KR0156246B1 - 프로테이나제 억제제, 그의 제조방법 및 그를 함유한 의약 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

프로테이나제 억제제, 그의 제조방법 및 그를 함유한 의약
제1도는 인체 비쿠닌의 1차 구조를 도시한 도면.
제2도는 de[1-17,78-147]-Met18-Xaa36-Xaa38-비쿠닌 변이체의 제조; 기초 유전자의 올리고뉴클레오티드 서열을 도시한 도면.
제3도는 de[1-17,78-147]-Met18-비쿠닌 유전자 (pTZKUN1) 및 de[1-17,78-147]-Met18-Xaa36-Xaa38-비쿠닌 유전자 변이체(pTZKU1XX)의 클로닝을 도시한 도면.
제4도는 de[1-17]-비쿠닌 유전자 (pTZBIK) 및 de[1-17]-Met18-비쿠닌(pTZBIK1) 및 de[1-17]-Met18-Xaa36-Xaa38-비쿠닌 유전자 (pTZBIK1XX)의 클로닝을 도시한 도면.
제5도는 de[1-79]-비쿠닌 유전자 (pTZKUN2)의 클로닝을 도시한 도면.
제6도는 비쿠닌의 두번째 도메인의 유전자 변이체의 제조를 도시한 도면.
제7도는 Xaa=Ile, Leu, Met 및 Val 또는 de[1-79]-Xaa92-Xaa94비쿠닌 유전자 변이체의 클로닝을 도시한 도면.
제8도는 Xaa=Ile, Leu, Met 및 Val 또는 Phe를 갖는 de[1-17]-Met18-Xaa36-Xaa38-Xaa92-Xaa94-비쿠닌 유전자 변이체의 클록닝을 도시한 도면.
제9도는 de[1-17,82-147]-Met18-Xaa36-Xaa38-비쿠닌 유전자(아미노산 서열 T-V-A-A에 의한 제1 도메인의 C-말단의 연장부)의 클로닝을 도시한 도면.
제10도는 대장균-효모 셔틀 pMT15를 도시한 도면.
제11도는 알파-인자 리이더 서열의 부위-특이성 돌연변이 유발을 도시한 도 면.
제12도는 알파-인자 프로모터 및 변형 알파 리이더 -인자 서열을 사용하여 비쿠닌의 발현/분비를 위한 변형 효모-대장균 셔틀 벡터를 제조하는 과정을 도시한 도면.
제13도는 알파-인자의 전선구 서열을 함유하는 pMT15 대장균-효모 셔틀 벡터내에 클로닝시킨 천연 생성 비쿠닌 유전자를 도시한 도면.
제14도는 발현 벡터 pLLB 3638을 도시한 도면.
제15도는 발현 벡터 pLLB 9294를 도시한 도면.
제16도는 발현 벡터 p4LB를 도시한 도면.
제17도는 발현 벡터 pDLLB-121들 도시한 도면.
본 발명은 인체 비쿠닌의 억제 작용을 갖는 도메인 (즉, 인터-α- 트립신 억제제, 또는 산-안정성 혈청 트립신 억제제 또는 뇨의 트립신 억제제의 억제 작용을 갖는 성분)에 기초한 펩티드 변이체, 미생물(세균, 하등 진핵생물)을 사용한 유전자 조직의 방법에 의한 상기 펩티드의 제조방법 및 이 펩티드 변이체들을 함유한 의약품에 관한 것이다. 이 펩티드 변이체들은 세린 프로테아제, 예컨데, 췌장 및 과립구의 엘라스타아제, 카텝신 G 또는 플라즈마 칼리크레인을 억제하는 능력을 특징으로 한다.
프로테아제가 세포외 공간에 도달하게 되면 이들은 보통 α1-프로테이나제 억제제와 같은 강력한 내인성 프로테이나제 억제제에 의해 신속히 포획된다(Travis Salvesen, Ann. Rev. Biochem. 52, 655, 1983 참조). 특수 환경에 있어서, 이 보호 기작은 작용하지 않거나, 적어도 적절히 작용하지 않을 수 있으며, 그 결과는 특히 기종, 패혈성 쇼크, 폐쇼크, ARDS, 류마티스 관절염, 응혈 장해, 신 및 간 부전증의 발생과 같은 심한 병리학적 상태일 수 있다. 특이 작용을 갖는 프로테이나제 억제제는 이와 관련한 강력한 치료제로서 특히 중요한 것이다. 인체용으로 특히 중요한 프로테이나제 억제제는 천연 인체 억제제와 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 이것은 특히, α1-프로테이나제 억제제 결핍증(기종의 발육)의 치료와 같이 장기간의 치료에 사용되어 독성 또는 알레르기성 부작용을 예방한다.
그의 세포외 억제가 일차로 염증 부위를 목표로 하는 α1-프로테이나제 억제제는 호중성 엘라스타아제의 천연 길항질이나, 이는 몇가지 이유 때문에 치료용으로 최적이지는 못하다. 이것의 53,000d의 비교적 큰 분자량은 비생리학적으로 큰 중량부의 억제제의 사용을 필요로 한다. 요구되는 양은 유전 공학적 수단에 의해 얻을 수는 있으나, 생리학적 방식으로 글리코실화 되지 않는 재조합 단백질의 순환에 있어서 감소된 반감기때문에 이보다 더 많은 양의 억제제를 사용하는 것이 필요할 수도 있다 (Matheson et al., J. Biol. Chem. 261, 10404, 1986 참조). 여하튼 이 억제제는 단백질 가수분해 및 산화에 감성인 것으로 간주된다.
상기 두가지 특성은 활성 종의 농도를 감소시킨다. 산화에 대한 감성은 억제제의 반응성 중심(P1위치)의 메티온닌 잔기를, 예컨데, 류신으로 대체시킴으로써 유전 공학적 수단에 의해 제거할 수 있다(McCourthey et al., Nature 313, 149, 1985 참조).
본 발명의 목적은, 예컨데, 인체 질병 치료용의 현저하게 낮은 분자량을 갖는 인체 백혈구 엘라스타아제, 카텝신 G 또는 플라스마 칼리크레인에 대한 프로테이나제 억제제를 개발하기 위한 것이다. 이와 관련하여 이 목적은 현재 공지된 인체 억제제를 변형시킴으로써 테일러(tailor)단백질 억제제가 목적하는 억제 스펙트럼을 갖는가의 여부를 검사하는 것이다. 이에 적합한 염기성 분자로서 예견되는 것은 몇개의 아미노산 잔기들을 대체시킴으로써 이들 억제제(제1도) 본래의 억제 스펙트럼의 특이 변이체를 얻는 것이 가능하다면 인체 인터-α-트립신억제제 ITI(Schreitm
Figure kpo00002
ller et al, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 368, 963, 987; Gebhard et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 369s, 19, 1988; Gebhard et al., FEBS Lett. 229, 63, 1988 ; Gebhard et al., Euro. J. Biochem. 출판중, 참조)[이하, 비쿠닌(제1도)이라 약칭함] 이외에, 혈청(STI)및 뇨(UTI)중 동일한 구조를 갖는 쿠니쯔형 (Kunitz-type)트립신의 억제 활성을 갖는 소단위들일 것이다. 이들은 단일 유전자의 1차 전사 산물을 단백질 가수분해에 의해 성숙시킨 결과로 생성되며[Kaumeyer et al., Nucleic Acid Res. 14, 7839,1986 참조) 트립신으로 제거가능한 N-말단 펩티드(아미노산 잔기 1-21)및 두 연속된 구조적으로 연관된 도메인(도메인1은 아미노산 잔기 22-77로서 정의된 N-말단 도메인이고 도메인2는 아미노산 잔기 78-147로서 정의된 단백질의 C-말단부이다)으로 구성되고, 이들은 또한 트립신으로 처리하여 단독으로 얻을 수도 있다. 두 도메인은 억제 특이성이 다른 프로테이나제 억제 작용을 갖는다(Gebhard Hochstraβer in: Proteinase Inhibitors, Barrett Salvesen, eds., Elsevier, 1986, p375 참조).
특이 생리학적 환경에 따라, 급성형 단백질 비쿠닌은 두 복합체 형 (ITI 또는 면역글로블린과의 복합체로) 및 STT로 검출되는 비복합체형으로 존재해도 좋다. UTI는 신장 여과를 겪은 STI이다. 따라서, 각각의 억제제는 이들이 기타 단백질과 결합되었는가 또는 그렇지 않은가 또는 다른 체액에서 검출되는가 하는 점에서만 상이하다. 예컨데, 비쿠닌 도메인에 기초한 호중성 엘라스타아제, 카텝신 G 또는 플라스마 칼리크레인의 특이하고 강력한 억제제는 억제제의 도메인 1 또는 Ⅱ의 반응중심의 P1위치에서 아미노산 잔기들을 대체시킴으로써 얻을 수 있다. 더욱이, 예컨데, 도메인의 특정 P2' 위치에서 추가의 대체는 또한 억제 특성을 더욱 증대시킨다.
따라서, 본 발명은 일반적으로 반응 중심의 P1위치에서 뿐만 아니라 P1 2위치에서 천연 아미노산 잔기가 다른 천연 아미노산 잔기로 대체되었기 때문에 그의 억제 스펙트럼이 쿠니쯔형 억제제의 변이체, 특히 천연 억제제 또는 그의 개별 도메인의 억제 특성이 한개 또는 두개의 도메인의 반응성 중심의 P1및(또는)P2' 위치에서 천연 아미노산 잔기가 다른 아미노산 구체적으로, Ala, Gly, Ile, Leu, Arg, Phe, Val, Tyr, Trp 및 Lys로 되는 군으로 부터의 아미노산에 의해 대체됨으로써 변형 및 (또는) 개선된 것인 한, 인체 비쿠닌의 단일 도메인 또는 서로 연결된 도메인들의 기초 위에서 얻어진 억제제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 천연 cDNA와 상기 합성 DNA의 영역의 코돈 및 연관의 특별한 선택과는 무관하게, 억제제 변이체의 기초를 형성하는 유전자 구성에 관한 것이다.
더 나아가, 본 발명은 또한 한개 또는 두개의 P2' 위치에서 뿐만 아니라 한개 또는 두개의 P1위치에서 치환 이외에 기타 위치에서 다른 대체가 일어난 비쿠닌 변이체에 관한 것이다. 이 종류의 추가의 대체는 목적하는 억제 특성을 더욱 개선시키거나 생체내 반감기를 연장시키는 더욱 바람직한 약리학적 특성을 초래하거나, 또는 보다 이로운 산업적 제제물을 초래할 수도 있다.
마지막으로, 본 발명은 또한 기본 구조의 형성에 필요한 26 및 76 위치(억제제 도메인 1) 및 82 및 132 위치 (억제제 도메인 2)에서 시토신 잔기가 떨어진 성질과 정도가 상이한 N-말단 및 C-말단 펩티드 절편을 갖는 비쿠닌 변이체를 포함한다. 원래 정의된 도메인 한계 (억제제 도메인1의 Lys22및 Arg77및 억제제 도메인 2의 Thr78및 Asn147)는 트립신으로 얻을 수 있는 기능성 펩티드로의 분할의 토대 위에서 정의되었으며 현재 측정되고 있는 엑손 영역과 정확히 일치하지는 않는다 (Vetr et al., FEBS Lett. 출판중, 1989). 이에 의하면, 두 억제제 도메인은 각각 아미노산 잔기 ASP24및 Vla79, 및 Ala80및 Asp137에 제한될 것이다 (제1도 참조). 사용한 발현계에 따라 각각의 유전자 조립체는 이들이 최종 억제제 변이체 중에 전체적으로 또는 부분적으로 함유되었고 단순히 전구체 단백질의 일부분으로서 일시적으로 가능하는지 여부 및 이들 연장부가 천연 비쿠닌 또는 외부 단백질로 지정될 수 있는지 여부에 상관없이 N-또는 C-말단 펩티드 연장부를 암호화할 수 있다.
예컨데, 메치오닌 잔기와는 별도로 비쿠닌의 천연 아미노산 서열과 동일한 N-말단 서열Met18-Thr19-Val20-Lys21을 트립신으로 처리하여 원래 정의된 도메인1의 조성물에 대응하는 단일 생성물을 유리하게 얻을 수 있다. 또한 이러한 방법으로 N-말단 외부 단백질 절편을 갖는 조립체로 부터 비쿠닌 도메인을 용이하게 제거하는 것이 가능하다. (N-말단 외부 단백질 절편이 없이)직접 발현시, 특정 조건 하에서 부분적으로 또는 더나아가 완전히 N-말단 메티오닌이 제거되는 것을 예견해도 좋다. 치료에 응용함에 있어서, 도메인1의 단일-헤드로딘 조립체의 C-말단 아르기닌의 제거가능성을 예방하기 위해 상황에 따라서는 C-말단의 연장이 바람직하다.
비쿠닌의 변이체 또는 비쿠닌 변이체 단편의 발현은 세균 또는 진핵 세표계에서 성공적으로 행해진다. 따라서, 세균성 계 중에서 적합한 것은, 예컨데 세포내에서 형성되고 적합한 융합 파트너(예, MS2 리플리카제의 N-말단부)에 연결된 융합 단백질로서 세포질 내의 비융합 형태이거나 또는 이와 달리, 억제 작용을 갖고 적합한 신호 펩티드 (예, OmpA 신호 펩티드)에 의해 세포주변 공간으로 분비된 생성물의 대장균 K-12 균주의 발현계이다.
진핵세포계 중에서 적합한 것은, 예컨데, 발현 생성물이 분비 경로를 통하여 적합한 리이더 서열 (예, 알파 인자 전선구-서열)에 의해 운반되어 억제 활성을 갖는 물질로서 배양 배지 내로 방출되는 효모 분비계이다. 또한 세포내 합성을 초래하는 효모 발현계를 사용하는 것이 가능하다.
그러나, 추가로 많은 기타의 원핵 또는 진핵 발현계, 예컨데, 고초균, 포도상구균, 하니세눌라, 아스페르길루스의 균주 또는 기타 숙주 균주를 사용하는 것이 가능하다.
포유류에 나타나는 것과 유사한 글리코실화를 얻으려 할 경우, 정확하게 글리코실화가 되는 계를 선택해야 한다. 비글리코실화 비쿠닌 변이체들은 원핵 발현계에서 얻어진다. 효모 발현계는 보통 포유류와 글리코실화 패턴과는 다른 글리코실화를 초래한다. 비글리코실화 비쿠닌 변이체는 탈글리코실화를 사용하거나 또는 글리코실화되지 않는 변이체를 발현 시킴으로써 제조할 수 있다.
본 발명은 비독성, 불활성의 제약상 적합한 부형제 이외에, 본 발명에 의한 화합물 1종 이상을 함유하거나 또는 본 발명에 의한 활성 화합물 1종 이상으로 된 제약 제제 및 이들 제제의 제조 방법을 포함한다.
본 발명은 또한 단위 투여 제약 제제를 포함한다. 이것은 제제가 활성 물질의 함량이 개별 투여량의 분수 또는 배수에 해당하는 개별 형태, 예를 들면, 정제, 피복 정제, 캡슐제, 환제, 좌약제 및 앰플제 형태일 수 있음을 의미한다. 단위 투여는 1,2,3 또는 4배의 개별 투여량을 함유하거나 또는 1/2, 1/3, 또는 1/4의 개별 투여량을 함유할 수 있다. 개별 투여량은 1회 투여하는 활성 화합물의 양 및 일반적으로 1일 투여량, 그의 반절, 또는 삼분의 일 또는 사분의 일에 해당하는 활성 화합물의 양을 함유하는 것이 바람직하다.
제약상 적합한 비독성 불화성 부형제로서는 고형분, 반 고형분 또는 액체희석제, 충전제 및 제형 보조제 등이 될 수 있다.
바람직한 제약 제제로서는 정제, 피복정제, 캡슐제, 환제, 과립제, 좌약제, 용액제, 현탁액제 및 에멀젼제, 페이스트제, 연고제, 겔제, 크림제, 로숀제, 분말제 및 분무제등이 있다.
정제, 피복 정제, 캡슐제, 환제 및 과립제는 활성 화합물 또는 이 화합물과 함께 종래의 부형제, 예를 들면(a) 충전제 및 증량제 (예, 전분, 락토오스, 수크로오스, 글루코오스, 만니톨 및 실리카, (b) 결합제 (예, 카르복시메틸셀룰로오스, 알긴산염, 젤라틴 및 폴리비닐피롤리돈), (c) 보습제 (예, 글리세린), (d) 붕해제 (예, 아가-아가, 탄산칼슘 및 탄산나트륨), (e) 용액 억제제 (예, 파라핀), (f) 흡수 촉진제 (예, 사급 암모늄 화합물), (g) 습윤제, (예, 세틸 알콜, 또는 글리세린 모노스테아레이트), (h) 흡수제 (예, 카올린 및 벤토나이트) 및 (i) 윤활제 (예, 탈크, 스테아르산 칼슘 및 스테아르산 마그네슘 및 고제 폴리에틸렌 글리콜) 또는 상기 (a) 내지 (i) 부형제의 혼합물을 함유할 수 있다.
정제, 피복 정제, 캡슐제, 환제 및 과립제는 임의로는 불투명화제를 함유하는 통상의 피복 및 외피를 갖출 수 있으며, 장관내 특정 부분에서 단지 우선적으로 활성 화합물 또는 활성 화합물들을 임의로는, 지연 방식으로 방출할 수 있는 조성물일 수 있으며, 사용가능한 봉매 조성물의 예로서는 중합체 물질 및 왁스일 수 있다.
활성 화합물 또는 화합물은 임으로는 상기 부형제의 1종 이상을 갖는 미세 캡슐화 형태로 사용될 수 있다.
좌약에는 활성 화합물 또는 화합물들 이외에도 통상의 수용성 또는 수불용성 부형제, 예를들면, 폴리에틸렌 글리콜, 지방 (예, 카카오 지방) 및 고급 에스테르 (예, C16-지방산을 함유하는 C14-알콜) 또는 이들 물질의 혼합물을 함유할 수 있다.
연고제, 페이스트제, 크림제 및 겔제는 활성 화합물 또는 화합물들 이외에도 통상의 부형제, 예를 들면, 동물 및 식물성 지방, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트 (tragacanth), 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 및 산화아연 또는 이들 물질의 혼합물을 함유할 수 있다.
분제 및 분무제는 활성 화합물 및 화합물들 이외에도 종래의 부형제, 예를 들면, 락토오스, 탈크, 실리카, 수산화알루미늄, 규산칼슘 및 폴리아미드 분말 또는 이들 물질의 혼합물을 함유할 수 있다. 분무제는 또한 종래의 추진제, 예를 들면 클로로플루오로히드로카본을 함유할 수 있다.
용액제 및 에멀젼제는 활성 화합물 또는 화합물들 이외에도 종래의 부형제, 예를 들면 용매, 용해제 및 유화제 (예, 물, 에틸알콜, 이소프로필알콜, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸포름아미드, 오일, 특히, 목화유, 땅콩유, 옥수수 배종유, 올리브유, 피마자유, 참깨유, 글리세린, 글리세린포르말, 테트라히드로푸르푸릴알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 또는 이들 물질의 혼합물)를 함유할 수 있다.
비경구 투여용 용액제 및 에멀젼제는 또한 혈액과 등장성인 멸균 형태일 수 있다.
현탁액제는 활성화합물 또는 화합물들 이외에도 종래의 부형제, 예를 들면 희석액 (예, 물, 에틸 알콜, 또는 프로필렌 글리콜), 현탁제 (예, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 소르비탄 에스테르), 미세결정 셀룰로오스, 알루미늄 메타-히드록시드, 벤토나이트, 아가-아가 및 트라가 칸트 또는 이들 물질의 혼합물을 함유할 수 있다.
상기의 제형물은 또한 염료, 방부제 및 향 및 풍미를 개선시키는 첨가제(예를 들면, 페퍼민트유 및 유칼리나무유) 및 감미제 (예, 사카린)를 함유할 수 있다.
치료용 활성 화합물은 바람직하기로는 전체 혼합물의 0.1 내지 99.5 중량%, 더욱 바람직하기로는 약 0.5 내지 95 중량%의 농도로 상기 제약 제제중에 존재해야 한다.
상기 약제는 또한 본 발명의 화합물 이외에도 다른 제약상 활성 화합물도 함유할 수 있다.
상기 약제는 공지된 통상의 방법, 예를 들면, 활성 화합물 또는 활성 화합물들을 다른 부형제 또는 부형제들과 혼합시킴으로써 제조한다.
활성 화합물 또는 약제는 국부, 경구, 비경구, 복막내, 및(또는) 직장으로 투여할 수 있으며, 경구 또는 비경구 투여가 바람직하며, 정맥내 또는 근육내 투여가 특히 바람직하다.
일반적으로, 인체 의약 및 수의약 모두에 있어서 본 발명의 활성 화합물 또는 화합물들은 최상의 결과를 얻기 위해서 24시간마다 수회 개별 투여 형태로 약 0.5내지 500㎎/㎏(체중), 바람직하기로는 4 내지 100㎎/㎏(체중)의 전체량을 투여하는 방법이 유익한 것으로 밝혀졌다. 개별 투여 형태는 본 발명의 활성 화합물 또는 활성 화합물을 약 1 내지 250㎎/㎏(체중), 바람직하기로는 3 내지 60㎎/㎏(체중) 함유할 수 있다. 그러나, 상기 투여량으로부터 변형시켜 투여할 필요성이 있으며, 구체적으로는 치료할 대상의 특성 및 체중, 질병의 특성 및 심도, 제제의 특성 및 약물 투여의 특성, 투여하는 시간 및 투여시간 간격에 의존한다.
따라서, 어떤 경우에 있어서 활성 화합물의 상기량 미만으로 투여하는 것이 충분할 수 있는 반면에 다른 경우에 있어서는 활성화합물의 화합물의 최적 투여 및 투여 형태는 당업계의 숙련된 사람에 의해 전문적인 지식에 기초하여 쉽게 결정할 수 있다.
[방법]
제한 효소로 DNA를 절단하고, DNA 폴리머라제 Ⅰ의 존재 중에서 5'-돌출 말단을 dNTP로 채워, 멍 빈(mung bean) 뉴클리아제로 절단하고, DNA를 전기영동시킨 후, DNA 단편을 단리시키고, DNA 단편을 결찰시키고, 대장균을 형질 전환시키고, 콜로니 혼성화시키는 방법은 마니아티스 (Maniatis) 등의 Cold Spring Harbor (1982)사 출판 Molecular Cloning에 기재된 표준 방법을 사용하였으며, 제조회사의 정보[Boehringer Mannheim (Mannhim)사, Biolabs (Schwalbach)사, Pharmacia (Freiburg)사로 부터 구입한 제한효소, 멍 빈 뉴클레아제(Pharmacia사 제품) 및 컴피턴트 대장균 세포 (BRL, Eggenstein)]를 이용하였다.
[올리고뉴클레오티드의 화학적 합성]
올리고뉴클레오티드는 확립된 포스포아미다이트 화학 (β-시아노에틸 N,N'-디이소프로필포스포아미다이트)을 사용하여 Pharmacia Gene AssemblerTM중에서 합성하고 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 정제하였다.
[DNA 서열화]
개별 유전자 구조의 DNA 서열을 확인하기 위해서 이중 가닥 DNA를 Chen Seeburg (DNA, 제4호, 제165페이지, 1985년)의 방법으로 각각의 경우에 두가닥 모두를 직접 서열화하였다.
[효모 형질 전환]
효모 균주 SC106[MAT-알파, hom3, ga12, his6, ura3, 균주 S2207A, 미합중국 94720 캘리포니아주 버클리 소재, 캘리포니아 대학교(University of California)의 효모 유전자 저장 센터 (Yeast Genetics Stock Center]의 세포농도 2 x 107/㎖인 세포 현탁액 100㎖를 원심분리시키고, 세포 침전물을 TE 완충액(10mM Tris x HC1, pH 7.5, 1mM EDTA) 5㎖로 1회 세척한 후, LiA 완충액 (완충액중의 0.1M 리튬 아세테이트)5㎖로 세척하였다. 이어서 이 세포를 LiA 완충액 1㎖ 중에 현탁시키고, 30℃에서 1시간 동안 배양시켰다. 이 방법으로 얻은 컴피턴트 세포를 4℃에서 하루동안 저장하였다. 형질 전환은 다음의 방법으로 행하였다.
플라스미드 용액 10㎕(DNA 1 매지 5㎍) 및 담체 DNA 15㎕(청어 정액으로부터의 변성 DNA, 3㎎/㎖)를 세포 현탁액 0.1㎖에 첨가하였다. 30℃에서 30분 동안 배양시킨 후 폴리프로필렌 글리콜 (LiA 완충액 중의 40% 폴리프로필렌 글리콜 3350) 0.7㎖를 첨가하고, 이어서 30℃에서 60분 동안 추가로 배양시켰다. 이어서 이 세포를 열 쇼크(heat shock)(42℃, 5분) 가한 후 에펜도르프 소형 원심분리기에서 4초 동안 원심분리시켰다. 세포 펠릿을 각각 TE 완충액 0.5㎖로 2회 세척한 후, 이 세포를 TE 완충액 0.1㎖ 중에 현탁시켜 선택 영양 배지상에 평평하게 깔았다. 3일 후에 형질전환체를 얻었다.
[형질전환체의 배양 및 분비물의 분석]
형질전환체를 트레오닌, 메티오닌, 및 히스티딘 (각각 20㎎/리터)을 함유한 SD 배지(아미노산이 없는 0.67% 효모 질소 기재, 2% D-글루코오스)에서 30℃에서 배양시켰다. 충분한 세포 밀도에 도달한 후, 세포를 원심분리시키고, 배양물 상층액 중의 트립신 또는 엘라스타제 억제 활성을 측정하였다.
[폴리아크릴아미드 겔 전기 영동]
단백질은 통상적으로 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 검출 하였으며 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliaut blue)로 착색시켰다.
[아미노산 분석]
단백질 약 1나노몰(nmol)을 진공하, 6M HC1, 0.05% β-메르캅토에탄올 200μ1 중의 110℃에서 22시간 동안 배양시켰다. 가수분해물을 건조시키고, 0.2M 시트르산나트륨 완충액, pH 2.2, 150㎕ 중에 용해시키고, 여과시켰다. 아미노산 분석은 형광 검출기 및 C-R2AX 적분기를 갖춘 Biotronic LC 500 아미노산 분석기 (Shimdzu사 제품)로 행하였다. 이 아미노산은 참고 문헌(Bonson Hare의 Proc. Notl. Acad. Sci. USA 제72호, 제619페이지 (1975))에 따라 프탈알데히드와 반응시킨 후 정량하였다.
[아미노산 서열화]
트리플루오르아세트산 30㎕중에 용해된 단백질 1 내지 2 나노몰 (nmol)을 폴리브렌(Polybrene)으로 처리된 유리 섬유 여과기에 적용시켜 훼익크(Hewick)등의 J. Biol. Chem. 제 256호 제799페이지 (1981)의 방법으로 가스상 서열 분석기 중에서 서열을 결정하였다. 페닐티오히단토인 유도체를 분리하고, Waters HPLC계를 사용하여 베이레우터 (Beyreuther) 등의 Modern Methods in Protein Chemistry, 제303-325페이지, Walter de Gruyter 출판사, 베를린 소재 (1983)에 기재된 바와 같이 시아노 HPLC 컬럼(DuPont사 제품)을 사용하여 분석하였다.
[트립신 억제능 분석]
트립신 활성은 게이거(Geiger) 및 프리쯔 (Fritz)의 Methods of Enzymatic Analysis, 제V권, 제3판, Bergmeyer(판), Verlag Chemie 출판사, Weinheim (1984)소재, 제121페이지의 방법으로 기질로서 벤조일-L-아르기닌 p-니트로아닐리드로 측정하였다. 방출된 p-니트로아닐린은 405nm에서 분광계로 측정하였다. 효소 및 억제제는 기질을 첨가하기 전에 15분 동안 예비 배양시켰다.
[엘라스타제 억제능 분석]
인체 백혈구 엘라스타제를 미합중국 엘라스틴 프로덕츠 캄파니 (Elastin Products Company Inc.사)[P.O.Box 147, Pacific, Miss. 63069, U.S.A 소재]로 부터 구입하였다. 사용한 기질은 MeOSuC-Ala-Ala-Pro-Val-PNA(Bachem, Bubendorf, Switzerland)이었다. 분석 조건은 표 1에 나타냈다. 일반적으로, 억제제 샘플은 분석 완충액으로 희석시키고, 효소를 첨가하고, 이 혼합물을 예비 배양시켰다.
이 반응은 기질 (DMSO 중에 0.1m 농도로 용해시키고 완충액으로 저장용액 농도로 조정하였음)을 첨가시킴으로써 시작되었으며, 기질로부터의 p-니트로아닐린의 방출은 405nm에서 계속적으로 측정하였다. 100% 값은 억제제 없이 대응하는 분석법에서 결정하였다. 억제능(백분율)은 다음 방정식으로 계산하였다.
Figure kpo00003
Figure kpo00004
[실시예 1]
[비쿠닌 유전자 변이체의 제조 및 대장균 내에서의 발현]
각각의 비쿠닌 유전자 변이체들은 일면으로는 천연 mRNA에 기초하고, 다른 일면으로는 각각의 도메인 또는 이들 부분의 합성 유전자에 기초한다. cDNA 클론들은 올리고뉴클레오티드 프로브와의 혼성화 (Kaumeyer et al., Nucleic Acids Res. 14, 7839-7849, 1986 참조)에 의하거나 또는 항체로 인해 인터-α-트립신 억제제에 대하여 선별화 (Schreitm
Figure kpo00005
ller et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 368, 963-970, 1987 참조) 함으로써 적합한 cDNA 은행으로 부터 얻었다. 합성 유전자 (제1 도메인)또는 유전자 절편(제2 도메인)을 다음과 같이 얻었다:
Xaa=Ile, Leu, Met 또는 Val을 갖는 de[1-17,78-147]-Met18-Xaa36-Xaa38-비쿠닌 유전자의 제조
제1 도메인 (de[1-17,78-147]-Met18-비쿠닌) 및 그의 변이체 (예컨데, Xaa=Ile, Leu, Met 또는 Val을 갖는 de[1-17,78-147]-Met18-Xaa36-Xaa38-비쿠닌)에 대한 유전자는 완전한 합성에 의해 생성되었고 제한 효소 NcoI, Asp718및 SaII의 적합한 조합으로 절단시킴으로써 이들 유전자들로 부터 단독으로 또는 함께 제거될 수 있는 두 모듈로 부터 제조하였다. 이 제조에 의해 변이체의 제조(제2도 참조)를 위한 여러가지 백터계에 있어서 유전자 조작 및 내부의 Asp718제한 절단 부위를 통한 모듈의 대체가 촉진되었다.
모듈1은 올리고뉴클레오티드 1-6을 포함하며 모듈2는 올리고뉴클레오티드7-12를 포함하였다. Xaa36-Xaa38변이체의 제조는 단순히 모듈 1의 대체만을 필요로 하였다. 모듈1 변이체를 제조하기 위해선, 올리고뉴클레오티드 2,3,5 및 6을 필요시, 메티오닌(ATG)에 대한 코돈을 이소류신(ATC), 류신(CTG) 또는 발린(GTT) 또는 반대 가닥 중의 이것의 상보성 가닥에 대한 코돈으로 대체시킨 올리고뉴클레오티드 변이체로 대체시켰다. N-말단 서열 V-T-K는 천연 N-말단 펩티드의 부분이었다. 유일한 외부 아미노산은 이것의 제거를 대장균 내에서 유전자의 직접 발현시 행할 수 있는 출발 메티오닌이었다.
클로닝 방법은 도면 제3도에 나타냈다. 플라스미드 pTZ18NCO는 pTZ18R (파마시아사에서 입수)를 EcoRI으로 절단하고, 멍 빈 뉴클레아제로 처리한 후, 팔린드롬성 서열 5'-ACCATGGT-3'과 연결하여 대장균 DH5내에서 형질전환시킴으로써 제조하였다. 이 제조물은 서열 분석에 의해 확인하였다.
플라스미드 pTZMODI 및 pTZMOD1XX (xx=IL, LM, MM, LL, VL)은 플라스미드 pTZ18NCO를 NcoI 및 Asp718로 절단시키고, 선형 플라스미드를 올리고뉴클레오티드 1-6(모듈1, 제2도) 또는 폴리뉴클레오티드 키나아제로 인산화시킨 대응하는 올리고뉴클레오티드 변이체와 연결시킨 후 서열화 및 대장균 DH5 내로의 형질전환 및 방사성 표지시킨 올리고뉴클레오티드4로의 콜로니 혼성화 후 플라스미드 DNA를 단리함으로써 특성화하였다.
플라스미드 pTZKUN1은 플라스미드 pTZMOD1을 ASP 718 및 Sa1I으로 절단시키고, 선형 플라스미드를 폴리뉴클레오티드 키나아제로 인산화시킨 올리고뉴클레오티드 7-12 (모듈2)와 연결시킨 후, 대장균 DH5내로의 형질전환 및 방사성 표지시킨 올리고뉴클레오티드 11로 콜로니 혼성화시키고 이어서 플라스미드 DNA의 서열화에 의해 특성화시킨 후 단리하였다.
플라스미드 pTZKUN1XX (XX-IL, LM, MM, LL, VL)를 제조하기 위해, 이 모듈의 각각의 올리고뉴클레오티드 7-12 대신에 pTZKUN1로 부터 Asp 718 및 Sall로 제거한 모듈2의 단편을 사용하고 제조를 위한 공정은 상기한 바와 유사하였다.
de[1-17]-Met18-Xaa36-Xaa38-비쿠닌 유전자의 제조
de[1-17]-Met18-Xaa36-Xaa38-비쿠닌형의 비쿠닌 유전자는 제1 도메인 중에서만 아미노산 치환체를 갖는 이중 헤드로된 변이체이다. 이들은 제1 도메인 또는 이것의 변이체의 합성 유전자를 제2 도메인의 천연 유전자 단편과 축합시킴으로써 얻었다. 클로닝 방법은 도면 제4도에 기재하였다.
플라스미드 pTZBIK는 pTZ18R 중에 클로닝시킨 α1-마이크로클로불린-비쿠닌 클론의 cDNA로 부터 제한 뉴클레아제 Sau3A로 절단시킴으로써 얻었다. 이 생성된 단편 A (제4도 참조)를 겔 전기영동에 의해 단리하였다. 이 단편은 α1-마이크로 글로불린-암호화 부위가 없는 거의 완전한 비쿠닌 유전자 및 비쿠닌의 N-말단 펩티드에 대한 유전자 절편을 소부분 함유하였다. 절편의 말단을 클레나우(Klenow)효소 존재 하에서 dATP 및 dGTP로 채우고 멍 빈 뉴클레아제로 평활 말단을 만든 후, Hind III로 선형화시켜 상기와 같이 멍빈 뉴클레아제로 평활 말단을 만든 플라스미드 pTZ19R (파마시아사 제품)내에 클로닝시켰다. 대장균 DH5 내로의 형질전환을 행하였다. 생성된 클론의 플라스미드 DNA는 서열 분석에 의하여 확인하였다.
플라스미드 pTZBIK1 및 pTZBIK1XX (XX=IL, LM, MM, LL, VL)은 비쿠닌 유전자의 도메인 1의 천연 유전자 절편을 적절한 합성 유전자 절편 또는 이들의 변이체 중 하나로 대체하여 발생시켰다. pTZBIL DNA의 절편C를 SphI 및 PstI으로 절단한 후 단리하였으며 도메인1의 모든 부분에 대한 유전자 절편이 제외된 비쿠닌의 완전한 cDNA 서열을 함유하고, 대응하는 절단 플라스미드 pTZKUN1 및 pTZKUN1XX (XX=IL, LM, MM, LL, VL)(제3도 참조)에 연결시킨 후 대장균 DH5에 클로닝시켰다. 생성 클론들의 플라스미드 DNA는 서열 분석에 의해 특성화하였다.
Xaa=Ile, Leu, Met, Val, Phe를 갖는 de[1-17]-Xaa92-Xaa94-비쿠닌 유전자의 제조
비쿠닌을 절단하여 제2 도메인 (de[1-79]-비쿠닌)을 얻었다. 그의 변이체 (de[1-7]-Xaa92-Xaa94-비쿠닌)는 도메인 2(모듈3)의 ApaI/XmnI 제한 단편을 제7도에 나타낸 바와 같이 올리고뉴클레오티드 A-D 또는 이들의 변이체 (제6도)의 적절한 조합으로 대체시킴으로써 제조하였다.
플라스미드 pTZKUN2(제5도)는 pTZBIK1 DNA를 제한 효소 Hind III 및 BspMI으로 처리한 후 멍 빈 뉴클레아제로 단편의 말단에서 평활 말단을 만든 단편 A를 XcyI로 절단시켜 상기와 같이 멍빈 뉴클레아제로 처리한 벡터 pTZ 19(R)과 대장균 DH5 세포로 형질전환시킨 후 연결시켰다. 각각의 클론들의 플라스미드 DNA를 서열 분석에 의해 특성화시켰다.
pTZKUN2의 ApaI/XmnI를 모듈 3의 적당한 올리고뉴클레오티드로 대체시켜 플라스미드 pTZKUN2XX (XX=IL, LL, VL 및 LF)를 얻었다(제6도 참조). 상기 제한 뉴클레아제로 절단하고 5'말단을 송아지의 장내 알칼리성 포스파타아제로 데포스포릴화 시킨 후 벡터 단편이 단리되었다. 폴리뉴클레오티드 키나제로 포스포릴화시킨 모듈 3의 올리고뉴클레오티드와 연결시키고, 대장균 DH5내에서 형질 전환시킨후 지도로 나타내어 개별 클론의 플라스미드 DNA를 특성화시키고 최종적으로 서열분석하였다 (제7도).
de[1-17-Met18-Xaa36-Xaa38-Xaa92-Xaa94-]-비쿠닌 유전자의 제조
양도메인에서 치환체를 갖는 비쿠닌 유전자 변이체는, 변이체 도메인 1(pTZBIK1XX; 제4도)를 갖는 비쿠닌 유전자 변이체로부터 제8도에 나타낸 방법과 같이 천연 도베인2의 유전자 절편을 도메인2의 유전자 변이체의 대응 절편으로 대체시킴으로써 생성시켰다.
제한 뉴클레아제 EcoRI 및 ApaI에 의한 플라스미드 pTZBIXX의 절단, 송아지 장의 알칼리성 포스파타아제로 DNA 절편의 5' 말단의 탈인산화 및 벡터 단편의 단리에 이어 이와 마찬가지로 pTZKUN2XX로 부터 단리한 EcoRI/ApaI 단편과 연결시킨 후 대장균 DH5내에 클로닝시켰다. 각각의 클론들의 플라스미드는 서열 분석에 의해 특성화하였다.
de[1-17,82-147]-Met18-Xaa36-Xaa38-비쿠닌 유전자의 제조
아미노산 서열 T-V-A-A(de[1-17,82-147]-Met18-Xaa36-Xaa38-비쿠닌)의 추가의 C-말단 연장부를 갖는 제1 도메인의 유전자를 적절한 비쿠닌 변이체의 플라스미드 pTZBIK1XX를 제2 도메인을 올리고뉴클레오티드 a(5'-CTGTGGCGGCCTGAG-3') 및 b(5'-AATTCTCAGGCCGCC-3')으로 대체한 후 얻었다 (제9도). 이 목적을 위해, pTZBIK1XX를 BspMI 및 EcoRI으로 절단하고, DNA 단편의 5' 말단을 송아지 장의 알칼리성 포스파타아제로 탈인산화시킨 후 올리고뉴클레오티드의 존재하에서 연결시켰다. 대장균 DH5의 형질전환 후, 각각 콜론의 플라스미드 pTZKUN1XXc를 서열 분석에 의해 확인하였다.
[비쿠닌 변이체의 발현]
상기 일부 비쿠닌 유전자 변이체를, 그 자체로 및 여러가지 발현 벡터, 예컨데, PJLA50Z (Schauder et al., Gene 52, 279-283, 1987), pEX3 (Stanley Luzio, EMBO J. 3, 1429-1434,1984) 및 pEX 3407 (Kocken et al., FEBS Lett. 236, 132-134, 1988)에 재클로닝시킨 후의 상태로 클로닝 벡터에서 발현시키는 것이 가능하였다. 예컨데, NcoI/SalI 및 NcoI/-EcoRI 단편은 각각 플라스미드 pTZKUN1XX 및 pTZBIK1XX2XX로 부터 단리시킬 수 있으며, 일치되게 절단하여 소아지 장의 알칼리성 포스파타아제로 처리한 벡터 pJLA502에 직접 연결시킬 수 있었다. 별도로, 플라스미드 pTZBIK1XX (NcoI/EcoRI 단편, 제4도), pTZBIK1XX2XX (NcoI/EcoRI 단편, 제8도), pTZKUN1XX (NcoI/Hind III 단편, 제3도)로 부터의 단편을 단리하고 멍 빈 뉴클레아제로 평활 말단을 만들어서 벡터 pEX3 또는 pEX3407에 연결시켰다.
플라스미드 pTZKUN2XX의 단편 (제8도)을, EcoRI으로 절단하고, 멍 번 뉴클레아제로 처리한 후 연속해서 BamHI으로 절단시킨 후 pEX 벡터 내에 연결시켜 생성시켰다. 이 목적을 위해 pEX 벡터의 DNA를 SalI으로 절단하고, 멍 빈 뉴클레아제로 처리하거나, 앞서 언급한 제조법과 마찬가지로, PstI로 절단하고, 멍 빈 뉴클레아제로 처리하고 이어서 BamHI 으로 절단하였다. 대장균 pop2136의 형질전환체 (Vidal-Ingigliardi Raibaud, Nucleic Acids Res. 13, 1163, 1985)는 유전자 발현의 온도의 의존성 조절을 허용하였다. 모든 경우에 생성되는 이 융합단백질은 산-불안정 Asp-Pro 펩티드를 경유하여 발현될 단백질에 연결되었다. 융합 단백질의 제거, 비쿠닌 부분의 정제 및 재생에 의해 de[1-17,78-147]-Pro18-비쿠닌, de[1-17,78-147]-Pro18-비쿠닌 및 de[1-78]-Pro18-비쿠닌 및 de[1-78]-Pro79-비쿠닌형의 억제제 변이체를 생성하였다. 이 비쿠닌 부분은 또한 (트립신으로)단백질가수분해에 대해 특히 불안정한 서열 Pro20-Lys21-Lys22를 사용함으로써 융합 파트너로 부터 절단시킬 수 있었다. 단일-헤드로 된 변이체를 특히 분비발현계 중에서 잘 발현시킬 수 있었다.
발현 생성물은 (예컨데, 융합 단백질의 측정을 위해) 겔 전기영동에 의해 또는 표준 효소 억제분석(융합 파트너의 제거, 비쿠닌 부분의 정제 및 재생 후)에 의해 측정하였다.
얻어진 결과는, 예컨데, 대장균에서 발현에 대해 기재한 방법으로 제조한 de[1-17]-Met-18-Leu-36-Leu-38-비쿠닌, de[1-17]-Met-18-Leu-36-Leu-38-Leu-92-Leu-94-비쿠닌 및 de[1-17]-Met-18 -Leu-92-Leu-94-비쿠닌이 강력한 프로테아제 억제작용을 가짐을 나타냈다.
[실시예 2]
[Leu-36-Leu-38-비쿠닌의 발현]
유전자의 클로닝 : MAT-알파-1 구조 유전자를 함유한 pBR322로 부터 유도된 벡터인 pCY17 (Kurjan and Herskowitz, Cell, 30, 933, 1982 참조)은 캘리포니아 대학교의 헤르스코비쯔 (Herskowitz)로 부터 입수하였다. pMT15는 효모-대장균 셔틀 벡터이다(제10도 참조). 이것은 대장균 및 효모에 대한 선별 마커로서 작용하는 AmpR, bla 및 URA3 유전자 절편을 함유한다. pMT15는 추가로 pBR322의 ColE1 복제 기점 및 2μ 플라스미드의 B형 절편을 가지므로 이 플라스미드는 대장균 및 효모 모두에 있어서 안정된 복제를 수행할 수 있었다. 이것은 또한 플라스미드 pCY17로 부터 얻은 EcoRI-Hind III 절편으로서 MAT1-알파 프로모터 및 알파 인자 전구 단백질의 N-말단 전선구 서열을 암호화하는 서열을 함유하였다. 이 절편에 이어 전구-인버타아제의 34 N-말단 아미노산을 암호화하는 115 bp HindIII- BamHI 단편이 3' 말단에 존재한다 (Das et al., Mol. Gen. Genet., 218, P. 240, 1989 참조). 마지막으로 pMT15는 BamHI 절단 부위의 3' 말단에 효모 URA3 유전자로 부터 얻은 160bp의 효모 전사 터미네이터를 함유하였다 (Yarger et al., Mol. Cell. Biol. 8, 1095, 1986 참조).
pMT15로 부터 알파-인자 전선구-리어터 서열의 암호와 영역을 함유하는 235 bp Pst I-Hind III 단편을 벡터 M13mp18내에 클로닝시키고 돌연변이유발성 올리고뉴클레오티드 5'-GAA GAA GGG GTA TTG GAT AAA AGA-3'을 사용하여 부위 특이성 돌연변이시켰다. 돌연변이 유발 결과 알파 인자 전선구-서열 중의 81번 위치에서 세린 코돈이 TGT에서 AGC로 변화되어 Hind III제한 요소 절단 부위가 발생되었다. 이에 따라 제조한 213bp PstI-HindIII 단편(제11도)은 pMT15의 235bp PstI-Hind III 단편을 대체하는데 사용하였다. 이러한 식으로 변형시킨 플라스미드를 pS600으로 칭하였다. 이것은 프로세싱 부위로서 Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala대신에 Lys-Arg를 암호화하는 서열을 함유하였다 (제12도 참조).
Leu-36-Leu-38-비쿠닌 유전자의 제조 : 비쿠닌의 암호화 서열을 갖는 플라스미드 PIMI (Das and Lehman, J. Cell. Biochem. 2B, 284,1988 참조)으로 부터의 540 bp Sau3AI 단편을 M13mP19에 클로닝시키고 Met-36을 Leu-36으로 및 Met-38을 Leu-38로 형질전환시키기 위해 부위 특이성 돌연변이 유발시켰다. 돌연변이 유발은 세이어 등 [Sayer et al., Nucl. Acids. Res., 16, 79(1988년)]의 방법에 의해 행하였다. 추가로 다음의 서열로 된 이중 가닥 DNA 단편을 제조하였다.
5' ... AGC TTG GAT AAA AGA GCT GTG CTA CC CAA
3'- AC CTA TTT TCT CGA CAC GAT GGG GTT
GAA GAG GAA G............................3'
CTT CTC CTT CCT AG.................5'
이 DNA 단편을 표준 공정에 의해 인산화 시켰다. 이러한 방식으로 얻은 DNA 단편을 돌연변이시킨 비쿠닌 서열과 함께 Hind III 및 BamHI으로 절단시킨 8.2 bp PS600 플라스미드 내에 삽입시켰다. 올리고머를 전선구 인자 서열의 3' 말단 및 비쿠닌 유전자의 5' 말단에 재구성시켰다. 이와 같이 얻은 신규 플라스미드 pLLB 3638은 Leu-36-Leu-38-비쿠닌 서열에 융합된 프로세싱 부위로서 Lys-Arg를 갖는 전선구-알파 인자 성려에 대한 암호화 영역을 함유하였다. pLLB 3638 중의 전선구-알파 인자- Leu-36-Leu-38-비쿠닌의 융합 부위에서 DNA 및 대응 아미노산 서열을 제14도에 나타냈다.
억제 작용을 갖는 Leu-36-Leu-38-비쿠닌의 발현, 분비 및 탐지 : 효모 균주SC106(MATα, hom3, ga12, his6, ura3)을 상기 방법에 따라 pLLB 3638로 형질전환시켰다. URA3+ 세포들을 단리하여 배양하였고 배양 상층액을 엘라스타아제-억제 활성에 대해 시험하였다. 대조 시험에 있어서 pS 600으로 형질전환시킨 SC106세포들은 배양 배지에서 엘라스타아제-억제 작용을 갖지 않는 것으로 나타났다.
얻은 결과는 맥주 효모균 (Saccharomyces cerevisiae)에서 발현된 Leu-36-Leu-38-비쿠닌 유전자는 배양 배지에서 다음의 특성을 갖는 두 단백질 종의 형성을 초래하였음을 나타냈다: (a) 활성 트립신 억제제, (b) SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동에 의한 20K 및 17K의 분자량, (c) 비쿠닌의 N-말단 서열의 약60% 나타내고 de,[Ala-1)-비쿠닌의 서열이 약 60% 나타내는 각각의 단백질 종.
[실시예 3]
[Leu-92-Leu-94-비쿠닌의 발현]
유전자 클로닝 ; 비쿠닌의 암호화 서열을 갖는 pIM1 DNA (Das and Lehman, J. Cell. Biochem. 12B, 284, 1988)의 540bp Sau 3AI 단편 (제13도 참조)을 플라스미드 M13 mp19 내에 클로닝시키고 Arg-92를 Leu-92로 Phe-94을 Leu-94로 변화되도록 부위 특이성 돌연변이를 유발시켰다. 이러한 방식으로 돌연변이시킨 단편들을 실시예1과 유사하게 플라스미드 pS 600내에 클로닝시켰다. 발현 벡터 pLLB 9294의 전선구-알파-인자-Leu-92-Leu-94-비쿠닌 유전자의 융합 부위에서 DNA 서열 및 대응 아미노산 서열을 제15도에 나타냈다.
억제 작용을 갖는 Leu-92-Leu-94-비쿠닌의 발현, 분비 및 탐지 : SC106Y을 상기 방법에 따라 pLLB 9294로 형질전환시키고; URA3+ 세포들을 단리하여 배양시키고; 배양 상층액을 엘라스타아제-억제 활성에 대해 시험하였다. 대조 시험에 있어서 pS600으로 형질전환시킨 SC106 세포들은 배양 배지에서 엘라스타아제-억제 작용을 갖지 않는 것으로 나타났다.
얻은 결과들에 있어서 맥주 효모균 (Saccharomyces cerevisiae)에서 발현된 Leu-92-Leu-94-비쿠닌 유전자는 배양 배지에서 다음의 특성들을 갖는 두 단백질종의 형성을 초래하였음을 나타냈다: (a) 활성 엘라스타아제 억제제, (b) SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 20K 및 17K의 분자량, (c) 비쿠닌의 N-말단서열을 약 60% 나타내고, de(Ala-1)-비쿠닌의 서열을 약 40% 나타내는 각각의 단백질 종.
[실시예 4]
[Leu-36-Leu-38-Leu-92-Leu-94-비쿠닌의 발현]
유전자 클로닝 : 비쿠닌의 암호화 서열을 갖는 pIM1 DNA (Das and Lehman, J. Cell. Biochem. 12B, 284, 1988)의 540 bp Sau 3AI 단편 (제13도 참조)을 플라스미드 M13mp19 내에 클로닝시키고 Met-36을 Leu-36으로, Met-38을 Leu-38로, Arg-92를 Leu-92로 Phe-94을 Leu-94로 변환되도록 부위 특이성 돌연변이를 유발시켰다. 이러한 방식으로 돌연변이시킨 단편들을 실시예 1과 유사하게 플라스미드 pS600 내에 클로닝시켰다. 발현 벡터 p4LB의 전선구-알파-인자-Leu-36-Leu-38-Leu-92-Leu- 94-비쿠닌 유전자의 융합 부위에서 DNA 서열 및 대응 아미노산 서열을 제16도에 나타냈다.
억제 작용을 갖는 Leu-36-Leu-38-Leu-92-Leu-94-비쿠닌 유전자의 발현, 분비 및 탐지: SC106을 상기 방법에 따라 p4LB로 형질전환시키고; URA3+ 세포들을 단리하여 배양하고; 배양 상층액을 엘라스타아제-억제 활성에 대해 시험하였다. 대조시험에 있어서 pS600으로 형질전환시킨 SC106 세포들은 배양배지에서 엘라스타아제-억제작용을 갖지 않는 것으로 나타났다.
얻은 결과들에 있어서는 맥주 효모균에서 발현된 Leu-36-Leu-38-Leu-92-Leu-94-비쿠닌 유전자는 배양 배지에서 다음의 특성들을 갖는 두 단백질 종의 형성을 초래하였음을 나타냈다: (a) 활성 엘라스타아제 억제제, (b) SPS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의한 20K 및 17K의 분자량, (c) 비쿠닌의 N-말단 서열을 약60% 나타내고 de(Ala-1)-비쿠닌의 서열을 약 40% 나타내는 각각의 단백질종.
[실시예 5]
[de(1-21)-Leu-36-Leu-38-비쿠닌의 발현]
유전자의 클로닝: de(1-21)-비쿠닌의 암호화 영역 (제13도)을 갖는 pIM1 DNA(Das and Lehmann, J. Cell. Biochem, 12B, 284, 1988)의 480 bp PvuII 단편을 플라스미드 M13mp19내에 클로닝시키고 Met-36을 Leu-36으로 Met-38을 Leu-38로 변환시키기 위해 부위 특이성 돌연변이시켰다. 돌연변이유발은 세이어 등 [Sayer et al.,Nucl. Acids. Res., 16, 791 (1988년)]의 방법에 의해 행하였다.
추가로 다음의 서열로된 이중 가닥 DNA 단편을 제조하였다:
5'-AGC TTG GAT AAA AGA AAA GAA GAT TCC TGC CAG-3'
AC CTA TTT TCT TTT CTT CTA AGG ACG GTC-5'
이 DNA 단편을 표준 공정에 의해 산화시켰다. 이러한 방식으로 얻은 DNA 단편을 돌연변이시킨 비쿠닌 서열과 함께 Hind III 및 BamHI로 절단시킨 8.2 bp pS600 플라스미드 내에 삽입시켰다. 올리고머를 전선구-알파-인자 서열의 3' 말단 및 비쿠닌 서열의 5' 말단에 재구성시켰다. 이와 같이 얻은 신규 플라스미드 pDLLB-121은 de(1-21)-Leu-36-Leu-38-비쿠닌 서열에 융합된 프로세싱 부위로서 Lys-Arg 를 갖는 전선구-알파 인자 서열에 대한 암호화 영역을 함유하였다. pDLLB-121 중의 전선구-알파 인자-Leu-36-Leu-38-비쿠닌의 융합 부위에서 DNA 및 대응 아미노산 서열은 제17도에 나타냈다.
억제작용을 갖는 de(1-21)-Leu-36-Leu-38-비쿠닌 발현, 분비 및 탐지: SC106을 상기 방법에 따라 pDLLB-121로 형질전환시키고; URA3+세포들을 단리하여 배양하고; 배양 상층액을 엘라스타아제-억제 활성에 대해 시험하였다. 대조시험에 있어서 pS600으로 형질전환시킨 SC106 세포들은 배양 배지에서 엘라스타아제-억제 작용을 갖지 않는 것으로 나타났다.
얻는 결과들에 있어서는 맥주 효모균에서 발현된 de(1-21)-Leu-36-Leu-38-비쿠닌유전자를 배양 배지에서 다음의 특성들을 갖는 단백질의 형성을 초래하였음을 나타냈다: (a) 활성 트립신 억제제, (b) SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의한 17K 및 15K의 분자량, (c) de(1-21)-비쿠닌 N 말단 서열 Lys-Glu-Asp-Ser-Cys 을 나타내는 단백질.
제1도에 있어서, N-말단 펩티드 (1-21번 위치) 및 도메인 1 (22-77번 위치) 및 2(78-147번 위치)는 트립신으로 절단시킴으로써 얻어진다. 화살표는 상이한 엑손들에 의해 암호화되는 영역의 서열을 나타내고, 발표는 반응 중심의 특이적으로 변형된 잔기 P1및 P'2를 나타낸다. 비쿠닌의 두 억제제 도메인에 있어서 동일한 아미노산 잔기들은 수직선으로 강조하였다.
제2도에 있어서, 변이체에 대체된 잔기들은 복선으로 밑줄을 그었다. NcoI인식 서열CCATGC의 유전자 부분의 5' 말단에서 첫번째 코돈 및 유전자의 3' 말단에서 3개으 연속적인 정지 코돈(end)중 세번째 마지막 뉴클레오티드는 Sall인 식 서열 GTCGAC의 부분이다. 개별적인 모듈을 제한하는 제한 뉴클레아제 NcoI, Asp 718 및 Sall에 대한 인식 서열은 단선으로 밑줄 그었다. 유전자의 제조에 사용된 올리고뉴클레오티드들은 화살표의 번호로 나타냈다.
제4도에 있어서, M : α1-마이크로글로불린; D1 및 D2 : 비쿠닌의 도메인 1 및 2 ; N: 비쿠닌의 N-말단 펩티드; C: 비쿠닌의 C-말단 서열; KUN1 : 모듈 Mod1 및 Mod2로 되는 합성 도메인 1. 클로닝 공정에 따라 없어진 절단 부위는 생성 플라스미드에 있어서는 더 이상 동정하지 않고 표시하였다. 단편 B 및 D는 이들이 이와 같이 생성되지 않았을 경우에라도 이해를 돕도록 기재하였다.
제5도에 있어서, D2: 비쿠닌의 도메인 2, C: 비쿠닌의 C-말단 서열; KUN1 : 모듈 Mod1 및 Mod2로된 합성 도메인 1; 클로닝 공정에 따라 없어진 절단 부위는 생성된 플라스미드에서의 동정 없이 기재하였다. 단편들은 이들의, 예컨데, B 및 C와 같이 생성되지 않았다 하더라도 이해를 돕도록 표시하였다.
제6도에 있어서,. de[1-79]-Xaa92-Xaa94-비쿠닌 변이체 및 Xaa92-Xaa94=Ile, Leu, Met, Val 또는 Phe를 갖는 de[1-17]-Met18-Leu36-Leu38-Leu92-Leu94-비쿠닌. 도메인 2(78번 위치)로 부터의 천연 비쿠닌 서열을 나타냈으며 올리고뉴클레오티드 A 및 B에 있어서 비쿠닌의 92 및 94번 위치(복선으로 표시)에 있어서 코돈이 개개의 변이체(Ile; ATC; Leu; CTG; Val; GTT; 반대 가닥에 있어서 이들의 상보성 서열)의 필요에 따라서 대체된 합성 올리고뉴클레오티드 A-D (화살표)를 나타냈다. 제한 뉴클레아제 ApaI (GGGCCC) 및 XmnI(GAANNNNTTC)에 대한 인식 서열은 단선으로 표시하였다.
제7도에 있어서, D2: 비쿠닌의 도메인 2; KUN2 : 천연 XmnI/ApaI 단편을 합성 모듈 3으로 대체시킨 후 비쿠닌의 도메인 2; C: 비쿠닌의 C-말단 서열.
제8도에 있어서, KUN1 : 모듈 1 및 2로 된 합성 도메인1; KUN2 : 천연 XmnI/ApaI 단편을 합성 모듈3으로 대체시킨 후 비쿠닌의 도메인 2; C: 비쿠닌의 C-말단 서열.
제9도에 있어서, KUN1 : 모듈 1 및 2로된 합성 도메인 1; D2 : 비쿠닌의 도메인; C: 비쿠닌의 C-말단 서열; a 및 b : 올리고뉴클레오티드 링커들임 (명세서 참조).
제11도에 있어서, TCT의 AGC로의 돌연변이발생은 (Ⅰ)이라 하는 213 bp의 Pst Ⅰ-Hind III 단편의 단리를 촉진한다.
제12도에 있어서, 변형 알파-인자 리이더 서열 (제11도에서 Ⅰ)을 PstI-Hind III 유전자 단편으로서 벡터 pM15에 삽입시켜 본래의 알파-인자 리이더 서열을 대체시켰다.
제14도에 있어서, 전선구-알파 인자-Leu-36-Leu-38-비쿠닌 유전자 융합체를 벡터 pS600 내에 클로닝시켰다. pLLB3638 중의 전선구-알파 인자 Leu-36-Leu-38의 융합 부위에서의 DNA 서열 및 대응하는 아미노산 서열을 나타냈다. Lys-Arg는 전선구-알파 인자 서열의 KEX2 프로세싱 부위이다 (Julius et al., Cell. 37, 1075, 1984 참조). 1-38번의 아미노산은 비쿠닌 뮤테인 서열의 것에 해당한다.
제15도에 있어서, 전선구-알파 인자-Leu-92-Leu-94-비쿠닌 유전자 융합체를 벡터 pS600 내에 클로닝시켰다. pLLB 3638 중의 전선구-알파 인자 Leu-92-Leu-94-비쿠닌의 융합 부위에서의 DNA 서열 및 대응하는 아미노산 서열을 나타낸다. Lys-Arg는 전선구-알파 인자 서열의 KEX2 프로세싱 부위이다 (Julius et al., Cell, 37, 1075, 1984 참조). 1-94번의 아미노산은 비쿠닌 뮤테인 서열의 것에 해당한다.
제16도에 있어서, 전선구-알파 인자-Leu-36-Leu-38-Leu-92-Leu-94-비쿠닌 융합체를 벡터 pS600 내에 클로닝시켰다. p4LB의 전선구-알파 인자-Leu-36-Leu-38-Leu-92-Leu-94-비쿠닌의 융합 부위에서의 DNA 서열 및 대응 아미노산 서열이 나타나 있다. Lys-Arg는 전선구-알파 인자 서열의 KEX2 프로세싱 부위이다 (Julius et al., Cell. 37, 1075, 1984 참조). 1-94번의 아미노산 번호는 비쿠닌 뮤테인 서열의 것에 해당한다.
제17도에 있어서, 전선구-알파 인자 de(1-21)-Leu-36-Leu-38-비쿠닌 유전자 융합체를 벡터 pS600 내에 클로닝시켰다. pDLLB-121의 전선구-알파 인자-de(1-21)-Leu-36-Leu-38 비쿠닌의 융합 부위에서의 DNA 서열 및 대응 아미노산 서열이 나타나 있다. Lys-Arg는 전선구-알파 인자 서열의 KEX2 프로세싱 부위이다 (Julius et al., Cell. 37, 1075, 1984 참조). 1-38번의 아미노산 번호는 비쿠닌 뮤테인 서열의 것에 해당한다.

Claims (12)

  1. 36,38,45,92,94,98 및 116번 위치의 아미노산 잔기 중 1개 이상의 아미노산 잔기가 Ala, Gly, Ile, Leu, Phe, Val, Arg, Tyr, Trp, Lys로 되는 군에서 선택된 다른 천연 아미노산으로 대체된 인체 비쿠닌의 21-147번 아미노산 서열을 갖는 프로테이나제 억제제.
  2. 제1항에 있어서, 다음과 같은 대체 조합을 갖는 프로테이나제 억제제. (A) 36번 위치의 Met가 Leu, Ile, Val, Arg, Phe, Tyr, Trp, Lys 로 대체됨; (B) 38번 위치의 Met가 Leu, Arg, Ile,Val, Lys 로 대체됨; (C) 45번 위치의 Asn이 Ala, Gly, Ile, Leu, Phe, Val, Arg, Tyr, Trp, Lys 로 대체됨; (D) 92번 위치의 Arg가 Leu, Ile, Val, Phe, Lys로 대체됨; (E) 94번 위치의 Phe가 Leu, Arg, Lys, Ile, Val로 대체됨; (F) 98번 위치의 Trp가 Tyr, Lys, Ile, Val, Phe, Leu, Ala, Gly로 대체됨; (G) 116번 위치의 Glu가 Arg, Lys로 대체됨.
  3. 제1항에 있어서, 1개 이상의 Met 잔기가 Leu, Ile, Val으로 대체된 프로테이나제 억제제.
  4. 제1항에 있어서, 아미노산 잔기의 N-말단에 비쿠닌의 천연 서열 중 1내지 21번 서열로부터 유도된 아미노산 서열의 폴리펩티드가 추가된 프로테이나제 억제제.
  5. 제1항에 있어서, 글리코실화 부위를 갖거나 또는 갖지 않는 프로테이나제 억제제.
  6. 제1항에 정의된 바와 같이 아미노산이 대체된 인체 비쿠닌의 22 내지 77번, 1내지 77번 또는 78 내지 147번 위치의 아미노산 서열을 갖는 단편.
  7. 제2항에 있어서, 1개 이상의 Met잔기가 Leu, Ile, Val으로 대체된 프로테이나제 억제제.
  8. 제2항에 있어서, 아미노산 잔기의 N-말단에 비쿠닌의 천연 서열 중 1 내지21번 서열로부터 유도된 아미노산 서열의 폴리펩티드가 추가된 프로테이나제 억제제.
  9. 제3항에 있어서, 아미노산 잔기의 N-말단에 비쿠닌의 천연 서열 중 1 내지 21번 서열로부터 유도된 아미노산 서열의 폴리펩티드가 추가된 프로테이나제 억제제.
  10. 제2항에 있어서, 글리코실화 부위를 갖거나 또는 갖지 않는 프로테이나제 억제제.
  11. 제3항에 있어서, 글리코실화 부위을 갖거나 또는 갖지 않는 프로테이나제 억제제.
  12. 제4항에 있어서, 글리코실화 부위을 갖거나 또는 갖지 않는 프로테이나제 억제제.
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