SK414191A3 - Human interleukin-4 - Google Patents

Description

Obiast vynálezu

Tento vynález ee týká proteínových a muteinových faktorú lidského imunitního systému a nukleových kyselín, které je kodují. Tento vynález se konkrétne týká proteínových a muteinových faktorú (spolu s nukleovými kyselinami, které je kodují), které vykazuj! aktivitu jak jako rastový faktor T bunék tak jako rústový faktor B-bunék.

Dosavadní stav techniky

Technológii rekombinantní DNA se obvykle rozumi technika integrace genetické informace ze zdroje dárce do vektorä pro následné opraoovéni (procesi), jako je napríklad zavedení do hostitele, čímž se prenesená genetická informace kopíruje a/nebo docházi k expresi v novém prostredí. Obecné existuje genetická informace ve formé komplementárni DNA (cDNA) odvozené od informační RNA (mRNA) kódujici žádaný proteínový produkt. Nosičem je často plasmid, který má schopnost inkorporovat o DNA pro pozdéjší replika c i v hosti telí a v nékterých pŕipadeoh skutočné regulovat expresi cDNA a tím ŕídífc syntézu kódovaného produktu v hotiteli·

Je známo, že imunitní odpoveú savcú je založená na sérii složitých bunečných interakcí, které se nazývaj! imunitní síČ”. Nedávne výzkumy pŕinesly nové pohledy na vnitŕní práci této šité. 1 když je jasné, že mnoho z odpovedi souvisi se siti-podobnými interakcemi lymfocytú, ma^ofágú, granulocytú a jiných bunék, imunologové se nyní obvykle pridržuj! názoru, že rozpustné proteíny (napríklad tak zvané lymfokiny nebo monokiny”) hrají rozhodující úlohu pri regulaci téchto bunečných interakcí. Existuje tedy značný zájem i isolaci, oharakterizaci a mechanismus púsobeni bunečných modulační ch fa ktorú. Jejich porozumení by mélo pŕinést prúlom do diagnosy a terapie ci&obných stavú.

- 2 ..J Ή\· i, ·. T iik ·: · · ;. -H ?

V Y: ^!P lymfokiny sfejmé zprostŕedkovávají bunečné aktivity rúznými zpúsoby. Bylo ukáž áno, že podporuj! proliferaci, rúst a diferenciaci pluripofcenciálnich hernátopoletiekých kmeňových bunék v obrovském množstvi progenitorú sestavenýoh do ráznych bunečných línií zodpovedných za imunitní odpoveď· Tyto línie často odpovídají rúzným zpúsobem, jestliže se lymfokiny používaj! ve spojení s jinými činidly· f

4zxy K,. ^;

X· -!p ’· Έί úty . -7^;V <?

; j . · „ eh/..,.

Línie bunék, které jsou zvlášté dáležité pro imunitní odpovéď, zahrnují dvé tfídy lymfocytúí B-bunky, které mohou produkovat a ôékretovat imunoglobulíny (proteíny se schopností rozoznávat a vázat oízi látku, aby jl bylo možno odstranit) a Φ-bunky rúzných p Odra d, které sekretují lymfokiny a indukuj! nebo potlačuj! B-bunky a néktaré další bunky (včetné jiných T-bunék), čímž se vytváfí imunitní síi·

Jinoudúle šitou bunečnou linií je žirná bunka (která nebyla positivné identifikována u všech savčioh druhú)

- granule obsahujicí spojovací tkánová bunka umísténá bez’ prostredné vedie kapilár v celém tele, ve zvlášté vysokých koncentracích v plicích, kuši a v gastroíntestinální a v genitsourinéraím faktu· 2irné bunky hraj! hlavní roli v porucháchsouvisejících s alergií, zvlášté anaíylaxi: jestliže vybrané antigény zesíčuji jednu tŕídu imunoglobulínú navázanýchna receptory na povrchu žirné bunky, tato žirná bunka degranuluje a uvolňuje mediátory (napríklad histamín, serotohín, hsparin, prostáglandiny atd.), které zpúsobují alergické reakce» napríklad anafylaxi.

Píl výskumu smérujícimu k lepšímu pochopení (a tedy /potenciálni terapeutické léčbé) rúzných imunitních porúch pPekáži obecná neschopnost uchováva t bunky ímunitního systému in vitro· Imunologové objovili, že kultivování tô ch to bunék lze dosáhnout s použitím supernatantú T-bunék a jiných bunék, které obsahují rústové faktory, jako jsou napríklad nékteré lymfokiny· ' ’ ŕ‘ ·'

Detekae, isolace a čisténi fektorú, jako jsou napŕí- 3 ~ klad lymfokiny e jiné rozpustné medlátory imunitních reakci je mimoŕádné obtížná a je často komplikována povahou supernatantú, v nichž se faktory nacházejí, divergencí a zkríženými aktivitami rúznýoh složek ve smesích, citlivosti (nebo nedostatkem citlivosti) analýz» které se použivají pro stanovení faktorú, častými podobnostmi v molekulových hmotách a jinými vlastnostmi faktoru, a velmi nízkou koncentrací faktorú v jejich prirodnim prostredí.

Jak se stává dostupnými stále vice lymfokinú, primárné molekulárnim klonováním, zvýšil se zájem o nalezení klinických aplikaoí pro tyto lymfokiny. Diky své fy Biologické podobnosti s hormony (napríklad rozpustné faktory, rústovó mediátory, púsobení pros tŕednictvím receptorú bunék) je popenciálni použiváni lymfokinú analogické bežnému používáni hormonú, napríklad: Baxter: Ha túre 321. 193 (1936). Jednou možnosti je, že hladiny lymfokinú u pacienta lze pŕlmo nebo nepfimo upravovat tak, aby tyto úpravy pŕínesly prospšéné imunitní odpovédi, napríklad potlačení zánétu, alergie nebo odmitání tkáné nebo stimuleci nebo zvýšení potence proti infekci nebo proti malignimu rústu. Mezi další potenciálni klinická použití lymfokinú patrí uchovávéní a expandování in vitro populace jistých bunék imunitniho systému od jedné osoby pro prípadné zpétné zavedení do stejné nebo do jiné osoby, aby se tak dosáhlo prospéšného účinku. Napríklad se bežné provádéji výskumy, ktorými se zjiščuje, jestli populace lymfokinem aktivovaných zabíjeolch T-bunék (zabiješú) pacienta mohou být expandovány mimo jeho nebo jeji telo a potom zpétné injekcl vnesený tak, aby se dosáhlo zvýšené protinádorové odpovedi. J iným potenciálnim klinickým použitím lymfokinú, zvlášté faktorú stimulujících kolonie, jako je napríklad faktor stimuluj í ci kolonli graoulocyt-makrofág (GM-CSF), s faktorú zvyšujících jejich aktivity, je stimulace generace krevnich bunék, napŕíklaS^jred- nebo post-chemoterapií nebo pred- či post-radiační terapii proti nádorúKjpŕi léčení myeloidní hypoplasie nebo pri léčení syndrómy deficience neutrofilú ÍDexters Náture 321. 193 (1936).J. Takové faktory by mohly být užitočné také pri

- 4 terapii transplantátem kostní drené, který se stále více používá pri léčení aplastické e nemí e nebo j istých leukémií·

Existují dvé vlastnosti lyafokínú, které mají dáležitý dásledek pri takových klinických aplikacích: jednotlivé lymfokiny jsou často pleiotropnif biologické účinky jednoho lymfokinu lze obvykle modulovat alespoň jednim jiným lymfokinem, buú inhibicí nebo zesilením. Napríklad nádorový nektoŕioký faktor, který vykazuje synergismus s gama-interferonea, stimuluje produkci interleukínu-1 (IL-1) a múže aktivovat fagocytovou aktivitu neutrofilú. k»l, protein produkovaný aktivovanými makrofágy, zprjjtredkovává rozmanité biologické aktivity včetne stimulace proéerace thn$ooytú indukcí uvolnování interleukinu-2 (IL-2), stimulace maturace a proliferaoe B-lymfocytú, aktivity fibroblastového rústového faktoru e indukce syntézy proteinú v akútni fázi hepstocyty. 0 IL-1 bylo také popsáno, že stimuluje uvolnování prostáglandinu a kolagenasy ze synoviálních bunék a že je identický s endogenním pyrôgenem: Erampschaidt: J· Leuk. Biol· 36, 341 až (1984).

lnterleuki&-2, drive označovaný jako rústový faktor Τ-bunék» je lymfokin, který je produkován T-tunkami, které jscru aktivovány lektinem nebo antigenem· fitezi popsané biologické aktivity IL-2 patrí stimulace dlouhodobého in vitro r&stu kloná aktivovaných T-bunék, zvýšení mitogenese thymocytú. a indukce reaktivity oytotoxických T-bunék a odpovédí plaky tvoŕicích bunék v kultúrach bunék ze sleziny nahých myši· Navíc bylo ukáž áno, že podobné jako interferony (IFN) IL-2 zvyšuje aktivitu pŕirozených zabiječú, z ôehož vyplývá možnost potenciálniho použití pri léčení nádorových onemocnení s Henney a spol.: Náture 291, 335 až 35θ (1981)· V této terapii již byly popsány nékteré úspechy, napr. Lotze a Rosenberg: Treatment of Tumor Patients with Purified Human Interleukin-2, strany 711 až 719 v .publikaci Sorga e spol· (red.)s Cellular and Molecular Biology of Lymphokinee (Académic Press, Inc·, New York, 1985) a Rosenberg a Lotze: ’Oancer Xmmunotherapy U s ing lnterleukin-2 and Interleukin-2-éetpvated Lymphocytes”, ánn. Rev· Immunol· 4, 681 až

709 (196®). Avšak toxicita IL-2 omezuje dávkování (které lze použít u pacientú trpícich nádorovým onemocnšním) » ktorým by se dosáhlo výhodnosti techto vlastností! Lotze a Rosenberg, strany 711 až 719 Q Welte a spel.# strany 799 až 799 ve shora uvedené oitaci Sorga a spel.(red·)·

Metcalf D· e The Hematopoietic Colony Stimulating Pactors” (Elsevier_v Masterdem, Ϊ984) poskytuje pŕehled výskumu týkajiciho se lymfokinú z rúzných faktorú, které spadají do imunitní odpovedi savoú. Yung Y. P. a spol·! J· Immunol. 127. 794 (1931) popisuje částečne čištšni proteínu o molekulové hmote 59 000»který vykazuje aktivitu r úst oW/f s ktorú žirných bunek (M0G3?) a jeho oddélení od interleukiau-2 (IL-2), 'také známého jako rústový faktor T-bunčk. Kábel G. a spol. (Náture 291. 332 (1981).) popisujl íäOGP s molekulovou hmotou asi *9 000 a s pi asi 6,0. Clarfc-Lawis I. a Schrader «Γ. (J. Immunol. 127. 19*1 (1931)·) popisují protein s aktivitou rústového faktoru podobající se MCGF aktivite o molekulové hmote asi 29 000 ve fosforečnanom pufrovaném solném roztoku a asi 23 000 v 6ffi hydrochloridu guanidinu s pl asi 4 až 8, ale s pl asi 6 až 3 po zpracování s neuraminidáseu· Ký ši IL-2 a interleukin-3 (H»-3) byly částečné charakterlzovány biochemický Gillisem S· a spol. s J. Immunol· 124. 1994 až 1962 (1930) a Ihlám J· a spol·! J· Immunol· 129. 2431 až 2436 (1982)i IL-2 mšl zdánlivou molekulovou hmotu (možná jako dimér) asi 30 000 až 59 000» IL-3 mel molekulovou hmotu asi 28 QOO. Lidský ZI^*2 má zdánlivou molekulovou hmotu asi 19 000 a byl popsán Gillisem S· a spol. (iEuann, Rev. 65. 167 až 209 (1932)·)· Srovnáni aktivít II»—3 a MOGF supernatantú T-bunšk bylo popsáno Yungem Y. a spol·: Conteap. Top. Mol. Immunol· 10. 147 až 179 (1939) a Reaniokem D. a spol. i J. Immunol, 134. 910 až 919 (1939).

Existuje rozsáhlé literatúra týkajíci se regulace rústu B-bunek a diferenciaoe rozpustnými faktory» pro pŕehled viz napríklad Howard a Paul» Aon. Rev. Immunol. l_t 307 až 993 (1989)» Howard a spol. 1 Immunol. Rev. *73. 189 až 210 (1934)» Kíshimoto a spol.: Immunol. Rev. 73· 97 až 113

- 6 (198*0 a Eishimoto: Ann. Bev. Immunol· až 19?

(1939)· Existuj! jieté zmätky kolem nomenklatúry používané pro značení nižných f a ktoré, které vyplývaj! z toho, že se používají rúzné výchozí materiály, z obtíží pri čišténí a z rozdílú v analýzách používaných pro deflnování jejich bi· ©logických aktivít. V nékterých prípadoch bylo v otázkách nomenklatúry dosaženo dohody s Paul: Immuáology Today 4, >22 (1989) a Paul t Molecular Immunol. 21. 343 (1984).

Aktivita rústové faktoru B-bunék (BCGP) je charakterizována schopností vyvolá t syntézu DNA v B-bunkách, které jsou souČasné stimulovány vystavením púsobení anti-IgM nebo podobných antigenú. Pŕedpokládá se, že interleukin-1 (IE-1) je Zapotfebí také pro to, aby došlo k projevu BCGF aktivity, alespoň tehdy, jestliže se analýza provádí s nízkými husto» tami B-bunék. Pro lidský BCGP jsou popsány také j iné analýzy, napríklad Maizel a spol. s Proc. Natl. Acad. Sci. 80. 904? až 909i (1983) (podpora dlouhotrvajícího rústu lidských B-bunék v kultufe). Aktivita, kteŕá souvisi s drívšjší analýzou, byla označená také jako aktivita stimulujicího faktoru -1 B-bunék (BSP-1) a BCGP X, aby se odližovaly od podobných a/nebo souvisejících aktivít. Podobné byla popsána aktivita označená BCGP II. Je charakter izována schopností vyvoval syntézu DBA v B-bunkách, které jsou stimulovány mátogenem nebo v transformovaných liniíoh B-bunék. Mezi mitogeny, které souviseji s BCGP II aktivitou, patrí dextran-sulfát, lípopolysacharid a extrakty Staphyloooocus. BCGP I v téchto testech neregistruje žádnou odpovéá. U lidí sé pŕedpokládá, že BCGP II je molekula s molekulovou hmotou asi 90 000 a žepúsobí synergický s BCGF I (tj. BSF-1) pri podpore prollferaoe B-bunék v imunitní odpovedi» Yoahízaka a spol·»

i. Imunol. 130. 1241 až 1246 (1983). Hoasard a spol.# ®Xp. lled, 193. 914 až 923 (1932) byli první, kteŕí uká•Xi«tenči m^šiho BCGP (pozdéji byl nazýván rúzné: p&t B8P-1 nebo indukční faktor IgG^) rozdílného od snkinu-2· Podobná pozorováni byla popsána téméŕ souBTO lidský systém Toshizakim a spol·» ď. Immunol.

' až I3OI (1982) a pozdéji Okadou a spol. s J. Exp. 583 až 990 (1983).

- 3-Biochemická a biologická charakterizace molekúl, které vykazuj! BGGF (nebo BSF-l) aktivitu od téchto prvních objevu stále stoupá. Maizel a spol. (Proc· Natl. Acad. Sci. 79.

599® 6002 (1982)·) popsali ne trypsin citlivý lidský

BCGF s molekulovou hmotou 12 000 až 13 000 a e isoelektríciým. bodem (pl) asi 6,3 až 6,6. Farrar a spol· (J. Immunol· 151, 1353 až 1342 (1935)·) popsali Částečné čišténi heterogenniho myšího BCGF s molekulovými hmotami 11 000 a 15 000 (podie SDS-PAGE) s pl 6,4 až 3,7· Ohara a Paul (Náture 315· 333 až 336 (1935)·) popisuj! monoklonální protilátku špecifickou pro myši B3F-1. Pro BSF-l uvádéji molekulové hmoty 14 OCX) a 19 000 až 20 000 s pl 6,7· Butler a spol· (J· Immunol·

133· 251 až 255 (I934).) popisuj í lidský BGGF o molekulové hmote 13 000 až 20 000 s pl 6,3 až 6,6· Bubis a spol· (Proc· Natl, Acad. Sei. 82 , 2935 až 2939 (1935).) popisuje, že pŕedinkubace klidových B-bunék s BSF-l pred vystavením púsobení anti-IgM protilátok zvyšuje bunečný objem a pozdéji zrychluje vstup do S-fáze po vystavení púsobení anti-IgK protilátok· Vitetta s pol. (J. Exp. Ked. 162· 1726 až 1751 (1985).) popisuje částečné čistení myších BSF-l supernatantú EL-4 bunek neobsahujicích sérum HPLC na obránených fázích· Podie SDS-PAGE má proteín molekulovou hmotu asi 20 000 až 22 000, Ohara a spol. (σ. Immunol. 130. 2518 až 2523 (1985).) také popisují částečné čišténi myšího BSF1 podobným postupem a současné uvádéji, že faktor je protelnem o molekulové hmote asi 13 000 až 21 700. Sideras a spol· (Eur· J. Immunol· 1^» 536 až 595 a 595 až 598 (1985) popisuj! částečné čistení myšího IgG^-indukujícího faktoru, tj, BSF-l, a uvádéji, že faktor je protelnem o molekulové hmoté asi 20 000 s pl 7,2 až 7>4 a 6,2 až 6,4« Smith a Renníck (Proc. Natl, Acad· Soí· 8£, 1857 až 1861 (1986).) popisuj í dšlení faktoru od IL-2 a IL-3, který vykazuje aktivitu rústového faktoru T bunék a aktivitu rústového faktoru žirných bunék. Pozdéji Noíjaa a spob (Náture 519. 640 až 646 (1936)·) klonovali a sekvenovsli nukleovou kyselinu kodujici faktor podie Siderase a spol a Lee a spol· (^roc. Natl· Acad. Sci· 83« 2061 až 2065 (1986)·) klonovali a sekvenoveli nukleovou kyselinu kodujici faktor podie Smitha a Rennicka. Nedávno Grabstein (J, Exp. Sed. 163, 1405 až 1414 (1986).) popsali čišténi a sekvenovéní myšího BSF-l.

— '2 —

Milanese a spol. (Science 231, 1118 až 1122 (1986).) popisuje lymfokin, který se nepodobá BSF—1 a který provisor— nš označili IL-4A. Jejich IL-4A je protein o molekulové hmote 10 000 až 12 000, který je vylučován pomocnými T bunkami po zesičování T3-Ti receptorú. Stimuluje klidové lymfocyty interakcí s Tll receptory a následujici indukoí receptorú interleukinu-2 (IL-2).

Sanderson a spol. (Proc. Natl. Acad. Sci. 83, 43? až 440 (1986)·) navrhli pojmenovat eosínofilní diferenciální faktor interleukin 4 na záklsdé dúkazu, že je zrejmé shodný s rústovým faktorom 11 B hunék.

pŕe^cházejíciho je zrejmé, že objev a vývoj nových lymfokinú by mohl pŕispét k rozvoji terapii pro široký rozsah degeneračních stavú, které pŕímo nebo nepŕímo zahrnují imunitní systém a/nebo herná topole t ické bunky. Objev a vývoj lymfokinú, které zvyšuj! potenciál pŕíssnivých aktivít znáaých lymfokinú, by byl velioe výhodný. Napríklad dávku omezující toxicita IL-2 pri léšeni nádoru by mohla být snížena tím, kdyby byly dostupné lymfokiny nebo kofa ktorý ee sesilujícími účinky. Nebo by bylo možné zvýšit účinnost transplantátú kostní dŕené, kdyby byly dostupné faktory, které by zesilovaly aktivitu faktorú stimulujicich kolonie.

Podstata vynálezu

Tento vynález se týká lidského interleukinu-4 (Ilr-4). Tento vynález zahrnuje nukleové kyseliny, které kodují poly peptidy vy kazu jici IL-4 aktivitu, tyto peptidy samotné a zpúsoby jejich výroby. Nukleové lgrseliny podie tohoto vynálezu jsou definovány 1) jejich homologii s klonovanými komplementárnimi DNA (cDNA) sekvenoemi popsanými zde a 2) funkčními analýzami IIr-4 aktivity polypeptidú kódovaných témito nukleovými kyselinami· Pojem IL-4 aktivita tak, jak je zde používán u proteínu nebo polypeptidu, znamená, že protein nebo polypeptid vykazuje jak aktivitu rústového faktoru B bunék (BCGP aktivitu) tak aktivitu rústového faktoru T bunék (TCGF aktivitu). IL-4 aktivita%tanovuje druhové-spe- 9 V cifickými TGGF a BCGF analýzami. Jak zde bude dále úplné j i vysvetleno, špecifická uspoŕádání IL-4 mohou být dále charak· terizována ďalšími analýzami. Napríklad nékteré formy lldské· ho IIk-4 zesilují aktivitu TCGF IL-2, nékteré formy lidského IZh-4 zesilují GM-CSF stimulovanou proliferaoi j istých typá bunék, nékteré formy lidského II»-2 mohou indukovat expresi Fc-epsilon receptoru v B bunkách a nékteré formy lidského IL-4 mohou indukovat expresi MHC (Major compatibility complex) v B bunkáchs trída II DR antigénu v lidských B bunkách a Xa antigénu v myších B bunkách.

Tento vynález je založen zčásti na objevu a klonováni cDNA, kfceré jsou schopný expresi poskytovat proteíny s IL-4 aktivitou. Mezi cDNA klony podie tohoto vynáJLezu patri lidské c® inserty plasmidových vektor á kloň 46 (také zde označovaný jako pcD-2Fl-13 nebo pcD-46) a kloň 125” (také zde označovaný jako pcD-125). Jiným zajlmavým klonem je cDNA insert plasmidového vektoru pcD-2A-E5. Tyto triVektory jsou uložený v American Type Culture Collection (ATOC)_P Sockville Bäd., pod ATCG číslem 55 557, 67 029 a 55 550.

Tento vynález se týká nukleových kyselin s nukleotidovými eekvencemi, které jsou efektivné homologni s cDNA klony podie tohoto vynálezu e které expresi poskytuj! ID-4 aktivitu. Nukleové kyseliny a proteíny podie tohoto vynálezu mohou být odvozený od shora uvedených cDNÁ standardními tech nikami mutace sekvenci nukleových kyselin. Mohou sepŕipravovat de novo z bunščných línii odvozených od imunitního systému, jako jsou napríklad hybridomy T bunék, které obsahuj! nebo mohou být indukovány tak, aby obsahovalý sekvence informační SNA (mRNA) kódu jici IIr-4. Mohou se získávat sondovánim DNA nebo RNA extraktú nebo bank sondami odcývzenými od cDNA klonú. podie tohoto vynálezu.

Pojem efektivné homologni tak, jak je zde; ppužíván, znamená, že sekvence nukleotidu je schopná být d0égována hybridizační sondou odvozenou od cDNA klonu podie tohoto vynálezu. Presné číselné vy jádreni homologie nutné pro detekci nukleových kyselín kodujicioh IL-4 aktivitu závisí na néko- 10 lika fakt orech, mezi než patrí s 1) homologie sondy s ne-IL-4 kodujícími sekvencemi asociovanými s cilovými nukleovými kyselinami, dúraznost hybridizačních podmínek, 3) skutečnosti, zda se.používají jednovlákaové nebo dvouvláknové sondy, 4) skutečnosti, zda se používaji sondy RNA nebo DNA, 3) velikošti redukce nešpecifické väzby sondy, 6) povahy markeru, který se používá pro detekci sondy, 7) frakce guanidinových a cytosinových baží v sonde, 3) distrShuce chybných párování aiezl sondou a cilem, 9) velikosti sondy spod.

Efektívne homologní sonda odvozená od cDNA podie tohoto vynýlezu je s výhodou alespoň z 50 prooent (50 %) homologní se sekvenol, která se isoluje· Efektívne homologní sonda odvozená od cDNA podie tohoto vynálezu je výhodnej! alespoň ze sedmdesáti peti až osmdesáti prooent (75 až 80 %) homologní se sekvenol, která se isoluje. Efektívne homologní sonda odvozená od cDNA podie tohoto vynálezu je nejvýhodneji alespoň z devadesáti prooent (90 %) homologní se sekvencí, která se isoluje,

Homologie, jak je zde tento pojem používáa, znamená míru podobností mezi dvéma sekvencemi nukle tidú (nebo aminokyselín)· Homologie se vyjadruje jako zlomék nebo procento baží s ohybným párováním (nebo procento aminokyselín s ohybným párovaním) po tom, co se obš sekvenee (možné, že nemají stejné délky) seŕadí vedie sebe· Pojem séra žení je zde použiván ve smyslu podie Sankoffa a Kruskela, viz kapitola prvá v Time Warps, Stxing Edite, and &acromolecules« The Theory andPractice of Sequenee Comparison” (Addison-Wesley, Reading, Ma., 1983). Zhruba ŕečeno - dve sekvenee se seŕadí tak, že se maximalizuje počet baží (nebo aminokyselín) s chybným párováním mezi témito dvéma sekvencemi s vložením mlnimálního počtu prázdných” nebo nulových baží v kterékoliv sekvencí tak, aby došlo k maximálnímu prekryvu. Pro dané dvé sekvenee jsou dostupné algoritmy pro výpočet jejich homolqgíe: napr· Needleham a Wunschs J, Mo(, Biol· 48, 443 až 453 (1970) a Sankoff a Kraska 1 (shora uvedená citace), straň⁸ ^3 až 29· provádení takových srovnání jsou dostupné také komerční služby, napr· Intelligenetics, Inc.

(Palb Alto, Ka., USA).

-11 'Hento vynález se také týká pŕírodních lidských rústovýhh faktorú (polypeptidú), které vykazuj! široké spektrum ak. tivity pro rúzné bunky spsda jící-do imunitná, odpovedi. Zpúsoby prípravy takových faktorú a jejich použití pro in vivo léčení lidi je rovnéž pŕedmetem tohoto vynálezu. Tyto polypeptidové prostŕedky obsahuji lidský faktor v podstjé v čistém stavu schopný vy kazovat stimulační aktivitu na B bunky₉ T bunky a na žirné bunky·

Tyto faktory, které byly púvodnš isolovány z kapaliny supernatantu rúzných T bunék, obsahuj! prírodní polypeptidy, které maj! za neredukujicích podmínek molekulovou hmotu asi

000 nebo 15 000, nebo aktivní fragmenty takových polypeptidú. Tyto faktory se mohou používat samotné nebo společnš s jinými sloučeninami pro rúzné diagnostické nebo terapeutické účely včetné prípravy špecifických protilátok.

Výhodným uspoŕádáním podie tohoto vynálezu je rada glykosylovaných nebo neglykosylovaných lidských IL-4 proteinú a muteinú následujícicho obecného vzorce I t

X(His)	-	X(Lys)	-	X<Cys)	-	X(Asp)	-	X(Ile)		X(Thr)	-
X (Leu)	-	X(Gln)	-	X(Glu)	w	X(Ile)	«»	X(Ile)	«a»’	X(I#s)	-
X (Thr)	-	X(Leu)	-	X(Asn)	-	X(8er)	-	X (Leu)	-	X(Thr)	-
X(Glu)	-	X(Gla)	•	X(Lys)	-	X(Thr)	-	X (Leu)	-	X(Cys)	-
X(Thr)	-	X(Glu)	-	X(Leu)	•	X(Tfar)	-	X(Val)	-	X(Thr)	-
X(Asp>	-	X(Ile)	-	X(Phe)	-	X(Lla)	-	X(Ala)	-	X(Ser)	-
X(Lys)	-	X(Asn)	-	X(Thr)	-	X(Thr)	-	X(Glu)	•	X(lys)	-
X(Glu)	-	X(Thr)	-	X(PHe)	-	X(Oys)	M*»	X(Arg)	-	X(Ala)	-
X (Ale)	-	X(Thr)	-	X(Val)	-	X(Leu)	-	X(Arg)		X(Gln)	-
X(Phe)	-	X(Tyr)	-	X(Ser)	«Η»	X(His)	-	X (His)	-	X(Glu)	-
X(Lys)	-	X(Asp)	-	X(Thr)		X(Arg)	e»	x<cys)	-	X (Leu)	-
X(Gly)	-	X(Ala)	-	X(Thr)	-	X(Ale)	-	X(Gln)	-	X(Gln)	-
X(Phe)	-	X(His)	-	X(Agr)	-	X(His)	-	X(Lye)	-	X(Gln)	•
X (Leu)	-	X(Ile)	-	X(Arg)	-	X(Phe)	-	X (Leu)	-	X(Iys)	-
X(Arg)	-	X(Leu)	-	X(Asp)	-	X(Arg)	-	X(Asn)	-	X (Leu)	-
X(Trp)	-	X(Gly)	-	X(Leu)	-	X(Ala)	-	X(Gly)	-	X(Leu)	-
X(Asn)	-	X(Ser)	-	X(Cys)	*	X(Pro)	-	X(Val)	-	X(Iys)	-
X(Glu)	-	X(Ala)	-	X(Asn)	-	X(Gln)	-	X(Ser)	-	X(Thr)	-
X (Leu)	-	X(Glu)	«	X(Asn)	-	X(Ehe)	-	X(Leu)	-	X (Glu)	-

X(Arg) - X(Leu) - X(Iys) - X(Thr) - X(Ile) « X(Met) X(Arg) - X (Glu) - X(Lys) - X(Tyr) - X(Ser) - X(Iys) X(Oys) - X(Ser) - X(Ser) v némž výraz X(Xas) znamená skupinu synonymEiích aminokyselín k aminokyseline Xaa. Synonyma! aminokyseliny v této skupiné maj! podstatné podobné fyzikálne-chemické vlastnosti pri substituoi mezi členy této skupiny· ktorými se zaGhovává biologická funkce molekuly (Granthams Science 185. 862 až 864 (1974)·)· Je zrejmé, že ve shora uvedené sekvenci lze provést inseroe a delece aminokyselín aniž by dožlo ke zménš biologické funkce, zvlášté jestliže inseroe nebo deleoe obsahuj! pouze nékolik aminokyselín, napríklad pod dese t, s jestliže se neodstraňuj! nebo nenahrazuj! aminokyseliny, které jsou rozhodujíci pro funkční konformaoi, napríklad oysteinovýoh skupín, viz napr. Anfinsefi: ⁿPrinoiples That Govern the Folding of Proteín Chains, Science 131. 225 až 250 (1975)· Proteíny a mu t e iny produkované takovými delecmi a/nebo inseroemi jsou v rozsahu tohoto vynálezu. Pokud je na zbytek aminokyselín proteínu obecného vzorce 1 odkazováno čislem, toto číslo nebo čísla jsou vztažena k N-konci proteínu.

Synonymnímí aminokyselinami jsou s výhodou ty aminokyseliny, které jsou uvedený v tabulce I. Výhodnejšími aminokyselinami jsou ty aminokyseliny, které jsou v tabulce I uvedeny pred druhým lomí tkem v každé rádce. Ne j výhodné j ši aminokyseliny jsou ty aminokyseliny, které jsou v tabulce I uvueny pred prvnim lomí tkem v každé rádce.

Tabulka I

Výhodné skupiny synonymnlch aminokyselín

amino- kyselina	synonymu! skupina
Ser	Ser,//Thr, Gly, Asn
Arg	Arg,/His, lys,/Glu, Gin
Leu	Leu, íle, žäet,/, Phe, /Val, Tyr
Pro	Pro,/Ala,/Thr, Gly
Thr	Thr,//Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin

Tabulka I (pokračování)
amino- kyselina	synonymni skupina
Thr	Thr, // Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin
Ala	Ala, / Pro, / Gly, Thr
Val	Val, / Met, íle / Tyr, Phe, Leu, Val
Gly	Gly, // Ala, Thr, Pro, SQr
íle	íle, Met, Leu, /Phe, Val, / íle, Tyr
Phe	Phe, /Met , Tyr, íle, Leu, /Trp , Val
Tyr	Tyr, / Phe, / Trp, Met, íle, Val, Leu
Cys	Cys, Ser, // Thr
His	His, / Gin, Arg, / lys, Glu, Thr
Gin	Gin, / Glu, His, / lys, Asn, Thr, Arg
Asn	Asn, / Asp, / Ser, Gin
Lys	lys, / Arg, / Glu, Gin, His
Asp	Asp, / Asn, / Glu
Glu	Glu, / Gin, / Asp, lys, Asn, His, Arg
Met	Met, íle, Leu, / Phe, Val

’i'ento vynález ee týká polypeptidú obecného vzoroe I e aminokyselinovými substitucend (mezi aminokyselinou pŕírodního lidského HM a synonymni aminokyselinou) v jedné nebo ve více polohách. Pojem K-krát substituovaný” ee zde peužívá k popsání podrady polypeptidú obecného vzorce I, v nšmž jsou prírodní aminokyseliny substituovány synonymaími aminokyselinami a to alespoň v N-polohách. Tak napríklad skupina

1-krát substituovaných polypeptidú obecného vzorce 1 sestává z 559 polypeptidú výhodných skupín synonymních ^côinokyselin, 189 výhodnejších skupín synonymních aminokyselín a 56 najvýhodnejších skupín synonymních aminokyselín· Tyto počty se spočítají tak, že se seČte počet aminokyselín každého druhu v pŕírodním ŕetšzci a vynásobí se velikostí skupiny synonymních aminokyselín pro každou aminokyselinu. Skupina lidských HM polypeptidú s výhodou sestává z 10-krát substituovaných polypeptidú obecného vzorce X, výhodné j i sestává z 3-krát substituovaných polypeptidú obecného vzorce I a nejvýhodneji sestává z 1-krát substituovaných polypeptidú obecného vzorce X, ktorou je zvláštš prírodní lid14 ©ký IL-4 polypeptid, jeho© sekvence je ilustrovaná na obrázku 1G výkresu.

Podobné pojem N-krát-vložený ve vztahu k polypeptidu obecného vzorce I se zde použivá k popsáni rady poly peptidu, v níž bylo do sekvence definované obecným vzoreem Z vlošeno od 1 do N aminokyselín· Vložené aminokyseliny se s výhodou vyberou z výhodných skupín synonymních aminokyselín (Tabúlka I) s aminokyselín obklopujicich inserci, výhodnej1 ee vyberou z výhodnejších aminokyselín (tabulka I) aminokyselín obklopujiclch inserci a nejvýhodnéji se vyberou z nejvýhodne j ši c h aminokyselín (tabulka I) aminokyselín obklopujiclch inserci. Tak napríklad jedna podskupina skupiny s 1-krát vloženými peptidy obsahuje aminokyselinu vloženou mezi H-konec (X(His) a pŕilehlý X(Gly). Inserce, které jsou definovány členy této podskupiny, jsou s výhodou vy brány ze skupiny sestávající z Pro, Ala, Gly, Thr, Ser, Glu, Gin,

Arg, Hls a lys, výhodnej! jsou vy brány ze skupiny sestávajíoí z Gly, His, Gin a Arg a ne jvýhodné ji jsou vy brány ze skupiny sestávajlcí z His a Gly. Inserce lze zavést mezi jakékoliv pŕilehlé aminokyseliny obecného vzorce I. Jelikož je možných 128 mís t inserce a jelikož je možné provádšt násobné inserce do stejného mís ta, pro 2-j^át vložený peptid obecného vzorce I existuje tedy 16 >84 podskupín peptidá·

Velikost každé podskupiny závisí na velikosti skupín ami. nokyselin synonymnioh s aminokyselinami objLýfipující inserci.,

Pojem N-krát deletovaný” ve vztahu k polypeptidúm obecného vzorce I je použiván k popsáni rady peptidä. s 1 až H aminokyselinami deletovanými ze sekvence obecného vzorce I. Sada 1-krát deletovaných polypeptidu obecného vzorce I tedy sestává ze 129 podskupín polypeptidä každého o délce 128 aminokyselín (128-mer). Každá z pod^upin dále sestává ze všech 128-merä definovaných výhodnými, výhodnejšími a najvýhodnejšími skupinami synonymnioh aminokyselín· i

Shora uvedené výhodné uspoŕádání podie tohoto vynálezu · \ zahnú j e sekvence nukleotidu efektívne homologsiích schopných \ kodovat polypeptidy obecného vzorce I pro výhodné, výhodnéjíí \ \

- 15 · a najvýhodnejší skupiny synonymních aminokyselín· Výhodnejší sekvence nukleotidú jsou schopný kodova t polypeptidy obecného vzorce I pro výhodné· výhodnejší a nejvýhodnčjší skupiny synonymních aminokyselín.

Tento vynález se zvlášté týká prirodniho lidského IL-4, sekvence aminokyselín· která je ilustrována na obrázku 1· a všech eekvencí nukleotidú, které jsou schopný jí kodovat·

Pro oznaôování aminokyselín· nukleotidú, reštrikční ch endonukleas apod· jsou v tomto spisu používány štandardní zkratkyf napríklad Cohn: “Nomenclature and Symbolism of α-Amino Acids” v “Methods in Enzymology 106. 3 až 17 (1984) a Wood a spol.: Biochemistry: A Problems Approaoh”, druhé vydáni (Benjamín· Menlo Park, 1981) a také Roberts: “Directory of Bestriction Endonucleases v Ifethods in Enzymology 68. 27 až 40 (1979).

Tento vynález se týká problómú, které souvisejí s použitím imunoregulačních činidel pro léčení humánních nebo veterinárníoh chorob. Podie tohoto vynálezu se zvláštč zlskávají sloučeniny, které mají priznivé účinky, jestliže se používaj! samotné· Nebo mohou tyto sloučeniny púsobit spoločne s j inými lymfokiny a mediátory imunitniho systému tak, aby se eískaly priznivé účinky.

Hyní budou popsána výhodná uspoŕádáni tohoto vynálezu, zčásti v souvislosti s doprpovázejicími výkresy, t j. obrázky 1 až 19·

Obrázek IA ilustruje sekvenci nukleotidú a odvozenou sekvenci aminokyselín insertu vektoru pcD-2A~E3, který expres! poskytuje myší IL-4.

Obrázek 1B ilustru^ekvenci nukleotidú a odvozenou sekvenci aminokyselín insertu vektoru pcD-125, který expresí poskytuje myší IL-4.

Obrázek 10 ilustruje sekvenci aminokyselín vyčisteného prírodního lidského IIr-4, který je získáván eicpresí a sekreči v opičích bunkách COS 7 transfektovaných pcD-125.

ft

Gbrázek 2A je mapa vektoru pcD-2A-EJ, insertu, který kóduje myši IL-4.

Obrázok 2B je mapa štepení insertu vektoru poD-2á-52 restrikčnimi endonukleasami.

Obrázok 20 je mapa vektoru peD-46, insertu, který kóduje lidský II*-⁴·

Obrázok 2D je mapa štepení insertu vektoru pcD-46 restrikčaími endonukleasami·

Obrázok JA ilustruje relatívni TCGF aktivity (v závislosti na sredéní) rúzných kultur supernatantú včetné supernatantu z kutlury bunék COS 7 transfektovaných pcD-2A-E5 (krivka 1)·

Obrázok JB ilustruje relatívni MCGE aktivity (v závislosti na zŕeďéní) rúzných kul tur super na ta^fiú vóetne supernatantu e kultury bunék COS 7 transfektovaných pcD-2A.Ej (krivka 1).

Obrázok 50 ilustruje relatívni stupeň ináukee la produkovaného označenými mnpžstvími supernatantu z bunek COS 7 transfektovaných pcD-2A-EJ (krivka 1), bunék Cl.Lyl⁺2*’/9 (krivka 2) a plané transfektovaných bunék COS 7 (krivke J).

Obrázok JD graficky ilustruje rozsah indukce XgE s IgG^ super na t entý bunék COS 7 transfektovaných pcD-2A-EJ a rúzných kontrol v myších slezinových bunkách bez I bunšk·

Obrázok 4A ilustruje TCGF aktivity nékolika pcD-125 transfektovaných supernatantú a kontrol méŕených analýzou kolorimetrlcké proliferace línie na faktoru závislých lidských pomocných T bunék, JL-EBV.

Obrázek 4B ilustruje TCGF aktivity nékolika pcD-125 transfektovaných supernatantô s kontrol mérených analýzou kalorimetrické proliferaoe PHA-stimulovaných perifernich krevnieh lymfocytú.

Obrázek 49 ilustruje TCGF aktivity pcD-125 toansfektovených supernatantô a kontrol môžených inkorporací tolerovaného thymidinu PHA-stimulovanými per^ierními krevníai lymfocyty.

Obrázek je histogram četnosti bunek v závislosti na intensité fluorescence pro kontrolu populace stimulovaných lidských tonsilních B bunék, jejichž Fc-epsilon receptory byly označený fluorescencie

Obrázek 53 je histogram četnosti bunék v závislosti na inensltš fluorescence pro kontrolu populace stimulovaných lidských tonsilnich B bunék, které byly vystavený pôsobení média se stáva jícího z 0,1 % supernatantu bunék COS 7 transfektovaných pcD-125 a jejichž Fc-epsilon receptory byly označený fluorescencie

Obrázek 5C je histogram četnosti bunék v závislosti na intensité fluorescence pro kontrolu populace stimulovaných lidských tonsilnich B bunék, které byly Stavený pôsobení média sestávajicího z 1 % supernatantu bunék: COS 7 toansfektovaných pcD-125 a jejichž Fc-epsilon receptory byly označeny fluorescencie

Obrázek 5D je histogram četnosti bunék v závislosti na intensité fluorescence pro kontrolu populace stimulovaných lidských tonsilnich bunék B, které byly vystavený pusobeni média sestáva jicího z 10 % supernatantu bunék COS 7 toansfektovaných pcD-125 a jejichž Fc-epsilon receptory byly označeny fluorescencie

Obrázek 6A ilustruje sekvenci nukleotidô syntetického lidského IL-4 génu, který se používá pro expresi pŕírodniho nebo mutovaného IL-4 v E. coli.

«Μ «ΜΗΜΜΜΜΜ

Obráaek 63 je mapa étépeni restrikčnímí endonukleasami syntetického lidského IL-4 (génu) vloženého do plasmidu pUC18.

Obráz jky 7A až 7F ilustruj! dvoj vláknové DNA fragmenty 1A/B až 6Λ/Β používané pro skone truováni syntetického génu lidského IL-4.

Obrázok 8 ilustruje sekvence nukleotidá prilehlých k inioiačnimu ATG kodonu v E· coli expreením vektoru TAC-RBS. Tyto sekvence začínaj! u restrikčniho místa EcoRI s konči u místa HindlII. Ribosomová väzobná sekvence (RBS), která vykazuje komplementaritu k 3* konci 16S robosomové DNA je podtršena a ATG iniciační kodon je podtržen.

Obrázok 9 ilustruje histogramy četnosti bunék v závislosti na inteneité fluorescenoe pro populaee bunék odvozených od pacienta se syndróme» holých lymfocytd. Bunky byly barveny fluorescenčné značenými anti-DR monoklonálními protilátkami.

Obrázok 10 ilustruje absorpčni profil pfti 215 nm konečného stupné člätení lidského IL-4, který 8pečivá v HPLC na G-4 kolone na obráconých fázích.

Obrázok 11 je mapa konstrukce plasmidu pBBV-173 obsahujici cDNA lidského IL-4.

Obrázok 12 je mapa konstrukce plasmidu TRPCH.

Obrázok lj5A je mapa konstrukce plasmidu pMF-elfaS·

Obrázok lj5B ilustruje TCGF aktivity nškolika transfekčnioh supernatantá z kultury kvasinek, které expres! poskytuj! lidský IL-4 e jeho rdzné muteiny.

Obrázok 14 ukazuje riistové krivky na faktoru závislých bunečných linií: LG/9 žírnych bunék (1A), UK—<2 žirných bunék (13), ľíFS-60 bunék (10) a HT2 T bunék (ID). Kiltivuje se

- 19 5.10^ bunék g rúznýini koncentracemi Cl.l supernatantu (plná p R kolečka), IL-2 (plné čbverecky), IL-3 (prázdná kolečka), CM-CSF^R (prázdne trojúhelníky ), IFN-^ (plné trojúhelníky) nebo P388D1 supernatantu (prázdné diamanty). MC/9 bunky (IA) byly kultivovány také s ruznýiai koncentracemi vyčisteného IL-3 (prázdna kolečka) nebo IL-3 smíchaného s 200 jednotkami IL-2^R (plné čtverečky), GM-CSF^K (prázdne; trojúhelniky), IFIi-ýu (plné trojúhelníky) nebo P3888LI supernatantem (prázdné diamanty). Aktivita rastového faktoru byla méŕena po 24· hodinách kolorimetricky. Absorbance pri. 570 nm (reference 63O nm) byla méŕena na prístroji Dynatek Micro Elisa reader.

Obrázek 15 ilustruje FPLC chromátografii na iontoméniči supernatantu 01,1. Sedia ml (35 ^mS proteínu) koncetrovaného supernatantu se dialysuje v 50nM fosforečnanu, sodného, lmM EDTA, pH 7,0 (7,8 m S/cm), nanese se na kolonu Pharmacia Mono S (0,5 x 5 cm) ekvilibrovanou stejným pufrem (pufr A). Pufr B je pufr A s IM chloridem sodným. Podminky eluce: prútok: 0,5 ml/minutu, frakce po 0,5 ml, eluce 0 až 4-0% B čtyŕicet minút, 4-0 až 100% B deset minút. Každá frakce byla testována na proliferačná. aktivitu na NFS-60 (IL-3, plná kolečka), HT2 (TCG2, . 600 kolečka) a MO/9 (MCGF) bunky. ^udpoveÚ MO/9 není uvedená. Sipky ukazují polohy, kde hladiny proliferace MG/9 dosáhly hladiny proliferace supernateritem Cl.l.

Obrázek 16 ade ilut^sruje 08 chromá tograf ii IL-5 zbaveného supernatantu 01.1 na obrácenýoh fázích. 100 /ul 3 x mono-S prošlého supernatantu (frakce 59 až 61, obrázek 15) v 0,1% TFA se nanese na kolonu Pharmacia 08 (0,5 x 2 cm) s obrácenými fáze^mi. Pufr A = 0,1% TFA ve vode, pufr B = 0,1% TFA v acetonitrilu. Eluce: 0,5 ml/minutu, frakce po 0,5 ml, ctyŕi minutý 0 až 25% Bj padesát minút 25 až 60% B, čtyŕi minutý 60 až 100% B. Každá frakce se testuje na proliferační aktivitu na NFS-60 (IL-3, plná kolečka), HT2 (TOGF, prázdná kolečka) a MO/9 bunky (MCGF, plné trojúhelníký). Sipka označuje frakci, která méla maximum TCGF aktivity a která poskytovala hladiny proliferace MG/9 podobné jako supernatant Cl.l po pŕidání nasycených IL-3 hladín ke každé frakci.

- 20 Obrázek 16B ilustruje GS chromatografii supernatantú GK15-1 myších T-bunék na obránených f ázích, 2 mg (0,5 ml) koncentrovaného GKL5-1 supernatantú v 0,1% TFA se nanese Ba kolonu Pharmacia C3 s obrácenými fázemi a eluuje se jak shora uvedeno. Každá frakce se testuje na TCGF aktivitu na HT2 bunkách (prázdná kolečka). Sipka označuje místo, kde se myši IL-2® eluoval za stojných podmínek. Vložený graf t titrane Cl.l (plná kolečka) a IL-2 (plné čtverečky) a GK15-1 supernatantové (prázdná kolečka) TCGF aktivity pŕímo srovnemé na stejné desee.

Obrázek 17 ukazuje MCGF a TCGF aktivity částečné vyčišténého faktoru z kolony s obrácenými fázemi (SP faktor). Proliferace byla méŕena jako inkorporac© l%]-thymidinu po 24 hodinách kultivace. žirné bunky MC/9 a bunky HT2 T byly kultivovány s rúznými koneentrsc emi supernatantú Cl.l (plná kolečka), IL-3⁵ (prázdná kolečka), IL-2® (prázdne trojúhelniky), SP faktoru (prázdná čtverečky) a zredénimi BP faktoru v prítomnosti 200 jednotek IL-3^R (plné čtverečky) nebo zredénimi IL-2 v prítomnosti nasyoených hladín BP faktoru (plné trojúhelniky).

Obrázek 13 ilustruje chromatofokusaci supernatantú Cl.l. 1,5 ml (3,5 supernatantú ve 25 nM bis-tris, pH 7,1» m nanese na kolonu Pharmacia Mono P (0,5 x 20 cm) a eluuje se pufrom Poly buf f er 74 (1 í 10), pH 4,0, prútokí 0,5 ml/minutu, frakoe po 1 ml. Každá frakce se testuje na proliferačni aktivitu na NFS-60 (IL-3, prázdná kolečka),

HT2 (TGGF, plná kolečka) a MC/9(MCGF, neuvádéno až na to, že maximum MCGF aktivity je označeno šípkou). Maximum TGGM (frakce 12, pl s 6,2) odpovídá minimu IL-3 aktivity; hladiny MCGF proliferace jsou najvyšší v mís t e označeném šípkou.

Obrázek 19 charakterizuje SDS PAGE supernatantú Cl,l< a částečné vyčistených MCGF/TCGF. (A)í Neredukujicí SDS PAGE nefrakcionovaného supernatantú. Pred redukcí 50mM DTT (60 °C, pet minút) se maximum TCGF posunuje nepatrné k vyšším molekulovým hmotám (21 000 a 16 000). Tento posun je doprovázen drastickou ztrátou aktivity. (B)s Neredukujíoí SDS PA GE frakcí maxima MCGF/TCGF z ohroma tograf ie na katexu (frakce 59 až 61, obrázek 15). Pred redukci se maxima (redukce 6Q °, 5 minút, DTT) MGGŕF a TGGF posunu— ji k nepatrné vyšším molekulovým hmotám (21 000 a 16 000). Tento posun je doprovázen drasti^cým snížením aktivity.

Sipky označuj! jediné frakce, u nichž pridaní nasycených množství IL-5 zvyšuje MCGF aktivitu na úrovne supernatantuí IL-5 (prázdná kolečka), TGGF (plná kolečka), MCGF (prázdné trojuhelničky).

Tento vynález se týká glykosylovaných nebo neglykosylovaných lidských polypeptidá, které vy kazu j í IL-4 aktivitu a které jsou odvozený od IL-4 polypeptidá popsaných zde pomoci standardnich zp&sobú. prípravy proteiná. Tento vynález se také týká nukleových kyselín se sekvencemi schopnými kodovat polypeptidy podie tohoto vynálezu a nukleových kyselín, jejichž sekvenoe jsou efektivné homologní s cDNA kloná podie tohoto vynálezu. A konečné tento vynález se týká zpúsobú prípravy glykosylovaných nebo neglykosylovených polypeptidä podie tohoto vynálezu, (které využívaj! sekvenoe nukleotidú zde popsané a zpásobú. použití polypeptidá podie tohoto vynálezu.

Zpásoby prípravy, používaní a identifikace polypep. tidú. a nukleových kyselin podie tohoto vynálezu jsou diskutovány níže v obecných pojmech. Potom je uvedeno nékolik pripadá, v nichž jsou použitý obecné zpásoby na špecifických typoch bunék, vektorá, reakčních činidel apod. Nejdŕíve bude stručné popsána jejich isolace z pŕírodnich zdrojá.

Tyto, polypeptidy lze vyčistit do zdánlivé homogenity ze supernatantú snadno dostupných bunéčných zdrojú. Lze je tedy ekonomicky vyrábét v čisté formé. Tím jsou umožnéna rúzná terapeutická a jiná použití.

Tyto polypeptidy jsou charakteristické tím, že obsahu ji polypeptid vykazujicí stimulační aktivitu na B-bunky, T-bunky a žirné bunky. V prírodní formé jednoho druhu máji polypeptidy molekulovou hmotu na SDS PAGE asi 20 OCX) a 15 000 za neredukujících podmínek a 21 000 a 16 000 sa redukujícich podmínek· Prostŕedek, který obsahuje tyto polypeptidy v vpodststé čisté formé vykazuje isoelektrický bod (pi) asi 6,2 ehromatofokusaoí· Rústové faktory jsou mimoŕádné silná činidla, která vykazuji významnou aktivitu v mimoŕádné nízkýoh konoentracích (napr. ménš než 1 nanogram na ml)· Tyto polypeptidy lze odlíšit od hormonú a jiných proteinii pŕirozené produkovaných T bunkami (napr. IL-2, IL-3, GM-CSF a IFN-^ ) chromatografii ns katexu nebo za jedinečných elučnioh podmínek z kolony s obránenými fázemi.

U myší nékteré polypeptidy podie tohoto vynálezu podporuj! pouze nizké hladiny proliferaoe nékterých bunék, jako jsou napríklad linie žirných bunek závislých na IL-3, avšak synergický zvyšuj! rust takových bunék (napríklad žirných bunék) v prítomnosti druhého faktoru (napr· IL-3). Polypeptidy mohou stimulovat proliferaci nékterých línii T-bunék, ale obvykle v menším rozsahu než vyčistený IL-2. Takové polypeptidy mohou také indukovat expresí la v klldových B-buňkách a zvyšovat sekreci IgG& a IgE B-bunkamí, podobné jako 3SF-1· Tyto aktivity nejsou oddélitelné, pŕes všechny provedené biochemické frakcionace· Vétáina téchto aktivít však mizí po redukcl, napríklad v pŕíto* mnoati SDS. Tyto faktory lze získat z četných pŕírodních zdrojú rozmanitými zpúsoby. Jedním z vhodných zdrojä je jakákoliv z četných liaií T-bunék, která produkuje príslušné polypeptidy. Jedna taková linie T-bunék byla odvozená od myší G57GL6 (Káble G. a spol.: Proc. Natl. Acad· Sci·

USA 79· 1157 až 1161 (1981).), kterou lze uchovávat v modifikovaném doplneném BESE (Nable G. a spol. : Celí 23.

až 23 (1932)·)· Tato bunečná linie, puvodné označená 01.Ly1*2*19, byla uložená v Americké sbíroe ty pil kul tur (ATCCj) a označená číslam CBL8179· Mezi jiné vhodné bunéčné zdroje téchto polypeptidú patrí témeŕ jakékoliv bunky, které vylučuj! räzné protilátky pripisované polypeptidfim, jako jsou napríklad lidské periférni krevní lýmf00yty stejné tak jako jakékoliv dobre známé zdroje T-bunék, jako jsou napríklad mandle, sleziny atd·

Supernatant z takových bunečných zdrojú nebo v nékterých pŕípadech kapalina z rozbitých bunék se múže podrobit rozmanitým dobre známým čistícim postupúm, aby se od&élily proteíny podie tohoto vynálezu· čističi techniky se e výhodou používaj! ve vzájemných kombinaoich, aby se za j istila vysoká úroveň čistoty· Typicky se pri čišténi používá chromatografie filtrací na gélu, chromatografie na SP katexu, chromatografie na obrácených fázích, skupinové špecifická chromatografie (napríklad na Haparin/sepharoae) nebo jiná obvyklé zpúsoby déleni, pokud zajisžuji efektívni frakcionaci proteínu. Lze použít také vysokotlaké kapal i nové chromatografie (HPLC), isoelektriekou f okús ec i a elektroforesu na SDS polyakrylamidovém gélu.

Supernatant z príslušné bunečné línie se múže nejdŕíve rozdeliť na frakce chromátografii na silném katexu· Typicky se to provádí tak, že poly peptidy podie tohoto vynálezu zústávají navázány na koloné, zatímco asi 93 % protelnú, které byly nanesený na kolonu, koloaou pro jde· Zbývajicí navázaný protein se múže eluovat solným gradientem· V jednom usporádání podie tohoto vynálezu gradient chloridu sodného uvolnuje predmetný polypeptld pri asi 0,19M koncentraci· Tato frakcionace se zopakuje dvakrát· (Primárné, aby se odstránil zbývajicí IL-’i.). Tím se získá čistota vétší než asi 99 %· Potom se materiál frakoionuje na Heparin-Sepharose a chromatografuje ee na obrácených fázich (clS nebo c4)· V druhém prípade se tyto polypeptidy eluuji 42% acetonitrilem· Spojené frakce obsahujicí predmetný polypeptid v extrémné vysoké čistoté, v podstate homogénni, se javí jako jediný pás o molekulové hmoté asi 20 000 na SDS-PAGE potažené stríbrea. Takto vyčiäténý materiál je alespoň 65 OOO-krát čiatsi než materiál v prírodní forme·

Tyto polypeptidy se mohou používat jako antigény pro prípravu pro t flá t e k, které dále mohou být použitý jako antigény pro prípravu anti-idiotypovýoh protilátek.

- 24 Konvenčnimi zpúsoby ee mohou pripraviť buď monoklonální nebo polyklonální protilátky. Tyto polypeptidy nebo jejich fragmenty, obecné fragmenty s alespoň asi 15 aminokyselinami, se mohou používať jako takové· S výhodou jsou však navázány nebo napojený na adjuvant nebo antigén, který aktivuje imunitní systém· Mohou se používať nižné antigény, jako jsou napríklad serové albumíny, KM, globulíny nebo podobné·

Pro navázání adjuvantú na polypeptidy jsou dostupné rozmanité zpúsoby, jako je napríklad glutaraldehyd, meleimidobenzoová kyselina, diazobenzoová kyselina nebo podobné sloučeniny. Mezi adjuvanty patri Freundúv adjuvant, hydroxid hlinitý nebo podobné. Antigén se hostiteli podává injekcí v konvenčnioh množstvích. Béhem dvou až čtyŕtýdenních intervalú se múže podať jedna nebo více dalšich injekcií. Jestliže se používá monoklonální protilátka, normálné se my šík podá jedna púvodní injekce a jedna zesilující injekce, slezina se isoluje a spleaocyty se pak napojí s príslušným nápojová c im partnerem konvenčnimi zpúsoby. Viz napríklad Galfre a spol.s Náture 266. 550 (1977), Kennett a spol.» Current Tople s in Microbiology and Immunology 81. 77 (1973) e USA patenty čísla 4 381 292 a 4 363 799. Pro špeciálni účely lze však použit pro prípravu protilátek s lidskými Fe ŕetézci jiné savo®, jako je napríklad primát, napríklad človók.

Polypeptidy se mohou používať samotné nebo v kombinaci s protilátkami pri diagnose polypeptidú. V obou pŕipadeoh pŕl použití pro diagnostické analýzy mohou být buú zhačené nebo neznačené. V literatúre je popsán velký počet diagnostických analýz včetné navázání buú pŕimo nebo nepriato téchto polypeptidú nebo protilátek na rúzné mar^ry, jako jsou napríklad enzymy, radionuklidy, fluorescenční činidla, substráty, koenzymy, částice, napríklad «magnetické částice nebo podobné. Jako ilustraoe téchto analýz viz napríklad USA patenty ô. 3 817 837, 3 850 752, 4 174 384,

177 437 a 4 374 925.

Rúzné analýzy se podie dohody delí na homogénni a heterogénni imunoanalýzy. Rozdíl je dán tím, jestli komplex polypeptidu a jeho protilátky musí být oddélen od nezkomií.'

- 25plexovaných členu špecifického vazebného páru· Rúzné analýzy se označuj! jako SI, ELISA, RIA, homogénni RIA, blot tečkováňím, Westernova analýza nebo podobné·

Protilátky téchto polypeptidú se mohou používa t samotné jako antigény produkujici anti-idiotypy, které mohou sloužit jako kompetitivni antigény s epitopickými místy kompetitivními s epi t opíc kými místy téchto polypeptidú· Tyto anti-idiotypy mohou tedy sloužit jako inhibítory nádorú, jako náhrady pŕedmétných polypeptidú nebo jako entagonisté pŕedmétných polypeptidú·

Tyto polypeptidy tvorí rodinu pŕirozené se vy skytujίο ich polypeptidú, které mohou být odvozený od pŕírodních zdroj ú, a také nepŕirozené se vyskytujících polypeptidú, které sdílejí fyBiologické vlastnosti, jako jsou napríklad v&zebná specifičnost a stimulační aktivity na B bunky nebo žirné bunky· Menší rozdíly mezi druhy nebo púvodu mohou vyžadovat modifíkaci čistících postupú, což je známé odborníkúm· ľyto poly peptidy mohou být také sekvenovány a fragmenty lze pak syntetizovat dobre známými zpúsoby - víz napríklad! Barany a Merrifields Solid-Phase Peptide Synthesis, The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Specíal Methods in Peptide Synthesis, část A, díl 2·, Gross a Merenhofer (red·), Academic Press, Ν·Υ. 1930, strany 1 až 234Polypeptidové prostŕedky podie tohoto vynálezu jsou užitečné v rúzných smérech· Napríklad tyto polypeptidy mohou indukovat rúst T-bunék a žirných bunék, buď v kultuŕe nebo in vivo. žirné bunky, jak bylo shora uvedeno, jsou dúležitými zdroji heparinu, histaminú, prostaglandinú a jiných biologicky dúležitých materiálú· Podobné rústové faktory lze používa t jako stimulátory pro B- a T-bunky, zvláštš pro takové, o nichž je známo, že sekretují proteíny (napr· Lymfokiny a imunoglobuliny) užitečné v imunitním systému· Tyto faktory se typicky zahrnújí do kultivačního média, které se pridá k bunečné kultuŕe· Vhodná koncentrace fektorú závisí na typu bunéčné linie, obvykle bude faktor ale pŕítomen v množství asi 0,1 yug/ml až asi 1 mg/ml, výhodné j i asi 1 ^ug/ml až asi 10 /Ug/ml v kultúrach· Použití rúzných

- 26 rastových faktorá podie tohoto vynálezu muže odstranit požada vek použiván! kŕmnych hunék pro zachování žádaných bunečných linii, což vede k podstatnému zvýšení čistoty produktá z téchto bunečných linii·

Polypeptidové prostŕedky podie tohoto vynálezu najdou použití také in vivo pri léčení r&zných imunodeficiencí nebo pri zvysováni pŕirozené imunitní odpovedi. Napríklad mohou polypeptidové prostŕedky podie tohoto vynálezu napomáhat pri léčení nebo prevenci infekce stimulovaním ma turac© a/nebo rás tu B-bunék, T-bunék a žirných buhék, čímž se snižuje vníma vost živočícha k infekci.

V další části tohoto spisu je popsáne de novo príprava IL-4 c DNA. Pro prípravu de novo a pro klonováni cBNA a pro zkonstzuování o DNA bank jsou nyní dostupný rozmanité zpilsoby, viz napríklad nedávno uveŕ^nený souborný člábek Ďohertyho Cloning and Expression of c DNA”, kapitola 10· v Gottesman (red·) Molecular Celí Genetios* (John Wiley and Sons, New York, 1985) a Brandis a spol. í Preparation of c DNA Libraries and the Detection of Specific Gene Sequencesľ v SetXow a spol· (red.)» Genetic Engineering 8, 299 až >16 (plénum Press, New York, 1986)·

Napríklad celková mENA se extrahuje (napríklad jako popisuje Berger S. a spol· t Biochemistry 18. 514> až 5149 (1979)·) n bunek (napríklad ne transformovaných lxdských T bunek) produkujících poly peptidy, které vykazují žádanou aktivitu. Z této celkové mENA lze zkonstruovat dvoj vláknové DNA primerem Iniciovanou reversni transkripci (Verme I*: Biochem. Biophys. Acta 473· 1 až 38 (1978)·). Získá se tak první část každé mENA sekvence, načež se syntetizuje druhé vlákno (Xtand H· a spol.! Nucleic Acids Nes. 2» 2251 až 2266 (1931)·)· Potom se cDNA klonuj! napojením na vhodný plasmidový nebo bakteriofágový vektor (Rougeon F. a spol.» Nucl· Acids Bes· 2 , 2365 až 2378 (1975) nebo Scherer G. a spol·! Dev. Biol· 86· 438 až 447 (1931).)komplemen$@rními homópolymernimi konci (Efstratiadis A. a spol· ž Celí 11« 571 až 585 (1977)·) nebo kohesivnimi konci vytvorenými segmenty lin- 27 keru obsahujícimi príslušná reštrikční místa (Maniatis a spol·: Molecular Cloning: A Laboratory Manuel, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. 1982).) a následujícím transformovánim vhodného hosti tele (obecné viz Efstratiadis A·, Villa-Bcrmaroff L,: Cloning of double stranded cDNA v Setlow J. a Holiaender A. (red.): Genetic Engineering 1, Plénum Publishing Corp·, Ν·Y·, USA, 1982)·)·

Výhodným zdrojem m^RNA kodujícim žádané polypeptidy jsou bunky, jejiohž supernatanty obsahuji stimulační aktivity B-bunék, T-bunék a/nebo žirných bunék nebo jiné aktivity souvisejicl s polypeptidy podie tohoto vynálezu. Jednou takovou línii je linie myších T-bunék Cl.Ly 1^2^/9 (ATCC č.

CRL3179) (Nabel G. a spol.: Náture 291, 332 až 334 (1981).). Obecné lze vhodné bunky získat z rozmanitých zdrojú, jako je napríklad lidská slezina, mandle a periférni krev. Mohou e© používat také klony T-bunék, jako jsou napríklad ty, které se isoluji z T-lymfocytá periférni krve (viz Research Monographs in Immunology, (red·) von Doehmer H. a Ha a f V·: Section D: Human T-Cell Clones, dil 3., strany 243 až 333» Elsevier Science Publishers, N. X. , 1933)·

Prípravu mRNA, které jsou schopný kodovat IL-4, témito bunkami lze potvrdlt tím, že se extrahovaná mRNA podá mikroinjekcí oocytúm Xenopus la e vis, ^ato technika mikroinjekoí je níže popsána plné, obecné ji popsalColman a spol·: Export of Proteins from Oocytes of Xenopus La evis. Celí 12, 517 až 526 (1979) a Maniatis a spol·: Molecular Cloning:

A laboratory M&uual str. 250 až 332 (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982).

Jestllže mRNA, které kodujíoí žádený IL-4 predstavuj! velmi malou frakci celkové mRNA, mohou být zapotŕebí další stupné, ktorými se obohatí tak, aby to bylo praktické pri vyhledávání (testování) cDNA klonú, o které jde. Tskové postupy jsou odborníkúm známé. Jsou popsány níže v nékolika príklade ch a v nékolika pracích a odkazech: napŕikad Maniatis a spol na str. 225 až 228 ve shora uvedené citeci,

Suggs a spol·: Proc. Natl· Acad. Sci· 78. 6613 až 6617 (1981), Parnes a spol.: Proc· Natl. Acad. Sci. 78. 2253 až

- 28 2257 (1931) a Davis a spol·: Proc· Natl. Acad. Sol· 81»

2194 až 2198 (198*)·

Výhodný zpúsob prípravy IL-4 oDNA de novo se spolóhá na funkční expresi o DNA v pcD expresním vektoru, který vyvinuli Okayama a Bergí Mo4· Celí. Biol· 2, 161 až 170 (1970) a Mol· Celí. Biol. 280 až 289 (1983) a který je dostupný od firmy Pharmacia (Plecatawey, N.J.). Expresní vektor pcD obsahuje časný promotor SV40, pozdní místo strihu a počátek replikaee· Tento vektor umožňuje expresi oDNA insertú do opičloh bunék COS 7, které poskytuj! T antigén pro replika c i po D plasmidu. Testování cDNA bank zahrnuje transfekci sestavy plasmidových DNA do bunék COS 7 pomoci DEAE Dextranu. Jelikož lymfokiny, a zvlášté IL-4, jsou proteíny, které se sekretuji, je možné testovát super na tan ty transfektovaných bunék na biologickou aktivitu po nékolika dne ch inkubace· Positivni sestry se dále rozdélí, aby se identifikovaly jednotlivé oDNA klony, které po transfekci dávaj! blologlokou aktivitu.

Okayama a Berg-expresni vektor se stručné zkonstruuje následujícím zpúsobem. Polyadenylovená mRNA se aneluje na koneo polydeoxythymidylové kyselín? (oligo-dT) napojené na

eelý vektor slouží jako primer pro syntézu cDNA· Po syntéze oDNA se pripojí 3*polydeoxycytidylové (oligo dC) konce. Následuje rozštšpeni púsobením HindlII, které odstrihne (v jedinečném Híndlll místé) fragment SV40 DNA, na néjž je pŕipojen jeden z oligo dO koncu, časný promotor SV40 zústává neporušen. Nahodile se vyskytující místa HindlII insertu jsou ovlivnéna minímálné, protože hybrid cDNA/ENA je odolný vôči Štépení pôsobením Hind 1X1 o Na prečnlvajici konec nalavo od místa štépení Híndlll se aneluje oddélené skonštruovaný fragment HindlII s 3*“polyguánidyloveným (oligo dG) koncern. Tento vektor se oirkularizuje a nechá se zreagovat ⁸ S· aoli HNasou H, DNA poly mera s ou X a DNA lígasou, aby se nahradilo vlákno DNA. Tyto vektory se klonuji v E. coli. Vytvorí se tak banka oDNA. Prvky SV40 umožnují, aby došlo k expres i vektoru v eukaryotických bunkách i v prokaryotických bunkách, zvlášté v savčich bunkách, jako jsou napríklad opičí bunky COS 7 nebo bunky vaječníkú čínského kŕečka (GHO),

Jakmile je zkompletována tato banka cDNA v Okeyma-Bergvektorú, seberou se c DNA klony a náhodné sestavy se testuj! na pŕítomnost žádoucích c DNA standardnimi postupy, napr. selôkcí hybridú, detekci antigenních determin^t produktú získaných expres! a/nebo funkčnimi analýzami. Positívní sestavy se pak sonduj! c DNA z indukovaných línií T-bunék. Potom se positívní sondované sestavy rozdéli na jednotlivé klony, které se dále testuj! transfekoí do vhodného hostite le (jako je napríklad kultur_a savčich bunšk) a supernatant hostitele se testuje na aktivitu.

Hr-4 cDNA se pripraví hybridizačními sondami odvozenými od objevených cDNA následujícím zpúsobem. Zde popsané o DNA se mohou používa t jako sondy pro identifikaci homolognioh sekvencí u ruzných bunščných typú, jako alternatíva isolac© de novo a klonováni nukleotidú kodujicíoh IIr-4. Používají se štandardní techniky, napr. Beltz a spol.s Isolatíon of Mul* tigene Families and Determination of Homolôgies by Filter Hybridization Methods” v Methods in Enzymology 100. 266 až 289 (193» a Callahan a spol. s Detection and Cloning of Human DNA Sequences Related to the Mouse Mammary Tumor Vírus Genome v Proc. Natl. Acad. Sci. 79, 5503 až 5507 (1982). cDNA podie vynálezu se používaj! pri konstruování sond (standardními technikami, napr. Mánietis a spol.t viz shora.) pro testování (pri nízkých stupních hybridizace) genomových nebo cDNA bank (opét zkonstruovaných standardnimi zpúsoby) bunečných typú, o nichž se pŕedpokládá, že produkuj! XIr-4. Používaj! se štandardní testovací postupy, napr. viz Grunstein a spol. t Proc. Natl. Acad. Sci. 72. 3£$1 až 3§^5 (1975) nebo Benton a spol.s Science 196. 180 až 183 (1977).

Jak zde bude dále popsáno podrobnšji, lidský IL-4 byl isolován myší IL-4 sondou. Následujíci analýza ukazuje asi 70 % homologie mezi vybranými oblastmi lidských a myších cDNA, Na základé evoluční vzdólenosti mezi myší a človekom se

- 50 pŕedpokládá, že vétäina, jestliže ne všechny savči IL-4 gény jsou detegovatelné sondami skonštruovanými s jedné nebo více cNjlĎA podie tohoto vynálezu, viz: Wilson a spol·! Biochémie a 1 Evolution”, Ann. Rev. Biochem. 46. 575 až 659 (1977), Kimuret The Neutrel Theory of ^lecular Evolution, kapitola 11 v Nei a Koehn (red.): Evolution of Genes and Proteíne (Slnauer Associates, Sunderland, Ma·, 1935).

V další části bude popsána príprave mutovaných IL-4 metodou proteínového inženýrství. Jakmile je jednou dostupne informace o sekvenci nukleových kyselín a/nebo sekvenci aminokyselín pŕirodniho proteínu, lze pro prípravu skutečnš jakékoliv mutace v prírodní sekvenci použit ruzné zpdsoty. Shortles Science 229. 1195 až 1201 (1985) esuhrnné popisuje zpáscby mutace nukleových kyselín, které jsou použitelné podie tohoto vynálezu. Mutanty pŕírodnich IL-4, tj. IL-4 muteiny, se prípravují mistné špecifickou oligonukleotidem ŕízenou mutagenesí (napr. Zoller a Smith: Methods in Enzymology 100. 463 až 500 (1985)· Mark a spol.í USA patent č. 4 518 534 nazvaný Ruman Recombinant Interelukin-2 Muteins, nebo tzv. kazetovou mutagenesou, kterou popisuje Wells a spol.: Gene 54» 515 až 525 (1985) a Estell a spol.t Science 255. 659 až 665 (1536). V dále uvedených sekcích bude používána notaoe podie Estella a spol. (viz shora uvedená citace) pro identifikováni muteinu. Napríklad lidský IL-j| mutein Leu³² (nebo jeddoduôe Leu³², jestliže se prírodní protein rozumí primo ze souvislostí textu) označuje polypeptid, jehož sekvence aminokyselín je identická se sekvenci aminokyselín pŕirodniho proteínu až na polohu 32 vzhledem k N-konoi. V této poloze je Phe subetituován Leu. Podobné lze označovat i více než jednu substituci, napr. mutein, který má Phe v poloze 32 subetituován Leu a

Asn v poloze 111 je substituován Asp, se označuje jako lidop ητ_ ský IL-4 mutein (Leu , Asp ). Delece se oznáČují výrezem ”4ϊ Napríklad mutein, jemuž chybí Gin v poloze 71, se označuje jako lidský IL-4 mutein Δ Inserce se označuje IS(Xaa). Napríklad mutein s Leu vloženým za Glu v poloze 71 se označuje jako lidský IL-4 mutein IS' (Leu). Lidský IL-4 mutein (Ser^,A^·, 12^( Gly)) znamená tedy sekvenci pŕirodniho lidského IL-4, který je modifikován znamena sek^-Xaag-Xaax-» náhradou Ser za ‘Ihr v poloze 13, deleci Gin v poloze 71 a insereí Gly bezprostredné za Ala v poloze 9¾ Inserce více aminokyselín do stejného mista se označuje lS^(Xaa^Xaag—Xaa^—, ·.··), kde Xáa venci, která je vložená za polohu i· Adice na N-konec se označí indexem O, napríklad IS° (Xaa). Delece slávneí, napríklad delece aminokyselín v polohách 6 až 10, se označuje buú Δ⁶“¹⁰ nebo /7, δ» Í°)·

Pro získání muteinú lidského IL-4 se nejvýhodnéji používá kazetová mutagenese. dak bude dále podrobnej! popsáno, syntetický gen lidského IL-4 se skonštruuje se sekvenci jedinečných míst štépenl restrikčními endonukleasami, která jsou umísténa približné stejnomérné podél génu· Jedinečnost restrikčních mís t by méla být zachována i po vložení génu do príslušného vektoru. Segmenty tohoto génu se pak mohou vhodné štépit a nahrazovat syntetickými oligonukleotidy (tj. kazetami”), které koduji žádaji mutein.

Pri stanovení počtu a distríbuci jedinečných restrikčnách míst se ber© v úvahu nékolik f a ktorú: 1) již existující reštrikční mista v expresním vektoru, 2)- jestli je žádoucí použití druhové-speeifického nebo rodové-epecifického kodonu a 5) vhodnost a spolehlivost syntézy a/nebo sekvenování segmentú mezi jedinečnými restrikčními místy.

Lidský IL-4 podie tohoto vynálezu je definován v pojmech biologických aktivít a/nebo homologie s popsanými usporádáními. Mezi lidské IL-4 podie tohoto vynálezu patrí proteíny a muteiny (od objeveaýoh pŕírodních poly peptidú), které jsou homologní s objevenými pŕírodními polypeptidy a které vykazuj! jak BCGF aktivitu tak TGGP aktivitu. Lidské IL-4 podie tohoto vynálezu jsou také definovány jejich biologickými aktivitami (definovanými podrobneji níže), které zahrnuj! BCGBéktivitu, TCG? aktivitu (která je zde označována jako IL-4 aktivita) a také alespoň jednu nebo více aktivít vybraných ze skupiny aktivít sestavející z aktivity indukce MHG antigénu, aktivity indukce F_Q-epsilon receptoru, aktivity potenciace rústu kolonie granulocytú stimulované GM-CSF, TÓGE potencující aktivity interleukinu-2 a

- 32 1^- a IgE-indukční aktivity· Predpokladá se, že IL-4 jsou ve svýoh aktivitách druhové-specifickými. To znamená, že napríklad lidský IL-4 vykazuje TCGF aktivitu pri analýzování liniemi lidských T bunék, ale ne pri analyzovaní liniemi myších T-bunék·

TCGF aktivita se stanovuje následujicim zpúsobem: Je popsáno nékolik standardních analýz TCGF aktivity, napr· Devos a spol.: Nucleic Acids Research 11· 4307 až 4323 (1933)« Thurman e spol·: J· Biol· Response Modifiers 85 až 107 (1986) a Robert-Guroff a spol·, kapitola 9· v Guróff (red·) Growth and Maturation Factors” (John Wiley and Sons, ^e^York, 1984), Obecné jsou TCGF analýzy založený na schopnos?i%odporovat proliferaci per$íernich lymfocytá ne na IL-2 závislých línii T bunék, napr· Gillis a spol·» <fr· Immunol· 120· 2027 (1978). Proliferaci lze stanovlt standardními zpásoby, napríklad inkorporací triciovaného thymidinu nebo kolorimetrickými zpásoby (Mosmann t J. Immunol. Meth. 6£, 55 až 63 (1983).).

Lidskou TCGF aktivitu lze testovet napríklad následujicími stupni: (1) promyté lidské periférni krevní lymfooyty (asi 2.10^ v 5° mikroliteeoh) pŕedem stimulované fytohemaglutininem (PHa) sedm dná a potom kultivovány sedm dná s IL-2, s e pŕidají do mikrotitrovací jamky, (2) do každé jamky se pŕidají zŕedéní (50 mikrolitrá) materiálu obsahujícího TCGF, (3) lymfocyty se inkubují 72 hodiny pri 37 °C, (4) do každé jamky se pridá tríciovaný thymidin (asi 20 mikrolitrá, 20 mikrocurie na mililitr) a (5) bunky se pŕenesou na proužky filtračniho papíru, promyjí a spočítaj! se scintilačním počitačem·

Jak je podrobnej! popsáno v pŕíkladech, nékteré formy IL-4 máji schophost zesilovat TCGF aktivitu IL-4, Pojem zesíleni (potenciace)”, jak je zde používán, v souvislosti s takovou aktivitou, znamená, že maximálni hladina proliferace v TCGF analyzovaaém systému zpásobená IL-2 se zvýši pridaním IL-4.

BCGF aktivita se testuje následujicím zpúsobem: BCGF aktivite je definována analýzou popsanou Howardem a spol·:

J. ^xp. Med. 155. 914 sž 925 (1982), Analýzy BCGF jsou uvedeny v souborném článku Howarda a Paula: Ann. Rev. Immunol. 1, 507 až 333 (1983). Ve stručnosti - BCGF aktivite se méŕí stúpnem, kterým jsou vyčistené klidové bunky atimulovápy proliferovat v prítomnosti submitogenaí koncentrace anti-I^S nebo podobného antigénu. Analýza lidské BCGF aktivity se múže provádét podie následujicích stupnús

Obohacené populace B bunék se získají z periférni krve, sleziny, mandlí nebo jiných standerdních zdroju odstŕedováním hustotním gradientem (Ficoll/Hypague) (napr. Pharmacia) s dvéma cykly s ovčími erytrocyty, které byly zprecovány s

2-aminoethylisothiouroniumbromidem, aby se odstranily T bunky. Tyto prípravky B bunék by mély obsahovst více než 95 % povrchových Ig bunék a více než 95 % bunék positivních na antigén špecifický pro lidské B bunky, oož se stanoví monoklonální protilátkou BI špecifickou na lidské B-bunky, která je dostupná od firmy Coulter (Hialeah, Fl.). Znečistení T-bunkami by mélo být menší než 1 % (stanovuje se vybavením anti-Leu»l mnnoklonálními protilátkami (Bec~ ton-Dickinson, Mountaln View, Ks.) nebo OKI 11 protilátkami (Ortho Diagnostics, Westwood, Ma·))· Tri mililitry kultUry téchto B lymfocytú (asi 5·1θ^ bunék na mililitr) v Ysselové médiu (Yssel a spol·: J. Immunol. Meth. 6$. 55 až 65 (198$·) se aktivuje bud kmenem StaphyloooccuB aureus Cowan I (SAC) (napr, 0,01^ roztokem SAC, který je dostupný od Calbiochem pod obchodnim označením Pansorbin nebo který lze pripravit postupem popsaným Falkoffem a spol,: J. Immunol. 129. 9? až 102 (1982),) nebo anti-Igffi protilátkami (napr. BRL, Gaithersburg, läd.) navázanými na perličky, napríklad 5 yUg/ml perliček Imunobeads, které lze získat od Bio-Rad (Richmond, Ka·)· B bunky se kultivuji bud dvaoet čtyŕi hodiny (v prípad é SAC) nebo 72 hodiny (pro anti-IgM perličky) a potom se prečistí Ficoll/fiypaque hustotním odstŕedováním, aby se odstranily částice SAC, perličky, neživotaschopné bunky a podobné. Proliferace B bunék se meŕí vyšitá®.®si 5. 10⁴ B lymfocytú v 50 /ul média v 0,2ml mikrotitrovacioh jamkách

- J4 s plochým dnem. Fŕidají se rúzná rodení materíálú, u ktorých pŕedpoklédáme BCGF aktivitu, na konečný objem 50 mikrolitrú. Inkorporace triciovaného thymidinu ee stanoví po 48 hodinách (anti-IgM kultury) nebo 72 hodinách (SAC kultury). Podobné analýzy byly popsány také Muraguchim a spol.: J. Immunol· 129« 1104 až 1108 (1982) a Yoshizakí a spol·: J· Immunol. 128. 1296 až 1J01 (1981).

Indukce HBB.G antigénu se zjišČuje následujícím zpúsobem. Bylo ukázáno, že IL-4 mohou indukovat expresi MHG antigenú (napr· la u myši) v rúzných typoch bunék imunitniho systému, zvlášte u B bunek· Roehm a spol· (J· Sxp. Led. 160 . 679 až 694.) popisuje dôkaz, že faktor, který vykazuje BCFG aktivitu, byl schopný indukovat také expres! LHC systému antigénu u normálnich klidových B bunék. Analýzy indukce MHC antigénu jsou zobecnény analýzami myších B bunšk uvedenými v tomto odkazu. Ve stručnosti se postupuje tak, že bunky imu* nitního systému se vystaví pôsobení IL-4. Potom se značenými protilátkami špecifickými pro iáHC antigény stanoví exprese tšchto antigenú na povrchu bunék. Stupeň indukce se stanoví srovnáním indukovaných bunék s kontrolami. Pro dané druhy lze použít nékolikero rúzných protilátok· Nékteré hybridomy jsou dostupné z ATCC (ty produkuj! monoklonální anti-MHC antigenové protilátky). Nékteré jsou dostupné komerčné (napríklad antu-HLA-DB produkované hybridomy pod ATCC čísly HB10J, HB109, HB110 nebo HBIJl, anti-I-A^b,d produkované hybridomy pod ATCC číslem HBJ$, anti-BLA-DR L24J dostupné od fy. Bencton Dickinson (Mountain View, Ks.) nebo podobné). Luže být potrebné rutinním experimentovaním prizpúsobit analýzu príslušným druhúm a optimalizovat podmínky analýzy tak, sby se získal nejcitlivéjši zpúsob zjiščování hladiny MHC antigénu· Pro test indukce lidského MHC antigénu se shora popsaným nebo podobným zpúsobem pripraví vyčistené B bunky. MHC indukci lze zjišňovat také pro nevyčistené prípravky z bunék sleziny. Protilátkou označené bunky se s výhodou detegují prútokovou cytometrií, napríklad pristrojení Becton Dickinson FACS nebo ekvivalentnim zpúsobem.

MCGF aktivite se stanovuje následujícím zpúsobem. Predpokladá se, že IL-4 obecné vykszují MCGF aktivitu. Avšak vzhledem k nedostatku príslušných analytických technik byla MCGF aktivita prokázána pouze u hlodavčího IL-4. MCGF analýzy myšího IL-4 jsou založený na proliferaci na faktoru závislých myších žirných nebo bazofilnich buaéčnýeh línii· MCGF aktivitu lze testová t pro linie myších žirných bunék MC/9, které jsou uložený v ATCC pod číslem CSL 3306 s je popsána v USA patentu č, 4 559 310, stejné tak i Habelem s spol· i Celí 23· 19 (81).

Myší MCGF analýzy jsou popsány také Ihlem a spol.: J. Immunol. 127 . 794 (1981). MCGF aktivita se s výhodou stanovuje kolorimetricky podie Mosmsnna (shora uvedená citece)s použitím bunék MC/9. Ve stručnosti lze tento postup popsat takto - bunky MC/9 se kultivují ve Falconových mikrotitrovacioh miskách s plochým dnem (10 bunék na jamku) v Dulbeocové modifikovaném médiu doplnéném o 4 % plodového . séra, 50 yUM 2-merkeptoethanolu, 2 mM glutaminu, neesenciální aminokyseliny, esenciálni vitamíny a rúzné koncentrace testovaných supernatantú na konečný objem 0,1 ml. Po dvaceti hodinách inkubace se ke každé bunečné kultuŕe pridá 50 /Ug

3-(4,5-dimethy lthiazoi-2-y l)-2,5-dif eny 1-tetra zolium-bromidu (Sigma) v 10 yul fosforečnanom pufrovaného solného roztoku. Po čtyfech hodinách se pridá 0,1 ml 0,04M kyseliny chlorovodíkové v isopropanolu, aby se rozpustil barevný formazanový produkt. Absorbance pŕí 57θ nm (reference 650 nm) se méŕí na prístroji Dynatech Microelisa Autoreader (ΜΗ58θ)^Μ nebo na podobném pristrojí.

V další části bude popsána indukce recpetoru F_c-epsig^n Bylo objeveno, že IL-4 indukuje expresi F_c-epsilon v B bunkách a T bunkách, zvlášté pak na lidských B bunkách, které jsou stimulovány anti-IgM protilátkami nebo podobným antigénom. Bylo také objeveno, že gama-ínterferon špecificky inhibuje IL-4 indukovanou expresi F -epsilon na B-bunkách.

M

-3δAnalýza indukce recfi?toru Fc-epsilon se s výhodou provádi stojné jako BCFG analýza. To znamená, že získané vyčišténé B-bunky se stimulují aati-IgM protilátkou (nebo podobným antigenem) a vystaví se pôsobení IL-4. Na konec se bunky analyzuj! na receptory Fc-epsilon. Je dostupno nekolik analýz kvantitativního vyhoduocení Fc-epsilon reeeptorô na povrchu bunék, napríklad Yodoi a Ishizaka: J. Immunol. 122, 2577 až 2585 (1979)> Hudak a spol. s J. Imraunol. Meth. 84, 11 až 24 (1985) a Bonnefoy a spol·: J. Immunol. Meth. 88, 25 až 52 (1986). Fc-epsilon receptory se mohou meŕit prôtokovou cytometrii s označenými monoklonálními protilátkami špecifickými pro receptory, napr. pžístrojem Becton Dickinson FACS-IV nebo podobným pristrojem. Monoklonální; protilátky špecifické pro Fc-epsilon receptor lze zkonstruovat konvenčnlmi zpôsoby,

IL-4 indukuje se|kŕeci IgE s IgGj isotypô v lipopolySa cha r idy (LBS) aktivovaných B-bunkách, napr. Coffman a spol.: J. Immunol. 156. 4558 až 4541 (1986), Sideras a spol. ·. Eur. J. Immunol. 15, 586 až 595 (1985)· Tyto aktivity lze mérit štandardní imunoanslýzou pro protilátkový isotyp, jak to popsal Cofftoana spol.: J. Immunol. 156. 949 až 954 (1936)· Ve stručnosti‘/Se to provádí tak, že B-buňky se aktivuj! LPS kultivováním s témito polysacharidy, napríklad asi 4 mikrogramy/ml Šálmonella tvphimurium LPS (dostupná od firmy Sigma) nebo osi 90 yug/ml LPS extrahovaného z E. poli 055 (jak shora popisuje Sideras a spol.)· Fo 4 až 8-denni kultivaci se isolují supernatanty pro analýzu. Fro mérení rôznýeh koncentrací isotypô se mohou používat štandardní analýzy typu JSĹISA špecifické pro isotyp. Anti-isotypové protilátky pro' analýzu jsou komerčné dostupné nebo se mohou zíekat z ATCC.

Aktivita faktoru stimulu jicího kolonie (CSF) se stanovú je následu jlcím zpúsobem J Fro stanovení GSF aktivity se homopoíetioké bunky, napríklad bunky kostní drené nebo bunkrve z pdpenečni snôry, uvedeou do suspensé jednotlivých bunék. Tyto bunky sé pak imobilizují“ v polopevném (agarot , vém) nebo ve viskozním (methylcelulosovém) médiu obsahu jicim živné látky a obvykle plodové teleci sérum. V prítomnosti príslušného stimulačniho faktoru budou jednotlivé bunky proliforovat e diferencovat se. Jelikož púvodní bunky jsou imobilizované, kolonie se vyvinou jako bunky proliferované a ma túrované. Tyto kolonie se pak vyhodnotí po 7 až 14 dnech (Burgess A. s Growth Pactors and Stem Celia”, str. 52 až 55» Academic Press, New York, 1984.). (Pro špecifické aplikace rústu granulocytú a makrofágu, viz Bradely T. a Metcalf D. s Aust. J. Exp. Biol. Säed. Sci. 44, 287 až 300 (19θβ) e obecné viz Metcelf D·» Homopoietic Colonies, Springer-Verlag, Berlín, 1977·)· Jestliže je to žádouci, jednotlivé kolonie se mohou extrahovat, umístlt na mikroskopická sklíčka, f i* xovat a obarvit barvive, Wright/Geimsa (3todd-SanfordiClinical Dlagnosie by Laboratory Methods, 15· vydáni, (ŕed.) Davidson a Henry (1974).). Potom lze provést morfologickou analýzu ty pá. bunék prítomných v jednotlivé kolonii.

Bunky kostní drene se odeberou pacientovi s neherná t ologickou chorobou s prevrstvi se pros Picoll (typ 400, Sigaa Chemical Co·, St. Louis, MO·), odstreďují se (2000 otáček za minutu) (dvacet minút) a bunky na rozhraní se odstráni, ^yto bunky se promyjí dvakrát Dulbeccovým aediem modifikovaným podie Is&vea, které obsahuje 10 % plodového telecího séra (PCS), resuspendujl se ve stejném médiu a adharentní bunky se odstráni adherencí na Petriho desky z umélé hmojty. Neadherentni bunky se v množstvi 10^ bunék/ml pridaj í k Iscoveové médiu obsahujícímu 20 % FCS, 50 yuíá 2-merkeptoethanolu, 0,9 % methylcelulosy a rúzné koncentrace buď super na ta nt ú, o níchž je známo, že obsahují kolonie stimulující aktivitu, nebo testovaných eupernatantd. Jednomililitrové podily se vysejí do 35mm Petriho misek a kultivuj! se pri 37 °C ve vodou nasycené áaosféfe se 6 % oxidu uhličitého ve vzduchu, Po tfech dnech kultivace se na každou desku pridá jedna jednotka erytropoietinu. Desátý den až čtrnáotý den se invéranim mikroskopem spočtou kolonie granulocyt-makrofág a erythroidní bursty.

Bunky 2 krve pupeneční šnúry v heparinu se odstreáují w 38 gest minút pri 2000 otáčkách za minutu. Bunky bílých krvinek v mezifázi mezi plasrnou a maximem bunék červených krvinek se pŕenesou do zkumavky, která obsahuje 0,17K chlorid amonný a 6% FCS. Po peti minutách v ledu se suspense prevrstvi 4 ml PECS e odstrekuje se šest minút pri 2000 otáčkách za minutu. Bunéčné pelety se promyjí Dulbeccovým fosforečnanom sodným pufrovaným solným roztokem a postupné se postupuje stejné jak shora uvedeno pro bunky kostní drene (stupeň s Picollem a adherence na umelé hmoté)· Neadherentní bunky s nízkou hustotou se isolují a v množství 10^ bunék ne kulturu se umistí do polopevného kultivačniho média jak shora popsáno.

^a konci analýz se složení bunék stanoví po aplikaci jednotlivých kolonií na sklenené desti^By a vybarvení bar. vivem Iíright-Giemsa · Eosinofily se vybraví barvivem Luxol Pást Blue“ (Johnson G. a Metcalf D. í Exp. Hematol. 8, 949 až 561 (1980)·

Pojem potenciace” (zesílení”), jak je zde používán v odkazech na rúst granulocytú stimulovaný GM-CSF, znamená, že kolonie granulocytú ve. shora popsaných analýzách jsou Vétší, jestliže se používá GM-CSF spoločné s IIr-4 než u GM-GSF samotného ôišténi získaných polypeptidú a príprava farmaceutických prostŕedkú se provádí následujícím zpúsobem: Polypeptidy podie tohoto vynálezu, které se získavají expresi v E. coli. v kvasinkách nebo v j iných bunkách, mohou být čistený staňdardními postupy známými odbornikúm, mezi než patrí sráženi síranom amónnym„ frakcionace chromá tograŕií na sloupci (napríklad na iontoméniči, gelová filtrace, elektroforesa, afinitni chromatografie atd.) a konečné rekrystalizace (obecné viz Enzýme Purhfication and Related Techniques”, Methods ia Enzymology 22 . 233 až 577 (1977) a Soopes R.: Protein Purt\fícation: Principles and Practice, Springer-Verlaí&É New York, 1932·)· Jednou ^rvyčišténé, buk částečné nebo do homogenity, mohou se tyto polypeptidy podie tohoto vynálezu používat pro výzkumné účely, napríklad jako doplnky pro média určená ke kul t i va c i bunék (pŕikladem je minimálni esenciálni médium podie Eaglyho, Iscoveem modifikované

Dulbeccovo médium nebo RPÍál 1640 dostupné od firmy Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.) a Gibco Divison (Chagrin Falls, Oh.)) a jako antigenni látka pro vyvolání špecifických imunoglobulinú použi t e iných v imunoanalýzáeh, imunofluorescenčních barvivech atd. (viz obecné Immunological MethocW’, dily I a II, (red.:) Lefkovits I. a Pernis B·, Academic Press, New York, N. Y. (1979 a 1981) a ”Handbook of Exoejkaental Immunology (red·») Weiij D·, Blackwell Scientifio Publications, St. Louis, Mb. (1979).).

Polypeptidy se mohou používať také ve farmaceutických prostŕedcích, napríklad pro zvýšení obranyschopnosti proti rúzným infekeím. Tak pacienti s re&matlckouartritidou, v pripadá potreby transplantu, nebo s imunodeficiencí zpúsobenou chemoterapií rakoviny, pokročilým vékem, imunosupresivními činidly atd., mohou být léčeni takovými polypeptidy. Tyto prostred^ mohou stimulovať selektívne rúzné složky imunitního systému, bu3 samotné nebo s jinými Činidly dobre známymi odborníkúm. Mezi tyto prostŕedky patrí imuno-reaktivní činidla, jako jsou napríklad lymfokiny (napríklad IL-1, IL-2 atd.), jakékoliv faktory stimulujici kolonie, imunoglobuliny atd., z hledíska vlivu na zesilení aktivít polypeptidú podie tohoto vynálezu. Tyto polypeptidy naleznou použití také v situacích (in vivo nebo in vitro), v nichž je žádoucí zvýšená proliferace bunék nebo zvýšení produkce imunoglobulinú.

Farmaceutické prostŕedky podie tohoto vynálezu se mohou pripravovať tak, že se tyto polypeptidy smichají s výhodou s inertnimi farmaceutický pŕijatelnými nosiči. Vhodné nosiče a vhodné zpúsoby prípravy farmaceutických prostŕedkú jsou dobre známé odborníkúm (viz napr. Remington*s Phsgŕaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia» National Pormulsry,

Ma c k Publishing Company, Eaeton, Pa., 1984.). Výhodným zpúsobem podávání je parenterálni podávání, které múže zahrnovať použití mechanických dodávacích systémú.

Farmaceutický prostŕedek se pripravuje s výhodou tak, aby existoval v jednotkové dávkové formé. Každá jednotka ob40 aahuje príslušné množství účinné složky. Množství účinné složky v jednotkové dávce prostŕedku múže být rúzné nebo se upravuje na 1 /Ug až 100 mg podie toho kterého. použití a podlo aktivity účinné složky. Jestliže je to žádouci, múže prostŕedek obsahovat jiná terapeutická činidla.

Dávkování je rúzné. Závisí na potrebách pacienta, na intensite stavu poruchy, která je léčena, a na sloučeniné, která se používá. Pojem efektívni množství jak je tento pojem používán, zde znamená, že se tyto faktory berou do úvahy pri stanovování aádoucích dávek. Stanovení príslušného dávkování pro konkrétni situaei je v rukou odbornikú. Obvykle se léčení počíaá s menšími dávkami, které jsou menší než je optimálni dávka sloučeniny. Potom se dávka zvyšuje po malých množstvách aji do dosažení optimálního účinku pro daný prípad. Je-li vhodné, pak se celková denní dávka múže rozdélit a podá t se v ne kolika menších dávkách behom dne.

Ne závér této časti spisu budou popsány používané expresní systémy. Pro prípravu proteinú a muteinú podie tohoto vynálezu se mohou používat rozmanitá expresní systémy (tj. kombinace hostitel-vektor). Mezi možné typy hostitelských bunék patrí bunky (ale nejsou omezeny jenom na né) baktérií, kvasinek, hmyzu, savcú a podobne. Optimalizace exprese príslušného proteínu nebo muteinu závisí na mnohá faktorech, jako je napríklad 1) povahu proteínu nebo muteinu, které mají být expresí pripravený, napríklad zda produkt exprese je jedovatý pro nékteré hostitelské systémy, 2) zda je žádouci a jaké typy po-transiačních modifikací jsou žádouci, napríklad, rozsah a druh glykoaylaoe múže ovlivnit výber hostitele, J) povaha 5'a 5' oblastí obklopujících oblast kódující proteín nebo mutein, o který nám jde, napríklad výber promotorú a/nebo sekvenci potrebných pro regulaci translace je rozhodujíci pro účinnost exprese, 4) jestli jde o prechodnou nebo stabilní expresi, 5) snadnost oddelení produktu získaného expresí od proteinú a dalších látek hostitelských bunék s/nebo kultivačního prostredí, 6) snadnost a účinnost transfekce hostitelú, která prechodné expresí poskytuj! proteín nebo mutein, o který nám jde, 7) množství

-41 bunéčné kultur-y, která se používá pro expresí protoinu nebo muteinu, o který nám jde, 3) jestli protein nebomuteÍn,Q k

který nám jde, je pri expresi získáván napojený na fra@aent^x proteínu endogénni pro hostitele a podobné faktory· \

Obecné jsou pro klonování DNA sekvencí podie tohoto (vynálezu výhodné prokaryoty. Obecným právodcem pro používáni prokaryotických expresních systémú, jsou následujíoícitaces Hania tis a spol. í Molecular Cloning: A Ieboratory /Manual**, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1982, Perbalv A Praotical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons, N.Y.j 1984, Glovert DNA Cloning: A Practioal Approach, díl I. a 11«, IRL Press, Oxford, 1935 a de Boer a spol·: Strstegies for Optimizing Foreign oene Expression in Escherichia Coli v Genes: Strúctúre and Expression, Kroon (red.) , j John Wiley and Sons, N.Y., 1983· Zvlášté užltečný je napríklad E, coli K12 kmeň 294 (ATCC č. 31446). Mohou se používa t i jiné mikrobielní kmeny, napríklad kmeny E· coli. jako je napríklad E. coli B a B. coli X1776 (ATCC č. 31537)* Týid ^ííklady jsou ovšem zamýšleny spíše jako ilustrujíci než omezující.

Pro expresi se mohou používa t také prokaryoty. Mohou se používat shora uvedené kmeny, E. coli W3110 (Fa~. /?“. prototrofní, ATCC č. 27 325), bacily, jako je napríklad Bacillus subtilis a jiné enterobaktaie, jako je, napríklad/ Salmonella tsphimurium nebo Serratia maroegans. ä rúzné druhy pseddomonas.

Plasmidové vektory obsahujíci sekvence replikohu a regulao®, které jsou odvozený od druhá slučitélnýoh s bunkou hostitele, se používaj! ve spojení s témito hostítelí· Tento vektor obvykle nese místo replikace a sekvenGe markeru, který je schopen poskytnout transformované bunce fenotypovou selekci. Napríklad E. coli se často transformuje plasmidem pBRý22, plasmidem odvozeným od druhu E. coli (Bolivara spol.: Gene 2, 95 (1977)·)· Plasmid pBR322 obsahujei gény ampícilinové a tetracyklinové resistence· Tato skutečnost predstavuje snadný prostŕedek pro identifikaci transforme42 vaných bunék. Plagŕsid pBP<522 nebo jiný mikrobiálni plasmid musí obsahovat také, nebo musí být upraven tak, aby obsahoval, promotory, které mohou využívat mikrobielni organismy pro expresi jejich vlastníoh proteinú. Mezi tyto promotory nejobvyklej! používané pri konstrukci rekombinantni DNA patri β-laktamass (penicilinasa), promotorové systémy laktosy (Chang a spol.: Náture 275. 615 (1573), Itakura a spol.s Science 198, 1056 (1977)» Goeddel a spol.í Náture 281. 544 (1979)) e promotorový systém tryptofanu (trp) (Goeddel a spol·: Sucleic Acids Res. 3, 4057 (1930)» prihláška evropského patentového úradu č. 0056776). I když tyto promotory jsou ne j obvyklej i používány, byly objeveny a jsou využívány z jiné mikrobielni promotory. Podrobnosti týkajici se jejich sekvenoí nukleotidú byly publikovaný. Tyto znalosti umožňuj!, aby je zručný odborník mohl funkčné ligovát s plašmidovými vektory (Siebeniist: Celí 20. 269 (1930).).

Vedie prokaryotú se mohou používat také eukaryOtické mikróby, jako jsou napríklad kultury kvasinek. Mezi nejobvykleji používané eukaryotioké mikroor gáni srny patrí Saocharomyoes cerevisiae neboli obyčejné pekaŕské kvasnice. Pro ©xpresi v Saccharomyces cerevisiae se obvykle používá plasmid YRp7 (Stinchoomb a spol.: Náture 282 . 59 (1979)» Kingaman a spol.: Gene 2» 141 (1979)» Tschemper a spol·: Gene 10.

157 (1930).). Tento plasmid již obsahuje gen trp 1, který poskytuje selekčni marke r pro mutovaný kmeň kva sine k tím, že mu chybí achopnost rus tu v tryptofanu, napríklad ATCC é. 44 0?6 nebo FEP4-1 (Joness Genetics 35. 12 (1977)·)· Prítomnost části trpí, jako charakteristiky genomu bunky kvesinkového hostitele tak poskytuje efektívni zpúsob detekce transformace rústem da neprítomnosti tryptofanu.

Mezi vhodné prom%orové sekvence kvasInkových vektoru patri promotory 5-fosfoglycerátkinasy (Hitzeman a spol.t J. Biol. Chem. 255. 2075 (1930).) nebo jiných glykolytickýoh enzymú (Hess a spol·: J. Adv. Enzýme Reg, 2» 1*9 (1963), Holia nd a spol.í Biochemistry 17. 4900 (1973).), jako jsou napríklad enolasa, glyceraldehyd-5-fosfát-dehydrogônasa, hexokinasa, pyruvát-dekarboxylasa, fosfofruktokinasa, glukoso— 4J —

6-fosfát-isomer a sa, 5-fosfoglycerát-mutasa „ pyruvát-kinasa, triosefosfát-iaomerasa, fosfoglukoso-isomerasa a glukokinaša. Pri konstrukei vhodných expresních plssmidú se térmi— načni sekvence asociované s témito gény také ligují do expiesního vektoru v poloze 3* sekvence, která má být ziskána expresí. Tím dôjde k polyadenylaci mRNA a k terminaci. Jinými promotory, které mají další výhody v transkripci regulované podmíakami rústu, jsou proáŕborové oblasti alkohol-dehydrogenasy 2, isocytochromu C, kyselinové fosfafcasyj degradativních enzýmu souvisejících s metrbolisnen dusíku, shora uvedená glycer_eldehyd-3~fo8fát-dehydrogenasa ε enzymy zodpovedné za využití maltosy a galaktosy (Hollandí viz výše.)· Jakýkoliv plasmidový vektor obsahující s kvasinkou slučitelný promotor, počátek replikace a sekvenci terminace, je vhodný.

Jako hoeti.teleé se krome mikroorgánismu mohou použivat také kultury bunek odvozené od vícebunečných organismú. V princípu lze použít jakoukoliv bunéčnou kulturu, od obratlovcú nebo bezohrátlých. Nejvetší zajem byl však soustŕedén na bunky obra tlovcú a množení bunék obratlovcú v kultúre (tkánová kultura) se stalo v nedávnych dobách rutinním postupem O'lissue Culture“, Acsdemic Press, Krase a Patterson (redaktori), 1975·)· Príklady takových užitečných línií hostitelských bunék jsou VERO e HeLa bunky, bunky vaječníku čínskeho krečka (CH0) a bunečné línie W138, BHK,

COS 7, myšího my e lomu (ATCC ô. TIB 19 nebo TIB 20) a MDCK. Expresní vektory pro takové bunky obvykle obsahuj! (jestliže je to nutné) počátek replikaoe a promotor umísténý v čele génu, který má být expresí ziskáván, spolu s jakýmikoliv nutnými ribosomovými väzobnými mís ty, mís ty strihu RNA, polyadenylaČním míetem a sekvencemi terminace transkribce.

Pri používaní savčích bunék se regulačních funkcí na expresních vektorech dosahuje často vírovým materiálem. Obvykle používané promotory jsou odvozený od polyoma, adenoViru 2 a nejčastéji od SV40 (Simian Vírus 40). Zvlášté užitočnými jsou časný a pozdní promotor víru EV40, protože oba jsou snadno získatelné z tohoto víru jako fragment, který také obsahuje SV40 vírový počátek replikaoe (Fiers a

- 44 a spol.t Náture 275» 115 (1978)·). Je možné používat také menší nebo vétší fragmenty SV40 zs predpokladu, že obsshnjí eekvenci o približné 250 párech nukleotidň od místs HindXH k mi s tu BglI umísténému ve virovém počátku replikace. Bále je také možné a Často žédoucí využit sekveace promotoru nebo regulace normálne asociované se žádanou sekvencí génu za predpokladu, že taková sekvence regulace je elučitelná se systémy bunék hostitele.

Počátkem replikace môže být buď exogénni pocátek na vektoru, napríklad počátek odvozený od SV40 nebo jiných vírových, zdrojô (napr. Polyoma, Adeno, VSV, BPVatd.) nebo endogénni od chromosomového replikačního mechanisrau bunky hostitele. Často je postačující integrovat vektor do chromosomu bunky hostitele.

Pri výberu výhodné bunky hostitele pro transfekci vektory podie tohoto vynálezu, které obsahují DNA sekvence kodující jak t»PA tak DHFE protein, je vhodné vybrat hostitele podie typu použitého ĽfíFR. proteínu· Jestliže se používá DHFR protein pŕírodního typu, je výhodné vy brat takovcu hostitelskou bunku, která je deficitní na DHFR. Tím se umožní použit sekvencí kodující DHFR jeko marker pro úspešnou transfekci v selektivním médiu, kterému chybí hypoxanthin, gly c in a thymidin. Takoyými príslušnými hostitelskými bunkami jsou bunéčné linie vaječnikô čínského kŕečka (CHO) deficitní na DHFR aktivitu, pripravené a množené jak popisují Urlaub a Chazín: Proc. Natl· Acad· Sci· (USA) 77· 4216 (1930).

Na druhé strané - jestliže se jako regulační sekvence používá DHFR protein s nízkou vazebnou afinitou na MTX, není nutné používat bunky resistentni vôči DHFR. Jelikož mutant DHFR je resistentni na methotrexát, mohou se jako prostŕedky pto selekci používa t média obsahující 2ÉEX za predpokladu, že hostitelské bunky jsou samy citlivé na methotrexát. Jednou z t e kový c h užitečných bunečných línií je linie CHO, CHG-K1, ATCC číslo CCL 61.

- 4$ Mezi expresní systémy z bezobratlých pátri larva bource morušového, Bombyx mori. ínfektovaaá vektorem báouloviru, ftnBPV, popsaná Maedou a spol.í Náture 313» 392 až 894 (1935) a v Saibo Koguku 4, 767 až 779 (1985)·

Príklady provedení vynálezu

Následujíci príklady slouží jako ílu$šrace tohoto vynálezu· Výber hoetitelú a vektorú. a stejné tak i koncentrace reskčních činidel, teploty a hodboty dalšich proménných veličín jsou zde uvedený pouze jako príklady aplikace podie tohoto vynálezu a nemély by být považovány jako jeho omezení.

V príkladoch budou používaný následující materiály a metódyl T bunečné linie Gl.Iyl⁺2*/9 (označované jako Cl.l), Sabel G·, Greenberger J· 3., Sskakeeay M. í. a Cantor H.: Proo. Natl. Acad. Sci. USA £8, 1157 až 1161 (1931) a GK15-1 (dodané M, Giedlinem, DNaX Research Inštitúte of Molecular and Cellular Biology, Inc.f DNAX) byly resuspendovány v množstvi 5.10^ bunék na mililitr v RPM 164ΰ, 50yU&í 2ME,

1% FCS e 2 yUg/ml Con A po 24 hodin. Tyto supernatanty byly spojený a skladovány pri - 79 °C.

KLonované linie žirných bunék MC/9 (Nable G., Galii S· J·, Dvorak H. F. a Cantor H.i Náture 291« 332 až 534 (1981) byly získaný od G. Nabela (Dana Farber Cancer Inštitúte f DFCI). Linie žirných bunék MM3 (poskytnuté R. Cofítoanem, DNAX) a Dx-2 (odvozené D. fíennickem, DNAX) byly charakterizovány neprítomností markerú asociovaných s nyeL lomonocyty a prítomností IgB receptorú a hladín histamínu vétáích než 25θ ng/10^b bunék. Línie myeoloidních NFS-60 bunék se získá podie J. Ihleho (Frederick Cancer Research Fa— čili ty f FGRF). Subklonováním NFS-60 bunéčné línie se získá kloň závislý na IL-3. T-bunéčná linie HT2 byla získána od S. Strobera (Stanford University, Palo Alto, Ca.), CTLI.-2 byla dodána Farrarem (FCRF) a Ly 23/4 byla dodána G. Nabelem (DFCI). Linie žirných bunék a T bunék byly kultávovány . v RPMI 1640, 10% FCS, 50/UM 2MS doplnéném o rekombínant IL-3 nebo IL-2.

Hladiny histamínu nékolika na IL-3 závislých bunečných linii byly 3nalyzovány zpúsobem podie Shoreho P. A., Burkhaltera A. s Conna V.H.: J, Pha^ŕ. Exp, Ther· 127. 1Q2 až 186 (1959)· Aktivita rústového faktoru T bunek a žirných bunšk by la stanovene pomoci inkorporace íAlJ-thymidinu nebo kolorímetrickou analýzou, jak popisuje Moemann T.í J. Immunol. Methods 65. 55 s ž 63 (1933)·

IL-3 vyciStený zs supernatantu WEHI 3 byl darován J.

Ihlem (FCRF). Kekombinantní IL-2, IL-3, GM-CSF a IFN-^ byly používány ve forme supernatantu z ledvin bunek opice (DOS 7) transfektovaných odpovídsjícímí c DNA klony. Jedna jednotka IL-2, IL-3 nebo GM-CSF byle. definovaná jako množství faktoru, které stimuluje 50 % maximálni inkorporace thymidinu na faktoru závislých bunečných linii (Eonnick D. a spol. í «7. Immunol, 134, 910 až 919 (1985)·)· Jedna jednotka IFN-/ ochráni 50 % myšíoh L bunek proti cytopathogenním vlivúm víru v&sikulární stomatitidy (Schreiber S. a spol.s J. Exp. Med. 156. 677 až 689 (1982)«,).

3-bunky se pripraví z© suspense jediného typu bunšk myších slezinných bunek zbavených T bunek a makrofágú podie standardnich postupú (fíoward tó. s spol. s J. Exp. Med. 155.

914 (1982)·). Zde popsaný vyčišténý faktor byl testován na svoji schopnost indukovat Ic expresi na B-bunkách cytofluorometrickou analýzou a stimulovánim proliferace B-bunék anti-Ig kostimulující analýzou, jak je to popsáno v práci Roehma a spol. t J. xp. Bied. 160. 679.

Stanovení proteinú byls založená bud na UF absorpcí (280 nm nebo 220 nm) nebo na standardnich krivkách skonštruovaných pomoci analýzy vážící barvivo (Bradford M.: Annual Biochem. 72. 243 až 2$4 (1976).). Supernstanty se na počátku dvaoôtinásobne zkoncentruji kazetovou jednotkou Pellicon (BHllipor, Bedford, Me.) nebo (po chromátografii s obrácenými fázami) odparením rozpouštédla v prístroji Speedvac” (Savant, Farmingdale, ΝΪ). SDS PAGE byle provádéňs pomoci laemmliho systému (Laeimuli U.: Náture 227. 680 až 635 (1970)·)·

- 4Τ s 12% separačním gelem. Markerové proteiny byly štandardy s ηίζ3

Gély byly v^b^tvovány stríbrem zpúsobem popsaným Merrilem C. a spol.: Science 211, 1437 až 1438 (1981). Pri analýzách MCGF a TCGF aktivity jako funkce molekulových hmôt se vzorky s nebo bez predcházející redukce 50 mM DTT elektroforesují, gély se rozrežou na lmm sekvence, rozdrtí a protein ee eluuje preš noc pri 4 °C v 0,5 ml analyzovaného média doplnšného o 5 mg/ml ovl/abuminu (Sigma, St. Louis, Mo.)·

Chromatografie se provádí pri 18 °C na systému Pharmacia FPLC s detektorem Kratos Spectroflow 773 UV (Kratos, Rarasey, NJ.). Chromatografie na katexu použivé kolonu Pharmacia Mono S (0,5 x 5 cm) ekvilibrovaňou 50mM fosforečnanem sodným a lmM EDTA o pH 7,0. Supernatanty byly na kolonu nanesený ve stejném pufru, eluovány byly gradientem chloridu sodného do IM koncentrace.

Pro chromatografii e prevrácenými fázemi byla

Pharmacia C8 (0,5 x 2 cm). Vzorek zredšný 0,1% TFA (pH 2)se nanese na kolonu a eluuje se acetonitrilovým gradientem s 0,1 % TFA.

Isoelektrické body MCGF a TCGF aktivít byly zjišíovány chromatofokusací na kolonš Pha^racia Mono S (0,5 x 5 cm). Vzorek v 0,025M bis tris, pH 7,1, se nanese na kolonu Mono P ekvilibrovanou stejným pufrem. Gradientová eluce se provádí pufrem Pharmacia Polybuffer 74” , pH 4,0 (Zŕedšní 1 J 10, pH se upraJ vuje 0,2M aminodioctovou kyselinou). pH eluátu se nepretržité sleduje pH monitorem (Pharmacia). Pred injekcemi se všechny vzorky zfiltrují jednotkou Millex GV 0,2/U (Millipore).

Frakce z SDS PAGE z chromatografie se analyzuj í, na schopnost podporovat próliferaci tŕí bunečných linií: NFS-60 (IL-3), MC/9 (MCGF) a HT2 (TCGF).

Pri čistení tohoto faktoru do homogenity se osm litrd Con-A-aktivovaného Cl.l supernatantu dialyzuje ve 20mS5 pufru HEPES, pH 7,0, potom se nechá projít kolonou s katexem Pharmacia Mono S 10-10 ekvilibro vaňou stepným pufrem. Maximu^aktivity

- 48 bylo eluováno lineárním gradientem solným pufrem pri 0,2M koncentraci chloridu sodného. Tento materiál byl spojen, . zahuštén, redialyzován ve 20mM pufru HEPES, pH 7,0, a naneeen na Heparin-Sepharosovou kolonu ekvilibrovanou stejným . pufrem. Maximum aktivity bylo eluováno lineárním solným gradientem od O,45M koncentrace do 215 koncentrace chloridu sodného. Tento materiál byl spojen, zredén 10 x OtlO/TEA/Hg⁰· pH 2, a frakcionován na kolonš s obrácenými fázemi Vydac* (c4). Eluce lineárním gradientem acetonitrilu, 0,1% TFA, poskytla aktivitu p?i 42% koncentraci acetonitrilu.

Príklad 1

Nová príprava myších IL-4 cDNA s Cl,Lyl*2rf9 bunék a prechodná exprese v opičích bunkách COS 7 cDNA klony kódující IL-4 byly isolovány z myší pomocný bunéčné linie Cl.Lyl*2/9. která je uložená v ATCC pod číslem CRL 8179, a která je popsána Nabelera a spol·: Celí 23» až 28 (1981) a Proc. Natl. Acad. Sci. 78, 1157 až 1161 (1981). Mezi jiné myší buiky,. o nichž je známo, že produkují BCGF aktivitu, patrí linie EL-4, která je dostupná od ATCC, pod číslem TIB 39. Postupy, které jsou v tomto príkladu použi vány, byly popsány Leemem a spol.j Proc. Natl. Acad. Sci. 83 . 2061 až 2065 (1986). Ve stručnosti se postupuje tak, že. se zkonstruuje pCD cDNA banka z informační RNA (mRNA) z konkanavalinem A (ConA) indukovaných bunék Cl.Lyl⁺2“/9 podie postupu popsaného Okayamou a Bergem, jak shora uvedeno. Klony IL-3 a GELCSF se z velké podbanky náhodné vybraných klonú odstráni hybridizaci ³²P- značenými cDNA sondami. SestaJ vy a/nebo jednotlivé klony ze zbytku podbanky se analýzují na IL-4 cDNA transfekci opičích bunék COS 7 a testováním supernatantú kultury na MCGF a TCGF aktivitu.

A. Indukce produkce- IL-4

Bunky Cl.Lyl⁺2“/9 se indukuj í ConA tak, aby produkova-! ly IL-4 mRNA následujícím zpôsobemt Bunky se kultivují v množství 5.1O⁵ na mililitr v Dulbeccem modifikovaném Eagleho

J 50 J bim je se vazebným pufrem (lOmM Tris, pH 7,4® Íra® EDTA, 0,5® chlorid sodný, 0,5% SDS). Eluent z kolony byl nechán ješté . dvakrát projít kolonou. Kolona se pak promyje 20 ml vazebného pufru. PolyA* mRNA se isoluje promytíra elučním pufrem.

RNA se obvykle eluuje v prvních dvou ml elučního pufru. RNA se vysráží 1,1 objemu 3M octanu sodného (pH 6) a dvéma objemy ethanolu. RNA peleta se isoluje odstŕeJlovéním, promyj.e se dvakrát studeným ethanolem a vysuší. Peleta se pak resuspenduje ve vode. Jednotlivé podíly se zŕedí a stanoví se absorbanee pri 260 nm.

C. Konstrukce banky pcD cDNA

DPŕíprava vektorového primeru a oligoÄG)-konč£cích linkerových DNA

Použije se postup podie Okayamy a Berga (Mol. and Celí. Biol. 2, 161 až 170 (1982).) s pouze malými modifikacemi. Plasmidy pcDVl z pLl jsou popsány Okayaraou a Bergem (Mol. and Celí. Biol. 2» 380 až 389 (1983)··).Tyto plasmidy jsou, dostupné od fyrmi Pharmacia (Piscataway, N.J.). Byl používán modifikovaný plasmid pcDVl, který obsahuje Nsil raísto v dŕívéjším umísténí mista KpnI.

t

Vzorek 80 mikrogramú pcDVl se pri 30 °C rozštšpí púso^ bením 20 jednotek endonukleasy KpnI v reakční smési 450 yajĹ obsahující 6 mM Tris^HCl (pH 7,5), 6 mM chloridu hoŕečnatéJ ho, 6 mM chloridu sodného, 6 mM a.merkaptoethanolu a 0,1 mg hovézího serového albumínu (BSA) na mililitr. Po 16 hodinách se štépení ukončí pŕidáním 40 mikrolitrú 0,25M EDTA (pH 8,0) a 20 mikrolitrô 10% dodecylsulfátu sodného (SDS). DNA se isoluje extrakcí smési vody nasycenou smési (1 s 1) fenolu β chloroformem (dále zde označovanou jako smés fenolu s chlo-¹ rdformem) a následujícxm vysrážením ethanolem. Homopolyraerní konce o prúmeru 60, ale ne více než 80, deoxythymidylátových zbytkú (dT) na konec se pridájí k endonukleasou Nsil generovaným koncúm s koncovou transferasou telecího brzlíku následujícím zpúsobem¹; reakční smés (38 mikrolitrú) obsahovala kakodylát sodný-30m& Trió.HCl, pH 6,8, jako pufr s IraM chloridem kobaltnatým, 0,lmM dithiothreitolem, 0,25mŕ5 dTTP, DNA rozštépenou endonukleasou Nsil a 68 jednotek koncové deoxy49 médiu (DO) se ,4 % tepelné inaktivov,aného plodového telecího séra, 5.10^¾ 2-merkaptoethanolem (2-ÍSE), 2mJS glutaminem, neesenciálními aminokyselinami, esenciálnírai vitamíny a 2 /ug/ml ConA. Po dvanácti až čtrnáctihodinové inkubaci pri 37 °C s 10 % oxidu uhličitého se supense bunék odstrekuje deset minút pri 1500 otáčkách za minutu. Isólují se bunečné pelety, které se okamžité zmrazí na - 70 °C.

B· Isolace mRNA

Celková bunečná DNA se isoluje z bunék guanidin-isothiokyanátovým postupem podie Chirgwina J· a spol» (Biochemis.try, 18, 5294 až 5299 (1979)·)· Zmrazené bunéčné pelety z ConA-in-¹ dukovaných Cl.I.yľ*2Ť/9 bunék (12 hodín po stimulaci) se suspendují v lysovacím roztoku guanidin-isothiokyanátu. Dvacet mililitri lysovacího roztoku ee použije pro 1,5.10® bunék. Pelety se resuspendují pipetováním, DNA se pak rozstrihá čtvero projitím Injekční stŕíkačkou s jehlou (16 gauge).

Tento lysát se navrství na 20 ml 5,7® chloridu eesného a 10m® EDTA ve 40ml polyallomeraí zkumavce pro odstŕekováni. Tento roztok se odstrekuje pri 25 000 otáčkách na odstŕedivce Beckman SW28 rotor” (Beckman Instruments, Inc.,, Pajo Alto, Ka.) čtyricet hodin pri teplote 15 °C. Guanidin-ieo-^:, thiokyanatová fáze obsahuj í cí DNA se odpipetuje až do mezifází. St.ény zkumavky a mezifází se promyjí dvéma až tŕemi mi guanidin-isothiokyanatového lysovacího roztoku. Zkumavka byla odŕíznuta pod mezifázím núžkami. Roztok chloridu eesného se dekantuje. RNA pelety se promyjí dvakrát studeným 7055 ethanolem. Pelety se pak resuspendují v 500 /Ul 10mM Tri,s· • HC1, pH 7,4, lmM EDTA a 0,5% SDS. Pridá se 50 /Ut 3® oc^ tanú sodného a RNA se vysráží 1 ml ethanolu. Odstŕekováním se isoluje asi 0,3 mg celkové RNA· Pelety se promyjí jednou studeným ethanolem.

Pelety promyté a vysušené celkové RNA se resuspendují v 900 /ul oligo(dT) elučního pufru (10m® Tris-HCl, pH 7,4, Im® EDTA, 0,5% SDS). RNA se zahŕívá tri minutý na 68 °C.

Potom se ochladí v ledu. Pridá se 100 yUl 5N chloridu sod-· , ného. Vzorek RNA se nanese na 1-ml oligo(dT) celulosovou kpJ lonu (typ 3, Collaboration Research, Waltham, Ma.), ekvili7-. . 51 nukleotidyltransferasy (P-L Biochemicals, Inc., Milwauke, Wi.). Fo triceti minútach pri 37 °C se reakce zastaví 20 raikroli$ry 0,25$ EDTA (pH 8,0) a 10 mikrolitry 10% SDS. DNA se isoluje nékolika extrakcemi smési fenolu s chloroformem a vysrážením ethanolera. DNA se pak rozštep?' 15 jednotkami endonukleasy EcoRI v 50 mikrolitrech obsahujících 10 raK Tris-HCl, pH 7,4, mM chloridu horečnatého, 1 mB dithiothreitolu a 0,1 mg BSA na mililitr pét hodin pri 37 °C. Velký fragment, který obsahuje SV40 polyadenylační misto, počátek replikace pBR322 a gen ampicilinové resistence, se vyčistí elektroforesou na agarosovém (1%) gélu a isoluje se s gélu modifikací postupu se skleneným práškem (Vogelstein B. a Gillespie D·: Proc·

Hati. Acad. Sci. 76, 615 až 615 (1979).). dT~koncová DNA . se pak dále vyčistí absorpcí a elucí z kolony s oligo(dA)celulosou nasledovné: DNA se rozpustí v 1 ml lOmM Tris.HCl, pH 7,3, puf’ru obsahujícím ImM EDTA a IM chlorid sodný., o- , chladí se na 0 °C a aplikuje se na kolonu s oligo(dA)-celuJ losou (0,6 x 2,5 cm) ekvilibrovancu stejným pufrem pri 0 ,^QC a eluovanou vodou sa teploty místiQsti. Eluovaná DNA se vysráží ethanolera a rozpustí se v lOmSž Tris-HCl, pH 7»3, s lmM ethylendiaminotetraoctovou kyselinou (EDTA).

DNA s napojeným oligo(dGjkoncem se pripraví tak, že se 75 mikrogramú pLl DNA rezštepí 20 jednotkami endonukleasy PstI ve 450 mikrolitrech smési obsahující 6 mM Tris-HCl, pH 7,4, 6 mM chloridu horečnatého, 6 mM 2-merkaptoethanolu, mM chloridu sodného a 0,01 mg BSA v mililitru. Po šestnáct-i hodinách pri 30 °C se reakční smes extrahuje smési fenolu s chloroformem a DNA se vysráží allcoholem. Konce 10 až 15 deoxyguanylátových (dG) zbytkú se pak pŕidají na konec se 46 jednotkami terminálni deoxynukleotidyl-transferasy ve stejné reakční smesi (38 mikrolitru) jak shora popsáno s tím, že se 0,1 mM dGTP nahradí dTTP. Po dvaceti minutách pri 37 °C se reakční smés extrahuje smési fenolu s ehloroformem a DNA se vysráží ethanolem. Potom se stepí pňsobeníra 35 jednotek endonukleasy HindlII v 50 mikrolitrech smési obsahující 20mM Tris-HCl, pH 7,4, 7mM chlorid horečnatý, 60mEI chlorid sodný a 0,1 mg BSA čtyri hodiny pri 37 °C. Malá DNA s oligo(dG) linkerem se vyčistí na agárosovém gélu (l%)elek- 52 troforesou a ^ioluje se jak shora popsáno.

2) príprava banky cDRA

Stupeň lí syntéza cDNA. Reakční srnča (10 /Ul) obsahová?· la 50mffi Tris-HCl, pH 3,3, 8^mM chlorid horečnatý, 30mM chlorid draselný, 0,3mK dithiothre.itol a 2 ta!S každého z dATP, dTTP, dGTP a dCTP, 20 ^uCi ^3SP-d.CTP (3000 Ci/mmol), 3 ^ug polyA* ΠΪΓΑ z Con-A indukovaných T-bunek, 6C jednotek RNasinu (obchodní označení inhibitoru ribonukleasy od Promega Biotec, Inc. , Madison, Wi.), dva mikrogramy DNA primeru vektoru .

(15 pmolíi primerového konce) a 45 jednotek reversní transkriptasy. Reakce 3e inkubuje 60 minút pri 42 °G. Reakce se potom zastaví pridaním 1 mikrolitru O,25?4 EDTA (pH 8,0 )a 0,5 mikrolitrá 10% SDS. Pridá se 40 mikrolitrá smési fenolu s chloroíormem, roztok se intensivne míchá v míchačí ^MVortex^P a potom se odstrekuje. K vodné fázi se pridá 40 mikrolitrá 4® octanu amonného a 160 mikrolitru ethanolu. Roztok se ochladí suchým ledem (15 minút) , zahreje se na teplotu mastnosti za márneho trepaní, aby se rozpuetily nezreagované deoxynukleo t id- trif osf á ty, které se vysrážely behem ochlazování a odstrekuje se deset minút v Eppendorfové mikroodstŕedivee· . peleta se rozpustí v 10 mikrolitrech lOmM Tris-HCl, pH 7,3, a lmK EDTA, smíchá se s 10 mikrolitry 4M octanu amonného a * vysráží se 40 mikrolitry ethanolu. Tento postup odstraňuje více než 99 % nezreagovaných deoxynukleotid-trifosfátá.

Peleta se promyje ethanolem.

Stupeň 2j Oligodeoxycytidylátové (oligo(dC)) pridávání. Pelety, které obsahují plasmidovou cDKAsmRTíA, se rozpustí ve 20 mikrolitrech !40mM kakodylátu sodného - 30 mM Tris-HCl, pH pufru 6,8, obsahujícího lmM. chlorid kobaltnatý, 0,lmM dithiothreitol, 0,2 ^ug poly (A), 70^uSi dCTP, 5 /Ci ³²P-d6TP, 3000 Ci/mmol, a 60 jednotek deoxynukleotidýl-transferasy.

Tato reakce se provádí pet minút pri 37 °C, čímž se umožní pridaní 10 až 15 zbytká dCMP ne. konec. Reakce se potom ukončí pridaním dvou mikrolitrá O,25M EDTA (pH 8,0) a .1 mikrolitru 10% SDS. po extrakci 20 mikrolitry smési fenolu s clile-⁵ roformem se vodná fáze smíchá s dvaceti mikrolitry 4M octanu amonného. DEä se vysráží a presráž-í se 80 mikrolitry ethanolu.

- 53 Výsledné pelety se promyjí ethanolem.

Stupeň 3í štepení endonukleasou Kind III. Tato·peleta se rozpustí ve 30 /Ul pufru, který obsahuje 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 7 mM chloridu horečnatého, 60 mM chloridu sodného a. 0,1 mg BSA na mililitr. Potom se štepí púsobením deseti jedno tek $£donukleasy Hind III dvé hodiny pri 37 °C. Reakce se ukončí pŕidáním 3 /Ul 0,25M EDTA (pH 8,0) a 1,5 /ul 10$ SDS. Po extracki smési fenolu s chloroformem a pridání 30 ^ul 4M octanu ámonného se DNA vysráží pŕidáním 120 mikrolitrú ethanolu. Peleta se promyjé ethanolem a rozpustí se v 10 /ul lOmM Tris-HCl, pH 7,3, a lmM EDTA. Pridá se ethanol (3 /Ul), aby se zabránilo zmrznutí béhem skladování pri - 20 °C.

Stupeň*4í Cyklizace zprastŕedkovaná oligo(dG)-koncovým linkerém DNA. 9/Ul vzorek endonukleasou HindlII rozštépeného oligo (dC )-zakončeného cDNA: mRNA plasmidu (asi 90 % vzorku) se inkubuje ve smési (90 ^ul) obsahující lOmM Tris.HCl, pH,

7,5, lmM EDTA, Q·,IM chloridu sodného a 1,8 pmolu oligo(dG)zakončeného linkeru DNA 5 minút pri 65 °C. Teplota se pak zvýši na 42 °C na dobu 60 minút, načež se ochladí na 0 °C. Objem této smési (90 mikrolitrú)se upraví na 900 mikrolitrú obsahujících 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 4 mM chloridu hoŕečnatého, 10 mM síranu ámonného, 0,1 M chloridu draselného, mikrogramú BSA v jednom militru a 0,1 mM β-NAD. Pridá se 6 mikrogramS E. coli DNA ligasy a roztok se inkubuje pŕes noc pri 12 °C.

Stupeň 5: náhrada RBA vláknem $NA· Pro náhradu vláknem fiNA insertu se ligační smés upraví tak, aby obsahovala 40 mikromplú každého ze čtyŕ deoxynukleosld-’trifosfátú,

0,15 mM β-NAD, 4 mikrogramy další E. coli DNA ligasy, 16 jednotek E. coli DNA polymerasy X (Poli) a 90 jednotek JE* ^RNAsy H. Tato smés (960 mikrolitrú) se inkubuje postupné pri 12 °C a za teploty místnosti po dobu jedné hodiny. Tím se podporuje optimálni opravná (reparační) syntéza a záŕezová translace Poli.

Stupeň 6: transforraace E. coli. Transformace se provádí podie postupu popsaného Cohenem a spol. s menšími Äodifika-^; cemi (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110 az 2114 (1972)·)· B, coli R-12 kmeň MC1061 (Casadaban M. a Cohen S. ť J. Mol. Biol. 138, 179 až 207 (1980) byl kultivován do 0,5 jednotek absorbance pri 600 nm pri 37 C ve 300 ml L-živné pôdy. Bunky se isolují odstŕeňováním. Suspendují se ve 30 ml lOraM Pipee (pH 7,0), 60ral chloridu vápenatého. 15% glycerolu a odstŕeSují se pét minút pri 0 °C. Bunky se resuspendují ve 24 ml shora uvedeného pufru a opét se inkubují pét minút pri 0 °C. Potom se 1,0mi podíly suspense bunék smíchají s . 0,1 ml ONA roztoku (stupeň 5) a smés se inkubuje dvacet minút pri 0 °C. Bunky se pak udržují dvé minutý za 42 °C a pak deset minút za teploty místnosti. Pridá se leden litr L-živné pôdy a kultura se inkubuje 60 minút pri 37 °C. Pridá se ampicilin na koncentrací 50 ^ug/ral. Tato kultura se trepe, dalších deset hodin pri 37 °C. Zredéní této kultury se nastfíkají na agarovou L-živnou pôdu obsahujicí 50 zug/ml ampicilínu. Po 12 az 24 hodinách inkubace pri 37 C se j,ed-^: notlivé kolonie vyberou sterilní zubárskou špachtlí. Cel-^;

B. Testování (skríning) pcD banky

10^ jednotlivých klonô se náhodné výbere z banky cDNA,

T-bunČk a množí se jednotlivé v jamkách miábtitrovacích deeek/misek, které obsahují 200 /Ul L-živné pôdy s 50 yUg/ral ampicilínu a 7 % dimethylsulfoxidu. Pri soustŕedení se pouze na novou MCGF, aktivitu bylo identífikováno 53 IL-3 cDH'A, klonô a jeden GM-C3F cDNA kloň hybridizací príslušnými ^^1značenými cDNA sondami zkonstruovanými z klonô objevených Leeem a spol. (proc. Hati. Acad. Sci. 82, 43&O až 4364 (1985),) a Yokotou a spol. (Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 107Q až 1074 (1984)·). Tento postup se provede následujícím zpôsobem: Každá deska s 56 kultúrami se replikuje na nitrocelulosové filtry pro testování hybridizací. Hybridizace se provádí v 6 x SSPS (1 x SSPE znamená lSOnJÍ chlorid sodný, lOmM fosforečnan sodný, pH 7,4, M EDTA, 0,1% SDS, 100 /Ug E.coli tRNA na mililitr, 50% formamid) 16 hodin pri 42 °C. Hybridizační klony se identifikuj! autoradiografií na promytých filtrech. Tyto klony byly odstránený sterilizací mikrotitrovacích jamek obsahujicich tyto klony ethanolem pred prípravou sestav klonú. Sestavy obsahují aš 48 cDNA . klonú. Tyto sestavy byly pripravený z mikrotitrovacích kultúr. Dvé sté takový.ch sestav bylo necháno rúst v jednolitrových kultúrach a L·-živnou pudou obsahujici 100 yug/sil apu pícilinu. Plasmidová DNA se isoluje z každé kultury a vyčistí se dvakrát projitím gradienty chloridu cesného. DNA , každá sestavy se transfektuje do opičích bunék COS 7 nasledujúcim postupem (Bunky C0S7 jsou popsány Gluzmanem: Celí

23. 175 až 180 (1981) a jsou ^stupne od ATTC pod č. GRL 1651)·

Jeden den pred transfekcí ee približné 10' opičích bunék COS 7 vyseje na jednotlivé ΙΟΰκπη desky v DME obsahujícim 1<% plodové telecí sérum a 2mM glutamin. Aby se provedla. transfekce, médium 3e odebere z každé desky a nahradí se 4 ml DME obsahujícího 50mM Tria.HCI, pH 7,4, 400 yUg/ml DĽÄE-Dextranu a 50 /ug plasmidových DNA, které mají být testovaný. , Tyto desky se inkubují čtyŕi hodiny pri 37 °C, potom se médium obsahujici DNA odstráni a desky se promyjí dvakrát 5 al DKE bez séra. DME (se 150 yuM Chloroquine)se dá zpét na desku, která se pak dále inkubuje další tri hodiny pri 37 °C.

Tyto dssky.se promyjí jednou DME, potom DMS obsahujici 4%, plodové telecí sérum, 2mM glutamin, penicilín a streptomycín. V posledné uvedeném DME s prísadami se bunky inkubujú 72 hodiny pri 37 °C. Kulti^ční médium se odebere a vyhodnotí se rôznymi bioanalýzami.

Pôvodní rada sestav plasmid’’ se testuje primáme pomoci proliieračních analýz na aktivity TCC-Γ a MCGP bunečnými liniemi HT-2 (podrobuj! popsanými níže), a také bunečnou 15„nií MC/S. Ξ prvních 110 sestav testovaných na téchto dv.ou bunečných liniích osm poskytovalo významnou aktivita v HT-2 TCGF analýze. Nékolik téchto sestav mélo slabou, ale významnou MCGF aktivitu, ale jelikož MCGF aktivity byly obvykle slabší a variabilnejší, nespoléhali jsme na tuto analýzu pro identifikování positivních sestav.

Približne polovina s téchto COS supernatantô z trans-¹ , i . 56 t * fekcí náhodných sestav bylo analzováno také na I a-^; indukuj ící aktivitu na myších B bunkách. Mezi testovanými sestavamju každé sestavy, která vykazovala aktivitu TCGF, bylo zjíä-í téno, že vykazuje také Ia-indukující aktivitu. Existuje tedy zde perfektní korelace mezi TCGF aktivitou a Ia-indukující aktivitou.

Jedna sestava, 2A, která byla reprodukovatelné nejaktivnšjsí ve všech analýzách, byla rozdelená na 48 menších podsestav. Dve podsestavy byly positivní jak na MCGF tak TCGF aktivitu. Jeden kloň, 2A-EC, obecný pro obé sestavy, byl potom nechán samostatné rôst. Jeho plasmidová DNÁ byla transfektována do bunék COS 7 jak shora popsáno. Výsledný COS supernatant se pak testuje na prítomnost rúzných aktlvit , včetné MCGF, TCGF, la-indukující aktivity a IgE- a IgG-zvyšujxcí aktivity.

Pstl fragment dlouhý 366 párô nukleotidô, isolovány z klonu 2Α-Β3 (obrázek lA)a označený ^²P_Z se pak použije jako, sonda pro testovaní sestav, které byly positivní, na biologickou aktivitu stejné jako ostatních netestovaných sestav. Testování se provádí hybridizací na filtrech replikací mi-^: krotitrovacími kultúrami jak shora popsáno. Bylo isolováno devét hýbridizujících klonô. Jejfch DNA byly analyzovány restrikčním mapováním. Všechny sestavy, které vykazovaly. biologickou aktivitu, obsahovaly alespoň jeden hybridizující kloň, který sdílel obecnou mapu restrikčního štépení, s klonem 2A-E3. Frekvence hýbridizujících klonô z lo^ klonô, které byly vybrány, ukazuje na frekvenci približné Θ,2 % v celé bance. Z hýbridizujících klonô, které byly testovány, približné 90 % ezpresí poskytovalo funkční protein.

t

E. Biologické aktivity kul tur supernatantô opičích bunék COS 7 transfektovaných pcD-2A-B3 _t Supernatant bunek COS 7, které byly transfektovány pcD-2A-E3,. byl testován na TCGF aktivitu na myších bunéčných liniích HT-2 pomocných T-bunék, popsaných Watsonem v J. Exp, Med. 150. 1510 (1979). Proliferace bunék HT-2, stanovovaná i 57 kolorimetričkou analýzou podie Mosmanna (viz shora uvedená, citace) byla/použita jako raíra TCGF aktivity (stupeň proliferace se koŕeíujé s optickou hustotou (OD) od 570 nm do ,

630 nm). Ojír^zek 3A ilustruje relatívni TCGF aktivitu rúzJ ných zredni i )j supernatantu z bunék COS 7 transfektovaných pcD-2A—E3 (krivka 1), ii) supernatantu z kul tur Cl.Lyl*2ŤY9 (kriyka 2), ,< iii)supernatantu z bunék COS 7 transfektovanýeb’pcD plasmidem nesoucím IL.2 cDNA (krivka 3) a iv)su- , pernatäntu z bunék COS 7 transfektovaných pcD plasmidem neobe^ctujícím ž4dný cDNA insert (tj. mock” (^simulovaná) tŕánjefekce) (krivka 4)· /'y ' - .

/ r* . . . /'Podobné byly supernatanty z bunék COS 7 transfektovanýchp c D- 2 Α-Ε3 testovány na MCGF aktivitu na MC/9 bunkách,, opétž kolorimetrickou analýzou podie Mosraanna, kterou se mé-. ŕí proliferäce ÉC/9. Obrázek 3B ilu^rujé relatívni MCOP aktivitu. i) supernatantu z bunék COS 7 transfektovaných pcDk-2A-33 (krivka 1), ii) supernatantu z bunék COS 7 transfektovaných pcD..plasmidem nesoucím IL-3 cDNA (krivka 2),. iii) supernatantu bunék Cl.Lyl+279 (krivka 3) a iv)supernatantu z bunék' COS 7 transfektovaných simulovanou transfekcí /(krivka, 4).

Obrázek 30 ilustruje výsledky la indukční analýzy provedené.ha i,) supernatantu z bunék COS 7 transfektovaných pcD-£-E3 (krivka 1), ii)supernatantú bunék Cl.Lyl⁺2*’/9 (krivká 2) a iii) supernatantú z bunék COS 7 transfetovaných; simulovanou transfekcí (krivka 3). Analýza Ia-indukce ae provádí postupem podie Roehraa a spol. (shtsyra uvedená citäcé). Nékolik myší DBA/2 (ve stáŕí dva až tri merice) bylo usmŕceňo. Chirurgicky byla odebrána slezina. EryJ trocytý bylylysovány. hypotoniekým šokera 0,87% chloridem amonnjb. Potom byly T-bunky lysovány cy to toxickými monoklonálními protilátkami namírenými proti povrchovým markerúm špecifickým pro T-bunky (Thy-1, Lyt-1 a Lyt-2), načež následovala inkubace v králičím komplementu. Mŕtve bunky se pak odstránipomoci ficoll-hypaque hustOtních gradientú. Adhereatní bunky byly pred tím odstranény adherencí na plašJ 58 tické Petriho misky pri 37 °C. V tomto okamžiku byly buSky promyty, spočítaný a zj istená jejich životaschopnost, Pži-, blizne jeden milión bunék byl inkubován v 0«5 ml média tkánové kultury (RPMI 1640 nebo minimálni esenciálni médium ,

- MEM (Earleho sôl)) (Gibco) dopŕ&ného 10 % plodového tele-, ciho séra, 2-merkaptoethanolem a rôznymi antibiotiky ( penicilín, streptomycín a gentamycin). V pokusoch, pri nichz positivní kontroly sestávaly ze superhatantú z T-bunék indukovaných mitogenem T-bunek a pro neutralizaci mitogenu se pridá 10 mg/ml (konečná koncentráte) α-methylmanosidu. Po , 24-hodinové inkubaci se bunky, isolují a pripraví se pro vybarvení anti-I-A^a nebo anti-I-A^oa monoklonálními protilátkami. Tyto protilátky byly použitý jako protilátky prvního stupné konjugované bučí s haptenera N.I.P. nebo s biotinem. Vybavení se d^ončí inkubaci téchto bunék fluoreskujícími reakčními činidly druhého stupne (buä anti-íNIF protilátky nebo avidin). Intensita fluorescenčního zabarvení se pak stanovuje buň na fluorescenci sorterem bunék (Becton-Dickinson, Kountain View, Ka.) nebo cytofluorografem (Ortho Dia-, gnostlcs, Cambridge, Ma.). Fluorescenční jednotky na obrázku 3C byly vypočteny násobením procenta positivníoh bunék v každém vzorku intensitou fluorescenčního zabarvení.

/

Obrázek 3D graficky ilustruje stupné, kterými jsou pro-; dukce IgE a IgG^ indukovány v myších slezinných bunkách zbavených T-bunék i) mediem COS 7 samotným (sloupeček 1), ii) 20% supernatantem z COS 7 bunék transfektovaných simulovanou transfekcí (sloupeček 2), iii) 10% supernatantem z Cl.Lyl*2T/9 bunék plus 20% supernatantem z COS 7 bunek transfektovaných simulovanou transfekcí (sloupček 3) a iv) 20% supernatantem z pcD-2A-^íE3 transfektovaných bunék COS 7 (sloupeček 4). Hladiny IgE a IgG^ byly stanovený shora popsanou ELISou špecifickou pro isotyp.

Bylo zjišténo, že myší IL-4 zvysují MCGF aktivitu IL-3 v MC/9 bunkách (Smith a Rennick: Proc. Natl. Acad. Sci. 83. 18.57 až 1861 (1986).). Bylo zjišténo,, že myší IL-4 zvyšují, GM-CSF-stimulovanou proliferaci na IL-3 závislé bunéčné li2 59 -¹ nie NFS-60, popsané Holmesem a spol.t Proc· Natl· Acad· Sci· 82, 6687 až 6691 (1985).

F. Štruktúra pcD-‘2jUE3 a sekvence nukleotidň jeho cDNA insertu Štruktúra pcD-2A-E3 je ilustrována na obrázku 2A. Expandovaná reštrikční mapa jeho insertu je ilu^rována na obrázku 2B. Insert byl sekvenován jak podie Maxaraa a Gilberta (Methods in Enzymology 65. 499 až 560 (1980)·) tak podie Sangera (Proc· Natl, Acad. Sci· 74* 5463 až 5467 (1977)·)·

Tato sekvence je ilustrována na obrázku 1Δ spolu s odx^rozenou aminokyselinovou sekvencí nejdelší čtecí oblasti ve fázi 3 prvním ATG počátečním kodonem. Jediná dlouhá otevrená čtec^ oblast v myším 2A-E3 cDNA klonu sestává ze 140 aminokyselinový c h zbytkô. Jelikož tento lymfokin je sekretovaný protein, lze očekávat, že hydrofobní leader sekvence by mela pŕedcházet sekvencí matúrované sekretované formy proteíny. Analýza hydrofobosti plasmidu a srovnání s navrženou souhlasnou sekvencí pro procesi signálních peptidô (Perlman a spol.: J.

Mol. Biol. 167. 391 až 409 (1983 )· ) vede k tomu, že ke stopení polypeptidového prekursorú by mohlo dojít v místé za serinovým zbytkem v poloze 20 aminokyselín na obrázku 1A. Grabstein a spol. (J· Exp. Med. 163* 1405 až 1414 (1986,). ) potvrdil, že N-koncová sekvence sekretovaného myšího IL-4 začíná v poloze 21 His na obrázku 1A.

Príklad 2

Príprava lidského IL-4 myší cDNA sondou na banku cDNA lidských pomocných T bunék a prechodná exprese v opičích bunkách COS 7 a v myších L bunkách cDNA klony kodující IL-4 byly ieolovány z bank' cDNA zkonstruovaných z indukovaných lidských pomocných T bunék, 2F1, a indukovaný lymfocyty lidské periférni krve (PBL) zpňsobem myší cDNA sondy. Mezi další lidské bunečná linie, o , nichž je známo, že poskytují BCGF aktivitu, se 2ahmují vaJ rianty linie OEM, která je dostupná od ATCC pod č. CCL 119, CRL 8436 a TIB 195, popsané Foleym a spol.s Cancer 18, 522 až 529 (1965) a Liglerem· Lymphokine Research J, 183 až 191 (1984).

- 60 Kloň lidských pomocných bunék T', 2P1, a lidské PBL byly kultivovány v Iscoveove médiu doplnénóm 3 % plodového telecího séra. Bunky 2P1 byly aktivovaný ConA (10 ^ug/ml). PBL byly stimulovaný 1 ^ug/ml RNA po dobu. 12 hodín. Potom bylo pŕidáno 5 /ug/ml ConA. Bunky byly isolovány čtyri hodiny (2F1) nebo deset bodin (PBL) po pridaní ConA.

Extrakce mRNA a konstrukce banky cDNA se provádí jak popsáno v príkladu 1. Z klonu myší pcD-2A-E3 cDNA se isoluje PstI fragment, označí se záŕezovou transla^cí (1.10^ impul- . sô za minutu na mikrogram) a použije sé jako sonda pro nitj*ocelulosové filtry obsahujicí prípravky plasmidové DNA z deseti sestav, každé predstavujúci približné 1.10^ klonu 2P1 cDNA banky. Byly použitý mírné hybridizační podmínky (preš noc pri 42 °C)j 6 x SSPE (1 x SSPE znamená 180mM chlorid sodný, lOmií fosforečnan sodný, pH 7,4, ImK EDTA) (Maniatis T,a spol·: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Gold. Spľ*ing Harbor Laboratory, N.Y., 1982.).), 20% formamid (objemové díly k objemovým dílôrn), 0,17i dodecylsulfát sodný, tRKA kvasinkový nosič na 100 ^ul. Filtry se promyjí dvakrát SSPE, 0,1% sodným/Scdecylsulfátem pri 37 °C.

V jedné z deseti sestav byl identifikován jediný kloň (pcD-46)· Další klony byly získaný testováním PBL cDNA bank sondou zkonstruovanou z Nhel-ScoRl fragmentu pci)-46 (klu-’ strovaného na reštrikční mape na obrázku 2D), Analýza reštrikčnými enzyjny ukazuje, že PBL klony byly identické se strukturou pcD-46.

Bylo objeveno, že na. guanidin bohaté oblast v 5 ’, nebo proti sméru vlákna, smeru od kódujúci oblasti insertu pc.D- 46 vykazovala expresi IL-4 polypeptidu. Potom se insert pcD-46 reklonuje, aby se odstránila oblast bohatá na guanidin. Výsledný kloň se označí pcD-125. Bylo také objeveno, že exprese se zlepší transfektováním myších bunék pcD-46.

Vektor pcD-125 byl vytvoŕen následujícím zpôsobem: pcD-46 se rozštépí pôsobením Sau3A. Isoluje se fragment obsahujúci 5' 162 nukleotidô cDNA insertu (odstránením CC segmentu),, Potom se tento fragment vloží d.o místa BglII plasmidu plOl. Plasmid plOl byl odvozen od pcD-myšího IL-3 (viz Yokota T. a 3pol·: shora uvedená citace (1384).). Dele tn,j e se sekvence od Pstl místa na 5 konci cDNA do BglII. místa v myší IL-3 cDNA. BglII místo je obsaženo v míst© napojená deletované sekvence. Fragment Sau3A je napojen na, promotor 3740 jako v dcD-46 až na GC segment. Zbytek limské, cDNA byl pak zrekonetruován a HindlII/Nhel fragmentu z pcD-46, který nese 3* konec cDNA, SV-40 poly-A místa a všech pBR322 sekvencí pcD-46.

Supernatanty pcD-46- ε poD-125-transfektovaných CO3 7 a L bunék byly analyzovaný na 3CGF a TCG? aktivitu, la analyzována linií lidských pomocných T bunék JLformovanou virera Spstein-Barr a fytohema vaných lidských perifernícn krevnich lym ^lutinineirbcytú.

TCG? by-. HB7 transstimuloKlon linií lidských pomocných T bunék JL-EBV byl stimulovén osaŕenými (4300 R) bunkami lidských EBV-transf o lisovaných 3-bunečných linií. Potom byl uchováván v médiu RPNií 1640, které obsahuje 10$ lidského AB séra, 50^uftľ 2-merkaptoethanol (2ME) a rekombinantni lidský IL-2. Lidské PSD byly stimulovaný PHA (20 /Ug/ml) a uchovávaný, v R?MI 1640 obsahujícim 10$ plodové telecí sérum, 50^uíá 2-merkaptoethaJ nol a rekombinantni lidský IL-2. Po péti až deseti dnech od stimulace se bunky JL-EBV nebo PHA blasty použijí jako cíle, v dvcudenní TCG? analýze s využitím Mosraannovv kolorimetricJ ké metódy (shora popsané) nebo v trídenrd TCG? analýze s využitím inkorporace [^íf)*thymidinu.

Obrazek 4A ilustruje TCG? ak' ’ity merene JL-EBV bunkami (kolorimetrická analýza): i)Supernatantô bunék. C0S7 transfek tovanýc’i pcD plasmidy, které expresi poskytuj í lid—^: eký IL-2 (krivka A), ii) supornátantu bunék L transfektovaných pcD!25 transfek tovan;

nek CO3 7 transfer tantú bunék COS 7 (krivka B) ch pcDl25 , iii) supernatantú bunék COS (krivka C), iv) supernatantú . b u- ·.

tovaných pcD-46 (krivka D) a v) supernatransfektóvaných simulovanou transfekcí (krivka E),

Obrázek

4B ilustruje TCGF aktivity rcéŕené PHAstimulovanými PBL (kolorimetricks analýza): i) superna- . tantu bunék COS 7 transfektovaných plasmidy pcD, které expres! poskytuj! lidský IL-2 (krivka A), ii) supernatantu bunék COS 7 transfektovaných pcD-125 (krivka B) a iii) supernatantu bunék COS 7 transfektovaných simulovanou transfekcí (krivka C). Obrázek 4C ilustruje TCGP aktivity mé- . rené PHÁ-stimulovanými PBL (analýza inkorporacx triciovaného thymidinu): i) supernatántô bunék COS 7 tranafektovaných pcD-125 (krivka A), ii) supernatantô bunék COS 7 transfektovaných plasmidy pcD, které expres! poskytuj! lidský , IL-2 (krivka B) a iii) supernatantô bunék COS 7 transfektovaných. simulovanou transfekcí (krivka C).

BCGP aktivita rôznych redén! pcD-125 transfektovaných supernatantô byly srovnávány s BCGP (komerční BCGP) popsanými Maizelem a spol.j Proc· Natl. Acad. Sci. 79· 5998 až 6002 (1982), který je komerčné dostupný od Cytokine Technology International (Buffalo, NY). Tabulka II ilustruje BCGP. aktivity, rôzných zŕedéní supernatantô transfektovaných C0S 7 na antilgM protilátkami predem aktivované B-bunky. B-bunky se pripraví jak shora popsáno v sekci analýzy.

Tabulka II

Vliv supernatantô IL-4 cDNA transfekfcô na B-bunky predem aktivované anti-IgM

% (obj. díly) pridaných supernatantô	simulovaná · transfekce	inkorporace kloň 125	3H-thymidinu simulovaná transfekce + 10 % BCGP	kloň 125 + 10% BCGP
0	278	278	1835	L835
0,2	189	144	1362	2303
1	323	1313	1699	3784
5	408	4314	1518	7921
15	397	4289	1093	8487

Tabulka III ilustruje BCGP aktivity rôzných zŕedéní supernatantô transfektovaných COS 7 na B-buňky pčedem aktivované SAC (pripravené jak shora uvedeno).

Tabulka III . . Aktivita supernatantú ILÍ4 cDNA transfekce na B-bunky predem aktivované SAG

% (obj. díly) pridaných supernatantú	inkorporace ^H-thymidinu •(počet impulsu za minutu)
simu- lovaná trans- fekce	kloň 125	simulovaná transfekce 10 % BCGF	kloň 125 + 10 % BCGF
0	2237	2237	12 992	12 992
0,2	1789	2682	13 126	5 655
1	740	2374	13 7X4	6 765
5	1285	2826	5 848	10 023
15	1560	4701	10 128	10 924

I když lidský IL-4 podie vynálezu i komerční BCGF vykazuj í BCGF aktivitu (Mehta a spol.: J. Immunol. 135. 3298, až 3302 (1985)·), znamená to, že TCGF aktivitu lze biochemický oddélit od BCGF aktivity komerčního BCGF. To ukazuje, že tyto aktivity jsou zpúsobeny núznými molekulami. Lidský II»-4 a komerční BCGF jsou tedy rúzné molekuly, nebol TCGF aktivita je u lidského IL-4 neoodelitelná od BCGF aktivity standardními technikami -bio^Semické frakcionace.

Supernatanty bunék COS 7 transfektované plasmidy nespucími lid^u IL-4 cDNA indukují proliféraci normálních lidskýeh T bunék a klonu JL-SBV lidských T bunék. Avšak maximálni rozsah proliferace lidských T bunék indukovaných jako odpovéä na, lidský IL-4 je asi polovinou odpovedi indukované lidským IL-2. proliféraci indukující aktivita IL-4. by nemela být inhibována monoklonálními protilátkami proti IL-2 nebo, proti IL-2 receptorom pri testování. Tyto výsledky pŕedpokládají, že IL-4 púsobí prímo na T-bunky a nikoliv cestpu indukce IL-2 a še tato aktivita není, zprostredkována IL-2 recítetorem. Supernatanty lidského IL-4 COS stimulují takjé proliféraci lidských B bunék pŕedem aktivovaných optimál— nimi koncentracemi anti-IgM protilátek navázaných na perličky a mají další proliferační kapacitu ε komerčním BCGF v hladinách nasycenosti^vBCGF analýze. To pŕedpokládá, že lid« 64 — ský IL-4 a komerční BCGF pôsobí na B bunky rôznými cestami, napríklad možná rôznymi radami receptorô. Supernatanty významne neindukují proliferaci B bunek pŕedem aktivovaných, pôsobením SAC, zatímco komerční BCGF vyčistený od superna-^; tantô PBL kultur stimulovaných pôsobením PHA silne indukuje proliferaci lidských B bunek pŕedem aktivovaných pôsobením SAC, Tyto výsledky dále ukazují, že cDNA lidského 1L-4 kóduje jinou BCGF aktivitu než je aktivita prítomná v komerční m BCGF.

Supernatant pcD-125 transfektovaných bunek COS 7 byl testován také na schopilo st indukovat Fc-epsilon receptory na tonsilních B bunkách. Lidské tonsilní bunky se dispergují na suspensi jednotlivých bunek standardními zpôsoby. Populace 3 bunék se obohatí podie shora popsaného postupu a obohacené bunky se stimulují anti-IgM protilátkou 24 hodiny v Jcultivačníra médiu pri 37 C. Bunky, které nesou receptor Fe-epsilon, se analyzují sortérem bunek Becton Dickinson, FACS IV s použitím fluorescenčné značené monoklonální protilátky špecifické pro tento receptor zpúsobem, který popisuje Bonnefoy a spol.: J. Immunol. Líeth. 88, 25 až 32 (1986). Obrázky 5A až 5D jsou histogramy ilustrující frek-, venci bunék (svislá osa) v závislosti na intensité fluoresi* cence (vodorovná osa). Intensita fluorescence je príino úmerná počtu Fc-epsilon receptoru prítomných na buňce, Ve všech techto obrázcích byly bunky stimulovänjr pôsobením Anti-IgM. Obrázky 5A až 5D odpovídají pôsobení 0 %, 0,1 1 % a 10 % supernatantu z bunek COS 7 transfektovaných pôsobením pcD-125.

Byla stanovená sekvence DNA cDNA insertu klonu c. 46. Tato sekvence je uvedená na obrázku IB. cDNA insert je dlouhý 615 párô nukleotidô vyjraa poly(A konce, Jde o jedinou otevŕenou čtecí oblast s prvním ATG kodonem umísténým u 64. nukleotidu od 5* konce, nasleduje 153 kodonu končících terJ minačním kodonem TAG v poloze 523 až 525 nukleotidô. N-konJ cový segment pŕedpovédéného polypeptidu je hydrofobní, jak lze pro sékretovaný protein očekávat.

J 65 Srovnání kodujicíoh oblastí lidské a myší cDNA podie, tohoto vynálezu ukazuje, že oblasti sekvence kodující lidskou cDNA v pcD-46 zahrnújící polohy aminokyselín 1 až 90. a 129 až 149 sdílejí približné 50% homologii s odpovídajícífci oblastmi sekvence kodující myší cDNA (2A-E3). ^yto oblastí a 5* a 3* neprekladané oblasti adílejí približné 70% homologii u dvou cD>’A sekvencí rôzných druhú, pri éeraž tato oblast zahrnující aminokyseliny 91 až 128 lidského proteínu sdílí velmi omezenou homologii s odpovídající myší oblastí. Celkem je š e a t ze sedmi cysteinových zbytkú v lidském proteinu zachováno v príbuzném myším proteínu. Jistá homologie sekvence aminokyselín existuje mezi prírodní formou lidské-’ ho polypeptidu podie tohoto vynálezu a myším IL-3. Zbytky, aminokyselín 7 až 16 a 120 až 127 vykazují 50% a 55% homologli se zbytky 16 až 27 a 41 až 49 polypeptidu prekursoru myšího IL-3 (Ybkota T. a spol.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA gl, 1070 až 1074 (1984).).

Jak je dále podrobnej! popsáno, bylo zjišténo, že lidský IL-'4 vyči.šténý ze supernatantu COS 7 transfektovaných pôsobením pcD-125 je polypeptid o 129 aminokyselinách se sekvencí ilustrovanou na obrázku 1C.

Príklad 3

Zvýšená exprese lidského IL-4 v opičľ'ch bunkách COS 7 por mocí vektoru odvozeného od W (Epctein-Baar virus) obsahujícího promotor RSV-LTR

Deseti až dvaceti-násobné zvýšení exprese lidského IL-4 se získá reklonováním Xhol fragmentu p.cD-125 do EBV-odvozeného vektoru obsahujxcího promotor RSV-LTR (s dlouhýra koncovým opakováním viru Rousova sarkomu). Od EBV-odvozený vektor a RSV-LTR promotor jsou popsány Gormanem a spol.: Proc. Hati. Acad. Sci. USA 79, 6777 až 6781 (1982) a Yatesem a spol.: Náture 313, 812 až 815 (1985).

Fragment HindITI/Xhol obsahující promotor RSV-LTR byl isolován z plasmidu pcD pŕedem zkonstruovaného z RSV-LTR obsahujíciho AccI/HindlII fragment popsaný Gormanem a spol.

- 66 (shora uvedená citace) a komerčné 'dostupný pcD vektor (napríklad Pharmacia). Shora uvedený HindlII/XhoI fragment a , HindlII/XhoI fragment £ plaamidu pLl (Pharmacia) se sestŕihnou do plasmídu pcDVi (dostupného od Pharmacia). Orientaoe oblasti počátku replikace 3V40 není rozhodující. Mezi místem AatlI a místem Ndel výsledný vektor pcD obsahuje v sekvenci (od. AatlI raísta) oblast počátku replikace 5V4O, promotor RSV-LTH a £740 polyA oblast. ?o tom, co ee isoluje fragment Xhol z pcD-125, a po tom, co se vloží do míeta Xhol nové skonštruovaného pcD vektoru, jedinečná mista AatlI a Ndel ve vektoru se pŕevedou standardními technikami na mista Sali.· Stručne - vektor pcD ee rosstepí pôsobením AatlI a Ndel, isoluj© s© fragment obsahující IL-4 a isolovaný fragment se nechá zreagovat s T4 DNA polymerasou v prítomnosti príslušných koncentraci nukleosid-trifosf á ťú. 5-*· 3 DNA polymeraaová aktivita ľ 4 DNA polymeraey doplňuje preenívající konce restrikčních štépú a 3'—*5* endonukleasová aktivita T4 DNA polymerasy štepí 3 pŕecnívající konce restrikčních štepu·. Zústanou tak fragmenty ee zarovnanými konci, a nimiž se 11gují T4 DNA ligasou kinasované Sali linkery (New England Biolabs).

Shora uvedený Sali fragment (ilustrovaný na obrázku 11.) se vloží do vektoru p 201 odvozeného od EB7 a popsaného Yatesem (viz shora uvedená citace) a lov raísté jedinečného mista Clal, které bylo prevedeno na misto Sali standardními technikami. Ve stručnosti - p.?01 (ilustrovaný na obrázku 11) se rozštépí púsobením Olal a nechá ss zreagovat s DNA polymerasou I (Klenowôv fragment) a príslušnými koncentraoemi nukleosid-triíoafátú. Tento postup doplňuje pŕečnívající konce štépu Clal tak, že se získá fragment se zarovnanými konci. Dále ae zarovnané konce ligují s kinasovým Sali linkerejn. Výsledný od SSV odvozený vektor obsahující pronotor NSV-LTR a cDNA insertu lidského IL-4 jsou zde označovaný jako pEBV-178.

pEBV-178 se transfektuje do bunék COS 7 standardními technikami. Kultury eupernatantú se analyzují na TGGF aktivitu jako míru exprese IL-4.

Príklad 4

Exorese prírodní ho lidského 1L4 a. muteinu IS° (Ala— Glu—Phe} v E. coli

Pro enpresi lidského IL-4 v E. coli byly zkonstruovány dva vektory obsahuj í cí ineerty c DNA lidského IL-4: pIR-‘III sekreční vektor, který .obsahuje sekvenci peptidu ompA proteinú (pir-III-ompA2) a plasmid ?UC1.2, který obsahuje promotor trpP a pŕilehlo ribosomové vasebné místo (RBS) oblasti (TRPC11”).

A. pIH-III-ompA2

Byly zkonstruovány dva vektory pomoci pl a smidu pIE-111-¹ -ompA2, který js popsán Ghrayeteem a spol.: EM3Q Journal 3., 2437 až 2442 (1SS4) a Masuiiia a spol.: Biotechnology 31 až 85 (1984).

<1

První vektor, označený pIK-XIIompA2(l) byl zkonstruovén ligací, v sérii, EcoRI/BamHI-rozstQpeného plasmidu, syntetického linkeru a BaraRI/EcoRV fragmentu z pcD-125. Použití syntetického linkeru v této ko.nstrukci vede. k sekreci biologicky aktivního polypeptidú IL-4 se tfemi H-koncovými aminokyselinami. navíc Ala-Glu-phe—. t.j, sekretuje se mutein IL° . (Ale—Glu-Phe). Syntetický linker sestávs z následujicích sek— venci nultí eo t idú:

AA TTC CAC AAG

G . GTG TTC

TGC GAT ACG . CTA

EcoRI/BaraHI ro.sštepený pITT-III-ompA2 a BemHI-EcoRV fragment z plasmidu pcD-125 se smíchají ve štandardní ligační emesi (napr. viz Maniatis a spol.: shora uvedená citace.) obsahující O,lmikromolární koncentraci syntetického, linkeru. E. coli kmeň AblS99 se iňfektuje plasnidsm pTM-III~orapA2(l) a transformanty se vyberou hybridizací kolonií cDNA 3ondou 32

P-označeného IL-4. Extrakty lidského IL-4 pro analýzu se získají následujicím zpúsobem: Po sonikování (pôsobení ultrazvuku) se bakteriálni kultury odstreňují a supernatant se odstráni z pelet, Pelety ge nechají zreagovat s 1¾ SDS,. 2ffiM dithiothreitolem a 6M gusnidinera. Tento materiál se odš^3uje, supernatant se odstráni ε pc-leta ee nechá zreagovat s 3% SDS a 2mM dithiothreitolem pri 45 °C. Materiál se opet

-66 odstrekuje a supernatant se analyzuje SDS-PAGE.

Zkonstruuje se pIN-.III-ompA(2)tak, aby se expresí zífiU , kéval prírodní iideký IL-'4· Pridání tŕeeh aminokyselín v koní strnkei pIN-III-'ompA(1) se odstráni místne-špecifickou mutagenesí sekvence ompA signálního peptidu pIN-IIX-oropA2. Místí ne-špecifická mutsgenese se provádí podie Zollera & Smitha (shora uvedené citace), Ve stručnosti - Xbal/BamHI fragment z pIN-III-ompA2 obeahující sekvenci kodujici ompA signálni peptid (vis obrázek 1 ve shora uvedené citacl. Ghrayeba a spol. ) se vyčistí, smíchá se s vyčistenou Xbal/BainHI-rozštépenou repí likačpí formou (RF) M13mpl9, liguje, transfektuje se do E. ogí li K-12 JM101 a vyseje se· Vyber© a namnoží se jasný plak v prítomnosti IPTG a X-gal, Pripraví se jednovláknová DNA, napríklad podie Messinga: Methods in Enzymology*; díl 101, ,

Academic Press, New York, lS83,0ddčlené se syntetizuje a fosforyluje oligonukleotidový primer (23-mer) obsahující vyznačené substituee nukleotidu (uvedeno ve čtverečku):

GGAATTCAGAAGCT

TG

GCTAC - 3

Tato sekvence zavádí druhé HindlII místo do oblasti kodujici signálni peptid mutovaného pIN-'IIl-ompA2. Oligonukleotidoyý primer se aneluje a M13mpl9 RF obsahující Xbal/BamHI fragment plasmidu pIN-III-ompA2 a zpracuje se s DNA polymerasou v prítomnosti príslušných koncentrací nukleosld-trifosfátň. Výsledné replikační formy se použijí pro transfektování JT'.'ílOl E, coli. Plaky, které obsahují mutant, se testují značenou oligonukleotidovou sondou. Sekvence vybrané replikační formy se potvrdí dideoxy-sekvenováním s použitím uversál- , ního Ml3 priméru. Vybraná replikační forma sé namnoží, i so J luje a rosštepí pôsobením Xbal a BamHI. Vyčištčný Xbal/BamHI fragment se vloží do Xbal/BamHI rozštčpeného. pIN-IIL-ompA.

Aby se vytvoril pI.N-III-ompA2(?), mutant pIN-III-oinpA2 ee namnoží, vyčistí, rozštepí pôsobením HindlJI a BamHI a smíchá se s BamHI-EcoRV fragmentom plasmídu pcDúl25 ve s^dardním ligačním roztoku obsahujicim 0,lmikromolární koncentraci následujícího syntetického linkeru:

A GCT GAC AAG TGC GAT GTG TTC ACG CTA .

- 69 E, coli kmeň Abl899 byl infektován plasmidem pIN-III~orapA2(2). Transformanty ©e vyberou hybridizací kolonií značenou XI—’4 cDNA sondou, ÍL-4 extrakty, pripravené jek shora uvedeno,, vykazují TCGF aktivitu srovnatelnou se superaatanty pcD-125 COS 7 bunék,

B. TRPC11

Vektor TRPC11 byl zkonstruován ligací syntetického souhlasného RBS fragmentu e Clal linkery (ATGOAT) a klonováním výsledných fragmentú do ClaL-rozštépeného pHTllhc (který byl pŕedem upi^ŕen tak, aby obsahoval místo Clal). pKTllhc je malý (2 300 nukleotidú), AMp\ TET⁵derivát plasmidu pBR322 o vysokém počtu kópií, který nese EcoRI-HindlII polyllnke— novou oblast •’fíVX plasmidu (popsaného Maniatisem a spol·: , viz shora uvedená citace). Byl modifikoyán tak, aby ebsahoí' val místo Clal roz štepením pBSTllhc pú sobením EcoRI a BamHI, doplnéním výsledných pŕečnívajíeích koncú a ligací linkerem Clal (CATCGATG). Tím se zreštauruj! mista EcoRI a BamHI a místo Smal se nahradí Clal,

Jeden transformant z konstrukce TRPC11 mél tandem RBS sekvence obklopený místy Clal. Jedno z míst Clal. a část druhé kópie sekvence RBS byly odstranény rozštépením tohoto plasmidu púsobením Peti, zreagováním s nukleasou Bal31, rozštépením púsobením ScoRI a reakcí s T4 DNA polymerasou , v prítomnosti všech č tyr deoxynukleotld-trlfosfátú, Výsled»’ né fragmenty o 30 až 40 párech nukfeotidú byly isolovány PAGE a klpnovány do pUC12 rozštepeného púsobením Smal, J3. coli trpB—nesoucí EcoRI fragment o 248 párech nukleotidú odvozený od pKCIOl (popsaný Nicholsem a spol,i Methods in Enzymology 101> 155 (Academic Press, N. Y. , 1583). ) byl potom klonován do mista EcoRI. Ukončí se tak konstrukce TRPC11, která je uvedená na obrázku 12.

TRPC11 byl použit jako vektor pro cDNA lidského IL-,4. Nejdŕíve se rozštépí púsobením Clal a BamHI, bo tom se vyJ čistí a smíchá se s fragmentem EcoRV/BamHI z plasmidu pcD-125 se štandardním ligačním roztokem obsahujícím 0,lmikro* lamí koncentraci následujícího syntetického, linkerus

TCG ATG CAC AAG TGC GAT

AC GTG TTC ACG GTA .

Výbere se insert obsahující vektor, jak je to shora popsáno, a množí se v E. coli K-12 kmeňu JMLOl. IL-4 byl extrahován ná sleduj í cím zpúsobem. Na bunky JM101 se púsobí ultrazvukem v jejich kultivaČním médiu. Smes se pak odstrekuje, Peleta se resuspenduje ve 4$ guanidinu a 2mK dithi^hreitolu a opét, se odstrekuje. Supernatant se testuje na biologickou aktivitu. Bylo zjišténo, že vykazuje TGGP aktivitu srovnatelnou p aktivitami supernatantú bunšk GOS 7, které jsou transfekto^ vány pcD-125·

Príklad 5

Príprava, cDNA hovézího IL-4 pomoci sond cDNA myšího a lidského IL-4 na banku cDNA hovézích pomocných T bunék a dočasná exprese v opičích bunkách COS 7

Klony cDNA kodující IL-4 se isolují z bank cDNA zkon-’ struovaných z indukovaných hovezích periferních krevních lymfocytú (PBL) zpúsobem kombinace myších a lidských cDNA sond, Mezi alternatívni zdroje hovézích cDNA patrí linie nékolika hovézích bunék uchovávané ve sbírce živočišných linií ATCS , NBL. Postupy jsou v podstate identické s témi, které byly popsány v príkladu 2. Bunky se isolují asi deset hodin po in-? dukci Con A. Extrakce mRNA a zkonstruování hanky cDNA se provedou stejné jako v príkladu 2.

Sondy myší a lidské cDNA se mohou používal společné jako smés nebo postupné pro detekce cDNA hovézího IL-4. Jako v príkladu 2 se fragment PstI isoluje z myšího klonu cDNA pcD_2A—E3. Podobné fragment P3tl se isoluje z klonu cDNA lidskóho pcD—125· Nekteré další fragmenty jsou také dostupné pro zkonstruování sond. 3uč společné nebo oddelené se fragmenty PstI označí zárezovou translací (asi 1.10® počet impulsú za minutu na mikrogram) a použijí se pro aondování .nitrocelulosových filtru obsahujících plasmidové DNA prípravky z deseti sestav, každá predstavujúci asi 1000 klonú indukované ,·<=>, í n·

- 7i PBL cDNA banky. Hybridizace na filtru se provádí jako v príkladu 2» Positivni vyhodnocene klony s3 identifikuj! a namno ží·

Príklad 6

T 4 o

Exprese pri,rodní ho lid akého IL-4 a mutcinô SA a IS° (GlyAsn-Phe-Val-His-Gly) v Saccliaromycez Séfcisiae c DITA pri rodní ho lidského IL-4 a dva jeho mutanty byly . klonovány do piasmidu pKP-alfa8 a získavaný expresi v kvasinkách 3 ac c haroayo e s cerevisiae. ľ.onstrukce a aplikace pMF-alfaS pro expresi nekvasinkových proteínu je plne popsána lliyajimou a spol.: Jene 22· 155 až 161 (1935) &, L-iyajinpu a spol.: EliBO Journal 2« 1193 až 1197 (1986). Plasľiid plľP-alfaS je uložen v Americké sbírce typú kultur (American Type Cultúre Collection, Hockville, 34d, )pod číslem TO 140. Mapa plasmi-’ du je uvedená na obrázku 13A (popis obrázku uvádí S’iyajima a spol.s Gene (shora uvedená citace).).

A. Téutein £ ^**4 lidského IL-4

Iaoluje se plasmid pcD-125 a rosštépí se pôsobením

EcoRV. a BamHI. Fragment ScoRV/BamHI obsahujicí cDNA lidského IL-4 se ieoluje, nechá se zreagovat s DNA polyraerasou I (Xlenowôv fragment), kterou se doplní .BamHI rozštépení, naoež se ktnasuje (tj, fosforyluje). pMP-alfaS se rozštépí pôsobením 3tul a spojí ee s kinasovýra ĽcoRV/BamHI fragmentem z plasmidu pcD-125 ve standardním lígačníra roztoku. Vznikne tak plasmid phlL-4—2. Plasmid phIL-4—2 se použije pro .transformaci S. cerevisiae 203-12 (SíATalfa trp 1-289 pep4-3), která byla získána z Yeast Genetic Stock Center” (Stredisko kvasinkových genetických zásob), ľniverslty v Kalifornii, Berkeley. Bunky kvaoinek se nechají rust v syntetickám médiu oczahujícím C,67 h kvasinkových dusíkatých basí bez aminokyselín, 2 % glukcsy a C,5 % kasaminokyselin (Diico )· Xvc.sxnkove bunky se transformuj í plasmid y znôsobera s octanem líthným podie Ito a spol.: J. Bacteriol. 153, 163. az l6ľ (19b-3), Solekcc traneformantô so provádí v syntetic— kerii médiu, kterénu chybí tryptofan. Supernatant kultury transformantu se testuje na TCGP aktivitu.

Obrázek 13B (krivka D) ilustruje bC-fiľ' aktivitu nékolika vedení supernatantu z phIL-4-2-tranformovaných bunek kvasinek ve srovnání s jinýrci faktory (krivka A znamená lidský IL-2, krivka B znamená supernatant pcD-125-transfektovaných bunék COS 7 a krivka C znamená sup.ernatanty z bunek kvasinek, které jsou transformovaný pbIL-4-1). Krivka E ilustruje , TCG? akti’/itu supernatantu s kvasinek, které byly trans formovaný pôsobením pféF-alfač, kterému chybí insert oDNA IL-4. t j. jde o simulovaný transforiflaut.

B. Yutein IS° (Oly-Asn-Fhe-V&l-His-filip lidského IL-4

Insert pKF-alfaS pro expresi muteinu IL° (Gly-Asn-FheVal-His-Gly) se pripraví presné jako mutein A az na to, že s e použije fragment Nael/EamHI z plaemidu pcD-125· Výsledný plasraid se označí phIL-4-1· Nekterá, ňedéní superna^tantu z bunek kvasinek transformovaných phIL-4-1 byle. testována r.a TCGF aktivitu. Výsledky jsou ilustrovány krivkou C na. obrázku 13B. Tyto. supernatasty byly testovaný také na BCGF. aktivitu jak na B-lymfocytechjcteré byly aktivovaný anti-IgM tak na téch, které byly aktivovaný SAC, Analýzy byly provádony shora popsaným zpúsobem. Výsledky jsou uvedený v Tabulce IV.

Tabulka IV

BCGF. aktivity supernatantú bunek kvasinek transformovaných phlL- 4— 3 % (obj. díly) pridaných supernatantu

H-thyraidinová inkorporace (počet irapulsú za minútu) “Λ-lyrafocyty aktívo- 3-íyraŕocýTy'“aTl1-7 vané SAC vovane anti-IgV s perličkami

0,0	3633	± 1239	641	t	69
0.09	7610		310	13221	+	472
0,19	9235	+	181
0,39	10639	+	786	16681	+	310
0,73	10372	+	572	18090	♦	1248
1.56	9905	+	328	17631	+	1216
3.12	11354	t	836	19766	+	1179
6,25	10481	+	541	19810	♦	1349
12,5	9641	+	30	18136	+	1126
25,0	8253	t	357	14750 + 1125

- 73 C. Exprese pnrocrího lidského IL-4 v kvasinkách cDNA kódujúci prírodní lidský IL-4 byla klonována do plí?-s.lfa8 nejdŕíve insercí nukleotidň proti smeru vlákna N-koncového ílis kodonu sa vzniku restrikčního místa KpnI.

Po štepení, pueobením KpnI a zpracování s DNA polymerasou I, e-e cDNA JL-4 se zarovnanými konci, vloží do místa Stul plasmidu pNr-alfaS. Štandardní místpé-špecifickou mutagenesí . se vytvorí místo KpnI, Stručné - pcD-125 se rozstepí pňsobením BamNI. Tento fragment obsahující úplnou cDNA lidského IL-4 se isoluje a vloží se do místa BamHl plasmidu M13rapfí. Isoluje ee jednovláknový M13mp8 obsahující insert. Ten se hybridizuje syntetickým oligonukleotidem, který slouží jako primér:

- TCCACGGA

GGTAC

CACAAGTG - 3

Vložené nukleotidy jsou označený orámovaním obdélníkem, Plcmi/sd, který obsahuje cDNA mutovaného IL-4 , byl identi-, fikován oligonukleotidovou sondou, nminožen, isolován a ne— chán zreagovat s KpnI a BamHl. Fragment Kpnl/BamHI byl isolován, nechán zreagovat ε DNA polymerasou I (Klenoŕ/ňv fragment),. čímž se získaly zarovnané konce, kinasován a ligován ε pMF-alfa8, který byl rozštepen pňsobením, Stul. Kvasinky byly transformovány výslednými plaemidy pMN-alfag, označenými phIL-4-3, jak shora popsáno. Supernatanty byly testovaný na TCí'F aktivitu. Tytc? supernatanty vykazovaly TCGT aktivitu srovnatelnou 9 aktivitou, která byla pozorovaná u supernatantu kvasinlýš transformovaných phIL-4-1.

Príklad 7

Konštrukcie a exprese syntetického génu lidského IL-4 v u. colr

Skonštruuje se syntaticxý gen lidského IL-4, kíerý'v podstate obsahuje bakteriálni výhodné kademy, včetne rady jedinečných níst pro reštrikční endonukleasy (zde označovaných jako «jedinečná reštrikční místa”) a který umožňuje rýchlou a '/hodnou expre3i rozmanitých muteinň lidského IL-4. Sekvence nukleotidň syntetického génu je ilustrována na obrázku 6A, Zpňsoby konstrukce a exprese syntetického

- 74 génu tohoto príkladu jsou štandardní zpúsoby molekulárni biológie, napr. zvlášte viz Sproat b. Gait: Nucleic Acids Research 13, 2959 až 2977 (1985) a Ferretti a snol.: Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 83, 599 až 603 (1986), ale taká Mullenhach a spol.: J. Biol. Chem. 261, 719 av 72? (1986),

Wells a spol.: Cene 34, 315 až 323 (1985) a Estell a spol.t Science 233, 65.9 až 663 (1986). Ve stručnosti - syntetický gen lidského IL-4 se sostaví z více chemicky syntetizovaných dvojvláknových DMA fragmentú, Sekvance nukleotidú syntetického génu jsou vybrány tak, aby sestavený syntetický gen obsahoval radu jedinečných reštrikčních raíst.

$ada jedinečných reštrikčných míet znamená radu segraentú, které mohou být snadno vyštépeny a nahrazeny segmenty se zmenenými sekvencemi baží. Syntetické fragmenty se vloží buä prímo nebo po ligaci s jinými fragmenty do vhod-, ného vektoru, jako je napríklad plasmid pUC nebo pod. Shp-^! ra uvedené segmenty zhruba odpovídají kazetám” podie Wel-,

Ise a spol. (viz shora uvedená citace). Syntetické fragmen-’ ty se syntetizují standardními technikami, napr, Gait: Oligonucleotide Synthesisj A Practical Approach” (IRL Press, Oxford, Anglie, 1984). S výhodou se používají automatické syntetizátory, jako je napríklad Applied Biosystems, Inc., (Foster City, Ka. ) model 3S0A. Plasmidy pUC a podobné vektory jsou komerčne dostupné napríklad od Pharmacia-PL ne-, bo Boehriger-Mannheim. Klonování a exprese se mohou provádét standardními bakteriálnymi systémy, napríklad E. coli K-12 kmenem JM101, -TM103 nebo podobnými, která jsou popsány Vierou a Messing^ra; : Gene 19, 259 až 268 (1982).

Štepení reštrikčnými endonukleasami a ligační reakce se provádéjí podie štandardných costupú, napr. podie postupú, které popisuje Maniatis a spol.: Molecular Cloningj A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982).

Alkalický zpusob (Maniatis a spol.: viz shora uvedená citace) se používá pro prípravu plasmidú v malém mérítku,

Pro prípravy ve velkých méŕítcích se používají modifikace alkalického zpúsobu, kde se pro vysrášení nukleových kyselin

- 75 z vycereného lysátu používá stejný objem isopropanolu. Srážení studeným 2,5M octanem amonným se použije pro odstránení RNA pred odstreďovaním hustotním gradientem chloridu cesného a detekcí ethidiumbromldem.

Pri hybriď^aci na filtrech se používají kruhové filtry Whatman 540 pro prenos kolonií, které se pak lyaují a fiaqují postupným zpracováním. s 0,5M hydroxidem sodným, 1,5M chlorldera sodnýmj IM Tris-HCl, pH 8,0, 1,5M chloridem sodným . (vždy po dvou minútach) a zahrotím na 80 C po dobu 30 minút, Hybridizace se provádí v 6 x SSPE, 20% formamidu,

0,1% dodecylsulfátu sodném (SDS), 100 ^ug/ml. E, coli tRNA,

100 /ug./ml bsrviva Coomasie Brillíat Blue G-250” (Biorjad) šest hodin pri 42 °C s použitím ^? P-značených (kinasovaných) syntetických DNA. (20 x SSPE se pripraví rozpustením 174 & chloridu sodného, 27,6 g hydrátu dlhydrcgenŕosforečnanu sodného a 7,4 g EDTA v 800 ml vody, upravením pH tohoto roztoku na hodnotu 7,4 hydroxidem sodným, upravením objemu na jeden litr a sterilizací v autoklávu.)

Filtry ee dvakrát promyjí (15 minút, teplota raístnosti) 1 x SSPE, 0,1% SDS. Po autorádiografli (Fuji RX film) se poši tivní kolonie umístí serazením vyrostlých kolonií s modré vybarvenými koloniemi na filtrech.

DNA se sekvenuje buď chemickou degradační metodou podie Maxama a Gilbertaj Methods in Enzymology 65, 499 (1980) nebo dideoxy-metodou podie Sangera a spol.: Proc. Natl. Acad, Sci. USA 74* 5463 (1977). Templáty pro dideoxy-reakce jsou buď jednovláknové DNA odpovídajících oblastí reklonované do vektorá M13mp (napr. Messing e. spol.: Nucleic Acids Res.

_9, 309 (1981) nebo dvouvláknová DNA pripravená miníalkalip-’ kým zpúsobem, denaturovaná 0,7M hydroxidem 3odným (pet minút, teplota raístnosti) a vvsrážená ze smési 0,2M hydroxidu sodného ε 1,43M octanem amónnym pridáním dvou objemu ethanolu. Dideoxy-reakce se provádéjí pri 42 °C.

DNA se syntetizuje fosforamiditovou chémií e použitím syntetizátorú Applied Biosystems 380A. Syntéza, odstránení chránících skupin, štepení a čištšní (PAGÉ, eluce 7M močovinou, chromatografie na DEAE-celulose) se provádí jako je to popsáno v príručce výrobce pro syntetizátor 38OA. Komtplementární vlákna syntetických DNA, které se mají k lono-· . vat (kždého po 400 ng) se amíchají a fosforylují polynukleJ otid-kinssou v reakčním objemu 50 /Ul. Tato DNA se liguje s 1 /ug vektorové DNA rozštepenó príslušnými restrikčními. enzymy. Ligace se provádí v objemu 50 ^ul za teploty mís_zt-Í nosti po dobu čtyri až dvanáct hodin. Podmínky pro fosforylaci, štšpení restrikčními enzymy, polymerasové reakce a pro ligaci jsou popsány (íáaniatis a spol.j shora uvedená citace). Kolonie se vyhodnotí na lacZ* (jestliže je to, žádouci) vysetíra na L-%ar doplnéirŕ $ ampicilin, isppropyl-1-thio-P-D-galaktosid (IPTGka 5-brom-ichlor-itndolyl-p-D-galaktopyranosid (x-gal) (40 zug/ml).

' v' ·

CpOCirtajC

Vektor TAC-RBS Be zkonstruuje radou stupňô/doplnéním (výchozí stupeň) DNA polymerasou jediného BamHI místa tacP-nesoucího plasmidu pDR540 (Pharmacia)» Tento produkt, se pak dále liguje s nefosforylovanýmí syntetickými oligoJ nukleotidy (Phanjíracia). Vytvorí se tak dvouvláknový fragment, který kóduje souhlasné ribosomové vasebné místo (BBS, GTAAGGAGGTTTAAC)· Po ligaci se smés fosforyluje a religuje SstI linkerem ATGAGCTCAT. Výsledný komplex se pak štepí pôsobením SstI a EcoRI. Elektroforesou na poljRtrylapii dovsm gélu (PAGE) se isoluje fragment o 173 párech nuklepJ tidô. Tento fragment se klonuje do plasmidu pUC18 rozštčpeného pôsobením EcoRI. a SstI (Pharmacia)(jak popsáno níže), Sekvence RBS—ATG-polylinkerových oblastí konečné kon— strukce (nazývané TAC-RBS) je uvedená na obrázku 8.

Synteticky gen lidského IL-4 se sest.aví dc plasmidu pUC18 v šesti stupnich. V každém stupni lze detegovat inserty bez delecí a/nebo insercí po klonování podie zachován lacZ(e) génu z plasmidu pUC18 ve fázi s ATG počátečním kodonem vloženým ve stupni 1. Klony obsahující deleční a/ne bo inserení zmeny se mohou odfiltrovat vyhodnocením modrých kolonii na L-ampicilinových deskéch obsahujících x-gal jáj „j a IPTG. V každém stupni se sekvence insertô mohou snadno potvrdí t unl versálním sekvenačním primer em na plasmidové DNA, pripravené v malém méŕítku, napríklad dostupným od Boehrin^ ger Mannheim.

Ve stupni 1 se vektor TAC-RBS rozštepí pôsobením Satí, spracuje se s T4 DNA polyraerasou (jejíž 3' exonukleasová aktivita štepí 3 * pŕečnívající vlákna štepu SstI za vzniku . fragmentô se zarovnanými konci). PO deaktivaci T4 DNA polymerasy se zpracuje s EcoRI za vzniku fragmentu o 173 párech nukleotidu (bp) obsahujících oblast TAC-RBS se zarovnaným koncern v místš ATG počátečního kodonu a a EcoRI štépem na opačném konci, Rakonec se isoluje fragment TAC-RBS se 173 páry nukleotidô.

Ve stupni 2 se isolovaný TAC-RBS fragment ze stupne 1 smíchá s plasmidem pUC18, který je rozštepen pôsobením EcoRI a SstI, a se syntetickým fragmentem lA/p, který, jak ukazuje obrázek 7A, má zarovnaný konec na konci proti smeru vlákna a pŕeenívajíeí kohee, který odpovídá štepení pňsobením SstI na konci po sméru vlákna. Tyto fragmenty se ligují za vzniku plasmidu pUC18 ze stupné 2.

t

Ve stupni 3 se syntetické fragmenty 2A/B a 3A/B (ilustrované na obrázku 7B a 7C) smíchají s pUC18 ze stupné 2 rozštépeným pôsobením SstI a 3amHI (po ampllfikači a vyčistení) a ligují se za vzniku pUCIS ze stupné 3. Povšimnete si, ze konec fragmentu 2A/B po sméru vlákna obsahuje další báze, které tvorí BamHI pŕečnívající konec. Tyto další nukleotidy se odštšpí ve stupni 4. Také fragmenty 2A/B a 3A/B mají komplementárni jednovláknové konce o 9 zbytcích, které se po smíchání anelují. Žôstane tak 2A/B rozštépený pôsobením SstI proti sméru vlákna a 3A/B rozštépený pôsobením BamHI po smeru vlákna. Ligací se získá pUC18.

Ve stupni 4 se pl7C18 ze stupne 3 rozštépený pôsobením ífllul a Zbal (po amplifikaci a vyčistení) opétovné vyčistí, smíchá se se syntetickým fragraentem 4A/B (obrázek 7D)a ligací se získá pUC18 ze stupné 4.

- 78 J

Ve stupni 5 se pUC18 ze stupné 4 rozštépený pôsobením . Xbal a Sali (po ampliflkaci a vyčišténí) smíchá se syntetickým fragmentem 5A/B (obrézek 7E) a liguje se za vzniku pUC18 že stupne 5.

Ve stupni 6 se pUC18 ze stupné 5 rozštepený pôsobeníjn Sali a HindlII (po ampliflkaci a vyčistení) smíchá se syntetickým fragmentem 6A/B (obrázek 7F) a liguje se sa vzniku konečné konstrukce.

Gbrézek δΒ je mapa štépení techto jedinečných reštrikční ch raíst prítomných v konstrukci pUCl8 pravé popsané. Jestliže se popsaný syntetický gen lidského IL-4 použije jako ineert pUC18, každý par jedinečných restrlkČních míst definuje segment, který lze snadno vystríhnout a nahradít j i— nými syntetickými segmenty» $ada jedinečných restrikčních. raíst zahrnuj© EcoHI, Hpal, Sací (Sstl), EcoRV, PstI, Mini, Bell, Xbal, Nael, Sali, Xhol a HindlII.

Plasmid pUCIS,. který obsahuje syntetický gen IL-4 se vloží do E. coli K-12 kmeň JlvľlOl. Po kultivaci se protein, extrahuje z bunék JK1Q1. Zŕedéní extraktu se testují na biologickou aktivitu.

Príklad 8

Konstrukce a exprese muteinu Ile^ lidského IL-4 v E. coli.

Leu v poloze 52 (vzhledem k N-konc-i pŕírodního lidská-⁵ ho IL-4) se zmení na íle. Vytvorí se tak mutein Ile^² lid-, ekého IL-4. Plasmid pNC18 z príkladu 7, který obsahuje syntetický gen lidského IL-4 (obrázek 6A), se rozštépí pôsobením P^jStl a Mini a vyčistí. Shora uvedený vyčišténý pUCIS se smíchá se syntetickým dvouvláknovým fragmentem ilustrovaným níže a liguje se. Ta část sekvence nukleotidô, v níž došlo ke zmené, je uvedená v obdél.níku. Výsledný plasmid pUCIQ . se transfektuje do E. coli K-12 kmene JM01 nebo do podobneho kmene. Nechá se probíhat exprese.

u 79

	GA	GCT	GCT	ACC
A V kí	TCT	CGA	CCA	TGG
TAC	TCT	CAC	CAC	GAA
ATG	AGA	GTG	GTG	CTT

GTT	ATC	CGT	CAG	TTC
CAA	TAG	GCA	GTC	AAG
AAA	GAC	A
TTT	CTG	TGC	GC

(Pstl/Mlul substitucni fragment 52 pro generaci muteinu íle lidského IL-4)

Po kultivaci se protein dardními technikami, Zredéní gickou aktivitu.

extrahuje z bunék JM1O1 stanextraktô se testují na bioloPríklad 9

C Q T T

Konstrukce a exprese muteinv (Ile^? , Asp ^x) lidského IL-4 Modifikovaný plasmid oUC18 z nríkladu 8 (obsahující íle kodující sekvenci) se rozštépí pôsobením Sali a Xhol. Isoluje se velký fragment, Isolovaný fragment se smichá se syntetickým dvojvláknovýra fragmentem ilustrovaným níže ve standardním ligačním roztoku. Zmenená část sekvence je ohraničená pbdélníkem. Výsledný plasmid se transfektuje do E, poli K~12 kmeň JM101 nebo podobných. Nechá se probíhat exprese.

TCG ACT GA

CTG GAA GAC CTT

GAC TTC C CTG . AAG GAG CT (S alΪ/XhoI subs ti tu oní fragment) ?u kultivaci s? protein extrahuje z bunek JM101 standardními technikami. Zŕedéní extraktô se testují na liologiekou aktivitu.

Príklad 10

Sekvence lidského IL-4 vyčisteného ze Lidský IL-4 se vyčistí z kultury supernatantô transfekce sup ema tantô bunek doča/snč transfektovaných vektory obsahujúcimi cDNA lidského IL-4. Sekvenee sekretovaného prírodního lidského IL-4 byľa stanovená u vyčišténého materiálu.

A. Biologická analýza pro čišténí

TCGF aktivita byla použitá pro analyzování lidského ,

IL-4 béhem separačních postupô. Analýza je v podstaté stej— ná jako je to posáno shora v príkladu 2· Ve stručnosti - krev od s&svého dérce se prenese do hepaŕlnizované zkumavky a navrství se na Picoll-Hypaque, napríklad 5 ml krve na 3 ml, Ficoll-Hypaque v 15ml zkumavce pro odstŕeôování, Po odstŕeôování pri 3000 x g dvacet minút se bunky v raezifází odebe-¹ rou a zŕedí se kultivačníra sediem sestávajícím z RPMI 16.40, které obsahuje 10% plodové telecí sérum, 50mlkromolání 2merkaptoethanol, 20 mik.rograraô/ml fytchemaglutlninu (PHA)a rekombinantní li.dský IL-2. Po peti až deseti dnech inkubace pri 37 °C se PHA-stimulované lymfoeyty periférni krve (PBL) promyjí a použijí se pro dvoud.enní kolorimetrické analýzy: Mossmann: J. Immunol. Methods 65. 55 až 63 (1933). Seriálová dvojnásobná zŕedénť standardního IL-4 (supernatanty z buä GOS 7 bunék transfektovaných pcD-125 nebo ΰ^Τ bunék transfektovaných pEBT-178) nebo frakce, které se testuji, ae daji do misek s 96 jamkami s rôstovým mediem shora popeaným tak, aby kpnečný objem byl 50 mikrolitrô na jamku. 50 mikrolitrô PHA-'Stimulovaných PBL v množství 4 až 8,10^ bunék na ml s e pridá do každé j?.mky a misky s e inkubují dva dny pri teploté 37 °0. Rôst bunék se pak zmeŕí podie Mosmanna (shora uvedená citace).

Jednotky TCGF aktivity lidského IL-4 jsou definovaný vzhledem k supernatantôm COS 7 bunék transfektovaných pcp-125 (príklad 2) nebo bunék COS 7 transfektovaných pEBV-178 (príklad 3).

Pri Slšténí jsou jednotky vztaženy na aktivity supernatantô pcD-125 transfekce, které se produkují následujícím zpôsobem. Asi 1.10 bunék COS 7 se vyseje na 10Omm desky pro tkáňové kultury obsahujicí Dulbeccovo modifikované Eagleho médium (DME), 10% plodové telecí sérum a 4®M L-glutamin.

J 31 Asi dvacet čtyŕi hodiny po vysetí se médium odebere z desek. a bunky se' promyjí dvakrát pufrovaným DO (50mM Trie) bez séra. Sa každou desku se pridá po 4 ml puírovaného DhE bes séra (se 4»M L-glutaminem), £0 mikrolitrú DEAE-'dextranu a 5 mikrogrsmô pcD-125 DNA. Bunky oe psk inkubují v této smési , Štyri hodiny pri 30 °C. Potom se smés odebere a bunky se promyjí jednou pufrovaným DME bes séra. Po promytí se pridá 5 ml

DME se 4m?l L-glutaminem, lOOmikromolárním ”Ghloroqúinem^M a 2% plodovým telecím serem do každé jamky. Bunky se inkubují tri hodiny, načež se promyjí pufrovanýro DME bez séra. Dále se pridá 5 ml DKE se 4mM L-glutaminem a 4% plodovým telecím serem. Bunky se inkubují 24 hodin pri 37 °C. Potom se bunky promyjí jednou až trikhát DME nebo PBS, pridá se 5 ml DME bez séra (se 4mši L-glutaminem) a bunky ee inkubují pri 37 °C.

Kultura supernatantu se isoluje po trech dnech.

Jedna jednotka, jak se toto množství používa zde, zna-? mená množství faktoru, která v jedné jamc.e (0,1 ml) stimuluje 50 % maximálni proliferaoe 2,10^ PHA-stimulovaných PBL béhem 48-hodinové období.

B. Čistení

Čiáténí se provádí postupnou aplikací chromatografie na katexu, gelové filtrace a|vysokotlaké kapalinové chromatografie na obrécených fázich, Všechny operace byly provádény pri 4 °C.

Po odstránení bunék COS 7 odstrečíováním se supernatant zahustí asi desetináeobné ultrafiltrací a skladuje se pri - 80 °C až do dalšího postupu. IL-4 byly stanovený analyzovaním schopnosti proteínu stimulovat proliferaci fytohemaglutininem indukovaných lidských lymfocytu periférni krve, tj, TCGF aktivitou podie shora popsané štandardní analýzy.

Zahustený COS 7 supernatant, který má TCGF aktivitu asi 10 až 10^& jednotek na mililitr a obsah proteínu približne 15 až 20 mg/ml, ee dialysuje proti dvéma zmenám 50πώΊ sodné soli HSPES, pH 7,0, dvacet Čtyŕi hodiny (každá zmena je

- 82 približne desetinásobelc až patnáctinásobek objemu jednoho koncentrátu). Dlalysát se nanese na kolonu (1 x 2,5 cm) s náplní S-Sepharoee (prútok kolonom 0,2 ml za minutu), , kteŕá ce pŕedem ekvilibruje)<Sbdnou. solí HEPES, pH 7,0· Kolóna se promyjé 15 objemy kolony ekvilibračního pufru, následuje eluce dvaceti objemy kolony od 0 do 0,5% gradientu chloridu sodného v 50mM sodné soli HEPES, pH 7,0· Gradi— ent se ukončí elucí péti objemy kolony roztokem stejné koncentrace: 5QmEJ sodná súl HEPES, 0,5M chlorid sodný, pH 7,0· Z jednotlivých dávek. byly zíakány frakce 1,5 ml a 1,8 ml·, Bylo zjišténo, že IL-4 titry se u obou c hroma tografií eluovaly mezi 300mM a 500míí koncentraci chloridu sodného.

Seat frakcí z každé kolony s naplní S-Sepharose obsahující IL-4 titry se oddelené spojí na celkové objemy 9,0 a 10,8 ral, Oba. objemy se zahustí na 1,9 ml ultrafilträcí membránou .Amicon ΪΜ5 (pŕedél molekulové hmoty: 5000). V tomto stupni bylo získáno približné 80 % proteinu. Z kone ent/ovaný IL-4 roztok se nanese na kolonu s nosičem Sephadex G-100 (1,1 x 53 cm), pŕedem ekvilibrovaňou v 50mM HEPES,

0,4M chloridu sodném, pH 7,0. Kolona se eluuje stejným pufrem rýchlostí 0,15 ml/min. Bylo odebréno celkem 50 frakoí (1,0 ml/frakce). Byly analyzovány na IL-4 titry, Maximum bi©logické aktivity bylo zjišténo pri zdánlivé molekulové hmote 22 000. Sephadex 0-100 byla kalibroyán na stanovení zdanlivé molekulové hmoty hovézím serovým albuminem (molekulová hmota 55 000), karbonatdehydrataeou (molekulová hmota 30 000) a cytochromem C (molekulová hmota 11 700).

Frakce z kolony s náplní Sephadex G-100 obsahuj í cí IĽ4 aktivitu se zahustí tri- až Štyrikrát ve vákuu a injekcí se nanese na predkolonu (4,6 x 20 mm) s náplní Vydac C-4, pro eluci byl použit lineárni gradient od 0 do 72 % (objemové dxly) acetonitrilu v 0,1% (objemové Ííly) kyseliny trifluoroctové (TFA)j doba 15 minút; teplota kolony 35 °Cj prútok 1,0 ral/minutu. Výsledkem byle, že se získal tri maxima, kteŕá byla detegována. pri .314 nm. h?; retenční dobou 7, 8_t2. a 8,7 minutý (maxima 1, 2 a 3 na obrázku 10 )„ 40mikrolitrový podíl maxima 2 (s eluční dobou 8,2 minutý) byl lyofili/L

- 83 J zován a znovu rozpuštén v minimálním esenciálním médiu obsa^· hujícím 10% plodové telecí sérum. Tento roztok vykazoval poši tivní TCGM odpovečí. 300mikrolitrový podíl maxima 2 se od-’ parí dosucha a odparek ee znovu rozpustí ve 200 mikrolitrech 0,1% (hmotnoatní díly k objemovým dílúm) dodecylsulfátu sodného (SDS). Dvoumikrolitrový podíl se zŕedí 200 ^nl 1% (ob-’ jemové díly) TPA a rechromatografuje se. HPLC tohoto roztpku ukazuje jediné maximum gŕi 215 nm. Materiál maxime 2 vykazoval aktivitu asi 7.10 jednotek na miligram,

C. Analýza sekvence aminokyselín

Stanovení sekvence aminokyselín se provádí automatickou Edmanovou degradací v plynné fázi (Hewick R, M., Hunkapillar W. M., Hood L. E. a Dryer W. J.: J. Biol. Chem. 256.

7990 (1981)·) mikrosekvenátorem Applied Biosystems. 90mikro* litrový podíl maxima 2 z frakcí HPLC se rozpustí v 0,1% S D,S jak shora popsáno a nanese se na filtrační náplň ze sklenených vláken v prítomnosti Polybrenu. Byly získány informae© o sekvenci aminokyselín až do 35. zbytku. Sekvence od N-kon-, ce byla stanovená takto: His - Lys - . - Asp - íle - Thr J

Leu * Gin - Glu - íle - íle - Lys - Thr - Leu - Asn - Ser

Leu - Thr - Glu - Gin «. Lys - Thr - Leu - . - Thr - Glu J

Leu - _ - Val - 'ľ&r - ^AsP - 21 e - Phe - Ala - Ala, kde podtržená prázdná místa znaraenají, že chybí identifikova-¹ , telná aminokyselina. Prázdná místa naAninovém konci v poloháoh 3 a 23 souvisejí s prítomností cysteinu, který môže být tímto systémem detegován. Prázdne raísto v poloze 28,. které odpovídá threoninu v pŕedpovézené (podie cDNA) sek... venci, múze pocházet bučí od variability detekce fenylthiohydantion-threoninu nebo od prítomnosti O-glykosylace nebo 0-esterifikace.

lOOmikrolitrový podíl HPLC frakce, u níž se provádí sekvenace od aminového konce, s,e odparí do sucha, načež se, znovu rozpustí v 70% kyseline raravenčí. Pridá se padesátinásobný molární nadbytek bromkyanu. Roztok se nechá štát ,

2,5 hodiny za teploty místnosti. Štepený protein se sekvanuje na sekvenátoru firmy Applied Biosystems v plynné fázi jak shora popsáno. Dve sekvence byly identifikovatelné:

Arg - Glu - Lys - Tyr * Ser - Lys (1)

His - Lys - _- Asp - íle Thr (2)

Sekvence (l)je identická se sekvenci predpovézenou podie , cDNA. Tato sekvence byla pvolnéna odžtepením methloninového zbytku v, poloze 120 pôsobením bromkyanu. Poslední dva , zbytky na C-konei mohou být prítomný, ale nemusí bít detegovateln© díky nedostatku vzorku. Sekvence (2) je identická se sekvenci na aminovára konci získanou pro prírodní IL-4 protein, jak shora popsáno. Na základe relativních množství uvolnžnýoh fenyl thiohydanta in-aminokysel iný na amino vám konci a na karboxylovém konci lze pŕedpokládat ekvimolární množství obou sekvenci ve vzorku. Tento výsledek podporuje závšr, že vzorek proteinu, který byl eekvenován, obsahuje , pŕevážnš jediný polypeptidový ŕetšz e aminovým a karboxyloí vým koncern pŕedpovezeným podie sekvence cDNA lidského IL-4.

Príklad 11

Konstrukce a exprese muteinu (Ile^²* IS^^ (Ala))lidského IL-4

Modifikovaný plasmid pUC18 z príkladu 8 (obsahující sekvenci kodující Ile^²) ee rozštšpí pôsobením Mlul a Bell, Isoluje se velký fragment. Isolovaný fragment se amíchá se syntetickým dvouvláknovým fragmentem ilustrovaným niže ve standardním ligačním roztoku. Výsledný plasmid se transfektuje do E. coli K-12 JM101 nebo do podobného a namnoží se.

CG	CGT	TGT	CTC	GGC	GCC ACT GCG CAG TTC CAC CGT
	A	ACA	GAG	ccc-	CGG TGA CGCfGTC AAG GTG GCA Delece
CAC	AAA	GAG	CT
GTG	TTT	GTC	GAC	TAG	(Mlul/Bcll substituční fragment)

Modifikovaný plasmid se isoluje a rozštšpí se pôsobením Xbal a Nael. Isoluje se velký fragment. Isolovaný fragment se smíchá se syntetickým dvouvláknovým fragmentem ilustrovaným níže ve standardním ligačním roztoku. Pridaný kodon je uveden v rámečku. Výsledný plasmid'se transfektu^ je do E. coli K-12 kmene JM101 nebo do podobného a nechá se probehnout exprese.

J 8$ Γ~1

CTA GAC CGT AAC CTG TGG GGC CTG GCC GCC'

TG GCA TTG GAC AGC CCG GAC CGG CGGj (Xbal/Nael substituční frage^nnt)

Po kultivaci se protein extrahuje standardními spúsoby z bunék JK1O1. Zŕedéní extraktú se testují na biologickou aktivitu»

Príklad 12

Indukce DR antigenú na bunkách od pacientú tr^pících syndromera holých lymfocytô

Syndróm holých lyrafocytú je charakterizován nedofltatkem exprese HLA antigenú tŕídy I a/nebo II na površích bunék. Často souvisí s tšzkou imunodeficiencí, napríklad Touraines Lancet 319 až 321 (7. února 1981), Touraine a Bethels Human Immunology 147 až 153 (1961) a SuUivan a spol. i J. Clin. Invest. 76« 75 až 79 (1965)· Bylo objeveno, že lidský IL-4 je schopen indukovat expres! DR antigénu tŕídy II na povr-^! šxoh bunék odvozených od pacienta trpícího eynďromem holých lymfocytú.

Periférni krevní lymfocyty (P3L) byly získán;/ od pac.ientú trpících na HLA antigény tŕídy II bez exprese, B-buňí ky Byly vyčiätény od PBL v podstate jak shora uvedeno. B-bunéčná linie (označená IJD31) byla získána transformaoí virem, Epstein-Barr (EBV). EBV-transformované bunky byly kultivovány 48 hodin v médiu podie Yssela (shora popsaného) s 2 % plodového telecího séra a 5 % (objemové díly k objemovým dílúm) koncentrace supernatantú z bunék C03 7 transfektovaných plasmidem pcD-125· Bunky byly isolovány, fixovány,, obarveny fluorescenčné označenou anti-DR monoklonální pro-^: tilátkou (napr, Becton Dickinson, L243) a analyzovaný prňtokovou cytometrií, Obrázek 9 ilustruje histogramy frekvence bunék proti intensité fluorescence pro kontrolní oopulaci, i£3V-transformovaných bunék .isolovaných pred púeobením IL-4 (krivka A) a populaoi EBV-transformovaných bunék isolovaných po púsobení IL-4 (krivka B),

- 86 príklad 13

MC tík aktivita supernatantú Cl.LyI⁺2“/9 (Cl.l)

Vyčistený IL-3 a supernatant z bunék CGS 7. transfektovaných IL-3 cDNA kleniem (rekombinantní IL-3* IL-3K) stimulovaný do j isté míry proliferaci linie širných bunék MC/9 (obrázek 14A). Avšak hladina této prolifesýrce byla tretinou až polovinou proliferace, kterou indukuje supernatant Cl.l T bunék. Prítomnost ConA v supernatantu T bunék (2 ^ug/ml) nepŕiapívá nijak významné k jeho. MCG? aktivite. Jedni» vysvetlením tohoto jevu je, se IL-3 není zodpovedný za veškerou MCtíF aktivitu px'-odukovanou bunkami Cl.l. Linie žírnych bunék, které byly použitý pro tyto analýzy, by také mohly . být (teoreticky) znečistený populací bunék závislou na drvhen faktoru. Tato druhé, možnost je však vyloučena, protože reklonovsní bunečné 'linie MC/9 poskytuje eubklony, z nichž každý odpovídá IL-3 a supernatantu bunék stejným zpusobem jako originálni kloň ŔiC/9 ·

Jelikož supernatant cl.l také obsahuje lymfokiny jiné nes IL-3, byly tyto lymfokiny testovány na jejich schopnost podperevat rust bunék MC/S. Bunky MC/9. však neodpovídaly rúzným koncentracím rekcmbinantního ÍL-2, IFN a Glví-'CSF a, také supernatantu obsahuj í cíiio IL-1 (bunky P3880 1) (obrázek 14A). Lavíc doplnení kul tur obsahujících jíizné konce.ntrace rekombinantního IL-3 o 1L-2, GK-CSF, IFN-^ nebo T.L-1 neetimuluje proliferaci bunék tóc/9 nad hladinu, která byla získána ε IL-3 samotným, To ukazuje na to, že ke zvýšené MCtíŕ aktivitu supernatantu T bunék nedochází díky obsahu téchto jiných známýcli faktorú.

Srovnávací ώ-tudie a jinýmý bunečnými liniemi závislými na faktoru byly provádény následujícím zpúsobemt Dve jiné linie žirných bunék, DX-2 a ľ.®3, taká dávají vyšší prolif erační odpovedi oe supernatantera Cl.l než 3 IL-3 (renresentativni dutá pro DX-2 jsou uvedená na obrázku 143). Tyto bučky také neodpov.ídají na IL-2, OM-CSP nebo supernatanr búrok ?388u-l. Zvýšená proliferační odpovéä bunék MC/9 ua supernatant í bunék múže být typická u širných bunék

obecné. Naproti tomu bunky typu granulocytô (NFS-6O) byly stimulovaný téraeŕ stejné supernatantem Cl.l a Il>-3 (obrázek 14C). I když bunky KFS-6O neodpovídájí na IL-2, IFN-^ a b.upernatant F388D-1, existuje malá, ale reprodukovatelná stimulaoe Gíä-CSF. Se skutečnoeti, že IL-3 a supernatant T bunék indukují srovnatelné. hladiny nroliferace, lze pŕedpokládat,. že bunečná linie NFS-60 môže být relatívne necitlivá na další faktory prítomné v supernatantu T bunék. Bunky NFS-60 se mohou tedy používat pro analyzování IL-3 pri pokusech oddélit IL-3 od jiných MCGF aktivít frakcionací proteínô.

TCGF aktivita supernatantu Cl.l byla ana'lyzována pomoci linie T bunék závislých na IL-2, HT2. Nasycená koncentrace supernatantú Cl.l neproménné stimulovaly ínkorporaci ^JH-thymidinu pod maximálni hladinou dosaženou s rekombinantním IL-2 (obrázek 143). Podobná výsledky byly získaný se dvéma jinými bunečnými liniemi. Supernatanty neobeahují žádnou inhibiční sloučeninu, jelikož její pridání ke kulturám ΗΦ2 obs&huľiicim n

-'B-thymidinu

IL-2 nevykazovalo žádnou redukci inkorporac (obrázek 143). Tyto výsledky pŕedpokládají v

z, e supernatant. Cl.l obsahuje TCG? aktivitu odlišnou od TCG? aktivít;/ IL-2. Biochemický dôkaz na podporu tohoto závéru je uveden níže.

V* t 1 V v f i/red b ô 2 na chromatografická frakcionace supernatantu

Cl.l se provádí nasledovné. Supernatant Cl.l se frakcionuje rôznymi chr.omatografickými metódami s bezprostŕedním oílera oddelení IL-3 od jiných KCGF aktivit, Proliferaoe bunék NFS-60 byla použitá pro sledování IL-3 špecificky proti p.ozadí celkové MCG? aktivity dané proliferaci MC/9. TCGF aktivita byla hodnocena proliferaci bunék HT?.

Jelikoz se supernatant Cl.l frakcionuje chromatografii na katexu pH neutrálním pH, v prôtoku (frakce 1 až 20) se Objevuje približne 93 ý neneseného proteínu, 97 % jednotôk IL-3 (sledovaného proliferaci NFS-60) a 1 £ jednotek TCGF (obrázek 15). Eluce navázaného proteínu gradientern chloridu sodného eluuje TGG? aktivitu pri 0,19M koncentrací chlo-í ridu sodného (frakce 60). Malé, ale reprodukovatelná maximum

- 88 TCGP aktivity se objevuj e také pri IM koncentraci chloridu sodného. Žádnou další významnou aktivitu TCGP se nepodarilo eluovat pri vyšších koncentracích chloridu sodného (a to až do 3M koncentrace). V približne stejné oblasti jako TCGP maximum (detegovatelné KPS-odpovéä) byla eluována také malá množství IL-3. Pouze frakce, které odpovídají maximu TCGP aktivity (frakce 59 až 61 )a prútoku (frakce 1 až 20) sti- . mulovaly vysoké hladiny proliferace MC/9, srovnatelné s proliferací nefrakcionovaného eupernatantú (Šipky, obrázek 15,). Jelikož titrační krivky ukazují, že frakce 59 až 61 obsahu-’ jí více z vysokých hladin MCGP, aktivity než prňtok, byly délány pokusy zmenšit další IL-3 aktivitu eluující se současne s maximem TCGP a hodnocenou hladinou proliferace MC/9. Prakce 59 až 61 byly tedy ješté dvakrát rechromatografovány , za stejných podmínek. Po tretím.proj ití kolonou se 0,19M koncentrací chloridu sodného eluovalo současné více než 95 %

TCGP aktivity,, V prútoku ani v jakýchkoliv frakcích z kolony však nebylo prítomno žádné raéŕitelné množství IL-3 (NPS-60. odpovéá). Avšak stále se ješté společné s maximem TCGP elu-, ovala MCGP aktivita, která nyní stimulovala ustálenou hladinu proliferace MC/9 , které byla významné nižší než hladina získané se supematanterc Cl.l nebo IL-3 (viz níže). Jelikož tyto frakce postrédaly rašŕitelnou IL-3 aktivitu (nepri tomnost NFS-60 odpovedi), zrejmé nový MCGP samotný byl neschopen stimulovat bunky MC/9 do stejného stupne jako surový supernatant T-bunék.

Pri dalším pokusu oddélit MCGP od TCGP byl trikrát frakoionovaný materiál (frakce 59 až 61). zŕedén destkrát 0,1% kyselinou trífluoroctovou ve vodé na pH 2 a nanesen pŕímo na kolonu s náplní C8 s obrácenými fázemi, Obrázek 16A ukazuje eluční profil navázaného proteínu, který byl uvolnén gradíentem acetónitrilu v 0,1% ΤΡΑ. V prú toku se ne-^: objevila žádná MCGP ani TCGP aktivita, Obé aktivity byly elu— ovány společné 37% acetonitrilem (frakce 26 až 29). Avšak nasycená MCGP odpoveď byla nyní pouze asi polovinou toho, co produkoval IL-3 samotný (obrázek 17A), Když byly všechny frakce znovu analyzovány v prítomnosti nasycených hladin IL-3, pouze frakce 26 až 29 vykazovaly odpovéá proliferace

89 ffiC/9 v nadbytku IL-3 samotného (šipka, obrázok 16A). Ve sktu tečnosti velikost odpovedi byla podobná odpovédi nefrakcio-, novaného supernatantú samotného (obi'ázek 17A). Dále byly také pozorovaný proliferační hladiny ekvivalentní s hladinami nefrakcionovaného supernatantú u frakcí 26 as 29 testovaných v prítomnosti IL-3 obaaženáho v prútoku nebo IL-3 vyčištšné , formy WEHI 3· Eombinace IL-3 a jedinečného MCGF/TCGff stimuluje hladiny proliferace MC/9» je Charakteristické pro pú-’ vodní supernatant T bunék.

I když chromatografie na obránených fázích selhala pri oddŽlení MCGF od TCGF, bylo ukázáno, še TGG? se Uší od IL-2 dvšma hledisky. 3a prvé, jes.tliže rekombinantni IL-2 v supernatantech bunék COS 7 (IL-2 )a supernatant' z linií myších T bunék (GF15-1) produkujících (stimulovaných ConA).

IL-2 jsou oba chromatograf ovány na stejné kolone za stepných podmínek, TCGF aktivita se eluuje 45% acetonitrilera jako ostré Maximum, které neprskrývá polohu eluce 37% acetinitrilem označující Cl.l TCGF .(obrázek 16B). 3a druhé, nasycená odpavšä HT2 bunék ne. IL-2¹* je velice odlišná od odpovedi, která charakterizuje supernatant Cl.l. (obrázek .163, Insert), Dále, nebyla detegována. žádná zrejmá synergie mezi částečné vyčisteným TCGF ε IL-2 (obrázek 17B).

Frúbéh chromatofokusace supernatantú Cl.l je ukázán na obrázku 1S. IL-3 aktivita (NFS-6O odpovšJ) vykazuje velmi heterogénni profil, indukující sktivitu^spl hodnotami vyššími než 7,1. ale TCGF aktivita se zdá být homogénnej ši s hlavním TCGF pásem (frakce 12) vykezujícím pi približné 6,2. To ôdpovídá maximu MCGF aktivity (NC/9 cápovécO po pridaní nasycených hladín IL-3.

V této části tohoto spisu bude popsána SDS PAGE supernatantu Cl.l a čéstečne vyčištenébo faktoru. Obrázek 19 porovnává elektrofonetické profily nefrakcionovaného supernatantu Cl.l (obrázek 19A) s materiálem, který prošel chro-^{ matografií na katexu, s frakcemi 59 až 61 (obrázek 19B). Protc-in byl eluován. prfrao z gelových vrstev. Aktivita byla stanovená proliferaci'. Jak frakce z kstexu tak supernatant Cl.ľt vykazuj í TCGF maxima: pri molekulových hmotách 20 000, a 15 000 za neredukujících podmínek a pri molekulových hmotách 21 OCO a 16 000 za redukujících podmínek. Jelikož ka- , tcx byl zbaven IL-3, byly indukovaný pouze nízké hladiny proliferace MC/9 a tato MC'GF j ešte odpovídala TCGF maximum. Pridaní nyscených množstvi TL-3 ke všem fraKcím zvýšilo odpoveď proliferace MG,'9 na hladiny supernatantú 01.1 pouze. u frakcí 3 maximom MCGF/TCGF (Šipky, obrázok 19B). IX»-3 aktivita supernatantú byla nejvétší v poloze molekulové hmoty 24 000, ale objevuje se také v širokých pásech kolem oblasti molekulové hmoty 20 000.. Významné je, že hladiny proliferace MC/y nad hladinami IL-3 ee vyakytovaly v oblasti molekulové hmoty 20 000 elektrofóresovaneho supernatantú (šípka, obrásek 19i). stŕíbrem potúžený SDS gel ne jvíce vyčisteného materiálu MCGP/TCG? (frakce 2U z kolony s obrácenými fázemi) také vykazoval silné proteínové pásy u molekulových hmôt 20 000 a 13 000.

ajikrogramová množstvi faktoru ve formé e molekulovou hmotou 20 000 byla vyčišténa do homogenity po.stupnou frakcionací 0onÁ-3upernatantú z aktivovaných Cl.l T-bunék: Dch.romatograŕií na kaxsxu, 2) chromátografií na nosiči Heparin-Sepharosa a 3) chromátografií na nosiči c4 s obrácenými fázemi jak shora popsáno. Výsledný materiál vykazuje oouze jediný pás u molekulové hmoty 20 000 uodle stŕíbrem potažené. ODS-PAGE, což odpovída jedinému maximu a UF absorbcí pri eluci na c4. Biologická charakterizace vyčisteného faktoru no. tvrdila jeho schopnost stimulov a t nízké hladiny orolifera.ee a širných b.unek & zvyšoval proliferaci žirnýnh huňa IL-3.

T—baník

Jäk je uvoúeuo v. tabulce tivit stimulujicích 3-bunky, « (Rosím K.« X, a spol. : J. Exn. Howard ii. a spol.: Proc. Kati. (1981), Roehm F. k. a spol.: 81, G i s· y a č- x o \ ĺ p x) < i. Ja

V, tento faktor m·' nékolik ak_ teré jdou p^ipisovány BSF1 Med. 169, 679 až 694 (1984),

Acad. Sci. USA 78, 5788 Proc. hati,Acad. Sci. USA prvé indukuje zvýšenou exnre- 91 si la na klidových 3-buňkáeh ve srovnání s kontroln?' popíliaci (tabulka V). Za druhé, tento faktor, ve spojení s .

O anti-Ig protilátkami, indukuje významnou inkorporaci -Ήthymidinu, ccž znamená že pôsobí jako doprqj3|ydný faktor pri stimulaci proliferace B-buzék.

Tabulka V

Analýzy stimulace B-bunék zdroj inkroporaceJä-ttjwiidinu antiľlg _lnd,_Jk;._e opracovaných#bunék* T-a** (počet impulsú za minútu) “ ne frak c io no vaný

Cl.Lyl⁺2”/9 supernatant 33 788 vyčistený faktor 44 125 médium (negatívni kontrola) 4 128

+	5	454	162,3
+	n Cl	775	157,1
+		734	35,5

⁺ Uvedené výsledky jsou púfrmérera počtu impulsú za minutu + jh strední odchýlka tŕech kultivaci doplnených o nasycené hladiny faktoru ++

Uvedené výsledky jsou prúmére-m relatívni strední fluorescence tŕech kultivaci doplnených c nasvcené hladinv faktoru.

Tyto polypeptidy vykazují nékolik biologických aktivít, které se liší jak ve zdanlivých zprostredkovaných funkcích tak v typu ovlivňovaných bunék. Jak bylo popsáno, mezi tyto aktivity patrí synergie indukce proliferace linií B-bunék a širných bunék, časná aktivace klidových B-¹ bunék, stimulace proliferace Ti. bunék a selektívni zvýšení, produkce IyC^ a IgE mitogenem aktivovaných B-bunek. Vyčistení polypeptidú do homogenity vyjasnilo rozsah téchto aktivít.

Na záldadé predcházející·'ho bude ocenéno, ze vyčistené proteinv podie tohoto vynálezu poskytují odborníkúm nové terapeutické možnosti. Možnost produkovať významná množstvi téchto faktorú umožní zlepšená in vitro kultivace vybraných línií savčích bunék, rovnež tak i celkove zlepšené porozumení imuntní odpovedi.

cDNA klony pcD-2A-E3, pcD-46 (pcD-2Fl-13), pcD-125 a kvasinkového vektoru pMF-alfa8 byly uložený v Americké sbírce typň kul tur, Rockville, Md, USA (ATCC: American Type Culture Collection) pod císly 33 330, 53 337, 67 029 a 40 140. Tato uložení jsou provedena v souladu s Budapešť skou dohodou o ukládání mikroorganismň pro patentové účely (Budapest Tres ty on the International Recognition o f the Deposit of Micro-organisms for the purposes of Patent Procedúre) z roku 1977.

Claims (6)

1. Lidsk.ý interleukín-4,

2. Lidský interleukín-4, vyznačujici se tím, že má alespoň 9.10? jednotek/mg Ij/ativity TCGF (faktor rôstu T-bunék).

3. Lidský interleukín-4, vyznačujici s e tím, Se vykazuje alespoň jednu aktivitu, s výhodou dve aktivity, které jsou vybrány ze skupiny sestáv.ající z aktivity indukce MHC antigénu, aktivity indukce Fc-epsilon ree^pfetoru, aktivity zesilující rôst kolonií GM-CSF stimulovaných granulocytô, aktivity zesilující TCGF interleukinu-2 a aktivity IgG|- a IgE-indukce.

4.

Lidský interleukín-4, vyznač u j í c í s e t í .m , že v podstate neobsahuje suoleené bílovinný materiál.

5. Protein s aktivitou interleukinu-4, vyznač u j i c i s e tím , že obsahuje desetinásobne substituovaný poly peptid se sekvencí aminokyselín obecného vzorce:

X (His) - X(Lys) - X(C,ys) . X (leu) - X(Gln) - X(Glu)

X (Thr) - X (Leu) - X (Asn) X(Glu) - X(Gln) - X(Lys) X(Thr) - X(Glu) - X(Leu) X(Asp) - X(Ile) - X(Phe) X(Lys) - X(Asn) - X(Thr) X(Glu) - X(Thr) - X (Phe)

X (Ala) - X(Thr) - X(Val) X(Phe) - X(Tyr) - X(Ser) X(Lys) - X(Asp) - X(Thr) X(Gly) - X(Ala) - X(Thr) X(Phe) - X(His) - X(Arg) X(Leu) - X(Ile) - X(Arg) , X(Arg) - X(Leu) - X(Asp) X(Trp) - X(Gly) - X(Leu) . X(Asn) - X(Ser) - X(Cys) .

X(Asp) - X(íle) X(Thr) (6)- X(Ile) - X(Ile) — X(Lys) (1?)- X(Ser) - X(Leu) au X(Thr) (18)- X(Thr) X(Leu) « X(Cys) (24)- X(Thr) - X (Val) — X(Thr) (30)- X(Ala) - X(Ala) - X(Ser) (36)- X(Thr) - X(Glu) - X(Lys) (42 )- X(Cys) - (Arg) «* X(Ala) (48)- X(Leu) - X(Arg) » X(Gin) (54)- X(His) - X(His) - X(Glu) <60 )- X(Arg) - X(Cys) au X(Leu) (66)- X(Ala) - X(Gln) - X(Gin) (72)- X(vHie )- X (Lys.) - X(Gin) (78 )- X (Phe) - X(Leu) - X(Lys) (84 )- X (Arg) - X(Asn) M. X(Leu) (90 )- X (Ala) - x(Gly) W X(Leu) (96)-. .X (Pro) - X(Val) «V X(Lys) (102)-

- 94 X (Glu) - X(Ala) - X(Asn) - X(Gln) - X(Ser) - X(Thr) (108λ

X(Leu) - X(Glu) - X(Asn) - X (Phe) - X(Leu) - X(Glu) (114)«

X(Arg) - X(Leu) - X (Lys) - X (Thr) - X(Ile) - X(Met) (120 )·

X(Agr) - X(Glu) - X (Lys) - X(Tyr) - X(Ser) - X(Lys) (126).

X(Cys) - X(Ser) - X(Ser) (129) v némš

X (Ser) znamená skupinu sestávající ze Ser, Thr, Gly a Asn,

X(Arg) znamená skupinu sestávajíoí z Arg, His, Gin, Lys a Glu, X(Leu) znamená skupinu sestáva.lící z Leu, íle, Phe, Týr, Met a Val, X(Pro) znamená skupinu sestáva.jící z Pro, Gly, Ala í Thr, X(Thr) znamená skupinu sestávající s Thr, Pro, Ser, Ala, Gly, His a Gin, » X(Ala) znamená. skupinu sestávající z Ala, Gly, Thr a Pro, X(Val) znamená skupinu sestáva.j í cí z Val, et, Tyr, Phe, íle a Leu, X(Gly) znamená skupinu sestávající z Gly, Ala, Pro, Thr a Ser, X(11e) znamená skupinu sestávající z íle, Met, Tyr, Phe, Val a Leu, X(Phe) znamená skupinu sestávající z Phe, Trp, Met, Tyr, íle. Val a Leu * X(Tyr) znamená skupinu sestáva.jící z Tyr, Trp, Met, Phe, íle, Val a L9U * X(His) znamená skupinu sestáva]ící z His, Glu, Lys, Gin, Thr a Arg, X(Gin) znamená skupinu sestáva.j ící z Gin, Glu, Lys, Asn, His, Thr a Arg « X(Asn) znamená skupinu sestávající z Asn, Glu, Asp, Gin a Ser, X(Lys) znamená skupinu sestávající Z Lys, Glu, Gin, His a Arg, X(Asp) znamená skupinu sestávající z Asp, Glu a Asn X(Glu) znamená skupinu sestávající 2 Glu, Asp, Lys, Asn, Gin, His a Arg a

- 95 X(Met) znamená skupinu sestávající s Met, Phe, íle. Val, Leu a Tyr.

Protein podie bodu 5, vyznačuj í c i se t x m , že uvedený gl^yosylovaný nebo neglykosylovaný polypentid j.e trojnásobná substituován, s výhodou že je jednou substituo— ván.

7. Protein pcýole bodu 5, v y znač u j í c í že uvedený glykosylovaný nebo neglykosylovaný polypeptid. není vícekrát substituován než jednou v oblasti zbytkô a-

minokyselín 3 až 29 včetne včetne, a 105 až 35 až 66 vče 125 včetne. tne, 78 až 87 včet- ne, 98 až 99 Protein podie bodu ‘ ?, v y z n a č u j í c í s e tím, žei X (Ser)znamená Ser, X(Arg) znamená skupinu sestávající z Arg, His a Lys, X(Leu) znamená. skupinu sestávající z Leu, íle, Phe a Met * X (Pro) znamená skuoinu sestévající z Pro a Ala, X(Thr) znamená Thr, X(Ala)znamená i skupinu sestávající z Ala a Pro, X (Val) znamená skupinu sestávající z Val, Met a íle, X(Gly) znamená Gly, X(Ile) znamená skupinu sestávajícx z íle, Het, Phe, Val a Leu, X (Phe) znamená skupinu sestávajícx z Phe, Met, Tyr, íle a Leu, X(Tyr) znamená skupinu sestávající z Tyr a Phe, X(His) znamená skupinu sestávající z His, Gin a Arg, X(Gln) znamená skupinu sestávajícx z Gin, Glu a His, X(Asn) znamená skupinu sestávajíoí z Asn a Asp,, X(Lys) znamená skupinu sestávajícx z Lys a Arg, X(Asp) znamená skupinu sestávající z Asp a Asn, X(Glu) znamená skupinu sestávajícx z Glu a Gin· a X(Met) znamená skupinu sestávajícx z Met, Phe, íle, Val a Leu. Protein podie bodu i S, v y z ; n a č u j í ex se tím,

96 že uvedený glykosylovaný nebo negiykosyiovaný polypeptid ja jednou substituován.

10· Protein podie bodu 9, v y s n r č u j a. c í a e t í in , že uvedený glykosylovaný nebo negiykosyiovaný polypeptid není substituován více než jedenkrát v oblasti sbytkú aminokyselín 3 až 23 včetne, 35

a. z 6

6 včetne, 78

m.

včetne , 98 až 99 včetne a. 105 až 125 včetne. in podl e bodu 7, vyznačí; j 9 c í s e . , že: X (Arg) znamená Arg, X(Leu) znamená skupinu sectávající z Leu, íle a X(Pro ) znamená Pro, X(Ala) znamená Ala, X(Val) znamená Val, X(Ile) znamená skupinu sestávaiící z íle, Met a X(Phe) znamená Phe, X(Tyr) znamená Tyr, X(His) znamená His, X(Gin) znamená Gin, X(Asn) znamená Asn, X (Lys) znamená Lys, X (Asn ) znamená. Asp, X(Glu? znamená Glu a X(Met) znamená. skupinu sestávající z het, íle a

12. Proteín podie bodu 11, v y z r, _a č u j í c í s e tím , že uvedený glvkosylovaný nebo neg'!.ykoGyloaný polypeptid není substituován více než jednou v oblasti zbytkú aminokyselín 3 až 29 včetne, 35 až 66 včetne, 78 až87 včetne, 98 až 99 včetne a 105 až 125 včetne.

13. Proteín podie bodu 12, kterým. ie ma túrovaný lidský ínter leu.kin-4, v y z n a č u j í c í a e tím , že uvedený glykosvlovaný nebo neglykovylovaPý, poV’per.tid znamená, polypeptid vzorce: Hioj.LyG-.Cyfi-Asp-Ile-Thr-.LeuOln- Glu- íle- II e- Ly s- Thr-L e u- A s n- S e r- Leu- Thr- Glu- Gin- Ly sThr- Leu- G y s- Thr- G1 u- Leu- Thr- Val- Thr- A sp- II e-P h e- A la- A1 aS er- Ly p- A s n- Thr- Tlir- 01 u-Ly s-.Gl u- Thr-ph e- 0 y c- Á r g- Al a- Al aThr- Val- Leu. - Ar g- G1 n- Ph e- Tyr- S er- Hi s- Hi s- G1 u- Ly s- A sp- Thr.

97 Arg-Cys-Leu-Gly-Ala-Thr-Ala-Gln-Gln-Phe-His-Arg-His-LysGln-Leu-^le-Arg-Phe-Leu-Lys-Arg-Leiv Aep-Arg-Asn-Leu-Trp-ŕ Gly-Leu-Ala-Gly-Leu-Asn-Ser-Cys-Pro-Val-Lys-Glu-Ala-AsnT· Gin- S er- Thy- Leu- Glu- A sp-Phe-Leu- Glu- Ar g-Leu- Lys- Thr- II e-

Ser-Lys-Cys-Ser-Ser

14. Protein podie bodu 13, vyznačujici. .s.e tím , že obsahuje leader sekvenci vzorce: Met-Gly-LeuThr-S er-Gin-Leu-Leu-Pro-Pro- Leu-Phe-Phe-Leu-Leu-Al a-Cy sA1 a- G1 y-A sn- Ph e-V al- Hi s- G1 y .

15· Glykosylovaný nebo neglykosylovaný protein s aktivitou lidského lnterleukinu-4, vyznačujici se , tím , že je vybrán ze skupiny sestávající z polypeptidú s deseti insercemi, deseti delecemi a deseti substitucemi obecného vzorce:

X(His) - X(Lys) - X(Cys) - X(Asp) - X(Ile) - X(Thr) X(Leu) - X(Gln) - X(Glu) - X(Ile) - X(Ile) - X(Lys) X(Thr) - X(Leu) - X(Asn) - X(Ser) - X(Leu) - X(Thr> X(Glu) - X(Gln) - X(Lys) - X(Thr) - X(Leu) - X(Cys).X(Thr) - X(Glu) - X (Leu) - X(Thr),- X(Val) - X(Thr) X(Asp) - X(Ile) _r X(Phe) - X(Ala) - X(Ala) - X(Ser) X(Lys) - X(Asn) - X(Thr) - X(Thr) - X(Glu) - X(Lys) X(Glu) - X(Thr) - X(Phe) - X(Cys) - X(Arg) - X(Ala) J

X(Ala) - X(Thr) - X(Val) - X(Leu) - X(Arg) - X(Gln) X(Phe) - X(Tyr) - X(Ser) - X (His) - X(His) - X(Glu) X(Lys) - X(Asp) - X(Thr) - X(Arg) - X(Cys) - X(Leu) X(Gly) - X(Ala) - X(Thr) - X(Ala) . X(Gln) - X(Gln) X(phe) - X(His) - X(Arg) - XÍHis) - X(Lys) - X(Gln)X(Leu) - X(lle) - X(Arg) - X(Phe) - X(Leu) - X(Lys)X(Arg)-- X(Leu) - X(Asp) - Xtrg) - X(Asn) - X(Leu)X(Trp) - X(Gly) - X(Leu) - X(Ala) - X(Gly) - X(Leu)X(Asn) - X(Ser) - X(Cys) - x(Pro) - X(Val) - X(Lys)X(Glu) - X(Ala) - X(Asn) - X(Gln) - X(Ser) - X(Thr)X(Leu) - X(Glu) „ X(Asn) X(Phe) - X(Leu)^ X(Glu)X(Arg) - X(Leu) - X(Lys) - X(Thr) - X(Ue) - X(Met)_r

X(Arg) x(Glu) - X(Lys) - X(Tyr) - x(ser) - /XLys)X(Cys) - x(Ser) - X(Ser), v nemž

X(Ser) znamená skupinu sestávající ze Ser, Thr, Gly a Asn

X(Arg) znamená skupinu sestávající z Arg, His, Gin, Lys a Glu, X (Leu) znamená skupinu sestávající z Leu, íle. Phe, Tyr, Met a Val, X(Pro) znamená skupinu sestávaj ící z Pro, Gly, Ala a Thr, X(Thr) znamená skupinu sestávající 2j Thr, Pro, Ser,

Ala, Gly, His a Gin,

X(Ala) znamená skupinu sestávaj?ící z Ala, Gly, Thr a Pro, X(Val) znamená skupinu i Phe, íle a Leu, sestávající z Val, Met, Tyr, X(Gly) znamená skupinu sestávající z Gly, Ala, Thr, Pro a Ser, X(Ile) znamená skupinu sestávající z íle, Het, Tyr,

Phe, Val a Leu,

X(Phe) znamená skupinu sestávající z Phe, Tr >>, Met, Tyr, íle. Val a Leu, X(Tyr) znamená skupinu sestávající 55 Tyr, Trp, Het, Phe, íle, Val a Leu, X(His) znamená skupinu sestá.vajíeí z His, Glu, Lys, Gin, Thr a Arg, X(Gin) znamená skupinu sestávající z Gin, Glu, Lys, Asn, His, Thr a Arg, X(Asn) znamená skupinu sestávajíc-í rV Í.Í Asn, Glu, Asp, Gin a Ser, X(Lys) znamená skupinu sestávající Z Lys, Glu, Gin, His a Arg, X(Asp) znamená skupinu sestáva,jící £.i Asp, GLu a Asn X(Glu) znamená skupinu sestávající z Glu, Asp, Lys, Asn, Gin, His ä Arg i a X(Met) znamená skupinu sestávajíoí z Het, Phe, íle. Val, Leu a Tyr.

16.

Protein podie bodu 15, v y s n tím , še uvedený glykosylovaný polypeptid neobsahuje více než je ci a jednu substituci.

a č u j í c í se nebo neglykosylovaný dnu inserci, jednu dele17. Protein podie bodu 16, vyznačuj ící

I.

99 tím , že uvedený glykosylovaný nebo neglykosylovaný polypeptid neobsahuje více než jednu inserci v oblasti zbytkú aminokyselín 3 až 29 včetné, 35 až 66 včetné, 78 až 87 včetné, 98 až 99 včetné a 105 až 125 včetné.

18. Protein podie bodu 15, vyznačující se tím , že uvedený glykosylovaný nebo neglykosylovaný polypeptid neobsahuje více než jednu inserci, jednu deleoi nebo jednu substituci v oblasti zbytkú aminokyselín 3 až 29 včetné, 35 až 66 včetné, 78 až 87 včetné, 98 až

99 včetné a 105 až 125 včetné. Protein podie bodu 15, vyznačující se tím , že X(Ser) znamená Ser, X(Arg) znamená skupinu sestávající z Arg, His a Lys, X(Leu) znamená skupinu sestávající z Leu, íle, Phe a Met, X (Pro) znamená skupinu sestávající z Pro a Ala, X(Thr) znamená Thr, X(Ala) znamená skupinu sestávájící z Ala a Pro, X(Val) znamená skupinu sestávající z Val, Met a He, X(Gly) znamená Gly, X(Ile) znamená skupinu sestávající z íle, Met, Phe, Val a Leu, X(Phe) znamená skupinu sestávající z Phe, Met, Tyr, íle a Leu, X(Tyr) znamená skupinu sestsvající 2 Tyr a Phe, X(His) znamená skupinu sestávající z His, Gin a Arg, X(Gin) znamená skupinu sestávající 2 Gin, Glu a His, X(Asn) znamená skupinu sestávající z Asn a Asp, X(Lys) znamená skupinu sestávající z Lys a Arg, X(Asp) znamená skupinu sestávající z Asp a Asn, X(Glu) znamená skupinu sestávající z Glu a Gin a X(Met) znamená skupinu sestávající z Met, Phe, íle,

Val a Leu.

20. Protein podie bodu 19, vyznačující se t 1 m , ze uvedený glykosylovaný nebo neglykosylovaný polypeptid neobsahuje více než dve inserce, dve delece

- 100 nebo dve substituee v oblasti zbytkú aminokyselín 3 až 29 včetné, 35 až 66 včetné, 78 až 87 včetné, 98 až 99 včetné a 105 až 125 včetné,

21. Protein podie bodu 15, vyznačuj í cí se tím , že uvedený glykosylovaný nebo neglykosylovaný polypeptid znamená rautein lidského interlu/ekinu-4.

22. Protein podie bodu 15, vyznačující se tím , že uvedený glyks^ylovaný. nebo neglykosylovaný polypeptid znamená mutein 13° (Gly-Asn-Phe-Val-His-Gly) nebo mutein IS° (AlarGlu-Phe) lidského interleukinu-4.

23. Farmaceutický prostŕedek pro stimulaci imunitniho systému, vyznačující se tím , že obsahuje terapeuticky slučitelný nosič a efektívni množství lidského interleukinu-4.

24. Farmaceutický prostŕedek, vyznačuj ící s.e tím , že obsahuje terapeuticky slučitelný nosič a efektivní množství lidského interleukinu-4 pro zesílení terapeutických účinkô interleukinu-2, pri čemž lidský interleukin-4 je vybrán ze sloučenin ^fhle bodu 7.

25· Farmaceutický prostŕedek, vyznačuj ící s e tím , že obsahuje terapeuticky slučitelný nosič a efektivní množství lidského interleukinu-4 pro zesílení terapeutických účinkô interleukinu-2, pri čemž lidský interfeukin-4 je vybrán ze sloučenin podie bodu 13.

26. Farmaceutický prostŕedek, vyznačující se tím , že obsahuje terapeuticky slučitelný nosič a efektivní množství lidského interleukinu-4 pro zesílení terapeutických efektô GM-CSF, pri čemž uvedený lidský interleukin-4 je vybrán ze sloučenin podie bodu 7, s výhodou anamená sloučeninu podie bodu 13,

27. Farmaceutický prostŕedek podie bodu 22, v y z n a č u. jící se tím, že stimuluje expresi MHC anti- 101 genú trídy II na 3-buňkách.

28. Nukleová kyselina, v y z n a č u j í c í se tím že obsahuje sekvenci nukleotidu schopných kodov.at poly-, peptid vykazující aktivitu savčího interleukinu-4 a alespoň jednu další aktivitu vybranou ze skupiny sestávajxcí z aktivít;/ indukce KHC antigénu, aktivity indukce Ec-epsilon receptoru, aktivity zesílujxcx rúst kolonie granulocytú stimulovaných C-K-CSP, aktivity zesílujxcx TCGP interleukinu-2 a aktivity indukce IgG^ a IgE,

29. Nukleová kyselina podie bodu 28, v y z n a S u j í c í s e tím , že sekvence nukleotidú je alespoň ze sedradesáti péti procent homologní se sekvenci DNA v cDNA insertu vektoru vybraného z pcD-46 a pcD-125.

30. Nukleová kyselina podie bodu -9, vy z n a č u j í c. í s e tím , že uvedená sekvence je alespoň z devadesáti procent homologní se sekvenci DNA v cDNA insertu vektoru vybraného z pcD-46 a pcD-125·

31. Sloučenina, vyznačuj ící se tím , že je vybrána ze skupiny sestávajícx z nukleových kyselin ob sahující^. sekvenci kodonú schopných kodovat polypeptidy podie bodu 19.

32. Sloučenina, v y z n a č u j í c je vybrána se skupiny sestávajícx sahujících sekvenci kodonú stepných kodovat polypeptidy podie bodti 7.

33. Sloučenina, v y značujícx s e tí m , že je vybrána ze skupiny sestávajícx s nukleových kyselin obsahujících sekvenci kodonú schopných kodovat polypeptidy podie bodu 18.

34. Sloučenina, v y s n a č u j í c í s e t x m , že je vybrána ze skupiny sestávající s nukleových kyselin obsahujících sekvenci kodonú schopných kodovat polypeptidy podie bodu 9.

í s e tím , že z nukleových kyselin ob

102 35. Sloučenina, vyznačujici se t í ra ,še je vybrána ze skupiny sestávající z nukleových kyselín . obsahujících sekvencí kodonú schopných kodovat polypentidy podie bodu 13.

36. Sloučenina podie bodu 35, vyznačujici s e .

ΐ t í m , že uvedená sekvence kodonú je definována sekvencí nukleotidú kodujících tento polypeptid» .

‘ Met- Gly-Leu-Thr-Ser- Gln-Leu-Leu-Pro-Pro?.Leu..Phe-Phe-IifeuLeu-Ala~.Cys-Ala-Gly-Asn-Phe-Val-Kis-Gly-His-Lys-Cys-Aspíle- Thr-Leu- Gin- Gin- II e-Ile-Ly s- Thr-Leu-Asn-Ser-Leu- ThrGlu- Gin- Lys- Thr- Leu- Cys- Thr- Glu-L eu~ Thr-V al- Thr-A sp- II ePhe- Ala-Ala-S er-Lys-A sn- Thr- Thr- Glu-Ly s- Glu-Thr-Phe-Cy s-,

Arg-Ala-'Ala- Thr-Val-Leu- Ar s- Gln-Phe?. Tyr- Ser-Hi s-His- GluLy s— Λ sp?. Thr-Arg- Cy s- L e u- Gly?. Al a- Thr?. Al a- Gin.- Gln-Phe?.Hi sArg-Kis-.Lys-Gln-Lyfé-Ile-Arg-Phe-Leu-Lys-Arg-úeu-Asp-Ars?.

A sn- L eu- Trp- Gly- Leu-Al a- Gly- L e u- A sn- S er?. Cy s~ Pro-V aL-LysGlu-Ala»Asn?.Gln-Ser-Thr-Leu-Glu-Aen-Phe-J»eu„Glu-Arg-LeuLys-Thr-Ile-Met-Arg-Glu-Ly 3- Tyr-Ser-Lys-Cys-Ser-Ser.

37o Nukleová kyselina podie bodu 35, vyznačujici s e t í m , že uvedená sekvence kodonú je definována následujícím vzorceras CAC AAA TGT GAC ATC ACT CTG CAA GAA AlC

ATC AAA ACT CTG AAC TCG TTA ACC GAA CAG AAA ACC CTG TGC ACC GAG CTC ACT GTT ACT GAT ATC TTC GCT GGT TCC AAA AAC ACT ACT GAA AAA GAA ACT TTC TGC AGA GCT GCT ACC GTT CTG CGT CAG TTC TA G TCT CAC CAC GAA AAA GAC ACG CGT TGT CTC GGC GCC ACT GCG CAG CAG TTC CAC CGT CAC AAA CAG CTG ATC AGA TTC CTG AAA CGT CTA GAC CGT AAC CTG TGG GGC CTG GCC GGC CTG AAC TCT TGT CCG GTT AAA GAA GCT AAC CAG TCG ACT CTG GAA AAC TTC CTC GAG CGT CTG AAA ACC ATC ATG CGT GAA AAG TAC TCT AAA TGC TCT TCT, »

38. Zpúsob prípravy polypeptidu vykazu.jíeího aktivitu lidského interleukinu-4, vyznačujici a e tím, že sestává ze stupňúj

- zkonstruovaní vektoru obsahujícího sekvencí nukleotidú kodujících uvedený polypeptid, pri čeraž tuto sekvencí je možné získávat expresí hostitelem obsahujícím tento

- 103 vektor a tato sekvence .je z alespoň 75 % homologni 'S insertem pcD-125,

- inkornorace vektoru do hostitele a _ uchovávaní hostitele obsahujícího vektor za podmínek vhodných pro expresi sekvencí nukleotidň na uvedený polypeptid.

39. Zpúsob podie bodu 38, v y z n a č u j í c í s e tím, že uvedená sekvence nutásotidú je vybrána ze sekvencí podie bodu 34.

40. Zpúsob podie bodu 38. v y z n a c u j í c í s e tip, že uvedená sekvence nukleotidô je vybrána se sekvencí podie bodu 36 a jako hostitel se používá savčí buňka.

41. Bunka, která je vybrána ze skupiny bunék sestávající s bunék kvasinek, bakteriálnych bunék a savčích bunék, vy-, z n a č u j í c í s e tím , že tato bunka je transformována nebo prechodné transfektována vektorem obsahujícím sekvenci nukleové kyseliny podie bodu 34.

42. Bunka, která je vybrána ze skupiny bunék sestávající z b.unek kvasinek, bakteriálnych bunék a savčích bunék, v y z n a Č u j í c í s e tím , že tato bunka je transformovaná nebo prechodné transfektována vektorem obsahujícíra sekvenci nukleové kyseliny podie bodu 36.

43· Bunka podie bodu 42, v y z n a č u j í c í s e tím že uvedená skupina sestává z bunék Esch^íchia coli, bunék Saccharomyces cerevisiae, opičích bunék COS 7, bunék va-, ječníkú čínskeho krečka, myších L bunék a myších myelomových bunék.

44. Vektor, který je schopen transfor&ovat bakteriálniho hostitele, v y s n a č u j í c í s e t í m , že obsahuje sekvenci nukleové kyseliny podie bodu 34.

45. vektor podie bodu 44, v y z n a č u j í. c í s 'e tím, že je. vybrán ze skupiny sestávající s pIN-III-ompA2, TRPC11 a TAC-RBS.

- 104 ιt

46, Vektor, který je schopen transformovat kvasinkového hostitele, vyznačujici se tím , že obsahuje sekvenci nukleové kyseliny podie bodu 34.

47. Vektor podie bodu 46, vyznačujici se tím, že sestává z pO-alfaS.

46. Vektor, který je schopen transformovat nebo dočasné trans-’ fektovat savčího hostitele, vyznačujici se tím , že obsahuje sekvenci nukleové kyseliny podie bodu 34.

49. Vektor podie bodu 48, vyznačujici se tím, že sestává z pcD plasmidu,

50. Vektor podie bodu 49, vyznačujici ee tím, že se jako pcD plasmid používá pcD-125 nebo pcD-46.

51. Použití farmaceutického prostŕedkú podie bodu 22 pro léčení syndrómu holých lymfocytú stimulací exprese HLA-DR antigenú tŕídy II na B bunkách podávaním efektívni dávky uvedeného farmaceutického prostŕedkú, vyznačujici s e * t £ m , že se jako lidský interleukín-4 používá polypeptid vzoreet

His-Ly s-Cy s-Asp-Il e- Thr_r Leu-Gln- 01. u- II e- II e*-Ly s- Thr- LeuAen-S er-Leu-Thr-Glu- Gln-Lys- Thr-Leu-Cy s- Thr- Glu-Leu- ThrVal-Thr-Aep-Ile-Phe-Al a-Ala-S er-Ly s- A sn- Thr- Thr-’Glu-LysGlu— Thr-Phe- Cy s- Arg-Äl aUAla- Thr- VaL- Leu- Ar Gln-Phe- TyrSer-HlB-His-Glu-Lys-Asp-Thr-Arg-Cys-Leu-Gly-Ala-Thr-AlaGln-Gln-Phe-His-Arg-His-Lys-Gln-Leu-Ile-Arg-Phe-Leu-LysArg-Leu-Asp-Arg-Asn-Leu-Trp-Gly-Leu-Ala-Gly-Leu-Asn-SerCysrPro-Val-Lys-Glu-Ala-Asn-Gln-Ser-Thr-Let-Glu-Asn-PheLeu-Glu-Arg-Leu-Lys-Thr_Il e-Me t-Arg- Glu-Ly s- Tyr- Ser-Ly sCys-Ser-Ser.