HU218104B - Humán, Kunitz-típusú proteázgátló változatai - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya a „szöveti faktorútvonal” inhibitor (tissue factorpathway inhibitor, TFPI) humán, Kunitz-- típusú proteázinhibitor doménII-jének változata, melyre az jellemző, hogy az aminosavszekvenciája:X1 Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp X2 Gly X3 Cys X4 X5 X6 X7 X8 X9 TyrPhe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe X10 Tyr Gly Gly CysX11 X12 X13 Met Asn Asn Phe X14 Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile CysGlu Asp X15 (SEQ ID No. 1.), ahol X1 jelentése hidrogénatom vagy 1–5természetes aminosavrész, kivéve a Cys-t, X2–X14 jelentése egymástólfüggetlenül természetes aminosavrész, X15 jelentése hidroxilcsoportvagy 1–5 természetes aminosavrész, kivéve a Cys-t, azzal afeltétellel, hogy X1–X15 aminosavrészek közül legalább egyben eltérésvan a natív szekvencia megfelelő aminosavrészeit illetően; továbbáhogy X4 jelentése nem lehet Leu. ŕ

Description

A találmány tárgya humán, Kunitz-típusú proteázinhibitor-domén változata, a változatot kódoló DNS, eljárás a változat előállítására, és a változatot tartalmazó gyógyszerkészítmény.

A polimorf magvú leukociták (neutrofilek vagy PMN-ek) és a mononukleáris fagociták (monociták) fontos szerepet töltenek be a szövetkárosodásnál, fertőzésnél, akut vagy krónikus gyulladásnál és a sebhegedésnél. A sejtek a vérből a gyulladás helyéhez vándorolnak és - a megfelelő stimulációt követve - oxidánsokat (O ·, O₂ , H₂O₂ és HOC1), valamint különféle proteolitikus enzimeket tartalmazó szemcséket hoznak létre. A kiválasztó szemcsék többek között alkalikus foszfatázt, metaloproteinázokat - például zselatinázt és kollagenázt - és szerin-proteázokat - például neutrofil elasztázt, katepszin G-t és proteináz-3-at tartalmaznak.

Látens metaloproteinázok szabadulnak fel metaloproteináz szöveti gátlóval (TIMP) együtt. Az aktivációs mechanizmus nem teljesen felderített, de valószínű, hogy tiolcsoportok oxidációja és/vagy a proteolízis szerepet játszik a folyamatban. A szabad metaloproteinázaktivitás a TIMP inaktivációtól is függ.

A leukociták azurofil szemcséiben a szerin-proteázok - neutrofil elasztáz, katepszin G és proteináz-3 aktív enzimként találhatók glükóz-amino-glükánokkal komplexet alkotva. Ezek a komplexek inaktívak, de a szekréciókor disszociálnak, és felszabadulnak az aktív enzimek. A proteázaktivitás semlegesítésére nagy menynyiségű arproteinázinhibitor (a,-Pl) és cq-kimotripszininhibitor (cq-Chl) található a plazmában. A polimorf magvú leukociták viszont képesek helyileg inaktiválni az inhibitorokat. így a neutorfil elasztáz legfontosabb inhibitora, az a_rPI reaktív centruma (Met-358) érzékeny az aktiválódott PMN-ek által termelt metabolitok oxidáló hatására. Ez körülbelül 2000-szeres mértékben csökkenti az a,-Pl neutrofil elasztázzal szembeni affinitást.

Az a_rPI helyi semlegesítése után az elasztáz más proteolitikus enzimek számos gátlóját képes tönkretenni. Az elasztáz hasítja az a_rChI-t és ezáltal elősegíti a katepszin G aktivitását. Ugyancsak hasítja a TIMP-t, ami a metaloproteinázok általi szöveti degradációt eredményezi. Továbbá az elasztáz hasítja az antitrombin IIIt és a heparin kofaktor ΙΙ-t, valamint a „szöveti faktorútvonal” gátlót (tissue factor pathway inhibitor, TFPI), ami valószínűleg elősegíti a rögképződést. Másrészt a neutrofil elasztáz koagulációs faktorokat lebontó képessége feltételezhetően ellentétes hatású, úgyhogy az elasztáz teljes hatása nem világos. A neutorofil elasztáz fibrinolízisre gyakorolt hatása egyértelműbb. A fibrinolitikus aktivitás fokozódik, amikor az elasztáz hasítja a plazminogén aktivátorgátlót és az a₂-plazmininhibitort. Ezenkívül ezen mindkét inhibitort oxidálják és inaktiválják az O₂-metabolitok.

A PMN-ek nagy mennyiségű szerin-proteázt tartalmaznak, és az egyes leukocita-proteázokból 200 mg szabadul fel naponta, hogy leküzdjék a szervezetbe behatoló ágenseket. Akut gyulladáskor a felszabaduló enzim mennyisége többszörösére növekszik. Normális körülmények között az cq-PI, α,-ChI és az α,-makroglobulingátlók nagy mennyisége kellően alacsony szinten tartja a proteolízist. Több jel azonban arra mutat, hogy számos krónikus betegséget patológiás proteolízis okoz, ami a PMN-ek túlstimuláltságának következménye. Ezt eredményezi például az autoimmunválasz, a krónikus fertőzés, a dohányfüst vagy más irritáló tényező stb.

Az aprotinin (borjúhasnyálmirigy-tripszin inhibitor) ismert gátlója a különféle proteázoknak, ideértve a tripszint, kimotripszint, plazmint és kallikreint, ezért terápiás céllal alkalmazzák az akut hasnyálmirigy-gyulladás, a sokkszindróma különböző állapotai, hiperfibrinolitikus vérzés és miokardiális infarktus kezelésére [például J. E. Trapnell és munkatársai, Brit J. Surg., 61:177 (1974); J. McMichan és munkatársai, Circulatory shock, 9:107 (1982); L. M. Auer és munkatársai, Acta Neurochir., 49:207 (1979); G. Sher, Am. J. Obstet. Gynecol., 129:164 (1977); és B. Schneider, Artzneim.-Forsch., 26:1606 (1976)]. Az aprotinin nagy dózisú adagolásával lényegesen csökkenthető a szívműtéteknél - beleértve a kardiopulmonáris sönt kialakítását - jelentkező vérveszteség [például Β. P. Bidstrup és munkatársai, J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 97:364-372 (1989); W. van Oeveren és munkatársai, Ann. Thorac. Surg., 44:640-645 (1987)]. Megelőzőleg kimutatták [például H. R. Wenzel és H. Tschesche, Angew. Chem. Intemat. Ed., 20:195 (1981)], hogy bizonyos aprotininanalógok, például az aprotinin (1-58, Vall5) viszonylag magas szelektivitást mutatnak a granulocita-elasztázt illetően és gátló hatást a kollagenázra, míg az aprotinin (3-58, Argl5, Alal7, Ser42) kiváló plazmakallikreint gátló hatással rendelkezik (lásd; WO 89/10374).

Viszonylag magas aprotinindózisok ismételt injektálásánál vesekárosító hatást figyeltek meg patkányoknál, nyulaknál és kutyáknál (Bayer, Trasylol, Inhibitor of proteainase; E. Glaser és munkatársai, in: „Verhandlungen dér Deutschen Gesellschaft für Innere Medizin, 78. Kongress”, Bergmann, München 1972, 1612-1614. oldal). Az aprotinin nefrotoxikus hatása (többek között elváltozásokként jelenik meg) a hatóanyagnak a vese proximális tubulussejtjeiben való felhalmozódásával magyarázható, ami az aprotinin magas pozitív töltésének az eredménye, minthogy megkötődik a tubulusok negatív töltésű felületén. Ez a nefrotoxicitás az aprotinint klinikai felhasználására kevésbé alkalmassá teszi különösen ott, ahol az inhibitor nagy dózisban történő adagolására van szükség (például a kardiopulmonális sönt kialakításánál). Emellett az aprotinin egy boíjúprotein, ami ezért egy vagy több epitópot tartalmazhat, ami nemkívánatos immunválaszt vált ki az embernél.

A jelen találmány tehát olyan humán proteinázinhibitorokkal foglalkozik, melyek aprotinin típusúak (azaz Kunitz-típusú inhibitorok), hasonló gátlási profillal, illetve ezek olyan módosulataival, melyek a kívánt gátlási profillal rendelkeznek.

A találmány tárgya a „szöveti fáktorútvonal” gátló (TFPI) humán, Kunitz-típusú proteázinhibitor dómén ΙΙ-jének változata, amelynek aminosavszekvenciája:

HU 218 104 Β

X* Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp X² Gly X³ X⁴ X⁵ X⁶ X⁷ X⁸ X⁹ Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe X¹⁹ Tyr Gly Gly Gys X¹¹ X¹² X'³ Met Asn Asn Phe X¹⁴ Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn He Cys Glu Asp X'³ (SEQ ID No. 1) ahol X¹ jelentése hidrogénatom vagy 1 -5 természetes aminosavrész, kivéve a Cys-t, X²-X¹⁴ jelentése egymástól függetlenül valamelyik természetes aminosavrész, kivéve a Cys-t és X¹⁵ jelentése hidroxilcsoport vagy 1-5 természetes aminosavrész, kivéve a Cys-t azzal a feltétellel, hogy X'-X¹³ aminosavrész közül legalább egy eltér a természetes aminosavszekvencia megfelelő aminosvrészétől.

A „természetes aminosavrész” kifejezésen értjük a 20 álalánosan előforduló aminosav, tehát Alá, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Trp, Met, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg és His valamelyikét.

A TFPI-t, ami exogén pathway-inhibitorként (EPI) vagy lipoproteinnel kapcsolatos koagulációinhibitorként (LACI) is ismert, Broze és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:1886-1890 (1987) és EP 300 988] izolálták és a proteint kódoló gént klónozták (EP 318451). A fehérje másodlagos szerkezetének analízise azt mutatja, hogy a proteinnek három Kunitz-típusú inhibitordoménje van: 22-79. aminosavszakasz (I), 93-150. aminosavszakasz (II) és 185-242. aminosavszakasz (III). A Kunitz-típusú domén-I TF/FVIIa-hoz, a Kunitz-típusú dómén II az FXa-hoz kötődik [Girard és munkatársai, Natúré, 338:518-520(1989)].

Egy vagy több aminosavnak a fentebb említett helyeken történő helyettesítésével lehetőség nyílik a TFPI Kunitz-típusú dómén II gátlási profiljának megváltoztatására oly módon, hogy az elsődlegesen gátolja a neutrofil elasztázt, a katepszin G-t és/vagy a proteináz-3-at. Továbbá lehetőség van olyan változatok elkészítésére, melyek specifikusan gátolják a koagulációban vagy fibrinolízisben (például plazmin vagy plazmakallikrein), illetve a komplement kaszkádban részt vevő enzimeket.

A TFPI Kunitz-típusú dómén II-nek egyik előnye, hogy az össztöltése negatív, ellentétben az aprotininével, mely - mint fentebb jeleztük - erős pozitív töltésű. Olyan, találmány szerinti változatokat készíthetünk tehát el, melyeknek töltésösszege az aprotinin töltésénél kevésbé pozitív, és így e változatok nagy dózisban való adagolásánál csökken a vesekárosodás esélye. A másik előnye az aprotininhez képest, hogy ez humán fehérje (fragmens), így tehát az emberi szervezetbe való bevitelénél a nemkívánatos immunreakciók lényegesen lecsökkennek.

A TFPI Kunitz-típusú dómén II előnyös variánsai közül példaként említjük azt, hogy X¹ jelentése LysPro; vagy ahol X² jelentése Alá, Arg, Thr, Asp, Pro, Glu, Lys, Gin, Ser, Ile vagy Val, különösen ahol X² jelentése Thr vagy Pro; vagy ahol X³ jelentése Pro, Thr, Leu, Arg, Val vagy Ile, különösen, ahol X³ jelentése Pro vagy Ile; vagy ahol X⁴ jelentése Lys, Arg, Val, Thr, Ile, Leu, Phe, Gly, Ser, Met, Trp, Tyr, Gin, Asn vagy Alá, különösen ahol X⁴ jelentése Lys, Val, Leu, Ile, Thr, Met, Gin vagy Arg; vagy ahol X⁵ jelentése Alá,

Gly, Thr, Arg, Phe, Gin vagy Asp, különösen, ahol X⁵ jelentése Alá, Thr, Asp vagy Gly; vagy ahol X⁶ jelentése Arg, Alá, Lys, Leu, Gly, His, Ser, Asp, Gin, Glu, Val, Thr, Tyr, Phe, Asn, Ile vagy Met, különösen ahol X⁶ jelentése Arg, Phe, Alá, Ile, Leu vagy Tyr; vagy ahol X⁷ jelentése Ile, Met, Gin, Glu, Thr, Leu, Val vagy Phe, különösen ahol X⁷ jelentése Ile; vagy ahol X⁸ jelentése Ile, Thr, Leu, Asn, Lys, Ser, Gin, Glu, Arg, Pro vagy Phe, különösen ahol X⁸ jelentése Ile vagy Lys; vagy ahol X⁹ jelentése Arg, Ser, Alá, Gin, Lys vagy Leu, különösen ahol X⁹ jelentése Arg; vagy ahol X¹⁰ jelentése Gin, Pro, Phe, Ile, Lys, Trp, Alá, Thr, Leu, Ser, Tyr, His, Asp, Met, Arg vagy Val, különösen ahol X¹⁰ jelentése Val vagy Lys; vagy ahol X¹¹ jelentése Gly, Met, Gin, Glu, Leu, Arg, Lys, Pro vagy Asn, különösen ahol X¹¹ jelentése Arg vagy Leu; vagy ahol X¹² jelentése Alá vagy Gly; vagy ahol X¹³ jelentése Lys, Asn vagy Asp, különösen ahol X¹³ jelentése Lys vagy Asn; vagy ahol X¹⁴ jelentése Val, Tyr, Asp, Glu, Thr, Gly, Leu, Ser, Ile, Gin, His, Asn, Pro, Phe, Met, Alá, Arg, Trp vagy Lys, különösen, ahol X¹⁴ jelentése Lys vagy Glu; vagy ahol X¹⁵ jelentése Gly.

Előnyös változat, ahol X¹ jelentése Lys-Pro és X¹⁵ jelentése Gly, míg az X²-X'⁴ jelentései azonosak az előzőekben tett meghatározásokkal.

A találmány szerinti TFPI Kunitz-típusú dómén II variánsok előnyösen nem tartalmaznak Met-t a proteázkötő régióban (vagyis az X³-X¹⁴ aminosavak által reprezentált szakaszban). Az oi|-PEI fent leírt analógiájára, e helyek bármelyikén lévő Met-maradék az inhibitort érzékennyé tenné a PMN-ek által termelt oxigénmetabolitok oxidatív inaktiváló hatásával szemben és fordítva, ha e helyeken nem szerepel Met-maradék, az az inhibitornak nagyobb stabilitást biztosít az oxigénmetabolitok jelenlétében.

Kívánatos lehet megváltoztatni az utat, melyen a TFPI Kunitz-típusú dómén II változat glikozilálódik a gazdasejtben történő termelésekor. A találmány egyik kivitelezési módja lehet tehát, ahol az aminosavszekvencia:

X' Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp X² Gly X³ X⁴ X³ X⁶ X⁷ X⁸ X⁹ Tyr Phe Tyr Asn X'6 Gin X'⁷ Lys Gin Cys Glu Arg Phe Χ'θ Tyr Gly Gly Cys X X'² X·³ Met Asn Asn Phe X¹⁴ Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp X'³ (SEQ ID No. 2), ahol X'-X¹³ jelentése azonos az 1. igénypontban tett meghatározásokkal, X¹⁶ jelentése Gin, Gly, Alá, Ser, Val vagy Phe, különösen ahol X'⁶ jelentése Gin vagy Alá és X¹⁷ jelentése Thr vagy Alá.

Általában előnyösek azok a találmány szerinti változatok, ahol a Kunitz-típusú dómén II proteázkötő helyén lévő aminosavak közül egy vagy több (azaz az X³-X'⁴ aminosavak közül egy vagy több, ami megfelel az aprotinin 13., 15., 16., 17., 18., 19., 20., 34., 39., 40., 41. és 46 helyének) azonos a természetes aprotinin megfelelő helyén lévő aminosavával.

Példák az ilyen változatokra:

Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Lys Alá Arg Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys

HU 218 104 Β

Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn lle Cys Glu Asp Gly (SEQ ID No. 3);

Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly lle Cys Lys Alá Arg lle Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn lle Cys Glu Asp Gly (SEQ ID NO. 4);

Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly lle Cys Lys Alá Arg He Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Asn Met Asn Asn Phe Lys Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn lle Cys Glu Asp Gly (SEQ ID No. 5); vagy

Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Pro Cys Lys Alá Arg lle lle Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Alá Lis Met Asn Asn Phe Lys Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn lle Cys Glu Asp Gly (SEQ ID NO. 6.).

A találmány további tárgya DNS-szerkezet, ami a humán Kunitz-típusú inhibitordomén találmány szerinti változatát kódolja. A találmány szerinti DNS szintetikus úton a szokásos módszerekkel előállítható, például S. L. Beaucage és Μ. H. Caruthers által leírt foszfoamidit-módszerrel [Tetrahedron Letters, 22:1859-1869. (1981)] vagy Matthes és munkatársai módszerével [EMBO Journal, 3:801-805 (1984)]. A foszfoamiditmódszer szerint oligonukleotidokat szintetizálunk, azokat tisztítjuk, hasítjuk, ligáljuk és megfelelő vektorokban klónozzuk.

A TFPI Kunitz-típusú dómén II klónozásához alternatív módon használhatunk genomiális vagy cDNS-t (a genomiális vagy cDNS-könyvtár szűrővizsgálatával szintetikus oligonukleotidpróbákat alkalmazva és a dómén ΙΙ-t kódoló DNS-szekvenciát izolálva).

A DNS-szekvencia módosítható egy vagy több olyan helyen, ahol a kívánt aminosavcserét akarjuk elvégezni, például hely irányította mutagenezissel, amihez a homológ rekombináció jól ismert eljárásában a kívánt aminosavszekvenciát kódoló szintetikus oligonukleotidokat használjuk.

A találmány további tárgya a találmány szerinti DNS-szerkezetet tartalmazó rekombináns expressziós vektor. A rekombináns expressziós vektor lehet bármilyen vektor, ami előnyösen alávethető rekombináns DNS-eljárásoknak. A vektor kiválasztása gyakran a gazdasejt függvénye. így a vektor lehet önállóan sokszorozódó vektor, azaz amelyik extrakromoszomálisan, elkülönülten létezik, replikációja független a kromoszomális replikációtól; ilyen például a plazmid. Másrészt a vektor lehet olyan is, hogy a gazdasejtbe való bevitel után beépül a gazdasejt genomjába és a kromoszómával (kromoszómákkal) replikálódik, amelybe (amelyekbe) beépült. A vektorban a TFPI Kunitz-típusú dómén II találmány szerinti változatát kódoló DNS-szekvenciának működő kapcsolatban kell lennie egy alkalmas promoterszekvenciával. A promoter bármilyen olyan DNS-szekvencia lehet, ami a kiválasztott gazdasejtben transzkripciós aktivitást mutat, és származhat homológ vagy heterológ fehérjéket kódoló génekből. így például emlőssejtekben a TFPI Kunitz-típusú dómén II találmány szerinti változatát kódoló DNS transzkripciójának irányítására alkalmas az SV promoter [Subramani és munkatársai, Mól. Cell. Bioi., 1:854-864. (1981)], az MT-1 (metalotionein) promoter [Palmiter és munkatársai, Science, 222:809-814 (1983)] vagy az adenovírus 2 major késői promoter. Élesztő gazdasejtekben alkalmazható promoterek lehetnek az élesztő glikolitikus génjeiből [Hitzeman és munkatársai, J. Bioi. Chem., 255:12 073-12 080 (1980); Alber és Kawasaki, J. Mól. Appl. Gén., 1:419-434 (1982)], az alkoholdehidrogenáz génekből (Young és munkatársai; in: Genetic Engeineering of Microorganisms fór Chemicals, szerk.: Hollaender és munkatársai, Plenum Press, New York, 1982) származó promoterek vagy a TPI 1 (4 599 311 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom) vagy ADH2-4c [Russel és munkatársai, Natúré 304:652-654 (1983)] promoterek. Amenynyiben a gazdasejt fonalas gomba, alkalmas promoter lehet az ADH3 promoter [McKnight és munkatársai, The EMBO J., 4:2093-2099 (1985)] vagy a tpiA promoter.

A TFPI Kunitz-típusú dómén II találmány szerinti változatát kódoló DNS-szekvenciának egy alkalmas terminátorhoz is működőképesen kell kapcsolódnia. Ilyen terminátor lehet a humán növekedési hormon terminátora (Palmiter és munkatársai, lásd fent) vagy - ha a gazdasejt gomba - a ΤΡΙ1 (Alber és Kawasaki, lásd fent) vagy az ADH3 (McKnight és munkatársai, lásd fent) promoterek. A vektor további elemeket is tartalmazhat, például poliadenilációs szignált (például az SV40-ből vagy az adenovírus 5 Elb régiójából), transzkripciós enhancerszekvenciát (például SV40 enhancer) és transzlációs enhancerszekvenciát (például VA adenovírus RNS-t) kódoló.

A találmány szerinti rekombináns expressziós vektor tartalmazhat még olyan DNS-szekvenciát, ami lehetővé teszi a vektor számára, hogy az adott gazdasejtben replikálódjon. Ilyen szekvenciára példa - ha a gazdasejt emlőssejt - az SV40 replikációs origója vagy - ha a gazdasejt élesztősejt - a 2 μ-os élesztőplazmid REP 1-3 replikációs gének vagy replikációs origó. A vektor tartalmazhat szelektációs markert, például olyan gént, aminek terméke kiegészíti a hiányos gazdasejtet, ilyen lehet a dihidrofolát-reduktázt (DHFR) kódoló gén; vagy amelyik rezisztenciát biztosít egy adott hatóanyaggal, például neomicinnel, higromicinnel vagy metotrexáttal szemben; vagy a Schizosaccharomyces pombe TPJ gént [P. R. Russel, Gene, 40:125-130 (1985)].

Az eljárás, mellyel a TFPI Kunitz-típusú dómén II változatot kódoló DNS-szekvenciát, a promotert, illetve a terminátort ligáljuk és a replikációs információkat tartalmazó alkalmas vektorba beépítjük, jól ismert a szakemberek előtt (lásd például: Sambrook és munkatársai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989).

A gazdasejt, amelybe a találmány szerinti expreszsziós vektort bevisszük, bármilyen sejt lehet, ami a találmány szerinti TFPI Kunitz-típusú dómén II változatot termelni képes, az előnyösen egy eukariótasejt, például emlős-, élesztő- vagy gombasejt.

HU 218 104 Β

A gazdasejtként alkalmazható élesztősejt bármilyen olyan élesztőgomba lehet, ami a tenyésztése alatt nagy mennyiségű TFP1 Kunitz-típusú dómén I találmány szerinti változatot termel. Példaként említhető alkalmas élesztőgombák a Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe vagy a Saccharomyces uvarum törzsei. Az élesztősejt transzformálása történhet protoplasztképzéssel, amit természetesen az ismert módon végzett transzformáció követ.

Alkalmas emlőssejtvonalakra példaként említjük a COS (ATCC CRL 1650), a BHK (ATCC CRL 1632, ATCC CCL 10) vagy a CHO (ATCC CCL 61) sejtvonalakat. Az emlőssejtek transzfektálására és a sejtekbe bevitt DNS-szekvenciák kifejezésre szolgáló módszereket írják le az alábbi munkák: Kaufman és Sharp, J. Mól. Bio., 159:601-621 (1982); Southern és Berg, J. Mól. Appl. Génét., 1:327-341 (1982); Loyter és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 79:422-426 (1982); Wiglerés munkatársai, Cell, 14:725 (1978); Corsaro és Pearson, Somatic Cell Genetics, 7:603 (1981); Graham és van dér Eb, Virology, 52:456 (1973); Neumann és munkatársai, EMBO I, 1:841-845 (1982).

Gazdasejtként alkalmazhatunk gombasejteket is. Alkalmasak a fonalas gombák sejtjei, például az Aspergillus vagy Neurospora fajok, különösen az Aspergillus oryzae vagy az Aspergillus niger törzsek. Aspergillus faj fehéijék kifejezésére való felhasználását írja le például az EP 238023 szabadalom.

A találmány további tárgya eljárás a TFPI Kunitztípusú dómén II találmány szerinti előállítására, mely eljárás a fenti sejtek olyan körülmények között történő tenyésztéséből, mely a találmány szerinti változat kifejeződéséhez vezet, valamint a nyert változat tenyészléből való kinyeréséből áll.

A sejtek tenyésztéséhez használt tápközeg bármely olyan táptalaj lehet, mely alkalmas az emlőssejtek vagy a gombák (beleértve az élesztőket) tenyésztésére. A gazdasejt az inhibitort kiválasztja a tápközegbe, ahonnan az a szokásos módszerekkel kinyerhető. Ehhez elválasztjuk a sejteket a közegtől centrifugálással vagy szűréssel, a felülúszóból vagy a szűrletből sóval - például ammónium-szulfáttal - lecsapjuk a fehérjeszerű alkotórészeket, majd különféle kromatográfiás eljárással például ioncserés kromatografálással vagy affinitáskromatografálással stb. - tisztítunk.

A találmány további tárgya gyógyszerkészítmény, mely a TFPI Kunitz-típusú dómén II találmány szerinti változatát tartalmazza gyógyászati szempontból alkalmazható vivőanyagok vagy közegül szolgáló anyagok kíséretében. A találmány szerinti készítmény bármely ismert módszerrel formulázható, erre példákat találunk a Reminton’s Pharmaceutical Sciences (1985) munkában. A készítmény tipikus formájában alkalmas a szisztémás injekcióra vagy infúzióra és ehhez steril vízben, izotóniás sóoldatban vagy glükózoldatban készült oldatot használunk.

A TFPI Kunitz-típusú dómén II találmány szerinti változata tehát előnyösen alkalmazható gyógyászati célra ott, ahol natív aprotinin vagy más gátlási profilú aprotininanalóg javasolt, különösen abban az esetben, ha nagy aprotinindózisok adagolása szükséges. A találmány szerinti változat alkalmazhatósága annak köszönhető, hogy gátolni képes a humán szerin-proteázokat, például a tripszint, plazmint, kallikreint, elasztázt, katepszin G-t, proteináz-3-at. Olyan betegségek kezelésére alkalmas, ahol feltételezhető, hogy azok oka az aktív PMN-ekből felszabaduló elasztáz, katepszin G és proteináz-3 által kiváltott patológiás proteolízis. Idetartozik (de nem korlátozódva csak ezekre) az akut hasnyálmirigy-gyulladás, gyulladások, trombocitopénia, vérlemezfunkció-védelem, szervvédelem, sebhegesedés, sokk (beleértve a tüdősokkot) hiperfibrinolitikus vérzés, emfiszéma, reumatoid ízületi gyulladás, felnőttkori légzési nehézségek, krónikus gyulladásos bélártalmak és pikkelysömör.

A találmány további tárgya a fent TFPI Kunitz-típusú inhibitordomén II-nek vagy változatának felhasználása olyan gyógyszer elkészítésére, mely alkalmas a túlstimulált PMN-ekből felszabaduló proteázok okozta patológiás proteolízissel kapcsolatos állapotok vagy betegségek vagy állapotok megelőzésére vagy kezelésére.

A fenti gyógyászati alkalmazáson kívül a TFPI Kunitz-típusú dómén II találmány szerinti változata felhasználható olyan természetes anyagok humán eredetű forrásokból való izolálására, melyek közvetlenül vagy közvetve a TFPI Kunitz-típusú dómén Π-höz kötődnek. Ezek lehetnek például proteázok vagy receptorok. Az említett tulajdonság felhasználható szűrővizsgálatoknál vagy affinitáskromatográfia alkalmazásakor.

Az elmondottakhoz a szokásos DN S-technikát alkalmazzuk (Sambrock J., Fritsch E. F. és Maniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. 1989). A szintetikus oligonukleotidokat automata DNS-szintetizátoron (380B, Applied Biosystems) készítjük el a foszforamidit-eljárással, ellenőrzött pórusú üveghordozón [Beaucage S. L. és Caruthers Μ. H., Tetrahedron Letters, 22:1959-1869 (1981], A DNSszekvenciát dideoxi-láncterminációs technikával határozzuk meg [Sanger F., Micklen S. és Coulson A. R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467 (1977)]. A polimeráz-láncreakciókat (PCR) egy DNS Thermal Cycler készüléken (Perkin Elmer Cetus) hajtjuk végre.

Aminosavanalízishez a vizsgálandó mintát vákuumban leforrasztott csövekben 6M sósavban 110 °C hőmérsékleten 24 órán keresztül hidrolizáljuk. Az analízist mikrokaliberű művelethez módosított Bechman 121 MB automata aminosavanalizátoron végezzük. Az N-terminális aminosavszekvenciát egy, az Edmanlebontást alkalmazó, automata Applied Biosystems 470A gázfázisú szekvenátoron kapjuk meg. Az egyes ciklusokból származó, felszabadult PTH-aminosavak detektálását és mennyiségi meghatározását on-line fordított fázisú HPLC-vel hajtjuk végre.

A molekulasúly-meghatározás BIO-ION 20 plazmadeszorpciós tömegspektrométeren (PDMS) történik, ami egy körülbelül 15 cm-es repítőcsővel van ellátva és pozitív módban működik. 5 μΐ-es mintákat analizálunk felgyorsuló feszültségtartománynál 15 kV-ig és az iono5

HU 218 104 Β kát 5 millió hasítási eseményből gyűjtjük össze. A molekulaion meghatározási pontossága jól definiált csúcsnál 0,1%-os, különben valamivel alacsonyabb.

Az elmondottak szemléltetésére az alábbiakban példákat adunk meg. A példák kizárólag szemléltető célzatúak és a találmány oltalmi körét nem korlátozzák.

1. példa

A TFPI második Kunitz-típusú doménjének (TFPI-2) termelése KFN-1651 élesztőtörzzsel

A teljes TFPI-t kódoló cDNS-t humán máj HepG2 sejtvonalból (ATCC HB 8065) izoláljuk és 0,9 kb nagyságú BamHI-Xbal fragmensként pKFN1168 emlős expressziós vektorba építjük be [Pedersen A. H., Nordfang O., Norris F., Wiberg F. C., Christensen P. M., Moeller K. B., Meidahl-Pedersen J., Beck T. C., Norris K., Hender U. és Kisiel W., J. Bioi. Chem., 265:16 786-16793 (1990)]. Az inszert DNSszekvenciáját a SEQ ID No. 7 szekvenciaábrán adjuk meg. A TFPI-2-t a 152-325. nukleotidok kódolják, amint jeleztük.

TFPI-2: a PCR-reakcióhoz templátként 0,1 pg, a pKFN-1168-ból származó, 0,9 kb nagyságú BamHiXbal fragmenst használjuk 100 pm NOR-2526 primer (CCTGAGAGATTGGAGAAGAGAAAGCCAGATT TCTGCTT) és 100 pm NOR-2528 primer (CTGGAATCTAGATTAACCATCTTCACAAATGTT) mellett. A NOR-2526 primer 17 3’-terminális bázisa megfelel a SEQ ID No. 7-ben lévő TFPI-2 gén 365-381. bázisának, a 21 5’-terminális bázis azonos az alábbiakban leírásra kerülő pKFN-100 plazmidból származó szintetikus leadergén (lásd 2. ábra) 215-235. bázisaival. A NOR-2528 összeillő a SEQ ID No. 7 521-540. bázisszakaszával és van egy 5’-szakasza, ami transzlációs stopkodont tartalmazza, amit egy Xbal hasítóhely követ.

A PCR-reakciót 100 μΐ térfogatban hajtjuk végre, kereskedelmi készlet felhasználásával (GenAmp, Perkin Elmer Cetus), a ciklus: 94 °C 20 s, 50 °C 20 s, 72 °C 30 s 19 ciklus után a befejező ciklusban: 72 °C 10 perc. A 210 kb nagyságú PCR-terméket 2%-os agarózgélen izoláljuk gélelektroforézissel.

Szignálleader: a PCR-reakció emplátjaként 0,1 pg, a pKFN-1000-ből nyert, 0,7 kb nagyságú PvuII fragmens szolgál 100 pmol NOR 1478 (GTAAACGACGGCCAGT) primer és 100 pmol NOR-2523 (TCTCTTCTCCAATCTCTCAGC) primer mellett A NOR-1478 megfelel a SEQ ID No. 5 EcoRI hasítóhely feletti közvetlen szekvenciának. A NOR-2523 primer összeillő a pKFN-100 szintetikus leadergénje 17 3’-terminális bázisával. A PCR-reakciót a fentiek szerint hajtjuk végre, egy 257 kb-ú fragmenst nyerve.

A pKFN-1000 a pTZ19R plazmid [Mead D. A., Szczesna-Skorupa E. és Kemper B., Prot. Engin., 1:67-74 (1986) származéka, ami szintetikus élesztő szignálleader peptidet kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz.

A pKFN-1000 plazmidot a WO 90/10075 szabadalom íqa le. A pKFN-1000 EcoRI helyétől lefelé elhelyezkedő 235 bp DNS-szekvenciát és a szintetikus élesztő szignálleader kódolt aminosavszekvenciáját a SEQ ID No. 9 adja meg.

Szignálleader-TFPI-2: a fent leírt két PCR-fragmensből 0,1-0,1 pg-ot összekeverünk. A PCR-reakciót 100 pmol NOR-1478 és 100 pm NOR-1528 primerek jelenlétében hajtjuk végre, a ciklus: 94 °C 1 perc, 50 °C 2 perc és 72 °C 3 perc. 16 ciklus után a végső ciklusban, 72 °C 10 perc.

A nyert 442 bp-ú fragmenst 1%-os agarózgélen izoláljuk gélelektroforézissel, majd EcoRI és Xbal enzimekkel hasítjuk. A kapott 412 bp-ú fragmenst a pMT636 plazmidból kapott, 9,5 kb-ú NcoI-EcoRI fragmenshez és a pMT636 plazmidból származó, 1,4 kb-ú NcoI-EcoRI fragmenshez ligáljuk A pMT636 plazmidot a PCT/DK88/00138 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés írja le.

A pMT636 egy E. coli - S. cerevisiae shuttle-vektor, ami a Schizosaccharomyces pombe TPI-génjét (PÓT) [Russel P. R., Gene, 40:125-130 (1985)], a S. cerevisiae trióz-foszfát-izomeráz promoterét és terminátorát, TPI_p és TPI_T [Albert T. és Kawasaki G., J. Mól. Appl. Gén., 1:419-434 (1982)] tartalmazza.

A ligációs elegyet használjuk a kompetens E. coli törzs (r~, m⁺) transzformálására, ampicillinrezisztenciára szelektálva.

A DNS-szekvencia azt mutatja, hogy a telepekből nyert plazmidok a TFPI-2 helyes szekvenciáját tartalmazzák, megfelelően kapcsolódva a szintetikus élesztő szignálleader génhez.

pKFN-1065 plazmidot szelektálunk a további felhasználásra. A pKFN-1065 plazmid szerkezetét az 1. ábra mutatja be.

A pKFN-1065 plazmid expressziós kazettája az alábbi szekvenciákat tartalmazza.

TPI_p-KFN 1000 szignálleader - TFPI-2-TPI_T.

A pKFN-1065 plazmidból származó, 412 bp-ú EcoRI-Xbal fragmens DNS-szekvenciáját a SEQ ID No. 11 mutatja be.

Élesztőtranszformáció: A S. cerevisiae MT663 törzset (E2-7B XE11-36 a/α, Atpi/Atpi, pép 4-3/pep 4-3) YPGaL táptalajban (1% Bacto élesztőkivonat, 2% Bacto pepton, 2% galaktáz, 1% laktát) tenyésztjük 0-D-6oonm=0>6 értékig.

100 ml tenyészetet centrifugálunk, az üledéket 10 ml vízben mossuk, centrifugálás után 10 ml alábbi összetételű oldatban szuszpendáljuk: 1,2 M szorbitol, 25 mM Na₂EDTA, pH=8,0 és 6,7 mg/ml ditiotreitol. A szuszpenziót 30 °C hőmérsékleten tartjuk 15 percen át, centrifugáljuk és a sejteket 10 ml, alábbi összetételű oldatban szuszpendáljuk: 10 mM Na₂EDTA, 0,1 M nátrium-citrát, pH=5,8 és 2 mg Novozym®234. A szuszpenziót 30 °C hőmérsékleten tartjuk 30 percen át, a sejteket centrifugálással összegyűjtjük, 10 ml 1,2 M szorbitololdatban és 10 ml CAS-oldatban [1,2 M szorbitol, 10 mM kalcium-klorid, 10 mM Trisz.HCl, pH=7,5 ; Trisz=trisz(hidroxi-metil)-amino-metán] mossuk és 2 ml CAS-oldatban újraszuszpendáljuk. Transzformáláshoz 0,1 pg pKFN-1063 plazmidot adunk hozzá és 15 percen át szobahőmérsékleten tartjuk. 1 ml alábbi összetételű oldatot adunk hozzá: 20% polietilénglikol 4000, 20 mM kalcium-klorid, 10 mM kalciumklorid, 10 mM Trisz.HCl (pH=7,5), és a szuszpenziót

HU 218 104 Β szobahőmérsékleten tartjuk 30 percen át. A szuszpenziót centrifugáljuk, az üledéket 0,1 ml SOS-oldatban (1,2 M szorbitol, 33 térfogat% YPD, 6,7 mM kalciumklorid, 14 pg/ml leucin) szuszpendáljuk, és a szuszpenziót 30 °C hőmérsékleten 2 órán át állni hagyjuk. A szuszpenziót ezután ismét centrifügáljuk, az üledéket 0,5 ml 1,2 M szorbitololdatban szuszpendáljuk. 6 ml top-agart adunk hozzá [Sherman és munkatársai, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1981); 1,2 M szorbitol, 2,5% agar] 52 °C hőmérsékleten. A szuszpenziót ugyanilyen összetételű lemezre öntjük.

napos 30 °C hőmérsékleten történő tenyésztés után a transzformált telepeket felvesszük, újra izoláljuk és felhasználjuk a folyékony táptalajon történő tenyésztéshez. Egy ilyen K.FN-1593 transzformánst szelektálunk további jellemzés céljára.

Fermentáció: A KFN-1593 élesztőtörzset YPD táptalajon (1% élesztőkivonat, 2% Difco pepton és 3% glükóz) tenyésztjük. Az 1 liter térfogatú tenyészetet 30 °C hőmérsékleten rázatjuk az O.D._{650 nm}=24 érték eléréséig. Centrifügálás után a felülúszót elválasztjuk.

Tisztítás: 1000 ml felülúszó kémhatását foszforsavval pH=3,0 értékre állítjuk be és S-Sepharose Fást Flow oszlopra (Pharmacia 2,6 χ 3,6 cm) visszük, amit 25 mM nátrium-dihidrogén-foszfát-pufferrel, pH=3,5 egyenlítettünk ki. A kiegyenlítő pufferrel való mosás után a TFPI-2-t 40 ml 1 M nátrium-kloridot tartalmazó pufferrel eluáljuk, detektáláshoz a tripszingátló aktivitását használva. A sótalanítás Sephadex G-25 oszlopon (Pharmacia, 2,6 χ 34 cm) történik, a kiegyensúlyozáshoz és az eluáláshoz ammónium-hidrogén-karbonát-oldatot használva, pH=7,5. A további tisztítás Mono S oszlopon (Pharmacia, 0,5 χ 5 cm) történik gradienselúcióval, melyhez 10% (tömeg/térfogat) acetonitrilt tartalmazó nátrium-dihidrogén-foszfát-pufferben, pH=3,5 a nátriumklorid-koncentrációját 23 perc alatt 0-ról 0,43 M-ra emeljük; átfolyási sebesség: 1 ml/perc. Az N-glikozilált TFPI-2 0,20 M, a nem glikozilált TFPI-2 0,26 M nátrium-klorid-koncentrációnál eluálódik. A nem glikozilált TFPI-2 további tisztítását HPLC-vel végezzük C-18 fordított fázisú oszlopon (Novo Nordisk A/S, 0,4x25 cm), a gradienselúcióhoz 0,1% trifluor-ecetsav-oldatban az acetonitril koncentrációját 30 perc alatt 0-ról 50%-ra emelve; átfolyási sebesség: 1 ml/perc. A TFPI-2 40%-os acetonitrilkoncentrációnál eluálódik. A tisztított terméket fagyasztva szárítjuk és körülbelül 200 nM koncentrációban vízben oldjuk. Az oldatból vett mintában meghatározzuk az aminosav-összetételt (I. táblázat), az aminosavszekvenciát, a molekulasúlyt (PDMS, talált 6840,8, számított: 6840,6) és a proteázgátló aktivitást.

I. táblázat

Aminosav	Elméleti	Mért
Alá	0	0,31
Gys	6	5,14
Asx	9	8,94

Aminosav	Elméleti	Mért
Glx	9	9,25
Phe	5	4,89
Gly	6	6,01
His	0	0,13
Ile	3	2,82
Lys	4	4,12
Leu	3	3,04
Met	1	0,82
Pro	2	2,08
Arg	3	2,86
Ser	0	0,17
Thr	3	2,92
Val	0	0,16
Trp	0	-
Tyr	4	3,75
Összesen:	58	57,41

2. példa [R15K,G16A,Y17R,T19I]-TFPI-2 előállítása KFN-1811 élesztőtörzzsel

0,1 pg, a pKFN-1605 plazmidból származó, TFPl-2-t kódoló 1,3 kb nagyságú SphI-BamHI fragmenst használunk templátként két PCR-reakcióban. Az első PCR-reakcióban 100 pmol NOR-2022 (GGAGTTTAGTGAACTTGC) prímért és 100 pmol M-460 prímért (GTTATAAAAATACCTGATAATACGAGCTTTACATATTCCAGGATC) alkalmazunk. A második PCR-reakcióhoz 100 pmol NOR-1495 prímért (TAAGTGGCTCAGAATGA) és 100 pmol M-459 prímért (GATCCTGGAATATGTAAAGCTCGTATTATCAGGTATTTTTATAAC) használunk.

A NOR-2022 Sphl hasítóhely alatti 94. bp-nál kezd. Az M-460 összeillő a TFPI-2 DNS-szekvencia 263-307 szakaszával (SEQ ID No. 11) hat össze nem illő párosítástól eltekintve. A NOR-1495 primer a BamHI hasítóhely feletti 561. bp-nál kezd. Az M-459 összeillő az Μ-460-nal.

A PCR-reakciót 100 pl térfogatban hajtjuk végre kereskedelmi készlet felhasználásával (Gene Amp, Perkin Elmer Cetus), a ciklus: 95 °C 1 perc, 50 °C 1 perc és 72 °C 2 perc. 24 ciklus után a befejező ciklusban 72 °C 10 perc. A PCR-termékeket - 444 bp nagyságú fragmens az első és 285 bp nagyságú fragmens a második reakcióból - elektroforézissel izoláljuk 2%-os agarózgélen. A fent leírt fragmensekből körülbelül 0,1-0-1 pg mennyiségeket összekeverünk. A PCR-reakcióhoz 100 pmol NOR-2022 és 10 pmol NOR-1495 primereket használunk; a ciklus: 95 °C 1 perc, 50 °C 2 perc és 72 °C 3 perc. 22 ciklus után a befejező ciklusban 72 °C 10 perc.

A nyert 687 bp nagyságú fragmenst elektroforézissel tisztítjuk 1%-os agarózgélen, majd EcoRI és Xbal enzimekkel hasítjuk, A 412 bp nagyságú kapott fragmenst a pMT636 plazmidból származó, 9,5 kb nagyságú NcolXbal ffagmenshez és a pMT636 plazmidból származó,

HU 218 104 Β

1,4 kb nagyságú NcoI-EcoRI fragmenshez ligáljuk A pMT636 plazmidot az 1. példában írtuk le.

A ligációs elegyet használjuk a kompetens E. coli törzs (r , m⁺) transzformálására, ampicillinrezisztenciára szelektálva. A DNS-szekvenálás azt mutatja, hogy a nyert telepekből származó plazmid helyes DNS-szekvenciát tartalmaz - [R15K,G16A,Y17R,T19I]-TFPI-2 a szintetikus élesztő szignálleader génhez kötve.

A KPN-1798 plazmidot további felhasználásra elválasztjuk. A pKFN-1798 412 bp nagyságú EcoRI-Xbal ffagmensének DNS-szekvenciáját a SEQ ID No. 13 szerkezetben mutatjuk be.

A pKFN-1798 plazmiddal az MT663 élesztőtörzset transzformáljuk az 1. példában leírtak szerint, a KFN-1811 élesztőtörzset nyerve.

A KFN-1811 transzformált törzs YDP tápközegben történő tenyésztését a felülúszóban lévő [R15K,G16A,Y17R,T19I]-TFPI-2 analízisét és tisztítását az 1. példában leírtak szerint hajtjuk végre.

3. példa

Szerin-proteáz gátlása TFPI (dómén II) KFN-1593mal

A KFN 1593-t élesztő tenyészléből tisztítjuk az 1. példában leírtak szerint. A KEN 1593 koncentrációját UV-elnyelés alapján határozzuk meg; 1%-os E_{280 nm}=8,3 és M_w=6500. A sertéstripszint a Novo Nordisk (Bagsvaerd, Dánia), a borjúkimotripszint (TLCK kezelt) és a sertéshasnyálmirigy-kallikreint a Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA), a humán plazmint és a humán plazmakailikreint a Kabi (Stockholm, Svédország) cégektől szereztük be.

A humán neutrofil elasztázt és a katepszin G-t a PMN-ből tisztítjuk Baugh és Travis módszerével [Biochemistry, 15:836-843 (1976)]. Az S2251, S2586, S2266, S2302 peptidil-nitroanilid-szubsztrátok a Kabi cégtől (Stockholm, Svédország) származnak. Az M4765 és S7388 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) és az Fxa-1 NycoMed (Oslo, Norvégia) készítmények.

A szerin-proteinázokat különböző koncentrációjú KFN 19593-mal inkubáljuk. Ezután hozzáadjuk a szubsztrátot és a maradék proteinázaktivitást 405 nmen mérjük. Az eredményeket a II. és III. táblázatban mutatjuk be.

A nem módosított TFPI Kunitz-típusú dómén II (KFN 1593) a tripszint (Kj=5x 10~M) és az X faktort (Kj=150 nM) gátolja. A KFN 1953 mérsékelt gátlást mutat a plazmin és a neutrofil elasztáz esetében, míg a katepszin G-t és a kallikreint lényegében nem gátolja.

4. példa [R15K,G16A,Y17R,T19I,L39R]-TFPI-2 előállítására KFN-1867 élesztőtörzsből

A két PCR-reakcióban 0,1 pg, a pKFN-1798 plazmidból származó, [R15K,G16A,Y17R,T19I]-TFPI-2-t kódoló, 1,3 kb nagyságú SphI-BamHI fragmenst használjuk. Az első reakcióban 100 pmol NOR-2022 prímért (GGAGTTTAGTGAACTTGC) és 100 pmol M-462 prímért (CCAGTGTCTCAAAATTGTTCATATTGCCCCTGCATCCACC) használunk. A második reakcióban 100 pmol NOR-1495 prímért (TAAGTGGCTCAGAATGA) és 100 pmol M-461 prímért (GGTGGATGCAGGGGCAATATGAACAATTTTGAGACACTGG) használunk. A NOR-2022 primer az Sphl hasítóhely alatt, a 94. bp helyen kezd. Az M-462 összeillő a SEQ ID No. 11 341-380. helyén lévő TFPI-2 DNS-szekvenciával, két össze nem illő párosodástól eltekintve A NOR-1495 primer a BamHI hasítóhely feletti 561. bp helyen kezd. Az M-461 összeillő az Μ-462-vel.

A PCR-reakciót 100 pl térfogatban végezzük kereskedelmi készletet (Gene Amp, Perkin Elmer Cetus (használva; a ciklus: 95 °C 1 perc, 50 °C 1 perc és 72 °C 2 perc. 24 ciklus után befejező ciklusban: 72 °C 10 perc. A PCR-termékeket - 518 bp nagyságú fragmenst az első és 209 bp nagyságú fragmenst a második reakcióból - elektroforézissel nyeljük ki 2%-os agarózgélen.

A fent leírt két reakciótermék 0,1-0,1 pg mennyiségét összekeverjük. A PCR-reakciót 100 pmol NOR-2022 és 100 pmol NOR-1495 primer felhasználásával hajtjuk végre, a ciklus: 95 °C 1 perc, 50 °C 2 perc és 72 °C 3 perc. 22 ciklus után a befejező ciklus 72 °C-os lépése 10 perces.

A nyert 687 bp nagyságú fragmenst 1% agarózgélen elektroforézissel tisztítjuk és EcoRI és Xbal enzimekkel hasítjuk. A kapott 412 bp nagyságú fragmenst a pMT636 plazmid 1,4 kb-ú NcoI-EcoRI fragmensével ligáljuk. A pMT636 plazmidot az 1. példában ismertettük.

A ligációs eleggyel transzformáljuk a kompetens E. coli törzset (R-, m⁺), ampicillinrezisztenciára szelektálva. A DNS-szekvenálás azt mutatja, hogy a nyert telepből származó plazmidok az [R15K,G16A,Y17R, T19I,L39R]-TFPI-2 helyes DNS-szekvenciáját tartalmazzák szintetikus élesztő szignálleader génhez kötve.

A pKFN-1861 plazmidot további felhasználásra kinyertük. A pFKN-1861 plazmid 412 bp nagyságú EcoRI-Xbal fragmensének DNS-szekvenciáját a SEQ ID No. 15 mutatja.

A pKFN-1861 plazmiddal MT663 élesztőtörzset transzformálunk az 1. példában leírtak szerint, a KFN-1867 élesztőtörzset nyerve.

A transzformált KFN-1867 törzs YPD tápközegben történő tenyésztése, a felülúszóban lévő [R15K,G16A,Y17R,T19I,L39R]-TFPI-2 analízise és tisztítása az 1. példában leírtak szerint történik.

5. példa

Az [P15K,G16A,Y17R,T19I,L39R,E46K]-TFPI-2 előállítása KFN-1868 élesztőtörzsből

A két PCR-reakcióban templátként 0,1 pg, a pKFN-1798 plazmidokból származó, [R15K,G16A, Y17R,T19I]-TFPI-2-t kódoló, 1,3 kb nagyságú SphlBamHI fragmenst használunk. Az első reakcióban 100 pmol NOR-2022 prímért (GGAGTTTAGTGAACTTGC) és 100 pmol 14-464 prímért (CCAGTGTCTTAAAATTGTTCATATTGCCCCTGCATCCACC) használunk. A második PCR-reakcióban 100 pmol NOR-1495 prímért (TAAGTGGCTCAAGAA-TGA) és 100 pmol M-463 prímért (GGTGGATGCA8

HU 218 104 Β

GGGGCAATATGAACAATTTTAAGACACTGG) használunk. A NOR-2022 primer az Sphl hasítóhely alatti 94. bp-nál kezd. Az M-464 összeillő a SWQ ID No. 11 341-380. közötti TFPI-2 DNS-szekvenciával, három nem illeszkedő párosodástól eltekintve. A NOR-1495 a BamHI hasítóhely feletti 561. bp-nál kezd. Az M-463 összeillő az Μ-464-gyel.

A PCR-reakciót 100 pl térfogatban végezzük kereskedelmi készlettel (Gene Amp, Perkin Elmer Cetus); a ciklus: 95 °C 1 perc, 50 °C 1 perc és 72 °C 2 perc. 24 ciklus után a befejező ciklus 72 °C-os lépése 10 perces. A PCR-reakciók termékeit - 518 bp nagyságú ffagmens az első és 209 bp nagyságú ffagmens a második reakcióból - 2%-os agarózgélen elektroforézissel tisztítjuk. A fenti reakciótermékekből 0,1-0,1 pg mennyiségeket összekeverünk. A PCR-reakciót 100 pmol NOR-2022 és 100 pmol 1495 primerekkel végezzük; a ciklus: 95 °C 1 perc, 50 °C 2 perc, 72 °C 3 perc. 22 ciklus után a befejező ciklus 72 °C-os lépése 10 perces.

A nyert 687 bp nagyságú fragmenst 1%-os agarózgélen tisztítjuk elektroforézissel, majd EcoRI és Xbal enzimekkel hasítjuk. A kapott 412 bp nagyságú fragmenst a pMT636 plazmidból származó, 9,5 kb nagyságú NcolXbal és pMT636 plazmidból származó, 1,4 kb nagyságú NcoI-EcoRI fragmensekkel ligáljuk A pMT636 plazmidot az 1. példában írtuk le.

A ligációs elegyet használjuk a kompetens E. coli törzs (r~, m⁺) transzformálására, az ampicillinrezisztenciára szelektálva. A DNS-szekvenálás azt mutatja, hogy a nyert telepekből izolált plazmidok az [R15K,G16A, Y17R,T19I,L39R,E46K]-TFPI-2 helyes DNS-szekvenciáját tartalmazzák szintetikus élesztő szignálleader génhez kapcsolódva.

A pKFN-1862 plazmidot további felhasználásra elválasztjuk. A pKFN-1862 412 kb nagyságú EcoRIXbal fragmensének DNS-szekvenciáját a SEQ ID No. 17 mutatja.

A pKFN-1862-vel az 1. példában leírtak szerint transzformáljuk az MT663 élesztő törzset, a KFN-1868 élesztő törzshöz jutva.

A KFN-1868 transzformált törzs YPD tápközegben történő tenyésztését a felülúszóban lévő [R15K, G16A,Y17R,T19I,L39R,E46K]-TFPI-2 analízisét és tisztítását az 1. példában leírtak szerint hajtjuk végre.

6. példa

TFPI-2 többszörös mutációja a 15. és 16. helyen

A két PCR-reakcióhoz templátként a pKFN-1605 plazmidból származó, TFPI-2-t kódoló, 1,3 kb nagyságú SphI-BamHI fragmenst használjuk. Az első PCR-reakcióban 100 pmol NOR-2022 prímért (GGAGTTTAGTGAACTTGC) és 100 pmol M-749 prímért [AATACCTGGTAATATAA(C/G)C(C/G)A(A/C)ACATATTCCAGGATC) használunk. A második PCR-reakcióban 100 pmol NOR-1495 prímért (TAAGTGGCTCAGAATGA) és 100 pmol M-750 prímért (GATCCTGGAATATGT(T/G)T(C/G)G(C/G)TTATATTACCAGGTATT) használunk. A NOR-2022 primer az Sphl hasítóhely alatt 94. bp helyen kezd. Az M-749 összeillő a SEQ ID No. 11 263-299. közötti

TFPI-2 DNS-szekvenciájával négy össze nem illő párosítástól eltekintve. A NOR-1495 primer a BamHI hasítóhely felett 561. bp-nál kezd. Az M-750 összeillő az Μ-749-cel.

A PCR-reakciót 100 pl térfogatban végezzük kereskedelmi készlettel (GeneAmp, Perkin Elmer Cetus); a ciklus: 95 °C 1 perc, 50 °C 1 perc, 72 °C 2 perc. 24 ciklus után a befejező ciklus 72 °C-os lépése 10 perces. A PCR-reakció termékeit - 439 bp nagyságú ffagmens az első és 285. bp nagyságú ffagmens a második reakcióból - 2%-os agarózgélen izoláljuk elektroforézissel. A fenti reakciók termékeiből 0,1-0,1 pg mennyiségeket összekeverünk. A PCR-reakciót 100 pmol NOR-2022 és 10 pmol NOR-1495 primerekkel hajtjuk végre; a ciklus: 95 °C 1 perc, 50 °C 2 perc és 72 °C 3 perc. 22 ciklus után a befejező ciklus 72 °C-os lépése 10 perces.

A nyert 687 bp nagyságú fragmenst 1%-os agarózgélen elektroforézissel tisztítjuk és EcoRI-Xbal enzimekkel hasítjuk. A kapott 412 bp nagyságú fragmenst a pT219R plazmidból [Mead D. A., Szczesna-Skopura E. és Kemper B., Prot. Engin., 1:67-74 (1985)] nyert 2,8 kb nagyságú EcoRI-Xbal ffagmenshez ligáljuk.

A ligációs eleggyel transzformáljuk a kompetens E. coli törzset (r~, m⁺), ampicillinrezisztenciára szelektálva. DNS-szekvencia szerint az alábbi hat plazmidot izoláltuk, mely a szintetikus élesztő szignálleader génhez kötve TFPI-2 jelzett analógjait kódolják:

plazmid analóg pKFN-1885 [R15FJ-TFPI-2 pKFN-1883 [R15F, G16A]-TFPI-2 pKFN-1905 [R15L]-TFPI-2 pKFN-1882 [R15L, G16A]-TFPI-2 pKFN-1887 [R15V]-TFPI-2 pKFN-1886 [R15V, G16A]-TFPI-2

A transzformált élesztőtörzs YPD tápközegben történő tenyésztését, a felülúszóban lévő TFPI-2-analógok analízisét és tisztítását az 1. példában leírtak szerint hajtjuk végre.

8. példa

A szerin-proteáz gátlása TFPI (dómén II) KFN 1811, 1867 és 1868-cal

A három TFPI (dómén II) változatot élesztő tenyészléből izoláljuk. Koncentrációjukat a 214 nm-en mért UV-elnyelés alapján határozzuk meg BPTI-t használva összehasonlító anyagként. A végső koncentráció meghatározása tripszinnel való titrálással történik. A sertést tripszint, a humán rekombináns proteineket, a Vlla faktort, aktivált protein C-t (ACP) és a tPA-t a Novo Nordisk A/S (Bagsvaerd, Dánia) cégtől szereztük be, akárcsak a humán trombint. A botjú kimotripszin és a glanduláris kallikrein a Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) a humán rekombináns szöveti faktor a Corvas (San Diego, CA, USA) készítménye. A humán neutrofil katepszin G-t a PMN-extraktumból tisztítjuk Baugh és Travis [Biochemistry, 15: 836-843 (1967)] módszerével. A humán plazmint a Kabi (Stockholm, Svédország), az uPA-t a Serono (Milán, Olaszország) cégtől szereztük be, a humán Xa-faktor Dr. W. Kisiel (Albuquerque,

HU 218 104 Β

NM USA), a humán plazmakallikrein Dr. I. Schousboe (Copenhagen, Dánia) ajándéka volt

Az S2251, S2302, S2266, S2586, S2288, S2444, S2366 és S2238 peptidil-nitroanilid-szubsztrátok a Kabi (Stockholm, Svédország), az S7388 és az M4765 a Sig- 5 ma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA), az FXa-1 a Nycomed (Oslo, Norvégia) cégtől származik.

A szerin-proteázokat különböző koncentrációjú Kunitz-domén változatokkal inkubáljuk 30 percen át. 0,6 mM szubsztrátot adunk a reakcióelegyhez, és a maradék proteinázaktivitást 405 nm-en mérjük. Az eredményeket a II. táblázatban foglaltuk össze.

A három változat erős specifikus plazmingátló anélkül, hogy a plazma más vizsgált proteinázai gátolnák.

II. táblázat

KÍApp(nM)

Enzim	Enzimkoncentráció	Szubsztrát	Kj(nM)
KFN 1811	KFN 1867	KFN 1868
Tripszin	10 nM	S2251	<<1	<<1	<<1
Plazmin	4nM	S2251	3	3	3
Neutrofil elasztáz	10 nM	M4765	n.g.	n.g.	n.g.
Nf. katepszin G	50 nM	S7388	n.g.	n.g.	n.g.
Plazmakallikrein	3nM	S2302	>100	>100	>100
Glandurális kallikrein	1 U/ml	S2266	>100	>100	>100
Kimotripszin	2,5 nM	S2586	10	20	20
tpA	10 nM	S2288	n.g.	n.g.	n.g.
Vlla/TF faktor	10nM/15nM	FXa-1	n.g.	n.g.	n.g.
Xa-faktor	3nM	FXa-1	n.g.	n.g.	n.g.
uPA	5nM	S2444	n.g.	n.g.	n.g.
APC	5nM	S2366	n.g.	n.g.	n.g.
Trombin	3 NIHu/ml	S2238	n.g.	n.g.	n.g.

9. példa

Szerin-proteinázok gátlása TFPI (dómén II) KFN 1983, 1897, 11898 és 1928-cal

A három változatot élesztő tenyészléből tisztítjuk. Koncentrációjúkat 214 nm-en mért fényelnyeléssel határozzuk meg, összehasonlító anyagként BTPI-t használva. A sertéstripszint a Novo Nordisk A/S (Bagsvaerd, Dánia), a borjúkimotripszint (TLCK kezelt) a Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA), a humán rekombináns szöveti faktort a Corvas (San Diego, CA, USA), a humán plazmint a Kabi (Stockholm, Svédország) cégektől szereztük be. A humán neutrofil katepszin G-t és az elasztázt a PMN-extraktumból tisztítjuk Baugh és Travis módszerével [Biochemistry, 15:836-843(1976)]

Az S2251, S2586 peptidil-nitroanilid-szubsztrátok a Kabi (Stockholm, Svédország), az S7388 és M4765 a Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) készítményei.

A szerin-proteinázokat különböző koncentrációkban lévő változatokkal kezeljük 30 percen át, ezután 0,6 nM szubsztárotot adunk a reakcióelegyhez, és a maradék proteinázaktivitást 405 nm-en méijük. Az eredményeket a III. táblázatban foglaljuk össze.

III. táblázat

Enzim	Enzimkon- centráció	Szubsztrát	KiAPP 0>M)
KNN 1893	KFN 1897	KFN 1898	KFN 1928
Tripszin	10 nM	S2251	n.g.	n.g.	n.g.	n.g.
Kimotripszin	2,5 nM	S2586	<5	gyg·	gy-g·	<5
Neutrofil elasztáz	4nM	M4765	0,23	0,46	0,35	2,2
Neutrofil katepszin G	50 nM	S7388	n.g.	n.g.	n.g.	n.g.
Plazmin	4nM	S2251	n.g.	n.g.	n.g.	n.g.

n.g. - nincs gátlás < 1 μπι koncentrációnál gy.g. - gyenge gátlás 100 mM koncentrációnál

HU 218 104 Β

SZEKVENCIALISTA 1) INFORMÁCIÓK

i) Bejelentő:

a) név: Novo Nordisk A/S

b) utca: Novo Allé 5

c) város: Bagsvaerd

e) ország: Dánia

f) postai irányítószám: DK-2880

g) telefon: +45 4444 8888

h) telefax: +45 4449 3256 10

i) telex: 37304 ii) A bejelentés címe: Humán Kunitz-típusú proteázgátló változatai ii) A szekvencia száma: 18 iv) számítógéppel olvasható forma 15

a) adathordozó típusa: floppy disk

b) számítógép: IBM PC-kompatibilis

c) operációsrendszer: PC-DOS/MS-DOS

d) Szoftver: Patentln Release #1.0, Version #1,25 (EPO)

2) Adatok a SEQ ID No. 1-hez:

i) a szekvencia jellemzői:

a) hossza: 57 aminosav

b) típusa: aminosav

d) szerkezete: lineáris ii) a molekula típusa: fehéije vi) eredete

a) organizmus: szintetikus xi) a szekvencia leírása SEQ ID No. 1:

Xaa

Asp

Phe

Cys

Phe

Leu

Glu

Glu

hsp

Xaa

Gly

Xaa

Cys

Xaa

Xaa

Xaa

1

5

10

15

Xaa

Xaa

Xaa

Tyr

Phe

Tyr

Asn

Asn

Gin

Thr

Lys

Gin

Cys

Glu

Arg

Phe

20

25

30

Xaa

Tyr

Gly

Gly

Cys

Xaa

Xaa

Xaa

Met

Asn

Asn

Phe

Xaa

Thr

Leu

Glu

35

40

45

Glu

Cys

Lys

Asn

Ile

Cys

Glu

Asp

Xaa

50

55

2) Adatok a SEQ ID No. 2-höz i) A szekvencia jellemzői:

a) a szekvencia hossza: 57 aminosav

b) típusa: aminosav d) szerkezete: lineáris ii) a molekula típusa: fehéije 30 vi) eredete

a) organizmus: szintetikus xi) a szekvencia leírása SEQ ID No. 2:

Xaa Asp Phe Cys Fhe Leu Glu Glu Asp Xaa Gly Xaa Cys Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Tyr Fhe Tyr Asn Xaa Gin Xaa Lys Gin Cys Glu Arg Fhe 20 25 30

Xaa Tyr Gly Gly Cys 35

Glu Cys Lys Asn Ile 50

Xaa Xaa Xaa Met 40

Cys Glu Asp Xaa 55

Asn Asn The Xaa Thr Leu Glu 45

2) Adatok a SEQ ID No. 3-hoz i) A szekvencia jellemzői:

a) hossza: 58 aminosav

b) típusa: aminosav d) szerkezete: lineáris

Lys Pro Asp Phe Cvs Fhe Inu 1 5~ ii) a molekula típusa: fehéije vi) eredete

a) organizmus: szintetikus xi) a szekvencia leírása SEQ ID No. 3:

Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Lys Alá 10 15

Arg Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg 20 25 30

HU 218 104 Β

Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu 35

Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys 50 “ 55

2) Adatok a SEQ ID No. 4-hez i) A szekvencia jellemzői:

a) hossza: 58 aminosav

b) típusa: aminosav d) szerkezete: lineáris

Gly Asn Két Asn Asn Phe Glu 1hr Leu 40 45

Glu Asp Gly ii) a molekula típusa: fehéije vi) eredete

a) organizmus: szintetikus xi) a szekvencia leírása SEQ ID No. 4:

Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu 1 5

Arg Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr 20

Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Arg 35

Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys 50 55

2) Adatok a SEQ ID No. 5-höz i) A szekvencia jellemzői:

a) hossza: 58 aminosav

b) típusa: aminosav d) szerkezete: lineáris

Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu 1 5

Arg Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr 20

Fhe Lys Tyr Gly Gly Cys Arg Gly 35 40

Glu Glu Cys Lys Asn Ile 50

Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Lys Alá 10 15

Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg 25 30

Gly Asn Két Asn Asn Fhe Glu Thr Leu 40 45

Glu Asp Gly ii) a molekula típusa: fehérje vi) eredete

a) organizmus: szintetikus xi) a szekvencia leírása SEQ ID No. 5:

Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cvs Lys Alá 10 ' 15

Asn Asn Gin Thr Lys Gin cys Glu Arg 25 30

Asn Két Asn Asn Phe Lys Thr Leu 45

Cys Glu Asp Gly 55

2)

Adatok a SEQ ID No. 6-hoz i) A szekvencia j ellemzői: a) hossza: 58 aminosav ii) molekulatípus: fehéije vi) eredete

a) organizmus: szintetikus

b)

típus:

i : ami

nosav

xi) a

szekvencia 1<

eírása

SEQ1

ID No.

.6:

c)

szerk

ezete:

lineái

•is

Lys

Pro

Asp

Fhe

Cys

Phe

Leu

Glu

Glu

Asp

Pro

Gly

Pro

Cys

Lys

Alá

1

5

10

15

Arg

Ile

Ile

Arg

Tyr

Fhe

Tyr

Asn

Asn

Gin

Thr

Lys

Gin

Cys

Glu

Arg

20

25

30

Phe

Val

Tyr

Gly

Gly

Cys

Arg

Alá

Lys

Met

Asn

Asn

Phe

Lys

Thr

Leu

35

40

45

Glu

Glu

Cys

Lys

Asn

Ile

cys

Glu

Asp

Gly

50

55

HU 218 104 Β

2) Adatok a SEQ ID No. 7-hez

i) A szekvencia jellemzői:

a) hossza: 945 bázispár

b) típusa: nukleinsav

c) száltípusa: egyszálú

d) szerkezete: lineáris ii) a molekula típusa: cDNS vi) eredete: CDS

a) organizmus: Homo sapiens ix) azonosító jegy: a) név/jel: CDS

b) elhelyezkedés: 365...538 xi) a szekvencia leírása SEQ ID No. 7:

GGATCCGAAT TCCACCATGA AGAAACTACA TGCACITTGG GCTTCTCTAT GCCTGCIGCT 60

TAATCTIGCC CCTGCCCCTC TIAATGCTGA TTCTGAGGAA GATGAAGAAC ACACAATIAT 120

CACAGATACG GAGTIGCCAC CACTGAAACT TAIGCATTCA TITICTGCAT TCAAGC-OGGA 180

TGATCGCCCA TCTAAAGCAA TCATGAAAAG ATITTTCTTC AAIATTITCA CTOGACAGTC 240

CGAAGAATIT ATATATCGGG GATGTCAAGG AAATCAGAAT GGATTTCAAA GTCTGGAAGA 300

GTGCAAAAAA ATCTCTACAA GAGATAATCC AAACAGGATT ATAAAGACAA CATTCCAACA 360

AGAA AAG CCA GAT TTC TGC TIT TTC GAA GAA GAT CCT GGA ATA TCT GGA 409

Lys Pro Asp Fhe Cys Pite Leu Glu Glu Asp Pro Gly He Cys Arg

10 15

GCT TAT ATT ACC AGG	TAT TIT TAT AAC AAT CAG ACA AAA CAG TCT GAA	457
Gly	iyr Ile	Ihr Arg 20	Tyr	Fhe	Tyr	Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu
25	30
CCT	TTC AAG	TAT GCT	GGA	TGC	CTG	GGC AAT	ATG AAC AAT TIT GAG ACA	505
Arg	Fhe Lys	Tyr Gly	Gly	Cys	Leu	Gly Asn	Met Asn Asn Phe Glu Thr
		35				40	45
CTG	GAA GAA	TGC AAG	AAC	ATT	TCT	GAA GAT	GCT CCGAATGGTT TCCAGCTGGA	558
Leu	Glu Glu	Cys Lys	Asn	Ile	Cys	Glu Asp Gly
	50				55

TAATTATGGA AOCCAGCTCA ATCCTCTGAA TAACTCCCIG ACTCCGCAAT CAACCAAGGT 618

TCCCAGCCIT TTTGAATITC ACGGTCCCTC ATCCTCTCTC ACTCCAGCAG ACAGAGGATT 678

GIGTOGIGCC AATGAGAACA GAITCTACTA CAATTCAGTC ATIGGGAAAT GCOGCCCATT 738

TAAGTACAGT GGAIGTGGGG GAAATGAAAA CAATTTTACT TCCAAACAAG AATGTCIGAG 798

GGCATCTAAA AAAGGTTTCA TCCAAAGAAT ATCAAAAGGA GGCCTAATTA AAACCAAAAG 858

AAAAAGAAAG AAGCAGAGAG IGAAAATAGC AIATGAAGAG ATCTTTGITA AAAAIATCTG 918

AATTIGTTAT AGCAATGTAA CTCTAGA 945

2) Adatok a SEQ ID No. 8-hoz c) szerkezete: lineáris

i) A szekvencia jellemzői: 50 ii) a molekula típusa: fehérje

a) hossza: 58 aminosav xi) a szekvencia leírása SEQ ID No. 8:

Lys Pro Asp Fhe Cys Fhe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly

10 15

Tyr Ile Thr Arg Tyr Fhe Tyr Asn Asn Gin Ihr Lys Gin Cys Glu Arg 20 25 30

Fhe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Fhe Glu Thr Leu 35 40 45

HU 218 104 Β

Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly 50 55

2) Adatok a SEQ ID No. 9-hez

i) A szekvencia jellemzői:

a) hossza: 235 bázispár

b) típusa: nukleinsav

c) száltípusa: egyszálú

d) szerkezete: lineáris ii) a molekula típusa: cDNS vi) eredete

a) organizmus: szintetikus ix) azonosító jegye:

a) név/jel: CDS

b) elhelyezkedése: 77...235 xi) a szekvencia leírása SEQ ID

GAATTCCAIT CAAGAAIAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATIT CATACACAAT 60

AIAAACGACC AAAAGA ATC AAG GCT CTT TTC TTC GTT TTC TCC TTC ATC* 109

Met Lys Alá Val Fhe Leu Val Leu Ser Leu Ile io

GGA TTC TCC TCG GCC CAA CCA	CTC ACT Val Thr 20
Gly Phe Cys	Trp 15	Alá	Gin	Pro
ATT	CCG	GAA	GAG	TCT	CTC	ATC	ATC	GCT
Ile	Pro	GlU	GlU	Ser	Leu	Ile	Ile	Alá
		30					35
CTC	GCC	ATG	GCT.	GAG	AGA	TTC	GAG	AAG
Val	Alá	Met	Alá	Glu	Arg	Leu	Glu	Lys
	45					50

GGC GAT GAA TCA TCT GTT GAG 157

Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu

GAA AAC ACC ACT TTG GCT AAC 205

Glu Asn Thr Thr Leu Alá Asn

AGA 235

Arg

2) Adatok a SEQ ID No. 10-hez i) A szekvencia jellemzői:

a) hossza: 53 aminosav

b) típusa: aminosav

d) szerkezete: lineáris ii) a molekula típusa: fehérje xi) a szekvencia leírása SEQ ID No. 10:

Met Lys Alá Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile Gly Phe Cys Trp Alá 15 10 15

Gin Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu Ile Pro Glu Glu Ser 20 25 30

Leu Ile Ile Ma Glu Asn Thr Thr Leu Alá Asn Val Alá Met Alá Glu 35 40 45

Arg Leu Glu Lys Arg

Adatok a SEQ ID No. 11-hez		a) név/jel: CDS
i) A szekvencia jellemzői:		b) elhelyezkedése: 77...409
a) hossza: 418 bázispár	50	ix) azonosító jegy
b) típusa: nukleinsav		a) név/jel: szignálpeptid
c) száltípus: egyszálú		b) elhelyezkedése: 77...235
d) szerkezete: lineáris		ix) azonosító jegy
ii) a molekula típusa: cDNS		a) név/jel: érett peptid
vi) eredete	55	b) elhelyezkedése: 236...409
a) organizmus: szintetikus/humán		xi) a szekvencia leírása SEQ ID No. 11
ix) azonosító jegy

HU 218 104 Β

GAATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATIACAAA CLATCAATTT CATACACAAT 60

ATAAACGACC AAAAGA ATC AAG GCT GTT TTC TTC GIT TTG TCC TTC ATC 109

Met Lys Alá Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile -53 -50 -45

GGA TTC TCC Gly Phe Cys

TCG GCC

CAA CCA GTC ACT GGC GAT GAA TCA TCT GTT GAG

157

Trp

Alá

Gin Pro Val -35

Thr

Gly

Asp Glu

Ser Ser -30

Val

Glu

-40

ATT

CCG

GAA

GAG

TCT

CTG

ATC

ATC

GCT

GAA

AAC

ACC

ACT

TTC

GCT

AAC

205

Ile

Pro

Glu

Glu

Ser

Leu

Ile

Ile

Alá

Glu

Asn

Thr

Thr

Leu

Alá

Asn

-25

-20

-15

GTC

GCC

ATC

GCT

GAG

AGA

TTC

GAG

AAG

AGA

AAG

CCA

GAT

TTC

TGC

TTT

253

Val

Alá

Met

Alá

Glu

Arg

leu

Glu

Lys Arg

Lys

Pro

Asp

Phe

Cys

Phe

-10

-5

1

5

TTC

GAA

GAA

GAT

CCT

GGA

ATA

TCT

OGA

GGT

TAT

ATT

ACC

AGG

TAT

TTT

301

Leu

Glu

Glu

Asp

Pro

Gly

Ile

Cys Arg

Gly

Tyr

Ile

Thr

Arg

Tyr

Phe

10

15

20

TAT

AAC

AAT

CAG

ACA AAA

CAG

TCT

GAA

CCT

TTC

AAG

TAT

GGT

GGA

TCC

349

Tyr

Asn

Asn

Gin

Thr

Lys

Gin

cys

Glu

Arg

Phe

Lys

Tyr Gly Gly Cys

30 35

CTG GGC AAT ATG AAC AAT TIT GAG ACA CTG GAA GAA TGC AAG AAC ATT Tph Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile

45 50

TCT GAA GAT GGT TAATCTAGA Cys Glu Asp Gly ⁵⁵

2) Adatok a SEQ ID No. 12-höz i) A szekvencia jellemzői:

a) hossza: 111 aminosav

b) típusa: aminosav

d) szerkezete: lineáris ii) a molekula típusa: fehérje xi) a szekvencia leírása SEQ ID No. 12

Met

Lys

Alá

Val

Phe

Leu

Val

Leu

Ser

Leu

Ile

Gly

Phe

Cys

Trp

Alá

-53

-50

-45

-40

Gin

Pro

Val

Thr

Gly

Asp

Glu

Ser

Ser

Val

Glu

Ile

Pro

Glu

Glu

Ser

-35

-30

-25

Leu

Ile

Ile

Alá

Glu

Asn

Thr

Thr

Leu

Alá

Asn

Val

Alá

Met

Alá

Glu

-20

-15

-10.

Arg

Leu

Glu

Lys

Arg

Lys

Pro

Asp

Phe

cys

Phe

Leu

Glu

Glu

Asp

Pro

-5

1

5

10

Gly

Ile

cys

Arg

Gly

Tyr

Ile

Thr

Arg

Tyr

Phe

Tyr

Asn

Asn

Gin

Thr

15

20

25

Lys

Gin

Cys

Glu

Arg

Phe

Lys

Tyr

Gly

Gly

Cys

Leu

Gly

Asn

Met

Asn

30

35

40

Asn

Phe

Glu

Thr

Leu

Glu

Glu

Cys

Lys

Asn

Ile

Cys

Glu

Asp

Gly

45

50

55

HU 218 104 Β

2) Adatok a SEQ ID No. 13-hoz

i) A szekvencia jellemzői:

a) hossza: 418 bázispár

b) típusa: nukleinsav

c) száltípus: egyszálú

d) szerkezete: lineáris ii) a molekula típusa: cDNS vi) eredete

a) organizmus: szintetikus ix) azonosító jegy

a) név/jel: CDS

b) elhelyezkedése: 77...409 ix) azonosító jegy

a) név/jel: szignálpeptid 5 b) elhelyezkedése: 77...235 iv) azonosító jegy

a) név/jel: érett peptid

b) elhelyezkedése: 236...409 xi) a szekvencia leírása SEQ ID No. 13:

GAAITCCATT CAAGAATACT? TCAAACAAGA AGATEACAAA CTATCAATIT CAIACACAAT 60

ATAAACGACC AAAAGA ATC AAG GCT CTT TTC TTG GTT TIG TCC TTC ATC 109

Met Lys Alá Val Fhe Leu Val Leu Ser Leu He

	-53	-50	-45
GGA TTC TCC TGG	GCC CAA CCA	GTC ACT? GGC GAT GAA	TCA TCT CTT GAG 157
Gly Fhe Cys Trp	Alá Gin Pro	Val Thr Gly Asp Glu	Ser Ser Val Glu
-40		-35	-30
ATT CCG GAA GAG	TCT CTG ATC	ATC GCT GAA AAC ACC	ACT TTG GCT AAC 205
Ile Pro Glu Glu	Ser Leu Ile	Ile Alá Glu Asn Thr	Thr Leu Alá Asn
-25	-20	-15
CTC GCC ATC GCT	GAG AGA TTG	GAG AAG AGA AAG CCA	GAT TTC TGC TIT 253
Val Alá Met Alá	Glu Arg Leu	Glu Lys Arg Lys Pro	Asp Phe Cys Phe
-10	-5	1	5
TIG GAA GAA GAT	CCT GGA AIA	TGT AAA GCT CGT ATT	ATC AGG TAT TIT 301
Leu Glu Glu Asp	Pro Gly Ile	Cys Lys Alá Arg Ile	Ile Arg Tyr Phe
10		15	20
TAT AAC AAT CAG	ACA AAA CAG	TGT GAA CGT TIG AAG	TAT GGT GGA TGC 349
Tyr Asn Asn Gin	Thr Lys Gin	Cys Glu Arg Phe Lys	Tyr Gly Gly Cys-
25		30	35
CTG GGC AAT ATG	AAC AAT ΤΓΤ	GAG ACA CTG GAA GAA	TGC AAG AAC ATT 397
Leu Gly Asn Met	Asn Asn Phe	Glu Thr Leu Glu Glu	Cys Lys Asn Ile
40	45	50
TGT GAA GAT GGT	TAATCTAGA		418
Cys Glu Asp Gly
55
Adatok a SEQ ID No. 14-hez	d) szerkezete: lineáris
i) a szekvencia jellemzői		45 ii) a molekula típusa: fehérje
a) hossza: 11 aminosav	xi) a szekvencia leírása SEQ ID No. 14:
b) tínusa: aminosav
Met Lys Alá	Val Phe leu	Val Leu Ser Leu Ile	! Gly Phe Cys Trp Alá
-53	-50	-45	-40
Gin Pro Val	Thr Gly Asp	Glu Ser Ser Val Glu	: Ile Pro Glu Glu Ser
-35		-30	-25
Leu Ile Ile	Alá Glu Asn	Thr Thr Leu Alá Asn	i Val Alá Met Alá Glu
-20		-15	-10
Arg leu Glu	Lys Arg Lys	Pro Asp Phe Cys Fhe	Leu Glu Glu Asp Pro
-5	1	5	10

HU 218 104 Β

Gly Ile Cys Lys Alá Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr 15 20 25

Lys GLn Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn 30 35 40

Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly

2) Adatok a SEQID No. 15-höz

i) A szekvencia jellemzői:

a) hosssza: 418 bázispár

b) típusa: nukleinsav

c) száltípusa: egyszálú

d) szerkezete: lineáris ii) a molekula típusa: cDNS vi) eredete

a) organizmus: szintetikus ix) azonosító jegy

55

a) név/jel: CDS

b) elhelyezkedés: 77...409 ix) azonosító jegy

a) név/jel: szignálpeptid

b) elhelyezkedés: 77...235 15 ix) azonosító jegy

a) név/jel: érett peptid

b) elhelyezkedése: 236...409 xi) a szekvencia leírása SEQ ID No. 15:

GAATTCCAn’ CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTAIGAAITT CATACACAAT 60 AIAAACGACC AAAAGA ATG AAG GCT GIT TTC TTG CTT TIG TCC TTG ATC 109

Met Lys Alá Val -53 -50

Fhe

Leu

Val

Leu

Ser -45

Leu

Ile

GGA

TTC

TGC

TGG

GCC CAA CCA GTC

ACT

GGC

GAT

GAA

TCA

TCT

GTT

GAG

157

Gly

Fhe

Cys

Trp

Alá Gin Pro Val

Thr

Gly Asp

Glu

Ser

Ser

Val

Glu

-40

-35

-30

ATT

COG

GAA

GAG

TCT CTG ATC ATC

GCT

GAA

AAC

ACC

ACT

TIG

GCT

AAC

205

Ile

Pro

Glu

Glu

Ser Leu Ile Ile

Alá

Glu

Asn

Thr

Thr

Leu

Alá

Asn

-25

-20

-15

GTC

GCC

ATG

GCT

GAG AGA TTG GAG

AAG

AGA

AAG

CCA

GAT

TTC

TGC

ITT

253

Val

Alá

Met

Alá

Glu Arg Leu Glu

Lys Arg

Lys

Pro

Asp

Fhe

Cys

Fhe

-10

-5

1

5

TTG

GAA

GAA

GAT

CCT GGA ATA TGT

AAA

GCT

CCT

ATT

ATC

AGG

TAT

ΊΤΤ

301

Leu

Glu

Glu

Asp

Pro Gly Ile Cys

Lys

Alá

Arg

Ile

Ile

Arg

Tyr

Phe

10

15

20

TAT

AAC

AAT

CAG

ACA AAA CAG TGT

GAA

CCT

TTC

AAG

TAT

GCT

GGA

TGC

349

Tyr

Asn

Asn

Gin

Thr Lys Gin Cys

GlU

Arg

Fhe

Lys Tyr Gly

Gly

Cys

25

30

35

AGG

GGC

AAT

ATG

AAC AAT TIT GAG

ACA

CTG

GAA

GAA

TGC AAG

AAC

ATT

397

Arg Gly

Asn

Met

Asn Asn Phe Glu

Thr

Leu

Glu

Glu

Cys Lys

Asn

Ile

40

45

50

TCT

GAA

GAT

GCT

TAATCTAGA

418

Cys

Glu

Asp

Gly

2) Adatok a SEQ ID No. 16-hoz i) a szekvencia jellemzői:

a) hossza: 111 aminosav

b) típusa: aminosav

d) szerkezete: lienáris ii) a molekula típusa: fehérje xi) a szekvencia leírása SEQ ID No. 16:

HU 218 104 Β

Met

Lys

Alá

Val

Fhe

Leu

Val

Leu

Ser

Leu

Ile

Gly

Fhe

Cys

Trp

Alá

-53

-50

-45

-40

Gin

Pro

Val

Thr

Gly

Asp

Glu

Ser

Ser

Val

Glu

Ile

Pro

Glu

Glu

Ser

-35

-30

-25

Leu

Ile

Ile

Alá

Glu

Asn

Thr

Thr

Leu

Alá

Asn

Val

Alá

Met

Alá

Glu

-20

-15

-10

Arg

Leu

Glu

Lys

Arg

Lys

Pro

Asp

Phe

cys

Phe

Leu

Glu·

Glu

Asp

Pro

-5

1

5

10

Gly

Ile

Cys

Lys

Alá

Arg

Ile

Ile

Arg

Tyr

Fhe

Tyr

Asn

Asn

Gin

Thr

15

20

25

Lys

Gin

Cys

Glu

Arg

Phe

Lys

Tyr

Gly

Gly

Cys

Arg

Gly

Asn

Met

Asn

30

35

40

Asn

Phe

Glu

Thr

Leu

Glu

Glu

Cys

Lys

Asn

Ile

Cys

Glu

Asp

Gly

45

50

55

2) Adatok a SEQ ID No. 17-hez a) név/jel: CDS

i) A szekvencia jellemzői: b) elhelyezkedés: 77...409

a) hossza: 218 bázispár ix) azonosító jegy

b) típusa: nukleinsav	25	a) név/jel: szignálpeptid
c) száltípus: egyszálú		b) elhelyezkedése: 77...235
d) szerkezete: lineáris		ix) azonosító jegy
ii) a molekula típusa: cDNS		a) név/jel: érett peptid
vi) eredete		b) elhelyezkedés: 236...409
a) organizmus: szintetikus	30	xi) a szekvencia leírása SEQ ID No. 17

ix) azonosító jegy

GAATTCCAIT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATIT CATACACAAT 60

ATAAACGACC AAAAGA ATG AAG GCT GTT TTC TIG GTT TIG TCC TIG ATC 109

Met Lys Alá Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile -53 -50 -45

GGA TTC TC-C TGG GCC CAA CCA CTC ACT GGC GAT GAA TCA TCT GTT GAG

157

Gly

Fhe

Cys Trp -40

Alá Gin

Pro

Val Thr —35

Gly

Asp

Glu

Ser -30

Ser

Val

Glu

ATT

CCG

GAA GAG

TCT CTG

ATC

ATC GCT

GAA

AAC

ACC

ACT

TIG

GCT

AAC

205

Ile

Pro -25

Glu Glu

Ser Leu

Ile -20

Ile Alá

Glu

Asn

Thr -15

Thr

Leu

Alá

Asn

CTC

GCC

ATG C-CT

GAG AGA

TIG

GAG AAG

AGA

AAG

CCA

GAT· TTC

TGC

ITT

253

Val -10

Alá

Met Alá

Glu Arg -5

Leu

Glu Lys

Arg

Lys 1

Pro

Asp

Fhe

Cys 5

Fhe

TIG

GAA

GAA GAT

CCT GGA

ATA

TCT AAA

GCT

CGT

ATT

ATC

AGG

TAT

TTT

301

Leu

Glu

Glu Asp 10

Pro Gly

Ile

Cys Lys 15

Alá

Arg

Ile

Ile

Arg Tyr 20

Fhe

TAT

AAC AAT CAG

ACA AAA

CAG

TGT GAA

CGT

TTC

AAG

TAT

GCT

GGA

TGC

349

Tyr

Asn Asn Gin 25

Thr Lys

Gin

Cys Glu 30

Arg

Phe

Lys

Tyr 35

Gly

Gly

Cys

AGG

GGC

AAT ATG

AAC AAT

TIT

AAG ACA

CTG

GAA

GAA

TGC

AAG

AAC

ATT

397

Arg Gly 40

Asn Met

Asn Asn

Phe 45

Lys Thr

Leu

Glu

Glu 50

cys Lys

Asn

Ile

HU 218 104 Β

TCT GAA GAT GGT TAATCTAGA 418

Cys Glu Asp Gly

2) Adatok a SEQ ID No. 18-hoz i) a szekvencia jellemzői:

a) hossza: 111 aminosav

b) típusa: aminosav

d) szerkezete: lineáris ii) a molekula típusa: fehérje ix) a szekvencia leírása SEQ ID No. 18:

Met lys Alá Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile Gly Fhe Cys Trp Alá

-53 -50 -45 -40

Gin Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu Ile Pro Glu Glu Ser

-35 -30 -25

Leu Ile Ile Alá Glu Asn Thr Thr Leu Alá Asn Val Alá Met Alá Glu -20 -15 -io

Arg Leu Glu Lys Arg Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro “5 15 10

Gly Ile Cys Lys Alá Arg Ile Ile Arg Tyr Fhe Tyr Asn Asn Gin Thr 15 20 25

Lys Gin Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Asn Met Asn 30 35 40

Asn Fhe Lys Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly

Claims (41)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. A „szöveti faktorútvonal” inhibitor (tissue factor pathway inhibitor, TFPI) humán, Kunitz-típusú proteázinhibitor dómén II-jének változata, azzal jellemezve, hogy az aminosavszekvenciája:

   X¹ Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp X² Gly X³ Cys X⁴ X⁵ X⁶ X⁷ X⁸ X⁹ Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe X> Tyr Gly Gly Cys X X¹² X>³ Met Asn Asn Phe X¹⁴ Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp X¹³ (SEQ ID No. 1.), ahol X¹ jelentése hidrogénatom vagy 1-5 természetes aminosavrész, kivéve a Cys-t, X²-X¹⁴ jelentése egymástól függetlenül természetes aminosavrész, X¹⁵ jelentése hidroxilcsoport vagy 1-5 természetes aminosavrész, kivéve a Cys-t, azzal a feltétellel, hogy X'-X¹⁵ aminosavrészek közül legalább egyben eltérés van a natív szekvencia megfelelő aminosavrészeit illetően; továbbá hogy X⁴ jelentése nem lehet Leu.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti változat, ahol X¹ jelentése Lys-Pro.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti változat, ahol X² jelentése Alá, Arg, Thr, Asp, Pro, Glu, Lys, Gin, Ser, Ile vagy Val.
4. 4. A 3. igénypont szerinti változat, ahol X² jelentése Thr vagy Pro.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti változat, ahol X³ jelentése Pro, Thr, Leu, Arg, Val vagy Ile.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti változat, ahol X³ jelentése Pro vagy Ile.
7. 7. Az 1. igénypont szerinti változat, ahol X⁴ jelentése Lys, Arg, Val, Thr, Ile, Phe, Gly, Ser, Met, Trp, Tyr, Gin, Asn vagy Alá.
8. 8. A 7. igénypont szerinti változat, ahol X⁴ jelentése Lys, Val, Ile, Thr, Met, Gin vagy Arg.
9. 9. Az 1. igénypont szerinti változat, ahol X⁵ jelentése Alá, Gly, Thr, Arg, Phe, Gin vagy Asp.
10. 10. A 9. igénypont szerinti változat, ahol X⁵ jelentése Alá, Thr, Asp vagy Gly.
11. 11. Az 1. igénypont szerinti változat, ahol X⁶ jelentése Arg, Alá, Lys, Leu, Gly, His, Ser, Asp, Gin, Glu, Val, Thr, Tyr, Phe, Asn, Ile vagy Met.
12. 12. A 11. igénypont szerinti változat, ahol X⁶ jelentése Arg, Phe, Alá, Leu vagy Tyr.
13. 13. Az 1. igénypont szerinti változat, ahol X⁷ jelentése Ile, Met, Gin, Glu, Thr, Leu, Val vagy Phe.
14. 14. A 13. igénypont szerinti változat, ahol X⁷ jelentése Ile.
15. 15. Az 1. igénypont szerinti változat, ahol X⁸ jelentése Ile, Thr, Leu, Asn, Lys, Ser, Gin, Glu, Arg, Pro vagy Phe.
16. 16. A 15. igénypont szerinti változat, ahol X⁸ jelentése Ile vagy Thr.
17. 17. Az 1. igénypont szerinti változat, ahol X⁹ jelentése Arg, Ser, Alá, Gin, Lys vagy Leu.
18. 18. A 17. igénypont szerinti változat, ahol X⁹ jelentése Arg.
19. 19. Az 1. igénypont szerinti változat, ahol X¹⁰ jelentése Gin, Pro, Phe, Ile, Lys, Trp, Alá, Thr, Leu, Ser, Tyr, His, Asp, Met, Arg vagy Val.

    HU 218 104 Β
20. 20. A 19. igénypont szerinti változat, ahol X¹⁰ jelentése Val vagy Lys.
21. 21. Az 1. igénypont szerinti változat, ahol X¹¹ jelentése Gly, Met, Gin, Glu, Leu, Arg, Lys, Pro vagy Asn.
22. 22. A 21. igénypont szerinti változat, ahol X¹¹ jelentése Arg vagy Leu.
23. 23. Az 1. igénypont szerinti változat, ahol X¹² jelentése Alá vagy Gly.
24. 24. Az 1. igénypont szerinti változat, ahol X¹³ jelentése Lys, Asn vagy Asp.
25. 25. A 24. igénypont szerinti változat, ahol X¹³ jelentése Lys vagy Asn.
26. 26. Az 1. igénypont szerinti változat, ahol X¹⁴ jelentése Val, Tyr, Asp, Glu, Thr, Gly, Leu, Ser, Ile, Gin, His, Asn, Pro, Phe, Met, Alá, Arg, Trp vagy Lys.
27. 27. A 26. igénypont szerinti változat, ahol X¹⁴ jelentése Lys vagy Glu.
28. 28. Az 1. igénypont szerinti változat, ahol X¹⁵ jelentése Gly.
29. 29. Az 1. igénypont szerinti változat, ahol X¹ jelentése Lys-Pro és X¹⁵ jelentése Gly.
30. 30. Az 1. igénypont szerinti változat, ahol az aminosavszekvencia:

    X¹ Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp X² Gly X³ Cys X⁴ X⁵ X6 X⁷ X8 X9 Tyr Phe Tyr Asn X'6 Gin X'⁷ Lys Gin Cys Glu Arg Phe X¹⁰ Tyr Gly Gly Cys X X·² X·³ Met Asn Asn Phe X¹⁴ Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp X¹⁵ (SEQ ID No. 2), ahol X'-X¹⁵ jelentése azonos az 1. igénypontban tett meghatározásokkal, X¹⁶ jelentése Gin, Gly, Alá, Ser, Val vagy Phe, különösen Gin vagy Alá, és X¹⁷ jelentése Thr vagy Alá.
31. 31. Az 1. igénypont szerinti változat, ahol az aminosavszekvencia:

    Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Lys Alá Arg Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly (SEQ ID No. 3).
32. 32. Az 1. igénypont szerinti változat, ahol az aminosavszekvencia:

    Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Lys Alá Arg Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys

    Arg Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly (SEQ ID No. 4).
33. 33. Az 1. igénypont szerinti változat, ahol az aminosavszekvencia:

    Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Lys Alá Arg Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Asn Met Asn Asn Phe Lys Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly (SEQ ID No. 5.).
34. 34. Az 1. igénypont szerinti változat, ahol az aminosavszekvencia:

    Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Pro Cys Lys Alá Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Alá Lys Met Asn Asn Phe Lys Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly (SEQ ID No. 6.).
35. 35. DNS-szerkezet, azzal jellemezve, hogy az 1-34. igénypont bármelyike szerinti humán, Kunitz-típusú proteázinhibitor-változatot kódoló DNS-szekvenciát tartalmazza.
36. 36. Rekombináns expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy a 35. igénypont szerinti DNS-szerkezetet tartalmazza.
37. 37. Sejt, azzal jellemezve, hogy a 35. igénypont szerinti DNS-szerkezetet vagy a 36. igénypont szerinti expressziós vektort tartalmazza.
38. 38. Eljárás az 1 -34. igénypontok bármelyike szerinti humán, Kunitz-típusú proteázinhibitor-változat előállítására, azzal jellemezve, hogy a 37. igénypont szerinti sejteket olyan körülmények között tenyésztjük, hogy a fehérje kifejeződjön és a nyert proteint kinyerjük a tenyészetből.
39. 39. Gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy az 1-34. igénypontok bármelyike szerinti humán, Kunitztípusú proteázinhibitor-változatot tartalmazza gyógyászati szempontból alkalmazható vivőanyag vagy közegül szolgáló anyag kíséretében.
40. 40. A 39. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy heparint is tartalmaz.
41. 41. TFPI humán, Kunitz-típusú proteázinhibitor dómén ΙΙ-jének vagy az 1 -34. igénypontok bármelyike szerinti változatának felhasználása a patológiás proteolízissel kapcsolatos betegségek vagy állapotok megelőzésére vagy gyógyítására szolgáló gyógyszer elkészítéséhez.