JPH0884591A - 哺乳動物インターロイキン−4活性を示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸 - Google Patents

哺乳動物インターロイキン−4活性を示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸

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JPH0884591A
JPH0884591A JP7217072A JP21707295A JPH0884591A JP H0884591 A JPH0884591 A JP H0884591A JP 7217072 A JP7217072 A JP 7217072A JP 21707295 A JP21707295 A JP 21707295A JP H0884591 A JPH0884591 A JP H0884591A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 有用なインターロイキン−4産生用のヌクレ
オチドの提供。 【解決手段】 ヒトインターロイキン−4活性を示し、
MHC抗原誘導活性、Fc−イプシロン受容体誘導活
性、GM−CSF刺激顆粒コロニー成長増強因子、イン
ターロイキン2 TCGF増強活性、およびIgG1
ならびにIgE−誘導活性からなる群から選択される少
なくとも1つの活性を更に示すポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列からなる核酸。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は哺乳動物の免疫系の
タンパク質因子および突然変異タンパク質(ムテイン,mu
tein)因子をコードする核酸に関する。より詳細には、
本発明はT細胞増殖因子活性およびB細胞増殖因子活性
の両方を示すタンパク質因子および突然変異タンパク質
因子をコードする核酸に関する。また、本明細書中に
は、それらのタンパク質因子についても記載する。
【0002】
【従来の技術】組換えDNA技術は一般に供給源からの
遺伝情報をベクター内に組み込み、その後宿主への導入
のようなプロセッシングを行って、新しい環境のもとで
その転移遺伝情報を複製および/または発現させる技術
に関する。通常、遺伝情報は目的のタンパク質産物をコ
ードするメッセンジャーRNA(mRNA)から誘導され
る相補DNA(cDNA)の形で存在する。キャリアは往
々にしてプラスミドであり、プラスミドは宿主内での複
製のためにcDNAを組み込れる能力を有し、いくつか
の場合には実際にcDNAの発現を制御し、それにより
宿主内でのコード化産物の合成を導く能力をもってい
る。
【0003】しばらくの間、哺乳動物の免疫応答は“免
疫ネットワーク"と呼ばれる一連の複雑な細胞相互作用
に基づくことが知られていた。最近の研究は、このネッ
トワークの内部機構への新たな洞察を与えた。多くの免
疫応答が実際にリンパ球、マクロファージ、顆粒球およ
び他の細胞のネットワーク様相互作用を中心に動いてい
ることは確かであるが、今や免疫学者達は一般にこれら
の細胞の相互作用を制御する上で可溶性タンパク質(例
えば、いわゆる“リンフォカイン”や“モノカイン”)
が重要な役割を演じていると考えている。従って、細胞
調節因子の単離、同定および作用機構には多大の関心が
寄せられ、これらの理解は数多くの病気の診断および治
療に画期的な躍進をもたらすであろう。
【0004】リンフォカインは明らかにいろいろなやり
方で細胞の活動を仲介する。それらは多分化能性造血幹
細胞の増殖、成長および分化を促進して、免疫応答に関
与する種々の細胞系統を構成する膨大な数の前駆細胞へ
と分化させることが知られている。これらの細胞系統
は、リンフォカインを他の作用物質と共に使用する場
合、しばしば異なる方法で応答する。
【0005】免疫応答にとって特に重要な細胞系統は2
種類のリンパ球:すなわちB細胞とT細胞であり、B細
胞は免疫グロブリン(異物を認識し、それと結合してそ
れを除去する能力をもつタンパク質)を生産・分泌する
ことができ、一方種々のサブセットのT細胞はリンフォ
カインを分泌し、B細胞と免疫ネットワークを構成する
他の細胞(他のT細胞を含む)を誘発または抑制すること
ができる。
【0006】その他の重要な細胞系統は肥満細胞(すべ
ての哺乳動物種においてポジティブに同定されたわけで
はない)・・・・体中の毛細管に接近して、特に肺、皮
膚、胃腸管および泌尿生殖器官に高濃度で存在する顆粒
含有結合組織細胞である。肥満細胞はアレルギー関連疾
患(特にアナフィラキシー)において中心的な役割を演
じ、すなわち所定の抗原が肥満細胞表面上の受容体に結
合したあるクラスの免疫グロブリンと交差結合すると
き、肥満細胞は顆粒を放出してアレルギー反応(例えば
アナフィラキシー)を引き起こす媒介物質(例えばヒスタ
ミン、セロトニン、ヘパリン、プロスタグランジンな
ど)を放出する。
【0007】種々の免疫疾患をより一層理解するための
研究(これは免疫疾患を治療することにつながる)は、一
般に免疫系の細胞をin vitroで維持することが困難で
あるために妨げられている。免疫学者達は、これらの細
胞の培養が種々の増殖因子(例えばリンフォカイン類)を
含むT細胞および他の細胞の上清を使用することにより
達成できることを見出した。
【0008】リンフォカインや免疫反応の他の可溶性媒
介物質のような因子の検出、単離および精製は非常に困
難であり、そしてしばしばそれらを含む上清の性質その
もの、混合物中の諸成分の活性の分散および乗り換え(c
ross−over)、因子の性質を調べるために利用するアッ
セイの感度(またはその欠如)、因子の分子量範囲および
他の特性における類似性、ならびにそれらの自然環境に
おける因子濃度の低さにより複雑になっている。
【0009】リンフォカインが主に分子クローニングに
よって次第に利用可能になるにつれて、それらの臨床上
の用途を見出すことに関心が高まった。ホルモンとの生
理学的類似性(例えば可溶性因子、増殖媒介物、細胞受
容体を介しての作用)のために、リンフォカインの使用
可能性はホルモンの最近の用途に類推して論じられた:
例えばデクスター(Dexter),Nature,Vol.321,p.
198(1986)を参照されたい。1つの期待は、患者
におけるリンフォカイン レベルが有益な免疫応答(例
えば炎症、アレルギーまたは組織拒絶反応の抑制、ある
いは感染症または悪性増殖に対する刺激もしくは増強)
を引き起こすために直接的または間接的に操作し得ると
いうことである。リンフォカインの他の臨床上の用途に
は、あるヒトのある種の免疫系細胞を有益な作用のため
に同じヒトまたは別のヒトへ終局的に再導入すべく、こ
れらの細胞のin vitro集団を維持・増殖させることが
含まれる。例えば、患者のリンフォカイン活性化キラー
T細胞の集団を患者の体外で増殖させて、その後高めら
れた抗腫瘍応答を引き起こすために再注入し得るかどう
かを調べる研究が現在進行中である。リンフォカイン、
特に顆粒球−マクロファジコロニー刺激因子(GM−C
SF)のようなコロニー刺激因子およびそれらの活性を
高める因子、の他の臨床上の用途は、例えば腫瘍に対す
る化学療法または放射線療法の前後に、骨髄形成不全の
治療のために、あるいは好中球欠損症候群の治療のため
に、血液細胞の発生を刺激することである:デクスター
(Dexter),Nature,Vol.321,p.198(1986)を
参照されたい。この種の因子はまた、再生不良性貧血や
ある種の白血病の治療に次第に使用されつつある骨髄移
植療法において有用であるだろう。
【0010】このような臨床用途にとって重要なリンフ
ォカインの2つの性質がある:すなわち個々のリンフォ
カインはしばしば多面作用性(pleiotropic)であり;また
1つのリンフォカインの生物学的作用は一般に少なくと
も1つの他のリンフォカインによって調節(抑制または
増強)しうる。例えば、γ−インターフェロンと相乗的
な腫瘍壊死因子はインターロイキン−1(IL−1)の生
産を刺激し、且つ好中球の食作用を活性化することがで
きる。活性化マクロファージによって生産されるタンパ
ク質IL−1は、インターロイキン−2(IL−2)放出
の誘導による胸腺細胞増殖の刺激、Bリンパ球の成熟お
よび増殖の刺激、線維芽細胞増殖因子活性、および肝細
胞による急性期タンパク質(acutephase protein)合成
の誘導を含めた広範囲の生物学的作用を仲介する。ま
た、IL−1はプロスタグランジンおよび滑液細胞から
のコラゲナーゼ放出を刺激し、且つ内因性発熱因子に一
致することが報告された:クランプシュミット(Krampsc
hmidt),J.Leuk.Biol.,Vol.36,p.341〜35
5(1984)を参照されたい。
【0011】インターロイキン−2(以前はT細胞増殖
因子と呼ばれていた)はレクチン活性化または抗原活性
化T細胞によって生産されるリンフォカインである。I
L−2の報告された生物学的活性には、活性化T細胞ク
ローンの長期in vitro増殖、胸腺細胞の有糸分裂増
強、およびヌードマウス脾細胞培養物における細胞障害
性T細胞の反応性およびプラーク形成細胞の応答の誘導
が含まれる。さらに、インターフェロン(IFN)と同様
に、IL−2はナチュラルキラー細胞の活性を増大させ
ることが分かり、新生物疾患の治療への使用可能性が示
唆された:ヘネイ(Henney)ら,Nature,Vol.291,p.
335〜338(1981)を参照されたい。このような
治療法においていくつかの成功が報告された:例えばロ
ッゼ(Lotze)およびローゼンバーグ(Rosenberg),“精
製ヒトインターロイキン−2による腫瘍患者の治療”,
ソーグ(Sorg)ら編集,Cel lular and Mo lecular B
iologyof Lympho kines(アカデミックプレス社,ニュー
ヨーク,1985);およびローゼンバーグおよびロッゼ,
“インターロイキン−2およびインターロイキン−2活
性化リンパ球を使用する癌の免疫療法”,Ann.Rev.
Immunol.,Vol.4,p.681〜709(1986)を参
照されたい。しかしながら、IL−2の毒性はこれらの
性質を利用するために癌患者に投与しうるIL−2の投
与量を制限した:ソーグら編集の上記文献中のロッゼお
よびローゼンバーグ,p.711〜719;およびウェルテ
(Welte)ら,p.755〜759を参照されたい。
【0012】メットカーフ(Metcalf,D.),Th e Hem
atopoietic Colony Stimulating Factors (エル
セビアー,アムステルダム,1984)は哺乳類の免疫応
答に関与するリンフォカインおよび種々の増殖因子に関
する研究の概要を開示している。ヤング(Yung,Y.
P.)ら、J.Immunol.Vol.127,p.794(198
1)は肥満細胞増殖因子(MCGF)活性を示す約35kd
のタンパク質の部分精製およびT細胞増殖因子(TCG
F)とも呼ばれるインターロイキン−2(IL−2)から
のその分離を開示している。ナベル(Nabel,G.)ら,
ature,Vol.291,p.332(1981)は約45kdの
分子量および約6.5のpIをもつMCGFを報告してい
る。クラークルイス(Clark−Lewis,I)およびシュレ
ーダー(Schrader),J.Immunol.,Vol.127,p.1
941(1981)はリン酸緩衝溶液中で約29kdおよび
6Mグアニジン塩酸塩中で約23kdの分子量、ならびに
約4〜8のpI(ノイラミニダーゼ処理後には約6〜8の
pI)をもつ肥満細胞様増殖因子活性を示すタンパク質を
開示している。ネズミIL−2およびインターロイキン
−3(IL−3)はそれぞれギリス(Gillis,S.)ら,J.
Immunol.,Vol.124,p.1954〜1962(19
80)およびイーレ(Ihle,J.)ら、J.Immunol.,Vo
l.129,p.2431〜2436(1982)によって生
化学的に部分同定され、IL−2は約30〜35kdの見
かけ分子量(恐らくは二量体として)をもち、そしてIL
−3は約28kdの分子量をもつことが報告された。ヒト
IL−2は明らかに約15kdの分子量をもち、ギリス
ら,Immu.Rev.,Vol.63,p.167〜209(19
82)に記載されている。IL−3とT細胞上清のMC
GF活性との比較はヤング(Yung,Y.)およびムーア
(Moore,M.),Contemp.Top.Mol.I mmunol.,Vo
l.10,p.147〜179(1985)およびレニック
(Rennick,D.)ら,J.Immunol.,Vol.134,p.9
10〜919(1985)に報告された。
【0013】可溶性因子によるB細胞の増殖および分化
の調節に関して多数の文献が存在する:例えばハワード
(Howard)およびポール(Paul),Ann.Rev.Immuno
l.,Vol.1,p.307〜333(1983);ハワード
ら,Immunol.Rev.,1984,No.78,p.185〜2
10;キシモト(Kishimoto)ら、Immu nol.,Rev.,1
984,No.78,p.97〜118;およびキシモト,An
n.Rev.Immunol.,Vol.3,p.133〜157(19
85)を参照されたい。種々の因子を分類するために用
いた命名法には、供給源物質の相違、精製の困難性、お
よびそれらの生物学的活性を定めるのに使用したアッセ
イの相違のために幾分かの混乱が生じた。命名法に関す
るコンセンサスは明らかにいくつかの場合に達成され
た:ポール(Paul),Immunology Today,Vol.4,p.3
22(1983);およびポール(Paul),Molecular Im
munol.,Vol.21,p.343(1984)を参照された
い。B細胞増殖因子(BCGF)活性は、抗IgMまたは
類似の抗原にさらすことにより刺激したB細胞において
DNA合成を引き起こす能力により特徴づけられる。イ
ンターロイキン−1(IL−1)もまた、少なくともアッ
セイを低密度のB細胞の存在下で行う場合には、BCG
F活性を証明するために必要であると考えられる。ヒト
BCGFについての別のアッセイは例えばメイゼル(Ma
izel)ら、Proc.Natl. Acad.Sci.,Vol.80,p.
5047〜5051(1983)(培養下でのヒトB細胞
の長期増殖の維持)に記載されている。前者のアッセイ
に関連した活性はまた、類似のおよび/または関連した
活性からそれを区別するために、B細胞刺激因子−1
(BSF−1)活性およびBCGF Iとして分類され
た。特にBCGF IIと呼ばれる活性が明示された。
これはマイトジエン刺激B細胞または形質転換B細胞株
においてDNA合成を誘発する能力によって特徴づけら
れる。BCGF IIと関係したマイトジエンにはデキ
ストラン硫酸、リポ多糖およびスタフィロコッカス・ア
ウレウス(Staphylococcus)抽出物が含まれる。BCG
F Iはこれらのアッセイにおいて何の応答も示さな
い。ヒトの場合に、BCGF IIは約50キロダルト
ン(KD)の分子量をもつ分子であり、それは免疫応答に
おいてB細胞増殖を促進する際にBCGF I(すなわち
BSF−1)と相乗的に作用すると考えられる:ヨシザカ
(Yoshizaka)ら,J.I mmunol.,Vol.130,p.124
1〜1246(1983)を参照されたい。ハワードら,
J. Exp.Med.,Vol.155,p.914〜923(19
82)は初めてインターロイキン−2と異なるネズミB
CGF(のちにBCGF−1,BSF−1,またはIgG1
誘導因子といろいろな名称で呼ばれた)の存在を明らか
にした。同じような観察がヨシザキら,J.Immunol.,
Vol.128,p.1296〜1301(1982)により
ほとんど同時にヒトの系について報告され、その後オカ
ダ(Okada)ら,J.Exp.Med.,Vol.157,p.583
〜590によっても報告された。
【0014】BCGFまたはBSF−1活性を示す分子
の生化学的および生物学的性状決定はこれらの初期発見
以来たゆまず進行している。メイゼル(Maizel)ら,Pro
c.Natl.A cad.Sci.,Vol.79,p.5998〜6
002(1982)は12〜13KDの分子量および約
6.3〜6.6の等電点(pI)をもつトリプシン感受性ヒ
トBCGFを報告した。ファーラー(Farrar)ら,J.Im
munol.,Vol.131,p.1838〜1842(198
3)はSDS−PAGEにより11KDと15KDの分
子量および6.4〜8.7のpIをもつ不均一のネズミB
CGFの部分精製を報告した。オハラ(Ohara)およびポ
ール(Paul),Nature,Vol.315,p.333〜336
(1985)はネズミBSF−1に特異的なモノクローナ
ル抗体を開示し、そして14KDおよび19〜20KD
の分子量および6.7のpIをもつBSF−1を示した。
バトラー(Butler)ら,J.Immunol.,Vol.133,p.
251〜255(1984)は18〜20KDの分子量お
よび6.7〜6.6のpIをもつヒト−BCGFを報告し
ている。ルビン(Rubin)ら,Proc.Natl.Aca d.Sc
i.,Vol.82,p.2935〜2939(1985)は抗
IgM抗体にさらす前に休止B細胞とBSF−1とをプ
レインキュベーションすると細胞容量が増大し、その後
抗IgM抗体にさらした際にS期へ入るのが早まること
を報告している。ビテッタ(Vitetta)ら,J.Exp.Me
d.,Vol.162,p.1726〜1731(1985)は
EL−4細胞の血清不含上清の逆相HPLCによるネズ
ミBSF−1の部分精製を開示している。SDS−PA
GEは約20〜22KDのタンパク質を示した。オハラ
(Ohara)ら、J.Immunol.,Vol.135,p.2518
〜2523(1985)はまた類似の方法によるネズミB
SF−1の部分精製を報告し、その因子が約18〜2
1.7KDのタンパク質であることを示した。サイダー
ス(Sideras)ら、Eu r.J.Immunol.,Vol.15,p.
586〜593および593〜598(1985)はネズ
ミIgG1誘導因子(すなわちBSF−1)の部分精製を報
告し、その因子が7.2〜7.4および6.2〜6.4のp
Iをもつ約20KDのタンパク質であることを示した。
スミス(Smith)およびレニック(Rennick),Proc.Nat
l.Acad.Sci.,Vol.83,p.1857〜1861
(1986)はIL−2およびIL−3からのT細胞増殖
因子活性および肥満細胞増殖因子活性を示す因子の分離
を報告している。その後、ノマ(Noma)ら,Nature,Vo
l.319,p.640〜646(1986)はサイダースら
の因子をコードする核酸をクローニングして、その塩基
配列を決定し、またリー(Lee)ら、Proc.N atl.Aca
d.Sci.,Vol.83,p.2061〜2065(198
6)はスミスとレニックの因子をコードする核酸をクロ
ーニングしてその塩基配列を決定した。比較的最近にな
って、グラブスタイン(Grabstein)ら,J.Exp.Me
d.,Vol.163,p.1405〜1414(1986)は
ネズミBSF−1の精製およびアミノ酸配列決定を報告
している。
【0015】ミネラス(Milanese)ら、Science,Vol.
231,p.1118〜1122(1986)は彼らが暫定
的にIL−4Aと命名したBSF−1とは無関係のリン
フォカインを報告した。彼らのIL−4AはT3−Ti
受容体の交差結合後にヘルパーT細胞から分離された1
0〜12KDのタンパク質である。それはT11受容体
との相互作用およびインターロイキン−2(IL−2)受
容体はその後の誘導により休止リンパ球を刺激する。
【0016】サンダーソン(Sanderson)ら、Proc.Na
tl.Acad. Sci.,Vol.83,p.437〜440(19
86)は好酸球分化因子がB細胞増殖因子IIと明らか
に同じであるという証拠に基づいて、そのB細胞分化因
子にインターロイキン−4という名称を与えることを提
案した。
【0017】
【発明が解決しようとする課題】前述のことから、新し
いフォカインの発見および開発が、免疫系および/また
は造血細胞と直接的または間接的に関係する広い範囲の
変性症状の治療法の開発に寄与することは明らかであ
る。特に、既知のリンフォカインの有効性を増強するリ
ンフォカインの発見および開発は非常に有利であるだろ
う。例えば、腫瘍治療におけるIL−2の用量制限毒性
は相乗作用をもつリンフォカインまたはコファクターの
利用によって減少し、また骨髄移植物の効力はコロニー
刺激因子の活性を増強する因子の使用により増加するで
あろう。
【0018】
【課題を解決するための手段】本発明は哺乳動物のイン
ターロイキン−4(IL−4)に関する。それはIL−4
活性を示すポリペプチドをコードする核酸、およびポリ
ペプチド自体、ならびにそれらの生産方法を包含する。
本発明の核酸は(1)本明細書に記載のクローン化相補D
NA(cDNA)配列に対するそれらの相同性、および
(2)その核酸によってコードされるポリペプチドに適用
されるIL−4活性の機能検定により規定される。本明
細書において使用する場合、タンパク質またはポリペプ
チドに関する“IL−4活性”なる用語は、そのタンパ
ク質またはポリペプチドがB細胞増殖因子(BCGF)活
性およびT細胞増殖因子(TCGF)活性の両方を示すこ
とを意味する。所定の哺乳類の場合、IL−4活性は種
特異的TCGFおよびBCGF検定により測定される。
以下でより詳細に説明するように、IL−4の特定態様
は別のアッセイによってさらに同定される。例えば、い
くつかの形のネズミIL−4は肥満細胞増殖因子(MC
GF)活性を示し;いくつかの形のヒトおよびネズミIL
−4はともにIL−2のTCGF活性を増強し;いくつ
かの形のネズミおよびヒトIL−4はあるタイプの細胞
におけるGM−CSF刺激増殖を増強し;いくつかの形
ヒトおよびネズミIL−4はB細胞上のFc−イプシロ
ン受容体発現を誘導することができ;そしていくつかの
形のヒトおよびネズミIL−4はB細胞上の主要組織適
合遺伝子複合体(MHC)抗原:すなわちヒトB細胞上の
クラスIIDR抗原およびマウスB細胞上のIa抗原、
の発現を誘導することができる。
【0019】本発明はその一面がIL−4活性をもつタ
ンパク質を発現し得るcDNAの発見およびクローニン
グに基づいている。本発明のcDNAクローンにはプラ
スミドベクター“クローン46”(またここではpcD−
2F1−13やpcD−46と呼ばれる)および“クロー
ン125”(またここではpcD−125と呼ばれる)のヒ
トcDNA挿入物、ならびにプラスミドベクターpcD−
2A−E3のマウスcDNA挿入物が含まれる。3種の
ベクターはメリーランド州ロックビルのアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション(ATCC)に受託番号
53337,67029および53330としてそれぞ
れ寄託された。
【0020】
【発明の実施の形態】本発明は、本発明のcDNAクロ
ーンに事実上相同であり且つIL−4活性を示すヌクレ
オチド配列をもつ核酸を含む。本発明の核酸およびタン
パク質は、核酸配列の標準突然変異誘発技術により上記
cDNAから誘導される。それらはIL−4をコードす
るメッセンジャーRNA(mRNA)配列を含むか又はそ
れを含むように誘導し得る免疫系誘導細胞株(例えばT
細胞ハイブリドーマ)から新たに作ることができ、それ
らは本発明のcDNAクローンから誘導されるプローブ
を用いてDNAまたはRNAの抽出物もしくはライブラ
リーを検索することにより得られる。
【0021】本明細書で用いる“事実上相同”なる用語
は、ヌクレオチド配列が本発明のcDNAクローンから
誘導されるハイブリダイゼーションプローブによって検
出され得ることを意味する。IL−4活性をコードする
核酸を検出するために必要な相同性の正確な数値測定は
(1)標的核酸に関連した非IL−4コード配列に対する
プローブの相同性、(2)ハイブリダイゼーション条件の
緊縮性、(3)1本鎖プローブを使用するか又は2本鎖プ
ローブを使用するか、(4)RNAプローブを使用するか
又はDNAプローブを使用するか、(5)その測定がプロ
ーブの非特異的結合を減らすように行われるか、(6)プ
ローブを検出するために用いる標識の性質、(7)プロー
ブ中のグアニンおよびシトシン塩基の割合、(8)プロー
ブと標的との誤対合の分布、(9)プローブの大きさなど
を含めたいくつかの要因により左右される。
【0022】好ましくは、本発明のcDNAから誘導さ
れる事実上相同なプローブは単離すべき配列と少なくと
も50%相同である。より好ましくは、事実上相同なプ
ローブは単離すべき配列と少なくとも75〜80%相同
である。最も好ましくは、事実上相同なプローブは単離
すべき配列と少なくとも90%相同である。本明細書で
用いる“相同”なる用語は2つのヌクレオチド(または
アミノ酸)配列間の類似性の尺度である。相同は2つの
配列(恐らく等しくない長さのもの)を整列させた後の対
合塩基(またはアミノ酸)の割合すなわち百分率として表
される。“整列”なる用語はTime Warps,String
Edits,and Macromolecules:The Theory and P
ractice of Sequence Compari son(アジソン−ウェ
スレー,リーディング,MA,1983)の第1章にサンコ
フ(Sankoff)およびクラスカル(Kruskal)によって定義
された意味で使用される。概略的に述べると、2つの配
列は最大オーバーラップをもたらすようにいずれかの配
列に最小限の“ブランク(blank)”または“ナル(nul
l)”塩基を挿入することにより、2つの配列間の対合塩
基(またはアミノ酸)の数を最大にすべく整列される。2
つの配列が与えられると、それらの相同をコンピュータ
で算定するためにアルゴリズムが利用可能である:例え
ばニードルハム(Needleham)およびヴァンシュ(Wunsc
h),J.Mol.Biol.,Vol.48,p.443〜453(1
970)、およびサンコフおよびクラスカルの上記文献
p.23〜29を参照されたい。また、このような比較を
行うための商業サービス、例えばインテリジェネティク
ス社(パロアルト,CA)を利用をすることもできる。
【0023】本発明はまた免疫応答に必要不可欠な種々
の細胞に対して広範囲の活性スペクトルを示す天然哺乳
類増殖因子(ポリペプチド)に関する。この種の因子の生
産方法および哺乳類のin vitro治療におけるそれらの使
用が提供される。このようなポリペプチドにはB細胞、
T細胞および肥満細胞刺激活性を示すことができる実質
的に純粋な哺乳動物因子が含まれる。
【0024】最初に種々のT細胞の上清から単離された
これらの因子には非還元条件で約20kdまたは15kdの
分子量を示す天然ポリペプチド、またはこのようなポリ
ペプチドの活性断片が含まれる。これらの因子は様々な
診断および治療目的(特定抗体の生産を含む)のために単
独でまたは他の化合物と共に使用される。本発明の好適
な態様は下記の式Iで表されるグルコシル化または非グ
ルコシル化ヒトIL−4タンパク質および突然変異タン
パク質である:
【0025】式 I X(His)−X(Lys)−X(Cys)−X(Asp)−X(Ile)−X(Thr)− X(Leu)−X(Gln)−X(Glu)−X(Ile)−X(Ile)−X(Lys)− X(Thr)−X(Leu)−X(Asn)−X(Ser)−X(Leu)−X(Thr)− X(Glu)−X(Gln)−X(Lys)−X(Thr)−X(Leu)−X(Cys)− X(Thr)−X(Glu)−X(Leu)−X(Thr)−X(Val)−X(Thr)− X(Asp)−X(Ile)−X(Phe)−X(Ala)−X(Ala)−X(Ser)− X(Lys)−X(Asn)−X(Thr)−X(Thr)−X(Glu)−X(Lys)− X(Glu)−X(Thr)−X(Phe)−X(Cys)−X(Arg)−X(Ala)− X(Ala)−X(Thr)−X(Val)−X(Leu)−X(Arg)−X(Gln)− X(Phe)−X(Tyr)−X(Ser)−X(His)−X(His)−X(Glu)− X(Lys)−X(Asp)−X(Thr)−X(Arg)−X(Cys)−X(Leu)− X(Gly)−X(Ala)−X(Thr)−X(Ala)−X(Gln)−X(Gln)− X(Phe)−X(His)−X(Arg)−X(His)−X(Lys)−X(Gln)− X(Leu)−X(Ile)−X(Arg)−X(Phe)−X(Leu)−X(Lys)− X(Arg)−X(Leu)−X(Asp)−X(Arg)−X(Asn)−X(Leu)− X(Trp)−X(Gly)−X(Leu)−X(Ala)−X(Gly)−X(Leu)− X(Asn)−X(Ser)−X(Cys)−X(Pro)−X(Val)−X(Lys)− X(Glu)−X(Ala)−X(Asn)−X(Gln)−X(Ser)−X(Thr)− X(Leu)−X(Glu)−X(Asn)−X(Phe)−X(Leu)−X(Glu)− X(Arg)−X(Leu)−X(Lys)−X(Thr)−X(Ile)−X(Met)− X(Arg)−X(Glu)−X(Lys)−X(Tyr)−X(Ser)−X(Lys)− X(Cys)−X(Ser)−X(Ser)
【0026】式中、X(Xaa)はアミノ酸Xaaと同義の
アミノ酸群を表す。1つの群に含まれる同義アミノ酸
は、その群のアミノ酸同士を置換してもその分子の生物
学的機能を保存するのに十分なほど類似した物理化学的
性質を持っている:グランサム(Grantham),Science,
ol.185,p.862〜864(1974)を参照された
い。また、アミノ酸の挿入および欠失が生物学的機能を
変えることなく上記配列においてなし得ることは明らか
であり、特に挿入または欠失が数個のアミノ酸(例えば
10個以下)を巻き込むにすぎず、しかも機能的なコン
ホメーションに重要なアミノ酸(例えばシスティン残基)
を除去または置換しない場合に、アミノ酸の挿入および
欠失が可能である:アンフィンセン(Anfinsen),“タン
パク質鎖の折りたたみを支配する原理”,Scince,Vo
l.181,p.223〜230(1973)を参照された
い。このような欠失および/または挿入によって生じる
タンパク質および突然変異タンパク質は本発明の範囲に
含まれる。式Iのタンパク質のアミノ酸残基が数字で表
される場合、その数字はいつでもタンパク質のN末端か
らのものである。
【0027】好ましくは、同義アミノ酸群は表1で定義
されるものである。より好ましくは、同義アミノ酸群は
表1のそれぞれの列の第2斜線の前に表示されるもので
あり、最も好ましくは同義アミノ酸群は表2のそれぞれ
の列の第1斜線の前に表示されるものである。
【0028】
【表1】 好適な同義アミノ 酸群 アミノ酸 同義アミノ酸群 Ser Ser,/Thr,Gly,Asn Arg Arg,/His,Lys,/Glu,Gln Leu Leu,Ile,Met,/Phe,/Val,Tyr Pro Pro,/Ala,/Thr,Gly Thr Thr,/Pro,Ser,Ala,Gly,His,Gln Ala Ala,/Pro,/Gly,Thr Val Val,/Met,Ile,/The,Phe,Leu,Val Gly Gly,/Ala,Thr,Pro,Ser Ile Ile,Met,Leu,/Phe,Val,/Ile,Tyr Phe Phe,/Met,Tyr,Ile,Leu,/Trp,Val Tyr Tyr,/Phe,/Trp,Met,Ile,Val,Leu, Cys Cys,Ser,/Thr His His,/Gln,Arg,/Lys,Glu,Thr Gln Gln,/Glu,His,/Lys,Asn,Thr,Arg Asn Asn,/Asp,/Ser,Gln Lys Lys,/Arg,/Glu,Gln,His Asp Asp,/Asn,/Glu Glu Glu,/Gln,Asp,Lys,Asn,His,Arg Met Met,Ile,Leu,/Phe,Val/
【0029】本発明は1個所または複数の個所にアミノ
酸置換(天然ヒトIL−4のアミノ酸と同義アミノ酸と
の置換)をもつ式Iのポリペプチドを包含する。“N重
置換”なる用語は、天然アミノ酸が少なくともN個所で
同義アミノ酸によって置換された式Iのポリペプチドの
サブセットを説明するために用いられる。従って、例え
ば式Iの1重置換ポリペプチド群は同義アミノ酸の好適
な群の場合に559種のポリペプチドから成り、同義ア
ミノ酸のより好適な群の場合に189種のポリペプチド
から成り、そして同義アミノ酸の最適な群の場合に56
種ポリペプチドから成る。これらの数字は天然鎖中のそ
れぞれの種類のアミノ酸の数にそのアミノ酸の同義アミ
ノ酸群の数を掛けたものを合計することによって得られ
た。好ましくは、ヒトIL−4ポリペプチドの群は式I
の10重置換ポリペプチドから成り、より好ましくは式
Iの3重置換ポリペプチドから成り、そして最も好まし
くは式Iの1重置換ポリペプチドから成り、とりわけ図
3に示す配列(配列番号3)をもつ天然ヒトIL−4ポ
リペプチドが含まれる。
【0030】同様に、式Iのペプチドに関する“N重挿
入”なる用語は、1〜N個のアミノ酸が式Iの配列中に
挿入されたポリペプチドを表すために用いられる。好ま
しくは、挿入アミノ酸は挿入の両側に位置するアミノ酸
の好適な同義アミノ酸群(表1)から選ばれ、より好まし
くはそれらは挿入の両側に位置するアミノ酸のより好適
な同義アミノ酸群(表2)から選ばれ、そして最も好まし
くはそれらは挿入の両側に位置するアミノ酸の最適な同
義アミノ酸群(表3)から選ばれる。従って、例えば1重
挿入ペプチド群の1つのサブグループはN末端X(His)
と隣接X(Gly)との間に挿入された。1個のアミノ酸を
含む。このサブグループのアミノ酸を規定する挿入は好
ましくはPro,Ala,Gly,Thr,Ser,Gln,Glu,Arg,H
isおよびLysよりなる群から選ばれ、より好ましくはそ
れらはGly,His,GlnおよびArgよりなる群から選ば
れ、そして最も好ましくはそれらHisおよびGlyよりな
る群から選ばれる。挿入は式Iのどの隣接アミノ酸の間
でも行うことができる。可能な挿入個所は128存在
し、しかも同一位置での多重挿入が可能であるので、式
Iの2重挿入ペプチドは16384サブグループのペプ
チドをもたらし、それぞれのサブグループの大きさは挿
入の両側に位置するアミノ酸の同義アミノ酸群の大きさ
に関係している。
【0031】式Iのポリペプチドに関する“N重欠失”
なる用語は、1〜N個のアミノ酸が式Iの配列から欠失
されたペプチド群を表すために用いられる。従って、式
Iの1重欠失ポリペプチド群は129サブグループのポ
リペプチドから成り、それぞれのポリペプチドは128
個のアミノ酸から成る鎖長(128−mer)を有する。そ
れぞれのサブグループは好適な、より好適な、および最
適な同義アミノ酸群によって定められるすべての128
−merを包含する。
【0032】本発明の好適な態様はさらに好適な、より
好適な、および最適な同義アミノ酸群のための式Iのポ
リペプチドをコードすることができるヌクレオチド配列
または事実上相同なヌクレオチド配列を含む。より好ま
しくは、上記ヌクレオチド配列は好適な、より好適な、
および最適な同義アミノ酸群のための式Iポリペプチド
をコードすることができる。
【0033】特に、本発明は天然ヒトIL−4(そのア
ミノ酸配列は図3(配列番号3)に示す)、およびそれ
をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。
【0034】本明細書の全体を通して、アミノ酸、ヌク
レオチド、制限エンドヌクレアーゼなどを示すために標
準的な略号が用いられる:例えばコーン(Cohn),“α−
アミノ酸の命名法および略号”, Methods in Enzym
ology,Vol.106,p.3〜17(1984);ウッド(Wo
od)ら, Bioche mistry:A Problems Approach,第2
版,(ベンジャミン,メンロパーク,(1981);およびロ
バーツ(Roberts),“制限エンドヌクレアーゼ一覧集”,
Methods in Enzymology,Vol.68,p.27〜40
(1979)を参照されたい。
【0035】本発明は医学および/または獣医学疾患を
治療するための免疫調節剤の応用に関連した諸問題に向
けられる。とりわけ、本発明は単独で使用するとき有益
な効力をもつ化合物、または他のリンフォカインおよび
免疫系媒介物と協力して有益な効力を生ずることができ
る化合物を提供する。
【0036】本発明の好適な態様は今や添付の図面(図
1〜40)を参照することにより説明されるであろう。
【0037】図1はネズミIL−4を発現するベクター
pcD−2A−E3の挿入物のヌクレオチド配列および推
定上のアミノ酸配列を示す(配列番号1)。
【0038】図2はヒトIL−4を発現するベクターpc
D−125の挿入物のヌクレオチド配列および推定上の
アミノ酸配列を示す(配列番号2)。
【0039】図3はpcD−125でトランスフェクショ
ンされたCOS7サル細胞により発現・分泌された精製
天然ヒトIL−4のアミノ酸配列を示す(配列番号
3)。
【0040】図4はベクターpcD−2A−E3の地図で
あり、その挿入物はネズミIL−4をコードする。
【0041】図5はベクターpcD−2A−E3の挿入物
の制限エンドヌクレアーゼ切断地図である。
【0042】図6はベクターpcD−46の地図であり、
その挿入物はヒトIL−4をコードする。
【0043】図7はベクターpcD−46の挿入物の制限
エンドヌクレアーゼ切断地図である。
【0044】図8はpcD−2A−E3でトランスフェク
ションされたCOS7細胞からの1つの(曲線1)を含む
種々の培養上清の(希釈範囲にわたる)相対的なTCGF
活性を示す。
【0045】図9はpcD−2A−E3でトランスフェク
ションされたCOS7細胞からの1つの(曲線1)を含む
種々の培養上清の(希釈範囲にわたる)相対的なMCGF
活性を示す。
【0046】図10はpcD−2A−E3でトランスフェ
クションされたCOS7細胞(曲線1)、C1.Ly1+ 2
-/9細胞(曲線2)、および疑似トランスフェクション
されたCOS7細胞(曲線3)からの表示量の上清によっ
て生じたIa誘導の相対度を示す。
【0047】図11はpcD−2A−E3でトランスフェ
クションされたCOS7細胞およびT細胞を除いたマウ
ス脾細胞の種々の対照からの上清によるIgEおよびIg
1誘導の度合を示す。
【0048】図12は因子依存性ヒトヘルパーT細胞株
JL−EBVに対する比色定量増殖検定により測定され
た。数種のpcD−125トランスフェクション上清およ
び対照のTCGF活性を示す。
【0049】図13はPHA刺激末梢血リンパ球に対す
る比色定量増殖検定により測定された、pcD−125ト
ランスフェクション上清および対照のTCGF活性を示
す。
【0050】図14はPHA刺激末梢血リンパ球による
トリチウム化チミジン取り込みにより測定されたpcD−
125トランスフェクション上清および対照のTCGF
活性を示す。
【0051】図15はFc−イプシロン受容体を蛍光標
識した刺激ヒト扁桃腺B細胞の対照集団についての細胞
相対数対蛍光強度のヒストグラムである。
【0052】図16はpcD−125でトランスフェクシ
ョンされたCOS7細胞からの0.1%上清より成る培
地にさらした刺激ヒト扁桃腺B細胞集団(そのFc−イプ
シロン受容体を蛍光標識したもの)についての細胞相対
数対蛍光強度のヒストグラムである。
【0053】図17はpcD−125でトランスフェクシ
ョンされたCOS7細胞からの1%上清より成る培地に
さらした刺激ヒト扁桃腺B細胞集団(そのFc−イプシロ
ン受容体を蛍光標識したもの)についての細胞相対数対
蛍光強度のヒストグラムである。
【0054】図18はpcD−125でトランスフェクシ
ョンされたCOS7細胞からの10%上清より成る培地
にさらした刺激ヒト扁桃腺B細胞集団(そのFc−イプシ
ロン受容体を蛍光標識したもの)についての細胞相対数
対蛍光強度のヒストグラムである。
【0055】図19は天然または突然変異IL−4を大
腸菌内で発現させるのに有用な合成ヒトIL−4遺伝子
のヌクレオチド配列を示す(配列番号4)。
【0056】図20はプラスミドpUC18に挿入され
た合成ヒトIL−4遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ切
断地図を示す。
【0057】図21−26はそれぞれ合成ヒトIL−4
遺伝子を構築するために使用される2本鎖DNAフラグ
メント1A/B〜6A/Bを示す(配列番号5〜1
6)。
【0058】図27は大腸菌発現ベクターTAC−RB
S中のイニシエーターATGコドンに隣接するヌクレオ
チド配列を示す。その配列はEcoRI制限部位から始ま
り、HindIII部位で終わる。16SリボソームRN
Aの3'末端に相補性を示すリボソーム結合配列(RB
S)およびATGイニシエーターコドンには下線が施さ
れている。
【0059】図28は裸リンパ球症候群の患者から誘導
される細胞集団についての細胞相対数対蛍光強度のヒス
トグラムである。これらの細胞は蛍光標識抗DRモノク
ローナル抗体で染色した。
【0060】図29はC−4カラムでの逆相HPLCに
よるヒトIL−4の最終精製工程における215nm吸収
プロフィールである。
【0061】図30はヒトIL−4cDNAを含むプラ
スミドpEBV−178の作製地図である。
【0062】図31はプラスミドTRPC11の作製地
図である。
【0063】図32はプラスミドpMF−アルファ8の
作製地図である。
【0064】図33は天然ヒトIL−4および種々のそ
の突然変異タンパク質を発現する酵母培養物からの数種
のトランスフェクション上清のTCGF活性を示す。
【0065】図34は因子依存性細胞株:MC/9肥満
細胞(1A)、DX−2肥満細胞(1B)、NFS−60細
胞(1C)およびHT2 T細胞(1D)の増殖曲線を示
す。5×103個の細胞をいろいろな濃度のC1.1上清
(中実の円)IL−2R (中実の正方形)、IL−3R (中
空の円)、GM−CSFR (中空の三角形)、IFN−γR
(中実の三角形)、またはP388D1上清(中空のひし
形)の存在下に培養した。MC/9細胞(1A)はまたい
ろいろな濃度の精製IL−3(中実の円)、または200
単位のIL−2R (中実の正方形)、GM−CSFR (中
空の三角形)、IFN−γR (中実の三角形)またはP3
88D1上清(中空のひし形)と混合したIL−3R の存
在下で培養した。増殖因子活性は比色定量検定により2
4時間後に測定した。570nm(基準630nm)での吸光
度はダイナテク・マイクロ・エリサ・リーダーを使って
測定した。
【0066】図35はC1.1上清のFPLCカチオン
交換クロマトグラフィーを示す。濃縮上清7ml(タンパ
ク質35mg)は50nMリン酸Na、1mM EDTA、pH
7.0中で透析し(7.8mS/cm)、同じ緩衝液(緩衝液
A)で平衡化したファーマシア・モノSカラム(0.5×
5cm)に加えた。緩衝液B=A+1M NaCl。溶出条
件:流速0.5ml/分;0.5ml/分画;40分で0〜40
%B,10分で40〜100%B。各分画のアリコート
はNFS−60(IL−3,中実の円)、HT2(TCG
F,中空の円)およびMC/9(MCGF)細胞に対する増
殖活性について検定した。MC/9応答は示されていな
い;矢印はMC/9増殖レベルがC1.1上清のそれらに
到達した位置を示す。
【0067】図36はIL−3を除去したC1.1上清
の逆相C8クロマトグラフィーを示す。モノSカラムに
3回通過させた0.1%TFA中の上清(分画59〜6
1,図35)100μlはファーマシアC8逆相カラム
(0.5×2cm)に装填した。緩衝液A=H2O中の0.1
%TFA;緩衝液B=アセトニトリル中の0.1%TF
A。溶出条件=0.5ml/分;0.5ml/分画;40分で0
〜25%B,50分で25〜60%B,4分で60〜10
0%B。各分画のアリコートはNFS−60(IL−3,
中実の円)、HT2(TCGF,中空の円)およびMC/9
細胞(MCGF,中実の三角形)に対する増殖活性につい
て検定した。矢印は各分画に飽和レベルのIL−3R
添加後にC1.1上清と類似のMC/9増殖レベルを生
じた、ピークTCGF活性を含む分画を示す。
【0068】図37はGK15−1ネズミT細胞上清の
逆相C8クロマトグラフィーを示す。0.1%TFA中
の濃縮GK15−1上清2mg(0.5ml)はファーマシア
C8逆相カラムに加え、上記のように溶出した。各分画
のアリコートはHT2細胞(中空の円)に対するTCGF
活性について検定した。矢印はネズミIL−2R 同一条
件で溶出した位置を示す。挿入:同一プレートで直接比
較されたC1.1(中実の円)およびIL−2R (中実の正
方形)およびGK15−1上清(中空の円)のTCGF活
性の滴定。
【0069】図38は逆相カラムからの部分精製因子
(RP因子)のMCGFおよびTCGF活性を示す。増殖
は24時間の培養期間の経過後の[3H]−チミジン取り
込みにより測定した。MC/9肥満細胞およびHT2
T細胞はいろいろな濃度のC1.1上清(中実の円)、I
L−3R (中空の円)、IL−2R (中空の三角形)、RP
因子(中空の正方形)および200単位のIL−3R の存
在下でのRP因子の希釈物(中実の正方形)または飽和レ
ベルのRP因子の存在下でのIL−2の希釈物(中実の
三角形)と共に培養した。
【0070】図39はC1.1上清のクロマトフォーカ
シングを示す。25nMビス−トリス、pH7.1中の上
清1.5ml(35mg)はファーマシア・モノPカラム(0.
5×20cm)に加え、ポリバッファー74(1:10)pH
4.0を用いて流速0.5ml/分、1ml/分画で溶出し
た。各分画のアリコートはNFS−60(IL−3,中空
の円)、HT2(TCGF,中実の円)およびMC/9(M
CGF,図示せず,但しピークMCGF活性は矢印で示
す)に対する増殖活性について検定した。TCGFピー
ク(分画12,pI=6.2)は最小IL−3活性と一致
し、MCGF増殖レベルは矢印で示したところで最も高
い。
【0071】図40はC1.1上清および分精製MCG
F/TCGFのSDS−PAGEを示す。 A) 非分画化上清の非還元SDS−PAGE。50mM
DTTでの先行還元(60℃で5分間)はTCGFピー
クをわずかに高分子量(21kdおよび16kd)へ移し、こ
れは活性の急激な消失を伴う。 B) カチオン交換クロマトグラフィーからのピークM
CGF/TCGF分画(分画59〜61,図36)の非還
元SDS−PAGE。50mM DTTでの先行還元(6
0℃で5分間)はMCGFおよびTCGFピークをわず
かに高分子量(21kdおよび16kd)へ移し、これは活性
の急激な消失を伴う。矢印は飽和量のIL−3の添加に
よりMCGF活性が上清レベルにまで高まる分画のみを
示す:IL−3(中空の円)、TCGF(中実の円)、MC
GF(中空の三角形)。
【0072】本発明はIL−4活性を示し且つ標準的な
タンパク質工学技術を用いてここに記載のIL−4ポリ
ペプチドから誘導し得るグリコシル化または非グリコシ
ル化哺乳動物ポリペプチドを包含する。本発明はまた本
発明ポリペプチドをコードする核酸配列を含み、その核
酸配列は本発明のcDNAクローンと事実上相同であ
る。最後に、本発明はここに記載のヌクレオチド配列を
使用する本発明のグリコシル化または非グリコシル化ポ
リペプチドの製法、ならびに本発明のポリペプチドの使
用方法を包含する。
【0073】本発明のポリペプチドおよび核酸を製造、
使用および同定する技術は以下で一般的に説明される。
その後、一般技術を特定の細胞型、ベクター、試薬など
と共に使用するいくつかの特定実施例が提供される。ま
ず初めに、天然源からのそれらの単離を簡潔に説明する
であろう。
【0074】これらのポリペプチドは容易に入手しうる
細胞源の上清から見かけ上均一になるまで精製すること
ができ、こうして種々の治療用途または他の用途を可能
にすべく純粋な形で経済的に製造することができる。
【0075】これらのポリペプチドはB細胞−、T細胞
−および肥満細胞−刺激活性を示すポリペプチドを含む
ことにより特徴づけられる。ある種の天然型ポリペプチ
ドは非還元条件下で約20kdおよび15kd、そして還元
条件で約21kdおよび16kdのSDS−PAGE上での
分子量を示す。実質的に純粋な形の本発明のポリペプチ
ドを含む組成物はクロマトフォーカシングで約6.2の
等電点(pI)を示す。この増殖因子は極めて低濃度(例え
ば1ng/ml以下)で顕著な活性を示し、非常に効力のあ
る物質である。このポリペプチドはカチオン交換クロマ
トグラフィーまたは逆相カラムからの特定溶出条件を使
用することにより、自然界でT細胞によって生産される
タンパク質(例えばIL−2,IL−3、GM−CSFお
よびIFN−γ)およびホルモン類から区別することが
できる。
【0076】ネズミの場合では本発明のいくつかのポリ
ペプチドはIL−3依存性肥満細胞株のようなある種の
細胞を低レベルで増殖させるにすぎないが、第2因子
(例えばIL−3)の存在下ではこの種の細胞(例えば肥
満細胞)の増殖を相乗的に高める。このポリペプチドは
数種のT細胞株の増殖を刺激するが、一般に精製IL−
2よりは増殖の度合が劣る。またこの種のポリペプチド
は休止B細胞上でのIa発現を誘導し、またBSF−1
と同様にB細胞によるIgGおよびIgE発現を高めるこ
とができる。これらの活性は多数の性化学的分画化にも
かかわらず分画不能である。しかしながら大部分の活性
は還元後、例えばSDSの存在下で破壊される。
【0077】これらの因子はいろいろな方法で多数の天
然源から得られる1つの適当な源はこのようなポリペプ
チドを生産する多数のT細胞株のうちのいずれかであ
る。1つのこのようなT細胞株はC57GL6マウス
[ネーブル(Nable)ら、 Proc.Natl.A cad.Sci.
USA,78:1157〜1161(1981)を参照]か
ら誘導され、この細胞株は修飾補充DME[ネーブル
ら、 Cell,23:19〜28(1982)を参照]中に維
持される。初めにC1.Ly1+-/9と呼ばれたこの細
胞株はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
に受託番号CRL8179として寄託された。これらの
ポリペプチドの他の適当な細胞源には、ヒト抹消血リン
パ球およびよく知られたT細胞源(例えば扁桃腺、脾臓
など)のいずれかのような、そのポリペプチドに対する
種々の抗体を分泌するほとんど全ての細胞が含まれる。
【0078】このような細胞源からの上清または、いく
つかの場合には破壊細胞からの液体は、本発明タンパク
質を分離するために多種多様の公知精製法に付される。
好ましくは、精製法は高い純度を確保するために組合せ
て使用される。一般的に、精製はゲル濾過クロマトグラ
フィー、SPカチオン交換クロマトグラフィー、逆相ク
ロマトグラフィー、官能基特異的クロマトグラフィー
(例えばヘパリンセファロースによるクロマトグラフィ
ー)、または有効なタンパク質の分画化をもたらす他の
慣用分離法を使用するだろう。高圧液体クロマトグラフ
ィー(HPLC)、等電点フォーカシングおよびSDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動も使用することができ
る。
【0079】例えば、適当な細胞株からの上清は初めに
強カチオン交換クロマトグラフィーにより分画化され
る。一般に、本発明のポリペプチドはカラムに結合され
たままであり、一方負荷タンパク質の約98%は通り抜
ける。残存する結合タンパク質は塩勾配を用いて溶離し
うる。本発明の1つの態様では、塩化ナトリウム勾配が
約0.19Mで本発明ポリペプチドを遊離させた。この
分画化を2回以上(主に残留IL−3を除くために)繰り
返すと、約95%以上の純度が得られた。その後、この
物質は順次ヘパリンセファロースおよび逆相(C4また
はC8)クロマトグラフィーで分画化される。後者の場
合に、これらのポリペプチドは42%アセトニトリルで
溶離した。プールしたこれらの分画は本発明ポリペプチ
ドを極めて高純度で、本質的に均一(銀染色SDS−P
AGE上で約20kdの単一バンド)に含有する。この精
製物質はそれが天然形で存在するときよりも少なくとも
65000倍純粋である。
【0080】これらのポリペプチドは抗体生産用の抗原
として使用され、続いてその抗体は抗イディオタイプ抗
体生産用の抗原として使用される。ポリクローナル抗体
またはモノクローナル抗体が慣用方法に従って作られ
る。これらのポリペプチドまたはその断片(一般に断片
は少なくとも約15個のアミノ酸をもつ)は単独で使用
しうるが、好ましくは免疫系を活性化するアジュバンド
または抗原に結合もしくは架橋される。血清アルブミ
ン、キーホール・リンペット(Keyhole Limpet)、ヘ
モシアニン、グロブリンなどの種々の抗原が使用され
る。アジュバンドをポリペプチドに架橋させるために
は、グルタルアルデヒド、マレイミド安息香酸、ジアゾ
安息香酸のような種々の技法が利用される。アジュバン
ドにはフロインドアジュバンド、水酸化アルミニウムな
どが含まれる。通常の量の抗原は適当な宿主に注射さ
れ、その後1回またはそれ以上の2次免疫注射が2〜4
週間おきに行われる。モノクローナル抗体を使用する場
合、一般にマウスに1次および2次免疫注射を行い、脾
臓を摘出し、その後その脾細胞を慣用技法に従って適当
な融合パートナーと融合させる。例えばガルフレ(Galf
re)ら,Nature,266:550(1977);ケネット(Ke
nnett)ら、Current Topics in Microbiolog y an
dImmunology,81:77(1978);および米国特許第
4381292号、同第4363799号を参照された
い。しかしながら、特殊な目的のために他の哺乳類(例
えば霊長目動物)も使用され、例えばヒトFc鎖を持つ抗
体を生産するためにヒトが使用される。
【0081】ポリペプチドはそのポリペプチドの診断に
おいて単独で、または抗体と組合せて使用される。診断
アッセイで使用するために、いずれか一方または両方が
標識されるか、あるいは標識されない。これらのポリペ
プチドまたは抗体を直接または間接に種々の標識(例え
ば酵素、放射性核種、蛍光体、基質、補酵素、磁性粒子
のような粒子など)に結合させることを含めた多くの診
断アッセイが文献中に記載されている。これらのアッセ
イの例として、例えば、米国特許第3817837号、
同第3850752号、同第4174384号、同第4
177437号および同第4374925号を参照され
たい。
【0082】種々のアッセイは任意に均質イムノアッセ
イと不均質イムノアッセイに分けられ、その区分はポリ
ペプチドとその抗体との複合体を特異的結合対の非結合
員子から分離しなければならないかどうかに基づいてい
る。種々のアッセイはEI、ELISA、RIA、均質
EIA、ドット−ブロット、ウエスターンなどと呼ばれ
ている。
【0083】これらのポリペプチドに対する抗体は、こ
れらのポリペプチドのエピトープ部位と競合するエピト
ープ部位をもつ競合的抗原として役立ちうる抗イディオ
タイプを作るために、抗原として単独で使用される。従
って、これらの抗イディオタイプは腫瘍抑制剤として、
本発明ポリペプチドの代替物として、または本発明ポリ
ペプチドの拮抗物質として使用することができる。
【0084】これらのポリペプチドは天然源から誘導さ
れる自然界に存在するポリペプチド、ならびに結合特異
性およびB細胞または肥満細胞刺激活性のような生理学
的特性を共有する自然界に存在しないポリペプチドの一
群を形成する。種または源の間の小さな差異は、当分野
で習熟した者には明らかなように、精製プロトコルにお
いて何らかの変更を必要とするかもしれない。またこれ
らのポリペプチドはそのアミノ酸配列を決定し、その後
公知技術に従ってポリペプチド断片を合成することがで
きる。例えば、バラニー(Barany)およびメリーフィー
ルド(Merrifield)Solid−Phase Peptide Synthe
sis,“ペプチド、分析・合成・生物学”,特別なヘプチ
ド合成法、パートA,Vol.2,グロス(Gross)およびメ
ーレンホッファー(Merenhofer)編集、アカデミックプ
レス,ニューヨーク,1980,p.1〜284を参照され
たい。
【0085】本発明ポリペプチドはいろいろな方法で有
用性を見出せるであろう。例えば、これらのポリペプチ
ドは培養下で又はin vivoでT細胞および肥満細胞の増
殖を誘発することができる。先に述べたように、肥満細
胞はヘパリン、ヒスタミン、プロスタグランジンおよび
他の生理学的に重要な物質の大切な供給源である。同様
に、この増殖因子はB細胞およびT細胞、特に免疫系に
おいて有用なタンパク質(例えばリンフォカインおよび
免疫グロブリン)を分泌することが知られているもの、
を刺激するために使用される。一般に、この増殖因子は
細胞培養物に添加される培地中に混入されるであろう。
その因子の適当な濃度は細胞株の型により変化しうる
が、一般に約0.1μg/ml〜約1mg/ml、より好ましく
は約1μg/ml〜約10μg/mlで培地中に存在するであ
ろう。本発明増殖因子の使用は、所望の細胞株を維持す
るための支持細胞(feeder cell)の必要性を排除するこ
とができ、その結果その細胞株からの生産物の純度を実
質的に高めることができる。
【0086】また、本発明のポリペプチドは各種の免疫
不全症を治療するために、あるいは自然の免疫応答を増
強させるために、in vivoでの用途を見出せるであろ
う。例えば、この種のポリペプチドはB細胞、T細胞お
よび肥満細胞の成熟および/または増殖を刺激し、それ
により感染症に対する動物の感受性を低下させることに
より、感染症の治療または防御に役立つであろう。
【0087】I.IL−4 cDNAの de novo調製 cDNAのde novo調製およびクローニング、ならびにc
DNAライブラリーの構築のために現在では種々の方法
がある。たとえば、最近の総説が下記に示されている。
ドハーティ、“cDNAのクローニングおよび発現”,ゴ
ッテスマン編,分子細胞遺伝学,10章(ジョン・ワイリ
イ・アンド・サンズ・ニョーヨーク,1985);および
ブランディスら,“cDNAライブラリーの調製および特
異的遺伝子配列の検出”,セトロウら編、遺伝子工学,8
巻,299−316頁(プレナム・プレス,ニョーヨーク,
1986)。
【0088】たとえば、目的活性を示すポリペプチドを
産生する細胞(たとえば形質転換されていないヒトT細
胞源)から総mRNAを抽出する(たとえばエス・バーガ
ーら,バイオケミストリー18:5143−5149[1
979])。二重鎖DNAはこの総mRNAから、プライ
マー開始により逆転写して(アイ・ベルメ・ビオヘミ・
ビオフィジ・アクタ(Biochem.Biophys.A cta),47
3巻,1−38頁[1977])、まず各mRNA配列の相
補体を作成し、次いで第2鎖合成を開始することにより
(エッチ・ランドら,ヌクレイック・アシッヅ・リサ
(Nucl eic AcidsRes.),9:2251−2266[1
981])構築される。次いでcDNAを適切なプラスミ
ドまたはバクテリオファージベクターに(エフ・ルージ
ョンら,ヌクレイック・アシッヅ・リサ (Nucleic A
cids Res.),2,2365−2378[1975]また
はジー・シエラーら,ディベ・バイオロ(Dev.Biol.)
86,438−447[1981])、相補的ホモポリマー
テイルを介して(エー・エフストラチアジスら,セル,1
0,571−585[1977])または適宜な制限部位を
含むリンカーセグメントにより作られた粘着末端を介し
て(マニアチスら,モレ キュラー・クローニング:実験室
の手引,コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー,ニョーヨーク,1982)結合させ、次いで適切な宿
主を形質転換することによってクローニングしうる。
(一般的にはエー・エフストラチアジスおよびエル・ビ
ラーコルマロフ,“二重鎖cDNAのクローニング”,ジ
ェイ・セトロウおよびエー・ホレンダー(編者),遺伝子
工学,1巻,プレナム・パブリッシング社,ニョーヨーク,
米国[1982]を参照されたい。)
【0089】目的とするポリペプチドをコードする好ま
しいmRNA源はそれらの上層液がB細胞、T細胞およ
び/またはマスト細胞に対する刺激活性、あるいは本発
明のポリペプチドに付随する他の活性を含む細胞であ
る。このような系列の1つはマウスT細胞系列C1.Ly
+-/9(A.T.C.C.受理番号CRL8179)で
ある(ジー・ナーベルら,ネイチャー291:332−3
34(1981)。一般に、適切なT細胞を各種の供給
源、たとえば哺乳動物(たとえばヒト)、脾臓、扁桃腺お
よび末梢血から得ることができる。T細胞クローン、た
とえば末梢血Tリンパ球から単離されたものも使用でき
る(免疫学における研究論文,編者,エッチ・フォン・デ
ーマーおよびブイ・ハーフ;D章:“ヒトT細胞クロー
ン”,8巻,243−333;エルスフィール・サイエン
ス・パブリッシャーズ,ニョーヨーク,[1985])。
【0090】これらの細胞によりIL−4をコードしう
るmRNAが産生されることは、抽出されたmRNAをゼ
ノプス・レビス(Xenopus laevis)の卵母細胞にマイク
ロインジェクションすることにより確認できる。このマ
イクロインジェクション法はのちにより詳細に記述さ
れ、一般的には下記に示されている。コールマンら、
“ゼノプス・レビスの卵母細胞からの蛋白質の排出”
,17巻,517−526頁(1979);およびマニア
チスら、分子クローニ ング:実験室の手引き,350−3
52頁(コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー,ニューヨーク,1982)。
【0091】目的とするIL−4をコードするmRNA
が総mRNAのうちのきわめて小さな画分をなす場合
は、目的とするcDNAクローンを検出するためのスク
リーニング法を実質的なものにするために画分濃度を高
める工程が必要になるであろう。この種の方法は当技術
分野で標準的であり、後記の具体的ならびに幾つかの報
文および参考文献に示されている。たとえばマニアチス
ら、225〜228頁,前掲;サグズら,プロシ・ナショ
ナル・アカデ・サイ (Proc.Natl.Acad.Sci.),
78巻,6613−6617頁(1981);パーネスら、
プロシ・ナショナル・アカデ・サイ (Proc .Natl.
Acad.Sci.),78巻,2253−2257頁(198
1);デイビスら,プロシ・ナショナル・アカデ・サイ
(Proc.Natl.Acad.Sci.),81巻,2194−2
198頁(1984)。
【0092】IL−4 cDNAをde novo製造するため
の好ましい方法はオカヤマおよびバーグ(モレ・セル・
バイオロ(Mol.Cell.Biol.),2巻,161−170
頁(1982);および3巻,280−289頁(1983)
により開発された、pcD発現系におけるcDNAの機能
的発現に依存し、これはファルマシア(ニュージャージ
ー州,ビスカタウェイ)から入手できる。pcD発現ベクタ
ーはSV40初期プロモーター、後期スプライシングジ
ャンクション、および複製起点を含む。このベクターは
pcDプラスミドの複製に関するT抗原を提供するCOS
7サル細胞においてcDNA挿入物の発現を可能にす
る。cDNAライブラリーのスクリーニングにはプラス
ミドDNAのプールをDEAE−デキストランの使用に
よりCOS7細胞へトランスフェクションすることが含
まれる。リンフォカイン(特にIL−4s)は分泌蛋白質
であるので、トランスフェクションした細胞から得た上
層液を数日間インキュベートしたのち生物活性につきア
ッセイすることができる。陽性のプールをさらに分割し
て、トランスフェクション後に生物活性を与える単一c
DNAクローンを固定する。
【0093】要約するとオカヤマおよびバーグの発現ベ
クターは下記の構成をもつ。SV40初期プロモーター
領域を含むKpnL I消化pBR322プラスミドの突出
鎖に結合したポリデオキシチミジル酸(オリゴdT)テイ
ルにポリアデニル化mRNAがアニールしている。すな
わちベクター全体がcDNA合成のプライマーとして作
用する。cDNA合成後に3'−ポリデオキシシチジレー
ト(オリゴdC)テイルを結合させ、次いでHindIII消
化し、これによりオリゴdCテイルのうち1個が結合し
たSV40 DNAの断片が切り取られる(唯一のでHin
dIII部位において)。SV40初期プロモーターは無
傷のまま残り、挿入物の偶発性でHindIII部位が受
ける影響は最小である(ハイブリッドcDNA/RNAは
HindIII消化に対して抵抗性であるため)。別個に構
成された、3'−ポリグアニジル化(オリゴdG)テイルを
もつHindIII断片を、HindIII消化により残され
た粘着末端にアニールする。このベクターを環化し、大
腸菌RNアーゼH、DNAポリメラーゼIおよびDNA
リガーゼで処理し、RNA鎖をDNAで置換する。これ
らのベクターを大腸菌にクローニングして、cDNAラ
イブラリーを形成する。SV40由来の要素はベクター
を真核細胞においても原核細胞、特に哺乳動物細胞、た
とえばCOS7サル細胞またはチャイニーズ・ハムスタ
ー卵巣(CHO)細胞においても発現可能にする。
【0094】オカヤマ/バーグプラスミドベクターにお
けるcDNAライブラリーが完成すると、cDNAクロー
ンを採取し、ランダムプールを目的のcDNAの存在に
ついて、標準的方法、たとえばハイブリッド選択、発現
生成物における抗原決定因子の検出、および/または機
能アッセイにより調べる。次いで陽性のプールを、誘導
されたT細胞系列から得たcDNAでプローブ検出す
る。次いで陽性のプローブ検出プールを個々のクローン
に分け、さらに適切な宿主(たとえば哺乳動物培養細胞)
へトランスフェクションし、宿主上層液を活性につきア
ッセイすることにより試験する。
【0095】II.本発明cDNAから誘導されたハイ
ブリダイゼーションプローブによるIL−4 cDNA
の調製 ここに開示されたcDNAをプローブとして使用し、I
L−4コード化ヌクレオチドの新たな単離およびクロー
ニングの代わりとして異なる細胞型における相同配列を
同定することができる。標準法が用いられる。たとえば
ベルツら,“フィルターハイブリダイゼーション法によ
るマルチジーン ファミリーの単離および相同体の決
定”,メソッズ・イン・エンザイモロジー,100巻,2
66−285頁(1983);およびカラハンら,“マウス
乳腺腫瘍ウイルスゲノムに関連するヒトDNA配列の検
出およびクローニング”プロシ・ナショナル・アカデ・
サイ.,(Proc.Natl.Acad.Sci.),79巻,550
3−5507頁(1982)。基本的には本発明のcDN
Aを用いて、IL−4産生が推定される細胞型のゲノム
またはcDNAライブラリー(同様に標準法により構成)
を低いハイブリダイゼーションストリンジェンシーにお
いてスクリーニングするためのプローブを構築する(標
準法による;たとえばマニアチスら,前掲文献を参照され
たい)。標準スクリーニング法を用いる。たとえばグリ
ュンシュタインら,プロシ・ナショナル・アカデ・サ
イ.,(Proc. Natl.Acad.Sci.),72巻,3961
−3965頁(1975);またはベントンら,サイエン
,196巻,180−183頁(1977)。
【0096】後により詳細に記述するように、ヒトIL
−4をネズミIL−4プローブにより単離した。後述の
分析によりヒトcDNAマウスcDNAの選ばれた領域間
に約70%の相同性が示された。マウスとヒトの進化の
差を仮定すると、大部分(すべてではなくても)哺乳動物
IL−4遺伝子を本発明のcDNA一種または2種以上
から構成されたプローブにより検出しうると考えられ
る。ウイルソンら,“生化学的進化”,アナ・レビ・バイ
オケミ(Ann.Rev.Biochem.),46巻,573−63
9頁(1977);キムラ,“分子進化の中性理論”,11
章,ナイおよびケーン編 遺伝子および蛋白質の進化(サ
イナウエル・アソシエーツ,マサチュセッツ州,サンダー
ランド,1983)。
【0097】III.蛋白質工学による突然 変異体IL
−4s の調製 天然蛋白質について核酸配列および/またはアミノ酸配
列が求められると、天然配列において実質上いかなる突
然変異をも得るために各種方法を用いることができる。
ショートルはサイエンス,229巻,1193−1201
頁(1985)に、本発明に適用できる核酸突然変異誘発
法につき概説している。好ましくは天然IL−4s の突
然変異体、すなわちIL−4ムテイン(mutein)が部位特
異性オリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発、たとえば
ゾラーおよびスミス,メソッズ・イン・エンザイモ ロジ
,100巻468−500頁(1983);マークら,米
国特許第4,518,584号明細書,“ヒト組換インタ
ーロイキン−2ムテイン”により,あるいはいわゆる
“カセット”突然変異誘発、ウェルズら,ジーン,34
巻,315−323頁(1985);およびエステルら,
イエンス,233巻,659−663頁(1986)により
得られる。以下の節ではエステルら(上記)ガムテインの
識別に用いた表記法に従い、一般化する。たとえば“ヒ
トIL−4ムテインLeu82”(または天然蛋白質が状況
から理解される場合は簡単に“Leu82”)はそのアミノ
酸配列がN末端に関して82の位置以外は天然蛋白質の
ものと等しいポリペプチドを示す。この位置において、
PheがLeuにより置換されている。2以上の置換も同様
に指示できる。たとえば位置82のPheがLeuにより、
位置111のAsnがAspにより置換されているムテイン
はヒトIL−4ムテイン(Leu82,Asp111)と呼ばれる。
欠失は“△'s”により示される。たとえば位置71のG
lnを欠如するムテインはヒトIL−4ムテイン△71と呼
ばれる。挿入は“IS(Xaa)"により示される。たとえ
ば位置71のGlnの後ろにLeuが挿入されたムテインは
ヒトIL−4ムテインIS71(Leu)と呼ばれる。従って
ヒトIL−4ムテイン(Ser13,△71,IS94(Gly))は位
置13のThrをSerによって交換し、位置71のGlnを
欠失させ、かつ位置94のAlaの直後にGlyを挿入する
ことにより修飾された天然ヒトIL−4配列を表す。多
数のアミノ酸を同一部位に挿入したものはISi(Xaa1
−Xaa2−Xaa3−・・・)により示され、ここでXaa1
Xaa2−Xaa3−・・・は位置iの後ろに挿入された配列
である。N末端追加は上部添字“0”によって示され
(たとえばIS0(Xaa))、たとえばアミノ酸6−10の
欠失は△6-10としてまたは(△6,△7,△8,△9,△10)とし
て示される。
【0098】きわめて好ましくは、ヒトIL−4ムテイ
ンを与えるカセット突然変異が採用される。後により詳
細に記述するように、遺伝子に沿ってほぼ均一な間隔を
置いた唯一の制限部位の配列を含む合成ヒトIL−4遺
伝子が構築された。制限部位の唯一性は遺伝子が適宜な
ベクターに挿入された際に保持されなければならず、こ
れにより遺伝子の各部分を適宜切除して、目的とするム
テインをコードする合成オリゴヌクレオチド(すなわち
“カセット”)と置換することができる。唯一の制限部
位の数および分布を決定するためには、(1)発現ベクタ
ー中の既存の制限部位、(2)種特異性コドンまたは属特
異性コドンのいずれを使用したいか、ならびに(3)唯一
の制限部位間の各部分の合成および/または配列決定の
簡便さおよび信頼性を含む幾つかの因子を考慮する必要
がある。
【0099】IV.IL−4活性についての生物学的特
性およびアッセイ 本発明のヒトIL−4を生物活性および/または示され
た具体例との相同性に関して定める。本発明のヒトIL
−4s は示された天然ポリペプチドと相同であり、かつ
BCGF活性およびTCGF活性の双方を示す蛋白質お
よびムテイン(示された天然ポリペプチドの)を含む。あ
るいは本発明の哺乳動物IL−4s はそれらの生物活性
(のちにより詳細に定める)によっても定められ、これに
はBCGFおよびTCGF活性(ここではIL−4活性
と呼ぶ)のほか、MHC抗原誘導活性、Fcイプシロンレ
セプター誘導活性、GM−CSF刺激顆粒白血球コロニ
ー増殖増強活性、インターロイキン−2TCGF増強活
性、ならびにIgG1−およびIgE−誘導活性よりなる
群から選ばれる少なくとも1種またはそれ以上が含まれ
る。
【0100】IL−4s の活性は種特異性であると考え
られる。すなわち、たとえばヒトIL−4はヒトT細胞
系列によりアッセイしてTCGF活性を示すが、ネズミ
T細胞系列によりアッセイして活性は示さない。逆にネ
ズミIL−4はネズミT細胞系列によりアッセイしてT
CGF活性を示すが、ヒトT細胞系列によりアッセイし
て活性は示さない。
【0101】A.TCGF活性 TCGF活性については幾つかの標準アッセイ法が報告
されている。たとえばデボスら,ヌクレイック・アシッ
ズ・リサーチ、11巻,4307−4323頁(198
3);サーマンら,ジェイ・バイオロ・レスポンス・モデ
ィファイヤーズ(J.Biol.Response Modifiers),5
巻,85−107頁(1986);およびロバート−グロフ
ら,グロフ編,増殖および成熟因子,9章(ジョン・ワイリ
イ・ニューヨーク,1984)。一般にTCGF活性はあ
る因子が末梢Tリンパ球またはIL−2依存性T細胞系
列の増殖を促進する効力に基づく。たとえばギリスら,
ジェイ・イムノロ(J.Immunol.),120巻,2027
頁(1978)増殖は標準法、たとえばトリチル化チミジ
ンの取込みにより、または比色法により測定できる。モ
スマン,ジェイ・イムノロジ・メソ(J. Immunol.Met
h ),65巻,55−63頁(1968)。
【0102】たとえばヒトTCGF活性は下記の各工程
によりアッセイすることができる。 (1)あらかじめフィトヘマグルチニン(PHA)で7日間
刺激したのちIL−2と共に7日間培養され、洗浄され
たヒト末梢血リンパ球(50μl中に約2×105個)をマ
イクロタイターウェルに添加し;(2)TCGF含有材料
の希釈液(50μl)を各ウェルに添加し;(3)リンパ球を
37℃で72時間インキュベートし;(4)トリチル化チ
ミジン(約20μl,20μCi)を各ウェルに添加し;そし
て(5)細胞を濾紙片上に採取し、洗浄し、シンチレーシ
ョンカウンターで計数する。
【0103】具体例中により詳細に記述するように、あ
る種のIL−4はIL−2のTCGF活性を増強しう
る。ここでこの種の活性に関連して用いられる“増強(p
otentiation)”は、IL−2により生じる、TCGFア
ッセイ系における最高水準の増殖がIL−4の添加によ
って高められることを意味する。
【0104】B.BCGF活性 BCGF活性はハワードら、ジェイ・エクス・メ ディ
(J.Exp.Me d.),155巻,914−923頁(198
2)に示されたアッセイ法により定められる。BCGF
アッセイ法はハワードおよびポール,アナ・レビ・イム
ノロ(An n.Rev.Immuno l.),1巻,307−333頁
(1983)に一般的に概説されている。要約するとBC
GF活性は精製された休止B細胞が分裂促進濃度以下の
抗IgMなどの抗原の存在下で増殖を刺激する程度によ
って測定される。たとえばヒトBCGF活性のアッセイ
は下記の各工程により行うことができる。
【0105】末梢血、脾臓、扁桃腺その他の標準的供給
源から、フィコール/ハイパーク(Ficoll/Hypaque)
密度勾配遠心分離法(たとえばファルマシア)、および2
−アミノエチルイソチオウロニウムブロミド処理ヒツジ
赤血球を用いてT細胞を除去するロゼット形成サイクル
2回によって、濃縮B細胞集団を得る。これらのB細胞
は表面Ig+ 細胞95%以上を含有し、抗ヒトB細胞特
異性モノクローナル抗体B1(コールターより入手、フ
ロリダ州、ハイアリース)により測定して95%以上の
細胞がヒトB細胞特異性抗原に対し陽性でなければなら
ない。T細胞の混入は、抗Leu−1モノクローナル抗体
(ベクトン−ディッキンソン、カリフォルニア州、マウ
ンテン・ビュー)またはOKT 11抗体(オルト・ディ
アグノスティックス、マサチュウセッツ州、ウエストウ
ッド)を用いる染色法により測定して1%以下でなけれ
ばならない。このBリンパ球の培養物3ml(約5×105
個/ml・イッセル培地,イッセルら,ジェイ・イムノロ・
メソ(J. Immunol.Meth .),65巻,55−63頁(1
984))をスタフィロコッカス・アウレウス・コーワン
I(Staphyl ococcus aureus Cowan I)菌株(SAC)
(たとえばSACの0.01%溶液,パンソルビン(Panso
rbin)の商品名でカルビオヘミから得られる;またはファ
ルコフ,ジェイ・イムノロ(J.Immunol.),129, 巻,
97−102頁(1982)の記載に従って調製できる)
またはビーズに結合させた抗IgM抗体(たとえばBR
L、ガイタースバーズ、MD)、たとえばバイオーラド
(リッチモンド、CA)から入手できる5μg/mlのイム
ノビーズ(Immunobead)によって活性化する。B細胞を
24時間(SACの場合)または72時間(抗IgMビーズ
の場合)培養し、次いでフィコール/ハイパーク密度勾
配遠心法により再精製してSAC粒子、ビーズ、生存し
ていない細胞を除去する。培地50μl中約5×104
のBリンパ球を0.2mlの平底マイクロタイターウェル
中で平板培養することによりB細胞の増殖を測定する。
BCGF活性をもつと推定される材料の各種希釈液を添
加して最終容積50μlとなす。48時間後(抗IgM培
養)または72時間後(SAC培養)にトリチル化チミジ
ンの取込みを測定する。同様なアッセイ法がムラグチ
ら,ジェイ・イムノロ(J.Immunol.),129巻,110
4−1108頁(1982);およびヨシザキら,ジェイ・
イムノロ(J.Immunol.),128巻,1296−1301
頁(1981)にも示されている。
【0106】C.MHC抗原誘導 IL−4が種々の免疫系の細胞、特にB細胞においてM
HC抗原(たとえばマウスにおけるIa)の発現を誘導し
うることが証明されている。レームら,(ジェイ・エクス
・メディ・(J.Exp.Me d.),160巻,679−69
4頁)はBCGF活性を示す因子が正常な休止B細胞に
おいてMHC抗原の発現をも誘導しうることを証明し
た。MHC抗原誘導に関するアッセイ法は、この文献に
示されたネズミB細胞についてのアッセイ法を一般化し
たものである。要約すると、免疫系細胞をIL−4に暴
露し、次いで細胞表面における特定のMHC抗原の発現
を、この抗原に特異的な標識付き抗体によって測定す
る。誘導の程度は、誘導された細胞を対照と比較するこ
とによって判定される。いずれの特定の種についても数
種の抗体を用いることができる。モノクローナル抗MH
C抗原抗体を産生するハイブリドーマ数種がATCCか
ら入手され、数種が市販されている(たとえばATCC
受託番号HB103,HB109,HB110,またはH
B151のハイブリドーマにより産生される抗HLA−
DR;ATCC受理番号HB35のハイブリドーマによ
り産生される抗I−A b'd;ベクトン・ディッキンソン
(カリフォルニア州、マウンテン・ビュー)から入手され
る抗HLA−DR L243など)。このアッセイ法を
個々の種に適応させるためには、また最も感度の高いM
HC抗原水準の読みを得るのに最適な条件にするために
は、若干のルーテイン実験が必要であろう。ヒトMHC
抗原誘導アッセイのためには、精製B細胞を上記によ
り、または同様な方法により調製することができる。あ
るいは脾臓細胞の精製調製物につきMHC誘導をアッセ
イすることができる。抗体標識付き細胞は好ましくはフ
ローサイトメトリーにより、たとえばベクトン・ディッ
キンソンFACS型機器などにより検出される。
【0107】D.MCGF活性 IL−4sは一般にMCGF活性を示すと考えられてい
る。しかし適切なアッセイ法がないため、MCGF活性
はけっ歯類IL−4について証明されていたにすぎな
い。ネズミIL−4 MCGFアッセイ法は因子依存性
ネズミ肥満細胞または好塩基細胞系列の増殖に基づく。
特にMCGF活性はネズミ肥満細胞系列MC/9を用い
てアッセイすることができる。この細胞系はATCCに
受託番号CRL 8306で寄託され、米国特許第4,
559,310号明細書、およびナーベルら、セル、2
3巻、19頁(1981)に記載されている。ネズミMC
GFアッセイ法はイーレら、 ェイ・イムノロ(J.Im
munol.)、127巻、794(1981)によっても報告
されている。
【0108】好ましくはMCGF活性はMC/9細胞を
用いてモスマン(前掲)の比色アッセイ法によって測定さ
れる。要約すると、MC/9細胞を平底ファルコンマイ
クロタイタートレー(細胞104/ウェル)内で、4%ウ
シ胎仔血清、50μM・2−メルカプトエタノール、2
mMIグルタミン、非必須アミノ酸、必須ビタミン、お
よび種々の濃度の被験上層液を補充したダルベッコの改
良培地(最終容量0.1ml)中において培養する。リン酸
塩緩衝化食塩液10μl中50μgの3−(4,5−ジメチ
ルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾ
リウムブロミド(シグマ)を、20時間のインキュベーシ
ョン後に各細胞培養物に添加する。4時間後にイソプロ
パノール中の0.04M・HClを0.1ml添加して、有
色のホルマゲン系反応生成物を可溶化する。570nm
(参考630nm)における吸光をダイナテック・マイクロ
エリザ・オートリーダー(MR580)またはこれに類す
る機器により測定する。
【0109】E.Fc−イプシロンレセ プター誘導 IL−4がB細胞およびT細胞、特に抗IgM抗体また
は同様に抗原により刺激されたヒトB細胞においてFc
−イプシロンの発現を誘導することが見出された。また
ガンマインターフェロンがB細胞におけるIL−4誘導
Fc−イプシロンの発現を特異的に抑制することも見出
された。
【0110】好ましくはFc−イプシロンレセプター誘
導のアッセイ法は最初はBCGFアッセイの場合と同様
に行われる。すなわち精製B細胞を得て、これを次いで
抗IgM抗体(または同様に抗原)で刺激し、IL−4に
暴露する。最後にこれらの細胞をFc−イプシロンレセ
プターにつきアッセイする。
【0111】細胞表面のFc−イプシロンレセプターの
定量については数種のアッセイ法がある。たとえばヨド
イおよびイシザカ、ジェイ・イムノロ(J.Immuno
l.)、122巻、2577−2583頁(1979); ハ
ダックら、ジェイ・イムノロ・メソ(J.Immunol.Me
th.)、84巻、11−24頁(1985); およびボン
ネフォイら、ジェイ・イムノロ・メソ(J.Immunol.
Meth.)、88巻、25−32頁(1986)。特にFc
−イプシロンレセプターはそのレセプターに特異的な標
識付きモノクローナル抗体を用いたベクトン・ディッキ
ソンFACS−IVなどの機器によるフローサイトメト
リーにより測定することができる。Fc−イプシロンレ
セプター特異性モノクローナル抗体は常法により構成す
ることができる。
【0112】F.IgG 1 −およびIgE誘導 IL−4はリポ多糖類(LPS)活性化したB細胞におい
てIgEおよびIgG1同基準標本の分泌を誘導する。た
とえばコフマンら、ジェイ・イムノロ(J.Imm uno
l.)、136巻、4583−4541頁(1986); サ
イデラスら、ユーロ・ジェイ・イムノロ(Eur.J.Im
munol.)、15巻、586−593頁(1985)。これ
らの活性は抗体同基準標本の標準イムノアッセイ法、た
とえばコフマンら、ジェイ・イムノロ(J.Immuno
l.)、1361巻、949−954頁(1986)に記載
された方法により測定することができる。要約すると、
B細胞をたとえばサルモネラ・ティフィムリウム(Sal
mo nella typhimurium)LPS(シグマより入手)約4μg
/mlまたは大腸菌055から抽出したLPS(サイデラ
スらが報告した方法による、前掲)と共に培養すること
によりLPS活性化する。4〜8日間培養したのち、上
層液をアッセイ用に採取する。標準的な同基準標本特異
性ELISA型アッセイ法を用いて各種同基準標本濃度
を測定することができる。アッセイ用の抗−同基準標本
抗体が市販されており、あるいはATCCから入手でき
る。
【0113】G.コロニー刺激因子(C SF)活性 CSF活性を測定するために造血細胞、たとえば骨髄細
胞または臍帯(fetal cord)血球を単一細胞懸濁液状にし
た。次いで栄養素および通常はウシ胎仔血清を含有する
半固体状の(寒天)または粘稠な(メチルセルロース)培地
中で個々の細胞を“固定化する”。適宜な刺激因子の存
在下で個々の細胞が増殖し、分化するであろう。最初の
細胞は固定化されているので、細胞が増殖し、成熟する
のに伴ってコロニーが発達する。これらのコロニーを7
〜14日後に採点することができる。エー・バーゲス、
成長因子および幹細胞、52−55頁、アカデミック・
プレス ニューヨーク、[1984]。(顆粒球およびマ
クロファージの増殖への特異的適用については、ティー
・ブラッドリーおよびディー・メトカーフ、オースト・
ジェイ・エクスペ・バイオロ・メディ・サイ(Aust.
J.Exp.Biol.Med.Sci.)、44巻、287−3
00頁[1966]を、また一般的にはディー・メトカー
フ、造血コロニー、シュプリンゲル・フェアラーク、フ
ェルラーク、ベルリン[1977]を参照されたい。)所
望により個々のコロニーを抽出し、顕微鏡用スライドに
乗せ、固定し、ライト/ギームザにより染色することが
できる。(トッド−スタンフォード、実験室的方法によ
る臨床診断、第15版、編者、デイビッドソンおよびヘ
ンリー[1974])。単一コロニーにつき存在する細胞
型の形態学的分析を次いで行うことができる。
【0114】非血液学的疾患を伴う患者から採取した骨
髄細胞をフィコール(400型、シグマ・ケミカル社、
セントルイス、MO)上に広げ、遠心分離し(2,000r
pm、20分)、界面の細胞を取出す。ウシ胎仔血清(FC
S)10%を含有するイスコブ(Iscove)の改良ダルベッ
コ培地中でこれらの細胞を2回洗浄し、同培地に再懸濁
し、プラスチック製シャーレに付着させることにより付
着性細胞を除去する。20% FCS、50μM・2−
メルカプトエタノール、0.9%メチルセルロース、お
よびコロニー刺激活性を含むことが知られている上層液
または被験上層液(種々の濃度)を含有するイスコブの培
地に、非付着性細胞を105個/mlにおいて添加する1m
lのアリコートを35mmのシャーレに広げ、37℃で空
気中6%CO2の飽和湿度雰囲気内において培養する。
培養開始の3日後にエリスロポエチン1単位を各プレー
トに添加する。顆粒球−マクロファージコロニーおよび
赤血球バーストを10〜14日目に倒立顕微鏡により計
数する。
【0115】ヘパリン中に採取した臍帯(coyd)血細胞を
2,000rpmで6分間遠心分離する。血漿と赤血球のピ
ーク間の界面にある白血球を0.17M塩化アンモニウ
ムおよび6%FCSを含有する試験管に移す。氷上で5
分間保持したのち、懸濁液の下部にFCS 4mlを積層
し、2,000rpmで6分間遠心分離する。細胞ペレット
をダンベッコのリン酸塩緩衝化食塩液で洗浄し、先に骨
髄細胞に関して記載したフィコールおよびプラスチック
付着工程を行う。低密度の非付着性細胞を採取し、前記
の半固体培地に105個/培地において広げる。
【0116】アッセイの終了時に個々のコロニーをガラ
ススライドに施しライト/ギムザで染色したのち細胞組
成を調べる。好酸球はルキソール・ファースト・ブルー
(Luxol Fast Blue)で染色することにより測定され
る(ジー・ジョンソンおよびディー・メトカーフ、エク
スペ・ヘマ トロ(Exp.Hematol)Vol.8、549−5
61頁[1980]。
【0117】GM−CSF刺激顆粒球の増殖に関してこ
こで用いられる“増強(potentiation)”は上記アッセイ
法において顆粒球コロニーがコロニーの増殖を刺激する
ためにGM−CSFをIL−4と共に用いた場合の法が
GM−CSFを単独で用いた場合よりも大きいことを意
味する。
【0118】V.精製および薬剤組成物 大腸菌、酵母その他の細胞中で発現された本発明のポリ
ペプチドは当技術分野における標準法に従って精製され
る。これには硫酸アンモニウム沈澱法、分画カラムクロ
マトグラフィー(たとえばイオン交換、ゲル濾過、電気
泳動、アフィニティクロマトグラフィーなど)および最
終的な結晶化(一般的に“酵素の精製および関連法”、
メソッズ・イン・エンザイモロジー22; 233−57
7[1977]およびアール・スコープス、蛋白質の精
製: 原理と実際、シュプリンゲル・フェアラーク、ニュ
ーヨーク[1982]を参照されたい)が含まれる。精製
されると(部分的に、または均質に)、本発明のポリペプ
チドを研究の目的で、たとえば細胞増殖用培地への補充
として(たとえば最小必須培地 イーグル・イスコブの
改良ダルベッコ培地、またはRPMI 1640; シグ
マ・ケミカル社(ミズーリ州、セントルイス)およびジコ
ブ・ディビジョン(チャグリン・オハイオ州、フォール
ズ)から入手される)、またイムノアッセイ、免疫蛍光染
色などに有用な特異的免疫グロブリンを誘導するための
抗原物質として使用できる(一般的に免疫学的方法、I
およびII巻、編者: アイ・レフコビッツおよびビー・
ペルニス、アカデミック・プレス、ニューヨーク州、ニ
ューヨーク、1979、1981];および実験的免疫学
ハンドブック、編者: ディー・ワイル、ブラックウェル
・サイエンティフィック・パブリケーションズ、ミズー
リ州、セントルイス[1979]を参照されたい)。
【0119】本発明のポリペプチドは薬剤組成物中に
も、たとえば各種感染に対する天然の防御を強化するた
めに使用できる。たとえば慢性関節リウマチを伴う患
者、移植を要する患者、または癌の化学療法、高齢化、
免疫抑制剤などにより起こる免疫欠損を伴う患者をこれ
らのポリペプチドで処置することができる。これらの組
成物は単独で、または当業者に周知の他の薬剤と組み合
わせて、免疫系の種々の部分を選択的に刺激することが
できる。特にこれらの組成物は本発明のポリペプチドが
もつ増強活性の点からみて他の免疫反応性薬剤、たとえ
ばリンフォカイン(たとえばIL−1、IL−2など)、
コロニー刺激因子、免疫グロブリンなどを含有すること
ができる。これらのポリペプチドは細胞増殖または免疫
グロブリン産生の強化を目的とする際の刺激(インビボ
またはインビトロ)にも使用される。
【0120】本発明の薬剤組成物はこれらのポリペプチ
ドを好ましくは不活性の、薬剤学的に受容できる担体と
混合することにより調製できる。適切な担体およびそれ
らの調製法は当技術分野で周知である(たとえばレミン
トンの製 剤化学および米国薬局方: 米国処方集、マック
・パブリッシング・カンパニー、ペンシルバニア州、イ
ーストン[1984]を参照されたい)。好ましい投与経
路は非経口であり、機械的デリバリーシステムの使用も
含まれる。
【0121】好ましくは薬剤組成物は単位用量剤形であ
り、各単位は適宜な量の有効成分を含有する。単位用量
製剤中の有効化合物の量は、個々の用途および有効成分
の効力に応じて1μgから100mgまで変化または調製
することができる。所望により組成物は他の治療薬を含
有してもよい。
【0122】用量は患者の要求条件、処置すべき状態の
程度、および用いられる個々の化合物に基づいて変える
ことができる。ここで用いる“有効量”という語は、用
量を考慮する際にこれらの因子を計算に入れることを意
味する。個々の状況に適した用量を決定することは当業
者が容易になしうる範囲のものである。一般に処置はそ
の化合物の最適用量よりも少ない小用量から開始する。
その後、用量を少量ずつ増し、その状況下で最適な効果
を達成する。便宜的に総一日量を分割して、その日に少
量ずつ投与することもできる。
【0123】VI.発現系 本発明の蛋白質およびムテインを産生させるために広範
な発現系(すなわち宿主−ベクターの組み合わせ)を用い
ることができる。可能な種類の宿主細胞には細菌、酵
母、昆虫、哺乳動物などからの細胞が含まれるが、これ
らに限定されない。特定の蛋白質またはムテインの発現
を最適なものにするのは多くの因子に依存し、これには
以下のものが含まれる。(1)発現すべき蛋白質またはム
テインの性質、たとえば発現産物がある種の宿主系にと
って有毒であるかも知れない、(2)翻訳後修飾が望まし
いか否か、またいかなる型の修飾が望ましいか、たとえ
ば希望するグリコシル化の程度および種類が宿主の選択
に影響を与える可能性がある、(3)目的とする蛋白質ま
たはムテインのコード部位をフランキングする5'およ
び3'領域の性質、たとえば翻訳の制御に関与するプロ
モーターおよび/または配列の選択が効果的発現にとっ
て重要である、(4)一過性の発現または持続的な発現の
いずれかを求めるか、(5)発現産物を宿主細胞および/
または培地の蛋白質および他の物質から分離する際の難
易、(6)一過性に目的の蛋白質またはムテインを発現す
る宿主のトランスフェクションの難易および効率、(7)
目的とする蛋白質またはムテインを発現するために用い
られる細胞培養の規模、(8)目的とする蛋白質またはム
テインが宿主にとって内生の蛋白質断片に融合した形で
発現されるか否か。
【0124】一般に本発明のDNA配列のクローニング
には原核生物が好ましい。原核生物発現系を提供するた
めの一般的ガイドはマニアチスらの分子クローニング:
実験室の手引き(コールド・スブリング・ハーバー・ラ
ボラトリー、ニューヨーク、1982); パーバル、分
子クローニングの実用ガイド(ジョン・ワイリー・アン
ド・サンズ、ニューヨーク、1984); クローバー、
DNAク ローニング: 実際の研究法、IおよびII巻
(IRLプレス、オクスフオード、1985); ならびに
デ・ベールら、“大腸菌における最適な外来遺伝子発現
のための方法”、遺伝子: 構造と発現、クルーン編(ジ
ョン・ワイリー・アンド・サンズ、ニューヨーク、19
83)により得られる。たとえば大菌K12 株294
(ATCC No.31446)が特に有用である。使用
できる他の微生物株には大腸菌の菌株、たとえば大腸菌
Bおよび大腸菌X1776(ATCC No.3153
7)が含まれる。これらの例はもちろん例示のためのも
のであって限定ではない。
【0125】原核生物は発現のためにも使用できる。上
記の菌株のほか、大腸菌W3110(Fs-、λ-、原栄養
体、ATCC No.27325)、杆菌、たとえば枯草
菌(Bacillu s subtilis)、および他の腸内細菌、たとえ
ばネズミチフス菌もしくは霊菌(Serratia marcesan
s)、および種々のシュードモナス属菌種も使用できる。
【0126】一般に、宿主細胞と適合性の種に由来する
レプリコンおよび制御配列を含むプラスミドベクターが
これらの宿主の組み合わせて用いられる。ベクターは通
常は複製部位、および形質転換細胞において表現型を選
定しうるマーキング配列を保有する。たとえば大腸菌は
しばしばpBR322、すなわち大腸菌の一菌種に由来
するプラスミドを用いて形質転換される(ボリバーラ、
ジーン、2巻、95頁(1977))。pBR322はアン
ピシリンおよびテトラサイクリン耐性に関する遺伝子を
含むので、形質転換細胞を識別するための容易な手段を
提供する。pBR322プラスミドまたは他の微生物プ
ラスミドは微生物が自身の蛋白質の発現のために利用し
うるプロモーターをも含むか、またはこれを含むべく修
飾されなければならない。組換えDNAの構築に最も一
般的に用いられるプロモーターにはβ−ラクタマーゼ
(ペニシリナーゼ)およびラクトーズプロモーター系(チ
ャンら、ネイチャー、275巻、615頁(1978);
イタクラら、サイエンス、198巻、1056頁(19
77); ゲッテルら、 イチャー、281巻、544頁
(1979))、およびトリプトファン(trp)プロモーター
系(ゲッテルら、ヌクレイック・アシッズ・リサ(Nucle
ic Acids Res.)、8巻、4057頁(1980);
欧州特許出願公開第0036776号明細書)が含まれ
る。これらが最も一般的に用いられるが、他の微生物の
プロモーターも見出されて利用されており、それらがヌ
クレオチド配列に関する詳細は公表され、当業者はこれ
らをプラスミドベクターと機能的にリゲートさせること
ができる(シーベンリストら、セル、20巻、269頁
(1980))。
【0127】原核微生物、真核微生物のほかに酵母培養
物も使用できる。ビール酵母(Saccharomyces serevis
iae)、または一般のパン酵母が真核微生物のうちでは最
も慣用されるものである。サッカロミセス属において発
現させるために慣用されるプラスミドはYRp7である
(スティナヒコームら、ネイチャー、282巻、39頁
(1979); キングスマンら、ジーン、7巻、141頁
(1979); チェンパーら、ジーン、10巻、157頁
(1980))。このプラスミドは、トリプトファン中で
増殖する能力を欠如した酵母の突然変異株(たとえばA
TCC No.44076のたはPEP4−1)に対する
選択マーカーを備えたtrp1遺伝子をすでに含んでいる
(ジョーンズら、ジェネティックス、85巻、12頁(1
977))。そこで、酵母細胞ゲノムの特色としてtrp
傷害(lesion)が存在することは、トリプトファンの不存
下での増殖により形質転換を検出するために有効な状況
を与える。
【0128】酵母ベクターにおける適切なプロモーター
配列には3−ホスホグリセレートキナーゼ(ヒッツェマ
ンら、ジェイ・バイオロ・ケミ(J.Biol.Chem.)、
255巻、2073頁(1980))、あるいは他の解糖
酵母(ヘスら、ジェイ・アドバ・ エンザイム・レギ(J.
Adv.Enzyme Reg.)、7巻、149頁(1968);
ホランドら、バイ オケミストリー、17巻、4900頁
(1978))、たとえばエノラーゼ、グリセルアルデヒ
ド−3−リン酸 デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、
ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナー
ゼ、グルコース−6−リン酸イソメラーゼ、3−ホスホ
グリセリン酸ムダーゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオー
スリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ
およびグルコキナーゼが含まれる。適切な発現プラスミ
ドを構築する際には、これらの遺伝子に付随する終止配
列も、発現ベクターの発現すべき配列の3'位にリゲー
トさせ、mRNAのポリアデニル化および終止を行わせ
る。増殖条件によって転写が制御されるという付加的な
利点をもつ他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲ
ナーゼ2、イソチトクロームC、酸性ホスファターゼ、
窒素の代謝に付随する変性酵素、前記のグリセリルアル
デヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルト
ースおよびガラクトースの利用に関与する酵素に関する
プロモーター領域である(ホランド、前掲)。酵母適合性
プロモーター、複製起点、および終止配列を含むプラス
ミドベクターはいずれも適している。
【0129】微生物のほかに、多細胞生物に由来する細
胞培養物も宿主として利用できる。原則として、この種
の細胞培養物は脊椎動物または無脊椎動物のいずれであ
っても有効である。しかし脊椎動物細胞における関心が
きわめて大きく、培養における脊椎動物の増殖(組織培
養)が近年ルーティンな方法となっている[組織培養、ア
カデミック・プレス、クルーズおよびパターソン編者4
(1973)]。この種の有用な宿主細胞系の例はVER
OおよびHeLa細胞、チャイニーズハムスター卵巣(C
HO)細胞系、ならびにW138、BHK、COS7、
マウス骨髄腫(ATCC No.TIB19またはTIB
20)およびMDCK細胞系列である。この種の細胞に
対する発現ベクターには通常は(必要ならば)、発現すべ
き遺伝子の前方に位置する複製起点およびプロモーター
が、必要なリボソーム結合部位、RNAスプライシング
部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター
配列と共に含まれる。
【0130】哺乳動物細胞に用いるために、発現ベクタ
ーに対する制御機能がしばしばウイルス材料によって供
給される。たとえば慣用されるプロモーターはポリオー
マ、アデノウイルス2、きわめて頻繁にシミアンウイル
ス40(SV40)に由来する。SV40ウイルスの初期
および後期プロモーターは特に有用である。両者とも、
SV40ウイルス由来の複製起点をも含む断片としてウ
イルスから容易に得られるからである(フィールズら、
ネイチャー、273巻、113頁(1978)。これより
も小さいかまたは大きいSV40断片も、HindIII
部位からウイルス由来の複製起点に位置するBglI部位
へ向かって伸びる約250bpの配列を含む限り使用でき
る。さらに、普通は目的とする遺伝子配列に付随するプ
ロモーターまたは制御配列を用いることも、これらの制
御配列が宿主細胞系に適合しうる限り可能であり、しば
しば望ましい。
【0131】複製起点は外来起点によってベクターに
(たとえばSV40または他のウイルス(たとえばポリオ
ーマ、アデノ、VSV、BPVなど)源に由来するもの)
与えられるか、あるいは内的に宿主細胞染色体複製機構
によって与えることができる。ベクターを宿主細胞染色
体に挿入することでしばしば十分である。
【0132】t−PAおよびDHFR蛋白質双方をコー
ドするDNA配列を含む本発明のベクターによるトラン
スフェクションのために好ましい宿主細胞を選ぶ際に
は、用いるDHFRタンパク質の型に従って宿主を選ぶ
ことが適切である。野性型DHFRタンパク質を用いる
場合は、DHFRを欠如する宿主細胞を選ぶことが好ま
しい。これによりヒポキサンチン、グリシンおよびチミ
ジンを欠如する選択培地においてトランスフェクション
成立のマーカーとしてDHFRコード配列を使用するこ
とができる。このような適切な宿主細胞はDHFR活性
を欠如するチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞系
列であり、これはウルラウプおよびチェイシン、プロシ
・ナショナル・アカデ・サイ.、(ユーエスエー)(Pro
c.Natl.Acad.Sci.)(USA)77巻、4216頁
(1980)に記載された方法に従って調製され、増殖す
る。
【0133】他方、MTXに対し低い結合親和性をもつ
DHFRタンパク質を制御配列として用いる場合、DH
FR耐性細胞を用いる必要はない。突然変異DHFRは
メトトレキセート耐性であるので、宿主細胞自体がメト
トレキセート感受性である限り、MTX含有培地を選択
の手段として用いることができる。MTXを吸収するこ
とができる。真核細胞は大部分がメトトレキセート感受
性であると思われる。これらの有用な細胞系列の1つ
は、CHO系列、CHO−K1 ATCC No.CC
L61である。
【0134】無脊椎動物の発現系にはバキュロウイルス
(baculovirus)ベクター、BmNPVを感染させたカイコ
(Bomby x mori)の幼虫が含まれる。これについてはマ
エダら、ネイチャー、315巻、892〜894頁(1
985)、および細胞工学、4巻、767−779頁(1
985)に記載されている。
【0135】
【実施例】以下の実施例は本発明を説明するためのもの
である。ベクターおよび宿主、ならびに試薬濃度、温度
および他の変数の値は本発明の応用を例示するためのも
のにすぎず、本発明の限定と考えるべきではない。材料および方法 細胞系列Cl.Lyl+-/9(Cl.1と呼ぶ)(ジー・ナ
ーベル、ジェイ・エス・グリーンバーガー、エム・サカ
キーニー、およびエッチ・カント(1981)プロシ・ナ
ショナル・アカデ・サイ.、ユーエ スエー(Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA)、78、1157−1161
頁)、およびGK15−1(エム・ギードリン提供、モレ
キュラー・アンド・セルラー・バイオロジー社 DNA
X研究所; DNAX)を、RPMI 1640、50μm
2ME、1% FCSおよび2μg/ml ConA中に
細胞5×105個/mlで24時間再懸濁した。上層液を
採取し−70℃に保存した。
【0136】クローン化マスト細胞系列、MC/9(ジ
ー・ナーベル、エス・ジェイ・ガリ、エッチ・エフ・ド
ボラックおよびエッチ・カントー(1981)、ネイチャ
291、332−334はジー・ナーベル(ダナ・フ
ァルベル癌研究所; DFCI)から得られた。マスト細
胞系列MM3(アール・コフマンにより提供、DNAX)
およびDx−2(ディー・レニックにより誘導、DNA
X)は骨髄単球付随マーカーの不在によって、またIgE
レセプターおよび250ng/106細胞以上の水準のヒ
スタミンの存在によって明らかにされた。骨髄姓NFS
−60細胞はジェイ・レイ(フレデリック癌研究施設;
FCRF)により提供された。NFS−60細胞系列を
サブクローニングしてIL−3依存性クローンを得た。
T細胞系列HT2はエス・ストロバー(スタンフォード
大学、カリフォルニア州、パロ・アルト、から得られ;
CTLL−2はダブリュー・ファラル(FCRF)により
供給され; Ly23/4はジー・ナーベル(DFCI)に
より供給された。マスト細胞およびT細胞系列は組換え
IL−3またはIL−2を補充したRPMI1640、
10% FCS、50μM 2ME中で増殖させた。
【0137】数種のIL−3依存性細胞系列のヒスタミ
ン水準をピー・エー・ショア、エー・バークハルターお
よびブイ・エッチ・コン(1959)、ジェイ・ファルマ
・エクスペ・テラ(J.Pharm.E xp.Ther.) 12
、182−186の方法によりアッセイした。T細胞
およびマスト細胞発育因子の活性は[3H]−チミジンの
取り込みにより、または比色アッセイ法により測定され
た(ティー・モスマン、ジェイ・イムノロ ・メソズ(J.
Immunol.Methods)、65: 55−63(1983)に
記載)。
【0138】WEHI3上層液より精製したIL−3は
ジェイ・イーレ(FCRF)から与えられた。組換えIL
−2、IL−3、GM−CSFおよびINF−γは、対
応するcDNAクローンをトランスフェクションさせた
COS−7サル腎細胞からの上層液の形で用いられた。
IL−2、IL−3またはGM−CSFの1単位は、因
子依存性細胞系列の最大[3H]−チミジン取り込みを5
0%刺激した量の因子と定義された(ディー・レニック
ら(1985)ジェイ・ イムノロ(J.Immunol.)13
4:910−919)。1単位のIFN−γプロモーター
は50%のマウスL細胞を水疱性口内炎ウイルスの細胞
変性作用から保護する。(アール・シュライバーら、(1
982)ジェイ・エクスペ・メディ(J.Exp .Med.)
156: 677−689)。
【0139】B細胞はマウス脾臓細胞の単一細胞懸濁液
から、T細胞およびマクロファージを標準法により除去
することによって調製された(エム・ハワードら、ジェ
イ・エクスペ・メディ(J.Exp.Med.)155: 91
4(1982))。ここに記載された精製因子はそれがB
細胞におけるIaの発現を誘発する効力についてサイト
フルオロメトリー分析により、またB細胞増殖を刺激す
る効力について抗Ig同時刺激(co−stimulation)アッセ
イ法により評価した(エヌ・レームら、ジェイ・エクス
ペ・メディ(J.Exp .Med.)160: 679に記
載)。
【0140】タンパク質測定はUV吸収(280nmまた
は220nm)に基づくか、あるいは色素結合アッセイ法
により作成された標準曲線に基づいてなされた(エム・
ブラッドフォード、(1976)アナリ・バイオケミ(An
nal.Biochem.)72: 248−254)。上層液をま
ずペリコ・カセットユニット(ミリポア、マサチュセッ
ツ州、ベッドフォード)によって、あるいは(逆相クロマ
トグラフィーの後)スピードバク(セイバント、ニューヨ
ーク州、ファーミングデール)中での溶剤蒸発によって
20倍に濃縮した。SDS PAGEはレムリのシステ
ム(ユー・レムリ、(1970)ネイチャー227: 68
0−685)により12%分離用を用いて行なわれた。
マーカータンパク質はファルマシア低分子量標品(ファ
ルマシア、スウェーデン、ウプサラ)であった。ゲルは
シー・メリルら(1981)サイエンス211:1437
−1438の記載に従って銀染色された。MCGFおよ
びTCGF活性を分子量の関数として直接に評価するた
めに、50mM、DTTであらかじめ還元したまたは還
元しない試料を電気泳動し、ゲルを1mmの切片にスライ
スし、破砕し、卵アルブミン(シグマ、ミズーリ州、セ
ントルイス)5mg/mlを補充したアッセイ培地0.5ml
中へ4℃で一夜、タンパク質を溶離させた。
【0141】クロマトグラフィーは18℃で、クラスト
・スペクトロフロー773UV検出器(クラトス、ニュ
ージャージー州、ラムゼー)を備えたファルマシアFP
LCシステムにより行われた。陽イオン交換クロマトグ
ラフィーには50mMリン酸ナトリウム、1mM、EDT
A(pH7.0)で平衡化したファルマシア・モノSカラム
(0.5×5cm)を用いた。同緩衝液中の上層液をこのカ
ラムに施し、NaCl濃度勾酸(1Mまで)で溶離した。逆
相クロマトグラフィーにはファルマシアC8カラム
(0.5×2cm)を用いた。0.1%TFA(pH2)で希釈
した試料をカラムに乗せ、0.1%TFAを含有するア
セトニトリル濃度勾配により溶離した。
【0142】MCGFおよびTCGF活性体の等電点は
ファルマシア・モノPカラム(0.5×20cm)上でクロ
マトフォーカシング(chromatofocussing)により推定さ
れた。0.025Mビストリス(pH7.1)中の試料を同
緩衝液で平衡化した“モノP”カラムに装填した。濃度
勾配溶離はファルマシア・ポリバッファー74(pH4.
0)(1:10希釈、0.2Mアミノジ酢酸でpH調整)を用
いて行われた。溶出液のpHはファルマシアpHモニター
により連続的に測定された。注入前に試料はすべてミレ
ックスGV0.2μユニット(ミリポア)により濾過され
た。
【0143】SDS PAGEまたはクロマトグラフィ
ー実験で得た画分はそれらが3種類の細胞系列NFS−
60(IL−3)、MC/9(MCGF)、およびHT2
(TCGF)の増殖を支持する効力についてアッセイされ
た。
【0144】この因子を精製均質化するために、Con−
A活性化したCl.1上層液8lで20mMヘペス緩衝液(p
H7.0)中へ透析し、次いで緩衝液で平衡化したファル
マシア・モノS10/10陽イオン交換カラムに導通し
た。ピーク活性は直線的塩濃度勾配により0.2M・Na
Clにおいて溶出した。この材料をプールし、濃縮し、
20mMヘペス緩衝液(pH7.0)中へ再透析し、同緩衝
液で平衡化したヘパリン−セファロースカラム上へ装填
した。ピーク活性は2M・NaClまでの直線濃度勾配に
より0.45M・NaClで溶出した。この材料をプール
し、0.10/TFA/H2O(pH2)で10倍希釈し、
バイダック逆相カラム(c4)で分画した。アセトニトリ
ルの直線濃度勾配(0.1%、TFA)を施すことにより
活性が42%アセトニトリルにおいて放出された。
【0145】実施例I.Cl.Ly1 + - /9細胞からの
ネズミIL−4cDNAのde novo調製およびCOS7サ
ル細胞における一時的発現 IL−4をコードするcDNAクローンをネズミヘルパ
ーT細胞系列Cl.Ly1+-/9から単離した。この細
胞系列はATCCに受託番号CRL8179で寄託さ
れ、ナーベルらによりセル、23巻、19−28頁(1
981)、およびプロシ・ナショナル ・アカデ・サ
イ.、(Proc.Natl.Acad.Sci.)78巻、115
7−1160頁(1981)に記載されている。BCGF
活性を生じることが知られている他のマウス細胞にはE
L−4系列が含まれ、これはATCCから受託番号TI
B39で入手できる。この例に用いた方法はリーら、
ロシ・ナショナル ・アカデ・サイ (Proc.Natl.Ac
ad. Sci.)83巻、2061−2065頁(1986)
に示されている。要約すると、コンカナバリンA(Con
A)誘発Cl.Ly1+-/9細胞からオカヤマおよびバ
ーグ(前掲)の方法により、pcDcDNAライブラリーを
構成した。ランダムに選ばれたクローンの大型サブライ
ブラリーから32P標識cDNAプローブとのハイブリダ
イゼーションによりIL−3およびGM−CSFを除去
した。このサブライブラリーの残りからなるプールおよ
び/または各クローンを、COS7サル細胞の感染およ
びMCGFおよびTCGF活性についての培養物上層液
の試験によって、IL−4につきスクリーニングした。
【0146】A.IL−4産生の誘導 Cl.Ly1+-/9細胞を下記に従ってConAにより誘
導し、IL−4mRNAを産生させた。細胞を5×105
/mlにおいて、4%熱不活性化ウシ胎仔血清、5×10
-5M・2−メルカプトエタノール(2−ME)、2mM、
グルタミン、非必須アミノ酸、必須ビタミン、およびC
onA 2μg/mlを含むダルベッコの改良イーグル培地
(DME)中で培養した。37℃で10%CO2中におい
て12〜14時間インキュベートした後、細胞懸濁液を
1500rpmで10分間遠心分離した。細胞ペレットを
採取し、直ちに−70℃で凍結した。
【0147】B.mRNAの単離 ジェイ・チルグウィンら(バイオケミストリー、18:
5294−5299[1979])のグアニジンイソチオ
シアヌレート法により細胞から総細胞DNAを分離し
た。ConA誘導Cl.Ly1+-/9細胞からの凍結細胞
ペレット(刺激の12時間後)をグアニジンイソシアヌレ
ート細胞溶解用溶液に懸濁した。細胞溶解用溶液20ml
を1.5×108個の細胞につき用いた。ペレットをピペ
ッティングにより再懸濁し、次いで16ゲージの針を用
いて注射器に4回導通することによりDNAを剪断し、
細胞溶解物を40ml容ポリアロマー(polyallomer)遠心
管中で20mlの5.7M・CsCl、10mM・EDTAの
上部に積層した。この溶液を25,000rpmでベックマ
ンSW28ローター(ベックマン・インスツルメンツ
社、カリフォルニア州、パロ・アルト)中において15
℃で40時間遠心分離した。DNAを含有するグアニジ
ンイソシアヌレート相をピペットで上から下方の界面に
まで下降させた。管壁および界面をグアニジンイソシア
ヌレート細胞溶解用溶液2〜3mlで洗浄した。試験管を
界面の下方ではさみにより切断し、CsCl溶液をデカン
トした。RNAペレットを冷70%エタノールで2回洗
浄した。次いでペレットを10mMトリス・HCl(pH
7.4)、1mM・EDTA、0.05%SDS 500μ
lに再懸濁した。3M酢酸ナトリウム50μlを添加し、
RNAをエタノール1mlで沈澱させた。総RNA約0.
3mgを遠心分離により採取し、ペレットを冷エタノール
で1回洗浄した。
【0148】洗浄および乾燥した総RNAペレットをオ
リゴ(dT)溶離緩衝液(10mMトリス・HCl(pH7.
4)、1mM・EDTA、0.5%SDS)900mlに懸濁
した。RNAを68℃で3分間加熱し、次いで氷上で冷
却した。100lの5M・NaClを添加した。RNA試
料を結合緩衝液(10mMトリス・HCl(pH7.4)、1m
M・EDTA、0.5M・NaCl、0.5%SDS)で平
衡化した1.0mlのオリゴ(dT)セルロースカラム(タイ
プ3、コラボラティブ・リサーチ、マサチュセッツ州、
ウォルサム)に装填した。カラムからの流出液をさらに
2回カラムに導通した。次いでカラムを結合緩衝液20
mlで洗浄した。溶離緩衝液で洗浄することによりポリA
+mRNAを採取した。RNAは通常、最初の2mlの溶離
緩衝液中に溶出した。RNAを0.1容量の3M酢酸ナ
トリウム(pH6)および2倍容量のエタノールで沈澱さ
せた。RNAペレットを遠心分離によって採取し、冷エ
タノールで2回洗浄し、乾燥させた。次いでペレットを
水に再懸濁した。アリコートを希釈し、260nmにおけ
る吸光度を測定した。
【0149】C.pcD cDNAライブラリーの構築 1) ベクタープライマーおよびオリゴ(dG)テイル付き
リンカーDNAの調製 オカヤマおよびバーグ(モレ・アンド・セル ・バイオロ
(Mol&Cell.Biol.)、2巻、161−170頁[1
982])の方法をわずかに変更して用いた。pcDV1お
よびpL1プラスミドはオカヤマおよびバーグ(モレ・ア
ンド・セル・バイオロ(Mo l&Cell.Biol.)3: 38
0−389[1983])により記載されており、ファル
マシア(ニュージャージー州、ピスカタウェイ)から入手
できる。詳細には、先のKpnI部位の位置にNsiI部位
を含む修飾されたpcDV1プラスミドを用いた。
【0150】pcDV1 DNAの試料80μgを30℃
で20UのKpnIエンドヌクレアーゼにより、6mMト
リス・HCl(pH7.5)、6mM・MgCl2、6mM・Na
Cl、6mM・2−ME、および0.1mg/mlウシ血清ア
ルブミン(BSA)を含有する450μlの反応混合物中
で消化した。16時間後に0.25M・EDTA(pH8.
0)40μlおよび10%ドデシル硫酸ナトリウム(SD
S)20μlで消化を停止し、水−飽和1:1フェノール
−CHCl3(以下フェノール−CHCl3と呼ぶ)で抽出し
た後エタノールで沈澱させることによりDNAを採取し
た。平均60(ただし80を越えない)のデオキシチミジ
レート(dT)残基(末端当たり)のホモポリマーテイルを
下記によりウシ胸線ターミナルトランスフェラーゼによ
り、NsiIエンドヌクレアーゼ産生末端に付加した。反
応混合物(38μl)はカコジル酸ナトリウム−30mMト
リス・HCl(pH6.8)(緩衝液として)、ならびに1mM
・COCl2、0.1mMジチオスレイトール、0.25mM
・dTTP、NsiIエンドヌクレアーゼ消化DNA、お
よび68Uのターミナルデオキシヌクレオチジルトラン
スフェラーゼ(p−Lバイオケミカルズ社、ワイオミング
州、ミルウォーキー)を含有していた。37℃で30分
後に0.25M・EDTA(pH8.0)20μlおよび10
%SDS 10μlにより反応を停止し、フェノール−
CHCl3で数回抽出したのちエタノール沈澱によりDN
Aを採取した。次いでDNAを15UのEcoRIエンド
ヌクレアーゼにより、10mMトリス・HCl(pH7.
4)、10mM・MgCl2、1mMジチオスレイトール、お
よび0.1mg/mlのBSAを含有する50μl中で37℃
において5時間消化した。SV40ポリアデニル化部位
およびpBR322複製起点およびアンピシリン耐性遺
伝子を含む大型断片を、アガロース(1%)ゲル電気泳動
により精製し、ガラス粉末法に変法によりゲルから採取
した(ビー・フォーゲルシュタインおよびディー・ジレ
スピー、プロシ ・ナショナル・アカデ・サイ. (Pro
c.Natl.Acad.Sci.)76: 615−619[19
79])。dT−テイル付きDNAをさらに下記に従って
オリゴ(dA)−セルロースカラムの吸収および溶離によ
って精製した。1mM・EDTAおよび1M・NaClを
含有する10mMトリス・HCl(pH7.3)緩衝液1mlに
DNAを溶解し、0℃に冷却し、同緩衝液で平衡化した
オリゴ(dA)−セルロースカラム(0.6×2.5cm)に施
し、水により室温で溶離した。溶離したDNAをエタノ
ールで沈澱させ、1mM・EDTAを含む10mMトリス
・HCl(pH7.3)に溶解した。
【0151】オリゴ(dG)テイル付きリンカーDNAは
下記により製造された。75μgのpL1・DNAを20
UのPstIエンドヌクレアーゼにより、6mM・トリス
・HCl(pH7.4)、6mM・MgCl2、6mM・2−M
E、50mM・NaCl、および0.01mg/mlのBSAを
含有する450μl中で消化した。30℃で16時間後
に反応混合物をフェノール−CHCl3により抽出し、D
NAをアルコールで沈澱させた。次いで10〜15デオ
キシグアヌレート(dG)残基のテイルを各末端に、前記
と同じ反応混合物(38μl)(ただし、dTTPの変わり
に0.1mM・dGTPを含む)中で46Uのターミナルデ
オキシヌクレオチジルトランスフェラーゼにより付加し
た。37℃で20分後に混合物をフェノール−CHCl3
で抽出し、DNAをエタノールで沈澱させたのち、これ
を30UのHindIIIエンドヌクレアーゼにより、2
0mM、トリス・HCl(pH7.4)、7mM・MgCl2、6
0mM・NaClおよび0.1mgのBSAを含有する50μ
l中で37℃において4時間消化した。少量のオリゴ(d
G)テイル付きリンカーDNAをアガロースゲル(1.8
%)電気泳動により精製し、上記に従って採取した。
【0152】2) cDNAライブラリーの調製: 工程1: cDNA合成。反応混合物は50mMトリス・H
Cl(pH8.3)、8mM・MgCl2、30mM・KCl、0.
3mMジチオスレイトール、各2mMのdATP、dTT
P、dGTP、およびdCTP、20μCi 32P−dCT
P(3000Ci/ミリモル)、3μgのCoA誘導T細胞
由来ポリA+・RNA、60単位のRNアシン(RNasi
n、リボヌクレアーゼ阻害剤の商品名、プロメガバイオ
テック社より、ワイオミング州、マジソン)および2μg
のベクター−プライマーDNA(プライマー末端15ピ
コモル)、および45Uのリバーストランスクタプター
ゼを含有していた。反応物を42℃で60分間インキュ
ベートし、次いで、0.25M・EDTA(pH8.0)1
μlおよび10%SDS 0.5μlの添加により停止し;
フェノール−CHCl3 40μlを添加し、溶液をボル
テックスミキサー中で激しくブレンドした後遠心分離し
た。4M酢酸アンモニウム40μlおよびエタノール1
60μlを水相に添加し、溶液をドライアイスで15分
間冷却し、緩和に振とうしながら室温にまで加温して、
冷却に際して沈澱していた未反応のデオキシヌクレオシ
ド三リン酸を溶解し、エッペンドルフ微量遠心機で10
分間遠心分離した。ペレットを10μlの10mMトリス
・HCl(pH7.3)および1mM・EDTAに溶解し、4
M酢酸アンモニウム10μlと混合し、エタノール40
μlで再沈澱させた。この処理により99%以上の未反
応デオキシヌクレオシド三リン酸が除去された。ペレッ
トをエタノールで濯いだ。
【0153】工程: 2 オリゴデオキシシチジレート
[オリゴ(dC)]の付加。プラスミド−cDNA: mRNA
を含有するペレットを1mM・COCl2、0.1mMジチ
オスレイトール、0.2μgのポリ(A)、70μM・dC
TP、5μCi 32P−dCTP(3000Ci/ミリモ
ル)、および60Uのターミナルデオキシヌクレオチジ
ルトランスフェラーゼを含有する140mMカコジル酸
ナトリウム−30mMトリス・HCl(pH6.8)緩衝液2
0μlに溶解した。反応を37℃で5分間行い、各末端
に10〜15残基のdCMPを付加させ、0.25M・E
DTA(pH8.0)2μlおよび10%SDS 1μlで終
結させた。フェノール−CHCl3 20μlで抽出したの
ち水相を4M酢酸アンモニウム20μlと混合し、DN
Aを沈澱させ、エタノール80μlで再沈澱させ、最終
ペレットをエタノールで濯いだ。
【0154】工程3: エンドヌクレアーゼ消化。20m
Mトリス・HCl(pH7.4)、7mM・MgCl2、60mM
・NaCl、および0.1mg/mlのBSAを含有する緩衝
液30μlにペレットを溶解し、10UのHindIIIエ
ンドヌクレアーゼにより37℃で2時間消化した。反応
を0.25M・EDTA(pH8.0)3μlおよび10%S
DS 1.5μlで終結させ、フェノール−CHCl3で抽
出した後4M酢酸アンモニウム30μlを添加し、エタ
ノール120μlによりDNAを沈澱させた。ペレット
をエタノールで濯ぎ、次いで10μlの10mMトリス・
HCl(pH7.3)および1mM・EDTAに溶解し、エタ
ノール3μlを添加して−20℃での貯蔵に際して凍結
するのを防止した。
【0155】工程4: オリゴ(dC)テイル付きリンカー
DNAにより媒介された環化。HindIIIエンドヌク
レアーゼ消化したオリゴ(dC)テイル付きcDNA:mRN
Aプラスミド(試料の約90%)の試料9μlを、10mM
トリス・HCl(pH7.5)、1mM・EDTA、0.1M
・NaCl、および1.8ピコモルのオリゴ(dC)テイル
付きリンカーDNAを含有する混合物(90μl)の中で
65℃において5分間インキュベートし、42℃に移行
させ(60分間)、次いで0℃に冷却した。混合物(90
μl)を900μlの容量に調製した。20mM・トリス・
HCl(pH7.5)、4mM・MgCl2、10mM・(NH4)2
SO4、0.1M・KCl BSA 50μg/mlおよび
0.1mM・β−NADを含有していた。大腸菌DNAリ
ガーゼ6μgを添加し、次いで溶液を12℃で一夜イン
キュベートした。
【0156】工程5: DNAによるRNA鎖の置換。挿
入物のRNA鎖を置換するために、リゲーション混合物
を、4種のデオキシヌクレオシド三リン酸各40μM、
0.15mM・β−NAD、追加の大腸菌DNAリガー
ゼ4μg、16Uの大腸菌DNAポリメラーゼI(Pol
I)および9Uの大腸菌RNアーゼHを含有すべく調製
した。この混合物(960μl)を順次、12℃および室
温で各1時間インキュベートして、PolIによる修復合
成およびニックトランスレーションを促進した。
【0157】工程6: 大腸菌の形質転換。形質転換はコ
ーエンら(プロシ・ナショナル・アカデ・サ ユー
エスエー(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)、69:
2110−2114[1972])の方法をわずかに変更
したものにより行われた。大腸菌K−12株MC106
1(エム・カサダバンおよびエス・コーエン、ジェイ・
モレ・バイオロ(J.Mol.Biol.)、138: 179
−207[1980])を37℃でL−ブロス300m
l中において、600nmで0.5吸光単位になるまで増
殖させた。細胞を遠心分離により採取し、30mlの10
mMパイパス(pH7)60mM・CaCl2、15%グリセリ
ンに懸濁し、0℃で5分間遠心分離した。細胞を上記緩
衝液24mlに再懸濁し、再び0℃で5分間インキュベー
トした。次いでアリコートの細胞懸濁液をDNA溶液
(工程5)0.1mlと混合し、0℃で20分間インキュベ
ートした。次いで細胞を42℃に2分間保持した後室温
に10分間保持した。次いでL−ブロス1リットルを添
加し培養物を37℃で60分間インキュベートした。ア
ンピシリンを50μg/mlの濃度にまで添加した。培養
物を37℃でさらに10時間振とうした。この培養物の
希釈液を、アンピシリン50μg/mlを含有するL−ブ
ロス寒天上に広げた。37℃で12〜24時間インキュ
ベートした後各コロニーを無菌のつまようじで採取し
た。全体として約1×105の独立したcDNAクローン
が得られた。
【0158】D.pcDライブラリーのスクリーニング。 T細胞cDNAライブラリーから104の単一クローンを
ランダムに採取し、アンピシリン50μg/mlおよびジ
メチルスルホキシド7%を含むL−ブロス200μlを
入れたマイクロタイターディッシュのウェル中で別個に
増殖させた。新規なMCGF活性のみに注目するため
に、53個のIL−3cDNAクローンおよび1個のG
M−CSF cDNAクローンを、リーら、プロシ・ ナシ
ョナル・アカデ・サイ.(Proc.Natl.Acad.Sc
i.)、82巻、4360−4364頁(1985)および
ヨコタら、プロシ・ナ ショナル・アカデ・サイ (Pro
c.Natl.Ac ad.Sci.)、81巻、1070−107
4頁(1984)により示されたクローンから構成された
適宜な32P標識cDNAプローブとのハイブリダイゼー
ションにより同定し、除いた。この処理は下記に従って
行われた。培養物96種の各プレートのレプリカをニト
ロセルロースフィルター上に作成し、ハイブリダイゼー
ションスクリーニングに用いた。ハイブリダイゼーショ
ンは6XSSPE(1XSSPE=180mM・NaCl;
10mMリン酸ナトリウム(pH7.4); 1mM・EDT
A)0.1%SDS、100μg/ml大腸菌tRNA、5
0%ホルムアミド中で42℃において16時間行われ
た。ハイブリダイズするクローンは洗浄フィルターのオ
ートラジオグラフィーにより同定された。これらのクロ
ーンを含むミクロタイターウェルをクローンプールの調
製前にエタノールで滅菌することにより、これらのクロ
ーンを除いた。48個までのcDNAクローンを含むプ
ールをミクロタイター培養物から調製した。この種のプ
ール200個を、アンピシリン100μg/mlを含有す
るL−ブロスの培養物1リットル中で増殖させた。プラ
スミドDNAを各培養物から単離し、2回のCsCl濃度
勾配により精製した。各プールを表すDNAを下記によ
りCOS7サル細胞にトランスフェクションした(CO
S7細胞についてはグルツマンによりセル23巻、17
5−180頁(1981)に記載されており、ATCCか
ら受託番号CRL1651で入手できる。)
【0159】トランスフェクションの1日前に、10%
ウシ胎仔血清および2mMグルタミンを含有するDME
に、100mmのプレート上において、約106個のCO
S7サル細胞を接種した。トランスフェクションを行う
ために、培地を各プレートから吸引除去し、50mMト
リス・HCl(pH7.4)、400μg/ml・DEAE−デ
キストランおよび被験プラスミドDNA50μgを含有
するDME4mlで置換した。プレートを37℃で4時間
インキュベートし、次いでDNA含有培地を除去し、各
プレートを血清不含のDME5mlで2回洗浄した。クロ
ロキン150μMを含有するDMEをプレートに添加
し、次いで37℃でさらに3時間インキュベートした。
プレートをDMEで1回洗浄し、次いで4%ウシ胎仔血
清、2mMグルタミン、ペニシリンおよびストレプトマ
イシンを添加した。次いで細胞を37℃で72時間イン
キュベートした。増殖培地を採取し、種々のバイオアッ
セイ法において評価した。
【0160】最初の1組のプラスミドプールを主として
増殖アッセイ法により、TCGF活性およびMCGF活
性についてそれぞれHT−2細胞系列(下記に、より詳
細に記述する)およびMC/9細胞配列を用いてスクリ
ーニングした。これら2細胞系列についてアッセイした
最初の110プールのうち8プールはHT−2TCGF
アッセイにおいて有意の活性を生じた。これらのプール
のうち数種は弱いが有意のMCGF活性を示したけれど
も、MCGF活性は一般により弱くかつより変動性であ
ったため、本発明者らは陽性プールの同定のためこのア
ッセイ法を信頼しなかった。
【0161】ランダムプールトランスフェクションによ
るCOS7上層液の約半数はマウスB細胞に対するIa
誘導活性についてもアッセイされた。被験プールのうち
TCGF活性については有効であることが示された各プ
ールはIa誘導活性も備えていることが認められた。従
って、TCGF活性とIa誘導活性の間には完全な相関
関係があった。
【0162】すべてのアッセイにおいて再現性をもって
最も有効であった1プール(2A)を、より小さな48の
サブプールに小分割した。これらのサブプールはMCG
FおよびTCGF活性の双方について陽性であった。両
サブプールに共通の単一クローン、(2A−E3)を次い
で別個に増殖させ、そのプラスミドDNAを前記のCO
S7細胞にトランスフェクションした。次いで生じたC
OS上層液を各種活性の存在についてアッセイした。こ
れにfMCGF、TCGF、Ia誘導、ならびにIgEお
よびIgG増強活性が含まれていた。
【0163】クローン2A−E3から単離し、32Pで標
識した366塩基対の長さをもつPstI断片(図1)をプ
ローブとして用いて、生物活性について陽性であったプ
ールおよび他の未試験プールをスクリーニングした。ス
クリーニングは前記のようにマイクロタイター培養物の
レプリカを作成したフィルターへのハイブリダイゼーシ
ョンによって行われた。ハイブリダイズした9クローン
を単離し、それらのDNAを制限マッピングにより分析
した。生物活性を示したプールはすべて、クローン2A
−E3と共通の制限開裂地図を共有する少なくとも1種
のハイブリダイズクローンを含んでいた。採取したクロ
ーン104のうちハイブリダイズクローンは、総ライブ
ラリー中約0.2%の頻度を示す。被験ハイブリダイズ
クローンのうち約90%が機能性タンパク質を発現し
た。
【0164】E.pcD−2A−E3でトランスフェクシ
ョンしたCOS7サル細胞の培養上層液の生物活性 pcD−2A−E3でトランスフェクションしたCOS7
細胞からの上層液を、ネズミヘルパーT細胞系列HT−
2においてTCGF活性につき試験した(ワトソン、
ェイ・エクスペ・メディ(J.Exp.Med.)、150
巻、1510頁(1979)に記載)。モスマン(前掲)の
比色アッセイ法により測定したHT−2細胞の増殖をT
CGF活性の尺度として用いた(増殖の程度は570〜
630nmの光学濃度(OD)と相関関係にあった)。図8
は種々の希釈度における(i)pcD−2A−E3でトラン
スフェクションしたCOS7細胞から得た上層液(曲線
1)、(ii)Cl.Lyl+-/9培養物から得た上層液(曲
線2)、(iii)IL−2 cDNAを保有するpcDプラス
ミドでトランスフェクションしたCOS7細胞から得た
上層液(曲線3)および(iv)cDNA挿入物を含まないpc
DプラスミドでトランスフェクションしたCOS7細胞
(すなわち“モック(mock)”トランスフェクション)から
得た上層液(曲線4)の相対的TCGF活性を示す。
【0165】同様に、pcD−2A−E3トランスフェク
ションしたCOS7細胞から得た上層液をMC/9細胞
におけるMCGF活性について試験した。この場合もモ
スマンの比色アッセイ法を採用してMC/9増殖を測定
した。図9は(i)pcD−2A−E3でトランスフェクシ
ョンしたCOS7細胞から得た上層液(曲線1)、(ii)I
L−3 cDNAを保有するpcDプラスミドでトランスフ
ェクションしたCOS7細胞から得た上層液(曲線2)、
(iii)Cl.Lyl+-/9細胞から得た上層液(曲線3)、
および(iv)モックトランスフェクションしたCOS7細
胞から得た上層液(曲線4)の相対的MCGF活性を示
す。
【0166】図10は(i)pcD−2A−E3でトランス
フェクションしたCOS7細胞の上層液(曲線1)、(ii)
Cl.Lyl+-/9細胞の上層液(曲線2)、および(iii)
モックトランスフェクションしたCOS7細胞の上層液
(曲線3)について行ったIa誘導アッセイの結果を示
す。Ia誘導アッセイはレームら(前掲)により記載され
た方法に従って行われた。数匹のDBA/2マウス(2
〜3カ月令)を屠殺し、脾臓を外科処置により採取し
た。0.87%塩化アンモニウムを用いる低張ショック
により赤血球を細胞溶解した。次いで、T細胞特異性表
面マーカー(Thy−1、Lyt−1およびLyt−2)指向性
の細胞毒性モノクローナル抗体を用いてT細胞を溶解
し、次いで家兎補体中でインキュベートした。次いで、
フィコール−ハイパーク密度勾配により死細胞を除去し
た。付着性細胞は37℃プラスチック製シャーレに付着
させることによりあらかじめ除去されていた。この時点
で細胞を洗浄し、計数し、生存率につき採点した。10
%のウシ胎仔血清、2−メルカプトエタノールおよび各
種抗生物質(ペニシリン、ストレプトマイシンおよびゲ
ンタマイシン)を補充した組織培養用培地(RPMI16
40、または最小必須培地−MEM/アーレの塩(ジブ
コ)0.5ml中で約100万個の細胞をインキュベートし
た。陽性の対照がT細胞有糸分裂誘発因子コンカナバリ
ンAで誘発したT細胞からの上層液よりなる実験におい
ては、10mg/ml(最終濃度)のα−メチルマンノシドを
添加して、有糸分裂誘発因子を中和した。24時間のイ
ンキュベーションの後、細胞を採取し、抗−I−Adま
たは抗−I−Abdモノクロナール抗体による染色のため
に調製した。これらの抗体をハプテンN.I.Pまたはビ
オチンのいずれかに結合した第1段階抗体として用い
た。次いで細胞を蛍光処理した第2段階試薬(抗−NI
P抗体またはアビシン)と共にインキュベートすること
により、染色を完了した。次いで蛍光活性化細胞ソータ
ー(ベクトン−ディッキンソン、カリフォルニア州、マ
ウンテンビュー)またはサイトフルオログラフ(オルト・
ダイアグノスティックス、マサチュセッツ州、ケンブリ
ッジ)を用いて蛍光染色の強度を測定した。図10の蛍
光単位は、各試料中の陽性細胞の%に蛍光染色の強度を
掛けることにより算出された。
【0167】図11はIgEおよびIgG1の産生がT細
胞枯渇したマウス脾臓細胞において(i)COS7培地の
み(棒1)、(ii)モックトランスフェクションしたCOS
7細胞からの上層液20%(棒2)、8(iii)Cl.Lyl+
-/9からの上層液10%プラスモックトランスフェ
クションしたCOS7細胞からの上層液20%(棒3)、
および(iv)pcD−2A−E3トランスフェクションした
COS7細胞からの上層液20%(棒4)により誘発され
る程度をグラフで示す。IgEおよびIgG1の水準は前
記の同基準標本特異性ELISAにより測定された。
【0168】ネズミIL−4はMC/9細胞においてI
L−3のMCGF活性を高めることが認められた(スミ
スおよびレニック、プロシ・ナショナル・アカデ・サイ
(Proc.Natl.Acad.Sci.)、83巻、1857
−1861頁(1986)、ネズミIL−4はIL−3依
存性細胞系列のGM−CSF刺激による増殖を高めるこ
とも認められた(ホームズら、プロシ・ナショナル・ア
カデ・サイ (P roc.Natl.Acad.Sci.)、82
巻、6687−6691頁(1985)に記載)。挿入物
はマキサマおよびギルバー法(メソッズ・イン・エンザ
イモロジー、65巻、499−560頁(1980))、
ならびにサンガー法(プロシ・ナショナル・アカデ ・サ
(Proc.Natl.Acad.Sci.)、74巻、546
3−5467頁(1977))の双方により配列決定され
た。図1にその配列を、第1ATG開始コドンと同相の
最長オープンリーディングフレームについての推定アミ
ノ酸配列と共に示す(配列番号1)。マウス2A−E3
cDNAクローンにおける単一長鎖オープンリーディン
グフレームは140アミノ酸残基からなる。このリンフ
ォカインは分泌タンパク質であるので、疏水性リーダー
配列が分泌形の成熟タンパク質に関する配列に先行する
と予想される。ポリペプチドの疏水性を分析し、先行す
るシグナルペプチドに関して提示されたコンセンサス配
列(パールマンら、ジェイ・モレ・バイオロ(J.Mol.
Biol.)、167巻、391−409頁(1983))と
比較することにより、前駆ポリペプチドの開裂は図1の
アミノ酸位置20におけるセリン残基に続いて起こるこ
とが示唆される。グラブシュタインら(ジェイ・エクス
ペ・メディ、(J.Exp.Med.)、163巻、1405
−1414頁(1986))は分泌されたネズミIL−4
のN−末端配列が図1の位置21Hisにおいて開始する
ことを確認した。
【0169】実施例II.ヒトヘルパーT細胞cDNA
に対するネズミcDNAプローブによるヒトIL−4の
産生ならびにCOS7 サル細胞およびマウスL細胞にお
ける一過性発現 誘導ヒトヘルパーT細胞、2F1、および誘導ヒト末梢
血リンパ球(PBL)から構成されたcDNAライブラリ
ーより、ネズミcDNAプローブによってIL−4をコ
ードするcDNAクローンを単離した。BCGF活性を
生じることが知られている他のヒト細胞系列にはCEM
系列の変種が含まれ、ATCCから受託番号CCL11
9、CRL8436、およびTIB195で入手でき、
フォーレーら、キャンサー、18巻、522−529頁
(1965)、およびクグラー、リンフォカイン・リサー
、3巻、183−191頁(1984)に記載されてい
る。
【0170】ヒトヘルパーT細胞クローン、2F1、お
よびヒトPBLを、ウシ胎仔血清3%を補充したイスコ
ブの培地で増殖させた。2F1細胞をConA(10μg/
ml)で活性化し、PBLをPNA 1μg/mlで12時間
刺激した後5μg/mlのConAを添加した。ConA添加
の4時間後(2F1)または10時間後(PBL)に細胞を
採取した。
【0171】mRNAの抽出およびcDNAライブラリー
の構成は実施例1の記載に従って行われた。PstI断片
をマウスpcD−2A−E3 cDNAクローンから単離
し、ニックトランスレーションにより標識し、(1×1
8cpm/μg)、10個のプール(それぞれ約1×103
ローンの2F1 cDNAライブラリーを表す)からのプ
ラスミドDNA調製物を含むニトロセルロースフィルタ
ーのプローブ検出に用いた。低ストリンジェンシーハイ
ブリダイゼーション条件(42℃で一夜)を採用した。6
xSSPE(1xSSPE=180mM・NaCl/10mM
リン酸ナトリウム(pH7.4)/1mM・EDTA)(ティ
ー・マニアチスら、 子クローニング: 実験室の手引
(コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、ニ
ューヨーク、(1982))、20%(v/v)ホルムアルデ
ヒド、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム、酵母キャリヤ
ーtRNA 100μl。フィルターを2×SSPE、0.
1%ドデシル硫酸ナトリウムで37℃において洗浄し
た。
【0172】単一クローン(pcD−46)が10中1個の
プールにおいて同定された。他のクローンが、pcD−4
6のNheI−EcoRI断片(図7の制限地図に示す)から
構成されたプローブを用いてPBL cDNAライブラリ
ーをスクリーニングすることにより得られた。制限酵素
による分析からこれらのPBLクローンの構造はpcD−
46と等しいことが示された。
【0173】pcD−46のコード部位挿入物から5'(す
なわち上流)方向のグアニジンに富む領域がIL−4ポ
リペプチドの発現を抑制することが見出された。従って
pcD−46の挿入物を再クローニングしてグアニジンに
富む領域を除去した。得られたクローンはpcD−125
と表示される。マウスL細胞をpcD−46でトランスフ
ェクションすることによっても発現が改良されることが
見出された。ベクターpcD−125は下記により形成さ
れた。pcD−46をSau3Aで開裂して、cDNA挿入
物の5'側162ヌクレオチドを含む断片(GCセグメン
トを除く)を単離し、次いでこの断片をp101のBgl
I部位に挿入した。プラスミドp101はpcDマウスI
L−3(ヨココタら、[1984]前掲文献参照]から誘導
され、cDNAの5'末端のPstI部位からマウスIL−
3 cDNA内のBglII部位までの配列を欠失してい
た。BglII部位は欠失配列のジャンクションに含まれ
る。Sau3A断片をpcD−46断片の場合と同様にSV
40プロモーターに融合させた(GCセグメントを除
く)。次いでcDNAの3'末端、SV40ポリA部位、
およびpcD−46のすべてのpBR322配列を保有す
るpcD−46からのHindIII/NheI断片を用いて
ヒトcDNAの残部を再構成した。
【0174】pcD−46およびpcD−125−トランス
フェクションされたCOS7およびL細胞の上層液をB
CGFおよびTCGF活性についてアッセイした。TC
GFはエプスタイン−バルウイルスで形質転換されたヒ
トヘルパーT細胞系列JL−EBV、およびフィトヘマ
グルチニン刺激されたヒト末梢血リンパ球を用いてアッ
セイされた。
【0175】ヒトヘルパーT細胞クローンJL−EBV
を、ヒトEBV形質転換B細胞系列の照射(4500R)
細胞で刺激したのち、10%ヒトAB血清、50μM−
2−メルカプトエタノール(2ME)および組換えヒトI
L−2を含有するRPMI1640培地中に維持した。
ヒトPBLをPHA(20μg/ml)で刺激し、10%ウ
シ胎仔血清、50μM・2MEおよび組換えヒトIL−
2を含有するRPMI1640中に維持した。刺激の5
〜10日後にJL−EBV細胞またはPHAブラスト(b
last)をモスマンの比色法(前記)による2日間のTCG
Fアッセイ法または[3H]−チミジン取込みによる3日
間のTCGFアッセイ法においてターゲットとして用い
た。
【0176】図12は、JL−EBV細胞により測定し
た(比色アッセイ法) (i)ヒトIL−2を発現するpcDプラスミドでトランス
フェクションしたCOS7細胞からの上層液(曲線A);
(ii)pcD−125でトランスフェクションしたL細胞か
らの上層液(曲線B); (iii)pcD−125でトランスフ
ェクションしたCOS7細胞からの上層液(曲線C); (i
v)pcD−46でトランスフェクションしたCOS7細胞
からの上層液(曲線D); および(v)モックトランスフェ
クションしたCOS7細胞からの上層液(曲線E)のTC
GF活性を示す。図13はPHA刺激したPBLにより
測定した(比色アッセイ法)(i)ヒトIL−2を発現するp
cDプラスミドでトランスフェクションしたCOS7細
胞からの上層液(曲線A)、(ii)pcD−125でトランス
フェクションしたCOS7細胞からの上層液(曲線B)、
および(iii)モックトランスフェクションしたCOS7
細胞からの上層液(曲線C)のTCGF活性を示す。図1
4はPHA刺激されたPBLにより測定された(トリチ
ル化チミジン取込みアッセイ法)(i)pcD−125でトラ
ンスフェクションしたCOS7細胞からの上層液(曲線
A)、(ii)ヒトIL−2を発現するpcDプラスミドでト
ランスフェクションしたCOS7細胞からの上層液(曲
線B)、および(iii)モックトランスフェクションしたC
OS7細胞からの上層液(曲線C)のTCGF活性を示
す。
【0177】pcD−125トランスフェクション上層液
の各種希釈液のBCGF活性を、マイゼルら、(プロシ
・ナショナル・アカデ・サイ (Proc.Natl.Acad.
ci.)、79巻、5998−6002頁(1982))に
より報告されたBCGF(“市販BCGF”)(サイトカ
イン・テクノロジー・インターナショナル(ニューヨー
ク州、バッファロー)から市販されている)の活性と比較
した。表2は抗IgM抗体により予備活性化したB細胞
に対するCOS7トランスフェクション上層液の各種希
釈液のBCGF活性を示す。B細胞は前記アッセイの章
の記載に従って調製された。
【0178】
【表2】
【0179】表3はSAC予備活性化されたB細胞(前
記により調製)における、COS7トランスフェクショ
ン上層液の各種希釈液のBCGF活性を示す。
【0180】
【表3】
【0181】本発明のヒトIL−4および市販のBCG
Fは共にBCGF活性を示すが、メータら(ジェイ・イ
ムノロ(J.Immunol.)、135巻、3298−330
2頁(1985)は市販のBCGFのBCGF活性から生
化学的にTCGF活性を分離できることを証明した。こ
れはその活性が別個の分子によって生じていることを示
している。従ってヒトIL−4と市販のBCGFは異な
る分子である。ヒトIL−4の場合、TCGF活性を標
準的な生化学的分画技術によってBCGF活性から分離
することはできないからである。
【0182】ヒトIL−4cDNAを保有するプラスミ
ドでトランスフェクションされたCOS7細胞からの上
層液は正常なヒトT細胞およびヒトT細胞クローンJL
−EBVの増殖、ならびにマウスIL−4に類似の活性
を誘発する。しかしヒトIL−4に応答して誘発された
ヒトT細胞の最大増殖度はヒトIL−2により誘発され
たものの約半分である。IL−4の増殖誘発活性は試験
に際しIL−2に対する、またはIL−2レセプターに
対するモノクローナル抗体により阻害されなかった。こ
れらの結果は、IL−4はT細胞に直接に作用し、IL
−2の誘導によるものではないこと、またその活性はI
L−2レセプターにより媒介されないことを示唆する。
COSヒトIL−4上層液はビーズに結合した最適濃度
の抗IgM抗体で予備活性化されたヒトB細胞の増殖も
刺激し、BCGFアッセイの飽和水準において市販のB
CGFに付加的な増殖容量をもつ。これは、ヒトIL−
4と市販のBCGFが異なる経路で、たとえば恐らく異
なる組のレセプターによりB細胞に作用することを示唆
する。各上層液はSACで予備活性化されたB細胞の増
殖を有意に誘発しなかったが、PHAで刺激されたPB
L培養物の上層液から精製した市販のBCGFはSAC
予備活性化されたヒトB細胞の増殖を著しく誘発した。
これらの結果はさらに、ヒトIL−4cDNAが市販の
BCGFに存在するものと異なるBCGF活性をコード
することを示す。
【0183】pcD−125トランスフェクションしたC
O7細胞の上層液を、それが扁桃腺B細胞のFc−イプ
シロンレセプターを誘発する効力についても試験した。
ヒト扁桃腺細胞を標準法により分散させ、単一細胞懸濁
液となした。前記のプロトコールによりB細胞集団を濃
縮し、濃縮された細胞を37℃の培地中で24時間、抗
IgM抗体により刺激した。Fc−イプシロンレセプター
保有細胞をベクトン・ディッキンソンFACS IV細
胞ソーターにより、該レセプターに特異的な蛍光標識モ
ノクローナル抗体を用いてボンネフォイら、(ジェイ・
イムノロ・メソ(J.Immunol.Meth.)、88巻、2
5−32頁(1986)により示された方法によりアッセ
イした。図15−18は細胞頻度(縦軸)対蛍光強度(横
軸)を示すヒストグラムである。蛍光強度は細胞上に存
在するFc−イプシロンレセプターの数に比例する。す
べての図において細胞は抗IgMで刺激された。図15
−18はpcD−125トランスフェクションしたCOS
7細胞からの0%、0.1%、1%および10%上層液
からなる培地への暴露に相当する。
【0184】クローンNo.46のcDNA挿入物のDN
A配列を決定し、図2に示す(配列番号2)。cDNA
挿入物は615bpの長さである(ポリ(A)テイルを除
く)。単一オープンリーディングフレームがあり、最初
のATGコドンは5'末端から64ヌクレオチドの位置
にあり、これに153コドンが続き、ヌクレオチド位置
523〜525の終止コドンTAGで終わる。予言され
たポリペプチドのN末端セグメントは分泌タンパク質に
ついて予期されたように疏水性である。
【0185】本発明のヒトおよびマウスcDNAのコー
ド部位間の比較によって、アミノ酸位置1−90および
129−149に包含される、pcD−46のヒトcDN
Aコード配列の各領域は、対応するマウスcDNA(2A
−E3)コード配列領域とほぼ50%相同域を共有する
ことが明らかになった。これらの領域、ならびに5'お
よび3'非翻訳領域はこれら異種からの2種のcDNA配
列間でほぼ70%の相同域を共有するが、ヒトタンパク
質のアミノ酸91−128により包含される領域はマウ
スの対応する領域と共有する相同域がごく限られてい
る。全体的にヒトタンパク質における7個のシステイン
残基のうち6個は関連するマウスタンパク質において保
守されている。天然の形の本発明のヒトポリペプチドを
マウスIL−3のものとの間には若干のアミノ酸配列相
同性がある。アミノ酸残基7−16および120−12
7は、それぞれマウスIL−3前駆ポリペプチドの残基
16−27および41−49に50%および55%相同
である(ヨコタら、プロシ・ナショナ ル・アカデ・サ
イ.,ユーエスエー(Proc.Natl.Acad.Sci. U.
S.A.)81:1070−1074[1984]).
【0186】後に、より詳細に記述するように、pcD−
125トランスフェクションしたCOS7上層液から精
製したヒトIL−4は図3に示した配列をもつ129ア
ミノ酸ポリペプチドであることが見出された(配列番号
3)。
【0187】実施例III.RSV−LTRプロ モータ
ーを含むエプシュタインバルウィルス(EBV)由来のベ
クターの使用によるCOS7サル細胞におけるヒト IL
−4の発現の増強 ラウス肉腫ウイルス長鎖末端反復(RSV−LTR)プロ
モーターを含むEBV由来のベクターへpcD−125の
Xho I断片を再クローニングすることにより、ヒトI
L−4発現が10〜20倍増強された。EBV由来のベ
クターおよびRSV−LTRプロモーターはゴルマン
ら,プロシ・ナ ショナル・アカデ・サイ(Proc.Natl.
Acad.Sci.)79巻,6777−6781頁(198
2):およびエイテスら,ネイチャー,313巻,812−
815頁(1985)に記載されている。
【0188】RSV−LTRプロモーターを含むHind
III/Xho I断片を、ゴルマンら(前掲)により記載
されたAccCI/HindIII断片を含むRSV−LT
Rおよび市販のpcDベクター(たとえばファルマシア)よ
りあらかじめ構成されたpcDプラスミドから単離した。
SV40複製起点(ori)を含むpL1プラスミド(ファル
マシア)から得た上記のHin dIII/XhoI断片および
HindIII/XhoI断片をプラスミドPCDV1(ファ
ルマシアから入手できる)へ挿入した。SV40ori領域
の向きは決定的ではない。得られるpcDベクターはAat
II部位とNdeI部位の間に順次(AatII部位から)S
V40ori領域、RSV−LTRプロモーター、および
SV40ポリA領域を含む。pcD−125のXhoI断片
を単離し、新たに構成されたpcDベクターに挿入した
後、ベクター上の唯一のAatIIおよびNdeI部位を標
準法によりSalI部位に変える。要約すると、pcDベク
ターをAatIIおよびNdeIで消化し、IL−4を含む
断片を単離し、単離された断片を適宜な濃度のヌクレオ
シド三リン酸の存在下でT4 DNAポリメラーゼの
5'→3'DNAポリメラーゼ活性が制限切断部の5'突
出末端をフィルインし、T4 DNAポリメラーゼの
3'→5'エキソヌクレアーゼ活性が制限切断部の3'突
出末端を消化して平滑末端断片を残し、これにキナーゼ
処理Sal Iリンカー(ニュー・イングランド・バイオ
ラボズ)をT4 DNAリガーゼによりリゲートする。
【0189】上記Sal I断片(図30に示す)をエイテ
スら(前掲)により記載されたEBV由来のベクターp2
01の唯一の la I部位の位置(標準法によりSal
I部位に変えられている)に挿入する。要約すると、p2
01(図30に示す)をCla Iで消化し、DNAポリメ
ラーゼI(クレノー断片)および適宜な濃度のヌクレオシ
ド三リン酸類で処理する。この方法により、Cla I切
断部の突出末端がフィルインされ、平滑末端断片が残さ
れる。次いで平滑末端をキナーゼ処理Sal Iリンカー
にリゲートする。得られたRSV−LTRプロモーター
およびIL−4cDNA挿入因子を含むEBV由来のプ
ロモーターをここではpEBV−178と呼ぶ。
【0190】pEBV−178を標準法によりCOS7
細胞中にトランスフェクションし、培養上層液をIL−
4発現の尺度としてのTCGF活性についてアッセイし
た。
【0191】実施例IV.大腸菌における天然のヒトI
−4およびムテインIS 0 (Ala−Glu−Phe)の発現 ヒトIL−4cDNA挿入物を含む2種のベクターを大
腸菌におけるヒトIL−4の発現用として構築した。す
なわちompAタンパク質のシグナルペプチド配列を含むp
IN−III分泌ベクター(“pIN−III−ompA
2”),ならびにtrp Pプロモーターおよび隣接するリ
ボソーム結合部位(RBS)隣接を含むpUC12プラス
ミド(“TRPC11”)である。
【0192】A.pIN−III−ompA2 pIN−III−ompA2プラスミド(グラエブ(Ghraye
b)ら,EMBOジャーナル,3巻,2437−2442頁
(1984),およびマツイら,バイオテクノロジー,2巻,
81−85頁(1984)に記載)を用いて2種のベクタ
ーを構築した。
【0193】pIN−IIIompA2(1)と表示される第
1ベクターは順次EcoRI/BamHI−消化pIN−I
II−ompA2プラスミド、合成リンカー、およびpcD
−125のBamHI/EcoRV断片をリゲートすること
により構築された。この構築に用いた合成リンカーは3
個の追加N末端アミノ酸Ala−Glu−Phe−をもつ生物
活性IL−4ポリペプチドを分泌した。すなわちムテイ
ンIL0(Aia−Glu−Phe)が分泌された。合成リンカ
ーは下記のヌクレオチド配列からなっていた(配列番号
17および18)。 AA TTC CAC AAG TGC GAT G GTG TTC ACG CTA
【0194】EcoRI/BamHI−消化pIN−III
−ompA2およびpcD−125のBamHI/EcoRV断
片を、0.1μM合成リンカーを含有する標準リゲーシ
ョン溶液(たとえばマニアチスら、前掲)中で混合した。
大腸菌株Ab1899をpIN−III−ompA2(1)プ
ラスミドで感染し、形質転換体を32P−標識付きIL−
4cDNAプローブによるコロニーハイブリダイゼーシ
ョンにより選択した。アッセイ用のヒトIL−4抽出物
は下記により得られた。音波処理後に細菌培養物を遠心
分離し、上層液をペレットから除去した。ペレットを1
%SDS、2mMジチオスレイトール、および6Mグア
ニジンで処理した。材料を再遠心分離し、上層液を廃棄
し、ペレットを45℃で3%SDSおよび2mMジチオ
スレイトールで処理した。材料を再び遠心分離し、上層
液をSDS−PAGEによりアッセイした。
【0195】pIN−III−ompA(2)は天然ヒトIL
−4を発現すべく構築された。pIN−III−ompA
(1)構築における3種のアミノ酸付加物をpIN−II
I−ompA2のompAシグナルペプチド配列の部位特異性
突然変異により除去した。部位特異性突然変異はゾラー
およびスミス(前掲)の記事に従って行われた。要約する
と、ompAシグナルペプチドをコードする配列を含むpI
N−III−ompA2のXbaIBamHI断片(グラエブ
らの第1図を参照されたい、前掲)を精製し、精製され
XbaIBamHI消化した複製形(RF)のM13mp1
9と混合し、リゲートし、大腸菌K−12 JM101
にトランスフェクションし、平板培養した。IPIGお
よびX−galの存在下で透明なプラークを選択し、増殖
させ、たとえばメッシング,メソッズ・イン・エンザイ
モロジー,101巻(アカデミック・プレス、ニューヨー
ク、1983)に示された方法により一重鎖DNAを調
製した。別個に、指示された塩基置換体(四角で囲んだ
もの)を含む下記のオリゴヌクレオチドプライマー(23
−mer)を合成し、リン酸化した。
【0196】
【化1】
【0197】この配列(配列番号19)は突然変異pI
N−III−ompA2のシグナルペプチドコード部位に
第2のHindIII部位を導入する。pIN−III−om
pA2のXbaIBamHI断片を含むM13mp19 R
Fにこのオリゴヌクレオチドプライマーをアニールし、
適宜な濃度のヌクレオシド三リン酸類の存在下にDNA
ポリメラーゼで処理した。得られたRFを用いてJM1
01大腸菌をトランスフェクションし、突然変異を含む
プラークを標識付きオリゴヌクレオチドプローブにより
スクリーニングした。選ばれたRFの配列はユニバーサ
ルM13プライマーを用いるジデオキシ配列決定法によ
り確認された。選ばれたRFを増殖させ、単離し、Xba
IおよびBamHIで消化し、精製XbaI/BamHI断片
XbaIBamHI消化したpIN−III−ompA2に
挿入した。pIN−III−ompA2(2)を形成するため
に、pIN−III−ompA2を増殖させ、精製し、Hin
dIIIおよびBamHIで消化し、pcD−125のBam
I/EcoRV断片と、0.1μMの下記合成リンカー
(配列番号20および21)を含有する標準リゲーショ
ン溶液中で混合した。
【0198】 A GCT CAC AAG TGC GAT GTG TTC ACG CTA
【0199】大腸菌株Ab1899にpIN−III−om
pA2(2)プラスミドを感染させ、形質転換体を32P−
標準IL−4cDNAプローブによるコロニーハイブリ
ダイゼーションにより選択した。前記により調製された
IL−4抽出物はpcD−125 COS7細胞上層液に
匹敵するTCGF活性を示した。
【0200】B.TRPC11 TRPC11ベクターは合成コンセンサスRBS断片を
Cla Iリンカー(ATGCAT)にリゲートし、得られ
た断片をCla I制限pMT11hc(あらかじめCla
部位を含むべく修飾されている)へクローニングするこ
とにより構築された。pMT11hcはπVXプラスミド
(マニアチスらにより記載、前掲)のEcoRI/Hind
IIポリリンカー領域を保有するpBR322の小型
(2.3Kb)高コピーAMPR,TETS誘導体である。こ
れはpMT11hcをEcoRIおよびBamHIで制限し、
得られた粘着末端をフィルーインし、Cla Iリンカー
(CATCGATG)とリゲートさせ、これによりEcoR
IおよびBamHI部位を再形成し、SmaI部位をCla
I部位で置換することによって、Cla I部位を含有
すべく修飾された。
【0201】TRPC11構成からの一形質転換はCla
I部位によりフランクされた縦列RBS配列を含んで
いた。Cla I部位の1つおよびRBS配列の第2コピ
ーの一部は、このプラスミドを、Pst Iで消化し、
a131ヌクレアーゼで処理し、Eco Iで制限し、4
種すべてのデオキシヌクレオシド三リン酸類の存在でT
4 DNAポリメラーゼで処理することにより除去され
た。得られた30−40bp断片をPAGEにより採取
し、Sma I制限pUC12へクローニングした。次い
で、pKC101(ニコルズらによりメソッズ・ イン・エ
ンザイモロジー,101巻,155頁(アカデミック・プ
レス・ニューヨーク、1983)に記載)から誘導された
2488bp 大腸菌trp P保有EcoRV断片をEcoR
I部位にクローニングし、TRPC11の構築を完了し
た。これを図31に示す。
【0202】TRPC11をまずCla IおよびBamH
Iで消化し、これを精製し、次いで0.1μMの下記合
成リンカー(配列番号22および23)を含有する標準
リゲーション溶液中でpcD−125の coRV/BamH
I断片と混合することによって、TRPC11をヒトI
L−4cDNAに関するベクターとして用いた。
【0203】 TCG ATG CAC AAG TGC GAT AC GTG TTC ACG CTA
【0204】挿入物を含むベクターを前記に従って選択
し、大腸菌K−12株JM101中で増殖させた。IL
−4は下記により抽出された。JM101細胞をそれら
の培地中で音波処理し、遠心分離した。ペレットを4M
グアニジンおよび2mMジチオスレイトールに再懸濁
し、再び遠心分離した。上層液を生物活性につき試験
し、pcD−125トランスフェクションしたCOS7細
胞の上層液のものに匹敵するTCGF活性を示すことが
認められた。
【0205】実施例V.ウシヘルパーT細胞cDNAラ
イブラリーに対するマウスおよびヒトIL−4cDNA
プローブによるウシIL−4の調製およびCOS7サル
細胞における一過性発現 マウスおよびヒトcDNAプローブの組合わせにより誘
発されたウシ末梢血リンパ球(PBL)から構築されたc
DNAライブラリーより、IL−4をコードするcDN
Aクローンを単離する。ウシcDNAの代替供給源には
ATCCのNBL動物系列コレクションに維持される数
種のウシ細胞系列が含まれる。処理法は実施例2に記載
されたものと実質的に等しい。ConAによる誘発の約1
0時間後に細胞を採取する。mRNAの抽出の場合と同
様に行われる。
【0206】マウスおよびヒトcDNAプローブを共に
混合物として、または順次用いて、ウシIL−4cDN
Aを検出する。実施例IIの場合と同様に、Pst I断
片をマウスpcD−2A−E3 cDNAクローンから単
離する。同様にPst I断片をヒトpcD−125 cD
NAクローンから単離する。他の数種の断片もこれから
プローブを構成するために用いることができる。単離さ
れたPst I断片を一緒に、または別個にニックトラン
スレーションにより標識し(約1×108cpm/μg)、こ
れを用いて10プールからのプラスミドDNA調製物を
含むニトロセルロースフィルターをプローブ検出する。
各プローブは約1000クローンの誘導PBL cDN
Aライブラリーを示す。フィルターハイブリダイゼーシ
ョンは実施例IIの場合と同様に行われた。陽性に採点
されるクローンを同定し、増殖させた。
【0207】実施例VI.ビール酵母菌における天然ヒ
トIL−4およびムテインΔ 1-4 およびIS 0 (Gly−As
n−Phe−Val−His− Gly)の発現 天然ヒトIL−4cDNAおよびそれらの2種の突然変
異体をプラスミドpMF−28にクローニングし、ビー
ル酵母菌において発現させた。pMF−28の構成およ
び非酵母タンパク質発現への利用についてはミヤジマ
ら,ジーン,37巻,155−161頁(1985):ミヤジ
マら,EMBO ジャーナル,5巻,1193−1197頁
(1986)に詳細に記載されている。pMF−28はア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(マリー
ランド州,ロックビル)に受託番号40140で寄託され
ており、プラスミドの地図は図32に示されている(図
中の表示はミヤジマら,ジーン、(前掲)に詳細に定義さ
れている)。
【0208】A.ヒトIL−4ムテインΔ1-4 プラスミドpcD−125を単離し、EcoRVおよび am
Iで消化した。ヒトIL−4cDNAを含むEc oR
BamHIを単離し、DNAポリメラーゼI(クレノー
断片)で処理してBamHI切断部をフィルーインし、キ
ナーゼ処理した(すなわちリン酸化)。pMF−28をSt
u Iで消化し、pcD−125のキナーゼ処理EcoR
BamHI断片と標準リゲーション溶液中で混和し、プ
ラスミドphIL−4−2を形成した。phIL−4−2を
用いてビール酵母菌20B−12(MTAアルファtrp
1−289 pep4−3)(酵母遺伝子保存センター、カ
リフォルニア大学、バークレーから入手した)を形質転
換した。アミノ酸不含のイースト・ナイトロジェン・ベ
ース0.67%、グルコース2%およびカザミノ酸(ディ
フコ)0.5%を含有する合成培地で酵母を増殖させた。
酵母細胞を上記プラスミドでイトーら、(ジェイ・バク
テリオロ・(J.Bacteriol.),153巻,163−16
8頁(1983))の酢酸リチウム法により形質転換し、
形質転換体をトリプトファン欠如合成培地において選択
した。形質転換体培養物上層液をTCGF活性について
試験した。図32(曲線D)はphIL−4−2形質転換し
た酵母細胞から得た上層液の希釈液数種のTCGF活性
を他の因子と比較して示す(曲線A………ヒトIL−2;
曲線B………pcD−125トランスフェクションしたC
OS7細胞からの上層液;および曲線C………phIL−
4−2形質転換した酵母細胞からの上層液)。曲線Eは
IL−4cDNA挿入物を欠如したpMF−28で形質転
換した酵母(すなわち“モック(mock)”形質転換体から
の上層液のTCGF活性を示す。
【0209】B.ヒトIL−4ムテインIS0(Gly−A
sn−Phe−Val−His−Gly) ムテインIS0(Gly−Asn−Phe−Val−His−Gly)
の発現のためのpMF−28挿入物をムテインΔ1-4の場
合と同様に調製した。ただしpcD−125由来のNaeI
BamHI断片を用いた。得られたプラスミドをphIL
−4−1と表示した。phIL−4−1形質転換した酵母
細胞から得た上層液の希釈液数種類をTCGF活性につ
き試験した。結果は図33の曲線Cによって示される。
上層液を抗IgMおよびSAC活性化Bリンパ球の双方
においてBCGF活性についても試験した。これらのア
ッセイは前記に従って行われ、結果は表4に示される。
【0210】
【表4】
【0211】C.酵母における天然ヒトIL−4の発現 まずN末端Hisコドンの上流に塩基を挿入することによ
Kpn I制限部位を形成することによって、ヒト天然
IL−4をコードするcDNAをpMF−α8にクローニ
ングした。Kpn Iで開裂し、DNAポメリラーゼIで
処理した後、平滑末端IL−4cDNAをpMF−α8の
Stu I部位に挿入した。Kpn I部位は標準的な部位
特異性突然変異誘発を採用して形成された。要約する
と、pcD−125をBamHIで消化し、ヒトIL−4c
DNA全体を含む断片を単離し、M13mp8のBamH
部位へ挿入した。この挿入物を含む一重鎖M13mp8を
単離し、プライマーとして作用する下記の合成オリゴヌ
クレオチド(配列番号24)にハイブリダイゼーション
した。
【0212】
【化2】
【0213】挿入されたヌクレオチドを四角で囲んだ。
突然変異IL−4cDNAを含むプラスミドをオリゴヌ
クレオチドプローブにより同定し、増殖させ、単離し、
KpnIおよびBamHIで処理した。Kpn I/BamHI
断片を単離し、DNAポメリラーゼI(クレノー断片)で
処理して平滑末端となし、キナーゼ処理し、StuI消化
pMF−α8とリゲートさせた。得られたpMF−α8プ
ラスミド(phIL−4−3と表示)により前記に従って酵
母を形質転換し、上層液をTCGF活性について試験し
た。上層液はphIL−4−1形質転換した酵母について
観察されたものに匹敵するTCGF活性を示した。
【0214】実施例VII.大腸菌における合成 ヒトI
L−4遺伝子の構成および発現 実質的に菌の好ましいコドンからなり、一連の唯一の制
限エンドヌクレアーゼ部位(ここでは“唯一の制限部
位”と呼ぶ)を含み各種のヒトIL−4ムテインを速や
かにかつ簡便に発現させることができる合成ヒトIL−
4遺伝子を構築する。この合成遺伝子のヌクレオチド配
列を図19に示す(配列番号4)。この例の合成遺伝子
を構築および発現するための方法は分子生物学の分野で
標準的である。たとえば特にスプロートおよびゲイト、
ヌクレイック・アシッヅ・リサーチ,13巻,2959−
2977頁(1985);およびフェレッティら,プロシ・
ナシ ョナル・アカデ・サイ (Proc.Natl.Aca d.S
ci.),83巻,599−603頁(1986):が参照され
るが、ムインバッハら,ジェイ・ バイオロ・ケミ (J.
Bi ol.Chem.),261巻、719−722頁(198
6);ウェルズら,ジーン,34巻,315−323頁(19
85);およびエステルら,サイエンス,233巻,659
−663頁(1986)も参照される。すなわち合成ヒト
IL−4遺伝子は化学的に合成された複数の二重鎖DN
A断片から組立てられる。組立てられた合成遺伝子が一
連の唯一の制限部位を含むように合成遺伝子の塩基配列
が選ばれる。
【0215】この一連の唯一の制限部位が、容易に切除
されかつ異なる塩基配列をもつセグメントと置換されう
る一連のセグメントを規定する。かく合成断片は直接
に、または他の断片とのリゲーションに、適切なベクタ
ー、たとえばpUCプラスミドなどに挿入される。上記
各セグメントはウェルズら(前掲)の“カセット”にほぼ
対応する。合成断片は標準法により合成さる。たとえば
ゲイト,オリゴヌクレオチド合成:実用的な方 (IRL
プレス、英国オックスフォード,1984)。好ましくは
自動合成装置、たとえばアプライド・バイオシステムズ
社(カリフォルニア州、フォスター・シティー)モデル3
81Aが用いられる。pUCプラスミドなどのベクター
は市販されている(たとえばファルマシア−PL、また
はベーリンガー−マンハイム)。クローニングおよび発
現は標準的な細胞系、たとえば大腸菌K−12株、JM
101,JM103などにおいて行うことができる。(ピ
エラおよびメッシング,ジーン,19巻,259−268
頁(1982)に記載)。
【0216】制限エンドヌクレアーゼ消化およびリガー
ゼ反応は標準法により行われる。たとえばマニアチス
ら,分子クローニング:実験室の手引(コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリーズ、ニューヨーク、19
82)。
【0217】小規模プラスミド調製にはアルカリ法(マ
ニアチスら,前掲)が採用される。大規模調製にはアルカ
リ法の変法が採用され、この場合は等容量のイソプロパ
ノールを用いて、透明化された細胞溶解液から核酸を沈
澱させる。2.5M酢酸アンモニウムを用いる沈澱法に
よりRNA除去した後、塩化セシウム平衡密度勾配遠心
分離、および臭化エチジウムによる検出を行う。
【0218】ハイブリダイゼーション後の濾過のために
はワットマン540フィルターサークルを用いてコロニ
ーを取り上げ、ついでこれを0.5M・NaOH、1.5
M・NaCl;1MトリスHCl(pH8.0),1.5M・Na
Cl(各2分);および80℃における加熱(30分)によ
り、順次処理することによって細胞溶解し、固定する。
ハイブリダイゼーションは6XSSPE、20%ホルム
アミド、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、1
00μg/ml大腸菌tRNA、100μg/mlクーマシー
・プリリアント・ブルーG250(バイオラド)中で42
℃において6時間、32P標識(キナーゼ処理)合成DNA
を用いて行われる。(20×SSPEはNaCl 174
g,NaH2PO4・H2O2 7.6g、およびEDTA7.
4gをH2O800mlに溶解し、NaOHによりpHを7.
4に調整し、容量を1lに調整し、オートクレーブ処理
により滅菌することによって調製される)。
【0219】フィルターを1xSSPE0.1%SDSで
2回(室温で15分間)洗浄する。オートラジオグラフィ
ー(フジRXフィルム)後に、再増殖したコロニーをフィ
ルター上の青色に着色したコロニーに整列させることに
より陽性コロニーの位置を決定する。
【0220】DNA配列はマキサムおよびギルバート
(メソッズ・イン・エンザイモロジー,65巻,499頁
(1980)の化学的分解法、またはサンガーら(プロシ
・ナショナル・アカデ・サイ),(Proc.Natl.Acad.
Sci.).,74巻,5463頁(1977)のジデオキシ
法により決定される。ジデオキシ反応の鋳型はM13mp
ベクターに再クローニングされた関連領域の一重鎖DN
A(たとえばメッシングら,ヌクレイック・アシッヅ・リ
サ,(Nucleic Acids Res.),9巻,309頁(198
1)、またはミニアルカリ法により調製され、0.2M.
NaOHで変性され(5分、室温)、0.2M.NaOH、
1.43Mの酢酸アンモニウムから2容量のエタノール
の添加により沈澱した二重鎖DNAである。ジデオキシ
反応は42℃で行われる。
【0221】DNAはアプライド・バイオシステムズ3
80A合成装置を用いてホスファーアミダイト化学によ
り合成される。合成、脱保護基、開裂および精製(7M
尿素PAGE、溶離、DEAEセルロースクロマトグラ
フィ)は380A合成装置取扱い説明書の記載に従って
行われる。クローニングすべき相補的な合成DNA鎖
(各400ng)を混合し、50μlの反応容積でポリヌク
レオチドキナーゼによってリン酸化する。このDNAを
適宜な制限酵素で消化したベクターDNA1μgとリゲ
ートし、リゲーションする。リゲーションは50μlの
容量で室温において行われる。リン酸化、制限酵素によ
る消化、ポリメラーゼ反応、およびリゲーションの条件
は文献に記載されている(マニアチスら、前掲)。アンピ
シリン、イソプロピル−1−チオ−β−D−ガラクトシ
ド(IPIG)(0.4mM)および5−ブロム−4−クロル
−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド(x−ga
l)(40μg/ml)を補充したL寒天上で平板培養するこ
とにより、コロニーをlacZ+について採点する(所望に
より)。
【0222】TAC−RBSベクターは、tacP−保有
プラスミドpDR540(ファルマシア)の単一BamH
部位をDNAポメリラーゼによりフィルーインすること
に始まる一連の工程により構築される。次いで生成物を
非リン酸化合成オリゴヌクレオチドにリゲートさせると
コンセンサスリボソーム結合部位(RBS、GTAAG
GAGGTTTAAC)をコードする二重鎖断片が形成
される。リゲーション後に混合物をリン酸化し、Sst
IリンカーATGAGCTCAT と再リゲートさせ
る。得られた複合体を次いでSst IおよびEcoRIで
開裂し、173bpの断片をポリアクリルアミドゲル電気
泳動(PAGE)により単離し、Eco I/Sst I制限
pUC18(ファルマシア)にクローニングする(後述)。
最終構築物(TAC−RBSと呼ぶ)のRBS−ATGポ
リリンカー領域の配列を図28に示す。
【0223】合成ヒトIL−4遺伝子は6工程でpUC
18プラスミド中へ組込まれる。各工程1で挿入された
ATG開始コドンと共にフレーム内に維持することによ
り、欠失を含まない挿入物および/または挿入物を検出
することができる。欠失および/または挿入変化を含む
クローンはx−galおよびIPIGを含有するL−アンピ
シリン平板上で青色のコロニーを計数することによって
排除することができる。あるいは各工程で、小規模プラ
スミドDNA調製物についての万能配列決定プライマ
ー、たとえば(ベーリンガー・マンハイムから得られる
もの)を用いて挿入物の配列を容易に確認することがで
きる。
【0224】工程1ではTAC−RBSベクターをSst
Iで消化し、T4 DNAポメリラーゼ(その3'エキ
ソヌクレアーゼ活性がSst I切断部の3'突出鎖を消
化して、平滑末端断片を形成する)で処理し、T4 D
NAポメリラーゼを不活化した後EcoRIで処理する
と、TAC−RBS領域を含み、ATG開始コドン部に
平滑末端をもち、その反対側にEcoRI末端をもつ17
3塩基体(bp)の断片が形成される。最後に173bpのT
AC−RBS断片を単離する。
【0225】工程2では、工程1の単離されたTAC−
RBS断片をEcoRI/SstI消化プラスミドpUC1
8および合成断片1A/Bと混合する。後者は図21に
示すようにその上流末端に平滑末端をもち、その下流末
端にはSst Iに対応する粘着末端をもつ。この断片を
リゲートして工程2のpUC18を形成する。
【0226】工程3では、合成断片2A/B(図22お
よび図23に示す)を工程2のSstI/BamHI消化pU
C18(増幅および精製の後)と混合し、リゲートして、
工程3のpUC18を形成する。断片2A/Bの下流末
端が付加的な塩基を含み、これがBamHI粘着末端を形
成する点を留意されたい。これらの付加的塩基は工程4
で開裂する。同様に2A/Bおよび3A/Bは相補的な
9残基一重鎖末端を備えており、これらが混和された際
にアニールし、2A/Bの上流Sst I切断部および3
A/Bの下流BamHI切断部を残し、pUC18にリゲ
ートする。
【0227】工程4では、工程3のMlu I/XbaI消
化pUC18(増幅および精製の後)を再精製し、合成断
片4A/B8(図24)と混合し、リゲートして、工程
4のpUC18を形成する。
【0228】工程5では、工程4のXbaI/SalI消化
pUC18(増幅および精製の後)を5A/Bの合成断片
(図25)と混合し、リゲートして、工程5のpUC18
を形成する。
【0229】工程6では、工程5のSalI/HindII
I消化pUC18(増幅および精製の後)を合成断片6A
/B(図26)と混合し、リゲートして、最終構成を形成
する。
【0230】図20は上記のpUC18構成に存在する
唯一の制限部位の開裂マップである。開示された合成ヒ
トIL−4遺伝子をpUC18の挿入物として用いた場
合、唯一の制限部位各対は、容易に切除され、他の合成
断片と置換しうるセグメントを規定する。この唯一の制
限部位の組にはEcoRI,HpaI,SacI,(SstI),Eco
V,PstI,MluI,BclI,XbaI,NaeI,SalI,Xh
oI,およびHindIIIが含まれる。
【0231】合成IL−4遺伝子を含むpUC18を大
腸菌K−12株JM101に挿入する。培養後にJM1
01から蛋白質を抽出し、抽出後の希釈液を生物活性に
つき試験する。
【0232】実施例VIII.大腸菌におけるヒトIL
−4ムテインIle 5 2 の構成および発現 位置52(天然ヒトIL−4のN末端に対し)のLeuをI
leに変えて、ヒトIL−4ムテインIle52を形成する。
図19の合成ヒトIL−4遺伝子を含む実施例VIIの
pUC18プラスミドをPstIおよびMluIで消化し、
精製する。この精製プラスミドを下記の合成二重鎖断片
(配列番号25および26)と混合し、リゲートさせ
る。変化させた部分の塩基配列を四角で囲む。得られた
pUC18を大腸菌K−12株JM101などにトラン
スフェクションし、発現させる。
【0233】
【化3】
【0234】ヒトIL−4ムテインIle 52 を得るための
PstI/MluI置換用断片 培養後に標準法によりタンパク質をJM101細胞から
抽出し、抽出液の希釈液を生物活性につき試験する。
【0235】実施例IX.ヒトIL−4ムテイン(Ile
52 ,Asp 111 )の構築および発現 実施例VIIIの修飾されたpUC18プラスミド(Ile
52コード配列を含む)をSalIおよびXhoIで消化し、
大型断片を単離する。単離された断片を標準リゲーショ
ン溶液中で下記の合成二重鎖断片(配列番号27および
28)と混合する。セグメントの変化させた部分を四角
で囲む。得られたプラスミドを大腸菌K−12株JM1
01などにトランスフェクションし、発現させる。
【0236】
【化4】
【0237】SalI/XhoI置 換用断片 培養後に標準法によりタンパク質をJM101から抽出
し抽出液の希釈液を生物活性につき試験する。
【0238】実施例X.トランスフェクションした上清
から精製したヒトI L−4の配列 ヒトIL−4 cDNAを含むベクターで一過性トラン
スフェクションした細胞の培養上清からヒトIL−4を
精製した。精製した物質を用いて分泌された天然型ヒト
IL−4の配列を決定した。
【0239】A.精製のための生物学的アッセイ 分離工程を通じてヒトIL−4をアッセイするためにT
CGF活性を用いた。このアッセイは実施例IIで記載
した方法と実質的に同じである。簡単に述べると、健康
な給与者(ドナー)から得た血液をヘパリン化チューブに
入れて、フィコール−ヒパーク(Ficoll−Hypaque)の
上に層とした;例えば15mlの遠沈管中でフィコール−
ヒパーク3mlあたり血液5mlとする。3000xgで20
分間遠心分離した後、表面の細胞を吸引し、10%ウシ
胎児血清、2−メルカプトエタノール50μlフィトヘ
マグルチニン(PHA)20μg/mlおよび組換えヒトI
L−2を含むRPMI1640からなる成長培地中に希
釈した。37℃で5〜10日間インキュベーションした
後、PHA−刺激末梢リンパ球(PBL)を洗浄し、モス
マン(Mossmann),J.Immonol.Methods,6,55〜6
3(1983)に記載の2日間の比色分析アッセイに用い
た。IL−4標準品(pcD−125)またはpEBT−1
78でトランスフェクションされたCOS7細胞からの
上清)の連続2倍希釈物または試験すべき分画を96ウ
ェルのトレー上に上記した成長培地を用いて調製し、最
終容量を50μl/ウェルとした。各ウェルに約4〜8
×106細胞/mlのPHA−刺激PBL50μlを加え、
トレーを37℃で2日間インキュベートした。次いでモ
スマン(同上)の方法によって細胞成長を刺激した。
【0240】ヒトIL−4TCGF活性の単位はpcD−
125でトランスフェクションした COS7細胞(実施例II)またはpEBV−178でト
ランスフェクションした COS7細胞(実施例III)のいずれかに関して定めら
れる。
【0241】精製のためには、以下のようにして産生さ
れるpcD−125でトランスフェクションした上清の活
性に基づいて単位を定める。約1×106個のCOS7
細胞をダルベッコの改変イーグル培地(DME),10%
ウシ胎児血清および4mM L−グルタミンを含有する
100mmの組織培養プレート上に播種した。播種24時
間後に培地をプレートから吸引し、そして細胞を血清不
含緩衝化(50mMトリス)DMEで2回洗浄した。各プ
レートに血清不含緩衝化DME4ml(4mML−グルタミ
ンを含む),DEAE−デキストラン80μlおよびpcD
−125DNA5μgを加えた。この混合物中で細胞を
30℃にて4時間インキュベーションし、その後混合物
を吸引除去し、そして細胞を血清不含緩衝化DMEで1
回洗浄した。洗浄後、4mM L−グルタミンを含むD
ME5ml,100μMクロロキンおよび2%ウシ胎児血
清を各プレートに加え、細胞を3時間インキュベーショ
ンし、その後血清不含緩衝化DMEで2回洗浄した。次
いで、4mM L−グルタミンおよび4%ウシ胎児血清
を含むDME5mlを加えて細胞を37℃にて24時間イ
ンキュベーションした。細胞をDMEまたはPBSで1
〜3回洗浄した後、血清不含DME5ml(4mM L−グ
ルタミン含有)を加え、そして細胞を37℃で培養し、
5日後に培養上清を回収した。
【0242】本明細書中で使用する1単位とは、2×1
4個のPHA−刺激PBLの50%最大増殖を刺激す
る1ウェル(0.1ml)あたりの因子量である。
【0243】B.精製 精製は陽イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過およ
び逆相高速液体クロマトグラフィーを順次用いて行っ
た。全ての操作を4℃で実施した。
【0244】遠心分離によってCOS7細胞を除去した
後、上清を限外濾過によって約10倍に濃縮し、そして
次の工程に用いるまで−80℃で保存した。IL−4の
力価は上記の標準的アッセイ法を用いることによってフ
ィトヘマグルチニン−誘導ヒト末梢血リンパ球の増殖を
刺激するタンパク質の活性、即ちTCGF活性をアッセ
イすることによって決定した。
【0245】約104〜106単位/mlのTCGF活性と
約15〜20mg/mlのタンパク質含量を有する濃縮CO
S7の上清を50mM HEPESナトリウム,pH7.0
を2回取りかえて24時間透析する(1回の外液量は濃
縮分物の約10〜15倍容量である)。透析液をあらか
じめ50mM HEPESナトリウム,pH7.0で平衡化
しておいたS−セファロースのカラム(1×2.5cm,流
速:0.2ml/分)にかけた。カラムをカラムの15倍容
量の平衡緩衝液で洗浄し、次いでカラムの20倍容量の
直線的塩化ナトリウムグラジエント(50mM HEPE
Sナトリウム,pH7.0中の0〜0.5M塩化ナトリウ
ム)を用いて溶出した。5倍容量の固定濃度液(50mM
HEPESナトリウム,0.5M NaCl pH7.0)
で溶出することによってグランジエントを終了させた。
夫々のバッチから1.5mlおよび1.8mlの分画を回収し
た。300mMから500mM塩化ナトリウムで溶出した
両方のクロマトグラフィーにIL−4力価が見い出され
た。
【0246】IL−4力価を含む各S−セファロースカ
ラムからの6つの分画を全容量が9.0および10.8ml
となるように別途合せた。両方の容量をアミコンYM5
膜(分子量カットオフ:5,000)を用いる限外濾過によ
って1.9mlに濃縮した。この工程からのタンパク質の
回収率は約80%であった。濃縮したIL−4溶液をあ
らかじめ50mM HEPES,0.4M NaCl,pH7.
0で平衡化しておいたセファデックスG−100カラム
(1.1×58cm)に装填し、カラムを同じ緩衝液で0.1
5ml/分の速度で溶出した。全部で50分画(1.0ml/
分画)を回収し、そのIL−4力価を分析した。生物活
性のピークはみかけ分子量22,000ダルトンのあた
りに認められた。ウシ血清アルブミン(65,000ダル
トン),炭酸脱水酵素(30,000ダルトン)およびチト
クロームC(11,700ダルトン)を用いてセファデッ
クスG−100カラムの見掛け分子量の決定を行った。
【0247】IL−4活性を有するセファデックスG−
100カラムからの分画を真空下に3〜4倍に濃縮し、
これをバイダックC−4ガードカラム(4.6×20mm)
に注入した。0.1%(v/v)トリフルオロ酢酸(TFA)
中の0〜72%(v/v)アセトニトリルの直線的グランジ
エントで15分かけてカラム温度35℃,流速1.0ml/
分にて溶出した。214nmで検出したところ、保持時間
7,8.2および8.7分に3つのピーク(それぞれ図29
のピーク1、2および3)が観察された。ピーク2(溶出
時間8.2分)の40μlアリコートを凍結乾燥し、そし
て10%ウシ胎児血清を含む最小必須培地中に再溶解し
た。この溶液は陽性のTCGF反応を示した。ピーク2
の300μlを蒸発乾固して0.1%(w/v)ドデシル硫酸
ナトリウム(SDS)200μl中に再溶解した。その2
μlを1%(v/v)TFA200μl中に希釈して再クロマ
トグラフに付した。この試料のHPLCは215nmに単
一ピークを示した。ピーク2の物質は約7×108単位
/mgの活性を有することを示した。
【0248】C.アミノ酸配列分析 アミノ酸配列の決定はアプライド・バイオシステムズ社
の微量配列分析機を用いて自動ガス相エドマン分解法
[R.M.ヘウイック(Hewick),M.W.フンカピラー
(Hunkapillar),L.E.フッド(Hood)およびW.J.
ドレイヤー(Dryer),J.Biol.Chem.256 79
90(1981)参照]によって実施した。ピーク2のH
PLC分画90μlを上記のように0.1%SDSに溶解
して、ポリブレン(Polybrene)の存在下にグラスファイ
バーフィルターカートリッジに装填した。35番目の残
基までのアミノ酸配列の情報が得られた。N−末端の配
列は以下の通りである。
【0249】 His - Lys - Asd - Ile - Thr - Leu - Gln - Glu - Ile - Ile - Lys - Thr - Leu - Asn - Ser - Leu - Thr - Glu - Gln - Lys - Thr - Leu - - Thr - Glu - Leu - - Val - Thr - Asp - Ile - Phe - Ala - Ala (式中、空欄は同定しうるアミノ酸が欠如していること
を示す。)
【0250】アミノ末端における第3位および23位の
空欄はこの決定では検出されないシステインの存在と一
致した。cDNAの予測配列ではトレオニンに対応する
第28位の空欄はフェニルチオヒダントイン・トレオニ
ン検出の代わり易さによるものか或いはO−結合グリコ
シル化またはエステル化の存在によるものであるかも知
れない。
【0251】アミノ末端配列に用いたHPLC分画10
0μlを蒸発乾燥して70%ギ酸に再溶解した。50倍
モル過剰の臭化シアンを加えてこの溶液を室温に2.5
時間おいた。開裂したタンパク質を上記のようにアプラ
イド・バイオシステム社のガス相配列決定機にかけて配
列の決定を行った。以下の2つの配列が同定された。
【0252】 (1) Arg - Glu - Lys - Tyr - Ser - Lys (2) His - Lys - - Asp - Ile - Thr
【0253】配列(1)は、第120位のメチオニン残基
を臭化シアン分解することにより得られたcDNAの予
測配列と同じである。C末端の最後の2残が存在してい
たかも知れないが、試料が不十分であったために検出さ
れなかったのかも知れない。配列(2)は上記したよう
に、天然型IL−4タンパク質として得られたアミノ末
端配列と同じである。得られたアミノ末端およびカルボ
キシル末端のフェニルチオヒダントイン−アミノ酸の相
対的量は試料中に両配列が等モル量存在することを示唆
した。この結果は、配列決定に用いたタンパク質試料が
ヒトIL−4のcDNA配列から予測されたアミノ末端
およびカルボキシル末端を有する単一のポリペプチド鎖
を主して含んでいたという結論を支持する。
【0254】実施例XI.ヒトIL−4突然変異タンパ
ク質(Ile5271,IS94(Ala))の創製および発現 実施例VIIIの修飾プラスミドpUC18(Ile52をコ
ードする配列を含む)をMluIおよびBclIで切断し、
大きいフラグメントを単離した。単離したフラグメント
を標準連結用溶液中で以下に記載の合成二本鎖フラグメ
ント(配列番号29および30)と混合した。得られた
プラスミドを大腸菌K−12株JM101株等にトラン
スフェクションして増殖した。
【0255】
【化5】
【0256】MluI/BclI置 換フラグメント 修飾プラスミドを単離してXbaIおよびNaeIで切断
し、大きいフラグメントを単離した。単離したフラグメ
ントを標準連結溶液中で以下に記載の合成二本鎖フラグ
メント(配列番号31および32)と混合した。追加し
たコドンを箱で囲んだ。得られたプラスミドを大腸菌K
−12JM101株等にトランスフェクションして発現
させた。
【0257】
【化6】
【0258】XbaI/NaeI置 換フラグメント 培養後、タンパク質を標準手法によってJM101細胞
から抽出し、抽出物の希釈物の生物活性をアッセイし
た。
【0259】実施例XII.裸リンパ球症候群(bare l
ymphocyte syndrome) 患者からの細胞上にあるDN 抗原
の誘導 裸リンパ球症候群は細胞表面のHLA抗原クラスIおよ
び/またはクラスIIの発現を欠くことを特徴とし、ま
たしばしば重篤な免疫不全を伴う[例えばツーレイン(T
ouraine),Lancet,319〜321(1981.2.7);
ツーレインおよびベテル(Bethel),Human Immunol og
y,2,147〜153(1981);およびサリバン(Sull
ivanら,J.Clin. Invest.,76,75〜79(198
5)を参照のこと]。ヒトIL−4は裸リンパ球症候群患
者に由来する細胞表面上のクラスIIDR抗原の発現を
誘導しうることが見い出された。
【0260】HLAクラスII抗原の非発現に悩む患者
から末梢リンパ球(PBL)を採取した。このPBLから
上記の方法でB細胞を精製,そしてエプソン−バールウ
イルス(EBV)を用いて形質転換することによってB細
胞系(UD31と命名)を樹立した。EBVで形質転換さ
れた細胞は、2ウシ胎児血清および5%(v/v)濃度のpc
D−125でトランスフェクションしたCOS7細胞を
含むイッセル培地(上述)中で48時間培養した。細胞を
収穫し、固定し、蛍光標識した抗−DRモノクローナル
抗体(例えばベクトン・ディッキンソン社のL243)で
染色し、そしてフローサイトメトリーで分析した。図2
8はIL−4処理前に収穫したEBV−形質転換細胞の
対照数(曲線A)およびIL−4処理後のEBV−形質転
換細胞数(曲線B)の各蛍光強度に対する細胞頻度のヒス
トグラムを表す。
【0261】実施例XIII.C1.Ly1 + - /9(C
1.1) 上清のMCGF活性 精製IL−3およびIL−3 cDNAクローンでトラ
ンスフェクトしたCOS7細胞からの上清(組換えIL
−3;IL−3R)は肥満細胞系MC/9の増殖を同程度
に刺激した(図34A)。しかしながら、このレベルはC
1.1T細胞上清によって誘導されたレベルの1/3〜
1/2であった。T細胞上清中のConAの存在(2μg/
ml)はそのMCGF活性に有意に寄与しない。上記効果
の説明として、C1.1細胞によって産生されるMCG
F活性の全てがIL−3によるものではないということ
が考えられる。あるいは、アッセイに使用した肥満細胞
系が細胞の第2の要因に依存する集団で汚染されていた
ということも(理論的には)考えられる。しかしながら、
後の説は排除される。何故なら、MC/9細胞の再クロ
ーン化はサブクローンを生産し、各サブクローンはIL
−3および元のMC/9クローンと同様の細胞上清に対
応するからである。
【0262】C1.1の上清はIL−3以外のリンホカ
インも含んでいるのでこれらのもののMC/9細胞の生
育増強能を試験した。しかしながら、MC/9細胞は各
種濃度の組換えIL−2,IFN JおよびGM−CS
Fに対して反応を示さず、またIL−1を上清(P38
8D1細胞)に対しても反対を示さなかった(図34
A)。更に、各種濃度の組換えIL−3とIL−2,GM
−CSF,IFN−γまたはIL−1を含む培養物を補
充してもIL−3単独で得られるレベル以上にMC/9
細胞の増殖を刺激しなかった。このことは、T細胞上清
のMCGF活性の増加は、これらの既知の因子を含有す
ることによるものではないことを示唆している。
【0263】他の因子に依存する細胞系との比較研究 他の2種の肥満細胞であるDX−2およびMM3もまた
IL−3よりもC1.1上清を用いた方より高い増殖反
応を示した(DX−2についての代表的なデータを図3
4Bに示す)。これらの細胞は、IL−2,IFN−γ,
GM−CSFまたはP388D−1細胞に対して反応し
なかった。従って、T細胞上清に対するMC/9細胞の
増殖増強反応は肥満細胞一般にいえることなのかも知れ
ない。これとは対照的に、顆粒球性細胞(NFS−60)
はIL−3およびC1.1上清によってほぼ同等に刺激
された(図34C)。NFS−60細胞はIL−2,IF
N−γおよびP388D−1上清に対して反応しなかっ
たが、GM−CSFによって少しではあるが再現性のあ
る刺激を示した。IL−3およびT細胞上清が同程度の
レベルの増殖を誘導するという事実は、NFS−60細
胞系がT細胞上清中に存在する付加的な因子に対して比
較的非感受性であるかも知れないということを示唆す
る。従って、NFS−60細胞を、タンパク質分画によ
ってIL−3をその他のMCGF活性体から分離する試
みにおいてIL−3のアッセイに用いた。
【0264】C1.1上清のTCGF活性をIL−2依
存性T細胞系HT2を用いて評価した。C1.1上清の
飽和濃度は、組換えIL−2で達成される最高レベルよ
りも十分低いレベルでの3H−チミジンの取り込みを一
定に刺激した(図34D)。同様の結果が他の2つの細胞
系でも得られた。上記上清をIL−2を含有するHT2
培養物に添加しても3H−チミジンの取り込みを全く減
少させなかったので該上清は阻害物質を含んでいない
(図34D)。これらの結果はC1.1上清がIL−2と
は異なるTCGF活性を含んでいることを示している。
この結論を支持する性化学的根拠を以下に示す。
【0265】C1.1上清の予備的クロマトグラフィー
分画 IL−3を他のMCGF活性体から分離するという目的
のために各種のクロマトグラフィー法を用いてC1.1
上清を分画した。MC/9増殖によって明らかにされた
全MCGF活性のバックグラウンドに対するIL−3を
特異的に追跡するためにNFS−60細胞の増殖を用い
た。TCGF活性はHT2細胞増殖によってアッセイし
た。
【0266】C1.1上清を中性pHにおいて陽イオン
交換クロマトグラフィーで分画したところ、充填したタ
ンパク質の約98%,IL−3単位の97%(NFS−6
0増殖によるアッセイにおいて)およびTCGF単位の
1%がフロースルー中に出現した(図35)。結合したタ
ンパク質を塩化ナトリウムのグラジエントで溶出したと
ころ、0.19M NaCl(フラクション60)でTCG
F活性が放出された。小さいながらも再現可能なTCG
F活性のピークも1M NaClでみられた。これ以上の
高いNaCl濃度(3Mまで)にしても更に有意なTCGF
活性は溶出しなかった。TCGFのピークとほぼ同じ領
域に少量のIL−3にも溶出した(NFS−60応答に
て検出可能)。TCGF活性のピークに対応する分画(フ
ラクション59〜61)およびフロースルー(フラクショ
ン1〜20)のみが分画上清に比較して高レベルのMC
/9増殖を刺激した(図35,矢印)。滴定曲線はフラク
ション59〜61の方がフロースルーよりも高レベルの
MCGF活性を含んでいることを示唆したので、TCG
Fピークと同時溶出するIL−3活性を更に減らして再
度MC/9増殖レベルを評価する試みを行った。そこで
フラクション59〜61を同じ条件で更に2回再クロマ
トグラフィーに付した。
【0267】3回カラムを通した後は、95%以上のT
CGF活性が終止一貫して0.19M NaClで溶出し
た。フロースルー中、あるいはどのカラムフラクション
も測定しうるIL−3(NFS−60応答)は見られなか
った。しかしながら、TCGFピークとなおかつ同時溶
出するものは、C1.1上清またはIL−3で得られた
よりも有意に低いプラトーレベルのMC/9増殖を刺激
した(以下参照)。これらフラクションは測定しうるIL
−3活性を欠いていた(NFS−60応答の欠如)ので、
新たなMCGF自体は粗T細胞上清と同程度にMC/9
細胞を刺激することができなかった。
【0268】TCGFからMCGFを更に分離するため
に、上記3回分画したもの(フラクション59〜61)を
水中の0.1%TFAで10倍に希釈してpH2とし、こ
れを直接C8逆相カラムに装填した。図36は結合した
タンパク質を0.1%TFA中のアセトニトリルのグラ
ジエントで溶出した溶出パターンを示す図である。フロ
ースルー中にはMCGFおよびTCGF活性は何ら見ら
れなかった。これらの活性はいずれも37%アセトニト
リル(フラクション26〜29)で同時溶出した。しかし
ながら、飽和MCGF応答は今や、IL−3で得られた
約半分しかなかった(図38)。全フラクションを飽和レ
ベルのIL−3存在下で再アッセイしたところ、フラク
ション26〜29のみが過剰のIL−3単独中でMC/
9増殖応答を示した(図36矢印)。事実、その応答強度
は未分画の上清自体の応答強度と似ていた(図38A)。
更に、未分画の上清と同等な増強レベルはIL−3含有
フロースルーまたはWEHI3から精製したIL−3の
存在下でアッセイしたフラクション26〜29に観察さ
れた。従ってIL−3とユニークなMCGF/TCGF
との組合わせがもとのT細胞上清に特徴的なMC/9増
強レベルを刺激する。
【0269】逆相クロマトグラフィーによってはMCG
FをTCGFから分離することができなかったけれど
も,TCGFは2つの基準によってIL−2とは異なる
ものであることが示された。第1に、COS7細胞上清
中の組換えIL−2(IL−2R)およびIL−2産生性
(ConA刺激)ネズミT細胞系(GF15−1)からの上清
をいずれも同じ条件で同じカラムにかけてクロマトグラ
フィーに付したところ、TCGF活性は45%アセトニ
トリルでシャープなピークで溶出するが、このピークは
C1.1 TCGFを示す37%アセトニトリルの位置
とオーバーラップしない(図37)。第2に、IL−2R
に対するHT2細胞の飽和応答はC1.1上清の特徴と
は全く異なっている(図37,挿入図)。更に、部分精製
したTCGFとIL−2との間に明らかな相乗効果は何
ら見られなかった(図38)。
【0270】C1.1上清のクロマトグラフォーカシン
グを図39に示す。IL−3活性(NFS−60応答性)
は7.1よりも大きい等電点を有する活性を含む非常に
不均質のものであることを示したが、TCGF活性の方
は主要TCGF(フラクション12)が等電点約6.2を
有するより均質なものであることを示した。このことは
飽和レベルのIL−3を添加後にMCGF活性(MC/
9応答)が最大となったことと一致する。
【0271】C1.1上清および部分精製因子のSAC
PAGE 図40は未分画C1.1上清(図40A)の電気泳動パタ
ーンを陽イオン交換クロマトグラフィーにかけた物質で
あるフラクション59〜61の電気泳動パターン(図4
0B)とを比較したものである。ゲル切断物からタンパ
ク質を直接溶出し、増殖法により活性を測定した。陽イ
オン交換フラクションとC1.1上清はいずれもTCG
Fピーク(非還元条件下では29Kdおよび15Kdに、
そして還元条件下では21Kdおよび16Kd)を示す。
陽イオン交換した物質はIL−3を減じているため、ご
く低レベルのMC/9増殖のみが誘導され、このMCG
F活性はなおTCGFピークと一致していた。全フラク
ションに飽和量のIL−3を加えたところ、MCGF
/TCGFフラクションピークにおいてのみC1.1上
清レベルに対するMC/9増殖応答が上昇した(図40
B,矢印)。該上清のIL−3活性は24Kdの位置で最
大であったが、約20Kdの領域にも幅広いのピークが
見られた。IL−3よりも十分大きなMC/9増殖レベ
ルは電気泳動した上清の10Kdの位置に見られること
は重要である(図40A,矢印)。最も高度に精製したM
CGF/TCGF物質(逆相カラムのフラクション28)
の銀染色SDSゲルも20Kdおよび15Kdに顕著なタ
ンパク質のバンドを示した。
【0272】上記因子の20Kdの物質μg量を活性化C
1.1T細胞からのConA上清を上述した連続的分画: (1) 陽イオン交換クロマトグラフィー (2) ヘパリン・セファロース・クロマトグラフィー,
および (3) C4逆相クロマトグラフィー を行うことによって均質に精製した。最終精製物質は銀
染色SDS−PAGEにおいて20Kdに単一バンドの
みを示し、これはC4逆相カラムの溶出物の単一のUV
吸収と対応する。この精製因子の生物学的性質は低いレ
ベルのT細胞および肥満細胞増殖刺激能ならびにIL−
3依存性肥満細胞増殖増強能であることが確かめられ
た。
【0273】表5に示すように、この因子はBSF−1
について報告されている数種のB細胞刺激活性[N.
W.ローム(Roehm)ら,J.E xp.Med169,679〜
694(1984);M.ハワード(Howard)ら,Proc.N
atl.Acad.Sci.U.S.A.78,5788(198
1);N.W.ロームら,Proc.Natl.Acad.Sc i.
U.S.A.81,6149〜6153(1984)]を有
している。第1に該因子は対照群に比較して休止B細胞
上におけるIaの発現増加を誘導する(表5)。第2にこ
の因子は抗−Ig抗体と結合して有意[3H]−チミジンの
取り込みを誘導するが,このことは該因子がB細胞増殖
の刺激において補助的な因子として機能することを示し
ている。
【0274】
【表5】
【0275】これらのポリペプチドは機能および影響を
及ぼす細胞の型の双方において異なる数種の生物学的活
性を示すことができる。上述したように、これらの活性
はB細胞および肥満細胞系の増殖誘導、休止B細胞の初
期活性化、T細胞の増殖刺激およびマイトジェン−活性
化B細胞におけるIgG1およびIgE産生増強における
相乗作用を含んでいる。
【0276】以上詳しく説明したように、本発明の精製
タンパク質が当業者に新規な治療の可能性を提供するこ
とが理解されよう。これらの因子を有意な量産生するこ
とができたことは、選択された哺乳動物細胞系のin vi
tro培養における改良および哺乳動物免疫応答の全体的
な理解の向上に寄与することであろう。
【0277】cDNAクローンpcD−2A−E3、pcD
−46(pcD−2F1−13)、pcD−125および酵母
ベクターpMF−アルファ8はアメリカンタイプカルチ
ャーコレクション(米国メリーランド州,ロックビル)(A
TCC)にそれぞれ受託番号53330、53337、
67029および40140として寄託されている。こ
れらの寄託は特許手続上の微生物の寄託に関する国際的
承認に基づくブダペスト条約(1977)上の寄託であ
る。
【0278】
【発明の効果】本発明により、有用なインターロイキン
−4ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からな
る核酸、かかる核酸を含むベクター、かかるベクターで
形質転換した細胞が提供される。
【0279】
【配列表】
【0280】配列番号:1 配列の長さ:585 配列の型:核酸 鎖の数:2本鎖 トポロジー:直鎖状 配列: TTAGCATCTC TTGATAAACT TAATTGTCTC TCGTCACTGA CGCACAGAGC TATTG ATG 58 MET 1 GGT CTC AAC CCC CAG CTA GTT GTC ATC CTG CTC TTC TTT CTC GAA TGT 106 Gly Leu Asn Pro Gln Leu Val Val Ile Leu Leu Phe Phe Leu Glu Cys 5 10 15 ACC AGG AGC CAT ATC CAC GGA TGC GAC AAA AAT CAC TTG AGA GAG ATC 154 Thr Arg Ser His Ile His Gly Cys Asp Lys Asn His Leu Arg Glu Ile 20 25 30 ATC GGC ATT TTG AAC GAG GTC ACA GGA GAA GGG ACG CCA TGC ACG GAG 202 Ile Gly Ile Leu Asn Glu Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Cys Thr Glu 35 40 45 ATG GAT GTG CCA AAC GTC CTC ACA GCA ACG AAG AAC ACC ACA GAG AGT 250 MET Asp Val Pro Asn Val Leu Thr Ala Thr Lys Asn Thr Thr Glu Ser 50 55 60 65 GAG CTC GTC TGT AGG GCT TCC AAG GTG CTT CGT ATA TTT TAT TTA AAA 298 Glu Leu Val Cys Arg Ala Ser Lys Val Leu Arg Ile Phe Tyr Leu Lys 65 70 75 CAT GGG AAA ACT CCA TGC TTG AAG AAG AAC TCT AGT GTT CTC ATG GAG 346 His Gly Lys Thr Pro Cys Leu Lys Lys Asn Ser Ser Val Leu MET Glu 80 85 90 CTG CAG AGA CTC TTT CGG GCT TTT CGA TGC CTG GAT TCA TCG ATA AGC 394 Leu Gln Arg Leu Phe Arg Ala Phe Arg Cys Leu Asp Ser Ser Ile Ser 95 100 105 TGC ACC ATG AAT GAG TCC AAG TCC ACA TCA CTG AAA GAC TTC CTG GAA 442 Cys Thr MET Asn Glu Ser Lys Ser Thr Ser Leu Lys Asp Phe Leu Glu 110 115 120 AGC CTA AAG AGC ATC ATG CAA ATG GAT TAC TCG TAG TACTGAGCCA 488 Ser Leu Lys Ser Ile MET Gln MET Asp Tyr Ser 125 130 135 CCATGCTTTA ACTTATGAAT TTTTAATGGT TTTATTTTTA ATATTTATAT ATTTATAATT 548 CATAAAATAA AATATTTGTA TAATGTAACA GAAAAAA 585
【0281】配列番号:2 配列の長さ:618 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列: GATCGTTAGC TTCTCCTGAT AAACTAATTG CCTCACATTG TCACTGCAAA TCGACACCTA 60 TTA ATG GGT CTC ACC TCC CAA CTG CTT CCC CCT CTG TTC TTC CTG CTA 108 MET Gly Leu Thr Ser Gln Leu Leu Pro Pro Leu Phe Phe Leu Leu 1 5 10 15 GCA TGT GCC GGC AAC TTT GTC CAC GGA CAC AAG TGC GAT ATC ACC TTA 156 Ala Cys Ala Gly Asn Phe Val His Gly His Lys Cys Asp Ile Thr Leu 20 25 30 CAG GAG ATC ATC AAA ACT TTG AAC AGC CTC ACA GAG CAG AAG ACT CTG 204 Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu 35 40 45 TGC ACC GAG TTG ACC GTA ACA GAC ATC TTT GCT GCC TCC AAG AAC ACA 252 Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr 50 55 60 ACT GAG AAG GAA ACC TTC TGC AGG GCT GCG ACT GTG CTC CGG CAG TTC 300 Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe 65 70 75 TAC AGC CAC CAT GAG AAG GAC ACT CGC TGC CTG GGT GCG ACT GCA CAG 348 Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln 80 85 90 95 CAG TTC CAC AGG CAC AAG CAG CTG ATC CGA TTC CTG AAA CGG CTC GAC 396 Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp 100 105 110 AGG AAC CTC TGG GGC CTG GCG GGC TTG AAT TCC TGT CCT GTG AAG GAA 444 Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu 115 120 125 GCC AAC CAG AGT ACG TTG GAA AAC TTC TTG GAA AGG CTA AAG ACG ATC 492 Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile 130 135 140 ATG AGA GAG AAA TAT TCA AAG TGT TCG AGC TGA ATATTTTAAT 535 MET Arg Glu Lys Thr Ser Lys Cys Ser Ser 145 150 TTATGAGTTT TTGATAGCTT TATTTTTTAA GTATTTATAT ATTTATAACT CATCATAAAA 595 TAAAGTATAT ATAGAATCTA AAA 618
【0282】配列番号:3 配列の長さ:129 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド
【0283】配列番号:4 配列の長さ:387 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列: CAC AAA TGT GAC ATC ACT CTG CAA GAA ATC ATC AAA ACT CTG AAC 45 TCG TTA ACC GAA CAG AAA ACC CTG TGC ACC GAG CTC ACT GTT ACT 90 GAT ATC TTC GCT GCT TCC AAA AAC ACT ACT GAA AAA GAA ACT TTC 135 TGC AGA GCT GCT ACC GTT CTG CGT CAG TTC TAC TCT CAC CAC GAA 180 AAA GAC ACG CGT TGT CTC GGC GCC ACT GCG CAG CAG TTC CAC CGT 225 CAC AAA CAG CTG ATC AGA TTC CTG AAA CGT CTA GAC CGT AAC CTG 270 TGG GGC CTG GCC GGC CTG AAC TCT TGT CCG GTT AAA GAA GCT AAC 315 CAG TCG ACT CTG GAA AAC TTC CTC GAG CGT CTG AAA ACC ATC ATG 360 CGT GAA AAG TAC TCT AAA TGC TCT TCT 387
【0284】配列番号:5 配列の長さ:80 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列: CAC AAA TGT GAC ATC ACT CTG CAA GAA ATC ATC AAA ACT CTG AAC TCG 48 TTA ACC GAA CAG AAA ACC CTG TGC ACC GAG CT 80
【0285】配列番号:6 配列の長さ:76 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列: C GGT GCA CAG GGT TTT CTG TTC GGT TAA CGA GTT CAG AGT TTT GAT GAT 49 TTC TTG CAG AGT GAT GTC ACA TTT GTG 76
【0286】配列番号:7 配列の長さ:55 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列: C ACT GTT ACT GAT ATC TTC GCT GCT TCC AAA AAC ACT ACT GAA AAA GAA 49 ACT TTC 55
【0287】配列番号:8 配列の長さ:50 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列: TTT TTC AGT AGT GTT TTT GGA AGC AGC GAA GAT ATC AGT AAC AGT GAG CT 50
【0288】配列番号:9 配列の長さ:58 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列: TGC AGA GCT GCT ACC GTT CTG CGT CAG TTC TAC TCT CAC CAC GAA AAA 48 GAC ACG CGT G 58
【0289】配列番号:10 配列の長さ:72 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列: GGA TCC ACG CGT GTC TTT TTC GTG GTG AGA GTA GAA CTG ACG CAG AAC 48 GGT AGC AGC TCT GCA GAA AGT TTC 72
【0290】配列番号:11 配列の長さ:68 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列: CG CGT TCT CTC GCC GCC ACT GCG CAG CAG TTC CAC CGT CAC AAA CAG 47 CTG ATC AGA TTC CTG AAA CGT 68
【0291】配列番号:12 配列の長さ:68 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列: C TAG ACG TTT CAG GAA TCT GAT CAC CTG TTT GTG ACG GTG GAA CTG 46 CTG CGC AGT GGC GCC GAG ACA A 68
【0292】配列番号:13 配列の長さ:63 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列: CTA GAC CGT AAC CTG TGG GGC CTG GCC GGC CTG AAC TCT TGT CCG GTT 48 AAA GAA GCT AAC CAG 63
【0293】配列番号:14 配列の長さ:63 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列: T CGA CTG GTT AGC TTC TTT AAC CGG ACA AGA GTT CAG GCC GGC CAG 46 GCC CCA CAG GTT ACG GT 63
【0294】配列番号:15 配列の長さ:73 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列: TCG ACT CTG GAA AAC TTC CTC GAG CGT CTG AAA ACC ATC ATG CGT GAA 48 AAG TAC TCT AAA TGC TCT TCT TAA A 73
【0295】配列番号:16 配列の長さ:74 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列: AAG CTT TTA AGA AGA GCA TTT AGA GTA CTT TTC ACG CAT GAT GGT TTT 48 CAG ACG CTC GAG GAA GTT TTC CAG AG 74
【0296】配列番号:17 配列の長さ:17 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列: AA TTC CAC AAG TGC GAT 17
【0297】配列番号:18 配列の長さ:13 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列: ATC GCA CTT GTG G 13
【0298】配列番号:19 配列の長さ:23 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列: GGAATTCAGAAGCTTGCGGCTAC 23
【0299】配列番号:20配列の長さ:16配列の
型:核酸鎖の数:二本鎖トポロジー:直鎖状 配列: A GCT CAC AAG TGC GAT 16
【0300】配列番号:21配列の長さ:12配列の
型:核酸鎖の数:二本鎖トポロジー:直鎖状 配列: ATC GCA CTT GTG 12
【0301】配列番号:22 配列の長さ:18 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列: TCG ATG CAC AAG TGC GAT 18
【0302】配列番号:23 配列の長さ:14 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列: ATC GCA CTT GTG CA 14
【0303】配列番号:24 配列の長さ:21 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列: TCCACGGAGGTACCACAAGTG 21
【0304】配列番号:25 配列の長さ:48 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列: GA GCT GCT ACC GTT ATC CGT CAG TTC TAC TCT CAC CAC GAA AAA GAC A 48
【0305】配列番号:26 配列の長さ:56 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列: CG CGT GTC TTT TTC GTG GTG AGA GTA GAA CTG ACG GAT AAC GGT AGC AGC 50 TCT GCA 56
【0306】配列番号:27 配列の長さ:19 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列: TCG ACT CTG GAA GAC TTC C 19
【0307】配列番号:28 配列の長さ:19 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列: TC GAG GAA GTC TTC CAG AG 19
【0308】配列番号:29 配列の長さ:46 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列: CG CGT TGT CTC GGC GCC ACT GCG CAG TTC CAC CGT CAC AAA GAG CT 46
【0309】配列番号:30 配列の長さ:46 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列: GAT CAG CTG TTT GTG ACG GTG GAA CTG CGC AGT GGC GCC GAG ACA A 46
【0310】配列番号:31 配列の長さ:30 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列: CTA GAC CGT AAC CTG TGG GGC CTG GCC GCC 30
【0311】配列番号:32 配列の長さ:25 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列: GC GGC CAG GCC CCA CAG GTT ACG GT 25
【図面の簡単な説明】
【図1】 ネズミIL−4を発現するベクターpcD−
2A−E3の挿入物のヌクレオチド配列および推定上の
アミノ酸配列を示す配列図である。
【図2】 ヒトIL−4を発現するベクターpcD−1
25の挿入物のヌクレオチド配列および推定上のアミノ
酸配列を示す配列図である。
【図3】 pcD−125でトランスフェクションされ
たCOS7サル細胞により発現・分泌された精製天然ヒ
トIL−4のアミノ酸配列を示す配列図である。
【図4】 その挿入物がネズミIL−4をコードする、
ベクターpcD−2A−E3の地図である。
【図5】 ベクターpcD−2A−E3の挿入物の制限
エンドヌクレアーゼ切断地図である。
【図6】 その挿入物がヒトIL−4をコードする、ベ
クターpcD−46の地図である。
【図7】 ベクターpcD−46の挿入物の制限エンド
ヌクレアーゼ切断地図である。
【図8】 pcD−2A−E3でトランスフェクション
されたCOS7細胞からの1つの(曲線1)を含む種々
の培養上清の(希釈範囲にわたる)相対的なMCGF活
性を示すグラフである。
【図9】 pcD−2A−E3でトランスフェクション
されたCOS7細胞からの1つの(曲線1)を含む種々
の培養上清の(希釈範囲にわたる)相対的なMCGF活
性を示すグラフである。
【図10】 pcD−2A−E3でトランスフェクショ
ンされたCOS7細胞(曲線1)、C1.Ly1+-
9細胞(曲線2)、および疑似トランスフェクションさ
れたCOS7細胞(曲線3)からの表示量の上清によっ
て生じたIa誘導の相対度を示すグラフである。
【図11】 pcD−2A−E3でトランスフェクショ
ンされたCOS7細胞およびT細胞を除いたマウス脾細
胞の種々の対照からの上清によりIgEおよびIgG1
誘導の度合を示すグラフである。
【図12】 因子依存性ヒトヘルパーT細胞株JL−E
BVに対する比色定量増殖検定により測定された、種々
のpcD−125トランスフェクション上清および対照
のTCGF活性を示すグラフである。
【図13】 PHA刺激末梢血リンパ球に対する比色定
量増殖検定により測定された、pcD−125トランス
フェクション上清および対照のTCGF活性を示すグラ
フである。
【図14】 PHA刺激末梢血リンパ球によるトリチウ
ム化チミジン取り込みにより測定されたpcD−125
トランスフェクション上清および対照のTCGF活性を
示すグラフである。
【図15】 Fc−イプシロン受容体を蛍光標識した刺
激ヒト扁桃腺B細胞の対照集団についての細胞相対数対
蛍光強度のヒストグラム図である。
【図16】 pcD−125でトランスフェクションさ
れたCOS7細胞からの0.1%上清よりなる培地に暴
露した刺激ヒト扁桃腺B細胞集団(そのFc−イプシロ
ン受容体を蛍光標識したもの)についての細胞相対数対
蛍光強度のヒストグラム図である。
【図17】 pcD−125でトランスフェクションさ
れたCOS7細胞からの1%上清よりなる培地に暴露し
た刺激ヒト扁桃腺B細胞集団(そのFc−イプシロン受
容体を蛍光標識したもの)についての細胞相対数対蛍光
強度のヒストグラム図である。
【図18】 pcD−125でトランスフェクションさ
れたCOS7細胞からの10%上清よりなる培地に暴露
した刺激ヒト扁桃腺B細胞集団(そのFc−イプシロン
受容体を蛍光標識したもの)についての細胞相対数対蛍
光強度のヒストグラム図である。
【図19】 天然または突然変異IL−4を大腸菌内で
発現させるのに有用な合成ヒトIL−4遺伝子のヌクレ
オチド配列図である。
【図20】 プラスミドpUC18に挿入された合成ヒ
トIL−4遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ切断地図で
ある。
【図21】 合成ヒトIL−4遺伝子を構築するために
使用される2本鎖DNAフラグメント1A/Bの配列図
である。
【図22】 合成ヒトIL−4遺伝子を構築するために
使用される2本鎖DNAフラグメント2A/Bの配列図
である。
【図23】 合成ヒトIL−4遺伝子を構築するために
使用される2本鎖DNAフラグメント3A/Bの配列図
である。
【図24】 合成ヒトIL−4遺伝子を構築するために
使用される2本鎖DNAフラグメント4A/Bの配列図
である。
【図25】 合成ヒトIL−4遺伝子を構築するために
使用される2本鎖DNAフラグメント5A/Bの配列図
である。
【図26】 合成ヒトIL−4遺伝子を構築するために
使用される2本鎖DNAフラグメント6A/Bの配列図
である。
【図27】 大腸菌発現ベクターTAC−RBS中のイ
ニシエーターATGコドンに隣接するヌクレオチド配列
図である。
【図28】 裸リンパ球症候群の患者から誘導される細
胞集団についての細胞相対数対蛍光強度のヒストグラム
図である。
【図29】 C−4カラムでの逆相HPLCによるヒト
IL−4の最終精製工程における215nm吸収プロフ
ィールを示すグラフである。
【図30】 ヒトIL−4cDNAを含むプラスミドp
EBV−178の作製地図である。
【図31】 プラスミドTRPC11の作製地図であ
る。
【図32】 プラスミドpMF−アルファ8の作製地図
である。
【図33】 天然ヒトIL−4および種々のその突然変
異タンパク質を発現する酵母培養物からの数種のトラン
スフェクション上清のTCGF活性を示すグラフであ
る。
【図34】 因子依存性細胞株の増殖曲線を示すグラフ
であり、図34(A)はMC/9肥満細胞(1A)の場
合、図34(B)はDX−2肥満細胞(1B)、図34
(C)はNFS−60細胞(1C)の場合、および図3
4(D)はHT2 T細胞(1D)である場合を示す。
【図35】 C1.1上清のFPLCカチオン交換クロ
マトグラフィーにおけるクロマトグラムを示すグラフで
ある。
【図36】 IL−3を除去したC1.1上清の逆相C
8クロマトグラフィーにおけるクロマトグラムを示すグ
ラフである。
【図37】 GK15−1ネズミT細胞上清の逆相C8
クロマトグラフィーにおけるクロマトグラムを示すグラ
フである。
【図38】 逆相カラムからの部分精製因子(RP因
子)のMCGFおよびTCGF活性を示すグラフであ
り、図38(A)はMC/9肥満細胞の場合、図38
(B)はHT2 T細胞の場合を示す。
【図39】 C1.1上清のクロマトフォーカシングに
おけるクロマトグラムを示すグラフである。
【図40】 C1.1上清および分精製MCGF/TC
GFのSDS−PAGEにおけるクロマトグラムを示す
グラフであり、図40(A)は非分画化上清の非還元S
DS−PAGEの場合、図40(B)はカチオン交換ク
ロマトグラフィーからのピークMCGF/TCGF分画
の非還元SDS−PAGEの場合を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C07K 14/54 8318−4H C12N 1/19 8828−4B 1/21 8828−4B 5/10 // C12P 21/02 K 9282−4B (C12N 1/19 C12R 1:865) (C12N 1/21 C12R 1:19) (C12N 5/10 C12R 1:91) 7729−4B C12N 5/00 B (C12N 5/00 B C12R 1:91) (31)優先権主張番号 881553 (32)優先日 1986年7月3日 (33)優先権主張国 米国(US) (31)優先権主張番号 908215 (32)優先日 1986年9月17日 (33)優先権主張国 米国(US) (72)発明者 タカシ・ヨコタ アメリカ合衆国カリフォルニア州94303, パロ・アルト,コロラド・アベニュー890 (72)発明者 ケンイチ・アライ アメリカ合衆国カリフォルニア州94306, パロ・アルト,ジョージア・アベニュー 648 (72)発明者 ティモシー・モスマン アメリカ合衆国カリフォルニア州94025, アサートン,エルロイデン・ドライブ69 (72)発明者 ドナ・レニック アメリカ合衆国カリフォルニア州94022, ロス・アルトス,アーモンド・アベニュー 601 (72)発明者 クレイグ・スミス アメリカ合衆国カリフォルニア州94041, マウンテン・ビュー,フランクリン・スト リート350

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 ヒトインターロイキン−4活性を示し、
    そしてMHC(主要組織適合遺伝子複合体)抗原誘導活
    性、Fc−イプシロン受容体誘導活性、GM−CSF(顆
    粒球−マクロファージコロニー刺激因子)刺激顆粒球コ
    ロニー成長増強活性、インターロイキン2 TCGF
    (T細胞増殖因子)増強活性、およびIgG1−ならびにI
    gE−誘導活性からなる群から選択される少なくとも1
    つの活性を更に示すポリペプチドをコードするヌクレオ
    チド配列からなる核酸。
  2. 【請求項2】 前記ヌクレオチド配列が、pcD−46お
    よびpcD−125からなる群から選択されるベクターの
    cDNA挿入物中のDNA配列に対して事実上相同であ
    る請求項1記載の核酸。
  3. 【請求項3】 前記ヌクレオチド配列が、前記のDNA
    配列に対して少なくとも50%相同である請求項2記載
    の核酸。
  4. 【請求項4】 前記ヌクレオチド配列が、前記DNA配
    列に対して少なくとも75%相同である請求項3記載の
    核酸。
  5. 【請求項5】 以下の式: X(His)−X(Lys)−X(Cys)−X(Asp)−X(Ile)−X(Thr)− X(Leu)−X(Gln)−X(Glu)−X(Ile)−X(Ile)−X(Lys)− X(Thr)−X(Leu)−X(Asn)−X(Ser)−X(Leu)−X(Thr)− X(Glu)−X(Gln)−X(Lys)−X(Thr)−X(Leu)−X(Cys)− X(Thr)−X(Glu)−X(Leu)−X(Thr)−X(Val)−X(Thr)− X(Asp)−X(Ile)−X(Phe)−X(Ala)−X(Ala)−X(Ser)− X(Lys)−X(Asn)−X(Thr)−X(Thr)−X(Glu)−X(Lys)− X(Glu)−X(Thr)−X(Phe)−X(Cys)−X(Arg)−X(Ala)− X(Ala)−X(Thr)−X(Val)−X(Leu)−X(Arg)−X(Gln)− X(Phe)−X(Tyr)−X(Ser)−X(His)−X(His)−X(Glu)− X(Lys)−X(Asp)−X(Thr)−X(Arg)−X(Cys)−X(Leu)− X(Gly)−X(Ala)−X(Thr)−X(Ala)−X(Gln)−X(Gln)− X(Phe)−X(His)−X(Arg)−X(His)−X(Lys)−X(Gln)− X(Leu)−X(Ile)−X(Arg)−X(Phe)−X(Leu)−X(Lys)− X(Arg)−X(Leu)−X(Asp)−X(Arg)−X(Asn)−X(Leu)− X(Trp)−X(Gly)−X(Leu)−X(Ala)−X(Gly)−X(Leu)− X(Asn)−X(Ser)−X(Cys)−X(Pro)−X(Val)−X(Lys)− X(Glu)−X(Ala)−X(Asn)−X(Gln)−X(Ser)−X(Thr)− X(Leu)−X(Glu)−X(Asn)−X(Phe)−X(Leu)−X(Glu)− X(Arg)−X(Leu)−X(Lys)−X(Thr)−X(Ile)−X(Met)− X(Arg)−X(Glu)−X(Lys)−X(Tyr)−X(Ser)−X(Lys)− X(Cys)−X(Ser)−X(Ser) [式中、 X(Ser)は、Ser、Thr、Gly、およびAsnからなる群
    を表し、 X(Arg)は、Arg、His、Gln、Lys、およびGluから
    なる群を表し、 X(Leu)は、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、およびV
    alからなる群を表し、 X(Pro)は、Pro、Gly、Ala、およびThrからなる群
    を表し、 X(Thr)は、Thr、Pro、Ser、Ala、Gly、His、お
    よびGlnからなる群を表し、 X(Ala)は、Ala、Gly、Thr、およびProからなる群
    を表し、 X(Val)は、Val、Met、Tyr、Phe、Ile、およびL
    euからなる群を表し、 X(Gly)は、Gly、Ala、Thr、Pro、およびSerから
    なる群を表し、 X(Ile)は、Ile、Met、Tyr、Phe、Val、およびL
    euからなる群を表し、 X(Phe)は、Phe、Trp、Met、Tyr、Ile、Val、お
    よびLeuからなる群を表し、 X(Tyr)は、Tyr、Trp、Met、Phe、Ile、Val、お
    よびLeuからなる群を表し、 X(His)は、His、Glu、Lys、Gln、Thr、およびA
    rgからなる群を表し、 X(Gln)は、Gln、Glu、Lys、Asn、His、Thr、お
    よびArgからなる群を表し、 X(Asn)は、Asn、Glu、Asp、Gln、およびSerから
    なる群を表し、 X(Lys)は、Lys、Glu、Gln、His、およびArgから
    なる群を表し、 X(Asp)は、Asp、Glu、およびAsnからなる群を表
    し、 X(Glu)は、Glu、Asp、Lys、Asn、Gln、His、お
    よびArgからなる群を表し、そしてX(Met)は、Met、
    Phe、Ile、Val、Leu、およびTyrからなる群を表
    す]で定義されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを
    コードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換
    または一過性トランスフェクションすることによって得
    られうる細胞。
  6. 【請求項6】 酵母細胞、細菌細胞、および哺乳動物細
    胞からなる群から選択される請求項5記載の細胞。
  7. 【請求項7】 エシェリキア・コリ(Escherichia col
    i)細胞、サッカロミセス・セレビシェ(Saccharomyces
    cerevisiae)細胞、COS7サル細胞、チャイニーズ
    ハムスター卵巣細胞、マウスL細胞、およびマウスミエ
    ローマ細胞からなる群から選択される請求項6記載の細
    胞。
  8. 【請求項8】 以下の式: X(His)−X(Lys)−X(Cys)−X(Asp)−X(Ile)−X(Thr)− X(Leu)−X(Gln)−X(Glu)−X(Ile)−X(Ile)−X(Lys)− X(Thr)−X(Leu)−X(Asn)−X(Ser)−X(Leu)−X(Thr)− X(Glu)−X(Gln)−X(Lys)−X(Thr)−X(Leu)−X(Cys)− X(Thr)−X(Glu)−X(Leu)−X(Thr)−X(Val)−X(Thr)− X(Asp)−X(Ile)−X(Phe)−X(Ala)−X(Ala)−X(Ser)− X(Lys)−X(Asn)−X(Thr)−X(Thr)−X(Glu)−X(Lys)− X(Glu)−X(Thr)−X(Phe)−X(Cys)−X(Arg)−X(Ala)− X(Ala)−X(Thr)−X(Val)−X(Leu)−X(Arg)−X(Gln)− X(Phe)−X(Tyr)−X(Ser)−X(His)−X(His)−X(Glu)− X(Lys)−X(Asp)−X(Thr)−X(Arg)−X(Cys)−X(Leu)− X(Gly)−X(Ala)−X(Thr)−X(Ala)−X(Gln)−X(Gln)− X(Phe)−X(His)−X(Arg)−X(His)−X(Lys)−X(Gln)− X(Leu)−X(Ile)−X(Arg)−X(Phe)−X(Leu)−X(Lys)− X(Arg)−X(Leu)−X(Asp)−X(Arg)−X(Asn)−X(Leu)− X(Trp)−X(Gly)−X(Leu)−X(Ala)−X(Gly)−X(Leu)− X(Asn)−X(Ser)−X(Cys)−X(Pro)−X(Val)−X(Lys)− X(Glu)−X(Ala)−X(Asn)−X(Gln)−X(Ser)−X(Thr)− X(Leu)−X(Glu)−X(Asn)−X(Phe)−X(Leu)−X(Glu)− X(Arg)−X(Leu)−X(Lys)−X(Thr)−X(Ile)−X(Met)− X(Arg)−X(Glu)−X(Lys)−X(Tyr)−X(Ser)−X(Lys)− X(Cys)−X(Ser)−X(Ser) [式中、 X(Ser)は、Ser、Thr、Gly、およびAsnからなる群
    を表し、 X(Arg)は、Arg、His、Gln、Lys、およびGluから
    なる群を表し、 X(Leu)は、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、およびV
    alからなる群を表し、 X(Pro)は、Pro、Gly、Ala、およびThrからなる群
    を表し、 X(Thr)は、Thr、Pro、Ser、Ala、Gly、His、お
    よびGlnからなる群を表し、 X(Ala)は、Ala、Gly、Thr、およびProからなる群
    を表し、 X(Val)は、Val、Met、Tyr、Phe、Ile、およびL
    euからなる群を表し、 X(Gly)は、Gly、Ala、Thr、Pro、およびSerから
    なる群を表し、 X(Ile)は、Ile、Met、Tyr、Phe、Val、およびL
    euからなる群を表し、 X(Phe)は、Phe、Trp、Met、Tyr、Ile、Val、お
    よびLeuからなる群を表し、 X(Tyr)は、Tyr、Trp、Met、Phe、Ile、Val、お
    よびLeuからなる群を表し、 X(His)は、His、Glu、Lys、Gln、Thr、およびA
    rgからなる群を表し、 X(Gln)は、Gln、Glu、Lys、Asn、His、Thr、お
    よびArgからなる群を表し、 X(Asn)は、Asn、Glu、Asp、Gln、およびSerから
    なる群を表し、 X(Lys)は、Lys、Glu、Gln、His、およびArgから
    なる群を表し、 X(Asp)は、Asp、Glu、およびAsnからなる群を表
    し、 X(Glu)は、Glu、Asp、Lys、Asn、Gln、His、お
    よびArgからなる群を表し、そしてX(Met)は、Met、
    Phe、Ile、Val、Leu、およびTyrからなる群を表
    す]で定義されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを
    コードするヌクレオチド配列を含むベクターであって、
    細菌宿主細胞を形質転換することのできるベクター。
  9. 【請求項9】 pIN−III−ompA2、TRPC1
    1、およびTAC−RBSからなる群から選択される請
    求項8記載のベクター。
  10. 【請求項10】 以下の式: X(His)−X(Lys)−X(Cys)−X(Asp)−X(Ile)−X(Thr)− X(Leu)−X(Gln)−X(Glu)−X(Ile)−X(Ile)−X(Lys)− X(Thr)−X(Leu)−X(Asn)−X(Ser)−X(Leu)−X(Thr)− X(Glu)−X(Gln)−X(Lys)−X(Thr)−X(Leu)−X(Cys)− X(Thr)−X(Glu)−X(Leu)−X(Thr)−X(Val)−X(Thr)− X(Asp)−X(Ile)−X(Phe)−X(Ala)−X(Ala)−X(Ser)− X(Lys)−X(Asn)−X(Thr)−X(Thr)−X(Glu)−X(Lys)− X(Glu)−X(Thr)−X(Phe)−X(Cys)−X(Arg)−X(Ala)− X(Ala)−X(Thr)−X(Val)−X(Leu)−X(Arg)−X(Gln)− X(Phe)−X(Tyr)−X(Ser)−X(His)−X(His)−X(Glu)− X(Lys)−X(Asp)−X(Thr)−X(Arg)−X(Cys)−X(Leu)− X(Gly)−X(Ala)−X(Thr)−X(Ala)−X(Gln)−X(Gln)− X(Phe)−X(His)−X(Arg)−X(His)−X(Lys)−X(Gln)− X(Leu)−X(Ile)−X(Arg)−X(Phe)−X(Leu)−X(Lys)− X(Arg)−X(Leu)−X(Asp)−X(Arg)−X(Asn)−X(Leu)− X(Trp)−X(Gly)−X(Leu)−X(Ala)−X(Gly)−X(Leu)− X(Asn)−X(Ser)−X(Cys)−X(Pro)−X(Val)−X(Lys)− X(Glu)−X(Ala)−X(Asn)−X(Gln)−X(Ser)−X(Thr)− X(Leu)−X(Glu)−X(Asn)−X(Phe)−X(Leu)−X(Glu)− X(Arg)−X(Leu)−X(Lys)−X(Thr)−X(Ile)−X(Met)− X(Arg)−X(Glu)−X(Lys)−X(Tyr)−X(Ser)−X(Lys)− X(Cys)−X(Ser)−X(Ser) [式中、 X(Ser)は、Ser、Thr、Gly、およびAsnからなる群
    を表し、 X(Arg)は、Arg、His、Gln、Lys、およびGluから
    なる群を表し、 X(Leu)は、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、およびV
    alからなる群を表し、 X(Pro)は、Pro、Gly、Ala、およびThrからなる群
    を表し、 X(Thr)は、Thr、Pro、Ser、Ala、Gly、His、お
    よびGlnからなる群を表し、 X(Ala)は、Ala、Gly、Thr、およびProからなる群
    を表し、 X(Val)は、Val、Met、Tyr、Phe、Ile、およびL
    euからなる群を表し、 X(Gly)は、Gly、Ala、Thr、Pro、およびSerから
    なる群を表し、 X(Ile)は、Ile、Met、Tyr、Phe、Val、およびL
    euからなる群を表し、 X(Phe)は、Phe、Trp、Met、Tyr、Ile、Val、お
    よびLeuからなる群を表し、 X(Tyr)は、Tyr、Trp、Met、Phe、Ile、Val、お
    よびLeuからなる群を表し、 X(His)は、His、Glu、Lys、Gln、Thr、およびA
    rgからなる群を表し、 X(Gln)は、Gln、Glu、Lys、Asn、His、Thr、お
    よびArgからなる群を表し、 X(Asn)は、Asn、Glu、Asp、Gln、およびSerから
    なる群を表し、 X(Lys)は、Lys、Glu、Gln、His、およびArgから
    なる群を表し、 X(Asp)は、Asp、Glu、およびAsnからなる群を表
    し、 X(Glu)は、Glu、Asp、Lys、Asn、Gln、His、お
    よびArgからなる群を表し、そしてX(Met)は、Met、
    Phe、Ile、Val、Leu、およびTyrからなる群を表
    す]で定義されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを
    コードするヌクレオチド配列を含むベクターであって、
    酵母宿主細胞を形質転換することのできるベクター。
  11. 【請求項11】 ベクターpMF−アルファ8である請
    求項10記載のベクター。
  12. 【請求項12】 以下の式: X(His)−X(Lys)−X(Cys)−X(Asp)−X(Ile)−X(Thr)− X(Leu)−X(Gln)−X(Glu)−X(Ile)−X(Ile)−X(Lys)− X(Thr)−X(Leu)−X(Asn)−X(Ser)−X(Leu)−X(Thr)− X(Glu)−X(Gln)−X(Lys)−X(Thr)−X(Leu)−X(Cys)− X(Thr)−X(Glu)−X(Leu)−X(Thr)−X(Val)−X(Thr)− X(Asp)−X(Ile)−X(Phe)−X(Ala)−X(Ala)−X(Ser)− X(Lys)−X(Asn)−X(Thr)−X(Thr)−X(Glu)−X(Lys)− X(Glu)−X(Thr)−X(Phe)−X(Cys)−X(Arg)−X(Ala)− X(Ala)−X(Thr)−X(Val)−X(Leu)−X(Arg)−X(Gln)− X(Phe)−X(Tyr)−X(Ser)−X(His)−X(His)−X(Glu)− X(Lys)−X(Asp)−X(Thr)−X(Arg)−X(Cys)−X(Leu)− X(Gly)−X(Ala)−X(Thr)−X(Ala)−X(Gln)−X(Gln)− X(Phe)−X(His)−X(Arg)−X(His)−X(Lys)−X(Gln)− X(Leu)−X(Ile)−X(Arg)−X(Phe)−X(Leu)−X(Lys)− X(Arg)−X(Leu)−X(Asp)−X(Arg)−X(Asn)−X(Leu)− X(Trp)−X(Gly)−X(Leu)−X(Ala)−X(Gly)−X(Leu)− X(Asn)−X(Ser)−X(Cys)−X(Pro)−X(Val)−X(Lys)− X(Glu)−X(Ala)−X(Asn)−X(Gln)−X(Ser)−X(Thr)− X(Leu)−X(Glu)−X(Asn)−X(Phe)−X(Leu)−X(Glu)− X(Arg)−X(Leu)−X(Lys)−X(Thr)−X(Ile)−X(Met)− X(Arg)−X(Glu)−X(Lys)−X(Tyr)−X(Ser)−X(Lys)− X(Cys)−X(Ser)−X(Ser) [式中、 X(Ser)は、Ser、Thr、Gly、およびAsnからなる群
    を表し、 X(Arg)は、Arg、His、Gln、Lys、およびGluから
    なる群を表し、 X(Leu)は、Leu、Ile、Phe、Tyr、Met、およびV
    alからなる群を表し、 X(Pro)は、Pro、Gly、Ala、およびThrからなる群
    を表し、 X(Thr)は、Thr、Pro、Ser、Ala、Gly、His、お
    よびGlnからなる群を表し、 X(Ala)は、Ala、Gly、Thr、およびProからなる群
    を表し、 X(Val)は、Val、Met、Tyr、Phe、Ile、およびL
    euからなる群を表し、 X(Gly)は、Gly、Ala、Thr、Pro、およびSerから
    なる群を表し、 X(Ile)は、Ile、Met、Tyr、Phe、Val、およびL
    euからなる群を表し、 X(Phe)は、Phe、Trp、Met、Tyr、Ile、Val、お
    よびLeuからなる群を表し、 X(Tyr)は、Tyr、Trp、Met、Phe、Ile、Val、お
    よびLeuからなる群を表し、 X(His)は、His、Glu、Lys、Gln、Thr、およびA
    rgからなる群を表し、 X(Gln)は、Gln、Glu、Lys、Asn、His、Thr、お
    よびArgからなる群を表し、 X(Asn)は、Asn、Glu、Asp、Gln、およびSerから
    なる群を表し、 X(Lys)は、Lys、Glu、Gln、His、およびArgから
    なる群を表し、 X(Asp)は、Asp、Glu、およびAsnからなる群を表
    し、 X(Glu)は、Glu、Asp、Lys、Asn、Gln、His、お
    よびArgからなる群を表し、そしてX(Met)は、Met、
    Phe、Ile、Val、Leu、およびTyrからなる群を表
    す]で定義されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを
    コードするヌクレオチド配列を含むベクターであって、
    哺乳動物宿主細胞を形質転換することのできるベクタ
    ー。
  13. 【請求項13】 pcDプラスミドからなる請求項12記
    載のベクター。
  14. 【請求項14】 前記プラスミドがpcD−46およびpc
    D−125からなる群から選択される請求項13記載の
    ベクター。
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Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0740943B2 (ja) * 1985-09-30 1995-05-10 佑 本庶 新規なポリペプチドをコードするdna及びその製造方法
US5912136A (en) * 1985-11-19 1999-06-15 Schering Corporation Monoclonal antibodies against human interleukin-4 and hybridomas producing the same
US5700915A (en) * 1985-11-19 1997-12-23 Schering Corporations Human interleukin immunopurification processes
US5041381A (en) * 1986-07-03 1991-08-20 Schering Corporation Monoclonal antibodies against human interleukin-4 and hybridomas producing the same
US5082927A (en) * 1986-09-24 1992-01-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Selectively cytotoxic IL-4-PE40 fusion protein
AU620537B2 (en) * 1986-12-19 1992-02-20 Immunex Corporation Human interleukin-4 muteins
SE8701004D0 (sv) * 1987-03-11 1987-03-11 Astra Ab Method for therapy of leukemias and certain other malignancies
WO1989001046A1 (en) * 1987-07-29 1989-02-09 Schering Biotech Corporation Purification of human interleukin-4 expressed in escherichia coli
JPH02485A (ja) * 1987-08-03 1990-01-05 Yuu Honshiyo 新規なヒトインターロイキン4、該因子を発現させるための組換えベクター及びそのベクターにより形質転換された形質転換体
DE3882611T2 (de) * 1987-08-03 1993-12-23 Tasuku Honjo Menschliches Interleukin-4, Expressionsvektoren dafür und diese enthaltende Transformanten.
ES2058490T3 (es) * 1988-02-02 1994-11-01 Schering Biotech Corp Metodo de reducir respuestas de inmunoglobulina e.
GB8808015D0 (en) 1988-04-06 1988-05-05 Ritter M A Chemical compounds
GB2218420B (en) * 1988-04-12 1992-07-15 British Bio Technology Synthetic gene encoding interleukin 4
WO1989010939A1 (en) * 1988-05-13 1989-11-16 University Patents, Inc. Immunogens and biologically active peptides derived from shared sequences from antigens and anti-idiotypic antibodies or antibodies specific for cellular receptors of the antigens
US4958007A (en) * 1988-05-17 1990-09-18 Schering-Plough Corp. Extraction of human interleukin-4- from bacteria
AU643427B2 (en) * 1988-10-31 1993-11-18 Immunex Corporation Interleukin-4 receptors
WO1990006765A1 (en) * 1988-12-21 1990-06-28 Schering Corporation Use of interleukin-4 for lowering blood glucose levels and/or effecting weight reduction
WO1990007932A1 (en) * 1989-01-20 1990-07-26 The University Of Melbourne Fibrinolysis
US5077388A (en) * 1990-05-31 1991-12-31 Schering Corporation Purification of human interleukin-4 from a secreted escherichia coli mutant
WO1991007186A1 (en) * 1989-11-21 1991-05-30 The University Of Melbourne Anti-inflammatory compositions and methods
SE465039B (sv) * 1989-11-23 1991-07-15 Chemrec Ab Saett att framstaella koklutar med hoeg sulfiditet foer sulfatmassakokning
US5188827A (en) * 1989-12-18 1993-02-23 Schering Corporation Use of interleukin-4- for lowering blood-cholesterol levels
IL96714A0 (en) 1989-12-20 1991-09-16 Schering Corp Antibody antagonists of human interleukin-4
CA2078676A1 (en) * 1990-03-21 1991-09-22 Jerome Schwartz Use of il-4 to enhance immune response to infectious antigenic challenges
EP0563254B1 (en) * 1990-12-19 1995-11-08 Schering Corporation Use of il-4 to enhance immune response to immunogens in vaccines
ATE135233T1 (de) * 1991-01-10 1996-03-15 Schering Corp Verwendung von il-4 zur verstärkung von wundheilung und besserung und zur heilung von infizierten wunden und wunden bei diabetischen säugetieren
US5494662A (en) * 1992-04-27 1996-02-27 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Stimulator for bone formation
US5716612A (en) * 1994-09-07 1998-02-10 Schering Corporation Use of IL-4 for potentiation of chemotherapeutic agents
AUPN481295A0 (en) * 1995-08-16 1995-09-07 Medvet Science Pty. Ltd. Agonists of haemopoietic growth factors
US6335426B1 (en) 1996-06-14 2002-01-01 Bayer Corporation T-cell selective interleukin-4 agonists
US5986059A (en) * 1996-06-14 1999-11-16 Bayer Corporation T-cell selective interleukin-4 agonists
US6028176A (en) 1996-07-19 2000-02-22 Bayer Corporation High-affinity interleukin-4 muteins
CA2331726C (en) * 1998-05-12 2010-03-09 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of molecular interaction sites on rna and other biomolecules
AUPQ005399A0 (en) * 1999-04-29 1999-05-27 Medvet Science Pty. Ltd. Agonists or antagonists for haemopoietic growth factors
LT2665486T (lt) 2011-01-18 2020-04-10 Bioniz, Llc Kompozicijos, skirtos gama-c-citokino aktyvumui moduliuoti
WO2015089217A2 (en) 2013-12-10 2015-06-18 Bionz, Llc Methods of developing selective peptide antagonists
CN102212888A (zh) * 2011-03-17 2011-10-12 靳海峰 一种基于高通量测序的免疫组库构建方法
US11400134B2 (en) 2015-10-09 2022-08-02 Bioniz, Llc Modulating gamma-c-cytokine activity
WO2020227019A1 (en) 2019-05-03 2020-11-12 Bioniz, Llc Modulating the effects of gamma-c-cytokine signaling for the treatment of alopecia and alopecia associated disorders

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US799668A (en) * 1905-05-29 1905-09-19 Albert R Pritchard Dough kneader and mixer.
US799669A (en) * 1905-07-27 1905-09-19 Eugene S Regnier Combined cutting and raking implement.
US843958A (en) * 1905-11-20 1907-02-12 Whitehead & Hoag Co Key-ring tag.
US4613459A (en) * 1982-10-20 1986-09-23 Dana-Farber Cancer Institute Lymphocyte growth factor
US4695542A (en) * 1983-10-04 1987-09-22 Dnax Research Institute Of Molecular And Cellular Biology, Inc. cDNA clones coding for polypeptides exhibiting multi-lineage cellular growth factor activity
WO1987004723A1 (en) * 1986-02-11 1987-08-13 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant human b-cell growth factor
ZA872781B (en) * 1986-05-19 1987-10-05 Immunology Ventures B-cell stimulating factor
AU620537B2 (en) * 1986-12-19 1992-02-20 Immunex Corporation Human interleukin-4 muteins

Also Published As

Publication number Publication date
DE3650751D1 (de) 2001-02-22
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OA08947A (en) 1990-11-30
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IL80678A (en) 1999-05-09
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