, Ile in Position 19 durch einen anderen natürlich vorkommenden Aminosäurerest ersetzt ist, Lys in Position 41 durch einen anderen natürlich vorkommenden Aminosäurerest ersetzt ist oder Arg in Position 42 durch Lys oder Ser ersetzt ist.
- Im vorliegenden Kontext soll der Ausdruck "reduzierte positive Nettoladung" Analoga mit einer niedrigeren positiven Nettoladung als natives Aprotinin (das eine positive Nettoladung von +6 hat) sowie ohne Nettoladung oder mit einer negativen Nettoladung umfassen. Es sei angemerkt, daß die Nettoladung von Aprotinin je nach pH-Wert variieren kann und daß die Ausdrücke "positive Nettoladung", "negative Nettoladung", "positiv geladen" oder "negativ geladen" für die Ladung des Moleküls bei einem neutralen pH-Wert gelten.
- Der Ausdruck "Protease-Bindungsstelle" soll die Aminosäurereste bezeichnen, die für die Protease-Hemmung wichtig sind, d.h. die Aminosäurereste, die sich durch Bindung an Aminosäurereste am oder nahe beim aktiven Zentrum des Enzyms in engem Kontakt mit der Protease befinden. Zur Zeit zählt man dazu (und im vorliegenden Kontext sind sie definiert als) die Aminosäurereste in Position 12-18 und 34-39 (vgl. H. Fritz und G. Wunderer, Arzneim.-Forsch. 33(1), 1983, S. 484). Vorzugsweise werden Aminosäurereste außerhalb der Protease-Bindungsstelle entfernt, insertiert oder ersetzt, nur um eine wesentliche Änderung des Protease-Inhibitionsprofils des Analogons der Erfindung im Vergleich zu dem von nativem Aprotinin zu vermeiden.
- Es wurde überraschenderweise gefunden, daß Aprotinin-Analoga mit einer reduzierten positiven Nettoladung eine erheblich geringere Nephrotoxizität aufweisen als natives Aprotinin. Ein Grund für die geringere Nephrotoxizität könnte sein, daß Aprotinin-Analoga mit einer niedrigeren positiven Nettoladung eine reduzierte Bindungsaffinität zur Oberfläche der proximalen Tubuli (Bürstensaummembran) haben, so daß sie in hohem Maße in den Urin ausgeschieden werden. Diese Erklärung steht im Einklang mit den Ergebnissen von H. Fritz et al., loc. cit., die berichten, daß chemisch modifizierte Aprotininderivate (Tetramaleoyl- und Pentamaleoylderivate), die weniger basisch sind als natives Aprotinin, nicht an eine isolierte Bürstensaumfraktion binden, sondern quantitativ in den Urin ausgeschieden werden.
- Andererseits unterscheidet sich das chemisch modifizierte Aprotinin dadurch stark von Aprotinin und anderen nativen Proteinen, daß es Derivate von Aminosäuren enthält, die man in natürlich vorkommenden Makromolekülen nicht findet. Man sollte daher die Möglichkeit nicht ausschließen, daß die fehlende Anhäufung der chemisch modifizierten Derivate in den Nieren anderen geänderten Eigenschaften der modifizierten Derivate als der reduzierten positiven Nettoladung zuzuschreiben ist.
- Von anderen Peptiden wurde gefunden, daß sie mit geringerer Affinität und Kapazität als Aprotinin an den Bürstensaum binden, obwohl sie positiv geladene Aminosäuren enthalten und/oder eine positive Nettoladung aufweisen. Dies deutet darauf hin, daß die positive Nettoladung von Aprotinin nicht die einzige Erklärung für die Bindung und Anhäufung von Aprotinin in den Zellen der proximalen Tubuli ist (M. Just et al., 1st Symp. Physiol., Prop. Pharmacol. Ration.: Kininogenases, Schattauer, Stuttgart 1973, S. 1163-1167).
- Weiterhin wurde überraschenderweise gefunden, daß sich Aprotinin-Analoga mit reduzierter thermischer Stabilität nicht im gleichen Maße in Nierengewebe anhäufen wie natives Aprotinin. Wie oben beschrieben, ist die dreidimensionale Anordnung von Aprotinin sehr kompakt, und man glaubt, daß der Inhibitor dadurch in hohem Maße stabil gegen Denaturierung und proteolytischen Abbau ist. Die Anhäufung von Aprotinin in den Nieren kann also auch ein Ergebnis der außergewöhnlichen Stabilität des Inhibitors sein. Es ist daher möglich, daß die Substitution von einem oder mehreren Aminosäureresten im Aprotininmolekül zur Bildung von Aprotinin-Analoga mit im Vergleich zu der des nativen Moleküls reduzierter Stabilität führt. Im vorliegenden Kontext kann "reduzierte Stabilität" für Auswahlzwecke als reduzierte thermische Stabilität des Analogons in wäßrigen Lösungen bei einem pH-Wert von etwa 4-10 ausgedrückt werden. Der in-vivo-Effekt einer solchen reduzierten Stabilität kann darin bestehen, daß das Analogon anfälliger für Abbau, z.B. proteolytischen Abbau, wird, was zu einer schnelleren Entfernung des Analogons aus den proximalen Tubuli führt.
- Man glaubt zur Zeit, daß die reduzierte Nephrotoxizität der Analoga der Erfindung auf einer Kombination einer reduzierten positiven Nettoladung und einer reduzierten Stabilität des Moleküls beruht.
- Eine Ursache, die zur Schädigung der Nieren durch die Verabreichung von nativem Aprotinin beiträgt, kann darin bestehen, daß sich Aprotinin aufgrund einer Affinität zu negativ geladenen Strukturen auf der Membranoberfläche an den Glomerulusmembranen anhäuft. Dies kann zu einer erweiterten Porengröße des Glomerulus und in der Folge zu einer erhöhten Permeabilität für größere Moleküle, z.B. Albumin, führen, was wiederum zu einer Proteinüberbelastung der Nieren führen kann. Wahrscheinlich hat das Aprotinin-Analogon der Erfindung deshalb eine geringere schädigende Wirkung auf die Porengröße der Glomerulusmembran als natives Aprotinin, weil es eine geringere Affinität zu negativ geladenen Strukturen auf dieser Membran hat.
- Weiterhin wurde in manchen Fällen beobachtet, daß die Verabreichung von Aprotinin zu einer anaphylactoiden Reaktion führt. Es wurde die Hypothese aufgestellt, daß diese anaphylactoide Reaktion mit der Freisetzung von Histamin zusammenhängt, die durch die positive Nettoladung von Aprotinin hervorgerufen worden sein kann. Daher hält man es für möglich, daß die anaphylactoide Reaktion, die vermutlich mit der Verabreichung von nativem Aprotinin einhergeht, durch die Verabreichung des Aprotinin-Analogons der Erfindung reduziert oder gar beseitigt werden kann.
- Gemäß der Erfindung könnte jeder der positiv geladenen Aminosäurereste außerhalb der Protease-Bindungsstelle durch einen der negativ geladenen Aminosäurereste Glu oder Asp oder durch einen der neutralen Aminosäurereste Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Glu, Ser, Thr, Val, Trp oder Tyr ersetzt werden. Um jedoch inaktive Analoga oder Analoga mit einer ungeeigneten dreidimensionalen Struktur, die von einer unerwünschten Faltung des Moleküls herrührt, zu vermeiden, werden vorzugsweise Substitutionen ausgewählt, die mit Aminosäureresten auf entsprechenden Positionen anderer Protease- Inhibitoren oder in Domänen größerer Strukturen, die einen hohen Grad der Homologie zu nativem Aprotinin aufweisen, identisch sind. Mit anderen Worten, die Auswahl von Aminosäureresten für die Substitution beruht vorzugsweise auf einer Analyse von Molekülen, die zu Aprotinin homolog sind. Es sei angemerkt, daß gleichzeitig mit der oder den Aminosäuresubstitutionen, die direkt zu einer Reduktion der positiven Nettoladung beitragen, noch eine oder mehrere andere Aminosäuresubstitutionen durchgeführt werden können, die nicht selbst zu einer positiven Nettoladung führen, die jedoch erforderlich sein können, um ein aktives Analogon mit einer geeigneten dreidimensionalen Struktur zu erzeugen.
- Dementsprechend bezieht sich die vorliegende Erfindung in einem spezielleren Aspekt auf ein Aprotinin-Analogon, das die allgemeine Formel I
- aufweist, wobei
- R¹ ein Dipeptid, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Arg-Pro, Glu-Pro, Asp-Pro, Ala-Pro, Ile-Pro, Thr-Pro, His-Pro, Leu-Pro, Gly-Pro und Ser-Pro besteht, Pro oder Wasserstoff ist,
- R² ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Tyr, Glu, Asp, Ser, Thr, Ala und Val besteht,
- R³ ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Arg, Glu, Asp, Leu, Ser, Ala, Gln und Thr besteht,
- R&sup4; ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Asn, Glu und Asp besteht,
- R&sup5; ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Lys, Glu, Asp, Thr, Val, Ala, Ser, Phe, Gln und Gly besteht,
- R&sup6; ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Gln, Glu, Asp, Val und Ala besteht,
- R&sup7; ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Ala, Asp, Glu und Gly besteht,
- R&sup8; ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Lys, Glu, Asp, Asn, Ser, Thr und Ala besteht,
- R&sup9; ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Arg, Glu, Asp, Ser, Asn, Leu, Gly, Gln, Met und Thr besteht,
- R¹&sup0; ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Asn, Glu und Asp besteht,
- R¹¹ ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Lys, Glu, Asp, Leu, Tyr, Ala, Val, Thr, Ser, Pro, His und Ile besteht, und
- R¹² ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Arg, Glu, Asp, Gln, Ala, Asn, His, Gly, Ser und Thr besteht,
- mit der Maßgabe, daß wenigstens einer der Aminosäurereste R¹- R¹² von dem entsprechenden Aminosäurerest des nativen Aprotinins verschieden ist und daß, wenn R¹ Wasserstoff ist, wenigstens einer der Aminosäurereste R²-R¹² von dem entsprechenden Aminosäurerest des nativen Aprotinins verschieden ist, außer daß R&sup9; nicht Ser ist, wenn R¹ Wasserstoff ist.
- Abgesehen von diesen internen Substitutionen im Aprotininmolekül ist es auch möglich, ein Peptid, das einen oder mehrere negativ geladene Aminosäurereste (d.h. Glu oder Asp) enthält, am N- oder C-Terminus des Aprotininmoleküls hinzuzufügen, um die erforderliche Reduktion der positiven Nettoladung zu erhalten. Es ist weiterhin möglich, einen oder mehrere neutrale Aminosäurereste am N- oder C-Terminus des Aprotininmoleküls hinzuzufügen, um eine Reduktion der Stabilität des Moleküls zu erhalten. Solche Additionen können entweder am nativen Aprotininmolekül oder zusätzlich zu anderen Modifikationen, wie sie oben angegeben sind, erfolgen.
- Wenn gewünscht wird, neben der Reduktion der Nephrotoxizität die Protease-hemmenden Eigenschaften des Aprotinin-Analogons zu verändern, ist es möglich, das Analogon zusätzlich in der Protease-Bindungsstelle zu modifizieren. Zum Beispiel wurde schon früher gezeigt (vgl. H.R. Wenzel und H. Tschesche, Angew. Chem. Internat. Ed. 20, 1981, S. 295), daß Aprotinin (1-58, Valis) eine relativ hohe Selektivität für Granulocyten- Elastase und eine inhibitorische Wirkung auf Collagenase aufweist, Aprotinin (1-58, Ala15) eine schwache Wirkung auf Elastase aufweist und Aprotinin (1-58, Gly15) eine ausgezeichnete Antitrypsin-Wirkung aufweist und überraschenderweise auch Kallikrein hemmt. Weiterhin ist es möglich, die inhibitorische Wirkung von Aprotinin gleichzeitig mit der Reduktion der positiven Nettoladung zu modifizieren, indem man eine oder mehrere positiv geladene Aminosäuren in der Protease- Bindungsstelle durch neutrale oder negativ geladene Aminosäuren ersetzt.
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich also weiterhin auf ein Aprotinin-Analogon, das neben der Modifikation außerhalb der Protease-Bindungsstelle noch durch Ersatz von einem oder mehreren Aminosäureresten in der Protease-Bindungsstelle durch einen bzw. mehrere andere Aminosäurereste modifiziert ist,
- mit Ausnahme solcher Aprotinin-Analoga, bei denen die Aminosäure in Position 1 oder die Aminosäuren in den Positionen 1 und 2 deletiert sind, Ile in Position 19 durch einen anderen natürlich vorkommenden Aminosäurerest ersetzt ist, Lys in Position 41 durch einen anderen natürlich vorkommenden Aminosäurerest ersetzt ist oder Arg in Position 42 durch Lys oder Ser ersetzt ist, und
- wobei Gly in Position 12 durch einen anderen natürlich vorkommenden Aminosäurerest ersetzt ist, Pro in Position 13 durch einen anderen natürlich vorkommenden Aminosäurerest ersetzt ist, Cys in Position 14 durch einen anderen natürlich vorkommenden Aminosäurerest ersetzt ist, Lys in Position 15 durch Arg, Val, Thr, Ile, Leu, Phe, Gly, Ser, Met, Trp, Tyr oder Ala ersetzt ist, Ala in Position 16 Gly ist, Arg in Position 17 durch einen anderen natürlich vorkommenden Aminosäurerest ersetzt ist, Ile in Position 18 durch Leu, Met, Val oder Phe ersetzt ist oder Cys in Position 38 durch einen anderen natürlich vorkommenden Aminosäurerest ersetzt ist.
- Insbesondere weist das Analogon die allgemeine Formel II
- auf, wobei R¹-R¹² wie oben definiert sind,
- R¹³ ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Lys, Arg, Glu, Leu, Met, Tyr und Phe besteht,
- R¹&sup4; ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Ala und Gly besteht,
- R¹&sup5; ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Arg, Ala, Gly, Lys, Leu, Met, Phe, Tyr, Ile und Asn besteht,
- R¹&sup6; ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Ile, Met, Leu, Phe, Thr und Glu besteht,
- R¹&sup7; ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Ile, Leu, Lys, Gln, Glu, Ser, Arg, Thr und Asn besteht,
- R¹&sup8; ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Val, Thr, Leu, Ser, Tyr, Gln, His, Pro, Phe, Asn, Ile und Lys besteht,
- R¹&sup9; ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Gly, Thr und Ser besteht, und
- R²&sup0; ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Gln, Lys, Met, Asn, Leu, Gly und Glu besteht,
- mit der Maßgabe, daß wenigstens einer der Aminosäurereste R¹- R¹² und wenigstens einer der Aminosäurereste R¹³-R²&sup0; von dem entsprechenden Aminosäurerest des nativen Aprotinins verschieden sind und daß, wenn R¹ Wasserstoff ist, R¹&sup5; nicht Ala ist, R¹&sup7; nicht Glu ist und R&sup9; nicht Ser ist und daß, wenn R¹&sup5; Ala ist, R&sup9; nicht Ser ist.
- Beispiele für zur Zeit favorisierte Aprotinin-Analoga der allgemeinen Formel (I) sind ein Analogon, bei dem R¹ Glu-Pro ist, R&sup5; Glu ist, R&sup8; Glu ist, R¹¹ Glu ist und R², R³, R&sup4;, R&sup6;, R&sup7;, R&sup9;, R¹&sup0; und R¹² wie in der nativen Aprotininsequenz sind; oder bei dem R¹ Glu-Pro ist, R&sup9; Glu ist, R¹¹ Glu ist und R², R³, R&sup4;, R&sup6;, R&sup7;, R&sup8;, R¹&sup0; und R¹² wie in der nativen Aprotininsequenz sind; oder bei dem R&sup9; Glu ist, R¹¹ Glu ist und R¹, R², R³, R&sup4;, R&sup5;, R&sup6;, R&sup7;, R&sup8;, R¹&sup0; und R¹² wie in der nativen Aprotininsequenz sind; oder bei dem R² Ser ist, R&sup4; Asp ist, R&sup5; Thr ist, R&sup6; Glu ist, R&sup8; Asn ist, R¹² Glu ist und R¹, R³, R&sup7;, R&sup9;, R¹&sup0; und R¹¹ wie in der nativen Aprotininsequenz sind; oder bei dem R² Ser ist, R³ Leu ist, R&sup7; Gly ist, R&sup8; Asn ist, R&sup9; Gly ist, R¹&sup0; Glu ist, R¹¹ Tyr ist und R¹, R&sup4;, R&sup5;, R&sup6; und R¹² wie in der nativen Aprotininsequenz sind; oder bei dem R¹ Wasserstoff ist, R&sup9; Ser ist, R¹¹ Glu ist und R², R³, R&sup4;, R&sup5;, R&sup6;, R&sup7;, R&sup8;, R¹&sup0; und R¹² wie in der nativen Aprotininsequenz sind; oder bei dem R¹ Wasserstoff ist, R&sup9; Ser ist, R¹¹ Ala ist und R², R³, R&sup4;, R&sup5;, R&sup6;, R&sup7;, R&sup8;, R¹&sup0; und R¹² wie in der nativen Aprotininsequenz sind; oder bei dem R¹ Wasserstoff ist, R² Ser ist, R&sup4; Asp ist, R&sup5; Thr ist, R&sup6; Glu ist, R&sup8; Asn ist, R¹² Glu ist und R³, R&sup7;, R&sup9;, R¹&sup0; und R¹¹ wie in der nativen Aprotininsequenz sind; oder bei dem R¹ Wasserstoff ist, R&sup4; Asp ist, R&sup5; Thr ist, R&sup6; Glu ist, R¹² Glu ist und R², R³, R&sup7;, R&sup8;, R&sup9;, R¹&sup0; und R¹¹ wie in der nativen Aprotininsequenz sind; oder bei dem R¹ Wasserstoff ist, R² Ser ist, R&sup7; Gly ist, R&sup8; Asn ist, R&sup9; Gly ist, R¹² Glu ist und R³, R&sup4;, R&sup5;, R&sup6;, R¹&sup0; und R¹¹ wie in der nativen Aprotininsequenz sind; oder bei dem R¹ Wasserstoff ist, R&sup9; Ser ist, R¹² Glu ist und R², R³, R&sup4;, R&sup5;, R&sup6;, R&sup7;, R&sup8;, R¹&sup0; und R¹¹ wie in der nativen Aprotininsequenz sind; oder bei dem R¹ Wasserstoff ist, R&sup9; Glu ist, R¹² Glu ist und R², R³, R&sup4;, R&sup5;, R&sup6;, R&sup7;, R&sup8;, R¹&sup0; und R¹¹ wie in der nativen Aprotininsequenz sind; oder bei dem R¹ Wasserstoff ist, R&sup5; Glu ist, R&sup9; Ser ist, R¹² Glu ist und R², R³, R&sup4;, R&sup6;, R&sup7;, R&sup8;, R¹&sup0; und R¹¹ wie in der nativen Aprotininsequenz sind; oder bei dem R¹ Wasserstoff ist, R&sup5; Glu ist, R&sup9; Glu ist, R¹² Glu ist und R², R³, R&sup4;, R&sup6;, R&sup7;, R&sup8;, R¹&sup0; und R¹¹ wie in der nativen Aprotininsequenz sind.
- In einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein DNA-Konstrukt, das ein Aprotinin-Analogon gemäß der Erfindung codiert. Das DNA-Konstrukt der Erfindung kann nach bewährten Standardverfahren synthetisch hergestellt werden, z.B. nach dem von S.L. Beaucage und M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1981, S. 1859-1869, beschriebenen Phosphoamidit-Verfahren oder dem von Matthes et al., EMBO Journal 3, 1984, S. 801-805, beschriebenen Verfahren. Gemäß dem Phosphoamidit-Verfahren werden Oligonucleotide synthetisiert, z.B. in einem automatischen DNA-Synthesizer, gereinigt, assoziiert, ligasiert und in geeigneten Vektoren kloniert.
- Alternativ dazu ist es möglich, genomische DNA oder cDNA zu verwenden, die für natives Aprotinin codiert (die z.B. erhalten wird, indem man eine genomische oder cDNA-Bibliothek unter Verwendung synthetischer Oligonucleotidsonden durchmustert) und die an einer oder mehreren Stellen modifiziert ist, die den Stellen entsprechen, an denen man Aminosäuresubstitutionen einzuführen wünscht, z.B. durch ortsspezifische Mutagenese unter Verwendung synthetischer Oligonucleotide, die die gewünschte Aminosäuresequenz codieren, für homologe Rekombination im Einklang mit wohlbekannten Verfahren.
- In noch einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf einen rekombinanten Expressionsvektor, der ein DNA-Konstrukt der Erfindung umfaßt. Bei dem rekombinanten Expressionsvektor kann es sich um jeden Vektor handeln, der bequem DNA-Rekombinationsverfahren unterzogen werden kann, und die Wahl des Vektors wird häufig von der Wirtszelle abhängen, in die er eingeführt werden soll. So kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor sein, d.h. ein Vektor, der als extrachromosomale Entität existiert, deren Replikation von der chromosomalen Replikation unabhängig ist, z.B. ein Plasmid. Alternativ dazu kann der Vektor ein solcher sein, der, wenn er in eine Wirtszelle eingeführt wird, in das Genom der Wirtszelle integriert und zusammen mit dem (den) Chromosom(en), in die er integriert wurde, repliziert wird.
- In dem Vektor sollte die DNA-Sequenz, die das Aprotinin- Analogon der Erfindung codiert, operabel mit einer geeigneten Promotorsequenz verbunden sein. Bei dem Promotor kann es sich um jede DNA-Sequenz handeln, die in der gewählten Wirtszelle Transcriptionsaktivität zeigt, und er kann von Genen abgeleitet sein, die Proteine codieren, die zur Wirtszelle entweder homolog oder heterolog sind. Beispiele für geeignete Promotoren zur Steuerung der Transcription der DNA, die das Aprotinin-Analogon der Erfindung codiert, in Säugerzellen sind der SV-40-Promotor (Subramani et al., Mol. Cell Biol. 1, 1981, S. 854-864), der MT-1-(Metallothionein-Gen)-Promotor (Palmiter et al., Science 222, 1983, S. 809-814) oder der späte Hauptpromotor des Adenovirus 2. Zu den geeigneten Promotoren für die Verwendung in Hefewirts zellen gehören Promotoren von Hefe-Glycolyse-Genen (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 1980, S. 12073-12080; Alber und Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1, 1982, S. 419-434) oder Alkohol-Dehydrogenase-Genen (Young et al., in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaender et al., Hrsg.), Plenum Press, New York, 1982), oder die Promotoren TPI1 (US 4,599,311) oder ADH2-4c (Russell et al., Nature 304, 1983, S. 652-654). Geeignete Promotoren für die Verwendung in Fadenpilzwirtszellen sind zum Beispiel der ADH3-Promotor (McKnight et al., The EMBO J. 4, 1985, S. 2093-2099) oder der tpiA- Promotor.
- Die DNA-Sequenz, die das Aprotinin-Analogon der Erfindung codiert, kann auch operabel mit einem geeigneten Terminator verbunden sein, wie dem Human-Wachstumshormon-Terminator (Palmiter et al., loc. cit.) oder (für Pilzwirte) den Promotoren TPI1 (Alber und Kawasaki, loc. cit.) oder ADH3 (McKnight et al., loc. cit.). Der Vektor kann weiterhin Elemente wie Polyadenylierungssignale (z.B. von SV 40 oder dem Elb-Bereich von Adenovirus 5), Transcriptions-Enhancersequenzen (z.B. den SV- 40-Enhancer) und Translations-Enhancersequenzen (z.B. diejenigen, die Adenovirus-VA-RNAs codieren) umfassen.
- Der rekombinante Expressionsvektor der Erfindung kann weiterhin eine DNA-Sequenz umfassen, die den Vektor in die Lage versetzt, sich in der fraglichen Wirtszelle zu replizieren. Beispiele für eine solche Sequenz sind (wenn die Wirtszelle eine Säugerzelle ist) der SV-40-Replikationsstartpunkt oder (wenn die Wirtszelle eine Hefezelle ist) die Replikationsgene REP 1-3 und der Replikationsstartpunkt des Hefeplasmids 2u. Der Vektor kann auch einen Selektionsmarker umfassen, z.B. ein Gen, dessen Produkt einen Defekt in der Wirtszelle ergänzt, wie das Gen, das für Dihydrofolat-Reduktase (DHFR) codiert, oder eines, das Resistenz gegenüber einem Wirkstoff, z.B. Neomycin, Hygromycin oder Methotrexat, vermittelt, oder das Schizosaccharomyces-pombe- TPI-Gen (beschrieben von P.R. Russell, Gene 40, 1985, S. 125- 130).
- Die Verfahren, die verwendet werden, um die DNA-Sequenzen, die für das Aprotinin-Analogon der Erfindung codieren, den Promotor und den Terminator zu ligasieren und sie in geeignete Vektoren einzusetzen, die die zur Replikation notwendige Information enthalten, sind dem Fachmann wohlbekannt (vgl. zum Beispiel Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
- Bei der Wirtszelle, in die der Expressionsvektor der Erfindung eingeführt wird, kann es sich um jede Zelle handeln, die in der Lage ist, das Aprotinin-Analogon der Erfindung zu erzeugen, und vorzugsweise handelt es sich um eine eukaryontische Zelle, wie eine Säuger-, Hefe- oder Pilzzelle.
- Bei dem als Wirtszelle gemäß der Erfindung verwendeten Hefeorganismus kann es sich um jeden Hefeorganismus handeln, der bei der Kultivierung große Mengen des Aprotinin-Analogons der Erfindung erzeugt. Beispiele für geeignete Hefeorganismen sind Stämme der Hefespezies Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe oder Saccharomyces uvarum. Die Transformation von Hefezellen kann zum Beispiel durch Protoplastenbildung und anschließende Transformation in an sich bekannter Weise durchgeführt werden.
- Beispiele für geeignete Säugerzellinien sind die Zellinien COS (ATCC CRL 1650), BHK (ATCC CRL 1632, ATCC CCL 10) oder CHO (ATCC CCL 61). Verfahren zum Transfizieren von Säugerzellen und zum Exprimieren von in die Zellen eingeführten DNA-Sequenzen sind z.B. beschrieben in Kaufman und Sharp, J. Mol. Biol. 159, 1982, S. 601-621; Southern und Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1, 1982, S. 327-341; Loyter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 1982, S. 422-426; Wigler et al., Cell 14, 1978, S. 725; Corsaro und Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 1981, S. 603; Graham und van der Eb, Virology 52, 1973, S. 456; und Neumann et al., EMBO J. 1, 1982, S. 841-845.
- Alternativ dazu können Pilzzellen als Wirtszellen der Erfindung verwendet werden. Beispiele für geeignete Pilzzellen sind Zellen von Fadenpilzen, z.B. Aspergillus spp. oder Neurospora spp., insbesondere Stämme von Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger. Die Verwendung von Aspergillus spp. für die Expression von Proteinen ist z.B. in EP 272 277 beschrieben.
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Verfahren zur Herstellung eines Aprotinin-Analogons gemäß der Erfindung, wobei das Verfahren das Kultivieren einer Zelle, wie sie oben beschrieben ist, unter Bedingungen, die der Expression des Aprotinin-Analogons förderlich sind, und das Gewinnen des resultierenden Analogons aus der Kultur umfaßt.
- Bei dem zum Kultivieren der Zellen verwendeten Medium kann es sich um jedes herkömmliche Medium handeln, das zum Züchten von Säugerzellen oder Hefeorganismen geeignet ist, je nach der gewählten Wirtszelle. Das Aprotinin-Analogon wird von den Wirtszellen in das Wachstumsmedium sezerniert und kann mit herkömmlichen Verfahren daraus gewonnen werden, einschließlich des Abtrennens der Zellen aus dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration, Ausfällen der Proteinkomponenten des Überstands oder Filtrats mit einem Salz, z.B. Ammoniumsulfat, Reinigung durch eine Vielzahl chromatographischer Verfahren, z.B. Ionenaustauschchromatographie oder Affinitätschromatographie oder dergleichen.
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Aprotinin-Analogon der Erfindung zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Arzneimittelhilfsstoff umfaßt. In der Zusammensetzung der Erfindung kann das Aprotinin-Analogon nach jedem der bewährten Verfahren zum Zubereiten pharmazeutischer Zusammensetzungen zubereitet werden, wie es z.B. in Remington's Pharmaceutical Sciences, 1985, beschrieben ist. Die Zusammensetzung kann typischerweise in einer Form vorliegen, die für die systemische Injektion oder Infusion geeignet ist, und kann als solche mit sterilem Wasser oder einer isotonischen Salzlösung oder Glucoselösung zubereitet werden.
- In noch einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung eines Aprotinin-Analogons der Erfindung zur Herstellung eines Medikaments mit im Vergleich zu nativem Aprotinin reduzierter Nephrotoxizität und/oder eines Medikaments, das beim Verabreichen zu einem reduzierten Auftreten anaphylactoider Reaktionen im Vergleich zu denen, die man mit nativem Aprotinin erhält, führt.
- Wie oben angemerkt, wurde gefunden, daß natives Aprotinin, das in Dosen verabreicht wird, die sich klinischen Dosen annähern, eine schädliche Wirkung auf die Nieren zeigt. Diese Wirkung kann auf die außergewöhnlich hohe Stabilität und relativ hohe positive Nettoladung des Aprotininmoleküls zurückzuführen sein. Das Aprotinin-Analogon der Erfindung wird daher als vorteilhaft für die Verwendung bei therapeutischen Anwendungen angesehen, die für natives Aprotinin vorgeschlagen werden, insbesondere solchen, die die Verwendung großer Aprotinindosen erfordern. Zu den therapeutischen Anwendungen, bei denen die Verwendung des Aprotinin-Analogons der Erfindung wegen seiner Hemmung von Human-Serin-Proteasen, z.B. Trypsin, Plasmin, Kallikrein, Elastase und Kathepsin G, angezeigt ist, gehören unter anderem akute Pancreatitis, Entzündung, Thrombocytopenie, Konservierung der Thrombocytenfunktion, Organkonservierung, Wundheilung, Schock (einschließlich Schocklunge) und Zustände, die hyperfibrinolytische Haemorrhagie beinhalten. Eine hohe Aprotinindosis ist während oder nach cardiopulmonalen Bypass-Operationen angezeigt; die geringere Nephrotoxizität des Aprotinin- Analogons der vorliegenden Erfindung ist daher für diese Anwendung und möglicherweise bei anderen Operationen, die mit einem (größeren) Blutverlust einhergehen, von besonderem Interesse; dies gilt auch für die möglicherweise reduzierte Gefahr des Hervorrufens einer anaphylactoiden Reaktion aufgrund der niedrigeren positiven Nettoladung des Analogons.
- Die Erfindung wird weiterhin anhand der folgenden Beispiele unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben, wobei
- Figur 1 den Aufbau eines synthetischen Aprotinin-Gens aus Oligonucleotidsequenzen zeigt;
- Figur 2 den Aufbau des Plasmids pKFN-1503 zeigt;
- Figur 3 eine Graphik ist, die die inhibitorische Wirkung in Urin und Nieren nach der Verabreichung von Aprotinin-Analoga mit unterschiedlichen Nettoladungen und unterschiedlicher thermischer Stabilität zeigt;
- Figur 4 die inhibitorische Wirkung in Urin 3 Stunden nach der Verabreichung von Aprotinin-Analoga mit unterschiedlichen Nettoladungen zeigt;
- Figur 5 die inhibitorische Wirkung in Nieren 3 Stunden nach der Verabreichung von Aprotinin-Analoga mit unterschiedlicher thermischer Stabilität zeigt; und
- Figur 6 die Akkumulation der inhibitorischen Wirkung in Nieren nach der Verabreichung von Aprotinin-Analoga mit unterschiedlicher thermischer Stabilität zeigt. Der Akkumulationsindex wird berechnet als inhibitorische Wirkung nach 3 Stunden, dividiert durch die inhibitorische Wirkung nach 1 Stunde.
- Die vorliegende Erfindung wird weiterhin anhand der folgenden Beispiele erläutert, die den beanspruchten Umfang der Erfindung keineswegs einschränken sollen.
- Ein synthetisches Gen, das für [Glu1, Glu26, Glu41, Glu46]- Aprotinin codiert, wurde durch Ligasierung aus 10 Oligonucleotiden aufgebaut. Die Oligonucleotide wurden mit einem automatischen DNA-Synthesizer mit Hilfe von Phosphoramiditchemie auf einem Glasträger mit kontrollierten Poren synthetisiert (Beaucage, S.L., und Caruthers, M.H., Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869).
- Die folgenden 10 Oligonucleotide wurden synthetisiert:
- Aus den obigen 10 Oligonucleotiden wurden 5 Duplexe A-E gebildet, wie es in Figur 1 gezeigt ist.
- Aus den entsprechenden Paaren von 5'-phosphorylierten Oligonucleotiden wurden durch 5 min Erhitzen auf 90ºC und anschließendes Abkühlen auf Raumtemperatur im Verlaufe von 75 min jeweils 20 pmol der Duplexe A-E gebildet. Die fünf Duplexe wurden miteinander gemischt und mit T&sub4;-DNA-Ligase behandelt. Das synthetische Gen wurde nach der Elektrophorese des Ligasierungsgemischs auf einem 2%igen Agarose-Gel als 203-bp-Bande isoliert. Das erhaltene synthetische Gen ist in Figur 1 gezeigt.
- Das synthetische Gen wurde mit einem 209-bp-EcoRI-NcoI-Fragment von pLaC212spx3 und mit dem 2,8-kb-EcoRI-XbaI-Fragment des Plasmids pTZ19R (Mead, D.A., Szczesna-Skorupa, E., und Kemper, B., Prot. Engin. 1 (1986), 67-74) ligasiert. Das Plasmid pLaC212spx3 ist in Beispiel 3 der Internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/DK88/00147 beschrieben.
- Das 209-bp-EcoRI-NcoI-Fragment von pLaC212spx3 codiert ein synthetisches Hefe-Leitpeptid.
- Das Ligasierungsgemisch wurde verwendet, um einen kompetenten E.-coli-Stamm (r&supmin;, m&spplus;) zu transformieren, wobei anhand der Ampicillin-Resistenz selektiert wurde. Die DNA-Sequenzierung (Sanger, F., Micklen, S., und Coulson, A.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467) zeigte, daß Plasmide aus den resultierenden Kolonien die korrekte DNA-Sequenz für [Glu1, Glu26, Glu41, Glu46]-Aprotinin enthielten.
- Ein Plasmid pKFN-1503 wurde für die weitere Verwendung ausgewählt. Der Aufbau des Plasmids pKFN-1503 ist in Figur 2 dargestellt.
- pKFN-1503 wurde mit EcoRI und XbaI gespalten, und das 412-bp- Fragment wurde mit dem 9,5-kb-NcoI-XbaI-Fragment von pMT636 und dem 1,4-kb-NcoI-EcoRI-Fragment von pMT636 ligasiert, was das Plasmid pKFN-1508 ergab, siehe Figur 3. Plasmid pMT636 ist in der Internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/DK88/00138 beschrieben.
- pMT636 ist ein E.-coli-S.-cerevisiae-Schaukelvektor, der das Schizosaccharomyces-pombe-TPI-Gen (POT) (Russell, P.R., Gene 40 (1985) 125-130), den S. -cerevisiae-Triosephosphat-Isomerase- Promotor- und -Terminator, TPIP und TPIT (Alber, T., und Kawasaki, G., J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 419-434), enthält. Das Plasmid pKFN-1508 enthält die folgende Sequenz:
- TPIP-LaC212spx3-Leitsignal (1-47)-GluArgLeuGluLysArg [Glu1, Glu26, Glu41, Glu46]-Aprotinin-TPIT, wobei das LaC212spx3- Leitsignal das synthetische Hefeleitsignal ist, das in der Internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/DK88/00147 beschrieben ist. Die DNA-Sequenz des 412-bp-EcoRI-XbaI-Fragments von pKFN- 1503 und pKFN-1508 ist im Sequenzlisting ID No. 1 gezeigt.
- Der S.-cerevisiae-Stamm MT663 (E2-7B XE11-36 a/α, Δtpi/Δtpi, pep 4-3/pep 4-3) wurde auf YPGal (1% Bacto-Hefeextrakt, 2% Bacto-Pepton, 2% Galactose, 1% Lactat) bis zu einer optischen Dichte von 0,6 bei 600 nm gezüchtet.
- 100 ml der Kultur wurden durch Zentrifugation geerntet, mit 10 ml Wasser gewaschen, erneut zentrifugiert und in 10 ml einer Lösung resuspendiert, die 1,2 M Sorbit, 25 mM Na&sub2;EDTA, pH = 8,0, und 6,7 mg/ml Dithiothreit enthielt. Die Suspension wurde 15 Minuten bei 30ºC inkubiert, zentrifugiert, und die Zellen wurden in 10 ml einer Lösung resuspendiert, die 1,2 M Sorbit, 10 mM Na&sub2;EDTA, 0,1 M Natriumcitrat, pH = 5,8, und 2 mg Novozym 234 enthielt. Die Suspension wurde 30 Minuten bei 30ºC inkubiert, die Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen, in 10 ml 1,2 M Sorbit und 10 ml CAS (1,2 M Sorbit, 10 mM CaCl&sub2;, 10 mM Tris-HCl (Tris = Tris(hydroxymethyl)aminomethan), pH = 7,5) gewaschen und in 2 ml CAS resuspendiert. Zur Transformation wurden 0,1 ml in CAS resuspendierte Zellen mit ungefähr 1 ug Plasmid pKFN-1508 gemischt und 15 Minuten bei Raumtemperatur gelassen. 1 ml einer Lösung (20% Polyethylenglycol 4000, 20 mM CaCl&sub2;, 10 mM CaCl&sub2;, 10 mM Tris-HCl, pH = 7,5) wurde hinzugefügt, und das Gemisch wurde weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur belassen. Das Gemisch wurde zentrifugiert, und das Sediment wurde in 0,1 ml SOS (1,2 M Sorbit, 33% v/v YPD, 6,7 mM CaCl&sub2;, 14 ug/ml Leucin) resuspendiert und 2 Stunden bei 30ºC inkubiert. Dann wurde die Suspension zentrifugiert, und das Sediment wurde in 0,5 ml 1,2 M Sorbit resuspendiert. Dann wurden 6 ml Top-Agar (das SC-Medium von Sherman et al. (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)), das 1,2 M Sorbit plus 2,5% Agar enthielt) bei 52ºC hinzugefügt, und die Suspension wurde auf Platten gegossen, die dasselbe Agar- verfestigte, Sorbit-haltige Medium enthielten.
- Nach 3 Tagen bei 30ºC wurden transformante Kolonien ausgesucht, erneut isoliert und zum Ansatz von Flüssigkulturen verwendet. Eine solche Transformante, KFN-1512, wurde für die weitere Charakterisierung ausgewählt.
- Der Hefestamm KFN-1512 wurde auf YPD-Medium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton (von Difco Laboratories) und 6% Glucose) gezüchtet. Eine 200-ml-Kultur des Stammes wurde bei 30ºC 3 Tage lang mit 250 U/min bis zu einer optischen Dichte von etwa 20 bei 600 nm geschüttelt. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand durch FPLC-Ionenaustauschchromatographie analysiert. Der Hefeüberstand wurde durch eine 0,22-um-Millex-GV-Filtereinheit filtriert, und 1 ml wurde auf eine MonoS-Kationenaustauschersäule (0,5 x 5 cm) aufgetragen, die mit 20 mM Ameisensäure, pH 3,7, äquilibriert worden war. Nach dem Waschen mit Äquilibrierungspuffer wurde die Säule mit einem linearen NaCl-Gradienten (0,1 M) in Äquilibrierungspuffer eluiert. Die Trypsin-Inhibitor-Aktivität wurde in den eluierten Fraktionen durch einen spektrophotometrischen Assay (Kassel, B., Methods Enzymol. 19 (1970), 844-852) und weiterhin durch Integration der Absorption bei 280 nm von E1%280 (Aprotinin) = 8,3 quantifiziert.
- Um Material für Toxikologieuntersuchungen zu erhalten, wurde der Hefestamm KFN-1512 in größerem Maßstab gezüchtet. Das Aprotinin-Analogon wurde durch eine Kombination von Ionenaustauschchromatographie und Umkehrphasen-HPLC gereinigt.
- Ein synthetisches Gen, das für [Glu1, Glu42, Glu46]-Aprotinin codiert, wurde durch Ligasierung aus 10 Oligonucleotiden aufgebaut, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.
- Das von pTZ19R abgeleitete Plasmid pKFN-1505, das das synthetische Gen enthielt, das im gleichen Leseraster mit einem synthetischen Hefeleitpeptid verknüpft war, wurde so aufgebaut, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.
- Durch Befolgen des Verfahrens von Beispiel 1 wurde ein Hefe- Expressionsplasmid pKFN-1510 erhalten, das den folgenden Aufbau enthielt: TPIP-LaC212spx3-Leitsignal (1-47)-GluArgLeuGluLysArg [Glu1, Glu42, Glu46]-Aprotinin-TPIT.
- Die DNA-Sequenz des 412-bp-EcoRI-XbaI-Fragments von pKFN-1505 und pKFN-1510 ist im Sequenzlisting ID No. 3 angegeben.
- Das Plasmid pKFN-1510 wurde wie oben beschrieben in den Hefestamm MT663 transformiert, was den Hefestamm KFN-1514 ergab.
- Kultivieren des transformierten Stammes KFN-1514 in YPD-Medium, Analyse auf [Glu1, Glu42, Glu46]-Aprotinin im Überstand und Herstellung von Material für toxikologische Untersuchungen wurden wie oben beschrieben durchgeführt.
- Das 144-bp-AvaII-XbaI-Fragment, das [Glu42, Glu46]-Aprotinin codiert, von pKFN-1505 wurde verwendet, um das entsprechende DNA-Fragment, das Aprotinin(12-58) codiert, im Plasmid pKFN- 1000 zu ersetzen, was das Plasmid pKFN-1528 ergab. Das Plasmid pKFN-1000 ist in Beispiel 4 der Internationalen Patentanmeldung Veröffentlichungs-Nr. WO 90/10075 beschrieben.
- Durch Befolgen des Verfahrens von Beispiel 1 wurde ein Hefe- Bxpressionsplasmid pKFN-1541 erhalten, das den folgenden Aufbau enthielt: TPIP-LaC212spx3-Leitsignal (1-47)-GluArgLeuGluLysArg [Glu42, Glu46]-Aprotinin-TPIT.
- Die DNA-Sequenz des 412-bp-EcoRI-XbaI-Fragments von pKFN-1528 und pKFN-1541 ist im Sequenzlisting ID No. 5 angegeben.
- Das Plasmid pKFN-1541 wurde wie oben beschrieben in den Hefestamm MT663 transformiert, was den Hefestamm KFN-1544 ergab.
- Kultivieren des transformierten Stammes KFN-1544 in YPD-Medium, Analyse auf [Glu42, Glu46]-Aprotinin im Überstand und Herstellung von Material für toxikologische Untersuchungen wurden wie oben beschrieben durchgeführt.
- Das synthetische Gen, das für [Ser10, Asp24, Thr26, Glu31, Asn41, Glu53]-Aprotinin codiert, wurde durch Ligasierung aus 10 Oligonucleotiden aufgebaut, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.
- Das von pTZ19R abgeleitete Plasmid pKFN-1530, das das synthetische Gen enthielt, das im gleichen Leseraster mit einer synthetischen Hefeleitpeptidsequenz verknüpft war, wurde so aufgebaut, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.
- Durch Befolgen des Verfahrens von Beispiel 1 wurde ein Hefe- Expressionsplasmid pKFN-1532 erhalten, das den folgenden Aufbau enthielt: TPIP-LaC212spx3-Leitsignal (1-47)-GluArgLeuGluLysArg- [Ser10, Asp24, Thr26, Glu31, Asn41, Glu52]-Aprotinin-TPIT.
- Die DNA-Sequenz des 412-bp-EcoRI-XbaI-Fragments von pKFN-1530 und pKFN-1532 ist im Sequenzlisting ID No. 7 angegeben.
- Das Plasmid pKFN-1532 wurde wie oben beschrieben in den Hefestamm MT663 transformiert, was den Hefestamm KFN-1545 ergab.
- Kultivieren des transformierten Stammes KFN-1545 in YPD-Medium, Analyse auf [Ser10, Asp24, Thr26, Glu31, Asn41, Glu53]- Aprotinin im Überstand und Herstellung von Material für toxikologische Untersuchungen wurden wie oben beschrieben durchgeführt.
- Das synthetische Gen, das für [Ser10, Leu20, Gly40, Asn41, Gly42, Gln44, Tyr46]-Aprotinin codiert, wurde durch Ligasierung aus 10 Oligonucleotiden aufgebaut, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.
- Das von pTZ19R abgeleitete Plasmid pKFN-1534, das das synthetische Gen enthielt, das im gleichen Leseraster mit einer synthetischen Hefeleitpeptidsequenz verknüpft war, wurde so aufgebaut, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.
- Durch Befolgen des Verfahrens von Beispiel 1 wurde ein Hefe- Expressionsplasmid pKFN-1537 erhalten, das den folgenden Aufbau enthielt: TPIP-LaC212spx3-Leitsignal (1-47)-GluArgLeuGluLysArg- [Ser10, Leu20, Gly40, Asn41, Gly42, Gln44, Tyr46]-Aprotinin- TPIT.
- Die DNA-Sequenz des 412-bp-EcoRI-XbaI-Fragments von pKFN-1534 und pKFN-1537 ist im Sequenzlisting ID No. 9 angegeben.
- Das Plasmid pKFN-1537 wurde wie oben beschrieben in den Hefestamm MT663 transformiert, was den Hefestamm KFN-1547 ergab.
- Kultivieren des transformierten Stammes KFN-1547 in YPD-Medium, Analyse auf [Ser10, Leu20, Gly40, Asn41, Gly42, Gln44, Tyr46]- Aprotinin im Überstand und Herstellung von Material für toxikologische Untersuchungen wurden wie oben beschrieben durchgeführt.
- Das 1,4-kb-AhaII-StyI-Fragment und das 1,8-kb-AhaII-SalI-Fragment, beide vom Plasmid pKFN-306, wurden mit einem Duplex ligasiert, der aus den folgenden beiden synthetischen Oligonucleotiden bestand:
- Das Plasmid pKFN-306 ist ein von pTZ19R abgeleitetes Plasmid mit einem 502-bp-EcoRI-XbaI-Einschub, der das Leitsignal-(1- 85)-Gen des Saccharomyces-cerevisiae-Paarungsfaktors α1 enthält, das im gleichen Leseraster mit einem synthetischen Gen für Des-Arg1,des-Pro2-[Ser42]-Aprotinin verknüpft ist. Der Aufbau des Plasmids pKFN-306 ist in WO 89/01968 beschrieben.
- Das Ligasierungsgemisch wurde verwendet, um einen kompetenten E.-coli-Stamm (r&supmin;, m&spplus;) zu transformieren, wobei anhand der Ampicillin-Resistenz selektiert wurde. Die DNA-Sequenzierung (Sanger, F., Micklen, S., und Coulson, A.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467) zeigte, daß Plasmide aus den resultierenden Kolonien die korrekte Sequenz für Des-Arg1,Pro2- [Ser42,Glu46]-Aprotinin enthielten.
- Ein Plasmid pKFN-1629 wurde für die weitere Verwendung ausgewählt.
- Durch Befolgen des Verfahrens von Beispiel 1 wurde ein Hefe- Expressionsplasmid pKFN-1656 erhalten, das den folgenden Aufbau enthielt: TPIP-MFα1-Leitsignal (1-85)-des-Arg1,des-Pro2-[Ser42, Glu46]-Aprotinin-TPIT.
- Die DNA-Sequenz des 502-bp-EcoRI-XbaI-Fragments von pKFN-1629 und pKFN-1656 ist im Sequenzlisting ID No. 11 angegeben.
- Das Plasmid pKFN-1656 wurde wie oben beschrieben in den Hefestamm MT663 transformiert, was den Hefestamm KFN-1660 ergab.
- Kultivieren des transformierten Stammes KFN-1660 in YPD-Medium, Analyse auf Des-Arg1,des-Pro2-[Ser42, Glu46]-Aprotinin im Überstand und Herstellung von Material für toxikologische Untersuchungen wurden wie oben beschrieben durchgeführt.
- Das 1,4-kb-AhaII-StyI-Fragment und das 1,8-kb-AhaII-SalI-Fragment, beide vom Plasmid pKFN-306, wurden mit einem Duplex ligasiert, der aus den folgenden beiden synthetischen Oligonucleotiden bestand:
- Das Plasmid pKFN-306 ist ein von pTZ19R abgeleitetes Plasmid mit einem 502-bp-EcoRI-XbaI-Einschub, der das Leitsignal-(1- 85)-Gen des Saccharomyces-cerevisiae-Paarungsfaktors α1 enthält, das im gleichen Leseraster mit einem synthetischen Gen für Des-Arg1,des-Pro2-[Ser42]-Aprotinin verknüpft ist. Der Aufbau des Plasmids pKFN-306 ist in WO 89/01968 beschrieben.
- Das Ligasierungsgemisch wurde verwendet, um einen kompetenten E.-coli-Stamm (r&supmin;, m&spplus;) zu transformieren, wobei anhand der Ampicillin-Resistenz selektiert wurde. Die DNA-Sequenzierung (Sanger, F., Micklen, S., und Coulson, A.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467) zeigte, daß Plasmide aus den resultierenden Kolonien die korrekte Sequenz für Des-Arg1,des- Pro2-[Ser42,Glu46]-Aprotinin enthielten.
- Ein Plasmid pKFN-1631 wurde für die weitere Verwendung ausgewählt.
- Durch Befolgen des Verfahrens von Beispiel 1 wurde ein Hefe- Expressionsplasmid pKFN-1657 erhalten, das den folgenden Aufbau enthielt: TPIP-MFα1-Leitsignal (1-85)-des-Arg1,des-Pro2-[Ser42, Ala46]-Aprotinin-TPIT.
- Die DNA-Sequenz des 502-bp-EcoRI-XbaI-Fragments von pKFN-1631 und pKFN-1657 ist im Sequenzlisting ID Wo. 13 angegeben.
- Das Plasmid pKFN-1657 wurde wie oben beschrieben in den Hefestamm MT663 transformiert, was den Hefestamm KFN-1661 ergab.
- Kultivieren des transformierten Stammes KFN-1661 in YPD-Medium, Analyse auf Des-Arg1,des-Pro2-[Ser42, Ala46]-Aprotinin im Überstand und Herstellung von Material für toxikologische Untersuchungen wurden wie oben beschrieben durchgeführt.
- Ein synthetisches Gen, das für Des-Arg1,des-Pro2-[Ser10, Asp24, Thr26, Glu31, Asn41, Glu53]-Aprotinin codiert, wurde durch Ligasierung aus 10 Oligonucleotiden aufgebaut, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.
- Das von pTZ19R abgeleitete Plasmid pKFN-1707, das das synthetische Gen enthielt, das im gleichen Leseraster mit einem synthetischen Hefeleitpeptid verknüpft war, wurde so aufgebaut, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.
- Durch Befolgen des Verfahrens von Beispiel 1 wurde ein Hefe- Expressionsplasmid pKFN-1709 erhalten, das den folgenden Aufbau enthielt: TPIP-LaC212spx3-Leitsignal (1-47)-GluArgLeuGluLysArg- des-Arg1,des-Pro2-[Ser10, Asp24, Thr26, Glu31, Asn41, Glu53]- Aprotinin-TPIT.
- Die DNA-Sequenz des 406-bp-EcoRI-XbaI-Fragments von pKFN-1707 und pKFN-1709 ist im Sequenzlisting ID No. 15 angegeben.
- Das Plasmid pKFN-1709 wurde wie oben beschrieben in den Hefestamm MT663 transformiert, was den Hefestamm KFN-1735 ergab.
- Kultivieren des transformierten Stammes KFN-1735 in YPD-Medium, Analyse auf Des-Arg1,des-Pro2-[Ser10, Asp24, Thr26, Glu31, Asn41, Glu53]-Aprotinin im Überstand und Herstellung von Material für toxikologische Untersuchungen wurden wie oben beschrieben durchgeführt.
- Das 1,8-kb-AhaII-XbaI-Fragment und das 1,4-kb-AhaII-AvaII-Fragment, beide vom Plasmid pKFN-306 (siehe Beispiel 5), wurden mit einem synthetischen 141-bp-AvaII-XbaI-Fragment ligasiert, das [Asp24, Thr26, Glu31, Glu53]-Aprotinin codierte.
- Das resultierende, von pTZ19R abgeleitete Plasmid war pKFN- 1711.
- Durch Befolgen des Verfahrens von Beispiel 1 wurde ein Hefe- Expressionsplasmid pKFN-1713 erhalten, das den folgenden Aufbau enthielt: TPIP-MFα1-Leitsignal (1-85)-des-Arg1,des-Pro2-[Asp24, Thr26, Glu31, Glu53]-Aprotinin-TPIT.
- Die DNA-Sequenz des 502-bp-EcoRI-XbaI-Fragments von pKFN-1711 und pKFN-1713 ist im Sequenzlisting ID No. 17 angegeben.
- Das Plasmid pKFN-1713 wurde wie oben beschrieben in den Hefestamm MT663 transformiert, was den Hefestamm KFN-1737 ergab.
- Kultivieren des transformierten Stammes KFN-1737 in YPD-Medium, Analyse auf Des-Arg1,des-Pro2-[Asp24, Thr26, Glu31, Glu53]- Aprotinin im Überstand und Herstellung von Material für toxikologische Untersuchungen wurden wie oben beschrieben durchgeführt.
- Ein synthetisches Gen, das für Des-Arg1,des-Pro2-[Ser10, Gly40, Asn41, Gly42, Glu53]-Aprotinin codiert, wurde durch Ligasierung aus 10 Oligonucleotiden aufgebaut, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.
- Das von pTZ19R abgeleitete Plasmid pKFN-1715, das das synthetische Gen enthielt, das im gleichen Leseraster mit einem synthetischen Hefeleitpeptid verknüpft war, wurde so aufgebaut, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.
- Durch Befolgen des Verfahrens von Beispiel 1 wurde ein Hefe- Expressionsplasmid pKFN-1718 erhalten, das den folgenden Aufbau enthielt: TPIP-LaC212spx3-Leitsignal (1-47)-GluArgLeuGluLysArg- des-Arg1,des-Pro2-[Ser10, Gly40, Asn41, Gly42, Glu53]-Aprotinin-TPIT.
- Die DNA-Sequenz des 406-bp-EcoRI-XbaI-Fragments von pKFN-1715 und pKFN-1718 ist im Sequenzlisting ID No. 19 angegeben.
- Das Plasmid pKFN-1718 wurde wie oben beschrieben in den Hefestamm MT663 transformiert, was den Hefestamm KFN-1739 ergab.
- Kultivieren des transformierten Stammes KFN-1739 in YPD-Medium, Analyse auf Des-Arg1,Pro2-[Ser10, Gly40, Asn41, Gly42, Glu53]- Aprotinin im Überstand und Herstellung von Material für toxikologische Untersuchungen wurden wie oben beschrieben durchgeführt.
- Das 1,8-kb-AhaII-XbaI-Fragment und das 1,4-kb-AhaII-AvaII-Fragment, beide vom Plasmid pKFN-306 (siehe Beispiel 5), wurden mit einem synthetischen 141-bp-AvaII-XbaI-Fragment ligasiert, das [Ser42, Glu53]-Aprotinin codierte.
- Das resultierende, von pTZ19R abgeleitete Plasmid war pKFN- 1721.
- Durch Befolgen des Verfahrens von Beispiel 1 wurde ein Hefe- Expressionsplasmid pKFN-1724 erhalten, das den folgenden Aufbau enthielt: TPIP-MFα1-Leitsignal (1-85)-des-Arg1,des-Pro2-[Ser42, Glu53]-Aprotinin-TPIT.
- Die DNA-Sequenz des 502-bp-EcoRI-XbaI-Fragments von pKFN-1721 und pKFN-1724 ist im Sequenzlisting ID No. 21 angegeben.
- Das Plasmid pKFN-1724 wurde wie oben beschrieben in den Hefestamm MT663 transformiert, was den Hefestamm KFN-1742 ergab.
- Kultivieren des transformierten Stammes KFN-1742 in YPD-Medium, Analyse auf Des-Arg1,des-Pro2-[Ser42, Glu53]-Aprotinin im Überstand und Herstellung von Material für toxikologische Untersuchungen wurden wie oben beschrieben durchgeführt.
- Das 1,8-kb-AhaII-XbaI-Fragment und das 1,4-kb-AhaII-AvaII-Fragment, beide vom Plasmid pKFN-306 (siehe Beispiel 5), wurden mit einem synthetischen 141-bp-AvaII-XbaI-Fragment ligasiert, das [Glu42, Glu53]-Aprotinin codierte.
- Das resultierende, von pTZ19R abgeleitete Plasmid war pKFN- 1762.
- Durch Befolgen des Verfahrens von Beispiel 1 wurde ein Hefe- Expressionsplasmid pKFN-1765 erhalten, das den folgenden Aufbau enthielt: TPIP-MFα1-Leitsignal (1-85)-des-Arg1,des-Pro2-[Glu42, Glu53]-Aprotinin-TPIT.
- Die DNA-Sequenz des 502-bp-EcoRI-XbaI-Fragments von pKFN-1762 und pKFN-1765 ist im Sequenzlisting ID No. 23 angegeben.
- Das Plasmid pKFN-1765 wurde wie oben beschrieben in den Hefestamm MT663 transformiert, was den Hefestamm KFN-1752 ergab.
- Kultivieren des transformierten Stammes KFN-1752 in YPD-Medium, Analyse auf Des-Arg1,des-Pro2-[Glu42, Glu53]-Aprotinin im Überstand und Herstellung von Material für toxikologische Untersuchungen wurden wie oben beschrieben durchgeführt.
- Das 1,8-kb-AhaII-XbaI-Fragment und das 1,4-kb-AhaII-AvaII-Fragment, beide vom Plasmid pKFN-306 (siehe Beispiel 5), wurden mit einem synthetischen 141-bp-AvaII-XbaI-Fragment ligasiert, das [Glu26, Ser42, Glu53]-Aprotinin codierte.
- Das resultierende, von pTZ19R abgeleitete Plasmid war pKFN- 1768.
- Durch Befolgen des Verfahrens von Beispiel 1 wurde ein Hefe- Expressionsplasmid pKFN-1770 erhalten, das den folgenden Aufbau enthielt: TPIP-MFα1-Leitsignal (1-85)-des-Arg1,des-Pro2-[Glu26, Ser42, Glu53]-Aprotinin-TPIT.
- Die DNA-Sequenz des 502-bp-EcoRI-XbaI-Fragments von pKFN-1768 und pKFN-1770 ist im Sequenzlisting ID No. 25 angegeben.
- Das Plasmid pKFN-1770 wurde wie oben beschrieben in den Hefestamm MT663 transformiert, was den Hefestamm KFN-1755 ergab.
- Kultivieren des transformierten Stammes KFN-1755 in YPD-Medium, Analyse auf Des-Arg1,des-Pro2-[Glu26, Ser42, Glu53]-Aprotinin im Überstand und Herstellung von Material für toxikologische Untersuchungen wurden wie oben beschrieben durchgeführt.
- Das 1,8-kb-AhaII-XbaI-Fragment und das 1,4-kb-AhaII-AvaII-Fragment, beide vom Plasmid pKFN-306 (siehe Beispiel 5), wurden mit einem synthetischen 141-bp-AvaII-XbaI-Fragment ligasiert, das [Glu26, Glu42, Glu53]-Aprotinin codierte.
- Das resultierende, von pTZ19R abgeleitete Plasmid war pKFN- 1771.
- Durch Befolgen des Verfahrens von Beispiel 1 wurde ein Hefe- Expressionsplasmid pKFN-1773 erhalten, das den folgenden Aufbau enthielt: TPIP-MFα1-Leitsignal (1-85)-des-Arg1,des-Pro2-[Glu26, Glu42, Glu53]-Aprotinin-TPIT.
- Die DNA-Sequenz des 502-bp-EcoRI-XbaI-Fragments von pKFN-1771 und pKFN-1773 ist im Sequenzlisting ID No. 27 angegeben.
- Das Plasmid pKFN-1773 wurde wie oben beschrieben in den Hefestamm MT663 transformiert, was den Hefestamm KFN-1756 ergab.
- Kultivieren des transformierten Stammes KFN-1756 in YPD-Medium, Analyse auf Des-Arg1,des-Pro2-[Glu26, Glu42, Glu53]-Aprotinin im Überstand und Herstellung von Material für toxikologische Untersuchungen wurden wie oben beschrieben durchgeführt.
- Die folgenden Aprotinin-Analoga mit einer im Vergleich zu rekombinantem Aprotinin (1-58) reduzierten positiven Nettoladung und reduzierten thermischen Stabilität wurden für die toxikologische Durchmusterung ausgewählt: KFN-1512, KFN-1514, KFN-1544, KFN-1545, KFN-1547, KFN-1660 und KFN-1661. Ihre Hauptmerkmale unter toxikologischen Gesichtspunkten sind in Tabelle 1 gezeigt. Zum Vergleich sind Daten für rekombinantes Aprotinin gezeigt. Die Denaturierungstemperatur ist als Maß für die biologische Stabilität angegeben. Tabelle 1. Allgemeine Informationen
- Am 1. Tag der Untersuchung jedes Analogons erhielten Gruppen von 2 männlichen und 2 weiblichen Ratten 33, 100, 300 oder 900 mg Analogon/kg Körpergewicht. Zwei ähnlich zusammengesetzte Kontrollgruppen erhielten physiologische Kochsalzlösung oder mit Salzsäure auf ungefähr pH 4,5 angesäuerte physiologische Kochsalzlösung. Die letztere Lösung diente als Träger. Das Dosisvolumen betrug in allen Fällen 10 ml/kg Körpergewicht. Die Ratten wurden 7 Tage lang beobachtet und am 8. Tag getötet. Bei der Autopsie wurden die Nieren gewogen und für die Histopathologie präpariert. Reaktionsvariablen sind in den Spaltenüberschriften von Tabelle 2 gezeigt.
- Die Ergebnisse der individuellen Untersuchungen sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Daten für rekombinantes Aprotinin sind zum Vergleich mit aufgenommen (Dosierung: 11-300 mg/kg). KFN- 1512 konnte nicht aufgelöst werden, wie es für die Verabreichung der höchsten Dosis (900 mg/kg) erforderlich wäre.
- Ein einziges Tier starb bei 900 mg KFN-1545/kg. Abgesehen davon traten keine Todesfälle auf.
- Nach der Verabreichung (300 mg/kg Körpergewicht) von KFN-1512, KFN-1544, KFN-1545 und KFN-1660 war keine histopathologische Veränderung der Nieren zu erkennen. Weiterhin war auch nach der Verabreichung von 900 mg KFN-1514, KFN-1547 und KFN-1661 pro kg Körpergewicht keine histopathologische Veränderung der Nieren zu erkennen. Alle Analoga hatten also no-toxic-effect- Konzentrationen in bezug auf histopathologische Veränderungen der Nieren von 300 mg/kg oder darüber, im Vergleich zu 11 mg/kg für Aprotinin.
- In bezug auf andere Reaktionsvariablen waren die Analoga äquivalent oder besser als Aprotinin. Tabelle 2. No-toxic-effect-Konzentrationen für verschiedene Reaktionsvariablen, mg/kg
- 1,2 höchste Dosis = 300 mg/kg
- ² niedrigste Dosis = 11 mg/kg
- Das Toxizitätsprofil von Aprotinin-Analoga, die anhand einer Durchmusterung nach intravenöser Einzeldosisverabreichung an Wistar-Ratten bewertet wurden, war im Vergleich zum Toxizitätsprofil von Aprotinin in variierendem Ausmaß verbessert. Alle Aprotinin-Analoga hatten no-effect-Konzentrationen in bezug auf Nephrotoxizität von 300 mg/kg oder mehr. KFN-1514 hatte eine Gesamt-no-toxic-effect-Konzentration von 900 mg/kg, was gleich der höchsten Dosis ist.
- Rekombinantes authentisches Aprotinin und die gemäß Beispiel 1-7 hergestellten Analoga wurden in 0,9%iger NaCl gelöst, so daß man ein Dosisvolumen von 1 ul/g Ratte erhielt. Die Konzentrationen der Injektionslösungen waren Kontrollen, die nach den im Abschnitt "Verfahren" angegebenen Verfahren analysiert wurden.
- Weibliche Wistar-Ratten mit einem Gewicht von 200-230 g wurden verwendet. Aprotinin und die Analoga wurden in zwei verschiedenen Modellen getestet: 1) anästhetisierten und 2) unanästhetisierten Ratten.
- Die Ratten wurden durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital-Natrium anästhetisiert. Die Halsschlagader und die Drosselvene wurden freigelegt, und mit Polyethylenkathetern (PE-50, Intramedic) wurden Kanülen angelegt. Der Halsschlagaderkatheter wurde zur Infusion von 3,8 ml 0,9%iger NaCl/h mit einem Perfusor (B. Braun) und einem Blutdruck-Meßwertwandler verbunden. Änderungen des Blutdrucks wurden unter Verwendung eines Bandschreibers (Kipp & Zonen, BD 9) aufgezeichnet. Die Analoga wurden als Bolusinjektionen innerhalb von 15 Sekunden durch den Drosselvenenkatheter verabreicht.
- Blutproben wurden 3, 10, 20, 40 und 60 Minuten nach der Verabreichung aus dem Halsschlagaderkatheter erhalten. Die Proben (0,45 ml) wurden in 3-ml-Reagenzgläsern, die 50 ul 0,13 M Natriumcitrat enthielten, aufgefangen und zentrifugiert. Das Plasma wurde bis zur Analyse bei -20ºC aufbewahrt. Sechzig Minuten nach der Verabreichung wurden die Ratten mit einer Überdosis von Pentobarbital-Natrium getötet, und die Nieren und die Leber wurden entnommen, gewogen und bei -80ºC aufbewahrt.
- Vor der Verabreichung von Analoga wurde eine orale Dosis von 2 ml destilliertem H&sub2;O gegeben. Die Analoga wurden intravenös als Bolusinjektionen in eine Schwanzvene gegeben, wobei ein intravenöser Katheter (Venflon 22 G, Viggo-Spectramed, Helsingborg, Schweden) verwendet wurde. Nach der Verabreichung wurden die Katheter mit 0,5 ml 0,9%iger NaCl durchgespült und entfernt. Ein Pflaster wurde an die Injektionsstelle angebracht, um ein Bluten aus dem Schwanz zu vermeiden.
- Dann wurde die Ratte in einen Stoffwechselkäfig gebracht, um den erzeugten Urin aufzufangen.
- Nach 3 Stunden wurde die Ratte durch Verabreichung von CO&sub2;/O&sub2; (9/1) in den Käfig getötet, und die Nieren und die Leber wurden entnommen und bis zur Analyse bei -80ºC aufbewahrt.
- Während der CO&sub2;-Verabreichung entleerte die Ratte die Harnblase, und nachdem die Ratte entfernt worden war, wurde der Stoffwechselkäfig mit 0,9%iger NaCl gespült, so daß man ein Gesamt-Urin-NaCl-Volumen von 25 ml erhielt.
- Eine Niere (ungefähr 1 g) und ungefähr 2 g Lebergewebe wurden in getrennte 10-ml-Kunststoffproberöhrchen gegeben, und 2 ml 0,9%ige NaCl wurden hinzugefügt. Die Gewebe wurden unter Verwendung eines High Intensity Ultrasonic Processor (Modell VC50, Solics & Materials Inc., Danbury, CT, USA) 5 min homogenisiert. Dann wurden die Nieren- und Leberhomogenisate mit Kochsalzlösung verdünnt, so daß man ein Gesamtvolumen von 10- 25 bzw. 4 ml erhielt.
- Die Konzentrationen von Aprotinin und Analoga in Plasma, Leberhomogenisaten und Injektionslösungen wurden photometrisch mit einem Cobas Fara II (Roche) gemessen. In Kürze: Plasma, Homogenisate oder Injektionslösungen wurden mit Säure einer Fällung unterzogen, um andere Kallikrein-Inhibitoren als Aprotinin zu entfernen. Die Kallikrein-hemmende Aktivität in der Probe wurde gemessen, indem man Kallikrein aus Schweine- Pancreas (Sigma K 3627) und das chromogene Substrat S2266 (Kabi) verwendete.
- Die Konzentrationen in Nierenhomogenisaten und Urin wurden nach demselben Verfahren gemessen, außer daß der Fällungsschritt weggelassen wurde, da die intrinsische Kallikrein- hemmende Aktivität in den verdünnten Homogenisaten und im Urin vernachlässigbar war.
- Für jedes Analogon in jedem Medium wurden getrennte Standardkurven verwendet.
- 14 Gruppen von anästhetisierten und 14 Gruppen von unanästhetisierten Ratten wurden untersucht. Eine Dosis von 1,56 umol (ungefähr 10 mg) Aprotinin oder Aprotinin-Analogon pro kg Körpergewicht wurde jeder Ratte verabreicht. Grunddaten von den 28 Gruppen sind in Tabelle III angegeben. Tabelle III
- BW: Körpergewicht (g). KW: Nierengewicht (g).
- LW: Lebergewicht (g). A: Modell anästhetisierte Ratte.
- U: Modell unanästhetisierte Ratte.
- Für die statistische Bewertung wurde Spearmans Rangsummenkorrelationstest verwendet. Tabelle 4. Aprotinin-Analoga: Gehalt an inhibitorischer Aktivität in Nieren und Urin nach intravenöser Verabreichung an Ratten
- ¹ Der Nierenakkumulationsindex ist berechnet als Gehalt an inhibitorischer Aktivität nach 3 Stunden, dividiert durch den Gehalt nach 1 Stunde.
- ² Messung durch Differential-Scanning-Kalorimetrie in 20 mM 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure, pH 5,5
- Der Gesamtgehalt in den Nieren (in % der Dosis) nach 1 und 3 Stunden und im Urin nach 3 h ist in Figur 3 und Tabelle IV gezeigt.
- Anscheinend wurden große Unterschiede zwischen den Analoga gefunden.
- Für Aprotinin betrug der Gehalt in Nieren 1 Stunde nach der Verabreichung ungefähr 20% der Dosis, während der Gehalt nach 3 Stunden auf mehr als 40% stieg. Die Ausscheidung von Aprotinin in den Urin war vernachlässigbar.
- Um zu bewerten, ob die Ausscheidung in den Urin nach 3 Stunden mit der Nettoladung der Analoga zusammenhing, wurde der Grad der Korrelation zwischen diesen Werten berechnet.
- Es wurde gefunden, daß der Gehalt in Urin stark mit den Nettoladungen der Analoga korreliert ist (vgl. Figur 4). Tabelle V
- Um die Stabilität der Analoga in Nierengewebe zu untersuchen, wurde eine Niere aus 14 anästhetisierten Ratten (eine aus jeder Gruppe) in zwei Stücke mit gleichem Gewicht geteilt. Ein Stück wurde bei 37ºC aufbewahrt, und das andere Stück bei 4ºC. Nach 4 Stunden wurden die Gewebe homogenisiert, und der Gehalt an Analoga wurde gemessen. Ein Stabilitätsindex war definiert als Gehalt in dem bei 37ºC aufbewahrten Stück, dividiert durch den Gehalt in dem bei 4ºC aufbewahrten Stück. Die Stabilitätsindices sind in Tabelle VI angegeben; es zeigt sich, daß rAprotinin, KFN 1514 und KFN 1544 anscheinend die stabilsten Verbindungen sind, z.B. im Vergleich zu KFN 1660, das instabiler zu sein scheint.
- Die Stabilität von Analoga wurde außerdem durch die Bestimmung ihrer Denaturierungstemperatur untersucht. Es wurde gefunden, daß die Denaturierungstemperaturen in hohem Maße mit dem Gehalt in Nierengewebe 3 Stunden nach der Verabreichung (Figur 5) und mit den Akkumulationsindices (Figur 6), jedoch nicht mit der Ausscheidung in den Urin korreliert waren.
- Diese Daten lassen vermuten, daß die Nettoladung für die Ausscheidung in den Urin von Bedeutung sein kann, aber für die Konzentration und Anhäufung in Nieren von geringerer Bedeutung ist. Andererseits scheint die Anhäufung in den Nieren mit der Denaturierungstemperatur und der Stabilität von Analoga in Nierengewebe zusammenzuhängen.
- Es ist jedoch wahrscheinlich, daß die 1 Stunde nach der Verabreichung gemessenen Konzentrationen in Nierengewebe aufgrund von Abbau oder Umverteilung verändert waren. Es ist also möglich, daß die z.B. 10 min nach der Verabreichung gemessenen Konzentrationen mit der Nettoladung korrelieren würden.
- Die folgenden Schlußfolgerungen wurden gezogen:
- 1) Alle getesteten Analoga wurden von den Nieren aufgenommen, aber in unterschiedlichem Ausmaß. Die Anhäufung in den Nieren schien mit der thermischen Stabilität und der Stabilität in Nierengewebe, aber nicht mit der Nettoladung der Moleküle zusammenzuhängen.
- 2) Die Ausscheidung in den Urin schien mit der Nettoladung der Analoga, aber nicht mit der Stabilität zusammenzuhängen.
- (i) Anmelder: Bjoern, Soeren Erik
- Norris, Kjeld
- Diness, Viggo
- Noerskov-Lauritsen, Leif
- Christensen, Niels Dyhr
- Bregengaard, Claus
- (ii) Titel der Erfindung: Aprotinin-Analoga
- (iii) Zahl der Sequenzen: 29
- (iv) Korrespondenzaddresse:
- (A) Adressat: Novo Nordisk A/S
- (B) Straße: Novo Allé
- (C) Stadt: Bagsvaerd
- (E) Land: Dänemark
- (F) ZIP: 2880
- (v) computerlesbare Form:
- (A) Typ des Mediums: Diskette
- (B) Computer: IBM-PC-kompatibel
- (C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
- (D) Software: PatentIn Ausgabe #1,0, Version #1,25
- (vi) aktuelle Anmeldungsdaten:
- (A) Anmeldungsnummer:
- (B) Einreichungsdatum:
- (C) Klassifizierung
- (vii) frühere Anmeldungsdaten:
- (A) Anmeldungsnummer: DK 2361/90
- (B) Einreichungsdatum: 1. Okt. 1990
- (vii) frühere Anmeldungsdaten:
- (A) Anmeldungsnummer: DK 1118/91
- (B) Einreichungsdatum: 12. Juni 1991
- (viii) Informationen über Anwalt/Vertreter
- (A) Name: Thalsoe-Madsen, Birgit
- (C) Zeichen/Aktennummer: 3465.204-WO
- (ix) Informationen über Telekommunikation:
- (A) Telefon: (212) 867-0123
- (B) Telefax: (212) 867-0298
- (C) Telex:
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge: 418 Basenpaare
- (B) Typ: Nucleinsäure
- (C) Strangform: Einzelstrang
- (D) Topologie: linear
- (ii) Molekültyp: cDNA
- (vi) ursprüngliche Herkunft:
- (A) Organismus: synthetisch
- (ix) Merkmal:
- (A) Name/Schlüssel: CDS
- (B) Ort: 77..409
- (ix) Merkmal:
- (A) Name/Schlüssel: sig_Peptid
- (B) Ort: 77..235
- (ix) Merkmal:
- (A) Name/Schlüssel: mat_Peptid
- (B) Ort: 236..409
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 1:
- (1) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge: 111 Aminosäuren
- (B) Typ: Aminosäure
- (D) Topologie: linear
- (ii) Molekültyp: Protein
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 2:
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge: 418 Basenpaare
- (B) Typ: Nucleinsäure
- (C) Strangform: Einzelstrang
- (D) Topologie: linear
- (ii) Molekültyp: cDNA
- (vi) ursprüngliche Herkunft:
- (A) Organismus: synthetisch
- (ix) Merkmal:
- (A) Name/Schlüssel: CDS
- (B) Ort: 77..409
- (ix) Merkmal:
- (A) Name/Schlüssel: sig_Peptid
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Claims (27)
1. Aprotinin-Analogon, wobei, um eine reduzierte positive
Nettoladung zu erhalten, wenigstens ein positiv geladener
Aminosäurerest außerhalb der Protease-Bindungsstelle
entfernt oder durch einen neutralen oder negativ geladenen
Aminosäurerest ersetzt ist und/oder wobei wenigstens ein
negativ geladener Aminosäurerest insertiert oder
hinzugefügt ist und/oder wobei wenigstens ein neutraler
Aminosäurerest durch einen negativ geladenen Aminosäurerest
ersetzt ist und/oder wobei, um eine reduzierte thermische
Stabilität des Analogons in wäßrigen Lösungen bei einem
pH-Wert von etwa 4-10 zu erhalten, ein oder mehrere
Aminosäurereste außerhalb der Protease-Bindungsstelle, die
an der Stabilisierung des Analogons beteiligt sind,
deletiert oder durch einen oder mehrere andere
Aminosäurereste ersetzt sind und/oder ein oder mehrere
Aminosäurereste, die das Analogon destabilisieren, außerhalb der
Protease-Bindungsstelle hinzugefügt sind,
mit Ausnahme solcher Aprotinin-Analoga, bei denen die
Aminosäure in Position 1 oder die Aminosäuren in den
Positionen 1 und 2 deletiert sind, Ile in Position 19 durch
einen anderen natürlich vorkommenden Aminosäurerest
ersetzt ist, Lys in Position 41 durch einen anderen
natürlich vorkommenden Aminosäurerest ersetzt ist oder Arg in
Position 42 durch Lys oder Ser ersetzt ist.
2. Aprotinin-Analogon gemäß Anspruch 1, das die allgemeine
Formel I
aufweist, wobei
R¹ ein Dipeptid, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die
aus Arg-Pro, Glu-Pro, Asp-Pro, Ala-Pro, Ile-Pro, Thr-Pro,
His-Pro, Leu-Pro, Gly-Pro und Ser-Pro besteht, Pro oder
Wasserstoff ist,
R²
ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt
ist, die aus Tyr, Glu, Asp, Ser, Thr, Ala und Val
besteht,
R³ ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt
ist, die aus Arg, Glu, Asp, Leu, Ser, Ala, Gln und Thr
besteht,
R&sup4; ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt
ist, die aus Asn, Glu und Asp besteht,
R&sup5; ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt
ist, die aus Lys, Glu, Asp, Thr, Val, Ala, Ser, Phe, Gln
und Gly besteht,
R&sup6; ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt
ist, die aus Gln, Glu, Asp, Val und Ala besteht,
R&sup7; ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt
ist, die aus Ala, Asp, Glu und Gly besteht,
R&sup8; ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt
ist, die aus Lys, Glu, Asp, Asn, Ser, Thr und Ala
besteht,
R&sup9; ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt
ist, die aus Arg, Glu, Asp, Ser, Asn, Leu, Gly, Gln, Met
und Thr besteht,
R¹&sup0; ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt
ist, die aus Asn, Glu und Asp besteht,
R¹¹ ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt
ist, die aus Lys, Glu, Asp, Leu, Tyr, Ala, Val, Thr, Ser,
Pro, His und Ile besteht, und
R¹² ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt
ist, die aus Arg, Glu, Asp, Gln, Ala, Asn, His, Gly, Ser
und Thr besteht,
mit der Maßgabe, daß wenigstens einer der Aminosäurereste
R¹-R¹² von dem entsprechenden Aminosäurerest des nativen
Aprotinins verschieden ist und daß, wenn R¹ Wasserstoff
ist, wenigstens einer der Aminosäurereste R²-R¹² von dem
entsprechenden Aminosäurerest des nativen Aprotinins
verschieden ist, außer daß R&sup9; nicht Ser ist, wenn R¹
Wasserstoff ist.
3. Aprotinin-Analogon gemäß Anspruch 1, wobei ein Peptid,
das im wesentlichen aus einem oder mehreren negativ
geladenen oder neutralen Aminosäureresten besteht, am
N-Terminus des Aprotininmoleküls hinzugefügt ist.
4. Aprotinin-Analogon gemäß Anspruch 1, wobei ein Peptid,
das im wesentlichen aus einem oder mehreren negativ
geladenen oder neutralen Aminosäureresten besteht, am
C-Terminus des Aprotininmoleküls hinzugefügt ist.
5. Aprotinin-Analogon gemäß einem der vorstehenden
Ansprüche, das neben der Modifikation außerhalb der Protease-
Bindungsstelle noch durch Ersatz von einem oder mehreren
Aminosäureresten in der Protease-Bindungsstelle durch
einen bzw. mehrere andere Aminosäurereste modifiziert ist,
mit Ausnahme solcher Aprotinin-Analoga, bei denen die
Aminosäure in Position 1 oder die Aminosäuren in den
Positionen 1 und 2 deletiert sind, Ile in Position 19 durch
einen anderen natürlich vorkommenden Aminosäurerest
ersetzt ist, Lys in Position 41 durch einen anderen
natürlich vorkommenden Aminosäurerest ersetzt ist oder Arg in
Position 42 durch Lys oder Ser ersetzt ist, und
wobei Gly in Position 12 durch einen anderen natürlich
vorkommenden Aminosäurerest ersetzt ist, Pro in Position
13 durch einen anderen natürlich vorkommenden
Aminosäurerest ersetzt ist, Cys in Position 14 durch einen anderen
natürlich vorkommenden Aminosäurerest ersetzt ist, Lys in
Position 15 durch Arg, Val, Thr, Ile, Leu, Phe, Gly, Ser,
Met, Trp, Tyr oder Ala ersetzt ist, Ala in Position 16
Gly ist, Arg in Position 17 durch einen anderen natürlich
vorkommenden Aminosäurerest ersetzt ist, Ile in Position
18 durch Leu, Met, Val oder Phe ersetzt ist oder Cys in
Position 38 durch einen anderen natürlich vorkommenden
Aminosäurerest ersetzt ist.
6. Aprotinin-Analogon gemäß Anspruch 5, das die allgemeine
Formel II
aufweist, wobei R¹-R¹² wie in Anspruch 2 definiert sind,
R¹³ ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt
ist, die aus Lys, Arg, Glu, Leu, Met, Tyr und Phe
besteht,
R¹&sup4; ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt
ist, die aus Ala und Gly besteht,
R¹&sup5; ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt
ist, die aus Arg, Ala, Gly, Lys, Leu, Met, Phe, Tyr, Ile
und Asn besteht,
R¹&sup6; ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt
ist, die aus Ile, Met, Leu, Phe, Thr und Glu besteht,
R¹&sup7; ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt
ist, die aus Ile, Leu, Lys, Gln, Glu, Ser, Arg, Thr und
Asn besteht,
R¹&sup8; ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt
ist, die aus Val, Thr, Leu, Ser, Tyr, Gln, His, Pro, Phe,
Asn, Ile und Lys besteht,
R¹&sup9; ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt
ist, die aus Gly, Thr und Ser besteht, und
R²&sup0; ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt
ist, die aus Gln, Lys, Met, Asn, Leu, Gly und Glu
besteht,
mit der Maßgabe, daß wenigstens einer der Aminosäurereste
R¹-R¹² und wenigstens einer der Aminosäurereste R¹³-R²&sup0; von
dem entsprechenden Aminosäurerest des nativen Aprotinins
verschieden sind und daß, wenn R¹ Wasserstoff ist, R¹&sup5;
nicht Ala ist, R¹&sup7; nicht Glu ist und R&sup9; nicht Ser ist und
daß, wenn R¹&sup5; Ala ist, R&sup9; nicht Ser ist.
7. Aprotinin-Analogon gemäß Anspruch 2, wobei R¹ Glu-Pro
ist, R&sup5; Glu ist, R&sup8; Glu ist, R¹¹ Glu ist und R², R³, R&sup4;,
R&sup6;, R&sup7;, R&sup9;, R¹&sup0; und R¹² wie in der nativen Aprotininsequenz
sind.
8. Aprotinin-Analogon gemäß Anspruch 2, wobei R¹ Glu-Pro
ist, R&sup9; Glu ist, R¹¹ Glu ist und R², R³, R&sup4;, R&sup6;, R&sup7;, R&sup8;,
R¹&sup0; und R¹² wie in der nativen Aprotininsequenz sind.
9. Aprotinin-Analogon gemäß Anspruch 2, wobei R&sup9; Glu ist, R¹¹
Glu ist und R¹, R², R³, R&sup4;, R&sup5;, R&sup6;, R&sup7;, R&sup8;, R¹&sup0; und R¹² wie
in der nativen Aprotininsequenz sind.
10. Aprotinin-Analogon gemäß Anspruch 2, wobei R² Ser ist, R&sup4;
Asp ist, R&sup5; Thr ist, R&sup6; Glu ist, R&sup8; Asn ist, R¹² Glu ist
und R¹, R³, R&sup7;, R&sup9;, R¹&sup0; und R¹¹ wie in der nativen
Aprotininsequenz sind.
11. Aprotinin-Analogon gemäß Anspruch 2, wobei R² Ser ist, R³
Leu ist, R&sup7; Gly ist, R&sup8; Asn ist, R&sup9; Gly ist, R¹&sup0; Glu ist,
R¹¹ Tyr ist und R¹, R&sup4;, R&sup5;, R&sup6; und R¹² wie in der nativen
Aprotininsequenz sind.
12. Aprotinin-Analogon gemäß Anspruch 2, wobei R¹ Wasserstoff
ist, R&sup9; Ser ist, R¹¹ Glu ist und R², R³, R&sup4;, R&sup5;, R&sup6;, R&sup7;,
R&sup8;, R¹&sup0; und R¹² wie in der nativen Aprotininsequenz sind.
13. Aprotinin-Analogon gemäß Anspruch 2, wobei R¹ Wasserstoff
ist, R&sup9; Ser ist, R¹¹ Ala ist und R², R³, R&sup4;, R&sup5;, R&sup6;, R&sup7;,
R&sup8;, R¹&sup0; und R¹² wie in der nativen Aprotininsequenz sind.
14. Aprotinin-Analogon gemäß Anspruch 2, wobei R¹ Wasserstoff
ist, R² Ser ist, R&sup4; Asp ist, R&sup5; Thr ist, R&sup6; Glu ist, R&sup8;
Asn ist, R¹² Glu ist und R³, R&sup7;, R&sup9;, R¹&sup0; und R¹¹ wie in der
nativen Aprotininsequenz sind.
15. Aprotinin-Analogon gemäß Anspruch 2, wobei R¹ Wasserstoff
ist, R&sup4; Asp ist, R&sup5; Thr ist, R&sup6; Glu ist, R¹² Glu ist und
R², R³, R&sup7;, R&sup8;, R&sup9;, R¹&sup0; und R¹¹ wie in der nativen
Aprotininsequenz sind.
16. Aprotinin-Analogon gemäß Anspruch 2, wobei R¹ Wasserstoff
ist, R² Ser ist, R&sup7; Gly ist, R&sup8; Asn ist, R&sup9; Gly ist, R¹²
Glu ist und R³, R&sup4;, R&sup5;, R&sup6;, R¹&sup0; und R¹¹ wie in der nativen
Aprotininsequenz sind.
17. Aprotinin-Analogon gemäß Anspruch 2, wobei R¹ Wasserstoff
ist, R&sup9; Ser ist, R¹² Glu ist und R², R³, R&sup4;, R&sup5;, R&sup6;, R&sup7;,
R&sup8;, R¹&sup0; und R¹¹ wie in der nativen Aprotininsequenz sind.
18. Aprotinin-Analogon gemäß Anspruch 2, wobei R¹ Wasserstoff
ist, R&sup9; Glu ist, R¹² Glu ist und R², R³, R&sup4;, R&sup5;, R&sup6;, R&sup7;,
R&sup8;, R¹&sup0; und R¹¹ wie in der nativen Aprotininsequenz sind.
19. Aprotinin-Analogon gemäß Anspruch 2, wobei R¹ Wasserstoff
ist, R&sup5; Glu ist, R&sup9; Ser ist, R¹² Glu ist und R², R³, R&sup4;,
R&sup6;, R&sup7;, R&sup8;, R¹&sup0; und R¹¹ wie in der nativen Aprotininsequenz
sind.
20. Aprotinin-Analogon gemäß Anspruch 2, wobei R¹ Wasserstoff
ist, R&sup5; Glu ist, R&sup9; Glu ist, R¹² Glu ist und R², R³, R&sup4;,
R&sup6;, R&sup7;, R&sup8;, R¹&sup0; und R¹¹ wie in der nativen Aprotininsequenz
sind.
21. DNA-Konstrukt, das eine DNA-Sequenz umfaßt, die ein
Aprotinin-Analogon gemäß einem der Ansprüche 1 bis 20
codiert.
22. Rekombinanter Expressionsvektor, der ein DNA-Konstrukt
gemäß Anspruch 21 umfaßt.
23. Zelle, die einen Expressionsvektor gemäß Anspruch 22
enthält.
24. Verfahren zur Herstellung eines Aprotinin-Analogons gemäß
einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei eine Zelle gemäß
Anspruch 23 unter Bedingungen kultiviert wird, die der
Expression des Aprotinin-Analogons förderlich sind, und das
resultierende Analogon aus der Kultur gewonnen wird.
25. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Aprotinin-
Analogon gemäß einem der Ansprüche 1 bis 20 zusammen mit
einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder
Verdünnungsmittel umfaßt.
26. Verwendung eines Aprotinin-Analogons gemäß einem der
Ansprüche 1 bis 20 zur Herstellung eines Medikaments mit
im Vergleich zu nativem Aprotinin reduzierter
Nephrotoxizität.
27. Verwendung eines Aprotinin-Analogons gemäß einem der
Ansprüche 1 bis 20 zur Herstellung eines Medikaments, das
beim Verabreichen zu einem reduzierten Auftreten
anaphylactoider Reaktionen im Vergleich zu denen, die man mit
nativem Aprotinin erhält, führt.
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