JPS637794A - 組換え宿主から生産されたアプロチニン相同体、それらのための方法、発現ベクタ−および組換え宿主、およびそれらの製薬学的使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、アプロチニン相同体類および組換えＤＮＡ技
術によるそれらの生産に関する。

ここに開示する化学的に合成したＤＮＡ分子は、アプロ
チニンまたはアプロチニン相同体のアミノ酸配列および
粗製が実質的に一致する、新規なポリペプチド類または
ポリペプチド類の遺伝情報を指定しかつアプロチニンま
たはアプロチニン相同体の生物学的活性を有するＤＮＡ
配列によって特徴づけられる。

アプロチニンは５８アミノ酸を含みかつトリプシン、キ
モトリプシン、プラスミンおよびカリクレインを阻害す
る作用を有する。よく知られたペプチドである。それは
ウシ器官からの塩基性プロイテナーゼ阻害剤であり、そ
して種々の病気、例えば、超線維素溶解性出血およびト
ラウマチン出血シゴックの処置のための価値ある薬物、
Ｔｒａｓｙｌｏｌ・、となった［概観については、Ｈ。

フリッツ（Ｆｒｉｔｚ）およびＧ、ウンデシル（Ｗｕｎ
ｄｅｒｅｒ）、１９８３、薬物の研究（Ｄｒｕｇ、　　
Ｒｅ５−）３３．４７９−４９４参照］。

最近、位ｆｆ１１５にリジンの代わりに他のアミノ酸を
もつアプロチニン相同体は、アプロチニンに比べて変更
された作用、；づよび効能を有する価値あるプロイテナ
ーゼ阻害剤であることが示された［ドイツ国公開明細書
（ＤＥ−ＯＳ）３３　３９６９３号、Ｈ，Ｒ，ベンゼル
（Ｗｅｎｚｅｌ）ら、１９８５、ペプチドおよび蛋白質
の化学、Ｖｏ　ｌ　、　３］。これらの７ブロチニン相
同体は膵臓および白血球からのエラステラーゼ、および
カテプシンＧに対して強い阻害作用を有する。　。

このようなアプロチニン相同体は５次のエラステラーゼ
の過度の放出、膵臓エラステラーゼ（膵炎）、血清エラ
ステラーゼ［アルセロＳクレオシス（ａｒｔｈｅｒｏｓ
ｃｌｅｒｏｓｉｓ）］、結結合織への損傷を伴う急性お
よび慢性の炎症、血管壁への損傷、壊死の病気および肺
組織の変性における白血球エラステラーゼ、に関連する
病気において治療学的に使用することができる。とくに
白血球エラステラーゼ、免疫学的プロセスによる炎症反
応、例えば、リウマチ性関節炎において、リゾシーム酵
素が演する部分は同等に重要である。

アプロチニンおよびアプロチニン相同体はウシ器官から
、およびウシトリプシン阻害剤の半合成的転化により得
ることができる［チェシュ（Ｔｓｃｈｅｓｃｈｅ）、Ｍ
、、ペンゼＪＬ／　（Ｗｅ　ｎ　ｚ　ｅｌ）、Ｍ、、シ
ュムク（Ｓ　ｃ　ｈｍｕ　ｃ　ｋ）、Ｒｏ、シュナベル
（Ｓｃｈｎａｂｅｌ）、Ｅ、、ドイツ国公開明細書（Ｏ
５−ＤＥ）３３　３９６９３号　ＡＩ、１９８５年５月
１５日発行］が、収量は比較的少ない。

組換えＤＮＡ技術および関連する技術は高い品質の相同
体を必要な多い量で得る有効な方法であろうことが考え
られた。この目標は、宿主有機体から組換えＤＮＡ技術
の生産物として、生物学的に活性なアプロチニン相同体
を生産することであった。

微生物中の異型ＤＮＡの発現の方法は現在知られている
。

既知のアミノ酸配列のポリペプチドの遺伝情報を指定す
るＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ配列、ｍＲＮＡに対して相補
的であるｃＤＮＡを使用することにより、あるいは遺伝
暗号に従うコドンを選択することおよび合成遺伝子を調
製することによって調製することができる。

ウシ膵臓トリプシン阻害剤の遺伝子からのウシゲノムク
ローンの部分的ＤＮＡ配列は、Ｓ、アンダーツｙ（Ａｎ
ｄｅｒｓｏｎ）および１．Ｂ、キングストン（Ｋｉｎｇ
ｓｔｏｎ）、１９８３、プロシーデインゲス・オブ・ナ
ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ
、　　Ｎａｔｌ　、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、）ＵＳ
Ａ、８０．６８３−６８４２、によってクローニングさ
れて、ＢＰＰＴＩのためのゲノムクローンが特徴づけら
れた。

ＢＰＴＩおよびウシ牌阻害剤ＩＩの遺伝情報を指定する
ウシゲノムのより大きいセグメントは、最近シーリクエ
ンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）され、そして発表さ
れた［１．Ｂ、キングストン（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ）およ
びＳ、アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）、１９８６、
バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　Ｊ
、）、２３３．４４３−４５０］　。

本発明の目的は、アプロチニン相同体類、それらを暗号
化（ｅｎｃｏｄｅ）する核酸類、前記核酸類を組込んだ
ベクター類およびそれらで形質転換された細胞およびア
プロチニン相同体類を得る方法を提供することである。

本発明の目的に対して、適切な設計（ｄｅｓｉｇｎ）を
もちかつ広い用途を約束するつ合成遺伝子を調製するコ
ドンを選択することは最も重要であった。

これは、とくに、制限酵素の独特認識部位によって停止
するＤＮＡブロックまたはカセットからなる合成マスタ
ー遺伝子を構成する場合である。このような遺伝子の設
計は、このようなりＮＡブロック内のすべてのＤＮＡ配
列の容易な修飾または突然変異を可能とする。

アプロチニン相同体は組換えＤＮＡ技術によって調製さ
れた。このようなアプロチニン相同体。

例えば、Ｖａｔ−１５−１１ｌｅ−１５−１Ｌｅｕ　−
１５−１Ｐｈｅ−１５−およびＡｌａ−１５−、Ａｒｇ
−１５、ｃｔｙ−ｔｓ、５ｅｒ−１５−１Ｔｒ　ｐ　−
１５＋、　Ｔｙ　ｒ　−１５，アプロチニン単独あるい
は位置５２がＧｌｕ、Ｌｅｕ、Ｖａ１、ＡｒｇまたはＴ
ｈｒで置換されているアプロチニンとの組み合わせは、
位置５２にＭｅｔを有する既知のアプロチニンおよびそ
の相同体類に等しいことが発見され、そしてそれらの生
産と一緒に開示する。Ｍｅｔ−５２の置換は、遺伝子操
作された融合ポリペプチドが臭化シアンにより融合ポリ
ペプチド中のＭｅｔで切断（ｃｌｓａｖｅ）されたアプ
ロチニンおよびアプロチニン相同体の生産を可能とする
。

このような相同体類の遺伝情報を指定する合成りＮＡ、
前記相同体類を発現するための構造遺伝子からなる組換
えプラスミドるおよび前記組換えプラスミド類で形質転
換された大腸菌（以下Ｅ。

ｃｏ１、という）を、また、開示する。

以下において、アプロチニンおよびアプロチニン相同体
の遺伝情報を指定するＤＮＡ断片の構成および選択の方
法を示す。

既知の蛋白質配列およびアプロチニンおよびアプロチニ
ン相同体の遺伝暗号を使用して、このようなポリペプチ
ドの遺伝情報を指定するＤＮＡ配列を決定した。

遺伝暗号の同義性は、任意の所定のアミノ酸配列のため
のコドンの選択における実質的な自由紙を許す。

この蛋白質のアミノ酸配列を表示するコドンのなかのす
べての可能な塩基置換を決定した。これに従い、可能な
りＮＡ配列内に位置するすべての潜在的な制限部位を決
定した。

マスター遺伝子のためのコドンの選択は１次の考察によ
ってガイドされる： 第１に、コドンおよび断片を選択し、そして断片の不都
合な相補性を回避するように、断片のアセンブリーを設
計した。

第２に、Ａ−Ｔ塩基対に富んだ領域を回避して、転写の
早期の停止に伴う問題を克服する。

第３に、アプロチニンの修飾を容易に生成でき、構造と
活性との間の相関関係を検査できるように、適切な断片
の他の断片との置換による形質転換体または塩基の置換
の検証を促進するために　−必要な制限部位を選択した
。

第４に、選択したコドンの大部分は微生物ゲノムの発現
において好ましいものである［Ｈ，グロスジーｙ（Ｇｒ
ｏｓｊｅａｎ）およびＷ、７ｙイアース（Ｆｉｅｒｓ）
、遺伝子（Ｇｅｎｅ）、１８　（１９８２）１９２−２
０９；Ｍ、ゴウイ（Ｇｏｕｙ）およびＣ，ガウチーア（
Ｇａｕｔｉｅｒ）、核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａ
ｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ）、１０　（１９８２）７０
５５−７０７４参照］。

合成アプロチニン遺伝子類およびそれらの相同体類の主
要な設計は第１図に示されている。

制限エンドヌルレアーゼのための認識部位によって取囲
まれた４つのブロック（α、β、γ、δ）から成る合成
マスター遺伝子の設計は、さらに、融合および非融合の
発現のためのＤＮＡ配列の容易な修飾および変更（コド
ン使用、突然変異、蛋白質操作、遺伝子の増幅）を可能
とする。

合成遺伝子は次のようにして構成した：アプロチニンお
よびアプロチニン相同体のための合成遺伝子は、重複す
る末端領域を有する１５の精製したオリゴヌクレオチド
のアセンブリーによって、マスター遺伝子を経て構成し
た（第１図参照）。この構成は２工程で実施した。遺伝
子の部分ＡについてＤＮＡ断片１、２．３．４および６
、および部分ＢについてＤＮＡ断片５．７．８．９．１
０．１１．１２．１３．１４および１６の交雑、結合お
よび精製によって、遺伝子の部分Ａおよび部分Ｂを生成
した（第２図）、第２に、遺伝子の部分ＡおよびＢを結
合し、そして精製した。この構成のため、後述する物質
および方法を使用した。マスター遺伝子のＤＮＡ配列は
第３図に示されている。それは開始コドンＡＴＧ、２つ
の終止コドン、ＴＡＧおよびＴＡＡ、Ｅｃ。

ＲＩのための５′末端制限部位およびＨｉｎｄＩＩＩお
よびＢａｍＨＩのための３゛末端制限部位、およびまた
Ａｐａ　　Ｉ、Ｓｔｕ　　Ｉ、Ｓａｃ　　ＩＩ（Ｓｓｔ
　　ＩＩ）のための内部の制限部位を含む。これらの部
位、ことに内部の部位は、解読配列のクローニング、他
のアミノ酸の遺伝情報を指定するかあるいは他のコドン
を使用を有するＤＮＡ断片を交換することによるマスタ
ー遺伝子の修飾を促進する。この遺伝子の増幅は、適切
なリンカ−（ｌｉｎｋｅｒ）の付加によって容易に実施
できる。蛋白質操作の全体のスペクトル作成はこのよう
な構成を用いて可能である。

アプロチニン相同体のための遺伝子を構成するため、適
当なりＮＡ配列をもつ制限断片のみを交換しなくてはな
らなかった０位置１５および５２を含むアミノ酸の変更
の遺伝情報を指定するするであろう、このような断片の
ための配列は第２ｂ図に記載されている。

組換えプラスミドは、次のようにして構成した： 実験のアプロチニンのクローニングのために選択したプ
ラスミドはｐＵＣ８であった［Ｊ、ビエイラ（Ｖｉｅｉ
ｒａ）およびＪ、メッシング（Ｍｅ　ｓ　ｓ　ｉ　ｎｇ
）、１９８２、遺伝子（Ｇｅｎｅ）、１９．２５９］、
このクローニングベクターは、ｐＢＲ３２２ｉ導アンピ
シリン遺伝子、および１列の独特制限酵素認識部位を含
有するｌａｃ　　Ｚ　　遺伝子の一部分に結合したＤＮ
Ａ複製の起源から成る。このベクターを１ａｃ−Ｅ、ｃ
ｏ１、中に導入すると、形質転換体は適当な指示へトリ
皿上に青色のコロニーを生成する。

ＤＮＡ断片を多数の制限部位のいずれか、例えば、Ｅｃ
ｏ　　ＲＩとＢａｎ　　ＨＩとの間の中にクローニング
すると、ｌａｃ遺伝子は不活性化され、白色のコロニー
が生成する。プラスミドｐＵＣ８はＰ−Ｌ　　バイオケ
ミカルス（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から商業的に入
手可能である。

発現プラスミドは次のようにして構成した：融合蛋白質
としてアプロチニンおよびアプロチニン相同体を発現す
るため、Ｕ、リュター（Ｒｕｔｈｅｒ）およびＢ、ミュ
ラー−ヒル（Ｍｕ　ｌ　１ｅｒ−Ｈｉｌｌ）、１９８３
．ＥＭＢＯジャーナル、３．１７９１−１７９４による
同様な実験において示されているように、適当な遺伝子
がβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のカルボキシ末端と融合
されているプラスミドを構成した。親プラスミドｐＵＲ
２７ｇはｌａｃ　　Ｚ　　遺伝子の３′末端に単一のク
ローニング部位、ＢａｍＨＩ、Ｓａｌ　　Ｉ、Ｐｓｔ　
　Ｉ、ＸｂａＩおよびＨｉｎｄ　　ＩＩＩを有する（ま
た、ドイツ国特許出願Ｐ３　３０９　５０１、．９参照
）。適切なりローニング部位および正しいリーディング
フレームの中に解読ＤＮＡ配列を挿入すると、そのＤＮ
Ａによって暗号化されたペプチドと結合した活性β−ガ
ラクトシダーゼの融合蛋白質が生ずる。

発現ベクターｐＵＲ２７８の制限部位ＢａｎＨＩおよび
Ｈｉｎｄ　　ＩＩＩを、発現ベクター中で７ブロチニン
およびアプロチニン相同体のための合成遺伝子をクロー
ニングするために選択した。したがって、ＢａｍＨＩｔ
−遺伝子の５°Ｅｃｏ　　ＲＩ末端に付加しかつ３°末
端にＨｉ　ｎｄＩＩＩ部位を使用することによって、ア
プロチニン遺伝子を修飾することが必要であった（第６
図参照）。

組換えＤＮＡの研究のために次の標準の材料および方法
を使用した： ここに記載する合成遺伝子、このような遺伝子を使用す
る組換えプラスミドおよび発現ベクターは、次の材料お
よび方法によって調製しかつ特徴づけることができる。

材料 醗ス ポリヌクレオチド−キナーゼ（ＰＮＫ）、５．５単位／
ＪＬｌ：ベーリンガー・マンハイム（Ｂ　ｏ　ｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）Ｎｒ、６３３５４２゜ ＤＮＡポリメラーゼ；クレノー、ベーリンガー・マンハ
イム　Ｎｒ、１０４　５２３゜ Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼ、０．９単位／ＪＬｌ；ベーリ
ンガー・マンハイム　Ｎｒ、４８１　２　　２制限酵素
はベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓ
ｄａ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　Ｌ　　ｂＳ）ベーリンガ
ー・マンハイム、バイオラプス（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
−Ｍａｎｎｈｅｉｍ５２３、ＢｉｏＬａｂｓ）。

子牛腸アルカリ性ホスファターゼ（ｃＩＰ）；ベーリン
ガー・マンハイム。

リゾチームＩＲナーゼ（ＲＮａｓｅ）；ベーリンガー・
マンハイム。

ス遠 ガフ？　　３２　　Ｐ　　ＡＴＰ；アマ−ジャム（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ）Ｎｒ、ＰＢ　　１０１６８゜アルファ　
３２　　Ｐ−ｄＴＴＰ；アマ−ジャム１６７゜ ＡＴＰ、シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｎｒ、Ａ−６１４４゜ ビス　アクリルアミド；サーバ（Ｓｅｒｖａ）１９１９
５゜ アクリルアミド；サーバおよびパイオーラブ（Ｂｔｏ−
Ｒａｂ）１６１−０−０３゜ ＴＥＭＥＤ　、サーバ　３５９２５゜ 過Ｖｔｍアンモニウム；サーバ　１３３７５゜尿素、Ｂ
ＲＬ　　超純粋５５０５ＵＡ。

ＤＥ５２（予＠膨潤ジエチルアミンエチルセルロース）
；ワット−Ｆ７　（Ｗｈａｔｍａｎ）Ｃａｔ　、４０５
７−０５０゜ ＤＴＥ、サーバ　２０６９７゜ インプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＦＴＧ）
、シグマ　Ｉ　　５５０２゜ ５−ブロモ−４−クロロインドリル−β−Ｄ−ガラクト
シド（Ｘｇａｌ）；ベーリンガー　６５１７４５゜ Ｎ、Ｎ’−ジメチルホルムアミド；メルク（Ｍｅｒｃｋ
）２　２０３　０３４゜ ＧＴＡ サッカロース、ＢＢＬ　　５５０３　　ＵＡ。

ジアミノピメリン酸；シグマ　Ｄ　　ｌ３７７゜Ｍ　　
１３　−　ジデオキシヌクレオチド　シーフェンシング
系；ニュー・イングランド拳バイオラボラトリーズ（Ｎ
ｅｗ　　Ｅｎｇｌａｎｄ　　Ｂｉ。

１ａｂｓ）、米国マサチュセ７ツ州ベベリリイ木４０４
、木４０９゜ クロロホルム。

イソアミルアルコール チミジン；サーバ　１８６０００ グルコース　Ｄ　（＋）　　；メルク　８　３　３　７
。

トリス；メルク　８３８２。

水酸化カリウム；メルク　５０３３゜ 塩化カルシウム；メルク　２３８２゜ 塩化ルビジウム；シグマ　Ｒ２２５２゜塩化マグネシウ
ム：シグバ　Ｍ　　３６３４゜ＤＭＳｏ；ジグ−ｆ　　
Ｄ　　５８７９゜ＥＤＴＡ　； 酢酸カリウム： ＳＤＳ； ＮＡ プラスミド　ＰＵＣａ；ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃ
　ｉ　ａ）　Ｐ−Ｌ　　バイオケミカルス（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ）２７−４９１６−ｘＸ− Ｂａｎ　　ＨＩ　　リンカ−０ 塵亜友主ｌ憩ユ１！ バクトートリプトン（Ｂａｃｔ　ｏ−ｔ　ｒｙｐｔ　。

ｎｅ）；デ（７：Ｉ　（Ｄｉ　ｆｃｏ）０１２３−Ｏｌ
。

バクトー酵母エキス；０１４０−０１゜ＬＢ−培地： （１リツトルについて）１０ｇのバクトートリプトン、
５ｇのバクトー酵母エキス、１０ｇのＮａｃ１、ｐＨ７
，５にＮａＯＨで調節。

カッパ　１７７６−培地： （１リツトルについて）２５ｇのバクトートリプトン、
７．５ｇのバクトー酵母エキス、１モルのトリス−ＨＣ
１（ｐＨ７，５）２０ｍ１、９５０ｍ１にし、オートク
レーブ処理し、そして冷却し、滅菌する；　５　ｍ　ｌ
の１モルのＭｇＣ１２，１０ｍ１の１％のジアミノピメ
リン酸、１０ｍ１の０．４％のチミジン、２５ｍ１の２
０％のグルコース。

ＹＴ−培地： （１リツトルについて）８ｇのバクトートリプトン、５
ｇのバクトー酵母エキス、５ｇのＮａＣ１゜ 寒天ペトリ皿を１５ｇのバクトー寒天を１リツトルの適
当な培地に添加して調製した。

指示ペトリ皿： １．５％の寒天を含む１リツトルのオートクレーブ処理
したＹＴ培地に、次の溶液を添加した：２ｍ１ｃ７）０
．１モルののＩＰＴＧ、２ｍｌのＮ、Ｎ”−ジメチルホ
ルムアミド中の２％のＸ−ｇａｌおよび２ｍｌの１００
ｍｇ／ｍｌのアンピシリン。

抗生物質： クロロアンフェニコール；ベーリンガー・マンハイム　
６３４　４３３゜ アンピシリン；サーバ　１３３９７゜ テトラサイクリン；サーバ　３５８６５゜緩衝液および
溶液 ２０ルモルのＡＴＰ　　　　　　　水中１０ミリモルの
ＡＴＰ　　　　　　水中１０ＸＰＮＫ−ミックス： ０．５モルのトリス−１（ｃ１（ｐＨ７，６）：０．１
モルのＭｇＣ１２，５０ミリモルのＤＴＥ、１ミリモル
ののＥＤＴＡ。

１０Ｘリガーゼ−ミックス： ０．５モルのトリス−ＭＣＩ　　（ｐＨ７，４）；０．
１モルのＭｇＣ１２；０．１モルのＤＴＥ；１０モルの
ＡＴＰ。

１０ＸＳＰ−５０： １００ミリモルのトリス−ＨＣｌ　（ＰＨ７。

５）；１００ミリモルのＭｇＣ１２；５００ミリモルｃ
Ｆ）ＮａＣ１；１０ミリモルのＤＴＴ。

１０ＸｓＰ−１００： １００ミリモルのトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７。

５）；１００ミリモルのＭｇＣｌ　　２；１モルのＮａ
Ｃ１；１０ミリモルのＤＴＴ。

１０ＸＳＰ−０： １００ミリモルのトリス−ＭＣＩ　（ｐＨ７゜５）；１
００ミリモルのＭｇＣ１２；１０ミリモルのＤＴＴ。

１モルののＴＢＥ： １モルのトリス；０．８３モルののホウ酸；１０モルの
ＥＤＴＡＢ　ｐＨ８，，３゜ ３ｘホルムアミド色素ミックス； ７０％のホルムアミド；２０％のグリセロール；ｌミリ
モルのＥＤＴＡ　；　０．３３ｍｇ／ｍ１のブロモフェ
ノールブルー；　０．６６ｍｇ／ｍｌのキシレンシアツ
ールＦＥ；　０．６６ｍｇ／ｍ１ｃ７）オレンジＧ。

２０ＸＥ−緩衝液： ０．８モルのトリス：０．４モルの酢酸ナトリウム；４
０ミリモルのＥＤＴＡ；ＰＨ８，３，。

１０ＸＣＩＰ−緩衝液： ０．５モルのトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ９，０）；１０ミ
リモルのＭｇＣ１２；１ミリモルのＺｎＣ１２：１０ミ
リモルのスパーミジン。

形質転換緩衝液： 次のように調製した：１５ｇのサッカロース、１ｍｌの
３．５モルののＫＯＨｌｌｍｌの１モルののＣａＣ１２
，２ｍ１５．０モルののＲｂＣ１を水性パイプスト（ｂ
ｉ　ｄｅｓｔ）　で５０ｍ１にし、１０％の酢酸でｐＨ
６，２に調節し、１ｍｌの４．５モルのＮｎＣ１２を添
加し、１０％の酢酸でｐＨ５，８に調節し、水性パイプ
ストで１００ｍ１にし、そして滅菌濾過する。

ＴＥｗ！衝液： １０ミリモルのトリス−ＨＣ１（ｐＨ８。

０）、０．１ミリモルのＥＤＴＡ。

１０ＸＮＴ−緩衝液： リゾデームミックス： ５０ミリモルのグルコース、１ミリモルのＥＤＴＡ％　
ｌＯミリモルのトリス−ＭＣＩ（ｐＨ８゜０）。

フェノール／セバグ（Ｓ　ｅ　ｖ　ａ　ｇ）　　：１容
量％の８０％のフェノールおよび１容量％のセバグ（ク
ロロホルム：イソアミルアルコール、２４：１）。

仇！迭 マミアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、１９８２、モ分子
クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、
コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−１米国
コールド・スプリング、に記載されている、組換えＤＮ
Ａの研究のための標準法を、後述する多少の変更を加え
て使用した。

標準のエタノール沈澱 ＤＮＡペレットを溶解するか、あるいは溶液を０．３モ
ルのす酢酸ナトリウムに調節し、２容量部のエタノール
を添加し、−７０℃で１５分間インキュベーションし、
そして遠心した。ペレットを８０％のエタノールで２回
洗浄し、そして真空乾燥した。

標準のフェノール抽出 溶液をフェノール／セバグ、容量比１：１、とよく混合
し、遠心し、フェノール相を１／１０の緩衝液または水
で再抽出し、水相をプールした。

ポリアクリルアミドゲルの電気泳動後のＤＮＡ少量のＤ
ＮＡ断片（２５０ヌクレオチドまで）をゲル電気泳動に
より分離し、そしてオートラジオグラフィーまたはＵＶ
比仮により帯を可視化した（予備被覆したＴＬＣ−板Ｓ
ｉ１ｇｕｒ−２５、マーチェレイーネイゲルΦアンド・
カンパニー）、帯をスライスし、シリコ−化ガラス林で
かきまぜ、約４００ｍ１ＴＥ緩衝液ｐＨ８，０−？？４
２℃において１８時間溶離した。この物質を遠心し、そ
して沈澱物を４２℃デ４時間再溶敲し、そして遠心した
０両者の上澄みを一緒にし、そして細いＤＥ−５２パス
ツールピペツトのカラムおよび１モルのＴＥＡＢＣを使
用する陰イオン交換オートラジオグラフィーにより精製
した。凍結乾燥後、ＤＮＡを２回水中に溶解かつ凍結乾
燥した。

標準の結合 標準の結合（ベクターより小さい断片）のため、小さい
比１：５をベクター：断片について使用した。最終のＤ
ＮＡ農砥は２５ＪＬｇ／ｍｌであった。ＤＮＡを少量の
ＴＥ緩衝液中に溶解し。

１０×−リガーゼミックス、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを添加
し、１×リガ一ゼミツクス濃度に調節した（５０ミリモ
ルのトリス−ＨＣｌ　　ｐＨ７，４，１０モルのＭｇＣ
１２，１０ミリモルのＤＴＥ、１　ミｌＪモル（７）Ａ
ＴＰ　；標準体１３０ｐｌ）。

反応は１４℃で１６時間実施した。

ＤＮＡ断片の標準の５°標識付は 脱ホスホリル化ＤＮＡ　（最終濃度的０．２−モル）を
Ｉ×キナーゼ緩衝液工（５０ミリモルのトリス−ＨＣｌ
　　ｐＨ７，６，１０モルのＭｇＣ１２，５ミリモルの
ＤＴＥ、０．１ミリモルのＥＤＴＡ）中に溶解した。標
識付けしないＡＴＰと一緒に、ガンマ３２　　Ｐ　　Ａ
ＴＰ　（３０００Ｃｉ／ミリモル）を添加した。ＡＴＰ
の最終濃度は常にｔｇモル）より大きかった０反応は単
位の定義およびＤＮＡｅ度に基づいて計算して５００〜
１０００倍過剰量のポリヌクレオチドチナーゼを使用し
て、３７℃で３０分間実施した。反応をフェノール抽出
のために停止させた。ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、
洗浄し、そして乾燥した。

標準の制限エンドヌクレーゼ消化 制限エンドヌクレーゼ消化は製造業者のマニュアルに種
として従って実施した。精製した塩不含ＤＮＡを緩衝液
中に溶解しく使用した酵素の対してそれぞれ５ｐ−ｏ、
５Ｐ−５０または５Ｐ−１００）そして適当量の酵素で
消化した。最後に、物質をフェノール抽出し、そしてエ
タノール沈澱させた。

アガロースゲル電気泳動後のＤＮＡ断片の標準０公濱 ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離し［参
照、Ｔ、マニアチス（ＭａｎｉａｔｉＳ）ら、１９８２
、コールド・スプリング−ハーバ−番ラボラトリー１分
子のクローニング（Ｍ。

１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃ，Ｉｏｎｉｎｇ）］、ｘチジウム
ブロミドで着色し、そして長波長のＵＶ光のもとで切断
した。スライスを透析袋の中に入れ、０．５ＸＥ緩衝掖
を充填しく容量比、緩衝液ニゲルのスライス、１．５：
１）そして緩衝液でよく囲まなくてはならない。気泡を
含まないシールした袋を、０．５ＸＥ緩衝液を充填した
電気泳動室内に入れた。電気泳動を２００Ｖで３０分間
実施し、次いでＴＬ流の極性を３０秒間逆転して、ＤＮ
Ａを透析袋から解放した。ゲルのスライスを取囲む緩衝
液を注意して除去し、モしてＤＥＡＥセルロースまたは
ＤＥ５２カラムでさらに精製した（上を参照）。

ＤＮＡの標準の脱ホスホリル化 完全に消化しかつ精製したＤＮＡを水中に溶解し、モし
てＩＸＣＩＰ−緩衝液に調節した（標準の合計体積４８
ＪＬｌ）。１ル１　（２０単位）の子牛間ホスファター
ゼ（ｃＩ　Ｐ）の添加により３７℃において反応を開始
し、３０分後再びＩｇｌのＣＩＰを添加した。１時間後
、５．１の５０ミリモルのＥＧＴＡを添加することによ
り反応を停止させ、そしてインキュベーションを６５℃
で１０分間実施した。ブラ）（ｂｌｕｎｔ）末端または
リセスド（ｒｅｃｅｓｓｅｄ）５’末端をもつＤＮＡの
脱ホスホリル化のため、反復インキュベーションを、そ
れぞれ、３７℃で１５分間および５６℃で１５分間実施
した。ＤＮＡをフェノール／セバグで抽出し、そしてエ
タノールで沈澱させた。

オートラジオグラフィー フィルム：　ＡＧＦＡ−ゲベルト、ＣｕｒｉｘＲＰ　　
１．１００ＡＦＷ、コダック　ＸＡＲ５，１６５１５１
２Ｘ線現像剤、ＡＧＦＡＧ１５２、コダック　ＬＸ２４
　　Ｘ線定着液；ＡＧＦＡ　　Ｇ３５３．コダック　Ａ
Ｌ４゜標準の形質転換手順 形質転換は、Ｄ、ハナハン（Ｈａ　ｎ　ａ　ｈ　ａ）［
１９８３、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー（Ｊ、　　Ｍａｔ、　　Ｂｉｏ１、）１６６．５５
７−５８０］の手順を使用して実施した。

２０ｍ１の単一のコロニーを接種しそしてカッパ１７７
６培地中で生長させた（３７℃、２００ｕｐｍのシュイ
カー）の宿主株の１　ｍ　ｌを添加して、１００ｍ１の
予備加温した（３７）カッパ１７７６を接種した。

この培養物を同一条件下で培養した。細胞の生長を０．
２　０Ｄ　　５００ｎｍで停止させた。４℃に冷却し、
そして遠心した後、細胞沈殿を２０ｍ１水冷形質転換緩
衝液中に再懸濁させ、モして０℃で５分間インキュベー
ションした。この懸濁液を再び遠心しく３０００ｒｐｍ
、４℃、１５分）そして４ｍｌの水冷形質転換緩衝液中
に再懸濁させた。フルｌのＤＭＳＯを２００鉢ｌに添加
した後、細胞のアリコートを氷冷水中で１５〜６０分間
さらにインキュベーションした。拮抗（ｃｏｍｐｅｔｅ
ｎｔ）細胞のこのようなアリコートに、２０．１のＴＥ
中に溶解したＤＮＡを添加し、この混合物を氷水中で２
０分間および４２℃で３分間インキュベーションし、１
ｍｌの予備加温した（３７℃）カッパ１７７６培地をこ
のようなアリコートで接種し、そして３７℃において１
時間培養した。形質転換体を平板培養（ｐｌａｔｉｎｇ
）するため、細胞を遠心しく３０００ｒｐｍ、１５分、
４℃）、ＹＴ培地中に再懸濁させ。

そして指示ペトリ皿上で平板培養した。形質転換体の期
待する数に従い、ある量の懸濁液を平板培養に使用した
。

標準の急速分析プラスミド分離 この手順はバーポイム（Ｂ　ｉ　ｒ　ｎ　ｂ　ｏ　ｉ　
ｍ）およびドリイ（Ｄｏ　ｌｙ）、１９７９　（参照、
また、Ｔ、マニアチスら、１９８２）からの方法の修正
である。分析すべき各形質転換体から、２ｍｌの一夜の
培養物を調製し［木製ようじ（ｗｏ。

ｃｉｅｎ　　ｔｏｏｔｈ　　ｐｉｃｋ）、３７℃、１６
時間、回転車］、−夜の培養物の１．５ｍｌを１分間１
２０００ｇで遠心した（エツペンドルフ遠心ａ）、沈殿
物を２ｍｇのリゾチーム７１　ｍ　ｌのりゾチームミッ
クスの新しく調製した溶液中に再溶解し、次いで２０℃
で５分間インキュベーションした。１％のＳＤＳを含有
する新しぐ調製した水冷０．２モルのＮａＯＨの添加後
、試料を氷上で５分間インキュベーションした。染色体
ＤＮＡおよび蛋白質の沈殿のため、１５０．１の水冷酢
酸カリウムｐＨ４，５を添加した。お℃で５分間インキ
ュベーションしかつ１０分間１２０００　ｇで遠心した
後、プラスミド含有上澄みを新しい管に移し、そしてク
ロロホルム／インアミルアルコール（２４二１）で抽出
した。５００．１のインプロパツールを水相に添加した
。混合物を一２０℃で３０分間インキュベーションした
。遠心（ｉｏ分、１２０００ｇ）後、沈殿を８０％のエ
タノールで洗浄し、そして簡単に真空乾燥した。

この物質はゲル電気泳動による５〜６の異なる制限分析
のために十分であった。

ゴヌクレオチドの標準の精製 オリゴヌクレオチド（約２０　００　２６０ｎｍ）を緩
衝化ホルムアミド（０，１モルのＴＢＥ）中に溶解し、
そして７モルの尿素、２０％のポリアクリルアミドゲル
で電気泳動的に分離した［マクサム（Ｍａｘａｍ）およ
びギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）、酵素学における方法
（Ｍｅｔｈ、　　Ｅｎｚｙｍｏ１、）、６５．５００−
５６０．１９８０１゜ゲルをフルオレセイン化した薄い
層状板に置き、そしてＤＮＡをＵＶ光で可視化した。ポ
リアクリルアミドゲルの電気泳動後、分離および精製を
ＤＮＡの分離の標準の基本的方法について概説したよう
に実施した（上を参照）。

この手順の品質は、ガンマ３２Ｐ　　ＡＴＰおよびポリ
アクリルアミドゲルの電気泳動で分析的５゜ホスホリル
化により日常的に検査した。

バクテリア中で大量に合成された多数の蛋白質は不溶性
の形態で蓄積する［Ｄ　、　Ｃ、ウィリアムス（Ｗｉ　
１１　ｉ　ａｍｓ）、Ｒ，Ｍ、パン・フランク（Ｖａｎ
　　Ｆｒａｎｋ）、Ｊ、Ｂ、バーネッ）　（Ｂｕｒｎｅ
ｔ　ｔ）、Ｗ、Ｌ、ムス（Ｍｕｔｈ）、１９８２、サイ
エンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）且１１，６８７］、これらの
不溶性蛋白質を包含物体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　　ｂｏ
ｄｉｅｓ）と呼ばれる。これらは通常変性剤（ｄｅｎａ
ｔｕｒａｎｔｓ）でのみ可溶化でき、それゆえ他の細胞
蛋白質から容易に精製することができるであろう。

Ｅ、ｃｏ１、　　ＲＲＩΔＭ１５（ＡＴＣＣ３５１０２
）をプラスミドｐＲｋ４８．１．１で形質転換した。ｐ
Ｒｋ４８．１．１は、Ｅ、ｃ。

１、のプロモーター、オペレーターおよびリポソーム結
合部位より下流のＧｌｕ−５２−７ブロチニンβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子を暗号化する。１５−ＧＩＵ−５２
−アプロチニンβ−ガラクトシダーゼ融合蛋白質の最大
の蓄積は、合計の細胞蛋白質の２０％であった。包含は
、−般に、極性（ｐｏｌａｒ）領域またはサブ極性（ｓ
ｕｂ−ｐｏｌａｒ）領域に曲在荷し、１つの包含を有す
る正常の長さの細胞は各極性（ｐ　ｏ　１　ｅ）付近に
存在する。

Ｅ、ｃｏ１、　　ＲＲＩΔＭ１５の一夜の培養物を遠心
し、次いで沈殿物を破壊的（ｂｒｅａｋｉｎｇ）緩衝液
中に再懸濁した。ａ音波処理後、包含物体を回収するた
め細胞リゼイトを遠心した。

包含物体を２モルののグアニジン塩酸塩で洗浄した。精
製工程はラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）［Ｕ　、　Ｋ　、
ラエムリ、１９７０、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２
７７．６８０−６８６）に従うＳＯ３−ポリアクリルア
ミドの電気泳動により検査した。第８図。

完全なＬｙｓ−１５−Ｇｌｕ−アプロチニンを回収する
ため、包含物体を可溶化し、臭化シアンで切断し、そし
て折たたまれないＧｌｕ−５２−アプロチニンを折たた
まなくてはならなかった。

包含物体を、十分な量のＤＴＴを含有する６モルののグ
アニジン塩酸塩中に可溶化することができた。非可溶化
部分を分離するため、融合蛋白質をｌθミリモルのメル
カプトエタノールを含有する水に対して透析することに
って沈殿させる。この湿った融合蛋白質を７０％のギ酸
中に溶解し、そして臭化シアンで切断した［Ｅ、グロス
（Ｇｒｏｓｓ）、Ｂ、ウィトコツプ（Ｗｉｔｋｏｐ）、
１９６１、アメリカン・ケミカル・ソサイアティ（Ａｍ
ｅｒ、　　Ｃｈｅｍ、　　Ｓｏｃ、）８３．１５１０−
１５１１］。

Ｇｌｕ−５２−アプロチニンをβ−ガラクトシダーゼの
臭化シアン断片からイオン交換クロマトグラフィーによ
って分離し、そして同時に再び折たたんだ［Ｔ、Ｅ、レ
イグトン（ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ）、プロシーデインゲス
・オブ・ジェネックスーＵＣＬＡ−シンポジウム（Ｐｒ
ｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　　ｏｆ　　Ｇｅｎｅｘ−ＵＣＬＡ
　　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）１９８５、キングストーンズ
；ブレス］　（第９図）、活性阻害剤はウェスタンプロ
ット分析により検出できた（第１０図）。

活性分画を蒸発により濃縮し、次いで０．１モルののＮ
Ｈ４ＨＣＯ３に対して透析した。凍結乾燥後、阻害剤を
高純度のＲＰ−１８カラムのＨＰＬＣにより、緩衝液Ａ
中の０．１％のＴＦＡおよび緩衝液Ｂ中の０．１％のＴ
ＦＡ６０％のＣＨ３ＣＮを使用して精製した。

活性分画をプールし、そして阻害剤をヘライック（Ｈｅ
ｗｉ　ｃｋ）［Ｒ，Ｍ、ヘラ４−／り（Ｈｅｗｉ　ｃｋ
）、Ｍ、Ｗ、７７カビラー（Ｈｕ　ｎ　ｋ　ａｐｉ　１
１ｅｒ）、Ｌ、Ｅ、７−ド（Ｈｏ　ｏ　ｄ）、Ｗ、１．
ドレイアー（Ｄｒｅｙｅｒ）、１９８１、ジャーナル・
オブψバイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　　Ｂｉｏ
１、　　Ｃｈｅｍ、）２５６．７９９０−７９９７１に
従う気相シークエンサー（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）でマイ
クロシーフェンシング（ｍｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎ
ｇ）することによって特徴づけた。Ｎ−末端から最初の
２０残基は期待する阻害剤と同一である（表２）、アミ
ノ酸分析は、阻害剤が期待するアミノ酸組成を有するこ
とを立証する（表１）。

アプロチニンおよびＧｌｕ−５２−アプロチニンのトリ
プシン阻害活性の比較は同一の応答曲線を示す（第１１
図）。

これらの実験のすべてが示すように、Ｇｌｕ−５２−ア
プロチニンをＥ、ｃｏ１、中で融合蛋白質として生産し
、そして変性条件下の切断および分離後にそれを単離す
ることが可能である。

Ｖａｌ−１５−Ｇｌｕ−５２−アプロチニンはＧｌｕ−
５２−アプロチニンについて説明したのと同様な方法で
β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質から調製できる（第１
１図、第１３図）、阻害活性をエラスターゼ阻害アッセ
イによって測定した。

阻害剤はアミノ酸分析およびＮ−末端シーフェンシング
によって特徴づけた（表１および表２）。

アプロチニンのすべての他の誘導体は、Ｇｌｕ−５２−
アプロチニンおよびＶａｌ−１５−Ｇｌｕ−５２−アプ
ロチニンについて説明し左のと同様な方法で調製できる
であろう。

９１　：Ｇｌｕ−５２−７プロチニンおよびＶａｌ−１
５−１１：１ｕ−５２−アプロチニンのアミノ酸分析 ミ゛ロニンＧｌｕ−５２Ｖａｌ−１５−Ｇｌｕ−５２＾
ｓｐ　　　　４，７５（５）　　　　４．９２（５）　
　　　５．１０（５）１’ｈｒ　　　　２，９０（３）
　　　　２．９１（３）　　　　２．８５（３）Ｓｅｒ
　　　　Ｏ，９Ｂ（１）　　　　１．０１（１）　　　
　０．９５（１）Ｇｌｕ　　　　２，９０（３）　　　
　４．３０（４）　　　　４．３０（４）にＩｙ　　　
　５，９２（６）　　　　５，９１（８）　　　　６，
３０（６）Ａｌａ　　　　６，００（６）　　　　６，
００（６）　　　　ｔｉ、００（６）Ｖａｔ　　　　１
．０４（１）　　　　１．０２（１）　　　　２．０６
（２）Ｍｅｔ　　　　Ｏ，９５（１）　　　　−１１ｅ
　　　　１，２９（２）　　　　１．３０（２）　　　
　１．３５（２）Ｌｃｕ　　　　２．１０（２）　　　
　２，０ｆ（２）　　　　２．（）１（２）Ｔｙｒ　　
　　３，９２（４）　　　　３．７０（４）　　　　３
．８１（４）Ｐｈｒ　　　　３，８８（４）　　　　４
．０８（４）　　　　４．０５（４）Ｌｙｓ　　　　３
，９９（４）　　　　３．８０（４）　　　　３．１０
（３）Ａｒｇ　　　　５，８２（６）　　　　５−７５
（６）　　　　６ｙＯＯ（６）アミノ酸はｏ−７タルア
ルデヒドを使用するカラム誘導化後に測定した。

ＣｙｓおよびＰｒｏは決定しなかった。

表２：　　Ｇｌｕ−５２−アプロチニンおよびＶａｌ−
１５−Ｇｌｕ−５２−アプロチ ニンのアミノ酸シークエンシング（Ｎ −末端） １、Ｇｌｕ−５２−アプロチニン；約１ｎモルのの配列
を２０サイクルにわたってシーフェンシングした： Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇ
ｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒ
ｏ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａ１ｇ−Ｉ　１ｅ−Ｉ　
１　ｅ−Ａｒｇ　−２、Ｖａｌ−１５−Ｇｌｕ−５２−
アプロチニン；約１ｎモルのの配列を２０サイクルにわ
たってシーフェンシングした： Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓ　ｐ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ　−Ｇｌｙ−
Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＡＩｇ−Ｉ　　１ｅ
−Ｉ　　ｌｅ−Ａｒｇ　−アプロチニン／Ｇｌｕ−５２
−アプロチニンの鵠 ＢｒＣＮ−ｃ切断後に得られたＧｌｕ−５２−アプロチ
ニンを、真正のアプロチニンと、ブタトリプシンに対し
てする阻害活性について比較した。

両方の基質Ｐｙｒｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡおよ
びベンゾイル−Ａｒｇ−ｐＮＡをトリプシンの決定に使
用した。

アプロチニンの原溶液はｉ　ｐ−ｇ　／　ｍ　１であり
、そしてＧｌｕ−５２−アプロチニン０．６牌ｇ／ｍｌ
について、０−１００−２００−３００−４００−５０
０ＪＪ、１のこの原溶液をベンゾイル−Ａｒｇ−ｐＮＡ
を使用する試験に使用した。Ｐｙｒｇ　１　ｕ−Ｇ　Ｉ
　Ｖ−Ａ　ｒ　ｇ　−ｐＮＡを使用する試験において、
０−３−６−９−１２−１５ＪＬｌを使用した。結果を
表３に要約する。

紋： これらの結果が示すように、アプロチニンおよびＧｌｕ
−５２−アプロチニンは、両者のトリプシン阻害アッセ
イにおいて、同一の投与−応答曲線を示す。このことは
Ｇｌｕ−５２−アプロチニンが実際に１００％の活性分
子を含有することのみならず、かつまたトリプシン−阻
害剤複合体が同一桁数で存在することを立証する。

ウェスタンプロット ウェスタンプロットは、トウビン（Ｔｏｗｂｉｎ）が記
載するようにして実施する［Ｈ，トウビｙ　（Ｔｏｗｂ
　ｉ　ｎ）、Ｔ、　ステへリン（Ｓｔａｅｈｅｌｉｎ）
、１．ゴートン（Ｇｏｒｄｏｎ）、１９７９、プロシー
デインゲス・オブ・ナショナル令アカデミー壱オブｅサ
イエンシズ（Ｐｒ。

ｃ、　　Ｎａｔ　１．　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、）Ｕ
ＳＡ、７６．４３５０−４３５４］　、ニトロセルロー
スのプロットを、第１抗体としてウサギポリクローナル
抗アプロチニン抗体および第２抗体といしてビオチニル
化ロバ抗ウサギ抗体を使用してブロービング（ｐｒｏｂ
ｉｎｇ）した。免疫複合体の検出は、供給業者のマニュ
アル（ＡＭＥ　ＲＳＨＡＭ　　ＢＵＣＨＬＥＲ，Ｂｒａ
ｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）に記載されるように基質として、
４−クロロー−１−ナフトールと複合化したストレプト
アビジン−ビオチニル化ワサビペルオキシダーゼを使用
して実施した。

エリザ（ＥＬＩＳＡ） 酵素酵素結合免疫収着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、ミュ
ラー−エステル（Ｍｕｌ　１ｅｒ−Ｅｓｔｅｒｌ）が記
載するようにマイクロタイター抗体プレートを使用す−
る拮抗的（ｃｏｍｐｅｔ　ｉｔ　１ｖｅ）モードで実施
した［Ｗ、ミュラー−エステル（Ｍｕｌ　１ｅｒ−Ｅｓ
ｔｅｒｌ）、Ａ、オニトル（Ｏｅ　ｔ　ｔ　１）　、　
Ｅ　、　ツにシｘイト（Ｔｒｕｓｃｈｅｉｔ）、Ｈ，７
リツツ（Ｆｒｉｔｚ）、フレセニウス（Ｆｒｅｓｅｎｉ
ｕｓ）、Ｚ、　　Ａｎａ１、　　Ｃｈｅｍ、）（１９８
４）３１７．７１８−７１９］。

アミノ酸配列の決定 約０．５〜２ナノモルの蛋白質を３０ｇ１のＴＦＡ中に
可溶化した。３ｍｇのポリブレンで予備処理したガラス
繊維のフィルターに試料を適用した。配列の分析は、ア
プライドーバイオシステムス（ＡＰＰＬＩＥＤ　　ＢＩ
Ｏ３ＹＳＴＥＭＳ）［インコーホレーテッド（Ｉｎｃ、
、）、米国］からの気相蛋白質シークエンサーにより、
ヘライック（Ｈｅｗｉｃｋ）［Ｒ，Ｍ、ヘラ４−／り（
Ｈｅｗｉｃｋ）、Ｍ、Ｗ、７ンカピラー（Ｈｕｎｋａｐ
ｉｌｌｅｒ）、Ｌ、Ｅ、７−ド（）（ｏｏｄ）。

Ｗ、１．ドレイア−（Ｄｒｅｙｅｒ）、１９８１、ジャ
ーナル・オブＯバイオロジカル・ケミスト　リ　−　（
Ｊ、　　　　Ｂｉｏ１、　　　　Ｃｈｅｍ、）　　　２
５６．７９９０−７９９７］に従い実施した。段階的に
遊離したアミノ酸フェニルチオ永和誘導体を、シアノ−
ＨＰＬＣカラム（デュポン）およびペイレウサー（Ｂｅ
ｙｒｅｕｔｈｅｒ）が記載する分離システムを使用して
分析した［Ｋ、ペイレウサ−（Ｂｅｙｒｅｕｔ　ｈｅｒ
）、Ｂ、ビースラー（Ｂｉｅｓｌｅｒ）、Ｊ、ポウエン
ス（Ｂ。

ｗｅｎｓ）、Ｒ，ディウドロップ（Ｄｉｌｄｒ。

ｐ）、に、ネウフ−１−（Ｎｅｕｆｅｒ）、に、スチュ
バー（Ｓｔｕｂｅｒ）、Ｓ、ザイス（ｚａｉｓ）、Ｒ，
ニーリング（Ｅｈｒｉｎｇ）、Ｐ、ゼイベル（Ｚａｂｅ
ｌ）１９８３、蛋白質化学における現代的方法（Ｍｄｅ
ｒｎ　　Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　　Ｐｒｏｔｅｉｎ　　ｃ
ｈｅＩｎ″１ｓｔｒｙ）、３０３−３２５ページ、ワル
ターΦデ・グルイタ−・アンド畳カンパニー、ベルリン
］。Ｍ５１０　ポンプ、ＷＩＳＰ　　７１０Ｇ　　オー
トインジェクター、ＬＣ−スペクトロフォトメーターＭ
　　４８１およびＳＨＩＭＡＤＺＵ　　積分装置Ｃ−Ｒ
３Ａを含む、ＷＡＴＥＲ３ＨＰＩ、Ｃシステムを使用し
た。

酸加水分解およびアミノ酸分析 約１マイクロモルの蛋白質をパイレックス管に入れ、こ
れに０．０５％の２−メルカプトエタノールを含有する
ｚｏｏ、ｔの６モルのＨＣＩの一定に沸臆するＨＣＩを
添加した［１．ＡＴ。

ボッツ（Ｐｏｔｔｓ）Ｊｒ、１９６０、アナリティカル
ーパイオケミストリー（Ａｎａ１、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ
、）１３１．１−１５］、管を真空中でシールし、そし
て１１０℃で２２時間インキュベーションした。加水分
解物を急速に乾燥し、１５０，１の０．２モルののクエ
ン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ２，２中に再溶解し、そして
濾過した。アミノ酸分析は、蛍光検出機およびＳＩＭＡ
ＤＺＵ　　Ｃ−Ｒ２ＡＸｉ分器を装備するＢＩＯＴＲＯ
ＮＩＫ　　ＬＣ５０００で実施した。アミノ酸は、本質
的にベンソン（Ｂ　ｅ　ｎ　ｓ　ｏ　ｎ）が記載するよ
うにして０−フタルジアルデヒドと反応させた後、実施
した［Ｊ、Ｒ，ベンソン（Ｂｅｎｓｏｎ）、Ｐ、Ｅ、ヘ
アー（Ｈａ　ｒ　ｅ）、１９７５、プロシーデインゲス
・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ番すイエンシズ
（Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔ１、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ
、）ＵＳＡ　　７旦、６１９−６２２］。

標準白血球エラスターゼのアッセイ 社五 ヒト白血球エラスターゼをエラスティンΦプロダクツ・
カンパニー・インコーホレーテッド（Ｅｌａｓｔｉｎ　
　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　　Ｃｏ　ｍｐａｎｙ、Ｉｎｃ、、
米国ミシシッピー州パシ７　イー／り、６００６９、Ｐ
、Ｏ，Ｂｏｘ　　１　４７、］。

メトキシスクシニル−Ｌ−７ラニルーＬ−アラニル−Ｌ
−７’ロリルーＬ−バリン−Ｐ−ニトロアニリド−に、
ナカジ？　（Ｎａｋａ　Ｊ　ｉｍａ）。

Ｊ、Ｃ，パワーズ（Ｐｏｗｅ　ｒ　ｓ）　、　Ｍ、　Ｊ
　、カスチロ（ｃａｓｔ　ｉ　ｌ　ｌ　ｏ）、Ｂ、Ｍ、
アシュ（Ａｓｈｅ）およびＭ、ジンメルマン（Ｚｉｍｍ
ｅｒｍａｎｎ）、ジャーナル・オプΦバイオロジカル・
ケミストリー（Ｊ、　　Ｂｉｏ１、　　Ｃｈｅｍ、）、
２５４．４０２７　（１９７９）］を、Ｆａ、　ペイ’
ｚム（Ｂａｃｈｅｍ）、７！インケミカリエン・アクチ
ェンゲゼルシャフ）（Ｆｅｉｎｃｈｅｍｉｋａｉｌｅｎ
　　ＡＧ）、　　スイス国ＣＨ−４４１５ブデンドルフ
、ハウプトストル、１４４から入手した。

土工 ０．０５％のツイーン８０を含有する０、２モルのトリ
ス−緩衝液ＰＨ８，０および０．０５モルの塩化カルシ
ウムおよび阻害剤の溶液の混合物の５５０ｇ１に、１０
０ｍ１の５０％のエチレングリコール中に１ｍｇの酵素
を溶解して得られた溶液の５％ｌを添加した。この混合
物を室温で３０分間インキュベーションした０次いで、
１ｍｌのジメチルスルホキシド中の５９ｍｇのメトキシ
スクシニル−Ｌ−７ラニルーＬ−７ラニルーＬ−プロリ
ル−Ｌ−バリン−ｐ−ニトロアニリドおよび試験緩衝液
中の６．５ＪＬ１の混合物の１００７ｔｌを攪拌しなが
ら添加した。４０５における光学濃度の増加を記録した
：阻害剤含有試料および酵素対照の光学濃度の増加係数
に１００を駆けることによって、阻害率％を決定した。

トリフシンの阻害（アッセイ） 基質ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリ
ド（メルク　１６７０）またはピログルタミル−グリシ
ル−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド［商業的に入手回
部なピログルタミル−グリシン（ＳＥＮＮ　　６８８６
）およびアルギニン−ｐ−＝トロアニリドＸＨＢ　ｒ　
（ＳＥＮＮ　　９１２３）から、ジシクロへキシルカー
ポジイミド縮合によって合成された］によって、トリプ
シンの阻害を決定した。この基質は、また、ＫＡＢＩに
より、ウロキナーゼ基質として表示Ｓ−２４４４で収光
されている。

前者は試料中のアプロチニンの量に直線的に応答するが
、感度が低い、後者は高い感度をもつが、アプロチニン
−トリプシン複合体がそれらの低い濃度で溶解するため
、投与−応答曲線は直線ではない。

トリプシンおよびトリプシン阻害剤の測定のための緩衝
液は、０．０１モルのＣａＣｌ２および０．０５％のツ
イーンａｏｅを含有する０、２モルのトリス、ｐＨ８，
０である。

決定は４００ｎｍにおいて光学濃度（ＯＤ）の読みを可
能とする任意に分光光度計で実施できる。完全に自動化
された測定のため、分光光度計はマイクロコンピュータ
−を装備するか、あるいは適当なパーソナルコンピュー
ターにインターフェースで接続させなくてはならない。

使捨ての１ｃｍのセミマイクロプラスチッククベットを
すべてのアッセイのために使用する。ＯＤは１分の間隔
で８サイクルにわたって読む。１分あたりのＯＤの平均
の増加を活性単位として任意に取る。

阻害のアッセイのため、ブタトリスシン（メルク　８３
５０）溶液（０，００１ＮのＨＣ１１５０％のグリセロ
ール中）を阻害剤試料と混合し、緩衝液で１００ＪＬｌ
に調節し、そして室温で１０分間インキュベーションす
る。この反応を基質溶液の添加により開始させる。より
詳細な情報を下表に記載する。阻害活性は検量線から取
るか、あるいはこの目的のために特別に開発されたコン
ピュータープログラムによって自動的に計算する。

基質としてＰｙｒ　　基質としてベン ｇｌｕ−Ｇｌｙ−シイルーＡｒｇ Ａｒｇ−ｐＮＡを　−ｐＮＡを使用 使用するアッセイ　するアッセイ トリプシン　１５Ｊｊ、１　（ｌルｇ　　２０ル１（１
０／ｍｌ）　　　　　　　００ルｇ／ｍ ｌ） 基質　　　　５０ＪＬｌ（１０％　５０ＪＬ１　（１０
のエタノール中　％のＤＭＳＯ中 ０．０２モル）　　　　０．０２モル）この分野におい
て、形質転換に適当な多数の種々の微生物、すなわち、
培養または発行において生長できる単細胞の有機体、が
知られている。形質転換に好ましい有機体は、バクテリ
ア、酵母菌および菌類（ｆｕｎｇｉ）を包含する。

ここに開示する研究のために選択した特定の有機体は、
アメリカン・タイプΦカルチャー・コレクシボン（Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　Ｃｏ
１１ｅｃｔｉｏｎ）にＡＴＣＣＮｏ、３５１０２で受託
されているＥ、ｃｏｌ。

ＲＲ１ΔＭ１５であった。他の適当なＥ、ｃ。

１、を、また、使用できる。

本発明は、無毒の不活性の製薬学的に適当な賦形剤に加
えて、本発明による化合物の１種またはそれ以上を含有
するか、あるいは本発明の活性化合物の１種またはそれ
以上から成る製剤、およびこれらの製剤の製造法を包含
する。

本発明は、また、投与単位の形態の製剤を包含する。こ
れは、製剤が個々の部分の形態、例えば、錠剤、糖剤、
カプセル剤、ピル、坐薬およびアンプル剤の形態である
ことを意味し、その活性特質の含量は個々の投与量の数
分の１あるいは多数倍に相当する。投与単位は１例えば
、１．２．３または４倍の個々の投与量、あるいは個々
の投与量の１／２．１／３または１／４を含有すること
ができる８個々の投与量は、好ましくは、１回の投与で
与えられかつ通常１日量の全部、半分または３分の１ま
たは４分の１に相当する量の活性化合物を含有する。

無毒の不活性の製薬学的に適当な賦形剤とは。

すべての種類の固体、半固体または液体の希釈剤、充填
剤および配合助剤であると解釈すべきである。

錠剤、糖剤、カプセル剤、ピル、丸剤、坐薬、溶液、懸
濁液および乳濁液、泥膏、軟膏、ゲル、クリーム、ロー
ション、粉剤およびスプレーを好ましい製剤である。

錠剤、糖剤、カプセル剤および丸剤は、活性化合物の１
種またはそれ以上と、次の普通の賦形剤を含有できる＝
（ａ）充填剤および増量剤、例えば、でんぷん、ラクト
ース、グルコース、マンニトールおよびシリカ、（ｂ）
結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギ
ン酸塩、ゼラチンおよびポリビニルピロリドン、（ｃ）
保湿剤、例えば、寒天、炭酸カルシウムおよび重炭酸ナ
トリウム、（ｅ）溶解遅延剤、例えば、パラフィン、お
よび（ｆ）吸収促進剤、例えば、第四アンモニウム化合
物、（ｇ）湿潤剤、例えば、セチルアルコールまたはグ
リセリンモノステアレート、　　（ｈ）吸着剤、例えば
、カオリンおよびベントナイト、および（ｉ）潤滑剤、
例えば、タルク、ステアリン酸カルシウムおよびステア
リン酸マグネシウムおよび固体のポリエチレングリコー
ル、または（ａ）〜（ｉ）に記載した物質の混合物。

錠剤、糖剤、カプセル剤、ピルおよび丸剤は、普通の被
膜および外殻を含有することができ、これらは不透明剤
を含むことができ、そしてそれらは、活性化合物の１種
またはそれ以上のみを、あるいは好ましくは、腸管の特
定の部分において、可能ならば長時間にわたって、放出
するような組成物であることができ、使用可能な埋め込
み組成物の例はポリマー物質およびワックスである。

活性化合物の１種またはそれ以上は、賦形剤の１種また
はそれ以上と一緒に、マイクロカプセル化した形態にす
ることができる。

生薬は、活性化合物の１種またはそれ以上に加えて、普
通の水溶性または非水溶性の賦形剤、例えば、ポリエチ
レングリコール、脂肪、例えば、カカオ脂肪、高級エス
テル、（例えば、ＣＩ　４−アルコールとＣｌ６−脂肪
酸とのエステル）またはこれらの物質の混合物を含有す
ることができる。

軟膏、混合、クリームおよびゲルは、活性化合物の１種
またはそれ以上に加えて、普通の賦形剤、例えば、動物
性および植物性の脂肪、ワックス、パラフィン、デンプ
ン、トラガカント、セルソース誘導体、ポリエチレング
リコール、シリコーン、ベントナイト、シリカ、タルク
および酸化亜鉛またはこれらの混合物を含有することが
できる。

散剤および噴霧剤は、活性化合物の１．！！またはそれ
以上に加えて、普通の賦形剤、例えば、ラクトース、タ
ルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム
およびポリアミド粉末またはこれらの物質の混合物を含
有することができる。噴霧剤は、普通の噴射剤、例えば
、クロロフルオロ炭化水素をさらに含有することができ
る。

溶液および乳濁液は、活性化合物の１種またはそれ以上
に加えて、普通の賦形剤、例えば、溶媒、可溶化剤およ
び乳化剤１例えば、水、エチルアルコール、イソプロピ
ルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアル
コール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１
．３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油
、ことに綿実油、Ｍ花生油、トウモロコシ肝油、オリー
ブ油、ヒマシ油およびごま油、グリセリン、グリセリン
−ホルマール、テトラヒドロフルフ゛】ルアルコール、
ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エス
テル、またはこれらの混合物を含有することができる。

非経口的投与に対して、溶液および乳濁液は、血液等張
性の無菌の形態にすることができる。

懸濁液は、活性化合物の１種またはそれ以上に加えて、
普通の賦形剤、例えば、液状希釈剤、例えば、エチルア
ルコール、プロピレングリコール、懸濁剤、例えば、エ
トキシル化インステアリルアルコール、ポリオキシエチ
レンソルビトールエステルおよびソルビタエステル、微
結晶性セルロース、メタ水醸化アルミニウム、ベントナ
イト、寒天およびトラガカントまたはこれらに混合物を
含有することができる。

また、前述の配合形態は、染料、防腐剤、および芳香お
よび風味を改良する添加剤、例えば、ペパーミント油お
よびユーカリ油、および甘味剤、例えば、サッカリンを
含有することができる。

治療学的に活性な化合物は、好ましくは、前述の製剤中
に、全混合物の約０．１〜９９．５重量％、好ましくは
約０．５〜９５重量％の量で存在する。

また、前述の製剤は、本発明による化合物に加えて、他
の製薬学的に活性な化合物を含有することができる。

前述の製剤は、既知の方法に従い普通に、活性化合物の
１種またはそれ以上を賦形剤の１種またはそれ以上と混
合することによってつくられる。

活性化合物または製剤は、局所的、経口的、非経口的、
腹腔内および／または経直腸的に、好ましくは経口的ま
たは非経口的、例えば、静脈内または筋肉内に投与する
ことができる。

−般に、所望の結果を得るためには、活性化合物の１種
またはそれ以上を２４時間毎に約０．５〜約５００、好
ましくは５〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の合計量で、場合に
よっては数回に分けて投与することが、人間および獣の
医学において有利であることがわかった０個々の投薬物
は、好ましくは、活性化合物の１種またはそれ以上を約
１〜約２５０、ことに３〜６０ｍｇ／ｋｇ体重の量で含
有する。しかしながら、前述の投薬量からはずれなけれ
ばならないことがあり、特にそのことは処舒を受ける患
者の性質および体重、病気の性質および重さ、製剤の性
質および薬剤の投与方法、投与を行う時間または間隔に
依存する。

かくして、ある場合には、活性化合物は前述の量よりも
少量〒十分であり、−方他の場合には前記量を超えなけ
ればならない場合も起こる＋あろう。必要な特定の最適
な投与量および活性化合物の投与方法は、この分野に精
通するものにとっては、その専門知識に基づき容易に決
定することができる。

発現プラスミドｐＲｋ４９．２．１およびｐＲｋ４８．
１．１で形質転換したＥ、ｃｏ１、は、トイチエ・ザン
ムルングｅフォン・ミクロオルガニスメン（Ｄｅｕｔｓ
ｃｈｅ　　Ｓａｍｍｌｕｎｇｖｏｎ　　Ｍｉｋｒｏｏｒ
ｇａｎｉｓｍｅｎ、Ｇｒｉｓｅｂａｃｈｓｔｒ、８．Ｄ
−３４００ＧＩｊｔｔｉｎｇｅｎ）に受託番号ＤＳＭ　
　３６７８およびＤＳＭ　　３６７９で受託された。

衷廊勇 実施例１ 遺伝子を含むオリゴヌクレオチドを固相合成法により調
製した。オリゴマーの合成法は概説した通りであり、そ
してブトロン活性化され、保護された２°−デオキシリ
ボヌクレオチドホスホルアミダイトを利用した。すべて
の順次に工程は、アプライド拳バイオシステムス３８０
型ＤＮＡ合成装置で自動化された方法において、この製
造業者から入手した保護されたヌクレオチド、溶媒、お
よび化学物質および試薬を使用して実施した。同様に同
じ製造業者から入手した固相支持体は調節された孔のガ
ラスであり、これに出発３゛−ヌクレオチドはすでに付
着されていた。製造業者の操作指導書および使用者の社
報に従う自動化された反応サイクルに、ある種の変更を
導入した。合成が完結したとき、製造業者の推奨に従い
ＤＮＡ合成装置内で、オリゴマーを脱保護しそして固体
の支持体から切離した。

密封したバイアル中でオリゴマーを含有する水溶液を濃
水酸化アンモニウムとともに５５℃に４〜２４時間過熱
することによって、保護基の除去を完結した。得られる
溶液を蒸発させ、残留物を０．０１モルのｆｆｉ炭酸）
リエチルアンモニウム緩衝液、ｐＨ７，０（ＴＥＡＢ緩
衝液）中に溶解した。この溶液をセファデックス（Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘ）−Ｇ５０・ゲルの濾過樹脂のクロマトグ
ラフィーにかけた。このカラムを同一のＴＥＡＢ、１衝
液中で調製し、そして同一緩衝液で溶離した。

空隙体積で溶離する物質をプールし、そして溶液を蒸発
させた。

残留物の一部（２６０ｎｍにおける吸収単位の１０〜４
０％）を装入用緩衝液（組成：０．１％のブロモフェノ
ールブルー、０．１％のキシレンシアツール、１０ミリ
モルのＥＤＴＡニナトリウム、ホルムアミド中）をポリ
アクリルアミドゲルの電気泳動によりさらに精製した。

このゲルの大きさは１８Ｘ３２ｃｍであり、厚さは１．
５ｍｍであった。この方法において精製された各オリゴ
マーのためのウェル（ｗｅ　ｌ　１）の大きさは幅が２
〜５ｃｍであり、そして５オリゴマーまでを単一のゲル
で精製した。ゲル中のアクリルアミドの濃度は、所望生
成物の鎖の長さに依存して１４〜２０％であった。より
長いオリゴマーのため、１４％のアクリルアミドゲルを
調製し、これに対してより短いオリゴマーは２０％まで
のアクリルアミドゲルで精製した。ゲルは、また、７モ
ルの尿素およびトリス−ホウ酸塩−ＥＤＴＡ緩衝液（０
，１モルのトリス、０．１モルのホウ酸塩、２ミリモル
のＥＤＴＡ、ｐＨ８，３）を含有した。展開用緩衝液は
同一のトリス−ホウ酸塩−ＥＤＴＡ混合物であった。電
気泳動は２０〜６０ワツトの一定電力で１８〜６時間実
施した。このような、禦準の技術はアプライド・バイオ
システムスから入手でさる種々の使用者の情報の会報か
ら得られる。

電気泳動の完結後、ゲルをプラスチックラップに包み、
そしてオリゴマーをＵＶ光のシャドウィング（ｓｈａｄ
ｏｗｉ　ｎｇ）により可視化した。

このシャドウィングは次のようにして実施した。

包装したゲルを蛍光性の薄い層状クロマトグラフィー用
板上に配置し、そしてゲルを短波長の紫外線源で見た。

所望の生成物は最も遅く移動する主要ブルーのＤＮＡ断
片として、このシャドウィング技術によって現われる。

所望の帯をゲルから切除した。ＤＮＡオリゴマーを、エ
ピゲン（ＥｐｉＧｅｎｅ）Ｄ−ゲル（Ｇｅｌ＠）電気泳
動装置を使用して、ゲルのスライスから粉末状ジエチル
アミノエチル（Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ）セルロース上に溶離し
た。オリゴマーをセルロースから１モルのＴＥＡｖ！ｌ
衝液で溶離した。オリゴマーを含有する緩衝液を蒸発さ
せ、残留物を０．００１モルのＴＥＡＢ緩衝液中に溶解
し１次いで前述のように七ファデックス−Ｇ　　５０・
のカラムに通過させて脱塩した。空隙体積中にれする物
質をプールし、そして凍結乾燥して最終生成物を得た。

上に概説した手順を使用して、精製されたオリゴマーの
各々の約０．５〜５．０Ａ２６０単位を得た。

実施例２ これらの特定の合成アプロチニン遺伝子の構成は、１５
の精製したオリゴヌクレオチドのアセンブリーを包含す
る（第１４図参照）、第３図に示すＤＮＡ配列は、開始
コドンＡＴＧ、２つの終末コドン、ＴＡＧおよびＴＡＡ
、末端制限部位Ｅｃｏ　　ＲＩおよびＨｉｎｄ　　ＩＩ
ＩおよびＢａｍＨＩおよび内部の制限部位を含む、これ
らの部位の選択は、解読配列のクローニングおよびその
修飾を促進した。

この合成遺伝子の発生に使用した構成は、断片のほかに
、材料および方法にいおいて詳述したポリヌクレオチド
キナーゼ、Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼおよび制限酵素を使
用した。

１５の精製したオリゴヌクレオチド断片を、５０ミリモ
ルのＴＥＡＢＣ（ｍ炭酸トリエチルカンモニウム緩衝液
、ｐＨ７，５）中に最終濃度１０ピロモル／ｅｌで溶解
した。すべての断片のホスホリル化は４つの別々の部分
（断片（Ｆｒａｇ、）１．３；断片２．４．６；断片５
．７．９．１１．１３；断片８．１Ｏ１１２，１４，１
６）において実施した。調製の目的で、各々の断片の８
０ピコモルを、それぞれ、ＩＸＰＮＫミックス、２ルモ
ルのＡＴＰ、０．１ルＣｉの３２Ｐ　ガンマＡＴＰ７１
０ピコモルの断片、ｌＯ単位のＰＮＫ／ピコモルの断片
の混合物中に溶解して、合計の体積が断片１、３につい
て３００ｐ１、断片２．４．６について４００ＪＬ１、
断片５．７．９，１１．１３について７００ＪＬｌおよ
び断片８．１０．１２．１４．１６について７００ｐｌ
であるようにした。各部分の反応は３７℃で３０分間実
施した。すべての部分をフェノール化し、エタノール沈
殿し、洗浄し、そして乾燥した。

交雑の目的で、断片１、３および断片２．４．６（ブロ
ックＡ）を１×リガーゼミツクス中に溶解しかつ混合し
、合計の体積を１２０ＪＬ１とし、７０℃で５分間イン
キュベーションし、室温に５時間以内に冷却した。他の
断片（ブロックＢ）を同一手順に従って２４０．１中で
交雑した。

結合の目的で、ブロックＡの溶液に１２ＪＬｌの１０ミ
リモルのＡＴＰ、１２ルｌの１００ミリモルのＤＴＥ、
２０ルＩＴＡ−ＤＮＡリガーゼを供給し、そしてブロッ
クＢの溶液に２倍量を供給した０反応は１４℃で７時間
実施した。１ＯＩＬｌのＴ４　　ＤＮＡリガーゼをブロ
ックＡに添加し、そしてブロックＢに２０１Ｌ１を添加
し、再び１４℃で４５分間インキュベーションした。こ
の混合物をフェノール化し、エタノール沈殿し、そして
乾燥した。

得られたブロックＡを９０．１のｌＸ５Ｐ−１００およ
び１０ＪＪ、１（７）ＥＣＯＲＩ　（１０ｇｌ／ル１）
中に溶解し、ブロックＢを９０，１のｌＸ５ｒ−５０お
よび１０ｐｌｃ７）Ｂａｍ　ＨＩ中に溶解し、そして３
７℃で１時間インキュベーションした。この反応をフェ
ノール抽出により停止し、そしてエタノール沈殿、６％
のポリアクリルアミドゲルの電気泳動を実施し、そして
ＤＮＡブロックを前述の同一手段に従い回収した。

棟梁の放射線標識したブロックＡおよびブロックＢを水
中に溶解し、ＩＸリガーゼミックスに調節し、そしての
最終の結合に関して前述したように合成遺伝子へ交雑さ
せた。その後、３１ＬｌのｌＯミリモルのＡＴＰ、３ル
ｌの１００ミリモルのＤＴＥ、３終ｌのＴ４　　ＤＮＡ
リガーゼを２２ルｌの交雑混合物に添加し、そして４℃
で７時間インキユベーシゴンした。再ヒ、１ルｌのＴ４
　　物質データリガーゼをＰ添加し、そしてこの反応１
４℃で４５分間実施した。結合生成物をフェノール抽出
およびエタノール沈殿により精製した。５Ｐ−５０中で
標準の制限酵素の消化（Ｂａｍ　　ＨＩ　　１．５ＪＬ
１．Ｅｃｏ　　Ｒ１１，５ルｌの二重消化）を実施した
。この物質をフェノール沈殿させ、そしてエタノール沈
殿前に、水溶液を３ミリモルのＭｇＣ１２０，３モルの
酢酸ナトリウムに調節した０次いで、６％のポリアクリ
ルアミドゲルの電気泳動を実施し、そして遺伝子を前述
と同一の手順に従い回収した。

実施例３ 実験的アプロチニンクローニングのために選択したプラ
スミドはＰＵＣ８［Ｊ、ビエラ（Ｖｉｅｒａ）およびＪ
、メッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）、１９８２、遺伝子（
Ｇｅｎｅ）、１９．２５９】であった、このクローニン
グベクターはｐＢＲ３２２０導アンピシリンリガーゼ遺
伝子と、１列の独特制限酵素制限部位を含有する１ａｃ
Ｚ　　遺伝子の一部に結合したＤＮＡ複製起源とから成
る。このベクターが１ａｃ−Ｅ、ｃ。

！、中に導入されるとき、形質転換は適当な指示ペトリ
皿上にブルーのコロニーを生成する。ＤＮＡ断片を多数
の制限部位のいずれか、例えば、Ｅｃｏ　　ＲＩとＢａ
ｍ　　ＨＩとの間にクローニングすると、ｌａｃ遺伝子
は不活性化されて白色のコロニーが生成する。

ベクターの調製 合成アプロチニンマスター遺伝子をｐＵＣａ中に結合す
るため、精製的ベクターの調製を実施した。精製された
ｐＵＣ８ＤＮＡ（約３０ピコモル）を、標準の制限エン
ドヌクレアーゼの消化の条件下に、Ｅｃｏ　　ＲＩおよ
びＢａｎ　　ＨＩで２回消化して、小さい内部のＥｃｏ
ＲＩ−Ｂａｍ　　ＨＩ断片を切断した。この調製物を、
鉛樹津のように、子牛賜ホスファターゼで脱ホスホリル
化し、アガロースゲルの電気泳動により分離し、そして
このベクターの大きいＥｃｏＲＩ−Ｂａｍ　　ＨＩ断片
を精製した（標準の条件）、この手順はこのベクターを
使用するそれ以上の研究を著しく促進する。なぜなら、
　　Ｅｃｏ　　ＲＩおよびＢａｍＨＩの末端におけるに
ベクター分子の事故結合は排除され、そして形質転換体
のバックグラウンドは劇的に減少するからである。

級令 ｐＲｋ　　６３の構成（第４図参照）を合計量の精製し
て合成アプロチニン遺伝子を１ピコモルのベクターと結
合することによって実施した（１゜４単位のＴ４−ＤＮ
Ａ−リガーゼ、１×リガーゼミツクス、合計の体９４５
ＪＬ１、１４℃において７時間のインキュベーション、
１単位の７４−ＤＮＡ−リガーゼの添加および１４℃に
おける４５分間の再インキュベーション）。

形質転換 り、ハナハン（Ｈａ　ｎ　ａ　ｈ　ａ　ｎ）からの反応
転換の手順（詳細は形質転換の手順参照）を用いて、Ｅ
、ｃｏ　１　、　　ＲＲＩΔＭ１５　［Ａ、カルニンス
（Ｋａｌｎｉｎｓ）ら（１９８３）、ＥＭＢＯジャーナ
ル　２．５９３．ＡＴＣＣ３５１０２］を受容体細胞と
して使用した。２００ｇｇ／ｍｌのアンピシリンを含有
する指示ペトリ皿上で結合物質の５０％で形質転換後１
，１５の「白色」形質転換体が得られた。バーンポイム
（Ｂｉｒｎｂ　ｉ　ｍ）およびドリー（Ｄｏ　１ｙ）１
９７９（７）急速分析用プラスミドの分離法（上を参照
）の修正法を使用して、すべての１５の形質転換体をス
クリーニングした。その後、１５の試料のペレットをｌ
ＪＬｇのＲナーゼを含有する３０ＬｌのｌＸ５Ｐ−１０
０中の再溶解した。Ｅｃｏ　　ＲＩおよびＢａｎ　　Ｈ
Ｉを使用する制限消化を実施した。

ゲル電気泳動後、１５の形質転換体のうちの４つはほぼ
２００塩基対長さく７）ＥＣＯＲＩ−Ｂａｍ　　ＨＩ断
片を有するプラスミドＤＮＡを含有することがわかった
。

このＥｃｏ　　ＲＩ−Ｂａｍ　　ＨＩ断片を有する形質
転換体のすべてを大規模で生長させ、そして各々からの
プラスミドを分離し、そしてさらに分析した。それらの
うちの２つをマクサム（Ｍａｘａｍ）およびギルバート
（Ｇｉｌｂｅｒｔ）（７）手順に従ってシーフェンシン
グすると、すべては正しい配列を示し、究めてすぐれた
化学的合成および構成を立証した。

プラスミドｐＲｋ５４．１．１　（Ｖａｌ−１５−Ｇｌ
ｕ−５２アプロチニン）を、合成遺伝子のベータブロッ
ク（Ａｐａ　　ｌ−５ｔｕ　　Ｉ断片）を、位Ｊ１５に
Ｌｙｓの代わりにＶａｌのためのコドンを含有するベー
タブロックとの簡単な置換によって構成した６ 約１００ピコモルの合成５ｓＤＮＡ断片ＢＥＡ４Ａおよ
びＢＥＡ　　４Ｂ（第２ｂ図参照）を２０ｇ１の水中に
溶解し、９５化合物に５分間加熱し、そして室温にゆっ
くり冷却した（５時間）。

交雑したホスホリル化していない断片を、Ａｐａ■−支
持体　Ｉ断片を欠＜ｐＲｋ６３．１．１からの１．５ピ
コモルのＤＮＡと結合した。この　　−結合混合物の５
０％を使用してＥ、ｃｏ１、　　ＲＲ１ΔＭ１５の形質
転換を実施した。１５００の形質転換体から、２４を分
析用プラスミドの分離および制限分析によって試験した
。すべては陽性であり、そしてそれらのうちの２つをバ
イオラプス（Ｂｉｏｌａｂｓ、米国マサシュセッツ州ベ
バリー）からのＭ　　１３　　ジデオキシヌクレオチド
シーフェンシング系によりシーフェンシングした。形質
転換体ｐＲｋ５４．１．１をそれ以上の実験のための使
用した。

実施例４ アプロチニンを融合蛋白質として発現させるため、Ｕ、
リューサー（Ｒｕｔｈｅｒ）およびＢ。

ミュラー−ヒル（Ｍｕ　ｌ　ｌｅ　ｒ−Ｈｉ　ｌ　ｌ）
、１９８３、ＥＭＢＯジャーナル、２．１７９１−１７
９４およびドイツ国公開明細書（ＤＥ−Ｏ５）３３　０
９　５０１．９による同様な実験において示されている
ように、アプロチニン遺伝子がβ−ガラクトシダーゼの
カルボキシ末端に位置するプラスミドを構成した。

合成遺伝子を発現ベクターｐＵＲ２７８中でクローニン
グするため、クローニング部位ＢａｎＨＩおよびＨｉｎ
ｄ　　ＩＩＩをい選択した。その後、Ｂａｍ　　ＨＩ部
位をアプロチニン遺伝子の５’Ｅｃｏ　　ＲＩ末端に付
加しそしてＨｉ　ｎｄＩＩＩ部位を３°末端において使
用して、アプロチニン遺伝子を修飾することが必要であ
った（第６図参照）。

５０ピコモル（７）ｐＲｋ６３．１．１を１２０ｗ１（
７）ＩＸｓＰ−１００中で３７℃におい−（Ｅｃ。

ＲＩ（１５ピコモルのｈ　ｉ　ｔ　／　ｐ、　ｌ　）で
−夜完全に消化した。このＤＮＡ物質の特記する５°Ｅ
ｃｏ　　ＲＩ末端を、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー
断片）、ｄＡＴＰおよびｄＴＴとの酵素反応により充填
した（マニアチスら１９８２）、６００ピコモルのの乾
燥したアルファ３２　　Ｐ　　ＡＴＰ（２５０ｕＣｉ）
を溶解し、そしテ１６０　ｇ　ＩのＤＮＡ（５０ピコモ
ル）、１０ルｌの１ミリモルのｄＡＴＰ（１００００ピ
コモル）、２０ル１のＮＴ緩衝掖液混合した。次いで、
１０ルｌのＤＮＡポリメラーゼＩ　（クレノー断片、５
０用ｌ）を添加し、そして最初のインキュベーションを
室温で実施した。３０分後、１０ルｌの１ミリモルのｄ
ＴＴＰ（１００００ピコモル）を５ルｌのポリメラーゼ
（２５ｇｌ）と−緒に添加し、そして第２回のインキュ
ベーションを室温で実施した。この物質をフェノール／
セバグ抽出し、放射線標識された分子量の分画をプール
し、エタノール沈殿させ、洗浄し、５０．１のＴＥ中に
溶解し、そして２０℃で貯蔵した。

フラッシュ（ｆｌｕｓｈ）末端をもつこの物質の２０Ｊ
ＬｌをＢａｍ　　ＨＩリンカ−との結合のために使用し
た。その後、ガンマ３２　　Ｆ　　ＡＴＰで標識付けさ
れた５’　　Ｂａｎ　　ＨＩリンカ−の４００ピコモル
（標準の５′ホスホリル化手順）を４０ピコモルのＤＮ
Ａ末端に結合した（標準の結合条件、４．５ルｌのＴ４
　　ＤＮＡリガーゼ、合計の体ｖｔ６０　、１）。リン
カ−の結合の品質を調節するため、分析用ゲル電気泳動
を実施した。

１００ピコモルのＢａｍ　　Ｈエリガーゼ、１．８単位
のＴ４　　ＤＮＡリガーゼの添加し、２０℃で１時間イ
ンキュベーションし、１単位の７４　　ＤＮＡリガーゼ
を添加し、そして１４℃で１８時間インキュベーション
した後、完全な結合が達成された。この反応混合物をフ
ェノール／セバグ抽出し、エタノール沈殿し、洗浄し、
乾燥し、そして４０ＪＬ１のＴＥ中に溶解した。

Ｂａｎ　　ＨＩおよびＩ（ｉｎｄ　　ＩＩＩ末端をもつ
合成アプロチニン遺伝子を調製するため、結合した直線
状プラスミド（１０ピコモル）をまずＨ・ｉｎｄ　　Ｉ
ＩＩ　（１０，５ピコモルのｈ　ｉ　ｔ　／　ｇ１、５
時間、３７℃）で切断し、次いで］３ａｍ）ＩＩ　（４
０ビ＝＋モルノｈ　ｉ　ｔ／ｇ　１．２０時間、３７℃
、標準条件）で切断した。断片を６％んＰポリアクリル
アミドゲルの電気泳動による分離後単離し、そして注意
して精製した（参照、標準手順）。

ベクターの調製 親ベクターｐＵＲ２７８（約５ピコモル）を不味Ｈｉｎ
ｄ　　ＩＩＩで切断しく標準条件）フェノール／セバグ
抽出により精製し、エタノール沈殿し、再溶解し、次い
でＢａｍ　　ＨＩで消化した（標準条件）。この物質を
、１％のアガロースゲル上に装填し、電気泳動させ、単
離し、そして精製して、合成アプロチニン遺伝子との結
合を完結するであろう１８塩基対長さのＢａｍＨＩ−Ｈ
ｉｎｄ　　ＩＩＩ断片が得られた。

標識および形質転換 結合のため、０．３ピコモルのベクター、１゜５ピコモ
ルの断片（はぼ）、２単位のＴ４　　ＤＮＡリウガーゼ
を使用した（標準条件１合計の体積３０ＪＬ１、１４℃
における４時間のインキュベーション）。

結合混合物のｌ／３を使用し、宿主としてＥ。

ｃｏｔ、　　Ｒ１１６Ｍ１５を使用して形質転換を実施
した（標準条件）０合計１７３の「ブルー」のコ０ニー
が・２００ｐｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する指示ペ
トリ皿上に得られた。これから１２の形質転換体を、急
速分析用プラスミド単離によりさらに分析した（標準条
件）、ベクターの再結合により得られた形質転換体の百
分率から計算すると、１７３の形質転換体のうちで、３
０はバックグラウンドの形質転換体であろう、この結果
は１２形質転換体の制限分析により確証された。それら
のうちの８つは陽性であり、約２００塩基対のＢａｍ　
　ＨＩ−Ｈｉｎｄ　　ＩＩＩ制限断片を示した。陽性の
形質転換体を、また、５ｓｔＩＩおよびアプロチニン遺
伝子内の独特制限部位により直線化した。マクサム（Ｍ
ａｘａｍ）およびギルバー）　（Ｇｉ　１ｂｅｒｔ）に
従う塩基配列の分析は、プラスミドｐＲｋ４８．１．１
が所望のアプロチニンＤＮＡ断片を挿入していることを
明らかにした（第６図参照）、プラスミドｐＲｋ４８．
１．１を、それ以上の分析および発現の研究に使用した
。

プラスミドｐＲｋ４８．１．１の個性は、ｐＲｋ５４．
１．１からのＶａｌ−１５−Ｇｌｕ−５２遺伝子を使用
する正確に同一の手順によって実施した。陽性の組換え
プラスミドｐＲｋ４９　。

２．１は正確なり貧Ａ配列を示し、そしてこの構成体は
それ以上の分析および発現の研究に使用した。

串 これらの構成体の発現を試みるために、ｐＲｋ４８．１
．１（ＤＳＭにＤＳＭ　　Ｎｏ、３６７９で受託されて
いる）およびｐＲｋ４９．２．１（ＤＳＭにＤＳＭ　　
Ｎｏ、３６７８？受託されている）を有するＥ、ｃｏ１
、菌株を、４１Ｌ１の０．１モル（７）ＩＰＴＧを補充
した２ｍｌのＩ、Ｂ−アンピシリン培地中に接種した。

アプロチニン遺伝子を含まないＰＵＲ２７８を含有する
クローンを、また、培地に接種して、アッセイの陰性の
対照を得た。攪拌しながら３７℃で１２〜１６時間生長
させた後、１ｍｌの試料を１００ｍ１のＬＢ−アンピシ
リン培地の接種に直接使用した。攪拌しながら３７℃で
１２〜１６時間生長させた後、細胞をベックマンＪＡＩ
Ｏローター内で５００Ｏｒｐｍにおいて１０分間遠心す
ることによって収穫した。

融合蛋白質の直接検出は、ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌ　ｉ
）、Ｕ、に、１９７０、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、
２７７．６８０ページ、およびまた、Ｂ、Ｄ、ヘイムス
（Ｈａｍｅ　ｓ）およびり。

リックウッド（Ｒｉｃｋｗｏｏｄ）、１９８１、蛋白質
のゲル電気泳動（Ｇｅｌ　　ｅｌｅｃｔｒ。

ｐｈｏｒｅｓｉｓ　　　ｏｆ　　　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）
、ＩＲＬ　　プレス・リミテッド、オックスフォード、
に従うＳＤＳ　　ポリアクリルアミドゲルの電気泳動に
より実施した。

Ｌ／−７（１ａｎｅ）１つにつき、約ｌＸｌ０Ｅ９の細
胞を遠心し、モしてＳＤＳ試料用緩衝液（０，３モルの
トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，８）。

５０％のグリセロール、５％のＳＤＳ、２５％のメルカ
プトエタノール）の１：５希釈物中に再溶解した。電気
泳動ゲルをクーマツシーブルーで着色した後、第７図は
誘導可能なβ−ガラクトシダーゼＧｌｕ−５２アプロチ
ニン融合蛋白質をもつＥ、ｃｏ１、蛋白質の典型的なパ
ターンを示す。

溶液： 破壊用緩衝液： ５０ミリモルのトリス、 １００３９モルの塩化マグネシウム、 １０ミリモルのメルカプトエタノール、２モルのグアニ
ジン−ＭＣＩ−溶液、 ２モルのグアニジン−ＨＣｌ。

５０ミリモルのトリス−ＭＣ１，ｐＨ７，７゜１００ミ
リモルの塩化ナトリウム、 ｌＯミリモルのメルカプトエタノール、６モルのグアニ
ジン−ＭＣＩ−溶液、 ６モルのグアニジン−ＨＣ１、 ５０ミリモルのトリス−ＨＣ１、 １００ミリモルの塩化ナトリウム、 １０ミリモルのメルカプトエタノール。

調゛製の目的で、６リツトルのＥ、ｃｏ１、の−夜の培
養物の菌株ＲＲ１ΔＭ１５を８００Ｏｒｐｍで１５分間
遠心した。約１５ｇの細胞ペレットを３０ｍ１の破壊用
緩衝液中に再懸濁させ、そして６分間間音波処理した（
水冷）、細胞リゼイトを２０００Ｏｒｐｍで２０分間遠
心した。上澄みを廃棄した。約１０ｇのペレットを２０
ｍ１の２モルののグアニジン塩酸塩溶液中に再懸濁し、
そして均質化した。２００００ｒｐｍで２０分間遠心し
た後、上澄みを廃棄した。約８ｇのペレットを、Ｎ２雰
囲気のもとに、２００ｍｇのＤＴＴを含有する２０ｍ１
の６モルのグアニジン塩酸塩溶液中に溶解し、そして５
０℃で１時間再還元した。この溶液を１１０００Ｏｒｐ
で１０分間遠心し、そして１０ミリモルのメルカプトエ
タノールを含有する水に対して２４時間透析した。沈殿
した融合蛋白質を２０００Ｏｒｐｍで２０分間遠心する
ことにより集めた。湿った融合蛋白質を３０ｍ１の濃ギ
酸中に溶解し、次いで７０％に水で希釈した。融合蛋白
質を、４ｇの臭化シアンの添加および窒素雰囲気中の暗
所における１８時間のインキュベーションにより切断し
た。この反応を２００ｍ１の水の希釈により停止させた
。水および揮発性副生物を凍結乾燥により除去した。臭
化シアンによる切断を、ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）に
従うＳＤＳゲル電気泳動によって検査した。収量は約１
．５ｇの臭化シアン断片であった。１系列の実験におい
て、収量は０．８〜２．５ｇで変化した。

溶液： 緩衝液Ａ、ＰＨ８，２ ５０ミリモルのトリス−ＭＣＩ、 １ミリモルのＥＤＴＡ。

ｐＨ８，２に調節、 緩衝液Ｂ、ｐＨ８，２ ８モルの尿素、 １ミリモルのビス−（２−ヒドロキシエチル）−ジサル
ファイド。

１ミリモルの２−メルカプトエタノール、緩衝液Ａ中。

緩衝液Ｃ，ｐＨ８，２ １ミリモルのビス−（２−ヒドロキシエチル）−ジサル
ファイド。

１ミリモルの２−メルカプトエタノール、緩衝液Ａ中、 緩衝液り、ｐＨ８，２ ０，６ミリモルの塩化ナトリウム、緩衝液Ａ中。

約３００ｍｇの凍結乾燥したＬｙ　ｓ　−１５−Ｇｌｕ
−５２−アプロチニンβ−ガラクトシダーゼ臭化シアン
断片を、３００ｍｇのＤＴＴを含有する３００ｍ１の緩
衝液Ｂ中に溶解した。この溶液を窒素雰囲気中で５０℃
におい１時間還元した。

次いで、この溶液をＣＭ−セファデックスのカラム（２
５Ｘ１００ｍｍ）（約１５ｍ１のＣＭ−ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ　　Ｆａｓｔ　　Ｆｌｏｅ・をＰ充填した）に適用
した。このカラムを、基線が安定となるまで、緩衝液Ｂ
で洗浄した。最初の直線の勾配溶離において、カラムを
１００ｍ１の緩衝液Ｂおよび１００　ｍ　ｌの緩衝液Ｃ
で展開した。第２直線勾配溶敲の適用前に、カラムを基
線が安定となるまで緩衝液Ａで洗浄した。第２勾配を１
００ｍ１の緩衝液Ａおよび１００　ｍ　ｌの緩衝液りで
形成した。ピーク分画をトリプシン阻害活性についてお
よびＥＬＩＳＡおよびウェスタンプロットによって試験
した（第１０図）、１系列の実験において、異なる試験
によって推定した収量は０．４〜２ｍｇの範囲であった
。

活性分画を蒸発により濃縮し、次いで０．１モルのＮＨ
４Ｈ３Ｏ３、ｐＨ７，５に対して１８時間透析した。凍
結乾燥した後、阻害剤を０．１％のＴＦＡ中に溶解し、
そして高い多孔率のＲＰ−１８カラム（ＢＩＯＲＡＤ）
の逆相クロマトグラフィーにかけ、緩衝液Ａ中０．１％
のＴＦＡおよび緩衝！＆Ｂ中０．１％のＴＦＡ　　６０
％の勾配を使用した。阻害剤をＮ−末端シーフェンシン
グおよびアミノ酸分析により特徴づけた。

実施例６ プラスミドｐＲｋ４９．２．１をもつＥ、ｃ。

１、形質転換体の発行およびＶａｌ−１５−Ｇｌｕ−５
２の精製を実施例５におけるのと同一の手順に従って実
施したが、ただし活性はトリプシン阻害試験の代わりに
エラスターゼアッセイにより試験した。Ｖａｌ−１５−
Ｇｌｕ−５２−アプロチニンは、ＣＭセファロースのカ
ラムから、Ｇｌｕ−５２−アプロチニンより速く溶離す
る。

１系列の実験において、異なる試験によって推定される
収量は０．１〜１ｍｇであった。

同一のＨＰＬＣ精製をＶａ　ｌ　−１５−Ｇ　ｌ　ｕ　
−５２の一アプロチニンの単離に適用した。阻害活性は
白血球エラスターゼ阻害のアッセイにより決定した。阻
害剤はＮ−末端シーフェンシングおよびアミノ酸分析に
よって特徴づけた。

実施例７ Ａｒｇ−１５−Ｇｌｕ−５２−アプロチニン遺伝子を構
成するため、ベータブロック（第１図）の検査した。こ
のブロックは、ｐＲｋ５４．１　。

１中でクローニングしたＶａ　１−１５−Ｇ　１　ｕ　
−５２漬伝子のＡｐａ　　ｌ−３ｔｕ　　Ｉ　　ＤＮＡ
断片である。

この断片を、コドンＳＧＴによりアルギニランについて
アミノ酸位置１５において解読する対応する断片によっ
て置換した。得られる組換えベクターを０ｐＮ）（０１
，１，１と命名し、部分的にシークエンシンブレ、そし
てそれ以上の実験に使用した。

Ａｒｇ−１５−Ｇｌｕ−５２−アプロチニン遺伝子の５
′末端に、ＢａｍＨＩ部位を付加し、そして単離した遺
伝子をＢａｍ　　ＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ中に結合し、発
現ベクターｐＵＲ２７８を切除した。

このＤＮＡをＥ、ｃｏＬ、　　ＲＲＩΔＭ１５の形質転
換に使用し、そして新規な発現プラスミドｐＲｋｌ１２
．１．１を選択した。

この形質転換のため、β−ガラクトシダーゼＡｒｇ−１
５−Ｇｌｕ−５２−アプロチニン融合蛋白質を単離し、
そしてＡｒｇ−１５−Ｇｌｕ−５２−７７’ｔｆｆチニ
ンを、前述のように臭化シアンの切断後に、精製した。

驚くべきことには、動力学的研究により、組換えＡｒｇ
−１５−Ｇｌｕ−５２−アプロチニンはヒト血漿カリク
レイン（Ｋｉ＝３．２Ｘ１０−’０モル）陽イオン性お
よび陰イオン性のヒトトリプシン（Ｋｉ値＜１０−”）
の非常に効力のある阻害剤である。Ｋｉ値はＭ、Ｗ、エ
ンピー（Ｅｍ　ｐ　ｉ　）およびＭ、ラスコラスキー（
Ｌａｓｋ。

ｗｓｋｉ）、Ｊ　ｒ　、、バイオケミストリー（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、）、　２１．２２７４　（１９８２）の方法
によって決定した。

Ａｒｇ−１５−相同体、例えば、実施例７の相同体は急
性の炎症、例えば、リウマチ性５ｔ１節炎、脈管神経性
浮腫、舗炎、膵炎およびショックの処置において非常に
有用である。Ａｒｇ−１５−相同体は、さらに、透析法
、例えば、人工膜および体外の循環における保護剤とし
て有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、合成アプロチニンマスター遺伝子の設計であ
る。 第２図は、遺伝子の部分ＡについてＤＮＡ断片１．２．
３．４および６、および部分ＢについてＤＮＡ断片５．
７．８．９．１０．１１．１２．１３．１４および１６
の交雑、結合および精製によって、得られた遺伝子の部
分Ａおよび部分Ｂをを示す。 第３図は１合成Ｇｌｕ−５２−アプロチニン遺伝子ＤＮ
Ａ配列（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨ１、ｐＲｋ６３．１．１
の部分的配列）を示す。 第４図は、プラスミドｐＲｋ６３．１．１の構成を示す
。 第５図は、プラスミドｐＲｋ５ｔ、１．１の構成を示す
。 第６図は、プラスミドｐＲｋ４ｇ　、１．１の構成を示
す。 第７図は、７．５％の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
の電気泳動の結果を示す。 第８図は、還元条件下に８％の５ＤＳ−ゲルにより検査
したＨ３　２０７４からのβ−ガラクトシダーゼ融合蛋
白質の分離を示す。 第９図は、Ｇｌｕ−５２−アブロチニンヲβ−ガラクト
シダーゼの臭化シアン断片からイオン交換クロマトグラ
フィーによって分離し、そして同時に再び折たたんだ結
果を示す。 第１０図は、Ｌｙｓ１５　　Ｇ１ｕ５２−アプロチニン
−β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質の分画した臭化シア
ンのウェスタンプロットを示す。 第１１図は、アプロチニンおよびＧｌｕ−５２−アプロ
チニンのトリプシン阻害活性の比較は同一の応答曲線を
示す。 第１２図は、Ｖａｌ１５　　Ｇｌｕアプロチニン−β−
ガラクトシダーゼ融合蛋白質のラエムリにより８％５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動の結果を示す
。 第１３図は、Ｖａｌ−１５−Ｇｌｕ−５２−アプロチニ
ンはＧｌｕ−５２−アプロチニンについて説明したのと
同様な方法でβ−ガラクトシダーゼ融合蛋白質から調製
できることを示す。 特許出願人　バイエル・アクチェンゲゼルシャフト　　
　　　　　　、１−。 イ、やい、Ｆや＋４１．Ｊあや、ｊ′・４５、Ａ　　　
　　　　　　Ｂ ＦＩＧ、　１ Ｆｒａ　　　Ｉ　　　　　ＡＡＴＴＣＡＴＧＣＧＴＣＣ
ＧＧＡＣＴＴＣＴＧＣＣＴＣＧＡＧＣＦｒａ　　　２　
　　　　ＣＡＧＡＡＧＴＣＣＧＧＡＣＧＣＡＴＧＦｒａ
　　　３　　　　　ＣＧＣＣＧＴＡＣＡＣＴＧＧＧＣＣ
ＣＴＧＣＡＡＡＧＣＴＦｒａ　　　４　　　　　ＣＣＣ
ＡＧＴＧＴＡＣＧＧＣＧＧＣＴＣＧＡＧＧＦｒａ　　　
５　　　　　ＣＧＴＡＴＣＡＴＣＣＧＴＴＡＣＴＴＣＦ
ｒａ　　　６　　　　　ＡＴＧＡＴＡＣＧＡＧＣＴＴＴ
ＧＣＡＧＧＧＦｒａ　　　７　　　　　ＴＡＣＡＡＴＧ
ＣＡＡＡＧＧＣＡＧＧＣＣＴＧＴＧＴＣＡＧＡＣＣＦｒ
ａ　　　８　　　　　ＣＣＴＧＣＣＴＴＴＧＣＡＴＴＧ
ＴＡＧＡＡＧＴＡＡＣＧＧＦｒａ　　　９　　　　　Ｔ
ＴＣＧＴＡＴＡＣＧＧＣＧＧＴＴＧＣＣＧＴＧＣＴＡＡ
ＧＣＧＴＦｒａ　　１０　　　　　ＡＡＣＣＧＣＣＧＴ
ＡＴＡＣＧＡＡＧＧＴＣＴＧＡＣＡＣＡＧＧＦｒａ　　
１１　　　　　ＡＡＣＡＡＣＴＴＣＡＡＡＴＣＣＧＣＧ
ＧＡＡＧＡＣＴＧＣＧＡＡＦｒａ　　１２　　　　　Ａ
ＴＴＴＧＡＡＧ”、ＴＧＴＴＡＣＧＣＴＴＡＧＣＡＣＧ
ＧＣＦｒａ　　１３　　　　　ＣＧＴＡＣＴＴＧＣＧＧ
ＴＧＧＴＧＣＴＴＡＧＴＡＡＡＧＣＴＴＧＦｒａ　　　
１４　　　　　ＣＡＣＣＧＣＡＡＧＴＡＣＧＴＴＣＧＣ
ＡＧＴＣＴＴＣＣＧＣＧＧＦｒａ　　１６　　　　　Ｇ
ＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＴＡＣＴＡＡＧＣＡＣべ一ヌーＥ
Ａ　２−７”ｏ−１７４ｆｆ１ｌＦ１１（江と巨　拷舒
、　　　　ＣＴＧＩ ａイ立　：　　Ａｐａｌ　　５ｔｕｌ ベーターεＡ４−ブ′口１７の−こ利 （Ｖａｌユｔｓ　　４＋％　　４チ、　　　　　ＧＴＴ
Ｉｎイ’ｆｌ　　：　　Ａｐａｌ−５ｔｕｌＧＡＣＧＣ
ＡＡＣＧＡＧＣＡＴＡＧＴＡＧＧＣＡＡＴＧＡＡＧＡＴ
ＧＴＴＡＣＧＴＴＴＣＣＧＴＣＣＣｙｓＶａＩＡｌａＡ
ｒｇ１１ｅ１１ｅＡｒｇＴｙｒＰｈｅＴｙｒＡｓｎＡ＋
ａＬｙｓＡＩａ？？？ａイ立　：　　Ａｐ６＋−５ｔｕ
ｌ ＧＡＣＧＴＡＧＣＧＡＧＣＡＴＡＧＴＡＧＧＣＡＡＴＧ
ＡＡＧＡＴＧＴＴＡＣＧＴＴＴＣＣＧＴＣＣＣｙｓＩｌ
ｅＡＩａＡｒｇ１１ｅＩｌｅＡｒｇＴｙｒＰｈｅＴｙｒ
ＡｓｎＡｌａＬｙｓＡ　１ａ？？？ＦＩＧ、　２ｂ Ｔ　ＴＡＡＧＴＡＣＧＣＡＧＧＣＣＴＧＡＡＧＡＣＧＧ
ＡＧＣＴＣＧＧＣＧＧＣＡＴＧＴＧＡＣＣＣＧＧＧＡＣ
ＧＴＴＴＣＧＡＧＣＡＴ（：　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　ＡｒｇρｒｏＡｓｐＰｈｅＣｙｓＬｅｕ
ＧＩｕＰｒｏρｒｏＴｙｒＴｈｒＧｌｙＰｒｏＣｙｓＬ
ｙｓＡＩａＡｒｇｌｌｅｃ：　　　　　　Ｉ　ｌ　ｅＡ
ｒｇ　ＴｙｒＰｈｅＴｙｒＡｓｎＡ　ｌ　ａＬｙｓＡＩ
ａＧ　ＩｙＬｅｕＣｙｓＧｌｎＴｈｒＰｈｅＶａｌＴｙ
ｒＧＩｙＧＩｙＣｙｓＡｒｇＡ　ｌ　ａＬｙｓＡｒｇＡ
ｓｎＡｓｎＰｈｅＬｙｓＳｅｒＡｌ　ａＧ　Ｉ　ｕＡｓ
ｐＣｙｓＧ　ｌ　ｕＡｒｇＴｈｒＣｙｓＧ　ｌｙＧ＋　
ｙＡ　Ｉ　ａＧＡＡＴＣＡＴＴＴＣＧＡＡＣ ＦＩＧ、　５ ＦＩＧ、　６ １、　　　Ｅ、ｃｏ＋ｉ　　７１１８ ２、　Ｅ、ｃｏ＋＋　７１１８　＃　ｐＵＲ２７８３、
Ｅ、ｃｏｌ＋　　７１１８　＃　ｐＲＫ　４９．２．１
４、　　Ｅ、ｃｏ＋ｉ　７１１８　＃　ｐＵＲ２７８Ｉ
ＰＴＧ　　（Ｅｎｄｋｏｎｚ、　　０．２　　ｍＭｌ　
　ｅ）　イ火ＬｆｆｉＪｒ５、　ε、ｃｏＨ７１１８＃
　ｐＲに４９．２．１１ＰＴＧ　（Ｅｎｄｋｏｎｚ、　
０．２　ｍＭ）　ノＪＲ７１，閤ヰＦＩＧ、　　７ ■ □□ ＦｆＧ、　８ ＦＩＧ、　１０ ２、　−貝ぎリビイ糾　（ｐＲに　４９．２，１１３、
ぶ５（仕 ４、　ブレ・Ｉト ＦＩＧ、　１２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、微生物学的に生産されたアプロチニンおよびアプロ
   チニン相同体。 ２、必要に応じてメチオニンを除外した天然に産出する
   アミノ酸により位置１５で置換された微生物学的に生産
   されたアプロチニン。 ３、微生物学的に生産されたアプロチニンおよびＡｒｇ
   −１５−、Ｖａｌ−１５−、Ｉｌｅ−１５−、Ｌｅｕ−
   １５−、Ｐｈｅ−１５−、Ｇｌｙ−１５−、Ｓｅｒ−１
   ５−、Ｔｒｐ−１５−、Ｔｙｒ−１５−およびＡｌａ−
   １５−アプロチニン。 ４、位置５２においてＧｌｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ
   またはＳｅｒによってさらに置換された特許請求の範囲
   第２項記載の微生物学的に生産されたアプロチニン。 ５、微生物学的に生産されたＧｌｕ−５２−アプロチニ
   ン。 ６、微生物学的に生産されたＶａｌ−１５−Ｇｌｕ−５
   ２−アプロチニン。 ７、微生物学的に生産されたＩｌｅ−１５−Ｇｌｕ−５
   ２−アプロチニン。 ８、微生物学的に生産されたＬｅｕ−１５−Ｇｌｕ−５
   ２−アプロチニン。 ９、アプロチニンおよび／またはアプロチニン相同体を
   解読するマスター遺伝子の構成に適するＤＮＡ断片。 １０、断片１ＡＡＴＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＴ
   ＧＣＣＴＣＧＡＧＣ、断片２ＣＡＧＡＡＧＴＣＣＧＧＡ
   ＣＧＣＡＴＧ、断片３ＣＧＣＣＧＴＡＣＡＣＴＧＧＧＣ
   ＣＣＴＧＣＡＡＡＧＣＴ、断片４ＣＣＣＡＧＴＧＴＡＣ
   ＧＧＣＧＧＴＣＧＡＧＧ、断片５ＣＧＴＡＴＣＡＴＣＣ
   ＧＴＴＡＣＴＴＣ、断片６ＡＴＧＡＴＡＣＧＡＧＣＴＴ
   ＴＧＣＡＧＧＧ、断片７ＴＡＣＡＡＴＧＣＡＡＡＧＧＣ
   ＡＧＧＣＴＧＴＧＴＣＡＧＡＣＣ、断片８ＣＣＴＧＣＣ
   ＴＴＴＧＣＡＴＴＧＴＡＧＡＡＧＴＡＧＡＡＣＧＧ、断
   片９ＴＴＣＧＴＡＴＡＣＧＧＣＧＧＴＴＧＣＣＧＴＧＣ
   ＴＡＡＧＣＧＴ、断片１０ＡＡＣＣＧＣＣＧＡＴＡＣＧ
   ＡＡＧＧＴＣＴＧＡＣＡＣＡＧＧ、断片１１ＡＡＣＡＡ
   ＣＴＴＣＡＡＡＴＣＣＧＣＧＧＡＡＧＡＣＴＧＣＧＡＡ
   、断片１２ＡＴＴＴＧＡＡＧＴＴＧＴＴＡＣＧＴＴＡＧ
   ＣＡＣＧＧＣ、断片１３ＣＧＴＡＣＴＴＧＣＧＧＴＧＧ
   ＴＧＣＴＴＡＧＴＡＡＡＧＣＴＴＧ、断片１４ＣＡＳＣ
   ＣＧＣＡＡＧＴＡＣＧＴＴＣＧＣＡＧＴＣＴＴＣＣＧＣ
   ＧＧ、断片１６ＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＴＡＣＴＡＡＧ
   ＣＡＣ、およびそれらの機能的同等体から成る群より選
   択されるＤＮＡ断片。 １１、配列 【遺伝子配列があります】 およびそれらの機能的同等体によって特徴づけられるＤ
   ＮＡｅ １２、Ｌｙｓ−１５−コドンがＶａｌ−１５−、Ｉｌｅ
   −１５−、Ｌｅｕ−１５−、Ｐｈｅ−１５−、Ｇｌｙ−
   １５−、Ａｌａ−１５−、Ａｒｇ−１５−、Ｓｅｒ−１
   ５−、Ｔｒｐ−１５−またはＴｙｒ−１５−Ｇｌｕ−５
   ２−アプロチニンを解読するコドンによって置換されて
   いる特許請求の範囲第１１項記載のＤＮＡ配列から本質
   的になるＤＮＡ。 １３、Ｇｌｕ−５２−コドンがＬｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ
   またはＳｅｒの遺伝情報を指定するコドンによって置換
   されている特許請求の範囲第１１または１２項記載のＤ
   ＮＡ。 １４、プラスミド類ｐＲｋ６３．１．１、ｐＲｋ５４．
   １．１、ｐＲｋ４９．２．１およびｐＲｋ４８．１．１
   。 １５、特許請求の範囲第１〜８項のいずれかに記載の蛋
   白質の生産に有用な発現プラスミド。 １６、ｐＲｋ４８．１．１およびｐＲｋ４９。 ２．１から成る群より選択される特許請求の範囲第５〜
   ８項のいずれかに記載の蛋白質の生産に有用な発現プラ
   スミド。 １７、アプロチニンおよび／またはアプロチニン相同体
   の遺伝情報を指定する発現ベヒクルで形質転換された宿
   主細胞。 １８、アプロチニンおよび／またはアプロチニン相同体
   の遺伝情報を指定する発現ベヒクルで形質転換された大
   腸菌（￥Ｅ．ｃｏｌ．￥）。 １９、特許請求の範囲第１６項記載の発現 ベヒクルで形質転換された大腸菌（￥Ｅ．Ｃｏｌ．￥）
   。 ２０、特許請求の範囲第１６項記載の発現ベヒクルで形
   質転換された大腸菌（￥Ｅ．ｃｏｌ．￥）ＲＲ１ΔＭ１
   ５（ＡＴＣＣＮｏ．３５１０ ２）。 ２１、組換えＤＮＡ技術によって得られたβ−ガラクト
   シダーゼ融合体からアプロチニンおよびアプロチニン相
   同体を調製することを特徴とするアプロチニンおよび／
   またはアプロチニン相同体を分離する方法。 ２２、工程： （ａ）アプロチニンの遺伝情報を指定するＤＮＡ断片を
   合成し、 （ｂ）前記ＤＮＡ断片を結合してマスター遺伝子を生成
   し、 （ｃ）アプロチニンマスター遺伝子をクローニングし、 （ｄ）マスター遺伝子中のＤＮＡ断片を置換し、 （ｅ）得られたマスター遺伝子を適当な発現ベクター中
   で結合し、 （ｆ）宿主細胞を前記発現ベクターで形質転換し、 （ｇ）前記宿主細胞を生長させ、 （ｈ）融合蛋白質を細胞培養物から分離し、（ｉ）前記
   融合蛋白質を切断し、そして （ｊ）アプロチニンまたはアプロチニン相同体を分離す
   る、 からなることを特徴とするアプロチニンを調製する方法
   。 ２３、微生物学的に生産されたアプロチニンおよび／ま
   たはアプロチニン相同体を含有することを特徴とする製
   薬学的組成物。 ２４、薬品の製造における微生物学的に生産されたアプ
   ロチニンおよびアプロチニン相同体の使用。 ２５、アプロチニンおよび／またはアプロチニン相同体
   を解読する遺伝子の構成のための特許請求の範囲第９項
   記載のＤＮＡ断片の使用。