CN1484700A - aopB基因,蛋白,同系物,片段和它们的变体,以及它们在细胞表面展示方面的应用 - Google Patents

aopB基因,蛋白,同系物,片段和它们的变体,以及它们在细胞表面展示方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了根癌土壤杆菌中一个被称为AopB的外膜蛋白、其变体、同系物和片段以及相应的DNA分子。本发明同时也包括一个用AopB相关蛋白作为载体蛋白在细菌表面展示过客蛋白的方法。过客蛋白的展示提供了如活疫苗的发展、文库筛选、蛋白纯化、生物去污和全细胞催化方面的应用。

Description

aopB基因，蛋白，同系物，片段和它们的变体， 以及它们在细胞表面展示方面的应用
相关申请的参考
该申请享有于2000年11月2日提交的美国临时专利申请60/244,902所应享有的权益。该临时专利申请的内容引入本申请作参考。
技术领域
该项发明是关于根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的AopB外膜蛋白、它的变体、同系物、片段和相应的DNA分子，它们可用于细菌细胞表面的蛋白展示。
背景技术
分子展示技术已发展用于构建和筛选多肽与抗体展示库，并用于开发重组疫苗、吸附剂、重组生物催化剂，以及用于诊断和分析的固相试剂。分子展示技术的概念在于它提供了基因型(如抗体的可变区基因)和表型(如抗原结合)之间的物质连接，达到同时筛选编码欲求功能(如结合)蛋白的基因的目的。
噬菌体展示已经用于探明多肽-配体之间的相互作用和广泛的应用于高亲和蛋白的分离，包括抗体(Winter G，Milstein C.1991.Man-madeantibodies.Nature 349：293-299；Vaughan T.J.，Williams A.J.，Pritchard K.，Osbourn J.K.，Pope A.R.，Earnshaw J.C.，McCafferty J.，Hodits R.A.，Wilton J.，Johnson K.S.1996.Human antibodies with sub-nanomolar affinities isolatedfrom a large non-immunized phage display library.Nat Biotechnol 14：309-314).噬菌体库的筛选过程通常是用固定后的配体进行重复的噬菌体捕获和洗脱，然后将噬菌体在细菌中加以扩增。最近提出一种展示技术是应用核糖体使多肽和其编码RNA在体外加以连接(Hanes J.，Pluckthun A.1997.Invitro selection and evolution of functional proteins by using ribosome display.Proc Natl Acad Sci USA 94：4937-42)。然而，在这两种方法中使用的噬菌体和核糖体都不能够自我复制，而且太小以致于不能够利用强有力的细胞分选技术例如荧光激活细胞分选术(FACS)的协助。
FACS可有助于高效大量筛选在细菌表面展示的蛋白或抗体库，因为其使用的体积相对大的细菌细胞能让该系统挑选可与荧光标记后的配体高亲和、高特异性结合的克隆(Daugherty PS，Olsen MJ，Iverson BL，Georgiou G.1999.Development of an optimized expression system for the screening ofantibody libraries displayed on the Escherichia coli surface.Protein Eng.12：613-21；Steidler L；Viaene J；Fiers W；Remaut E.1996.Functional display of aheterologous protein on the surface of Lactococcus lactis by means of the cellwall anchor of Staphylococcus aureus protein A.Immunotechnology.2：97-102；Andreoni C，Goetsch L，Libon C，Samuelson P，Nguyen TN，Robert A，Uhlen M，Binz H，Stahl S.1997.Flow cytometric quantification of surface-displayedrecombinant receptors on staphylococci.Biotechniques.23：696-702，704)。使用当前的高速细胞分选仪，1小时可以分选出108个细胞，其筛选量类似于通过噬菌体库筛选可获得的结果。因而，细胞表面展示结合FACS为蛋白工程提供了非常重要可供选择的展示技术。噬菌体展示方法是为灵敏的亲和筛选而设计，它依赖于单个分子的结合或者通过gpIII融合的单价展示。相对而言，细胞表面方法通常每个细胞可以获得104-105个拷贝。从而，在稳定性或表达水平方面的随机变异不会影响到细胞表面库的筛选。
细菌表面展示系统的发展起始于小的肽融合到一些外膜蛋白，例如OmpA，LamB，和PhoE后可以定位到大肠埃希氏菌(Escherichia coli)的细胞表面(Charbit A，Boulain J.C，Ryter A，Hofnung M.1986.Probing the topologyof a bacterial membrane protein by genetic insertion of a foreign epitope：expression at the cell surface.EMBO J.5：3029-37；Freudl R，MacIntyre S，Degen M，Henning U.1986.Cell surface exposure of the outer membraneprotein OmpA of Escherichia coli K-12.J Mol Biol.188：491-494；Agterberg M，Adriaanse H，Tommassen J.1987.Use of outer membrane protein PhoE as acarrier for the transport of a foreign antigenic determinant to the cell surface ofEscherichia coli K-12.Gene.59：145-50)。在细菌细胞表面表达蛋白的最吸引人的应用之一就是可以用来开发活的细菌疫苗。在细菌细胞表面展示抗原被认为是有利的，因为暴露在表面的抗原更有利于免疫系统的识别，而且，外膜上的脂多糖可以增强免疫反应，还可能作为锚定在细胞表面多肽的辅助因子发挥作用(Lee J.S.，Shin K.S.，Pan J.G.，and Kim C.J.2000.Surface-displayed viral antigens on Salmonella carrier vaccine.Nat.Biotechnol.18：645-648)。另外，细菌还有容易操作、制造和流通成本低的优点。这种方法产生新的重组疫苗目前已经有成功的报道(Kim EJ；Yoo SK.1999.Cellsurface display of hepatitis B virus surface antigen by using Pseudomonassyringae ice nucleation protein.Lett Appl Microbiol 29：292-297；Lee J.S.，ShinK.S.，Pan J.G.，and Kim C.J.2000.Nat.Biotechnol.18：645-648)。细菌表面展示系统另外的应用包括生产用于生物除污的全细胞吸附剂和新的生物催化剂(Kim YS；Jung HC；Pan JG.2000.Bacterial cell surface display of an enzymelibrary for selective screening of improved cellulase variants.Appl EnvironMicrobiol.66：788-793；Jung HC；Lebeault JM；Pan JG.1998.Surface displayof Zymomonas mobilis levansucrase by using the ice-nucleation protein ofPseudomonas syringae.Nat Biotechnol.16：576-80)。
普遍应用的Lpp-OmpA表面展示系统包括三部分：信号序列和成熟的大肠埃希氏菌脂蛋白N端开始的9个氨基酸(Lpp)，大肠埃希氏菌外膜蛋白OmpA的46-159位氨基酸，和过客(passenger)蛋白(Francisco JA，Earhart CF，Georgiou G.1992.Transport and anchoring of beta-lactamase to the extemalsurface of Escherichia coli.Proc Natl Acad Sci U S A.89：2713-2717)。这个系统已经成功的用于展示β-内酰氨酶(Francisco JA，Earhart CF，Georgiou G.1992.Proc Natl Acad Sci U S A.89：2713-2717)，绿色荧光蛋白(Shi，Huidong；Su，Wei Wen.2001.Display of green fluorescent protein on Escherichia coli cellsurface.Enzyme and Microbial Technology.28：25-34)，单链Fv(scFv)库(Daugherty PS；Chen G；Olsen MJ；Iverson BL，Georgiou G.1998.Antibodyaffinity maturation using bacterial surface display.Protein Eng.11：825-32；Daugherty PS，Olsen MJ，Iverson BL，Georgiou G.1999.Development of anoptimized expression system for the screening of antibody libraries displayed onthe Escherichia coli surface.Protein Eng.12：613-21)，和最近的HIV反转录酶(Bumett MS，Wang N，Hofmann M，Kitto GB.2001.Potential live vaccines forHIV.Vaccine.19：735-742)。然而，这个系统仍然有其局限性：(1)当Lpp-OmpA处于一个组成性表达的条件下，细胞的存活力非常低；因而必须使用一个严谨的调控系统和一个合适的低拷贝质粒来优化展示系统，尤其是对于大的过客蛋白(Daugherty PS，Olsen MJ，Iverson BL，Georgiou G.1999.Development of an optimized expression system for the screening of antibodylibraries displayed on the Escherichia coli surface.Protein Eng.12：613-21；Earhart C.F.2000.Use of an Lpp-OmpA fusion vehicle for bacterial surfacedisplay.Methods Enzymol.326：506-516)。(2)这个系统不能展示象细菌的碱性磷酸酶(PhoA)一样的二聚蛋白(Stathopoulos C，Georgiou G，Earhart CF.1996.Characterization of Escherichia coli expressing an Lpp′OmpA(46-159)-PhoAfusion protein localized in the outer membrane.Appl Microbiol Biotechnol.45：112-119)。PhoA的功能需要二硫键的形成，其形成不能自发而是需要至少在二硫键形成中的催化作用(Bardwell JC，McGovern K，Beckwith J.1991.Identification of a protein required for disulfide bond formation in vivo.Cell 67：581-589；Kamitani S，Akiyama Y，Ito K.1992.Identification andcharacterization of an Escherichia coli gene required for the formation ofcorrectly folded alkaline phosphatase，a periplasmic enzyme.EMBO J 11：57-62).
很多活性蛋白和酶都是多亚基结构，并且很多都需要通过二硫键进行分子间和分子内的相互作用。二硫键的形成和在壁膜间隙的过客蛋白的折叠会阻碍这些蛋白的有效展示。因而，在培养基中加入还原剂有助于提高CtxB域和PhoA的转运效率(Klauser T，Pohlner J，Meyer TF.1990.Extracellular transport of cholera toxin B subunit using Neisseria IgA proteasebeta-domain：conformation-dependent outer membrane translocation.EMBO J.9：1991-1999；Stathopoulos et al.，1996；Suzuki T，Lett MC，Sasakawa C.1995.Extracellular transport  of VirG protein in Shigella.J Biol Chem.270：30874-30880)。然而，生长培养基中加入还原剂，还会打断分子间和分子内相互作用所需的二硫键。这会影响到一些酶或蛋白质的活性和/或展示，也可能还会改变细菌的生长和基因的表达，尤其是在大规模的应用中，还可能会提高操作的成本，
细胞表面展示技术的相关参考文献包括：美国专利5,348,867，美国专利5,516,637，美国专利5,866,344，美国专利6,274,345，美国专利6,300,065和美国专利6,190,662。
发明概要
该项发明的一个方面是提供了包含编码以下任一种多肽的核酸序列的核酸分子：
(a)SEQ ID No：2；
(b)包含从SEQ ID No：2的N端开始的至少39个连续氨基酸的片段；和
(c)(a)或(b)的变体，其满足：(i)与(a)或(b)相应的多肽的氨基酸序列至少65％相同；和(ii)当该变体在革兰氏阴性菌中制备时，它是一种外膜蛋白。
包含SEQ ID No：2N端的至少39个连续氨基酸的片段可至少包括了SEQ ID No：2的N端区域。该发明的实施方案包括了SEQ ID No：2的N端区至少125，134，172，183，207个氨基酸的片段。
该项发明的另一个方面是提供了包含编码以下任一种多肽的核酸序列的核酸分子：
(a)SEQ ID No：4；
(b)包含从SEQ ID No：4的N端开始的至少16个连续氨基酸的片段，和
(c)a)或(b)的变体，其满足：(i)与(a)或(b)相应的多肽的氨基酸序列至少65％相同；和(ii)当该变体满足如下条件时，它是一种外膜蛋白：(1)在读框内与细菌的分泌信号和引导信号连接，(2)产生于革兰氏阴性菌。
包含SEQ ID No：4的N端的至少16个连续氨基酸的片段可至少包括了SEQ ID No：2的N端区域。该发明的实施方案包含了SEQ ID No：2N端区的至少102，111，149，160，184个氨基酸的片段。
该项发明的另一个方面是其提供了一种编码一融合蛋白的核酸序列，上述的融合蛋白包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽由该项发明的核酸分子编码。在该发明的一个实施方案中，第二多肽被融合到第一多肽的C端。
该项发明的另一个方面是提供了一个包含SEQ ID No：1中的6至309核苷酸的土壤杆菌属启动子。
本项发明的另一个方面是提供了一个分离出的5-100个核苷酸的探针或10-40个核苷酸的引物，其可与SEQ ID No：1或3的核酸分子，或与该核酸分子的互补序列在严谨条件下杂交的。
该项发明的另一个方面是其提供了一个表达载体，其包括本项发明中的核酸分子，它与一个或多个表达调控序列可操作地连接。在该发明的一个实施方案中，表达调控序列含有aopB启动子；另一个实施方案中，载体是大肠杆菌中的表达载体，其表达调控序列适合于在大肠杆菌中表达核酸。另一个实施方案中，载体是土壤杆菌属中的表达载体，它适合在土壤杆菌属中表达核酸分子，尤其是在根癌土壤杆菌中。
该项发明的另一个方面提供了一个由本发明的核酸分子或表达载体转化了的重组微生物。在该发明的一个实施方案中，重组体微生物在其表面展示了本发明的多肽或融合蛋白。
该项发明的另一个方面是提供了包括以下任一种氨基酸序列的多肽，
(a)SEQ ID No：2；
(b)包含从SEQ ID No：2的N端开始的至少39个连续氨基酸的片段；和
(c)(a)或(b)的变体，其满足：(i)与(a)或(b)相应的多肽的氨基酸序列至少65％相同；和(ii)如果这个变体制备于革兰氏阴性细菌，那么它是一种外膜蛋白。
该项发明的另一个方面是提供了包括以下任一种氨基酸序列的多肽：
(a)SEQ ID No：4；
(b)包含从SEQ ID No：4的N端开始的至少16个连续氨基酸的片段，和
(c)a)或(b)的变体，其满足：(i)与(a)或(b)相应的多肽的氨基酸序列至少65％相同；和(ii)当该变体满足如下条件时，它是一种外膜蛋白：(1)与细菌的分泌信号和引导信号在读框内连接，并且(2)产生于革兰氏阴性菌。
该项发明的另一个方面是提供了生产本发明的多肽和融合蛋白的方法，该方法包括培养经表达载体转化了的微生物，所述表达载体含有编码本发明的多肽或融合蛋白的核酸分子，其中，该核酸分子与一个或多个表达调控序列可操作地连接。
本项发明的另一个方面是提供了能与本发明的多肽或融合蛋白中的载体蛋白特异性反应的抗体。在该发明的一个实施方案中，抗体为单克隆抗体。
本项发明的另一个方面提供了一个生产能够在其表面展示过客蛋白的微生物的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将表达载体导入到微生物中；和
(2)培养从步骤(1)中得到的微生物，以表达蛋白。
该展示方法中的表达载体包含：
(a)编码载体蛋白的核酸，载体蛋白可从本发明的多肽，特别是与AopB相关的蛋白以及AopB相关的外膜蛋白家族成员中选择；载体蛋白需要适合用于微生物的展示，并带有在微生物中有功能的细菌分泌信号。
(b)编码过客蛋白的核酸，该核酸要与编码载体蛋白的核酸在3′端框内连接。
(c)编码载体蛋白的核酸要与表达调控序列相连而起作用，该表达调控序列要适合在该微生物中表达编码该载体蛋白的核酸。
该发明的一个实施方案中，表达调控序列含有aopB启动子。在另一个实施方案中，在展示方法中所用的微生物在酸性条件下培养。
在另一实施方案中，载体蛋白和展示方法中所用的微生物是在以下的组中进行选择：
(a)载体蛋白是与AopB相关的多肽、片段或其变体，并且，可用于展示的微生物是土壤杆菌属，
(b)载体蛋白包含RopB多肽序列N端的150-220个连续的氨基酸，并且可用于其展示的微生物是根瘤菌属(Rhizobium)，
(c)载体蛋白包含布鲁氏菌属(Brucella)外膜蛋白序列N端的150-220个连续的氨基酸，并且可用于其展示的微生物是布鲁氏菌属。
(d)载体蛋白包含Pap31多肽序列N端的150-220个连续的氨基酸，并且可用于其展示的微生物是巴尔通氏体属(Bartonella)，
(e)载体蛋白包含PomA多肽序列N端的150-220个连续的氨基酸，并且可用于其展示的微生物是巴斯德氏菌属(Pasteurella)(Mannheimia)，
(f)载体蛋白包含PPE多肽序列N端的150-220个连续的氨基酸，并且可用于其展示的微生物是分枝杆菌属(Mycobacterium)，
(g)载体蛋白包含主要外膜蛋白序列N端150-220个连续的氨基酸，可用于其展示的微生物是嗜血菌属(Haemophilus)，或
(h)载体蛋白包含外膜孔多肽序列N端150-220个连续的氨基酸，可用于其展示的微生物是弧菌属(Vibrio)。
在该发明的优选实施方案中，分泌信号和载体蛋白一起发挥作用，展示了包含SEQ ID No：2中1-23氨基酸的过客蛋白，在进一步的优选实施方案中，所述微生物为根癌土壤杆菌。
该发明的展示方法进一步包含检测所培养微生物表面是否带有过客蛋白和选择在表面带有过客蛋白的微生物。在一个实施方案中，该分析方法采用了荧光激活细胞分选术(FACS)。
本项发明的另一个方面提供了在土壤杆菌属表面表达融合蛋白的方法，具体步骤包括：
(1)将载体导入土壤杆菌属的细菌中；并且
(2)培养由第一步得到的细菌，以表达融合蛋白；
其所用载体包括：
(a)编码该发明的融合蛋白的核酸序列，其中的融合蛋白带有细菌的分泌信号；和
(b)与编码融合蛋白的核酸可操作连接的表达调控序列，其中，该表达调控序列是适合在土壤杆菌属中表达所述编码融合蛋白的核酸。
本项发明的另一个方面是提供一个能够选择编码所需性质多肽的核酸的方法，该方法包含本发明的展示方法，其中的过客蛋白是多种的、已推断含有所需特性的多肽。这种方法进一步含有检测展示过客蛋白的微生物是否展示着过客蛋白的所需特性；选择和分离在其表面上展示着所需特性过客蛋白的微生物；以及从生物中分离表达载体的步骤。
在选择编码具有所需性质的多肽的核酸的方法的一个实施方案中，过客蛋白是来自于抗体表达库。欲求特性可以是与抗体特异的抗原的紧密结合、特异的抗原决定基的存在、或者是催化活性。
本发明的另一方面是提供一个从液体中去除污染物的方法，该方法包含该发明的展示方法，其中的过客蛋白能够与污染物结合，而且这种方法进一步包括用展示过客蛋白的微生物与含有污染物的液体在一定条件下接触一段时间，所述条件有利于过客蛋白与污染物结合；然后将微生物从液体中去除的步骤。在其中的一个实施方案中，污染物是重金属，而过客蛋白是金属硫蛋白。
本发明的另一方面是提供一个可激发哺乳动物免疫反应的方法，这种方法包括该发明的展示方法，其中的过客蛋白可以激发哺乳动物的免疫反应。这种方法进一步包含在有利于哺乳动物对过客蛋白产生免疫反应的时间和条件下给药展示着过客蛋白的微生物的步骤。在一个实施方案中，展示微生物是根癌土壤杆菌，它可用来当作活的疫苗。
本发明的另一个方面提供一个固相酶促反应的方法，这个方法包括该发明的展示方法，其中的过客蛋白可以用来催化反应，该方法进一步包括使欲催化的反应底物在有利于酶促反应的时间和条件下，与展示着过客蛋白的微生物接触一段时间的步骤。在一个实施方案中，所述过客蛋白是碱性磷酸酶。
本发明的另一个方面是提供一个提纯化合物的方法，该方法包含该发明的展示方法，其中的过客蛋白能够特异性地与该化合物结合，该方法进一步包括使含有该化合物的组合物与展示着过客蛋白的微生物接触，让接触时间和条件利于过客蛋白与化合物结合；在利于去除非特异性结合的污染物的条件下和时间内，洗所述微生物；以及在利于打断过客蛋白和化合物之间特异性结合的条件下和时间内，从所述微生物洗脱得到所要提纯的化合物。在一个实施方案中，所述化合物是抗体，所述过客蛋白是其特异性的抗原。
附图说明
以下对附图的描述有利于更深入的理解这项发明。
图1指示的是aopB位点的序列和其相关的构建体。
A.1.4kb的NheI片段的DNA序列包含了aopB和所推导出的AopB氨基酸序列。垂直的箭头指示的是mini-Tn5转座子的插入位点。被下画线标记的氨基酸是推测的信号肽。粗体显示的是推测的核糖体结合部位SD序列(AGGAG)。水平箭头指示的重复序列，其功能可能是不依赖于ρ因的转录终止子。
B.不同构建体的遗传和物理图谱。垂直线上方的数字指示的是DNA序列的位置；圆括号中的数字指示的是在AopB中氨基酸的位置。套着方框的水平箭头指示的是aopB的开放读框；黑色区域指示的是推测的信号肽。◆指示的是mini-Tn5转座子的插入位点。垂直的箭头指示的是活性phoA-aopB融合体上TnphoA转座子的插入位点。带有垂直线的水平箭头指示的是引入了限制性位点的PCR引物。
图2示意的是aopB和ropB基因产物的氨基酸序列对比。这个对比是通过DNASIS程序完成的。阴影字母代表的是两个基因产物中相同的氨基酸。
图3示意的是aopB基因的Southern杂交分析。根癌土壤杆菌菌株全DNA的获得与实施例1中提到的方法一样，根癌土壤杆菌不同菌株的全DNA与泳道的对应分别是GMI9023(泳道1)，A136(泳道2)，A6(泳道3)，C58(泳道4)和CGI1(泳道5)，苜蓿中华根瘤菌(Rhizobium meliloti)RCR2011全DNA对应于泳道6。DNA用SphI消化，并用荧光素标记的aopB探针进行杂交。
图4指示的是AopB蛋白在根癌土壤杆菌中的亚细胞定位。诱导的根癌土壤杆菌菌株C58细胞(泳道1，3，5，7，9，11)和CGI1细胞(泳道2，4，6，8，10，12)按照实施例1中介绍的进行收集和分级分离为全细胞裂解物(CL)(泳道1和2)，周质(P)(泳道3和4)，胞质(C)(泳道5和6)，全膜(TM)(泳道7和8)，内膜(IM)(泳道9和10)和外膜(OM)(泳道11和12)级分。然后将来自同一制品的样品进行SDS/12％PAGE凝胶电泳分离，之后将蛋白转移到Immobilon-P膜上通过AopB抗体使其可见。
图5示意的是对细菌表面的AopB进行的检测。根癌土壤杆菌A6010菌株按照实施例1描述的培养。得到的细胞直接用于与以下不同抗体的相互作用：兔多克隆AopB抗体，小鼠多克隆VirJ抗体或小鼠单克隆GFP抗体。全细胞的ELISA检测按照实施例1描述的进行，误差棒指示的是三次重复的标准差。
图6示意的是用全细胞ELISA检测AopB-GFP(A)和AopB-PhoA融合蛋白(B)在细胞表面展示的结果。按照实施例1中描述的方法对根癌土壤杆菌菌株C58(GFP-)，CG19(产生胞质GFP)，CGI1(染色体上含有aopB-gfp)，C58(pJYH21)(质粒上含有aopB-gfp)进行培养、固定；并且用全细胞ELISA检测AopB-GFP在细胞表面的展示(A)。质粒pJYH5039，pJYH5125，pJYH5134，pJYH5172和pJYH5207含有aopB-phoA融合体，其PhoA分别融合在AopB的39，125，134，172和207位氨基酸位点上。pJYH5包含野生型的aopB基因，而pJYH23含有由展示载体携带的phoA编码序列。这些质粒都被引入到C58菌株；含有这些质粒的C58细胞再被用来用PhoA抗体进行全细胞ELISA的方法检测AopB-PhoA的展示(B)。误差棒指示三次重复的标准差。
图7示意的是通过流式细胞仪分析评估AopB-PhoA在细胞表面展示的结果。含有pJYH5，pJYH5039，pJYH5125，pJYH5134，pJYH5172和pJYH5207的根癌土壤杆菌C58细胞按照实施例1中描述的在IB培养基上培养。小鼠抗-AP抗体按1∶1000加入，羊抗小鼠r-PE偶联物按照1∶100使用。总样本数为10,000。GMean代表几何平均值，几何平均值则是所记录细胞的平均荧光强度。
图8示意的是蛋白酶的可接近性(accessibility)分析的结果。包含pJYH5039，pJYH5125，pJYH5134，pJYH5172和pJYH5207的根癌土壤杆菌菌株C58，CGI1，和C58在IB培养基上培养。冲洗后，按照实施例1的方法在有和没有胰蛋白酶的情况下对细胞进行分别的处理。用抗-AopB抗体使AopB-GFP和AopB-PhoA融合蛋白可见，并且周质蛋白ChvE用抗-ChvE抗体使其可见。
图9示意的是展示载体pJYH20的物理图谱。这个质粒包含aopB启动子和编码AopB由1到172位氨基酸的aopB的1到516bp。多接头被引入到aopB的下游，以便于在aopB的开放读框内克隆和融合编码过客蛋白的外源基因。
图10示意的是AopB-PhoA在不同条件下表达情况的检测结果。根癌土壤杆菌菌株C58(pJYH23)，大肠埃希氏菌DH5α(pJYH23)和苜蓿中华根瘤菌RCR2011(pJYH23)在指定的培养基上培养。收集细菌细胞，并且通过抗-AP抗体使AopB172-PhoA可见。
图11示意的是生长培养基对细菌表面展示的影响。包含质粒pJYH5或pJYH23的根癌土壤杆菌菌株C58细胞置于MG/L培养基，在28℃过夜培养，然后在OD600＝0.3时可以转移到新鲜的AB或IB培养基，然后28℃培养18小时。展示效率通过全细胞ELISA确定。C58(pJYH5)作为阴性对照。实验重复三次。
图12示意的是流式细胞仪分析得到的AopB-PhoA展示结果。带有pJYH5或pJYH23的根癌土壤杆菌在MG/L，AB或IB培养基上培养。小鼠的抗-AP抗体按1∶1000加入，羊抗小鼠r-PE偶联物按1∶100使用。全样本为10,000，GMean代表几何平均值，几何平均值则是记录细胞的平均荧光强度。
发明详述
A.AOPB基因和AOPB蛋白
根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)染色体基因aopB已经被鉴定。这段基因与豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)中编码外膜蛋白的ropB基因有高度同源。通过转座子插入造成的aopB突变并不会影响细菌在不同培养基上的生长。
在pH 5.5的基本培养基上培养的CGI1突变细胞(包含aopB-gfp融合体)在紫外照射下显现强烈的荧光，而在中性的基本培养基上培养的细胞却没有荧光，这表明aopB基因可被酸性环境诱导。aopB编码一条长218个氨基酸的推测蛋白，其预计分子重量为22.8 kDa。TnphoA转座子插入突变，亚细胞分级分离和全细胞ELISA实验均表明AopB是一个暴露在细菌细胞表面的外膜蛋白，并且非常严谨，不会在其他部位出现。
以下是所举序列的描述：
SEQ ID No：1包含aopB基因的核苷酸序列
SEQ ID No：2AopB的全长氨基酸序列
SEQ ID No：3编码AopB的aopB核苷酸序列，但缺少推定的信号序列
SEQ ID No：4 AopB的氨基酸序列，但缺少推定的信号肽序列
SEQ ID No：5引物p54
SEQ ID No：6引物p55
SEQ ID No：7引物p119
SEQ ID No：8引物p112
SEQ ID No：9引物p118
SEQ ID No：10GFPuvFh3
SEQ ID No：11GFPuvRp1
SEQ ID No：12PhoAfH3
SEQ ID No：13PhoAreP1
AopB已经被确定为革兰氏阴性菌膜蛋白家族(此后称为AopB相关膜蛋白)中的一员。这个蛋白族中包括RopB(60％氨基酸序列相似性)，布鲁氏菌膜外的免疫原性蛋白(42-47％氨基酸序列相似性)，汉氏巴尔通氏体(Bartonella hensela)经噬菌体侵染产生的Pap31(46％氨基酸序列相似性)，溶血巴斯德氏菌(Pasteurella(Mannheimia)haemolytica)外膜蛋白PomA(47％氨基酸序列相似性)，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的PPE(39％氨基酸序列相似性)，杜氏嗜血菌(Haemophilus ducreyi)的主要外膜蛋白(43％氨基酸序列相似性)，和霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的外膜孔蛋白(40％氨基酸序列相似性)，还有假单胞菌(Pseudomonas)的孔蛋白F(OprF)的C端部分。
转录和翻译的调控序列可以是DNA的调控序列，如启动子、增强子、多腺苷酸信号、终止子、和可以为编码序列在寄主细胞提供表达的序列。
“启动子序列”是DNA分子上的一段调控序列，能够和细胞中的RNA聚合酶结合沿下游(3′方向)启动转录编码序列。为了阐明该发明，启动子序列可以在转录起始位点的3′端结合，并向上游(5′方向)延伸使其包括能够起始转录的最少的碱基或者元件数目。在启动子序列内有一个转录起始位点(通常通过核酸酶S1作图而确定的)，还有可以用于结合RNA聚合酶的蛋白结合区域(共有序列)。原核生物启动子除了含有-10和-35共有序列外还包括SD序列。
表达调控序列是一段操纵和控制另一段DNA序列的转录和翻译的DNA序列。编码序列则“受控于”转录和翻译调控序列，它在细胞内可被RNA聚合酶转录成mRNA，然后mRNA被翻译成蛋白质。
“分离的多核苷酸”被定义为是从其发生的环境中被去除而得的多核苷酸。分离的多核苷酸是结构上不同于自然产生的多核苷酸。这个词因此包括例如(a)一段DNA，其序列包括自然产生的基因组分子的部分序列，但是不包含该序列两侧的编码序列；(b)一段被整合到载体或原核或真核基因组中的多核苷酸，但所产生的分子与所有自然条件下发生的载体或基因组DNA分子都不一样；(c)一个分离的分子，例如cDNA，基因组片段，PCR产物片段或限制性酶切的片段；和(d)杂合基因的一部分的重组核苷酸序列，也就是编码融合蛋白的基因。特别指出要排除在这个定义之外的是处于在含有以下的混合物中的多核苷酸：(i)DNA分子、(ii)被转染的细胞、和(iii)细胞克隆，例如是出现在DNA文库，如cDNA或基因组DNA文库中的那些细胞克隆。
例如，一个DNA分子天然存在于细菌基因组或作为基因文库的一部分时并不是分离而得的，但是如果该分子分离于细菌基因组中剩下的部分是由于比如说发生了克隆事件(扩增)而得，那么它就是分离的分子了。通常，分离的DNA分子不受DNA区域(例如，编码区域)的限制，在自然发生的基因组中，它会紧邻5′或3′端。这样的分离的多核苷酸可以是载体或组合物或外源基因组的一部分，但仍然可以定义为分离的分子，因为它们并不是在自然情况下的一部分。
本项发明的多核苷酸可以是RNA或DNA(cDNA，基因组DNA，或合成的DNA)，或其修饰物，变体、同系物或片段。其DNA可以是单链或双链，并且，如果是单链可以是编码链，也可以是非编码链(反义链)。任何一个象SEQ ID NO：1或3所编码的本发明的多肽序列可以是(a)编码序列，(b)由(a)所转录的核糖核苷酸序列，或(c)用冗余或简并的遗传密码子编码相同多肽的编码序列。
多肽或蛋白指的是不管长度或翻译后是否修饰(例如，糖基化或磷酸化)的任一氨基酸链，两个词在本申请中可以互换。
氨基酸序列可来源于SEQ ID NO：2或4的同源的序列。象这里所用的“同源的氨基酸序列”是指在低于严格的熔解温度(Tm)25-35℃下，其编码序列可与SEQ ID NO：1或3的任一部分核苷酸序列进行杂交。其中同源的氨基酸序列是指与SEQ ID NO：2或4中的氨基酸序列不同的氨基酸序列有一个或多个氨基酸的取代，优选是保守取代。这样的序列也包含血清型变体(定义见下文)以及包含了缺失或插入，但仍保留所述多肽的原有遗传特性如免疫活性的序列。优选，这样的序列要与SEQ ID NO：2或4至少61％相同(例如，65％，68％，70％，73％，75％，78％相同)，优选至少80％相同(例如，82％，85％，88％，90％，93％，95％，98％相同)。
同源的氨基酸序列包括与SEQ ID NO：2或4序列相同或者实质相同的序列。所谓“实质相同的氨基酸序列”是指至少有90％(例如92％，94％，95％，96％，97％，98％)并优选有99％与参考序列相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，同源序列可不同于参考序列，但这些变化多数是保守的氨基酸取代。
保守氨基酸的取代就是发生在同一类氨基酸中的取代。这些氨基酸类别包括，例如，极性不带电荷的氨基酸，如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；碱性氨基酸如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；酸性氨基酸如天冬氨酸和谷氨酸；和非极性氨基酸如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和半胱氨酸。
同源多聚核苷酸的定义与此类似。优选同源序列是与SEQ ID No：1或3的编码序列至少有45％(例如50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，87％，90％，93％，96％)和优选有99％相同的序列。
同源性通常由如Sequence Analysis Software Package of the GeneticsComputer Group的序列分析软件(University of Wisconsin BiotechnologyCenter，1710 University Avenue，Madison，WI 53705)来测定。氨基酸序列按最大一致性排列。间隙可以人为地在序列中加以引入以达到合适的排列。一旦最佳的排列建立后，就可以通过比较两个序列在各个位置的氨基酸相对于所有位点的同一性来确定其同源性的水平。
这里所用的两个氨基酸或核苷酸序列间的“百分比同源性”、“百分比同一性”或“百分比相似性”都是通过按照最高匹配原则排列而确定的。“同一性”或“相似性”实质上是通过巧妙的衡量方式并且可以通过现有的技术计算出来。这里用来比对两个氨基酸或核苷酸序列同一性或相似性的计算机软件是DNAStar(DNAStar Inc.，Madison，Wis.)。然而，其他的一些软件如GCG程序包(Devereux，J.，et al.，Nucleic Acids Research(1984)12(1)：387)和BLASTP，BLASTN，FASTA(Atschul，S.F.et al.，J MolecBiol(1990)215：403)也可以用。这里确定的同源性(同一性或相似性)则是按照大家都知道的BESTFIT程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8 for Unix，Genetics Computer Group.University Research Park，575Science Drive，Madison，Wis.53711)而确定的。当使用BESTFIT或其他的序列排列软件来确定某一特定序列是否有例如与参考序列间大约90％的同源性时，根据当前的发明，参数应该设定保证同一性百分数是在参考核苷酸序列或氨基酸序列的全长的基础上计算的，而且允许同源区中的间隙可达到约参考序列总核苷酸数的10％。
两个多肽的百分相似性也可以通过使用包括BESTFIT在内的本领域已知的软件比对两个多肽链的氨基酸序列进行评测，通过使用鉴定相似性的默认参数设置。
Karlin和Altschul的运算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268，1990)，经由Karlin和Altschul修饰后(Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5877，1993)，已被吸收到Altschul等的NBLAST和XBLAST中(J.Mol.Biol.215：403-410，1990)，而用于搜索与参考序列同源的序列。
BLAST核苷酸序列搜索使用的是NBLAST程序，score＝100，wordlength＝12，以得到与本发明同源的序列。BLAST蛋白搜索使用的是XBLAST程序，score＝50，wordlength＝3，以得到与参考多肽(例如SEQ IDNO：2或4)有同源性的氨基酸序列。要得到用于比对的带有间隙的排列，需要按照Altschul等(Nucleic Acids Res.25：389-3402，1997)介绍的GappedBLAST进行。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用了各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数设置。参考http：//www.ncbi.nlm.nih.gov。
与SEQ ID NO：2或4同源的多肽链包括自然发生的等位基因变体，以及保留了参考多肽遗传特性的突变体或非自然发生的变体。对AopB而言，这样的遗传特性包括了其作为革兰氏阴性菌暴露在表面的外膜蛋白的拓扑结构。
正如我们所知道的，等位基因的变体是一种多肽的替换形式，其特征可以是因为发生了取代、缺失、或者一或几个氨基酸的添加，但却并不改变多肽的生物学功能。生物学功能是指多肽在自然状态下的细胞中所发挥的作用，即使这个功能对细胞的生长和存活并不必要。例如，孔蛋白的生物学功能就是允许胞外介质中存在的化合物进入细胞内。
等位基因的变体在自然界非常普遍。例如，一个细菌种如M.catarrhalis，通常由多种不同的菌株来代表，它们之间有着微小的等位基因的变异。事实上，一个在不同菌株间行使相同生物学功能的多肽在每一菌株中可以有不同的氨基酸序列(和核苷酸序列)，这种等位基因的变异在多核苷酸水平也得到了很好的体现。
一个获得编码同源多肽或等位基因变体的多聚核苷酸的方法是通过聚合酶链式反应(PCR)扩增由常规的方法提取的细菌基因组DNA。这涉及到与编码序列5′和3′端的上、下游配对的合成的寡核苷酸引物的使用。适宜的引物是通过SEQ ID NO：1或3提供的核苷酸序列信息设计的。步骤如下：选择包含10到40个核苷酸(如13，16，19，22，24等等)，更优选包含15-25个核苷酸的引物。选择含有足以保证有效杂交的C G比例的引物是有利的；也就是说，C和G的量至少占总核苷酸含量的40％，优选占50％。一个标准的PCR反应通常每100μL包含0.5到5个单位的Taq DNA聚合酶，20到200μM的每种脱氧核苷酸，优选每种核苷酸具有相同的浓度，超过总脱氧核苷酸浓度0.5到2.5mM的镁，105到106靶标分子，和大约20pmol的每种引物。进行大约25到50个PCR循环，低于引物实际Tm 15℃到5℃的退火温度。更加严谨的退火温度将有助于消除不正确的退火引物和减少不正确的核苷酸结合到引物的3′端。尽管更高的温度适合于对G+C丰富的靶标变性，通常变性温度是95℃到97℃。循环的数量依赖于初始加入的靶标分子的浓度，尽管超过40个循环不加推荐，这是由于循环次数过多会造成非特异性背景产物的增加。
另一个可用来得到编码同源多肽或等位基因变体的多核苷酸的方法是通过分子杂交的方法筛选DNA或RNA文库。杂交的步骤广为人知并被详细描述如Sambrook等(Sambrook，J.E.F.et.al.(1989)Molecular Cloning aLaboratory Manual 2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor N.Y)。优化杂交条件的重要参数可通过用于获得临界(critical)熔解温度的公式反映，大于该熔解湿度时，两条互补的DNA链可互相分开。对于大于或约等于600个核苷酸的多核苷酸，公式是：Tm＝81.5+0.41×(％G+C)+16.6log(阳离子浓度)-0.63×(％甲酰胺)-600/碱基数。在适当的严谨条件下，杂交温度(Th)大约是低于计算的Tm的20到40℃，20到25℃，或优选30到40℃。在这方面本领域技术人员可容易地确定出最佳的温度和盐浓度。
这里所提出的杂交核酸可以用来例如作为克隆探针、引物或者是诊断探针。分子杂交通常是要在严谨的条件下进行。核酸双链体或杂交体的稳定性由熔解温度或Tm值来表达，即杂交链分开的温度。这个熔解温度用来确定杂交所需的严谨条件。如果要鉴定的序列与探针序列有相关性并且基本一致而并非完全一致时，那么先确定最低的杂交温度是非常有用的，这样在特定的盐(例如SSC OR SSPE)浓度环境中，在该确定的最低温度时只有同源序列杂交。然后，假设每有1％的错配就会导致Tm值下降1℃，杂交反应最后冲洗的温度也相应降低(例如，如果序列与探针有超过95％的一致性，最后的冲洗温度就降低5％)。实际上，每1％的错配所带来的Tm的变幅可以介于0.5℃和1.5℃之间。严谨的杂交条件可以通过预杂交和杂交孵育来获得(i)在含有50％甲酰胺的6×SSC中在42℃杂交4-16小时，或(ii)在6×SSC(1M NaCl，0.1M枸椽酸钠(pH 7.0))水溶液中在65℃杂交4-16h小时。通常，杂交实验要在60℃-68℃温度下进行，例如65℃。在这种温度条件下，可以在6×SSC，更好的是2×SSC或1×SSC，最好是在0.5×SSC，0.3×SSC或0.1×SSC(不含甲酰胺)中获得严谨的杂交条件。1×SSC包含0.15M NaCl和0.015M枸椽酸钠。
有用的同系物和其中的非自然片段由已知的方法来设计，它们可用来鉴定抗原上可容许氨基酸序列变化和(或)缺失的区域。比如，比较来自不同种的同源多肽就可以鉴定出保守序列。越是差异多的序列就越能容许序列的变化。序列间的同源性可以通过上述的方法进行分析，比如Altschul等的BLAST同源搜索运算法则(Nucleic Acids Res.；25：3389-3402(1997))。另外，序列可以在体外修饰，然后按照下文介绍的方法筛选能展示过客蛋白的序列。
本领域技术人员将很容易了解到采用这项发明中的筛选步骤并不需要做不必要的实验就可确定SEQ ID NO：2或4的特定同系物或片段是否保持了AopB外膜蛋白的拓扑结构，并且，是否可做为载体蛋白展示过客蛋白。一般的分析过程包括以下步骤：
(i)将实验同系物或片段在读框内连接上一个报告蛋白(过客蛋白)如GFP。通常，编码过客蛋白和编码实验同系物或片段的核酸分子在读框内连接后就可产生融合蛋白。编码这个融合蛋白的核酸分子于是被插入到一个表达载体上，然后在细菌中通过步骤(ii)表达这个融合蛋白；
(ii)用编码该融合蛋白的核酸分子转化革兰氏阴性菌，优选根癌土壤杆菌；并且
(iii)使用适合的全细胞分析手段如FACS来分析报告蛋白在转化细菌中的活性。在细胞表面的报告蛋白的活性将显示所述同系物或片段是外膜蛋白，而且可作为一个用于展示的载体蛋白。
由此衍生的多肽包括SEQ ID NO：2或4的部分序列，与SEQ ID NO：2或4有同源性的多肽序列的部分序列，由全长多肽内部缺失而得的多肽和融合蛋白。
在一个实施方案中，AopB的片段来自SEQ ID No：2的N-端区域。另一些实施方案中，来自SEQ ID No：2的N-端的至少39个连续氨基酸的AopB片段是优选的，例如来自SEQ ID No：2的N-端的125，134，172，183和207个连续氨基酸。将过客蛋白与SEQ ID No：2的125，134，172，183和207个氨基酸的片段融合已得以例证，而且显示了其用于细胞表面展示的有效性。
尤其优选的是SEQ ID No.2 N-端的134到183个连续氨基酸片段，例如140，150，155，160，165，166，168，170，172，174，176，178，180个氨基酸的片段。
载体蛋白与过客蛋白的融合可让载体片段与过客蛋白氨基酸序列直接邻近而形成。另外还可以通过连接子序列连接载体片段和过客蛋白，如来自免疫球蛋白的灵活的连接子序列(参见美国专利5,516,637)。连接子可以含有蛋白酶特异的切割位点，以便于将过客蛋白从载体蛋白上可控制地释放下来。这样的蛋白酶切位点的例子包括对凝血因子Xa、肠激酶、胶原酶、Igase(来自淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae))、凝血酶和TEV(烟草蚀纹病毒)蛋白酶的切割特异的位点。
来自SEQ ID NO：1或3的30到600个核苷酸的多聚核苷酸或其互补体、同系物、变体至少可以用来作为得到其他同系物或变体的探针。得到部分序列的一个方法是通过PCR扩增，扩增应用的参数上文提到，应用的引物与要扩增的片段的5′和3′端上游和下游序列配对。其扩增的模板可以是SEQ ID NO：1或3的全长或它们相关的同系物或变体，或包含在多聚核苷酸混合物如DNA或RNA文库中的特定多聚核苷酸。另一种得到部分序列的方法是在如上文介绍的条件下，使用推算Tm的公式进行筛选杂交。30到600个核苷酸片段的获得，其Tm值要通过减法(600/多核苷酸碱基对数目)进行校正，并且严谨的杂交条件其杂交温度要低于Tm 5到10℃。要获得低于20-30个碱基寡核苷酸时，Tm的计算公式为：Tm＝4×(G+C)+2(A+T)。例如，50％G+C的18个核苷酸的片段Tm约为54℃。
SEQ ID NO：2或4中短的氨基酸片段或它们相应的同源序列，可以通过化学合成的办法得到(E.Gross and H.J.Meinhofer，4 The Peptides：Analysis，Synthesis，Biology；Modern Techniques of Peptide Synthesis，John Wiley &Sons(1981)，and M.Bodanzki，Principles of Peptide Synthesis，Springer-Verlag(1984))。
编码含有较大内部缺失的多肽片段的多核苷酸可以按照标准的方法构建(Sambrook，J.E.F.et.al.(1989)Molecular Cloning a Laboratory Manual 2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor N.Y.)。这个方法包括标准的PCR、反向PCR、和对DNA克隆分子的限制性内切酶处理。这些方法中所用的成分和使用的仪器可以从很多公司购买如Stratagene。
某些氨基酸可以取代蛋白上其他的氨基酸而不改变蛋白的活性区域比如结合位点。既然活性区域决定一个蛋白的生物学功能，那么就可以通过某些氨基酸的取代来获得相似生物学功能的蛋白。所以可以预期，可以改变AopB的多肽序列或其编码的DNA序列而不改变其生物学功能和活性。
在进行这种改变的时候，通常要考虑到氨基酸的亲水指数(hydropathicindex)。氨基酸的亲水指数对蛋白的生物学功能有非常重要的意义，这一点本领域已有共识(Kyte，J.，and Doolittle，R.F.(1982)Simple method fordisplaying the hydropathy character of a protein.J Mol Biol 157：105-132)。相关的亲水氨基酸构成蛋白的二级结构，因而决定了蛋白与其他分子的相互作用，例如与酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等等的相互作用。膜的拓扑结构可以通过Sipos和von Heijne(Sipos et al.，1993，Eur.J.Biochem213：1333-1340)描述的算法进行预测。
根据其亲水性和所带电荷对每一种氨基酸都进行了亲水指数的赋值(kyte和Dodittle，1982)。分别是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5).
已经知道某些氨基酸可以被另外的具有与其相似亲水指数的氨基酸取代而不改变蛋白的生物学活性，也就是说，得到功能相同的蛋白。要进行这种改变，取代氨基酸的亲水指数应该在被取代氨基酸亲水指数的.+-.2范围内，当然如果能控制在.+-.1甚至.+-.0.5就更好了。
同时可以根据美国专利4,554,101提供的氨基酸的亲水性更有效的进行氨基酸的取代，其指出了与蛋白生物特性相关的由相邻氨基酸的亲水性决定的蛋白的局部最大平均亲水性。
根据美国专利4,554,101的详细介绍，指定的氨基酸亲水值分别是：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0.+-.1)；谷氨酸(+3.0.+-.1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+-.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。
已经知道一个氨基酸可以被另外一个与之有相似亲水值的氨基酸取代，从而得到保持原有生物学特性，并且尤其是免疫学特性的蛋白。要做这样的改变，取代氨基酸的亲水值应该在被取代氨基酸亲水值的.+-.2范围内，当然如果能控制在.+-.1甚至.+-.0.5就更好了。
正如上文所述，氨基酸的取代通常要考虑到相关相似性的侧链取代，比如其疏水性、亲水性、电荷、大小等等，本领域技术人员一定知道考虑了前述各种情况的取代的实例包括：精氨酸和赖氨酸；天冬氨酸和谷氨酸，丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸的取代。
如这里所使用的，融合蛋白是包含本发明中多肽或由本发明中多肽得到的多肽与任何其他多肽(这里后面称为过客蛋白或多肽)在N或C端的融合。得到这种融合多肽的一个最简单的方法是翻译读框内连接的多聚核苷酸，即杂合基因。编码融合蛋白的杂合基因被插入到一个表达载体上，用于转化或转染寄主细胞。另外，编码多肽或多肽衍生物的多核苷酸序列也可以插入到其中已存在编码过客蛋白多肽的多核苷酸的表达载体中。大的蛋白可以有效的用于表面表达，所述蛋白包括β-内酰胺酶，碱性磷酸酶，纤维素酶的纤维素结合域，或者单链Fv抗体。
融合蛋白的有利事例如其一可以将本发明的多肽或同系物或片段(‘载体蛋白′)融合到一个具有酶活性的蛋白上，如碱性磷酸酶，或一个可以进行二级修饰的酶上(例如糖基化酶或二硫化物异构酶)。另外还可以将载体蛋白融合到一个可以结合化合物的过客多肽上，所述化合物如污染物(例如溶液中的重金属或血液中的滤过型污染物)或者其他的蛋白(例如抗体)。如果过客蛋白本身就是一个抗体，那么融合蛋白可以用来纯化该抗体特异的抗原，或用来去除溶液中某种特定抗原。如果过客蛋白是一个抗原蛋白，融合蛋白可以用来作为一个疫苗来激发免疫反应来抵抗这个抗原。
为了有效的融合，过客多肽可以融合到本发明多肽的N-或者更好是C端。优选的氨基酸插入位点是SEQ ID No：2第39，125，134，172，183和207位的氨基酸，最好是插入到172位氨基酸上游或下游10个氨基酸的位置。
本发明中的多聚核苷酸同时也可以编码杂合的多肽前体(precursorpolypeptides)，其包括来自异源的信号肽，成熟以后成为本发明中的多肽。“异源的信号肽”是指在自然发生的本发明的多肽前体中没有的信号肽。优选的异源信号肽是那些或来自于或衍生自革兰氏阴性菌的信号肽。在优选实施方案中，异源信号肽与载体蛋白成熟序列的N端相连。
革兰氏阴性菌拥有非常独特和复杂的细胞包被结构，其包括细胞的内细胞膜、周质和外细胞膜。要在利用本发明中的载体蛋白在细胞表面展示过客蛋白，表达的融合蛋白必须能够穿过内细胞膜和外细胞膜运输到细菌表面并保留在细菌表面。
为了使融合蛋白能够被定位在细胞的表面，载体蛋白必须含有有效的分泌信号序列以助载体蛋白穿过细胞内膜和用于将融合蛋白锚定在细胞表面的靶标序列。信号序列和靶标序列可以在自然发生的载体蛋白前体中获得，或者他们可以是异源序列，也就是说，可以从同一个细菌蛋白或相同或不同细菌的不同蛋白获得。
在革兰氏阴性菌中，细胞外膜是一个限制蛋白向外运输的障碍。通常只有菌毛蛋白、鞭毛蛋白、特异性的酶和少数毒素可以完全穿过外膜到达胞外。这些蛋白的大多数都是首先通过一般的分泌方式分泌到壁膜间隙，然后在一些其他的基因产物的辅助下穿过外膜。
对于一些外膜蛋白，如PhoE孔蛋白，对适当定位和聚集必要的信息分布在引物序列里。或者，靶标序列可能包含在一段短的连续片段内。例如，大肠埃希氏菌脂蛋白N端的头9个氨基酸对于其定位在外膜是必要的。将这段短序列与可溶性周质蛋白β-内酰胺酶融合将会使融合蛋白定位到胞外。同样，对OmpA进行研究发现154位和180位之间的氨基酸残基对于定位是关键的。对于OmpA，靶标定位和外膜聚合则显示截然不同的事件。
在一个实施方案中，一个杂合的多肽前体包含SEQ ID No：4和与之N端连接的，决定向外膜分泌的氨基酸序列。膜靶向序列已经在很多种膜蛋白中得到鉴定，其中包括Lpp。通常对于Lpp，其作为定位信号的蛋白域是相当短的。Lpp靶向序列包含信号序列和成熟蛋白的前面9个氨基酸。这些氨基酸在Lpp N端发现。其它的可以作为分泌和膜定位信号源的蛋白包括大肠埃希氏菌外膜脂蛋白如TraT，OsmB，NlpB，BlaZ；铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)脂蛋白1；流感嗜血菌(Haemophilus influenza)PA1和PCN蛋白；立氏立克次氏体(Rickettsia rickettsii)17kDa脂蛋白；淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhea)H.8蛋白等等。
本发明的一个方面包含(i)一个表达盒包含本发明的多聚核苷酸，其表达受控于所需的调控元件，尤其是适合的启动子；(ii)一个表达载体包含本发明的表达盒；(iii)经本发明表达盒和/或载体转化或转染了的原核或真核细胞；还有(iv)一个由编码本发明的多肽或多肽衍生物的核苷酸序列产生多肽的方法，其包括在利于本发明DNA分子表达的条件下培养经本发明表达盒和/或载体转化或转染了的原核或真核细胞，然后从培养物中回收所编码的多肽或多肽衍生物。
豌豆根瘤菌细胞可以通过Garg B，Dogta RC，Sharma PK.1999介绍的方法进行转化。High-efficiency transformation of Rhizobium leguminosarum byelectroporation.Applied and Environmental Microbiology 65：2802-2804；和Giddings G，Mytton L，Taylor L，Thomas S，Allen D，Skot L.2000.A secondaryeffect of transformation in Rhizobium leguminosarum transgenic for Bacillusthuringiensis Subspecies tenebrionis delta-endotoxin(cryIIIA)genes.Theoreticaland Applied Genetics 100：820-823。
苜蓿中华根瘤菌细胞可以通过Hayashi M，Maeda Y，Hashimoto Y，Murooka Y.2000介绍的方法进行转化。Efficient transformation ofMesorhizobium huakuii subsp rengei and Rhizobium species.Journal ofBioscience and Bioengineering 89：550-553。
Mesorhizobium loti细胞可以通过Hayashi M，Maeda Y，Hashimoto Y，Murooka Y.2000介绍的方法进行转化。Journal of Bioscience andBioengineering 89：550-553。
大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)细胞可以通过HattermannDR，Stacey G.1990描述的方法进行转化。Efficient DNA transformation ofBradyrhizobium japonicum by electroporation.Applied and EnvironmentalMicrobiology 56：833-836；和Hayashi M，Maeda Y，Hashimoto Y，Murooka Y.2000.Journal of Bioscience and Bioengineering 89：550-553。
马尔他布鲁氏菌(B.melitensis)细胞可以通过Ekaza E，Guilloteau L，Teyssier J，Liautard JP，Kohler S.2000描述的方法进行转化。Functionalanalysis of the ClpATPase ClpA of Brucella suis，and persistence of a knockoutmutant in BALB/c mice.Microbiology 146：1605-1616；和Jubier-Maurin V，Boigegrain RA，Cloeckaert A，Gross A，Alvarez-Martinez MT，Terraza A，Liautard J，Kohler S，Rouot B，Dornand J，Liautard JP.2001.Major outermembrane protein Omp25 of Brucella suis is involved in inhibition of tumornecrosis factor alpha production during infection of human macrophages.Infection and Immunity 69：4823-4830。
汉氏巴尔通氏体细胞可以通过Dehio M，Knorre A，Lanz C，Dehio C.1998描述的方法进行转化。Construction of versatile high-level expressionvectors for Bartonella henselae and the use of green fluorescent protein as a newexpression marker.Gene 215：223-229。
五日热巴尔通氏体(Bartonella quintana)细胞可以通过Dehio M，KnorreA，Lanz C，Dehio C.1998描述的方法进行转化。Construction of versatilehigh-level expression vectors for Bartonella henselae and the use of greenfluorescent protein as a new expression marker.Gene 215：223-229。
Mannheimia haemolytica细胞可以通过Marciel AM，Highlander SK.2001描述的方法进行转化。Use of operon fusions in Mannheimia haemolyticato identify environmental and cis-acting regulators of leukotoxin transcription.Infection and Immunity 69：6231-6239。
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)细胞可以通过Hinds J，Mahenthiralingam E，Kempsell KE，Duncan K，Stokes RW，Parish T，Stoker NG.1999描述的方法进行转化。Enhanced gene replacement in mycobacteria.Microbiology 145：519-527；和Bachrach G，Colston MJ，Bercovier H，Bar-NirD，Anderson C，Papavinasasundaram  KG. 2000.A new single-copymycobacterial plasmid，pMF1，from Mycobacterium fortuitum which iscompatible with the pAL5000 replicon.Microbiology 146：297-303.
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、伞菌假单胞菌(Pseudomonasagarici)和褐鞘假单胞菌(Pseudomonas fuscovaginae)细胞可以通过Enderle PJ，Farwell MA.1998描述的方法进行转化。Elctroporation of freshly platedEscherichia Coli and Pseudomonas aeruginosa cells.Biotechniques 25：954；和Kim C，Wood TK.1998.Electroporation of pink-pigmented methylotrophicbacteria.Applied Biochemistry and Biotechnology 73：81-88。
天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)细胞可以通过Oh SH，Chater KF.1997描述的方法进行转化。Denaturation of circular or linear DNA facilitatestargeted integrative transformation of Streptomyces coelicolor A3(2)：Possiblerelevance to other organisms. Journal of Bacteriology 179：122-127；和Gregorovic G，Vujaklija D.2001.High efficiency of direct plasmid transferbetween two Streptomyces spp.，and between Streptomyces spp.and E.coli.FoodTechnology and Biotechnology 39：49-53.
霍乱弧菌(Vibrio cholerae)细胞可以通过Panda DK，Banerjee R，Das J.1995介绍的方法进行转化。Construction of shuttle vectors for cloning in vibriocholerae and Escherichia coli.Journal of Biosciences 20：367-376。
杜氏嗜血菌(Haemophilus ducreyi)细胞可以通过Hansen EJ，Latimer JL，Thomas S E，Helminen M，Albritton WL，Radolf JD.1992介绍的方法进行转化。Use of electroporation to construct isogenic mutants ofHaemophilus ducreyi.Journal of Bacteriology 174：5442-5449；和Windsor HM，Gromkova RC，Koornhof HJ.1993.Transformation of v-factor independence from Haemophilusducreyi to haemophilus influenzae and haemophilus parainfluenzae.MedicalMicrobiology Letters 2：159-167。
这项发明还包括(i)如上面所描述的表达盒或载体，用来表达编码多肽或多肽衍生物的核苷酸序列，其多肽是定位在外膜的，和(ii)用表达盒或载体转化了的原核细胞并且其在细胞的表面表达多肽。
具体的这个多肽是载体蛋白和过客蛋白的融合体，过客蛋白能够到达细胞表面，这可以通过蛋白酶可接近性分析(protease accessibility)或放射碘化作用(radio-iodination)的方法进行确定。
重组的表达系统是从原核或真核寄主中选择的，从原核中更适宜。真核寄主包括酵母细胞(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris))，哺乳动物细胞(例如，COS1，NIH3T3，或JEG3细胞)，以及植物细胞。原核寄主包括革兰氏阴性菌，具体包括：土壤杆菌属，更适宜的是根癌土壤杆菌，根瘤菌属(Rhizobium)，布鲁氏菌属(Brucella)，汉氏巴尔通氏体，溶血巴斯德氏菌，结核分枝杆菌，杜氏嗜血菌，单胞菌属(Pseudomonas)，大肠埃希氏菌，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，欧文氏菌属(Erwinia)，志贺氏菌属(Shigella)，沙门氏菌属(Salmonella)，霍乱弧菌，乳杆菌属(Lactobacillus)，卡-介二氏菌(Bacille biliédeCalmette-Guérin)(BCG)，以及链球菌属(Steptococcurs)，优选不产毒素的霍乱弧菌突变菌株和减毒的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella tyPhimurium)菌株。
细菌和真核细胞可以从多种渠道包括从商业渠道获得，例如可以从美国典型培养物保藏中心(ATCC；Rockville，Maryland)获得，用于重组蛋白表达的商购细胞在购买时还附带了其使用说明。
不产毒素的霍乱弧菌突变株据美国专利4,882,278描述的，其含有两个ctxA等位基因缺失以致于不产生功能性的霍乱毒素。WO 92/11354描述了一个菌株，其中的irgA位点被突变失活，这个突变可以和单链的ctxA突变组合。WO 94/01533描述了一个缺失突变体，其缺少功能型的ctxA和attRS1DNA序列。如WO 94/19482所描述的，这些突变株通过遗传工程使其表达异源蛋白。
WO 92/11361描述了减毒的鼠伤寒沙门氏菌菌株能否通过遗传工程表达重组的异源蛋白。
目前发明的其它的用于作为蛋白表达寄主的细菌菌株如；High等EMBO(1992)11：1991和Sizemore等Science(1995)270：299中描述的弗氏志贺代菌(Shigella flexneri)；Medaglini等描述的格氏链球菌(Sreptococcusgordonii)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92：6868；和Flynn J.L描述的卡-介二氏菌，Cell.Mol.Biol.(1994)40(suppl.I)：31，WO 88/06626，WO 90/00594，WO 91/13157，WO 92/01796，和WO 92/21376。
本发明通常使用一种或多种通常可以得到的革兰氏阴性菌作为寄主细胞。但是，对于一些突变造成其膜成分有所改变的粗糙(rough)突变体，我们仍然希望其可用于本发明的实践。含有较高磷脂的膜，例如可能会给融合多肽在高温下的表达创造更好的条件。另一方面，可能由于脂质-蛋白间相互作用的增强，可使一些多肽更接近膜表面，从而可能会达到增强免疫原反应或改变吸附特性的目的。象这样的突变，自发的或非自发的，我们都希望其可以作为寄主细胞或作为膜定位序列或跨膜序列的来源。
在细菌中，我们发明的多肽可以插入到细菌基因组中或仍然作为质粒的一部分而保持自由状态。
表达系统的选择要依赖于我们所期望的表达多肽的特征决定。例如，将本发明多肽制备成一种特定的脂化形式可能是有利的。
本领域技术人员都知道，不是所有的载体和表达调控序列以及寄主都同样适合表达本发明的多核苷酸。然而，在以下所述的指导下，不用做不必要的试验，便可对载体，表达调控序列和寄主所出选择，同时不偏离本发明的保护范围。
在选择载体方面，寄主一定要选择适合载体在其中存在和复制，同时，还要考虑载体的拷贝数、控制拷贝数的能力以及其他蛋白如抗生素抗性蛋白的表达。在选择表达调控序列方面，需要考虑很多因素，其中重要的因素是考虑序列的相关强度(如在不同条件下控制表达的能力)，控制序列功能的能力，要表达的多核苷酸与调控序列间的适宜性(例如，要考虑避免出现会抑制有效转录的发夹二级结构)。在选择寄主方面，所选寄主要是与所选载体相适宜的单细胞寄主，对表达产物的可能毒性要有一定耐受力，如果需要其产物要能够分泌到外膜，要能够表达要求构象的蛋白，容易扩大规模以及容易纯化终产物。
对表达盒的选择依赖于所选择的寄主系统以及表达多肽的所需特征。通常，一个表达盒包括在寄主系统中有功能并且可以组成型或诱导型表达的启动子；核糖体结合位点；如果有必要还需要一个起始密码子(ATG)；编码信号肽例如脂质化(lipidation)信号肽的区域；本发明的DNA分子；终止密码子和任选3′终止区(翻译和/或转录终止子)。信号肽的编码序列与发明中的多聚核苷酸邻近并且放置在一个合适的读框内。信号肽的编码序列与编码成熟多肽的DNA分子同源或异源并且与用于表达的寄主的分泌装置相适宜。本发明中DNA分子的开放读框，单独或与信号肽一起，都放置在启动子之下以便于在寄主内转录和表达。启动子和信号肽编码区对本领域技术人员是已知的且可得到，这些包括例如，鼠伤寒沙门氏菌启动子(和由此得到的衍生物)可以在阿拉伯糖(启动子araB)的诱导下并且在革兰氏阴性菌如大肠埃希氏菌中有作用(如美国专利5,028,530和Cagnon等，(Cagnon et al.，Protein Engineering(1991)4(7)：843)所描述的)；噬菌体T7编码RNA聚合酶的基因启动子，该启动子在表达T7聚合酶的多种大肠埃希氏菌菌株中起作用(美国专利4,952,496)；OspA脂质化信号肽；以及RlpB脂质化信号肽(Takase et al.，J.Bact.(1987)169：5692)。
表达盒通常都是表达载体的一部分，根据在所选择的表达系统中的复制能力对其进行选择。表达载体(例如质粒)可以从例如Pouwels等描述的载体中进行选择(Cloning Vectors：A Laboratory Manual 1985，Supp.1987)。合适的表达载体可以从不同的商业公司购买。
用表达载体转化/转染寄主细胞的方法已经广为人知，并且依赖于如Sambrook，J.E.F.等在Molecular Cloning a Laboratory Manual 2nd ed(1989)介绍的对寄主细胞的选择。Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor N.Y.
在表达方面，发明中的重组多肽(或由此得到的多肽)产生并保持在细胞内，分泌到细胞外介质中或壁膜间隙或嵌入膜中。所述多肽可以从培养的细胞提取物或重组细胞培养物离心后得到的上清液中得到纯化。通常重组多肽是通过基于抗体的亲和进行纯化的或其他的可以被本领域技术人员采用的方法进行纯化，如编码多肽的多聚核苷酸或其衍生物与小的亲和结合域的融合体。利用抗体通过免疫亲和来纯化本发明多肽的方法将在以下介绍。
在这里提供的序列信息有助于设计用于诊断的特异的核苷酸探针和引物。因而，本发明的另一方面提供了在SEQ ID NO：1或3或相关的同源序列中存在的或由于遗传密码子的简并性而从上述这些序列中衍生得到的核酸探针或引物。
这里所提的“探针”是指在严谨条件下与SEQ ID NO：1或3中核酸分子、或其相关同源序列、互补或反义序列杂交的DNA(较好的是单链)或RNA分子(或其修饰物或其组合)。通常，探针要比全长序列明显短。这样的探针包含约5到约100(例如，10，12，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60...等等)，优选约从10到约80个核苷酸。具体地，探针至少要有75％(例如至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％)，优选至少要有95％与SEQ ID NO：1或3的部分同源。探针也可以包含和这些序列和部分互补的序列。探针也可以包含一些修饰的碱基如肌苷，5甲基脱氧胞苷，脱氧尿苷，二甲氨基-5-脱氧尿苷或二氨基-2，6-嘌呤。糖和磷酸残基也可以修饰或取代。例如，一个脱氧核糖可以被聚酰胺取代(Nielsen et al.，Science(1991)254：1497)而且磷酸酯残基可以被酯基团如二磷酸酯，烷基酯，芳基膦酸酯和偶磷硫羰酸酯所代替。此外核糖核苷酸中2′-羟基基因可以被包括如烷基在内的基团修饰。
本发明的探针可以作为捕获或检测探针被用于诊断。这种捕获探针通常直接或间接通过共价的方式或被动的吸附被固定在一个固相支持上。一个检测探针是被检测标记物所标记，这种标记物包括放射性同位素、酶如过氧化物酶、碱性磷酸酶和能够水解发色、发出荧光或发光的底物的酶、可以产色、发出荧光或发光的化合物、核苷酸碱基类似物和生物素。
本发明的探针可以用于传统的各项杂交技术中，例如斑点杂交(dot blot)中(Maniatis et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(1982)Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)，Southern印迹，northern印迹，或夹心法技术中(Dunn et al.，Cell(1977)12：23)。后项技术包括利用至少部分不同的核苷酸序列作为特异的捕获探针和/或检测探针的应用。
引物通常是大约10到约40个核苷酸(例如，11，12，13，14，15，17，20，25，30或35个核苷酸)用于在扩增过程(例如PCR)或延长过程或反转录方法中起始DNA的酶促聚合。标记涉及PCR的诊断方法中所用的引物的技术已广为人知。
如这里所描述的，本发明还包括(i)包括本发明探针在内应用于检测和/或鉴定土壤杆菌属存在于生物材料的试剂；(ii)检测和/或鉴定生物材料中土壤杆菌属存在的方法。在一个实施方案中，检测和鉴定的方法包括以下步骤：(a)从生物材料中得到样本，(b)从所述材料中抽提DNA或RNA并变性，然后(c)在严谨的杂交条件下将本发明的探针例如可以是捕获探针、检测探针或两者共存的与核酸杂交，检测结果。在另一实施方案中，检测和鉴定方法包括以下步骤：(a)从生物材料中得到样本，(b)从中抽提DNA，(c)至少一个，最好是二个本发明的引物用于对抽提DNA的聚合酶链式反应，(d)产生扩增的片段。
很显然，揭示SEQ ID NO：1或3中多聚核苷酸或其同系物或部分的序列，可以得到相关的氨基酸序列。因此本发明还包括经充分纯化了的本发明多聚核苷酸编码的多肽或其多肽衍生物。
“充分纯化的多肽”是指将多肽与其自然发生环境完全分开和/或与其合成环境中的大多数多肽分开的多肽。例如，充分纯化的多肽与细胞质中的多肽分离。在SDS-PAGE凝胶上的一条带并不等同于一个充分纯化的多肽，这是因为凝胶样品含有很多种类的多肽。了解此项技术的人将会明白本发明中多肽可以从自然资源中纯化如从一个土壤杆菌菌株纯化，或通过重组的方式制备。
本发明包括的多肽、同系物或片段是经过修饰的，以保持或改进它们在细胞表面展示过客蛋白的能力。这些修饰包括前面介绍的氨基酸的取代、缺失和插入，但并不改变其固有的拓扑结构和靶定到外膜的能力。
多肽或多肽的衍生物可以通过已知的实验手段产生和纯化，并用于得到其抗体。如上所述，多肽或其衍生物可以作为一种融合蛋白产生，其融合蛋白上带有利于纯化的融合尾。融合蛋白用于刺激小的哺乳动物产生免疫反应得到抗所述多肽或多肽衍生物的抗体(单一特异性抗体(monospecificantibody)，因此，本发明还包括与本发明多肽或多肽衍生物结合的单一特异性抗体。
“单一特异性抗体”是指该抗体能和本发明中某一特异性蛋白发生反应，所述蛋白即特异性的载体蛋白如AopB，其同系物或其中的片段。本发明中的抗体可以是单克隆的也可以是多克隆的。单一特异性抗体可能是重组体，例如，嵌和的(例如，由小鼠的可变区和人的恒定区组成)，人类化的(人的免疫球蛋白恒定骨架连接上动物的超变区，例如小鼠起源的)，和/或单链的抗体。多克隆抗体和单克隆抗体都是免疫球蛋白的片段形式，例如F(ab)′2或Fab片段。本发明的抗体是任何类型的，例如IgG或IgA，并且多克隆抗体可以是一个单一类型或其混合物。
本发明中对应多肽、同系物或其片段的抗体是由包含所述多肽，同系物或片段的组合物免疫激活哺乳动物产生的。这种抗体可以是多克隆的也可以是单克隆的。用于产生单克隆或多克隆抗体的方法已经被本领域技术人员所知道。作为复习，参考Antibodies，A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，Eds.E.Harlow and D.Lane(1988)，and D.E.Yelton et al.，1981.Ann.Rev.Biochem.50：657-680.对于单克隆抗体，参考Kohler &Milstein(1975)Nature 256：495-497。
由本发明的多肽或其衍生物如AopB产生的抗体可以通过标准的免疫方法进行制备和鉴定，例如Western印迹分析，斑点印迹分析或ELISA(Sambrook，J.E.F.et.al.(1989)Molecular Cloning a Laboratory Manual2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor N.Y.)。这些抗体用于检测样品如生物样品中土壤杆菌属细菌的存在，也可以通过亲和层析用于纯化本发明中的多肽或其衍生物。
因此，本发明还提供了(i)用于检测包括本发明抗体、多肽和多肽衍生物的生物样品中土壤杆菌属细菌存在的试剂，和(ii)一个检验生物样品中土壤杆菌存在的方法，其通过样品与本发明中的抗体、多肽或其衍生物接触组成了一个免疫复合物，并且通过检测这个复合体来指示所述样品或样品来源的有机体中土壤杆菌属细菌的存在。
本领域技术人员可以很容易地理解，这个免疫复合体是由样品中的成分和抗体、多肽或多肽衍生物(可以选择任何一种)形成的，在检测该复合物之前都要将任何非结合的成分去除。
在诊断方面的应用，反应物(也就是来自本发明的抗体、多肽或多肽衍生物)或者保持自由状态或者通过直接或间接的方法固定到一个固相支持上例如全细胞、试管、珠或任何其他经常用于此领域的支持物上。直接固定的方法包括反应物的细胞表面表达、被动吸附(无共价键连接)或在反应物与支持之间形成共价连接。间接方式是指可与反应物反应的抗反应物性化合物首先被结合到固相支持物上。
本项发明的另一方面是提供了从生物样品中纯化多肽或多肽衍生物的方法，其包含与样品间基于抗体的亲和层析，其中抗体是本发明的单一特异性抗体。
应用本发明的纯化过程，抗体可以是单克隆的或多克隆的，并且优选是IgG型的。纯化的IgG通过标准的方法从抗血清中获得。通常用的层析支持物以及偶联抗体的方法在Antibodies：A Laboratory Manual，D.Lane，E.Harlow，Eds.(1988)中有描述，并且下文也会概要介绍。
简言之，生物样品，如包含RopB的豌豆根瘤菌提取物较适于在一个非离子型的含去污剂的缓冲液中被上样至层析材料，最好首先用稀释生物样品所使用的缓冲液平衡层析材料，以便于本发明多肽或多肽衍生物(也就是抗原)能吸附到所述料上。层析材料，如胶或树脂与本发明的抗体偶联，或分批或装入柱中。洗掉没有结合的成分而抗原经过适当的洗脱缓冲液洗脱回收，所述洗脱缓冲液例如甘氨酸缓冲液或包含离液剂的缓冲液如盐酸胍，或高盐溶液(如，3M MgCl2)。洗脱下来的级分经回收，通过280nm吸收值确定抗原的存在。
本发明还与aopB基因5′区域一段有启动子活性的分离的DNA有关。尤其是，本发明涉及的aopB启动子包含从SEQ ID No：1中6到309位核苷酸区域发现的功能元件。本发明的启动子DNA至少包含aopB转录起始位点的5′侧翼区的部分核苷酸序列。优选实施方案中，本发明的启动子DNA包含转录调控位点可以使启动子在酸性pH下被诱导。
B.表面展示
本发明的一个方面是与细菌细胞表面展示系统相关的。在一个实施方案中，根癌土壤杆菌的外膜蛋白AopB作为载体蛋白，并且根癌土壤杆菌作为寄主。用两种过客蛋白即水母的绿色荧光蛋白(GFP)和大肠埃希氏菌的碱性磷酸酶(PhoA)进行全细胞ELISA、免疫荧光显微镜检测、流式细胞仪分析和蛋白酶的可接近性分析，试验结果显示，两种蛋白都可以定位在细菌细胞表面。
一方面，本发明提供了一个展示过客蛋白的系统，可以展示过客蛋白的原本状态。所谓“原本状态”是指相对于自然发生或参考状态，过客蛋白的至少一个特性(例如酶活性)或结构特征(例如结合位点或抗体的抗原决定基)保留在展示蛋白中。GFP和PhoA都在没有加入还原剂或任何其他减少二硫键形成的条件下被定位到细胞的表面。在细胞表面展示的PhoA蛋白仍具有酶的活性，即使PhoA蛋白的活性状态是二聚体形式并且需要形成分子内的二硫键，而这种情况在其他的展示系统中会影响展示的过程。
AopB至少有4个位点(SEQ ID No：2的氨基酸125，134，172，和207)可以有效的在细胞表面展示PhoA蛋白。只有AopB N端而并非C端需要参与展示的过程，这点与其他的展示载体蛋白不一样。一个包含多克隆位点的表面展示载体被构建，并且可以在AopB的第172位氨基酸位点展示过客蛋白。其它的展示载体也可以构建用来在AopB的其它氨基酸位点展示过客蛋白。
另一方面，当融合蛋白在aopB启动子的控制下时，本发明提供的展示系统可以通过pH来进行调控。天然aopB启动子控制下的CGI1突变细胞中aopB-gfp融合基因的表达在酸性pH而不是中性pH下高效表达，这表明aopB启动子可以被酸诱导。所谓酸性pH是指小于7的pH值；然而，本领域技术人员会知道选择酸性需要兼顾其它因素比如细胞的存活力、对蛋白输出装置的影响以及所选pH对想要过客蛋白折叠的适宜性。在优选实施方案中，用于表面展示该融合蛋白的pH大约为5.5。调控融合蛋白的表达便于用于在细胞中展示本身对细胞有潜在毒害的过客蛋白。在优选实施方案中，可调控的展示系统使用aopB启动子在土壤杆菌属中最好是根癌土壤杆菌中表达融合蛋白。
对于过客蛋白和载体蛋白间有效的融合，过客蛋白融合到本发明多肽的N端，或优选融合到C端。这个融合蛋白包含一个连接肽或在载体蛋白与过客蛋白之间存在一个蛋白酶敏感的位点。
为了展示，杂合的多肽前体可以包含异源的信号肽。优选的异源信号肽是那些革兰氏阴性菌的或来自于革兰氏阴性菌的信号肽。在优选实施方案中，异源的信号肽与成熟载体蛋白的N端结合。优选的信号肽包括AopB的信号序列，尤其是SEQ ID NO：2的1-23位氨基酸或其变体或以及优选来自于其它土壤杆菌的同系物。
其它有用的信号肽包括Lpp靶定序列，其包括信号序列和成熟蛋白的前面9个氨基酸。可以作为分泌和膜定位信号来源的蛋白包括大肠埃希氏菌外膜脂蛋白如TraT，OsmB，NlpB，BLaZ；铜绿假单胞菌脂蛋白1；流感嗜血菌PA1和PCN蛋白；立氏立克次氏体17 kDa脂蛋白；淋病奈瑟氏球菌H.8蛋白。
基于AopB的展示系统可以通过生长培养基的pH来调节。当细菌培养在酸性基本培养基中时展示效率最高，而当细菌培养在中性基本培养基或丰富培养基中时展示效率则较低。基于AopB的土壤杆菌属展示代表了一个可以控制的展示系统，其除了可以展示单体蛋白，还可以直接展示活性的象PhoA(含有二硫键)的二聚体或多亚基的蛋白。该系统明显提高了可展示蛋白的种类以及效率，是一种简便、经济以及有效的展示系统。
该发明不仅提供了AopB作为载体蛋白的展示系统，而且AopB的片段，尤其是AopB的N端片段，同系物以及其变体，还有与AopB同源的AopB相关膜蛋白都可以作为载体蛋白用于表面展示。AopB相关膜蛋白包括豌豆根瘤菌的RopB(60％的氨基酸序列的相似性)、布鲁氏菌种的免疫原性外膜蛋白(42-47％的氨基酸序列的相似性)、经噬菌体感染的汉氏巴尔通氏体的Pap31(46％的氨基酸序列的相似性)、溶血巴斯德氏菌外膜蛋白PomA(47％的氨基酸序列的相似性)、结核分枝杆菌的PPE(39％的氨基酸序列的相似性)、杜氏嗜血菌外膜主蛋白(43％的氨基酸序列的相似性)和霍乱弧菌的外膜孔蛋白(40％的氨基酸序列的相似性)以及假单胞菌种的孔蛋白F(OprF)的C端区域。
AopB相关膜蛋白包括那些对展示过客蛋白有功能的片段。基于同源性的分析，预期AopB相关膜蛋白与AopB大约有相同的大小，也就是20kDa到24kDa，可以用于展示的载体蛋白片段至少包含自然状态下的AopB相关膜蛋白N端的150到220氨基酸。
本领域技术人员可以通过以下步骤进行了解，可以优化AopB相关膜蛋白片段的大小使其适合作为一个载体蛋白。具体的分析包括以下步骤：
(i)将一个报告蛋白(过客蛋白)如GFP与测试片段即推测的载体蛋白在框内连接。通常，通过编码报告蛋白和所述测试片段的核苷酸序列的框内连接来产生融合蛋白。然后将编码融合蛋白的核苷酸序列插入到表达载体中，在细菌中按步骤(ii)表达融合蛋白；
(ii)用编码融合蛋白的核酸转化革兰氏阴性细菌，最好是与推测载体蛋白的菌种是一样的。并且
(iii)使用适合于全细胞的分析方法例如FACS分析转化菌株的报告蛋白活性。在细胞表面报告蛋白的高水平活性表示这个片段适合于作为载体蛋白。
苜蓿中华根瘤菌的一个22kDa的外膜蛋白RopB的序列可以通过EMBL登录号X80767或AJ007906获得。
布鲁氏菌属的不同外膜蛋白包括：马尔他布鲁氏菌的OM25_BRUME25 kDa的外膜蛋白(EMBL登录号U33003)，B.melitensis biovar Canis的OM25 BRUCA 25 kDa外膜蛋白(EMBL登录号U39358)，B.melitensis biovarSuis的OM25 BRUSU 25kDa外膜蛋白(EMBL登录号U39397)，B.melitensis biovar Abortus的OM25 BRUAB 25kDa外膜主蛋白前体(EMBL登录号X79284)，B.melitensis biovar Neotomae的OM25_BRUNE 25kDa外膜蛋白(EMBL登录号U39359)，B.melitensis biovar Ovis的OM25_BRUOV 25kDa外膜蛋白(EMBL登录号U33004)，B.melitensis biovar Abortus的外膜蛋白(EMBL登录号AJ313014)，和马尔他布鲁氏菌的OM31_BRUME 31kDa外膜蛋白(EMBL登录号AF076290)。
汉氏巴尔通氏体噬菌体60457的Pap31的31K主蛋白的序列可以在EMBL登录号AF001274；AF308165；AF308166；AF308167；AF308168；AF308169；和AF308170中查到。溶血巴斯德氏菌的外膜蛋白PomA的序列可以在EMBL登录号AF133259中查到。
结核分枝杆菌的PPE序列可以在EMBL登录号AL009198或AL008967(PE_PGRS)中查到。
霍乱弧菌的推导的外膜孔蛋白的序列可以在EMBL登录号AF030977中查到。杜氏嗜血菌的外膜主蛋白的序列可以在EMBL的登录号U60646中查到。
可作为寄主展示过客蛋白的细菌包括革兰氏阴性菌，包括但并不局限于土壤杆菌属，更适宜的包括根癌土壤杆菌，根瘤菌属，布鲁氏菌属，汉氏巴尔通氏体，溶血巴斯德氏菌，结核分枝杆菌，杜氏嗜血菌，假单胞菌属，大肠埃希氏菌，克雷伯氏菌，欧氏杆菌属，志贺氏菌属，沙门氏菌属，霍乱弧菌，乳杆菌属，卡-介二氏菌(BCG)，和链球菌属，尤其是不产毒素的霍乱弧菌突变菌株和减毒的鼠伤寒沙门氏菌菌株。
本发明的载体蛋白更适合用于展示适宜寄主。所谓“展示适宜”是指载体蛋白和寄主细胞的组合能够有效的展示过客蛋白。例如，根癌土壤杆菌作为寄主细胞和AopB作为载体蛋白的组合是展示适宜的。然而大肠埃希氏菌和AopB或苜蓿中华根瘤菌RCR2011和AopB的组合则是不适宜的。展示适宜性可以通过在寄主细胞中表达融合的载体蛋白和过客蛋白(通常是报告蛋白)，并且分析融合蛋白在细胞表面的存在情况而确定。
AopB，片段，变体和AopB相关膜蛋白的表面展示最好使用其天然的寄主菌。其同系物和变体可具体应用如下：RopB可以作为根瘤菌属中的载体蛋白；布鲁氏菌种的免疫原性外膜蛋白用于布鲁氏菌属中；汉氏巴尔通氏体的Pap31用于巴尔通氏体中，更好是用于汉氏巴尔通氏体；P.外膜蛋白PomA用于巴斯德氏菌属中，更适宜的用于溶血巴斯德菌；结核分枝杆菌的PPE用于分枝杆菌属中，更适宜的用于结核分枝杆菌；杜氏嗜血菌的外膜主蛋白用于嗜血菌属，更适宜用于杜氏嗜血菌；霍乱弧菌的外膜孔蛋白用于弧菌属，更适宜用于霍乱弧菌；和假单胞菌属的孔蛋白F(OprF)用于假单胞菌属。
在一次实施方案中，AopB，其同系物和变体和其融合体在天然的aopB启动子的调控下进行表达。在另些实施方案中，AopB相关膜蛋白和其片段是在其天然启动子的调控下表达用于展示过客蛋白，例如RopB是受ropB启动子控制。
本发明的细胞表面展示系统具有多种用途，其包括：
(I)活疫苗的发展。在这种应用中，过客蛋白可以包含提呈给免疫系统的抗原决定基，从而在免疫系统中引发免疫反应；
(II)肽文库的筛选。在这项应用中，肽文库可以展示并通过顺序的结合和洗脱或荧光激活细胞分选术进行筛选；
(III)生物吸附。在这种应用中，全细胞展示一个过客蛋白，该过客蛋白可以结合特定的配体，从而可以从溶液中去除这个配体。
(IV)纯化。在这种应用中，全细胞展示一个过客蛋白，该过客蛋白可以结合特定的配体或受体，当将这种全细胞用做亲合基质时可以达到纯化该配体或受体的目的。
(V)全细胞的催化作用。在这项应用中，酶可以被固定在细胞表面，从而这些细胞可以当作固相催化剂用于生物化学的反应。
C.疫苗
非重组活疫苗已经很大比例的应用了许多年，例如，活体减毒培养的卡一介二氏菌(BCG)可以赋予机体抵抗肺结核的免疫力。
最近，重点已经转移到对重组细菌疫苗的发展。在这种情况下疫苗包括用于口服的减毒的肠细菌寄主的活培养物比如大肠埃希氏菌或鼠伤寒沙门氏菌，其表达来自病原体的抗原肽。在体内，一些细菌会找到适合其与野生型大肠埃希氏菌和其他肠道微生物共生的方式。这种方式确保体内保存了一个低水平的抗原肽。因而活疫苗相对于亚单位或死亡的细菌疫苗保持了潜在的更有效的更长时间的免疫力。
尽管抗原可以激发免疫反应甚至当抗原是在细胞内产生时，但如果多肽抗原在一个合适的寄主菌株表面表达可以显著提高其免疫激活力，推测起来可能因为细菌表面例如沙门氏菌或大肠埃希氏菌表面作为一种辅助因素来提高抗原的免疫激活力。暴露在细菌细胞表面的抗原可能更容易被免疫系统识别(相对仅仅由细菌死亡和降解释放的抗原)，这是由于表面抗原更利于与抗原识别和呈递细胞(巨噬细胞，树突细胞以及B淋巴细胞)上的受体接触。
本发明的展示方法因而可以用于在革兰氏阴性菌中表面表达抗原。在优选实施方案中，用于抗原展示的细胞是土壤杆菌属或根瘤菌属的细胞作为活疫苗使用，这是因为土壤杆菌属或根瘤菌属对哺乳动物包括人类在内都是无害的。由这些细菌得到的活疫苗应该比来自于人类病原细菌的基因工程减毒的菌株更加安全。
其它的可以作为展示过客蛋白抗原的活体细菌载体的寄主细胞包括：志贺氏菌属，沙门氏菌属，霍乱弧菌，乳杆菌属，卡一介二氏菌(BCG)以及链球菌属。
因为土壤杆菌属和根瘤菌属可以在野生的条件下生存良好，因此，基于AopB和RopB的展示技术可以用于产生鱼类的活疫苗，其可以直接释放到水中。
不产毒素的霍乱弧菌突变菌株已作为口服疫苗为人所知。美国专利4,882,278描述了两个ctxA等位基因中每个编码序列的大量缺失以致于不产生有功能的霍乱毒素的菌株。WO 92/11354描述了irgA位点被突变失活的菌株，这个突变可与ctxA突变在单一菌株中组合。WO 94/01533描述了缺少功能型ctxA和attRSl DNA序列的缺失突变，这些突变菌株可通过基因工程的手段来表达异源的抗原，如WO 94/19482所描述的。霍乱弧菌菌株可以表达本发明的多肽或多肽衍生物，其有效使用剂量一般大约从1×105到大约1×109，比较好的是约1×106到约1×108，其剂量是指试剂中与服用方法相适宜的活细菌的量。首选的服用方法包括所有的粘膜途径，最好是通过鼻腔或口服。
通过基因工程手段构建的用于表达或不表达重组或异源抗原的减毒鼠伤寒沙门氏菌菌株，其用作口服疫苗如WO 92/11361所描述。首选的服用方法包括所有的粘膜途径，最好这些载体是通过鼻腔或口服。
本文中提到的目前发明的其它的作为疫苗载体的细菌菌株如弗氏志贺氏菌High et al.，EMBO(1992)11：1991和Sizemore et al.，Science(1995)270：299所介绍；还有Medaglini et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92：6868提到的格氏链球菌；和在Flynn J.L.，Cell.Mol.Biol.(1994)40(suppl.I)：31，WO 88/06626，WO 90/00594，WO 91/13157，WO 92/01796，和WO92/21376中的卡一介二氏菌。
在细菌载体中，本发明的多聚核苷酸被插入到细菌基因组或作为质粒一部分保持自由状态。
多种抗原决定基可与激活物(如IL-4)一起表达在细胞表面，以进一步刺激针对表面暴露蛋白的免疫反应。
活体细菌疫苗的服用方法通常是非肠道途径，如通过注射或口服。口服制剂包括一些赋形剂如可药用的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁盐、糖的钠盐、纤维素、碳酸镁等。这些组合物形成溶液、悬液、药片、药丸、胶囊，缓释制剂或粉末，其中包含10-95％活性成分，较适宜的是25-70％的活性成分。
疫苗的服用方式要与剂型相适宜，并且其用量要能够产生治疗效果和免疫激活作用。服用量要依据治疗的特定对象决定，包括，例如个体免疫系统生成抗体的能力和需要保护的程度。需要服用的活性成分的精确用量依赖于医生的判断。然而，适合的剂量范围是每次接种的活性成分大约是几百微克。初次给药和加强给药的适宜方案可以有所变化，但通常后来的接种或其它的给药跟随最初的服用方法。
应用的范围可以很广。任何常用的服用方法对疫苗都可行。包括生理允许的固相的口服或生理可接受的扩散，非肠道途径、注射等。给药疫苗的剂量取决于服用途径并且会因寄主大小不同而变化。
在很多情况下，需要多次投放疫苗，一般不超过6次，更常见的是不超过4次并且较适宜是一次或一次以上，通常至少是约3次。疫苗间正常有2到12个星期的间隔期，更常见的是3到5星期。免疫过程之后检测针对抗原的抗体。该检测可以通过常规的标记如放射性核苷酸、酶、荧光剂等等来完成。这些技术是已知的且可以通过很多专利对该种分析的说明来进行，如美国专利3,791,932；4,174,384和3,949,064。
D.文库筛选
细胞表面展示系统可以用于在一个库中筛选想要特性的蛋白质。通过将载体核酸与编码侯选过客蛋白的核酸库的可表达融合体转化到寄主生物中，可根据想要的功能筛选在细胞表面展示侯选蛋白的寄主细胞，所述功能例如与配体如抗体或抗原的特异性结合功能。筛选的方法包括，例如亲和分离技术，包括亲和柱层析，从亲合基质材料中分批洗脱，以及荧光激活细胞分选术(FACS)。
本发明的细菌展示库可以通过FACS进行筛选，其使用荧光标记的配体作为探针来检测表达所要过客蛋白的细菌。于是使用分选单个细菌的FACS装置便可分离得到已经不含有非表达子的细菌细胞。
本发明提供的筛选抗体的方法可以从在寄主细胞表面表达的大量侯选抗体中筛选抗体或片段。这些抗体是从由编码抗体或抗体片段的DNA制备的表达载体文库中获得的。这些DNA的一个来源可以是由一个选定的抗原在动物中免疫获得的；另外，可以使用其它来源的抗体基因如来源于杂交瘤制备的或通过对已知抗体基因的诱变制备的。一个较好的获得DNA片段的方法是从免疫动物抗体生成细胞中获得分离的mRNA。该mRNA可以被扩增，例如通过PCR，并且用于准备DNA片段来包括在载体内。由编码所选抗体或抗体片段的一种或多种DNA诱变所得的DNA片段也可以被使用。
一旦抗体表达库准备好了，用于鉴定和分离特异性抗体的抗原就可以用一个可检测的标记物来标记。有许多类型的可检测标记，包括荧光标记。标记的抗原在适宜特异性抗原抗体结合的条件下与展示抗体表达库的细胞接触。其条件可以进行改变以使在该条件下只有非常强的结合作用才可能发生，例如，通过使用非常低浓度的标记抗原。
鉴定抗体或抗体片段表达的细胞可以通过依赖于检测是否存在结合的可检测标记的方法来完成。尤其优选的鉴定和分离方法是细胞分选或流式细胞术如荧光激活细胞分选术(FACS)。
通过FACS鉴定表达抗体的细菌直接基于对可溶性半抗原的亲和性，从而消去结合在固相表面的杂质。这意味着与低浓度荧光标记抗原结合后，只有高亲和性的抗体可以通过分选重新获得，阳性克隆的分选只是受到流式细胞仪精确性的限制。
本发明的细菌展示库同样可以用亲和层析进行选择，其中对过客蛋白特异性的配体被结合在基质上。因为细菌细胞比较大，所以上样时需要十分小心，以防被非特异性的细胞堵塞了柱子。在利于过客蛋白与基质所结合的配体结合的条件下上样和平衡层析柱之后，细胞可以通过游离的配体通过层析柱或低pH进行洗涤。
展示过客蛋白的寄主细胞可以进一步培养并用于获得融合蛋白。如果需要，当载体蛋白和过客蛋白之间有特异性蛋白酶切位点存在的时候，可以通过蛋白酶处理使载体蛋白和过客蛋白分离。
一旦想要的过客蛋白被展示，编码该过客多肽的DNA就可以被突变，例如，使用增变菌株。亲和分离可以重新用于鉴定和选择想要的突变体。
由细菌产生的重组免疫球蛋白库包括重链和轻链的可变区域，以便于能够象自然状态的抗体一样具有抗原结合的亲和性。进一步，由于随机序列可以插入到抗体的编码序列中，所以来自于细菌的重组抗体种类实际上是多于通过哺乳动物产生的抗体种类，以便于更大抗体库可以产生。抗体在细菌表面的展示有助于选择与特异性抗原高亲和的抗体。因此，基于AopB的系统可以用于产生抗体库并对高亲和的抗体进行选择。
本发明的展示方法可以用于对重组蛋白的检测和定性。例如，这个方法可用于绘制一个未知的抗原决定基图。依据说明，将编码(1)随机肽库或(2)从免疫反应性的目的蛋白得到的多肽库的序列克隆到本发明的表达载体中，用于表达AopB的融合蛋白。用该载体库转化AopB展示适宜的寄主细胞，并在细菌细胞表面展示肽库-AopB的融合蛋白。在固体基质上培养之后，通过与表达的融合蛋白反应的标记抗体对细菌进行选择。反应性的克隆可以被挑选出并分离其载体。对插入序列的分析可以揭示抗体识别的与抗原决定基相应的肽序列。
本发明的展示方法还可以用于检测重组蛋白的活性如抗体的活性。例如，这个方法可以用来筛选重组的抗体-AopB融合蛋白库。这些库包括由重链和轻链可变区基因组成的组合的单链基因库或特异性重组抗体基因的突变库。要检测的特性包括结合活性、催化活性、抑制活性和改变的结构构象。
本发明还可以用来作为一个最初的克隆系统。例如，cDNA文库可以构建和插入到本发明的载体并且文库通过与配体的结合能力筛选。配体/结合分子的组合可以包括任何一对具有相互特异性结合的分子，例如，受体/配体，酶/底物(或类似物)，核酸结合序列/核酸等等。如果有了其中的一种，那么就可以用此方法分离相对应的克隆。
E.生物吸附
本发明的展示方法可以用于从液体中去除污染物。在这个方法中，在革兰氏阴性菌外膜表达的受体蛋白可以用于与多种不想要的成分互作。例如金属硫蛋白可以与多种重金属结合，例如铁、镉、锌、铜、钒以及其他相似的金属。当这些成分与革兰氏阴性菌的细胞表面结合，我们就可以把这些重金属从液体样品中去除。
因而，过客蛋白作为生物吸附剂的一个例子就是金属硫蛋白，人金属硫蛋白已经与一个外膜蛋白一起构成的融合体被表达(Jacobs et al.Gene 83，95(1989))。由于构建重组蛋白的方式，金属硫蛋白被定位在大肠埃希氏菌外膜的内侧并朝向壁膜间隙的方向。然而，由于金属离子可以扩散穿过外膜，所以重组体细胞相对正常的大肠埃希氏菌可以结合超过66倍的镉离子。
展示多肽如特定抗体的全细胞也可以作为吸附剂用来去除生物污染，例如来自水样品的细菌内毒素或去除来自于血液的滤过性杂质。这种全细胞吸附的效率可以通过细菌表面的交叉连接而提高。这也会增强细胞的稳定性防止被裂解。稳定的一个方法是通过细胞表面脂多糖形成细胞之间的特异交叉连接。因而细胞可以得到聚集和稳定而没有影响表面展示蛋白的功能。其它的细胞吸附剂类型是通过在细菌细胞外膜表达包括纤维素结合结构域、淀粉结合结构域、蛋白A、凝集素或蛋白酶受体等。
限制全细胞吸附剂发展的主要因素是缺少表面带有合适的配体的细菌菌株。根据本发明的展示方法，在细菌细胞表面展示不同序列的不同肽库应该是可以做到的。能展示与特定靶标分子有高亲合的肽的细胞可以通过FACS进行选择。适合全细胞吸附的配体可以由此被选择和应用于基于AopB的展示系统。
在优选实施方案中，土壤杆菌属和根瘤菌属分别带有AopB和同系物RopB，被作为寄主细胞用于生物吸附。这两个属的细菌都可以在含有少量营养的野生环境中存活数年。土壤杆菌属和根瘤菌属细胞可用于选择和展示能与危害分子结合的过客蛋白。展示细胞可直接用于从环境中去除危害分子。
F.纯化
生物分子的亲和纯化主要依赖蛋白和配体间的强的互作。通常，配体结合在固相的基质中，通过层析技术进行分离。最近，淀粉颗粒或脂质体用做亲和纯化的基质。在一些最有用和特异性的分离中，亲和的配体是蛋白如抗体、凝集素或蛋白受体。蛋白亲和吸附剂的制备包括多肽的产生、纯化和在固相支持基质上的固定。这三个步骤对于大规模应用通常是复杂和昂贵的。
在表面表达蛋白的细菌细胞可以作为重要的低花费的固相亲和基质。在优选实施方案中，用于纯化抗体特异性抗原的亲和基质包含展示抗体的全细菌。相反，展示抗原的全细菌用作亲合基质可以用于纯化特原特异的抗体。
G.全细胞催化
此发明的展示方法可以用于固定酶。通过上述方法可以使多种有生物催化活性的多肽在细菌细胞表面得到表达。在细菌细胞表面得到表达的酶有利于增加与底物的可接近性，酶的稳定性，及潜在提高脂类的溶解性。更特别的是，无需使用额外的细菌寄主细胞成分，固定于寄主细胞膜上的生物催化活性的多肽可以用于双相反应系统。固定化酶所提高的脂类溶解性能使在亲脂溶剂中的催化剂底物之间相互作用通过对水溶性生成物的萃取进入水相。这样的固定化系统更深一步预期可以包括将膜表面的固定化酶包裹在脂质体中或类似的小泡中。
整个细胞作为酶促催化剂的方法已经使用了几年了。通常，以产生特定酶的微生物作为生物催化剂使用，从而避免了与蛋白质提纯和固定化步骤相关的费用。通常，首先需要将细胞灭活，然后用渗透剂处理以使反应物及产物能扩散进入胞浆，最后细胞由化学交联形式固定。对全细胞生物催化剂的制备近年来也有不少改进。但，其固有的限制是当前技术所不能逾越的。首先，用于细胞膜穿透(permeabilization)的化学方法同时会导致一些重要的酶钝化。第二，其他一些细胞内的酶可能会竞争与底物作用而增加不必要的副产品产生及减少产量。第三，细胞内部的降解过程会限制生物催化剂的功能性生命周期。如果酶附于细胞外部，这些问题可以被减少。
基于AopB的展示系统可以在细胞表面产生固定的碱性磷酸酶，其可用做DNA片段脱磷酸化或其他用途。随后用离心或过滤轻松除去固定化酶。
实施例
以上内容只是一般性的描述了这项发明。要想对其有一个更深入的了解，可以参考以下提供的特定的实施例。这些实施例仅仅是为了说明的需要，而不是故意要限制本发明的范围。形式上的变化和等价物的取代被认为是可能有利的环境。虽然本文使用专业术语，这些术语是为了描述的方便而并非为了有所限制。
实施例1：试验方案
细菌菌株，质粒和培养基：该试验中所用的细菌菌株和质粒如表1所示。在37℃用LB培养基(Sambrook et al.，1989)培养大肠埃希氏菌菌株，如果必要可在LB培养基中加50μg/ml卡那霉素，100μg/ml氨苄青霉素和/或10μg/ml四环素。根癌土壤杆菌菌株在28℃培养于MG/L，AB或IB培养基上(Cangelosi，G.A.，Best，E.A.，Maninetti，G.，Nester，E.W.，1991.Genetic analysis of Agrobacterium.Methods Enzymol.204，384-397)，如需要可加100μg/ml卡那霉素和/或5μg/ml四环素。苜蓿中华根瘤菌菌株置于LB/MC培养基或M9培养基中培养(Finan，T.M.，Kunkel，B.，De Vos，G.F.，Signer，E.R.，1986.Second symbiotic megaplasmid in Rhizobium meliloticarrying exopolysaccharide and thiamine synthesis genes.J.Bacteriol.167：66-72；Glazebrook J，Walker GC.1991.Genetic techniques in Rhizobiummeliloti.Methods Enzymol.204：398-418)，必要时可加入10μg/ml四环素。质粒DNA通过进行三亲交配(triparental mating)导入至C58根癌土壤杆菌菌株中，辅助菌株(helper strain)为MT616。
                                 表1.细菌菌株和质粒
菌株 相关属性a 来源或参考
大肠埃希氏菌
DH5α endA1 hsdR17 supE44 thi-1 recA1 gyrA96relA1Δ(argF-lacZYA)U169(80dlacZΔM15 Bethesda     ResearchLaboratories
MT607 pro-82 thi-1 hsdR17 supE44 end44 endA1 recA56 Finan et al.，1986
MT616 MT607(pKR600)，mobilizer Finan et al.，1986
MT621 pro-82 thi-1 hsdR17 supE44 end44 endA1malF∷TnphoA；Donor strain of TnphoA Yarosh et al.，1989
根癌土壤杆菌
C58 野生型，胭脂碱(nopaline)型质粒pTiC58 由实验室收集
A136 无pTiC58的C58毒力消除型，RfR，NaIR Watson et al.，1975
CGI1 C58的衍生物，其内的标记了GFP的mini-Tn5转座子破坏了aopB；KmR，GmnR 本研究
A6010 A348[A136(pTiA6NC)]；Pho-，NalR，SmR Cangelosi et al.，1991
GMI9023 无pTiC58和pAtC58的C58毒力消除型，SmR，RfR Rosenberg and Huguet，1984
A348△virB7 A348[A136(pTiA6NC)]；△virB7 Berger and Christie，1994
苜蓿中华根瘤菌
RCR2011 和SU47类似的野生型 Charles and Nester，1993
质粒 相关特性a 来源或参考
pTZ19R 克隆载体，ColE1 oriV bla，AmpR US Biochemical
pSW172 宽宿主谱的IncP质粒，其中包括了Plac和下游多接头(polylinker)序列，TcR Chen and Winans，1991
pAG408 质粒包含标记了gfp的mini-Tn5转座子，GmR，KmR，AmpR Suarez et al.，1997
pJYH2 pTZ19R携带有9kb SphI片段，片段中包括插入了mini-Tn5的aopB，KmR，AmpR 本研究
pJYH5 pSW172携带有一个包含aopB的1.4kb PCR产物，TcR 本研究
pJYH31  pSW172携带有一个包含aopB的0.9kb PCR产物，TcR  本研究
pJYH5039  pJYH5包含TnphoA，插入在AopB的残基39，KmR，TcR  本研究
pJYH5125  pJYH5包含TnphoA，插入在AopB的残基125，KmR，TcR  本研究
pJYH5134  pJYH5包含TnphoA，插入在AopB的残基134，KmR，TcR  本研究
pJYH5172  pJYH5包含TnphoA，插入在AopB的残基172，KmR，TcR  本研究
pJYH5207  pJYH5 c包含TnphoA，插入在AopB的残基207，KmR，TcR  本研究
pVJ∷PhoA17  pVK102包含一个在virJ残基40融合有phoA的virJ基因，KmR  Pan et al.，1995
pTC115A∷PhoA  pTC115包含一个在VirA胞浆区内融合有phoA的VirA基因，KmR  本研究
pMAL-c2  克隆载体用于表达和纯化麦芽糖结合蛋白(MBP)融合蛋白，AmpR  New England Biolabs
pJYH17  pMAL-c2包含malE∷aopB融合基因，该融合基因含有一个编码MBP的基因，其上融合了整个AopB，该融合基因插入在pMAL-c2的EcoRI位点，AmpR  本研究
pJYH20  从pSW172得到的展示载体，包含aopB启动子和aopB的编码序列1-516bp，TcR  本研究
pJYH21  pJYH20的HindIII-PstI位点上包含gfp编码序列，TcR  本研究
pJYH23  pJYH20的HindIII-PstI位点上包含phoA编码序列，TcR  本研究
aAmp，氨苄青霉素；Gm，庆大霉素；Km卡那霉素；Nal，萘啶酸；Rf，利福平；Sm，链霉素；Tc，四环素。
Berger，B.R.，Christie，P.J.，1994.Genetic complementation analysis of the根癌土壤杆菌virB operon：virB2 through virB11 are essential virulence genes.J.Bacteriol.176：3646-3660；
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Green fluorescent protein-based reporter systems for genetic analysis ofbacteria including monocopy applications.Gene 196：69-74；
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DNA操作：除非有其他的说明，通常都会常规选用DH5α作为克隆试验的受体菌株。如先前所描述的来制备高效感受态细胞。(Inoue，H.，Nojima，H.，Okayama，H.，1990.High efficiency transformation of Escherichia coli withplasmids.Gene 96，23-28)。依据标准方案(Sambrook et al.，1989)，通过转化将质粒DAN导入大肠埃希氏菌。通过三亲交配，其中MT616为辅助菌株(Ditta，G.，Stanfield，S.，Corbin，D.，Helinski，D.R.，1980.Broad host range DNAcloning system for gram-negative bacteria：construction of a gene bank ofRhizobium melioti.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：7347-7351)，或电穿孔(Cangelosi，G.A.，Best，E.A.，Martinetti，G.，Nester，E.W.，1991.MethodsEnzymol.204，384-397)，宽宿主谱的质粒可以导入根癌土壤杆菌。根癌土壤杆菌的全部DNA可以依据Charles和Nester的方法制备(Charles，T.C.，Nester，E.W.，1993.J.Bacteriol.175：6614-6625)。
Southern分析：为了制备DNA探针，由适当的限制性酶消化质粒DNA。可以用琼脂糖凝胶分离DAN片段，并由GENECLEAN II试剂盒纯化(Biol0l)。用荧光素(Amersham)随机标记探针。将根癌土壤杆菌全部的DNA消化得到片段，在1.0％琼脂糖凝胶上分离片段，用PosiBlot 30-30 PressureBlotter(Stratagene)将片段转移到尼龙膜上。按制造厂商的说明(Amersham)进行杂交，洗涤和检测。
AopB的克隆和测序：提取突变菌株CGI1中的全部DNA，其中所述突变菌株CGI1的aopB基因上插入了mini-Tn5。Southern分析显示，因为转座子中没有SphI位点，9 kb的SphI DNA片段包含了插入两边的序列。从琼脂糖凝胶回收的DNA片段然后由GENECLEAN II试剂盒(Biolol)纯化。然后SphI DNA片段被克隆到pTZ19R的SphI位点。所生成的质粒命名为pJYH2。通过mini-Tn5的特异性引物及M13的反向引物和-40通用引物对pJYH2测序，所测序列资料于是用于产生下一轮的引物用于进一步测序。DNA测序使用的是ABI PRISM 377核酸序列分析仪。
为克隆全长野生型aopB基因，设计引物p54(5′-GCAAATC GCTAGCTGTCACTCAGC-3′)和p55(5′-AGAACG GCTAGCGCACTGAAGCGG-3′)可分别再退火到aopB基因的上游和下游序列。两个引物都有NheI位点(划线处的核苷酸)协助随后的克隆。以根癌土壤杆菌C58菌株的全部DNA为PCR的模板来扩增一个1.4kb的片段。一份50μl的PCR反应体系包括1X反应缓冲液，0.2mM dNTPs，20pmol的每种p54和p55引物，和2.5单位的TaqDNA聚合酶(Promega)。PCR反应混合物在95℃变性1分钟。随后总共30个循环按如下操作：95℃变性30秒，50℃退火30秒，和72℃延伸1.5分钟，随后进行一个72℃10分钟的延伸循环。然后用NheI消化PCR产物，再与已用XbaI消化的pSW172连接。双方向分别测定所生成的质粒pJYH5的序列，以得到确定的序列数据。用BLAST程序在数据库中寻找同源的序列。推定的信号肽由SMART确定。
MBP-AopB融合蛋白的纯化和AopB的抗体的制备：
将包含有MBP-AopB框内融合构建体的DH5α(pJYH17)，置于添加了100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜。用新配制的培养液将细胞培养物稀释100倍，再37℃培养至OD600≈0.5。通过加入IPTG至最终浓度0.3mM及在37℃细胞培养2-3小时，完成MBP-AopB融合蛋白的诱导。MBP-AopB的纯化是依据Pan et al.，1995.Mol.Microbiol.17：259-269中所述进行的。纯化后的蛋白注入兔子体内产生初级抗体。
用TnphoA的诱变确定AopB蛋白的拓扑结构：将包含野生型aopB基因的pJYH5质粒转化到MT621中，MT621中包含了TnphoA转座子。通过混合MT621(pJYH5)，A6010和MT616进行三亲交配，在MG/L琼脂平板上28℃过夜培养。将混合物用灭菌的小木棒刮下，重悬于IB液体培养基中。细胞悬浮液涂在IB平板上并28℃培养3天，其中IB平板中包含卡那霉素、四环素以及显色反应物5-溴-4氯-3-吲哚磷酸盐(5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate)(X-phos，20μg/ml)。蓝色的菌落转至新配制的MG/L平板，其中为了纯化加入了100μg/ml卡那霉素和2μg/ml四环素。通过三亲交配，将包含TnphoA插入的质粒导入MT607，由MT616作为辅助菌株。SmaI和ClaI用来绘制TnphoA插入的位置。通过使用phoA特异性的引物来进行测序以确定准确的插入位点。为了测定碱性磷酸酶的活性，根癌土壤杆菌细胞在MG/L中28℃过夜培养，在OD600＝0.3时转移到AB、IB或加有乙酰丁香酮(acetosyringone)(AS)(100μM)的IB中。通过测量对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate)的水解程度来确定PhoA融合体的碱性磷酸酶活性(Brickman，E.，Beckwith，J.，1975.Analysis of the regulation of Escherichia colialkaline phosphatase synthesis using deletions and phi80 transducing phages.J.Mol.Biol.96：307-3 16)。用以下公式计算碱性磷酸酶活性的特定单位：[(A420-1.75X A550)X 103]/[t(min)X A600]。
AopB基因表达的测定：用aopB-gfp和aopB-phoA融合体来测定aopB基因表达。为了使用aopB-gfp融合体，将CGI1细胞置于不同的培养基中培养。按前面所述的方法测量相对荧光强度(Ir)(Tang，X.，Lu，B.F.，Pan，S.Q.1999.A bifunctional transposon mini-Tn5gfp-km which can be used to select forpromoter fusions and report gene expression levels in根癌土壤杆菌.FEMSMicrobiology Letters 179：37-42)。用C58细胞为阴性对照。激发波长为395nm，发射波长为510nm；及波长间隙(wavelength slit)为5。使用aopB-phoA融合体时，带有aopB-phoA融合体的细菌细胞的碱性磷酸酶活性可按较早描述的方法测定。
亚细胞的分级分离：根癌土壤杆菌的亚细胞分级分离采用的是对先前描述的方法略有改动的方法(De Maagd，R.A.，Lugtenberg，B.，1986.Fractionation of Rhizobium leguminosarum cells into outer membrane，cytoplasmic membrane，periplasmic，and cytoplasmic components.J.Bacteriol.167：1083-1085)。简单的说，将根癌土壤杆菌菌株C58和CGI1置于MG/L培养基中28℃过夜培养，然后3200xg离心5分钟收集细胞。再用水清洗一次细胞，并转移到新的OD600＝0.3的IB液体培养基中。28℃诱导细胞18-20小时，再按上述方法收集。室温下，用50mM Tris-HCl(pH 8.0)，通过离心洗涤细胞沉淀(cell pellet)3次。一部分细胞沉淀(OD600测量大概为2×1010个细胞)按如下方法用来分离细胞周质级分。细胞沉淀重悬于5ml的50mMTris-HCl(pH 8.0)，20％蔗糖，2mM EDTA和0.2mg/ml溶菌酶中。细胞悬浮液室温下培养30分钟再在4℃3000xg离心15分钟。取上清液在20,000xg离心15分钟，其上层液体为胞周级分保存。另一部分的细胞沉淀(1×1011个细胞)按以下方法制备其他亚细胞级分。将细胞沉淀重悬于5ml的50mMTris-HCl(pH 8.5)，20％蔗糖，0.2mM DTT，0.2mg/ml DNase I和0.2mg/mlRNase A中。在20,000psi，将细胞悬浮液通过French Press mini-cell5次后，冰上培养30分钟。细胞裂解物用两倍体积的50mM Tris-HCl(pH 8.5)稀释，在262,000xg下用Beckman SW80Ti转子离心2小时。其上清液作为胞质级分保存，然后再用超声波将沉淀悬浮于20％蔗糖-5mM EDTA-0.2mM DTT中，而其中的一小部分悬浮液保存为全膜级分。将剩下的悬浮液铺在下列密度梯度上：2ml 60％蔗糖(wt/wt)，4ml 45％蔗糖(wt/wt)和5ml溶于5mM EDTA(pH 7.5)的30％蔗糖(wt/wt)。该梯度液在58,000xg用BeckmanSW41Ti转子离心18小时。收集保存上带的内膜级分和下带的外膜级分。加入3倍体积的丙酮沉淀胞周、胞质、内膜和外膜级分中的蛋白质。在Laemmli样本缓冲液中溶解各个级分。
AopB的全细胞ELISA：将根癌土壤杆菌菌株A6010的细胞置于有100μM乙酰丁香酮(AS)的IB培养基中诱导并用PBS(pH 7.4)通过在10,000g离心5分钟洗涤2次。通过测量600nm的光密度来确定细胞浓度并调整至4×108细胞/ml。取50μl的细胞悬浮液移至IMMUNLON 2HB微量滴定板的孔中。加入50μl 8％多聚甲醛固定细胞，并在室温下培养45分钟。之后用PBS(pH 7.4)洗涤2次，并用120μl含2％牛血清白蛋白的PBS封闭45分钟。用PBS洗涤3次后，将细胞与用PBST/BSA(PBS，0.02％Tween 20，0.2％BSA)稀释(1∶500)的AopB抗体、VirJ抗体(Pan et al.，1995.Mol.Microbiol.17：259-269)或GFP单克隆抗体(Clontech)一起孵育45分钟。用PBST(PBS，0.05％Tween 20)洗涤细胞3次，每次10分钟。加入50μl HRP偶联的2级抗体(1∶2000稀释)再培养45分钟。在每孔加200μl TMB-ELISA(GIBCO)前，用PBST洗涤3次，再避光培养15分钟。加入50μl 1N H2SO4来停止反应。用酶标仪测量450nm处的吸收值。
Western分析：在Laemmli样本缓冲液中将蛋白质样本煮沸5分钟使蛋白质样本变性，再上样至SDS/12％PAGE甘氨酸凝胶。进行蛋白质电泳再将蛋白质转移到PVDF膜上(BIO-RAD)。增加的同时，按照制造商建议的方法(Pierce)，通过扩增化学发光试剂进行封闭、洗脱、检测。
抗血清：按较早描述的方法制备兔抗AopB多克隆抗体。从ChemiconInternational购买小鼠抗碱性磷酸酶单克隆抗体。从Clontech买小鼠抗GFP单克隆抗体。C.W.Jones惠赠兔抗ChvE抗体。从Molecular Probes得到R-藻红蛋白(r-PE)偶联的羊抗小鼠IgG。购买Pierce的HRP偶联的羊抗兔和羊抗小鼠IgG。
展示蛋白的全细胞ELISA：在不同的液体培养基中培养根癌土壤杆菌细胞；用OD600确定细胞悬浮液的浓度；将细胞浓度调整到4×108细胞/ml。每50μl细胞悬浮液移到Immunlon 2HB微量滴定板(Dynex)的孔中。再每孔加入50μl的8％多聚甲醛固定细胞，并室温培养1小时。用PBS(pH 7.4)洗2次，用含2％BSA的150μl PBS(PBS/BSA)封闭1小时。用PBS洗涤3次后，将该细胞用含0.02％Tween 20的PBS/BSA稀释的(1∶500)第一抗体孵育1小时。用有0.05％Tween 20的PBS(PBST)，使用洗瓶洗涤细胞3次，在洗涤间隔中培养10分钟。然后加入50μl按1∶2000稀释的HRP偶联的羊抗兔或羊抗小鼠IgG，培养1小时。在加入200μl TMB-ELISA(GIBCO)避光培养15分钟前，用PBST洗细胞5次。用50μl 1N H2SO4终止反应。用酶标仪测量450nm的吸光值。
流式细胞分析：按上述方法培养根癌土壤杆菌菌株C58(pJYH5)，C58(pJYH5039)，C58(pJYH5125)，C58(pJYH5134)，C58(pJYH5172)以及C58(pJYH5207)。对于每一个菌株，用10,000×g离心1分钟收集4×108个细胞。用PBS洗涤细胞沉淀2次，再在1.5ml PBS/BSA中培养30分钟。在PBS/BSA中按1∶1000稀释单克隆小鼠抗AP抗体，之后加到悬浮液中。室温轻轻振荡培养悬浮液45分钟。用PBST洗涤3次后，将细胞重悬于用PBS/BSA稀释(1∶100)的1.0ml r-藻红蛋白偶联的羊抗小鼠IgG(Molecular Probes)中并避光振荡培养45分钟。用PBST洗涤一次后，加入1ml 2％多聚甲醛在室温下培养30分钟固定细胞。再按上述方法洗涤4次；将细胞重悬于500μl PBS中并用FACS流式细胞分析仪检测。记录10,000个细胞的荧光。
共聚焦显微镜检测(Confocal microscopy)：为进行上述流式细胞分析，用如上方法处理的15μl一份的细胞样品，滴到玻璃载玻片上；为防止荧光的快速猝灭每一份细胞样品加入一滴封片剂(Vector)并盖上盖玻片。在共聚焦显微镜下(激发波长为543nm，发射波长为570nm.)下检测细胞。
蛋白酶的可接近性分析(Protease accessibility assays)：在不同液体培养基中培养根癌土壤杆菌。按先前的方法(Burnett MS，Wang N，Hofmann M，Kitto GB.2001.Vaccine.19：735-742)略加修饰，用胰蛋白酶消化细胞。简单的说，通过10,000×g离心1分钟收集到OD600＝1的细胞悬浮液，并用1ml含有10mM MgCl2的25mM HEPES缓冲液(pH 8.0)洗涤一次。细胞沉淀重悬于50μl相同的缓冲液中再在冰上培养30分钟。在细胞悬浮液中加入胰蛋白酶，使其最终浓度达到0.1mg/ml；该混合物37℃培养5分钟。通过加入55μl的2×Laemmli样品缓冲液来停止反应。将样品煮沸10分钟，再将10μl的样品加到SDS/10％聚丙烯酰胺/Tris-甘氨酸凝胶上。将蛋白质电泳转移到PVDF膜上(Bio-Rad)。按照制造商建议的方法(Pierce)，通过扩增化学发光试剂进行封闭、洗脱、检测。AopB-PhoA和AopB-GFP蛋白用抗AopB抗体可以检测到。用抗ChvE抗体可以检测到ChvE蛋白(用做对照)。
测定含有pJYH23的细菌细胞的碱性磷酸酶活性：28℃在MG/L中过夜培养根癌土壤杆菌细胞；收集细胞并重悬于MG/L，AB，或IB中(OD600＝0.3)；再28℃培养18小时。大肠埃希化菌在LB培养基中28℃过夜培养；苜蓿中华根瘤菌细胞在LB/MC中28℃过夜培养。收集相当于OD600＝1的细菌细胞用于一次处理，为测定蛋白酶的易接近性，按上述方法洗涤和处理，同时加入或不加入0.1mg/ml胰蛋白酶。然后用1M Tris-HCl(pH 8.0)洗涤细胞二次，再重悬于1ml的相同的缓冲液中。100μl的每一份细胞悬浮液用1MTris-HCl(pH 8.0)稀释到1ml。用该细胞悬浮液来测定细菌细胞(包含有pJYH23)的碱性磷酸酶(AP)活性，如先前所述(Brickman and Beckwith，1975)，其中的AopB172-PhoA蛋白的活性由底物对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylphosphate)的水解速度确定。按如下公式计算碱性磷酸酶活性的特异单位：[(A420-1.75×A550)×103]/[t(min)×A600]。因胰蛋白酶处理而致的AP活性减少由胰蛋白酶处理后除去的AP活性的单位百分比表示。
实施例2：aopB和aopB相关基因的鉴定和特征：
由包含可以编码GFP变体的启动子缺少基因(promoter-less gene)的mini-Tn5转座子诱变根癌土壤杆菌C58，在UV光下该GFP变体可以产生亮绿色的荧光(Li，L.，Li，Y.，Lim，T.M.，Pan，S.Q.，1999.GFP-aided confocal laserscanning microscopy can monitor根癌土壤杆菌cell morphology and geneexpression associated with infection.FEMS Microbiol.Lett.179：141-146)。由质粒pAG408携带mini-Tn5转座子(Suarez，A.，Guttler，A.，Stratz，M.，Staendner，L.H.，Timmis，K.N.，Guzman，C.A.，1997.Green fluorescentprotein-based reporter systems for genetic analysis of bacteria includingmonocopy applications.Gene 196：69-74)。其中的一个变体，CGI1，包含一个在转座子插入一个可以通过基本培养基的低pH进行的差异诱导的基因；在IB平板(基本培养基pH5.5)而不是AB(基本培养基pH7.0)上，CGI1可以产生明亮的荧光。CGI1和其亲本C58在所有培养条件(MG/L，AB，IB)下生长没有差异。接种变体菌株CGI1和亲本C58到Kalanchoe植物的叶子上。细胞浓度为5×109细胞/ml时，CGI1和C58所导致的肿瘤形成没有明显差异。但在低浓度5×107时，在植物上CGI1导致的瘤比C58较少、较小。为了分离包含mini-Tn5的DNA片段，用Southern分析估算他们的大小。将包含mini-Tn和带有mini-Tn5插入位点两侧的序列的9kb SphI DNA片段克隆到pTZ19R而产生了pJYH2。对pJYH2的片段分析说明，插入了转座子的基因和编码根瘤菌属外膜蛋白(ropB)的基因有同源性(Roest，H.P.，Mulders，I.H.，Wijffelman，C.A.，Lugtenberg B.J.，1995.Isolation of ropB，a gene encoding a 22-kDa Rhizobiumleguminosarum outer membrane protein.Mol.Plant-Microbe Interact.8：576-583)。这个根癌土壤杆菌基因被指定为aopB(土壤杆菌属外膜蛋白)。
为了确定该基因的全部序列，用PCR扩增C58的DNA片段。其中一个1.4kb的片段包含有aopB的上游和下游的序列。将该片段克隆到pSW172中得到了质粒pJYH5。当将质粒pJYH5导入变体CGI1时，变体可以恢复全部的致瘤能力，这说明pJYH5携带了全长的aopB基因。因为1.4kb PCR片段包含大概500bp的aopB基因下游序列，这个短序列可能包含一个小的ORF，其可以互补由转座子造成的突变。为了排除转座子突变对aopB下游基因的极性影响从而造成的CGI1的毒力减弱的可能，用p119(5′-AAATCGATCTATTGCTGGTTAGGC-3′)和p112(5′-CGACTGCAGAAGGATCAGAACTTG-3′)作引物，通过PCR扩增C58中的片段，其中的引物分别包括了位点ClaI和PstI。产生的较小的DNA片段，随后克隆进pSW172中得到pJYH31。这个片段携带了1.4kb片段(图1B)从89到979bp的序列，但不包括aopB下游的ORF。通过三株交配，将pJYH31导入CGI1。在叶片上的毒力化验表明，CGI1(pJYH31)也恢复了全部的致瘤能力。这清楚地说明，aopB上的突变削弱了CGI1的毒力。序列分析说明，aopB基因座携带一个开放读框(ORF)，它编码一个22.8kDa的218个氨基酸的推定蛋白(图1A)。这个推定的蛋白与RopB有60％的同源性(图2)。
为了确定aopB基因的位置，通过包含aopB的DNA片段为探针探测A6和C58衍生物A136和GMI9023的基因组DNA。Southern分析说明，GMI9023，A136，A6，C58和CGI1中的每一个都带有包含aopB基因的单个SphI片段(图3)。这说明，aopB基因作为单个拷贝存在于这些菌株染色体上，因为GMI9023中没有Ti质粒也没有隐性质粒(cryptic plasmid)。因为CGI1中有mini-Tn5转位子插入在aopB，所以CGI1包括一个9 kb的片段，而GMI9023，A136和C58包括一个5.8kb片段。在A6中检测到较大的SphI片段的说明，章鱼碱(octopine)菌株可能也包含aopB基因但其序列可能与胭脂碱(nopaline)的有所不同。因为aopB基因和ropB基因的DNA序列的同源性只有66.5％，根瘤菌菌株中没有检测到有杂交信号。
在氨基酸序列水平上AopB蛋白和RopB有60％的相似性(图2)。AopB还和布鲁氏菌属的免疫原性外膜蛋白有42-47％的相似性，和感染了噬菌体的汉氏巴尔通氏体的Pap31有46％的相似性，与溶血巴斯德氏菌的外膜蛋白PomA有47％的相似性，与结核分枝杆菌的PPE有39％的相似性，与杜氏嗜血菌的外膜主蛋白有43％的相似性，及与霍乱弧菌的外膜蛋白有40％的相似性。AopB蛋白和假单胞菌的孔蛋白F(OprF)的一部分在C端有同源性。
实施例3：AopB在细胞表面的定位
为确定AopB在细菌细胞上的位置，通过TnphoA转座子诱导pJYH5的突变来确定AopB的亚细胞位置。从3000个转化结合子(transconjugants)中共获得了17个蓝色菌落。从这些蓝色菌落中的获得的质粒通过协助菌株MT616导入MT607。质粒的限制酶切图谱分析表明，它们中的14个在pJYH5的AopB开放阅读框包含TnphoA插入。限制图谱和DNA测序都说明，它们在5个不同位点都包含phoA插入，这些位点都在全部AopB蛋白中标出(图1B)。AopB残基134和207是TnphoA的转位热点，因为在这些位点上分别标注了5个和4个插入(图1B)。这也可能是相同转座子事件的复制所致。酶分析说明在5个不同的位置上的转座子插入产生水平相当的碱性磷酸酶(PhoA)活性(表2)。aopB-phoA融合体产生的PhoA活性高于virJ-phoA融合体(表2)；而已知VirJ存在于周质(Pan et al.，1995.Mol.Microbiol.17：259-269)。这些结果说明，全部的AopB蛋白位于周质或外膜。
为确定蛋白质位置，根据以前描述的步骤进行亚细胞分级分离试验(DeMaagd，R.A.，Lugtenberg，B.，1986.J.Bacteriol.167：1083-1085；Pan et al，1995.Mol.Microbiol.17：259-269)。如图4所示，因为在周质、胞质和内膜级分中都没有发现AopB，似乎AopB只存在于外膜级分中。有趣的是，转座子变异的CGI1中同样也在外膜中检测到框内AopB-GFP融合蛋白(泳道12)。但，因为与细胞的总裂解物相比较(泳道2和12)，只在外膜上检测到很少量的AopB-GFP而在其他部分没有检测到(泳道4，6，8和10)，说明这个融合蛋白的表现不稳定性。另一方面，天然的AopB蛋白的表现非常稳定，因为检测的在细胞裂解物中的AopB量和在外膜的一样(泳道1和11)。测序分析表明，TnphoA转座子被插到了氨基酸位点183。这些结果说明，183个氨基酸的N-端可以将融合蛋白运输到外膜。因为只在外膜级分中观测到极少量的融合蛋白(泳道12)，所以融合蛋白可能与外膜连接不稳定或在亚细胞分离分离过程中趋于降解。
进行全细胞ELISA可以通过确定AopB是否暴露在外膜的细胞表面并且是否可与AopB抗体直接反应来确认AopB的位置。如图5所示，经诱导的土壤杆菌菌株A6010(包括野生型aopB)细胞可以与AopB抗体反应，但不与VirJ或GFP抗体反应。这进一步证实了亚细胞分离的结果即AopB是外膜蛋白。因为已知VirJ主要位于周质级分中(Pan et al.，1995.Mol.Microbiol.17：259-269)，所以除去了位于周质的蛋白可以在全细胞ELISA试验制中抗体反应的可能性。推定的AopB蛋白的亲/疏水图没有显现任何大的疏水区。综上所述，可以断定AopB位于外膜的细胞表面。
               表2.phoA融合体的碱性磷酸酶(AP)活性a
    菌株   融合型  融合位置     AP活性
    A6010b     -    -     0
A6010(pTC115A∷phoA)b VirA-PhoA  胞浆结构域 0
    A6010(pVJ∷phoA17)b VirJ-PhoA     40     75±9
    A6010(pJYH5)     -     -     0
    A6010(pJYH5039) AopB-PhoA     39     854±26
    A6010(pJYH5125) AopB-PhoA     125     763±52
    A6010(pJYH5134) AopB-PhoA     134     668±12
    A6010(pJYH5172) AopB-PhoA     172     1042±48
    A6010(pJYH5207) AopB-PhoA     207     1031±58
a用在实施例1中的诱导培养基培养的根癌土壤杆菌细胞(含有质粒，质粒中包括virJ-pho4融合，virA-pho4融合或aopB-pho4融合)，来测量碱性磷酸酶活性。A6010(pVJ∷PhoA17)和A6010(pTC115A∷PhoA)分别用于正、负对照，因为VirJ-PhoA位于周质而VirA-PhoA位于细胞质。
b在100μM乙酰丁香酮(AS)存在下诱导根癌土壤杆菌细胞A6010，A6010(pTC115A∷phoA)和A6010(pVJ∷phoA17)，因为诱导virJ和virA基因需要有酚类化合物。
实施例4：酸性pH诱导aopB基因
为确定aopB基因可以由酸性pH诱导，比较在不同培养基中的突变体菌株CGI1(包含aopB-gfp融合)的相对的荧光亮度。如表3所示，在IB中培养比在AB中培养aopB-gfp表达增加了7倍。然而，在IB中有AS不影响aopB-gfp表达。另外，还用aopB-phoA融合体检测aopB基因的表达。在IB中培养比在AB中培养aopB-phoA表达增加了4-5倍。同样，AS不影响aopB-pho4表达。这些数据都说明aopB基因可以用酸性pH诱导而不能用AS。
                                表3.aopB基因表达的诱导
                                                      Ir a或AP活性   诱导
菌株               融合型       融合位置      培养基      单位b     倍数c
CGI1               AopB-GFP     183           AB          54±6       N/A
                                              IB          381±16     7.06
                                              IB±AS      384±19     7.11
A6010(pJYH5039)    AopB-PhoA    39            AB          184±8      N/A
                                              IB          925±61     5.03
                                              IB±AS      901±70     4.90
A6010(pJYH5172)    AopB-phoA    172           AB          338±25     N/A
                                              IB          1409±126   4.17
                                              IB±AS      1431±86    4.23
A6010(pVJ∷phoA17) VirJ-PhoA    40            IB+AS       82±6       N/A
                                胞浆结构
A6010(pTC115A∷phoA)   VirA-PhoA       IB+AS      0      N/A
                                   域
a如例1所述，检测土壤杆菌菌株CGI1(包含aopB-gfp融合)在不同培养基中培养的相对荧光强度(Ir)。
b如例1所述，检测根癌土壤杆菌细胞(有virJ-phoA融合，virA-phoA融合或aopB-phoA融合的质粒)在不同培养基中培养的碱性磷酸酶(AP)活性。AP检测过程中，分别以A6010(pVJ∷PhoA17)和A6010(pTC115A∷PhoA)为正、负对照，因为VirJ-PhoA位于周质并且VIrA-PhoA融合体位于胞质。
c用以AB培养基中的基因表达水平为对照计算诱导倍数。
实施例5：通过AopB进行的GFP和PhoA的表面展示
这个例子说明，当将AopB的N端区域融合到GFP或PhoA后，在细菌细胞表面发现AopB-GFP和AopB-PhoA融合蛋白。融合体中的GFP和PhoA都暴露在表面；他们可以与相应的抗体相互作用。GFP和PhoA的初级(primary)抗体能够与细菌表面的融合蛋白直接和特异性地相互作用。GFP或PhoA与初级抗体的复合物是稳定的。一旦它们可以与酶偶联的第二(secondary)抗体形成复合体，就可用比色法来观测。相对大的蛋白质碱性磷酸酶(其二聚体形式的分子量超过80kDa)在表面得到表达。
进行全细胞ELISA用来测试AopB-GFP融合蛋白对小鼠GFP抗体的表面可接近性。测试GFP抗体是否可以结合由包含aopB-gfp融合体的CGI1产生的AopB-GFP蛋白；因为CG19可以在细胞质产生高水平的GFP蛋白，所以选CG19为阴性对照。如图6所示，AopB-GFP确实位于细菌细胞的表面，因为CGI1全细胞的AopB-GFP蛋白可与GFP抗体结合(A)。相反，由CG19产生的细胞质GFP如期的表现出与GFP抗体的不可接近性。
为了了解，AopB是否可以展示碱性磷酸酶(PhoA)蛋白，PhoA不能由其他系统容易地展示。前面构建的pJYH5039，pJYH5125，pJYH5134，pJYH5172和pJYH5207质粒包含aopB-phoA融合体，其中PhoA分别融合在氨基酸位点39，125，134，172和207。将这些质粒导入C58并检测AopB-PhoA融合蛋白对PhoA抗体的表面可接近性。全细胞ELISA(图6，B)，流式细胞分析(图7)和共聚焦显微检测都说明AopB可在细胞表面展示PhoA。PhoA融合到AopB的氨基酸172时表面展示效率最高；当融合发生在39位氨基酸时效率最低(图6，Panel B；图7)。数据说明，AopB可以不需在培养基中增加任何还原剂就可直接展示PhoA蛋白。PhoA的展示可以由全细胞ELISA，流式细胞分析和共聚焦显微镜检测到。
为进一步确定由AopB表面展示的GFP和PhoA，进行蛋白酶可接近性分析，因为在细胞表面展示的过客蛋白可由细胞外加入的蛋白酶降解(EarhartC.F.2000.Use of an Lpp-OmpA fusion vehicle for bacterial surface display.Methods Enzymol.326：506-516)。胰蛋白酶消化法用于估算AopB-GFP的表面位置和含有pJYH5039，pJYH5125，pJYH5134，pJYH5172或pJYH5207的CGI1或C58中的AopB-PhoA融合蛋白的表面位置。进行消化时可用10mMMgCl2防止蛋白酶穿透到壁膜间隙(Tommassen J，Lugtenberg B.1984.Aminoterminus of outer membrane PhoE protein：localization by use of a bla-phoEhybrid gene.J.Bacteriol.157：327-329)。ChvE被认为是周质蛋白，ChvE蛋白可作为阴性标记。
图8所示，当在产生融合蛋白的全细胞中加入胰蛋白酶后，位于AopB氨基酸183的AopB-GFP(AopB183-GFP)和位于AopB的氨基酸125，134，172和207的AopB-PhoA(AopB125-PhoA，AopB134-PhoA，AopB172-PhoA，AopB207-PhoA)，都有显著的减少。相反，外加胰蛋白酶并未降解在所有测试菌株中的ChvE周质蛋白。
与全细胞ELISA、流式细胞分析和共聚焦显微一致，所有结果都显示AopB N端的氨基酸125，134，172，183和207是引导外源蛋白到达细菌细胞表面的允许位点。但，检测到的AopB39-PhoA的极少量被裂解，说明氨基酸39位点可能不能造成PhoA的完全展示。全细胞ELISA试验也表明，氨基酸39位点不是一个展示的有效位点(图6)。可能仅有AopB N端的39氨基酸不足以在细胞表面展示许多PhoA。然而，氨基酸位点172是PhoA展示的最适位置。
细胞表面展示的一个主要问题是展示细胞外膜的完整性，因为如果外膜存在结构上的损伤，许多基于表面的试验将不可信。蛋白酶可接近性试验说明AopB-GFP和AopB-PhoA融合蛋白可由外加的胰蛋白酶的裂解，而对周质ChvE蛋白的消化则不显著(图8)。这说明，对于以AopB为基础的细菌细胞展示系统，外膜的完整性大多没有受到破坏。
实施例6：表面展示载体的构建：
为了促进不同蛋白质的展示，以aopB为载体构建质粒载体(图9)。为此，首先要确定只有编码N端蛋白区域的aopB序列是否可以促进展示。删除AopB的C端区域(氨基酸173-218)和下游序列。保留aopB启动子和编码AopBN端区域的序列(氨基酸1-172)。选择AopB的氨基酸位点172作融合位点，因为这个位点是展示PhoA最有效的位点。用一对引物，P118(5′-CCGGTACCGGATCCTGCAGCTAGCAAGCTTCAACACCGGCACCAACCGTGTAAC-3′)和P119(5′-AAATCGATCTATTGCTGGTTAGGC-3′)，以C58基因组DNA为模板，来扩增0.7kb的片段。所得的PCR产物中包含了aopB启动子(起始密码子的上游223bp)和范围从1到513bp的aopB编码区。用ClaI和KpnI消化该片段，然后与用相同的酶剪切的pSWl72连接。得到的质粒pJYH20带有多克隆位点来协助外源基因的克隆(图9)。
为了测试载体质粒pJYH20是否可以用来展示象GFP和PhoA这样的蛋白，用引物GFPuvFh3(5′-GGG AAGCTTGGAGTAAAGGAGAAGAAC-3′)和GFPuvRp1(5′AA CTGCAGTCATTATTTGTAGAGC-3′)并以pGFPuv(Clontech)为模板，进行PCR来克隆包含gfp编码序列的0.7-kb片段。导入位点HindIII和PstI(划线处)来协助后续的克隆。将起始密码子ATG换成TGG(黑体)来避免从这点开始翻译。用HindIII和PstI消化得到的片段，再将该片段克隆到HindIII-PstI消化的pJYH20中。获得的质粒pJYH21带有aopB-gfp的框内融合体。扩增1.3-kb phoA片段，之后将其克隆到pJYH20生成pJYH23。以JYH5039为模板；PhoAfH3(5′-GGG AAGCTTCTGACTCTTATACACAAGTAGCG-3′)和PhoAreP1(5′-GG CTGCAGTTATTTCAGCCCCAGAGCGGC-3′)为引物，引物分别带有HindIII和PstI位点(划线处)。pJYH23中有一个aopB-phoA框内融合体，在aopB-phoA中的phoA基因没有编码N端信号肽的序列。然后通过三亲交配将质粒pJYH21和pJYH23导入C58。
按先前描述的方法进行全细胞ELISA和胰蛋白酶消化试验，从而确定GFP和PhoA是否分别可以在菌株C58(pJYH21)和C58(pJYH23)的细胞表面得到表达。如图6所示，以pJYH20为质粒载体的GFP和PhoA的展示效率和原先的aopB-gfp和aopB-phoA融合体相似，因为C58(pJYH21)和C58(pJYH23)的展示分别与CGI1和C58(pJYH5172)类似。在胰蛋白酶消化试验中，C58(pJYH21)产生的AopB-GFP和C58(pJYH23)产生的AopB-PhoA都可进行胰蛋白酶消化。这直接证实了，AopB的N端而非C端是过客蛋白融合体易位到细胞表面所必需的。
这还说明，展示载体质粒pJYH20能够用于高效地在细菌表面展示蛋白。位于aopB下游的特定限制性位点HindIII，PstI，BamHI，KpnI和SacI，可以使编码过客蛋白的外源基因的克隆简单化。
实施例7：条件对融合蛋白表达和展示的影响：
为了更深入了解AopB介导的表面展示的特征，通过试验来研究培养基对C58(pJYH23)中的AopB172-PhoA融合体表达水平的影响。如图10所示，C58(pJYH23)在MG/L和IB中培养时，AopB172-PhoA的表达水平无差别，但在AB培养基中表达水平却低很多。用全细胞ELISA和流式细胞分析来检测在MG/L，AB和IB培养的C58(pJYH23)的AopB172-PhoA的展示效率。如图11所示，当在IB中培养时，AopB172-PhoA蛋白可以在细胞表面得到高效展示，但在MG/L和AB培养基中培养时不能，虽然在MG/L中的表达水平与在IB中相同(图10，11和12)。这说明，在细菌表面通过AopB的蛋白展示可由酸性pH诱导。这可以作为一个重要因素来调控对外膜有害的蛋白的展示。
因为大肠埃希氏菌是多种遗传学操作常用的宿主，所以需要确定aopB展示系统是否可以直接用于其他细菌如大肠埃希氏菌和苜蓿中华根瘤菌。将编码AopB172-PhoA的质粒pJYH23导入大肠埃希氏菌和苜蓿中华根瘤菌RCR2011中。如图10所示，大肠埃希氏菌和苜蓿中华根瘤菌中融合蛋白的表达水平与根癌土壤杆菌相似，但全细胞ELISA、流式细胞分析和蛋白酶消化实验表明其不能有效地展示融合蛋白在细胞表面。在IB培养基中培养大肠埃希氏菌和苜蓿中华根瘤菌没有使这些细菌在其细胞表面展示融合蛋白，即使在含有pJYH23的大肠埃希氏菌和苜蓿中华根瘤菌中可以检测到碱性磷酸酶活性(表4)，这说明PhoA被定位到壁膜间隙中。这些都证明，在细胞表面的AopB-PhoA融合体的展示需要根癌土壤杆菌中特有的一些内源因子。这说明，苜蓿中华根瘤菌的RopB(AopB的同系物)可以作为载体用在天然宿主苜蓿中华根瘤菌的表面展示中。
         表4.不同培养条件下的AopB172-PhoA融合蛋白的碱性磷酸酶活性
                                  AP活性单位a
                                                             胰蛋白酶处理后AP活
菌株              培养基     无胰蛋白酶      胰蛋白酶消       性降低的百分比b
                                消化            化后
C58                MG/L         0               NTc                NAa
                   AB           0               NT                  NA
                   IB           0               NT                  NA
C58(pJYH23)        MG/L         952±35         868±11             9±2
                   AB           490±14         442±20             10±2
                   IB           3044±80        815±27             73±2
DH5α                               LB           0               NT                  NA
DH5α(pJYH23)      LB           89±4           82±5               8±2
RCR2011            LB/MC        0               NT                  NA
RCR2011(pJYH23)    LB/MC        460±62         417±58             9±1
a按材料和方法中描述的方法检测生长在不同培养基中带有pJYH23(含编码AopB172-PhoA的aopB-pho4融合体)的细菌细胞碱性磷酸酶(AP)活性。C58，DH5α和RCR2011分别作为C58(pJYH23)，DH5α(pJYH23)和RCR2011(pJYH23)的阴性对照。
bAP活性的降低由胰蛋白酶处理所降低的活性的百分比表示。
cNT，未检测。
dNA，无必要。
实施例8：表面展示的PhoA具有酶促活性。
为确定展示在细菌细胞表面的PhoA蛋白是否具有酶促活性，检测不同培养基培养的包含aopB-phoA融合的C58(pJYH23)中的碱性磷酸酶(AP)活性。以前已经阐明，只有当PhoA通过细胞质膜进入壁膜间隙或达到外膜上时，PhoA才具有酶促活性。如表4所示，在IB中培养的细菌细胞的AP活性比MG/L中的高约3.5倍，而在IB中培养细菌的AopB-PhoA融合蛋白的表达水平比MG/L略低(图10)。然而，只有在IB中而不是在MG/L中培养的细菌细胞才表现出PhoA在细胞表面的展示(图11和12)。虽然在MG/L中培养的细菌细胞产生的AopB-PhoA不能展示在细胞表面，但融合蛋白有高AP活性，说明AopB-PhoA转移穿过细胞质膜。在IB中培养的细菌细胞中的AopB-PhoA有较高的AP活性可能是因为AP的底物更容易接触到PhoA并因此有较快的酶促反应，这是因为这些细胞的AopB-PhoA融合蛋白在细胞表面展示并且AP的底物不用穿透外膜即可到达PhoA蛋白。这说明，在细胞表面展示的PhoA蛋白是具有酶促活性的。
为了确定展示显现在表面的AopB-PhoA融合蛋白是酶促活性的，用试验来检测胰蛋白酶处理对表达AopB-PhoA的整个细菌细胞的AP活性的影响。如表4所述，胰蛋白酶消化可以减少IB培养的C58(pJYH23)中的AP活性大概73％，而在MG/L或AB中培养时，用胰蛋白酶处理细胞后AP活性大约只降低10％。在前面的试验中已经说明，在IB中培养的细菌可以展示PhoA，而在MG/L或AB中则不能(图11和12)。因为只有暴露在细胞表面的蛋白质才能接触到外加的胰蛋白酶，由胰蛋白酶造成的AP活性的显著降低说明展示在细菌细胞表面的PhoA确实有酶促活性。观测表明，当没有PhoA展示在细胞表面时，胰蛋白酶消化在不同细菌细胞中只能降低大约10％的AP活性，所述细菌细胞包括根癌土壤杆菌，大肠埃氏菌和苜蓿中华根瘤菌。在这些细菌细胞中的AP活性的轻微减少可能是由于胰蛋白酶会降解外膜膜孔上的一些蛋白并进入周质降解周质的PhoA，而这些PhoA是由无展示的细菌细胞产生的。然而，所有数据都说明展示的PhoA是酶促活性的。
因为PhoA是含有二硫键的同二聚体起作用，所以以AopB为基础的土壤杆菌属展示系统代表了第一个可以用于直接展示活性状态的二聚体蛋白，象PhoA(有二硫键)的系统。
在本申请中选用的参考书在此包括了与它们有关的补充，解释，背景提供或教授方式，技术和/或在此选用的文章的范围。
                                序  列  表<110>新加坡国立大学(National University of Singapore)<120>aopB基因，蛋白，同系物，片段和它们的变体，以及它们在细胞表面展示方面的应用<130>79612-3<150>US 60/244,902<151>2000-02-11<160>13<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>1435<212>DNA<213>根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)<220><221>CDS<222>(316)..(969)<220><221>misc_feature<222>(316)..(384)<223>编码推测的信号肽<400>1ctagctgtca ctcagctcca aaagaattgg gcgatttttc attcacaatg caatttcggt      60ttaatttgaa tataactaag tttaaaggcg atctattgct ggttaggctt ctgttagggt      120taatataacc cttgtggcaa ttaggcaacg tctaattcta gtcacgtctc tgccccaaac      180aattcacatt ttggctcttt gatctccgca ttctcccatc aagttcagtt tccagagggg      240caaattaacc cgacgatttt taccgcgtct gaaaacaatg ttttgagtgc agagcggtcc      300tgaaaggaga ataac atg cgt att ttc gta gca acc ctt atg gct tcg acc       351
             Met Arg Ile Phe Val Ala Thr Leu Met Ala Ser Thr
             1               5                   10atg gca gcc gcc ggt ttt tcg gct gct tac gcc gcc gac gcc gta aat        399Met Ala Ala Ala Gly Phe Ser Ala Ala Tyr Ala Ala Asp Ala Val Asn
    15                  20                  25gag gtg ccg cag gca ccg gta gcc tac gac cag ccc gcc gcg gtc aag        447Glu Val Pro Gln Ala Pro Val Ala Tyr Asp Gln Pro Ala Ala Val Lys
30                  35                  40gat tgg tcc ggc gcc tac ctc ggt ggt acg gtc aac tat gactgg ggc         495Asp Trp Ser Gly Ala Tyr Leu Gly Gly Thr Val Asn Tyr Asp Trp Gly45                  50                  55                  60cgt ttc agc tcc agc aat gac ggt cgt gac gcc aag ggc ttc ggt ggc        543Arg Phe Ser Ser Ser Asn Asp Gly Arg Asp Ala Lys Gly Phe Gly Gly
            65                  70                  75ggc gtc tat ggt ggt tac aac atg cag agc ggc cag atc gtt tac ggt       591Gly Val Tyr Gly Gly Tyr Asn Met Gln Ser Gly Gln Ile Val Tyr Gly
        80                  85                  90gct gaa gca gac gtg aac atg ggc gac gag aag ggc tcc gcc ggt acg       639Ala Glu Ala Asp Val Asn Met Gly Asp Glu Lys Gly Ser Ala Gly Thr
    95                  100                 105gtt gcc ggt cgc gcc gtc gaa ggc aag cag ggc gtc aac ggc tcg ctg       687Val Ala Gly Arg Ala Val Glu Gly Lys Gln Gly Val Asn Gly Ser Leu
110                 115                 120cgt ggc cgc gtc ggt tac gac atg aac ccg ttc ctg ctt tat ggt acg       735Arg Gly Arg Val Gly Tyr Asp Met Asn Pro Phe Leu Leu Tyr Gly Thr125                 130                 135                 140gcc ggt ctt gct gtc tcc gac aac aag gtt cgt gac ggc gtc aac aag       783Ala Gly Leu Ala Val Ser Asp Asn Lys Val Arg Asp Gly Val Asn Lys
            145                 150                 155gac agc gcc acg gct ctc ggt tac acg gtt ggt gcc ggt gtt gaa gcc       831Asp Ser Ala Thr Ala Leu Gly Tyr Thr Val Gly Ala Gly Val Glu Ala
        160                 165                 170atg gtg acc gac aac atc acc gct cgt ctg gaa tat cgc tac agc gat       879Met Val Thr Asp Asn Ile Thr Ala Arg Leu Glu Tyr Arg Tyr Ser Asp
    175                 180                 185tac cag aag aag gac tac acg ctc ggc aac gat gcc ttc tcg cgt ggt       927Tyr Gln Lys Lys Asp Tyr Thr Leu Gly Asn Asp Ala Phe Ser Arg Gly
190                 195                 200ttt gac gac cac tcg gtc aag gcc ggt atc ggc gtc aag ttc               969Phe Asp Asp His Ser Val Lys Ala Gly Ile Gly Val Lys Phe205                 210                 215tgatccttct cggatcggtc aaggaaaagc cggggtttac gccccggctt ttttttgttt     1029ctgtgatttg ccatcgcctt aacgcccggt ggaaagaacc gggcgttttg ttcggcgggt     1089ctaggcggcg gctttcattt ccgcataggc gtcgaaacgc ttgccgaagg tttctggcca     1149ggctgccagc gcatcacgtc cctcggccca ctcaccggca aaacgcaggt cgagatagcc     1209gatcatcgct gcaagggcga aatggccgcc atgcagcttc ttgccggttt tcggcaggtt     1269ggcgttgagg tgatcgagcc cgcggaccac cttgctccac tgcttgtcga tccacggctg     1329atgaatcttg tcttccgggc ggaaacgccg ctcgtagacg atggcgagca ggcaatccat     1389gatgccgtcg cacagagctt ccagaatttc cgcttcagtg cgctag                    1435<210>2<211>218<212>PRT<213>根癌土壤杆菌<220><221>misc_feature<222>(1)..(23)<223>推测的信号序列<400>2Met Arg Ile Phe Val Ala Thr Leu Met Ala Ser Thr Met Ala Ala Ala1               5                   10                  15Gly Phe Ser Ala Ala Tyr Ala Ala Asp Ala Val Asn Glu Val Pro Gln
        20                  25                  30Ala Pro Val Ala Tyr Asp Gln Pro Ala Ala Val Lys Asp Trp Ser Gly
    35                  40                  45Ala Tyr Leu Gly Gly Thr Val Asn Tyr Asp Trp Gly Arg Phe Ser Ser
50                  55                  60Ser Asn Asp Gly Arg Asp Ala Lys Gly Phe Gly Gly Gly Val Tyr Gly65                  70                  75                  80Gly Tyr Asn Met Gln Ser Gly Gln Ile Val Tyr Gly Ala Glu Ala Asp
            85                  90                  95Val Asn Met Gly Asp Glu Lys Gly Ser Ala Gly Thr Val Ala Gly Arg
        100                 105                 110Ala Val Glu Gly Lys Gln Gly Val Asn Gly Ser Leu Arg Gly Arg Val
    115                 120                 125Gly Tyr Asp Met Asn Pro Phe Leu Leu Tyr Gly Thr Ala Gly Leu Ala
130                 135                 140Val Ser Asp Asn Lys Val Arg Asp Gly Val Asn Lys Asp Ser Ala Thr145                 150                 155                 160Ala Leu Gly Tyr Thr Val Gly Ala Gly Val Glu Ala Met Val Thr Asp
            165                 170                 175Asn Ile Thr Ala Arg Leu Glu Tyr Arg Tyr Ser Asp Tyr Gln Lys Lys
        180                 185                 190Asp Tyr Thr Leu Gly Asn Asp Ala Phe Ser Arg Gly Phe Asp Asp His
    195                 200                 205Ser Val Lys Ala Gly Ile Gly Val Lys Phe
210                 215<210>3<211>585<212>DNA<213>根癌土壤杆菌<220><221>CDS<222>(1)..(585)<220><221>misc_feature<223>没有信号序列的AopB<400>3gcc gac gcc gta aat gag gtg ccg cag gca ccg gta gcc tac gac cag      48Ala Asp Ala Val Asn Glu Val Pro Gln Ala Pro Val Ala Tyr Asp Gln1               5                   10                  15ccc gcc gcg gtc aag gat tgg tcc ggc gcc tac ctc ggt ggt acg gtc      96Pro Ala Ala Val Lys Asp Trp Ser Gly Ala Tyr Leu Gly Gly Thr Val
        20                  25                  30aac tat gac tgg ggc cgt ttc agc tcc agc aat gac ggt cgt gac gcc      144Asn Tyr Asp Trp Gly Arg Phe Ser Ser Ser Asn Asp Gly Arg Asp Ala
    35                  40                  45aag ggc ttc ggt ggc ggc gtc tat ggt ggt tac aac atg cag agc ggc      192Lys Gly Phe Gly Gly Gly Val Tyr Gly Gly Tyr Asn Met Gln Ser Gly
50                  55                  60cag atc gtt tac ggt gct gaa gca gac gtg aac atg ggc gac gag aag      240Gln Ile Val Tyr Gly Ala Glu Ala Asp Val Asn Met Gly Asp Glu Lys65                  70                  75                  80ggc tcc gcc ggt acg gtt gcc ggt cgc gcc gtc gaa ggc aag cag ggc      288Gly Ser Ala Gly Thr Val Ala Gly Arg Ala Val Glu Gly Lys Gln Gly
            85                  90                  95gtc aac ggc tcg ctg cgt ggc cgc gtc ggt tac gac atg aac ccg ttc      336Val Asn Gly Ser Leu Arg Gly Arg Val Gly Tyr Asp Met Asn Pro Phe
        100                 105                 110ctg ctt tat ggt acg gcc ggt ctt gct gtc tcc gac aac aag gtt cgt      384Leu Leu Tyr Gly Thr Ala Gly Leu Ala Val Ser Asp Asn Lys Val Arg
    115                 120                 125gac ggc gtc aac aag gac agc gcc acg gct ctc ggt tac acg gtt ggt      432Asp Gly Val Asn Lys Asp Ser Ala Thr Ala Leu Gly Tyr Thr Val Gly
130                 135                 140gcc ggt gtt gaa gcc atg gtg acc gac aac atc acc gct cgt ctg gaa      480Ala Gly Val Glu Ala Met Val Thr Asp Asn Ile Thr Ala Arg Leu Glu145                 150                 155                 160tat cgc tac agc gat tac cag aag aag gac tac acg ctc ggc aac gat      528Tyr Arg Tyr Ser Asp Tyr Gln Lys Lys Asp Tyr Thr Leu Gly Asn Asp
            165                 170                 175gcc ttc tcg cgt ggt ttt gac gac cac tcg gtc aag gcc ggt atc ggc      576Ala Phe Ser Arg Gly Phe Asp Asp His Ser Val Lys Ala Gly Ile Gly
        180                 185                 190gtc aag ttc                                                          585Val Lys Phe
     195<210>4<211>195<212>PRT<213>根癌土壤杆菌<220><221>misc_feature<223>没有信号序列的AopB<400>4Ala Asp Ala Val Asn Glu Val Pro Gln Ala Pro Val Ala Tyr Asp Glnl               5                   10                  15Pro Ala Ala Val Lys Asp Trp Ser Gly Ala Tyr Leu Gly Gly Thr Val
        20                  25                  30Asn Tyr Asp Trp Gly Arg Phe Ser Ser Ser Asn Asp Gly Arg Asp Ala
    35                  40                  45Lys Gly Phe Gly Gly Gly Val Tyr Gly Gly Tyr Asn Met Gln Ser Gly
50                  55                  60Gln Ile Val Tyr Gly Ala Glu Ala Asp Val Asn Met Gly Asp Glu Lys65                  70                  75                  80Gly Ser Ala Gly Thr Val Ala Gly Arg Ala Val Glu Gly Lys Gln Gly
            85                  90                  95Val Asn Gly Ser Leu Arg Gly Arg Val Gly Tyr Asp Met Asn Pro Phe
        100                 105                 110Leu Leu Tyr Gly Thr Ala Gly Leu Ala Val Ser Asp Asn Lys Val Arg
    115                 120                 125Asp Gly Val Asn Lys Asp Ser Ala Thr Ala Leu Gly Tyr Thr Val Gly
130                 135                 140Ala Gly Val Glu Ala Met Val Thr Asp Asn Ile Thr Ala Arg Leu Glu145                 150                 155                 160Tyr Arg Tyr Ser Asp Tyr Gln Lys Lys Asp Tyr Thr Leu Gly Asn Asp
            165                 170                 175Ala Phe Ser Arg Gly Phe Asp Asp His Ser Val Lys Ala Gly Ile Gly
        180                 185                 190Val Lys Phe
    195<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物 p54<400>5gcaaatcgct agctgtcact cagc                                           24<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物p55<400>6agaacggcta gcgcactgaa gcgg                                           24<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物p119<400>7aaatcgatct attgctggtt aggc                                           24<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物112<400>8cgactgcaga aggatcagaa cttg                                           24<210>9<211>54<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物p118<400>9ccggtaccgg atcctgcagc tagcaagctt caacaccggc accaaccgtg taac          54<210>10<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物 GFPuvFh3<400>10gggaagcttg gagtaaagga gaagaac                                           27<210>11<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物GFPuvRpl<400>11aactgcagtc attatttgta gagc                                              24<210>12<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物PhoAfH3<400>12gggaagcttc tgactcttat acacaagtag cg                                     32<210>13<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物PhoArePl<400>13ggctgcagtt atttcagccc cagagcggc                                         29

Claims (64)

1.一种核酸分子，其包含编码以下任何一种多肽的核酸序列：
(a)SEQ ID No：2；
(b)包含SEQ ID No：2N端起的至少39个连续氨基酸的片段；及
(c)(a)或(b)的变体，它：
(i)有至少65％的氨基酸序列与(a)或(b)的相应的多肽相同；并
(ii)该变体制备自革兰氏阴性菌时，是外膜蛋白。
2.权利要求1中的核酸分子，其中，包含SEQ ID No：2N端的至少39个连续氨基酸的片段包含SEQ ID No：2N端的至少125个氨基酸。
3.权利要求1中的核酸分子，其中，包含SEQ ID No：2N端的至少39个连续氨基酸的片段包含SEQ ID No：2N端的至少134个氨基酸。
4.权利要求1中的核酸分子，其中，包含SEQ ID No：2N端的至少39个连续氨基酸的片段包含SEQ ID No：2N端的至少172个氨基酸。
5.权利要求1中的核酸分子，其中，包含SEQ ID No：2N端的至少39个连续氨基酸的片段包含SEQ ID No：2N端的至少183个氨基酸。
6.权利要求1中的核酸分子，其中，包含SEQ ID No：2N端的至少39个连续氨基酸的片段包含SEQ ID No：2N端的至少207个氨基酸。
7.一种核酸分子，其包含编码以下任何一种多肽的核酸序列：
(a)SEQ ID No：4；
(b)包含SEQ ID No：4N端起的至少16个连续氨基酸的片段；和
(c)(a)或b)的变体，其：
(i)至少有65％的氨基酸序列与(a)或(b)的相应的多肽相同；并且，
(ii)该变体：(1)与细菌的分泌信号框内连结，而且(2)产生于革兰氏阴性菌时，是外膜蛋白。
8.权利要求7中的核酸分子，其中，包含SEQ ID No：4N端的至少16个连续氨基酸的片段包含SEQ ID No：4N端的至少102个氨基酸。
9.权利要求7中的核酸分子，其中，包含SEQ ID No：4N端的至少16个连续氨基酸的片段包含SEQ ID No：4N端的至少111个氨基酸。
10.权利要求7中的核酸分子，其中，包含SEQ ID No：4N端的至少16个连续氨基酸的片段包含SEQ ID No：4N端的至少149个氨基酸。
11.权利要求7中的核酸分子，其中，包含SEQ ID No：4N端的至少16个连续氨基酸的片段包含SEQ ID No：4N端的至少160个氨基酸。
12.权利要求7中的核酸分子，其中，包含SEQ ID No：4N端的至少16个连续氨基酸的片段包含SEQ ID No：4N端的至少184个氨基酸。
13.一种核酸分子，其包含编码融合蛋白的核酸序列，该融合蛋白包含权利要求1至12中任一项的核酸分子所编码的第一个多肽以及第二个多肽。
14.权利要求13中的核酸分子，其中所述的第二个多肽融合到第一个多肽的C端。
15.一种包含SEQ ID No：1的6到309核苷酸的土壤杆菌属的启动子。
16.一种分离的5到100个核苷酸的核酸探针，它在严谨条件下可与SEQID No：1或3的核酸分子或上述核酸分子的互补序列杂交。
17.一种分离的10到40个核苷酸的核酸引物，其在严谨条件下可与SEQID No：1或3的核酸分子或上述核酸分子的互补序列杂交。
18.一种表达载体，它包含权利要求1到14任一项中的核酸分子，该分子与一个或多个表达调控序列联结而起作用。
19.权利要求18中的载体，其中所述的表达调控序列含有aopB启动子。
20.权利要求18中的载体，其是大肠埃希氏菌中的表达载体，其中的表达调控序列适合于在大肠埃希氏菌中表达核酸序列。
21.权利要求18或19中的载体，其是土壤杆菌属中的表达载体，其表达调控序列适合于在土壤杆菌属中表达核酸序列。
22.权利要求21中的载体，其中所述的土壤杆菌属细菌是根癌土壤杆菌。
23.用权利要求1到14中任一项的核酸分子转化的重组微生物。
24.含有权利要求18到22中任一项的载体的重组微生物。
25.含有权利要求19或21中的载体的重组土壤杆菌。
26.权利要求25中的土壤杆菌，该属细菌在其表面展示由权利要求1到14中的任一种核酸序列所编码的多肽或融合蛋白。
27.包含以下任何一个氨基酸序列的多肽：
(a)SEQ ID No：2；
(b)包含SEQ ID No：2N端的至少39个连续氨基酸的片段，和
(c)(a)或(b)的变体，它：
(i)与(a)或(b)中相应多肽的氨基酸序列至少有65％相同；而且
(ii)如果这个变体是来自于革兰氏阴性菌，那么它是一个外膜蛋白。
28.权利要求27中的多肽，其中，包含SEQ ID No：2N端的至少39个连续氨基酸的片段包含SEQ ID No：2N端的至少125个氨基酸。
29.权利要求27中的多肽，其中，包含SEQ ID No：2N端的至少39个连续氨基酸的片段包含SEQ ID No：2N端的至少134个氨基酸。
30.权利要求27中的多肽，其中，包含SEQ ID No：2N端的至少39个连续氨基酸的片段包含SEQ ID No：2N端的至少172个氨基酸。
31.权利要求27中的多肽，其中，包含SEQ ID No：2N端的至少39个连续氨基酸的片段包含SEQ ID No：2N端的至少183个氨基酸。
32.权利要求27中的多肽，其中，包含SEQ ID No：2N端的至少39个连续氨基酸的片段包含SEQ ID No：2N端的至少207个氨基酸。
33.包含以下任何一个氨基酸序列的多肽：
(a)SEQ ID No：4；
(b)包含SEQ ID No：4N端的至少16个连续氨基酸的片段，和
(c)(a)或(b)的变体，它：
(i)与(a)或(b)中相应多肽的氨基酸序列至少有65％相同；和，
(ii)它在以下条件下是外膜蛋白：(1)与细菌的分泌信号框内连接，并且(2)产生于革兰氏阴性菌。
34.权利要求33中的多肽，其中，包含SEQ ID No：4N端的至少16个连续氨基酸的片段包含SEQ ID No：4N端的至少102个氨基酸。
35.权利要求33中的多肽，其中，包含SEQ ID No：4N端的至少16个连续氨基酸的片段包含SEQ ID No：4N端的至少111个氨基酸。
36.权利要求33中的多肽，其中，包含SEQ ID No：4N端的至少16个连续氨基酸的片段包含SEQ ID No：4N端的至少149个氨基酸。
37.权利要求33中的多肽，其中，包含SEQ ID No：4N端的至少16个连续氨基酸的片段包含SEQ ID No：4N端的至少160个氨基酸。
38.权利要求33中的多肽，其中，包含SEQ ID No：4N端的至少16个连续氨基酸的片段包含SEQ ID No：4N端的至少184个氨基酸。
39.一种融合蛋白，其包含权利要求27到38中任一项的第一个多肽和第二个多肽。
40.权利要求39中的融合蛋白，其中所述的第二个多肽融合于第一多肽的C端。
41.生产权利要求27中多肽的方法，该方法包括培养用表达载体转化的微生物的步骤，所述表达载体含有权利要求1中的核酸分子，该分子与一个或多个表达调控序列连结而起作用。
42.生产权利要求39中的融合蛋白的方法，该方法包括培养用含有编码融合蛋白的核酸分子的表达载体转化的微生物的步骤，其中的表达载体与一个或多个表达调控序列连结而起作用。
43.可与权利要求27到38中的任一种多肽或权利要求30或40中的融合蛋白的第一个多肽进行特异性反应的抗体。
44.权利要求43中的抗体，其是单克隆抗体。
45.产生可在其表面展示过客蛋白的微生物的方法，其步骤包括：
(1)将表达载体导入到受体微生物中；并且
(2)培养从步骤(1)中得到的微生物，以表达所述蛋白；
其中，所述表达载体包括：
(a)编码载体蛋白的核酸，该载体蛋白选自于：权利要求27至38中的任一种多肽或AopB相关外膜蛋白家族的成员；其中，所述载体蛋白需要适合于用微生物进行展示，并且带有在该微生物中有功能的细菌分泌信号；
(b)编码过客蛋白的核酸，该核酸要与编码载体蛋白的核酸在3′端进行框内连接；和
(c)表达控制序列与编码载体蛋白的核酸可操作地连接，该表达调控序列要适合在该微生物中表达所述编码载体蛋白的核酸。
46.权利要求45中的方法，其中所述的表达调控序列包含aopB启动子。
47.权利要求45中的方法，其中所用的微生物在酸性pH条件下培养。
48.根据权利要求45中所述的方法，其中所述的载体蛋白和微生物选自：
(a)载体蛋白是权利要求27到38中的任何一个多肽，并且可用于展示的微生物是土壤杆菌属。
(b)载体蛋白包含RopB多肽N端的150-220个连续的氨基酸，并且其用于展示的微生物是根瘤菌属。
(c)载体蛋白包含布鲁氏菌属外膜蛋白序列N端的150-220个连续的氨基酸，其用于展示的微生物是布鲁氏菌属。
(d)载体蛋白包含Pap31多肽序列N端的150-220个连续的氨基酸，并且用于其展示的微生物是巴尔通氏体。
(e)载体蛋白包含PomA多肽序列N端的150-220个连续的氨基酸，并且用于其展示的微生物是巴斯德氏菌属(Mannheimia)。
(f)载体蛋白包含PPE多肽序列N端的150-220个连续的氨基酸，并且用于其展示的微生物是分枝杆菌属。
(g)载体蛋白包含主要外膜蛋白序列N端的150-220个连续的氨基酸，其用于展示的微生物是嗜血菌属。
(h)载体蛋白包含外膜孔蛋白序列N端的150-220个连续的氨基酸，其用于展示的微生物是弧菌属。
49.权利要求45到48中任一项所述的方法，其所用的分泌信号包含SEQ ID No：2中的1到23位氨基酸。
50.权利要求45中所述的方法，其所用的载体蛋白是权利要求27到38中的任意一种多肽，而且微生物是土壤杆菌属细菌。
51.权利要求50中所述的方法，其所用的土壤杆菌属细菌是根癌土壤杆菌。
52.权利要求45到51中任一项所述的方法，其进一步包括以下步骤：
(3)分析步骤(2)所培养而得的微生物，以确定过客蛋白存在于所述微生物表面，并选择那些在表面带有过客蛋白的生物。
53.权利要求52中所述的方法，其中所采用的分析步骤包含荧光激活细胞分选术(FACS)。
54.在土壤杆菌属细胞表面表达融合蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将载体导入土壤杆菌属的一种细菌中，并且
(2)培养由第一步而得的细菌，以表达融合蛋白；
其所用载体包括：
(a)编码权利要求39或40的融合蛋白的核酸序列，其中的融合蛋白含有细菌的分泌信号；并且
(b)表达调控序列与编码该融合蛋白的核酸序列可操作地连接，该表达调控序列要适合在土壤杆菌属细菌中表达编码该融合蛋白的核酸。
55.选择编码所求特性多肽的核酸的方法，这个方法包含权利要求45中的方法，其中的过客蛋白是具有推定所求特性的众多的多肽，并且这个方法进一步包含以下步骤：
(3)检验由步骤(2)所得到的微生物以确定过客蛋白是否具有欲求特性；并且
(4)选择和分离由步骤(3)所得到的带有欲求特性的过客蛋白的微生物；并且
(5)从由步骤(4)而得的生物中分离表达载体；
其中步骤(5)所得到的表达载体中编码过客蛋白的核酸编码欲求特性的多肽。
56.权利要求55中所述的方法，所指的过客蛋白来自于抗体表达文库。
57.从液体中去除污染物的方法，这个方法包含权利要求45中的方法，其中过客蛋白能结合污染物，并且这个方法进一步包含以下步骤：
(3)将含有污染物的液体与由步骤(2)得到的微生物接触，所用的时间和条件应有利于过客蛋白与污染物的结合；和
(4)从所述液体中去除微生物。
58.权利要求57中所述的方法，其中所指的污染物是重金属，而过客蛋白是金属硫蛋白。
59.在哺乳动物中激发免疫反应的方法，这个方法包含权利要求45中所述的方法，其中的过客蛋白能激发哺乳动物的免疫反应，并且这个方法进一步包含以下步骤：
(3)在利于有效激发哺乳动物对过客蛋白产生免疫反应的时间和条件下，给药步骤(2)所得到的微生物。
60.权利要求59中方法，其中来自于步骤(2)中的微生物是根癌土壤杆菌，并且被作为活疫苗给药。
61.固相酶促催化反应的方法，这个方法包含权利要求45中的方法，其中过客蛋白能催化反应，并且这个方法进一步包含以下步骤：
(3)在利于有效酶促催化反应的时间和条件下，将催化反应的底物与由步骤(2)得到的微生物接触。
62.权利要求61中的方法，其中所指的过客蛋白是碱性磷酸酶。
63.纯化一个化合物的方法，这个方法包含权利要求45中所述的方法，其中的过客蛋白可以与该化合物特异性地结合，并且这个方法进一步包含以下步骤：
(3)在利于过客蛋白与该化合物特异性结合的时间和条件下，将由步骤(2)所得到的微生物与含有该化合物的组合物接触；
(4)在利于有效去除非特异性结合的污染物的时间和条件下洗涤由步骤(3)而得的微生物；并
(5)在利于打断过客蛋白与化合物的特异性结合的时间和条件下，从由步骤(4)而得的微生物中洗脱化合物。
64.权利要求63中所述的方法，其中所指的化合物是抗体，而且过客蛋白是其特异性的抗原。
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