CN1020472C - 哺乳动物白细胞介素-4 - Google Patents

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Abstract

提供了称为白细胞介素4(IL-4s)的哺乳动物蛋白及其变种蛋白，它们表现出B细胞生长因子和T细胞生长因子的活性。本发明的化合物包括天然人的和鼠的IL-4s及其变种蛋白，也包括能与所公开的cDNA有显著同源性和/或能为哺乳动物IL-4s及其变种蛋白编码的核酸。

Description

一般地说本发明是同哺乳动物免疫系统的蛋白质和突变型蛋白因子有关，以及同它们编码的核酸有关。更具体地说，本发明是同具有T细胞生长因子活性和B细胞生长因子活性的蛋白质和突变型蛋白因子（以及它们的编码核酸）有关。
重组DNA技术一般指把给体的遗传信息整合到运载体中作进一步加工，如通过导入到某寄主细胞内，因而被转入的遗传信息在新的环境里得到拷贝扩增和（或者）表达。这种遗传信息通常以互补DNA（cDNA）的形式存在，它来自为某种所需蛋白质产物编码的信使RNA（mRNA）。运载体经常是一种质粒它有使cDNA参入到寄主中作进一步复制的能力，有时实际上能控制cDNA的表达，因而能指导被编码的产物在寄主体内的合成。
已有一段时间来人们知道哺乳动物免疫反应是依靠一系列复杂的细胞相互作用，所谓“免疫网络”。近来的研究已经为这种网络内部活动提供了新的认识。毫无疑问，许多免疫反应实际上确是围绕着淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞以及其它细胞间网状相互作用作运行的，而免疫学家现在一般认为可溶性蛋白（如所谓“淋巴细胞活素”或“monokines”）在控制细胞的这些相互作用中起着关键性作用。因此，对细胞调节因子的分离、鉴定和作用机制有相当大的兴趣，机制的了解将会在许多病情的诊断和治疗方面产生重要的突破。
淋巴细胞活素看来以各种方式调节细胞的活动。已证明它们支持多能造血干细胞的增殖、生长和分化成大量祖代细胞，它们构成了与 免疫反应有关的形形色色的细胞链。当淋巴激活素与其它物质联合作用时，这些细胞链常常以不同方式作出反应。
对免疫反应特别重要的细胞链包括两类淋巴细胞，即B-细胞：能产生和分泌免疫球蛋白（有识别和结合外来物质并引起其清除的能力），和各种亚系T细胞：分泌淋巴细胞活素，诱导或抑制构成免疫网络的B-细胞和其它细胞（包括其它T细胞）。
另一重要的细胞链是肥大细胞（在所有哺乳动物中它还没有确切地鉴定出来）。这是一种位于靠近全身毛细血管的含有颗粒的结缔组织细胞，在肺、表皮、肠胃道和泌尿生殖器官有特别高的密集。如以下所表明，肥大细胞在变态有关疾病，特别在过敏症中起了关键作用：当被选择的抗原与结合在肥大细胞表面受体上的一类免疫球蛋白交联起来时，肥大细胞就脱去颗粒，释放出引起变态反应如过敏症的介质（如组胺、羟色胺、肝素、前列腺素等）。
更好地了解（因而有可能治疗）各种免疫机能失调的研究，由于一般不能在离体保持细胞的免疫系统而受到妨碍。免疫学家已经发现，用T细胞和其它细胞的上清液培养这些细胞是能够实现的，细胞上清液中含有各种生长因子，如淋巴细胞活素。
如淋巴细胞活素或免疫反应的其它可溶性介质等这些因子的检出、分离和纯化是极为困难的，而且常常被复杂化如由于它们独特地所处的上清液的那种性质，混合物中各种组分活性的不一致和有所交叉，确定因子特性的测定方法的灵敏度（或缺少灵敏度），因分子量范围和其它特征常常类似的因子，以及这些因子在它们自然情况下浓度非常低等等原因，都能将问题复杂化。
主要通过分子克隆可以获得更多的淋巴细胞活素，兴趣多集中在 寻找它们临床的应用。因为淋巴细胞活素与激素在生理上相似（如可溶性因子、生长介质，通过细胞受体的作用），它的应用潜在性已类似于当前激素的应用情况，（Dextex，Nature，321：198（1986））。人们希望病人体内淋巴细胞活素的水平能直接或间接地加以操作处理造成有利的免疫反应，例如，抑制炎症、变态症或者组织排斥作用，促进和增强抗感染或抗恶性生长等。淋巴细胞活素的其他潜在的临床应用包括在体外维持和扩增某人的某些免疫系统细胞的群体，然后再重新引入到同一个或另一个人的体内，以获有益效果。例如，目前正在确定某病人被淋巴细胞活素活化的杀伤T细胞是不是能够在他（她）的体外扩增，然后再注入，提高了抗肿瘤反应。淋巴细胞活素的另一可能的临床应用，特别是细胞团生成刺激因子，如果粒性白细胞-巨噬细胞的细胞团生成刺激因子（GM-CSF）以及强化其活性的因子可促进血细胞生长，例如用于肿瘤化疗前期和后期或放射治疗，骨髓发育不全的治疗，或者嗜中性细胞缺陷综合症的治疗等（Dexter，Nature，321：198（1986））。在骨髓移殖治疗中这种因子也会有用的，骨髓移殖正越来越多地用于治疗再生障碍性贫血和某些白血病。
淋巴细胞活素的两种性能对这种临床应用有重要的影响;单个淋巴细胞活素常常是多功能的，并且一种淋巴细胞活素的生物学效应通常通过抑制作用或增强作用被至少一种其它的淋巴细胞活素所调节。例如，肿瘤坏死因子与γ-干扰素协同，促进了白细胞介素-1（IL-1）的产生，并激活嗜中性白细胞的吞噬活性。IL-1是激活的巨噬细胞产生的蛋白质，调节范围广泛的生物学活性，如通过诱导白细胞介素-2（IL-2）的释放，促进胸腺细胞的增殖，促进B-淋巴细胞 的成熟、增殖，促进成纤维细胞生长因子的活性和诱导由肝细胞合成的急性期蛋白。也已报导IL-1促进从滑膜细胞释放前列腺素和胶原酶，并且同内源性热原是一样的（Krampschmidt，J·Leuk·Biol，36∶341-355（1984））。
白细胞介素-2，原先叫做T细胞生长因子，是由植物凝集素或抗原活化的T细胞所产生的一种淋巴细胞活素。所报导的IL-2生物学活性包括刺激被活化的T细胞团，使能长期地离体生长，增强胸腺细胞有丝分裂的发生，以及诱导对细胞有毒性的T细胞反应性和在乳鼠脾细胞的培养物中有空斑形成反应。此外，同干扰素（IFNs）一样，已经表明IL-2增大了天然的杀伤细胞的活性，从而认为这在治疗肿瘤病中有潜在用处（Henney    et    al·Nature，291：335-338（1981））。已报导这种治疗取得某些成功，如参见Lotze和Rosenberg的“用纯化的人白细胞介素-2治疗肿瘤病人”一文（在Sorg等“Cellular    and    Molecular    Biology    of    Lymphokines”，p711-719，Academic    Press.NY.1985;Rosenberg    and    Lotze：“Cancer    Immunotherapy    Using    Interleukine-2    and    Interleukine-2-activated    lymphocytes”，Ann.Rev.Immunol.Vol.4：681-709，1986）。然而IL-2的毒性限制了能够给予癌症病人的剂量，因而不能发挥它的效用，见Lotze    and    Rosenberg，711-719;和Welte等，755-759，（见前引用）。
Metcalf    D.“血细胞生成细胞团的促进因子”（Elsevier，阿姆斯特丹，1984）一书给淋巴细胞活素和哺乳动物免疫反应中有关的各种生 长因子的研究提供了一个全貌，Yung等人，（J·Immunol·127，794（1981））一文叙述了部分纯化一种表现出肥大细胞生长因子（MCGF）的活性、分子量大约35kd（千道尔顿）的蛋白质，以及它同白细胞介素-2（IL-2）（也称为T细胞生长因子（TCGF））的分离。Nabel G，等人，（Nature·291：332，（1981）报导了MCGF表现出分子量大约45kd及PI为6.0。Clark-Leuis，I和Schrader，J·（J.Immunol·127：1941（1981），叙述了一种旦白质具有类似肥大细胞生长因子活性，在磷酸缓冲的生理盐水中分子量为29kd，在6M盐酸胍中约23kd，PI约为4-8，但在神经氨糖酸苷酶处理后PI约6-8。鼠的IL-2和白细胞介素-3（IL-3）在生物化学上已被Gillis S.等人（J·Immunol·124：1954-1962（1980））和Inle·J等人。（Jぃ桑恚恚酰睿铮臁ぃ保玻梗海玻矗常保
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卜肿恿肯匀晃保担耄渥笥遥■4驯唬牵椋欤欤椋S·等人（Immu·Rev·63：167-209（1982））叙述过。T细胞上清液的IL-3和MCGF活性之间的比较已为Yung，Y·and Moore，M·（Comtemp·Top·Mol·Immunol·10：147-179（1985））以及Rennick D·等人。（J.Immunol.134：910-919（1985））报导过。
关于可溶性因子调控B细胞的生长和分化方面已有大量的文献，例如，评述方面参看Howard    and    Paul，Ann·Rev·Immunol· 1：307-333（1983），Howard    et    al.，Immunol.Rev.78：185-210（1984）;Kishimoto    et    al.，Immunol.Rev.No.78：97-118（1984）;Kishimoto，Ann.Rev.Immunol.3：133-157（1985）;由于材料来源上的不同，纯化的困难以及用于确定生物活性的测定方面的差别，在表示各种因子的命名上有些混乱。显然，在有些情况下已经达到了命名上的一致：Paul，Immunol    Today4：322（1983）;Paul，Molecular    Immunol，21：343（1984）。B细胞生长因子（BCGF）活性的特征是，能够通过接触到抗IgM或类似抗原，共同刺激B细胞中DNA的合成。认为白细胞介素-1（IL-1）也是为BCGF活性的表现所需要的，至少测定低密度B细胞时是如此。已经叙述过人BCGF的另外测定方法，例如，Maizel    et    al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，80：5047-5051（1983）（支持人的B细胞在培养物中长期生长）。与前一测定方法有关的活性表示为B细胞促进因子-1（BSF-1）活性和BCGF-1，以便把它同类似的和（或）有关活性区别开来。尤其是一已经叙述过称为BCGF-Ⅱ的活性。它的特征是能够在促细胞分裂剂促进的B细胞或转化的B细胞系中引起DNA的合成。与BCGF-Ⅱ活性有关的促细胞分裂剂包括硫酸聚葡萄糖酯、脂多糖及葡萄球菌提取物。在这些测定中，BCGF-Ⅰ不表现出任何反应。认为人的BCGF-Ⅱ是分子量约50kd的分子，促使B细胞在免疫反应中增殖的方面与BCGF-Ⅰ（即BSF-1）协同作用：Yoshizaka    et    al.，J.Immunol.，130：1241-1246（1983）。Howard    et    al.，J.Exp.Med，155： 914-923（1982）是第一个人证明鼠存在有不同于白细胞介素-2的BCGF（有各种不同的称呼，BCGFⅠ，BSF-Ⅰ或IgGl诱导因子等）。在人的系统里几乎同时报导了类似的观察：Yoshizaki    et    al.，J.Immunol.，128：1296-1301（1982），以及稍后Okada    et    al.，J.Exp.Med，157：583-590（1983）。
自从最初的发现以来，表现有BCGF或BSF-1活性的分子，其生物化学及生物学鉴定在不断地进展。Maizel    et    al.，Proc.Natl.Acad.Sci，79：5998-6002（1982）已报导了分子量为12-13kd和等电点pI约6.3-6.6的对胰蛋白酶敏感的人的BCGF。Farrar    et    al.，J.Immunol.，131：1838-1842（1983）报导了鼠的成份复杂的BCGF的部分纯化，它们在SDS-PAGE电泳中分子量为11和15KD。Ohara    and    Paul在Natare.，315：333-336（1985）叙述了鼠BSF-1专一的单克隆抗体，得到BSF-Ⅰ的分子量为14KD和19-20KD，pI为6.7。Butler    et    al.，J.Immunol.，133：251-255（1984）报导了人的BCGF分子量为18-20KD，pI6.3-6.6。Rubin    et    al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，82：2935-2939（1985）报导了在接触到抗-IgM抗体之前，休止期的B细胞与BSF-I的预保温培养可增大细胞体积，之后当接触到抗-IgM抗体则加快进入S期。Vitetta    et    al.，J.Exp.Med.，162：1726-1731（1985）叙述了用反相高压液相层析部分纯化了鼠EL-4细胞无血清上清液的 BSF-I。SDS-PAGE电泳证明蛋白质分子量约20-22KD。Ohara    et    al.，J.Immunol.，135：2518-2523（1985）也报导了用类似方法部分纯化鼠的BSF-1，这个因子是一种分子量18-21.7KD的蛋白质。Sideras等人
在Eur.J.Immunol.，15：586-593和593-598（1985）报导部分纯化了鼠的一种IgG诱导因子，这是一种BSF-1，这种因子是分子量约20KD，pI为7.2-7.4和6.2-6.4的蛋白质;Smith    and    Remnick在Proc.Natl.Acad.Sci.83：1857-1861（1986）报导了与IL-2和IL-3不同的一种因子，它表现出T细胞生长因子的活性和肥大细胞生长因子的活性。后来，Noma    et    al.，Nature，319：640-646（1986）克隆了Sideras等人发现的因子的编码核酸，并作了序列测定，以后Lee    et    al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，83：2061-2065（1986）克隆了Smith和Ronnick发现的因子的编码核酸，并作了序列测定。最近，Grabstein    et    al.，J.Exp.Med.，163：1405-1414（1986）报导了纯化BSF-1和它的序列测定。
Milanese，等人在Science，231：1118-1122（1986）中报导与BSF-I无关的淋巴细胞活素，并将它们暂时称为IL-4A。他们的IL-4A是T3-Ti受体交联后从辅助T细胞分泌出来的蛋白质，分子量10-12KD。它通过与T11受体的相互作用和近一步诱导白细胞介素-2（IL-2）受体，来刺激休眠的淋巴细胞。
Sanderson等人，在Proc·Natl·Acad·Sci·，83：437-440（1986）中提出，根据嗜酸性细胞分化因子同B细胞生长因子Ⅱ显然是相同的，因此称它为白细胞介素-4。
从前面所述，显然新的淋巴细胞活素的发现和开发可以对那些直接或间接地与免疫系统和（或）红细胞生成细胞有关的，范围广泛的退化性病变进行治疗作出贡献。特别是发现和开发那些使已知的淋巴细胞活素有利活性得到增强或更加有效的淋巴细胞活素，可能是极为有益的。例如在肿瘤治疗中，可能由于获得一种淋巴细胞活素或具有潜在作用的辅助因子，而降低了IL-2的毒性的限制剂量。或者由于可以得到一种能增强细胞团促进因子的活性因子，提高了骨髓移殖的效能。
本发明就是针对哺乳动物的白细胞介素-4（IL-4）。发明包括编码有IL-4活性的多肽的核酸，以及多肽本身及其生产的方法。本发明中核酸的确定是根据（1）它们与在这里发表的克隆的互补DNA（cDNA）序列有同源性;（2）对核酸编码的多肽作IL-4活性的功能测量。本文对一种蛋白质或多肽所谓“IL-4活性”意思是这种蛋白质或多肽表现出B细胞生长因子（BCGF）和T细胞生长因子（TCGF）的活性。对于某一种哺乳动物，IL-4活性是由一种特异的TCGF和BCGF检测来确定的。正如下面将作更详细的解释，IL-4的特异实例可以用另外的测定方法作进一步鉴定。例如，鼠IL-4的某些类型表现出肥大细胞生长因子（MCGF）的活性;人和鼠IL-4的有些类型能增强IL-2的TCGF活性;鼠和人的IL-4的有些类型会增强某些细胞类型中GM-CSF所促进的增殖;有的类型能诱导FC-ε受体在B细胞 中的表达;有的能诱导主要的组织相容性复合物（MHC）抗原在B细胞中的表达：类型ⅡDR抗原在人B细胞中和类型Ⅰa的抗原在小鼠B细胞中的表达。
本发明部分地依赖于cDNA的发现和克隆，这cDNA能表达有IL-4活性的蛋白质。本发明的cDNA克隆包括在质粒运载体“克隆46”（在这里也称pcD-2F1-13或pcD-46）和“克隆125”（这里也称pcD-125）中的人cDNA插入片段;和质粒运载体pcD-2A-E3的小鼠cDNA插入片段。这三种运载体都交给美国典型培养物收集中心（ATCC），Rockville.MD，保管，分别编号为ATCC53337，67029和53330。
本发明包括已知核苷酸序列的核酸，它同本发明中的cDNA克隆的序列有显著的同源，并表达出IL-4的活性。本发明的核酸和蛋白质能用核酸序列突变的标准技术从上面提到的cDNA中获得。这些核酸能在来自免疫系统的细胞系，如在T细胞杂交瘤中重新制备，这些细胞系含有或经诱导后含有编码IL-4的mRNA序列;这些核酸能用本发明的cDNA作探针，探测DNA或RNA的提取物或基因库来获得。
这里所用的术语“显著的同源”是指核酸序列能用本发明的cDNA克隆来的杂交探针进行检测。检测为IL-4活性编码核酸所必要的同源性，需作正确的定量测定，这依赖于几个因素，包括：（1）探针与靶核酸相关连的非IL-4编码序列之间的同源性，（2）杂交条件的严格程度，（3）所用探针是单链还是双链，（4）探针是RNA还是DNA，（5）用来减少探针非特异性结合的方法，（6）用于检出探针的标记物质之性质，（7）鸟嘌吟和胞嘧啶碱基 在探针中的百分数，（8）探针和靶核酸之间错酸对的分布，（9）探针的大小等等。
较好的情况是从本发明的cDNA来的有显著同源的探针应与被分离的序列至少有50%的同源性。更好的情况是显著同源的探针应与要分离的序列至少有75-80%的同源性。最好状况是有90%的同源性。
在这里作为术语所用的同源性是两种核苷酸（或氨基酸）序列之间类似性的量度，同源性是指将两个序列（可能不一样长）对齐排好之后，以配对碱基（或氨基酸）的分数或百分数来表示。所谓“对齐排好”这一术语是以Samkoff    and    Kvuskal所定义的意义来使用的（在Time    Warps，String    Edits    and    Macromolecules    The    Theory    Practice    of    Sequence    Compavison一书第一章，Addlson-Wesley，Reading，MA1983）。把最小量“空白的”或“无效的”碱基插入到每个序列中造成最大数量的重叠，使两个序列之间配对碱基（或氨基酸）的数量达到最大，这样两个序列就会大致上对齐排好。给定两个序列，可得到计算它们同源性的算式：例如，Needlehan    d    Wunsch.J.Mol.Biol.，48：443-453（1970）和SankoffandKruskal（上面已列出）p23-29。进行这种比较也可以找到商业性的服务，如Intelligenetics，Inc.（Palo    Alto    CA）。
本发明也与天然的哺乳动物生长因子（多肽）有关，这些因子对免疫反应不可缺少的各种细胞表现出很广的作用范围。本发明提供生产这些因子的方法以及它们用于体内处理哺乳动物。这些多肽的组成包含有某种相当纯的哺乳动物因子，这个因子能表现出B细胞、T细 胞和肥大细胞促进活性。
这些因子原先是从各种T细胞的上清液中分离到的，包含有在非还原条件下表现出一种分子量约20KD或15KD的天然多肽或这种多肽的活性片段。这些因子可以单独或者同其它化合物一起用于各种各样的诊断和治疗的目的，包括生产特异性的抗体。
本发明优选的具体表现形式是以下列公式所确定的一整套糖基化的或非糖基化的人的IL-4蛋白和突变型蛋白：
X（His）-X（Lys）-X（Cys）-X（Asp）-X（Ile）-X（Thr）-
X（Leu）-X（Gln）-X（Glu）-X（Ile）-X（Ile）-X（Lys）-
X（Thr）-X（Leu）-X（Asn）-X（Ser）-X（Leu）-X（Thr）-
X（Glu）-X（Gln）-X（Lys）-X（Thr）-X（Leu）-X（Cys）-
X（Thr）-X（Glu）-X（Leu）-X（Thr）-X（Val）-X（Thr）-
X（Asp）-X（Ile）-X（Phe）-X（Ala）-X（Ala）-X（Ser）-
X（Lys）-X（Asn）-X（Thr）-X（Thr）-X（Glu）-X（Lys）-
X（Glu）-X（Thr）-X（Phe）-X（Cys）-X（Arg）-X（Ala）-
X（Ala）-X（Thr）-X（Val）-X（Leu）-X（Arg）-X（Gln）-
X（Phe）-X（Tyr）-X（Ser）-X（His）-X（His）-X（Glu）-
X（Lys）-X（Asp）-X（Thr）-X（Arg）-X（Cys）-X（Leu）-
X（Gly）-X（Ala）-X（Thr）-X（Ala）-X（Gln）-X（Gln）-
X（Phe）-X（His）-X（Arg）-X（His）-X（Lys）-X（Gln）-
X（Leu）-X（Ile）-X（Arg）-X（Phe）-X（Leu）-X（Lys）-
X（Arg）-X（Leu）-X（Asp）-X（Arg）-X（Asn）-X（Leu）-
X（Trp）-X（Gly）-X（Leu）-X（Ala）-X（Gly）-X（Leu）-
X（Asn）-X（Ser）-X（Cys）-X（Pro）-X（Val）-X（Lys）-
X（Glu）-X（Ala）-X（Asn）-X（Gln）-X（Ser）-X（Thr）-
X（Leu）-X（Glu）-X（Asn）-X（Phe）-X（Leu）-X（Glu）-
X（Arg）-X（Leu）-X（Lys）-X（Thr）-X（Ile）-X（Met）-
X（Arg）-X（Glu）-X（Lys）-X（Tyr）-X（Ser）-X（Lys）-
X（Cys）-X（Ser）-X（Ser）
式Ⅰ
这里X（Xaa）代表一组同氨基酸Xaa同义的氨基酸。在同组中，同义氨基酸对于这一组成员之间的取代有基本上类似的生理化学性质，保持了分子的生物学功能：Grantham，Science.，185：862-864（1974）。显然在上面规定的序列中也可能有氨基酸的插入或缺失，但并不改变生物学功能，特别是如果插入或缺失只涉及几个氨基酸的话，例如在10个以下，那么并不会除去或置换掉对功能构象关键性的氨基酸，如半胱氨酸，Anfinsen，“Principles    that    Govern    the    Folding    of    Protein    Cnains”Science.，181：223-230（1973）。由这种缺失和（或）插入产生的蛋白质或突变型蛋白是本发明的范围之内。在这里公式Ⅰ蛋白质的氨基酸残基无论什么时候按数字表示，这数字都是指蛋白质的N-端。
同义的氨基酸群由表Ⅰ所给定的为较好，在表Ⅰ每行的第二个斜线号之前所列的氨基酸为更好，表Ⅰ每行的第一个斜线号之前的氨基酸为最好。
本发明包括公式Ⅰ的在单个或多个位置上有氨基酸置换（天然的人IL-4氨基酸和同义的氨基酸之间）的多肽。术语“N-重置换的”是用来叙述公式Ⅰ定义的一小群多肽，其天然的氨基酸至少在N个位置上已被同义氨基酸置换了。这样，例如公式Ⅰ中1重置换的多肽组对于较好的一组同义氨基酸来说，是由559种多肽构成的;而对于较好选择的一组同义氨基酸来说，是由189种多肽组成;对于最好选择的一组同义氨基酸来说，是由56种多肽组成。这些数字是通过把天然肽链中每一类的氨基酸的数目加起来，乘上那个氨基酸的同义氨基酸组的大小而得到的。一组人的IL-4多肽由公式Ⅰ的
表1    优选的同义氨基酸组
氨基酸    同义的组
Ser    Ser，//Thr，Gly，Asn
Arg    Arg，/His，Lys，/Glu，Gln
Leu    Leu，Ile，Met，/Phe，/Val，Tyr
Pro    Pro，/Ala，/Thr，Gly
Thr    Thr，//Pro，Ser，Ala，Gly，His，Gln
Ala    Ala，/Pro，/Gly，Thr
Val    Val，/Met，Ile/Tyr，Phe，Leu，Val
Gly    Gly，//Ala，Thr，Pro，Ser
Ile    Ile，Met，Leu，/Phe，Val，/Ile，Tyr
Phe    Phe，/Met，Tyr，Ile，Leu，/Trp，Val
Tyr    Tyr，/Phe，/Trp，Met，Ile，Val，Leu，
Cys    Cys，Ser，//Thr
His    His，/Gln，Arg，/Lys，Glu，Thr
Gln    Gln，/Glu，His，/Lys，Asn，Thr，Arg
Asn    Asn，/Asp，/Ser，Gln
Lys    Lys，/Arg，/Glu，Gln，His
Asp    Asp，/Asn，/Glu
Glu    Glu，/Gln，/Asp，Lys，Asn，His，Arg
Met    Met，Ile，Leu，/Phe，Val/
10重置换的多肽构成为较好，更好是由3重置换的多肽，最好是由1重置换的多肽构成，特别是那种含有图1c中所述的序列的人的天然IL-4多肽。
同样，关于式Ⅰ的肽链术语“N重插入”是用于叙述一套多肽，其中从1至N个氨基酸已经插入到公式Ⅰ规定的序列中。被插入的氨基酸从插入位点的两侧氨基酸的同义氨基酸组（表Ⅰ）中选择出来的定为较好;它们从插入位点两侧氨基酸的更佳的同义氨基酸组（表Ⅱ）中选出来为更好;它们从插入位点两侧氨基酸的最佳同义氨基酸组（表Ⅲ）中选择出来的为最好。例如，这群一重插入的多肽的亚群包括N末端X（His）和相邻的X（Gly）之间的氨基酸。这一亚群限定供插入的成员，较好地选自于Pro、Ala、Gly、Thr、Ser、Glu、Arg、His和Lys这一组，而更好的是选自Gly、His、Gln和Arg这一组，最好选自His和Gly这一组。可以在式Ⅰ任何相邻的氨基酸之间进行插入。因为有128个可供插入的位置，在同一位置又可以有多重插入，所以式Ⅰ的二重插入的多肽可达到16384个亚群，每个亚群的大小依插入处相邻氨基酸的同义氨基酸组的大小而定。
术语“N重缺失”就式Ⅰ多肽而言，是用于表示从式Ⅰ所定义的序列缺失1-N个氨基酸所产生的一组多肽，式Ⅰ中的一重缺失产生的多肽有129个亚群，各有128个氨基酸长度（即128-聚体），每个亚群都由较好的、更好的和最好的同义氨基酸群所限定的128聚多肽组成。
上述的本发明优选具体表现形式还包括那些能编码公式Ⅰ中较好的、更好的和最好的同义氨基酸组相对应多肽，或实际上与这些公式 Ⅰ多肽的编码有显著同源的核苷酸序列，而更好是指能编码较好的、更好的和最好的同义氨基酸相对应的式Ⅰ多肽的核苷酸序列。
本发明特别包括天然的人白细胞介素-4，其氨基酸序列见图1C，以及能够编码它的所有核苷酸序列。
全文用标准缩写法来表示氨基酸、核苷酸和限制性内切酶等等，即Cohn，“Namenclature    and    Symbolism    of    α-Amino    Acids，”Methods    in    Enzymology.Vol.106，p3-17（1984）;Wood    et    al.Biochemistry：A    Problems    Approach，2nd    ed.（Benjamin，Menlo    Park，1981）;和Roberts，“Directory    of    Restriction    Endonucleases”，Methods    in    Enzymology.Vol.68，p27-40（1979）。
本发明提出与应用免疫控制剂来治疗医学或兽医疾病的有关问题。尤其是提供了单独应用或与其它淋巴细胞活素或免疫体系介素合用的产生有益效应的化合物。
本发明所推荐的内容现在将予叙述，其中一部分将与图解结合起来（图1-19）。
图1A描述了运载体pCD-2A-E3插入片段的核苷酸的序列和被推论的氨基酸序列，该插入片段表达为鼠IL-4。
图1B描述了运载体PCD-125插入片段的核苷酸序列和推论的氨基酸序列，该插入片段表达为人的IL-4。
图1C描述了被PCD-125转染的COS7猴细胞表达和分泌的，被纯化的人的天然IL-4的氨基酸序列。
图2A是运载体PCD-2A-E3的图谱，它的插入片段编码 了IL-4。
图2B是运载体PCD-2A-E3插入片段的限制性内切酶的酶切图谱。
图2C是运载体PCD-46的图谱，其插入片段编码了人的IL-4。
图2D是运载体PCD-46插入片段的限制性内切酶的图谱。
图3A描述了各种培养物上清液的TCGF相对活性（在一个稀释范围内），它包括从PCD-2A-E3转染的COS7细胞来的培养物（曲线1）。
图3B描述了各种培养物上清液的MCGF相对活性（在一个稀释范围内），其中包括一个PCD-3A-E3转染的COS7细胞来的培养物（曲线1）。
图3C描述了所示数量的上清液产生Ia诱导的相对程度，这上清液来自PCD-2A-E3转染的COS7细胞（曲线1），Cl.LyL+2-/g细胞（曲线2）和空转染COS7细胞（曲线3）。
图3D图示了被PCD-2A-E3转染的COS7细胞上清液诱导IgE和IgG的程度。
图4A描述了对因子依赖的人辅助T细胞。JL-EBV用比色法测量增殖所得到几种PCD-125转染的上清液的TCGF活性及其对照。
图4B是描述了对pHA促进的外周血液淋巴细胞用比色法测量增殖时所测得的PCD-125转染的上清液及对照的TCGF活性。
图4C描述了pHA促进外周淋巴细胞，用3H-胸腺嘧啶参入所测定PCD-125转染上清液和对照的TCGF活性。
图5A是被促进的人扁桃腺B细胞对照群体的细胞频率与荧光强度间的直方图，B细胞的Fc-ε受体已经用荧光法标记。
图5B是受到促进的人的扁桃腺B细胞群体的细胞频度对荧光强度直方图，这种B细胞已接触过含有0.1%受PCD-125转染的COS-7细胞上清液组成的培养基，它的Fc-ε受体已作荧光标记。
图5C是受到促进的人扁桃腺B细胞群体的细胞频度对荧光强度的直方图，这种B细胞已接触过含有1%受PCD-125转染的COS7细胞上清液组成的培养基，它的Fc-ε受体已作了荧光标记。
图5D是受促进的人扁桃腺B细胞群体的细胞频度对荧光强度的直方图，这种B细胞已接触过含有10%受PCD-125转染的COS7细胞上清液组成的培养基，它的Fc-ε受体已作荧光标记。
图6A描述了人工合成的人IL-4基因的核苷酸序列在E.coli中表达天然的或突变的IL-4。
图6B是插入在质粒pUC18中人工合成人的IL-4基因的限制性内切酶酶切图谱。
图7A-7F分别描述了构建人工合成的人IL-4基因的1A/B到6A/B双链DNA片段。
图8描述了E.Coli表达运载体TAC-RBS的起始密码ATG比邻的核苷酸序列。这序列开始于EcoRI切点，结束在HindⅢ切点。核糖体结合序列（RBS）与16S核糖体RNA的3′端表达出互补。此结合序列有下线，起始密码子ATG划有下线。
图9描述了对患有裸露淋巴细胞症候群的病人来的细胞群体，细胞频度与荧光强度的直方图，这些细胞用荧光标记的抗DR单克隆抗体染色。
图10描述了人的IL-4最后的纯化步骤中215nm的吸收图谱，纯化步骤由在c-4柱上的逆相HPLC组成。
图11是含有人IL-4DNA的质粒PEBV-178的构建图谱。
图12是质粒TRPC-11的构建图谱。
图13A是质粒pMF-α8的构建图谱。
图13B描述了能表达天然的人IL-4和各种突变型蛋白的酵母培养物来的几种转染上清液的TCGF活性。
图14描写了因子依赖的细胞学的生长曲线，即Mc/9肥大细胞（1A），DX-2肥大细胞（1B），NFS-60细胞（1C）和HT2T细胞（1D）等。5×103细胞同各种浓度的上清液一起培养，与cl·1为黑圈，与IL-2R为空圈，与GM-CSFR为空三角形，与IFN-8R是实心三角形，或与p388D1上清空心菱形。MC/9细胞（1A）已同各种浓度纯化的IL-3（黑圈）、混合有200单位的IL-2R的IL-3R（黑方形）、GM-CSFR（空心三角形）、IFN-8R（黑三角形）或者p388D1上清液（中空菱形）一起培养。在24小时后用比色法测定生长因子的活性。在570nm的吸收值（用630nm作参照）在Dymatic Micro Elisa读数上测量。
图15描述Cl·1上清液的阳离子交换层析，7ml（含35mg蛋白质）浓的上清液透析到50nM磷酸钠盐、1mM    EDTA、 pH7.0（7.8ms/Cm）和加样到已用同样缓冲液平衡过的Pharmaci    Mono    S柱上（0.5×5Cm）上。洗脱条件：0.5ml/分钟·流速、0.5ml/管、0-40%缓冲液B/40分钟再，40-100%缓冲液B/10分钟。对每管取样测在NFS-60（IL-3黑圈）、HTR（TCGF，空圈）和Mc/9（MCGF）细胞上的增殖活性。Mc/9的反应未表现出来。箭头指示是达到Cl·1上清液水平的Mc/9增填水平的位置。
图16A描述IL-3已耗尽的Cl·1上清液的逆相C8层析。100μl在0.1%TFA中通过3×mono-S柱的上清液（第59-61分管，图15）加样到Pharmacia C8逆相柱上（0.5×2cm）。缓冲液A在水中有0.1%TFA，缓冲液B在乙腈中有0.1%TFA。洗脱条件：0.5ml/min、0.5ml/管、在四分钟内0-25%缓冲液B，在50分钟内25-60%缓冲液B，在4分钟内60-100%缓冲液B。每管取样测定，在NFS-60（IL-3黑圈）、HT2（TCGF、空圈）、Mc/9细胞（MCGF、黑三角形）等上面的增殖活性。箭头表示含有TCGF活性峰的部分，在每管加入饱和的IL-3R水平以后，这峰部分产生了类似于Cl·1上清液性质的Mc/9的增殖水平。
图16B描述了GK15-1鼠的T细胞上清液的逆相C8层析。2mg（0.5ml）浓缩的GK15-1在0.1%TFA中的上清液加样到Phormacia C8逆相柱上，同上条件进行洗脱。每管取样测定在HT2细胞（空圈）上的TCGF活性。箭头标出在同样条件下洗脱的鼠IL-2R洗脱的位置。插活：Cl·1（黑圈）、 IL-2R（黑方形）和GK15-1上清液（空圈）的TCGF活性直接在同一板上作比较。
图17叙述了从逆相柱上部分纯化的因子（RP因子）的MCGF和TCGF活性。用24小时培养之后〔3H 胸腺嘧啶参入未测定增殖情况。Mc/9肥大细胞和HT2T细胞同各种浓度的Cl·1上清液（黑圈）、IL-3R（空圈）、IL-2R（空三角形）、RP因子（空方）和在200单位IL-3R存在下与RP因子稀释液（黑方）或在有饱和水平的RP因子存在下IL-2的稀释液（黑三角形）一起培养。
图18描述了Cl·1上清液的层析图。在25nm    bis-tris，pH7.1缓冲液中、1.5ml（3.5mg）上清液加样到Pharmacia    mono    P柱上（0.5×20cm），然后用多聚缓冲液74pH4.0（1∶10）稀释，流速0.5ml/min，1.0ml/管。每管取样用在NFS-60（IL-3空圈）、HT-2（TCGF黑圈）和Mc-/9（MCGF，除了去箭头指示出MCGF活性参数位置外未标出）的增殖情况进行测量。TCGF峰（第12管，pI＝6.2）同微量的IL-3活性是吻合的，MCGF的增殖水平在箭头标明处达到最高。
图19表明Cl·1上清液和部分纯化的MCGF/TCGF的SDS-PAGF电泳图。
A）未分部分离上清液的非还原性SDS    PAGE电泳，在用50nm    DTT预先还原（60℃，5分钟）TCGF峰移到了稍高的分子量（21KD和16KD），伴随着活性的剧烈下降。
B）从阳离子交换层析得到的MCGF/TCGF峰的部分（图 15，管59-61）的非还原性SDS    PAGE电泳。用50mM    DTT预先还原（60℃，5分钟）使MCGF和TCGF峰移向稍高的分子量（21KD和16KD），伴随着活性的剧烈丧失。箭头标出加入饱和量的IL-3，把MCGF活性提高到上清液水平的那些部分，IL-3（空圈）、TCGF（黑圈），MCGF（空三角形）。
本发明包括表现出IL-4活性的糖基化及非糖基化的哺乳动物多肽，这些多肽可以用标准的蛋白质工程技术从这里公开的IL-4多肽中得到。本发明也包括为此多肽编码序列的核酸或其序列同本发明的cDNA克隆有显著同源的核酸。最后，本发明包括制作糖基化或非糖基化多肽的方法和使用这些多肽的方法，这些多肽制作是利用本发明中所公开的核苷酸序列。
制作、使用和鉴定本发明的多肽和核酸的技术在下面作一般性的讨论。然后提出几个特定的实例，其中的特定细胞类型、运载体、试剂等等应用这些通用性的技术。首先将简短地叙述它们从自然来源的分离。
这些多肽从容易得到的细胞原材料的上清液中纯化成明显地均一的，这样就能够在商业上制造成纯产品，用于各种治疗及其它的用途。
这些多肽的鉴定包括某种可表现出B细胞、T细胞和肥大细胞促进活性的多肽。在一种生物种体内这种多肽的自然形式是在SDS-PAGE电泳中，在非还原条件下表现出大约20KD和15KD的分子量，而在还原条件下表示为21KD和16KD。含有基本上纯的该种多肽的组分在层析聚集中表现出等电点pI6.2。这些生长因子是十分有潜力的物质，在极低浓度时（不是1mg/ml），显 示出相当大的活性，该多肽通过阳离子交换层析或从逆相层析中独特的洗脱条件，能与激素和T细胞天然产生的其他蛋白质（如IL-2、IL-3，GM-CSF和IFN-8）区分开来。
在鼠类中，本发明的某些多肽只支持某些细胞的低水平增殖，如依赖于IL-3的肥大细胞系，但是在第二种因子如IL-3存在下协同地增殖这种细胞（如肥大细胞）的生长。多肽能够促进某些T细胞的增殖，但一般只有纯的IL-2在较小程度上有过这促进作用。这种多肽也能够诱导休止的B细胞的Ia表达，以与BSF-1相似可增强B细胞分泌IgGl和IgE。虽经多次生化的分部分离这些活性仍是分不开。然而，大多数性活在还原后，例如有SDS存在下被破坏了。
这些因子能以各种各样方式从许多天然来源获得。一个合适的来源是产生该多肽的许多T细胞中的任何一种。一种这样的T细胞系来自C57GL6小鼠（Nable，G.et al，Proc，Notl，Acad，Sci.U.S.A.，78，1157-1161（1981）），该系能保存在修改过的补充DME中（Nable，G，et al.，Cell，23：19-28（1982））。该细胞系原先定名为Cl.Lyl+2-/9已移给美国典型培养物收集中心（ATCC）保存，登记号为CRL8179。这些多肽的其他合适的细胞来源包括几乎任何能分泌属于这些多肽的各种抗体的细胞，如人外周血淋巴细胞;以及任何已知的T细胞来源，如扁桃腺、脾等等。
为了分离本发明的蛋白质，从这些细胞来源的上清液，或有些情况下是从破碎细胞所得胞液的上清液，可按各种已熟悉的提纯程序纯化。这些纯化技术最好结合起来使用，以保证有高度的纯化水平。典型地 说，纯化将采用凝胶过滤层析、Sp阳离子交换层析、逆相层析、基团专一层析（如在肝素葡聚糖上）、或者其他能有效地分部蛋白质的普通分离方法。高压液相层析（HPLC）、等电聚焦和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳也可采用。
例如，从一个合适的细胞株来的上清液可以先用强阳离子交换层析分部。典型情况是本发明的多肽结合在柱上，而98%的上柱蛋白流经柱外。留在柱上的结合蛋白可以用盐梯度洗脱下来。在本发明的一个具体实例中，大约0.19M的氯化钠梯度即可洗脱所要的该多肽。这种分部重复两次以上（主要是除去残余的IL-3）同时达到了95%以上的纯度、进而再用肝素-葡聚糖和逆相（C4或C18）层析连续分部。在后一种情况下，这些多肽被42%乙腈洗脱。合并的各个部分，含有纯度极高的该种多肽，基本上是纯一的（在银染色的SDS-PAGE上20kd左右有单一的电泳带）。该纯化物比它在天然状态下存在时至少纯化了65000倍。
这些多肽可以作抗原用于产生抗体，这些抗体又可以用作抗原产生抗个体型抗体，多克隆抗体或单克隆抗体可以很方便地被制备。这些多肽或其片段，一般至少有15个左右的氨基酸，本身就可以使用，但最好结合到或连接到活化免疫系统的佐剂或抗原上。可使用的抗原，有血清白蛋白、钳孔蜮血菌蛋白、球蛋白等。可用多种技术，如戊二醛、顺丁烯二酰亚胺苯甲酸、重氮基苯甲酸等等将佐剂连至多肽上。佐剂包括Freunel式佐剂、氢氧化铝等。抗原以常量注入适当的寄主中。以2-4星期间隔再进行两次增效注射。当制备单克隆抗体时，通常是一个小鼠注射原初的和增效的注射液，分离脾脏，然后按照常规技术把脾单核细胞同适当的融合对象一起融合。可参阅一些实例 Galfre，et    al，Nature，266：550（1977）;Kennelt，et    al.Current    Topics    in    Microbiology    and    Immunology，81：77（1978）和美国专利4381292和4363799号。然而对于特殊的目的，可以用其他哺乳动物。灵长类如人，用来产生具有人的Fc链的抗体。
多肽本身或者同抗体联合用于对多肽的诊测。诊测时抗原和抗体两者或其中一者可标记也可不标记。在文献中叙述过大量的诊断测定，这包括直接或间接地把这些多肽或抗体结合到各种标记物上，如酶、放射性同位素、荧光物质、底物、辅酶、颗粒如磁性颗粒等等。这些测定的图示见美国专利3817837;3850752;4174384;4177437;4374925等实例。
各种测定法都人为地分成均一和不均一免疫测定，这种区分是根据多肽和它的抗体之间的复合物是否必须与专一性结合成对中的未形成复合物的组分分离开来。各种测定方法指EI、ELISA、RIA、均一的EIA、点-印渍法、Westerns杂交法等等。
这些多肽的抗体本身可以用作产生抗个体型抗体的抗原，这种抗抗体可用做竟争性抗原，因为它具有可与这类多肽的抗原决定簇竟争的抗原决定簇。因此这些抗抗体可做为肿瘤的抑制剂，作为该多肽的取代物或拮抗物。
这些多肽形成一个天然存在的多肽家族，它可能有天然的来源，也可能有非天然存在的多肽，但享有相同的生理性质，如结合特异性和对B细胞或肥大细胞的促进活性等。正如对技术很内行的人所了解的那样：在生物种和来源之间的微小差别可能要求纯化步骤上的修改。例如见Barany    and    Merrifield的Solid-Phase Peptide    Synthesis“The    Peptides，Analysis    Synthesis    Biology，”Special    Methods    in    Peptide    Synthesis，Part    A，Vol.2，Gross    and    Merenhofer，eds.，Academic    Press，N.Y.1980    pp.1-284。
本发明的多肽可多途径地得到应用。例如能在组织培养物中或活体内诱导T细胞和肥大细胞的生长。肥大细胞正如前面所指出的是肝素、组胺、前列腺素和其它生理重要物质的重要来源。类似地，生长因子可用来促进B-和T-细胞，特别是分泌免疫反应中有用的蛋白质（如淋巴细胞活素和免疫球蛋白）的那些细胞，典型的情况是这些因子可参入加至有细胞培养物的培养基内，所用因子的最适合浓度因所用细胞系类型不同而异，但一般是0.1μg/ml到1.0mg/ml，在培养物情况最好是1μg/ml到10μg/ml。
利用本发明的生长因子能消除利用饲养细胞的需求，来维持所需细胞系，结果可大大提高由此细胞系所形成的产物之纯度。
本发明的多肽化合物，也可用于体内治疗各种免疫缺陷和提高自然的免疫反应。例如，通过促进B细胞、T细胞和肥大细胞的成熟和生长，有助于防治传染因此降低动物对感染的易感性。
Ⅰ.IL-4cDNA的重新合成：
现在可以有各种各样的方法从头到尾制备和克隆cDNA，和组建cDNA基因库。例如近期的综述有Doherty的“cDNA克隆和表达”在Gottesman编的“Molecular    Cell    Genetics”一书第10章（John    Wiley    and    Son，New.York.1985）和Brandis    et    al.，“cDNA基因库的制备和特定基因序列 的检出”，在Setlow    et    al编“Genetic    Engieering”Vol.8，p299-316（Plenum    Press，New.York，1986）。
举例来说，从产生所需活性多肽的细胞（如非转化的人T细胞）中提取总mRNA（Berges，S.et    al报导的Biochemistry，18：5143-5149（1979））。从这总mRNA建成双链cDNA是通过用引物引发的反转录作用（Verme，I.，Biochem.Biophys.Acta.，Vol.473，p1-38（1977）），首先合成每条mRNA序列的互补物，然后再引发第二条链的合成（Land，H.et    al.，Nucleic，Acids.Res.，9：2251-2266（1981））。继后，把cDNA接合到适当的质粒或噬菌体运载体中而进行克隆（Rougeon，F.et    al.，Nucleic    Acids    Res，2：2365-2378（1975）或Scherer，G.et    al.，Dev.Biol.86：438-447（1981）），连接方法是通过互补的均聚体的尾巴（Efstratiadis，A.et    al，Cell，10：571-585（1977））或用含有适当限制性内切酶切点的接头片段所造成的粘性末端（Maniatis    et    al.，Molecular    Cloning：A    Laboratory    Manual，冷泉港实验室1982），然后去转化适当的寄主（一般参看Efstratiadis，A.，and    Villa-kormaroff，L.，“Cloning    of    double    stranded    cDNA”在Setlow.J.and    Hollaender.A.编的Genetic    Engineering，Vol，1，plenum    Publishing    Corp.，N.Y.U.S.A.（1982））。
编码所需蛋白质的mRNA的较好来源是这样的细胞，即其上清液含有对B细胞、T细胞和（或）肥大细胞的促进活性，或与本发明的多肽有关的其它活性。这样一种的细胞系是小鼠T细胞系Cl.Lyl+2-/9（即ATCC登记号CRL8179）（Nabel G.et al，Nature，291：332-334（1981））。一般说来，合适的T细胞能从各种来源中得到，象哺乳动物（如人）的脾、扁桃腺和外周血液。象从外周血液中T-淋巴细胞分离到的T细胞无性细胞系还可以用（见vor Doehmer，H.and Haaf，V.编的Research Monographs in Immunology，Section D：“Human T-Cell Clones”，vol.8，p243-333;Elsevier Science Publishers，N.Y.（1985））。
为确证这种细胞能产生编码IL-4的mRNA，可将提取的mRNA微量注射到Xenopus    Laevis的卵母细胞中。这种微量注射技术后面有更完整的叙述，一般性的介绍可参阅：Colman    et    al.，“Export    of    Proteins    from    Oocytes    of    Xenopus    Laevis”，Cell，17：517-526（1979）和Maniatis    et    al，Molecular    Cloning：A    Laboratory    Manual，p350-352（冷泉港实验室，N.Y.1982）。
如果所要编码IL-4的mRNA构成总mRNA非常小的一部分，为了使检出感兴趣的cDNA克隆的筛选步骤成为可行，富集这一分部的浓度可能是必需的。这种步骤在技术上是一般的，在下述例子以及一些文章和文献中都已发表，如Maniatis    et    al，（上面列出）p225-228;Suggs    et    al，Proc，Natl，Acad.Sci.，78：6613-6617（1981）;Parnes et    al，P·N·A·S·，78：2253-2257（1981），Davis    et    al，P·N·A·S·，81：2194-2198（1984）。
重新制备IL-4CDNA的一个优先采用的方法依靠此cDNA在Okayoma    and    Berg发现的PCD表达系统中进行有功能性表达，该系统已发表在Mol·Cell·Biol·，2：161-170（1982）和3：280-289（1983），并从Pharmacia（Piscataway，N·J·）可以得到。pcD表达载体含有SV40早期启动子，后期剪接作用和DNA复制起始点。此载体使COS7猴细胞中的cDNA插入片段得到表达，COS7细胞为pcD质粒的复制提供了T抗原。cDNA基因库的筛选包括用DEAE-葡聚糖把质粒DNA库转染到COS7细胞内。因为淋巴细胞活素，特别是IL-4是分泌蛋白质的，在几天保温培养之后可测定转侵细胞上清液中的生物活性。把有活性的合并并进一步分开，鉴定在转侵后得到的有生物活性的单个cDNA克隆。
简言之，Okayama    and    Berg表达性运载体组建如下，多聚（A）mRNA与寡聚（dT）尾巴退火，而该寡聚（dT）尾巴是联在含有SV40早期启动子的区段的pBR322质粒经KpnI水解后所形成的那个突出单链上。也就是整个运载体作为cDNA合成的引物。在cDNA合成后，3′端接上寡聚脱氧胞嘧啶核苷酸（寡聚dC），接着用HindⅢ水解，它在单一的HindⅢ切点上剪去了一段连接有寡聚dC尾巴的SV40的片段。SV40的早期启动子仍保持完整。插入片段内偶尔出现的HindⅢ切点极小受到影响，因为cDNA/RNA杂合链是抗HindⅢ水解的。分别构造的 一个具有3′寡聚脱氧乌嘌呤核苷酸（OligodG）尾巴的HindⅢ片段，与上述HindⅢ水解留下的粘性末端一起退火。这运载体被环化，用E.Coli    RNase    H、DNA聚合酶Ⅰ和DNA连接酶处理，使得用DNA取代RNA链。运载体克隆在E.coli中组成基因库。因有SV40的组成分，使运载体得以在真核细胞中以及原核细胞中，特别在哺乳动物细胞象COS7猴细胞中或中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中进行表达。
一旦在Okayma/Berg质粒运载体中完成了cDNA基因库，就收集cDNA克隆，随机的混合物用标准方法检查所要cDNA的存在，如杂交选择、检测表达产物上抗原决定簇，以及/或功能的测定。正反应的基因库再用诱导的T细胞系的cDNA进行探测。此后，有正反应的、探针测过的基因库分成一个个的克隆，并通过转侵到合适的寄主中进一步测定，（如哺乳动物细胞培养物），检查寄主细胞液中的活性。
Ⅱ、从公开的cDNA衍生出的杂多探针来制备IL-4    cDNA：
本文所公开的cDNA能用作识别不同细胞表型中同源序列的探针，作为IL-4编码序列重新分离和克隆的一种变通方法。用的是标准的技术，例如Beltz    et    al“分离的多基因家族和用滤纸杂交法确定同源性”。Methods    in    Enzymology.Vol.100：p266-285;Callahan    et    al，“与小鼠的乳腺肿瘤病毒基因组有关的人DNA序列的探测与克隆”PNAS，79：5503-5507（1982）。基本上，本发明的cDNA是用于为筛选而构建的探针（用标准方法，如上面提到的Maniatis    et    al），特 别是在杂交可信度较低的情况下来筛选为产生IL-4的细胞类型的基因组或cDNA的基因库（也用标准方法构建的）。采用标准的筛选手段，如Grunstein    et    al，PNAS.72：3961-3965（1975）或Benton    et    al，Science，196：180-183（1977）。
正如后面更全面地进行讨论的，人的IL-4是用鼠IL-4探针分离的。后来的分析指出，在人和小鼠cDNA的选择区域之间大约有70%的同源性。从小鼠和人之间的进化距离，可以相信大部分（如果不是全部的话）哺乳动物IL-4基因可用本发明的一种或几种cDNA构成的探针检测出来：Wilson    etal，“生化进化”，Ann.Rev.Biochem，Vol    46：p573-639（1977）;Kimura“分子进化的自然理论”在Nei    and    Roehn编“Evolution    of    Genes    and    Proteins”一书第11章（Sinauer    Associates，Sunderland，MA，1983）。
Ⅲ、用蛋白质工程制备鼠IL-4s：
一旦得到某种天然蛋白质的核酸序列或氨基酸序列，就有多种技术来造成天然序列中任何的突变。Shortle在Science，229：1193-1201（1985）中评述了可应用于本发明的核酸突变的技术。天然IL-4s的突变体也就是IL-4突变型蛋白，多是由寡核苷酸指导的专一性位点的突变，例如，Zoller    and    Smith，Methods    in    Enzymology，Vol    100：p468-500（1983）;Mark    etal：美国专利4518584题目为“人的基因工程的白细胞介质-2突变型蛋白”，或者按Wells等人所叙述的所谓“盒子”突变（Gene，34：315-323 （1985），Estell et al.，Science，233：659-663（1986））。在下面的几部分中，Estell等人用来识别突变型蛋白质的表示方法被沿用，并成为一般规定。例如“人IL-4突变型蛋白Leu82”（如果这种天然蛋白质从上下文中可理解的话，可简写为Leu82）是指一种多肽，它的氨基酸序列除了N末端82位之外都同天然蛋白质序列相同。在这82位上Leu已经置换了Phe。一个以上的置换也能以类似方法表示。例如在82位置上Leu置换了Phe，在111位上Asp置换了Asn的突变型蛋白，可写成：人IL-4突变型蛋白（Leu82Asp111）。缺失由“△′s”表示。例如，在71位上缺失Gln的一种突变型蛋白写为“人IL-4突变型蛋白△71”。插入用“IS（Xaa）”指明。例如：在71位的Gln后面插入有一个Leu的突变型蛋白写为“人IL-4突变型蛋白IS71（Leu）”。这样，人IL-4突变型蛋白（Ser13，△71，IS94（GlY））代表天然的人IL-4序列，其中已经在位置13上Thr被Ser取代，71位上Gln缺失，在94位的Ala直接在后面插入Gly。在同一位置上多个氨基酸的插入用ISi（Xaa1-Xaa2-Xaa3-…）表示。这里Xaa1-Xaa2-Xaa3-…是在位置i之后插入的序列。N末端的添加用右上角标O来表示，如IS0（Xaa），缺失的序列如氨基酸6-10标定为△6-10或△6、△7、△8、△9、△10。
盒式突变最好用在产生人IL-4突变型蛋白。正如下面作更充分的叙述，已构建成人工合成的人的IL-4基因，并沿着基因大致均匀地分布着单独的限制性内切酶切点。当基因插入到适当的运载体里时，仍保持限制性内切酶位点的独特性，因此，基因片段很方便地 进行切割，并可用人工合成的寡聚核苷酸取代之。
测定限制性内切酶位点的数目与分布需要考虑到几个因素，包括（1）在表达性运载体上先前已存在的切点位置，（2）是否要求使用种的专一性或属的专一性密码子，（3）对单一的限制性内切酶切点之间的片段进行人工合成和序列测定的方便和可靠性。
Ⅳ、IL-4活性的生物学性质测定。
本发明的哺乳动物IL-4是从生物学活性和与所发表的具体实例的同源性来下定义的。本发明的哺乳动物的IL-4s包括蛋白质和突变蛋白质，它们与所发表的天然多肽有同源性，并且表现出BCGF活性和TCGF活性。本发明的哺乳动物IL-4s的另一种定义方法是用生物学活性，这些活性（在下面将更完整地定义）包括BCGF活性和TCGF（在这里指IL-4活性），也可以从由MHC抗原诱导活性、Fc-ε受体诱导活性、GM-CSF促进的颗粒细胞团生长促进活性、白细胞介质素-2TCGF促进活性、IgGl和IgE诱导活性等组成的一组活性选出来一两种活性来定义的。
认为IL-4s在活性方面是种属专一性的。例如人IL-4当用人的T细胞系测定时，表现出TCGF活性，但当用鼠T细胞系测定就无活性。相反，鼠的IL-4当用鼠T细胞系测定时表现出TCGF活性，但用人T细胞系测定时就不出现活性。
A、TCGF活性：
已叙述TCGF活性的几种标准测定方法，例如：Devos等人 Nuclei Acids Res，11：4307-4323（1983），Thurman et al，J.Biol.Respense Modifiers，5：85-107（1986）和Robert-Guroff等人，在Guroff编的Growth and Maturation Factors一书第9章（John Wiley N.Y.1984）。一般来说，TCGF测定是根据一个因子能够启动外周T淋巴细胞的增殖或依靠IL-2的T细胞的增殖。例如，Gillis et al，J.Immunol，120：2027（1978）。增殖能用标准技术进行测定。如3H-胸腺嘧啶的参入或比色方法（Mosmann，J.Immunol.Meth，65：55-63（1983）。
作为实例，人TCGF活性能以下列步骤进行测定：（1）先用植物血球凝集素（PHA）刺激过7天，继后同IL-2一起培养7天的洗涤过的人外周血淋巴细胞（约2×105/50μl）加到微量滴定小室中;（2）含有TCGF的材料稀释液（50μl）加到每个小室中;（3）淋巴细胞在37℃培养72小时;（4）3H-胸腺嘧啶（约20μl，20μCi/ml）加入到各个小室;（5）细胞收集到滤纸条上，洗涤，在液闪计数器中计数。
正如在实例中叙述得更加充分的那样，有些类型的IL-4有促进IL-2的TCGF活性的能力。对这里的促进意思是：在TCGF测定系统中由IL-2引起的增殖的最高水平随着IL-4的加入而提高。
B：BCGF活性：
BCGF活性是按Howard    et    al揭示的测定方法定义的（J.Exp.Med，155：914-923（1982））。BCGF 的测定方法由Howard    and    Paul作了广泛性的评述（Ann.Rev.Immunal，1：307-333（1983））。简言之：BCGF活性是当抗IgM等抗原在引起有丝分裂以下的浓度存在时由纯的休止期B细胞促进增殖的程度来量度的。举例，可以按下面的步骤进行人BCGF活性测定：
通过从外周血液、脾脏、扁桃腺或其它标准来源用Ficoll/Hypaque密度梯度离心（如Pharmacia）与用2-aminoethylisothiouronium bromide处理过的羊红血球进行两次玫瑰花环试验以便消除T细胞，这样得到了浓缩的B细胞群体。当用从Co lter（Hialeah，FL）得到的抗人B细胞专一的单克隆抗体B1来测定时这种B细胞制备物应该含有95%以上的表面Ig+细胞，并含有95%以上的对人B细胞专一性的抗原。当用抗-Leu-1单克隆抗体（Becton-Dickinson，Moantaiu View CA）或OKT11抗体（Ortho Diagnostics，Westwood，MA）染色测定时，T细胞的混杂情况应该小于1%。3ml这种B淋巴细胞培养物（大约5×105/ml，在Yassel′s培养基里）（Yessel et al.，J.Immunol，Meth.，65：55-63（1984）），可被金黄色葡萄球菌Cowan I菌株（SAC）（即0.01%的sac溶液，商品名称Pansorbin，从Calbiochem可获得，或者能以Falkoff et al所述进行制备，J.Immunol.，129：97-102（1982））或者偶联在珠球上的抗-IgM抗体（BRL，Gaithersburg，MD）也就是从Bio-Rad（Richmond，CA）得到的5μg/ml的免疫小球所活化。B细胞培养24小时（在SAC活化的情况下）或72 小时（对于抗-IgM珠球来说），然后重新用Ficoll/Hypaque密度离心除去SAC颗粒、珠球和无活性的细胞等。B细胞的增殖是把50μl培养基中的5×104B淋巴细胞放到0.2ml平底微量滴定小室中进行测定的。加入各种不同稀释度的有BCGF活性的悬浮物质，最终体积为50μl。3H-胸腺嘧啶参入量在48小时后（抗-IgM培养物）或72小时后（SAC培养物）进行测定。类似的测定方法也已被Muraguchi et al.找到（Muraguchi et al.，J.Immunol，129：1104-1108（1982）;Yoshizaki et al.，J.Immunol，128：1296-1301（1981））。
C、MHC抗原的诱导。
已经证明IL-4能够诱导MHC抗原（如小鼠中的Ia）在各种细胞类型的免疫系统中，特别在B细胞中的表达。Roehm et al，在J.Exp.Med.，160：679-694中提出证据，表现出BCGF活性的因子也能够诱导正常的休止期B细胞上MHC抗原的表达。对MHC抗原诱导的测定是在该篇参考文献中提出的对鼠B细胞测定的普遍概括。简短地说，免疫系统的细胞接触到IL-4，然后细胞表面特定的MHC抗原的表达用对抗原专一性的标记抗体进行测定。诱导的程度可以把被诱导的细胞同对照作比较来确定。从ATCC可以得到几株杂交瘤，它们都产生抗-MHC抗原的单克隆抗体，有几株可以从商品获得（例如，ATCC登记号HB103，HB110，或HB151等的杂交瘤产生的抗-HLA-DR;ATCC HB35的杂交瘤产生的抗-HLA-DR;ATCC HB35的杂交瘤产生抗I-Ab，d。从Becton Dickinson （Mountain    View，CA）可以得到抗-HLA-DR    L243等等。可能需要某些常规实验使测定方法适应了特定的生物，使测定条件达到最佳，得到MHC抗原水平得到最灵敏的读数。对于人的MHC抗原诱导的测定方法，能以上面所述或类似的方法制备纯的B细胞。另外MHC诱导也能在未纯化的脾细胞制备物上进行测定。抗体标记的细胞最好用流动血球计数器，例如Becton    Dickinson    FACS型仪器或类似的型号上进行检测。
D、MCGF活性：
人们相信IL-4s一般都表现出MCGF活性。然而，由于缺乏合适的测定技术，所以只证明了对啮齿动物IL-4有MCGF活性。鼠IL-4MCGF测定方法是根据依赖此因子的鼠肥大细胞或嗜碱颗细胞系的增殖。特别是，MCGF活性能用鼠肥大细胞系MC/9来测定。（MC/9已交给ATCC，登记号为CRL8306，在美国专利4，559，310中和Nabel    et    al，Cell，23：19（1981）中有叙述）。鼠MCGF测定方法，Ihle    et    al在J.Immunol，127：794（1981）中作过叙述。
MCGF活性用MC/9细胞作Mosmann（上面提到过的）比色测定更为可取。简单地说，MC/9细胞培养在平底的Falcon微量滴定小孔（104个细胞/小孔）中，内有最终体积0.1ml的Dulbecco修改的培养基，并补充有4%牛胎胚血清，50μM2-巯基乙醇，2mM谷氨酰氨，非必需氨基酸，必要维生素以及各种浓度的试验上清液。经20小时培养之后，在每个细胞培养物中加入10μl磷酸缓冲液盐水中含有50μg3-（4，5-二甲基噻唑基-2-）-2，5-二苯基四唑鎓溴（Sigma），4小时之后， 加入0.1ml含0.04M HCl的异丙醇，使有色的甲
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反应产物溶解。570nm（参照为630nm）的吸收值在Dynatek Microelisa Autoreader（MR580型）或类似仪器上进行测定。
E、Fc-ε受体的诱导。
已经发现在B细胞和T细胞上，特别是被抗-IgM抗体等抗原促进的人B细胞中，IL-4诱导Fc-ε的表达。也已发现，γ-干扰素专一性地抑制B细胞上IL-4诱导Fc-ε的表达。
对Fc-ε受体诱导的测定方法，最初是对BCGF的测定开始的，也就是得到纯的B细胞，然后它再用抗-IgM-抗体（等抗原）进行刺激，并接触IL-4。最后测定细胞对Fc-ε受体的活性。
已有几种测定方法来定量细胞表面的Fc-ε受体，如Yodoi    and    Ishizaka，J.Immunol.122：2577-2583（1979）;Hudak    et    al.，J.Immunol.Meth，84，11-24（1985）;和Bonnefoy    et    al.，J.Immunol.Meth.88：25-32（1986），特别是Fc-ε受体能够用对此受体专一的标记单克隆抗体通过流动细胞计数器，如用Becton    Dickinson    FACS-Ⅳ等仪器进行测量。Fc-ε受体专一的单克隆株可以用常规技术来构建。
F、IgGl和IgE的诱导作用。
在脂多糖（LPS）-活化的B细胞中，IL-4诱导IgE和IgG同型抗原的分泌，例如Coffman    et    al，J.Immunol.，136：4538-4541（1986）;Sideras    et    al.，Eur.J.Immunol.，15：586-593（1985）。这些活 性都能用对抗体同型抗原的标准免疫测定法进行测量，正如Coffman    et    al.，J.Immunol.，136：949-954（1986）所叙述的。简短地说，例如把B细胞同大约4μg/ml鼠伤寒沙门氏菌的LPS（从Sigma公司可以得到），或约50μg/ml从E.Coli055提取的LPS（前面列出的Sideras    et    al所叙述）一起培养，B细胞就受到LPS的活化。经过4-8天培养之后，收集上清液作测定试验。能够用标准的同型抗原专一的ELISA型测定法来测量各种同型抗原的浓度。作这种测定方法的抗同型抗原的抗体可以在商业上得到，或者能从ATCC得到。
G、细胞团促进因子（CSF）的活性。
为了确定CSF的活性，造血细胞，例如骨髓细胞或胚胎脐带血细胞等制作成单个细胞的悬浮液。然后单个细胞“固定”在含有营养物质和通常牛胚胎血清的半固体（琼脂）粘稠的（如甲基纤维素）培养基上。在有适当的促进因子存在下，各个细胞将增殖和分化。自从最初的细胞被固着之后，当细胞增殖和成熟，发展成细胞团。经7-14天后就能记下这些细胞团，Burgess    A.，Growth    Factors    and    Stem    Cells一书p52-55，Academic    Press，NY.（1984）·（颗粒细胞和吞噬细胞专门应用于生长方面，参看Bradely    T.，and    Metcaff    D.，Aust.J.Exp.Biol.Med.Sci.，44：287-300（1966）和一般可参看Metcalf，D.，Hemopoietic    Colonies，Springer-Verlag，Berlin（1977））。如果需要，提取各别的细胞团，放在显微镜载玻片上，固定，用Wright/Geimsa染色（Todd-Sanford，Clinical    Diagnosis    by    Laboratory Methods，第15版，Davidson    and    Henry编，（1974））。然后能对每个细胞团所存在的细胞类型的形态进行分析确定。
从非血液病病人收集到的骨髓细胞铺在Ficoll上面（Ficoll 400型，Sigma Chemical Co.，St.Louis.Mo），离心（2，000rpm，20分钟），然后移取中间层的细胞。这些细胞在Iscove氏修改过含有10%胚胎牛血清（FCS）的Dulbecco氏培养基中洗涤两次，悬浮在同样的培养基中，使粘着在塑料培养皿上以除去粘着的细胞。不粘着的细胞以105细胞/ml加到含有20%FCS、50μM2-巯基乙醇，0.9%甲基纤维素以及各种浓度的已知含有细胞团促进活性的上清液或待测上清液的Iscove培基中。1ml样品放到35mm培养皿中，在37℃含6%CO2的完全潮湿的空气中培养。培养开始后三天，每个皿加入1单位促红细胞生成素。在10-14天后用倒置显微镜记录颗粒细胞-吞噬细胞细胞团及红细胞的破裂。
肝素中收集的脐带血细胞在2，000rpm离心6分钟，把血浆和红细胞之间界面上的白细胞转移到含有0.17N氯化铵和6%FCS的试管中。在冰浴中放5分钟之后，用4mlFCS把悬浮液铺在下边，在2，000rpm离心6分钟。细胞沉淀用Dulbecco磷酸盐缓冲的生理盐水洗涤，按上述处理骨髓细胞的方法用Ficoll和塑料粘着的步骤，收集低密度不粘着的细胞，以105细胞/培养物的量放在上述的半固体培养基上。
测定结束时，把各个细胞团放置在玻璃片上，用Wright/Giemsa染色后确定细胞的组成。用Luxol亮兰染色法检测嗜酸 性白细胞（Johnson    G.and    Metcalf，D.，Exp.Hematol，8，549-561（1980））。
在这里关于GM-CSF-促进的颗粒细胞生长所用的“促进作用”，意思是在上述测定方法中GM-CSF同IL-4一起使用，比单独使用GM-CSF来促进细胞团生长时，颗粒细胞长得更大。
V、纯化和药物的组分。
本发明在E.Coli中表达的多肽，在酵母或其它细胞中能按照文献中标准方法进行纯化，包括硫铵沉淀、柱层析分部（如离子交换、凝胶过滤、电泳、亲和层析等等）以及最后结晶（一般性技术见“酶的纯化及有关技术”，在Methods    in    Enzymology，22：233-577（1977），和Scopes    R.，蛋白质的纯化：原理和实践，Springer-Verlag.NY.（1982））。一旦部分纯化或纯化为均一时，本发明的多肽就可以用于研究，如作为补加物加到细胞生长培养基内（例如，最低限度的必要培基Eagle，Iscove′s修改过的Dulbecco培养或RPMI1640;从Sigma    Chemical    Company（St.Louis.MO），和GIBCO    Division（Chagrin    Falls，OH）均可得到，或者用作抗原物质诱出专一性的免疫球旦白，可用于免疫测定和免疫萤光染色等方面。（一般方面见Immunological    Methods    VolⅠ，Ⅱ，Lefkovits，I.and    Pernis，B.编，Academic    Press.NY.（1979，1981），和Handbook    of    Experimental    Immunology，Weir，D.编，Blackwell    Scientific    Pub.St.Louis.MO.（1978））。
本发明的多肽也可以用作药物的组成。例如，加强对各种感染的自然防护。这样，具有风湿样关节炎的病人在移植需要时，或具有因癌的化学治疗、老年、免疫抑制剂等等引起免疫缺陷的病人可以用这些多肽作治疗。这种组分单独地或者与内行人很了解的其它药剂一起使用能够选择性地刺激免疫系统的各种成份。特别是，考虑到本发明多肽还有促进活性，这种组分可能还包含其它有免疫反应的因子，如淋巴细胞活素（如IL-1，IL-2，等），任何一种细胞团促进因子、免疫球蛋白等。在需要提高细胞增殖和产生免疫球旦白的情况下（活体内或离体中），也可使用这些多肽。
将这些多肽制备成药物组分。最好是与惰性药物学上可接受的载体一起混合。为制备他们所需合适载体和加工在技术上是很了解的（例如见Remington的Pharmaceutical    Sciences    and    U.S.Pharmacopeia：National    Formulary（国民处方集），Mack    Pub.Company.Easton.PA.（1984））。优先考虑的给药方式是不经消化道的注射，包括采用机械递送系统。
这种药物的组分最好还是以单位剂量的形式，每单位含有适当数量的活性成分。按照特定的使用和活性组成成分的潜在能力，在单位剂量制剂中活性化合物的量可以有所变动，在1μg至100mg范围内调节，如果需要，合成物也能含有其它治疗因子。
剂量可以根据病人的需要、要处理的病情的严重性以及所用的特定物质而有所变动。在这里用的“有效量”这一术语，意思是当考虑剂量时要考虑到这些因子。对一个特定情况，确定合适的剂量是在于技术的熟练程度。一般来说，治疗从较小剂量开始，它比这物质的最佳剂量要小些。然后，剂量稍许提高，直至达到最佳的效果。为方便 起见，每天总剂量可以分开，在一天内分几次给药。
Ⅵ、表达系统。
范围广泛的表达系统（即寄主与运载体的组合）能用来生产本发明的蛋白质和突变型蛋白，寄主细胞可包括细菌、酵母、昆虫和哺乳动物等类型。但并不限于它们。某蛋白质或突变型蛋白的表达达到最佳程度依赖于许多因素，包括（1）所要表达的蛋白质和突变型蛋白的性质，可能表达的产物对某些寄主系统是有毒的。（2）不管是否要翻译后的修饰或什么类型的修饰，例如，所需的糖化作用的程度和种类可能影响到寄主的选用。（3）在该蛋白质或突变型蛋白编码区域两侧的5′端和3′端区域的性质，例如，选择启动子或者与翻译控制有关启动子和/或序列是有效表达的关键。（4）暂时性还是稳定性的表达。（5）表达产物是否容易同寄主细胞和/或培养中的蛋白质或其它物质分离开。（6）表达感兴趣的蛋白或突变蛋白的寄主，是否容易转侵，转侵的效率如何。（7）用来表达感兴趣的蛋白和突变型蛋白的细胞培养物的规模。（8）有兴趣的蛋白或突变型蛋白是否融合在寄主内源性蛋白质如因子之类的一个片段上进行表达。
一般来说，宁愿用原核生物来克隆本发明的DNA序列。操作原核表达系统，提供一般指导的有Maniatis    et    al.，Molecular    Cloning：A    Laboratory    Manual.冷泉港实验室，NY.（1982）;Perbal：A    Practical    Guide    to    Molecular    Cloning，John    Wiley    &    Sons，N.Y.（1984）;Glover    DNA    Cloning：A    Practical    Approach，VolⅠ，Ⅱ（IRL    Press.Oxford.1985）和de    Boer    et    al.，“Strategies    for    Optimizing    Foreign    Gene Expression    in    E.coli，在Genes：Structure    and    Expression一书，Kroon编，（John    Wiley    &    Sons，NY.1983）。例如，E.coli    K12菌株294（ATCC号31446）是特别有用的，可以使用的其它微生物菌株包括如E.coli    B和E.coli    X1776（ATCC号31537）等。当然，举这些例子的意图是例证性的说明，而不是限制性的。
原核生物也可以用作表达。前已提到过的菌株，以及E.coli W3110（Fs-，λ-，原养型，ATCC号27325），枯草杆菌、其它肠道杆菌如鼠伤寒沙门氏菌或S.marcesans赛氏杆菌、各种假单孢菌都可以使用。
一般来说，来自与寄主细胞相容的物种并含有复制子和控制序列的质粒运载体，可与这些寄主结合起来使用。这种运载体普通都携带一个复制位点，以及能在转化细胞中提供表型选择的标记序列。例如，E.coli常常用pBR322作转化，它来自E.coli的一个种（Bolivar，et    al.，Gene，2：95（1977））。pBR322含有氨苄基青霉素和四环素抗性基因，这就为鉴定转化的细胞提供了方便的手段。pBR322和其它微生物质粒也必须含有，或者被修饰后含有可以被微生物用来表达它自身蛋白质的启动子。在重组DNA构建中使用最普遍的这些启动子有β-内酰胺酶（青霉素酶）和乳糖操纵子系统（Chang    et    al.Nature.，275：615（1978）;Itakura，et    al;Science，198，1056（1977）;Goeddel，et    al.，Nature.281：544（1979））和色氨酸（trp）启动子系统（Goeddel，et    al，Nucleic    Acids    Res.，8：4057（1980）; EPO    Appl.Publ.No.0036776）。这些是使用最普遍的，也有发现和使用过其它微生物的启动子，它们的核苷酸序列的细节已发表，这样可使熟练的工作者把启动子序列同质粒运载体连接起来并保留其功能（Siebenlist    et    al.，Cell，20：269（1980））。
除了原核生物之外，真核的微生物象酵母是真核微生物中使用最为普遍的。啤酒酵母中表达，通常所用的质粒是YRp7（Stinchcomb，et al，Nature，282：39（1979）;Kingsman et al.，Gene，7：141，（1979）;Tschemper，et al.，Gene，10：157（1980））。这个质粒已经含有trp1基因，它为在色氨酸中还缺乏生长能力的酵母突变菌株，（如ATCC号44076或PEP4-1）提供了选择的标记（Jones，Genetics，85：12（1977））。作为酵母寄主细胞基因组特征的trp1的损缺，于是通过在缺乏色氨酸情情况下的生长，为检测转化作用提供了一个有效的环境。
酵母运载体中适用的启动序列包括3-磷酸甘油酸激酶的启动子（Hitzeman，et    al.，J.Biol.Chem.255：2073（1980）），或糖酵解酶其它启动子（Hess    et    al.J.Adv    Enzyme.Reg.，7：149（1968），Holland    et    al.，Biochemistry.17：4900（1978）），如醛缩酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶，己糖激酶、丙酮酸脱羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6-磷酸异构酶，3-磷酸甘油酸变位酶，丙酮酸激酶，丙糖磷酸异构酶，磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。在构建合适的表达质粒，在要被表达序列的3′端，把这些基因有关的终止序列，连接到表达质粒上，提 供mRNA的多聚腺苷酸化和终止反应。还具有其转录受生长条件所控制的优点的其它启动子是乙醇脱氢酶2、同型细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢有联系的分解酶类，前面提到过的甘油醛-3-磷酸和麦芽糖、半乳糖利用有关酶（Holland，同上）。含有与酵母协调的启动子、复制起始点和终止序列的任何质粒运载体都是合适的。
除了微生物之外，来自多细胞生物的细胞培养物也有用作寄主的，原则上说，不管脊椎动物或无脊椎动物的任何这种细胞培养物，都是可以工作的。然而对脊椎动物细胞的兴趣最大，并且在近年里在培养（组织培养）中，脊椎细胞的增殖已经发展成常规的手段〔Tissue    Culture一书，Academic    Press，Kruse    and    Patteson编，（1973）〕。有用的寄主细胞系的例子有VERO和Hela细胞，中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系，和W138，BHK，COS7，小鼠骨髓瘤（ATCC、No.TIB19或TIB20）和MDCK细胞系。这些细胞的表达质粒包括有（如有必要）一个转录起始点，位于要表达的基因之前的启动子，并且任何必要的核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷酸化位点和转录终止子序列等。
为了应用于哺乳动物细胞，表达性质粒的控制功能常常由病毒物质提供的，例如，普通使用的启动子是多瘤病毒、腺病毒2来的，最常用的来自猿猴病毒SV40。SV40的早期和后期启动子特别有用，因为这两者含有SV40病毒的复制起始点的一个片断，很容易从病毒中得到（Fiers，et    al，Nature，273：113（1978））。也可以用更短或更长的SV40片段，只要其中含有从HindⅢ位点延伸到病毒复制点BglⅠ切点的大约250bp。只要这种控制序列是与寄主细胞系统相容的，利用与所需的基因序列 正常相联的启动子或控制序列是可能的也是常常所希望的。
复制的起始点可以由运载体的外源的起始点提供，例如来自SV40或其它病毒（如多瘤病毒、腺病毒，VSV，BPV等等），或者内源地由寄主细胞染色体复制机制提供。把运载体整合到寄主细胞染色体内常常就足够了。
在选择适用的寄主细胞作为含有t-PA和DHFR蛋白质的编码DNA序列的运载体的转染时，按所用的DHFR蛋白质的类型，选择寄主是适宜的。如用野生型DHFR蛋白质，就宁可选择缺乏DHFR的寄主细胞，这就允许用DHFR编码序列作标记在缺乏次黄嘌呤、甘氨酸和胸腺嘧啶核苷的选择性培基中成功地进行转染。缺乏DHFR活性的中国仓鼠卵（CHO）细胞系是合适的寄主细胞，这种细胞株按Urlaub    and    Chasin所述进行制备和繁殖（PNAS·U·S·A·77：4216（1980））。
另一方面，如果对MTX结合活性很低的DHFD蛋白质用作控制序列，就不必利用抗DHFR的细胞，因为突变体DHFR是抗氨甲蝶呤的，所以含有MTX的培养基能用作为选择的手段，只要寄主细胞本身是氨甲蝶呤敏感的。能够吸收MTX的大多数真核细胞看来是氨甲蝶呤敏感的。这种有用的一株细胞系是CHO系的CHOK1（ATCC    No·CCL61）。
无脊椎动物的表达系统包括由一种杆状病毒运载体BmNPV感染的家蚕（Bombyx    mori）的幼虫，这已被Maeda    et    al叙述过（in    Nature，315：892-894（1985）和in    Saibo    Koguku，4：767-779（1985）。
实例
下面的实例用来阐述这一发明。运载体和寄主的选择以及试剂的浓度、温度和其它可变因素的含意，所有这些只是例举说明本发明的应 用，因而不要认为是限制。
材料和方法：
T细胞系Cl.Lyl+2-/9，（称为Cl.1）（Nabel.G，Greenberger，J.S.Sakakeeny MA.，and Caaton H.（1981）。PNAS.USA.78：1157-1161）和细胞系GK15-1（由Giedlin M提供，DNA X Research Institute of Molecular and Cellular Biology，Inc，DNAX）以浓度5×105细胞/ml悬浮在PRMI1640，50μM2ME，1%FCS和2μg/mlCon A中24小时。悬浮液收集，贮存在-70℃。
一种克隆的肥大细胞系MC/9（Nabel G.，Call.，SJ.Dvorak H.F.and Cantor.H.（1981）Nature，291：332-334）是从G.Nabel（Dana Farber Concer Institute;DFCI）得到的。肥大细胞系MM3（由R.Coffman.DNAX提供）和Dx-2（从D.Rennick，DNAX取得）的特点是缺乏骨髓单核细胞有关系的标记，存在IgE受体和大小250ng/106细胞浓度水平的组胺。骨髓细胞NFS-60细胞系是由J.Ihle（Frederick Cancer Research Facility;FCRF）提供的。NFS-60细胞系经亚克隆获得一株依赖于IL-3的克隆。T细胞系HT2是从S.Strober（Stanford大学，Palo Alto，CA）获得的;CTLL-2由W.Farrar（FCRF）提供的。肥大细胞的T细胞系生长在PRMI1640，10%FCS，50μM2-ME中补加有重组的IL-3或IL-2。
几株依赖于IL-3的细胞系内组氨水平是用Shore    P.A.et    al方法测定的（Shore    P.A.，Burkhalter    A.，and Conn V.H.，（1959）J.Pharm.Exp.Ther，127：182-186）。T细胞和肥大细胞生长因子的活性是通过〔3H〕-胸腺嘧啶核苷的参入或者Masmann T.所述的比色测定法进行测定的。（Mosmann T.，J.Immunol.Methods;65：55-63（1983））。
从WEHI3上清液纯化的IL-3是由J.Ihle（FCRF）赠送的。重组IL-2，IL-3，GM-CSF和INF-γ都是采用被相应的cDNA克隆转染过的COS-7猴肾细胞上清液形式。依赖促进因子的细胞系中，〔3H〕-胸腺核苷参入最大量的50%时因子的量定义为一单位的IL-2，IL-3或GM-CSF（Rennick D.et al（1985）J.Immunol.，134：910-919）。一单位IFN-γ保护50%的鼠L细胞免受水泡性口膜炎病毒的细胞病理作用（Schreiber R.et al（1982）J.Exp.Med.，156：677-689）。
B细胞按标准方法（Howard    M.et    al.，J.Exp.Med.，155：914（1982）），通过耗尽T细胞及巨噬细胞从小鼠脾细胞的单个细胞悬浮液中制备。这里叙述的纯化的因子是用细胞流动计数分析对它们诱导B细胞上Ia表达的能力，和用Roehn    N.et    al.（J.Exp.Med.，160：679）所述的抗-Ig共同促进作用的测定方法促进B细胞增殖的能力来估量的。
蛋白质的测定是根据UV吸收（28nm或220nm）或用染料结合测定方法作成的标准曲线（Bradford.M.（1976），Annal.Biochem.72：248-254）。用Pellicon    cassette    unit（注）（膜过滤装置）（Millipore公司，Bedford，MA）或（逆相层析之后）在Speedvac（Savant， Farmingdale，NY）（一种减压真空装置-注）进行溶剂蒸发，上清液先被浓缩20倍，再用12%PAGE分离胶，在Laemmli系统中（Laemmli    U，（1970）Nature，227：680-685）进行SDS    PAGE电泳。标记蛋白质是Pharmacia低分子量标准物质（Pharmacia，Uppsala，瑞典）。凝胶作银染色，如Merril，C.et    al所述（Merril，C.et    al.，（1981），Science，211：1437-1438）。为直接估计MCGF和TCGF活性与分子量的关系，对用50mMDTT作过预先还原反应和未作还原反应的样品进行电泳，凝胶切成1毫米的小片，捣碎，蛋白质在4℃过液洗脱到0.5ml补加有5mg/ml清蛋白（Sigma，St.Louis.MO）的测定培基中。
层析在18℃用Pharmacia    FPLC系统进行，FPLC系统装配有Kratos    Spectroflow773型紫外控测器（Kratos，Ramsey，NJ）。阳离子交换层析采用Pharmacia    Mono    S柱（0.5×5cm），它先用50mM磷酸钠盐、1mM    EDTA，pH7.0平衡。相同缓冲液中的上清液加到层析柱上，氯化钠梯度（至1.0M）作洗脱。逆相层析用Pharmacia    C8柱（0.5×2cm）。样品用0.1%TFA稀释到pH2，加到柱上，用含有0.1%TFA的乙腈梯度进行洗脱。
MCGF和TCGF活性的等电点在Pharmacia    mono    P柱（0.5×20cm）上用层析聚焦进行计算。样品在0.025M    bis    tris（pH7.1）的缓冲液中，加样到先与同样缓冲液平衡好的“Mono    P”柱上。流出液的pH不断地用Pharmacia    pH检测仪控测。在注射之前，所有样品都经Millex    GV    0.2μ单位（Millipore）滤器过滤。
从SDS    PAGE或层析来的各分部都测定其能否支持三种细胞系（NFS-60（IL-3），MC/9（MCGF）和HT2（TCGF））。增殖活 性的能力。
为把这因子纯化成均一的，8升Con A-活化的Cl.1上清液在20mM Hepes缓冲液pH7.0中透析，然后通过Pharmacia mono S10/10经过同样缓冲液平衡的阳离子交换柱。活性峰是用盐的线性梯度在0.2M Nacl时洗脱下来。峰内的物质合并，重新在20mM Hepes缓冲液（pH7.0）中透析，加样到已用相同缓冲液平衡过的肝素-葡聚糖柱上，活性峰用盐的线性梯度（最大到2.0M Nacl）洗脱在0.45M Nacl时被洗下。这部分物质再合并，用0.10/TFA/H2O，pH2稀释10倍，在Vydac逆相柱（C4）分部层析。采用乙腈的线性梯度和0.1%TFA，在42%乙腈时活性被洗脱出来。
实例Ⅰ 鼠IL-4cDNA从Cl.Lyl+2-/9细胞的重新制备以及在COS7猴细胞中的暂时性表达。
编码IL-4的cDNA克隆是从鼠的辅助T细胞系Cl.Lyl+2-/9分离的，这株T细胞交给TACC保存，保存号为CRL8179，并已为Nabel叙述过（Cell，23：19-28（1981），和PNAS.，78：1157-1161（1981））。已经知道其它产生BCGF活性的鼠细胞株包括有EL-4系，这可以从ATCC保存号TIB39号得到。在这一实例中所用的步骤已在Lee et al.，PNAS，83：2061-2065（1986）中发表。简单地说，一个pcD cDNA基因库是按照Okayama和Berg（上面已述）的方法用伴刀豆球蛋白A（ConA）诱导的Cl.Lyl+2-/9细胞得到的mRNA来组建的。通过与32p标记的cDNA探针的杂交，从随机选择的克隆的大量次级基因库中除去IL-3和GM-CSF克隆。次级基因库的剩余部分的合并物和/或各别的克隆株，通过转侵COS7猴细胞及测试培养上清液的MCGF和TCGF活性，筛选出IL-4的cDNA。 A.诱导产生IL-4
Cl.Lyl+2-/9细胞按如下方法用ConA诱导，产生IL-4mRNA。细胞以5×105/ml的浓度培养在Dulbecco修改过的Eagles培养基（DEM）中补加4%热失活的牛胚胎血清，5×10-5M2巯基乙醇（2-ME）2mM胍，非必需氨基酸，必需维生素和2从g/ml ConA。在10%Co2中37℃经12-24小时培养后，细胞悬浮液在1500rpm离心10分钟，收集细胞沉淀，立即在-70℃冰冻。
B.mRNA的分离
细胞总RNA是采用Chirgwin et al的异硫氰酸胍的方法从细胞中分离的（Chirgwin.J.et al.，Biochemistry，18：5294-5299〔1979〕）。从ConA诱导的Cl.Lyl+2-/9细胞（刺激12小时后）来的冰冻的细胞沉淀，是浮在异硫氰酸胍裂解液中的，每1.5×108细胞用20ml的裂解液。沉淀用吸液管悬浮，然后通过有16号针头的注射器4次，DNA被剪切断，在40ml异质同晶聚合物的离心管中，把裂解物铺在20ml5.7M CsCl，10mM EDTA液的顶部，这溶液在Beckman SW28离心转头上，25000rpm离心40小时，15℃。含有DNA的异硫氰酸胍相，用吸管从顶部吸出直到中间层。管壁和中间层用2-3ml异硫氰酸胍裂解液洗涤。用剪刀剪下中间层以下的离心管，CsCl溶液被倾去。RNA沉淀用70%冷乙醇洗两次。沉淀再悬浮在500μl10mM Tris.HCl.PH7.4-10mM EDTA-0.05%SDS中。加入50μl3M乙酸钠，RNA用l ml乙醇沉淀。大约0.3mg总RNA离心收集、沉淀再用冷乙醇洗一次。
洗过后干燥的总RNA沉淀被悬浮于900μl寡聚（dT）的洗脱缓冲液（10mM Tris·HCl，PH7.4-l mM EDTA-0.5%SDS）。RNA在68℃加热3分钟，然后在冰中冷却，加100μl 5M NaCl。RNA样品加到1.0ml寡聚（dT）纤维素柱上（3型，Collaborative Research，Waltham，MA）此柱用结合缓冲液平衡（10mM Tris.HCl，pH7.4，l mM EDTA，0.5M NaCl，0.5% SDS）。柱上的流过液再在柱上经过两次，此柱用20ml结合缓冲液洗涤。多聚A+mRNA用洗脱液洗涤收集。RNA通常都是在前2ml洗脱液中洗脱下来的。RNA用0.1倍体积的3M乙酸钠（PH6）和2倍体积的乙醇进行沉淀。离心收集RNA沉淀。用乙醇洗两次，干燥，然后沉淀再重新悬浮在水里。取1份样品作稀释，测定260nm时的吸收光谱。
C.PCD    CDNA基因库的构建
1.运载体的引物和寡聚（dG）末端的接头DNA的制备。
采用了OKayama和Berg的步骤（MOl.&    Cell.Biol.2：161-170〔1982〕），只有较少修改。质粒PcDVl和PLl被Okayama    &    Berg叙述过（Mol.&    Cell.Biol.3：380-389〔1983〕），可以从Pharmacia公司（Piscataway，N.J.）得到。明确地说，采用了一种修改过的PcDvl质粒，它在KpnI位点的原先位置上含有一个NsiI切点。
80μg PCDVl DNA样品用20单位KpnI限制性内切酶在450μl反应混合液中水解，30℃，此反应混合液含有6mM Tris-HCl（pH7.5）-6mM MgCl2-6mM NaCl-6mM 2 -ME-0.1mg/ml牛血清白蛋白（BSA）。16小时后，用40μl 0.25M EDTA（pH8.0）和20μl10%SDS终止水解反应;用水饱和的1∶1苯酚-氯仿（在以后写作苯酚-氯仿）抽提，然后乙醇沉淀回收DNA。均聚体尾巴平均长60（核苷酸），但不少于80，每个末端的脱氧胸腺核苷酸（dT）残基用牛胸腺末端转移酶按如下步骤加到NsiI内切酶产生的末端上。反应混合物（38μl）含有二甲胂酸钠-30mM Tris·HCl（pH6.8）作为缓冲液，有1mM CoCl2，0.1mM DTT，0.25mM dTTp，NsiI酶解过的DNA，和68单位末端脱氧核糖核苷酸转移酶（P-L Biochemicals，Inc.，Milwaukee，WI）。在37℃30分钟之后，反应用20μl 0.25M EDTA（pH8.0）和10μl10%SDS进行中止，DNA经苯酚-氯仿几次抽提后用乙醇沉淀回收。然后这DNA用15单位EcoRI内切酶在50μl含有10mM Tris·HCl.pH7.4-10mM MgCl2-1mM DTT-0.1mg/ml BSA的溶液中在37℃水解5小时，含SV40多聚腺苷酸化位点，DNA复制起始点和抗氨苄基青霉素的基因的大片段，用琼脂糖（1%）凝胶电泳进行纯化，又用修改过的玻璃粉方法（Vogelstein，B.& Gillespie，D.，PNAS.76：615-619〔1979〕）回收。有dT末端的DNA吸附在寡聚（dA）-纤维素柱上并洗脱，作进一步纯化，方法如下：DNA溶于1ml10mMTris·HCl（pH7.3）缓冲液（含有1mM EDTA和1M NaCl），在0℃冷却，在0℃加样到用同样缓冲液平衡过的寡聚（dT）-纤维素柱（0.6×2.5cm）上，再用水在室温下洗脱。洗脱的DNA用乙醇沉淀。并溶于10mM Tris·HCl.（pH7.3）-1 mM    EDTA中。
连接有寡聚（dG）末端的DNA的制备是：75μg pLI DNA用20单位PstI内切酶在450μl含有6mM Tris·HCl.（pH7.4）-6mM MgCl2-6mM 2-ME-50mM NaCl和0.01mg/ml BSA的溶液中水解。30℃，16小时后，反应混合物用苯酚-氯仿抽提和乙醇沉淀。然后除了用0.1mM dGTP代替dTTP外与上述相同的反应混合液（38μl）中用46单位末端脱氧核糖核酸转移酶加上10-15个脱氧鸟核苷酸（dG）残基的尾巴到每个末端，37℃经20分钟，反应混合物用苯酚-氯仿抽提，DNA经乙醇沉淀后，在50μl含有20mM Tris·HCl，pH7.4-7mM MgCl2-60mM NaCl-0.1mg/ml BSA的溶液中用35单位HindⅢ内切酶水解4小时，37℃。小分子的寡聚dG-尾巴的接头DNA用琼脂糖凝胶（1.8%）电泳纯化，再如上述方法回收。
2.cDNA基因库的制备：
步骤1：cDNA的合成。
反应混合物（10μl）含有50mM Tris·HCl，pH8.3-8mM MgCl2-30mM KCl-0.3mM DTT-dATp，dTTp，dGTp和dCTP各2mM-20μCi32P-dCTP（3000Ci/mmole）-3μg多聚A+RNA（来自ConA诱导下的T细胞）-60单位RNasin（商品名称，一种核糖核酸酶的抑制剂，Promega Biotec、Inc.Madison，WI），-2μg运载体的引物DNA（15Pmole的运载体核苷酸末端）-45单位反转录酶。反应在42℃培养60分钟，然后加1μl0.25M EDTA（PH8.0）中止反应， 加入0.5μl10%SDS和40μl苯酚-氯仿，溶液在Vortex混合器上强烈混合，再离心。在EPPendorP管中水相中加40μl4M乙酸铵和160μl乙醇溶液，在干冰中冷冻15分钟，轻轻地振动回温到室温，使得未反应在冰冻时已经沉淀下去的脱氧核糖核苷三磷酸溶解，离心10分钟，沉淀溶解于10μl10mM    Tris·HCl，PH7.3和1mM    EDTA，与10μl4M乙酸铵混均，用40μl乙醇重新沉淀，这一步骤使得99%以上未参与反应的脱氧核糖核苷三磷酸除去。沉淀用乙醇漂清。
步骤2：加上寡聚脱氧胞苷酸（oligo〔dc〕）。
含有质粒-cDNA：mRNA的沉淀溶于20μl140mM二甲胂酸钠-30mM Tris·HCl，pH6.8溶液，还含有1mMCoCl2-0.1mM DTT-0.2μg多聚（A）-70μM dCTP-5μCi32P-dCTP（3000Ci/mmole）-60单位末端脱氧核糖核酸转移酶。反应在37℃进行5分钟，允许每末端加上10-15个dCMP残基，然后用2μl0.25M EDTA（PH8.0）和20μl苯酚-氯仿结束反应，水相与20μl4M乙酸铵混合，DNA用80μl乙醇沉淀和再沉淀，最后的沉淀用乙醇漂清。
步骤3：用限制性内切酶HindⅢ水解。
沉淀溶解于30μl缓冲液，其中含有20mM Tris·HCl，PH7.4-7mM MgCl2-60mM NaCl-0.1mg/ml BSA，然后用10单位HindⅢ酶在37℃水解2小时。反应用3μl0.25M EDTA（PH8.0）和1.5μl10%SDS结束反应，在用苯酚-氯仿抽提之后，加入30μl4M乙酸铵，DNA用120 μl乙醇沉淀。沉淀物用乙醇漂洗干净，再溶解于10μl10mM    Tris·HCl（pH7.3）和1mM    EDTA中，加3μl乙醇以防止在-20℃贮存时冰冻。
步骤4：有寡聚（dG）尾巴接头的DNA进行环化。
9μl HindⅢ内切酶水解过的寡聚（dC）尾巴的cDNA：mRNA质粒的样品（大约90%的样品）在一个90μl的混合物中65℃保温5分钟，此混合物含有10mM Tris·HCl，pH7.5-1mM EDTA-0.1M NaCl-1.8pmol寡聚（dG）尾巴接头DNA，移到42℃再60分钟，然后冷却到0℃。此混合物（90μl）被调到900μl体积，含有20mM Tris·HCl，pH7.5-4mM MgCl2-10mM（NH4）2SO4-0.1M kCl-50μg/ml BSA-0.1mMβ-NAD，加入6μg E.coli DNA连接酶，然后溶液在12℃培养过夜。
步骤5：RNA链被DNA取代。
为取代插入的RNA链，连接反应混合物被调到含有四种脱氧核苷三磷酸各40μM，0.15mM    β-NAD，4μg补加的大肠杆菌DNA连接酶，16单位大肠杆菌DNA聚合酶I（POl.I）和9单位大肠杆菌RNase    H。混合物（960μl）在12℃和室温下连续保温各1小时，以促使最佳的修复合成和POl.I的缺口翻译。
步骤6：大肠杆菌的转化。
转化反应用Cohen    et    al.所述步骤稍加一点变动来完成的（PNAS.U.S.A.，69：2110-2114〔1972〕）。大肠杆菌K-12菌株MC1061（Casadaban    M.and    Cohen    S.，J. Mol.Biol.138：179-207〔1980〕）。在300μl-肉汤中37℃生长到A600nm为0.5。细胞离心收集。悬浮在30ml10mM Pipes（pH7.5）-60mM CaCl2-15%甘油中，在0℃离心5分钟。细胞悬浮在24ml上述缓冲液中，再在0℃培养5分钟;然后，1.0ml的细胞悬浮液与0.1ml这种DNA溶液（步骤5）混合，在0℃培养20分钟。下一步把细胞保持在42℃2分钟，然后室温下10分钟;再加入1升L-肉汤，培养物在37℃培养60分钟。加入氨苄基青霉素到浓度50μg/ml。培养物在37℃再振荡10小时。培养物稀释涂布在含有50μg/ml氨苄基青霉素的L-肉汤琼脂上。在37℃培养12至24小时之后，用灭过菌的牙签挑出各个菌落。一共得到大约1×105独立的菌cDNA。
D.筛选PcD基因库。
从T细胞cDNA基因库随机地挑选出104个克隆，分别在含有200μl补加有50μg/ml氨苄基青霉素和7%二甲亚砜的L-肉汤培养基中繁殖。为了把注意力只集中到非常好的MCGF活性上，用Lee et al（PNAS，82：4360-4364〔1985〕），和Yokota et al（PNAS，81：1070-1074〔1984〕）发表的克隆建成的32P适当标记的cDNA探针进行杂交，53株IL-3 cDNA克隆和1株GM-CSF cDNA克隆作鉴定，并进行淘汰。这步骤进行如下：有96个培养物的一个平板复制到硝基纤维素滤膜上进行杂交筛选。杂交在6×SSPE-0.1%SDS-100μg/ml E.Coli tRNA-50%甲酰胺中，42℃进行16小时（1×SSPE＝180mM NaCl，10mM磷酸钠盐，PH7.4，1mM EDTA）。杂交 的克隆由洗涤过的滤膜的放射自显影来鉴定。在制备克隆合并物之前，用乙醇使含有这些克隆的微量滴定小室灭菌，除去这些克隆。从微量滴定的小室的培养物制成含有48个cDNA克隆的合并物，200个这种合并物生长在1升含有100μg/ml氨苄基青霉素的L-肉汤培养物里。从每个培养物分离质粒的DNA，并通过CsCl梯度离心，两次形成离心带获得纯化。代表每个合并物的DNA如下所述都转化到COS7猴细胞里，（COS7细胞Gluzman讨论过，Cell，23：175-180〔1981〕，可以从ATCC登记号CRL1651得到）。
在转染之前一天，大约106COS7猴细胞接到100毫米培养皿里含有10%胚胎牛血清和2mM谷氨酰胺的DME中。为实现此转染反应，从每个培养皿吸出培基，再换4ml含有50mMTris·HCl，PH7.4-400μg/ml DEAE-葡聚糖和50μg要试验的质粒DNA的DME。培养皿在37℃培养4小时。然后除去含有DNA的培养，用5ml无血清的DME洗两次。含有150μM氯奎的DME重新加到培养皿中，然后这个培养皿在37℃再另外培养3小时。培养皿用DME洗一次，加入含有4%牛胚胎血清、2mM谷氨酰氨、青霉素和链霉素的DME。细胞再在37℃培养72小时。收集生长的培养基，以各种生物测定方法进行测定。
最初的一套质粒合并物主要是用HT-2细胞系和MC/9细胞系分别对TCGF和MCGF作增殖的测定来筛选的。最初的110个合并物在这二个细胞系上测定，8株在HT-2TCGF测定中产生了明显的活性。有几个合并物有微弱而明显的MCGF活性，但因为MCGF活性一般较弱而且有较多的变化，所以我们不依靠这种测定方法来确定有正反应的合并物。
从随机合并物感染的大约一半COS上清液也测定了对小鼠B细胞Ig诱导的活性。在所试验的合并物中，每个表明对TCGF活性有作用的合并物，都发现也有Ia-诱导活性。这样在TCGF活性和Ia诱导活性之间有一种不容置疑的相关性。
一个合并物，2A，在所有测定中重复性很好，最有活性，它再分为48个较小的亚合并物。两个亚合并物对MCGF和TCGF活性都表现为正结果。单个克隆2A-E3，是这两个亚合并物所共有的，它们单独地生长，质粒DNA按上所述转染到COS7细胞内。所产生的COS上清液测定各种活性存在情况，包括MCGF、TCGF、Ia诱导、IgE-和IgG增强的活性。
366碱基对长度的PSt片断从克隆2A-E3（图1A）分离出来，并用32P标记作为探针，筛选生物活性已是反结果的合并物和其它未试过的合并物。如上所述，这种筛选是从微量滴定板内培养物复制的滤膜上作杂交来完成的。分离到9株杂交的克隆，它们的DNA用限制内切酶酶切图谱来分析。所有表现出生物学活性的合并物含有至少一个杂交的克隆，它同克隆2A-E3有共同的限制性内切酶酶切图谱。在挑出来的104个克隆中，杂交克隆的频度推测是总的基因库的约0.2%。在所试验的杂交克隆中约90%表现了有功能的蛋白质。
E.PCD-2A-E3转染的COS7猴细胞培养物上清液的生物学活性。
PCD-2A-E3转化的COS7细胞的上清液，在鼠辅助T细胞系HT-2上试验它的TCGF活性，这已被Watson叙述过（J. Exp.Med.，150：1510〔1979〕）。HT-2细胞的增殖，是用Mosmann（上面已提到过）的比色测定方法确定的，是作为TCGF活性的测量（增殖的程度是同570至630nm时的光吸收（OD）有关的）。图3A描述了各种稀释度时的TCGF相对活性：（ⅰ）用PCD-2A-E3感染的COS7细胞的上清液（曲线1），（ⅱ）Cl.Lyl+2-/9培养物的上清液（曲线2），（ⅲ）用带有IL-2cDNA的pcD质粒转染的COS7细胞上清液，（ⅳ）用不含有cDNA插入片段的pcD质粒转染的COS7细胞上清液（也就是“空”的转染）（曲线4）。
类似地，从pcD-2A-E3转染的COS7细胞来的上清液在MC/9细胞上试验MCGF活性，再用Mosmann比色测定方法测量MC/9的增殖。图3B描述了下列的MCGF相对活性：（ⅰ）用pcD-2A-E3转染的COS7细胞上清液（曲线1），（ⅱ）用带有IL-3cDNA的pcD质粒转染的COS7细胞的上清液（曲线2），（ⅲ）Cl.Lyl+2-/9细胞来的上清液，（ⅳ）空转染的COS7细胞上清液（曲线4）。
图3C描述了在下列上清液上进行Ia诱导的结果：（ⅰ）pcD-2A-E3转染的COS7细胞的上清液（曲线1），（ⅱ）Cl.Lyl+2-/9上清液（曲线2），（ⅲ）空转染的COS7细胞的上清液（曲线3）。Ia诱导测定方法如Roehm et al.（上面已列举）所述。几只DBA/2小鼠（2-3个月龄）被提供用外科手术得到脾脏。红细胞用0.87%氯化铵的低渗休克来裂解。然后T细胞采用针对T细胞特异性的表面标记（Thy-1.Lyt-1和Lyt-2）的细胞毒素单克隆抗体进行裂解，接着培养在家兔的补体中。 死了的细胞再用Ficoll-hypaque密度梯度除去。粘着的细胞通过在37℃粘着在塑料培养皿上预先已经除去。这时洗涤细胞，记数，并记录其成活率。在0.5ml补充有10%牛胚胎血清，2-巯基乙醇和各种抗菌素（青霉素，链霉素和庆大霉素）。由T细胞促细胞分裂剂伴刀豆球蛋白A诱导的T细胞上清液构成的正控制实验中，加入α-甲基甘露糖苷中和促细胞分裂剂。经24小时培养后，收集细胞并准备用抗-I-Ad或抗-I-Abd单克隆抗体染色。这些抗体用作为结合到半抗原N.I.P.上或生物素上的第一阶段抗体。然后细胞同荧光素的第二阶段试剂（抗-NIP抗体或抗生素蛋白）一起保温，完成染色过程。荧光染色的强度是用荧光活化的细胞分析器（Becton-Dickinson.Mountain View，CA）或细胞荧光照相术（Ortho Diagnostics，Cambridge，MA）来确定的。图3C中荧光单位是每个样品中正反应细胞的百分数乘以荧光染色的强度来计算的。
图3D图示了T细胞耗尽了的小鼠胰脏细胞中，（Ⅰ）单独由COS7的培基（曲线1），（Ⅱ）从空转染的COS7细胞的20%上清液（曲线2），（Ⅲ）Cl.Lyl+2-/9细胞的10%上清液加空转染的COS7细胞来的20%上清液（曲线3），（Ⅳ）pcD-2A-E3转染的COS7细胞的20%上清液（曲线4）诱导产生IgE和IgGl的程度。IgE和IgGl的水平是用上述同型抗原专一的ELISA确定的。
发现鼠IL-4增强了MC/9细胞中IL-3的MCGF活性：Smith    and    Rcnnick，PNAS，83：1857-1861（1986）。也发现IL-4增强了依赖IL-3的细胞系NFS- 60的GM-CSF促进的增殖作用。（Holmes    et    al.叙述过，PNAS，82：6687-6691（1985））。
F、pcD-2A-E3的结构及其cDNA插入片断的核苷酸序列。
pcD-2A-E3的结构示于图2A，扩大的限制性内切酶酶切图谱示于图2B。插入片断用Maxam和Gilbert方法（Methods    in    Enzymology，Vol.65，p499-560（1980））和Sanger方法（PNAS，74：5463-5467（1977））作序列分析。图1表示这个序列以及从第一个起始密码子为ATG的最长开放性阅读框架的相位所推论的氨基酸序列。在小鼠2A-E3cDNA中唯一长的开放阅读框架是由140个氨基酸残基构成的。由于这淋巴激活素是一种分泌蛋白，应该预期在蛋白质的成熟分泌型序列之前有一亲水的前导序列。多肽疏水性分析以及同信号肽加工所假设的共同顺序（Perlman    et    al.，J.Mol.Biol.，167：391-409（1983））作比较，推测前体多肽断裂位置应该出现在图1A氨基酸位置20的丝氨酸残基之后。Grabstein    et    al.（J.Exp.Med.，163：1405-1414（1986））已经肯定了鼠分泌的IL-4N端序列是在图1A第21位His上开始的。
实例Ⅱ、通过对于人辅助T细胞cDNA基因库的鼠cDNA探针，制备人的IL-4，及其在COS7猴细胞和小鼠L细胞中暂时性表达。
给IL-4编码的cDNA基因库，是从一个诱导的人辅助T细胞2F1和诱导的人外周血淋巴细胞（PBLs）构建的cDNA基 因库中，用鼠的cDNA探针分离出来的。其它已知产生BCGF活性的人细胞系包括CME系的各种变异株，它们可以从ATCC登记号CCL119，CRL8436和TIB195获得，并被Foley    et    al.（Cancer，18：522-529（1965））和Ligler（Lymphokine    Research，3：183-191（1984））阐述过。
人辅助T细胞克隆2F1和人PBLs生长在补加3%牛胚胎血清的Iscove培基中。2F1细胞用ConA（10μg/ml）活化，PBLs可用1μg/mlPNA刺激12小时，之后补加5μg/ml    ConA。在加入ConA之后4小时收集2F1细胞，10小时后收集PBLs细胞。
mRNA的提取和cDNA基因库的构建如实例Ⅰ所述。PstⅠ片段从小鼠pcD-2A-E3cDNA克隆中分离，用缺口翻译进行标记（1×108cpm/μg），用来测硝基纤维素滤膜，硝基纤维素滤膜上含有10个合并物的质粒DNA制备物，每个合并物大约有1×103个2F1cDNA基因库的克隆。使用严格程度低的杂交条件（在42℃过夜）：6×SSPE（1×SSPE＝180mM NaCl/10mM磷酸钠盐，pH7.4/1mM EDTA）（Maniatis T.，et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual（冷泉港实验室，N.Y.1982）），20%（v/v）甲酰胺，0.1%SDS，酵母载体tRNA为100μl。此滤膜用2×SSPE，0.1%SDS在37℃洗涤。
10个合并物之中的1个。鉴定了一株克隆（pcD-46）。另外的克隆都是用从pcD-46的NheI-EcoRI片段（在 图2D的限制性内切酶图谱中已有描述）构建的探针来筛选PBL    cDNA基因库而获得的。限制性内切酶的分析指出，PBL克隆在结构上是同pcD-46一样。
已发现在pcD-46编码区域插入片断的5′端或者上游方向富有乌嘌呤的区域抑制了IL-4多肽的表达。结果，重新克隆pcD-46的插入片段，除去了富乌嘌呤的区域。得到的克隆定名为pcD-125。也发现用pcD-46转染小鼠L细胞会改进它的表达。
运载体pcD-125的形成如下：pcD-46用Sau3A酶切，分离含有cDNA插入片段5′端162个核苷酸的片段（消去了GC片段），然后这个片段插入到p101的BagⅢ位点内。质粒p101来自pcD-小鼠IL-3（见上面列出的Yokota    T.et    al.，（1984）），缺少cDNA5′端的PstⅠ位点到小鼠IL-3cDNA内BgLⅡ位点的序列。BgLⅡ位点是包含在缺失序列的接头处。象在pcD-46那样，除了GC段落之处，Sau3A片段融合到SV40的启动子上。人的cDNA其余部分再同pcD-46的HindⅢ/NheⅠ片段重新组建，这HindⅢ/NheⅠ片段带有cDNA的3′末端，SV40的多聚A部位和pcD-46内所有的pBR322序列。
pcD-46及pcD-125转染的COS7和L细胞的上清液测定其BCGF及TCGF活性。TCGF还用EB病毒（Epstein-Barr病毒）转化的人辅助T细胞系JL-EBV和植物凝集素促进的人外周血液淋巴细胞进行测定。
人辅助T细胞克隆JL-EBV，用人的EBV-转化的B细胞 系受辐射照射（4500R）的细胞进行促进，然后保存在含有10%人AB血清，50μM2-巯基乙醇（2ME）和重组的人IL-2的RPMI1640培基内。人的PBLs用PHA（20μg/ml）促进再保存在含有10%牛胚胎血清，50μM2ME和重组的人IL-2的RPMI1640培基中。促进作用之后5至10天，JL-EBV细胞或PHA的破碎，是用Mosmann比色法在二天里测定TCGF（上面已叙述）或者用3H-胸腺核苷参入的在三天里测定TCGF的对象。
图4A描述了下列上清液用JL-EBV细胞比色法）所测量的TCGF活性：（Ⅰ）用表达人的IL-2的pcD质粒转染的COS7细胞上清液，（曲线A），（Ⅱ）用pcD-125转染的L细胞上清液（曲线B），（Ⅲ）用pcD-125转染的COS7细胞的上清液（曲线C），（Ⅳ）用pcD-46转染的COS7细胞上清液（曲线D），（Ⅴ）空转染的COS7细胞的上清液（曲线E）。图4B描述了下列上清液用PHA促进PBLs（比色法测定）所测量的TCGF活性：（Ⅰ）用表达人IL-2的pcD质粒转染的COS7细胞上清液，（曲线A），（Ⅱ）用pcD-125转染的COS7细胞上清液（曲线B），（Ⅲ）空转染的COS7细胞上清液（曲线C）。图4C描述了下列上清液用PHA促进PBLs所测量的TCGF活性（3H-胸腺核苷参入试验方法）：（Ⅰ）用pcD-125转染的COS7细胞上清液（曲线A），（Ⅱ）用表达人IL-2的pcD质粒转染的COS7细胞上清液（曲线B），（Ⅲ）空转染的COS7细胞上清液（曲线C）。
pcD-125转染上清液各种稀释度的BCGF活性可与 Maizel    et    al所述的一种BCGF（“商品的BCGF”）的BCGF活性相比较（PNAS.79：5998-6002，（1982）和商业上可从Cytokine    Technology    International（Buffalo，NY）获得）。表Ⅱ描述了COS7转染上清液的各种稀释度，对于用抗-IgM抗体预先活化过的B细胞上的BCGF活性。B细胞的制备如上面关于方法一节所述。
表Ⅱ、IL-4cDNA转染上清液对已用抗-IgM-
预先活化过的B细胞的作用
加入上清液3H-胸腺核苷的参入（cpm）
%（v/v）    空转染    克隆125    空转染    克隆125
+10%BCGF    +10%BCGF
0    278    278    1835    1835
0.2    189    144    1362    2303
1    323    1313    1699    3784
5    408    4314    1518    7921
15    397    4289    1093    8487
表Ⅲ.IL-4cDNA转染上清液对SAC预先活化的
B细胞的活性
加入上清液3H-胸腺核苷参入（cpm）
%（v/v）    空转染    克隆125    空转染    克隆125
+10%BCGF    +10%BCGF
0    2237    2237    12992    12992
0.2    1789    2682    13126    5655
1    740    2374    13714    6765
5    1285    2826    5848    10023
15    1560    4701    10128    10924
表Ⅲ描述了COS7转染上清液各种稀释度，对于已用SAC预先活化的B细胞（制备见上述）的BCGF活性，尽管本发明的人IL-4和商品来源的BCGF两者都表现出BCGF活性，但Mehta    et    al.，（J.Immunol.，135：3298-3302（1985）证明了TCGF活性在生化上能够与商品BCGF的BCGF活性分离开来，指出这些活性是由分开的不同蛋白质造成的。这样，人IL-4和商品的BCGF是不同的分子，因为TCGF活性同人的IL-4中的BCGF活性用标准的生化分部技术都是不可分开的。
携带人IL-4cDNA的质粒转染的COS7细胞上清液诱导了正常人的T细胞和T细胞克隆株JL-EBV的增殖，这是类似于小鼠IL-4的活性。对人IL-4的反应中，人T细胞增殖的最大诱导程度大约是人IL-2诱导的一半。IL-4的诱导增殖的活性， 当试验时，不受IL-2的单克隆抗体和IL-2的受体抑制。这些结果使人们认为IL-4是直接作用于T细胞，而不是以诱导IL-2的途径来起作用的，并且它的作用不是通过IL-2受体来传达的。COS-人IL-4的上清液也促进了用最佳浓度在小珠上被抗-IgM抗体预先活化的人B细胞的增殖，并且用BCGF测量达到饱和水平的商品BCGF，上清液具有另外的增殖活性。这暗示了人IL-4和商品BCGF以不同途径作用于B细胞的，也就是可能由不同的一套受体起着作用的，上清液不是明显地诱导用BAC预先活化过的B细胞增殖，而受PHA刺激的PBL培养物上清液纯化的商品BCGF，却强烈地诱导了SAC预先处理的人B细胞增殖。这些结果进一步指出，人IL-4cDNA编码了BCGF活性，而这种活性有别于商品BCGF中存在的活性。
pcD-125转染的COS7细胞上清液，也试验了它诱导扁桃腺B细胞上Fc-ε受体的能力。人扁桃腺细胞用标准技术分散成单个细胞悬浮液。B细胞群体用上面叙述的方法进行浓缩。浓缩的细胞用抗-IgM抗体在37℃培养基中处理24小时。借助于Bonnefoy    et    al（J.Immunol.Meth.，88：25-32（1986））公布的技术，用对受体专一的荧光标记的单克隆抗体，带有Fc-ε受体的细胞在Becton    Dickinson    FACS    Ⅳ细胞分类器中进行检测。图5A-5D是说明细胞频度（纵坐标）对荧光强度（横坐标）的图示。荧光强度与细胞上存在的Fc-ε受体的数量成比例，在所有这些图示中，细胞都已用抗-IgM处理过了。图5A-5D相当于细胞接触到由pcD-125转染的COS7细 胞的0%，0.1%，1%和10%上清液构成的培养基。
克隆No.46的cDNA插入片段的DNA序列已被测定，示于图1B中。cDNA插入片段的长度615bp，包括多聚A尾巴，有一种开放阅读框架，第一个ATG密码子位于5′端64核苷酸处，接下来是153个密码子，在核苷酸位置523-525是终止密码TAG。正如对分泌蛋白所预期的所预示的多肽的N末端区段是疏水性的。
本发明的人和小鼠cDNA的编码区域之间的比较揭示，pcD-46中人的cDNA编码序列的区域包括氨基酸第1-90和129-149的位置，同小鼠cDNA（2A-E3）编码序列的相应区域共有大约50%的同源性。这些区域和5′，3′非翻译区域，在不同生物来的两种cDNA序列之间共有大约70%的同源性，而人蛋白质的第91-128氨基酸（复盖）相应区域与小鼠的这一区域之间同源性就很有限。总起来说，人蛋白质内7个半胱氨酸中的6个在小鼠相应蛋白中被保存。在本发明的人的自然形式的多肽和小鼠IL-3之间存在有某些氨基酸序列的同源性。氨基酸残基7-16和120-127与小鼠IL-3前体多肽（Yokota，T.et    al.，PNAS.USA.81：1070-1074（1984））的残基16-27和41-49之间分别有50%和55%的同源性。
正如下面更详细地叙述的，从pcD-125转染的COS7上清液纯化的人IL-4发现是129氨基酸的多肽，其序列示于图1C。
实例Ⅲ用Ebstein-Barr病毒（EBV）派生的含有RSV-LTR启动子的运载体在cos7猴细胞中增强表达人白细胞介素4
通过把pcD-125的Xhol片段再克隆入含有Rous肉瘤病毒长末端重复序列（RSV-LTR）启动子的EBV派生的运载体，人白细胞介素4的表达可增强10～20倍，EBV派生的运载体和RSV-LTR启动子由Gorman等（Proc    Natl    Acad    Soi，79：6777-6781，1982）和Yates等（Nature，313：812-815，1985）叙述。
一个含有RSV-LTR启动子的HindⅢ/XhoⅠ片段从以前组建的pcD质粒中提取到，该质粒系由Gorman等（见前註）叙述的含有RSV-LTR的AccⅠ/HindⅢ片段和市售的bcD运载体（例如：从phavmacia公司）组建而成。上述HindⅢ/XhoⅠ片段，和含有SV40复制起点（ori）的L1质粒（Pharmaeia公司）的HindⅢ/XhoⅠ片段拼接入质粒poDVI（可由Pharmaoia公司得到）。这里，SV40复制起点（ori）的取向并不重要，所得到的pcD质粒，在其AatⅡ和NdeⅠ位点间，按顺序（从AatⅡ位点起）含有：SV40ori区、RSV-LTR启动子和SV40的polyA区，当pcD-125的XhoⅠ片段被提取出来并插入新组建的bcD运载体之后，用标准技术将运载体上单一的AatⅡ和NdeⅠ位点转变成SalⅠ位点简单地说，pcD运载体被AatⅡ及NdeⅠ酶解，含有白细胞介素4的片段提取出来，在有合适浓度的核苷三磷酸存在的情况下用T4DNA聚合酶处理。T4DNA聚合酶的5′→3′DNA聚合酶活力将限制切点的5′-突出端补齐，T4DNA聚合酶的3′→5′外切 酶活力将限制切点的3′-突出端切除，从而得到平端片段，用T4DNA连接酶将其与激酶作用过的SalⅠ连接子（New    England    Biolabs）相连接。
上述SalⅠ片段（如图11所示），于用标准技术转变为SalⅠ位点的单一ClaⅠ位点处插入EBV衍生的运载体p201中（见yates等叙述，见前註）。简短地说，p201（如图11所示）为ClaⅠ酶解，用DNA聚合酶Ⅰ（Klenow片段）和合适浓度的核苷三磷酸处理。这一步将ClaⅠ切得的突出末端补齐成平端片段，所得到的含有RSV-LTR启动子和人白细胞介素4cDNA的EBV衍生的运载体，自此称之为pEBV-178。
pEBV-178用标准技术转化入COS7细胞，培养上清测定TCGF活力以检测白细胞介素4的表达。
实例Ⅳ天然人白细胞介素4和变种蛋白ISO（丙一谷一苯丙）在大肠杆菌中的表达。
两个含有人白细胞介素cDNA插入子的运载体被组建用以在大肠杆菌中表达人的白细胞介素4：一为pIN-Ⅲ分泌载体，它含有ompA蛋白的信号肽序列（“pIN-Ⅲ-ompA2”）;另一为pUC12质粒，它含有trpP启动子和相连的核糖体结合位点（RBS）区（“TRPC11”）。
A、pIN-Ⅲ-ompA2
用pIN-Ⅲ-ompA2组建了两个运载体，由Ghrayeb等（在EMBO    Journal，3：2437-2442，1984）和Masui等（在Bioteohnology，2：81-85，1984）所叙述。
第一个运载体称之为pIN-Ⅲ-ompA2（1），系通过按顺序连接 PIN-Ⅲ-ompA2质粒的EcoRI/BamHI酶解物，合成的连接子，和pcD125的BamHI/EcoRV片段。此项组建中使用的合成连接子，导致了含有三个N末端多余氨基酸丙-谷-苯丙的，有生物活力的白细胞介素4的分泌，也即变种蛋白ILO（丙-谷-苯丙）的分泌。该合成连接子由以下核苷酸序列构成：
AA    TTC    CAC    AAG    TGC    GAT
G    GTG    TTC    ACG    CTA
EcoRI/BamHI酶解的PIN-Ⅲ-ompA2和PCD-125的BamHI/EcoRV片段，于标准连接溶液（即Mamiatis等，见前註）中与0.1微克分子的合成连接子混合，用质粒pIN-Ⅲ-ompA2（1）感染大肠杆菌Ab1899株，转化子用32P标记的IL-4cDNA探针作菌落杂交选择，供检测用的人白细胞介素4抽提物按以下步骤获得：超声处理后，细菌培养物离心，除去上清，沉淀物用1%SDS，2mM二巯基苏糖醇及6M胍处理，再离心，去掉上清液，沉淀用3%SDS和2mM二巯基苏糖醇于45℃处理，此物再离心，上清液用SDS-PAGE检测。
pIN-Ⅲ-ompA（2）被组建以表达天然的人白细胞介素4，在pIN-Ⅲ-ompA（1）中的三个多出的氨基酸，在pIN-Ⅲ-ompA（2）的ompA信号肽序列中用点特异突变除去。点特异突变系按Zoller和Smith（见前註所公开的方法。简言之，含有omPA信号肽编码序列的pIN-Ⅲ-ompA（2）的XbaI/BamHI片段（见图1，Ghrayeb等;参照前註）提纯，与纯化的M13mp19复制型（RF）的XbaI/BamHI酶解物相混合，连接，感染大肠杆菌 K-12    JM101，辅平板，在IPTG及X-gal存在下，选出透明的噬斑并扩增，制备单链DNA（按照Mcssing于Methods    in    Enzyniology，vol.101，纽约，科学出版社，1983所公开的步骤）。另外，下述含有指定的碱基取代（框内的）寡核苷酸引物（23-聚物）被合成和磷酸化。
5′-GGAATTCAGAAGCT
Figure 861085795_IMG10
C
Figure 861085795_IMG11
GCTAC-3′。
此序列在突变的pIN-Ⅲ-ompA2的信号肽码区引入了第二个HindⅢ位点，这个寡核苷酸引物与含有pIN-Ⅲ-ompA2    XbaI/BamHI片段的M13mp19RF型退火，在存在合适浓度的核苷三磷酸的情况下用DNA聚合酶处理，这样产生的RF型用以转化大肠杆菌JM101，用标记的寡核苷酸探针筛选含有突变体的噬斑，选出的RF型用通用M13引物籍双脱氧法测序核定，选得的RF型扩增、纯化，用XbaI及BamHI消化，纯化的XbaI/BamHI片段插入到XbaI/BamHI酶解的pIN-Ⅲ-ompA2中，为形成pIN-Ⅲ-ompA2（2），将pIN-Ⅲ-ompA2的突变种扩增，纯化，用HindⅢ和BamHI酶解，与pcD-125的BamHI/EcoRV片段在含有0.1微克分子的下述合成连接子的标准连接溶液混合：
A    GCT    CAC    AAG    TGC    GAT
GTG    TTC    ACG    CTA
用pIN-Ⅲ-ompA2（2）感染大肠杆菌，Ab1899株，转化子用32p标记的IL-4    cDNA探针选择。按上述方法制备的白细胞介素4抽提物，表现出可与pcD-125cos7细胞上清液相比的 TCGF活力。
B.TRPC11
TRPC11运载体系通过连接合成的共性RBS片段（consensus RBS fragment）与ClaI连接子ATGCAT）及将连接物克隆入ClaI切过的pMT11hC（预先修饰使之含有ClaI切点）。pMT11hc是一个小的（2.3Kb）高拷贝数的来自pBR322的抗氨苄青霉素，对四环素敏感（AmpR，TetS）的衍生物，它含有πVX质粒（Manitis等叙述，见前註）的EcoRI-HindIII多连接子。它通过下述步骤含有了claI位点：将pMT11hc用EcoRI和BamHI酶解，将切得的粘性末端补齐，与ClaI连接子（CATC GATG）连接，这样重新保留了EcoRI BamHI位点，并将ClaI位点取代了SmaI位点。
在一个TRPC11构建的转化子中含有串连的与ClaI位点两侧的RBS序列，ClaI位点之一以及RBS序列的第二个拷贝中的一部分为以下步骤的除去，将这个质粒用PstI酶解，用Bal31核酸酶处理，用EcoRI切，再用T4 DNA聚合酶在所有四种脱氧核苷三磷酸存在下处理，产生的30～40bP的片段通过PAGE得到，克隆入SmaI酶解的pUC12中，从质粒pKC101（Nichols等叙述，Methods in Enzymology，Vol.101，p155，科学出版社，纽约，1983）中含有trpP的248bp的EcoRI片段，再克隆入EcoRI位点，从而完成TRPC11的构建，如图12所示。
TRPC11按以下方式成为人白细胞介素4cDNA的运载体：首先，用ClaI及BamHI酶解，纯化，再与pcD-125的EcoRV/BamHI片段在含有0.1微克分子的下列合成连接子的标准连接溶液相混合：
TCG    ATG    CAC    AAG    TGC    GAT
AC    GTG    TTC    ACG    CTA
含有插入片段的运载体按上述方法选出，在大肠杆菌K12株JM101中扩增，白细胞介素4按下述方法抽提：JM101细胞在其培养基中用声波处理，离心，沉淀悬浮于4M胍及2mM二巯基苏糖醇中，再离心，上清液测生物活力，发现表现出可与用pcD125感染的COS7细胞上清液相比的TCGF活力。
实例Ⅴ.通过小鼠及人LL-4    cDNA探针从牛的辅助T细胞cDNA库中制备牛白细胞介素4cDNA及在CDS7猴细胞中的临时表达。
从诱导的牛外周血淋巴细胞（PBLs）组建的cDNA库中通过合併使用小鼠及人的cDNA探针分离到编码IL-4的cDNA克隆，牛cDNA的另一来源包括在ATCC的NBL动物株系汇集所保存的几种牛细胞系。步骤大约与例Ⅱ所叙相同，mRNA抽提及cDNA库组建按例Ⅱ进行。
小鼠及人的cDNA探针可以一起使用或依次使用来探测牛的LL-4cDNA，如例Ⅱ，从小鼠pcD.2A-E3 cDNA克隆中分离到PstI片段，同样从人pcD-125cDNA克隆中分离到PstI片段，从一些其它的片段亦可得到以制做探针，每种分离到的PstI片段分别或合併作缺口翻译标记（约1×108cpm/微克），用于探测硝酸纤维素滤膜的质粒DNA，它们是来自10个群，每个代表诱导的PBL cDNA库中约1000个克隆。滤膜杂交按例Ⅱ进行。阳性反应菌落予以
Figure 861085795_IMG12
定及扩增。
实例Ⅵ.人天然白细胞介素4和变种蛋白△1-4和ISO（甘-门冬酰胺-苯丙-缬-组-甘）于啤酒酵母中的表达。
人的天然白细胞介素4cDNA和两个突变种克隆入质粒pMF-α8， 并于酵母Saccharommyces    cerevisiae中表达，作为表达非酵母蛋白的pMF-α8其构建及应用已充分地由Miyajima等（Gene，37：155-161，1985）Miyajima等（EMBO    Journal，5：1193-1197，1986）叙述。pMF-α8以登记号40140存入美国菌种保藏中心（ATCC，在ROckville，马里兰州），其图谱见图13A（其中记号已由Miyajima等在前引Gene中，已充分说明）。
A.人白细胞介素-4变种蛋白△1-4
提取质粒pcD-125，并用ECoRV和BamHI酶介，含有人IL-4cDNA的EcoRV/BamHI片段分离出来并用DNA聚合酶I（Klenow片段）补齐BamHI切口，并激酶化（即磷酸化）。
pMF-α8用StuI酶解，与pcD-125的激酶化的EcoRV/BamHI片段合併，在标准连接溶液中形成质粒phIL-4-2，phIL-4-2用于转化啤酒酵母20B-12（MATα，trp1-289，pep4-3，系从酵母遗传中心，加州大学，Berkeley得到）。酵母细胞在含有0.67%无氨基酸的酵母含氮基础培养基，2%葡萄糖，和0.5%的酪素氨基酸（Difco）合成培养基中生长，酵母细胞转化质粒用乙酸锂方法（Ito等。J.Bacteriol，153：163-6168，1983），转化子在缺色氨酸的合成培养基上选择，转化培养物上清液测定TCGF活力。图13B的曲线D表示pIL-4-2转化的酵母细胞上清液经若干稀释的TCGF活力，与之相比的有曲线A-人白细胞介素2，曲线B-pcd-125转染的COS7细胞上清液，及曲线C-phIL-4-1，转化的酵母细胞上清液）。曲线E表示不含IL-4cDNA插入物的pMF-α8转化子，也即“空白”转化子的酵母上清的TCGF活力。 B.人白细胞介素4变种蛋白ISO（甘-门冬酰胺-苯丙-缬-组甘）
表达变种蛋白ISO（甘-门冬酰胺-苯丙-缬-组-甘）的pMF-α8插入物的制备与变种蛋白△1-4的完全相同，只除了用的是pcD125的NaeI/BamHI片段，构成的质粒称为phIL-4-1，从phIL-4-1转化的酵母细胞上清液的几种稀释样品用于测定TCGF活力，结果见于图13B的曲线C，上清液亦测定了anti-IgM和SAC激活的B淋巴细胞的BCGF活力。测定按前述方法进行，结果见于表Ⅳ。
表Ⅳ    phIL-4-1转化的酵母细胞上清液的
BCGF活力
上清液 〔3H〕一胸腺嘧啶参入（cpm）
加量    SAC激活的    Anti-IgM珠激活的
%（体积/体积）    B淋巴细胞    B淋巴细胞
0    3633±1239    641±69
0.09    7610±310    13221±472
0.19    9235±181    ″″″
0.39    10639±786    16681±310
0.78    10372±572    18090±1248
1.56    9905±328    17631±1216
3.12    11354±836    18766±1179
6.25    10481±541    19810±1349
12.5    9641±30    18136±1126
25    8253±857    14750±1125
C.天然人白细胞介素4在酵母中的表达
编码天然人白细胞介素4cDNA按以下步骤克隆入pMFα8，先插入N一端组氨酸密码子上游碱基，形成KpnI位点，用KpnI断裂后用DNA聚合酶I处理，此平端的IL-4CDNA插入pMFα8的StuI位点。再用标准的位点特异突变方法形成KpnI位点，简言之，pcD-125用BamHI酶解，将含人完整人IL-4cDNA的片段分离出来并插入M13mp8的BamHI位点，提取含有此插入片段的单链M13mp8，与下面作为引物的合成寡核甘酸杂交：
5′-TCCACGGA
Figure 861085795_IMG13
CACAAGTG-3′
插入的核苷酸划在框内，含有突变的IL-4cDNA的质粒用寡核苷酸探针
Figure 861085795_IMG14
定，扩增，提取，用KpnI和BamHI处理，提取此KpnI/BamHI片段，用DNA聚合酶I（Klenow片段）处理产生平端，激酶化，与StuI酶解的pMFα8连接，产生的pMFα8质粒称之为phIL-4-3转化酵母，此上清液按上述测定TCGF活力。其上清液表现的TCGF活力可与phIL-4-1转化的酵母的上清液相比。
实例Ⅶ.合成的人白细胞介素4的构建和在大肠杆菌中的表达
合成的人IL-4基因基本上按适合细菌的密码来构建，包括一系列单一的限制性内切酶位点（此后称为“单一限制位点”），以利于快速方便地表达多种多样的人白细胞介素4变种蛋白，此合成基因的核苷酸序列见于图6A。此例中构建和表达合成的基因的技术是标准的分子生物学技术，见于Sproat和Gait，Nuclic    Acids    Researeh，Vol.13，pp2959-2977.1985;Ferretti等Proc.Natl.Acad.Sci.，83.599-603，1986;也见于Mullenbach等J.Biol.Chem，261：719-722，1986; Wells等Gene，34：315-323，1985;和Estell等Science，233：659-663，1986。简言之，合成的人白细胞介素4基因是从大量化学合成的双链DNA片段装配而成，合成基因的碱基顺序经过选择使得装配成的合成基因包含一系列单一限制位点。
一系列单一限制位点确定了一系列片段可以易于删除及用带有改换的碱基的片段置换，合成的片段可以直接插入、或在与其它片段连接后再插入合适的运载体，如pUC质粒或类似的质粒，上述的片段大量相应于Wells等所谓的“盒”（见前註）。合成的片段用标准技术合成，如Gait的“寡核苷酸合成实用方法”（IRL出版社，Oxford，UK，1984）。最好用自动合成仪，如Applied    Biosystems    Inc.（Foster    City，加州）的380A型。PUC质粒及类似质粒有市售，如pharmacia-PL公司，或Boehringer-Mannheim，克隆和表达可在标准的细菌系统进行，如大肠杆菌K12的JM101，JM103或类似株系，如Viera和Messing所述（Gene，19：259-268，1982）。
限制性酶解和连接反应按标准操作方案进行，如Maniatis等的分子克隆实验手册，（Cold    Spring    narbor    Laboratorg，New    york，1982）。
碱法（Maniatis等，见前註），用于小量制备质粒，大量制备采用修改的碱法，其中等体积的异丙醇用于从裂解液中沉淀核酸。在氯化铯平衡密度超离心和用溴化乙鎓探测之前用冷的2.5M乙酸铵沉淀以除去RNA。
滤膜杂交采用Whatman    540园滤片以吸起菌落，然后按顺序用0.5MNaoH-1.5M    Nacl;1MTris.HCI    pH80-1.5M    Nacl （每步2分钟）;及80℃加热30分钟处理进行溶菌和固定，杂交在6×SSPE，20%甲酰胺，0.1%十二烷基硫酸钠（SDS），100微克/毫升，E.coli tRNA，100微克毫升考马士亮兰G-250（BioRad）于42℃用32p-标记的（激酶化的）合成DNA作用六小时。（20×SSPE按以下制备：溶解174克氯化钠，27.6克NaH2po4·H2o，7.4克EDTA于800毫升水，用NaoH调PH至7.4，定容至1升，高压灭菌）。
滤膜用1×SSDE，0.1%SDS洗涤二次（15分钟，室温），在放射自显影之后（Fuji    RX胶片），阳性菌落通过再生的菌落与滤膜上兰色的菌落痕迹对照确定。
DNA用Maxam和Gilbevt的化学降解方法测序列（Methods    in    Enzy    mology，Vol.65，p499（1980）或Sangev等的双脱氧法测序列（Sanger等，proc.Natl.Acad.Scl.，74：5463（1977）。双脱氧反应的模板，或是有关序列再克隆到M13mp运载体（即Messing等，Nuclelc    Acids    Res.，9：309，（1981）所得的单链DNA，或用微量碱法制得的双链DNA。此双链DNA用0.2MNaoH变性（室温5分钟），然后加2倍体积乙醇，从0.2M    NaoH和1.43M乙酸铵中沉淀出来，双脱氧反应在42℃进行。
DNA用Applied    Biosystems公司的380A合成仪用亚磷酰胺法合成。合成、脱保护、断裂和纯化（7M脲pAGE，洗脱，DEAE-纤维素层析）均按380A合成仪手册进行。用于克隆的合成DNA的各互补链（每种400毫微克）混合起来，在50微升反应体积内，用多核苷酸激酶磷酸化。这DNA与1微克用适当限制性酶酶解的运载体连接，连接反应在50微升体积内在室温进行4至12小时，磷酸化的条件， 限制性酶解、聚合反应以及连接诸条件均已叙述（Maniatis等，见上註）。如有需要，通过舖在含有氨苄青霉素，异丙基-1-硫代-β-D-一半乳糖苷（（IPTG，0.4mM）和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷（X-gal，40微克/毫升）的L琼脂平板上Lac2+的计数来计算菌落。
构建TAC-RBS运载体通过一系列步骤，首先用DNA聚合酶补齐携有tacP的质粒pDR540（Pharmacia公司）的单一BamHl切点。产物再与形成编码通用的核糖体结合点（RBS，GTAAGGAGGTTTAAC）的双链片段的未磷酸化的合成寡核苷酸相连接（Pharmacia公司）连接后，混合物磷酸化，并与SstI连接子ATGAGCTCAT再连接，产生的复合物用SstI和EcoRI切断，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）提取173bp片段，克隆入EcoRI/SstI限制酶解的pUC18（Pha    macia公司）中，此最终建成之RBS-ATG-多连接子序列称为TAC-RBS，如图8所示。
合成的人白细胞介素4基因分为六步组装入PUC18质粒。在每一步凡没有发生删除和/或插入改变的插入子，都可以在克隆后通过其保留有pUC18的LacZ（α）基因的正确读框而判定（该基因的ATG起始码，是在第1个步骤时装入的）至于那些发生了删除和/或插入改变了的插入子，则可在含有X-gal和IPTG的L-氨苄青霉素平板上通过检查兰色菌落而剔除掉。另外的办法是在每一步，插入片段的序列都可以用通用的测序引物在少量质粒DNA制备物中很方便地加以核查。此引物可从Boehringer    Mannheim得到。
在第1步，TAC-RBS运载体为SstI酶解，通用T4DNA聚合酶处理（其3′，外切酶活力将SstI切口的3′，突出链切成平端），在使T4 DNA聚合酶失活后，用EcoRI作用，生成173碱基对（bp）的片段，它包含TAC-RBS区，在其ATG起始码处是平端，在另一端是EcoRI切点，最后将173bp的TAC-RBS片段提取出来。
第2步，在步骤1中提取的TAC-RBS片段与质粒pUC18的EcoRI/SstI酶解物和合成的片段1A/B相混合，连接形成第2步的pUC18。其中，合成片段的1A/B如图7A所示，在其上游端为平端，其下游端为相应SstI切口的交错（粘性）端。
在第3步，合成片段2A/B和3A/B（如图7B和7c）与Sstl/BamHI酶解的第2步的pUC18（在扩增和提片后）混合并连接，形成第3步的pUC18，注意片段2A/B的下游端具有额外的碱基以形成BamHI交错端，这些额外碱基在第4步中切去。在2A/B和3A/B片段还有互补的9-残基单链末端，它们在混合物中退火，留下2A/B的上游SstI切口和下游3A/B的BamHI切口以与pUC18相连接。
在第4步，第3步pUC18（在扩增和提纯后）的MluI/XbaI酶解物再纯化后，与合成片段4A/B（图7D）相混合，连接形成第4步的pUC18。
在第5步，第4步pUC18（在扩增和提纯后）的XbaI/SalI酶解物与合成片段5A/B（图7E）相混合，连接形成第5步的pUC18。
在第6步，第5步pUC18（在扩增和提纯后）的SaeI/HindIII酶解物与合成片段6A/B（图7F）相混合，连接形成最终的构建物。
图6B为刚才所述之pUC18构建物的单一限制位点的酶解图谱。当公开的合成人白细胞介素-4基因作为pUC18的插入子，每对单一的限制位点都明确规定了一个片段可以删除和被改变了的合成片段所替换。这些内切酶位点包括EcoRI，HpaI，SacI（SstI）.EcoRV， pstI，MluI，BceI，XbaI，NaeI，SalI，XhoI，和HindIII。
含有合成IL-4基因的pUC18放入大肠杆菌K-12株JM101，培养之后，从JM101中提出蛋白，提取物稀释以测定生物活力。
实例Ⅷ.人白细胞介素-4的变种蛋白Ile52的构建及在大肠杆菌中的表达。
第52位的Leu（位置系相对人白细胞介素-4的N末端而言）被改变为Ile形成人白细胞介素变种蛋白Ile52，例Ⅶ中的含有图6A的合成人白细胞介素-4基因的质粒pUC18，用PstI和MluI酶解和纯化，此纯化的pUC18与下面注明的合成双链片段混合和连接。碱基序列中改换的部分划在框内，形成的pUC18转化大肠杆菌K12株JM101或类似株，然后表达。
CAG    TTC    TAC    TCT    CAC    CAC    GAA    AAA
GTC    AAG    ATG    AGA    GTG    GTG    CTT    TTT
GAC    A
CTG    TGC    GC
为产生人白细胞介素4变种蛋白Ile52
的PstI/MluI的替换片段
培养后，用标准技术从JM101中抽提蛋白，抽提物稀释并测试生物活力。
实例Ⅸ.人白细胞介素4变种蛋白Ile52，ASp111的构建和表达
例Ⅷ中的修饰的pUC18质粒（含有Ile52的编码序列）用SalI 及XhoI酶解，提取大片段，提取的片段与下面注明的合成双链片段在标准连接溶液中混合。序列的改变部分加框，产生的质粒转化大肠杆菌K12株JM101成类似菌株，并予表达。
Figure 861085795_IMG16
SalI/XboI替换片段
培养后，用标准技术从JM101细胞中抽提蛋白，抽提物稀释并测试生物活力。
实例Ⅹ.从转染上清液中纯化的人白细胞介素-4的序列
从含有人白细胞介素4CDNA的运载体短期转染的细胞培养物上清液中纯化了人白细胞介素4，从纯化物中测定了分泌的天然人白细胞介素4的序列。
A.为纯化建立的生物学检测
在分离步骤中，TCGF活力用来检测人的白细胞介素4，此检测基本上与例Ⅱ中所述相同。简言之，健康供体的血液倾入肝素化的试管中，舖在Ficoll-Hypaque上，也就是15毫升离心管中每3毫升Ficoll-Hypaque加5毫升血。在3000×g离心20分钟后，中间界面的细胞吸出来，在由RPMI1640组成的生长培养其中稀释。该培养基含有10%胎牛血清，50微克分子的2-巯基乙醇，20微克/毫升的植物凝血素（PHA），和重组的人白细胞介素-2，在37℃保温5～10天，PHA激活的外周血淋巴细胞（PBLs）被洗下，在二天之内用于比色测定：Mossmann，J.Immunol，Methods，65：55-63，1983。白细胞介素4标准物（从pCD-125或pEBT-178转染的COS7细胞的上清液），或被测部分的一 系列二倍稀释液加在96孔板，用上述的生长培养基加至每孔50微升，再向每孔加入50微升pHA-激活的pBLs（约4-8×106细胞/毫升），板在37℃保温2天，然后，按Mosmann（见前註）测定细胞生长。
人白细胞介素4的TCGF活力单位按pCD-125转染的COS7细胞上清液（例Ⅱ）或pEBV-178转染的COS7细胞上清液（例Ⅲ而定义。
用于提纯过程，采用根据pcD-125转染的上清液活力单位。其过程如下：大约1×106COS7细胞种到含有Dulbeco修改的Eagle氏培养基（DME），10%胎牛血清和4mML-谷氨酰胺的100mm组织培养平血中，大约接种后24小时，培养基从平血中吸出，细胞用无血清的加缓冲液（50mMTris）的DME洗二次。向每个平皿中，加入4毫升无血清的、加有缓冲液的DME（以及4mML-谷氨酰胺），80微升的DEAE-葡聚糖，以及5微克的pcD-125DNA，细胞在此混合物中30℃保温4小时，吸出培养基，细胞用无血清的加缓冲液的DME洗一次。洗后每皿加入5毫升带有4mML-谷氨酰胺的DME，100毫克分子的氯喹，2%的胎牛血清，细胞保温3小时，然后用无血清的加缓冲液的DME洗二次。接着，加入5毫升带有4mML-谷氨酰胺的DME和4%胎牛血清，细胞在37℃保温24小时。此后，细胞用DME或PBS洗涤1-3次，加入5毫升无血清的DME（带有4mML-谷氨酰胺），细胞在37℃保温至5天后收获。
这里使用的一个单位，是指在48小时内，在一个孔内（0.1毫升）2×104PHA激活的PBLs中激活最大增生的50%的因子数量。
B.提纯
提纯是依次使用阳离子交换层析，凝胶过滤和反相高压液相层析来实现的，所有的操作都在4℃进行。
在离心除去COS7细胞后，上清液用超滤浓缩10倍，-80℃贮存至下一步加工。白细胞介素-4的滴度通过测此蛋白刺激植物凝集素诱导的人外周血淋巴细胞增生的能力，即用上述标准方法通过TCGF活力来测定。
浓缩的COS7上清液，具有约104-106单位/毫升TCGF活力，蛋白含量大约15～20毫克/毫升，对50mM HEPES钠盐PH7.0透析24小时，透析液换二次（每次约为浓缩液体须的10～15倍）透析液加在一个S-Sepharose柱上（1×2.5厘米，流速：0.2毫升/分）该柱预用50mM HEPES-钠，PH7.0平衡，柱用15倍柱体积的平衡缓冲液洗，然后用20倍柱体积的在50mM HEPES-钠PH7.0中的0-0.5M氯化钠线性梯度洗脱，梯度终了再用5倍柱体积的单一浓度，50mM HEPES-钠，0.5M氯化钠，PH7.0洗脱，每批收集分部为1.5毫升和1.8毫升。白细胞介素-4滴度在每次层析的300mM至500mM氯化钠的洗脱部分发现。
从每次S-Sepharose柱的含有白细胞介素-4滴度的6个部分被分别合併，总体积为9毫升和10.8毫升。每个都用Amicon    YM5膜（分子量截留：5000）超滤浓缩至1.9毫升。这步的蛋白回收大约是80%。浓缩的白细胞介素4溶液加在Sephadex    G-100柱（1.1×58厘米）上，该柱预用50mM    HEPES，0.4M氯化钠，PH7.0平衡，该柱用同种缓冲液于0.15毫升/分洗脱，总计50个部分（1.0毫升/部分）被收集及测定白细胞介素4的滴度， 生物活力峰值在表观分子量22，000道尔顿处，Sephadex    G-100的表观分子量测定用牛血清白蛋白（65，000道尔顿），碳酸酐酶（30，000道尔顿）和细胞色素C（11，7000道尔顿）校正。
从Sephadex G-100柱下来的，包含白细胞介素4活力的部分被真空浓缩3～4倍，注射加在Vydac C-4预柱（4.6×20毫米）上。一线性梯度0-72%（V/V）丙腈于0.1%（V/V）三氟乙酸（TFA）中在15分钟内形成，柱温35°，流速1.0毫升/分，在214nm处测得三个峰，滞留时间分别为7，8.2，8.7分（峰1，2和3，图10）峰2的-40微升部分（洗脱时间8.2分钟）被冷冻干燥，然后溶解在含有10%胎牛血清的最低基本培养基中。此溶液表现阳性TCGF反应，-300微升的第二峰蒸发干燥，再溶于200微升0.1%（w/v）十二烷基硫酸钠（SDS）中，取2微升部分溶于200微升1%（v/v）TFA，再层析，此样品的高压液相层析在215nm检测得到单峰，峰2物质表现活力约7×108单位/毫克。
C.氨基酸序列分析
氨基酸序列为自动的气相Edman降解测定，（Hewick，R.M，Hunkapillar，M.W，Hood，L.E.及Dryer W.J.1981，J.Biol.Chem，256：7990），采用Applid Biosystem公司的微量测序仪，峰2的90微升部分，溶于0.1%SDS，加在波动纤维滤柱上（在有Polybrene存在下），氨基酸序列数据可计至第35个残基，N-端序列如下：
His-Lys-    _    -Asp-Ile-Thr-Leu-Gln-Glu-
Ile-Ile-Lys-Thr-Leu-Asn-Ser-Leu-Thr-
Glu-Gln-Lys-Thr-Leu-    _    -Thr-Glu-Leu-
_    -Val-Thr-Asp-Ile-Phe-Ala-Ala 空白处表示缺少可
Figure 861085795_IMG17
定的氨基酸。
在N-端第3及第23位处的空白与存在半胱氨酸一致的，它不能在此体系中测出。第28位的空白相当于cDNA顺序预期的苏氨酸，未能测出可能由于乙丙酰苯异硫脲-苏氨酸测定的易变性，或是存在O-联接的糖基化成酯化。
曾用于测序列的HPLC部分100微升蒸发至干，复溶于70%甲酸加入50倍过量克分子数的溴化氰，室温放置2.5小时，断裂的蛋白质用Applied    Biosystems公司的气相测序仪测顺序，可检出两个序列：
（1）Arg-Glu-Lys-Tyr-Ser-Lys
（2）His-Lys-    _    -Asp-Ile-Thr
序列（1）与由cDNA序列推测的相符，为在第120位处甲硫氨酸受溴化氰断裂释出的。C端最后的二个残基可能原来是存在的，不过由于样品量不够未能测得，序列（2）与从天然白细胞介素-4得到的N-端序列相符，氨基末端和羧基末端所释出的乙内酰苯异硫脲氨基酸的相对含量说明样品中每种顺序有相等的克分子含量。这个结果支持下述结论，即：所测序列的蛋白质主要含有一条肽链，其氨基与羧基末端为从人白细胞介素-4cDNA序列推测出者。
实例Ⅺ.人白细胞介素-4变种蛋白（Ile52△71，IS94（Ala））的构建和表达
例Ⅷ中修饰的质粒pVC18（含有Ile52编码序列）用MluI和BolI酶解，提取其大片段，此提出的大片段与下面说明的合成双链片段在标准连接溶液中混合，生成的质粒转染大肠杆菌K12株JM101，成类似菌株，并予以扩增。
CG    CGT    TGT    CTC    GGC    GCC    ACT
A    ACA    GAG    CCG    CGG    TGA
GCG    CAG    TTC    CAC    CGT    CAC    AAA    GAG    CT
CGC    ↑    GTC    AAG    GTG    GCA    GTG    TTT    GTC    GAC    TAG
删除
MluI/BclI替换片段
修改的质粒提取并用XbaI和NaeI酶解，提出大片段，提取的片段与下面注明的合成双链片段在标准连接溶液中混合，添加的密码子加框。这样产生的质粒转染大肠杆菌K12株JM101成类似菌株，并做表达。
CTA    GAC    CGT    AAC    CTG    TGG    GGC
TG    GCA    TTG    GAC    ACC    CCG
Figure 861085795_IMG18
XbaI/NaeI替换片段
培养后，用标准技术从JM101细胞中抽提蛋白质，抽提物稀释并测定生物活力。
实例Ⅻ.在感染裸淋巴细胞症的病人细胞中诱导DR抗原
裸淋巴细胞综合症以在细胞表面缺乏Ⅰ类和/或Ⅱ类的HLA表达为特征，常常伴随严重的免疫缺损，如Touraine，Lancet，PP319-321（1981年2月7日），Touraine和Bethel，Human    Immunology，Vol.2，147-153，1981，和Sullivan等，J.Clin.Invest，76：75-79，1985，曾发现，人白细胞介素-4能将患有裸淋巴细胞综合症病人所得到的细胞的表面诱导Ⅱ类DR抗原的表达。
从患有不表达Ⅱ类HLA抗原的病人获得外周血淋巴细胞（PBLs），从PBLs提纯B细胞主要按前述方法，通过Epstin-Barr病毒（EBV）转化建立B细胞系，EBV转化的细胞培养48小时培养基为（见上述）加有2%胎牛血清和5%（V/V）浓度的pcD-125转染的COS7细胞上清液的人工合成的yssel培养基。收获细胞，固定，用荧光标记的抗DR单克隆抗体染色（即Becton    Dickinson    L243），用流动细胞计分析，图9表示细胞频度对荧光强度作图的直方图，曲线A是对照，在白细胞介素-4处理以前收获的EBV-转化的细胞群，曲线B是在白细胞介素-4处理后的EBV-转化的细胞群。
实例ⅩⅢ.Cl.Lyl+2-/9（Cl.l）上清液的MCGF活力
纯化的白细胞介素-3和从转染了白细胞介素-3cDNA克隆的COS7细胞上清液（重组白细胞介素-3，IL-3R）激活肥大细胞系MC/9的增生至同样的程度（图14A）。但是，这只是 Cl.lT细胞上清液诱导水平的三分之一至一半，在T细胞上清液中存在ConA（伴刀豆球蛋白A，2微克/毫升）也对MCGC活力无大影响，此效应的一个解释是白细胞介素3并非Cl.l细胞产生MCGF活力的根源。此外，用于测定的肥大细胞系可能（理论上说）污染了依赖次级因子的细胞群落，然而后一可能性可以排除，因为由MC/9细胞系再克隆产生的各亚克隆系对于IL-3和细胞上清液的反应与原始的MC/9克隆相同。
由于Cl.l上清液也含有与IL-3不同的淋巴细胞活素，也测定了它们促进MC/9细胞生长的能力。然而，MC/9细胞对各种浓度的重组白细胞介素-2，IFN，GM-CSF，以及含有白细胞介素-1的上清液（P388D细胞）均无反应（图14A）。此外，向含有不同浓度的重组白细胞介素-3的培养物中补加IL-2，GM-CSF，IFN-γ或IL-1都不刺激MC/9细胞增生至超过单独IL-3作用的水平。这表明，T细胞上清液增高MCGF活力并非由于这些其它的已知因素的成分。
与依赖其它因子的细胞系的比较研究
两种其它的肥大细胞系DX-2和MM3，也对Cl.l上清液给出较对IL-3为强的增生反应（DX-2的数据见图14B）这些细胞对IL-2，IFNγ，GM-CSF，或P338D-1细胞上清液也都并不反应，这样，MC/9细胞对T细胞上清液的增生反应的加强，可能是肥大细胞的一种普遍性质，与之相反，粒细胞类的细胞（NFS-60）受IF-3及Cl.l上清液的激活几乎相等（图14C）。尽管NFS-60细胞对IL-2，IFN-γ和P338D-1上清液均不反应，它却被GM-CSF虽小但可重复地 激活，IL-3和T细胞上清液诱导出相似水平的增生，说明NFS-60细胞系对T细胞上清液存在的其它的因子是相对不敏感的。所以，在用蛋白质分部分离法尝试把IL-3与其它MCGF活力分开时，使用NFS-60细胞检测IL-3。
用依赖IL-2的T细胞系HT2来估价Cl.l细胞上清液的TCGF活力。饱和浓度的Cl.l上清液激活3H胸腺嘧啶的掺入无例外地显著低于重组IL-2所达到的最高水平（图14D）。用两个其它细胞系得到同样结果。因为把它们加到含有IL-2的HT2培养物中并不降低3H-胸腺嘧啶的参入，所以这些上清液中并不含有抑制物质，（图14D）这些结果说明，Cl.l上清液所含的TCGF活力与IL-2是不同的，支持这一结论的生化证据见下文。Cl.1上清液的初步层析分部
用各种层析方法分部Cl.l上清液的直接目的是将白细胞介素-3与其它MCGF活力分开，NFS-60细胞的增生被用于追踪IL-3，特别是针对由MC/9增生给出的MCGF总活力的本底，TCGF活力由HT2细胞增生来估计。
当Cl.l上清液在中性PH下在阳离子交换柱层析分部分离时，约98%上柱蛋白，97%的IL-3单位（由NFS-60增生测得）和1%的TCGF单位出现在流出液中（图15），被结合蛋白用氯化钠梯度洗脱，在0.19M    NaCl处（第60部分）洗脱下TCGF活力，一少量但可重复的TCGF活力峰也出现在IM    NaCl处，再高的NaCl浓度（直到3M）也没有更多TCGF活力可以洗脱出来，一少量的IL-3也在大约与TCGF峰相同位置被洗脱（可测到的NFS-60反应）。与未分部分离的上清液相比，只有相当于TCGF活力峰（第59-61分部）和流出部分（第1-20分部） 高水平地激活MC/9增生（图15，箭头处）由于滴定曲线提示在第59-61分部比流出部分有更多的高水平MCGF活力，故尝试了进一步将与TCGF峰同时洗脱的IL-3活力去尽，并再测定MC/9的增生水平。这样，第59-61部分就在相同条件下再层析了两次以上。
第三次过柱以后，95%以上的TCGF活力仍然在0.19M    NaCl处洗脱，此时在流出部分和任何洗脱部分都没有可测出的IL-3（NFS-60）反应。然而，仍然与TCGF峰共同洗脱的MCGF活力只对MC/9增生呈平坦水平的激活，比从Cl.l和IL-3得到要低得多了（见下文）。因为这些部分没有可测出的IL-3活力（缺少NFS-60反应）显然这新的MCGF活力本身不可能把MC/9细胞激活粗的T细胞上清液所激活到的程度。
为进一步从TCGF中分开MCGF，三次分离的物质（第59-61部分）用0.1%TFA水溶液稀释十倍至PH2，并直接加到C8反相柱上，图16A显出结合蛋白为0.1%TFA中的丙晴梯度洗脱的图形，在流出部分没有MCGF或TCGF活力，两种活力共同在37%丙晴处被洗脱（第26-29部分），然而，此时MCGF的饱和反应只有单独IL-3所产生的大约一半，（图17A）当所有的部分在有不饱和水平的IL-3情况下重新测定时，只有第26-29部分在过量的IL-3存在时表现MC/9增生反应（图16A箭头），事实上，此反应数量级与未分离的上清液本身的相似（图17A）。进而，也测到与未分部上清液相当的增生水平，这是用第26-29分部并有流出部分的IL-3，或者从WEHI3中提纯的IL-3存在时所测的结果，这样，将IL-3与特定的 MCGF/TCGF合并，对于MC/9增生激活的水平与原始T细胞上清液是相同的。
尽管反相层析未能将MCGF从TCGF分开，此TCGF从两方面看与IL-2有所区别，首先，当从COS-7细胞上清液中得到的重组IL-2（IL-2R）和从产IL-2的（伴刀豆球蛋白激活的）鼠T细胞系（GF15-1）上清液在同样条件下在同样柱上层析时，TCGF活力在45%丙腈处以一尖锐峰被洗脱而与Cl.1TCGF特有的37%丙腈位置并不重叠。其次，HT2细胞对IL-2R的饱和反应与Cl.l上清液的性质很不相同（图16B，小插图）。加之，在部分纯化的TCGF和IL-2之间，并没有明显的协同作用。（图17B）
Cl.l上清液的层析聚焦图形如图18所示，IL-3活力（NFS-60反应）显示一极为不均一的图形，包括PI值高于7.1的活力成分，但是TCGF活力表现较为均一，主要TCGF（第12部分）表明其PI均为6.2，这与加有饱和水平的IL-3时测得的MCGF最大活力部分是相一致的，（MC/9反应）。
Cl.l上清液及部分纯化因子的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
图19比较了未分部分离的Cl.l上清液（图19A）和阳离子交换物质，第59-61部分（图19B）的电泳图形，蛋白从胶切片中直接洗脱，通过增生测定活力。阳离子交换部分及Cl.l上清液都显示TCGF峰，在非还原条件下，在20kd和15kd，在还原状态下，在21kd和16kd，由于阳离子交换物质中已去掉了IL-3，只能诱导出低水平的MC/9增生，且这些MCGF活力仍然与TCGF峰一致，将饱和量的IL-33加到全部分部中， 只有MCGF/TCGF峰部分可以将MC/9增生反应提高到C.ll上清液的水平（图19B箭头处）。上清液中的IL-3活力在24kd处最高，但在20kd区域亦出现一个宽峰，在电泳的上清液的20kd处，MC/9增生程度显著高于IL-3（图19A，箭头处），高度纯化的MCGF/TCGF物质（反相柱的第28部分）的银染SDS胶也在20kd和15kd处显示主要蛋白区带。
如前述，通过（1）阳离子交换层析，（2）肝素-Sepharose层析，（3）C4反相层析的连续分离，伴刀豆蛋白激活的Cl.l细胞上清液中20kd的因子已有微克量被纯化到匀一状态，此物质在银染的SDS-PAGF中在20kd处只有一条区带，相当C4洗脱图单独的UV吸收峰，纯化的因子的生物学特性确定了它有激活T细胞和肥大细胞低水平增生的能力，并且提高了依赖IL-3的肥大细胞增生。
如表5所示，该因子亦具有某些BSFl一类的激活B细胞的能力，（Roehm，N.W.et al.，J.Exp.Med;169：679-694，1984;Haward.M et al.，Proc.Natl，Acad.Sci，U.S.A;78：5788，1981;Roehm，N.W.et al;Proc，Natl.Acad.Sci.U.S.A;81：6149-6153，1984）。首先，与对照群相比，它诱导休止的B细胞增加Ia的表达（表Ⅴ），第二，此因子与抗Ig抗体联用，可以诱导〔3H〕-胸腺嘧啶大量掺入，显示它起刺激B细胞增生的辅助因子的功能。
表Ⅴ
B细胞激活测定
来源 [3]-胸腺嘧啶掺入抗Ig I-A
处理的B细胞＊ 诱导＊＊
未分部分离的
Cl.Lyl+2-/9 33，788cpm±5，454 162.3
上清
提纯因子    44，125cpm±2，775    157.1
培养基（负对照）    4，128cpm±734    35.5
＊所列值为平均cpm±三个复本的SEM，其培养物补加了饱和水平的因子。
＊＊所列值为三个复本的相对平均荧光的平均值，其培养物补加了饱和水平的因子。
此多肽可以显示几种生物活性，在其所关连的表现功能和其所影响的细胞类型上有所不同。如上述，这些活性包括在诱导B细胞和肥大细胞增生的协同性上，在早期活化休止的B细胞上，在刺激T细胞增生上和在选择性地提高促细胞分裂素活化的B细胞产生IgGl和IgE上，多肽纯化到均一使这些活性的范围更加清楚了。
从上述可知，本发明所纯化的蛋白提供给精于此项技术者以全新的治疗能力，大量生产这类因子的能力将可以改进所选定的哺乳动物细胞系的体外培养，同时全面地促进对哺乳动物免疫应答的认识。
cDNA克隆pcD-2A-E3，pcD-46（pcD-2Fl-13），pcD-125，和酵母运载体pMF-α8已存于美国菌种保藏中心（ATCC，Rockville，马里兰州，美国）其登记号分别为53330，53337，67029和40140，这些保存是按照国际公认的以专利流程为目的的微生物保藏布达佩斯公约（1977）实施的。

Claims (7)

1、一种生产具有人白细胞介素4活性的多肽的方法，该多肽是具有由下式限定的氨基酸顺序的多肽；但先导顺序必须置于所述氨基酸顺序前面：
His-Lys-X(cys)-Asp-X(Ile)-Thr-X(Leu)-Gln-(8)
Glu-X(Ile)-X(Ile)-Lys-Thr-X(Leu)-Asn-Ser-(16)
X(Leu)-Thr-Glu-Gln-Lys-Thr-X(Leu)-X(Cys)-(24)
Thr-Glu-X(Leu)-Thr-Val-Thr-Asp-X(Ile)-(32)
Phe-Ala-Ala-Ser-Lys-Asn-Thr-Thr-Glu-(41)
Lys-Glu-Thr-Phe-X(Cys)-Arg-Ala-Ala-Thr-(50)
Val-X(Leu)-Arg-Gln-Phe-Tyr-Ser-His-His-(59)
Glu-Lys-Asp-Thr-Arg-X(Cys)-X(Leu)-Gly-(67)
Ala-Thr-Ala-Gln-Gln-Phe-His-Arg-His-(76)
Lys-Gln-X(Leu)-X(Ile)-Arg-Phe-X(Leu)-Lys-(84)
Arg-X(Leu)-Asp-Arg-Asn-X(Leu)-Trp-Gly-(92)
X(Leu)-Ala-Gly-X(Leu)-Asn-Ser-X(Cys)-Pro-(100)
Val-Lys-Glu-Ala-Asn-Gln-Ser-Thr-X(Leu)-(109)
Glu-Asn-Phe-X(Leu)-Glu-Arg-X(Leu)-Lys-(117)
Thr-X(Ile)-X(Met)-Arg-Glu-Lys-Tyr-Ser-(125)
Lys-X(Cys)-Ser-Ser-(129)
式中：
X(Leu)，X(Ile)和X(Met)表示Leu，Ile和Met，X(Cys)表示Cys和Ser，
其特征在于该方法包括如下步骤：
构建含有编码所述多肽的核苷酸顺序的载体，其中核苷酸顺序能被含有载体的宿主表达，并且该核苷酸顺序至少有50%与pcD-125插入子同源；
将载体参入到宿主中：
在适宜于使核苷酸顺序在所述多肽中表达的条件下，保持含该载体的宿主。
2、按权利要求1的方法，其特征在于所述糖基化或非糖基化多肽由下式限定：
His-Lys-Cys-Asp-Ile-Thr-Leu-Gln-Glu-Ile-（10）
Ile-Lys-Thr-Leu-Asn-Ser-Leu-Thr-Glu-Gln-（20）
Lys-Thr-Leu-Cys-Thr-Glu-Leu-Thr-Val-Thr-（30）
Asp-Ile-Phe-Ala-Ala-Ser-Lys-Asn-Thr-Thr-（40）
Glu-Lys-Glu-Thr-Phe-Cys-Arg-Ala-Ala-Thr-（50）
Val-Leu-Arg-Gln-Phe-Tyr-Ser-His-His-Glu-（60）
Lys-Asp-Thr-Arg-Cys-Leu-Gly-Ala-Thr-Ala-（70）
Gln-Gln-Phe-His-Arg-His-Lys-Gln-Leu-Ile-（80）
Arg-Phe-Leu-Lys-Arg-Leu-Asp-Arg-Asn-Leu-（90）
Trp-Gly-Leu-Ala-Gly-Leu-Asn-Ser-Cys-Pro-（100）
Val-Lys-Glu-Ala-Asn-Gln-Ser-Thr-Leu-Glu-（110）
Asn-Phe-Leu-Glu-Arg-Leu-Lys-Thr-Ile-Met-（120）
Arg-Glu-Lys-Tyr-Ser-Lys-Cys-Ser-Ser（129）。
3、按权利要求1或2的方法，其特征在于所述人白细胞介素4是人白细胞介素4突变蛋白质IS°（Gly-Asn-Phe-Val-His-Gly），即具有先导顺序Gly-Asn-Phe-Val-His-Gly的人白细胞介素4。
4、按权利要求1或2的方法，其特征在于所述人白细胞介素4是人白细胞介素4突变蛋白质IS°（Ala-Glu-Phe），即具有先导顺序Ala-Glu-Phe的人白细胞介素4。
5、按权利要求1或2的方法，其特征在于：
（1）所述核苷酸顺序包括由编码该多肽的碱基顺序限定的密码子顺序：
His-Lys-Cys-Asp-Ile-Thr-Leu-Gln-Glu-Ile-（10）
Ile-Lys-Thr-Leu-Asn-Ser-Leu-Thr-Glu-Gln-（20）
Lys-Thr-Leu-Cys-Thr-Glu-Leu-Thr-Val-Thr-（30）
Asp-Ile-Phe-Ala-Ala-Ser-Lys-Asn-Thr-Thr-（40）
Glu-Lys-Glu-Thr-Phe-Cys-Arg-Ala-Ala-Thr-（50）
Val-Leu-Arg-Gln-Phe-Tyr-Ser-His-His-Glu-（60）
Lys-Asp-Thr-Arg-Cys-Leu-Gly-Ala-Thr-Ala-（70）
Gln-Gln-Phe-His-Arg-His-Lys-Gln-Leu-Ile-（80）
Arg-Phe-Leu-Lys-Arg-Leu-Asp-Arg-Asn-Leu-（90）
Trp-Gly-Leu-Ala-Gly-Leu-Asn-Ser-Cys-Pro-（100）
Val-Lys-Glu-Ala-Asn-Gln-Ser-Thr-Leu-Glu-（110）
Asn-Phe-Leu-Glu-Arg-Leu-Lys-Thr-Ile-Met-（120）
Arg-Glu-Lys-Tyr-Ser-Lys-Cys-Ser-Ser（129）
和（2）所述宿主是哺乳动物细胞。
6、按权利要求5的方法，其特征在于所述密码子顺序是由编码权利要求5限定的下述多肽的碱基顺序和-24至-1限定的先导顺序所限定的：
Met-Gly-Leu-Thr-Ser-Gln-Leu-Leu-Pro-Pro-（-15）
Leu-Phe-Phe-Leu-Leu-Ala-Cys-Ala-Gly-Asn-（-5）
Phe-Val-His-Gly--His-Lys-Cys-Asp-Ile-Thr-（6）
Leu-Gln-Glu-Ile-Ile-Lys-Thr-Leu-Asn-Ser-（16）
Leu-Thr-Glu-Gln-Lys-Thr-Leu-Cys-Thr-Glu-（26）
Leu-Thr-Val-Thr-Asp-Ile-Phe-Ala-Ala-Ser-（36）
Lys-Asn-Thr-Thr-Glu-Lys-Glu-Thr-Phe-Cys-（46）
Arg-Ala-Ala-Thr-Val-Leu-Arg-Gln-Phe-Tyr-（56）
Ser-His-His-Glu-Lys-Asp-Thr-Arg-Cys-Leu-（66）
Gly-Ala-Thr-Ala-Gln-Gln-Phe-His-Arg-His-（76）
Lys-Gln-Leu-Ile-Arg-Phe-Leu-Lys-Arg-Leu-（86）
Asp-Arg-Asn-Leu-Trp-Gly-Leu-Ala-Gly-Leu-（96）
Asn-Ser-Cys-Pro-Val-Lys-Glu-Ala-Asn-Gln-（106）
Ser-Thr-Leu-Glu-Asn-Phe-Leu-Glu-Arg-Leu-（116）
Lys-Thr-Ile-Met-Arg-Glu-Lys-Tyr-Ser-Lys-（126）
Cys-Ser-Ser（129）。
7、按权利要求1至6之任一项的方法，其特征在于所述密码子顺序是由下式限定的：
CAC  AAA  TGT  GAC  ATC  ACT  CTG  CAA  GAA  ATC
ATC  AAA  ACT  CTG  AAC  TCG  TTA  ACC  GAA  CAG
AAA  ACC  CTG  TGC  ACC  GAG  CTC  ACT  GTT  ACT
GAT  ATC  TTC  GCT  GCT  TCC  AAA  AAC  ACT  ACT
GAA  AAA  GAA  ACT  TTC  TGC  AGA  GCT  GCT  ACC
GTT  CTG  CGT  CAG  TTC  TAC  TCT  CAC  CAC  GAA
AAA  GAC  ACG  CGT  TGT  CTC  GGC  GCC  ACT  GCG
CAG  CAG  TTC  CAC  CGT  CAC  AAA  CAG  CTG  ATC
AGA  TTC  CTG  AAA  CGT  CTA  GAC  CGT  AAC  CTG
TGG  GGC  CTG  GCC  GGC  CTG  AAC  TCT  TGT  CCG
GTT  AAA  GAA  GCT  AAC  CAG  TCG  ACT  CTG  GAA
AAC  TTC  CTC  GAG  CGT  CTG  AAA  ACC  ATC  ATG
CGT  GAA  AAG  TAC  TCT  AAA  TGC  TCT  TCT。
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