CN1018793B - 从重组体宿主产生抑肽酶同系物及其制造方法,表达载体、重组体宿主和药物应用 - Google Patents
从重组体宿主产生抑肽酶同系物及其制造方法,表达载体、重组体宿主和药物应用Info
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Abstract
本发明涉及抑肽酶同系物、及其核酸编码、结合核酸和其它转化细胞的载体,以及获得抑肽酶同系物的方法。
Description
本发明涉及抑肽酶同系物及其用重组DNA技术的制备方法。
本文所述化学合成的DNA分子,其特征为编码新的多肽或多肽的DNA顺序,实质上与抑肽酶或抑肽酶同系物的氨基酸顺序及组合物一致,且具有抑肽酶或抑肽酶同系物的生物活性。
众所周知,抑肽酶是由58种氨基酸组成的肽,具有抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、血浆酶和激肽释放酶的作用。这是一种碱性蛋白酶抑制因子,取自牛的脏器,是一种有价值的药物,又名Trasylol
(抑肽酶),用来治疗各种疾病,如高溶解纤维蛋白原的出血和外伤出血的休克(参阅H.Fritz和G.Wunderer,1983年,Drug Res.,33期,479~494页)。
业已证明,抑肽酶的同系物与抑肽酶相比在15位上是其它氨基酸,而不是赖氨酸,它是有修饰作用和疗效的有效蛋白酶抑制剂(德国专利DE-OS 3339693号;H.R.温泽尔等1985年在《肽和蛋白质化学》3卷)。这些抑肽酶同系物对胰和白细胞中弹性蛋白酶以及组织蛋白酶G有强烈的抑制作用。
在急性的、慢性的破坏结缔组织,损害器壁,坏死病变和肺部组织变质的炎症中,胰腺弹性蛋白酶(胰腺炎)、血浆弹性蛋白酶(关节硬化)、白细胞弹性蛋白酶的过度释放引起的疾病,可用这种抑肽酶同系物治疗由溶酶体酶特别是白细胞弹性蛋白酶在由免疫处理引起的炎性反应中,例如风湿性关节炎中起着同样重要的作用。
虽然可从牛的脏器以及通过牛胰蛋白酶抑制因子(Tschesche,M.,Wenzel,M.,Schmuck,R.,Schnab,E.德国专利说明书DE 3339693 Al从15.05.58起)的半合成转化得到抑肽酶和抑肽酶同系物,但产量较少。
可见,重组DNA及有关技术的应用是提供必要的大量高质量抑肽酶同系物的有效方法。目的是从宿主生物体生产抑肽酶同系物,这是一种具在生物活性的重组DNA技术的产品。
异种DNA在微生物中的表达方法是已知的。
编码已知氨基酸顺序的多肽DNA的制备,可用基因组DNA顺序、与mRNA互补的cDNA顺序或根据遗传密码及制备合成基因选择密码子。
牛胰腺的胰蛋白酶抑制因子基因中牛基因组克隆的部分DNA顺序已由S.Anderson和I.B.Kingston(1983年,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.8.0卷,6838~6842页)克隆,其特征在于牛胰腺胰蛋白酶抑制因子(BPT1)基因组的克隆。
编码BPT1和牛脾抑制因子Ⅱ大片段牛基因组的顺序,已由Kingston,I.B.和Anderson,S.发表(1986年,《Biochem.J.》233期,443~450页)。
本发明的目的是提供抑肽酶同系物、编码该同系物的核酸、将核酸和由其转化的细胞相结合的载体,以及获得抑肽酶同系物的方法。
对于本发明的目的,最大的优点是以恰当设计并能广泛应用的方法选择制备合成基因密码子。
特别是构建合成主导基因包括DNA编码组或由限制酶的独特识别部位限定的DNA组。这种基因设计在DNA编码组内,可使全部DNA顺序容易修饰或突变。
采用重组DNA技术制备抑肽酶同系物,业已发现这类抑肽酶同系物例如Val-15-、Ile-15-、Leu-15-、Phe-15-和Ala-15-、Arg-15、Gly-15、Ser-15、Trp-15、Tyr-15、单独的抑肽酶,或与在52位上由
Glu、Leu、Val、Arg或Thr取代相结合的抑肽酶,与已知的抑肽酶及其在52位上有Met的同系物是等同的,它们的生产方法将一起介绍。Met-52的取代可生产抑肽酶和抑肽酶同系物,其中在融合多肽的Met位上,用溴化氰把遗传工程方法得到的融合多肽切断。
还介绍了编码这种同系物的合成DNA,包括表达该同系物的结构基因的重组体质粒,以及由重组体质粒转化的大肠杆菌(E.coli)。
下文说明编码抑肽酶和抑肽酶同系物的DNA片段的构建和选择方案。
已知蛋白质顺序及抑肽酶和抑肽酶同系物的遗传密码用来确定编码这类多肽的DNA顺序。
遗传密码的简并性允许在任何给定的氨基酸顺序的密码子选择中有很大的灵活性。
测定表示这种蛋白质的氨基酸顺序的密码子中所有可能的碱基取代。与此相应可测定定位在合理的DNA顺序内全部潜在限制性部位。
通过下述依据指导主导基因的密码子选择:首先,选择密码子和片段,设计片段组合,以避免不合适的片段互补。
其次,富集A-T碱基对的范围,避免转录过早终止的问题。
第三,选择限制部位应能检验转化株或通过其它片段置换适当的片段的碱基取代,使易于产生抑肽酶的饰变,检查结构及其活性间的关系。
第四,大多数选择的密码子是微生物基因组表达中最好的那些密码子(见H.Grosjean和W.Fiers,基因,18期(1982年)192~209页;M.Gouy和C.Gautier,Nucleic Acids Research,10期(1982年)7055~7074页。
图1表示合成抑肽酶基因及其同系物的主要设计。
合成主导基因由限制性核酸内切酶的识别部位周围的四个组(称作
α、β、γ、δ)组成,其设计应易于对未融合和融合表达的DNA顺序的修饰和改变(密码子使用、突变、蛋白质工程,基因的扩增)。
按如下所述构建合成基因:
由一组具有重叠末端区的15种纯寡核苷酸用主导基因构建抑肽酶和抑肽酶同系物的合成基因(见图1)。这个构建由两个步骤完成,首先,将部分A的DNA片段1、2、3、4和6与部分B的DNA片段5、7、8、9、10、11、12、13、14和16通过杂交、连接以及纯化产生基因的部分A和部分B(见图2)。其次,连接和纯化基因的部分A和B。下文介绍这种构建所用的材料和方法。图3表示主导基因的DNA顺序,它包括起始密码子ATG,两个末端密码子TAG和TAA,Eco RI的5′端限制部位和HindⅢ和BamHⅠ的3′端限制部位,以及ApaⅠ、StuⅠ、SacⅡ、(SstⅡ)的内限制部位。这些部位,尤其是内限制部位,能使编码顺序的克隆,以及通过交换编码其他氨基酸或有其它密码子用途的DNA片段的主导基因的修饰。编码加入适当的联结子顺序能很容易扩增基因。蛋白质工程的总的领域是有可能进行这种构建的。
为构建抑肽酶同系物的基因,仅交换一个含适当DNA顺序的限制片段。对图2b给出了包括15和52位的氨基酸变换编码的这种片段的顺序。
按如下所述构建重组体质粒:
为试验抑肽酶克隆选择的质粒是pUC8(J.Vierira和J.Messing,1982年Gene,19期259页)。该克隆载体由pBR322衍生氨苄青霉素酶基因和连接含有一系列独特限制酶识别部位的lac Z基因部分的DNA复制起点所构成。当该载体引入lac-大肠杆菌时,转化株就在相应的指示平板上产生蓝色菌落,将DNA片段克隆到许多限制部位中的任何部位,如Eco.RⅠ和Bam HI之间,钝化了产生白色菌落的lac基因。质粒pUC8可从P-L Biochemicals购到。
按如下所述构建表达质粒:
为表达如融合蛋白的抑肽酶和抑肽酶同系物,进行了质粒的构建,其中适宜的基因与β-半乳糖苷酶基因的羧基末端融合。如同U.Ruther和B.Muller-Hill于1983年,在《EMBO》第2期,1791~1794页所述实验相似。亲代质粒pUR278有单克隆部位,即在lac Z基因3′端的Bam HⅠ、Sal Ⅰ、Pst Ⅰ、Xba Ⅰ和Hind Ⅲ(参见德国专利申请P3309501.9)。将编码DNA顺序插入合适的克隆部位以及正确的读码,得到有活性的β-半乳糖苷酶与由DNA编码的肽相结合的融合蛋白。
为了将抑肽酶和抑肽酶同系物的合成基因克隆到表达载体中,选择了表达载体pUR278的限制部位Bam HⅠ和HindⅢ。为此有必要通过加在基因的5′EcoRI端的Bam HⅠ部位和应用3′端上的HindⅢ部位,以修饰抑肽酶基因(见图6)。
使用如下重组体DNA工作的标准材料及方法:
可以制备本文中所述的合成基因、重组体质粒及带有这种基因的表达载体,其特征在于下述材料和方法。
材料
酶
多核苷酸-激酶(PNK)5.5单位/微升;Boehringer-Mannheim 633542期,
DNA聚合酶;Klenow,Boehringer-Mannheim 104523期,
T4 DNA连接酶,0.9单位/微升;Boehringer-Mannheim 481220期,
限制酶可从贝塞斯达实验室(Boehringer-Mannheim生物实验室)获得,
小牛肠内的碱性磷酸酶(CIP);Boehringer-Mannheim,
溶菌酶;RN酶A;Boehringer-Mannheim,
试剂
γ 32p腺苷三磷酸(ATP);Amersham No.PB 10168
α 32p-dTTP Amersham 167
ATP;Sigma No.A-6144号
双丙烯酰胺:Serva 29195
丙烯酰胺;Serva和Bio-Rad 161-0103
N,N,N,N-四甲基乙烯二胺(TEMED);Serva 35925
过硫酸铵;Serva 13375
尿素;BRL超纯5505 UA
DE52(preswollen二乙氨乙基纤维素);Whatman,目录;4057-050
DTE;Serva 20697
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG);Sigma I 5502,
5-溴-4氯-吲哚基-β-D-半乳糖(X gal);Boehringer 651745
N,N′-二甲基甲酰胺;Merck 2203034
乙二醇四醋酸(EGTA)
蔗糖;BRL 5503 UA
二氨基庚二酸(Diaminopimelin acid);Sigma D 1377
M13-双脱氧核苷酸顺序系统;美国马萨诸塞州贝弗利408号、409号,新英格兰生物实验室
三氯甲烷
异戊基醇
胸核苷;Serva 18600
葡萄糖D(+);Merck 8337
三羟甲基氨基甲烷(Tris);Merck 8382
氢氧化钾;Merck 5033
氯化钙;Merck 2382
氯化铷;Sigma R 2252
氯化锰;Sigma M 3634
二甲亚砜;Sigma D 5879
乙二胺四乙酸(EDTA);
乙酸钾;
十二烷基硫酸钠(SDS);
DNA
质粒pUC8;Pharmacia P-L Biochemicals 27-4916-xx
Bam HI联结子
培养基和抗菌素
Bacto-胰胨;Difco 0123-01
Bacto-酵母提取物;Difco 0127-01
Bacto-琼脂;0140-01
LB-培养基:(用于1升)10克Bacto-胰胨,5克Bacto-酵母提取物,10克NaCl,用NaOH调整pH值至7.5。
Kappa 1776-培养基:(用于1升)25克Bacto-胰胨,7.5克Bacto酵母提取物,1M Tris-HCl(pH7.5)20毫升,加950毫升,高压灭菌并冷却,添加灭菌物质:5毫升1M MgCl2,10毫升1%二氨基庚二酸(diaminopimeline acid),10毫升0.4%胸核苷,25毫升20%葡萄糖。
YT-培养基:(用于1升)8克Bacto胰胨,5克Bacto酵母提取物,5克NaCl。
把15克Bacto琼脂加到1升适当的培养基,制备琼脂平板。
指示平板:把下列溶液加到1升经高压灭菌的含有1.5%琼脂的YT培养基中:2毫升0.1M IPTG,2毫升N,N′二甲基甲酰胺的2%X-gal和2毫升100毫克/毫升氨苄青霉素。
抗菌素,
氯霉素;Boehringer-Mannheim 634433,
氨苄青霉素;Serva 13397,
四环素;Serva 35865
缓冲液和溶液
20μM ATP在水中。
10μM ATP在水中。
10X多核苷酸激酶混合物:0.5M Tris-HCl(pH7.6);0.1M MgCl2;50mM DTE;1mM EDTA。
10X连接酶混合物:0.5M Tris-HCl(pH7.4);0.1M MgCl2;0.1M DTE;10mM ATP。
10X SP-50:100mM Tris-HCl(pH7.5);100mM MgCl2;500mM NaCl;10mM二硫苏糖醇。
10X SP-100:100mM Tris-HCl(pH7.5);100mM MgCl2;1M NaCl;10mM 二硫苏糖醇。
10X SP-0:100mM Tris-HCl(pH7.5);100mM MgCl2;10mM二硫苏糖醇。
1M TBE:1M Tris;0.83M硼酸;10mM EDTA;pH8.3。
3X甲酰胺染料混合物:70%甲酰胺;20%丙三醇;1mM EDTA;0.33毫克/毫升溴酚兰;0.66毫克/毫升二甲苯苯胺FE;0.66毫克/毫升橙红G。
20X E-缓冲液:0.8M Tris;0.4M 乙酸钠;40mM EDTA;pH8.3。
10X CIP-缓冲液:0.5M Tris-HCl(pH9.0),10mM MgCl2,1mM ZnCl2,10mM 亚精胺。
转化缓冲液:按如下所述制备:15克蔗糖,1毫升3.5M KOH,1毫升1M CaCl2,2毫升5.0M RbCl,加到50毫升联二苯乙酮(bidest)溶液,用10%乙酸调整pH值为6.2,加1毫升4.5M MnCl2,用10%乙酸调整pH值为5.8,用联二苯乙酮(bidest)溶液加至100毫升,过滤灭菌。
TE-缓冲液:10mM Tris-HCl,pH8.0,0.1mM EDTA。
10X NT-缓冲液:
溶菌酶混合物:50mM葡萄糖,1mM EDTA,10mM Tris-HCl,pH8.0。
酚/Sevag:80%酚和Sevag(三氯甲烷∶异戊基醇=24∶1)以1∶1(体积)的混合物。
标准方法
在Maniatis等人1982年(《分子克隆》,美国冷泉港,冷泉港实验室)所介绍的使用重组体DNA工作的标准方法,按下文所述进行某些修饰。
标准乙醇沉淀
溶解DNA碎片或把溶液调至0.3M乙酸钠,加入两份体积乙醇,在-70℃保温15分钟,离心分离,用80%乙醇洗涤碎片两次,再真空干燥。
标准酚萃取
以酚:Sevag为1∶1(体积)充分混合溶液,再离心分离。酚相用1/10(体积)缓冲液或水再萃取,合并水相。
聚丙烯酰胺凝胶电泳后,DNA片段的标准分离
通过凝胶电泳分离DNA小片段(至多250个核苷酸),由放射性自显影或紫外线使带可见(预涂薄层色谱板Silgur-25,Macherey-Nagel Co.),将带切下,用硅玻璃棒捣烂,在42℃下用约400微升TE缓冲液pH为8.0,洗脱18小时。经离心分离材料,碎片在42℃下再洗脱4小时,离心分离。将两份上清液合并,并在1mM TEABC缓冲液的小型DE-52巴氏灭菌吸管柱上经阴离子交换层析纯化,冻干后DNA在水中两次溶解和冻干。
标准连接
对于标准连接(小于载体的片段),载体与片段的摩尔比为1∶5。
DNA最终浓度为25微克/毫升。DNA溶解在少量TE缓冲液中,加入10X连接酶混合物、T4 DNA连接酶,调节至1X连接酶混合物浓度(50mM Tris-HCl,pH7.4,10mM MgCl2,10mM-DTE,1mM ATP;标准体积30微升)。在14℃下反应16小时。
DNA片段的标准5′端标记
脱磷酸DNA(最终浓度约0.2μM)溶于1X激酶缓冲液Ⅰ(50mM Tris-HCl,pH7.6,10mM MgCl2,5mM DTE,0.1mM EDTA)。γ 32p ATP(3000居里/毫摩尔)与未标记ATP一起加入,ATP最终浓度总是大于1μM,按单位定义和DNA浓度计算,超过多核苷酸激酶500~1000倍的量,在37℃下反应30分钟,萃取酚时停止该反应。用乙醇沉淀DNA,再洗涤和干燥。
标准核酸内切限制酶消化
主要根据工作手册进行核酸内切限制酶消化。将无DNA的纯化盐溶于缓冲液(Sp-0,Sp-50,Sp-100分别用于所用的酶),用适量的酶进行消化,最终材料用酚萃取及用乙醇沉淀。
琼脂糖凝胶电泳后,DNA片段的标准分离
通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段(见T.Maniatis等人1982年冷泉港实验室,分子克隆),用溴乙锭染色并在长波紫外线光下切断。切片放入透析袋,注满0.5X E-缓冲液(缓冲液与凝胶切片的体积比为1.5∶1),必须完全浸没有缓冲液中。密封袋口,使无气泡,放入注满0.5X E-缓冲液的电泳室,在200伏下电泳30分钟,再变换电流极性30秒,从透析袋壁取出DNA。谨慎地除去凝胶切片周围的缓冲液,进一步在二乙氨乙基纤维素或DE 52层析柱(见上)上纯化。
标准DNA脱磷酸化
完全消化和纯化的DNA溶于水水,调节至1X CIP-缓冲液(标准总容积为48微升),加1微升(20单位)CIP,在37℃开始反应,30分钟后再加1微升CIP,1小时后加5微升50mM EGTA,在65℃保温10分钟停止反
应。为了对含有钝端或切口5′端的DNA脱磷酸化,分别在37℃下15分钟和56℃下15分钟重复保温。用酚/Sevag萃取及乙醇沉淀DNA。
放射性自显影
胶片:AGFA-Gevaert,Curix RP1,100AFW,柯达XAR5,1651512 X射线显影剂;AGFA G153,柯达Lx24X射线定影剂;AGFA G353,柯达AL4。
标准转化方法
采用D.Hanahan方法转化(1983年,J.Mol.Biol.,166期,557~580页)。
20毫升用单个菌落接种并在K.1776培养基中生长(37℃,200转/分摇床)的宿主菌株的隔夜培养菌,取其中1毫升接种到100毫升预热的(37℃)K1776培养基中。
这种培养菌在同样条件下培养,在0.2光密度500毫微米时停止细胞生长,冷却到4℃后离心分离,细胞碎片再完全悬浮在20毫升冰冷的转化缓冲液中,在0℃时培养5分钟。悬浮液再离心分离(3000转/分,4℃,15分钟)并再悬浮在4毫升冰冷的转化缓冲液。将7微升DMSO加到200微升等分溶液后,细胞再在冰水中培养15~60分钟。将溶于20微升TE缓冲液的DNA加入到该等分反应潜能细胞中,该混合物在冰水中培育20分钟,在42℃保温3分钟。将这种等分细胞接种到1毫升预热的(37℃)K1776培养基上,在37℃培养1小时。为转移转化株,对细胞进行离心(3000转/分,15分钟,4℃),再悬浮在YT培养基并涂覆在指示板上,根据转化株的期望量,需将一定量的悬浮液用于转移。
标准快速分析质粒分离
这个方法是Birnboim和Doly(1979年)方法的一种改进(见T.Maniatis等人,1982年)。从每个应予分析的转化株,制备2毫升隔夜培养菌(木刺挑菌,37℃,16小时,转盘),在12000克的Eppendorf离心机上离心分离1.5毫升隔夜培养菌1分钟,将碎片再溶于新鲜制
备的每毫升溶菌酶混合物含有2毫克溶菌酶的溶液,在20℃下保温5分钟,在加入新鲜制备的冰冷的含1%十二烷基磺酸钠的0.2M NaOH以后,该样品在冰上保温5分钟。为沉淀染色体DNA和蛋白质,加入150微升冰冷的乙酸钾(pH4.8)。在0℃保温5分钟,并在12000克离心机上离心10分钟后,含上清液的质粒再转移到干净试管,并用三氯甲烷/导戊基醇(24∶1)萃取,把500微升异丙醇加到水相,混合物在-20℃时保温30分钟。离心后(10分钟,12000克),沉淀物用80%乙醇洗涤,并在真空中短暂干燥。该材料足以满足5~6次凝胶电泳的不同的限制性分析。
用聚丙烯酰胺凝胶电泳标准纯化寡核苷酸
寡核苷酸(大约20光密度,260毫微米)溶于缓冲的甲酰胺(0.1M TBE,并在7M尿素,20%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离(Maxam和Gilbert,Meth.Enzymol.65期,500~560页,1980年)。凝胶放在荧光薄板上,照射紫外线使DNA可见,在聚丙烯酰胺凝胶电泳后(见上文),用分离DNA的标准方法最好作初步的分离和纯化,通常用γ 32p ATP和聚丙烯酰胺凝胶电泳分析5′端磷酸化,以检验这种方法的质量。
从β-半乳糖苷酶Lys-15-Glu-52-抑肽酶融合蛋白制备Glu-52-抑肽酶。
大量细菌合成的许多蛋白以不溶形式积累(D.C.Williams,R.M.Van Frank,J.B.Burnett,W.L.Muth,1982年,Science 215卷,687页)。这些不溶性蛋白称作包涵体。它们通常只用变性剂使之溶化,所以易于由其它细胞蛋白纯化。
大肠杆菌株RR1 δM15(ATCC 35102)用质粒pRK48.1.1转化,该质粒编码在大肠杆菌启动子、操纵基因和核糖体结合部位下游的Glu-52-抑肽酶β-半乳糖苷酶基因。15-Glu-52-抑肽酶β-半乳糖苷酶融合蛋白的最大积累量是细胞蛋白总量的20%。包涵物一般定位在极区或亚极区,靠近每个极有含一个包涵物的很大百分数的正态长细胞。
离心分离大肠杆菌株RR1 δ M15隔夜培养菌,然后再将碎片悬浮在致断(breaking)缓冲液,在超声破碎以后,细胞溶解物经离心分离回收包涵体,该包涵体用2M盐酸洗涤。根据Laemmli(U.K Laemmli 1970年,Nature 277卷,680~685页)所述(见图8),由SDS-聚丙烯酰胺电泳检查提纯步骤。
为回收完整的lys-15-Glu-52-抑肽酶,包涵体必须增溶并用溴化氰切断,不折叠的Glu-52-抑肽酶必须折叠。
包涵体可在含足够量DTT的6M盐酸中增溶。在未增溶部分被分离后,融合蛋白因对含10mM巯基乙醇的水透析而沉淀。将该湿融合蛋白溶于70%甲酸并根据Gross(E.Gross,B.Witkop 1961年,Amer.Chem.Soc.83卷,1510-1511页)所述,用溴化氰切下。
Glu-52-抑肽酶通过离子交换层析,与β-半乳糖苷酶的溴化氰片段分离,同时根据Creighton(T.E.Creighton,Proceedings of Genex-UCLA Symposium 1985年,金斯敦,在印刷中)所述的方法再折叠(图9)。活性抑制剂可用Westernblot分析法测定(图10)。
活性部分通过蒸发浓缩,然后对0.1M NH4HCO3进行透析。冻干后,在大孔RP-18层析柱上,用缓冲液A的0.1%TFA和缓冲液B的0.1%TFA、60%CHCN的梯度,通过高压液相色谱法(HPLC)纯化抑制因子。
合并活性部分,根据Hewick(R.M.Hewick,M.W.Hunkapiller,L.E.Hood,W.I.Dreyer 1981年J.Biol.Chem.256卷,7990~7997页)所述,抑制因子的特征在于用气相顺序仪使之微顺序化。从氨基末端起的前20个残基与预期的抑制剂完全相同(表2)。氨基酸分析说明抑制因子具有期望的氨基酸组合物(表1)。
抑肽酶和Glu-52-抑肽酶通过胰蛋白酶抑制活性的对比证明具有相同的剂量反应曲线(图11)。
所有的这些实验说明,在大肠杆菌中产生像融合蛋白那样的Glu-52
-抑肽酶是可能的,并且在复性条件下切下和分离后对其进行分离。
Val-15-Glu-52-抑肽酶及其他抑肽酶衍生物的制备
可按上述Glu-52-抑肽酶的同样方法,从β-半乳糖苷酶融合蛋白制备Val-15-Glu-52抑肽酶(图12,13)。通过弹性蛋白酶抑制分析测定其抑制活性。
抑制因子的特征在于氨基酸分析和氨基末端顺序(表1和2)。
所有其它的抑肽酶衍生物可按上述Glu-52-抑肽酶和Val-15-Glu-52-抑肽酶的同样方法进行制备。
表1
抑肽酶、Glu-52-抑肽酶和Val-15-Glu-52-抑肽酶的氨基酸分析
氨基酸 抑肽酶 Glu-52 Val-15-Glu-52
Asp 4.75(5) 4.92(5) 5.10(5)
Thr 2.90(3) 2.91(3) 2.85(3)
Ser 0.98(1) 1.01(1) 0.95(1)
Glu 2.90(3) 4.30(4) 4.30(4)
Gly 5.92(6) 5.91(6) 6.30(6)
Ala 6.00(6) 6.00(6) 6.00(6)
Val 1.04(1) 1.02(6) 2.06(2)
Met 0.95(1) - -
Ile 1.29(2) 1.30(2) 1.35(2)
Leu 2.10(2) 2.01(2) 2.01(2)
Tyr 3.92(4) 3.70(4) 3.81(4)
Phe 3.86(4) 4.08(4) 4.05(4)
Lys 3.99(4) 3.80(4) 3.10(3)
Arg 5.82(6) 5.75(6) 6.00(6)
用邻-苯二醛在立式塔衍生后测定氨基酸。
Cys和Pro未测定。
表2
Glu-52和Val-15-Glu-52-抑肽酶(氨基末端)的氨基酸顺序
1.Glu-52-抑肽酶;大约1毫摩尔物质的顺序超过20个循环:
1 15
Arg-pro-Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Tyr-Thr-Gly-Pro-Cys-Lys-
16 20
Ala-Arg-Ile-Ile-Arg-
2.Val-15-Glu-52-抑肽酶;大约1毫摩尔物质顺序超过20个循环:
1 15
Arg-Pro-Aps-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Tyr-Thr-Gly-Pro-Cys-Val-
16 20
Ala-Arg-Ile-Ile-Arg-
抑肽酶和Glu-52-抑肽酶的对比
用BrCN切下后得到的Glu-52-抑肽酶与抑制猪胰蛋白酶活性的真实抑肽酶相比较,Pyrglu-Gly-Arg-pNA和苯甲酰-Arg-pNa两种物质用于胰蛋白酶测定。
抑肽酶的原料溶液是1微克/毫升,Glu-52-抑肽酶的原料溶液是0.6微克/毫升。0、100、200、300、400、500微升这种原料溶液和苯甲酰-Arg-pNA用于试验,在试验中使用0、3、6、9、12、15微升Pryglu-Gly-Arg-pNA,其结果列于表3。
表3
抑肽酶 Glu-52-抑肽酶
作用物 抑制剂量 △E/10分钟 抑制剂量 △E/10分钟
(每次测定) (每次测定)
苯甲酰- 0毫微克 0.91 0毫微克 0.91
Arg-pNA 100 0.76 60 0.77
200 0.57 120 0.68
300 0.39 180 0.58
400 0.08 240 0.44
500 0.00 300 0.30
Pyr-Glu- 0毫微克 0.85 0毫微克 0.84
Gly-Arg- 3 0.62 1.8 0.67
pNA 6 0.39 3.6 0.56
9 0.29 5.4 0.47
12 0.18 7.2 0.32
15 0.13 9.0 0.28
这些结果说明,抑肽酶和Glu-52-抑肽酶在两种胰蛋白酶抑制测定中的剂量响应曲线是相同的。这不仅说明Glu-52-抑肽酶几乎含100%活性分子,而且胰蛋白酶即抑制剂复合物具有相同量级的平衡常数。
Western印迹法
用Towbin所述方法进行Western印迹测定(H.Towbin,T.Staehelin),I.Gordon 1979年,美国国家科学院论文集76卷,4350~4354页)。以兔子的多克隆抗抑肽酶抗体作为初级抗体,含生物素的辅助抗兔子抗体作为次级抗体,探测硝化纤维的斑迹。按产品供应者手册所述,以抗生蛋白链菌素-生物素的辣根过氧物酶与4-氯-1-萘酚的复合物为作用物,检测免疫复合物(Amersham buchler,Braunschweig)。
固相酶连接免疫吸收剂测定(ELISA)
固相酶连接免疫吸收剂测定(ELISA)按Muller-Esterl(W.Muller-Esterl,A.Oettle.E.Truscheit,H.Fritz,Fresenius Z.Anal.Chem.(1984年)317卷,718~719页)所述,用微滴定度抗体板以竞争性方式进行。
氨基酸顺序测定
在30微升TFA中增溶大约0.5~2毫微摩尔蛋白质,该试样加到用3毫克polybrene预处理过的玻璃纤维滤器,顺序分析根据Hewick(R.M.Hewick,M.W.Hunkapiller,L.E.Hood,W.Dreger 1981年,I.Biol.Chem.256卷,7990~7997页)所述应用生物系统(美国股份有限公司)由气相蛋白质顺序装置来完成。分析逐步释放的氨基酸乙内酰苯硫脲衍生物,用氰基-HPLC柱(DU PONT)以及由Beyreuther(K.Beyrenther,B.Biesler,J.Borsens,R.Dildrop,K.Neufer,K.stuber,S.Zais,R.Ehring,P.Zabel 1983年,《蛋白质化学的现代方法》303~325页,Walter de Gruyter &Co.,Berling)所述的分离系统进行。使用Waters HPLC系统,包括M510泵、WISP710B自动注射器、LC-分光光度计M481和Shimadzu整合仪C-R3A。
酸水解和氨基酸分析
将大约1毫微摩尔蛋白质加到耐热玻璃管中,再加入200微升6M含0.05%2-巯基乙醇的恒沸HCl(I.T.Potts Jr.1969年《分析生物化学》131期,1~15页)。管子在真空下密封,110℃保温22小时。水解产物快速干燥,再溶解于150微升0.2M柠檬酸钠缓冲液,pH2.2,过滤。用装有荧光检测器和Shimadzu C-R2AX整合仪的Biotronik Lc 5000氨基酸分析仪进行氨基酸分析,基本上按Benson所述,与邻苯二醛反应后,定量测定氨基酸(J.R.Benson,P.E.Hare 1975年,美国国家科学院论文集72卷,619~622页)。
标准白细胞弹性蛋白酶测定
材料
人体白细胞弹性蛋白酶获自弹性蛋白制品公司(Inc.,P.O.Box 147,Pacific,Miss.63069/美国)。
甲氧琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-脯氨酰-L-缬氨酸-对硝基酰苯胺(K.Nakajima,J.C.Powers,M.J.Castillo,B.M.Ashe and M.Zimmermann,《生物化学》254卷,4027页,1979年)可得自Fa.Bachem,Feinchemikalien AG,Hauptstr,144,CH-4416 Bubendorf/瑞士。
方法
在100毫升50%乙二醇中溶解1毫克酶所得溶液,取其5μl加到550微升由下列材料组成的混合物:含0.05%多山梨酸脂80(Tween80)和0.05M氯化钙的0.2M Tris缓冲液pH8.0和抑制剂溶液。该混合物在室温下保温30分钟,然后搅拌加入100微升混合溶液,该混合溶液由6.5微升的甲氧琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-脯氨酰-L缬氨酸-对硝基酰苯胺(59mg)的二甲亚砜(1ml)溶液和试验缓冲液组成。在405处显示了光密度的增加,通过放大含试样和控制酶的抑制剂光密度增加系数来测定抑制百分率。
胰蛋白酶的抑制(测定)
胰蛋白酶抑制的测定,借助于作用物苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基酰苯胺(Merck 1670)或焦谷氨酰基-甘氨酰-精氨酸-对硝基酰苯胺,它由可买到的焦谷氨酰基-甘氨酸(SENN 6886)和精氨酸-对硝基酰苯胺×HBr(SENN 9123)用二环己基碳二亚胺缩合法合成。这种作用物还作为尿激酶作用物以名为KAB1 S-2444的商品销售。
前者对试样的抑肽酶量有线性响应的优点,但灵敏度较低。后者有较高的灵敏度,但由于抑肽酶-胰蛋白酶复合物在低浓度下的解离,剂
量响应曲线是非线性的。
测量胰蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂的缓冲液是含0.01M CaCl2和0.05% Tween80
的0.2M Tris。
这种测定可用在400毫微米能读数光密度(ODs)的任意分光光度计完成。为全自动测量,光度计必须装有微处理机或与适宜的个人计算机相连接。
全部测定可用1厘米半微量塑料比色杯。每隔1分钟读数光密度,在室温下超过8个周期。每分钟OD的平均增加量可任意地取作活性单位。
为测定抑制作用,猪的胰蛋白酶(Merck 8350)溶液(0.001N HCl/50%甘油)与抑制剂试样混合,用缓冲液调至500微升,在室温下保温10分钟,再加入作用物溶液促使反应进行。更详细情况列于下表。抑制活性取自标定曲线或特意为此目的编制计算机程序的自动计算。
用Pyrglu-Gly-Arg-pNA 用苯甲酰基-Arg-pNA
为作用物的测定 为作用物的测定
胰蛋白酶 15微升(1微克/毫升) 20微升(100微升/毫升)
作用物 50微升(10%乙醇含0.02M) 50微升(10%DMSO含0.012M)
在本领域内已知大量的各种微生物适用于转化,也就是能在培养液中生长或发酵的那些单细胞生物。用于转化的最理想生物包括细菌、酵母和真菌。
本文公开的为此工作所选择的特定微生物是E.coli RR1△15,存储在美国标准菌库,编号为ATTC 35102号。也可用其它适宜的E.coli菌株。
本发明还包括药物制剂及其制备方法,制剂中除药物上适合的无毒惰性赋形剂外,还含有本发明的1种或多种化合物,或由本发明的1种或多种活性化合物组成。
本发明还包括各种剂量单位的药物制剂,即这些制剂成各种形式,如片剂、包衣片剂、胶囊、丸药、栓剂和针剂。其中活性化合物的含量相当于单剂量的一部分或是单剂量的几倍。剂量单位可包括如1、2、3、或4单剂量,或者1/2、1/3或1/4单剂量,单剂量最好含有一次服用的活性化合物的量,通常相当于一日剂量的总量、1/2或1/3或1/4。
所谓药用上适宜的无毒惰性赋形剂指的是固体、半固体或液体稀释剂,填料及所有类型的配方助剂。
片剂、包衣片剂、胶囊、丸药、粒剂、栓剂、溶液、悬浮液和乳剂、泥膏剂、软膏、凝胶、乳膏、洗涤剂、粉剂和喷雾剂可说是最好的药物制剂。
片剂、包衣片剂、胶囊、丸药和粒剂可含活性化合物或常规赋形剂之外的化合物,如(a)填料和膨胀剂如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和二氧化硅,(b)粘合剂如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮,(c)致湿剂如甘油酰,(d)崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸钠、(e)溶液阻滞剂如石蜡,(f)吸收加速剂如季铵化合物,(g)润湿剂如鲸蜡醇和甘油酰-硬脂酸,(h)吸附剂如高岭土和膨润土,以及(i)润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和硬脂酸镁以及固体聚乙二醇,或所述(a)至(i)物质的混合物。
提供的片剂、包衣片剂、胶囊、丸药和粒剂,用通常的包衣和壳层,可任意地选择不透明剂,还可以是一种将活性化合物或化合物仅仅或者优先在肠道的一定部分释放的组合物,也可任意缓释,以及可用聚合物和蜡包埋。
活性化合物或化合物与一种或几种上述赋形剂一起,还可制成微胶囊形式。
栓剂除活性化合物或化合物外,还包括通常的水溶性或水不溶性
赋形剂,例如聚乙二醇、脂肪如可可脂肪和高碳酯(例如C16脂肪酸的C14醇)或这些物质的混合物。
软膏、泥膏剂、乳膏和凝胶除含有活性化合物或化合物以外,还可含常规赋形剂,例如动物脂肪和植物脂肪、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石粉和氧化锌,或这些物质的混合物。
粉剂和喷雾剂除含活性化合物或化合物以外,还可含常规赋形剂,例如乳糖、滑石粉、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末,或这些物质的混合物。喷雾剂还可包含通常的发射剂,如含氯氟烃。
溶液和乳剂除含活性化合物或化合物外,还可含普通赋形剂,如溶剂、增溶剂和乳化剂,例如水、乙醇、异丙基醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类、尤其是棉子油、花生油、玉米芯油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油、甘油、甘油缩甲醛、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨醇的脂肪酸酯,或这些物质的混合物。
对于不经肠道给药,还可以是与血液等渗压的无菌溶液和乳剂。
悬浮液除含活性化合物或化合物外,还可含普通赋形剂,例如液体稀释剂:水、乙醇、丙二醇,悬浮剂如乙氧基异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂以及黄蓍胶,或这些物质的混合物。
所述制剂还可包括着色剂、杀菌剂及改善气味和调味的添加剂,如薄荷油和桉油,以及增甜剂如糖精。
治疗用的活性化合物在上述制剂中,浓度最好约是混合物总量的0.1~99.5%(重量),最好为0.5~95%(重量)。
上述药物制剂除了包括本发明的化合物外,还可包括其它药用活性化合物。
上述药物制剂是用已知的常规方法制造的,例如用活性化合物或多种化合物与一种或多种赋形剂相混合的方法。
施用活性化合物或药物制剂可以是局部的、口服的、非肠道的、腹膜内的和/或直肠的方法,最好是口服或非肠道用药如静脉或肌肉注射。
总的说来,人用药品和兽用药品根据本发明每24小时以总量的大约0.5~500,最好是5~100毫克/公斤体重给以活性化合物或多种化合物,可任意选择分次给药的形式,以达到所要求的效果。单独给药中本发明的活性化合物或多种化合物,最好大约1~250,特别是3~60毫克/公斤体重。然而,偏离所述剂量则必需考虑,特别是倘若发生用药超越接受治疗的本身机能和体重、病的性质和严重程度,制剂和用药的性质,以及给药的时间和间隔的情况。
因此,在某些情况下,低于上述活性化合物的量就可满足,而在另一些情况下,上述活性化合物量必须超过。特别需要的最佳剂量和活性化合物给药类型,熟悉本领域的任何人在其熟悉的知识基础上可容易地决定。
用表达质粒pRK49.2.1和pRK48.1.1转化的E.coli,存放在德国微生物收藏中心,戈廷根,格利斯巴赫大街8号,D-3400,收藏号DSM3678和DSM3679。并且已于1987年3月25日寄存在中国典型培养物保藏中心,保藏号分别为CCTCC No:M87024和CCTCC No.M87025。
作为实施例7的同系物Arg-15同系物对治疗急性炎症非常有效,如风湿性关节炎、遗传、血管神经性水肿、肺炎、胰炎和休克。该Arg-15-同系物进一步用作透析方法中人造膜和体外循环中的保护剂。
实施例1
编码Glu-52和Val-15-Glu-52-抑肽酶的DNA片段的合成和纯化
用固相合成方法制备含基因的寡核苷酸。寡聚体的合成图是示意
图,活化所用质子,即被护2′-脱氧核苷酸磷酰胺。用从应用生物系统制造厂得到的被护核苷酸、溶剂、化学药品及试剂在380型DNA合成仪上自动控制完成全部顺序步骤。从同一工厂得到的固相载体是一种可控制的微孔玻璃,与起始的3′-核苷酸微相连接。按照制造厂操作规程和使用规定,进行了某些改进后引入自动反应循环。根据制造厂建议,合成完成后,寡聚体与DNA合成仪内的固相载体解封并断开。
在密封管中,含寡聚体的水溶液用浓氢氧化铵在55℃加热4~24小时,除去保护基团。蒸发所得溶液,残留物溶于0.01M碳酸氢三乙铵缓冲液,pH7.0(TEAB缓冲液)。该溶液在Sephadex-G50
凝胶过滤树脂上层析,用同样的TEAB缓冲液处理和洗脱该层析柱,汇集洗脱的物料并蒸发该溶液。
一部分溶于装载缓冲液(组分:在甲酰胺中,0.1%溴酚蓝,0.1%二甲苯基苯胺,10毫米乙二胺四乙酸二钠)的残余物(在260毫微米处吸光度为10~40%)通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步纯化,该凝胶尺寸是18×32厘米,厚度1.5毫米。用这种方法纯化的每个寡聚体的合适尺寸,其宽度为2~5厘米,用单个凝胶纯化的寡聚体至多5个。凝胶中丙烯酰胺浓度为14~20%,取决于所要求产品的链长。对较长的寡聚体,最好是14%丙烯酰胺凝胶,而纯化较短的寡聚体,丙酰胺凝胶至多20%,该凝胶还含7M尿素和Tris-硼酸盐-EDTA缓冲液(0.1克分子Tris,0.1M硼酸盐,2mM EDTA,pH8.3)。流动缓冲液是同样的Tris-硼酸盐-EDTA混合物。在恒定功率20~60瓦特,电泳18~6小时。这种标准技术可参阅应用生物系统的各种用户信息公报。
完成电泳后将凝胶包在塑料包装纸内,寡聚体由紫外线投影显象。包好的凝胶放在荧光薄层色谱板上,用短波长紫外光源观察凝胶。所要求的产品主要呈蓝色的DNA片段,用这种投影技术表现为最慢的转移,自凝胶产生的带是存在的。用EpiGene D-Gel
电泳装置将DNA寡聚体
从凝胶洗脱到粉状二乙氨乙基(DEAE)纤维素上。用1M TEAB缓冲液洗脱纤维素,回收寡聚体,再蒸发含寡聚体的缓冲液,残余物溶于0.01M TEAB缓冲液,然后,通过所述Sephadex-G50
柱脱盐,储集洗脱物并冻干得到最终产品。
用以上概述的方法,得到的每个纯化寡聚体约为0.5~5.0A260单位。
实施例2
用于Glu-52和Val-15-Glu-52-抑肽酶的合成抑肽酶主导基因的构建
这些特定的合成抑肽酶基因的构建包括15种纯核化寡苷酸的组合(见图2)。图3所示DNA顺序包括起始密码子ATG,两个末端密码子TAG和TAA,末端限制部位Eco RⅠ,Hind Ⅲ和Bam HⅠ,以及内限制部位。选择这些部位有助于编码顺序的克隆及其修饰。
用来生成这种合成基因的构建,除应用这些片段外,还使用多核苷酸激酶、T4 DNA连接酶,以及在材料与方法一节详细叙述的限制酶。
15种纯化的寡核苷酸片段溶于50mM TEABC(碳酸氢三乙铵缓冲液,pH7.5)最终浓度为10微微摩尔/微升。所有片段都磷酸化,处理成4个单独部分(片段1,3;片段2,4,6;片段5,7,9,11,13;片段8,10,12,14,16)。为了制备,各个片段用80微微摩尔分别溶于由下述物质组成的混合物,这些物质为1X PNK-混合物、2μM ATP、每10微微摩尔片段含0.5微居里P gamma ATP、每微微摩尔片段10单位PNK,使总体积分别为片段1,3,300微升;片段2,4,6,400微升;片段5,7,9,11,13和片段8,10,12,14,16:各为700微升。各部分反应在37℃时进行30分钟,所有部分被酚解,用乙醇沉淀、洗涤和干燥。
为了杂交,片段1,3和2,4,6(A组)溶解混合于1X连接酶混合物,总容积120微升,在70℃保温5分钟,在5小时内冷却到室温。其它片段(B组)按照相同方法在240微升中杂交。
为了连接,A组溶液补充12微升10mM ATP,12微升100mM DTE,20微升TA-DNA连接酶,而B组溶液补充两倍的量。在14℃下反应7小时,此后,A组加10微升T4 DNA连接酶,B组加20微升,再在14℃下保温45分钟。酚解该混合物,用乙醇沉淀并干燥。
得到的A组溶于90微升1X SP-100和10微升Eco RⅠ(10μ/μl),B组溶于90微升1X SP-50和10微升Bam HⅠ,在37℃下保温1小时。用酚萃取和乙醇沉淀而停止这些反应,进行6%聚丙烯酰胺凝胶电泳,各组DNA按上述同样方法回收。
等量放射性标记的A组和B组溶于水,调节至1X连接酶混合物,为最终连接成合成基因按上述杂交。为此,3微升10mM ATP,3微升100mM DTE,3微升T4 DNA连接酶加到22微升杂交混合物,在14℃下保温7小时,再加1微升T4 DNA连接酶,该反应在14℃下进行45分钟,通过酚萃取和乙醇沉淀提纯连接产品。在Sp-50中完成标准的限制酶消化(Bam HⅠ 1.5微升,Eco RⅠ 1.5微升双重消化),酚萃取的物料在乙醇沉淀前,该水溶液调节至3mM MgCl 0.3M乙酸钠。然后进行6%聚丙烯酰胺凝胶电泳,按上述同样方法回收基因。
实施例3
重组体质粒pRK63.1.1和pRK54.1.1的构建
为实验抑肽酶克隆精选的质粒是pUC8(J.Vieira和J.Messing,1982年Gene,19期,259页),这种克隆载体的组成是pBR322衍生的α-氨基苄青霉素酶基因和连接到含一组特殊的限制酶识别部位的lac Z基因部分的DNA复制起点。当这种载体引入lac E.coli,转化株就在适当的指示板上产生蓝色菌落,将DNA片段克隆到许多限制部位的任意部位上,如Eco RⅠ和Bam HⅠ之间的部位,使lac基因失活产生白色菌落。
载体制备
为把合成抑肽酶主导基因连接到pUC8中,完成制备载体制剂,用
Eco RⅠ和Bam HⅠ,在标准核酸内切限制酶消化条件下两次消化纯化pUC8DNA(大约30微微摩尔),切出Eco RⅠ-Bam HⅠ内的一小段片段。这种制剂按上述方法用小牛肠内的磷酸酶进行脱磷酸化,通过琼脂糖凝胶电泳分离,并提纯载体的Eco RⅠ-Bam HⅠ大片段(标准条件下)。这种方法非常便于用载体进一步工作,因为排除了在Eco RⅠ和Bam HⅠ末端上的载体分子的自身连接和转化株的背景急剧减少。
连接
用1微微摩尔载体通过连接纯化合成抑肽酶基因的总量构建pRK63(见图4)(1.8单位T4-DNA-连接酶,1X连接酶混合物,总容积45微升,在14℃下保温7小时,添加1单位T4-DNA-连接酶,在14℃下再保温45分钟)。
转化
用D.Hanahan的转化方法(详见标准转化方法),E.coli菌株RRIδM15(A.Kalnins等,1983年,EMBO Journal,2期,593页;ATCC35102)用作受体细胞。用50%连接物在含200微克/毫升α-氨基苄青霉素的指示板上转化后,得到15个“白色”转化株。15个转化株都用Birnboim和Doly1979年改进的快速分析质粒分离的方法(见上)进行筛选。为此,15个试样的碎片再溶于30微升含1微克核糖核酸酶A的1X SP-100中,用Eco RⅠ和Bam HⅠ完成限制性消化。
凝胶电泳后,发现15个转化株中的4个含有携带约200个碱基对长的Eco RⅠ-Bam HⅠ片段的质粒DNA。
携带这种Eco RⅠ-Bam HⅠ片段的所有转化株大量生长,分离出每个转化株的质粒作进一步分析,其中两个根据Maxam和Gilbert方法编顺序,顺序全部正确,证明了化学合成和构建极好。
通过Apa Ⅰ-Stu Ⅰ片段的合成基因的β组与含有在15位取代Lys的Val密码子的β组作简单交换,构建质粒pRK54.11(Val-15-Glu-52抑
肽酶)。
大约100微微摩尔合成SS DNA片段BEA 4A和BEA 4B(见图2B)溶于20微升水中,在95℃下加热5分钟,再在5小时内缓慢冷却至室温。用1.5微微摩尔缺失Apa Ⅰ-Stu Ⅰ片段的pRK63.1.1的纯化DNA连接杂交的未磷酸化片段,用30微升连接混合物进行标准连接,用50%连接混合物转化E.coli RR Ⅰ△M15。通过分析质粒分离和限制性分析,从1500个转化株中检查24个,全部正结果,其中两个用BioLabs(Beverly,MAUSA)的M13双脱氧核苷酸顺序系统编排顺序。转化株pRK54.1.1用于进一步实验。
实施例4
表达质粒pRK48.1.1和pRK49.2.1的构建
为表达融合蛋白的抑肽酶,构建一种质粒,其中抑肽酶基因位于β-半乳糖苷酶基因的羧基末端,如U.Rüther和B.Müller-Hill(1983年,EMBO Journal,2期,1791~1794页以及德国专利DE-OS 3309501.9号)所进行的类似实验。
为克隆表达载体pUR278中的合成抑肽酶基因,选择克隆部位BamHⅠ和HindⅢ,因此有必要在基因的5′EcoRⅠ端添加BamHⅠ部位,以及在3′端用HindⅢ部位,修饰抑肽酶基因(见图6)。
50微微摩尔pRK63.1.1DNA在37℃下,用120微升1 XSP-100中EcoRⅠ(15微微摩尔hit/微升)处理过夜,达到完全消化。通过与DNA聚合酶Ⅰ(Klenow片段)、dATP和dTTP(Maniatis等,1982年)的酶反应,填满这种DNA材料伸出的5′EcoRⅠ端。溶解600微微摩尔干燥的α32P ATP(250微居里),并与160微升DNA(50微微摩尔)、10微升1mM dATP(10000微微摩尔)、20微升NT缓冲液混合。然后添加10微升DNA聚合酶Ⅰ(Klenow,50微米),在室温下进行第一次保温,30分钟后,将10微升1mM dTTP(10000微微摩尔)与5微升聚合酶(25微米)一起加入,
在室温下进行第二次保温。用酚/Sevag萃取的物料,将放射性标记的分子量部分储集后用乙醇沉淀、洗涤、溶于50微升TE,于20℃下储存。
20微升这种齐平端的材料用于Bam HⅠ取结子连接,为此,用γ 32P ATP标记的400微微摩尔5′BamHⅠ联结子(标准5′磷酸化方法)连接到40微微摩尔DNA端(标准连接条件:4.5微米T4 DNA连接酶,总容积60微升)。为检查联结子连接质量,进行分析凝胶电泳,加入100微微摩尔BamHⅠ联结子、1.8单位T4 DNA连接酶以后,在20℃下保温1小时,再加入1单位T4 DNA连接酶,在14℃下保温18小时,达到完全连接。用酚/Sevag萃取反应混合物,用乙醇沉淀、洗涤、干燥并溶于40微升TE。
为制备具有Bam HⅠ和Hind Ⅲ末端的合成抑肽酶基因,先后用Hind Ⅲ(10.5微微摩尔hit/微升,5小时,37℃)和Bam HⅠ(40微微摩尔hit/微升,20小时,37℃标准条件)切断连接的线状质粒(10微微摩尔)。在6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和谨慎地纯化(见标准方法)后,分离出该片段。
载体制备
起始载体pUR278(大约5微微摩尔)首先用由酚/Sevag萃取、乙醇沉淀、再溶解纯化的Hind Ⅲ(标准条件)切开,然后用BamHⅠ(标准条件)消化。这种材料装到1%琼脂糖凝胶上,根据标准条件进行电泳,分离和提纯,除去18碱基对长的BamHⅠ-HindⅢ片段,该片段与合成抑肽酶基因竞争连接。
连接和转化
为连接0.3微微摩尔载体,使用1.5微微摩尔片段(近似)、2单位T4 DNA连接酶(标准条件,总容积30微升,在14℃下保温4小时)。
用E.coli菌株RRl δ MI5作为宿主,用1/3连接酶混合物(标准条件)完成转化。在含200微克α-氨基苄青霉素/毫升的指示板上得到总数为173个“蓝色”菌落。从这12个转化株中用快速分析质粒分离法
(标准条件)分析,按通过再连接载体得到转化株的百分率计算,173个转化株中应有30个是背景转化株。这个结果经12个转化株质粒的限制性分析得到肯定,其中8个是正结果,约有200碱基对的BamHⅠ-Hind Ⅲ限制片段。正重组体质粒也由Sst Ⅱ和抑肽酶基因内特殊的限制部位线性化。根据Maxam和Gilbert的碱基顺序分析(1980年),展现了质粒pRK48.1.1插入了所要求的抑肽酶DNA片段(见图6),用质粒pRK48.1.1作进一步分析和表达工作。
按完全相同的方法,用pRK54.1.1中的Val-15-Glu-52基因,构建质粒pRK 49.2.1。表示正确的DNA顺序和构建的正重组体质粒49.2.1用来进一步分析和表达工作。
检测β-半乳糖苷酶-Glu-52-抑肽酶和β-半乳糖苷酶-Val-15-Gln-52-抑肽酶的表达
为试图表达上述各个构建,将带有pRK48.1.1(保藏在DSM,DS No.3679)和pRK49.2.1(保藏在DSM,DSM No.3679)的E.coli菌株接种到2微升补加4微升0.1MIPTG的Lβ-α-氨基苄青霉素培养基中。将不含抑肽酶基因插入物的pUR278的克隆接种到培养基中,为测定提供负对照。在37℃下搅拌培养12~16小时后,将1毫升样品直接接种到100毫升LB-α-氨基苄青霉素培养基中。在37℃下搅拌培养12~16小时后,通过在贝克曼JA10旋转器(5000转/分)中离心分离10分钟收集细胞。
根据Laemmli,U.K.所述,用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳直接检测融合蛋白(1970年,Nature,277期680页,并参阅B.D.Hames和D.Rickwood1981年,蛋白质的凝胶电泳,IRL Press股份有限公司,牛津)。
每条约1×10E9细胞进行离心分离后,再溶于稀释度为1∶5的SDS样品缓冲液(0.3M Tris HCl pH8.8,50%甘油,5%SDS,25%巯基乙醇)。电泳后,凝胶用Coomassie蓝染色,图7说明E.coli蛋白与可归纳的β-半乳糖苷酶Glu-52抑肽酶融合蛋白的典型组合。
溶液
致断(bleaking)缓冲液:
50mM Tris;100mM氯化钠;
10mM氯化镁;
10mM巯基乙醇;
2M盐酸鈲溶液;
2M盐酸鈲;
50mM Tris-HCl,pH7.7;100mM氯化钠;
10mM巯基乙醇;
6M盐酸鈲溶液;
6M盐酸鈲;
50mM Tris-HCl;100mM氯化钠;
10mM巯基乙醇。
实施例5
Glu-52-抑肽酶的制备
1,β-半乳糖苷酶-融合蛋白Lys-15-Glu-52-抑肽酶的分离和溴化氰切断
为此制备目的,用8000转/分离心分离6升大肠杆菌隔夜培养菌株RRl δM15,15分钟,大约有15克(重量)的碎片再悬浮于30毫升致断缓冲液中并超声破碎6分钟(冰冷却),用20000转/分离心细胞溶解产物20分钟,除去上清液,大约10克碎片再悬浮于20毫升2M盐酸鈲溶液,使之均匀。用20000转/分离心20分钟后,除去上清液,在N2气氛下,大约8克碎溶于20毫升6M含200毫克DTT的盐酸鈲溶液,在50℃下还原1小时。该溶液用10000转/分离心10分钟,对含10M巯基乙醇的水透析24小时。用20000转/分离心20分钟,收集沉淀的融合蛋白,该湿融合蛋白溶于30毫升浓甲酸,然后用水稀释到70%,加4克溴化氰切断该
融合蛋白,在黑暗氮气氛下保温18小时,用200毫升水稀释,停止该反应,通过冻干排除水份和挥发性副产品。根据Laemmli,用SDS凝胶电泳检查溴化氰切断情况,得到约是1.5克溴化氰片段,在一系列试验中产量变化范围为0.8~2.5克。
溶液
缓冲液A.pH8.2,
50毫摩尔Tris-HCl,
1毫摩尔EDTA,
调至pH8.2,
缓冲液B,pH8.2,
在缓冲液A中加入:
8M尿素,
1毫摩尔双-(2-羟乙基)-二硫化物,
1毫摩尔2-巯基乙醇,
缓冲液C,pH8.2,
在缓冲液A中加入:
1毫摩尔双-(2-羟乙基)-二硫化物,
1毫摩尔2-巯基乙醇,
缓冲液D,pH8.2,
在缓冲液A中加入0.6摩尔氯化钠。
2.Glu-52-抑肽酶的分离和复性
大约300毫克冻干的Lys-15-Glu-52-抑肽酶β-半乳糖苷酶溴化氰片段溶于300毫升含300毫克DTT的缓冲液B。该溶液在氮气氛及50℃
下还原1小时,然后加到CM-Sephadex层析柱(25×100毫米),注入约15毫升CM-Sepharose Fast Flow
。该层析柱用缓冲液B平衡、洗涤,直至基准稳定为止。在第一线性梯度洗脱中,该层析柱用100毫升缓冲液B和100毫升缓冲液C展开。在第二线性洗脱梯度之前,用缓冲液A洗涤该层析柱,直至基准稳定为止。用100毫升缓冲液A和100毫升缓冲液D形成第二梯度。试验的峰值部分为胰蛋白酶抑制活性并通过ELISA和Western印迹法(Western blot)测定(见图10)。在一系列实验中,通过不同试验估算的产量是0.4~2毫克。
3.用反相高压液相色谱法纯化Glu-52-抑肽酶
通过蒸发浓缩活性部分,然后对0.1M NH4HCO3pH=7.5透析18小时。冻干后,抑制剂溶于0.1%TFA,并在大孔径RP-18柱(BIORAD)用含0.1%TFA的缓冲液A和0.1%TFA的缓冲液B反相色谱法分离。该抑制剂的特征在于氨基末端的顺序和氨基酸分析。
实施例6
Val-15-Glu-52-抑肽酶的表达及产品的特征
按实施例5所述的相同方法完成含有质粒pRK49.2.1的E.coli转化株发酵和Val-15-Glu-52-抑肽酶的纯化,其不同在于通过弹性蛋白酶抑制测定而不是胰蛋白酶试验活性。Val-15-Glu-52-抑肽酶比Glu-52-抑肽酶从CM-Sephadex柱洗脱为早。
在一系列实验中,由不同测定计算的产量是0.1~1毫克。
相同的HPLC纯化法用于Val-15-Glu-52-抑肽酶的分离。由测定白细胞弹性蛋白酶的抑制确定抑制活性。该抑制剂的特征在于氨基末端的顺序和氨基酸分析。
实施例7
Arg-15-Glu-52-抑肽酶的构建、表达和特征
为了构建Arg-15-Glu-52-抑肽酶基因,我们变换B组(图1)。这是
ApaⅠ-Stu Ⅰ DNA片段,其中Val-15-Glu-52-抑制酶基因被克隆在质粒pRK54.1.1。
用密码子CGT编码氨基酸15位上的精氨酸的相应片段替换该片段,得到的重组体载体称为pNH01.1.1,部分顺序化并用作进一步实验。
在Arg-15-Glu-52-抑肽酶基因的5′端,加入BamHⅠ部位,将分离的基因连接到切开的表达载体pUR278的BamHⅠ-HindⅢ。
该DNA用于转化E.coli RR1δM15,并选择含新的表达质粒pRK112.1.1的转化株。
从这种转化株,分离β-半乳糖苷酶Arg-15-Glu-52-抑肽酶融合蛋白质,如上述用溴化氰切断后,纯化Arg-15-Glu-52-抑肽酶。
出于意料的是动力学研究表明重组体Arg-15-Glu-52-抑肽酶是非常有效的人血浆激肽释放酶(Ki=3.2×10-10(M))的抑制剂,带有Ki值小于10-11(M)的阳离子和阴离子人胰蛋白酶。该Ki值由M.W.Empie和M.Laskowski,jr.法测定,参阅《生物化学》21卷,2274页(1982年)。
Claims (13)
1、制备抑肽酶药物组合物的方法,该方法包括将一种或多种作为活性组份的抑肽酶或抑肽酶同系物与一种或多种无毒惰性药物赋形剂相组合,其特征在于所述抑肽酶或抑肽酶同系物系由微生物方法产生,在其52位上被选自Glu,Leu,Val,Thr和Ser的氨基酸取代或与在15位上由天然氨基酸取代相结合。其中抑肽酶或抑肽酶同系物的制备方法包括如下步骤:
(a)通过杂交、连接和纯化,将纯化的寡核苷酸合成下列编码抑肽酶或抑肽酶同系物的DNA片段或功能与其相同的片段:
片段1AATTCATGCTCCGGACTTCTGCCTCGAGC
片段2CAGAAGTCCGGACGCATG
片段3CGCCGTACACTGGGCCCTGCAAAGCT
片段4CCCAGTGTACGGCGGTCGAGG
片段5CGTATCATCCGTTACTTC
片段6ATGATACGAGCTTTGCAGGG
片段7TACAATGCAAAGGCAGGCTGTGTCAGACC
片段8CCTGCCTTTGCATTGTAGAAGTAACGG
片段9TTCGTATACGGCGGTTGCCGTGCTAAGCGT
片段10AACCGCCGATACGAAGGTCTGACACAGG
片段11AACAACTTCAAATCCGCGGAAGACTGCGAA
片段12ATTTGAAGTTGTTACGCTTAGCACGGC
片段13CGTACTTGCGGTGGTGCTTAGTAAAGCTTG
片段14CACCGCAAGTACGTTCGCAGTCTTCCGCGG
片段16GATCCAAGCTTTACTAAGCAC
(b)连接上述DNA片段或功能与其相同的片段,得到具有下列DNA顺序的主导基因:
E A
C P
O A
R I
I
AATTCATGCGTCCGGACTTCTGCCTCGAGCCGCCGTACACTGGGCCCTGCAAAGCTCGTA
1---------+---------+---------+---------+---------+---------+50
TTAAGTACGCAGGCCTTGAAGACGGAGCTCGGCGGACATGTGACCGGACGTTTCGAGCAT
c:
S
T
U
1
TCATCCGTTACTTCTACAATGCAAAGGCAGGCCTGTGTCAGACCTTCGTATACGGCGGTT
61---------+---------+---------+---------+---------+---------+120
AGTAGGCAATGAAGATGTTACGTTTCCGTCCGGACACAGTCTGGAAGCATATGCCGCCAA
S
A
C
2
GCCGTGCTAAGCGTAACAACTTCAAATCCGCGGAAGACTGCGAACGTACTTGCGGTGGTC
121---------+---------+---------+---------+---------+---------+180
CGGCACGATTCGCATTGTTGAAGTTTAGGCGCCTTCTGACGCTTGCATGAACGCCACCAC
H B
I A
N M
D H
3 I
CTTAGTAAAGCTTG
131---------+----194
GAATCATTTCGAAC
(c)将所述主导基因克隆到质粒pRK63,1,1,pRK54,1,1,pRK49,2,1或pRK48,1,1的EcoRI和BamHI之间的适当部位,构建表达载体,
(d)在52位上编码Glu,Leu,Val,Thr或Ser的密码子取代主导基因DNA顺序中的Met-52-密码子或与在15位上编码Val,Ile,Leu,Phe,Gly,Ala,Arg,Ser,Trp或Tyr的密码子取代主导基因DNA顺序中的Lys-15-的密码子相结合;
(e)连接在相应表达载体中得到的主导基因;
(f)用所述表达载体转化大肠杆菌;
(g)培养大肠杆菌转化株;
(h)从细胞培养物中分离出融合蛋白;
(i)从融合蛋白分离得到抑肽酶或抑肽酶同系物。
2、按权利要求1的方法,其中所述在15位上的天然氨基酸系除了蛋氨酸之外的任何氨基酸。
3、按权利要求2的方法,其中所述氨基酸选自Arg-15-,Val-15-,Ile-15-,Leu-15-,Phe-15-,Gly-15-,Ser-15-,Trp-15-,Tyr-15-和Ala-15-。
4、按权利要求1的方法,其中在52位上的氨基酸是Glu。
5、按权利要求3的方法,其中15位上的氨基酸是Val或Arg和52位上的氨基酸是Glu。
6、按权利要求3的方法,其中15位上的氨基酸是Ile和52位上的氨基酸是Glu。
7、按权利要求3的方法,其中15位上的氨基酸是Leu和52位上的氨基酸是Glu。
8、按权利要求1的方法,其中药物组合物中抑肽酶或抑肽酶同系物的含量为0.1-99.5%(重量),最好含0.5-95%(重量)。
9、按权利要求1的方法,其中主导基因DNA顺序中编码Met-52-的密码子被编码Glu-52-的密码子取代。
10、按权利要求1的方法,其中主导基因DNA顺序中编码Lys-15-的密码子被编码Vla-15-或Arg-15-的密码子取代和编码Met-52-的密码子被编码Glu-52-的密码子取代。
11、按权利要求1的方法,其中主导基因DNA顺序中编码Lys-15-的密码子被编码Ile-15-的密码子取代和编码Met-52-的密码子被编码Glu-52-的密码子取代。
12、按权利要求1的方法,其中主导基因DNA顺序中编码Lys-15-的密码子被编码Leu-15-的密码子取代和编码Met-52-的密码子被编码Glu-52-密码子取代。
13、按权利要求1的方法,其中所述用表达载体转化的大肠杆菌是E.coli RRI△M15 pRK 48.1.1 8266(CCTCC No.M.87024和E.coli RRI △M15 pRK 49.2.1 8268(CCTCC No.M87025)。
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