KR930009084B1 - 포유동물의 인터로이킨-4, 이를 포함하는 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

포유동물의 인터로이킨-4, 이를 포함하는 조성물 및 이의 제조방법

제 1a 도는 쥐의 IL-4를 발현시키는 벡터 pcD-2A-E3 삽입물의 뉴클레오타이드 서열 및 추정의 아미노산 서열을 도시한 것이다.

제 1b 도는 사람의 IL-4를 발현시키는 벡터 pcD-125 삽입물의 뉴클레오타이드 서열 및 추정의 아미노산 서열을 도시한 것이다.

제 1c 도는 pcD-125를 사용하여 형질감염시킨 COS7원숭이 세포에 의해 발현되고 분리되는, 정제된 천연의 사람 IL-4의 아미노산 서열을 도시한 것이다.

제 2a 도는 쥐의 IL-4의 코드화하는 삽입물을 갖는 벡터 pcD-2A-E3의 지도이다.

제 2b 도는 벡터 pcD-2A-E3 삽입물의 제한 엔도뉴클레아제 절단 지도이다.

제 2c 도는 사람의 IL-4를 코드화하는 삽입물을 갖는 pcD-46의 지도이다.

제 2d 도는 벡터 pcD-46 삽입물의 제한 엔도뉴클레아제 절단 지도이다.

제 3a 도는 pcD-2A-E3-형질감염된 COS7 세포로 부터의 배양 상등액(곡선 1)을 포함한 여러가지 배양 상등액의 상대적인 TCGF활성(희석 범위에 걸쳐)을 도시한 것이다.

제 3b 도는 pcD-2A-E3-형질감염된 COS7 세포로 부터의 배양 상등액(곡선 1)을 포함한 여러가지 배양 상등액의 상대적인 MCGF 활성(희석 범위에 걸쳐)을 도시한 것이다.

제 3c 도는 pcD-2A-E3-형질감염된 COS7 세포(곡선 1), Cl. Lyl⁺2^-/9(곡선 2), 및 모의 형질감염된 COS7 세포(곡선 3)부터의 상등액 지정량에 의해 생성된 생대적인 Ia 유도 정도를 도시한 것이다.

제 3d 도는 pcD-2A-E3-형질감염된 COS7 세포로 및 T세포-결핍된 마우스 비장 세포에서의 여러가지 대조군으로부터의 상등액에 의해 유도된 IgE 및 IgG₁의 범위를 그라프적으로 도시한 것이다.

제 4a 도는 인자-의존적 사람 헬퍼 T세포주인 JL-EBV 상에서 비색 증식 검정에 의해 측정한 여러가지 pcD-125 혈질감염 상등액 및 대조군의 TCGF 활성을 도시한 것이다.

제 4b 도는 PHA-자극된 말초 혈 임파구 상에서 비색 증식 검정에 의해 측정한 pcD-125 형질 감염 상등액 및 대조군의 TCGF 활성을 도시한 것이다.

제 4c 도는 PHA-자극된 말초 혈 임파구 상에서 삼중수소 처리된 티미딘 삽입에 의해 측정한 pCD-125 형질 감염 상등액 및 대조군의 TCGF 활성을 도시한 것이다.

제 5a 도는 Fc-ε 수용체가 형광적으로 표지된, 자극된 사람 편도선 B세포의 대조 집단에 대한 세포 빈도수 : 형광 강도의 그라프이다.

제 5b 도는 Fc-ε 수용체가 형광적으로 표지되었으며, pcD-125-형질감염된 COS7 세포 부터의 0.1% 상등액으로 이루어진 배지에 노출된, 자극된 사람 편도선 B세포의 집단에 대한 세포 빈도수 : 형광 강도의 그라프이다.

제 5c 도는 Fc-ε 수용체가 형광적으로 표지되었으며, pcD-125-형질감염된 COS7 세포로부터의 1% 상등액으로 이루어진 배지에 노출된, 자극된 사람 편도선 B세포의 집단에 대한 세포 빈도수 : 형광 강도의 그라프이다.

제 5d 도는 Fc-ε 수용체가 형광적으로 표지되었으며, pcD-125-형질감염된 COS7 세포로부터의 10% 상등액으로 이루어진 배지에 노출된, 자극된 사람 편도선 B세포의 집단에 대한 세포 빈도수 : 형광 강도의 그라프이다.

제 6a 도는 이. 콜라이에서 천연 또는 돌연변이체 IL-4를 발현시키는데 유용한 합성의 사람 IL-4 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 도시한 것이다.

제 6b 도는 플라스미드 pUC 18에 삽입된 합성의 사람 IL-4 유전자의 제한 엔도뉴클레아제 절단 지도이다.

제 7a 내지 7F 도는 각각 합성된 사람 IL-4 유전자를 작제하는데 사용된 이본쇄 DNA 단편 1A/B 내지 6A/B를 도시한 것이다.

제 8 도는 이. 콜라이 발현 벡터 TAC-RBS에서 개시 ATG 코돈에 인접한 뉴클레오타이드 서열을 도시한 것이다.

제 9 도는 임파구 결핍성 증후근 환자로 부터 유도된 세포 집단에 대한 세포 빈도수 : 형광 강도를 도시한 것이다.

제 10 도는 C-4 컬럼상에서 역상 HPLC로 수행한, 최종의 사람 IL-4정제 단계에서의 215mm 흡수 프로필을 도시한 것이다.

제 11 도는 사람의 IL-4 cDNA를 함유하는 플라스미드 pEBV-178의 작제 지도이다.

제 12 도는 플라스미드 TRPC 11의 작제 지도이다.

제 13a 도는 플라스미드 pMF-α의 작제 지도이다.

제 13b 도는 천연한 사람 IL-4 및 이의 여러가지 뮤테인을 발현시키는 효모 배양물부터의 여러가지 형질감염 상등액의 TCGF 활성을 도시한 것이다.

제 14 도는 인자-의존 세포주 MC/9 마스트세포(1A), DX-2 마스트 세포(1B), NFS-60 세포(1C) 및 HT2T 세포(1D)의 성장 곡선을 도시한 것이다.

제 15 도는 Cl. 1 상등액의 FPLC양이온 교환 크로마토그라피의 결과를 도시한 것이다.

제 16a 도는 IL-3 결핍된 Cl. 1 상등액의 역상 C8 크로마토그라피의 결과를 도시한 것이다.

제 16b 도는 GK 15-1 쥐의 T세포 상등액의 역상 C8 크로마토그라피의 결과를 도시한 것이다.

제 17 도는 역상 컬럼으로부터 부분 정제된 인자(RP 인자)의 MCGF 및 TCGF 활성을 도시한 것이다.

제 18 도는 Cl. 1 상등액의 크로마토포커싱의 결과를 도시한 것이다.

제 19 도는 Cl. 1 상등액 및 부분정제된 MCGF/TCGF의 SDS-PAGE 의 결과를 도시한 것이다.

본 발명은 일반적으로 포유동물 면역계의 단백질 및 뮤테인(mutein)인자 및 이들을 코드화하는 핵산에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 T세포 성장 인자 활성 및 B 세포 성장 인자 활성 둘다를 나타내는 단백질 및 뮤테인 인자 및 이들을 코드화하는 핵산에 관한 것이다.

DNA 제조합 기술은, 일반적으로 공급원으로부터의 유전정보를 벡터내로 통합시키고 숙주내로의 도입과 같은 후속한 프로세싱으로 전달된 유전정보를 새로운 환경에서 복제시키고/시키거나 발현 시키는 기법으로 언급된다. 통상적으로, 유전 정보는 목적하는 단백질 생성물을 코드화하는 메신저 RNA(mRNA)로 부터 유도된 상보적 DNA(cDNA)의 형태로 존재한다. 담체는 종종 숙주에서의 복제를 위해 cDNA를 삽입시키고, 때때로, 실질적으로 cDNA의 발현을 조절함으로써 숙주에서 코드화된 생성물의 합성을 지시할 수 있는 능력을 가진 플라스미드이다.

상당한 기간동안, 포유동물의 면역 반응은 "면역 네트워크(immune network)"이라 불리는 일련의 복잡한 세포의 상호작용에 기인한다고 알려져왔다. 최근의 연구로, 이 면역 네트워크의 내부 작용에 관한 새로운 견해가 제공되었다. 반응의 대부분의 임파구, 대식세포, 과립구등의 세포의 네트워크-형 상호작용에 의해 사실상 순환한다는 것이 명백한 상태로 남아 있지만, 면역학자들은 현재 일반적으로 가용성 단백질[예 : 소위 "림포카인(lymphokine)" 또는 "모노카인(monokine)]"이 이들 세포의 상호작용을 조절하는데 중요한 역할을 한다는 견해를 가지고 있다. 그러므로, 세포 조절 인자의 분리, 특성화 및 작용의 기작에 상당한 관심이 쏟아지며, 이의 이해는 여러가지 치료요법에 상당한 진전을 줄 것이다.

림포카인은 명백히 세포 활성을 여러가지 방식으로 조절한다. 이들은 다능성 조혈 간 세포의 면역 반응을 이행하는 다양한 세포계(lineage)로 이루어진 거대한 숫자의 조상(progenitor)로의 증식, 성장 및 분화를 지지하는 것으로 밝혀졌다. 이들 계는 종종, 림포카인이 다른 제제와 함께 사용되는 경우 상이한 방식으로 반응한다.

면역 반응에 특히 중요한 세포 계에는 두 종류의 임파구가 포함된다 : B-세포[이 세포는 면역 글로블린(와인성 물질의 제거를 수행하기 위해 외인성 물질을 인지하고 결합하는 능력을 가지고 있는 단백질)을 생성하고 분비할 수 있다] 및 다양한 서브세트의 T-세포[이 세포는 림포카인을 분비하고, B 세포 및 면역네트워크를 구성하는 일부의 다른 세포(다른 T-세포 포함)을 유도하거나 억제한다].

또다른 중요한 세포 계는 폐, 피부, 위장관 및 성뇨기관에 고농도로, 신체를 통해 모세관에 인접하게 위치하는 과립-함유 결합조직 세포인 마스트 세포(이는 모든 포유동물 종에서 양성적으로 동정되지는 않았다)이다. 마스트 세포는 알러지-관련 장애, 특히 과민증(anaphylaxis)에서, 다음과 같이 중심적인 역할을 한다 : 선택된 항원이 마스트 세포 표면상의 수용체에 결합된 면역 글로불린의 일 부류와 가교결합하는 경우, 마스트 세포는 탈과립화하여, 알러지 반응(예 : 과민증)을 야기시키는 중개물(예를 들면, 히스타민, 세로토닌, 헤파린, 프로스타글란딘 등)를 방출한다.

여러가지 면역 장애를 더 잘 이해(및 잠정적으로 치료적처리)하기 위한 연구는 면역계의 세포를 시험관내에 유지시킬 수 있는 일반적인 능력의 부재로 인하여 저지되어 왔다. 면역학자들은 이들 세포를 T-세포 및 여러가지 성장 인자(예 : 림포카인)를 함유하는 다른 세포 상등액을 사용하여 배양할 수 있음을 밝혀냈다.

림포카인, 및 면역 반응의 다른 가용성 중개물과 같은 인자의 검출, 분리 및 정제는 극도로 어려우며, 종종 이들이 통상 존재하는 상등액의 특성, 혼합물에서 여러가지 성분의 활성의 차이 및 교차, 인자들의 특성을 확인하는데 이용되는 검정의 민감도(또는 이의 부족), 인자들의 분자량 및 기타 특징 범위에서의 빈번한 유사점, 및 이들의 자역적인 상태에서 인자들의 매우 낮은 농도에 의해 까다로와진다.

주로 분자 클로닝을 통해 보다 많은 림포카인을 이용할 수 있게 되었으므로, 이들에 대한 임상적 적용을 발견하는데 관한 흥미도 높아졌다. 호르몬과 생리학적 유사성(예를 들면, 가용성 인자, 성장 중개물, 세포 수용체를 통한 작용)으로 인해, 림포카인의 점정적인 사용은 호르몬의 통상적인 사용으로 유추되었다[참조 : Dexter, Nature, Vol. 321, 198페이지(1986)]. 하나의 희망은, 환자에 존재하는 림포카인의 수준이 유리한 면역 반응(예를 들면, 염증, 앨러지, 조직 거부 반응의 억제, 또는 감염증 또는 악성 성장에 대한 자극 또는 증감)을 일으키는 것을 직접적으로 또는 간접적으로 조작할 수 있다는 것이다. 림포카인의 다른 잠정적인 임상적 사용에는 유리한 효과를 위해 동일하거나 다른 사람에게 최종적으로 재도입시키기 위해, 한 사람의 특정 면역계 세포의 집단을 시험관 내에서 유지시키고 확장시키는 것도 포함된다. 예를 들어, 환자의 림포카인-활성화된 킬러 T세포의 집단을 이들 신체 밖에서 확장시킨 다음 재주입시켜 증진된 항종양 반응을 일으킬 수 있는지를 측정하는 연구가 현재 진행중이다. 림포카인[특히 콜로니 자극 인자(예 : 과립구-대식 세포 콜로니를 자극하는 인자(GM-CSF) 및 이들의 활성을 증진시키는 인자]의 또 다른 잠정적인 임상적 사용은, 예를 들어 종양에 대한 화학 요법 또는 방사성 요법의 전, 후에, 또는 골수 형성 부전증의 치료시, 또는 호중구 결핍증후군 치료시 혈 생성을 자극시키는 것이다[참조 : Dexter, Nature, Vol 321, 198페이지(1986)]. 이러한 인자는 또한 재생불량성 빈혈 및 특정의 백혈병을 치료하는데 증가추세로 사용되는, 골수 이식 요법에도 유용한다.

이러한 임상적 적용에 대해 중요한 영향력을 갖는 림포카인의 두가지 특성을 다음과 같다 : 개개의 림포카인은 종종 다상유전직(pleiotropic)이며 : 하나의 림포카인의 생물학적 효과는 종종 적어도 하나의 다른 림포카인에 의해 억제되거나 증가됨으로써 조절될 수 있다. 예를 들어, 감마-인터페론과 상조작용하는 종양괴사 인자는 인터로이킨-1(IL-1) 생성을 자극시키며 호중구의 식세포 활성을 활성화시킬 수 있다. 활성화된 대식세포에 의해 생성된 단백질 IL-1은 인터로이킨-2(IL-2) 방출 유도를 통한 흉선 세포 증식의 자극, B-임파구 성숙 및 증식의 자극, 섬유아세포 성장인자를 활성 및 간세포에 의한 급상 단백질 합성의 유도를 포함한 광범위한 생물학적 활성을 조절한다. IL-1은 또한 활액 세포로부터 프로스타글라딘 및 콜라게나제 방출을 자극시키고, 내인성 발열 물질과 동일한 것으로 보고되었다[참조 : Krampschmidt, J. Leuk. Biol., Vol. 36, 341-355페이지(1984)].

인터로이킨-2(이전에는 T-세포 성장인자로 명명했음)는 렉틴-또는 항원-활성화된 T세포에 의해 생성된 림포카인다. IL-2의 보고된 생물학적 활성에는 활성화된 T-세포 클론의 장기간의 시험관내 성장의 자극, 흉선 세포 유사분열의 증진, 밑 누드 마우스 비장 세포의 배양물에서 세포독성 T-세포반응성 및 플라크-형성 세포 반응의 유도가 포함된다. 또한, 인터페론(IFN)과 같이, IL-2는 천연 킬러 세포활성을 증가시킨다고 알려졌으므로 이는 신생물 질환 치료시 잠정적인 사용을 제시한다[참조 : Henney et a., Nature, Vol. 291, 335-338페이지(1981)]. 이러한 치료요법에서 일부의 성공이 보고되었다[참조 : Lotze 및 Rosenberg, "Treatment of Tumor Patients with Purified Human Interleukin-2", 711-719페이지, Sorg et., Eds. Cellular and Molecular Biology of Lymphokines(Academic Press, Inc. New York, 1985) ; 및 Rosenberg 및 Lotze, "Cancer Immunotherapy Using Interleukin-2 and Interleukin-2-Activated Lymphocytes", Ann, Rev. Immunol., Vol. 4, 681-709페이지(1986)]. 그러나, IL-2 독성은 이들 특성을 유리하게 취해야 하는 암 환자에게 전달될 수 있는 용량을 제한시킨다[참조 : Lotze 및 Rosenberg, 711-719페이지 ; 및 Welte et al., 755-759페이지, Sorg et al. Eds. (상기참조)].

문헌[참조 : Metcalf, D., The Hematopoietic Colony Stimulating Factors, (Elsevier, Amsterdam, 1984)]애는 포유동물의 면역반응에 관련된 림포카인 및 여러가지 성장 인자에 관한 연구의 개요가 기술되어 있다. 문헌[참조 : Yung, Y. P., et al., J. Immunol. Vol 127, 794페이지(1981)]에는 마스트 세포 성장인지(MCGF)활성을 나타내는 대략 35kd의 단백질의 부분 정제 방법 및 T-세포 성장인자(TCGF)로 알려진 인터로이킨-2(IL-2)로 부터 이 단백질을 분리하는 방법이 기술되어 있다. 문헌[참조 : Nabel, G., et al., Natrue Vol. 291, 332페이지(1981)]에는 45kd의 분자량 및 약 6.0의 pI를 갖는 MCGF가 보고되어 있다. 문헌[참조 : Clark-Lewis, I. 및 Schrader, J., J. Immunol., Vol. 127, 1941페이지(1981)]에는, 인산염-완충 식염수에서는 분자량이 약 29kd이고, 6M 구아니딘 염산염에서는 분자량이 약 23kd이며, pI가 약 4 내지 8이지만 뉴라미디나제 처리후에는 pI가 약 6 내지 8인, 마스트 세포-형 성장 인자 활성을 갖는 단백질이 기술되어 있다. 쥐의 IL-2 및 인토로이킨-3(IL-3)는 문헌[참조 : Gillis, S., et al., J. Immunol., Vol. 124, 1954-1962페이지(1980), 및 Ihle, J., et al., J. Immunol, Vol. 129. 2431-2436페이지(1982)]기술된 바대로 생화학적으로 부분적으로 특성화되었으며, 각각, IL-2는 약 30-45kd의 겉보기 분자량(대략 이량체로서)을 가지고 IL-3는 약 28kd의 분자량을 갖는다. 사람의 IL-2는 확실히 약15kd의 분자량을 가지며 하기 문헌에 기술되어 있다[참조 : Gillis, s., et al., Immu. Rev., Vol. 63, 167-209페이지(1982)]. T-세포 상등액의 IL-3의 MCGF 활성 사이의 비교는 하기 문헌들에 보고되어 있다[참조 : Yung Y. 및 Moore, M., Contemp. Top. Mol. Immunol., Vol. 10, 147-179페이지(1985) 및 Rennick, D., et al., J. Immunol., Vol . 134 910-919페이지(1985)].

여러가지 문헌에는 가용성 인자에 의한 B-세포 성장 및 분화의 조절에 관한 내용이 기술되어 있다[참조 : Howard 및 Paul, Ann. Rev. Immunol., Vol. 1, 307-333페이지(1983) ; Howard et al., Immunol. Rev., 1984, No. 78, 185-210페이지 : Kishimoto et al., Immunol. Rov., 1984, No. 78, 97-118페이지 ; 및 Kishimoto, Ann. Rev. Immunol., Vol. 3, 133-157페이지(1975)]. 공급 물질에서의 차이, 정제의 어려움, 및 이들의 생물학적 활성을 정의하는데 사용되는 검정의 어려움에서의 차이로 인해, 여러가지 인자들을 구분하는데 사용되는 명명법상에서의 약간의 혼란이 발생한다. 명명법상의 일치는 확실히 몇몇 경우에만 나타난다[참조 : Paul, Immunology Today, Vol. 4, 332페이지(1983) : 및 Paul, Molecular Immunol., Vol. 21, 343페이지(1984)]. B-세포 성장 인자(BCGF) 활성은 항-IgM 또는 유사한 항원에 노출시킴에 의해 공자극된 B-세포에서 DNA 합성을 야기시키는 능력에 의해 특징지워진다. 적어도 검정을 저밀도의 B세포를 사용하여 수행하는 경우, 인터로이킨-1(IL-1)은 또한 입증할 BCGF 활성을 위해 필요하다고 생각된다. 사람 BCGF에 대한 다른 검정도 기술되어 있다[참조 : Maizel et al., Proc. Natl. Acda. Sci., Vol. 80, 5047-5051페이지(1983)](배양물에서 사람 B세포의 장기간 성장을 지지).

앞의 검정에 관련된 활성은 또한, 이것을 유사하고/하거나 연관된 활성과 구별하기 위해, B세포 자극 인자-1(BSF-1) 활성 및 BCGFI 표지된다. 특히, BCGF II로 표기된 활성이 기술되었다. 이것은 유사 분열 물질-자극된 B세포에서 또는 형질전환된 B-세포주에서 DNA합성을 야기시키는 능력에 의해 특징지워진다. BCGF II 활성과 관련된 유사분열 물질에는 덱스트란 설페이트, 리포다당류 및 스타필로코커스(Staphylococcus)추출물이 포함된다. BCGF I은 이들 시험에서 반응을 나타내지 않는다. 사람에게 BCGF II는 약 50킬로달톤(KD)은 분자량을 갖는 분자이며, 면역 반응에서 B세포 증식을 촉진시킴에 있어서 BCGF I(즉, BSF-1)과 상조적으로 작용하는 것으로 생각된다[참조 : Yoshizaka et al., J. Immunol., Vol. 130, 1241-1246페이지(1983)], 문헌[참조 : Howard et al., J. Exp. Med., Vol. 155, 914-923페이지(1982)]에는 인터로이킨-2와는 다른 쥐의 BCGF(이는 이후에 BCGF I, BSF-1, 또는 IgG₁유도 인자와 같이 여러가지 불림)의 존재에 대해 가장 먼저 보고되었다. 사람 계에 대한 유사한 관찰도 거의 동시에 보고되었다[참조 : Yoshizaki et. al., J. Immunol., Vol. 128, 1296-1301페이지(1982) ; 및 그후 Okada et al., J. Exp. Med., Vol. 157, 583-590페이지(1983)].

BCGF 또는 BSF-1활성을 나타내는 분자의 생화학적 및 생물학적 특성화는 이들 최초의 발견 이후 꾸준히 진행되어 오고 있다. 문헌[참조 : Maizel et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 79, 5998-6002페이지(1982)]에는 12 내지 13kd의 분자량 및 약 6.3 내지 6.6의 등전점(pI)을 갖는 트립신-민감성 사람 BCGF가 보고되어 있다. 문헌(참조 : Farrar et al., J. Immunol., vol. 131, 1838-1842페이지(1983)]에는 SDS-PAGE에 의해 11 및 15KD의 분자량 및, 6.4 내지 8.7의 pI를 갖는 이종 쥐의 BCGF의 부분 정제 방법이 보고되어 있다. 문헌[Ohara 및 Paul, Nature, Vol. 315, 333-336페이지(1985)]에는 14KD 및 19 내지 20KD의 분자량 및 6.7의 pI를 갖는 쥐의 BSF-1에 특이성인 모노클로날 항체가 기술되어 있다. 문헌[참조 : Butler et al., J. Immunol., Vol. 133, 251-225페이지(1984)]에는 18-20KD의 분자량 및 6.3 내지 6.6의 pI를 갖는 사람 BCGF가 보고되어 있다. 문헌[참조 : Rubin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 82, 2935-2939페이지(1985)]에는 항-IgM항체에 노출시키기 전에 휴면 B-세포를 BSF-1과 예비배양하여 세포 용적을 증가시킨 후에 항-IgM항체에 노출시킴에 따라 S상에 도입하는 속도를 증가시킴에 대한 내용이 보고되어 있다.

문헌[참조 : Vitetta et al., J. Exp. Med., Vol. 162 1726-1731페이지(1985)]에서는 EL-4세포의 무혈청(serum-free)상등액의 역상 HPLC에 의해 쥐의 BSF-1을 부분 정제하는 방법이 기술되어 있다. SDS-PAGE으로 약 20 내지 22kD의 단백질이 나타난다. 문헌[참조 : Ohara et al., J. Immunol., Vol. 135, 2518-2523페이지(1985)]에는 또한 유사한 방법에 의해 쥐의 BSF-1을 부분 정제하는 방법이 보고되어 있으며, 인자가 약 18 내지 21.7KD의 단백질이라는 것도 보고되어 있다. 문헌[참조 : Sideras et al., Eur. J. Immunol., Vol. 15, 586-598페이지(1985)]에는 쥐의 IgG₁-유도인자, 즉, BSF-1을 부분정제하는 방법이 보고되어 있고, 인자가 7.2 내지 7.4 및 6.2 내지 6.4의 pI를 갖는 약 20KD의 단백질이라는 것도 보고되어 있으며 ; 문헌[참조 : Smith 및 Rennick, Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 83, 1857-1861페이지(1986)]에는 T세포 성장 인자 활성 및 마스트 세포 성장 인자 활성을 나타내는 IL-2 및 IL-3으로 부터 인자를 분리하는 방법이 보고되어 있다. 이후, 문헌[참조 : Noma et al., Nature, Vol. 319. 640-646페이지(1986)]에는 시러라스(sideras)등의 문헌에 기술되어 있는 인자를 코드화하는 헥산을 클로닝시키고 서열화하는 방법이 기술되어 있고, 문헌[참조 : Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 83, 2061-2065페이지(1986)]에는 스미스(smith) 및 레닉(Rennick)의 문헌에 기술되어 있는 인자를 코드화하는 핵산을 클로닝시키고 서열화하는 방법이 기술되어 있다. 더욱 최근에, 문헌[참조 : Grabstein et al., J. Exp. Med., Vol. 163, 1405-1414페이지(1986)]에는 쥐의 BSF-1을 정제하고 서열화하는 방법이 보고되어 있다.

문헌[참조 : Milanese et al., Science, Vol. 231, 1118-1122페이지(1986)]에는 잠정적으로 IL-4A로 표기한 BSF-1에 관련되지 않는 림포카인이 보고되어 있다. IL-4A는 T3-Ti 수용체의 가교결합 후에 헬퍼 T세포로 부터 분비되는 10 내지 12kD 단백질이다. 이것은 T11 수용체와의 상호작용 및 이어서 인터로이킨-2(IL-2)수용체의 유도를 통해 휴면중인 임파구를 자극시킨다.

문헌[참조 : Sanderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 83, 437-440페이지(1986)]에는 인터로이킨-4가 명백히 B세포 성장 인자 II와 동일하다는 증거를 기본으로 하여 이것이 호산구 분화 인자가 된다는 것이 제안되어 있다.

상기로 부터 신규의 림포카인의 발견 및 개발이 면역계 및/ 또는 조혈 세포를 직접적으로 또는 간접적으로 수반하는 광범위한 병리 상태에 대한 치료법에 발전시키는데 기여 할 수 있다는 것은 명백하다. 특히, 공지의 림포카인의 유리한 활성을 증진시키거나 증강시키는 림포카인의 발견 및 개발은 유리한다. 예를들어, 종양 치료시 IL-2의 용량-제한 독성은 증강 효과를 갖는 림포카인 또는 보조인자(cofactor)의 유효성에 의해 감소될 수 있으며; 골수 이식의 효력은 콜로니 자극인자의 활성을 증강시키는 인자의 유효성에 의해 증가될 수 있다.

본 발명은 포유동물의 인터로이킨-4(IL-4)에 관한 것이다. 본 발명에는 IL-4 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 코드화하는 핵산, 뿐만 아니라 폴리펩파이드 자체 및 이들을 제조하는 방법도 포함된다. 본 발명의 헥산은 (1) 본 명세서에 기술된 클로닝된 상보성 DNA(cDNA) 서열에 대한 이들의 동종성에 의해, 및 (2) 핵산에 의해 코드화되는 폴리펩타이드에 적용되는 IL-4 활성에 대한 작용성 시험에 의해 한정된다. 본 명세서에 사용하는, 단백질 또는 폴리펩파이드에 관한 "IL-4 활성"이란 용어는 단백질 또는 폴리펩타이드가 B-세포 성장인자(BCGF)활성 및 T-세포 성장인자(TCGF) 활성 둘다를 나타냄을 의미한다. 주어진 포유동물에 대해, IL-4활성은 종-특이성 TCGF 및 BCGF 검정에 의해 측정한다. 하기에 더욱 상세히 설명하는 바대로, IL-4의 특히 태양은 추가의 시험에 의해 더욱 특성화될 수 있다. 예를들어, 일부 형태의 쥐의 IL-4의 마스트 세포 성장인자(MCGF)활성을 나타내고 ; 일부 형태의 사람 및 쥐 둘다의 IL-4는 IL-2의 TCGF 활성을 증강시키며; 일부 형태의 쥐 및 사람 둘다의 IL-4는 특정 세포형에서 GM-CSF 자극된 증식을 증강시키고 ; 일부 형태의 사람 및 둘다의 IL-4는 B세포상에서 Fc-ε수용체 발현을 유도할 수 있으며; 일부 형태의 사람 및 쥐 둘다의 IL-4는 B 세포상에서 주요 조직적합성 컴플렉스(MHC) 항원[예를들면, 사람 B 세포상의 분류 II DR 항원, 및 하우스 B 세포상의 Ia 항원]의 발현을 유도할 수 있다.

본 발명은 IL-4 활성을 갖는 단백질을 발현시킬 수 있는 cDNA의 발견 및 클로닝을 기본으로 하고 있다. 본 발명의 cDNA 클론에는 플라스미드 벡터 "클로 46"(본 명세서에서는 pcD-2Fl-13 또는 pcD-46으로 명령)및 "콜론 125"(본 명세서에는 pcD-125로 명명)의 사람 cDNA 삽입물 : 및 플라스미드 벡터 pcD-2A-E3의 마우스 cDNA 삽입물이 포함된다. 3개의 벡터는 각각, 메릴랜드 록크빌 소재의 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션(American Type Culture Collection : ATCC)에는 ATCC 기탁번호 53337[한국 기탁번호 : KFCC 제10335호, 기탁기관 : 한국종균협회(KFCC), 기탁일 : 1987.3.17], 67029[한국기탁번호 : KFCC 제 10336호, 기탁기관, 한국종균협회, 기탁일 :1987.3.17.], 및 53330으로 기탁되었다.

본 발명에는 본 발명의 cDAN 클론에 사실상 동종이고 IL-4 활성을 발현시키는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산도 포함된다. 본 발명의 핵산 및 단백질은 성숙 핵산 서열에 대한 표준 기법에 의해 상기 언급한 cDNA로부터 유도될 수 있다. 이들은 IL-4를 코드화하는 메신저 RAN(mRAN) 서열을 함유하거나 함유하도록 유도할 수 있는 면역계 -유도 세포주(예 : T 세포 하이브리도마)로 부터 드 노보(de novo)적으로 제조할 수 있으며 ; 이들은 본 발명의 cDNA 클론으로부터 유도된 프로브를 사용하여 DNA 또는 RNA 추출물 또는 라이브러리를 탐침함으로써 수득될 수 있다.

본 명세서에 사용된 "효과적으로 동종성(effectively homologous)"이란 용어는 뉴클레오타이드 서열이 본 발명의 cDNA 클론으로부터 유도된 하이브리화 프로브에 의해 탐지될 수 있음을 의미한다. IL-4 활성을 코드화하는 핵산을 검출하는데 필요한 동종성의 정확한 수치상의 측정은 (1) 표적 핵산과 관련된 비-IL-4 코드화 서열에 대한 프로브의 동종성, (2) 하이브리화 조건의 엄중성, (3) 일본쇄 프로브를 사용하느냐 이본쇄 프로브를 사용하느냐, (4) RNA 프로브를 사용하느냐 DNA 프로브를 사용하느냐, (5) 프로브의 비특이성 결합을 감소시키는데 사용되는 방법, (6) 프로브를 검출하는데 사용되는 표지의 성질, (7)프로브에서 구아니딘 및 시토신 염기의 분획, (8)프로브와 표적물 사이에 잘못 짝지워진 것의 분포, (9)프로브의 크기 등을 포함한 여러가지 인자에 따라 달라진다.

본 발명의 cDNA로부터 유도된 효과적으로 동종성인 프로브는 분리될 서열에 적어도 50% 동종인 것이 바람직하다. 효과적으로 동종인 프로브는 분리될 서열에 적어도 75 내지 80% 동종인 것이 더욱 바람직하다. 효과적으로 동종성인 프로브가 분리될 서열에 적어도 90% 동종성인 것이 가장 바람직하다.

본 명세서에 사용되는 동종성이란 2개의 뉴클레오타이드(또는 아미노산) 서열 사이의 유사성의 척도이다. 동종성은 2개의 서열(대기 길이가 동일하지 않음)을 일렬로 정렬시킨 후에 짝지워지는 염기(또는 아미노산)의 분획 또는 백분율로 나타낸다. 본 명세서에 사용되는 일렬 정렬(alignment)이란 용어는 하기 문헌에 정의되어 있다[참조 : Sankoff 및 Kruskal, Time Warps, String Edits, and Macromolecules : The Theory and Practice of Sequence Comparison(Addiso-Wesley, Reading, MA, Chapter 1, 1983)]. 대체로, 2개의 서열은 최대로 중복시키기 위해 어느 하나의 서열에 최소수의 "무(blank)" 또는 "공(null)"염기를 삽입하여 2개의 서열 사이에 짝지워지는 염기(또는 아미노산)의 수를 최대화하도록 정렬시킨다. 주어진 2개의 서열은 이들의 동종성을 계산하기 위해 연산이 가능하다[참조 : Needleham 및 Wunsch, J. Mol. Biol., Vol. 48, 443-453페이지(1970) ; 및 Sankoff 및 Kruskal(상기 참조), 23-29페이지]. 또한, 이러한 비교를 수행하기 위한 상업적인 서어비스도 이용가능하다[예를 들면, Intellingenetics, Inc. (Palo Alto, CA)].

본 발명은 또한 면역반응에 필요한 다수의 세포에 대한 광범위한 활성 스펙트럼을 나타내는 천연의 포유동물 성장인자(폴리펩타이드)에 관한 것이다. 이들 인자의 제조방법 및 포유동물의 생체내 처리시 이들의 용도도 제공한다. 이러한 폴리펩타이드 조성에는 B-세포, T-세포 및 마스트 세포 자극 활성을 나타낼 수 있는 실질적으로 순수한 형태의 포유동물 인자를 포함한다.

원래 여러가지 T세포의 상등액으로부터 분리된 이들 인자에는 비-환원 조건하에서 약 20kd 또는 15kd의 분자량을 갖는 천연의 폴리펩타이드 또는 이러한 폴리펩타이드의 활성 단편도 포함된다. 이들 인자는 특이적 항체의 제조를 포함한 여러가지 진단 및 치료 목적을 위해 단독으로 또는 다른 화합물과 함께 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 태양은 하기 일반식으로 한정되는, 글리코실화되거나 비글리코실화된 사람 IL-4단백질 및 뮤테인의 세트이다.

X(H i s)-X(L y s)-X(C y s)-X(A s p)- X(I l e)- X(T h r)-

X(L e u)-X(G l n)- X(G l u )-X(I l e)-X(I l e)-X(L y s)-

X(T h r)-X(L e u)-X(A s n)-X(S e r)-X(L e u)-X(T h r)-

X(G l u)-X(G l n)-X((L y s)-X((T h r)-X((L e u)-X(C y s)-

X(T h r)-X(G l u)-X(L e u)-X(T h r)-X(V a l)-X(T h r)-

X(A s p)-X(I l e)-X(P h e)-X(A l a)-X(A l a)- X(S e r)-

X(L y s)-X(A s n)-X(T h r)-X(T h r)-X(G l u)-X(L y s)-

X(G l u)-X(T h r)-X(P h e)-X(C y s)-X(A r g)-X(A l a)-

X((A l a)-X(T h r)-X(V a l)-X(L e u)-X(A r g)-X(G l n)-

X(P h e)-X(T y r)-X(S e r)-X(H i s)-X(H i s)-X(G l u)-

X(L y s)-X(A s p)-X(T h r)-X(A r g)-X(C y s)-X(L e u)-

X((G l y)-X(A l a)-X(T h r)-X((A l a)-X(G l n)-X(G l n)-

X(P h e)-X(H i s)-X(A r g)-X(H i s)-X(L y s)-X(G l n)-

X(L e u)-X(I l e)-X(A r g)-X(P h e)-X(L e u)-X(L y s)-

X(A r g)-X(L e u)-X(A s p)-X(A r g)-X(A s n)-X(L e u)-

X(T r p)-X(G l y)-X(L e u)-X(A l a)-X(G l y)-X(L e u)-

X(A s n)-X(S e r)-X(C y s)-X(P r o)-X(V a l)-X(L y s)-

X(G l u)-X(A l a)-X(A s n)-X(G l n)-X(S e r)-X(T h r)-

X(L e u)-X(G l u)-X(A s n)-X(P h e)-X(L e u)-X(G l u)-

X(A r g)-X(L e u)-X(L y s)-X(T h r)-X(L e u)-X(M e t)-

X(A r g)-X(G l u)-X(L y s)-X(T y r)-X(S e r)-X(L y s)-

X(C y s)-X(S e r)-X(S e r)

[서열식 I]

상기식에서, X(Xaa)란 용어는 아미노산 Xaa와 유사한 아미노산의 그룹을 나타낸다. 그룹내에서 유사한 아미노산들은 그룹의 성분들 사이의 치환에도 분자의 생물학적 작용을 유지시키기에 충분한 유사한 물리학적 특성을 갖는다[참조 : Grantham, Science, Vol .185, 862-864페이지 (1974)]. 아미노산의 삽입 및 결실이, 특히 삽입 또는 결실에 단지 몇개의 아미노산, 예를들어 10개 이하의 아미노산이 관련 되고 작용성 구조에 중요한 아미노산(예 :시스테인 잔기)을 제거하거나 대체하지 않을 경우, 상기 정의한 서열내에서 생물학적 작용을 변화시킴없이, 가능할 수 있다[참조 : Anfinsen, "Principles That Govern The Folding of Protein Chains", Science, Vol .181, 223-230페이지 (1973)]. 이러한 결손 및/ 또는 삽입에 의해 제조된 단백질 및 뮤테인은 본 발명의 범위내에 있다. 서열식(I)의 단백질이 아미노산 잔기를 숫자로 언급하는 경우마다, 이러한 숫자 또는 숫자들을 단백질의 N-말단에 관한 것이다.

유사한 아미노산 그룹들은 표 I에 정의한 그룹이 바람직하다. 유사한 아미노산 그룹들이 표 I의 각 라인에서 두번째 슬래쉬 (/)전에 기재된 그룹인 경우 더욱 바람직하며 ; 유사한 아미노산 그룹들이 표 I의 각 라인에서 첫번째 슬래쉬 전에 기재된 그룹인 경우 더욱 바람직하다.

[표 I] 유사한 아미노산들의 바람직한 그룹

본 발명에는 단일 위치 또는 다수 위치에서 아미노산 치환(천연의 사람 IL-4의 아미노산과 유사한 아미노산 사이)을 갖는 서열식(I)의 폴리펩타이드를 포함한다. "N-회 치환된(N-fold substituted)"이란 용어는 적어도 N 위치에서 천연의 아미노산이 유사한 아미노산에 의해 치환된 서열식(I)로 정의되는 폴리펩타이드의 서브세트(subset)를 기술하는데 사용된다. 그러므로, 예를들어, 서열식(I)의 1-회 치환된 폴리펩타이드의 그룹은 유사한 아미노산의 바람직한 그룹에 대해 559개의 폴리펩타이드, 유사한 아미노산과의 더욱 바람직한 그룹에 대해 189개의 폴립펩타이드 및 유사한 아미노산의 가장 바람직한 그룹에 대해 56개의 폴리펩타이드로 이루어진다. 이들 숫자는 천연의 쇄에서 각 종류의 아미노산의 숫자를 이 아미노산에 대해 유사한 아미노산 그룹의 크기와 곱하여 계산하면 나온다. 사람 IL-4 폴립펩타이드의 그룹은, 특히 서열이 도면의 제 1c 도에 도시한 천연의 사람 IL-4 폴리펩타이드를 포함하는, 서열식(I)의 10-회 치환된 폴리펩타이드로 이루어지는 경우 바람직하며 ; 서열식(I)의 3-회 치환된 폴리펩타이드로 이루어지는 경우 더욱 바람직하며; 서열식(I)의 3-회 치환된 폴리펩타이드로 이루어지는 경우 더욱 바람직하며, 서열식(I)의 1-회 치환된 폴리펩타이드로 이루어지는 경우 가장 바람직하다.

마찬가지로, 서열식(I)의 폴리펩타이드에 관한 "N-회 삽입된(N-fold inserted)"이란 용어는 서열식(I)로 정의된 서열에 1 내지 N개의 아미노산이 삽입된 폴리펩타이드의 세트를 설명하는데 사용된다. 삽입된 아미노산이 삽입 위치에 플랭킹(flanking)된 아미노산의 유사한 아미노산의 바람직한 그룹(표 I)중에서 선택되는 경우 바람직하며 ; 이들이 삽입 위치에 플랭킹된 아미노산의 유사한 아미노산의 더욱 바람직한 그룹(표 I)중에서 선택되는 경우 더욱 바람직하며 ; 이들이 삽입위치에 플랭킹된 아미노산의 유사한 아미노산의 가장 바람직한 그룹(표 I)중에서 선택되는 경우 가장 바람직하다. 그러므로, 예를들어, 1-회 삽입된 펩타이드의 그룹의 하나의 서브그룹은 N-말단 x(His)와 인접한 x(GlY)사이에 삽입된 아미노산으로 이루어진다. 이러한 서브그룹의 성분들을 정의하는 삽입이 Pro, Ala, Gly, Thr, Ser,Gln, Glu, Arg, His 및 Lys로 이루어진 그룹중에서 선택되는 경우 바람직하며 ; 이들이 Gly, His, Gln 및 Arg 로 이루어진 그룹중에서 선택되는 경우 가장 바람직하며 ; 이들이 His 및 Gly로 이루어진 그룹중에서 선택되는 경우 가장 바람직하다. 삽입은 서열식(I)의 인접한 아미노산들 사이에서 가능하다. 가능한 삽입 위치가 128개이고, 동일한 위치에서 다중삽입도 가능하므로, 서열식(I)의 2-회 삽입된 펩타이드는 펩타이드의 서브그룹이 16,384개가 되며, 각 서브그룹의 크기는 삽입 위치에 플랭킹된 아미노산의 유사한 아미노산 그룹의 크기에 따라 달라진다.

서열식(I)의 폴리펩타이드에 관한 "N-회 결실된(N-fold deleted)"이란 용어는 서열식(I)로 정의되는 서열식로부터 결실된 1 내지 N개의 아미노산을 갖는 폴리펩타이드의 세트를 설명하는데 사용된다. 즉, 서열식(I)의 1-회 결손된 폴리펩타이드의 세트는 각각 길이가 128개의 아미노산인 폴리펩타이드(128-mer)의 129개의 서브그룹으로 이루어진다. 다시 서브그룹 각각은 유사한 아미노산의 바람직한, 더욱 바람직한 및 가장 바람직한 그룹들에 의해 정의되는 128-mer로 이루어진다.

본 발명의 상기의 바람직한 태양은 유사한 아민노산의 바람직한, 더욱 바람직한, 및 가장 바람직한 그룹들에 대해 서열식(I)의 폴리펩타이드에 효과적으로 동종이거나 서열식(I)의 폴리펩타이드를 코드화 할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 상기 뉴클레오타이드 서열은 유사한 아미노산의 바람직한, 더욱 바람직한, 및 가장 바람직한 그룹들에 대해 서열식(I)의 폴리펩타이드를 코드화할 수 있는 경우 더욱 바람직하다.

특히, 본 발명에는 천연의 사람 IL-4, 제 1c 도에 도시한 아미노산 서열, 및 이 아미노산 서열을 코드화 할 수 있는 모든 뉴클레오타이드 서열이 포함된다.

본 명세서에서는, 아미노산, 뉴클레오타이드, 제한 엔도뉴클레아제 등을 표기하는데 표준 약어를 사용한다[참조 : Cohn, "Nomenclature and Symbolism of α-Amino Acids, "Methods in Enzymology, vol. 106, 3-17페이지(1984) ; Wood et al., Biochemistry : A Problems Approach, 2nd ed.(Benjamin, Menlo Park, 1981) : a및 Roberts, "Directory of Restrction Endonucleases", Methods in Enzymology, Vol. 68, 27-40페이지(1979)].

본 발명은 의학적 및/또는 수의학적 장애를 치료하기 위해 면역조절제를 적용하는 것에 관련된 문제에도 관한 것이다. 특히, 본 발명은 단독으로 사용되는 경우 유리한 효과를 갖거나 다른 림포카인 및 면역-계중개물과 함께 작용하여 유리한 효과를 낼 수 있는 화합물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 태양을 지금부터, 부분적으로 첨부된 도면(제 1 도 내지 19 도)함께 설명한다.

제 1a 도는 쥐의 IL-4를 발현시키는 벡터 pcD-2A-E3 삽입물의 뉴클레오타이드 서열 및 추정의 아미노산 서열을 도시한 것이다.

제 1b 도는 사람의 IL-4를 발현시키는 벡터 pcD-125 삽입물의 뉴클레오타이드 서열 및 추정의 아미노산 서열을 도시한 것이다.

제 1c 도는 pcD-125를 사용하여 형질감염시킨 COS7원숭이 세포에 의해 발현되고 분리되는, 정제된 천연의 사람 IL-4의 아미노산 서열을 도시한 것이다.

제 2a 도는 쥐의 IL-4의 코드화하는 삽입물을 갖는 벡터 pcD-2A-E3의 지도이다.

제 2b 도는 벡터 pcD-2A-E3 삽입물의 제한 엔도뉴클레아제 절단 지도이다.

제 2c 도는 사람의 IL-4를 코드화하는 삽입물을 갖는 pcD-46의 지도이다.

제 2d 도는 벡터 pcD-46 삽입물의 제한 엔도뉴클레아제 절단 지도이다.

제 3a 도는 pcD-2A-E3-형질감염된 COS 7 세포로 부터의 배양 상등액(곡선 1)을 포함한 여러가지 배양 상등액의 상대적인 TCGF활성(희석 범위에 걸쳐)을 도시한 것이다.

제 3b 도는 pcD-2A-E3-형질감염된 COS 7 세포로 부터의 배양 상등액(곡선 1)을 포함한 여러가지 배양 상등액의 상대적인 MCGF 활성(희석 범위에 걸쳐)을 도시한 것이다.

제 3c 도는 pcD-2A-E3-형질감염된 COS 7 세포(곡선 1), Cl. Lyl⁺2^-/9(곡선 2), 및 모의 형질감염된 COS7 세포(곡선 3)부터의 상등액 지정량에 의해 생성된 생대적인 Ia 유도 정도를 도시한 것이다.

제 3d 도는 pcD-2A-E3-형질감염된 COS 7 세포로 및 T세포-결핍된 마우스 비장 세포에서의 여러가지 대조군으로부터의 상등액에 의해 유도된 IgE 및 IgG₁의 범위를 그라프적으로 도시한 것이다.

제 4a 도는 인자-의존적 사람 헬퍼 T세포 주인 JL-EBV 상에서 비색 증식 검정에 의해 측정한 여러가지 pcD-125 형질감염 상등액 및 대조군의 TCGF 활성을 도시한 것이다.

제 4b 도는 PHA-자극된 말초 혈 임파구 상에서 비색 증식 검정에 의해 측정한 pcD-125 형질 감염 상등액 및 대조군의 TCGF 활성을 도시한 것이다.

제 4c 도는 PHA-자극된 말초 혈 임파구 상에서 삼중수소 처리된 티미딘 삽입에 의해 측정한 pCD-125 형질감염 상등액 및 대조군의 TCGF 활성을 도시한 것이다.

제 5a 도는 Fc-ε 수용체가 형광적으로 표지된, 자극된 사람 편도선 B세포의 대조 집단에 대한 세포 빈도수 : 형광 강도의 그라프이다.

제 5b 도는 Fc-ε 수용체가 형광적으로 표지되었으며, pcD-125-형질감염된 COS 7 세포 부터의 0.1% 상등액으로 이루어진 배지에 노출된, 자극된 사람 편도선 B세포의 집단에 대한 세포 빈도수 : 형광 강도의 그라프이다.

제 5c 도는 Fc-ε 수용체가 형광적으로 표지되었으며, pcD-125-형질감염된 COS 7 세포로부터의 1% 상등액으로 이루어진 배지에 노출된, 자극된 사람 편도선 B세포의 집단에 대한 세포 빈도수 : 형광 강도의 그라프이다.

제 5d 도는 Fc-ε 수용체가 형광적으로 표지되었으며, pcD-125-형질감염된 COS 7 세포로부터의 10% 상등액으로 이루어진 배지에 노출된, 자극된 사람 편도선 B세포의 집단에 대한 세포 빈도수 : 형광 강도의 그라프이다.

제 6a 도는 이. 콜라이에서 천연 또는 돌연변이체 IL-4를 발현시키는데 유용한 합성의 사람 IL-4 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 도시한 것이다.

제 6b 도는 플라스미드 pUC 18에 삽입된 합성의 사람 IL-4 유전자의 제한 엔도뉴클레아제 절단 지도이다.

제 7a 내지 7f 도는 각각 합성된 사람 IL-4 유전자를 작제하는데 사용된 이본쇄 DNA 단편 1A/B 내지 6A/B를 도시한 것이다.

제 8 도는 이. 콜라이 발현 벡터 TAC-RBS에서 개시 ATG 코돈에 인접한 뉴클레오타이드 서열을 도시한 것이다. 이 서열은 EcoRI 제한부위에서 시작하여 Hind III 부위로 끝난다. 16S 리보좀 RNA의 3' 말단에 상보성을 나타내는 리보좀 결합서열(RBS)에는 밑줄을 그었으며, ATG 개시 코돈에는 밑줄을 그었다.

제 9 도는 임파구 결필성 증후근 환자로부터 유도된 세포집단에 대한 세포 빈도수 : 형광 강도를 도시한 것이다. 세포는 형광적으로 표지된 항-DR 모노클로닐 항체를 사용하여 염색한다.

제 10 도는 C-4 컬럼상에서 역상 HPLC로 수행한, 최종의 사람 IL-4정제 단계에서의 215mm 흡수 프로필을 도시한 것이다.

제 11 도는 사람의 IL-4 cDNA를 함유하는 플라스미드 pEBV-178의 작제 지도이다.

제 12 도는 플라스미드 TRPC 11의 작제 지도이다.

제 13a 도는 플라스미드 pMF-α 8의 작제 지도이다.

제 13b 도는 천연한 사람 IL-4 및 이의 여러가지 뮤테인을 발현시키는 효모 배양물부터의 여러가지 형질감염 상등액의 TCGF 활성을 도시한 것이다.

제 14 도는 인자-의존 세포주 MC/9 마스트 세포(1A), DX-2 마스트 세포(1B), NFS-60 세포(1C) 및 HT2 T 세포(1D)의 성장 곡선을 도시한 것이다. 5×10³세포를 Cl. 1 상등액(●), IL-2^R(■), IL-3^R(○), GM-CSF^R(Δ), IFN-γ^R(▲) 또는 P388D1 상등액(◇)의 농드를 변화시키면서 배양한다. MC/9 세포(1A)은 또한 정제된 IL-3(●), 또는 IL-2^R(■), GM-CSF^R(●), IFN-γ^R(▲) 또는 P388D1 상등액(◇)200단위와 혼합된 IL-3^R의 농도를 변화시키면서 배양한다. 성장 인자 활성은 24시간 후에 비색 시험으로 측정한다. 570nm(참조용 630nm)에서의 흡광도를 Dynatek Micro Elisa 판독기 상에서 측정한다.

제 15 도는 Cl. 1 상등액의 FPLC양이온 교환 크로마토그라피의 결과를 도시한 것이다. 농축된 상등액 7㎖(단백질 35mg)을 50nM Na 포스페이트, 1mm EDTA, pH 7.0(7.8ms/cm)중에 투석시킨 후, 동일한 완충액(완충액 A)을 사용하여 평형화시킨 Pharmacia Mono S컬럼(0.5×5cm)에 적용한다. 완충액 B=A+1M NaCl. 용출조건 : 0.5㎖/분 유속 ; 0.5㎖/분획 ; 40분 동안 0-40% B, 10분동안 40-100% B.

각 분획의 분취량을 NFS-60(IL-3, ●), HT 2(TCGF, ○)및 MC/9(MCGF) 세포상에서 증식 활성에 대해 시험한다. MC/9 반응은 나타나지 않았으며 : 화살표가 나타내는 위치는 MC/9의 증식강도가 Cl. 1상등액의 증식 정도에 도달하는 것을 나타낸다.

제 16a 도는 IL-3 결핍된 Cl. 1 상등액의 역상 C8 크로마토그라피의 결과를 도시한 것이다. 0.1% TFA중의 100μl의 3×mono-S 통과된 상등액(분획 59 내지 61, 제 15 도)을 Pharmacia C8 역상 컬럼(0.5×2cm)상에 적재한다. 완충액 A=물중의 0.1% TFA,완충액 B=아세노티트릴중의 0.1% TFA. 용출조건 : 0.5㎖/분, 0.5㎖/분획, 4분 동안 0-25% B, 50분 동안 25-60% B, 4분 동안 40-100% B. 각 분획의 분취량을 NFS-60(IL-3, ●), HT 2(TCGF, ○) 및 MC/9(MCGF, ▲) 세포상에서 증석 활성에 대해 시험한다. 화살표는 피크 TCGF활성을 함유하며, 각 분획에 포화시킬 정도의 IL-3^R을 가한 후에 Cl. 1 상등액의 증식 정도와 유사한 MC/9증식 정도를 생산하는 분획을 나타낸다.

제 16b 도는 GK 15-1 쥐의 T세포 상등액의 역상 C8 크로마토그라피의 결과를 도시한 것이다. 0.1% TFA 중의 농축된 GK15-1 상등액 2mg(0.5㎖)을 Pharmacia C8 역상 컬럼에 적용하여 상기 기술한 바와 같이 용출시킨다. 각 분획의 분취량을 HT2 세포(○)상에서 TCGF 활성에 대해 시험한다. 화살표는 동일한 조건하에서 쥐의 IL-2^R이 용출된 위치를 나타낸다. 삽입 : 동일한 평판 배지상에서 직접 비교하기 위해 Cl.1(●) 및 IL-2^R(□) 및 GK 15-1 상등액(○)TCGF 활성의 역가측정.

제 17 도는 역상 컬럼으로부터 부분 정제된 인자(RP 인자)의 MCGF 및 TCGF 활성을 도시한 것이다. 증식은 24시간동안 배양한 후에[³H]-티미딘의 삽입에 의해 측정한다. MC/9마스트 세포 및 HT2 T 세포는 Cl. 1상등액(●), IL-3^R(○), IL-2^R(Δ), RP인자(□)의 농도를 변화시켜면서, 200단위의 IL-3^R(■)존재하에 RP인자의 희석도를 변화시키거나 또는 포화정도의 RP인자(▲)존재항 IL-2의 희석도를 변화시키면서 배양한다.

제 18 도는 Cl. 1 상등액의 크로마토포커싱의 결과를 도시한 것이다. 25nM비스-트리스, pH 7.1중의 상등액 1.5㎖(35.mg)를 Pharmacia Mono P 컬럼(0.5×20cm)상에 적재하고 폴리 완충액 74(1 : 10), pH 4.0, 유속 0.1㎖/분, 1㎖/분획을 사용하여 용출시킨다. 각 분획의 분취량을 NFS-60(IL-3, ○), HT-2(TCGF, ●) 및 MC/9(MCGF, 피크 MCGF 활성을 화살표로 나타낸 것을 제외하고는 나타내지 않음)상에성의 증식에 의해 검정한다. TCGF-피크(분획 12, pI=6.2)는 최소 IL-3활성과 일치하며 ; MCGF증식 정도는 화살표에 가장 높다.

제 19 도는 Cl.1 상등액 및 부분 정제된 MCGF/TCGF의 SDS PAGE의 결과를 도시한 것이다.

A)분획화되지 않은 상등액의 비-환원 SDS-PAG. 50mM DTT(60°×5분)를 사용하여 환원시키기 전에는 TCGF 피크가 약간 높은 분자량(21Kd 및 16Kd)으로 이동하고, 활성에서의 극적인 감소가 수반된다.

B) 양이온 교환 크로마토그라프로부터의 피크 MCGF/TCGF분획(분획 59 내지 61, 제 15 도)의 비-환원 SDS PAGE, 50mM DTT(60°에서 5분 동안)를 사용하여 감소시키기 전에는 MCGF및 TCGF피크가 약간 높은 분자량(21Kd 및 16Kd)으로 이동하고, 활성에서의 극적인 감소가 수반된다. 화살표는 포화량의 IL-3을 가하여 MCGF활성을 상등액 수준으로 증가시킬 수 있는 분획을 나타내다(즉 IL-3(○), TCGF(●), MCGF(Δ).

본 발명에는 IL-4 활성을 가지며, 본 명세서에 기술한 IL-4 폴리펩타이드로부터 표준 단백질 공학기술을 사용하여 유도할 수 있는, 글리코실화되거나 비글리코실화된 포유동물 폴리펩타이드가 포함된다. 본 발명에서는 또한 본 발명의 폴리펩타이드를 코드화할 수 있는 서열을 갖는 핵산, 및 서열이 본 발명의 cDNA클론에 효과적으로 동종인 핵산도 포함된다. 최종적으로, 본 발명에서는 본 명세서에 기술한 뉴클레오타이드 서열을 이용하는, 본 발명의 글리코실화되거나 비글리코실화된 폴리펩타이드를 제조하는 방법 및 본 발명의 폴리펩타이드를 이용하는 방법도 포함된다.

본 발명의 폴리펩타이드 및 핵산을 제조하고, 사용하고 동정하는 기술은 일반적인 용어로 하기에 상세히 기술한다. 이후, 일반적인 기술을 특정의 세포형, 벡터, 시약등을 사용하여 적용한 몇개의 특정 실시예가 제공된다. 천연 공급원으로부터 이들은 분리하는 방법을 먼저 하기에 간단히 기술한다.

이들 폴리펩타이드를 쉽게 이용가능한 세포 공급원의 상등액으로부터 정제하면 균질성을 나타내며, 따라서 여러가지 치료 목적 및 다른 용도를 가능하게 하는, 순수한 형태로 경제적으로 제조할 수 있다.

이들 폴리펩타이드는 B-세포, T-세포 및 마스트-세포-자극 활성을 갖는 폴리펩타이드를 함유하는 것으로 특징화된다. 한 종의 천연 형태에서, 폴리펩타이드는 SDS PAGE 상에서 비-환원 조건하에서 약 20kd 및 15kd의 분자량을 가지며 환원 조건하에서 21kd 및 16kd의 분자량을 갖는다. 목적하는 폴리펩타이드를 실질적으로 순수한 형태로 함유하는 조성물은 크로마토포커싱에 의해 6.2의 등전점(pI)을 갖는다. 성장 인자는 극도로 낮은 농도(예를들면, ㎖당 lng이하)에서 상당한 활성을 갖는, 극도로 효능있는 제제이다. 폴리펩타이드는 호르몬 및 역상 컬럼으로부터 양이온 교환 크로마토그라피 도는 단일 용출조건을 통해 T세포에 의해 자연적으로 생성된 다른 단백질(예 : IL-2, IL-3, GM-CSF 및 IFN-r)과 구별될 수 있다.

쥐 중에서, 본 발명의 일부 폴리펩타이드는 특정의 세포(예 : IL-3-의존 마스트 세포주)의 증식을 낮은 정도로만 지지하지만, 제 2 의 인자(예 : IL-3) 존재하에서 이러한 세포(예 : 마스트 세포)의 성장을 상조적으로 향상시킨다. 폴리펩타이드는 몇개의 T-세포주의 증식을 자극할 수 있지만, 일반적으로 정제된 IL-2보다는 범위가 낮다. 또한, 이러한 폴리펩타이드는 휴면중인 B-세포상에서 Ia 발현을 유도할 수 있으며, BSF-1과 유사한 B-세포에 의한 IgG₁및 IgE 분비를 향상시킬 수 있다. 이들 활성은 다수의 생화학적 분획화로도 분리할 수 없다. 그러나, 대부분의 활성은, 예를들어 SDS 존재하에, 환원시킨 후 파괴된다.

이들 인자는 여러가지 방식으로 다수의 천연의 공급원으로부터 수득할 수 있다. 하나의 적절한 공급원은 목적하는 폴리펩타이드를 생성하는 다수의 T-세포주중 하나이다. 이러한 T-세포주중 하나는 C57GL6 마우스[참조 : Nable, G, et al.,Proc. Natl, Acad. Sic. U. S. A., 78 : 1157-11611(1981)]로 부터 유도되며, 이 주는 변형된 보충 DME[참조 : Nable, G. et al., Cell, 23 : 19-28(1982)]에서 유지시킬 수도 있다. 이 세포주(원래는 Cl. Ly1⁺2^-/9로 표기)은 아메리칸 타입 컬취 콜렉션에 기탁번호 CRL 8179로 기탁되었다. 이들 폴리펩타이드의 다른 적절한 세포 공급원에는 폴리펩타이드에 기인한 여러가지 항체를 분비하는 거의 모든 세포(예 : 사람의 말초혈 임파구)뿐만 아니라 공지된 T-세포 공급원 모드(예 : 편도선, 비장 등)가 포함된다.

이러한 세포 공급원으로부터의 상등액 또는, 일부의 경우, 파괴된 세포로부터의 액을 여러가지 공지의 정제방법으로 정제하여 본 발명의 단백질을 분리시킨다. 바람직하게는, 정제 기술을 고순도 정도로 확보하기 위해서도 조합하여 이용한다. 전형적으로, 정제는 겔 여과 크로마토그라피 SP 양이온 교환 크로마토그라피, 역상 크로마토그라피, 그룹-특이적 크로마토그라피(예를들면, Heparin Sepharose상에서), 또는 효과적인 단백질 분획화를 제공하는 다른 통상적인 분리방법을 이용한다. 고압 액체 크로마토그라피(HPLC), 등전점 포커싱, 및 SDS 폴리아크릴아미드겔 전기영동도 이용될 수 있다.

예를들어, 적절한 세포중으로부터의 상등액을 먼저 강양이온 교환 크로마토그라피에 의해 분획화할 수 있다. 통상적으로, 본 발명의 폴리펩타이드가 컬럼에 결합되어 남아 있는 반면, 적재된 단백질의 약 98%는 통과한다. 잔류하는 결합 단백질은 염 구배를 사용하여 용출시킬 수 있다. 본 발명의 한 태양에서, 염화나트륨 구배는 목적하는 폴리펩타이드를 약 0.19M에서 방출시킨다. 이 분획화는 약 95% 이상의 순도를 제공하도록 2회 이상 반복한다(주로 잔류의 IL-3을 제거). 그런 후, 물질을 Heparin-Sepharose 및 역상(C 4 또는 C 18)크로마토그라피에 의해 계속해서 분획화한다. 역상 크로마토그라피의 경우, 이들 폴리펩타이드는 42% 아세토니트릴에서 용출시킨다. 이들 푸울링된 분획은 극도로 높은 순도로, 거의 균질하게 (은-염색된 SDS-PAGE상의 약 20kd에서 단일 밴드)목적하는 폴리펩타이드를 함유한다. 이 정제된 물질은 이 물질이 천연의 형태로 존재하는 경우보다 적어도 65,000배 이상 순수하다.

이들 폴리펩타이드는 항체 제조시 항원으로 사용될 수 있으며, 항-인자상 항체 제조시 항원으로 사용될 수 있다. 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체는 통상의 방식으로 제조할 수 있다. 이들 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 일반적으로 적어도 약 15개의 아미노산을 갖는 단편은 이들 자체로 사용될 수 있지만, 면역계를 활성화시켜 주는 보조제 또는 항원에 결합되거나 연결된 경우가 바람직하다. 여러가지 항원, 예를들어 혈청 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌(Keyhole limpet hemocyanin), 글로불린 등이 사용될 수 있다. 보조제를 폴리펩타이드(예 : 글루타르알데하이드, 말레이미도벤조산, 디아조벤조산 등)에 연결시키는 데에는 광범위한 기술이 이용된다. 보조제에는 프로인트 보조제(Freund' s adjuvant), 수산화알루미늄 등이 포함된다. 항원은 적절한 숙주에 통상적인 양으로 주입하며, 1회 이상의 보조주사(booster injection)는 2 내지 4주간격으로 수행할 수 있다. 모노클로날 항체가 사용되는 경우, 일반적으로 마우스에 최초의 주사 및 보조주사로 주입하여 비장을 분리한 다음, 비장세포를 통상의 기술[참조 : Galfre et al., Nature (1977) 266 : 550 : Kennett et al., Current Topics in Microbiology and Immunology(1978) 81 : 77 ; 및 미합중국 특허 제4,381,292호 및 제4,363,799호]에 따라 적절한 융합 파트너와 융합시킨다. 그러나, 특정의 목적을 위해, 사람의 Fc 쇄를 갖는 항체를 제조하기 위해 다른 포유동물, 예를들어 영장류(예 : 사람)를 사용할 수 있다.

폴리펩타이드는 폴리펩타이드 진단시 이들 자체로 사용될 수도 있으며 항체와 함께 사용될 수도 있다. 진단시험에 사용하기 위해 이들 둘다 또는 하나를 표지하거나 표지하지 않을 수 있다. 다수의 진단 검정이 문헌에 기술되어 있으며, 직접적으로 또는 간접적으로, 이들, 폴리펩타이드 또는 항체가 다수의 표지[예 ; 효소, 방사성핵종, 형광체, 기질, 보조효소, 입자(예자기 입자)등]에 결합하는 것도 포함한다. 이들 검정의 대표적인 예는 하기 문헌들에 기술되어 있다[참조 : 미합중국 특허 제 3,817,837호 ; 제3,850,752호; 제4,174,384호 ; 제4,177,437호 및 제4,374,925호].

여러가지 검정은 임의로 동종 면역시험과 이종 면역시험으로 나누는데, 구별은 폴리펩타이드와 이의 항체사이의 컴플렉스가 특이성 결합 쌍의 컴플렉스와 되지 않은 성분으로부터 분리될 수 있는지를 기준으로 하고 있다. 여러가지 검정이 EI, ELISA, RIA, 동종 EIA, 반점-블롯, 웨스턴 등으로 언급된다.

이들 폴리펩타이드에 대한 항체는 이들 자체로서 항원으로서 사용되어 항-인자형을 생성하는데, 이 항-인자형은 이들 폴리펩타이드의 에피토프(epitope)부위에 경쟁적인 에피토프 부위를 갖는 경쟁력 항원으로서 작용할 수 있다. 그러므로, 이들 항-인자형은 종양 억제제로서, 목적하는 폴리펩타이드에 대한 치환체로서 또는 목적하는 폴리펩타이드에 대한 길항제로서 작용할 수 있다.

이들 폴리펩타이드는 천연 공급원으로부터 유도될 수 있는 천연적으로 존재하는 폴리펩타이드, 뿐만 아니라 생리적 특성(예 : 결합 특이성 및 B-세포 또는 마스트 세포 자극 활성)을 부여하는 자연적으로는 존재하지 않는 폴리펩타이드의 부류를 형성한다. 종(species) 또는 기원(origin)사이의 최소 차이는 본 분양의 숙련가에게 공지된 바와 같은 정제 조서에서 변형을 필요로 할 수 있다. 또한 이들 폴리펩타이드를 서열분석한 다음 단편을 공지된 기술에 따라 합성할 있다[참조 : Barany 및 Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis, "The Peptides, Analysis Synthesis Biology" , Special Methods in Peptide Synthesis, Part A, Vol. 2, Gross and Merenhofer, eds., Academic Press, N. Y. 1980. 1-284페이지].

본 발명의 폴리펩타이드 조성물은 여러가지 방식으로 유용성을 발견할 수 있다. 예를들어, 이들 폴리펩타이드는 배양물 또는 생체내에서, T-세포 및 마스트 세포의 성장을 유도할 수 있다. 상기에서 지적한 바대로 마스트 세포는 헤파린, 히스타민, 프로스타글란딘, 및 다른 생리학적으로 중요한 물질의 중요한 공급원이다. 유사하게, 성장 인자는 B-및 T- 세포, 특히 면역계에 유용한 단백질(예 : 림포카인 및 면역글로불린)을 분비한다고 알려진 세포를 자극시키는데 사용될 수 있다. 전형적으로, 인자는 세포 배양물에 가하는 배양 배지에 혼입시킬 수 있다. 인자의 적절한 농도는 세포주의 형태에 따라 달라지지만, 일반적으로 배양물에서 약 0.1μg/㎖ 내지 약 1mg/㎖, 더욱 바람직하게는 약 1μg/㎖ 내지 10μg/㎖로 존재한다. 본 발명의 성장 인자의 사용으로 목적하는 세포주를 유지시키기 위해 공급(feeder) 세포를 사용하여야 하는 필요성이 배제되므로, 그 결과 세포주로부터의 생성물의 순도가 실질적으로 향상된다.

본 발명의 폴리펩타이드 조성물은 또한 생체내에서 여러가지 면역 결핍증을 치료하거나 자연적인 면역반응을 향상시키는 데어도 사용된다. 예를들어, 이러한 폴리펩타이드 조성물은 B-세포, T-세포 및 마스트 세포의 성숙 및/또는 성장을 자극시킴으로서 감염을 치료하거나 예방하며, 이로인해 감염에 대한 동물의 감수성을 감소시키는 것을 도울수 있다.

[I. IL-4 cDNA의 드 노보(De Novo)의 제조]

여러가지 방법이 현재 cDNA이 드 노보 제조 및 콜로닝에 및 cDNA 라이브러리의 작제에 이용될 수 있다[참조 : Doherty의 최근의 보고서, "Cloning and Expression of cDNA". Chapter 10 in Gottesman, Ed. Molecular Cell Genetics(John Wiley Sons, New York, 1985) ; 및 Brandis et al., "Preparation of cDNA Libraries and the Detection of Specific Gene Sequences", in Setlow et al., Eds, Genetic Engineering, Vol. 8, 299-316페이지(Plenum Press, New York, 1986)].

예를들어, 전체 mRNA는 목적하는 활성을 갖는 폴리펩타이드를 생성하는 세포(예 : 형질전환되지 않은 사람 T-세포 공급원)로부터 문헌[참조 : Berger, S. et al., Biochemist지 18 : 5143-5149(1979)]에 기술된 방법에 따라 추출한다. 이 전체 mRNA 로부터의 이본쇄 cDNA는, 프라이머-개시된 역 전사[참조 : Verme, I., Biochem. Biophys. Acta, Vol. 473, 1-38페이지(1977)]를 이용하여 먼저 각 mRNA 서열의 상보체를 만든 다음, 제 2 본쇄 합성을 위해 프라이밍(priming)[참조 ; Land, H. et al., Nucleic Acids Res., 9 : 2251-2266(1981)]함으로써, 작제할 수 있다. 계속해서, cDNA는 이들을 상보성 단일중합체 테일[참조 : Efstratiadis, A, et al., Cell, 10, 571-585(1977)]또는 적절한 제한부위를 함유하는 링커 단편을 생성하는 점착 말단[참조 : Maniatis et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. 1982]을 통해 적절한 플라스미드 또는 박테리오파지 백터에 연결[참조 : Rougeon, f. et al., Nucleic Acids Res., 2,2365-2378(1975) 또는 Scherer, G, et al., Dev. Biol. 86, 438-447(1981)]시킨 다음, 적절한 숙주를 형질전환시킴으로써 클로닝시킬 수 이다[참조 : Efstratiadis, A., Villa-Kormaroff, L., "Cloning of double stranded cDNA" in Setlow, J. 및 Hollaender, A. (eds.)Genetic Engineering, Vol. 1, Plenum Publishing Corp., N. Y. , U. S. A.(1982)].

목적하는 폴리펩타이드를 코드화하는 mRNA의 바람직한 공급원은 상등액이 B-세포, T-세포 및/또는 마스트 세포에 대한 자극 활성, 또는 본 발명의 폴리펩타이드와 관련된 다른 활성을 함유하는 세포이다. 이러한 세포주중 하나는 마우스 T-세포주 Cl. Lyl⁺2^-/9(ATCC기탁번호 CRL8179)이다[참조 : Nabel, G. et al ., Nature 291 :332-334(1981)], 일반적으로, 적절한 T-세포는 포유동물(예 : 사람)의 비장, 편도선 및 말초혈관 같은 여러가지 공급원으로부터 수득할 수 있다. 말초혈 T-임파구로부터 분리된 클론과 같은 T-세포 클론도 사용될 수 있다[참조 : Research Monographs in Immunology, eds Von Doehmer, H. 및 Haaf, V. ; Secrion D : "Human T-Cell Clones", Vol. 8, 243-333페이지 ; Elsevier Science Publishers, N. Y. (1985)].

이러한 세포에 의해 IL-4를 코드화 할 수 잇는 mRNA의 생성은 추출된 mRNA를 제노퍼스 래비스(Xenopus laevis)의 난모세포(oocyte)에 현미주사(microinjection)함으로써 확인할 수 있다. 이 현미주사기술은 하기 문헌에 상세히 기술되어 있다[참조 : Colman et al., "Export of Proteins from Oocytes of. Xenopus Laevis", Cell. Vol. 17, 517-526페이지(1976) ; 및 Maniatis et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 350-352페이지(Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982)].

목적하는 IL-4를 코드화하는 mRNA가 전체 mRNA의 매우 작은 분획을 구성하는 경우, 삽입물의 cDNA 클론을 검출하기 위한 스크리닝 방법을 실제적으로 만들기 위해 분획농도를 강화시키는 단계가 필요할 수도 있다. 이러한 방법은 본 분야에서는 표준이며 하기 실시예 및 여러가지 논문 및 참조문헌에 기술되어 있다[참조 : Maniatis et al., 255-228페이지, 상기 참조 ; Suggs et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 78, 6613-6617페이지(1981) ; Parnes et al., Proc. Natl. Acad. Sci, Vol. 78, 2253-2257페이지(1981), Davis et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 81, 2194-2198페이지(1984)].

IL-4 cDNA의 드 노보 제조의 바람직한 방법은 오까야마 및 버그에 의해 개발[참조 : Okayma 및 Berg, Mol. Cell. Biol. Vol. 2, 161-171페이지(1982) ; 및 Vol. 3,280-289페이지(1983)]되고, 파마시아(Pharmacia ; Piscataway, N. J.)사에서 시판하고 있는 pcD 발현 계에서 cDNA의 작용성 발현에 의존한다. pcD발현 벡터는 V 40 초기 프로모터, 후기 스플라이싱 연결 및 복제원을 함유한다. 이 벡터는 pcD플라스미드이 복제를 위해 T 항원을 제공하는 COS 7원숭이 세포에서 cDNA 삽입물의 발현을 허용한다. cDNA라이브러리의 스크리닝은 DEAE-텍스트란을 이용하여 플라스미드 DNA의 푸울을 COS 7 세포에 형질감염시키는 것도 포함된다. 림포카인, 및 특허 IL-4는 분비되는 단백질이므로, 형질감염된 세포로부터의 상등액은 수일동안 배양한 후에 생물학적 활성에 대해 시험할 수 있다. 양성 푸울은 더 나누어 형질감염시킨 후에 생물학적 활성을 갖는 일본쇄 cDNA 클론을 동정한다.

간단히 말해, 오까야마 및 버그의 발현 벡터는 다음과 같이 작제한다. 폴리아데닐화된 mRNA를, SV 40초기 프로모터 영역을 함유하는 Kpn I-분해된 pBR 322 플라스미드의 돌출 본쇄에 연결된 폴리데옥시티미딜산(올리고 dT) 테일에 아닐링시킨다. 즉, 완전한 백터는 cDNA 합성을 위해 프라이머로서 작용한다. cDNA를 합성한 후, 3' 폴리데옥시시티딜레이트(울리고 dC)테일을 연결시킨 다음, Hind III 분해시켜, 올리고 dC 테일붕 하나가 연결된 SV 40 DNA-단편을 절단(유일한 Hind III 부위에서)한다. SV 40 초기 프로모터는 온전한 상태로 남아 있으며, 우연하게도 삽입물의 Hind III 분위는 하이브리드 cINA RNA가 Hind III 분해에 내성이 있기 때문에 최소로 영향받는다. 3' 폴리구아니딜레이트(올리고 dG) 테일을 갖는 별도로 작제된 Hind III 단편을 Hind III 분해에 의해 남겨진 점착 말단에 아닐링시킨다. 벡터를 환상화한 다음 이, 콜라이 RNase H, DNA 폴리머라제 I및 DNA 리가제를 사용하여 처리하여 RNA 본쇄를 DNA로 대체한다. 벡터를 이, 콜라이에 클로닝시켜 cDNA 라이브러리를 제조한다. SV 40 성분은 진핵 세포 뿐만 아니라 원핵 세포, 및 특히 포유동물 세포[예 : COS 7 원숭이 세포 또는 중국산 헴스터 난소(CHO)세포]에서 벡터가 발현되는 것을 허용한다.

일단 오까야마/버그 플라스미드 벡터에서 cDNA 라이브러기가 완성되면, cDNA 클론을 수거하여, 랜덤푸울을 표준 방법, 예를들어 하이브리드 선별, 발현된 생성물상에서 항원 결정인자의 검출, 및/또는 작용성 검정에 의해 목적하는 cDNA의 존재에 대해 점검한다. 이어서, 양성 푸울을 유도된 T 세포주로부터 DNA를 사용하여 탐침한다. 그런 후, 양성의 탐침된 푸울을 적절한 속주(예 : 포유동물 세포 배양물)에 형질감염시킴에 의해 시험할 개개의 클론으로 나누어, 숙주 상등액을 활성에 대해 검정한다.

[II. 기술된 cDNA로부터 유도된 하이브리드화 프로브를 통해 IL-4cDNA의 제조]

본 명세서에 기술된 cDNA를 프로브로 사용하며, IL-4코드화 뉴클레오타이드의 드 노보 분리 및 클로닝 방법으로서, 상이한 세포 형에서 동종 서열을 확인할 수 있다. 표준 기술은 하기 문헌들에 기술되어 있다[참조 : Beltz et al., "Isolation of Multigene Families and Determination of Homologies by Filiter Hybridization Methods", Methods in Enzymology, Vol. 100, 266-285페이지(1983) ; 및 Callahan et al., "Detection and Cloning of Human DNA Sequences Related to the Mouse Mammary Tumor Virus Genome", Proc. Natl. Acad. Sci., Vol 79,5503-5507페이지(1982)]. 기본적으로, 본 발명의 cDNA를 사용하여, IL-4를 생성한다고 생각되는 세포형의 게놈 또는 cDNA 라이브러리(다시, 표준 기술로 작제된 것)을, 낮은 하이브리드화 조건에서, 스크리닝하기 위해 프로브를 작제한다(표준기술 사용, 예를들어 Maniatis 등의 상기문헌 참조). 표준 스크리닝 방법은 하기 문헌에 기술되어 있다[참조 : Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 72,3961-3965페이지(1975); 또는 Benton et al., Science, Vol. 196, 180-183페이지(1977)].

하기에 더욱 상세히 기술하는 바대로, 사람의 IL-4의 쥐의 IL-4의 프로브를 사용하여 분리된다. 연속한 분석으로 마우스의 cDNA와 사람의 cDNA의 선택된 영역사이에서 약 70%의 동종성이 나타났다. 사람과 마우스 사이의 진화정도를 근거로 하여, 포유동물의 IL-4 유전자의 전부는 아니라 할지라도 대부분이 본 발명의 하나 이상의 cDNA로부터 작제된 프로브에 의해 탐지될 수 있다고 생각된다[참조 : Wilson et al., "Biochemical Evolution", Ann, Rev. Biochem. Vol. 46, 573-639(1977) ; Kimura, " The Neutral Theory of Molecular Evolution", Chapter 11 in Nei 및 Koehn, Eds. Evoluton of Genes and Proteins(Sinauer Associates, Sunderland, MA, 1983)].

[III 단백질 공학에 의해 돌연변이체 IL-4의 제조]

일단 천연의 단백질에 대한 핵산 서열 및/ 또는 아미노산 서열 정보가 이용가능하면, 천연의 서열에서 실질적으로 모든 돌연변이를 일으키는데 여러가지 기술이 이용될 수 있다. 문헌[참조 : Shortle, Science, Vol. 229, 1193-1201페이지(1985)]에는 본 발명에 적용할 수 있는 핵산을 돌연변이시키는 기술이 기록되어 있다. 바람직하게는, 천연의 IL-4의 돌연변이체인 IL-4 뮤테인은 부위-특이적 올리고-뉴클레오타이드-지시된 돌연변이 유발[참조 : Zoller 및 Smith, Methode in Enzymology, Vol. 100, 468-500페이지(1983) : Mark et al., 미합중국 특허 제 4,518,584호(발명의 명칭 ; "Human Recombinant Interleukin-2Muteins")]에 의해 ; 또는 "카세트(Cassette)" 돌연변이 유발[참조 : Wells et al. , Gene, Vol. 34,315-323페이지(1985) ; 및 Estell et al., Science, Vol. 233, 659-663페이지(1986)]에 의해 생성된다. 하기 단락에서, 뮤테인을 동정하는데 사용되는 에스텔(Estell)등(상기 참조)에 의한 기호가 기술되어 있으며 일반화되어 있다. 예를 들어, "사람 IL-4 뮤테인 Leu^82"(또는 이러한 맥락에서 천연 단백질이 이해되는 경우 간단히 "Leu^82")는 N-테일에 관해 82위치를 제외하고는 천연 단백질의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 나타낸다. 이 위치에서 Phe는 Leu로 치환된다. 하나 이상의 치환도 유사하게 나타낼 수 있다. 예를 들어, 82위치에서 Phe가 Leu로 치환되고 111위치에서 Asn이 Asp로 치환된 뮤테인은 사람 IL-4뮤테인(Leu⁸², Asp¹¹¹)로서 언급된다. 결실은 "Δ S"로 나타낸다. 예를 들어, 71 위치에서 Gln 이 결손된 뮤테인은 사람 IL-4 뮤테인 Δ⁷¹로서 언급된다. 삽입은 "IS(Xaa)"로 나타낸다. 예를 들어, 71위치에서 Gln 다음에 Leu가 삽입된 뮤테인은 사람 IL-4뮤테인 사람 IL-4 뮤테인 IS⁷¹(Leu)로서 언급된다. 그러므로, 사람 IL-4뮤테인(Ser¹³, Δ⁷¹, IS⁹⁴(Gly)은 13 위치에서 Thr이 Ser로 치환되고, 71위치에서 Gln이 결손되고, 94위치에서 Ala 바로 다음에 Gly가 삽입되어 변형된 천연의 사람 IL-4서열을 나타낸다.

동일 부위에서 다중 아미노산의 삽입은 IS¹(X^aa1-X^aa2-XAA³-…)(여기에서, X^aa1-X^aa2-X^aa3…은 i위치 다음에 삽입된 서열이다)로 나타낸다. N 테일 부가는 어깨글가 "0", 예를 들어 IS⁰(Xaa)로 나타내고, 예를 들어 아미노산 6-10의 결실 서열은 Δ^6-10또는 (Δ⁶,Δ⁷, Δ⁸,Δ⁹,Δ¹⁰)으로 표기한다.

카세트 돌연변이 유발을 이용하여 사람의 IL-4 뮤테인을 생성시키는 것이 바람직하다. 하기에서 더욱 상세히 기술하는 바대로, 합성의 사람 IL-4 유전자는 유전자를 따라 거의 일정하게 위치해 있는 유일한 제한 엔도뉴클레아제 부위의 서열을 사용하여 작제할 수 있다. 제한 부위의 유일성은, 유전자가 적절한 벡터에 삽입되어, 유전자의 단편이 유리하게 절단된 다음 목적하는 뮤테인을 코드화하는 합성의 올리고-뉴클레오타이드(즉, "카세트")로 대체되는 경우, 유지되어야만 한다.

유일한 제한 부위의 숫자 및 분포의 결정은(1) 발현 벡터에 제한 부위의 선재(preexisting), (2) 종-특이성 또는 속-특이성 코돈의 사용이 바람직하가에 관한 문제, 및 (3) 유일한 제한 부위사이의 단편을 합성하고/하거나 서열화하는 문제의 편리함 및 신뢰성을 포함한 여러가지 인자에 관한 사항을 수반한다.

[IV. IL-4활성에 대한 생물학적 특성 및 검정]

본 발명의 포유동물 IL-4는 기술된 태양에서 생물학적 활성 및/또는 동종성의 용어로 정의된다. 본 발명의 포유동물 IL-4에는 단백질, 및 기술된 천연 폴리펩타이드에 동정이고 BCGF 활성 및 TCGF 활성 둘다를 갖는 뮤테인(기술된 천연 폴리펩타이드는 IL-4활성으로 언급), 뿐만 아니라 MHC 항원 유도 활성, Fc-∈수용체 유도 활성, GM-CSF 자극된 과립구 콜로니 성장 강화 활성, 인터로이킨-2 TCGF 강화 활성, 및 TgGi-및 IgE-유도 활성으로 이루어진 활성의 그룹중에서 선택된 호활성 적어도 하나 이상을 이들의 생물학적 활성(하기에 상세히 설명)에 의해 정의된다.

IL-4 는 이들의 활성에서 종-특이성으로 갖는다고 생각된다. 다시 말해서, 예를 들면, 사람의 IL-4는 사람의 T 세포주에 의해서는 검정되지만, 쥐의 T 세포주에 의해서는 검정되지 않는 TCGF 활성을 갖는다. 역으로 말하면, IL-4는 쥐의 T 세포주에 위해서는 시험되지만, 사람의 T 세포 라인에 의해서는 시험되지 않는 TCGF 활성을 갖는다.

[A. TCGF 활성]

TCGF 활성에 대한 몇개의 표준 방법이 하기 문헌에 기술되어 있다[참조 : Devos et al., Nucleic Acids Research, Vol. 11, 4307-4323페이지(1983) ; Thurman et al., J. Biol. Response Modifiers, Vol. 5.85-107페이지(1986) ; 및 Robert-Guroff et al., Chapter 9 in Guroff. Ed., Growth and Maturation Factors(John Wiley, New York, 1984)]. 일반적으로, TCGF 검정은 말초 T임파구 또는 IL-2의존 T세포주의 증식을 중진시키는 인자의 능력을 기준으로 한다[참조 : Gillis et al., J. Immunol., Vol. 120 , 2027페이지(1978)] 증식을 표준 기술(예 : 삼중수소 처리된 티미딘 혼입)에 의해, 또는 비색 방법[참조 : Mosmann, J. Immunol. Meth., Vol. 65, 55-63페이지(1983)]의해 측정할 수 있다.

예를 들어, 사람의 TCGF 활성은 다음의 단계로 검정할 수 있다. : (1) 식물성혈구응집소(PHA)를 사용하여 7일 동안 미리 자극시키고 계속해서 7일 동안 IL-2와 함께 배양한, 세척된 사람의 말초 혈 임파구(50μl중 약 2×10⁵개)를 미소 역가 웰(microtiter well)에 가하고 ; (2)TCGF-함유 물질의 희석액(50μl)을 각 웰에 가한 다음 ; (3) 임파구를 37℃에서 72시간 배양하고; (4)삼중수소처리된 티미딘(약 20μl, 20μl/㎖)을 각 웰에 가한 다음 ; (5)세포를 여과지 스트림상에 수거하여, 세척하고, 섬광 계수기(Scintillation counter)에서 계수한다.

실시예에서 더욱 상세히 기술하는 바대로, IL-4의 일부형태는 IL-2의 TCGF 활성을 강화시키는 능력을 갖는다. 이러한 활성에 관하여 본 명세서에 사용되는 "강화(Potentiation)"라는 용어는 IL-2에 의해 야기되는 TCGF 시험계에서 증식의 최대 수준이 IL-4의 첨가에 의해 증가된다는 것을 의미한다.

[B. BCGF 활성]

BCGF활성은 문헌[참조 : Howard et al., J. Exp. Med., Vol. 155, 914-923페이지(1982)]에 기술된 검정에 의해 정의된다. BCGF에 대한 검정 방법은 일반적으로 문헌[참조 : Howard 및 Paul, in Ann. Rev. Immunol., Vol. 1, 307-333페이지(1983)]에 기록되어 있다. 간단히 말하자면, BCGF활성은 정제된 후면중인 B 세포가 항-IgM등의 항원의 서브유사분열 농도 존재하에 증식이 자극되는 정도에 의해 측정된다. 예를 들어, 사람의 BCGF 활성의 검정은 다음의 단계로 수행할 수 있다:

농축된 B세포 집단은 말초 혈, 비장, 편도선, 또는 Ficoll/Hypaquw 밀도 구배 원심분리에 의한 다른 공급원(예 : Pharmacia 제품), 및 T세포를 제공하는 2-아미노에틸이소티오우로늄 브로마이드-처리된 양의 적혈구로 로제팅(rosetting)된 2개의 사이클로부터 수득된다. 이러한 B 세포 제제는 95% 이상의 표면 Ig+세포, 및 항-사람 B-세포 특이적 모노클로날 항체 B 1(Coulter 제품 ; Hialeah, FL)에 의해 측정할 경우 B-세포 특이적 항원에 대해 양성인 95% 이상의 세포를 함유해야 한다. T 세포 오염은 항-Leu-1모노클로날 항체(Becton-Dickinson, Mountain View, CA) 또는 OKT 11 항체(Ortho Diagnostics, Westwood, MA)를 사용하여 엽색하여 측정하는 경우 1%이하여야 한다. 이러한 B임파구(야젤의 배지(참조 : Yssel et al., J. Immunol. Meth., Vol. 65,55-63페이지(1984)]㎖ 당 약 5×10⁵개)의 배양물 3㎖를 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus sureus) Cowan I 균주(SAC)(예 : 상품명 Pansorbin으로 Calbiochem가 시판하고 있거나, 문헌[참조 : Falkoff et al., J. Imminol., Vol. 129, 97-102페이지(1982)]에 기술된 방법으로 제조할 수 있는 SAC의 0.01% 용액)또는 비이드[예를 들면, Bio-Rad(Richmond, CA)제품인 면역비이드 5μg/㎖]에 커플링된 항-IgM 항체(예를 들면, BRL, Gaithersburg, MD)에 의해 활성화된다. B 세포를 24시간 동안(SAC의 경우) 또는 72시간 동안(항-Ig M 비이드에 대해) 배양한 다음 Ficoll/Hypaque밀도 구배 원심분리에 의해 다시 정제하여 SAC 입자, 비이트, 살아있지 않은 세포 등을 제거한다. B세포증식은 0.2㎖ 평저 미소역가 웰중 50μl의 배지에 약 5×10⁴개의 B임파구를 도말함으로써 측정한다. BCGF 활성을 갖는다고 생각되는 물질의 여러가지 희석액을 가하여 최종 용적을 50μl로 만든다. 48시간(항-IgM 배양물) 또는 72시간(SAC 배양물)후에 삼중수소처리된 타미딘 혼입을 측정한다. 유사한 검정방법이 하기 문헌에 기술되어 있다[참조 : Muraguchi et al., J. Jmmunol., Vol. 129, 1104-1108페이지(1982) ; 및 Yoshizaki et. al., J. Immunol., Vol. 128, 1296-1301페이지(1982)].

[C. MHC 항원 유도]

IL-4가 면역계의 여러가지 세포 형태에서, 특히 B세포에서 MHC 항원(예 : 마우스에서의 Ia)의 발현을 유도할 수 있다고 입증되었다. 문헌[참조 : Roehm et al., J. Exp. Med., Vol. 160, 679-694페이지]에는 BCGF활성을 갖는 인자가 휴면중인 정상적인 B 세포상에서 MHC 항원의 발현을 유도할 수도 있다는 증거가 제시되어 있다. MHC 항원 유도에 검정은 상기 문헌에 기술된 쥐의 B 세포에 대한 검정으로 일반화된다. 간단히 말하자면, 면역계 세포를 IL-4에 노출시킨 다음, 세포의 표면상에서의 특정 MHC 항원의 발현을 이 항원에 특이적인 표지된 항체에 의해 측정한다. 유도의 정도는 유도된 세포와 대조군을 비교하여 측정한다. 주어진 종에 대해 여러가지 상이한 항채를 사용할 수 있다. 모노클로날 항-MHC 항원 항체를 생성하는 여러가지 하이브리도마는 ATCC로 부터 이용가능하며, 몇몇은 상업적으로 시판되고 있다(예를 들면, ATCC 기탁번호 HB103, HB109, HB110 또는 HB151인 하이브리도마로부터 생성된 항-HLA-DR ; ATCC 기탁번호 HB35인 하이브리도마에 의해 생성된 항-I-A^b.b; 벡톤 딕킨즌(Becton dickinson ; Mountain View, CA) 제품인 항-HLA-DR L243등). 일부의 통상적인 실험은 MHC 항원 수준에 대해 가장 민감한 판독을 위해 검정을 특정 종에 적용하고 조건을 최적으로 해야할 필요가 있다. 사람의 MHC 항원 유도 검정을 위해, 정재된 B 세포를 상기 기술한 바와 같이, 또는 유사한 기술에 의해 제조할 수 있다. 또한, MHC 유도는 비장 세포의 정제되지 않은 제품상에서도 검정할 수 있다. 항체-표지된 세포는 예를 들어 Becton Dickinson FACS-형 기기 또는 등가물상에서 유동 혈구계산법(flow cytometry)으로 검출하는 하는 것이 바람직하다.

[D. MCGF 활성]

IL-4 는 일반적으로 MCGF 활성을 갖는다고 생각된다. 그러나, 적절한 검정 기술의 부족으로 인하여, MCGF 활성은 설치류의 IL-4에 대해서만 입증되었다. 쥐의 IL-4 MCGF 검정은 인자-의존적인 쥐의 마스트 또는 호염기성 세포주의 증식을 기준으로 하고 있다. 특히, MCGF 활성은 쥐의 마스트 세포주 MC/9(ATCC 기탁번호 CRL 8306)[참조 ; 미합중국 특허 제 4,559,310호 및 Nabel et al., Cell. Vol. 23. 19페이지(1981)]를 사용하여 검정할 수 있다. 쥐의 MCGF의 검정도 하기 문헌에 기술되어 있다[참조 : Ihle et al., J. Immunol., Vol, 127, 794페이지(1981)].

MCGF 활성은, MC/9 세포를 사용하여 모스만의 비색 검정(상기 참조)에 의해 측정하는 것이 바람직하다. 간단히 말하자면, MC/9 세포는 4% 태 송아지 혈청, 50μM 2-머캅토 에탄올, 2mM 글루타민, 비필수 아미노산 및 비필수 비타민을 보충시키고, 시험 상등액의 농도를 최종 용적 0.1㎖ 로 변화시킨 들베코의 변형 배지(Dulbecco's modified medium)중의 평저 Falcon 미소역가 트레이(10⁴세포웰)에서 배양한다. 인산염-완충 식염수 10μl 중의 3-(4, 5-디메틸티아졸-2-일)2, 5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드(Sigma) 50μg을, 20시간 배양후의 각 세포 배양물에 가한다. 4시간 후에, 이소프로판올중의 0.04M HCL 0.1㎖를 가하여 착색된 포르마잔 반응 생성물을 가용화시킨다. 570nm(대조용 630nm)에서의 흡광도를 Dynatek Microelisa Autoreader(MR 580) 또는 유사한 기기상에서 측정한다.

[E. Fc-∈수용체 유도]

IL-4가 B 세포 또는 T 세포 상에서, 특히 항-IgM 항체 또는 유사한 항원에 의해 자극된 사람의 B 세포상에서 Fc-∈발현을 유도한다고 밝혀냈다. 또한, 감마 인터패론은 특이적으로 B 세포상에서 IL-4 유도된 Fc-∈ 발현을 억제한다고 밝혀졌다.

Fc-∈수용체 유도에 대한 검정을 처음에는 BCGF 검정에 대한 것과 같이 진행시키는 것이 바람직하다. 다시 말해서, 정제된 B 세포는, 항-IgM 항체(또는 유사한 항원)을 사용하여 자극시킨 다음 IL-4에 노출시킴으로서 수득하다. 최종적으로 세포를 Fc-∈ 수용체에 대해 검정한다.

세포 표면상에서 Fc-∈ 수용체를 정량 분석하는데에는 여러가지 검정이 이용가능하다[참조 : Yodoi 및 Ishzaka, J. Immunol., Vol. 122, 2577-2583페이지(1979) ; Hudak et al., J. Immunol Meth., Vol. 84.11-24페이지(1985) ; 및 Bonnefoy et al., J. Immunol. Meth., Vol. 88, 25-32페이지(1986)]. 특히, Fc-∈ 수용체는, 예를 들어 Becton Dickinson FACS-IV등의 기기상에서, 수용체에 대해 특이적인 표지된 모노클로날 항체를 사용하여 유동 혈구계산법으로 측정할 수 있다. Fc-∈ 수용체 특이적 모노클로날은 통상의 기술을 사용하여 작제할 수 있다.

[F. IGg1-및 IgE-유도]

IL-4는 리포다당류(LPS)-활성화된 B 세포에서 IgE 및 IgG₁이소타입(isotype)의 분비를 유도한다[참조 : Coffman et al., J. Immunol., Vol. 136, 4538-4541페이지(1986) ; Sideras. et al., Eur J. Immunol., Vol. 15, 586-593페이지(1985)]. 이들 활성은 항체 이소타입에 대한 표준 면역검정에 의해 측정할 수 있다.[참조 : coffman et al., J. Immunol., Vol. 136, 949-954페이지(1986)]. 간단히 말하자면, B세포는, 이들을 예를 들어 약 4μg/㎖의 살모넬라 타이피무리음(Salmonella typhimurium) LPS(Sigma 제품), 또는 이 콜라이 055로부터 추출한 약 50μg/㎖ LPS[참조 : Sideras et al., 상기 참조]와 함께 배양함으로써 LPS-활성화된다. 4 내지 8일간 배양한 후, 상등액을 검정을 위해 수거하다. 표준의 이소타입-특이적 ELISA-형검정을 사용하여 여러가지 이소타입 농도를 측정할 수 있다. 검정을 위한 항-이소타입 항체는 시판되고 있거나, ATTC로부터 수득할 수 있다.

[G. 콜로니 자극 인자(CSF)활성]

CSF 활성을 측정하기 위해, 조혈 세포, 예를 들어, 골수 세포 또는 제대 혈구를 단일 세포 현탁액으로 만든다. 이어서, 개개의 세포를 영양소 및 통상적으로 태 송아지 혈청을 함유하는 반-고체(한천) 또는 점성(메틸셀룰로오즈) 배지에서 "고정화(immobilized)"시킨다. 적절한 자극 인자 존재하에, 개개의 세포는 증식되고 분화된다. 초기의 세포가 고정화되어 있으므로, 세포가 증식되고 성숙됨에 따라 콜로니가 성장한다. 이들 콜로니는 7 내지 14일 후에 계수한다[참조 : Burgess A., Growth Factors and Stem Cells, 52-55페이지, Academic Press, New York(1984)]. 과립구 및 대식세포의 성장에 특정적으로 적용하기 위해서는, 하기 문헌 참조 바람[참조 : Bradely, T. 및 Metcalf, D., Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci., Vol. 44, 287-300페이지(1966), 및 Metcalf, D., Hemopoietic Colonies, Springer-Verlag, Berlin(1977)]. 원하는 경우, 개개의 콜로니를 추출하여, 현미경 슬라이더상에 놓은 다음, 고정시켜서 Wright/Geisma를 사용하여 염색할 수 있다[참조 : Todd-Sanford, Clinical Diangnosis by Laboratory Methods, 15th Edition, Eds, Davidson and Henry(1974)]. 단일 콜로니당 존재하는 세포형의 형태학적 분석으로 측정할 수 있다.

비혈핵성 질병을 갖고 있는 환자로부터 수거한 골수 세포를 Ficoll(type 400, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)상에 도말하여, 원심분리(2000rpm, 20분)한 다음, 경계면에 있는 세포를 제거한다. 이들 세포를 10% 태 송아지 혈청(FCS)을 함유하는 이소코브(Iscove)의 변형된 둘베코의 배지에서 2회 세척하여, 동일한 배지에서 재현탁시킨 다음 플라스틱 페트리 접시에 접착시킴에 의해 접착 세포를 제거한다. 비접착 세포를 10⁵세포/㎖의 농도로, 20% FCS, 50μM 2-머캅토에탄올, 0.9% 메틸셀룰로오즈, 및 콜로니 자극 활성을 갖는다고 알려진 상등액이나 시험 상등액의 변화된 농도를 함유하는 이소코브의 배지에 가한다. 분취량 1㎖를 35mm 페트리 접시에 도말하여 공기중 6% CO₂의 충분한 습기찬 대기 37℃에서 배양한다. 배양개시 3일 후에, 1단위의 에리트로포이에틴을 각 평판에 가한다. 과립구-대식세포 콜로니 및 적혈구 버스트(burst)를 역상 현미경을 사용하여 10 내지 14일 후에 계수한다.

헤파린에 수거한 제대 혈구를 2,000rpm으로 6분 동안 원심분리시킨다. 혈장과 적혈구 피크사이의 경계면에 있는 백혈구를 0.17N 염화암모늄 및 6% FCS를 함유하는 튜브를 옮긴다. 얼음상에서 5분 후, 현탁액 하부에 4㎖ FCS를 넣고, 2,000rpm 으로 6분 동안 원심분리시킨다. 세포 펠렛을 둘베코의 인산염 완층 식염수를 사용하여 세척한 다음 골수 세포에 대해 상기 기술한 바와 같이 Ficoll 및 플라스틱 접착 단계를 수행한다. 저밀도 비접착세포를 수거하여 상기 기술한 바와 같이 반-고체 배양 배지에 10⁵세포/배양물의 농도를 도말한다.

검정의 마지막에, 개개의 콜로니를 유리 슬라드상에 놓은 다음 Wright-Giemsa을 사용하여 염색한 후에 세포 조성을 측정한다. 호산구는 Luxol Fast Blue를 사용하여 염색하여 측정한다[참조 : Johnson, G. 및 metcalf, D., Exp. Hematol., Vol. 8, 549-561페이지(1980)].

GM-CSF-자극된 과립구 성장에 관해 본 명세세에 사용한 "강화(potentiation)"란 용어는 상기 기술한 검정에서 과립구 콜로니가, GM-CSF만을 사용한 경우보다 GM-CSF를 IL-4와 함께 사용한 경우 콜로니 성장을 더 자극시킨다는 것을 의미한다.

[V. 정제 및 약제학적 조성물]

이. 콜라이, 효모 또는 다른 세포에서 발현되는 본 발명의 폴리펩타이드는 황산 암모늄 침전법, 분획화 컬럼 크로마토그라피(예 : 이온 교환, 겔 여과, 전기영동, 친화성 크로마토그라피 등) 및 근본적인 결정화법을 포함한 본 분야의 표준 방법에 따라 정제할 수 있다[참조 : "Enzyme Purification and Related Techniques". Methods in Enzymology, 22 : 233-577(1977)및 Scopes, R., Protein Purification : Principles and Practice, Springer-Verlag, New York(1982)]. 부분적으로 또는 군질하게 정제한 다음, 본 발명의 폴리펩타이드를, 예를 들어 성장 배지[예를 들면, 최소 필수 배지 Eagle, 이소코브의 변형 둘베코 배지 또는 RPMI 1640 ; Sigma Chemical Company(St. Louis, Mo)및 GIBCO Division(Chagin Falls, OH) 제품]에 대한 보충물로서, 및 면역검정, 면역 형광 염색법등에 유용한 특이적 면역글로불린을 유도해 내는 항원 물질로서 연구목적을 위해 사용 할 수 있다[참조 : Immunological Methods, Vols, I 및 II, Eds, Lefkovits, I 및 Pernis, B., Academic Press, New York, N. Y.(1979 및 1981) ; 및 Handbook of Experimental Immunology, ed. Weir, D., Blackwell Scientific Publications, St. Louis, MO(1978)].

본 발명의 폴리펩타이드는 또한 약제학적 조성물에 사용하여, 예를 들어 여러가지 감염에 대한 자연 방어를 증진시키는데 사용할 수도 있다. 즉 이러한 폴리펩타이드를 사용하여, 이식을 필요로 하는 류머티스성관절염, 또는 암화학치료, 고령, 면역억압제 등에 의해 야기되는 면역결핍증 환자를 치료할 수 있다. 조성물은 단독으로 또는 본 분야의 숙련가에게 공지된 다른 제제와 함께, 면역계의 여러가지 성분들을 선택적으로 자극시킬 수 있다. 특히, 조성물은 본 발명의 폴리펩타이드의 활성을 강화시키는 관점에서, 림포카인(예 : IL-1, IL-2 등). 콜로니 자극 인자, 면역글로불린 등과 같은 다른 면역-반응제제를 함유할 수 있다. 폴리펩타이드는 또한 증진된 세포 증식 또는 면역글로불린의 생성을 원하는 경우에도 생체내 또는 시험관 내에서 사용할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 이들 폴리펩타이드를 바람직하게는 불활성인, 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합함으로써 제조할 수 있다. 적절한 담체 및 이들의 제조방법은 본 분야에 공지되어 있다[참조 : Remington's Pharmaceutical Sciencses and U. S. Pharmacopeia : National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA(1984)], 바람직한 투여경로는 비경구적이며 기계적인 전달계의 사용도 포함할 수 있다.

약제학적 조성물은 각 단위가 활성 성분 적당량을 함유하는 단위 용량 형태가 바람직하다. 제제의 단위 용량에서 활성 화합물의 양은, 활성 성분의 특정 적용 및 효능에 따라 , 1μg 내지 100mg으로 변환시키거나 조정할 수 있다. 조성물은, 원하는 경우, 다른 치료제도 함유할 수 있다.

용량은 환자의 요구, 치료될 상태의 중증도 및 사용되는 특정 화합물에 따라 달라질 수 있다. 본 명세서에 사용되는 "유효량(effective amount)"이란 용어는 이들 인자를 고려하여 용량을 취하는 것을 의미한다. 특정의 상황에 대한 적절한 용량의 결정은 본 분야의 기술내에 있다. 일반적으로, 치료는 화합물의 최적 용량 이하의 소 용량을 사용하여 시작한다. 그런 후, 용량을 그 상황하에서 최적 효과에 도달될 때까지 소량씩 증가시킨다. 전체의 1일 용량을 나누어 하루동안 소량씩 투여하는 것이 편리하다.

[VI. 발현계]

여러가지 발현계(즉, 숙주-벡터 조합)을 사용하여 본 발명의 단백질 및 뮤테인을 제조할 수 있다. 숙주 세포의 가능한 형태에는 세균, 효모, 곤충, 포유동물 등으로부터 취한 세포가 포함되지만, 이로써 제한되지는 않는다. 특정의 단백질 또는 뮤테인의 발현의 최적화는(1) 발현될 단백질 또는 뮤테인의 성질(예를 들면, 발현된 생성물은 일부의 숙주계에 독성이 있을 수 있다. (2) 해독된 후에 변형된 형태 및 해독된 후 변형을 원하는 가에 관한 점(예를 들면, 목적하는 글리코실화의 범위 및 종류는 숙주의 선택에 영향 미칠 수 있다), (3) 당해 단백질 또는 뮤테인의 코드화 영역에 플랭킹된 5' 및 3'영역의 성질(예를 들면, 해독의 조절에 수반되는 프로모터 및/또는 서열의 선택은 효과적인 발현에 결정적이다). (4)일시적인 발현을 원하느냐 안정한 발현을 원하느냐에 관한 점, (5)발현된 생성물이 단백질, 및 수죽 세포 및/또는 배양 배지의 다른 물질로부터 용이하게 분리될 수 있느냐 하는점, (6) 당해 단백질 또는 뮤테인을 일시적으로 발현시키는 숙주를 형질 감염시키는데 있어서의 용이성 및 효율,(7) 당해 단백질 또는 뮤테인을 발현시키는데 사용되는 세포 배양물이 규모, (8) 당해 단백질 또는 뮤체인이 숙주에 외인성인 단백질의 단편에 융합되어 발현되는지에 관한 점 등의 인자를 포함한 많은 인자에 따라 달라진다.

일반적으로 원핵 세포가 본 발명의 DNA서열의 클로닝에 바람직하다. 원핵 발현 계를 이행하는데 있어서의 일반적인 지칭은 하기 문헌들에 기술되어 있다[참조 : Maniatis et al., Molecuar Cloning : A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y., 1982); Perbal, A Practical Guide to Molecular Colning(John Wiley ＆ Sons, N. Y., 1984); Glover, DNA Cloning : A Practical Approach, Vol. I 및 II(IRL Press, Oxford, 1985) ; 및 de Boer et al., "Strategies for Optimiting Foreign Gene Expression in Excherichia Coli", in Gense : Structure and Expression, Kroon, ed.(Jobn Wiley ＆ Sons, N. Y., 1983)].

예를 들어, 이. 콜라이 K12균주 294(ATCC 31466)가 특히 유용하다. 사용될 수 있는 다른 미생물 균주에는 이. 콜라이 B 및 이. 콜라이 X1776(ATCC 31537)과같은 이. 콜라이 균주도 포함된다. 이들 예는 물론 설명하기 위한 것이지 제한하고자 하는것은 아니다.

원핵 생물도 발현에 사용될 수 있다. 상기 언급한 균주뿐만 아니라, 이. 콜라이 W3110[Fs^-, λ^-, 프로토르로픽(prototropic), ATCC 27325], 바실러스 서브틸리스(Bacillus subills)같은 바실러스, 및 살로넬라 타이프무리움(Salmonella typhimurium )또는 세라티아 마르세산스(Seratia marcesans)와 같은 엔테로-박테리아새애(enterobacteriaceae), 및 여러가지 슈도모나스(psendomonas)종도 사용될 수 있다.

일반적으로, 숙주 세포에 적합한 종으로부터 유도된 레플리콘 및 조절서열을 함유하는 폴리스미드 벡터는 이들 숙주와 함께 사용될 수 있다. 벡터는 근원적으로 복제부위뿐만 아니라, 형질전환된 숙주에서 표현형적 선택을 제공할 수 있는 표지 서열(marking sequence)도 함유한다. 예를들어, 이. 콜라이종으로부터 유도된 플라스미드인 pBR3

22 [참조 : Bolivar, et al., Gene, Vol. 2, 95페이지(1977)]를 사용하여 이, 콜라이를 형질전환시킨다. pBR 322은 앰피실린 및 테트라사이클린 내성에 대한 유전자를 함유하므로 형질전환된 세포를 동정하는데 쉬운 수단을 제공한다. pBR322 플라스미드 또는 다른 미생물 플라스미드는 그 자신의 단백질의 발현을 위해 미생물 유기체에 의해 사용될 수 있는 프로모터를 함유하거나 함유하도록 변형시켜야 한다. 제조합 DAN 착제시 가장 통상적으로 사용되는 프로모터에는 β-락타마제(페니실리나제) 및 락토오즈 포로모터계[참조 : Chang et al. Nature, Vol, 275, 615페이지(1978), Itakura, et. al., Science, Vol, 198, 1056페이지(1977); Goeddel, et al., Nature, Vol, 281, 544페이지(1979)]및 트립토판(trp) 프로모터계[참조 : Goeddel, et al, Nucleci Acids Res., Vol, 8. 4057페이지(1980), EPO공개공보 제 0036776호]가 포함된다. 이들이 가장 통상적으로 사용되지만, 다른 미생물 프로모터도 발견되어 이용되고 있으며, 이들의 뉴클레오타이드 서열에 관한 상세한 설명은 공개되어 있고, 본 분야의 숙련자라면 이들을 플라스미드 벡터에 작용적으로 연결시킬 수 있다[참조 : Siebenlist et al., Cell, Vol. 20., 269페이지(1980)].

원핵 미생물에외에, 효모배양물과 같은 진행 미생물도 사용될 수 있다. 진행 미생물중에서 사카로마이세스 세레비지에 또는 통상의 제빵용 효모가 가장 통상적으로 사용된다.

사카로마이세스에서의 발현을 위해, 통상적으로 사용되는 플라스미드는 YE^p7, [참조 : Stinchcomb., et al., Nature, Vol. 282, 39페이지(1979) ; Kingsman et al., Gene, Vol, 7, 141페이지(1979) ; Tsachemper, et al., Gene, Vol. 10, 157페이지(1980)]이다. 이 플라스미드는 이미 트립포판에서 성장할 수 있는 능력이 결핌된 효모의 돌연변이 균주, 예를들면 ATCC 44076 또는 PEP4-1[참조 : Jones, Genetics, Vol, 85, 12페이지(1977)]에 대한 선택 표지물을 제공하는 trp 1유전자를 함유한다. 효모 숙주 세포 게놈의 특징으로서 trp 1 병소의 존재는 트립토판 부재하의 성장에 의한 형질전환을 탐지하는데 효과적인 환경을 제공한다.

효모 벡터에서 적절한 프로모터 서열은 3-포스포 글리세레리트 키나제[참조 : Hitzeman, et al., J. Biol. Che., Vol. 255, 2073페이지(1980)], 또는 에놀라이제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 디카복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코오즈-6-포스페이트 이소머라제, 3-포로포글리세레이트 뮤티제, 피루베이트 키나제 트리오즈포스페이트 이소머라제, 포스포글루코오즈 이소머라제 및 글루코키제와 같은 다른 해당 효소[참조 : Hess, et al, J. Adv. Enzyme Eeg., Vol. 7, 149페이지(1968): Holland, et al., Biochemistry, Vol. 17, 4900페이지 1978)]에 대한 프로모터가 포함된다. 적절한 발현 플라스미드 작제시, 이들 유전자와 관련된 종결 서열을 발현될 벡터에서 발현될 서열의 3'위치에 연결시켜 mRNA의 폴리아데닐화 및 종결을 제공한다. 성장조건에 의해 조절되는 전사의 추가의 잇점을 갖는 다른 프로모터는 알콜 디하이드로게나제 2, 이소사이트크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 관련된 분해 효소, 상기 언급한 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로 게나제, 및 말토오즈 및 갈락토오즈 이용에 관련된 효소에 대한 프로모터 영역이다[참조 : Holland, 상기 참조]. 효모에 적합한 프로모터, 복제원 및 종결 서열을 함유하는 플라스미드 벡터는 모두 적절하다.

미생물외에 다세포 유기체로부터 유도된 세포의 배양물로 숙주로서 사용할 수 있다. 이론적으로는, 척추동물이나 무척추동물의 세포 배양물 어느 것이나 사용할 수 있다. 그러나 척추동물의 세포기 더욱 중요하며, 배양물(조직 배양물)에서 척부동물 세포의 진행은 최근에 통상적인 방법으로 되었다[참조 : Tissue Culture, Academic Press, kruse 및 Palterson, editors(1973)]. 이러한 유용한 숙주세포주의 예로는 VERO 및 HeLa 세포, 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포주, 및 W138, BHK, COS 7, 마우스의 흑색종(ATCC TIB 19 또는 TIB 230), 및 MDCK 세포주가 있다. 이러한 세포에 대한 발현 벡터에는 기본적으로 (필요한 경우)복제원, 발현될 유전자앞에 위치한 프로모터, 리보좀 결합부의, RNA스플라이싱부위, 폴리아데날화 부위 및 전사 터미네이터 서열을 포함한다.

포유동물 세포에서 사용하기 위해, 발현 벡터상의 조절작용은 때때로 바이러스 물질에 의해 제공된다. 예를들어, 통상적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 및 가장 자주 시미안 바이러스 40(SV 40)으로부터 유도된다.

SV 40바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 이들 둘다가 SV 40 바이러스의 복제원도 함유하는 단편으로서 바이러스로부터 쉽게 수득되기 때문에, 특히 유용하다[참조 : Fiers, et al, Nature, Vol. 273, 113페이지(1978)]. 더 작거나 더 큰 SV 40 단편도, 바이러스의 복제원에 위치하는 Hind III 부위에서 Bg I부위 까지의 약 250bp 서열만만 포함되어 있다면, 사용될 수 있다. 또한, 통상적으로 목적하는 유전자 서열에 관련된 프로모터 또는 조절 서열도, 이러한 조절 서열에 숙주 세포계에 적합하면, 사용할 수 있으며, 종종 사용하는 것이 바람직하다.

복제원은 벡터, 예를들어 SV 40 또는 다른 바이러스(예 : 폴리오마, 아데노, VSV, BPV 등) 공급원으로 부터 유도된 벡터상의 외안성 오리진에 의해 제공되거나 숙주 세포 염색체 복게 메카니즘에 의해 내생적으로 제공될 수 있다. 종종 벡터를 숙주 세포 염색체에 통합시키는 것만으로도 충분하다.

t-PA 및 DHFE 단백빌을 코드화하는 DNA 서열로 이루어진 본 발명의 벡터에 의한 형질감염에 대해 바람작힌 숙주세포를 선택하는데 있어서, 사용되는 DHFR 단백질의 형태에 따라 숙주를 선택하는 것이 바람직하다. 야생형 DHFR 단백질이 사용되는 경우, DHFR이 결핍되어, 하이포크산틴, 글리신 및 티미딘이 결핍된 선택 배지에서 성공적인 형질감염을 위한 표지물로서 DHFR 코드화 서열을 사용할 수 있게 해주는 숙주 세포를 선택하는 것이 바람직하다. 이러한 적절한 숙주세포는 DHFR 활성이 결핍된 중국산 햄스터 나소(CHO) 세포주이며, 이의 제조 및 증식방법은 하기 문헌에 기술되어 있다[참조 : Urlaub 및 Cbasin, Proc, Nail. Acad. Sci. (USA) Vol. 77, 4216페이지(1980)].

한편, MTX 에 대해 낮은 결합 친화성을 갖는 DHFR단백질을 조절서열로서 사용하는 경우, DHFR-내성 세포를 사용할 필요는 없다. 돌연변이체 DHFR이 메토트렉세이트에 대해 내성이 있으므로, MTX-함유 배지는 숙주 세포 그 자체가 메토프랙세이트에 민감성인 경우 선별 수단으로서 사용될 수 있다. MTX를 흡수할 수 있는 대부분의 진핵세포는 메코트렉 세이트에 민감성인 것으로 나타났다. 이러한 유용한 세포주중의 하나는 CHO라인, CHO-K1 ATCC CCL 61이다.

무척추 발현 계에는 배클로 바이러스 벡터인 BmNPV 에 의해 감염된 누에의 유층(Bombyx mori)이 포함된다[참조 : Maeda et al., in Nature, Vol. 315, 892-89페이지(1984), 및 in Saibo Koguku, Vol, 4, 767-779페이지(1985)].

[실시예]

후술하는 실시예로 본 발명을 설명하고자 한다. 시약의 농도, 온도, 및 다른 변수 값뿐만 아니라 벡터 및 숙주의 선택은 단지 본 발명의 적용을 예시하는 것으로서, 이에 한정되지는 않는다.

[물질 및 방법]

T 세포주 CI. Lyl⁺2^-/9(Cl.1으로 칭함)[참조 : Nabel, G., Greenberger, J. S., Sakakeeny, M. A. 및 Cantor, H. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci, U. S. A. 78, 1157-1161페이지] 및 GK 15-1[참조 : M. Giedlin, DNAX Research Institute of Moleucuar and Cellular Biology, Inc., DNAX]를 24시간 동안 RPMI 1640, 50㎛ 2ME, 1% FCS 및 2μg/㎖ Con A 중에 5×10⁵세포/㎖의 농도로 wo현탁시킨다. 상등액을 모아 70℃에 보관한다.

클론화된 마스트 세포주, MC/9[참조 : Nable, G., Galli, S. J., Dvorak, H. F. 및 Cantor, H. (1981) Nature 291, 332-334페이지]를 G. Nabel(Dana Farber Cancer Institute ; DFCI)로부터 수득한다. 마스트 세포주 MM3(R. Coffman에 의해 제공됨, DNAX) 및 Dx-2(D. Rennick 에 의해 제공됨, DNAX)를 골수성 단구와 연관된 표지물(myelomocytic-associated markers)부재 및 IgE수용체 및 250ng/106세포 이상의 히스타민 존재에 의해 특성화시킨다. 골수성 NFS-6- 세포주는 J.Ihle(Frederick Cancer Research Facility : FCRF)로부터 제공된다.

NFS-6세포주를 서브클론화하여 IL-3-의존적 크클론을 수득한다.

T세포주 HT 2는 S. Strober(Stanford University, palo Alto CA)로부터 수득하며, CTLL-2는 W. Farrar(FCEF)에 의해 공급되고 ; Ly 23/4는 G. Nabel(DFCi)에 의해 공급된다. 마스트 세포 및 T세포주를 재조합 IL-3 또는 IL-2를 보충 시킨 RPMI 1640, 10% FCS, 50μM 2ME에서 성장시킨다.

수개의 IL-3-의존적 세포주의 히스타민 수준은 문헌[참조 : Sbore, P. A., Burkbalter, A., 및 Conn, V, H., I. Pharm. Exp Ther. 127 182-186페이지(1959)]에 기술된 방법에 의해 분석한다. T세포 및 마스트 세포 성장 인자 활성은 [³H]-티마딘 삽입 또는 비색 분석법[참조 : Mosmann, T. J. Immunol. Methods 65; 55-63페이지(1983)]에 의해 분석한다.

WEHI 3상등액으로부터 정제된 IL-3는 J. Ible(FCRF)로부터 수득한다. 제조합 IL-2, IL-3, GM-CSF 및 INF-γ는 상응하는 cDNA클론으로 형질감염된 COS-7원숭이 신장세포로부터의 상등액 형태로 사용된다. 1단위의 IL-2, IL-3 또는 GM-CSF를 인자-의존적 세포주의 50%최대[³H]-티미딘 삽입을 자극시키는 인자의 양으로서 정의한다[참조 : Rennick, D,et, al., (1985) J. Immunol., 134; 910-919페이지]. 1단위의 IFN-γ는 수포성 구내염 바이러스의 세포병리효과로부터 쥐의 L세포를 50% 보호한다[참조 : Schreiber R. et al., (1982)J. Exp. Med., 156, 677-689페이지].

B 세포는 표준방침[참조 : Howard, M. et al., J. Exp. Med., 155: 914페이지(1982)]에 따라 T-세포 및 대식세포를 고갈시킴으로써 마우스 비장 세포의 단일 세포 현탁액으로부터 제조한다. 본 명세서에 기재한 정재 인자에 대해, 세포 형광 분석법을 사용하여 B-세포상의 Ia발현을 유도하는 능력 및 Roehm, N. 등에 의해 기재된 바와 같이[참조 : J. Exp. Med. 160 ; 679페이지)항-Ig 공통-자극 분석을 사용하여 B-세포 증식을 자극하는 능력을 평가한다.

단백질 측정은 UV흡수(280nm 또는 220nm) 또는 염료 결합 검정법[참조 : Bradford, M. (1976) Annal. Bichem, 72 : 248-254페이지]을 사용하여 작성된 표준 곡선을 기초로 한다.

상등액은 펠리콘 카세트 단위(Pellicon cassette unit)(Millipore, Bedford, MA)를 사용하거나, (역상 크로마토그래피 후) Speedvac(Savant, farmingdale, NY)중에서 용매를 증발시켜 20배로 농축시킨다. SDS PAGE는 12% 분리 겔을 함유하는 라엠리계[찬조 : Laem㎖i, U.(1970) Nature 227 : 680-685페이지)를 사용하여 수행된다. 표지 단백질은 파마시아 저 분자량 표준 물질[Pharmacia Low MW Standards : Pharmacia, Uppsala, Sweden]이다. 겔은 문헌의 기재와 같이 온-염색한다[참조 : Merril, C. et. al., (1981) science 211 ; 1437-14738페이지], 분자량의 함수로서 MCGF 및 TCGF활성을 직접 분석하기 위하여, 50mM DTT로 환원시키거나 환원시키지 않은 시료를 전기 영동시키고 겔을 1mm 씩으로 자르고 분쇄한 다음, 단백질을 5mg/㎖의 오브알부민(Sigma, St. Louis, MO)를 보충시킨 0.5㎖ 검정 배지로 4℃에서 밤새 용출시킨다.

크로마토그라피는 Kratos Spectroflow 773UV 검출기(Kratos, Ramsey, NJ)가 장치 Pbarmacia FPLC 계상에서 18℃에서 수행한다. 양이온 교환 크로마토그라피는 50mM 인산나트륨, 1mM EDTA pH 7.0으로 평형화시킨 Pharmacia Mono S 컬럼(0.5×5cm)을 사용한다. 동일한 완충액중의 상등액을 컬럼에 적용시키고, 1M 까지의 NaCl 구배로 용출시킨다. 액상 크로마토그라피를 위해 Pharmacia C8 컬럼(0.5×2cm)를 사용한다. 0.1% TFA로 pH 2까지 희석시킨 시료를 컬럼에 적재하고 0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴 구배로 용출시킨다.

MCGF 및 TCGF 활성물의 등전점은 Pharmacia Mono P 컬럼(0.5×20cm) 상에서 크로마토포커싱에 의해 측정한다. 0.025M 비스 트리스 pH 7.1중의 시료를 동일한 완충액으로 평형시킨 "Mono P" 컬럼에 넣는다. Pharmacia 폴리 완충액 74, pH 4.0(1 : 10희석에, 0.2M 아미노아세트산으로 pH를 조절함)으로 구배용출시킨다. 용출물의 pH를 Pharmacia pH 모니터로 연속 측정한다. 주입하기 전에 모든 시료를 Millex GV 0.2μ단위(Millipore)를 통해 여과시킨다.

SDS PAGE 또는 크로마토그라피한 분획을 세가지 세포주, NFS-60(IL-3), MC/9(MCGF) 및 HT2(TCGF)의 증식지지 능력에 대해 검정한다.

상기 인자를 균직하게 정제하기 위해, 8ι의 Con-A-활성화 C). 1상등액으로 20mM Hepes 완충액, pH 7.0에 투석시킨 다음 동일한 완충액으로 평형시킨 Pharmacia Mono S 10/10양이온 교환 컬럼에 통과시킨다. 피크 활성물은 0.2M Nacl의 선형 염 구배로 용출된다. 이 물질을 모으고 농축시킨 다음 20mM Hepes 완충액 pH 7.0으로 다시 투석시키고, 동일한 완충액으로 평형시킨 Heparin-Sepharose 컬럼에 넣는다.

피크 활성물은 2M NaCl 가지의 선형 구배로 0.45M NaCl에서 용출된다. 이 물질을 모으고 0.10/TFA/H₂O, pH 2로 10배 희석시키고 Vydac 영상 컬럼(C4)상에서 분획화한다. 아세토니트릴, 0.1% TFA의 선형 구배를 적용하여 42% 아세토니트릴에서 활성물이 방출된다.

[실시예 1]

[Cl. Lyl⁺2^-/9세포에서 쥐의 IL-4 cDNA의 드 노보]

[제조방법 및 COS 7 원숭이 세포에서 일시적인 발현]

IL-4를 코드화하는 cDNA 클론을 쥐의 헬퍼 T세포주 Cl. Lyl⁺2^-/9(ATCC CRL 8179로 기탁되어 있으며, 문헌[참조 : Nabel et al., Cell, Vol. 23, 19-28페이지(1981) 및 Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 78, 1157-1161페이지(1981)]에 기재되어 있다)로부터 분리한다. BCFG 활성을 생성시키는 것으로 알려진 다른 쥐의 세포는 EL-4주(ATCC TIB 39)이다. 본 실시예에 사용된 방법은 문헌에 기재되어 있다[참조 : Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci, Vol. 83, 20612065페이지(1986)]. 간단히, pcD라이브러리를 전술한 오까야마 및 버그의 방법에 따라 콘카나발린 A(Con A)-유도된 Cl. Lyl⁺2^-/9 세포로부터의 메신저 RNA (mRNA)으로 작제한다. IL-3 및 GM-CSF클론은 cDNA 표지된 cDAN프로브로 하이드리드화시킴으로써 무작위로 선택된 클론의 큰 서브라이브러리로부터 제거된다. 남아있는 서브라이브러리로부터 푸울 및/또는 개개의 클론을 COS 7 원숭이 세포에 형질 감염시키고 배양 상등액을 MCGF 및 TCGF활성에 대해 시험하여 IL-4 cDNA에 대해 스크리닝한다.

[A. IL-4 생성의 유도]

Cl. Lyl⁺2^-/9세포는 하기와 같이 Con A에 의해 IL-4 mRNA를 유도 생성시킨다. 세포를 4% 열-불활성화 태 송아지 혈청, 5×10^-5M 2-머캅토에탄올(2-ME), 2mM 글루타민, 비필수아미노산, 필수 비타민 및 2μg/㎖ Con A를 함유하는 5×10⁵/㎖의 둘베코 변형 이글스 배지(Dulbecco's Modified Eagles medium)(DME)에서 배양한다. 10% CO₂중 37℃에서 12 내지 24시간 동안 배양한 후, 세포 현탁액을 1500rpm에서 10분간 원심분리한다. 세포 펠렛을 수거하여 -70℃에서 즉시 냉동시킨다.

[B. mRNA의 분리]

전체세포의 DNA를 구아니딘 이소시아네이트 방법[참조 : Chirgwin, J. et al., Bichemistry 18 : 5294-5299페이지(1979)]를 사용하여 세포로부터 분리한다. Con A-유도 Cl. Lyl⁺2^-/9세로로부터 (자극 12시간후)의 냉동 세포 펠렛을 구아니딘 이소티오시아네이트 용해 용애중에 현탁시킨다. 20㎖의 용해 용액을 1.5×10⁸세포에 대해 사용한다. 펠렛을 피펫으로 취하여 재현탁시킨 다음 16게이지의 바늘을 사용하여 주사기를 통해 4회 통과시켜 DNA를 변형시킨다. 용해물을 40㎖의 폴리알로머 원심분리튜브중 20㎖의 5.7M CeCl, 10mM EDTA의 상단에 놓는다. 이 용액을 40시간 동안 15℃에서 Beckman SW 28회전기(Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA)로 25,000rpm에서 원심분리시킨다. DNA를 함유하는 구아니딘 이소티오시아네이트 상을 상단으로부터 경계면 아래에서 피펫으로 분리시킨다. 튜브의 벽 및 경계면을 2 내지 3㎖의 구아니딘 이소티오세아네이트 용액 용액으로 세척한다. 가위로 튜브의 경계면 아래를 절단하고, CsCl용액을 제거한다. RNA펠렛을 냉 70% 에탄오로 2회 세척한다. 그 다음 펠렛을 500μl의 10mM트리스 HCl pH 7.4 1mM EDTA, 0.05% SDS에 재현탁시킨다. 50μl의 3M 나트륨 아세테이트를 가하고, RAN를 1㎖에탄올로 침전시킨다. 원심분리하여 약 0.3mg의 전체 RNA를 수거하고 냉 에탄올로 1회 세척한다.

세척하고 건조시킨 전체 RNA 펠렛을 900μl의 올리고 (dT) 용출 완충액(100mM Tris·HCl, pH 7.4 1mM EDTA, 0.5% SDS) 중에 재현탁시킨다. RNA를 68℃에서 3분간 가열한 다음 얼음 상에서 냉각시킨다. 100μl의 5M NaCl을 가한다. RNA 시료를 결합 완충액(10mM Tris-HCl, pH 7.4, 1mM EDTA, 0.5M NaCl, 0.5% SDS)로 평형화시킨 1.0㎖의 올리고 (dT)셀룰로오즈 컬럼(타입 3, Colaborative Research, Waltham, MA)상에 적재한다.

컬럼에서의 유출물을 2회 이상 컬럼을 통과시킨다. 그 다음 컬럼을 20㎖의 결합 완충액으로 세척한다. 폴리 A+ mRNA를 용출 완충액으로 세척하여 수거한다. RNA는 처음 2㎖의 용출 완충액에 용출한다. 0.1용적의 3N 나트륨 아세테이트(pH 6)및 2용적의 에탄올로 RNA를 침전시킨다. 원심분리하여 RNA펠렛을 수거하고 냉에탄올로 2회 세척한 다음 건조시킨다. 이어서, 펠렛을 물에 재현탁시킨다. 분취량을 희석시키고 260nm에서 흡광도를 측정한다.

[C. pcD cDNA라이브러리의 작제]

1)백터 프라이머 및 올리고(dG)-테일 링커 DNA의 제조 오까야마 및 버그의 방법[참조 : Okayama 및 Berg, Mol. ＆ Cell. Biol. Vol 2, 161-170페이지(1982)]를 단지 최소한으로 변형하여 사용한다. pcDV1 및 pL 1플라스미드는 문헌[참조 : Okayama 및 Berg, Mol. ＆ Cell. Biol. 3 : 380-389페이지(1983)]에 기재되어 있으며, 파마시아(Piscataway, N. J)에서 시판하고 있다. 특히, Kpn I 부위의 앞에 Nsi I 부위를 함유하는 변형된 pcDV1플라스미드가 사용된다.

80μg의 pcDV1 DNA시료를 30℃에서 6mM Tris·HCl(pH 7.5), 6mM MgCl₂, 6mM NaCl, 6mM 2-ME, 및 ㎖당 0.1mg의 소의 혈청 알부민(BSA)를 함유하는 450μl의 반응혼합물중 20U의 Kpn I 엔도뉴클레아제로 분해한다. 16시간 후, 40μl의 0.25M EDTA(pH 8.0) 및 20μl의 10% 나트륨 도데실 설페이트(SDS)로 분해를 종결시키고 ; 물-포화 1 : 1 페놀-CHCl₃(페놀- CHCl₃로 후술함)으로 추출한 후 에탄올로 침전시켜 DNA를 회수한다. 각 말단에 평균 60, EKS 80이하의 데옥시티미딜레이트(dT)잔기를 갖는 단일중합체 테일을 다음과 같이 소위 흉선 종결 전이효소를 사용하여 Nsi I엔도튜클레아제-생성 말단에 가한다 : 반응 혼합물(38μl)은 1mM CoCl₂, 0.1mM 디티오트레이톨, 0.25mM dTTP, Nsi I엔도뉴클레아제-분해된 DNA 및 68U의 말단의 데옥시뉴클레오티딜 전이효소(P-L Biochemicals, Inc., Milwaukee, WI)과 함께 완충액으로서 나트륨 카코딜레이트-30mM Tris-HCl pH 6.8을 함유한다. 37℃에서 30분 후, 2μl의 0.25M EDTA(pH 8.0) 및 10μl의 10% SDS를 사용하여 반응을 정지시키고, 페놀-CHCl₃로 수회 추출한 후, 에탄올 침전에 의해 DNA를 회수한다.

이어서 10mM Tris·HCl pH 7.4, 10mM MgCl₂, 1mM 디티오트레이톨 및 0.1mg/㎖의 BSA를 함유하는 50μl의 용액중, 37℃에서 5시간 동안 15단위의 EcoRI엔도뉴클레아제로 분해한다. SV 40폴리아데닐화 부위 및 pBR 322 복제원 및 앰피실린-내성 유전자를 함유하는 큰 단편은 아가로즈(1%)겔 전기영동에 의해 정제하고 수정된 유리 분말법[참조 : Vogelstein, B. A. Gillespic D., Proc. Natl. Acad. Sci. 76 : 615-619페이지(1979)]에 의해 겔로부터 회수한다. dT-테일 DNA는 다음과 같이 울리고(dA)-셀룰로오즈 컬럼으로부터 흡수 및 용출시키 더 정제한다 : DNA를 1mM EDTA 및 1M NaCl을 함유하는 1㎖의 10mM Tris·HCl pH 7.3완충액에 용해시키고, 0℃에서 냉각시킨 다음, 0℃에서 상기 완충액으로 평형시킨 올리고(dA)-셀룰로오즈 컬럼(0.6×2.5cm)에서 적용시키고, 실온에서 물로 용출시킨다. 용출된 DNA를 에탄올로 침전시키고 1mM EDTA 와 함께 10mM Tris·HCl pH 7.3에 용해시킨다.

올리고(dG)-테일 연결된 DAN는 6mM 트리스 HCl pH 7.4, 6mM MgCl2, 6mM 2-ME, 50mM NaCl, 및 0.01mg/㎖의 BSA를 함유하는 450μl의 용액중에서 20단위의 pst I 엔도뉴클레아제를 사용하여 75μg의 pL 1 DNA를 분해시켜 제조한다. 30℃에서 16시간 후, 반응 혼합물을 페놀-CHCl₃로 추출하고 DNA를 알콜로 침전시킨다. 이어서 각 말단 당 10 내지 15 데옥시구아닐레이트(dG) 잔기의 테일을 0.1mM dGTP를 dTTP로 대체한 것을 제외하고는 전술한 바와 같은 반응 혼합물(38μι)중에서 46단위의 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소를 사용하여 가한다. 37℃에서 20분 후, 이 혼합물을 페놀-CHCl₃로 추출하고, DNA를 에탄올로 침전시킨 후, 37℃에서 4시간 동안 20mM Tris HCl pH 7.4, 7mM MgCl₂, 60mM NaCl 및 0.1mg의 BSA를 함유하는 50μl 혼합물 중에서 35단위의 Hind III 엔도뉴클레아제로 분해한다. 작은 올리고(dG)-테일 링커 DNA를 아가로즈 겔(1.8%)전기영동에 의해 정제하고 전술한 바와 같이 회수한다.

[2) cDNA라이브러리 제조:]

[단계 1 : cDNA합성]

반응 혼합물을 (10μl)은 50mM Tris·HCl pH 8.3, 8mM MgCl₂, 30mM KCl, 0.3mM 디티오트레이톨, 2mM씩의 dATP, dTTP, dGTP, 및 dCTP, 20μ Ci³²p-dCTP

(3000Ci/mmole), Con-A-유도-T-세포로부터의 3μg 폴리 A+ RNA, 60단위의 RNasin

(Promega Biotec, Inc, Madiso WI에서 제조한 리보뉴클레아제 억제제)및 2μg의 벡터-프라이머 DNA(15pmol의 프라이머 말단) 및 45단위의 역 전사효소를 함유한다.

반응물을 42℃에서 60분간 배양한 다음 1μl의 0.25M EDTA(pH 8.0) 및 0.5μl의 10% SDS를 가하여 정지시키고 ; 40μl의 페놀-CHCl₃를 가하고, 이 용액을 보르텍스(vortex)혼합기에서 격렬히 혼합시킨 다음 원심분리한다. 수성상에 40μl의 4M 암모늄 아세테이트 및 160μl의 에탄올을 가하고, 용액을 드라이아이스로 15분간 냉각시킨 다음 온화하게 진탕시키면서 실온까지 가온하여 냉각시 침전된 미반응 데옥시 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 용해시키고, 에펜도르프 마이크로퓨즈(Eppendorf microfuge)로 10분간 원심 분리한다. 펠레을 10μl의 10mM Tris·HCL 7.3 및 1mM EDTA에 용해시키고, 10μl의 4M 암모늄 아세테이트와 혼합함 다음 40μl의 에탄올로 재침전시키는데 , 이 방법으로 미반응 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트의 99% 이상이 제거된다. 펠렛을 에탄올로 세척한다.

[단계 2 : 올리고데옥시시티딜레이트[올리고(dC)]첨가]

플라스미드-cDNA : mRNA를 함유하는 펠렛을 1mM CoCl₂, 0.1mM 디티오트레이톨, 0.2μg의 폴리(A), 70μM dCTP, 5μ Ci의³²P-dCTP 3000Ci/mmole 및 60단위의 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소를 함유하는 20μl 의 140mM 나트륨 카코딜레이트-30mM Tris·HCl pH 68완충액에 용해시킨다.

반응은 37℃에서 5분간 수행하여, 각 말단에 10 내지 15개 잔기의 dCMP를 첨가시킨 다음 2μl 의 0.25M EDTA(pH 8.0) 및 1μl의 10% SDS로 종결시킨다. 20μl의 페놀-CHCl₃으로 추출한 후, 수성상을 20μl의 4M 암모늄 아세테이트와 혼합하고, DNA를 80μι의 에탄올로 침전 및 재침전시키고, 최종 펠렛을 에탄올로 세척한다.

[단계 3 : Hind III 엔도뉴클레아아제 분해]

펠렛을 20mM Tris·HCl pH 7.4 7mM MgCl₂, 60mM NaCl 및 0.1mg/㎖ 의 BSA를 함유하는 30μl의 완충액에 용해시킨 다음 10단위의 Hind III 엔도뉴클레아제로 2시간 동안 37℃에서 분해한다. 반응은 30μl의 0.25M EDTA(pH 8.0) 및 1.5μl의 10% SDS로 종결시키고, 3μl의 4M 암모늄 아세테이트를 가하고 페놀-CHCl₃로 추출한 후, 120μl의 에탄올로 DNA를 침전시킨다. 펠렛을 에탄올로 세척하고, 10μl의 10mM 트리스 HCl(pH 7.3) 및 1mM EDTA중에 용해시킨 다음, 3μl의 에탄올을 가하여 -20℃에서 저장시 냉각을 방지한다.

[단계 4 : 올리고(dG)-데일 링커 DNA에 의해 중재된 환형화]

9μl의 시료 Hind III엔도뉴클레아제-분해된 올리고 (dC)-테일 cDNA : mRNA플라스미드(약 90%의 시료)를 10mM Tris·HCl pH 7.5, 1mm EDTA , 0.1M NaCl 및 1.8pmol의 올리고(dG)-테일 링커 DNA를 함유하는 혼합물(90μl)중, 65℃에서 5분간 배양한 다음, 60분간 42℃로 옮기고 0℃로 냉각시킨다. 혼합물(90μl)을 20mM Tris·HCl pH 7.5, 4mM MgCl₂, 10mM(NH₄)₂SO₄, 0.1M KCL, 50μg/㎖의 BSA 및 0.1mMβ-NAD를 함유하는 900μl의 용적으로 조절하고 ; 6μg의 이, 콜라이 DNA 리가제를 가한 다음 이 용액을 12℃에서 밤새 배양한다.

[단계 5: RNA 본쇄를 DNA로 대체]

삽입물의 RNA 본쇄를 치환하기 위하여, 연결 혼합물을 각 40μM의 네가지 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트, 0.15mM β-NAD, 4μg의 추가의 이.콜라이 DNA 라가제, 16단위의 이.콜라이 DNA 폴리머라제 I(Pol I)및 9단위의 이.콜라이 R Nase H을 함유하도록 조절한다. 이 혼합물(960μl)을 12℃ 및 실온에서 각각 1시간 동안 연속적을 배양하여 적절한 복구 합성 및 Pol I에 의한 니크 해독을 촉진시킨다.

[단계 6 : 이.콜라이의 형질전환]

하기 문헌에 기술된 방법의 최소 변형 방법에 의해 형질전환을 수행한다[참조 : Cohen et al , Proc. Nat. Acad .Sci. U.S.A. 69 : 2110-2114페이지(1972)]. 이.콜라이 K-12군주 MC 1061 [참조 : Casedaban, M. 및 Cohen, S., J.Mol.Bion., 138 : 179-207(1980)]을 300㎖의 L-육즙중, 37℃에서 0.5 흡광단위 (600nm에서)까지 배양시킨다. 원심분리하여 세포를 수거하고 30㎖의 10mM Pipes(pH 7), 60mM CaCl₂, 15% 글리세롤에 현탁시키고, 0℃에서 5분간 원심분리한다. 세포를 24㎖의 상기 완충액의 재현탁시키고 0 ℃에서 5분간 다시 배양한 다음 ; 분취량 1.0㎖의 세포 현탁액을 0.1㎖의 DNA 용액(단계 5)와 혼합하고 0℃에서 20분간 배양한다. 이어서, 이 세포를 42℃에서 2분간 유지시킨 후 10분간 실온에서 유지시키고 : 1ι의 L-육즙을 가한 다음 배양물을 37℃에서 60분간 배양시킨다. 엠피실린을 50μg/㎖ 농도까지 가한다. 배양물을 37℃에서 추가로 10시간 동안 진탕시킨다. 상기 배양물의 희석액을 50μg/㎖ 앰피신린을 함유하는 L-육즙 아가상에 도말한다. 37℃에서 12 내지 24시간 동안 배양한 후 개개의 콜로니를 멸균 이쑤기개로 취한다. 대체로 1×10⁵개의 의존적 cDNA 클론이 생성된다.

[D. pcD라이브러리의 스크리닝]

10⁴단일 클론을 T-세포 cDNA 라이브러리로부터 무작위로 취하여 50μg/㎖의 앰피실린 및 7%의 디메틸 설폭사이드를 함유하는 200μl의 L-육즙을 함유하는 미소역가 접시의 웰에서 각각 증식시킨다. 신규의 MCGF 활성물만을 모으기 위해, 53개의 IL-3 cDNA 클론 및 1개의 GM-CSFcDNA 클론을 문헌[참조 : Lee et al., Proc. Natl. Acad, SCi., Vol. 82, 4360-4364페이지(1985) 및 Yokoda et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 81, 1070-1074페이지(1984)]의 클론으로부터 작제된 적절한³²P-표지된 cDNA프로브로 하이브리드화시켜 동정한 다음, 제거한다. 상기의 방법은 다음과 같이 수행한다 : 96개의 배양물의 각 평판 배지를 하이브리드화 스크리닝을 위해 니트로셀룰로오즈 필터상에 복제시킨다. 하이브리드화는 6×SSPE(1×SSPE=180mM NaCl ; 10mM 인산나트륨, pH 7.4 ; 1mm EDTA), 0.1% SDS, 100μg/ ㎖ 이. 콜라이 tRNA, 50% 포름아미드중, 42℃에서 16시간 동안 수행한다. 하이브리드화 클론을 세척된 필터의 오오토라디오 그라피에 의해 동정한다. 이들 클론은 클론 푸울을 제조하기 전에 에탄올을 사용하여 이들 클론을 함유하는 미소역가 웰을 멸균하여 제거한다. 48개 이하의 DNA 클론을 함유하는 푸울을 미소역가 배양물로부터 제조한다. 이러한 푸울 200개를 100μg/㎖의 앰피실린을 함유하는 1ι의 L-육즙 배양물중에서 성장시킨다. 플리스미드 DNA를 각 배양물로부터 분리하고 CsCl 구배를 통해 2개의 밴딩으로써 정제한다. DNA 함유하는 각 푸울을 다음과 같이 COS 7원숭이 세포에 형질감염시킨다(COS 7 세포는 문헌[참조 : Gluzman, in Cell, Vol. 23, 175-180페이지(1981)]에 기재되었으며, ATCC CRL 1651로 기탁되었음).

형질감염시키기 1일전에, 약 10⁶COS 7 원숭이 세포를 10% 태 송아지 혈청 및 2mM 글루타민을 함유하는 DME중 각각 10mm평판상에 씨딩한다. 형질감염시키기 위해, 배지를 각 평판으로부터 흡입하여 50mM Tris·HCl, pH 7.4 , 400μg/㎖ DEAE-덱스트란 및 50μg의 시험할 플라스미드 DNA를 함유하는 4㎖의 DNA와 대체시킨다. 평판을 37℃에서 4시간 동안 배양하고, DNA-함유 배지를 제거한 다음 평판을 5㎖의 무혈청 DME로 2회 세척한다. 150μM 클로로퀴논을 함유하는 DME를 평판에 가한 다음, 37℃에서 3시간 더 배양한다. 평판배지를 DME로 1회 세척한 다음, 4% 태 송아지 혈청, 2mM 글루타민, 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유하는 DME를 가한다. 이어서, 세포를 37℃에서 72시간 동안 배양한다. 성장 배지를 수거하여 여러가지 생물검정으로 평가한다.

초기의 플라스미드 푸울 세트를, 각각 HT-2세포주(하기에 자세히 설명함) 및 MC/9 세포주를 갖는 TCGF 및 MCGF 활성에 대해 증식 검정법을 이용하여 일차적으로 스크리닝한다. 이들 두가지 세포주에 대해 검정한 처음 110개의 푸울중 8개에서 HT-2 TCGF 검정에서 상당한 활성이 나타났다. 이들 푸울중 몇개는 상당한 MCGF 활성을 가지나, MCGF 활성은 일반적으로 약하고 변하기 쉬우므로 양성 푸울을 확인하기 위해서는 상기 검정법에 의존하지 않는다.

무작위 푸울 형질감염으로부터의 COS 상등액중 약 절반은 마우스 B세포에 대한 Ia-유도활성에 대해 검정한다. 시험한 푸울중, TCGF 활성에 대해 활성으로 나타난 각 푸울은 또한 Ia-유도활성을 갖는 것으로 나타났다. 즉, TCGF 활성과 Ia-유도활성 사이에는 완벽한 상관관계가 성립한다.

모든 검정에서 가장 활성인 하나의 푸울인 2A를 48개의 보다 작은 서브푸울로 세분한다. 두개의 서브푸울은 MCGF 및 TCGF 활성에 대해 양성으로 나타났다. 상기 두개의 서브 푸울에 공통적인 단일 클론 2A-E3를 각각 성장시킨 다음 이의 플라스미드 DNA를 전술한 바와 같이 COS 7 세포에 형질감염시킨다. 생성되는 COS 상등액을 MCGF, TCGF, Ia-유도 및 IgE-및 IgG-증강활성을 포함한 여러가지 활성의 존재여부에 대해 시험한다.

클론 2A-E3(제 1a 도)으로부터 분리하고,³²P로 표지한 366개의 염기쌍의 긴 Pst I단편을 브로브로서 사용하여 생물학적 활성에 대해 양성인 푸울 및 다른 미시험 푸울을 스트리닝한다. 스크리닝은 전술한 바와 같이 미소역가 배양물로 복제된 필터에 하이브리드화하여 수행한다. 9개의 하이브리드화 클론을 분리하고, 제한 지도작성으로 이의 DNA를 분석한다. 생물학적 활성을 나타내는 모든 푸울은 공통의 제한 절단지도를 클론 2A-E3과 공유하는 적어도 하나의 하이브리드화 클론을 함유한다. 선택한 10⁴중 하이브리드와 클론의 빈도는 전체 라이브러리중 약 0.2%의 빈도이다. 시험할 하이브리드화 클론중 약 90%는 작용성 단백질을 발현한다.

[E. pcD-2A-E3로 형질감염된 COS 7원숭이 세포의 배양 상등액의 생물학적 활성]

pcD-2A-E3으로 형질감염된 COS 7 세포의 상등액을 주의 헬퍼 T세포주 HT-2[참조 : Watson, J. Exp, Med., Vol. 150, 1510페이지(1979)]상에서 TCGF활성에 대해 시험한다. Mosmann의 비색 검정법(전술함)에 의해 측정한 바와같이 HT-2 세로의 증식을 TCGF활성을 측정하는데 사용한다(증식정도는 570 내지 630nm에서의 흡광도(OD)와 상관관계를 갖는다). 제 3a 도는 (i) pcD-2A-E3으로 형질감염된 COS 7세포의 상등액(곡선 1), (ii) Cl. Ly1⁺2^-/9 배양물의 상등액(곡선 2), (iii) IL-2 cDNA를 갖는 pcD 플라스미드로 형질감염된 COS 7세포의 상등액(곡선 3)및 (iv) cDNA 삽입물을 함유허지 않는 pcD 플라스미드로 형질감염된(즉 , "모의" 형질감염) COS 7세포의 상등액(곡선 4)의 여러가지 희석액에서의 상대적인 TCGF 활성을 나타낸다.

유사하게, pcD-2A-E3 형질감염된 COS 7 세포 상등액을 다시 MC/9 증식을 측정하기 위한 모스만의 비색 검정법을 이용하여, MC/9 세포상에서 MCGF 활성에 대해 시험한다 : 제 3b 도는 (i) pcD-2A-E3으로 형질감염된 COS 7세포의 상등액(곡선 1), (ii) IL-3 cDNA를 갖는 pcD 플라스미드로 형질감염된 COS 7세포의 상등액(곡선 2) ; (iii) Cl. Ly1⁺2^-/9 배양물의 상등액(곡선 3) 및 (iv) 모의 형질감염된 COS 7 세포의 상등액(곡선 4)의 상대적인 MCGF 활성을 나타낸다.

제 3c 도는 (i) pcD-2A-E3으로 형질감염된 COS 7세포의 상등액(곡선 1), (ii) Cl. Ly1⁺2^-/9 배양물의 상등액(곡선 2)및 모의 형질감염된 COS 7세포의 상등액상에서 수행하는 Ia 유도 검정의 결과를 나타낸 것이다. Ia-유도 검정은 전술한 Roehm 등의 방법에 따라 수행한다. 여러마리의 DBA/2 마우스 (2 내지 3개월)을 죽여 비장을 적출한다. 0.87% 염화암모늄을 사용한 저장쇼크로 적혈구를 용해시킨다. 이어서, T- 세포 특이적 표면 표지물(Thy-1, Lyt-1 및 Lyt-2)에 대해 지시된 세포 독성 모노클로날 항체를 사용한 다음 토끼 보체중에서 배양하여 T-세포를 용해시킨다. 이어서 피콜-히페이그 밀도 구배로 죽은 세포를 제거한다. 플라스틱 페트리 접시에 37℃에서 접착시켜 접착세포를 미리 제거한다. 이때 세포를 세척하고 계수하여 생존력을 기록한다. 약 1백만개의 세포를 10% 태 송아지 혈청, 2-머캅토에탄올, 및 여러 항생물질(페니실린, 스트렙토마이신 및 젠타마이신)을 보충시킨 0.5㎖의 조직 배양 배지(RPMI 1640 또는 최소 필수 배지-MEM/Earle's 염)(Gibco)내에서 배양시킨다. T-세포의 상등액으로 이루어진 양성 대조군이 T-세포 유사분열물질 콘카나발린 A로 유도되는 실험에서 10mg/㎖(최종 농도)의 α-메틸-만노사이드를 가하여 유사분열 물질을 중화시킨다. 24시간 배양시킨 후, 세포를 수거하여 항-I-A^d또는 항-I-A^bd모노클로날 항체로 염색한다. 이러한 항체를 합텐 N. I. P. 또는 바이오틴에 접합된 제일단계 항체로 사용한다. 이어서, 세포를 형광화 제 2 단계 시약(항 NIP 항체 또는 아비딘)과 함께 배양시켜 완전히 염색시킨다. 이어서, 형광-활성화된 세포분류기(Becton-Dickinson, Mountain View, MA] 또는 Cytofluorograph

(Ortho Diagnostics, cambridge, MA)를 사용하여 형광염색의 강도를 측정한다. 제 3c 도의 형광단위는 각 시료중의 양성세포의 퍼센트와 형광염색의 강도를 곱하여 계산한다.

제 3d 도는 (i) COS 7 배지 단독(막대 1), (ii) 모의 형질 감염된 COS 7 세포의 20% 상등액(막대 2), (iii) Cl. Lyl⁺2^-/9 세포의 10% 상등액+모의 형질감염된 COS 7세포의 20% 상등액(막대 3), 및 pcD-2A-E3-형질감염된 COS 7 세포의 20%상등액(막대 4)에 의해 T-세포-결핍된 마우스 비장세포에서 유도된 IgE 및 IgG1, 생성정도를 그라프로 나타낸 것이다. IgE 및 IgG1의 수준은 전술한 이소타입-특이적 ELISA에 의해 측정한다.

쥐의 L-4는 MC/9 세포에서 MCGF 활성을 증진시키는 것으로 나타났다[참조 : Smith 및 Rennick, Proc. Natl. Acad, Sci., Vol. 1857-1861페이지(1986)]. 쥐의 il-4는 또한 il-3의존적 세포주 nfs-60의 gm-csf-자극된 증식을 증가시키는 것으로 나타났다[참조 : Holmes et al., Proc. Natl. Acad, Sci. Vol. 82, 6687-6691페이지(1985)].

[F. pCD-2A-E3의 구조 및 이의 cDNA 삽입물의 뉴클레오타이드 서열]

pCD-2A-E3의 구조는 제 2a 도에 도식적으로 나타나있으며, 이의 삽입물의 연장된 제한지도는 제 2b 도에 나타나있다. 삽입물은 문헌[참조 : Maxam 및 Gilbert, Methods in Enzymology, Vol. 65, 499-650 페이지(1980)] 기술된 막삼 및 길버트의 방법 및 문헌[참조 : Sanger, Proc. Natl. Acad. Sci, Vol 74, 5463-5467페이지(1977)]에 기술된 상기의 방법을 사용하여 서열화하였다. 서열은 처음 ATG 출발 코돈을 갖는 가장 긴 개발 판독 프레임에 대해 추정의 아미노산 서열과 함께 제 1a 도에 나타내었다. 마우스 2A-E3 cDNA클론에서 긴 단일 개방 프레임은 140개의 아미노산 잔기로 구성된다. 림포카인이 분비되는 단백질이므로, 소수성 리이더 서열은 분비되는 성숙 단백질의 서열을 선행할 것으로 예측된다. 폴리 펩타이드의 소수성 분석 및 시그널 펩타이들 프로세싱시키는 제안된 컨센서스 서열과의 비교[참조 : Perlman et al al., J. Mol. Biol., Vol. 167, 391-409페이지(1983)]는, 전구체 폴리펩타이드의 절단이 제 1a 도의 20번째 아미노산의 Ser 잔기 다음에서 일어나는 것을 제시한다. 분비되는 쥐의 IL-4의 N-말단 서열이 제 1a 도의 21위치 His에서 시작됨을 확인하였다[참조 : Grabstein et al., J. Exp . Med., Vol. 163, 1405-141페이지(1986)].

[실시예 II]

[사람 헬퍼 T 세포 cDNA 라이브러리에 쥐의 cDNA 프로브를 통해 사람의 IL-4의 제조 및 COS 7 원숭이 세포 및 마우스 L-세포에서 일시적인 발현]

IL-4를 코드화하는 cDNA 클론은 쥐의 cDNA 프로브를 사용하여, 유도된 사람의 헬퍼 T 세포, 2F1 및 유도된 사람의 말초혈 임파구(PBL)로부터 작제된 cDNA 라이브로리로부터 분리시킨다. BDGF 활성을 생성하는 공지의 다른 사람 세포주는 CEM주의 변이체(ATCC CCL 119, CRL 8436 및 TIB 195 ; Foley et al., Cancer, Vol. 18, 522-529페이지(1965) 및 Ligler, Lymphokin Research, Vol, 3, 183-191페이지(1984)에 기재되어 있음를 포함한다.

사람 헬퍼 T-세포주, 2F1, 및 사람 PBL은 3% 태 송아지 혈청을 보충시킨 이스코브 배지에서 성장시킨다. 2F1 세포를 ConA(10μg/㎖)로 활성화시키고 PBLs를 1μg/㎖의 PNA로 12시간 동안 자극한 후, 5μg/㎖의 ConA를 가한다. ConA를 가한후 4시간(2F1)또는 10시간(PBL)후에 세포를 수거한다.

mRNA 추출 및 cDNA 라이브러리의 작제는 실시예 1 에서 기재한 바와같이 수행한다. Pst I단편을 마우스 PcD-2A-3E cDNA 클론으로부터 분리하고, 니크 해독(1×10⁸cpm/μg)으로 표지한 다음, 각각 약1×10³클론의 2F1 cDNA 라이브러리를 나타내는 10개의 푸울로부터 플라스미드 DNA 제제를 함유하는 니트로셀룰로오즈 필터를 탐지하는데 사용한다. 덜 엄격한 하이브리드화 조건(42℃에서 밤새)을 사용한다 : 6×SSPE(1×SSPE=180mM NaCl/10mM 인산 나트륨, pH 7.4/1mM EDTA)[참조 : Maniatis, T.et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y., 1982)], 20%(vol/vol)포름아미드, 0.1% 나트륨 도세실 설페이트, 효모 담체 tRNA 100μl, 필터를 2×SSPE, 0.1%나트륨 도데실 설페이트로 37℃에서 세척한다.

단일 클론(pcD-46)이 열개의 푸울중 하나에서 확인되었다. 추가의 클론은 pcD-46의 Nhel-EcoRI 단편으로부터 작제된 프로브로 PBL cDNA 라이브러리를 스크리닝하여 수득한다.(제 2d 도의 제한지도에 나타냄), 제한효소에 의한 분석은 PBL 클론이 구조적으로 pcD-46과 동일함을 나타낸다.

pcD-46의 코드화영역 삽입물로부터 5'에 또는 상부의 구아디닌-풍부영역이 IL-4폴리펩타이드의 발현을 억제험이 밝혀졌다. 따라서, pcD-46의 삽입물재클론화하여 구아니딘-풍부영역을 제거한다. 생성된 클론을 pcD-125로 명명한다. 또한, 발현이 pcD-46로 마우스 L-세포를 형질감염시킴으로써 향상됨이 밝혀졌다.

벡터 pcD-25는 다음과 같이 형성된다 : pcD-46을 Sau 3A로 절단하여 cDNA 삽입물(GC 단편이 제거됨)의 5' 162개 뉴클레오 타이드를 함유하는 단편을 분리한 다음, 이 단편을 p101d㎖ Bg1 II부위에 삽입한다. 플라스미드 p101은 pcD-마우스 IL-3으로부터 유래하며[참조 : Yokota et al., (1984) 전술], cDNA의 5'말단의 Pst I부위로부터 마우스 IL-3 cDNA의 Bg1 II부위까지의 서열을 결실시킨다. Bg1 II는 부위는 결실된 서열의 연결부에 포함된다. Sau 3A 단편을 pcD-46에서와 같이 SV 40프로모터에 융합시킨다(GC 단편은 예외임). 나머지 사람 cDNA를 cDNA의 3' 말단, SV 40폴리-A 부위 및 pcD-46의 모든 pBR 322서열을 갖는 pcD-46으로부터의 HindIII/Nhe I 단편과 제작제 한다.

pcD-46-및 pcD-125- 형질감염된 COS 7 및 L 세포의 상등액을 BCGF 및 TCGF 활성에 대해 시험한다. TCGF는 Epstein-Barr 바이러스로 형질전화된 사람 헬퍼 T세포주 JL-EBV 및 식물성 혈구 응집소-자극된 사람 말초 혈 임파구로 시험한다.

사람 헬퍼 T-세포 클론 JL-EBV를 사람 EBV-형질전환된 B-세포주의 조사된(4500R)세포로 자극하고, 이어서 10% 사람 AB 혈청, 500μM 2-머캅토에탄올(2ME) 및 제조합 사람 IL-2를 함유하는 RPMI 1640 배지에 유지시킨다. 사람 PBL을 PHA(20μg/㎖)로 자극하고, 10% 태 송아지 혈청, 50μM 2ME 및 재조합 사람 IL-2를 함유하는 RPMI 1640에 유지시킨다. 자극을 가한지 5 내지 10일 후, JL-EBV 세포 또는 PHA 아세포를 전술한 Mosmann 비색법을 사용하는 2-일 TCGF 검정, 또는³H]티미딘 삽입을 이용하는 3-일 TCGF 검정에서 표적으로 사용한다.

제 4a 도는 (i) 의 사람의 IL-2를 발현하는 pcD플라스미드로 형질감염된 COS 7 세포의 상등액(곡선 A), (ii) pcD-125로 형질 감염된 L 세포의 상등액(곡선 B), (iii) pc D℃-125로 형질감염된 COS 7 세포의 상등액(곡선 C), (iv) pcD-46으로 형질감염된 COS 7세포의 상등액(곡선 D), 및 (v)모의 형질감염된 COS 7세포의 상등액(곡선 E)의 JL-EVB 세포(비색 검정법)에 의해 측정된 TCGF 활성을 나타낸다. 제 4B 도는 (i) 사람의 IL-2를 발현하는 pcD 플라스미드로 형질감염된 COS 7 세포의 상등액(곡선 A), (ii) pcD-125로 형질감염된 COS 7 세포의 상등액(곡선 B), 및 (iii) 모의 형질감염된 COS 7의 세포의 상등액(곡선 C)의 PHA-자극된 PBL 에 의해 측정된(비색 시험법) TCGF 활성을 나타낸다. 제 4c 도는 (i) pcD-125로 형질감염된 COS 7세포의 상등액(곡선 A), (ii) 사람의 IL-2를 발현하는 pcD 플라스미드로 형질감염된 COS 7 세포의 상등액(곡선 B) 및 (iii)모의 형질감염된 COS 7세포의 상등액(곡선 C)의 PHA-자극된 PBL에 의해 측정된(삼중수소처리된 티미딘 삽입검정법) TCGF 활성을 나타낸다.

pcD-125형질감염 상등액의 여러 희석액의 BDGF활성을 문헌에 기재된 BCGF의 BCGF 활성("시판되는 BCGF")과 비교 하였다[참조 : Maizel et al., Proc. Natl. Aca. Sci. Vol. 79, 5998-6002페이지(1982), Cytokine Techmology International(Buffalo, NY)에서 시판됨]. 표 II는 항-IgM 항체 예비(pre) 활성화된 B세포에 대한 COS 7 형질감염 상등액의 여러 희석액의 BCGF 활성을 나타낸 것이다. B세포는 전술한 검정 단락에서 기재된 바와같이 제조한다.

[표 II]

[항-IgM-예비(pre)활성화된 B세포에 대한 IL-4cDNA 형질감염 상등액의 효과]

표 III은 SAC-예비활성화된 B 세포(전술한 바와같이 제조)에 대한 COS 7 형질감염 상등액의 여러 희석액의 BCGF 활성을 나타낸 것이다.

[표 III]

[SAC-예비활성화된 B세포에 대한 IL-4 cDNA 형질감염 상등액의 활성]

본 발명의 사람 IL-4 및 시판되는 BCGF 는 모두 BCGF 활성을 나타내나[참조 : Mebta et al, J. Immunol. Vol, 135, 3298-3302페이지(1985)], 상기의 TCGF활성은 시판되는 BCGF 의 BCGF 활성과 생화학적으로 구별될 수 있으므로 상기 활성이 별도의 분자에 의해 야기된다는 것이 입증되었다. 즉, 사람 IL-4 및 시판되는 BCGF는 다른 분자인데, 왜냐하면 TCGF 활성은 표준 생화학적 분획법을 사용하여 사람 IL-4에서의 BCGF 활성과 분리할 수 없기 때문이다.

사람의 IL-4 cDNA를 갖는 플라스미드로 형질감염된 COS 7 세포의 상등액은정상인 T 세포 및 사람 T-세포 클론 JL-EBV의 증식을 유도하며, 이의 활성은 마우스의 IL-4와 유사하다. 그러나, 사람 IL-4에 반응하여 유도된 사람 T세포의 증식의 최대 크기는 사람 IL-2에 의해 유도된 약 절반이다. IL-4의 증식-유도 활성은 IL-2 또는 시험될때 IL-2 수용체에 대한 모노 클로날 항체에 의해 억제될 수 없었다. 이러한 결과는 IL-4가 T-세포에 대해 직접적으로 작용하며 IL-2의 유도에 의한 방법이 아니고, 이의 활성은 IL-2의 수용체에 의해 조정되지 않음을 시사한다. COS-사람 IL-4 상등액은 또한 비이드에 커플링된 항-IgM 항체의 최적 농도로 미리활성화된 사람 B세포의 증식을 자극하며, BCGF 검정의 포화 수준에서 시판되는 BCGF 와 함께 추가의 증식능력을 갖는다. 이는 사람 IL-4 및 시판되는 BCGF 가 다른 경로 즉, 아마도 다른 종류의 수용체에 의해 B 세포상에 작용함을 시사한다. 상등액은 SAC로 미리활성화된 B세포의 증식을 상당히 유도하지 않으나, PHA로 자극된 PBL 배양물의 상등액으로부터 정제한 시판되는 BCGF 는 SAC-미리활성화된 사람 B세포의 증식을 강하게 유도시킨다. 상기의 결과는 사람 IL-4 cDNA가 시판되는 BCGF 에 존재하는 것과는 다른 BCGF 활성을 코드화함을 추가로 나타낸다.

pcD-125-형질감염된 COS 7세포의 상등액을 편도선의 B 세포상의 Fc-ε수용체를 유도시키는 능력에 대해서도 시험 한다. 사람의 편도선 세포를 표준 방법을 사용하여 단일세포 현탁액으로 분산시킨다. B 세포 집단을 전술한 방법을 사용하여 증가시키고, 증가된 세포를 항-IgM 항체를 사용하여 24시간 동안 37℃의 배양 배지에서 자극한다. Fc-ε수용체-함유 세포를 문헌의 방법에 따라 수용체에 대해 특이적인 형광 표지한 모노클로날 항체를 사용하여 Becton Dickinson FACS IV 세포 분류기로 검정한다[참조 : Bonnefoy et al., J. Jmmunol. Meth., Vol. 88, 25-32페이지(1986)]. 제 5a 도는 세포 빈도(종축)대 형광강도(횡축)을 나타내는 그라프이다. 형광강도는 세포에 존재하는 Fc-ε 수용체의 수에 비례한다. 모든 도면에서, 세포는 항-IgM으로 자극하였다. 제 5a내지 5d 도는 pcD-125형질감염된COS 7세포의 0%, 0.1%, 10%상등액으로 이루어지는 배지에 노출시킨 것에 상응한다.

46번 클론의 cDNA 삽입물의 DNA 서열을 결정하여 제 1b 도에 나타내었다. cDNA 삽입물은 폴리(A)테일을 제외한 615bp 길이이다. 뉴클레오타이드 위치 523 내지 525에 종결 코돈 TAG 로 종결되는 153 코돈에 의해 이어지는 5'말단으로부터 64개 뉴클레오타이드에 위치된 최초 ATG 코돈을 갖는 단일 개방 판독 프레임에 존재한다. 예측한 폴리펩타이드의 N-말단의 단편은 분비되는 단백질에서 예측되는 바와같이 소수성이다.

본 발명의 사람 및 마우스 cDNA의 코드화 영역의 비교는 1 내지 90 및 129 내지 149 아미노산 위치로 커버되는 pcD-46내의 사람 pcD 코드화 서열의 영역이 마우스 cDNA(2A-E3)코드화 서열의 상응하는 영역과 약 50%의 동종성을 가짐을 보였다. 상기 영역 및 5' 및 3' 비해독 영역은 다른 종으로부터 두개의 cDNA 서열 사이에 약 70%의 동종성을 갖는 반면, 사람 단백질의 91 내지 128 아미노산에 의해 커버되는 영역은 상응하는 마우스 영역과 매우 한정된 동종성을 갖는다. 대체로, 사람 단백질내의 7개의 시스템인 잔기중 6개는 관련된 마우스 단백질에서 보존된다. 약간의 아미노산 서열 동종성이 본 발명의 천연형 사람 폴리펩타이드와 마우스 IL-3사이에 존재한다. 아미노산 잔기 7 내지 16 및 120 내지 127은 마우스 IL-3전구체 폴리 펩타이드의 잔기 16 내지 27 및 41 내지 49와 각각 50% 및 55% 동종성을 갖는다[참조 : Yokota, t. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81 : 1070-1074페이지(1984)].

더욱 자세히 후술할 것이나, pcD-125-형질감염된 COS 7 상등액에서 정제한 사람의 IL-4는 제 1c 도에 나타탠 서열을 갖는 129개 아미노산 폴리펩타이드임이 밝혀졌다.

[실시예 III]

[RSV-LTR 프로모터를 함유하는 Epstein-Barr바이러스(EBV)-유래된 벡터 사용에 COS 7원숭이 세포에서 사람 IL-4의 향상된 발현]

Rous 육종 바이러스의 긴-말단의 반복(RSV-LTR)프로모터를 함유하는 EBV- 유래된 백터내로 pcD-125의 Xho I 단편을 재클로닝시켜 사람 IL-4 발현을 10 내지 20배 향상시킨다. EBV-유래 벡터 및 RSV-LTR 프로모터는 문헌에 기재되어 있다[참조 : Gorman, et al., Proc. Nat. Acad, Sci., Vol. 79, 6777-6781페이지(1982) ; Yates et al., Nature, Vol. 313, 812-815페이지(1985)].

RSV-LTR 프로모터를 함유하는 HindIII/Xho I 단편을 전술한 Gorman 등에 의해 기술된 Acc I/Hind III 단편을 함유하는 RSV-LTR로 부터 미리 작제된 pcD 플라스미드 및 시판되는 pcD 벡터(예, Pharmacia)로부터 분리한다. 상기의 HindIII/Xho 단편 및 SV 40 복제기원(ori)를 함유하는 pL1 플라스미드(Pharmacia)로부터의 HindIII/Xho I 단편을 플라스미드 pcDV1(Pharmacia에서 시판됨)에 스플라이싱하는데, SV40 ori 영역의 배향은 중요하지 않다. Aat II 부위 및 Nde I부위 사이에, 생성된 pcD 벡터는 (Aat II 부위로부터의)서열에 SV40 ori 영역, RSV-LTR 프로모터 및 SV40 폴리 A 영역을 함유한다. pcD-125의 Xho I단편을 분리하고 새로이 작제된 pcD 벡터의 Xho I 부위에 삽입한 후, 벡터상의 유링한 Aat II 및 Nde I 부위를 표준 방법으로 Sa1 I 부위로 전환시킨다. 간단히, pcD 벡터를 Aat II 및 Nde I으로 분해하고, IL-4 함유 단편을 분리한 다음 분리된 단편을 적절한 농도의 뉴클레오사이드 트리포스페이트 존재하에 T4 DNA 폴리머라제로 처리한다. T4 DNA 폴리머라제의 5'→3' DNA 폴리머라제 활성은 제한 절단물의 5' 돌출말단에 채우고, T₄DNA 폴리머라제의 3'→5'엔도뉴클레아제 활성은 제한 절단물 의 3'돌출말단을 분해하여 평활말단 단편을 생성시켜 여기에 카나제 처리된 Sal I 링커(New England Biolabs)에 T4 DNA 리가제를 사용하여 연결시킨다.

상기 Sal I 단편(제 11 도에 설명됨)을 유일한 Cla I 부위의 위치에 상기 Yates 등에 의해 기재된 RBV-유래 벡터 p201에 삽입시키고, 표준기법을 사용하여 Sal I 부위로 전환시킨다. 간단히, p201(제 11 도에 설명됨)을 Cla I으로 분해하고 DNA 폴리머라제 I(클레노우 단편) 및 적절한 농도의 뉴클레오사이드 트리포스페이트로 처리한다. 이 방법으로 ClA I 절단물의 돌출 말단에 채워 평활말단 단편을 생성시킨다. 이어서, 평활말단을 키나제 처리된 Sal I 링커에 연결시킨다. RSV-LTR 프로모터 및 사람 IL-4 cDNA 삽입물을 함유하는 생성된 EBV- 유래 벡터를 본 명세서에는 pEBV-178로 나타낸다.

pEBV-178을 표준방법으로 COS 7 세포에 형질감염키고, 배양 상등액을 IL-4발현을 측정함으로써 TCGF 활성에 대해 시험한다.

[실시예 IV]

[이.콜라이에서 천연의 사람 IL-4 및 뮤테인 IS⁰(Ala-Glu-Phe)의 발현]

사람의 IL-4 cDNA 삽입물을 함유하는 두가지 벡터를 이.콜라이내에서 사람의 IL-4을 발현하도록 작제한다 : ompA 단백질의 시그널 펩타이드 서열을 함유하는 pIN-III 분리벡터("PIN-III-ompA2"), 및 trp P 프로모터와 인접한 리보좀 결합부위(RBS) 영역을 함유하는 puC12 플라스미드("TRPC 11")

[A. pIN-III-ompA2]

두 벡터를 pIN-III-ompA2 플라스미드를 사용하여 작제한다[참조 : Ghrayevb et al., EMBO Jpournal, Vol. 3, 2437-2442페이지(1984) 및 Masui et al., Biotechnolog

y Vol. 2, 81-85페이지(1984)].

pIN-III-ompA2(1)로 나타낸 첫번째 벡터는 EcoR I/BamH I-분해된 pIN-III-ompA2 플라스미드, 합성링커 및 pcD-125의 BamH I/EcoRV 단편을 연속적으로 연결시켜 작제한다. 상기 작제에 사용된 합성 링커는 세가지의 추가의 N-말단의 아미노산 Ala-Glu-Phe-를 갖는 생물학적으로 활성인 IL-4 폴리펩타이드를 분비시킨다 : 즉, 뮤테인 IL⁰(Ala-Glu-Phe)가 분비된다. 합성 링커는 하기 서열의 뉴클레오타이드로 이루어진다. :

A A T T C C A C A A G T G C G A T

G G T G T T C A C G C T A

EcoR I/Bam H I -분해된 pIN-III-ompA2 및 pcD-125의 BamH /EcoR V 단편을 0.1μM의 합성 링커를 함유하는 표준 연결 용액에 혼합한다[참조 : Maniatis et al., 상기 참조]. 이.콜라이 균주 Ab1899는 pIN-III-ompA2(1) 플라스미드로 감염시키고³²P-표지된 IL-4 cDNA 프로브를 사용하여 콜로니하이브리드화에 의해 형질전환체를 선별한다. 검정용 사람의 IL-4 추출물을 다음과 같이 수득한다. 초음파 처리한 후, 세균 배양물을 원심분리하고 상등액을 펠렛으로부터 제거한다. 펠렛을 1% SDS, 2mM 디티오트레이톨 및 6M 구아니딘으로 처리한다. 물질을 다시 원심분리하고, 상등액을 제거하고 펠렛을 45℃에서 3% SDS 및 2mM 디티오트레이톨로 처리한다. 물질을 다시 원심분리하고, 상등액을 SDS-PAGE에 의해 검정한다.

천연의 사람 IL-4를 발현시키도록 pIN-III-ompA(2)를 작제한다. pIN-III-ompA(1) 작제에 세가지 아미노산 첨가는 pIN-III-ompA2의 ompA 시그널 펩타이드 서열의 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해 제거된다. 부위 특이적 돌연변이 유발을 Zoller 및 Smith의 문헌에 따라 수행한다. 간단히, ompA 시그널 펩타이드 코드화서열을 함유하는 pIN-III-ompA2의 Xba I/Bam H I 단편(제 1 도 참조)[참조 : Gbrayeb et al., 상기 참조] 을 정제하고 M13mP 19의 정제된 Xba I/BamH I-분해된 복제형(RF)와 혼합하여, 연결시킨 다음, 이를 사용하여, 이.콜라이 K-12 JM101을 형질감염시켜 도말한다. IPTG 및 X-gaL의 존재하에 선명한 플라그를 선별하여 중식시키고, 일본쇄 DNA를 제조한다[참조 : Messing, Methods in Enzymology, Vol. 101(Academic Press, New York, 1983)]. 별도로, 지시된 염기 치환체[박스로 나타냄)을 함유하는 다음의 올리고뉴클레오타이드 프라이머(23-mer)를 합성하고 포스포릴화한다 :

5'-G G A A T T C A G A A G C T C

GCTAC-3'.

상기 서열을 돌연변이된 pIN-III-ompA2의 시그널 펩타이드 코드화 영역내의 제 2 의 Hind III 부위에 도입시킨다. 올리고 뉴클레오타이드 프라이머를 pIN-III-ompA2의 Xba I/Bam H I 단편을 함유하는 M13mp19RF 에 아닐링시키고, 적절한 농도의 뉴클레오타이드 트리포스페이트의 존재하에 DNA 폴리머라제 로 처리한다. 생성된 RF를 사용하여 이.콜라이 JM101를 형질감염시키고, 돌연변이체-함유 플라크를 표지된 올리고뉴클레오사이드 프로브에 의해 스크리닝한다. 선별된 RF의 서열을 광범위한 M13 프라이머를 사용하여 디데옥시 서열화에 의해 확인한다. 선별된 RF를 증식시키고 분리한 다음 Xbal I 및 BamH I으로 분해하여, 정제된 Xba I/BamH I 단편을 Xba I 및 BamH I-분해된 pIN-III-ompA2에 삽입한다. pIN-III-ompA(2)를 형성시키기 위해, 돌연변이체 pIN-III-ompA2를 증식시켜, 정제하고 Hind III및 BamH I 으로 분해하여 0.1μM의 하기 합성 링커를 함유하는 표준 연결 용액중에서 pcD-125의 BamH I/ EcoR V 단편과 혼합한다 :

A G C T C A C A A G T G C G A T

G T G T T C A C G C T A

이.콜라이 균주 Ab1899를 pIN-III-ompA2(2) 플라스미드에 의해 감염시키고, 형질전화체를³²P-표지된 IL-4 cDNA 프로브를 사용하여 콜로니 하이브리드화에 의해 선별한다. 전술한 바와 같이 제조된 IL-4 추출물을 pcD-125 COS 7세포의 상등액에 필적하는 TCGF 활성을 나타낸다.

[B. TRPC11]

TRPC11벡터는, 합성적 컨센서스 RBS 단편을 Cla I 링커(ATGCAT)에 연결시키고 생성된 단편을 Cla I-제한된 pMT11bc(Cla I 부위를 함유하도록 미리 변형시킴)에 클로닝하여 작제한다. pMT11bc는 VX 플라스미드의 EcoR I-HindIII 폴리링커 영역을 갖는 pBR322의 작고(2.3kb)높은 복제, AMP^R, TET^S유도체이다(Maniatis 등에 의해 전술됨). EcoR I 및 BamH I로 pMT11hc 를 제한 절단하고, 생성된 접착말단을 채운 다음, Cla I 링커(CATCGATC)와 연결시켜, EcoR I 및 BamH I 부위를 다시 회복하고 Sma I 부위를 Cla I부위로 대체시켜 Cla II부위를 함유하도록 변형시킨다.

TRPC11 작제물로부터의 한가지 형질전환체는 Cla I 부위에 의해 플랭킹된 일렬로 된 RBS 서열을 갖는다. Cla I 부위중 하나 및 RBS 서열중 제 2 의 복제물중 일부를 상기 플라스미드를 Pst I으로 분해하고, Bal31 뉴클로아제로 처리하고, EcoR I으로 제한 절단한 다음 네가지 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트 모두의 존재하에, T₄DNA 폴리머라제로 처리하여 제거한다. 생성된 30 내지 40bp 단편을 PAGE를 통해 회수하고 Sam I-제한된 pUC12내로 클로닝시킨다. pKC101로부터 유래된 248bp 이.코라이 trp P-함유 EcoR I 단편[참조 : Nichols et al., Methods in Enzymology, Vol. 101, 155페이지(Academic Press, N. Y.(1983)에 기재됨]를 EcoR I 부위내로 클로닝하여 TRPC11 작제를 완성한다. 이는 제 12 도에 나타나있다.

TRPC11은 우선 이를 Cla I및 BamH I으로 분해하고, 정제한 다음 0.1μM의 하기 합성링커를 함유하는 표준 연결 용액중에서 pcD-125의 EcoRV/BamH I 단편과 혼합하여 사람의 IL-4 cDNA에 대한 벡터로서 사용한다.

T C G A T G C A C A A G T G C G A T

A C G T G T T C A C G C T A

삽입물-함유 벡터를 전술한 방법으로 선별하며, 이.콜라이 K-12 균주 JM101내에서 증식시킨다. IL-4는 다음과 같이 추출한다. JM101 세포를 이의 배양배지에서 초음파 처리하여 원심분리한다. 펠렛을 4M 구아니딘 및 2mM 디티오크레이톨에 재현탁시키고 다시 원심분리한다. 상등액을 생물학적 활성에 대해 시험하여, pcD-125-형질감염된 COS 7 세포의 상등액의 TCGF 활성에 필적하는 TCGF활성을 나타냄을 알았다.

[실시예 V]

[소의 헬퍼 T 세포 cDNA 라이브러리에 마우스 및 사람의 IL-4 cDNA 프로브를 통한 소의 IL-4 cDNA 의 제조 및 COS 7 원숭이 세포에서 일시적 발현]

IL-4를 코드화하는 cDNA 클론을 혼합된 마우스 및 사람 cDNA 프로브를 사용하여 유도된 소의 말초혈 임파구(PBL)로부터 작제된 cDNA 라이브러리로부터 분리한다. 소의 cDNA의 다른 공급원을 ATCC의 NBL 동물 세포주 수집물에 보관된 여러가지 소의 세포주를 포함한다. 방법은 실시예 II에 기재된 방법과 거의 동일하다. 세포를 ConA에 의해 유도시킨 후 약 10시간 후에 수거한다. mRNA 추출 및 cDNA 라이브러리의 작제는 실시예 II에서와 같이 수행한다.

마우스 및 사람 cDNA 프로부는 소의 IL-4 cDNA를 검출하기 위해 혼합물로서 또는 연속적으로 사용될 수 있다. 실시예 II에서와 마찬가지로, Pst I단편을 마우스 pcD-24-E3 cDNA 클론으로 부터 분리한다. 유사하게, Pst I단편을 사람의 pcd-125 cDNA 클론으로부터 분리한다. 여러가지 다른 단편도 프로브의 작제에 사용할 수 있다. 분리된 Pst I단편을 함께 또는 별도로 니크 해독에 의해 표지시키고(약 1×10⁸cpm/μg)각각 유도된 PBL cDNA 라이브러리의 약 1000개의 클론을 나타내는 10개의 푸울로부터 플라스미드 DNA 제제를 함유하는 니트로셀룰로오즈 필터를 탐지하는데 사용한다. 필터 하이브리드화는 실시예 II에서와 같이 수행한다. 양성을 나타내는 클론을 확인하여 증식시킨다.

[실시예 VI]

[사카로마이세스 세레비시애에서 천연의 사람 IL-4 및 뮤테인 Δ_1-4및 IS⁰(Gly-Asn-Phe-Val-His-Gly)의 발현]

천연의 사람 IL-4 cDNA 및 이의 두가지 돌연변이체를 플라스미드 pMF-α8에 클로닝시키고, 효모 사카로마이세스 세레비시애에서 발현시킨다. 비-효모 단백질을 발현시키기 위한 pMF-α8의 작제 및 적용은 문헌[참조 : Miyajima et al., Gene Vol. 37, 155-161페이지(1985) : 및 Miyajima et al., EMBO Journal, Vol. 5 1193-1197페이지(1983)]에 충분히 기술되어 있다. pMF-α8은 ATCC에 기탁번호 40140로 기탁되어 있으며, 이 플라스미드의 지도는 제 13a 도에 나타나 있다(이 도면은 문헌[참조 : Miyajim

a et al., Gene, 상기 참조]에 상세히 기술되어 있다).

[A. 사람의 IL-4 뮤테인 Δ^1-4]

플라스미드 pcD-125를 분리하고, EcoR V 및 BamH I으로 분해한다. 사람의 IL-4 cDNA 를 함유하는 EcoR I/ BamH I 단편을 분리하고, DNA 폴리머라제 I(클레노우 단편)으로 처리하여 BamH I 절단물을 채우고 카나제 처리(즉, 포스포릴화)한다. pMF-α8을 Stu I으로 분해하고, 표준 연결 용액중에서 pcd-125 키나제 처리된 EcoR V/BamH I 단편과 결합시켜 플라스미드 phIL-4-2-를 형성시킨다. phIL-4-2를 사용하여 사카로마이세스 세레비시애 20B-12(MATalpha trp-1-289 pep 4-3 ; Yeast Genetic Stock Center, University of California, Berkeley로부터 수득함)를 형질전환시킨다. 효모 세포를 아미노산이 없는 0.67% 효모 질소 염기, 2% 글루코오즈 및 0.5% 카사미노산(Difco)을 함유하는 합성배지에서 성장시킨다. 효모세포는 하기 문헌에 기술된 리튬 아세테이트법에 의해 플라스미드로 형질전환시키고[참조 : Ito et al., J. Bacteriol., Vol.153 163-168(1983)]. 형질전환체를 트리토판이 결핍된 합성배지에서 선별한다. 형질전환체 배양물의 상등액을 TCGF 활성에 대해 시험한다. 제 13b (곡선 d)도는 phIL-4-2-형질전환체 효모 세포의 상등액의 여러 희석액의 TCGF활성을 다른 인자와 비교하여 나타낸 것이다(곡선 A…사람의 IL-2 ; 곡선 B…pcD-125-형질감염된 COS 7 세로의 상등액 ; 곡선 C…phIL-4-1형질전환된 효모세포의 상등액). 곡선 E는 IL-4 cDNA 삽입물이 결핍된 pMF-α8 로 형질전환시킨 효모(즉, 모의 형질전환체)의 상등액의 TCGF 활성을 나타낸다.

[B. 사람의 IL-4 및 뮤테인 IS⁰(Gly-Asn-Phe-Val-His-Gly)]

뮤테인 IS₀(Gly-Asn-Phe-Val-His-Gly)의 발현을 위한 pMF-α8 삽입물은 pc

D-125의 Nae I/BamH I 단편을 사용하는 것 이외에는 뮤테인 Δ^1-4에서와 동일하게 제

조한다. 생성된 플라스미드를 pHIL-4-1로 표기한다. pHIL-4-1-형질전환된 효모세포의 여러 희석액을 TCGF 활성에 대해 시험한다. 그 결과는 제 13b 도의 곡선 C에 나타나 있다. 상등액은 또한 항-1gM 및 SAC-활성화 B임파구상에서 BCGF 활성에 대해서도 시험한다. 전술한 바와 같이 검정하여 수득한 결과를 표 IV에 나타낸다.

[표 IV]

[phIL-4-3형질전환된 효모세포의 상등액의 BCGF 활성]

[C. 효모에서 천연의 사람 IL-의 발현]

천연의 사람 IL-4를 코드화하는 cDNA을 먼저 N-말단의 His 코돈의 상부에 염기를 삽입시킴으로써 pMF-α8에 클로닝시켜 Kpn 1 제한부위를 형성시킨다. Kpn 1 에의해 절단시키고 DNA 폴리머라제 I으로 처리한 후, 평활 말단화된 IL-4 cDNA를 pMF-α8의 Stu I부위에 삽입시킨다. Kpn I 부위는 표준부위-특이적 돌연변이 유발에 의해 형성된다. 간단히, pcD-125를 BamH I 으로 분해하고, 전체의 사람 IL-4를 함유하는 단편을 분리하여 M13mp8의 BamH I 부위에 삽입한다. 삽입물을 함유하는 일본에 M13mp8을 분리하고 프라이머로 사용되는 하기의 합성 올리고뉴클레오타이드에 하이브리드화시킨다 :

5'-TCCACGGA

CACAAGTG-3'

삽입된 뉴클레오타이드는 박스로 나타내었다. 돌연변이된 IL-4 cDNA를 함유하는 플라스미드를 올리고 뉴클레오타이드 프로브로 확인하여 증식시키고, 분리시킨 다음 Kpn I 및 BamH I으로 처리한다. Kpn I/BamH I 단편을 분리하여 DNA 폴리머라제 I(클레노우 단편)으로 처리하여 평활말단을 생성시키고, 키나제 처리한 다음 Stu I분해된 pMF-α8과 연결시킨다. 효모를 상술한 바와 같이 phIL-4-3으로 명명된 생성된 pMF-α8 플라스미드로 형질전환시키고 상등액을 TCGF 활성에 대해 시험한다. 이 상등액은 phIL-4-1형질전환된 효모의 상등액에서 관찰된 것에 필적하는 TCGF활성을 나타낸다.

[실시예 VII]

[이.콜라이에서 합성의 사람 IL-4 유전자의 작제 및 발현]

합성의 사람 IL-4 유전자를 세균성-바람직한 코돈을 함유하고 일련의 독특한 제한 앤조뉴클레아제 부위("독특한 제한 부위"로 후술함)를 포함하며, 다양한 사람 IL-2 뮤테인의 빠르고 편리한 발현을 허락하도록 작제한다. 합성 유전자의 뉴클레오타이즈 서열은 제 6a 도에 나타나 있다. 본 실시예의 합성 유전자의 작제 및 발현 방법은 분자생물학 분야에서 표준 방법이다[참조 : Sproat 및 Gait, Nucleic Acids Research, Vol. 13, 2959-2977페이지(1985) : Ferretti et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 83, 599-603페이지(1986) ; Mullenbach et al., J. Biol. Chem. Vo1.261, 719-722페이지(1986); Wells et al., Gene Vol. 34, 315-323페이지(1985) ; 및 Estell et al., Science, Vol. 233, 659-663페이지(1986)]. 간단히, 합성의 사람 IL-4 유전자는 다수의 화학적으로 합성된 이본쇄 DNA 단편으로부터 조합된다. 합성 유전자의 염기 서열은 조합한 유전자가 일련의 독특한 제한부위를 함유하도록 선별한다.

일련의 독특한 제한부위는 쉽게 절단되며 다른 염기 서열을 갖는 분절로 대체될 수 있는 일련의 분절로 정의한다. 합성 단편은 직접, 또는 다른 단편과 연결시킨 후 적절한 벡터(예를들어, pUC 플라스미드, 등)에 삽입시킨다. 상기 언급한 분절은 대략 Wells등(상기 참조)의 "카세트"에 상응한다. 합성 단편은 표준방법으로 합성된다[참조 : Gait, Oligonucleotide Synthesis : A Practical Approach(IRL Press, Oxford, UK, 1984)], 바람직하게는 자동화 합성기, 즉 Applied Biosystems, Inc.(Foster City. CA) model 380A를 사용한다. pUC 플라스미드 및 유사 벡터는 시판된다(예, Pharmacia-PL 또는 Boehringer-Mannheim). 클로닝 및 발현은 표준 세균계, 예를들어, 이.콜라이 k-12 균주 JM101, JM103등에서 수행할 수 있다[참조 : Viera및 Messing, Gene, Vol. 19, 259-268페이지(1982)].

제한 엔도뉴클레아제 분해 및 러가제반응은 표준 방법에 따라 수행한다[참조 : Maniatis et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982)].

알칼리법[Maniatis et al, 전술함]은 소규모의 플라스미드 제조에 사용된다. 대규모 제조를 위해, 수정된 알카리법을 사용하는데, 이 방법은 동일한 이소프로판올을 사용하여 맑은 용해물로부터 핵산을 침전시키다. 냉 2.5M 암모늄 아세테이를 사용하여 침전시킴으로써 염화세슘 평형 밀도 원심분리하고 에티디움 브로마이드로 검출하기 전에 RNA를 제거한다.

필터 하이브리드화를 위해 와트만(Whatman) 540 필터 서클을 사용하여 콜로니를 옮긴 다음 용해키키고, 0.5M NaOH, 0.15M Nacl : 1M Tris, HCl pH8.0, 1.5M NaCl(각 2분씩)으로 연속처리하여 고정시킨 다음 80℃로 가열(30분)한다. 6×SSPE, 20% 포름아미드, 0.1% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 100μg/㎖ 의 이.콜라이 tRNA, 100μg/㎖ Coomassie Brilliant Blue G-250(Biorad)중, 42℃에서 6시간 동안³²P-표지된(카나제 처리된)합성 DNA를 사용하여 하이브리드화시킨다(20×SSPE는 174g의 NaCl, 27.6g의 NaH₂PO₄H₂O 및 7.4g의 EDTA를 800㎖에 H₂O에 용해시키고, NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 조절하고 부피를 1ι가 되도록 한 다음 오토클레이빙하여 멸균시킨다).

필터를 1×SSPE, 0.1% SDS 로 2회(15분, 실온)세척한다. 자동방사선사진(Fuji RX film)을 찍은 후, 청색 반점의 콜로니를 사용하여 재성장된 콜로니를 정렬시킴으로써, 양성 콜로니를 필터상에서 위치시킨다.

DNA를 막삼 및 길버터의 화학적 분해법[참조 : Maxam 및 Gilbert, Methods in Enzymology, Vol. 65, 499페이지(1980)] 또는 디데옥시법[참조 : Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 74, 5463페이지(1977)]에 의해 서열화한다. 디데옥시 반응을 위한 주형은 M13mp 벡터내로 재클로닝된 적절한 영역의 일본쇄 DNA[참조 : Messing et al., Nucleic Acids Res, Vol. 9, 309페이지(1981)], 또는 미나알킬리법으로 제조하여 0.2M NaOH(5분, 실온)으로 변성시키고, 2용적의 에탄올을 가함으로써 0.2M NaOH, 1.43M 암모늄 아세테이트로부터 침전시킨 이본쇄이다. 디데옥시 반응은 42℃에서 수행한다.

DNA를 Applied Biosystem 380A합성기를 사용하여 포스포르아미다이트 화학에 의해 합성한다. 합성, 탈보호, 절단 및 정제(7M 우레아 PAGE, 용출, DEAE-셀룰로오즈 크로마토그라피)를 380A 합성기 설명서에 기재된 대로 수행한다. 클로닝시킬 합성 DNA 의 상보성 본쇄(각각 400ng)를 혼합하고, 50μl의 반응 용적중에서 폴리뉴클레오타이드 키나제를 사용하여 포스포릴화 한다. 이 DNA를 적절한 제한효소로 분해한 1μg 의 벡터 DNA와 연결하는데, 연결은 50μl의 용적중, 실온에서 4 내지 12시간 동안 수행한다. 포스포릴화, 제한효소분해, 폴리머라제 반응 및 연결의 조건은 전술한 바와 같다[참조 : Maniatis et al., 상기 참조]. 콜로니를 앰피실린, 이소프로필-1-티오-β-D-갈락토사이드(IPTG)(0.4mM) 및 5-브로보-4-클로로-3-인돌린-β- D-갈락토피라노사이드(x-gal)(40μg/㎖)가 보충된 L-한천상에 도말하여, lacZ⁺(필요한 경우)애 대해 계수한다.

TAC-RBS 벡터를 tac-P함유 플라스미드 pDR540(Pharmacia)의 단일 BamH I부위를 DNA 폴리머라제로 채우는 것에서 출발하여 일련의 단계에 의해 작제한다. 이어서 생성물을 비포스포릴화된 합성 올리고뉴클레오타이드(Pharmacia)에 연결하여 컨센서스 리보좀 결합부위(RBS, GTAAGGAGGTTTAAC)를 코드화하는 이본쇄 단편을 형성시킨다. 연결한 후, 혼합물을 포스포릴화하고 Sst I 링커 ATGAGCTCAT와 다시 연결시킨다. 생성되는 컴플렉스를 Sst I 및 EcoR I으로 절단하고 173bp 단편을 폴리아크릴아미드겔 전기영동(PAGE)으로 분리하여 EcoR I/ Sst I-제한된 pUC18(Pharmacia)내에 클로닝시킨다(후술함). 최종 작제물의 RBS-ATG 폴리링커 영역의 서열( TAC-RBS)는 제 8 도에 나타나 있다.

합성의 사람 IL-4 유전자를 6단계로 pUC18 플라스미드로 조합한다. 각 단계에서 결실부 및/또는 삽입부가 없는 삽입물을 단계 I에서 삽입된 ATG 출발 코돈과 함께 프레임내에 pUC18의 lacZ(α) 유전자를 유지시킴으로써, 클로닝한 후 검출할 수 있다. 결실 및/또는 삽입 변화가 없는 클론은 x-gal 및 IPTG을 함유하는 L-앰피실린 평판상에서 청색 콜로니를 계수하여 여과제거할 수 있다. 이와달리, 각 단계에서 삽입물의 서열은 소규모의 플라스미드 DNA 제제상에 통상의 서열화 프라이머(예 : Boehringer Mannheim제품)를 사용하여 용이하게 확인할 수 있다.

단계1에서, TAC-RBS 벡터를 SatI으로 분해하고, T₄DNA 폴리머라제(이의 3'액소뉴클레아제 활성은 SatI절단부의 3'돌출본쇄를 분해하여 평활 말단 단편을 형성한다)로 처리하고, T₄DNA 폴리머라제를 불활성화시킨 후, EcoRI 으로 처리하여, TAC-RBS영역을 함유하며 ATG 출발코돈에 평활말단을 갖고 반대편 말단에 EcoRI절단부를 갖는 173bp 단편을 형성시킨다. 최종적으로, 173bp TAC-RBS 단편을 분리한다.

단계 2에서, 단계 I의 분리된 TAS-RBS 단편을 EcoRI/SatI-분해된 플라스미드 pUC 18 및 제 7a 도에 나타난 바와 같이 상부 말단에 평활말단을 가지며 하부 말단에는 SatI 절단부에 해당하는 잠착말단을 갖는 합성단면 1A/B와 혼합한다. 단편들을 연결시켜 단계 2의 pUC 18을 형성한다.

단계 3에서, 합성단편 2A/B 및 3A/B(제 7b 및 7c 도에 나타있음)을 단계 2 의 SatI/BamHI-분해된 pUC 18(증폭 및 정제후)과 혼합하고 연결시켜 단계 3의 18을 형성시킨다. 단편 2A/B 의 하부 말단이 BamHI 점착 말단을 형성하는 추가의 염기를 함유함을 주목하라. 상기의 추가의 염기는 단계 4에서 제거된다. 또한 단편 2A/B 및 3A/B 의 혼합시 아닐링하는 상보성 9-잔기 일본쇄 말단을 갖는데, 2A/B의 상부 SatI 절단부 및 3A/B 의 하부 BamHI 를 연결시켜 pUC 18을 형성한다.

단계 4에서, 단계 3의 MInI/XbaI-분해된 pUC 18(증폭 및 정제후)를 다시 정제하고 합성 단편 4A/B(제 7d 도)와 혼합하고 연결시켜 단계 4의 pUC 18을 형성시킨다.

단계 5에서, 단계 4의 XbaI/SaII-분해된 pUC 18(증폭 및 정제후)를 5A/B의 합성 단편(제 7e 도)과 혼합하고 연결시켜 단계 5의 pUC 18을 형성시킨다.

단계 6에서, 단계 5의 Sa II/HindIII-분해된 pUC 18(증폭 및 정제후) 6A/ B의 합성 단편(제 7e 도)와 혼합하고 연결시켜 최종 작제물을 형성시킨다.

제 6b 도는 pUC 18작제물에 존재하는 독특한 제한부위의 절단지도이다. 기술된 합성의 사람 IL-4 유전자를 pUC 18의 삽입물로 사용하는 경우, 각 쌍의 독특한 제한부위는 쉽게 절단되며 다른 합성 분절로 대체될 수 있는 분절이다. 독특한 제한부위는 Eco EI, Hpa, I, Sac I(Sat I), Eco RV, Pat I, ㎖u, Bcll, Xba I, Nae I, Sal I, Xho I 및 Hind III이다.

합성 IL-4 유전자를 함유하는 pUC 18을 이.콜라이 K-12 균주 JM101에 삽입한다. 배양한 후, JM101세포로부터 단백질을 추출하고, 추출물을 생물학적 활성에 대해 시험한다.

[실시예 VIII]

[이.콜라이에서 사람의 IL-4 뮤테인 Ile⁵²의 작제 및 발현]

52 위치의 Leu(천연의 사람 IL-4의 N-말단과 비교하여)을 Ile로 바꾸어 사람 IL-4 뮤테인 Ile⁵²를 형성시킨다. 제 6a 도의 합성의 사람 IL-4유전자를 함유하는 실시예 VII의 pUC 18플라스미드를 PstI 및 ㎖uI로 분해시키고 정제한다. 상기 정제된 pUC 18을 하기 설명된 합성의 이본쇄 단편과 혼합하여 연결시킨다. 염기서열의 교환부위는 박스안에 나타내었다. 생성되는 pUC 18을 이.콜라이 K-12 균주 JM101에 형질감염시키고 발현시킨다.

GA GCT GCT ACC GTT ATC CGT

ACG TCT CGA CGA TGG CAA TAG GCA

CAG TTC TAC TCT CAC CAC GAA AAA

GTC AAG ATG AGA GTG GTG CTT TTT

GAC A

CTG TGC GC

사람의 IL-4 뮤테인 Ile⁵²를 생선시키기 위한 PstI/MluI 대체 단면

배양한 후, 단백질을 표준방법으로 JM101로부터 추출하고 추출물 희석액을 생물학적 활성에 대해 시험한다.

[실시예 IX]

[사람의 IL-4 뮤테인( Ile⁵², Asp¹¹¹)의 작제 및 발현]

실시예 VIII의 변형된 pUC 18플라스미드(Ile⁵²코드화 서열을 함유한다)를 SalI 및 XhoI으로 분해하고, 큰단편을 분리한다. 분리된 단편을 표분 연결 용액중에서 하기에 설명된 합성의 이본쇄 단편과 혼합한다. 서열중 교화부분은 박스로 나타내었다. 생성된 플라스미드로 이.콜라이 K-12 균주 등을 형질 감연시키고 발현시킨다.

TCG ACT CTG GAA GAC TTC C

GA GAC CTT CTG AAG GAG CT

[SalI/XhoI 치환단편]

배양한 후, 표준방법으로 JM101세포로부터 단백질을 추출하고, 추출물 희석액을 생물학적 활성에 대해 시험한다.

[실시예 X]

[형질감염 상등액으로부터 정제된 사람의 IL-4의 서열]

사람의 IL-4를 사람의 IL-4 cDNA를 함유하는 벡터로 일시적으로 형질감염된 세포의 배양 상등액으로부터 정제한다. 분비되는 천연의 사람 IL-4의 서열을 정제된 물질로부터 확인한다.

[A. 정제용의 생물학적 검정]

TCGF 활성은 분리과정시 사람의 IL-4를 사용하여 검정한다. 검정은 실시예 II의 방법과 거의 동일하다. 간단히, 건강한 헌혈자의 헤파린을 가한 튜브에 넣고 Ficoll-Hypaque상에 층을 형성시킨다. (예, 15㎖의 혈액), 3000xg 에서 20분간 원심분리한 후, 경계면의 세포를 흡출시키고 10% 태 송아지 혈청, 50μm 2-머캅토에탄올, 20μg/㎖ 식물성 혈구 응집소(PHA) 및 재조합 사람 IL-2를 함유하는 RPMI 1640으로 이루어진 성장 배지중에 희석시킨다. 37℃에서 5 내지 10일간 배양한 후, PHA-자극된 말초혈임파구(PBL)을 세척하고 2-일 비색 검정법에 사용한다[참조 : Mossmann, J. Immunol. Methods, VO1. 65, 55-63페이지(1983)]. 일련의 IL-4 표준물질의 2배 희석액(pcd-125- 또는 pEBT-178-형질감염된 COS 7세포로부터 상등액)또는 시험될 분획을 전술한 성장배지를 사용하여 96-트레이에서 수행하여 50μι/웰의 최종 용적을 수득한다. 약 4 내지 8×10⁵세포/㎖의 50μι의 PHA-자극된 PBL-자극된 PBL을 각 웰에 가하고, 트레이를 37℃에서 2일간 배양한다. 그 다음 전술한 Mosmann의 방법에 따라 세포성장을 측정한다.

사람의 IL-4 TCGF 활성의 단위는 pcD-125-형질감염된 COS 7 세포(실시예 II) 또는 pEBV-178-형질감염된 COS 7세포(실시예 III)의 상등액에 관하여 정의된다.

정제를 위해, 단위는 다음과 같이 제조되는 pcD-125형질 감염된 상등액의 활성을 기준으로 한다. 약 1×10⁵COS 7 세포를 둘베코의 변형된 이글 배지 (DME). 10% 태 송아지 혈청 및 4mM L-글로타민을 함유하는 100mm 조직 배양 평판상에 씨딩한다. 씨딩한지 24시간 후, 배지를 평판부터 제거하여 세포를 무혈청 완충(50mM Tris)된 DME로 2회 세척한다. 각 평판에 4㎖의 무혈청 완충된 DME(4mM L-글루타민 함유), 80의 DEAE-덱스트란 및 5μg의 pcD-125 DNA를 가한다. 세포를 상기 혼합물 중, 37℃에서 4시간 동안 배양한 다음 혼합물을 흡출시키고, 세포를 무혈청 완충된 DME로 1회 세척한다. 세척한 후, 각 평판에 4mM L-글루타민, 100μM 클로로퀴논, 및 2% 태 송아지 혈청을 함유하는 5㎖ DME를 가하고, 세포를 3시간 동안 배양한 다음 무혈청 완충된 DME로 2회 세척한다. 이어서, 4mM L-글루타민 및 4% 태 송아지 혈청을 함유하는 5㎖ DME를 가학 세포를 37℃에서 24시간 동안 배양한다. 이어서, 세포를 DME 또는 PBS로 1 내지 3회 세척하고, 5㎖의 무혈청 DME(4mM L-글루타민 함유)을 가하고, 5일 후 배양 상등액을 수거할 때까지 세포를 37℃에서 배양한다.

본 명세서에서 사용한 1단위는 1개의 웰(0.1㎖) 에서 48시간에 걸쳐 2×10⁴PHA-자극된 PBL의 50% 최대 증식을 자극하는 인자의 양이다.

[B. 정제]

정제는 양이온 교환 크로마토그라피, 겔여과 및 역상 고압 크로마토그라피를 연속적으로 적용하여 수행한다. 모든 과정은 4℃에서 수행한다.

원심분리에 의해 COS 7세포를 제거한 후, 상등액을 한외여과하여 약 10배로 농축시키고 추가로 반응시킬 때까지 -80℃에서 보관한다. IL-4 역가는 식물성 혈구 응집소-유도된 사람의 말초혈 임파구의 증식을 자극시키는 단백질의 능력 즉 TCGF 활성을 전술한 표준 시험 방법을 사용하여 검정하여 측정한다.

TCGF 활성이 약 10⁴내지 10⁶단위/㎖이고 단백질 함량이 약 15 내지 20mg/㎖인 농축된 COS 7 상등액을 24시간에 걸쳐 50mM 나트륨 HEPES pH 7.0를 2회 교체시켜 투석한다(각각의 교체는 한가지 농축물의 약 10 내지 15배 용적). 투석물을 50mM 나트륨 HEPES, pH 7.0로 미리평형시킨 S-Sepharose 컬럼 (1×2.5cm)(유속 0.2㎖/분)에 적용한다. 컬럼을 15배 컬럼 용적의 평형화 완충액으로 세척한 다음 50mM나트륨 HEPES, pH 7.0중의 0 내지 0.5M 염화나트륨으로 염화나트륨의 농도를 선형으로 증가시킨 20배 컬럼 용적으로 용출시킨다. 일정한 농도의 5배 컬럼 용적으로의 용출로 구배를 종결시킨다 : 50mM 나트륨 HEPES, 0.5M NaCl, pH 7.0, 각각의 배치로부터의 1.5㎖ 및 1.8㎖의 분획을 수거한다. IL-4 역가는 두 크로마토그라피가 300mM 및 500mM 염화나트륨 사이에서 용출하는 것으로 밝혀졌다.

IL-4 역가물을 함유하는 각 S-Sepharose 컬럼으로부터의 6개의 분획을 전체 용적 9.0 및 10.8㎖로 각각 조합시킨다. 두 용적물을 Amicon YM5막(한계 분자량 : 5000)을 사용하는 한외여과로 1.9㎖까지 농축시킨다. 상기 단계로부터 단백질 회수율은 약 80%이다. 농축된 IL-4 용액을 50mM HEPES, 0.4M NaCl, pH 7.0으로 전평형시킨 Sephadex G-100 컬럼(1.1×58cm)에 적용하고, 컬럼을 상기 완충액으로 0.15㎖/분의 속도로 용출시킨다. 전에 50분획(분획당 1.0㎖)을 수거하고 IL-4역가를 분석한다. 생물학적 활성 피크는 겉보기 분자량 22,000달톤에서 관찰된다. Sephadex G-100을 겉보기 분자양 측정을 위해 소의 혈청 알부민(65,000달톤), 카보닉 안하이드라제(30,000달톤) 및 시토크롬 C(11,700달톤)으로 보정한다.

IL-4 활성을 함유하는 Sephadex G-100 컬럼으로부터의 분획을 진공중에서 3 내지 4배로 농축시켜 Vydac c-4보호컬럼(4.6×20mm)에 주입한다. 0.1%(v/v)트리플루오로아세트산(TFA)중의 0 내지 72%(V/V)의 선형구배의 아세토니트릴을 35℃의 컬럼 온도 및 1.0㎖/분의 유속에서 15분간 생성한다. 세개의 피크가 7, 8.2 및 8.7분의 잔류시간에 214nm에서 검출되었다(각각, 제 10 도의 피크 1, 2 및 3) 피크 2의 40μι분취량(8.2분, 용출시간)을 동결건조시키고, 10%의 태 송아지 혈청을 함유하는 최소 필수 배지에 재용해 시킨다. 이 용액은 양성 TCGF 반응을 나타냈다. 피크 2의 300μι분취량을 증발건조시키고 200μι의 0.1%(w/v)나트륨 도데실 설페이트(SDS)에 재용해시킨다. 분취량 2μι를 200μι의 1%(v/s)TFA에 희석시키고 다시 크로마토그라피 한다. 이 시료의 HPLC는 215nm에서 단일피크를 나타냈다. 피크 2물질은 약 7×10⁸단위/mg활성을 나타냈다.

[C. 아미노산 서열분석]

아미노산 서열 측정은 Applied Bioststems 미소 서열 분석기를 사용하여 자동화된 가스-상 예드만 분해로 수행한다[참조 : Hewick, R.M., Hunkapillar, M, W., Hood, L. E, 및 Drter, W. M,(1981)J. Biol, Chem. 256 ; 7990]. 전술한 바와 같이 0.1% SDS에 용해시킨 피크 2 HPLC 분획의 90μι 분취량을 Polybrene 존재하에 유리 섬유 필터 카트리지에 적용한다. 아미노산 서열 정보는 35번째 잔기까지 수득된다. N-말단 서열은 다음과 같이 결정한다. His-Lys--Asp-Ile-Thr-Leu-Gln-Glu-Ile-Ile-Lys-Thr-Leu-Asn-Ser-Leu-Thr-Glu-Gln-Lys-Thr-Leu-Thr-Glu-Leu--Val-Thr-Asp-Ile-Phe-Ala-Ala

상기 서열에서 공판은 흑인가능한 아미노산의 결손을 나타낸다.

3번 및 23번 위치의 아미노-말단의 공란은 상기 계에서 검출될 수 없는 시스테인의 존재와 일치한다. cDNA-예측 서열에서 트레오닌에 상응하는 28위치의 공란은 페닐티오하이단토인-트레오닌 검출의 가변성 또는 O-결합된 글리코실화 또는 에스테르화의 존재에 기인한다.

아미노 말단의 서열이 수행된 HPLC 분획의 100μι분취량을 건조 증발시키고 70%포름산에 재용해시킨다. 50배 과량의 시아노겐 브로마이드를 가하고, 용액을 실온에서 2.5시간 방치한다. 절단된 단백질을 전술한 바와 같이 Applied Riosystems 가스-상 서열분석기 상에서 서열화된다. 두 서열이 확인 가능하다 :

(1) Arg-Glu-Lys-Ser-Lys

(2) His-Lys--Asp-Ile-Thr

서열(1)은 cDNA로부터 예측된 서열과 동일하여 120번 위치의 메티오닌 잔기의 시아노겐 브로마이드 절단으로 방출된다. C-말단의 마지막 두개의 잔기가 존재할 수 있으나 불출분한 시료 때문에 검출할 수 없다. 서열(2)은 전술한 바와 같이 천연의 IL-4 단백질에 대해 수득된 아미노-말다의 서열과 동일하다. 방출된 아미노말단 및 카복시 말단의 페닐티오하이단토인 아미노산의 상대적인 양은 시료중 두 서열의 등몰량을 제시한다. 이 결과는 서열화된 단백질 시료가 주로 사람의 IL-4 의 DNA 서열에서 예상된 아미노 및 카복시 말단을 갖는 단일 폴리펩타이드를 함유한다는 결론을 지지해준다.

[실시예 XI]

[사람의 IL-4 뮤테인[Ile⁵², Δ⁷¹, Is⁹⁴(Ala)]의 작제 및 발현]

실시예 VIII의 변형된 pUC 18플라스미드(Ile52 코드화 서열을 함유한다)을 ㎖uI 및 BclI로 분해하고, 큰 단편을 분리한다. 분리된 단편을 표준 연결 용액중에서 하기의 합성 이본쇄 단편과 혼합한다. 생성된 플라시미드로 이.콜라이 K-12 JM 101등을 형질감염시키고, 증식시킨다.

CG CGT TGT CTC GGC GCC ACT

A ACA GAG CCG CGG TGA

GCG CAG TTC CAC CGT CAC AAA GAG CT

CGT GTC AAG GTG GCA TTT GTG GTC GAC TAG

↑

결실

[MluI/BclI 대체단편]

변형된 플라스미드를 분리하여 Xbal 및 NaeI 로 분해하고, 큰 단편을 분리한다. 분리된 단편을 표준 연결 용액 중에서 합성 이본쇄 단편과 혼합한다. 첨가한 코돈은 박스 표시하였다. 생성된 플라스미드로 이 콜라이 K-12 균주 JM 101등을 형질감염시키고, 발현시킨다.

CTA GAC CGT AAC CTG TGG GGC

TG GCA TTG GAC ACC CCG

CTG GCC GCC

GAC CGC CGG

[XbaI/Nael 대체단편]

배양한 후, 단백질을 표준방법으로 JM 101세포로부터 추출하고, 추출물의 희석액을 생물학적 활성에 대해 시험한다.

[실시예 XII]

[임파구 결핍 증후군 환자의 세포에서 DR 항원의 유도]

임파구 결핍 증후군은 세포 표면에서의 제 I 형 및/ 또는 II 형 HLA 항원의 발현 부족에 의해 특징화되며, 심한 면역 결핍과 연관된[참조 : Touraine, Lancet 319-321페이지(1981.2.7) ; Touraine 및 Bethel, Human Immunology, Vol. 147-153페이지(1981) ; 및 Sullivan et al, J.Clin.Invest., vol. 76, 75-79페이지(1985)]. 사람의 IL-4 는 임파구 결핍 증후군 환자의 세포의 표면에서 제II형 DR항원의 발현을 유도시킬 수 있음이 밝혀졌다.

말초 혈 임파구(PBL)을 HLA II부류 항원의 비발현으로 인한 환자에서 얻는다. B세포는 전술한 바와같이 필수적으로 PBL로부터 정제되며, B세포주(UD 31로 표기)는 Epstein-Barr 바이러스(EBV)로 형질 전환시킨다. EBV-형질전환된 세포를 2% 태 송아지 혈청 및 pcD-126-형질감염된 COS 7 세포의 5%(v/s)농도의 상등액을 함유하는 이셀(Yssel's)규정 배지(전술함)에서 48시간 동안 배양한다. 세포를 수거하여 고착시키고 형광적으로-표지된 항-DR 모노클로날 항체(예, Becton Dickinson, L 243)로 염색하고, 유동 혈구 계산법으로 분석한다. 제 9 도는 IL-4 처리전에 수거한 EBV-형질전환된 세포의 대조 집단 (곡선 A) 및 IL-4 처리후 EBV-형질전환된 세포의 집단에 대한 세포반도수 : 형광광도의 그라프이다.

[실시예 XIII]

[Cl. Lyl^+2-/9(Cl.1)상등액의 MCGF 활성]

정제된 IL-3 및 IL-3 cDNA 클론(재조합 IL-3 ; IL-3)단독으로 형질감염된 COS 7 세포로부터의 상등액은 동일한 정도로 마스트 세포주 MC/9의 증식을 자극한다(제 14a 도) 그러나, 이 수준은 Cl.1 T세포 상등액에 의해 유도되는 증식의 1/3 내지 1/2 이다. T세포 상등액내에 ConA의 존재(2μg/㎖) 는 이의 MCGF 활성의 상당하게 기여하지는 않는다. 상기 주목한 효과에 대한 한가지 설명은 IL-3 Cl. 1 세포에 의해 생성된 MCGF 활성을 모두 계수한 것이 아니다는 것이다. 이와는 달리, 시험에 사용된 마스트 세포 주는 세포의 제 2 의 인자-의존적 분포 집단으로(이론적으로)오염될 수 있다. 그러나, 상기 후자의 가능성은, MC/9 세포주의 재클로닝으로 각각이 원래 MC/9클론과 같은 방식으로 IL-3 및 세포상등액과 반응하는 서브클론이 수득되므로 배제된다.

또한 Cl.1 상등액은 또한 IL-3 이외의 림포카인을 함유하므로 MC-9 세포의 성장을 촉진시키기 위한 이의 능력을 시험하였다. 그러나, MC/9 세포는 여러 농도의 재조합 IL-2, IFN 및 GM-CSF 뿐만 아니라 IL-1을 함유하는 상등액(P388D1세포)에 반응하지 않는다(제 14A 도). 더우기, IL-2, GM-CSF, IFN-γ또는 IL-1과 함께 재조합 IL-3의 여러 농도를 함유하는 배양물을 보충하는 경우 IL-3 단독으로 수들한 수준이상으로 MC-9 세포의 증식이 자극되지 않는다. 이는 T세포 상등액의 증가된 MCGF 활성이 상기 다른 인자의 기인하지 않음을 나태내는 것이다.

[다른 인자-의존 세포주를 사용한 비교연구]

두개의 다른 마스트 세포주, DX-2및 MM3은 또한 IL-3보다 Cl.1상등액과 보다 높은 증식 반응을 한다(DX-2에 대한 대표적인 데이타가 제 14b 도에 나타나있다). 상기 세포는 IL-2, IFN-γ, GM-CSF 또는 P388D-1세포의 상등액에 반응하지 않는다. 즉, T-세포 상등액에 대한 MC-9 세포의 증가된 증식반응은 일반적으로 마스트-세포에 전형적인 것일 수 있다. 대조적으로, 과립구-형 세VH(NFS-60)는 IL-3 및 Cl.1상등액에 의해 거의 동일하게 자극된다(제 14c 도). NFS-60세포는 IL-2, IFN-γ 및 P388 D-1상등액에 반응하지는 않으나, GM-CSF에 의해 적지만 재생성 가능한 자극이 존재한다. IL-3 및 T세포 상등액이 비교할만한 수준의 증식을 유도한다는 사실은 NFS-60 세포주가 T세포 상등액에 존재하는 추가의 인자에 비교적 민감하지 않음을 나타낸다. 따라서, NFS-60 세포를 단백질 분획하에 의해 다른 MCGF 활성으로부터 IL-3을 분리시켜 IL-3를 검정하는데 사용된다.

Cl.1상등액의 TCGF 활성은 IL-의존적 T세포주, HT2를 사용하여 평가한다. CL.1 상등액의 포화농도는 재조합 IL-2 로 성취된 최대수준 이하로 H-티미딘 삽입을 일정하게 자극한다(제 14d 도). 유사한 결과가 두가지의 다른 세포주로 수득된다. IL-2를 함유하는 HT2 배양물에 가하면³H-티미딘 삽입이 감소되지 않게 나타나므로, 상등액은 억제 물질을 함유하지 않는다(제 14d 도). 이 결과는 Cl.1 상등액이 IL-2와는 구별되는 TCGF 활성을 가짐을 나타낸다. 상기 결론을 지지해주는 생화학적 증기가 다음에 제시되어 있다.

[Cl.1 상등액의 예비 크로마토그라피 분획화]

다른 MCGF 활성물로부터 IL-3를 분리하는 목적으로 여러 크로마토그라피법에 의해 Cl.1 상등액을 분확화한다.

NFS-60세포의 증식을 이용하여 MC/9 증식에 의해 나타난 전체 MCGF 황성의 배경에 대해 특이적으로 IL-3을 추적한다. HT2 세포증식에 의해 TCGF 활성을 평가한다.

Cl.1상등액을 중성 pH에서 약 98%의 적제 단백질, 97%의 IL-3단위(NFS-60 증식에 의해 평가된)및 유출물을 통해 나타난 1%의 TCGF 단위를 사용한 양이온 교한 크로마토그라피에 의해 분획화한다(제 15 도). 염화나트륨 구배를 사용한 결합 단백질의 용출로 0.19M NaCl에서 TCGF 활성이 방출된다(60번 분획), 그러나 TCGF 활성의 적지만 재생성 가능한 피크가 또한 1M NaCl 에서 나타난다. 추가의 TCGF 활성이 보다 진한 NaCl 농도(3M 까지)에서도 용출될 수 없다. 소량의 IL-3또는 TCGF 피크와 거의 동일한 영역에서 용출된다(탐지할 수 있는 NFS-60 반응). 단지 피크 TCGF 활성(분획 59번 내지 61번) 및 유출물(분획 1 내지 20)에 상응하는 분획이 미분획화된 상등액(제 15 도 화살표)에 필적하는 높은 수준의 MC/9 증식을 자극한다. 역가곡선은 분획 59 내지 61이 유출물 보다 높은 수준의 MCGF 활성을 함유한다는 것을 제시하므로, TCGF 피크와 함께 용출하는 IL-3활성을 추가로 결합시키고 다시 MC/9 증식 수준 을 평가하는 시도를 하였다. 그후, 분획 59 내지 61을 동일한 조건에서 2회 이상 재크로마토그라피한다.

세번째 컬럼 통과후 95% 이상의 TCGF 활성이 0.19M NaCl에서 일관되게 용출된다. 유출물 또는 어떠한 컬럼 분획에서도 IL-3(NFS-60반응)이 측정되지 않는다. 그러나, TCGF피크와 함께 용출되는 것은 Cl.1상등액 또는 IL-3과 함께 수득되는 것보다 상당히 낮은 MC/9 증식의 정체수준을 자극하는 MCGF활성물이다(하기 참조). 상기의 분획은 IL-3활성을 측정할 수 없으므로(NFS 60 반응 부재), 명백히 그 자체의 신규 MCGF 는 조 T세포 상등액과 동일한 정도로 MC/9 세포를 자극할 수 없다.

TCGF로부터 MCGF를 더 분리하기 위해, 3X 분획화물질(분획 59 내지 61)을 H₂O중 1% TFA로 pH2까지 10배 희석시키고 C8 역상 컬럼상에 직접 적용시킨다. 제 16a 도는 TFA 중 0.1%의 아세토니트릴 구배로 방출되는 결합 단백질의 용출 현상을 보여준다. MCGF 또는 TCGF활성은 어느것도 유출물에 나타나지 않으며 ; 두가지 활성은 37% 아세토니트릴에서 공통으로 용출된다(분획 26 내지 29). 그러나, 포화 MCGF 반응은 IL-3단독에 의해 생성되는 양의 약 반에 지나지 않는다(제 17a 도). 모든 분획을 포화수준의 IL-3존재하에 다시 시험하면, 단지 26 내지 29분획만이 과량의 IL-3단독에서 반응하는 MC/9증식을 보여준다(제 16a 도 화살표). 사실상, 반응의 크기는 미분획화 상등액 자체의 것과 유사하다(제 17a 도). 더우기, 미분획화 상등액의 증식 수준과 동등한 수준의 증식이 유출물을 함유하는 IL-3 또는 IL-3정제형 WEHI 3의 존재하에 시험된 분획 26 내지 29를 사용하여 측정된다. 즉, IL-3 및 독특한 MCGF/ TCGF의 조합은 원래 T세포 상등액의 특징적인 MC/9 증식 수준을 자극한다.

비록 역상 크로마토그라피로는 TCGF로부터 MCGF 를 분할하지는 못하지만, TCGF는 두 기준에 의해 IL-2로부터 구별되어 나타난다. 우선, COS 7 세포 상등액중의 재조합 IL-2( IL-2^R) 및 쥐의 T세포주(GE 15-1)를 생성하는 (ConA 자극된) IL-2의 상등액을 모두 동등한 조건하에 동일한 컬럼상에서 크로마토그라피하는 경우, TCGF활성은 Cl.1 TCGF를 생성시키는 37%아세토니트릴 위치와 겹치지 않는 날카로운 피크중의 45% 아세토니트릴에서 용출된다(제 16b 도), 둘째로, IL-2R에 대한 HT 2세포의 포화반응은 Cl.1상등액의 특성과는 매우 다르다(제 16b 도 삽입물). 또한, 일부 정제된 TCGF및 IL-2사이에는 명백한 일치함이 탐지되지 않는다(제 17 b 도).

Cl.1 상등액의 크로마토포커싱 패턴이 제 18도에 나타나 있다. IL-3활성(NFS-60반응)은 7.1이상의 pI값을 갖는 활성을 포함한 매우 다른 프로필을 나타내나, TCGF활성은 약 6.2의 pI를 나타내는 주요 TCGF종(12분획)과 더욱 동종성을 나타냈다. 이는 IL-3의 포화수준을 가한 후 최대 MCGF 활성(MC/9반응)과 일치한다.

[Cl.1 상등액 및 부분정제된 인자의 SDS PAGE]

제 19 도는 미분획화 Cl.1 상등액(제 19a 도) 과 양이온 교환물질, 분획 51 내지 61(제 19b 도) 의 전기 영동적인 현상을 비교한 것이다. 단백질을 겔 조각으로부터 직접 용출하여 증식에 의해 활성을 측정한다. 양이온 교환 분획 및 Cl.1 상등액 모두는 TCGF 피크를 나타낸다. : 비환원 조건하에서 20kd 및 15kd, 및 환원 조건하에서 21kd 및 16kd, 양이온 교환물질은 IL-3을 결핍시키며 상기의 MCGF 활성은 TCGF피크와 일치한다. 모든 분획에 포화량의 IL-3^R을 가하여 피크 MCGF/ TCGF분획에 단지 Cl.1상등액 수준에 대해 반응하는 MC/9 증식을 일으킨다(제 19b 도 화살표). 상등액은 IL-3활성은 24kd 부위에서 가장 크지만 약 20kd 영역의 광범위한 피크에 나타나기도 한다. 중요하게, IL-3의 증식 수준 이상의 MC/9 증식 수준이 전기영동시킨 상등액의 20kd 위치에서 일어난다(제 19a 도 화살표). 가장 고도로 정제된 MCGF/ TCGF물질의 온-염색된 SDS 겔(역상 컬럼의 분획 28)은 또한 20kd 및 15kd 에서 뚜렷한 단백질 밴드를 나타냈다.

인자의 20kd형의 μg양은 전술한(1) 양이온 교환 크로마토그라피, (2) 헤파린 세파로오즈 크로마토그라피 및 (3) C4 역상 크로마토그라피에 의해 활성화된 Cl. 1T-세포로부터의 ConA-상등액의 연속 분획화로써 균질하게 정제한다. 최종물질은 C4 용출 프로필상의 단일 UV 흡수 피크에 상응하는 온-염색된 DSD-PAGE에 의해 20kd 에서 단일 밴드로 나타난다. 정제된 인자의 생물학적 특성은 T- 세포 및 마스트 세포증식을 낮은 수준으로 자극시키고 IL-3-의존적 마스트세포 증식을 증가시키는 이의 능력을 확실히 한다.

표 V에사와 같이, 여러 B-세포 자극 활성을 갖는 인자는 VSF 1에 기인한다[참조 : Roehm, N. W. et al., J. Exp, Med, 169 : 679-694페이지(1984) ; Howard, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78 : 5788페이지(1981) ; Roehm, N. W, et al., Proc, Natl. Acad . Sci. U. S. A. 81 : 6149-6153페이지(1984)]. 첫째로, 이는 대조집단과 비교하여 휴면상태의 B-세포상에 Ia의 발현을 증가시킨다(표 V).

둘째로는, 항-Ig 항체와 관련되 인자는 B-세포증식의 자극의 보조인자로서 작용하는 [³H]-티미딘 삽입을 유도한다. 이는 B-세포 증식 자극에 있어서의 보조인자로서의 작용을 나타낸다.

[표 V]

[B-세포 자극 검정]

주) * 포화수준의 인자를 보충한 3중 배양물의 평균 cpm±SEM으로서 보고된 결과임

** 포화수준의 인자를 보충한 3중 배양물의 평균 상대적 형광으로서 보고된 결과임.

이들 폴리펩타이드는 조정되는 겉보기 작용 및 영향받는 세포 형태 모두에서 다른 여러 생물학적 활성을 나타낼 수 있다. 전술한 바와 같이, 이들 합성은 B세포 및 마스트 세포주의 증식 유도, 휴면상태의 B-세포의 이른 활성화, T-세포 증식의 자극 및 유사분열물질 활성화 B-세포의 IgG₁및 IgE 생성을 상조한다. 폴리펩타이드를 균질하게 정제하는 것은 상기 활성의 범위를 명확히 해준다.

전술한 바로부터, 본 발명의 정제 단백질은 신규의 치료능력을 갖도록 본 기술분야에 제공될 것이다. 상당한 양의 상기 인자를 생성시키는 능력은 선택된 포유동물 세포주의 시험관내 배양물에서 향상될 뿐아니라 포유동물의 면역반응을 전체적으로 향상시킨다.

cDNA 클론 pcD-2A-E3, pcD-46(pcD-2F1-13), pcD-125 및 효모 벡터 pMF-α8 은 각각 American Type Culture Collection (Rockville, MD, U. S. A.)(ATTC)에 기탁번호 53330, 53337[한국 기탁번호 : KFCC 제 10335 호, 기탁기관, 한국종균협회, 기탁일 : 1987. 3.17.], 67029[한국기탁번호 : KFCC 제 10336 호, 기탁기관 ; 한국종균협회, 기탁일 ; 1987. 3. 17.] 및 40140으로 기탁되어 있다. 상기 기탁물은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 대한 부다페스트 조약(1977)하에 기탁한 것이다.

Claims (21)

1. 사람의 인토로이킨-4로 이루어진 단백질.
2. 제 1 항에 있어서, TCGF 활성이 적어도 9×10⁷단위/mg인 단백질.
3. 제 1 항에 있어서, 사람의 인터로이킨-4가 MHC 항원 유도 활성, Fc-수용체 유도 활성, GM-CSF 자극된 과립구 콜로니 성장 강화 활성, 인터로이킨-2 TCGF 강화 활성, 및 IgG₁-및 IgE-유도 활성중에서 선택된 적어도 하나의 활성을 추가로 나타내는 단백질.
4. 제 3 항에 있어서, 사람의 인터로이킨-4가 MHC 항원 유도 활성, Fc-ε수용체 유도 활성, GM-CSF 자극된 과립구 콜로니 성장 강화 활성, 인터로이킨-2 TCGF 강화 활성, 및 IgG₁-및 IgE-유도 활성 중에서 선택된 적어도 두가지의 활성을 추가로 나타내는 단백질.
5. 제 1 항에 있어서, 하기 서열식에서 정의되는 아미노산 사열을 가지며 아미노산 잔기 3 내지 29.35내지 66.78 내지 87,98및 99, 및 105내지 125로 정의된 영역내에서 2회 이하로 삽입되거나, 2회 이하로 결실되거나, 2회 이하로 치환된 글리코실화되거나 비글리코실화된 3회 치환된 폴리펩타이드로 이루어진 단백질.

   X(His)-X(Lys)-X(Cys)-X(Asp)- X(Ile)- X(Thr)-

   X(Leu)-X(Gin)- X(Glu )-X(Ile)-X(Ile)-X(Lys)-

   X(Thr)-X(Leu)-X(Asn)-X(Ser)-X(Leu)-X(Thr)-

   X(Glu)-X(Gln)-X(Lys)-X(Thr)-X(Leu)-X(Cys)-

   X(Thr)-X(Glu)-X(Leu)-X(Thr)-X(Val)-X(Thr)-

   X(Asp)-X(Ile)-X(Phe)-X(Ala)-X(Ala)- X(Ser)-

   X(Lys)-X(Asn)-X(Thr)-X(Thr)-X(Glu)-X(Lys)-

   X(Glu)-X(Thr)-X(Phe)-X(Cys)-X(Arg)-X(Ala)-

   X(Ala)-X(Thr)-X(Val)-X(Leu)-X(Arg)-X(Gln)-

   X(Phe)-X(Tyr)-X(Ser)-X(His)-X(His)-X(Glu)-

   X(Lys)-X(Asp)-X(Thr)-X(Arg)-X(Cys)-X(Leu)-

   X(Gly)-X(Ala)-X(Thr)-X(Ala)-X(Gln)-X(Gln)-

   X(Phe)-X(His)-X(Arg)-X(His)-X(Lys)-X(Gln)-

   X(Leu)-X(Ile)-X(Arg)-X(Phe)-X(Leu)-X(Lys)-

   X(Arg)-X(Leu)-X(Asp)-X(Arg)-X(Asn)-X(Leu)-

   X(Trp)-X(Gly)-X(Leu)-X(Ala)-X(Gly)-X(Leu)-

   X(Asn)-X(Ser)-X(Cys)-X(Pro)-X(Val)-X(Lys)-

   X(Glu)-X(Ala)-X(Asn)-X(Gln)-X(Ser)-X(Thr)-

   X(Leu)-X(Glu)-X(Asn)-X(Phe)-X(Leu)-X(Glu)-

   X(Arg)-X(Leu)-X(Lys)-X(Thr)-X(Ile)-X(Met)-

   X(Arg)-X(Glu)-X(Lys)-X(Tyr)-X(Ser)-X(Lys)-

   X(Cys)-X(Ser)-X(Ser)

   상기식에서, X(Ser)은 Ser이고 : X(Arg)는 Arg, His 및 Lys 로 이루어진 그룹 중에서 선택되며 ; X(Leu)는 Leu, Ile, Phe 및 Met로 이루어진 그룹 중에서 선택되고 ; X(Pro)는 Pro 및 Ala로 이루어진 그룹 중에서 선택되며 ; X(Thr)은 Thr이고 ; X(Ala)는 Ala 및 Pro로 이루어진 그룹 중에서 선택되며 ; X(Val)은 VaL, Met 및 Ile 로 이루어진 그룹 중에서 선택되고 ; X(Gly)는 Gly이며 ; X(Ile)는 Ile, Met, Phe, Val 및 Leu 로 이루어진 그룹 중에서 선택되고 ; X(Phe)는 Phe, Met, Tyr, Ile 및 Leu로 이루어진 그룹 중에서 선택되며 ; X(Tyr)은 Tyr 및 Phe 로 이루어진 그룹 중에서 선택되고 ; X(His)는 His, GIn 및 Arg로 이루어진 그룹 중에서 선택되며 ; X(Gln)은 Gln, Glu 및 His 로 이루어진그룹 중에서 선택되고 ; X(Asn)은 Asn 및 Asp로 이루어진 그룹 중에서 선택되며 ; X(Glu) 는 Glu 및 Gln으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고 ; X(Lys)는 Lys 및 Arg로 이루어진 그룹 중에서 선택되고 ; X(Asp)는 Asp 및 Asn으로 이루어진 그룹중에서 선택되며 ; X(Met)는 Met, Phe, Ile, Val 및 Leu로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
6. 제 5 항에 있어서, X(Arg)가 Arg이고 ; X(Leu)가 Leu, Ile 및 Met로 이루어진 그룹 중에서 선택되며 ; X(Pro)가 Pro 이고 : X(Ala)가 Ala이며 ; X(Val)이 Val이고 ; X(Ile)가 Ile, Met 및 Leu로 이루어진 그룹 중에서 선택되며 ; X(Phe)가 Phe이고 ; X(Tyr)이 Tyr이며 ; X(His)가 His이고 ; X(Gln)이 Gln이며 ; X(Asn)이 Asn이고 ; X(Lys)가 Lys 이며 ; X(Asp)가 Asp이고 ; X(Glu)가 Glu이며 ; X(Met)가 Met, Ile 및 Leu로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 단백질.
7. 제 6 항에 있어서, 글리코실화되거나 비그리코실화된 폴리펩타이드가 하기 서열식으로 정의되는 단백질.

   His-Lys-Cys-Asp- Ile- Thr-Leu-Gin-Glu-Ile-

   Ile-Lys-Thr-Leu-Asn-Ser-Leu-Thr-Glu-Gln-

   Lys-Thr-Leu-Cys-Thr-Glu-Leu-Thr-Val-Thr-

   Asp-Ile-Phe-Ala-Ala- Ser-Lys-Asn-Thr-Thr-

   Glu-Lys-Glu-Thr-Phe-Cys-Arg-Ala-Ala-Thr-

   Val-Leu-Arg-Gln-Phe-Tyr-Ser-His-His-Glu-

   Lys-Asp-Thr-Arg-Cys-Leu-Gly-Ala-Thr-Ala-

   Gln-Gln-Phe-His-Arg-His-Lys-Gln-Leu-Ile-

   Arg-Phe-Leu-Lys-Arg-Leu-Asp-Arg-Asn-Leu-

   Trp-Gly-Leu-Ala-Gly-Leu-Asn-Ser-Cys-Pro-

   Val-Lys-Glu-Ala-Asn-Gln-Ser-Thr-Leu-Glu-

   Asn-Phe-Leu-Glu-Arg-Leu-Lys-Thr-Leu-Met-

   Arg-Glu-Lys-Tyr-Ser-Lys-Cys-Ser-Ser
8. 제 3 항에 있어서, 사람의 인터로이킨-4가 사람의 인터로이킨-4 뮤테인 Δ^1-4인 단백질.
9. 치료적으로 적합한 담체와 사람의 인터로이킨-4 유효량을 포함하는 면역계 자극용 약제학적 조성물.
10. 제 9 항에 있어서, 사람의 인터로이킨-4가 제 5 항의 단백질 중에서 선택된, 인터로이킨-2의 치료 효과 강화용 약제학적 조성물.
11. 제 10 항에 있어서, 사람의 인터로이킨-4가 제 7항의 단백질인 약제학적 조성물.
12. 제 9 항에 있어서, 사람의 인터로이킨-4가 제 7항의 단백질 중에서 선택된, GM-CSF의 치료 효과 강화용 약제학적 조성물.
13. 제 12 항에 있어서, 사람의 인터로이킨-4가 제 7 항의 단백질인 약제학적 조성물.
14. 제 7 항에 있어서, B세포상의 제 II형 MHC 항원의 발현 자극용인 약제학적 조성물.
15. 사람의 인터로이킨-4 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 코드화하는 뉴클레오타이드 서열(여기에서, 뉴클레오타이드 서열은 벡터를 함유하는 숙주에 의해 발현가능하고 pcD-125 삽입물과 적어도 50% 동종이다)을 포함하는 벡터를 제조하고, 벡터를 숙주에 삽입시킨 후, 뉴클레오타이드 서열을 폴리펩타이드로 발현시키기에 적절한 조건하에 벡터-함유 숙주를 유지시키는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 사람의 인터로이킨-4활성을 나타내는 폴리펩타이드를 제조하는 방법.
16. 제 15 항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열이 제 6 항에서 정의한 폴리펩타이드를 코드화하는 서열 중에서 선택되는 방법.
17. 제 15 항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열이 제 7 항에서 정의한 폴리펩타이드를 코드화하는 서열 중에서 선택되고, 숙주가 포유동물 세포인 방법.
18. 제 6항에 있어서, 글리코실화되거나 비글리코실화된 폴리펩타이드 아미노산 잔기 3 내지 29, 35 내지 66, 78 내지 87, 98및 99, 및 105 내지 125로 정의된 영역내에서 1회 이하로 삽입된 단백질.
19. 제 6 항에 있어서, 사람 인터로이킨-4가 사람 인터로이킨-4 뮤테인 IS°(Gly-Asn-Phe-Val- His-Gly)인 단백질.
20. 제 6 항에 있어서, 사람 인터로이킨-4가 사람 인터로이킨-4 뮤테인 IS°(Ala-Glu-Phe)인 단백질.
21. 제 6항에 있어서, 글리코실화되거나 비글리코실화된 폴리펩타이드가 아미노산 잔기 3 내지 29, 35 내지 66, 78 내지 87, 98및 99, 및 105 내지 125로 정의된 영역내에서 1회 이하로 삽입되거나, 1회 이하로 결실되거나, 1회 이하로 치환된 단백질.

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