JPH07506335A

JPH07506335A - ヒトＫｕｎｉｔｚ型プロテアーゼ阻害剤変異体

Info

Publication number: JPH07506335A
Application number: JP5511992A
Authority: JP
Inventors: ノリス，ファニィ; ノリス，クヨルト; ビョルン，セーレン　エリク; ペテルセン，ラルス　クリスティアン; オルセン，オレ　フビルステズ
Original assignee: ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ
Priority date: 1992-01-07
Filing date: 1993-01-07
Publication date: 1995-07-13
Anticipated expiration: 2017-11-25
Also published as: HUT70295A; ATE154938T1; EP0621871B1; CA2127249A1; AU3345993A; US5576294A; CZ284911B6; DE69311893D1; IL104325A0; EP0621871A1; FI943233A; NZ246569A; HU218104B; ES2104121T3; DE69311893T2; NO942550L; IL104325A; FI943233A0; CZ164994A3; ZA9395B

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明は、ヒトＫｕｎｉｔｚ型プロテアーゼ阻害剤ドメインの変異体、その変異体をエンコードしているＤＮＡ　、その変異体及びその変異体を含む医薬組成物の製造方法に関する。

発明の背景多形核白血球（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ　１ｅｕｃｏｃｙｔｅｓ（好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉＩｓ）又はＰＭＮＳ））及び単核食細胞（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ（単球（ｗｏｎｏｃｙｔｅｓ）））は、組織損傷、感染、急性及び慢性炎症及び外傷治癒において重要な役割を演じている。これらの細胞は、血液から炎症部位に移動し、そして適当な刺激の後、それらは、酸化化合物（Ｏｓ　・、０．−１Ｈ，０，及びＨＯＣＩ）並びに様々な蛋白分解酵素を含む顆粒を放出する。この分泌顆粒は、アルカリ性ホスファターゼ、メタロプロテイナーゼ、例えば、ゼラチナーゼ及びコラ−ゲナーゼ及びセリン・プロテアーゼ、例えば、好中球エラスターゼ、カテプシンＧ及びプロテイナーゼ３を含む。

潜伏性のメタロブロティナーゼが、組織のメタロブロティナーゼ阻害剤（ｔｉｓｓｕｅ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＴＩＭＰ））と−緒に放出される。この活性化機構は、完全に明らかにされていないが、チオール基の酸化及び／又はタンパク質分解がその過程に参加しているようである。また、遊離のメタロブティナーゼ活性は、ＴＩＭＰの不活性化に依存する。

白血球のアズール性の（ａｚｕｒｏｐｈｉｌ）顆粒においては、セリン・プロテアーゼ好中球エラスターゼ、カテプシンＧ及びプロテイナーゼー３が、ゲルコサミノグリカンと複合体を形成する活性酵素として包まれている。これらの複合体は、不活性であるが、その活性酵素を放出するための分泌の間に解離する。このプロテアーゼ活性を中和するために、多量の阻害剤、α、−プロテイナーゼ阻害剤（α、　−Ｐｌ）及びα、−キモトリプシン阻害剤（α＋−Ｃｈｉ）が、血漿中にある。

しかしながら、好中球エラスターゼの最も重要な阻害剤であるＣ１−ＰＩは、引き金を引かれたＰＭＮｓにより作られた酸素代謝により活性中心（Ｍｅｔ−３５８）において酸化を受けやすい。これは、約２０００倍径、好中球エラスターゼについてのＣ１−ＰＩのアフィニティーを減少させる。

α＋−ＰＩの局所的中和の後、エラスターゼは、他のタンパク質分解酵素の多数の阻害剤を分解することができる。エラスターゼは、α、−Ｃｈｌを解裂し、そしてそれにより、カテプシンＧ活性を促進させる。また、それは、ＴＩＭＰをも解裂させ、メタロプロテイナーゼによる組織分解をもたらす。その上、エラスターゼは、アンチトロンビンＩＩ＋及びヘパリン補因子ＩＩ、並びに組織因子経路阻害剤（ＴＦＰ　ｌ　）であって血塊形成をおそらく促進するものを、解裂させる。他方においては、好中球エラスターゼの血液凝固因子分解能力は、エラスターゼの全体的な効果が明確にならないように逆の効果をもていると推定される。

フィブリン溶解現象（ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ）に対する好中球エラスターゼの効果は、曖昧ではない。フィブリン溶解活性は、エラスターゼかプラスミノーゲン活性物質阻害剤及びα、プラスミン阻害剤を解裂させる。なお、これらの阻害剤の両方が０３代謝物質により酸化及び不活性化される。

ＰＭＮｓは、多量のセリン・プロテアーゼを含み、そして白血球プロテアーゼのそれぞれ約２００ｍｇが体内の侵入性剤を処理するために毎日放出されている。

急性炎症は、放出された酵素の量の多数倍の増加を導く。正常の条件下、タンパク質分解は、多量の阻害剤α＋　−ＰＩ、α、−Ｃｈｉ及びα、マクログロブリンにより許容される低レベルにおいて保たれる。しかしながら、多（の慢性疾患がＰＭＮｓの過剰刺激を原因とする病的なタンパク質分解により引き起こされる、例えば、自己免疫応答、慢性感染、タバコの煙又は他の刺激物等により引き起こされるといういくつかの兆候がある。

アプロチニン（ウシ膵臓トリプシン阻害剤）は、トリプシン、キモトリプシン、プラスミン及びカリクレインを含む各種のセリン・プロテアーゼを阻害することが知られており、そおして急性膵臓塩、塞（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　１ｎｆａｒｃｔｉｏｎ）の治療において治療的に使用される（例えば、Ｊ、Ｅ、　Ｔｒａｐｎｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、　Ｂｒ１ｔ、　Ｊ、　Ｓｕｒ　、　６１．１９７４．　ｐ、　１７７；　Ｊ　ＭｃＭｉｃｈａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃ１ｒｃｕｌａｔｏｒｙ　５ｈｏｃｋ　９．１９８２．　ｐ、　１０７；　Ｌ。

Ｍ、　Ａｕｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｃｔａ　Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒ、　４９．１９７９．　ｐ、　２０７；　Ｇ、　５ｈｅｒ、　Ａｍ、　Ｊ、　０ｂｓｔｅｔ、　Ｇｙｎｅｃｏｌ、　１２９．１９７７、　ｐ、１６４；及びＢ、　５ｃｈｎｅｉｄｅｒ、　Ａｒｔｚｎｅｉｍ、−Ｆｏｒｓｃｈ、　２６．１９７６、　ｐ、　１６０６を参照のこと。）。高い投与量におけるアプロチニンの投与は、心肺バイパス手術を含む心臓外科手術に関する血液損失を有意に減少させる（例えば、Ｂ、Ｐ、　Ｂｉｄｓｔｒｕｐ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｔｈｏｒａｃ、　Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ、　Ｓｕｒｇ、　９７．１９８９．　ｐｐ、　３６４−３７２；　Ｗ、　Ｖａｎ　０ｅｖｅｒｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎｎ、　Ｔｈｏｒａｃ、　Ｓｕｒｇ、　４４．１９８７．　ｐｐ。

６４０−６４５を参照のこと。）。先に証明されているが（Ｈ，Ｒ，Ｗｅｎｚｅｌ　ａｎｄ　Ｈ，Ｔｓｃｈｅｓｃｈｅ、　Ａｎｇｅｗ、　Ｃｈｅｍ、Ｉｎｔｅｒｎａｔ、　Ｅｄ、　２０．１９８１．　ｐ、　２９５）、あるアプロチニン同族体、例えば、アプロチニン（１−５８，Ｖａｌ１５）が顆粒球エラスターゼについての比較的高い選択性及びコラ−ゲナーゼに対する阻害効果をもち、アプロチニン（１−５８，Ａｌａ１５）がエラスターゼに対する弱い効果をもち、一方、アプロチニン（３−５８゜Ａｒｇ１５．　Ａ１ａ１７．５ｅｒ４２）が優れた血漿カリクレイン阻害効果をもつ（Ｗｏ　８９／１０３７４参照）。

しかしながら、インビボにおいて投与されたとき、アプロチニンは、ラット、ウサギ及びイヌにおいて、比較的高い投与量のアプロチニンの反復注射の後に、腎臓毒性効果をもつことが見つかった（Ｂａｙｅｒ、　Ｔｒａｓｙｌｏｌ、　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ；　Ｅ、　Ｇｌａｓｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　ｆｎ”Ｖｅｒｈａｎｄｌｕｎｇｅｎ　ｄｅｒ　Ｄｅｕｔｓｃｈｅｎ　Ｇｅ５ｅｌｌｓｃｈａｆｔ　ｆｕｅｒ　Ｉｎｎｅｒｅ　ｍｅｄｉｚｉｎ、７８．　Ｋｏｎｇｒｅｓｓ”、Ｂｅｒｇｍａｎｎ、Ｍｕｅｎｃｈｅｎ、１９７２．　ｐｐ、１６１２−１６１４）。このアプロチニンについて観察された腎臓毒性（すなわち、病的形態での闘れ）は、その管の負電荷表面に結合されることを引き起こすアプロチニンの正味の高い正電荷の結果としての腎臓の基部の管細胞内でのアプロチニンの蓄積に起因するかもしれない。この腎臓毒性は、アプロチニンを、臨床目的に、特に、阻害剤の多量の投与量を投与する必要があるようなもの（例えば、心肺バイパス手術）に、好適でないものにしている。その上、アプロチニンは、ウシのタンパク質であり、これは、それ故、ヒトへのアプロチニンの投与の間の不所望の免疫応答を生じさせることができる１以上のエピトープを含むことができる。

それ故に、本発明の目的は、アプロチニンと同型のヒト・プロテアーゼ阻害剤（すなわち、Ｋｕｎｉｔｚ型阻害剤）であって同様の阻害特性をもち又は所望の阻害特性を示すように修飾されているものを同定することである。

発明の要約本発明は、組織因子経路阻害剤（ｔｉｓｓｕｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｐａｔｈｗａｙ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＴＦＰＩ））のヒトＫｕｎｉｔｚ型プロテアーゼ阻害剤ドメインＩＩの変異体であって、以下のアミノ酸配列：Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｘ”　Ｘ１２Ｘ１３Ｍａｔ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｐｈｅχ”　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ（ここで、ｘｌがＨ又はＣｙｓを除りｌ−５の天然アミノ酸残基であり、Ｘ　２、−ｘｌ４がそれぞれ独立してＣｙｓを除く天然アミノ酸残基を表し、そしてＸＩＳがＯＨ又はＣｙｓを除＜１−５の天然アミノ酸残基である。但し、アミノ酸残基ｘ＋　４１′の中の少な（ともｌが生来配列の対応アミノ酸残基とは異なっている。）を含んで成る変異体に関する。

本文においては、用語“天然アミノ酸残基“は、２０の一般的に生じたアミノ酸、すなわち、Ａｌａ　、Ｖａｔ　、　！ｅｕ　５ｌｌｅ　５Ｐｒｏ　、　Ｐｈｅ　。

Ｔｒｐ　Ｓ　Ｍｅｔ　、Ｇｌｙ　Ｓ　Ｓｅｒ　、Ｔｈｒ　、　Ｃｙｓ　、Ｔｙｒ　、Ａｓｎ　、　Ｇｉｎ　、　Ａｓｐ　。

Ｇｌｕ　、　Ｌｙｓ　、　Ａｒｇ及びＨｉｓの中のいずれか１つを示していると意図されている。

外因性経路阻害剤（ＥＰ［）又はリポ蛋白関連血液凝固阻害剤（ＬＡＣＩ）８８）、そしてこのタンパク質をコードしている遺伝子がクローン化されている、ＥＰ　３１８４５１を参照のこと。このタンパク質の２次構造の分析は、このタンパク質が、アミノ酸２２からアミノ酸７９まで（１）、アミノ酸９３からアミノ酸＋５０まで（１１）及びアミノ酸＋８５からアミノ酸２４２まで（ＩＩＩ）の３つのＫｕｎｉｔｚ壓阻害剤のドメインをもっことを示した。ＴＦＰ　ｆのＫｕｎｉｔｚ型ドメインＩは、ＴＦ／ＦＶＩＩａに結合することが示され、一方、ＴＦＰ　ｌのＫｕｎｉｔｚ型ドメイン］］は、ＦＸａに結合するこ先に示した１以上の位置において１以上のアミノ酸を置換することにより、それが優先的に好中球エラスターゼ、カテプシンＧ及び／又はプロテアーゼ−３を阻害するようにＴＦＰＩ　Ｋｕｎｉｔｚ型ドメインＩＩの阻害特性を変更することができる。その上、血液凝固又はフィブリン溶解現象に関連する酵素（例えば、プラスミン又は血漿カリクレイン）又は補体カスケードを特異的に阻害する変異体を構築することを可能とするとかできる。

ＴＦＰＩ　Ｋｕｎｉｔｚ型ドメインＩＩの１つの利点は、それが、先に示したように強い正味の正電荷をもつアプロチニンに対して正味の負電荷をもつことである。それ故、アプロチニンよりも低い正味の正電荷をもつ本発明の変異体を構築し、これにより、その変異体の大投与量の投与の間の腎臓損傷の危険を減少することが可能である。他の利点は、アプロチニンに対して、それが、ヒトへの投与に対する不所望の免疫学的応答をかなり減少させるようなヒトのタンパク質（断片）であるということである。

発明の詳細な開示ＴＦＰ　ＩのＫｕｎｉｔｚ型ドメインＩＩの好ましい変異体の例は：ｘ１がＬｙｓ−Ｐｒｏであり：又はＸ！がＡｌａ　、　Ａｒｇ　、　Ｔｈｒ　、　Ａｓｐ　、　Ｐｒｏ　、Ｇｌｕ　５Ｌｙｓ　、　Ｇｉｎ　、　Ｓｅｒ　１１ｉｅ及びＶａｌから成る群から選ばれたアミノ酸残基であり、特にＸｌがＴｈｒ又はＰｒｏであり：又はＸｌがＰｒｏ　、Ｔｈｒ　、　Ｌｅｕ　、　Ａｒｇ　、Ｖａｌ及びＩｌｅから成る群から選ばれたアミノ酸残基であり、特にＸ３がＰｒｏ又はＩｌｅであり；又はｘ４がＬｙｓ　、　Ａｒｇ　、Ｖａｌ　、　Ｔｈｒ　、　ｌｉｅ　、　Ｌｅｕ　、　Ｐｈｅ　、　Ｇｌｙ　５Ｓｅｒ、Ｍｅｔ　、　Ｔｒｐ　、　Ｔｙｒ　、　Ｇｉｎ　、　Ａｓｎ及びＡｌａから成る群から選ばれたアミノ酸残基であり、特にＸ４がＬｙｓ　５Ｖａｌ　、　Ｌｅｕ　５ｌｉｅ　、　Ｔｈｒ　、　Ｍｅｔ　、　Ｇｌｎ又はＡｒｇであり；又はＸ５がＡｌａ　、　Ｇｌｙ　、　Ｔｈｒ　、　Ａｒｇ　５Ｐｈｅ　、　Ｇｌｎ及びＡｓｐから成る群から選ばれたアミノ酸残基であり、特にＸ″がＡｌａ　、　Ｔｈｒ　、Ａｓｐ又はＧｌｙであり：又はｘｌがＡｒｇ　、　Ａｌａ　、　Ｌｙｓ　、　Ｌｅｕ　５Ｇｌｙ　、　Ｈｉｓ　５Ｓｅｒ　、　Ａｓｐ　、　Ｇｉｎ　。

Ｇｌｕ　、　Ｖａｌ　、　Ｔｈｒ　、　Ｔｙｒ　、　Ｐｈｅ　、　Ａｓｎ　５Ｉｌｅ及びＭｅｔから成る群から選ばれたアミノ酸残基であり、特にＸｌがＡｒｇ　、　Ｐｈｅ　、　Ａｌａ　１ＬｅＵ又はＴｙｒであり；又はｘ７がＩｌｅ　、　Ｍｅｔ　、　Ｇｉｎ　、　Ｇｌｕ　、　Ｔｈｒ　、　Ｌｅｕ　、　Ｖａｌ及びＰｈｅから成る群から選ばれたアミノ酸残基であり、特にｘ７がｌｉｅであり；又はｘ”がｌｉｅ　、　Ｔｈｒ　、　Ｌｅｕ　、　Ａｓｎ　５Ｌｙｓ　、　Ｓｅｒ　、　Ｇｉｎ　５Ｇｌｕ　、　Ａｒｇ　。

Ｐｒｏ及びＰｈｅから成る群から選ばれたアミノ酸残基であり、特にＸ８がＩｌｅ又はＴｈｒであり、又はｘ”がＡｒｇ　、　Ｓｅｒ　、　Ａｌａ　５Ｇｌｎ　５Ｌｙｓ及びＬｅｕから成る群から選ばれたアミノ酸残基であり、特にｘ９がＡｒｇであり；又はＸ１０がＧｉｎ　、　Ｐｒｏ　、Ｐｈｅ　５ｌｉｅ　、　Ｌｙｓ　１Ｔｒｐ　、　Ａｌａ　、　Ｔｈｒ　５Ｌｅｕ　。

Ｓｅｒ　、　Ｔｙｒ　、Ｈｉｓ　、　Ａｓｐ　、　Ｍｅｔ　、　Ａｒｇ及びＶａｌから成る群から選ばれたアミノ酸残基であり、特にＸＩＯがＶａｌ又はＬｙｓであり：又はＸ　ＩＩがＧｌｙ　、　Ｍｅｔ　、　Ｇｉｎ　、　Ｇｌｕ　５Ｌｅｕ　、　Ａｒｇ　、　Ｌｙｓ　、　Ｐｒｏ及びＡｓｎから成る群から選ばれたアミノ酸残基であり、特にＸｌｌがＡｒｇ又はＬｅｕであり：又はＸ　ｌｘがＡｌａ又はｃｒｙであり；又はＸ１３がＬｙｓ　、　Ａｓｎ及びＡｓｐから成る群から選ばれたアミノ酸残基であり、特にＸｌ２がＬｙｓ又はＡｓｎであり；又はＸ　１４がＶａｌ　、　Ｔｙｒ　、　Ａｓｐ　、　Ｇｌｕ　、　Ｔｈｒ　５Ｇｌｙ　、　Ｌｅｕ　、　Ｓｅｒ　Ｓ［ｌｅ　。

Ｇｉｎ　５Ｈｉｓ　、　Ａｓｎ　、　Ｐｒｏ　、　Ｐｈｅ　ＳＭｅｔ　、　Ａｌａ　ＳＡｒｇ　、　Ｔｒｐ及びＬｙｓから成る群から選ばれたアミノ酸残基であり、特にＸ１４がＬｙｓ又はＧｌｕであり：又はＸＩＩがＧｌｙである変異体である。好ましい態様においては、ＸｌがＬｙｓ− Ｐｒｏであり、そしてＸ１６がＧＩＹであり、一方Ｘ１１−ＸＩ４が先に定めたものである。

本発明のＴＦＰＩ　ｋｕｎｉｔｚ型ドメインＩＩの変異体は、好ましくは、プロテアーゼ結合領域内にＭｅｔ残基（すなわち、ｘ　’　−ｘ”により提示されるアミノ酸残基）を含んではならない。先に記載したαＩ−ＰＩへの類似性により、これらの位置の中のいずれかｌ内のＭｅｔ残基は、ＰＭＮｓにより作られた酸素代謝物による酸化的不活性化に感受性のある阻害剤を作るであろうし、そして反対に、これらの位置内のλｌｅｔ残基の欠如は、このような酸素代謝物の存在中でその阻害剤をより安定にするはずである。

ＴＦＰＩ　Ｋｕｎｉｔｚ型ドメインＩＩ変異体が宿主細胞により作られたとき糖添加（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）されるところの方法を変更することが要求されることができる。したがって、ある態様においては、本発明の変異体は、以下のアミノ酸配列をもっことができる。

Ｘ’　Ａｓｐ　Ｐｈｅ、Ｃｙｓ　ＰｈｅＬｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐχ２Ｇｌｙ　Ｘ’　Ｃｙｓ　ｘ４　ｘＳ　ｘＡ　ｘ７　Ｘ’χ９Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｘ１６Ｇｌｎ　Ｘ”　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｐｈｅχ”　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　ＧｌｙＣｙｓ　Ｘ”　Ｘ１２Ｘ”　Ｍａｔ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｘ”　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ工１ｅＣｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｘ１５（配列番号２）（ここで、Ｘｌ−Ｘ１６が請求項１中に示すものと同じてあり、ＸｌがＧｌｎ　、　Ｇｌｙ　、　Ａｌａ　、　Ｓｅｒ　５Ｖａｌ及びＰｈｅから成る群から選ばれたアミノ酸残基であり、特にＧｌｎ又はＡｌａであり、そしてＸｌ７がＴｈｒ又はＡｌａから成る群から選ばれたアミノ酸残基である。）。

本発明の目下好ましい変異体は、Ｋｕ旧【Ｚドメインのプロテアーゼ結合部位に位置する１以上のアミノ酸残基（すなわち、アプロチニンノ１３．１５．１６．１７．１８．１９．２０．３４．３９．４０．４１及び４６位に対応するＸ　２ −Ｘ＋４の中の１以上）が生来のアプロチニンの同−位置に存在するアミノ酸に置換されているようなものである。このような変異体の例は：Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｐｈａ　Ｌｅｕ　にｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　工１ｅ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　入１ａＡｒｑ　工１ｅ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　ＡｒｇＰｈｅ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｍａｔ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　ＬｅｕＬｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　ＰｈｅＣｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　ＧｌｙＬｙｓ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　ＡｌａＡｒｇ工１ｅ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　ＰｈｅＴｙｒ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　ＡｒｇＬｙｓ　Ｐｒｏ　ＡＳｐＰｈｅ　ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　にｌｕ　Ｇｌｕ　ＡＬＰ　Ｐｒｏ　ＧｌｙＬｙｓ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌａａｒｇ　工１ｅ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　ＡｒｇＰｈｅＬｙｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｍａｔ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｐｈａ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　ＬａｕＧｌｕ　Ｃ’ｌｕ　Ｃ：ｙｓ　ＬＹＳ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　ＣｙＳ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　（配列番号５＞　、　又１ｅｔＬｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｐｈｉ　Ｃｙｓ　ＰｈｅＬｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　ＡｌａＡｒｇ　工１ｅ　工１ｅ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｐｈｉ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　（ｙｌｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｒ■ ＰｈｅＶａｌ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　ＰｈｅＩｖｙｓ　Ｔｈｒ　Ｉ、ａｕである。

他の態様においては、本発明は、本発明に係るヒトＫｕｎｉｔｚ型阻害剤ドメイン変異体をコードしているＤＮＡ構築物に関する。本発明のＤＮＡ構築物は、確立された標準的な方法により、例えば、Ｓ、Ｌ、　Ｂｅａｕｃａｇｅ　ａｎｄ　Ｍ、Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２．１９８１．　ｐｐ。

１８５９−１８６９により記載されているようなホスホアミジット法、又はＭａｔｔｈｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　３．１９８４．　ｐｐ、　８０１−８０５により記載されているような方法により、合成的に、製造されることができる。

上記ホスホアミジット法に従って、オリゴヌクレオチドを、例えば、自動ＤＮＡ合成装置内で合成し、精製し、アニールし、連結し、そして好適なベクター内でクローン化される。

あるいは、ＴＦＰＩ　Ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン１１をコードしているゲノム又はｃＤＮＡ（例えば、合成オリゴヌクレオチド・プローブを使用してＴＦＰＩをコーディングしているＤＮＡについてゲノム又はｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、そしてそれらからドメイン１１をコーディングしているＤＮＡ配列を単離することにより得られる）を使用することが可能である。このＤＮＡ配列は、アミノ酸置換を、例えば、よく知られた手順に従って相同的組換えのための望ましいアミノ酸配列をエンコードしている合成オリゴヌクレオチドを使用した部位指定突然変異誘発により導入することが望ましいところの部位に対応する１以上の部位において、修飾される。

さらなる態様においては、本発明は、本発明のＤＮＡ構築物を含んで成る組換え発現ベクターに関する。この組換え発現ベクターは、便利には組換えＤＮＡ手順に供されることができるベクターのいずれかあることができ、そしてベクターの選択は、しばしば、それが導入されるべき宿主細胞に依存することかできるであろう。したがって、本ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外存在物として存在するベクターであり、その複製は染色体の複製と独立しているもの、例えば、プラスミドである。あるいは、このベクターは、宿主細胞中に導入されたとき、その宿主のゲノム中に組み込まれ、そしてそれが組み込まれている染色体と一緒に複製されるものであることができる。

ベクター内においては、本発明のＴＦＰＩ　Ｋｕｎｉｔｚ型ドメインＩＩ変異体をエンコードしているＤＮＡ配列は、好適なプロモーター配列に作用可能な状態で結合されなければならない。このプロモーターは、選択された宿主細胞内で転写活性を示すＤＮＡ配列のいずれがであることができ、そしてその宿主細胞に同種の又は異種のいずれかである蛋白をエンコードしている遺伝子から得られることができる。哺乳類細胞における本発明のＴＦＰＩ　Ｋｕｎｉｔｚ型ドメインｉｆ変異体をエンコードしているＤＮＡの転写に向けられるための好適なプロモーターの例は、ＳＶ　４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ。

１、１９８１．　ｐｐ、　８５４−８６４）、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２２．１９８３．　ｐｐ、　８０９−８１４）又はアデノウィルス２主要後期プロモーターである。酵母宿主細胞における使用のための好適なプロモーターは、酵母の解糖遺伝子（Ｈｉ　ｔｚｅｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２２５．１９８０．　ｐｐ、　１２０７３−１２０８０；　Ａｌｂｅｒａｎｄ　Ｋａｗａｓａｋｉ、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎ、　１．１９８２．　ｐｐ、　４１９−４３４）又はアルコール・デヒドロゲナーゼ遺伝子（Ｙｏｕｎｇ　ｅｔ　ａｔ、、　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｊｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ｆｏｒ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　（Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ。

ｅｄｓ、）、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８２）からのプロモーター、又は理旦（ＵＳ　４．５９９．３１１）又はＡＤＨ２−４ｃ　（Ｒｕｓｓｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３０４、１９８３．１１１）、　６５２−６５４）ブローターを含む。糸状菌宿主細胞における使用のために好適なプロモーターは、例えば、ＡＤＨ３プロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪ、　４．１９８５．　ｐｐ、　２０９３−２０９９）又は叩また、本発明のＴＦＰＩ　Ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン１■変異体をエンコードしているＤＮＡ配列は、好適なターミネータ−１例えば、ヒト成長ホルモンのターミネータ−（ｐａｌｍｉｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　ｏｐ、　ｃｉｔ、）又は（真菌宿主のための）ＴＰＩＩ（Ａｌｂｅｒ　ａｎｄ　Ｋａｗａｓａｋｉ、　ｏｐ、　ｃｉｔ、）又はＡＤＨ３（ＭｃＫｎ　ｉｇｈｔ　ｅｔ　ａｌ、、　ｏｐ、　ｃｉｔ、）プロモーターに作用可能な状態で連結されることができる。このベクターは、さらに、ポリアデニル化シグナルのような要素（例えば、ＳＶ　４０又はアデノウィルス５　Ｅｌｂ領域からのもの）、転写エンハンサ−配列（例えば、ＳＶ　４０エンハンサ−）及び翻訳エンハンサ−配列（例えば、アデノウィルスＶＡ　ＲＮＡ５をエンコードしているもの）を、含んで成ることができる。

本発明の組換え体発現ベクターは、さらに、そのベクターが問題の宿主細胞内で複製できるようにするＤＮＡ配列を含んで成ることができる。このような配列の例（その宿主細胞が哺乳類細胞であるとき）は、ＳＶ　４０の複製起点、又は（その宿主細胞が酵母細胞であるとき）酵母プラスミド２μ複製遺伝子ＲＥＰＩ− ３及び複製起点である。

また、このベクターは、選択マーカー、例えば、その生成物が宿主細胞内で欠損を補うような遺伝子、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＰＲ）をコーディングしている遺伝子又は薬剤、例えば、ネオマイシン、ハイグロマイシン又はメトトレキサートに対する耐性を与える遺伝子、又はシゾサツカロミセス・ボンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）のＴＰＩ遺伝子（Ｐ、　Ｒ，Ｒｕ５ｓｅ１１．　Ｇｅｎｅ　４０．１９８５．　ｐｐ、　＋２５−１３０により記載されているようなもの）を、含んで成ることができる。

本発明のＴＦＰＩ　ｋｕｎｉｔｚ型ドメインＩＩ変異体をコーディングしているＤＮＡ配列、それぞれ、そのプロモーター及びターミネータ−を連結するために、並びに複製のために必要な情報を含む好適なベクターにそれらを挿入するために使用される手順は、当業者によく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂ。

本発明の発現ベクターが導入されるところの宿主細胞は、本発明のＴＦＰＩ　Ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン１１変異体を作ることができる細胞のいずれかであることができ、そして好ましくは、真核細胞、例えば、哺乳類の、酵母の又は真菌の細胞である。

本発明に従って宿主として使用される酵母生物は、培養の間、多量の本発明のＴＦＰＩ　Ｋｕｎｉｔｚ型ドメインＩＩ変異体を作る酵母生物のいずれかであることができる。好適な酵母生物の例は、酵母種サッカえば、プロトプラスト形成その後のそれ１耐公知のやり方での形質転換により、行われることができる。

好適な哺乳類細胞系の例は、Ｃ０５（ＡＴＣＣＣＲＬ　１６５０）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣＣＲＬ１６３２、　ＡＴＣＣＣＣＬ　１０）又はＣＨＯ（ＡＴＣＣＣＣＬ　６１）細胞系である。哺乳類細胞のトランスフェクト方法及びその細胞内に導入されたＤＮＡ配列る。

あるいは、真菌細胞が、本発明の宿主細胞として使用されるとかできる。好適な真菌細胞の例は、糸状菌、例えば、アスペルギルス０２３中に記載されている。

本発明は、さらに、本発明に係るＴＦＰＩ　Ｋｕｎｉｔｚ型ドメインＩ＋変異体の製造方法、すなわち、その変異体の発現を誘導する条件下で先に記載したような細胞を培養し、そして得られた変異体をその培養物から回収することを含んで成る方法を含んで成る。

細胞を培養するために使用される培地は、その宿主細胞の選択に依存して、哺乳類の細胞又は真菌（酵母を含む）細胞を培養するために好適な慣用培地のいずれかであることができる。その変異体は、宿主細胞によりその培養培地に分泌されるであろうし、そして遠心分離又は濾過によるその培地からの細胞分離、塩例えば硫酸アンモニウムによる上澄液又は濾液のタンパク質成分の沈殿、様々なりコツトグラフィー手順、例えば、イオン交換クロマトグラフィー又はアフィニティー・クロマトグラフィー等による精製を含む慣用の手順により、それから回収されることができる。

また、本発明は、医薬として許容される担体又は賦形剤と一緒に本発明のＴＦＰＩ　Ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン１１変異体を含んで成る医薬組成物に関する。本発明の組成物中では、本変異体は、医薬組成物の確立ることができる。本組成物は、典型的には、全身的注射又は注入に好適な形態に在ることができ、そして滅菌水又は等張性生理食塩水又はグルコース溶液により、そのように、配合されることができる。

本発明のＴＦＰＩ　Ｋｕｎｉｔｚ型ドメインＩ＋変異体は、それ故、生来のアプロチニン又は他の阻害特性をもったアプロチニン同族体、特により大きなアプロチニン投与量の使用を必要とするもののために提案された治療的用途のための使用に有利であるべく、もくろまれている。ヒト・セリン・プロテアーゼ、例えば、トリプシン、プラスミン、カリクレイン、エラスターゼ、カテプシンＧ及びプロテイナーゼー３を阻害するその能力の結果として本発明の変異体の使用が示されているところの治療的用途は、急性膵臓炎、炎症、血小板減少症（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ）、血小板機能の保存、臓器の保存、外傷の治癒、高フィブリン溶解性出血を含むショック（ショック肺を含む）及び症状、気腫（ｅｍｐｈｙｓｅｍａ）　、’）ウマチ様関節炎、成人呼吸不全症候群、慢性炎症性内蔵疾患及び乾ｍ　（ｐｓｏｒｉａｓ　ｉｓ）を、言い換えれば、引き金を引かれたＰＭＮｓから放出されたエラスターゼ、カテプシンＧ及びプロテイナーゼー３による病的なタンパク質分解により引き起こされると推定される病気を含む（がこれに限定されない）。

その上、本発明は、過剰刺激されたＰＭＮｓから放出されたプロテアーゼによる病的なタンパク質分解と関連した疾患又は症状の防止又は治療のための医薬の製造のために、先に記載したようなＴＦＰＩ　Ｋｕｎｉｔｚ型阻害剤ドメインＩ＋又はその変異体を使用することに関する。

先に示したように、ＴＦＰＩ　Ｋｕｎｉｔｚ型阻害剤ドメイン１１又は変異体と同時にヘパリンを投与することが有利であることができる。

先に示した医薬用途とは別に、先に特定したＴＦＰＩ　Ｋｕｎｉｔｚ型ドメインＩＩ又はその変異体は、存用な天然物質、例えば、ヒト材料からのプロテアーゼ又はレセプタであって例えばスクリーニング検定又はアフィニティー・クロマトグラフィーによりＴＦＰＩ　Ｋｕｒ＋ｔｔｚ型ドメインＩＩに直接又は間接的に結合するものを、単離するために使用されることかできる。

実施例一般的方法標準的なりＮＡ技術を記載されているように行った（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、。

Ｐｒｉ　ｔｓｃｈ、　ε、Ｆ、、　ａｎｄ　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、（１９８９）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ）。合成オリゴヌクレオチドを、制御された細孔ガラス支持体上のホスホアミデッド化学を使用して自動ＤＮＡ合成ｎｄ　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｍ、Ｈ，、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２．　（１９８１）　１８５９−１８６９）　。ＤＮＡ配列決定を、ジデオキシ鎖停止技術（ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、、　Ｍｉｃｋｌｅｎ、Ｓ、、ａｎｄ　Ｃｏｕｌｓｏｎ、Ａ、Ｒ，、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７４　（１９７７）　５４６３−５４６７）ニヨリ行ツタ。

ボ’）ｙｌラ−ｔ’連［Ｅ応（ＰＣＲ）　ヲ、ＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）上で行った。

アミノ酸分析を、６Ｍ　ＨＣｌ中の１１０″Ｃにおける加水分解後、２４時間真空シール・チューブ内で行った。分析を、マイクロポア操作（ｍｉｃｒｏｂｏｒｅ　ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）について変更されたＢｅｃｋｍａｎ　１２１ＭＢ自動アミノ酸分析装置上で行った。

Ｎ−末端アミノ酸配列分析を、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４７０Ａ気相シーケンサ−を使用して自動エドマン分解により得た。オンライン逆相ＨＰＬＣによる分析を、それぞれのシーケンサ−・サイクルからの解放されたＰＴ）Ｉアミノ酸の検出及び定量化のために行った。

分子量測定値を、約１５ｃｍのフライト・チューブを備え、そしてポジティブ・モードにおいて操作されたＢＩＯ−１ＯＮ　２０プラズマ脱着質量分析計（ＰＤＭＳ）上で得た。５μｌのアリコツトを、１５ｋＶまでの加速電圧設定において分析し、そしてイオンを５ミリオンの分裂事象の間に回収した。指定した分子イオンに対する確かさは、よい形のピークについては、他の状態ではいくぶんより少ないが、約０．１％であった。

実施例１酵母株ＫＥＮ−１５９３からの、組織因子経路阻害剤、ＴＦＰＩ−２の第二Ｋｕｎｉｔｚドメインの調製完全長ＴＦＰ　ＩをエンコードしているｃＤＮＡを、ヒト肝臓由来の細胞系ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣＨＢ　８０６５）から単離し、そして０．９ｋｂ　ＢａｍＨＩ −Ｘｂａｌ断片として哺乳類の発現ベクター、ｐＫＦＮ−１１６８中に、先に記載したように挿入した（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ、　Ａ、Ｈ，、Ｎｏｒｄｆａｎｇ、　０．、　Ｎｏｒｒｉｓ、　Ｆ、、　Ｗｉｂｅｒｇ、　Ｆ。

Ｃ，、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ、　Ｐ、Ｍ、、　Ｍｏｅｌｌｅｒ、　Ｋ、Ｂ、、　Ｍｅｉｄａｈｌ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎ、　Ｊ、。

Ｂｅｃｋ、　Ｔ、Ｃ，、Ｎｏｒｒｉｓ、　Ｋ、、　Ｈｅｄｎｅｒ、　Ｕ、、　ａｎｄ　Ｋ１５ｉｅ１．　Ｗ、　１９９０．　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６５．１６７８６−１６７９３）　、この挿入物のＤＮＡ配列を、配列番号７中に与える。ＴＦＰＩ−２は、示されるように、ヌクレオチド３６５−５３８によりエンコードされている。

ＴＦＰＩ−２：　ｐＫＦＮ−１１６８からの０．９ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｘｂａ　Ｉ断片のＯ，ｌ　μｇを、ブライ７−　Ｎ０Ｒ−２５２６（ＧＣＴＧＡＧＡＧＡＴＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＣＣＡＧＡＴＴＴＣＴＧＣＴＴ）及びＮ０Ｒ− ２５２８（ＣＴＧＧＡＡＴＣＴＡＧＡＴＴＡＡＣＣＡＴＣＴＴＣＡＣＡＡＡＴＧＴＴ）　（７）それぞれ１００９モルを含むＰＣＲ反応液中のテンプレートとして使用した。Ｎ０Ｒ−２５２６の１７の３′末端塩基は、配列番号７内のＴＦＰ　［−２遺伝子内の塩基３６５〜３８１　と同一であり、そしてその２１の５′ 末端塩基は、以下に記載するｐＫＦＮ−１０００由来の合成リーダー遺伝子内の塩基２１５〜２３５（図２を参照のこと。）と同一である。プライマーＮ０Ｒ− ２５２８は、配列番号７内の塩基５２１〜５４０に相補的であり、そして翻訳終止コドンその後のＸｂａ　１部位を含む５゛伸長をもつ。

ＰＣＲ反応を、商業的キット（ＧｅｎｅＡｍｐ、　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）及び以下のサイクル、９４°Ｃにおいて２０秒間、５０”Ｃにおいて２０秒間、及び７２℃において３０秒間、を使用して１００μｌの容量において行った。

１９サイクルの後、最終サイクルを行った。ここで、７２℃の停止を１０分間維持した。ＰＣＲ生成物、すなわち、２１０塩基対の断片を、２％アガロース・ゲル上の電気泳動により単離した。

シグナル−リーダー；以下に記載するｐＫＥＮ−１０００からの０．７ｋｂ　Ｐｖｕｌｌ断片０）０．Ｉｕｇを、ブライ７−Ｎ０Ｒ−１４７８（ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ）及びＮ０Ｒ−２５２３（ＴＣＴＣＴＴＣＴＣＣＡＡＴＣＴＣＴＣＡＧＣ）　（７）それぞれ１ｏｏｐモルを含むＰＣＲ反応液中のテンプレートとして使用した。Ｎ０Ｒ−１４７８は、配列番号９内のＥｃｏＲ１部位の直上流の配列にマツチングする。プライマーＮ０Ｒ−２５２３は、Ｉ）ＫＦＮ− １０００の合成リーダー遺伝子の１７の３′末端の塩基に相補的である。配列番号９を参照のこと。ＰＣＲ反応を、先に記載するように行い、２５７塩基対の断片をもたらした。

プラスミドＩＩＫＦＮ−１０００は、合成酵母シグナル−リーダー・ペプチドをエンコードしているＤＮＡを含むプラスミドｐＴＺ１９Ｒの誘導体（Ｍｅａｄ、　Ｄ、Ａ、、　５ｚｃｚｅｓｎａ−３ｋｏｒｕｐａ、　Ｅ、　ａｎｄ　Ｋｅｍｐｅｒ、　Ｂ、、　Ｐｒｏｔ、　Ｅｎｇｉｎ、　１（１９８６）　６７−７４）テある。プラスミド１）ＫＥＮ−１０００は、ＷＯ９０／１００７５中に記載されている。ｐＫＦＮ−１０００のＥｃｏＲ１部位から２３５塩基下流のＤＮＡ配列及び合成酵母シグナル−リーダーのエンコードされたアミノ酸配列を、配列番号９内に与えた。

シグナル−リーダー−ＴＦＰＩ−２：先に記載したような２つのＰＣＲ断片のそれぞれ０．１Ｍｇを、混合した、ＰＣＲ反応を、プライマーＮ０Ｒ−１４７８及びＮ０Ｒ−２５２８のそれぞれ１００ｐモルを、そして以下のサイクル：９４° Ｃにおいて１分間、５０℃において２分間、及び７２°Ｃにおいて３分間を使用して行った。１６サイクル後、最終サイクルを行った。ここで、７２°Ｃの段階を、１０分間維持した。

得られた４２２塩基対断片を、１％アガロース・ゲル上の電気泳動により精製し、そして次に、ＥｃｏＲｌ及びＸｂａ　Ｉにより消化した。得られた４１２塩基対断片を、ｐＭＴ６３６からの９．５ｋｂ　Ｎｃｏｌ−Ｘｂａｌ断片及びｐＭＴ６３６からの１．４ｋｂ　Ｎｃｏｌ−ＥｃｏＲ１断片に連結した。プラスミドｐＭＴ６３６は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ８８１００１３８中に記載されている。

ｐＭＴ６３６は、シゾサツカロミセス・ボンベＴＰＩ遺伝子（ＰＯＴ）を含む大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）−サツカロミセス・セレビシェのシャトル・ベクター（Ｒｕｓｓｅｌｌ、　Ｐ、Ｒ，、Ｇｅｎｅ　４０　（１９８５）　１２５−１３０）　、サツカロミセス・セレビシェのトリオースホスフェート・イソメラーゼのプロモーター及びターミネータ−１ＴＰＩ、及びＴＰＩ　ｔ　（Ａｌｂｅｒ、　Ｔ、、　ａｎｄ　Ｋａｗａｓａｋｉ、　Ｇ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎ、Ｉ　（１９８２）、　４１９−４３４）である。

この連結混合物を、コンピテント大腸菌株Ｃｒ−、ｍ　”　）を形質転換するために使用し、アンピシリン耐性について選択した。ＤＮＡ配列決定は、得られたコロニーからのプラスミドが合成酵母シグナル−リーダー遺伝子に正確に融合されたＴＦＰ　［−２のための正しいＤＮＡ配列を含んでいたことを示した。

１つのプラスミドｐＫＦＮ−１６０５を、さらなる使用のために選択した。

プラスミドｐＫＦＮ−１６０５の構築を、図１中に説明する。

プラスミドｐＫＦＮ−１６０５の発現カセットは、以下の配列：ＴＰＩ　、−ＫＦＮ１００Ｏシグナル−リーダー−ＴＦＰＩ２−ＴＰＩＴを含む。

ｐＫＦＮ−１６０５からの４１２塩基対のＥｃｏＲＩ−Ｘｂａｌ断片のＤＮＡ配列を、配列表１１中に示す。

酵母の形質転換：サツカロミセス・セレビシェ株ＭＴ６６３（Ｅ２−７Ｂ　ＸＥＩＩ−３６ａ／　ａ、　Δｔｐｉ／Δｔｐｉ、　ｐｅｐ　４−３／ｐｅｐ　４− ３）を、ＹＰＧａＬ（１％Ｂａｃｔ。

酵母エキス、２％ＢａＣ１０ペプトン、２％ガラクトース、１％ラクトース）上で６００ｎｍにおける０、６の吸光度まで増殖させた。

１００ｍ１の培養物を、遠心分離により収穫し、ｌｏｍｌの水により洗浄し、再遠心分離し、そして１．２Ｍソルビトール、２５ｍＭ　Ｎａ　！　ＥＤＴＡ　ｐｌ＝８．０及び６．７ｍｇ／ｍｌジチオトレイトールを含む溶液の１０ｍ１中に、再懸濁させた。この懸濁液を、３０°Ｃにおいて１５分間インキュベートし、遠心分離し、そして細胞を、１．２Ｍソルビトール、１０ｍＭ　Ｎａ　！　ＥＤＴＡ。

０．１Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ＝５．８及び２ｍｇ　Ｎｏｖｏｚ）＋ｍ　＠２３４を含む溶液のｌ０ｍ１中に、再懸濁させた。この懸濁液を、３０°Ｃにおいて１０分間インキュベートし、遠心分離し、その細胞を、遠心分離により回収し、１０＋ｎｌの１．２Ｍソルビトール及び１０ｍ１のＣＡＳ（１，２Ｍソルビトール。

１０ｍ１’ｃａｃｌ　ｔ　、１０ｍＭ　Ｔｒｉ’ｓ　ＨＣＩ（Ｔｒｉｓ＝Ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタン’）　ｐｌ（＝７．５）中で洗浄し、そして２ｍｌのＣＡＳ中に再懸濁させた。形質転換のために、０．１ｍｌのＣＡＳ− 再懸濁細胞を、約ｌμｇのプラスミドＩ）ＫＦＮ−１６０５と混合し、そして室温において１５分間放置した。

１ｍｌの（２０％ポリエチレン・グリコール４０００．２０ｍＭ　ＣａＣｌ　＊　、　ｌｏｍＭ　ＣａＣ１ｔ＋　ｌ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ、　ｐＨ＝　７．５）を、添加し、そしてその混合物をさらに３０分間室温において放置した。この混合物を遠心分離し、そしてそのベレットを、Ｏ，１ｍｌの５Ｏ３（１，２Ｍ　ソルビトール、　３３ｖ／ｖ％ＹＰＤ、　６．７ｍＭ　ＣａＣＩｔ　、　１４Ｍｇ／ｍｌロイシン）中に再懸濁させ、そして３０°Ｃにおいて２時間インキュベートした。次にこの懸濁液を遠心分離し、そしてそのペレットを０．５ｍｌの１．２Ｍソルビトール中に再懸濁させた。次に、５２℃における６ｍｌの頂上寒天（Ｓｈｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　（Ｍｅｔｈａｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８２））のＳＣ培地であって１．２Ｍソルビトールに加え２．５％寒天を含むもの）を添加し、そして懸濁液を、同一寒天固化のソルビトール含有培地を含むプレート上に注いだ。

形質転換体コロニーを、３０°Ｃにおいて３日間後、拾い上げ、再単離し、そして液体培養を開始するために使用した。１つのこのような形質転換体ＫＦＮ−１５９３をさらなる特徴付けのために選択した。

発酵：酵母株ＫＰＮ−１５９３を、ＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ペプトン（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのもの）、及び３％グルコース）上で増殖させた。この株の１リツター培養物を、２４の６５０ｎｍにおける吸光度まで３０°Ｃにおいて振とうした。遠心分離後、その上澄液を単離した。

精製：　リン酸によりｐＨ３，０に調整した酵母上澄（１０００ｍｌ）を、２５ｍＭのリン酸２水素ナトリウムにより平衡化したＳ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　ｆａｓｔ　Ｆｌ。

Ｗのカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　２．６　Ｋ　３．６　ｃｍ）上に適用した。平衡化バッファーによる洗浄の後、トリプシン阻害活性として検定されたＴＦＰ　１−２を、１Ｍ塩化ナトリウムを含むバッファー（４０＋＋＋１）により溶出させた。

脱塩を、炭酸水素アンモニウム、　ｐＨ＝　７．５により平衡化され且つ溶出された５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　２．６　ｘ　３４ｃｍ）上で得た。

さらなる精製を、２５　ｍＭリン酸２水素ナトリウム、ｔｏｗ／ｖ％アセトニトリル、ｐＨ＝３．５中の０から０．４３Ｍまでの塩化ナトリウムの１ｍｌ／分における２３分間にわたるグラジェント溶出により、Ｍｏｎｏ　Ｓカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　０．５　Ｘ　５　ａｍ）上で行った。Ｎ−グリコジル化ＴＦＰ　［−２及び非グリコジル化ＴＦＰ＋−２は、それぞれ、０．２０Ｍ及び０．２６Ｍにおける塩化ナトリウムにより溶出した。非グリコジル化ＴＦＰ　［−２の最終精製を、０から５０％までのアセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸の１ｍｌ／分において３０分間にわたりグラジェント溶出によりＣＩ８カラム（Ｎｏｖ。

Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／Ｓ、　０．４　ｘ　２５ｃｍ）上の逆相ＨＰＬＣにより行った。

ＴＦＰ　Ｉ−２は、４０％アセトニトリルにおいて溶出した。精製生成物を、凍結乾燥させ、そして約２００ｎＭの濃度まで水中に再溶解させた。この溶液のアリコツト・サンプルを、アミノ酸組成（表１）、アミノ酸配列、分子量（ＰＤＭＳ　、実測：ＭＷ　６８４０．８、計算：　６８４０．６）及びプロテアーゼ阻害活性について分析した。

実施例２プラスミドｐＫＦＮ−１６０５からのＴＦＰ　Ｉ−２をエンコードしている１、　３ｋｂＳｐｈｌ−Ｂａｍ旧断片の０．１　μｇを、２つのＰＣＲ反応においてテンプレートとして使用した。第−ＰＣＲ反応においては、プライマーＮ０Ｒ− ２０２２（ＧＧＡＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＴＴＧＣ）及びＭ−４６０（ＧＴＴＡＴＡＡＡＡＡＴＡＣＣＴＧＡＴＡＡＴＡＣＧＡＧＣＴＴＴＡＣＡＴＡＴＴＣＣＡＧＧＡＴＣ）のそれぞれ１００１）モルを使用した。第二ＰＣＲ反応においては、プライマーＮ０Ｒ−１４９５（ＴＡＡＧＴＧＧＣＴＣＡＧＡＡＴＧＡ）及びＭ −４５９（ＧＡＴＣＣＴＧＧＡＡＴＡ　ＴＧＴＡＡＡＧＣＴＣＧＴＡＴＴＡＴＣＡＧＧＴＡＴＴＴＴＴＡＴＡＡＣ）のそれぞれ１００ｐモルを使用した。

Ｎ０Ｒ−２０２２は、Ｓｐｈ　１部位の９４塩基対下流の位置でプライムする。

Ｍ−４６０は、ＴＦＰＩ２　ＤＮＡ配列の２６３−３０７位（配列番号１１）に、６つのミスマツチを除き、相補的である。Ｎ０Ｒ−１４９５は、ＢａｍＨ１部位から５６１塩基対上流の位置でプライムする。Ｍ−４５９は、ト４６０に相補的である。

ＰＣＲ反応を、商業的キット（ＧｅｎｅＡｍｐ、　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）及び以下のサイクル：９５℃において１分間、５０℃において１分間、及び７２°Ｃにおいて２分間、を使用して１００μｌ容量において行った。

２４サイクル後、最終サイクルを行った。そこでは、その７２°Ｃ段階が１０分間維持された。このＰＣＲ生成物、すなわち、第−ＰＣＲからの４４４塩基対断片及び第二からの２８５塩基対断片を、２％アガロース・ゲル上の電気泳動により単離した。先に記載した２つのＰＣＲ断片のそれぞれ約０．１　ｕｇを、混合した。ＰＣＲ反応を、プライマーＮ０Ｒ−２０２２及びＮ０Ｒ−１４９５のそれぞれ１００９モル及び以下のサイクル：９５℃において１分間、５０°Ｃにおいて２分間及び７２°Ｃにおいて３分間、を使用して行った。２２サイクルの後、最終サイクルを行った。そこで、７２°Ｃ段階を１０分間維持した。

得られた６８７塩基対断片を、１％アガロース・ゲル上の電気泳動により精製し、そして次に、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａ　Ｉにより消化した。得られた４１２塩基対断片を、ｐＭＴ６３６からの９．５ｋｂ　Ｎｃｏｌ−Ｘｂａｌ断片及びｐＭＴ６３６からの１．４ｋｂ　Ｎｃｏｌ−ＥｃｏＲ１断片に連結した。

連結混合物を、コンピテント大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株（ｒ−、ｍ”　）を形質転換するために使用し、アンピシリン耐性につしマて選択した。ＤＮＡ配列は、得られたコロニーからのプラスミドが合成酵母シグナル−リーダー遺伝子に融合された［Ｒ１５に、　Ｇ１６Ａ、　Ｙ１７Ｒ，Ｔ１９１］−ＴＦＰＩ−２のための正しいＤＮＡ配列を含んでいたことを示した。

１つのプラスミドｐＫＦＮ−１７９８を、さらなる使用のために選択した。

ｐＫＦＮ−１７９８からの４１２塩基対のＥｃｏＲＩ−Ｘｂａ　Ｉ断片のＤＮＡ配列を、配列番号１３中に示す。

プラスミドｐＫＦＮ−１７９８を、実施例１中に記載したような酵母株ＭＴ６６３内に形質転換し、酵母株ＫＦＮ−１８１１を作った。

ＹＰＤ培地中での形質転換株ＫＦＮ−１８１１の培養、上澄中の［Ｒ１５に、　Ｇ１６Ａ、　Ｙ１７Ｒ，Ｔ１９１］−ＴＦＰＩ−２の分析、及び精製を、実施例１中に記載したように行った。

ＫＦＮ　１５９３を、実施例１中に記載したように酵母培養基から精製した。ＫＦＮ　１５９３の濃度を、１％Ｅｌｌｌ。ａｍ　＝　８．３及びＭ　、　＝　６５００を使用して測定した。ブタ・トリプシンは、Ｎｏｖａ　Ｎｏｒｄｉｓｋ（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、　Ｄｅｎｍａ　ｒ’ｋ　）からのものであり、カリクレインは、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ（Ｓｔ。

Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ，ＵＳＡ）からのものであり、ヒト・プラスミン及びヒト・血漿カリクレインは、Ｋａｂｉ（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、　Ｓｗｅｄｅｎ）からのものであった。

ヒト好中球エラスターゼ及びカテプシンＧを、Ｂａｕｇｈ　ａｎｄ　Ｔｒａｖｉｓ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１５　（１９７６）　８３６−８４３）により記載されているような方法に従ってＰＭＮｓの抽出物から精製した。ペプチジル・ニトロアニリド基質、５２２５１　、５２５８６．５２２６６　、５２３０２は、Ｋａｂｉ（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、　Ｓｗｅｄｅｎ）からのものであった。Ｍ４７６５及び５７３８８は、Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ（Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ，ＵＳＡ）からのものであり、そして及びＦＸａ−１は、ＮｙｃｏＭｅｄ（Ｏｓｌｏ、　Ｎｏｒｗａｙ）からのものである。

セリン・プロテアーゼを、様々な濃度のＫＦＮ　１５９３と共に３０分間インキュベートした。次に、基質を添加し、そして残存プロテイナーゼ活性を、４０５１ｍにおいて測定した。この結果を、図２及び図３中に示す。

非修飾ＴＰＰＩ　Ｋｕｎｉｔｚ　ドメインＩＩ（ＫＦＮ　１５９３）は、トリプシン（Ｋｌ　＝。

５　ｘ　１０−”Ｍ）及び因子Ｘ（に＋　＝１５０ｎＭ）の阻害剤である。ＫＦＮ　１５９３は、プラスミン及び好中球エラスターゼの中程度の阻害示すが、カテブソンＧ及びカリクレインの阻害は、本質的に存在しない。

表１アミノ酸　ＴＦＰ　Ｉ−２理論値　実測値論　５　４．８９９　９．２５工ｌｅ　３　２．８２Ｐｒｏ　２　２．０８Ｔｈｒコ２．９２全体　５６５７・４１実施例４酵母株にＦＮ−１８６７からの［Ｒ１５に、　Ｇ１６Ａ、　Ｙ１７Ｒ，Ｔ１９１．　Ｌ３９Ｒ］−ＴＦＰ［−２の生産プラスミドｐＫＦＮ−１７９８からの［Ｒ１５に、　Ｇ１６Ａ、　Ｙ１７１’１．Ｔ＋９１１−ＴＦＰＩ−２をエンコードしている１、３ｋｂ　Ｓｐｈｌ−ＢａｍＨＩ断片のｏ、ｌμｇを、２つのｐｃＲ反応においてテンプレートとして使用した。第−ＰＣＲ反応においテハ、フライ７−　Ｎ０Ｒ−２０２２（ＧＧＡＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＴＴＧＣ）及ヒＭ−４６２（ＣＣＡＧＴＧＴＣＴＣＡＡＡＡＴＴＧＴＴＣＡＴＡＴＴＧＣＣＣＣＴＧＣＡＴＣＣＡＣＣ）　ノそれぞれ１００ｐモルを使用した。第二ＰｃＲ反応反応−テハ、ブー７　イア　−ＮＯＲ−１４９５（ＴＡＡＧＴＧＧＣＴＣＡＧＡＡＴＧＡ）及びＭ−４６１（ＧＧＴＧＧＡＴＧ　ＣＡＧＧＧＧ　ＣＡＡＴＡ　ＴＧＡＡＣＡＡＴＴＴＴＧＡＧＡＣＡＣＴＧ　Ｇ　）のそれぞれ１００ｐモルを使用した。Ｎ０Ｒ−２０２２は、Ｓｐ旧部位の９４塩基対下流の位置テプライムする。Ｍ−４６２＋；！、ＴＦＰｌ２　ＤＮＡ配列（７）３４１−３８０位（配列番号１１）に、２つのミスマツチを除き、相補的である。Ｎ。

Ｒ−１４９５は、Ｂａｍ１１１部位から５６１塩基対上流の位置でプライムする。

Ｍ−４６１は、Ｍ−４６２に相補的である。

ＰＣＲ反応を、商業的キット（ＧｅｎｅＡｍｐ、　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）及び以下のサイクルニ９５°Ｃにおいて１分間、５０℃において１分間、及び７２℃において２分間、を使用して１００μｌ容量において行った。

２４サイクル後、最終サイクルを行った。そこでは、その７２℃段階が１０分間維持された。このＰＣＲ生成物、すなわち、第−ＰＣＲからの５１８塩基対断片及び第二からの２０９塩基対断片を、２χアガロース・ゲル上の電気泳動により単離した。先に記載した２つのＰＣＲ断片のそれぞれ約０．１　μｇを、混合した。ＰＣＲ反応を、プライマーＮ０Ｒ−２０２２及びＮ０Ｒ−１４９５のそれぞれ１００ｐモル及び以下のサイクル：９５°Ｃにおいて１分間、５０°Ｃにおいて２分間及び７２°Ｃにおいて３分間、を使用して行った。２２サイクルの後、最終サイクルを行った。そこで、７２℃段階を１０分間維持した。

得られた６８７塩基対断片を、１％アガロース・ゲル上の電気泳動により精製し、そして次に、ＥｃｏＲ［及びＸｂａ　Ｉにより消化した。得られた４１２塩基対断片を、ｐＭＴ６３６からの９．５ｋｂ　ＮｃｏｉＸｂａｌ断片及び１１Ｍ７６３６からの１．４ｋｂ　Ｎｃｏｌ−ＥｃｏＲ１断片に連結した。プラスミドｐＭＴ６３６は、実施例１中に記載されている。

連結混合物を、コンピテント大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株（ｒ−、ｍ”　）を形質転換するために使用し、アンピシリン耐性について選択した。ＤＮＡ配列は、得られたコロニーからのプラスミドが合成酵母シグナル−リーダー遺伝子に融合された［Ｒ１５に、　Ｇ１６Ａ、　Ｙ１７Ｒ，Ｔ１９１．　Ｌ３９Ｒ］−ＴＦＰｌ −２のための正しいＤＮＡ配列を含んでいたことを示した。

１つのプラスミドｐＫＦＮ−１８６１を、さらなる使用のために選択した。

１）ＫＦＮ−１８６１からの４１２塩基対のＥｃｏＲＩ−Ｘｂａ　Ｉ断片のＤＮＡ配列を、配列番号１５中に示す。

プラスミドｐＫＦＮ−１８６１を、実施例１中に記載したような酵母株ＭＴ６６３内に形質転換し、酵母株ＫＦＮ−１８６７を作った。

ＹＰＤ培地中での形質転換株ＫＦＮ−１８６７の培養、上澄中の［Ｒ１５に、　Ｇ１６Ａ、　Ｙ１７Ｒ，Ｔ１９１．　Ｌ３９Ｒ］−ＴＦＰｌ２の分析、及び精製を、実施例１中に記載したように行った。

プラスミドｐＫＦＮ−１７９８からの［Ｒ１５に、　Ｇ１６Ａ、　Ｙ１７Ｒ，Ｔ１９１］−ＴＦＰＩ−２をエンコードしている１、３ｋｂ　Ｓｐｈｌ−Ｂａｍ旧断片の０．１ｔ１ｇを、２つのＰＣＲ反応においてテンプレートとして使用した。第−ＰＣＲ反応においては、プライマーＮ０Ｒ−２０２２（ＧＧＡＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＴＴＧＣ）及びＭ−４６４（ＣＣＡＧＴＧＴＣＴＴＡＡＡＡＴＴＧＴＴＣＡＴＡＴＴＧＣＣＣＣＴＧＣＡＴＣＣＡＣＣ）のそれぞれ１００９モルを使用した。第二ＰＣＲ反応においては、プライマーＮ０Ｒ−１４９５（ＴＡＡＧＴＧＧＣＴＣＡＧＡＡＴＧＡ）及びＭ−４６３（ＧＧ　ＴＧＧＡＴＧ　ＣＡＧ　ＧＧ　ＧＣＡ　ＡＴＡＴＧＡＡ　ＣＡＡＴＴＴＴＡＡＧＡ　ＣＡＣＴＧＧ　j のそれぞれ１００９モルを使用した。Ｎ０Ｒ−２０２２は、Ｓｐｈｌ部位の９４塩基対下流の位置でプライムする。Ｍ−４６４は、ＴＦＰｌ２　ＤＮＡ配列の３４１−３８０位（配列番号１１）に、３つのミスマツチを除き、相補的である。

Ｎ０Ｒ−１４９５は、ＢａｍＨＴ部位から５６１塩基対上流の位置でプライムする。

Ｍ−４６３は、Ｍ−４６４に相補的である。

２４サイクル後、最終サイクルを行った。そこでは、その７２℃段階が１０分間維持された。このＰＣＲ生成物、すなわち、第−ＰＣＲからの５１８塩基対断片及び第二からの２０９塩基対断片を、２％アガロース・ゲル上の電気泳動により単離した。先に記載した２つのＰＣＲ断片のそれぞれ約０．１　μｇを、混合した。ＰＣＲ反応を、プライマーＮ０Ｒ−２０２２及びＮ０Ｒ−１４９５のそれぞれ１００ｐモル及び以下のサイクル＝９５℃において１分間、５０℃において２分間及び７２℃において３分間、を使用して行った。２２サイクルの後、最終サイクルを行った。そこで、７２°Ｃ段階を１０分間維持した。

得られた６８７塩基対断片を、１％アガロース・ゲル上の電気泳動により精製し、そして次に、ＥｃｏＲｌ及びＸｂａ　ｌにより消化した。得られた４１２塩基対断片を、９Ｍ７６３６からの９．５ｋｂ　Ｎｃｏｌ−Ｘｂａｌ断片及びｐＭＴ６３６からの１．４ｋｂ　Ｎｃｏｌ−ＥｃｏＲ１断片に連結した。プラスミドｐＭＴ６３６は、実施例１中に記載されている。

連結混合物を、コンピテント大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）株＜ｒ−＋ｍ”　＞を形質転換するために使用し、アンピシリン耐性について選択した。ＤＮＡ配列は、得られたコロニーからのプラスミドが合成酵母シグナル−リーダー遺伝子に融合された［Ｒ１５に、　Ｇ１６Ａ、　Ｙ１７Ｒ，Ｔ１９［、Ｌ３９Ｒ，Ｅ４６Ｋｌ −ＴＦＰＩ−２のための正しいＤＮＡ配列を含んでいたことを示した。

１つのプラスミドｐＫＦＮ−１８６２を、さらなる使用のために選択した。

ｐＫＦＮ−１８６２からの４１２塩基対のＥｃｏＲＩ−Ｘｂａｌ断片のＤＮＡ配列を、配列番号１７中に示す。

プラスミドｐＫＦＮ−１８６２を、実施例１中に記載したような酵母株ＭＴ６６３内に形質転換し、酵母株ＫＦＮ−１８６８を作った。

ＹＰＤ培地中での形質転換株ＫＦＮ−１８６８の培養、上澄中のｔＲ１５に、　Ｇ１６Ａ、　ＹＩ７Ｒ，Ｔｌ９１．　Ｌ３９Ｒ，Ｅ４６Ｋ］−ＴＦＰＩ２の分析、及び精製を、実施例１中に記載したように行った。

実施例６１５及び１６位におけるＴＦＰＩ２の多突然変異プラスミドｐＫＦＮ−１６０５からのＴＦＰＩ−２をエンコードしている１、　３ｋｂＳｐｈｌ−Ｂａｍ旧断片の０．１Ｒｇを、２つのＰＣＲ反応においてテンプレートとして使用した。第− ＰＣＲ反応においては、プライマーＮ０Ｒ−２０２２（ＧＧＡＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＴＴＧＣ）及びＭ−７４９（ＡＡＴＡＣＣＴＧＧＴＡＡＴＡＴＡＡ（Ｃ／Ｇ）Ｃ（Ｃ／Ｇ）Ａ（Ａ／Ｃ）ＡＣＡＴＡＴＴＣＣＡＧＧＡＴＣ）のそれぞれ１００ｐモルを使用した。第二ＰＣＲ反応においては、プライマーＮ０Ｒ−１４９５（ＴＡＡＧＴＧＧＣＴＣＡＧＡＡＴＧＡ）及びドア５０　（ＧＡＴＣＣＴＧＧＡＡＴＡＴＧＴ　（Ｔ／Ｇ）Ｔ　（Ｃ／Ｇ　）Ｇ　（Ｃ／Ｇ　）ＴＴＡＴＡＴＴＡＣＣＡＧＧＴＡＴＴ）のそれぞれ１００ｐモルを使用した。Ｎ０Ｒ−２０２２は、５ｐｈ１部位の９４塩基対下流の位置でプライムする。ドア４９は、ＴＦＰＩ−２ＤＮＡ配列の２６３−２９９位（配列番号１１）に、４つのミスマツチを除き、相補的である。Ｎ０Ｒ−１４９５は、ＢａｍＨ［部位から５６１塩基対上流の位置でプライムする。ドア５゜は、Ｍ−７４９に相補的である。

ＰＣＲ反応を、商業的キット（ＧｅｎｅＡｍｐ、　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）及び以下のサイクル＝９５°Ｃにおいて１分間、５０゛Ｃにおいて１分間、及び７２℃において２分間、を使用して１００μｌ容量において行った。２４サイクル後、最終サイクルを行った。そこでは、その７２°Ｃ段階が１０分間維持された。このＰＣＲ生成物、すなわち、第−ＰＣＲからの４３９塩基対断片及び第二からの２８５塩基対断片を、２％アガロース・ゲル上の電気泳動により単離した。先に記載した２つのＰＣＲ断片のそれぞれ約０．１Ｒｇを、混合した。ＰＣＲ反応を、プライマーＮ０Ｒ−２０２２及びＮ０Ｒ−１４９５のそれぞれ１ｏｏｐモル及び以下のサイクル＝９５℃において１分間、５０°Ｃにおいて２分間及び７２°Ｃにおいて３分間、を使用して行った。２２サイクルの後、最終サイクルを行った。そこで、７２℃段階を１０分間維持した。

得られた６８７塩基対断片を、１％アガロース・ゲル上の電気泳動により精製し、そして次に、ＥｃｏＲｌ及びＸｂａ　Ｉにより消化した。得られた４１２塩基対断片を、プラスミドｐＴＺ１９Ｒ（λ１ｅａｄ、　Ｄ、　Ａ、、　５ｚｃｚｅｓｎａ−３ｋｏｐｕｒａ、　Ｅ、、　ａｎｄ　Ｋｅｍｐｅｒ、　Ｂ、　Ｐｏｒｔ、　Ｅｎｇｉｎ、Ｉ　（１９８６）　６７−７４）からの２．８ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−Ｘｂａｌ断片に連結した。

連結混合物を、コンピテント大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株（ｒ−、ｍ”　）を形質転換するために使用し、アンピシリン耐性について選択した。ＤＮＡ配列決定により、合成酵母シグナル−リーダー遺伝子に融合された表示ＴＦＰＩ−２同族体をエンコードしている以下の６つのプラスミドを、同定したプラスミド　同族体ｐＫＦＮ−１８８５［Ｒ１５Ｆ］　−ＴＦＰニー２ｐＫＦＮ−１８８３［Ｒ１５Ｆ、Ｇ１６Ａ］−ＴＦＰニー２ｐＫＦＮ−１９０５［Ｒ１５Ｌ］　−ＴＦＰニー２ｐＫＦＮ−１８８２［Ｒ１５Ｌ、　Ｇ１６Ａ］　−ＴＦＰニー２ｐＫＦＮ−１８８７［Ｒ１５Ｖ］　−ＴＦＰＩ−２ｐＫＦＮ−１８８６［Ｒ１５Ｖ、　Ｇ１６Ａ］−ＴＦＰニー２これらのプラスミドからの旧２塩基対のＥｃｏＲｌ−Ｘｂａ［断片を、実施例１中に記載した発現プラスミドの構築のために使用した。

実施例１中に記載したような酵母株ＭＴ６６３の形質転換は、以下の酵母株をもたらした。

酵母株　同族体ＫＦＮ−１８９６［Ｒ１５Ｆ］−ＴＦＰニー２ＫＦＮ−１８９４［Ｒ１５Ｆ、　Ｇ１６Ａ］　−ＴＦＰニー２ＫＦＮ−１９２８［Ｒ１５Ｌ］　−ＴＦＰニー２ＫＦＮ−１８９３［Ｒ１５Ｌ、Ｇ１６．Ｊ−ＴＦＰニー２ＫＦＮ−４８９８［Ｒ１５Ｖ］　−ＴＦＰニー２ＫＦＮ−１８９７［Ｒ１５Ｖ、　Ｇ１６Ａ］−ＴＦＰニー２ＹＰＤ培地中ての形質転換酵母株の培養、上澄中のＴＦＰＩ−２同族体についての分析、及び精製を、実施例１中に記載゛したように行った。

３つのＴＦＰ［（ドメイン＋１）変異体を、酵母培養基から精製した。

これらの濃度を、標準としてＢＰＴＩを使用して２１４ｎｍにおける吸光度から測定した。最終濃度を、トリプシンによる滴定により測定した。

ブタ・トリプシン及びヒト組換えタンパク質、因子Ｖ［Ｉａ、活性化プロティンＣ（ＡＣＰ）、及びｔＰＡを、Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／Ｓ（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、　Ｄｅｎｍａｒｋ）から得た。ヒト・トロンビンも同様であった。ウシ・キモトリプシン及び顆粒カリクレインを、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、（Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ。

ＭＯｌＵＳＡ）から得た。切り詰められたヒト組換え組織因子を、Ｃｏｒｖａｓ（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ、　ＵＳＡ）から得た。ヒト好中球カテプシンＧを、Ｂａｕｇｈ　ａｎｄ　Ｔｒａｖｉｓにより記載されている方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１５　（１９７６）８３６−８４３）に従ってＰＭＮｓの抽出物から精製した。ヒト・プラスミンはＫａｂｉ（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、　Ｓｗｅｄｅｎ）からのものであり、ｕＰＡは、５ｅｒｏｎｏ（λｌｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）からのものであり、ヒト因子Ｘａは、叶、　Ｗ、　Ｋ１５ｉｅｌ（Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ、　ＮＭ、　ＵＳＡ）からの贈り物であり、そしてヒト血漿カリクレインは、叶、　Ｉ　Ｓｃｈｏｕｓｂｏｅ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、　Ｄｅｎｍａｒｋ）からの贈り物であった。

ペプチジル・ニトロアニリド基質、５２２５１　、５２３０２．５２２６６　、５２５８６．５２２８Ｂ　、５２４４４．５２３６６　、、及び５２２３８は、Ｋａｂｉ（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ。

Ｓ詩ｅｄｅｎ）からのものであった。５７３８８及びＭ４７６５はＳｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、（Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ，ＵＳＡ）からのものであり、モしてＦＸａ−１はＮｙｃ。

ｍｅｄ（Ｏｓｌｏ、　Ｎｏｒｗａｙ）からのものであった。

セリン・プロテイナーゼを、様々な濃度のＫｕ旧【２ドメイン変異体と共に３０分間インキュベートした。次に基質（０，６ｍＭ）を添加し、そして残存プロテイナーゼ活性を、４０５ｎｍにおいて測定した。結果を表１中に示す。

３つの変異体が、強い特異的プラスミン阻害剤であり、テストされた血漿からの他のプロテイナーゼの有意な阻害はなかった。

実施例９４つの変異体を、酵母培養基から精製した。これらの濃度を、標準としてＢＴＰ　Ｉを使用して２１４ｎｍにおける吸光度から測定した。ブタ・トリプシンを、Ｎｏｖａ　Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／Ｓ（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、　Ｄｅｎｍａｒｋ）から得、ウシ・キモトリプシン（ＴＬＣＫ処理）を、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、（Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ，ＵＳＡ）から得た。切り詰められたヒト組換え組織因子を、Ｃｏｒｖａｓ（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ、　ＵＳＡ）から得た。ヒト・プラスミンはＫａｂｉ（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、　Ｓｗｅｄｅｎ）からのものである。ヒト好中球カテプシンＧ及びエラスターゼを、Ｂａｕｇｈ　ａｎｄ　Ｔｒａｖｉｓにより記載されている方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１５　（１９７６）　８３６−８４３）に従ってＰＭＮｓの抽出物から精製した。

ペプチジル・ニトロアニリド基質、５２２５１　、５２５８６は、にａｂｉ（Ｓｔ。

ｃｋｈｏｌｍ、　Ｓｗｅｄｅｎ）からのものであった。５７３８８及びＭ４７６５はＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、（Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ，ＵＳＡ）からのものであった。

セリン・プロテイナーゼを、様々な濃度の変異体と共に３０分間インキュベートした。次に基質（０，６ｎＭ）を添加し、そして残存プロテイナーゼ活性を、４０５ｎｍにおいて測定した。結果を表２中に示す。

４つのＴＦＰＩ　Ｋｕｎｉｔｚ　ドメインＩＩ変異体（ＫＦＮ　１８９３．１８９７．１８９８．１９２８）が、好中球エラスターゼの強い阻害剤であることが分かった。

配列表（１）一般情報：（ｉ）出願人：（Ａ）名称：ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ（Ｂ）番地：ノボ　アレ（Ｎｏｖｏ　Ａ１１ｅ）（Ｃ）市：　ＤＫ−２８８０バグスバード（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ）（Ｅ）国：デンマーク（Ｄｅｎｍａｒｋ）（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：　ＤＫ−２８８０（Ｇ）電話：　＋４５４４４４８８８８（Ｈ）ファックス、　＋４５４４４９３２５６（１）テレックス：　３７３０４（１１、発明の名称：ヒトＫｕｎｉｔｚｕプロテアーゼ阻害剤変異体（ｉｉｉ）配列数：１８（１ｖ）コンピューター読込形態：（Ａ）媒体形式：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣ互換機（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェアー：Ｐａｔｅｎｔｌｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　＃１．Ｏ，Ｖｅｒｓｉｏｎ　＃１．２５（ＥＰＯ）（２）配列番号ｌに関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ、５７アミノ酸（Ｂ）形二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）配列の種類：タンパク質（ｖｌ）起源：（Ａ）生物名１合成（ｘｉ）配列：配列番号ｌ：Ｘａａ　Ａｓｐ　ｐｈｅｃｙ′５ｐｈ＝　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｘａａ　Ｇｌｙ　Ｘａａ　Ｃｙｓ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａｌ　５　１０　１５（２）配列番号２に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ、５７アミノ酸（Ｂ）形・アミノ酸（Ｄ）トポロジー、直鎖状（ｉｉ）配列の種類：タンパク質（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名９合成（ｘｌ）配列：配列番号２・（２）配列番号３に関する情報（］）配列の特徴− （Ａ）長さ：５８アミノ酸（Ｂ）形、アミノ酸（Ｄ）トポロジー　直鎖状（ｉｉ）配列の種類　タンパク質（ｖｌ）起源（Ａ）生物名　合成（ｘｌ）配列：配列番号３（２）配列番号４に関する情報。

（１）配列の特徴（Ａ）長さ　５８アミノ酸（Ｂ）形・アミノ酸（Ｄ）トポロジー　直鎖状（目）配列の種類　タンパク質（ｖｉ）起源（Ａ）生物８二合成（ｘｌ）配列、配列番号４Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　ＰｈｅＣｙｓ　ＰｈｅＬａｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ工１ｅ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌａｌ　５　１０　１５（２）配列番号５に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：５８アミノ酸（Ｂ）形　アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）配列の種類：タンパク質（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名０合成（ｘｌ）配列：配列番号５・（２）配列番号６に関する情報・（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ＝５８アミノ酸（Ｂ）形　アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）配列の種類、タンパク質（ｖｉ）起源。

（Ａ）生物名１合成（ｘｉ）配列、配列番号６ＦｈｅＶａｌ　Ｔｙｒ　（、ｌｙ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｍａｔ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｆｈｅ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕコ５　４０　４５（２）配列番号７に関する情報。

（１）配列の特徴。

（Ａ）長さ・９４５塩基対ＣＢ）形・核酸（ｃ）　ｈ貞二　一本夕貞（Ｄ）トポロジー　直鎖状（１１）配列のｆＩＪｌ類　ｃＤＮＡ（ｖｌ）起源（Ａ）生物名：ホモ・サピエンス（ｉｘ）特？Ｉ！１．：（Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ＣＤ５（Ｂ）位置　３６５．　、５３８（ｘｉ）配列：配列番号７品■τ＝℃広Ｘ瓦ｕロフユ　９４５（２）配列番号８に関する情報：（ｉ）配列の特徴・（Ａ）長さ：５８アミノ酸（Ｂ）形、アミノ酸（Ｄ）トポロジー、直鎖状（１１）配列の種類：タンパク質（ｘｉ）配列：配列番号８（２）配列番号９に関する情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ・２３５塩基対（Ｂ）形　核酸（Ｃ）鎖ニ一本鎖（Ｄ）　ｌ−ポロジー　直鎖状（目）配列の種類　ｃＤＮＡ（ｖｉ）起源・（Ａ）生物名　合成（１ｘ）特徴（Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ＣＤ５（Ｂ）位置：　７７、．２３５（ｘｉ）配列：配列番号９Ｇ丁ＣＧｏ：　ＡτＧ　ＧＣＴ　ＧへＧＡＧ入ＴＴＧ　ＧＡＧ　ＭＧ　ＡＧＡ　２コ５（２）配列番号ｌＯに関する情報。

（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ・５３アミノ酸（Ｂ）形　アミノ酸（Ｄ）トポロジー　直鎖状（１１）配列の種類：タンパク質（ｘｉ）配列：配列番号ｌＯ：Ｌａｕ工１ｅ工１ｅ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　’Ｉｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｓｒ＋　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｍａｔ：　Ａｌａ　Ｇｌ■ （２）配列番号１１に関する情報・（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ、４１８塩基対（Ｂ）形：核酸（Ｃ）鎖ニ一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）配列の種類：　ｃＤＮＡ（ｖｌ）起源：（Ａ）生物芯　合成／ヒト（１ｘ）特徴：（Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ　：　ＣＤ５（Ｂ）位置：　７７、．４０９（ｉｘ）特徴（Ａ）ＮＡλＩＥ／ＫＥＹ：　ｓｉｇ　ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｂ）位置：　７７、．２３５（１ｘ）特徴・（Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：　ｍａｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｂ）位置＋　２３６．．４０９（ｘｉ）配列・配列番号１１：（２）配列番号１２に関する情報：（１）配列の特徴（Ａ）長さ：　Ｉ１１アミノ酸（Ｂ）形、アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｌり配列の種類、タンパク質（ｘｉ）配列：配列番号１２゜Ｍａｔ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｖａｌ　ｐｈｅＩｊ！ｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｓａｒ　Ｌｅｕ工１ｅ　Ｇｌｙ　Ｐｈａ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ　ＡｌａＡｒｇ　ＴＡｌＧｌｕ　聯Ａｒｇ　Ｌｙｓ　ｂＡｓｐ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ｉａｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｐｒ。

−コ　１　５　１゜（２）配列番号１３に関する情報。

（１）配列の特徴。

（Ａ）長さ　４１８塩基対（Ｂ）形：核酸（ＣＨＩニ一本鎖（Ｄ）トポロジー　直鎖状（ｉｉ）配列の種類　ｃＤＮＡ（ｖｉ）起源。

（Ａ）生物名１合成（１ｘ）特徴。

（Ａ）ＮＡｌｔｔＥ／ＫＥＹ：ＣＤ５ＣＢ）位置：　７７、．４０９（１ｘ）特徴（Ａ）ＮＡＭＥ／にＥＹ：　ｓｉｇ　ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｂ）位置：　７７、．２３５（］Ｘ）特徴。

（Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：　ｍａｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｂ）位置：　２３６．．４０９（ｘｌ）配列　配列番号１３゜Ｑυα丁αフαＴＣｉす（込にコＣτＴＣＡＡＡＣす（＾λ；ζＴＡ（シＭＣフロ℃〜１ゴＴＣ障ア、ＣＭ］講ｒ　６０にフ！Ａ〜％Ａ　ＡＴ！ｌ；　ＡＡＧ　ＧＣＴ　ＧＴＩ”　ＴＩ’Ｃｉ　ＧｒＴ　’ＩＴＧτ（ＣＴｒＧ　ｆｆ　１０９ＴＴＧ　（、；ＩＩＡ　Ｑ！倶Ｘαコα込にスππＮ込απα汀にＡＴＣＮ石７０Ｔ　３０１ππｃｖｃｖαπ〕（π＝に込　４１８（２）配列番号１４に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：　１１１　アミノ酸（Ｂ）形二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：タンパク質（ｘｉ）配列：配列番号１４・Ｌａｗ工１ｅ工１ｅ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　ＡＳ−ＩＴｈｒ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｍａｔ、Ａｌａ　Ｇｌｕ（２）配列番号１５に関する情報・（ｉ）配列の特徴・（Ａ）長さ、４１８塩基対（Ｂ）形；核酸（Ｃ）鎖ニ一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類　ｃＤＮＡ（ｖｉ）起源。

（Ａ）生物名　合成（ｉｘ）特徴・（Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ＣＤ５（Ｂ）位ｉｔ：　７７、．４０９（１ｘ）特徴：（Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：　ｓｉｇ　ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｂ）位置：　７７、．２３５（１ｘ）特徴：（Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：　ｍａｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｂ）位置：　２３６．．４０９（ｘｌ）配列　配列番号１５ＴｒＧＱＩ込Ｃ端ＣσαゴαスＡＴＡππＡＡＡＧ（コαπにＴ証Ｎ石フロワズ　３０１ππＣ倶ａ四απコに℃スス　４１Ｂ（２）配列番号１６に関する情報：（１）配列の特徴。

（Ａ）長さ：　Ｉｌｌアミノ酸（Ｂ）形二アミノ酸（Ｄ）トポロジー・直鎖状（１１）配列の種類、タンパク質（ｘｉ）配列　配列番号１６・Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｐｈａ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｍａｔ　ＡｓｎコＯ３５４０（２）配列番号１７に関する情報（ｉ）配列の特徴・（Ａ）長さ・４１８塩基対（Ｂ）形：核酸（Ｃ）鎖　一本鎖（Ｄ）トポロジー・直鎖状（２）配列の種類・ｃＤＮＡ（■１）起源。

（Ａ）生物８二合成（１ｘ）特徴；（Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ＣＤ５（Ｂ）位置：　７７、．４０’１ｌ（ｉｘ）特徴・（Ａ）ＮＡλＩＥ／ＫＥＹ＋　ｓｉｇ　ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｂ）位置：　７７、．２３５（１ｘ）特徴。

（Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：　ｍａｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｂ）位置＋　２３６．．４０９（ｘｉ）配列：配列番号１７゜ＴＩＧＧＡＡＣＡＡＧＡＴＣＣｒＧＧＡＡＴＡＴＧｒＡＡＡＧＣｒＣＩｌｌ？ｒＡＴＴＡ！ＡＧＧ’ａＴＴｒｒ　３０１（２）配列番号１Ｂに関する情報・（ｉ）配列の特徴二（Ａ）長さ：　１１１　アミノ酸（Ｂ）形二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉ　ｉ）配列の種類　タンパク質（ｘｌ）配列・配列番号１８：トリプシン　キモトリプシンプラスミン　ＦＡＣ因子χａ［ＫＦＮ　１５９３］　（ｎＭ）　［ＫＦＮ　１５９３］　（ｎＭ）顆を立カリクレイン　血漿カリクレインＩＮＯＴｏｏ　２００　３００　４００　０　５００　１０００［ＫＦＮ　１５９３］　（ｎＭ）　［ＫＦＮ　１５９３コ　（ｎＭ）カテプシンＧ　好中球エラスターゼ活性（７）　活性（７）［ＫＦＮ　１５９３］　（ｎＭ）　［ＫＦＮ　１５９３］　（ｎＭ）Ｆｉｇ、　３補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成６年７月イー日

Claims

【特許請求の範囲】

１．組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）のヒトＫｕｎｉｔｚ型プロテアーゼ阻害剤ドメインＩＩの変異体であって、以下のアミノ酸配列：【配列があります】（配列番号１）｛ここで、Ｘ１がＨ又はＣｙｓを除く１−５の天然アミノ酸残基であり、Ｘ２− Ｘ１４がそれぞれ独立して天然アミノ酸残基を表し、そしてＸ１５がＯＨ又はＣｙｓを除く１−５の天然アミノ酸残基である。但し、アミノ酸残基Ｘ１−Ｘ１５の中の少なくとも１が生来配列の対応アミノ酸残基とは異なっている。｝を含んで成る変異体。
２．Ｘ１がＬｙｓ−Ｐｒｏである、請求項１に記載の変異体。
３．Ｘ２がＡＩａ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＩＩｅ及びＶａｌから成る群から選ばれたアミノ酸残基である、請求項１に記載の変異体。
４．Ｘ２がＴｈｒ又はＰｒｏである、請求項３に記載の変異体。
５．Ｘ２がＰｒｏ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｖａｌ及びＩＩｅから成る群から選ばれたアミノ酸残基である、請求項１に記載の変異体。
６．Ｘ３がＰｒｏ又はＩＩｅである、請求項５に記載の変異体。
７．Ｘ４がＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ及びＡｌａから成る群から選ばれたアミノ酸残基である、請求項１に記載の変異体。
８．Ｘ４がＬｙｓ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ又はＡｒｇである、請求項７に記載の変異体。
９．Ｘ５がＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ及びＡｓｐから成る群から遊ばれたアミノ酸残基である、請求項１に記載の変異体。
１０．Ｘ５がＡｌａ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ又はＣｌｙである、請求項９に記載の変異体。
１１．Ｘ６がＡｒｇ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、ｌｎ、Ｇｌｕ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ及びＭｅｔから成る群から選ばれたアミノ酸残基である、請求項１に記載の変異体。
１２．Ｘ６がＡｒｇ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ又はＴｙｒである、請求項１１に記載の変異体。
１３．Ｘ７がＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ及びＰｈｅから成る群から選ばれたアミノ酸残基である、請求項１に記載の変異体。
１４．Ｘ７がＩＩｅである、請求項１３に記載の変異体。
１５．Ｘ■がＩｌｅ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ及びＰｈｅから成る群から選ばれたアミノ酸残基である、請求項１に記載の変異体。
１６．Ｘ■がＩＩｅ又はＴｈｒである、請求項１５に記載の変異体。
１７．Ｘ■がＡｒｇ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ及びＬｅｕから成る群から選ばれたアミノ酸残基である、請求項１に記載の変異体。
１８．Ｘ■がＡｒｇである、請求項１７に記載の変異体。
１９．Ｘ１０がＧｌｎ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ及びＶａｌから成る群がら選ばれたアミノ酸残基である、請求項１に記載の変異体。
２０．Ｘ１０がＶａｌ又はＬｙｓである、請求項１９に記載の変異体。
２１．Ｘ１１がＧｌｙ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ及びＡｓｎから成る群から選ばれたアミノ酸残基である、請求項１に記載の変異体。
２２．Ｘ１１がＡｒｇ又はＬｅｕである、請求項２１に記載の変異体。
２３．Ｘ１２がＡｌａ又はＧｌｙである、請求項１に記載の変異体。
２４．Ｘ１２がＬｙｓ、Ａｓｎ及びＡｓｐから成る群から選ばれたアミノ酸残基である、請求項１に記載の変異体。
２５．Ｘ１３がＬｙｓ又はＡｓｎである、請求項２４に記載の変異体。
２６．Ｘ１４がＶａｌ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ及びＬｙｓから成る群から選ばれたアミノ酸残基である、請求項１に記載の変異体。
２７．Ｘ１４がＬｙｓ又はＧｌｕである、請求項２６に記載の変異体。
２８．Ｘ１５がＧｌｙである、請求項１に記載の変異体。
２９．Ｘ１がＬｙｓ−Ｐｒｏであり、そしてＸ１５がＧｌｙである、請求項１に記載の変異体。
３０．以下のアミノ酸配列：【配列があります】（配列番号２）｛ここで、Ｘ１−Ｘ１５が請求項１中に示すものと同じであり、Ｘ１６がＧｌｎ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ及びＰｈｅから成る群から選ばれたアミノ酸残基、特にＧｌｎ又はＡｌａであり、そしてＸ１７がＴｈｒ又はＡｌａから成る群から選ばれたアミノ酸残基である。｝を含んで成る、請求項１に記載の変異体。
３１．以下のアミノ酸配列：【配列があります】（配列番号３）をもつ、請求項１に記載の変異体。
３２．以下のアミノ酸配列：【配列があります】（配列番号４）をもつ、請求項１に記載の変異体。
３３．以下のアミノ酸配列：【配列があります】（配列番号５）をもつ、請求項１に記載の変異体。
３４．以下のアミノ酸配列：【配列かあります】（配列番号６）をもつ、請求項１に記載の変異体。
３５．請求項１〜３４のいずれかに記載のヒトＫｕｎｉｔｚ型プロテアーゼ阻害剤変異体をエンコードしているＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ構築物。
３６．請求項３５に記載のＤＮＡ構築物を含んで成る組換え発現ベクター。
３７．請求項３５に記載のＤＮＡ構築物又は請求項３６に記載の発現ベクターを含む細胞。
３８．請求項１〜３４のいずれかに記載のヒトＫｕｎｉｔｚ型プロテアーゼ阻害剤変異体の製造方法であって、そのタンパク質の発現を誘導する条件下で請求項３７に記載の細胞を培養し、そして得られたタンパク質をその培養物から回収することを含んで成る方法。
３９．請求項１〜３４のいずれかに記載のヒトＫｕｎｉｔｚ型プロテアーゼ阻害剤変異体及び医薬として許容される担体又は賦形剤を含んで成る医薬組成物。
４０．ヘパリンをさらに含んで成る請求項３９に記載の組成物。
４１．病的なタンパク質分解に関連する疾患又は症状の防止又は治療のための医薬の製造のための、請求項１〜３４のいずれかに記載のＴＦＰＩのヒトＫｕｎｉｔｚ型プロテアーゼ阻害剤ドメインＩＩ又はそれの変異体の使用。