JP3126975B2 - プロテイナーゼ阻害因子、それらの調製方法およびそれらを含有する薬物 - Google Patents

プロテイナーゼ阻害因子、それらの調製方法およびそれらを含有する薬物

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒトのビクニン（bikunin）の阻害活性を
有するドメインに基づくペプチド変異型（すなわち、イ
ンタ−α−トリプシン阻害因子の阻害活性を有する成
分、または尿トリプシン阻害因子）、微生物（バクテリ
ア、下等真核生物）を使用する遺伝子操作の方法により
前記ペプチドを調製する方法、ならびにこれらのペプチ
ド変異型を含有する薬物に関する。これらの変異型は、
セリンプロテアーゼ、例えば、膵臓および顆粒球エラス
ターゼ、カテプシンＧまたは血漿カリクレインを阻害す
るそれらの能力により特徴づけられる。
プロテアーゼは細胞外空間に到達すると、効力のある
内因性プロテイナーゼ、例えば、α１−プロテイナーゼ
阻害因子により通常急速に捕捉される（Travis ＆ Sa
lvessen、Ann.Rev.Biochem.52、655、1983）。ある場合
において、この保護機構は働かないか、あるいは少なく
とも適切に働かず、結局重大な病理学的状態、例えば、
なかでも、気腫、敗血症性ショック、ショック肺、ARD
S、慢性関節リウマチ、凝固疾患、腎臓および肝臓の不
全の発生であることができる。特定の作用をもつプロテ
イナーゼ阻害因子は、効力のある治療剤としてこれに関
して特別に重要である。ヒトにおける使用のため特に重
要であるプロテイナーゼ阻害因子は、自然ヒト阻害因子
に類似するアミノ酸配列を有する。これは、とくに、長
期間の治療、例えば、毒性またはアレルギー性副作用を
予防するためのα１−プロテイナーゼ欠損（気腫の発
生）の処置適用される。
α１−プロテイナーゼ阻害因子は好中球性エラスター
ゼであり、その細胞外阻害は炎症の事象において主な目
的であるが、それはいくつかの理由で治療学的使用に最
適には適さない。53,000dのその比較的高い分子は、非
生理学的に大きい重量の使用を必要とする。要求される
量は遺伝子操作の手段により得ることができるが、生理
学的方法においてグリコシル化されない組み換えタンパ
ク質の循環において生物学的寿命が減少するので、なお
より大きい量の阻害因子を使用することは必要であろう
［マテソン（Mathesen）ら、ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、261、104
0、1986］。いずれの場合においても、阻害因子はタン
パク質分解および酸化を受け易いと見なされる。
両者の性質は、さらに、活性種の濃度を減少する。酸
化を受け易さは、遺伝子操作手段により、阻害因子の反
応性中心におけるメチオニン残基（P1位置）を、例え
ば、ロイシンで置換することによって排除することがで
きるであろう［マクコートネイ（McCourtney）ら、ネイ
チャー（Nature）、313、1985］。
本発明の目的は、例えば、ヒトの病気の処置のための
明確により低い分子量を有するヒト白血球エラスター
ゼ、カテプシンＧまたは血漿カリクレインに対するプロ
テイナーゼ阻害因子を開発することである。これに関し
て、この目的は、現在知られているヒト阻害因子の修飾
により所望の阻害スペクトルを有するようにプロテイナ
ーゼ阻害因を調整することができるどうかを検査するこ
とであった。このための適当な基本的分子として、ヒト
インター−α−トリプシンITI（Schreitmller et a
l.、Biol.Chem.Hoppe−Seyler、368、1987;Gebhard et
al.、Biol.Chem.Hoppe−Seyler、369S、1988;Gebhard
et al.、FEBS 1ETT.229、63、1988;Gebhard et a
l.、Eur.J.Biochem.、印刷中）、これは以後ビクニンと
呼ぶ（第１図）、ならびに血清（STI）および尿（UTI）
中の同一構造のクニッツ（Kunitz）型トリプシン阻害因
子［わずかのアミノ酸残基の置換によりこれらの阻害因
子の自然阻害スペクトルを特異的に変更することができ
た場合（第１図）］の阻害活性を有するサブユニットを
考えることができるであろう。それらは単一の遺伝子の
一次翻訳産生物のタンパク質分解的成熟の結果であり
（Kaumeyer et al.、Nucleic Acids Research、1
4、7839、1986）そしてトリプシンにより排除すること
ができるＮ末端ペプチド（アミノ酸残基１〜21）および
２つの連続の構造的に関係するドメイン（ドメイン１は
Ｎ末端ドメインであり、アミノ酸残基22〜77として定義
され、そしてドメイン２はタンパク質のＣ末端部分であ
り、アミノ酸残基78〜147として定義される）から成
り、そしてこれらは、また、トリプシンの処理により単
一に得ることができる。両者のドメインは異なる特異性
のプロテイナーゼ阻害活性を有する（Gebhard ＆ Hoc
hstraβer、プロテイナーゼ阻害因（Proteinase Inhit
ors）、Barrett ＆ salvesen編、Elsevier、1986、p.
375）。
特定の生理学的状態に依存して、急性期のタンパク質
ビクニンは複合した形態（ITIまたは免疫グロブリンと
複合して）および複合しない形態（これは次いでSTIと
して検出可能である）の両者で存在することができる。
UTIは腎臓の濾過を実施した実施したSTIである。したが
って、個々の阻害因子は、それらが他のタンパク質が関
連する否か、あるいは異なる体液中で検出されることに
おいてのみ異なる。
例えば、ビクニンドメインに基づく好中球性エラスタ
ーゼ、カテプシンＧまたは血漿カリクレインの特異的ま
たは効力のある阻害因子は、阻害因子のドメインＩまた
はドメインIIの反応性中心の位置P1におけるアミノ酸残
基の置換により得ることができるであろう。さらに、ド
メイン、例えば、とくにP2′位置において追加の置換
は、阻害性質をさらに改良することができる。
したがって、本発明は、一般に、その阻害スペクトル
が、位置P1においてばかりでなく、かつまた反応性中心
のP1 2位置において、自然アミノ酸残基が、他の自然ア
ミノ酸残基で置換されている、クニツ型阻害因子に関
し、ことにヒトのビクニンの単一のドメイン、または互
いに結合したドメインに基づいて得られた阻害因子に関
し、ただし自然阻害因子またはその個々のドメインの阻
害性質が、一方または双方の反応性中心の位置P1および
／またはP2′の自然アミノ酸残基が任意の自然アミノ酸
により、とくにAla、Gly、Ile、Arg、Phe、Val、Tyr、T
rpおよびLysからなる群からのアミノ酸による置換によ
り変更および／または改良されていることを条件とす
る。さらに、本発明は、また、合成DNAをもつ自然cDNA
の領域のコドンおよび結合の特定の選択に無関係に、阻
害因子の変異型のための基準を形成する遺伝子構成体に
関する。
さらに、本発明は、また、一方または双方のP1位置な
らびに一方または双方のP2′における置換の外に、ま
た、他の位置において他の置換が存在する。この型の追
加の置換は所望の阻害性質を改良することができ、より
好適な薬力学挙動を生じ、生体内の半減期を延長する
か、あるいはより好適である工業的調製を生ずる。
最後に、本発明は、また、性質および程度が、基本構
造の形成に必要な位置26および76（阻害因子のドメイン
１）および82および132（阻害因子のドメイン２）にお
けるシステイン残基を除外して、異なるＮ末端およびＣ
末端のペプチドのセグメントを有するビクニンに関す
る。本来定義されたドメインの限界（阻害因子のドメイ
ン１のLys22およびArg77および阻害因子のドメイン２の
Thr78およびAsn147）は、トリプシンを使用して達成す
ることができる機能的ペプチドへの分割を基準にして定
められ、そして今回決定されたエクソン領域と正確に一
致しない（Vetr et al.、FEBS Lett.、印刷中、198
9）。これに従い、２つの阻害因子のドメインは、それ
ぞれ、アミノ酸残基Asp24およびVal79、およびAal80お
よびAsp137により制限されるであろう。使用する発現系
に依存して、個々の遺伝子の構成体は、これらが阻害因
子の変異型中に、全体でまたは一部分で、保持されるか
どうかおよび前駆体タンパク質の一部分として単に一時
的に機能するかどうか、およびこれらの発現を自然ビク
ニンまたは外来タンパク質に割り当てるかどうかに無関
係に、Ｎ末端またはＣ末端の遺伝情報を指定することが
できる。
例えば、Met残基を除外してビクニンの自然アミノ酸
配列と同一である、Ｎ末端配列Met18−Thr19−Val20−L
ys21は、トリプシンを使用する切断により、本来定めら
れるドメイン１の組成に相当する単一の産生物を、有利
に得ることができる。また、このようにして、ビクニン
をＮ末端の外来タンパク質のセグメントをもつ構成体か
らビクニンのドメインを円滑に除去することができる。
直接の発現（Ｎ末端の外来タンパク質セグメントをもた
ない）のとき、また、ある種の条件下に、Ｎ末端メチオ
ニンの部分的排除または完全な排除さえを期待すること
ができる。治療の応用においてドメイン１の単一ヘッド
の構成体上のＣ末端のアルギニンの除去の可能性を防止
するために、ある場合において、Ｃ末端の伸長は好まし
い。
ビクニンの変異型またはビクニンの変異型の断片の発
現は、バクテリアまたは真核生物の系を使用して連続的
に実施することができる。こうして、バクテリア系のう
ちで、例えば、次のものが適当である：大腸菌（Escher
ichia coli）K12菌株中の発現系；細胞質中の非融合形
態、細胞内で形成されかつ適当な融合相手、例えば、MS
2レプリカーゼのＮ末端部分に接続されている融合タン
パク質として、あるいはまた阻害活性を有しそしてペリ
プラスミック（periplasmic）空間中に適当なシグナル
ペプチド、例えば、OmpAシグナル配列のシグナルペプチ
ドの使用により分泌される産生物として。
真核生物の系のうちで、例えば、酵母菌の分泌系であ
り、ここで発現産生物は適当なリーダー配列、例えば、
アルファ因子のpre−pro−配列により、分泌ルートを経
て、運ばれ、そして阻害活性を有する物質として培地中
に解放される。さらに、細胞内合成を生じる酵母菌の発
現系を使用することができる。
しかしながら、多くの他の原核生物および真核生物の
発現系、例えば、バチルス属（Bacillus）、ブドウ球菌
属（Staphylococcus）、ハンセヌラ属（Hansenula）、
アスペルギルス属（Aspergillus）または他の宿主菌株
を使用することがさらに可能である。
目的が哺乳動物中に存在するものに類似するグリコシ
ル化を達成する場合、正しくグリコシル化する系を選択
しなくてはならない。非グルコシル化ビクニン変異型は
原核生物の発現系において得られる。酵母菌の発現系
は、通常、哺乳動物のグリコシル化パターンと異なるグ
リコシル化を生ずる。酵母菌の発現系を使用して得られ
る非グリコシル化ビクニン変異型は、脱グリコシク化酵
素の使用によるか、あるいはグリコシル化することがで
きない変異型の発現により調製することができる。
本発明は、無毒の不活性製剤学的に適当な賦形剤に加
えて、１種または２種以上の本発明の化合物を含有する
か、あるいは１種または２種以上の本発明の活性化合物
から成る製剤学的配合物、およびこれらの調製物の調製
方法を包含する。
本発明は、また、投与単位の製剤学的配合物を包含す
る。これは、配合物が個々の部分、例えば、錠剤、被覆
した錠剤、カプセル剤、、丸剤、座薬およびアンプルの
形態で存在し、その活性化合物は個々の投与量の分画ま
たは多数に相当する。投与単位は、例えば、個々の投与
量の１、２、３または４倍または1/2、1/3または1/4を
含有することができる。個々の投与量は、好ましくは、
１回の投与で与えられかつ通常１日の投与量の全体、1/
2、1/3または1/4に相当する量の活性化合物を含有す
る。
無毒の不活性の製剤学的に適当な賦形剤とは、すべて
のタイプの固体、半固体または液体の希釈剤、充填剤お
よび配合剤である理解すべきである。
述べることのできる好ましい製剤学的配合物は、錠
剤、被覆した錠剤、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、座薬、
溶液、懸濁液および乳濁液、パスタ、軟膏、ゲル、クリ
ーム、ローション、粉剤およびスプレーである。
錠剤、糖剤、カプセル剤、丸剤および顆粒剤は、慣用
の賦形剤に加えて活性化合物を含有することができ、賦
形剤の例は次のとおりである：（ａ）充填剤および増量
剤、例えば、澱粉、ラクトース、スクロース、グルコー
ス、マンニトールおよびサリチル酸、（ｂ）結合剤、例
えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼ
ラチンおよびポリビニルピロリドン、（ｃ）保潤剤、例
えば、グリセロール、（ｄ）崩壊剤、例えば、寒天、炭
酸カルシウムおよび炭酸ナトリウム、（ｅ）溶解遅延
剤、例えば、パラフィンおよび（ｆ）吸収促進剤、例え
ば、第四アンモニウム化合物、（ｇ）湿潤剤、例えば、
セチルアルコールおよびグリセロールモノステアレー
ト、（ｈ）吸収剤、例えば、カオリンおよびベントナイ
トおよび（ｉ）滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸カ
ルシウム、ステアリン酸マグネシウムおよび固体のポリ
エチレングリコール、またはすぐ上に列挙した（ａ）〜
（ｉ）の物質の混合物。
錠剤、糖剤、カプセル剤、丸剤および顆粒剤は、必要
に応じて不透明化剤を含有する、慣用の被膜および外殻
を有することができ、そして、また、活性化合物のみを
放出するか、あるいは必要に応じて遅延した方法で、腸
管のある部分において優先的に活性化合物を放出するよ
うな組成をを有することができる。使用できる埋め込み
組成物の例は、ポリマーの物質およびろうである。
活性化合物は、また、マイクロカプセル化された形態
で存在することができ、適当ならば１種または２種以上
の前述の賦形剤を含有することができる。
座薬は、活性化合物に加えて、慣用の水溶性または水
不溶性の賦形剤、例えば、ポリエチレングリコール、油
脂、例えば、カカオ脂および高級エステル（例えば、C
14−アルコールおよびC16−脂肪酸のエステル）、また
はこれらの物質の混合物を含有することができる。
軟膏、パスタ、クリームおよびゲルは、活性化合物に
加えて、慣用の賦形剤、例えば、動物および植物の油
脂、ろう、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロー
ス誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベン
トナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛、またはこれ
らの物質の混合物を含有することができる。
粉剤およびスプレーは、活性化合物に加えて、慣用の
賦形剤、例えば、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化
アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉
末、またはこれらの物質の混合物を含有することができ
る。スプレーは、さらに、慣用の噴射剤、例えば、クロ
ロフルオロ炭化水素を含有することができる。
溶液および乳濁液は、活性化合物に加えて、慣用の溶
媒、例えば、可溶化剤および乳化剤、例えば、水、エチ
ルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、
酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエー
ト、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコー
ル、ジメチルホルムアミド、油類、とくに綿実油、グラ
ウンドナット（groundnut）油、トウモロコシ胚油、オ
リーブ油、ひまし油およびゴマ油、グリセロール、グリ
セロールホルマール、テトラヒドロフルフリルアルコー
ル、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸
エステル、またはこれらの物質の混合物を含有すること
ができる。
非経口的投与のために、溶液および乳濁液は、また、
血液と等張である無菌の形態であることができる。
懸濁液は、活性化合物に加えて、慣用の賦形剤、例え
ば、液状希釈剤、例えば、水、エチルアルコールまたは
プロピレングリコールおよび懸濁剤、例えば、エトキシ
化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソル
ビトールおよびソルビタンエステル、微結晶質セルロー
ス、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒
天およびトラガカント、またはこれらの物質の混合物を
含有することができる。
述べた配合物の形態は、また、着色剤、防腐剤、匂い
および味の改良剤、例えば、ペパーミント油およびユー
カリ油および甘味剤、例えば、サッカリンを含有するこ
とができる。
本発明の活性化合物は、好ましくは、前述の製剤学的
配合物中に、合計の混合物の約0.1〜99.5重量％、好ま
しくは約0.5〜95重量％の濃度で存在すべきである。
前述の製剤学的配合物は、また、他の製剤学的に活性
な化合物を本発明の化合物に加えて含有することができ
る。
前述の製剤学的配合物は、慣用の方法で、既知の方
法、例えば、活性化合物を賦形剤と混合することによっ
て調製される。
活性化合物または配合物は、局所的に、経口的に、非
経口的に、腹腔内におよび／または経直腸的に投与する
ことができ、好ましくはこれは経口的または非経口的
に、例えば、静脈内または筋肉内に実施する。
一般に、ヒトおよび動物の両者の医学において、本発
明の活性化合物を、約0.5〜500、好ましくは４〜100mg/
kg体重の合計量で、24時間毎に、適当ならばいくつかの
個々の投与の形態で投与して、所望の結果を達成するこ
とは有利である。個々の投与量は、本発明による活性化
合物を好ましくは約１〜約250、とくに３〜60mg/kg体重
の量で含有する。しかしながら、前述の投与量から逸脱
することが必要であることがあり、とくに処置すべき患
者の性質および体重、病気の性質およびひどさ、配合の
性質および薬物の投与の性質および投与を行う期間また
は間隔に依存してそのようにすることが必要なことがあ
る。
こうして、ある場合において、前述の量より少ない活
性化合物と管理することが十分であることがある。活性
化合物の必要な最適な投与量および投与時間は、専門家
により彼の経験に基づいて容易に決定することができ
る。
方法 DNAを制限酵素で切断する方法、DNAポリメラーゼＩ
（クレノー断片）の存在下に５′−突起する末端にdNTP
を充填する方法、ヤエナリヌクレアーゼを使用する消化
の方法、DNAのゲル電気泳動、DNA断片の分離、E.coliの
形質転換およびコロニーハイブリダイゼーションの方法
は、次の文献に記載されている標準の方法：マニアチス
（Maniatis）ら、モレキュラー・クローニング（Molecu
lar Cloning）、コールド・スプリング・ハーバー（Co
ld Spring Harbor）（1982）；製造業者の情報を考慮
する［ベーリンガー・マンヘイム（Boehringer Mannhe
im）（Mannheim）、バイオラブス（Biolabs）（Schwalb
ach）、ファーマシア（Pharmacia）（Freiburg）からの
制限酵素；ヤエナリヌクレアーゼ、ファーマシア（Phar
macia）、および成分E.coli細胞、BRL（Eggenstei
n）］。
オリゴヌクレオチドの化学的合成 オリゴヌクレオチドは、ファーマシア遺伝子アセンブ
ラー（Pharmacia Gene Assembler ）中で確立された
ホスホルアミダイト化学（β−シアノエチルN,N−ジイ
ソプロピルホスホルアミダイト）を使用して合成し、そ
してポリアクリルアミドゲルの電気泳動を変性すること
によって精製した。
DNAの配列決定 個々の遺伝子の構成体のDNA配列を評価するために、
二本鎖DNAを各場合において両者の鎖においてチェン（C
hen）およびセーバーグ（Seeburg）（DNA、４、165、19
85）の方法により直接配列決定した。
酵母菌の形質転換 ２×107の細胞濃度を有する酵母菌菌株SC106（MAT−
アルファ、hom3、gal2、his6、ura3;菌株S220A、Yeast
Genetics Stoch Center、カリフォルニア大学、米
国カリフォルニア州94720バーケレイ）の細胞懸濁液の1
00mlを回転した；細胞の沈澱を１回5mlのTE緩衝液（10
ミリモルのトリス×HCl、pH7.5、１ミリモルのEDTA）
で、次いで5mlのLiA緩衝液（0.1モルのTE緩衝液中の酢
酸リチウム）で洗浄した。次いで、細胞を1mlのLiA緩衝
液中に懸濁し、そして30℃において１時間インキュベー
ションした。このようにして得られた成分の細胞を４℃
において１日間貯蔵した。形質転換を次の方法で実施し
た。
10μｇのプラスミド溶液（１〜５μｇのDNA）および1
5μの担体DNA（ニシン精子からの変性DNA、3mg/ml）
を、0.1mlの細胞懸濁液に添加した。30℃において30分
間インキュベーションし、次いで0.7mlのポリプロピレ
ングリコール（LiA緩衝液中の40％のポリプロピレング
リコール3350）を添加し、次いで30℃においてさらに60
分間インキュベーションした。次いで、細胞を熱衝撃
（42℃、５分）にかけ、引き続いてエッペンドルフのマ
イクロフージ中で４秒間回転した。細胞の沈澱を各回0.
5mlのTE緩衝液で２回洗浄し、次いで細胞を0.1mlのTE緩
衝液中に懸濁し、そして選択栄養培地上で平板培養し
た。形質転換体を３日後得た。
形質転換体の増殖および分泌産生物の分析 形質転換体は、スレオニン、メチオニンおよびヒスチ
ジン（各々20mg/）を補充したSD培地（アミノ酸を含
まない0.67％の窒素塩基、２％のＤ−グルコース）中で
30℃において培養した。適切な細胞密度に到達した後、
細胞を各回し、そして培養懸濁液中のトリプシンまたは
エラスターゼを測定した。
ポリアクリルアミドゲルの電気泳動 タンパク質は、通常、SDSポリアクリルアミドゲルの
電気泳動（Laemmli、Nature 277、680、1970）および
クーマッシー（Coomassie）ブリリアント・ブルーを使
用する着色により検出した。
アミノ酸分析 約１ナノモルのタンパク質は200mlの６モルのHCl、0.
05％のβ−メルカプトエタノールの存在下に110℃にお
いて真空下に22時間インキュベーションした。加水分解
物を乾燥し、150μの0.2モルのクエン酸ナトリウム緩
衝液pH2.2中に溶解し、そして濾過した。アミノ酸分析
はバイオトロニック（Biotronic）LC5000アミノ酸分析
器で蛍光検出器およびシマズ（Shomadzu）Ｃ−R2AX積分
器を使用して実施した。アミノ酸を文献に従いフタルア
ルデヒドとの反応後定量した「ベンソン（Benson）およ
びヘヤー（hare）、プロシーディングス・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.）USA、72、619（1975）］。
アミノ酸の配列決定 30μのトリフルオロ酢酸中に溶解した１〜２ナノモ
ルのタンパク質を、ポリブレン処理したガラス繊維のフ
ィルターへ適用し、そして気相配列決定装置［アプライ
ド・バイオシステムス（Applied Biosystems）］中で
文献の方法に従い配列決定した［ヘウィック（Hewick）
ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（J.Biol.Chem.）、256、7990（1981）］。フェニルヒ
ダントイン誘導体を、文献に記載されているように、ウ
ォーターズ（Waters）HPLC系を使用してシアノHPLCカラ
ム［デュッポン（DuPont）］の助けにより分離および分
析した［ベリレウテル（Beyreuther）ら、タンパク質化
学において現代の方法（Modern Methods in Protein
Chemistry）、303−325、Walterde Gruyter、ベルリ
ン（1983）］。
トリプシン阻害アツセイ トリプシンの活性は、次の文献の方法に従い、基質と
してベンゾイル−Ｌ−アルギニンｐ−ニトロアニリドを
使用して決定した：ゲイガー（Geiger）およびフリッツ
（Frits）、酵素分析の方法（Methods of Enzymatic
Analysis）、Vol.V.第３版、Bergmeyer編、Verlag C
hemie、ワインハイム（1984）。遊離したｐ−ニトロア
ニリンを分光光度計で405nmにおいて測定した。酵素お
よび阻害因子を15分間予備インキュベーションした後、
基質を添加した。
エラスターゼ阻害アッセイ ヒト白血球エラスターゼは、エラスチン・プロダクツ
・カンパニー・インコーポレーテッド（Elastin Produ
cts Company Inc.、米国ミシシッピイ州63069パシフ
ィック）から入手した。使用した基質はMeO−Ala−Ala
−Pro−Val−pNA［ベイケム（Bachem）、スイス国ブー
ベンドルフ］であった。アッセイの条件を表１に示す。
一般に、阻害因子の試料をアッセイの緩衝液で希釈し、
酵素を添加し、次いでこの混合物を予備インキュベーシ
ョンした。反応は基質（DSMO中に0.1モルの濃度に溶解
し、そして原溶液を緩衝液でその濃度に調節した）の添
加により開始し、そして基質からのｐ−ニトロアニリン
の遊離を405nmにおいて連続的に追跡した。100％の値は
阻害因子を使用しない対応するアッセイにおいて決定し
た。阻害（％）は、次の等式から計算した。
阻害％＝100×［１−（阻害因子の存在下のΔOD）／
（阻害因子の不存在下のΔOD）］ 表1:エラスターゼ阻害アッセイのための条件［ナカジマ
（Nakajima）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー（J.Biol.Chem.）、254、4027（197
9）］。
緩衝液 0.2モルのトリス/HCl、pH8.0＋0.1％のツイーン8
0 基質の添加後の合計の体積 0.65ml 酵素の量／アッセイ 50ng 室温における予備インキュベーション 30分 基質 MeO−Ala−Ala−Pro−Val−pNA 原溶液 0.065モル 量／アッセイ 30℃ 実施例１ ビクニン遺伝子変異型の構成およびE.coli中の発現 個々のビクニン遺伝子変異型は、一方において、自然
mRNAに基づきそして、他方において、個々のドメイン、
またはその一部分に基づく。cDNAは、適当なcDNAのバン
クから、オリゴヌクレオチドのプローブとのハイブリダ
イゼーション［カウメイアー（Kaumeyer）ら、核酸の研
究（Nucleic Acids Research）、14、7839−7849、19
86］によるか、あるいはヒトのインター−α−トリプシ
ン阻害因子に対する抗体を使用するスクリーニング［シ
ュレイトミューラー（Schreitmller）ら、Biol.Chem.
Hoppe−Seyer 368、963−970、1987］により得られ
た。合成遺伝子（第１ドメイン）または遺伝子セグメン
ト（第２ドメイン）は、次のようにして得た： de［1-17 78-147］−Met18−Xaa36−Xaa38−ビクニン
遺伝子の構成、例えば、Xaa＝Ile、Leu、MetまたはVal 第１ドメイン（de［1-17 78-147］−Met18−ビクニ
ン）およびその変異型（de［1-17 78-147］−Met18−X
aa36−Xaa38−ビクニン遺伝子の構成、例えば、Xaa＝Il
e、Leu、MetまたはVal）の遺伝子は、２つの分子から構
成し、それらは完全な合成により発生され、そして、単
一にまたは一緒に、制限ヌクレアーゼ、Nco I、Asp718
およびSal Iの適当な組み合わせで切断してこれらの遺
伝子から除去することができる。構成体は、種々のベク
ター系における遺伝子の操作および、内部のAsp718制限
切断部位を経る、変異型の調製のためのモジュールの置
換を促進する（第２図）。
モジュール１はオリゴヌクレオチド１〜６を包含し、
そしてモジュール２はオリゴヌクレオチド７〜12を包含
する。Xaa36−Xaa38の変異型の構成は、単に、モジュー
ル１の置換を必要とする。モジュール１変異型を構成す
るために、オリゴヌクレオチド２、３、５および６を、
必要に応じて、オリゴヌクレオチドの変異型で置換し、
これらのオリゴヌクレオチドの変異型において、Metの
コドン（ATG）がイソロイシンのコドン（ATC）またはロ
イシンのコドン（CTG）またはバリンのコドン（GTT）ま
たは反対の鎖の相補的配列により置換されている。Ｎ末
端の配列Ｖ−Ｔ−Ｋは自然Ｎ末端ペプチドの一部分であ
る。唯一の外来アミノ酸は開始メチオニンであり、その
排除は生体内のE.coli中の遺伝子の直接の発現により達
成することができる。
クローニングの方法は第３図において概説されてい
る。プラスミドpTZ18NCOは、pTZ18R（ファーマシア）を
EcoR Iで切断し、ヤエナリヌクレアーゼで処理し、パリ
ンドロームの配列５′−ACCATGGT−３′で結合し、そし
てE.coli DH5中に形質転換することによって調製し
た。構成体を配列の分析により評価した。
プラスミドpTZMODIおよびpTZMOD1XX（XX＝IL、LM、M
M、LL、VL）は、プラスミドpTZ18NCOをNde IおよびAsp7
18で切断し、直線化プラスミドをオリゴヌクレオチド１
〜６（モジュール１、第２図）またはオリゴヌクレオチ
ド変異型（これはポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化
されている）で結合し、E.coli DH5中に形質転換し、
放射線標識したオリゴヌクレオチド４でコロニーハイブ
リダイゼーションし、そしてプラスミドDNAを分離する
ことによって特性決定した。
pTZKUN1は、プラスミドpTZMODIをAsp718およびSal I
で切断し、直線化プラスミドをオリゴヌクレオチド７〜
12（モジュール２、第２図）（これはポリヌクレオチド
キナーゼでリン酸化されている）で結合し、E.coli DH
5中に形質転換し、そして放射線標識したオリゴヌクレ
オチド11でコロニーハイブリダイゼーションすることに
よって分離し、そしてプラスミドDNAを分離することに
よって特性決定した。
プラスミドpTZMOD1XX（XX＝IL、LM、MM、LL、VL）を
構成するために、pTZKUNIからAsp718およびSal Iで除去
したモジュール２の断片を、このモジュールの個々のオ
リゴヌクレオチド７〜12の代わりに使用し、そして構成
の手順はそれ以外すでに記載したものに類似した。
de［1-17］−Met18−Xaa36−Xaa38−ビクニン遺伝子の
構成 de［1-17］−Met18−Xaa36−Xaa38−ビクニン型のビ
クニン遺伝子は、第１ドメインにおいてのみアミノ酸の
置換をもつ二重ヘッドの変異型である。それらは、第１
ドメインの合成遺伝子またはその変異型を第２ドメイン
の自然遺伝子の断片と縮合することによって得た。クロ
ーニングの方法は第４図に記載されている。
プラスミドpTZBIKは、pTZ18R中で制限ヌクレアーゼSa
u3Aを使用する断片によりクローニングした、α１−ミ
クログロブリン−ビクニンクローン（pTZ18MB1）のcDNA
から得た。この発明した断片Ａ（第４図）し、これはゲ
ル電気泳動により分離した。この断片は、ビクニン遺伝
子のほとんど完全な配列を有するが、α１−ミクログロ
ブリンをエンコードする部分およびビクニンのＮ末端ペ
プチドのための遺伝子セグメントの小さい部分をもたな
い。断片の末端を選択的にdATPおよびdGTPでクレノー酵
素の存在下に充填し、ヤエナリヌクレアーゼで平滑末端
とし、そしてプラスミドpTZ19R（ファーマシア）（これ
はHind IIIで直線化されそして同様にヤエナリヌクレア
ーゼで平滑末端とされている）中にクローニングした。
E.coli DH5中への形質転換を実施した。生ずるクロー
ンのプラスミドDNAは配列の分析により評価した。
プラスミドpTZBIK1およびpTZBIK1XX（XX＝IL、LM、M
M、LL、VL）は、ビクニン遺伝子のドメイン１について
の自然遺伝子セグメントを適当な合成遺伝子セグメント
またはその変異形のセグメントで置換することによって
発生させた。pTZBIKのDNAの断片ＣをSph1およびPst Iで
切断分離し、そしてこれはドメイン１のほとんどすべて
についての遺伝子セグメントを除外して、ビクニンの完
全なcDNAを含有し、そして対応して切断したプラスミド
pTZKUN1およびpTZKUN1XX（XX＝IL、LM、MM、LL、VL）
（参照第３図）中に結合し、そしてE.coli DH5中にク
ローニングした。生ずるクローンのプラスミドDNAは、
配列の分析により特性決定した。
de［1-79］−Xaa92−Xaa94−ビクニン遺伝子の構成、こ
こでXaa＝Ile、Leu、Met、Val、Phe 第２ドメインの遺伝子（de［1-79］−ビクニン）は、
ビクニンの切頭（truncating）により得た（第５図）。
その変異型（de［1-79］−Xaa92−Xaa94−ビクニン）
は、ドメイン２のAva I/XmnIno制限断片（モジュール
３）をオリゴヌクレオチドＡ−Ｄまたはそれらの変異型
の適当な組み合わせ（第６図）で第７図に示すように置
換することによって調製した。
プラスミドpTZKUN2（第５図）は、断片Ａ（これはpTZ
BIKI DNAを制限ヌクレアーゼHind IIIおよびBspM Iで
処理し、そして断片の末端をヤエナリヌクレアーゼで平
滑末端とすることによって発生された）を、ベクターpT
Z19R（ファーマシア）（これはXcy Iで切断し、そして
E.coli DH5細胞中の形質転換後、同様にヤエナリヌク
レアーゼで処理されている）と結合することによって得
た。個々のクローンのプラスミドDNAは、配列の分析に
より特性決定した。
プラスミドpTZKUN2XX（XX＝IL、LL、VLおよびLF）
は、pTZKUN2のAva I/Xmn Iの断片をモジュール３の適当
なオリゴヌクレオチドで置換することによって得た（参
照、第６図）。ベクターの断片は、前記制限ヌクレアー
ゼで切断後分離し、そして仔ウシ腸アルカリ性ホスファ
ターゼで５′末端を脱リン酸化した。ポリヌクレオチド
キナーゼでリン酸化したモジュール３のオリゴヌクレオ
チドと結合し、そしてE.coli DH5中に形質転換した
後、個々のクローンのプラスミドDNAをマッピングおよ
び、最後に、配列の分析により特性決定した（第７
図）。
de［1-17−Met18−Xaa36−Xaa38−Xaa92−Xaa94−］ビ
クニン遺伝子の構成 両者のドメインにおいて置換をもつビクニン遺伝子の
変異型は、種々のドメイン１をもつビクニン遺伝子変異
型（pTZBIK1XX;第４図）から、自然ドメイン２の遺伝子
セグメントを、第８図に示す方法において、ドメイン２
の遺伝子変異型の対応するセグメント（第７図）で置換
することによって発生された。
プラスミドpTZBIXXの制限ヌクレアーゼEcoR IおよびA
pa Iによる切断、仔ウシ腸アルカリ性ホスファターゼに
よるDNA断片の５′末端の脱リン酸化およびベクター断
片の分離を実施し、次いでpTZKUN2XXから同様に分離し
たEcoR I/Apa I断片と結合し、そしてE.coli DH5中に
クローニングした。個々のクローンのプラスミドは、配
列の分析により特性決定した。
de［1-17 82-147］−Met18−Xaa36−Xaa38−ビクニン
遺伝子の構成 アミノ酸配列Ｔ−Ｖ−Ａ−Ａ（de［1-17 82-147］−
Met18−Xaa36−Xaa38−ビクニン）による追加のＣ末端
伸長をもつ第１ドメインの遺伝子は、適当なビクニン変
異型のプラスミドpTZBIKIXXから、第２ドメインをオリ
ゴヌクレオチドａ（５′−CTGTGGCGGCCTGAG−３′）お
よびｂ（５′−AATTCTCAGGCCGCC−３′）で置換後、得
た（第９図）。この目的で、pTZBIK1XXをBspM IおよびE
coR Iで切断し、DNA断片の５′末端を仔ウシ腸アルカリ
性ホスファターゼで脱リン酸化し、そしてベクターの断
片を分離し、そしてオリゴヌクレオチドの存在下に結合
した。E.coli DH5の形質転換後、個々のクローンのプ
ラスミドpTZBIK1XXc配列の分析により評価した。
ビクニン変異型の発現 記載するビクニン遺伝子変異型のあるものは、クロー
ニングベクターそれ自体中でおよび種々の発現ベクタ
ー、例えば、pJLA502（Schauder et al.、Gene 52、
279−283、1987）およびpEX3（Stanley ＆ Luzio、EM
BO J.3、1429−1434、1984）およびpEX3407（Kocken
et al.、FEBS Lett.236、132−134、1988）中の再ク
ローニング後の両者において、発現することができた。
例えば、Nco I/Sal IおよびNco I/EcoR I断片は、それ
ぞれ、プラスミドpTZKUN1XXおよびpTZBIK1XX2XX（第３
図および第８図）から分離し、そして直接ベクターpJLA
502（相応して切断しそして仔ウシ腸アルカリ性ホスフ
ァターゼで処理されている）中に結合することができ
る。あるいは、プラスミドpTZBIK1XX（Nco I/EcoR I断
片、第４図）、pTZBIK1XX2XX（Nco I/EcoR I断片、第８
図）、pTZKUN1XX（Nco I/Hind III、第３図）からの断
片を分離し、ヤエナリヌクレアーゼで平滑末端とし、そ
してベクターpEX3またはpEX3407中に結合することがで
きる。
プラスミドpTZKUN2XX（第７図）の断片は、EcoR Iで
切断し、ヤエナリヌクレアーゼで処理し、次いでBamH I
で切断し、そしてpEXベクター中に結合することができ
る。pEXベクターのDNAは、この目的で、Sal Iで切断し
そしてヤエナリヌクレアーゼで処理するか、あるいは最
後に述べた構成におけるように、ヤエナリヌクレアーゼ
で処理し、次いでBamH Iで処理することができる。E.co
li pop2136の形質転換体（Vidal−Ingigliardi ＆ R
aubaud、核酸の研究（Nucleic Acids Research）、1
3、1163、1985）は、遺伝子の発現の温度依存性制御を
可能とする。各場合において産生される融合タンパク質
は、酸不安定なAsp−Proペプチドのlkgを経て発現すべ
きタンパク質に結合する。融合タンパク質の部分の除
去、ビクニン部分の精製および復元ha、de［1-17］−Pr
o18−ビクニン、de［1-17 78-147］−Pro18−ビクニン
およびde［1-78］−Pro79−ビクニンの型の阻害因子の
変異型を生じた。ビクニン部分は、また、融合相手か
ら、タンパク質分解（トリプシンを使用する）に対して
とくに不安定な配列Pro20−Lys21−Lys22の使用により
切断することができる。単一ヘッドの変異型の分泌発現
系においてとくによく発現することができた。
発現産生物は、ゲル電気泳動（例えば、融合タンパク
質の決定のため）によるか、あるいは標準の酵素阻害ア
ッセイ（融合相手の排除、ビクニン部分の精製および復
元後）において検出された。
得られた結果は、例えば、E.coli中の発現により記載
する方法で調製された、de［1-17］−Met−18−Leu−36
−Leu−38−ビクニン、de［1-17］−Met−18−Leu−36
−Leu−38−Leu−92−Leu−94−ビクニンおよびde［
1-17］−Met−18−Leu−92−Leu−94−ビクニンは、効
力のあるプロテアーゼ阻害作用を有する。
実施例２ Leu−36−Leu−38−ビクニンの発現 遺伝子のクローニング:pCY17、pBR322から誘導された
（これはMAT−アルファ−１の構造遺伝子を含有する）
（KurjanおよびHerskowitz、Cell、30、933、1982）
は、ヘルスコウィッツ（Herskowitz）（カルフォルニア
大学）から入手したpMT15は酵母菌−E.coliシャトルベ
クターである（第10図）。それはAmpR、blaおよびURA3
遺伝子セグメント（これらはE.coliおよび酵母菌の選択
可能なマーカーとして作用する）を有する。pMT15は、
さらに、pBR322のCo1E1由来および２μのプラスミドの
Ｂ形態のセグメントを有するので、プラスミドはE.coli
および酵母菌の両者において安定な複製を行うことがで
きる。それは、さらに、MAT1−アルファプロモーターお
よび、プラスミドpCY17から得られたEcoR I−Hind III
断片として、アルファ因子の前駆体のＮ末端のpre−pro
−配列の解読配列を有する。この断片に引き続いて３′
に、前インベルターゼの34のＮ末端のアミノ酸の遺伝情
報を指定する115bpのHind III−BamH I断片が存在する
（Das et al.、モレキューラー・アンド・ジェネラル
・ジェネティックス（Molec.Gen.Genetio.）218、p.24
0、1989）。最後に、pMT15は、酵母菌URA3遺伝子から得
られた酵母菌の転写ターミネーターの160bpの断片をBam
H I切断部位の３′末端に含有した［Yarger et al.、
モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Mol.
Cell.Biol.）、８、1095、1986］。
アルファ−因子pre−pro−リーダー配列の解読領域を
有するpMT15からの235bpのPst I−Hind III断片を、ベ
クターM13mp18中にクローニングし、そして突然変異原
のオリゴヌクレオチド５′−GAA GAA GGG GTA TTG
GAT AAA AGA−３′を使用して特異的（directed）
突然変異誘発にかけた。この突然変異誘発により、アル
ファ−因子pre−pro−配列中の位置81におけるセリンの
コドンはTCTからAGCに変化され、Hind III制限切断部位
を発生した。これにより調製された213bpのPst I−Hind
III断片（第11図）を使用して、pMT15中の235bpのPst
I−Hind III断片を置換した。このようにして修飾され
たプラスミドをpS600と呼んだ；それは処理部位としてL
ys−Arg−Glu−Ala−Glu−Alaの代わりにLys−Argのた
めの解読配列を有する（第12図）。
Leu−36−Leu−38−ビクニン遺伝子の構成；ビクニン
の解読配列（第13図）を有するプラスミドPIM1（Dasお
よびLehman、J.Cell.Biochem.、2B、284、1988）からの
540bpのSau3AI断片を、M13mp19中にクローニングし、そ
して部位特異的突然変異させてMet−16をLeu−16にそし
てMet−38をLeu−38に形質変換した。突然変異誘発はセ
イヤース（Sayers）ら［核酸の研究（Nucleic Acids
Research）、16、79、（1988）］の方法により実施し
た。さらに、次の配列の二本鎖のDNA断片を調製した： DNA断片を標準の方法によりリン酸化した。このよう
にして得られたDNA断片を、突然変異したビクニン配列
と一緒に、Hind IIIおよびBamH Iで消化した8.2bpのpS6
00中に挿入した。オリゴマーは、pre−pro−アルファ−
因子の３′末端およびビクニン配列の５′末端の両者を
再構成した。したがって、このようにして得られた新し
いプラスミドpLLB3638は、Leu−36−Leu−38−ビクニン
配列に融合した処理部位としてLys−Argをもつpre−pro
−アルファ−因子のための解読配列を含有する。pLLB36
38中のDNAおよびpre−pro−アルファ−因子−Leu−36−
Leu−38−ビクニンの融合部位における対応するアミノ
酸配列を第14図に示す。
阻害活性を有するLeu−36−Leu−38−ビクニンの発現、
分泌および検出：酵母菌菌株SC106（MATd、hom3、ga1
2、his6、ura3）を、前述の方法に従い、pLLB3638を使
用して形質転換した;URA3+細胞を分離し、そして培養し
た；培養上澄み液をエラスターゼ阻害活性について試験
した。対照試験において、pS600で形質転換したSC106細
胞は培地中でエラスターゼ阻害活性を産生しないことが
示された。
その結果、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharo
myces cerevisiae）中の発現されたLeu−36−Leu−38
−ビクニン遺伝子は、次の性質をもつ培地中で２つのタ
ンパク質種の形成に導いたことが示された：（ａ）活性
トリプシン阻害因子、（ｂ）SDSポリアクリルアミドゲ
ル中の電気泳動に従い20kおよび17kの分子量、（ｃ）各
タンパク質種のうちで、約60％はビクニンのＮ末端の配
列を示し、そして約40％はde（Ala−１）ビクニンの配
列を示した。
実施例３ Leu−92−Leu−94−ビクニンの発現 遺伝子のクローニング：ビクニンの解読配列（第13図）
をもつpIM1 DNAの540bpのSau3A I断片（DasおよびLehm
an、J.Cell.Biochem.、12B、284、1988）をプラスミドM
13mp19中にクローニングし、そして特異的突然変異誘発
にかけて、Arg−92をLeu−92に変え、そしてPhe−94をL
eu94に変えた。このようにして突然変異した断片を、実
施例１に類似する方法でプラスミドpS600中にクローニ
ングした。発現ベクターpLLB9294中のDNA配列およびpre
−pro−アルファ−因子−Leu−92−Leu−94−ビクニン
の融合部位における対応するアミノ酸配列を第15図に示
す。
阻害活性を有するLeu−92−Leu−94−ビクニンの発現、
分泌および検出:SC106を、前述の方法に従い、pLLB9294
を使用して形質変換した;URA3+細胞を分離し、そして培
養した；培養上済み液をエラスターゼ阻害活性について
試験した。対照試験において、pS600で形質転換したSC1
06細胞は培地中でエラスターゼ阻害活性を産生しないこ
とが示された。
その結果、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharo
myces cerevisiae）中の発現されたLeu−92−Leu−94
−ビクニン遺伝子は、次の性質をもつ培地中で２つのタ
ンパク質種の形成に導いたことが示された：（ａ）活性
エラスターゼ阻害因子、（ｂ）SDSポリアクリルアミド
ゲル中の電気泳動に従い20kおよび17kの分子量、（ｃ）
各タンパク質種のうちで、約60％はビクニンのＮ末端の
配列を示し、そして約40％はde（Ala−１）ビクニンの
配列を示した。
実施例４ Leu−36−Leu−38−Leu−92−Leu−94−ビクニンの発現 遺伝子のクローニング：ビクニンの解読配列（第13図）
をもつpIM1 DNAの540bpのSau3A I断片（DasおよびLehm
an、J.Cell.Biochem.、12B、284、1988）をプラスミドM
13mp19中にクローニングし、そして特異的突然変異誘発
にかけて、Met−36をLeu−36に変え、Met−38をLeu−38
に変え、Arg−92をLeu−92に変え、そしてPhe−94をLeu
94に変えた。このようにして突然変異した断片を、実施
例１に類似する方法でプラスミドpS600中にクローニン
グした。発現ベクターp4LB中のDNA配列およびpre−pro
−アルファ−因子−Leu−Leu−36−Leu−38−92−Leu−
94−ビクニンの融合部位における対応するアミノ酸配列
を第16図に示す。
阻害活性を有するLeu−36−Leu−38−Leu−92−Leu−94
−ビクニンの発現、分泌および検出:SC106を、前述の方
法に従い、p4LBを使用して形質変換した;URA3+細胞を分
離し、そして培養した；培養上済み液をエラスターゼ阻
害活性について試験した。対照試験において、pS600で
形質転換したSC106細胞は培地中でエラスターゼ阻害活
性を産生しないことが示された。
その結果、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharo
myces cerevisiae）中の発現されたLeu−36−Leu−38
−Leu−92−Leu−94−ビクニン遺伝子は、次の性質をも
つ培地中で２つのタンパク質種の形成に導いたことが示
された：（ａ）活性エラスターゼ阻害因子、（ｂ）SDS
ポリアクリルアミドゲル中の電気泳動に従い20kおよび1
7kの分子量、（ｃ）各タンパク質種のうちで、約60％は
ビクニンのＮ末端の配列を示し、そして約40％はde（Al
a−１）ビクニンの配列を示した。
実施例５ de（１−21）−Leu−36−Leu−38−ビクニンの発現 遺伝子のクローニング:de（１−21）−ビクニンの解読
配列（第13図）をもつpIM1 DNAの480bpのPvu II断片
（DasおよびLehman、J.Cell.Biochem.、12B、284、198
8）をプラスミドM13mp19中にクローニングし、そして特
異的突然変異誘発にかけて、Met−36をLeu−36に変え、
そしてMet−38をLeu−38に変えた。突然変異誘発はセイ
ヤース（Sayers）ら［核酸の研究（Nucleic Acids Re
search）、16、79、（1988）］の方法により実施した。
さらに、次の配列の二本鎖のDNA断片を調製した： ５′−AGC TTG GAT AAA AGA AAA GAA GAT TCC TGC CAG−３′ AC CTA TTT TCT TTT CTT CTA AGG ACF GTC−５′ DNA断片を標準の方法によりリン酸化した。このよう
にして得られたDNA断片を、突然変異したビクニン配列
と一緒に、Hind IIIおよびBamH Iで消化した8.2bpのpS6
00中に挿入した。オリゴマーは、pre−pro−アルファ−
因子の３′末端およびビクニン配列の５′末端の両者を
再構成した。したがって、このようにして得られた新し
いプラスミドpDLLB−121は、de（１−21）−Leu−36−L
eu−38−ビクニン配列に融合した処理部位としてLys−A
rgをもつpre−pro−アルファ−因子のための解読配列を
含有する。pDLLB−121中のDNAおよびpre−pro−アルフ
ァ−因子−Leu−36−Leu−38−ビクニンの融合部位にお
ける対応するアミノ酸配列を第17図に示す。
阻害活性を有するde（１−21）−Leu−36−Leu−38−ビ
クニンの発現、分泌および検出：酵母菌菌株SC106を、
前述の方法に従い、pDLLB−121を使用して形質転換し
た;URA3+細胞を分離し、そして培養した；培養上澄み液
をエラスターゼ阻害活性について試験した。対照試験に
おいて、pS600で形質転換したSC106細胞は培地中でエラ
スターゼ阻害活性を産生しないことが示された。
その結果、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharo
myces cerevisiae）中の発現されたde（１−21）−Leu
−36−Leu−38−ビクニン遺伝子は、次の性質をもつ培
地中でタンパク質種の形成に導いたことが示された：
（ａ）活性トリプシン阻害因子、（ｂ）SDSポリアクリ
ルアミドゲル中の電気泳動に従い17kおよび15kの分子
量、（ｃ）タンパク質はde（１−21）−ビクニンのＮ末
端の配列Lys−Glu−Asp−STer−Cysを示した。
本発明の主な特徴および態様は、次の通りである。
１、ヒトのビクニンのアミノ酸21〜147の配列を有し、
前記配列において少なくとも１つのアミノ酸残基が他の
天然に産出するアミノ酸により置換されていることを特
徴とする、プロテイナーゼ阻害因子。
２、位置36、38、45、92、94、98、116の１または２以
上のアミノ酸残基が他の天然に産出するアミノ酸により
置換されている、上記第１項記載のプロテイナーゼ阻害
因子。
３、置換はAla、Gly、Ile、Leu、Phe、Val、Arg、Tyr、
Trp、Lysからなる群からのアミノ酸残基による、上記第
１項記載のプロテイナーゼ阻害因子。
４、次の置換： 位置36:Leu、Ile、Val、Arg、Phe、Tyr、Trp、Lysによ
りMet、 位置38:Leu、Arg、Ile、Val、Lys、 位置45:他の自然アミノ酸によりAsn、 位置92:Leu、Ile、Val、Phe、LysによりArg、 位置94:Leu、Arg、Lys、Ile、ValによりPhe、 位置98:Tyr、Lys、Ile、Val、Phe、Leu、Ala、Gay、Ser
によりTrp、 位置116:Arg、LysによりGlu、 の所望の組み合わせを有する、上記第１〜３項のいずれ
かに記載のプロテイナーゼ阻害因子。
５、１または２以上のMet残基は非酸化可能のアミノ酸
残基により置換されている、上記第１〜４項のいずれか
に記載のプロテイナーゼ阻害因子。
６、Ｎ末端に追加のポリペプチドを有し、そのアミノ酸
配列はビクニンの自然配列１〜21から誘導される、上記
第１〜５項のいずれかに記載のプロテイナーゼ阻害因
子。
７、グリコシル化を有するまたは有さない、上記第１〜
６項のいずれかに記載のプロテイナーゼ阻害因子。
８、上記第１〜７項のいずれかに記載のプロテイナーゼ
阻害因子から得られた、プロテイナーゼ阻害活性を有す
る断片。
９、ビクニンのアミノ酸22〜77、１〜77または78〜147
の配列を本質的に含有する、上記第８項記載の断片。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ヒトのビクニンの一次構造を示す。Ｎ末端ペ
プチド（位置１−21）およびドメイン１（位置22−77）
およびドメイン２（位置78−147）は、トリプシンを使
用する切断により得ることができる。矢印は、異なるエ
クソンによりエンコードされる領域の配列を示し、そし
て星印は反応性中心の特異的に変更された残基P1および
P2′を示す。ビクニンの２つの阻害因子のドメインにお
ける同一のアミノ酸残基は、垂直線で強調されている。 第２図は、de［1-17 78-147］−Met18−Xaa36−Xaa38
−ビクニン変異型の構成および基本遺伝子のオリゴヌク
レオチド配列を示す。変異型において置換された残基は
二重の下線を引かれている。Nco I認識配列のCCATGGの
属部分の５′末端における第１コドン、および遺伝子の
３′末端における３つの連続する停止コドンの第３の最
後のヌクレオチド（末端）は、Sal I認識配列GTCGACの
一部分である。個々のモジュールを限定する制限ヌクレ
アーゼのNco I、Asp718およびSal Iは、一重の下線が引
かれている。遺伝子の構成に使用するオリゴヌクレオチ
ドは、矢印で表されており、そして番号を付されてい
る。 第３図は、de［1-17 78-147］−Met18−ビクニン遺伝
子（pTZKUN1）およびde［1-17 78-147］−Met18−Xaa
36−Xaa38−ビクニン遺伝子の変異型（pTZKUN1XX）のク
ローニングを示す。 第４図は、de［1-17］−ビクニン遺伝子（pTZBIK）、de
［1-17］−Met18−ビクニン遺伝子（pTZBIK1）およびde
［1-17］−Met18−Xaa36−Xaa36−ビクニン遺伝子（pTZ
BIK1XX）のクローニングを示す。M:α１−ミクログロブ
リン:D1およびD2:ビクニンのドメイン１および2;N:ビク
ニンのＮ末端のペプチド;C:ビクニンのＣ末端の配列;KU
N1:モジュールMod1およびMod2から成る合成ドメイン
１。クローニング手順のために失われる切断部位は、生
ずるプラスミド中に記録されるが、もはや同定されな
い。断片ＢおよびＤは−それらがそれ自体発生されない
場合−向きを改良するためにを示されている。 第５図は、de［1-79］−ビクニン遺伝子（pTZKUN2）の
クローニングを示す。D2:ビクニンのドメイン２、C:ビ
クニンのＣ末端配列;KUNI:モジュールMod1およびMod2よ
りなる合成ドメイン1;クローニング法によつて消失した
開裂部位は、同定することなく得られたプラスミド中に
記録されている。断片は、それが例えばＢおよびＣのよ
うに発生されない場合でも向きを改良するために示され
ている。 第６図は、ビクニンの第２ドメインの遺伝子変異型:de
［1-79］−Xaa92−Xaa94−ビクニンの変異型およびde［
1-17］−Met18−Leu36−Leu38−Leu92−Leu94−ビクニ
ン、ここでXaa92−Xaa94＝Ile、Leu、Met、ValまたはPh
e、の構成を示す。ドメイン２からの自然ビクニン（位
置78）および合成オリゴヌクレオチドＡ−Ｄ（矢印）が
示されており、ここでオリゴヌクレオチドＡおよびＢに
おいてビクニンの位置92および94におけるコドン（二重
の下線）は個々の変異型の要件に従い置換されている
（Ile:ATC;Leu:CTG;Val:GTT;または反対の鎖中のそれら
の相補的配列）。制限ヌクレアーゼApa Iの認識配列（G
GGCCC）およびXmn I認識配列（GAANNNNTTC）には、一重
の下線が引かれている。 第７図は、de［1-79］−Xaa92−Xaa94−ビクニン遺伝子
の変異型、ここでXaa＝Ile、Leu、MetおよびVal、のク
ローニングを示す。D2:ビクニンのドメイン2;KUN2:合成
モジュール３による自然Xmn I/Apa I断片の置換後のビ
クニンのドメイン2;C:ビクニンのＣ末端の配列。 第８図は、de［1-79］−Met18−Xaa36−Xaa38−Xaa92−
Xaa94−ビクニン遺伝子の変異型、ここでXaa＝Ile、Le
u、Met、ValおよびPhe、のクローニングを示す。KUN1:
モジュール１および２から成る合成ドメイン1;KUN2:合
成モジュール３による自然Xmn I/Apa I断片の置換後の
ビクニンのドメイン2;C:ビクニンのＣ末端の配列。 第９図は、de［1-17 82-147］−Met18−Xaa36−Xaa38
−ビクニン遺伝子（アミノ酸配列Ｔ−Ｖ−Ａ−Ａによる
第１ドメインのＣ末端の伸長）KUN1:モジュール１およ
び２から成る合成ドメイン1;D2:ビクニンのドメイン;C:
ビクニンのＣ末端の配列;aおよびb:オリゴヌクレオチド
のリンカー（参照、発明の詳細な説明）。 第10図は、pMT15、E.coli−酵母菌のシャトルベクター
を示す。 第11図は、アルファ−因子のリーダー配列の部位特異的
突然変異の線図である。TCTのAGCへの突然変異は、
（Ｉ）と呼ぶ213bpのPst I−Hind III断片の分離を促進
する。 第12図は、アルファ−因子のプロモーターおよび修飾し
たアルファ−因子のリーダー配列を使用する、ビクニン
の発現／分泌のための修飾された酵母菌−E.coliの構成
を示す。修飾されたアルファ−因子のリーダー配列（第
11図においてＩと呼ぶ）はPst I−Hind III断片として
ベクターpMT15中へ組み込まれ、そして本来のアルファ
−因子のリーダー配列は置換された。 第13図は、アルファ−因子のpre−pro−配列を含有する
pMT15 E.coli−酵母菌のシャトルベクター中にクロー
ニングされた、天然に産出するビクニン遺伝子を示す。 第14図は、発現ベクターpLLB3638、ベクターpS600中に
クローニングしたpre−pro−アルファ−因子−Leu−36
−Leu−38−ビクニン遺伝子の融合、およびpLLB3638中
のDNAおよびpre−pro−アルファ−因子−Leu−36−Leu
−38−ビクニンの融合部位における対応するアミノ酸配
列を示す。Lys−Argは、pre−pro−アルファ−因子の配
列のKEX2処理部位である（Julius酢酸エチル、Cell、3
7、1075、1984）。アミノ酸の番号１〜38は、ビクニン
ムテイン配列中のそれに相当する。 第15図は、発現ベクターpLLB9294、ベクターpS600中に
クローニングしたpre−pro−アルファ−因子−Leu−92
−Leu−94−ビクニン遺伝子の融合、およびpLLB3638中
のDNAおよびpre−pro−アルファ−因子−Leu−92−Leu
−94−ビクニンの融合部位における対応するアミノ酸配
列を示す。Lys−Argは、pre−pro−アルファ−因子の配
列のKEX2処理部位である（Julius酢酸エチル、Cell、3
7、1075、1984）。アミノ酸の番号１〜94は、ビクニン
ムテイン配列中のそれに相当する。 第16図は、発現ベクターp4LB、ベクターpS600中にクロ
ーニングしたpre−pro−アルファ−因子−Leu−92−Leu
−94−ビクニン遺伝子の融合、およびp4LB中のDNAおよ
びpre−pro−アルファ−因子−Leu−36−Leu−38−Leu
−92−Leu−94−ビクニンの融合部位における対応する
アミノ酸配列を示す。Lys−Argは、pre−pro−アルファ
−因子の配列のKEX2処理部位である（Julius酢酸エチ
ル、Cell、37、1075、1984）。アミノ酸の番号１〜94
は、ビクニンムテイン配列中のそれに相当する。 第17図は、発現ベクターpDLLB−121、ベクターpS600中
にクローニングしたpre−pro−アルファ−因子−de（１
−21）−Leu−36−Leu−38−ビクニン遺伝子の融合、お
よびpDLLB−121中のDNAおよびpre−pro−アルファ−因
子−Leu−36−Leu−38−ビクニンの融合部位における対
応するアミノ酸配列を示す。Lys−Argは、pre−pro−ア
ルファ−因子の配列のKEX2処理部位である（Julius酢酸
エチル、Cell、37、1075、1984）。アミノ酸の番号１〜
38は、ビクニンムテイン配列中のそれに相当する。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｐ 1/16 Ａ６１Ｐ 9/00 7/02 11/00 9/00 15/00 11/00 17/00 15/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 17/00 Ａ６１Ｋ 37/64 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (56)参考文献 特開 昭63−87984（ＪＰ，Ａ) Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓ ｅｙｌｅｒ，336（1985），ｐ．473− 478 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，（1988）, ｐ．171−178 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (2)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】エラスターゼ阻害活性を有するLeu−92−L
    eu−94−ヒトビクニン、Leu−36−Leu−38−Leu−92−L
    eu−94−ヒトビクニン、Leu−92−ヒトビクニン（21−1
    47）及びLeu−92−Leu−94−ヒトビクニン（21−147）
    ならびにカリクレイン阻害活性を有するArg−94−ヒト
    ビクニン（78−147）、Arg−94−Arg−116−ヒトビクニ
    ン（78−147）、Arg−94−Tyr−98−ヒトビクニン（78
    −147）及びArg−94−Tyr−98−Arg−116−ヒトビクニ
    ン（78−147）よりなる群から選ばれる、ヒトビクニン
    のアミノ酸の21−147の配列を有するプロテイナーゼ阻
    害因子。
  2. 【請求項２】請求項１に記載のプロテイナーゼ阻害因子
    をコードする核酸で修飾された適当な宿主細胞を培養
    し、該阻害因子を培養物から取得することを特徴とする
    請求項１に記載のプロテイナーゼ阻害因子の製造方法。
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