HU208710B - Method for preparation of mammalian human il-4, dna encoding il-4, host cell and pharmaceutical composition comprising human il-4 - Google Patents

Description

A jelen találmány általánosságban az emlős immunrendszer protein és mutein faktoraira, valamint az ezeket kódoló nukleinsavakra vonatkozik. Részletesebben, a találmány olyan protein és mutein faktorokra (egyszersmind az őket kódoló nukleinsavakra is) vonatkozik, amelyek T sejt növekedési faktor hatást és B sejt növekedési faktor hatást együttesen fejtenek ki.

A rekombináns DNS technológia általánosságban egy olyan módszer, amikor egy donortól származó genetikai információt vektorokba integrálunk az információ további felhasználása céljából, például gazdasejtbe való beépítése révén, amikor is az átvitt genetikai információ új környezetben lemásolódik és/vagy kifejeződik. A genetikai információ általában olyan komplementer DNS (cDNS) formájában létezik, amely egy kívánt protein terméket meghatározó messenger RNStől (mRNS) származik. A hordozó gyakran olyan plazmid, amely képes arra, hogy e cDNS-t befogadja, hogy az a későbbiek folyamán egy gazdasejtben replikálódjék. A plazmid bizonyos esetekben ténylegesen a cDNS kifejeződését szabályozza, s ezáltal a kódolt terméknek a gazdasejtben való közvetlen szintetizálódását.

Jó ideje ismeretes, hogy az emlősöknél az immunválasz egy sorozat sejtek közti komplex kölcsönhatáson, az ún. „immun térháló” („immuné network”) működésén alapul. A legújabb kutatások révén új bepillantást nyerhettünk e térháló belső működésébe. Bár teljesen világos, hogy a válaszok nagy része valóban a limfociták, makrofágok, granulociták és más sejtek hálószerű kölcsönhatása révén jön létre, azonban az immunológusoknak most általában az a véleményük, hogy a szolubilis proteinek (például az ún. „limfokinek”, vagy „monokinek”) meghatározó szerepet játszanak a sejtek közti kölcsönhatások szabályozásában. Ezért igen jelentős érdek fűződik a sejt modulátor faktorainak az izolálásához, vizsgálatához és hatásmechanizmusuk megismeréséhez, valamint annak megismeréséhez, hogy melyik fog jelentős áttörést hozni számos betegség diagnózisában és terápiájában.

A limfokinek kétségtelenül különböző módon közvetítik a sejt-aktivitásokat. Kimutatták róluk, hogy elősegítik a pluripotens hematopoetikus őssejtek szaporodását, növekedését és differenciálódását roppant nagyszámú progenitor sejtre, amelyekből immunválaszért felelős különböző sejtvonalak indulnak ki. Ezek a sejtvonalak gyakran válaszolnak másként, ha a limfokineket egyéb anyagokkal együttesen alkalmazzák.

Az immunválasz szempontjából különösen fontos sejtvonalakhoz két limfocita osztály tartozik: B sejtek, amelyek az immunglobulinokat (proteinek, amelyek képesek felismerni és megkötni idegen anyagokat, hogy ezeket eltávolíthassák) termelik és szekretálják, és a különböző alcsoportba tartozó T sejtek, amelyek a limfokineket szekretálják, továbbá indukálják vagy gátolják a B sejteket és néhány más sejtet is (beleértve más T sejteket is). E két sejt-osztály alkotja meg az immun térhálót.

Egy másik fontos sejttípus a hízósejtek (bizonyítottan ezt a sejttípust még nem minden emlős fajban mutatták ki). A hízósejtek granulumokat tartalmazó kötőszöveti sejtek, amelyek a testet behálózó kapilláris erek közelében helyezkednek el, és különösen nagy sűrűségben találhatók a tüdőben, bőrben, a gyomor-bél csatornában és a húgy- és ivarszervi traktusban. A hízósejtek központi szerepet játszanak az allergiával összefüggő rendellenességekben - különösen az anafilaxiában - a következő módon: amikor a hízósejt felületén lévő receptorokhoz kötődött valamely immunglobulin osztály egy tagjával bizonyos antigének keresztreakcióba lépnek, a hízósejt degranulálódik és mediátorokat bocsát ki (például hisztamint, szerotonint, heparint, prosztaglandinokat stb.), amelyek allergiás reakciókat, például anafilaxiát, okoznak.

A különböző immun-rendellenességek jobb megismerésére (és ezáltal ezek potenciális gyógykezelésére) irányuló kutató munkát eddig az akadályozta, hogy az immunrendszer sejtjeit általában nem lehetett in vitro fenntartani. Immunológusok fedezték fel, hogy ezeknek a sejteknek a tenyésztését T sejt- és más sejt-felülúszók segítségével, amelyek különböző növekedési faktorokat - ilyen néhány limfokin - tartalmaznak, meg lehet oldani.

Ezeknek a faktoroknak, ilyenek a limfokinek és az immunreakciókban részt vevő más szolubilis mediátorok, a kimutatása, izolálása és tisztítása rendkívül nehezen kivitelezhető és gyakran bonyolult a felülúszó amiben általában fellelhetők - tulajdonságai miatt: az elegyekben a különböző komponensek egymás ellen hatnak és a hatások egymást keresztezik. Nehézséget jelent a faktorok tulajdonságainak meghatározására használt módszerek érzékenysége (vagy éppen hiánya), továbbá, hogy a faktorok molekulatömeg tartománya vagy más tulajdonságaik is, gyakran hasonlóak, és, hogy ezek a faktorok igen alacsony koncentrációban vannak jelen természetes előfordulási helyeiken.

Ahogy mind több limfokin lesz hozzáférhető, elsősorban a molekuláris klónozási eljárások révén, úgy nő a fontossága annak, hogy klinikai alkalmazásukat megtalálják. A hormonokhoz való fiziológiai hasonlóságuk miatt (például, hogy szolubilis faktorok, növekedés mediátorok, hatásukat sejt receptorok révén fejtik ki), a limfokinek potenciális felhasználását a hormonok általánosan elterjedt használatához hasonlítják [Dexter, Natúré, 321, 198 (1986)]. Remény van arra, hogy egy betegben a limfokinek szintjét közvetlenül vagy közvetve úgy lehet majd manipulálni, hogy jótékony immunválaszt hozzanak létre, például, hogy meggátolják a gyulladásokat, az allergiát vagy a szövet kilökődést, továbbá, hogy vagy stimulálással vagy potenciálással hassanak fertőzés és rosszindulatú burjánzás ellen. A limfokinek egyéb lehetséges klinikai felhasználása közt szerepelhet az is, amikor egy személy immunrendszerének bizonyos sejt populációját in vitro fenntartjuk és szaporítjuk abból a célból, hogy esetleg visszaadjuk ugyanazon személynek vagy másnak, bizonyos jótékony hatás elérése érdekében. Például, vizsgálatok vannak folyamatban annak meghatározására, vajon egy beteg limfokinnel aktivált killer T sejt populációját fel lehet-e szaporítani az illető szervezetén kívül, majd visszaad2

HU 208 710 Β ni számára, hogy szervezetében fokozott tumorellenes hatást idézzen elő. A limfokineknek, főleg a telep serkentő faktoroknak (CSF = colony stimulating factor), ilyen a granulocita-makrofág telep serkentő faktor (GM-CSF = granulocyte-macrophage colony stimulating factor) és az ezek hatékonyságát fokozó faktoroknak egy másik lehetséges klinikai felhasználása a vérsejt termelődés stimulálásban van, például a tumorellenes terápiában a kemoterápiát vagy besugárzást megelőzően vagy ezután alkalmazva, a myeloid hipopláziák (csontvelő fejletlensége) kezelésében, vagy a neutrofil-hiány tünetegyüttesek (neutrophil deficiency syndromes) kezelésében [Dexter, Natúré, 321, 198 (1986)]. Ezek a faktorok hasznosak lehetnek a csontvelő átültetéssel járó terápiában, amit egyre többször alkalmaznak veleszületett anémiák és bizonyos leukémiák esetében.

A limfokineknek két olyan tulajdonságuk van, amelyek fontos következményekkel járnak klinikai alkalmazásuk esetén: az egyedi limfokinek gyakran pleiotrópok; egy limfokin biológiai hatékonysága rendszerint legalább egy másik limfokinnel módosítható; vagy gátlással, vagy fokozással. Például a tumor nekrózisfaktor, amely a gamma-interferonnal szinergetikus, stimulálja az interleukin-1 (IL-1) termelést és aktiválhatja a neutrofilek fagocitálóképességét. Az IL-1 protein, amelyet aktivált makrofágok termelnek, a biológiai hatások széles változatát közvetíti, s ezek a következők: stimulálja a timocita proliferációt interleukin-2 (IL-2) kiválasztás indukciója révén; stimulálja a B limfociták érését és proliferációját; fibroblaszt növekedési faktor aktivitást fejt ki; indukálja a hepatocitákat akut fázisú protein szintézisre. Azt is közölték, hogy az IL-1 stimulálja a szinoviális sejtekből (ízületi sejtek) való prosztaglandin és kollagenáz kiválasztást, és hogy identikus az endogén pirogénnel [Krampschmidt, J. Leuk. Bioi., 36, 341— 355 (1984)].

Az interleukin-2, amelyet régebben T sejt növekedési faktornak neveztek, egy olyan limfokin, amelyet lektinnel vagy antigénnel aktivált T sejtek termelnek. Az IL—2 eddig közölt biológiai hatásai közé tartóznak a következők: stimulálja az aktivált T sejt kiónok hoszszantartó in vitro növekedését, fokozza a timociták mitogenezisét és indukálja a citotoxikus T sejtek reaktivitását és a plakk képző sejt-válaszokat csupasz egerek lépsejtjeinek a tenyészetében. Ezenkívül, kimutatták, hogy mint az interferonok (IFN), az IL-2 növeli a természetes killer sejtek aktivitását, s így feltételezhető, hogy potenciálisan felhasználható a neoplazmás betegségek kezelésében [Henney és munkatársai, Natúré, 291, 335-338 (1981)]. Az ilyen kezelések eredményességéről közlemények számolnak be [Lotze és Rosenberg: „Treatment of Tumor Patients with Purified Humán Interleukin-2”, a „Cellular and Molecular Biology of Lymphokines” c. kiadványban, 711-719. oldal, szerkesztették Sorg és munkatársai, kiadó: Academic Press, Inc., New York (1985), és Rosenberg és Lotze: „Cancer Immunotherapy Using Interleukin-2 and Interleukin-2Activated Lymphocytes”, Ann. Rév. Immunoi., 4,681709 (1986)]. Az EL-2 toxicitása azonban határt szab az adagolásnak, amikor e tulajdonságait felhasználva, rákos betegeknél alkalmazzák [Lotze és Rosenberg (711-719. old.) és Welte és munkatársai (755-759. old.) közleményei a Sorg és munkatársai fent idézett kiadványában],

D. Metcalf [The Hematopoietic Colony Stimulatin Factors, Elsevier, Amsterdam (1984)] összefoglalta az emlős immunválaszban szerepet játszó limfokinekkel és a különböző növekedési faktorokkal végzett kutatásokat. Y.-P. Yung és munkatársai [J. Immunoi., 127, 794 (1981)] leírták annak a mintegy 35 kD (kilo-dalton) molekulatömegű proteinnek a részleges tisztítását, amely hízósejt növekedési faktor aktivitást (MCGF = mást cell growth factor) fejt ki és az interleukin-2-től (IL-2), T sejt növekedési faktor néven is ismeretes (TCGF = T cell growth factor) - való elválasztását. G. Nabel és munkatársai [Natúré, 291, 332 (1981)] egy olyan MCGF-et talált, amelynek molekulatömege körülbelül 45 kD és pl értéke (izoelektromos pontja) körülbelül 6,0. I. Clark-Lewis és J. Schrader [J. Immunoi., 127, 1941 (1981)] egy olyan proteinről írtak, melynek hízósejt-szerű növekedési faktor aktivitása van, molekulatömege foszfáttal pufferolt izotóniás konyhasó oldatban körülbelül 29 kD, pl értéke 4-8, de neuraminidáz kezelés után 6-8. Az egérfélékben található IL-2 és interleukin-3 (D_-3) részleges biokémiai vizsgálatát S. Gillis és munkatársai [J. Immunoi., 124, 1954—1962 (1980)] és J. Ihle és munkatársai [J. Immunoi., 129,2431-2436 (1982)] végezték el. Vizsgálataik szerint az IL-2 (valószínűleg mint dimer) molekulatömege körülbelül 28 kD. Úgy tűnik, hogy a humán IL-2 molekulatömege 15 kD körüli [S. Gillis és munkatársai, Imm. Rév., 63, 167-209 (1982)]. A T sejt felülúszók IL-3 és MCGF aktivitásának összehasonlítását Y. Yung és M. Moore [Contemp. Top. Mól. Immunoi., 10, 147-179 (1985)], valamint D. Rennick és munkatársai [J. Immunoi., 134, 910—919 (1985)] végezték el.

Bőséges irodalom foglalkozik a B sejt növekedését és differenciálódását szabályozó szolubilis faktorokkal. Példák az összefoglaló közleményekre: Howard és Paul, Ann. Rév. Immunoi., 1, 307-333 (1983); Howard és munkatársai, Immunoi. Rév., 78, 185-210 (1984); Kishimoto és munkatársai, Immunoi. Rév., 78, 97-118 (1984) és Kishimoto, Ann. Rév. Immunoi., 3, 133-157 (1985). A különböző faktorok elnevezése terén bizonyos zűrzavar uralkodik, ennek oka az, hogy a kiindulási anyagok különbözőek, a tisztítás nehezen végezhető el és különböznek a biológiai hatékonyság meghatározására használt módszerek is. A nómenklatúrával kapcsolatban - úgy tűnik - bizonyos esetekben egyetértés jött létre [Paul, Molecular Immunoi., 21, 343 (1984) és Paul, Immunology Today, 4, 322 (1983)]. A B sejt növekedési faktor (BCGF) hatására jellemző, hogy olyan B sejtekben, amelyeket anti-IgM-mel vagy hasonló antigénekkel kostimuláltak, DNS szintézist képes megindítani. Úgy tűnik, hogy interleukin-1-re is szükség van ahhoz, hogy a BCGF aktivitás megnyilvánuljon, leg3

HU 208 710 Β alábbis, ha a vizsgálatot kis sűrűségű B sejtekkel végzik. A BCGF aktivitás meghatározására több alternatív módszert írtak le, például: Maizei és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci., 80, 5047-5051 (1983); humán B sejtek növekedésének hosszantartó fenntartása tenyészetben]. Az előbbi vizsgálathoz kapcsolódó aktivitás B sejt stimuláló faktor-1 (BSF-1) aktivitásnak és BCGF I néven is nevezik, hogy megkülönböztessék hasonló és/vagy rokon hatásoktól. Nevezetesen egy BCGF II elnevezésű aktivitást is leírtak. Ez az aktivitás DNS szintézist képes megindítani mitogénnel stimulált B sejtekben vagy transzformált B sejtvonalakban. A BCGF II aktivitáshoz kapcsolódó mitogének közé tartozik a dextrán szulfát, a lipopoliszacharidok és a Staphylococcus kivonatok. A BCGF I ezekben a vizsgálatokban nem jelez választ. Feltehető, hogy emberben a BCGF II egy körülbelül 50 kD molekulatömegű molekula, amely szinergetikusan hat a BCGF I-gyel (azaz a DSF-l-gyel), elősegítvén a B sejtek proliferációját valamely immunválasz esetén [Yoshizaka és munkatársai, J. Immunoi., 130, 1241-1246 (1983)]. Howard és munkatársai [J. Exp. Med., 155, 914-923 (1982)] elsőként mutatták ki egérfélékben BCGF jelenlétét (későbbi különböző elnevezései: BCGF I, BSF-1, vagy IgGj indukciós faktor) elkülönítve az interleukin-2-től. Majdnem ugyanakkor egy humán rendszerben hasonló megfigyelésről számoltak be Yoshizaka és munkatársai [J. Immunoi., 128, 1296-1301 (1982)] és később Okada és munkatársai [J. Exp. Med., 157,583-590 (1983)].

Ezen első felfedezések után állandó fejlődés következett be a BCGF vagy BSF-1 aktivitású molekulák biológiai vizsgálata terén. Maizei és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci., 79,5998-6002 (1982)] beszámoltak egy tripszin-érzékeny humán BCGF-ról, melynek molekulatömege 12-13 kD és izoelektromos pontja (pl) 6,3-6,6 körüli. Farrar és munkatársai [J. Immunoi, 131, 1838-1842 (1983)] 11 és 15 kD molekulatömegű (SDS-PAGE módszerrel meghatározva; SDS-PAGE = nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gél elektroforézis) és 6,4-8,7 pl értékű egér BCGF részleges tisztítását végezték el. Ohara és Paul [Natúré, 315, 333-336 (1985)] leírták egy egér BSF-l-re specifikus monoklonális antitestet és a BSF-1-re a következő molekulatömegeket adták meg: 14 kD és 19-20 kD; pl = 6,7. Butler és munkatársai [J. Immunoi., 133, 251-255 (1984)] egy 1820 kD molekulatömegű humán BCGF-et írtak le,

6,3-6,6 pl értékkel. Rubin és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 2935-2939 (1985)] közölték, hogyha a nyugvó B sejteket anti-IgM antitestekkel való kezelés előtt BSF-1-gyei előinkubálták, növekedett a sejt-térfogat és később, amikor az anti-IgM antitestek hatásának voltak kitéve, siettette az S-fázisba lépést. Vitetta és munkatársai [J. Exp. Med., 162, 1726-1731 (1985)] egér BSF-1 részleges tisztítását végezték el EL-4 sejtek szérum-mentes felülúszóiból, reverz HPLC segítségével. Az SDS-PAGE analízis egy körülbelül 20-22 kD-os proteint mutatott ki. Ohara és munkatársai [J. Immunoi., 135, 2518—

2523 (1985)] szintén leírták, hogy hasonló módon végezték el az egér BSF-1 részleges tisztítását és közölték, hogy a faktor egy körülbelül 18-21,7 kD tömegű protein. Sideras és munkatársai [Eur. J. Immunoi., 15, 586-593 (1985)] beszámoltak egy egér IgG_rinduktor faktor - azaz a BSF-1 - részleges tisztításáról és megállapították, hogy a faktor egy körülbelül 20 kD-os protein, melynek pl értéke 7,2-7,4 és 6,2-6,4. Smith és Rennick [Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 1857-1861 (1986)] egy olyan faktornak az IL-2-től és IL-3-tól való elválasztását végezték el, melynek T sejt növekedési faktor tulajdonsága és hízósejt növekedési faktor tulajdonsága volt. Később, Noma és munkatársai [Natúré, 319, 640-646 (1986)] klónozták és szekventálták a Sideras és munkatársai féle faktort kódoló nukleinsavat, majd Lee és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 2061-2065 (1986)] klónozták és szekventálták a Smith- és Renncik-féle faktort kódoló nukleinsavat. Legutóbb Grabetein és munkatársai [J. Exp. Med., 163, 1405-1414 (1986)] közölték, hogy tisztították és szekventálták az egér BSF-1-et.

Milanese és munkatársai [Science, 231, 1118-1122 (1986)] egy olyan limfokint írtak le, mely nincs rokonságban a BSF-l-gyel, s ideiglenesen IL-4A-val jelölték. Az általuk kimutatott IL-4A egy 10-12 kD-os protein, melyet helper T sejtek választanak ki, miután kereszt-reagáltak a T3-Ti receptorokkal. Az anyag a nyugvó limfocitákat úgy stimulálja, hogy reagál a Tll receptorokkal és ezután indukálja az interleukin-2 (IL2) receptorokat.

Sanderson és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 437-440 (1986)] javasolták, hogy az eozinofil differenciációs faktor elnevezése legyen interleukin-4, minthogy bizonyos, hogy azonos a B sejt növekedési faktor II-vel.

Az előbbiekből világosan kitűnik, hogy az új limfokinek felfedezése és vizsgálataik kifejlesztése hozzájárulhat az olyan degeneratív állapotok széles körében a gyógykezelések fejlesztéséhez, ahol közvetlenül vagy közvetve az immunrendszer és/vagy a hematopoetiküs sejtek játszanak szerepet. Amaz, olyan limfokineknek a felfedezése és kifejlesztése, amelyek az ismert limfokinek jótékony hatását fokozzák és potenciálják, nagyon előnyös lenne. Például a tumor terápiában az IL-2 dózisbehatároló toxicitást csökkenteni lehetne, ha olyan limfokin vagy kofaktor állna rendelkezésre, amelynek potenciáló hatása van; vagy növelhető lenne a csontvelő átültetés hatékonysága, ha olyan faktorokkal rendelkeznének, amelyek a telep stimuláló faktor hatását potenciálnák.

A jelen találmány a humán interleukin-4-re (EL-4) vonatkozik. A találmány magába foglalja az IL-4 aktivitást kifejtő polipeptideket kódoló nukleinsavakat, valamint magukat a polipeptideket és előállításuk módszereit. A találmány szerinti nukleinsavakat az jellemzi, hogy (1) a találmány szerinti klónozott komplementer DNS-sel (cDNS-sel) homológok, és hogy (2) a nukleinsavak kódolta polipeptidekhez az IL-4 aktivitás funkcionális vizsgálatai alkalmazhatók. Egy proteinnel vagy egy polipeptiddel kapcsolatban itt használt „IL-4

HU 208 710 Β aktivitás” kifejezés azt jelenti, hogy a protein vagy a polipeptid B sejt növekedési faktor aktivitást (BCGF) és T sejt növekedési faktor aktivitást (TCGF) együtt fejti ki. Egy adott emlősben az IL-4 aktivitást fajspecifikus TCGF és BCGF vizsgálatokkal határozzuk meg. Mint, ahogy ezt a későbbiekben részletesebben kifejtjük, az IL-4 specifikus változatai kiegészítő vizsgálatokkal pontosabban jellemezhetők. Például az egér IL4 bizonyos formái hízósejt növekedési faktor (MCGF) aktivitást is mutatnak; a humán és az egér IL-4 bizonyos formái potenciálják az IL-2 TCGF aktivitását; az egér és a humán IL-4 bizonyos formái potenciálják bizonyos sejttípusokban a GM-CSF által stimulált proliferációt; a humán és az egér IL-4 bizonyos formái indukálhatják Fc-epszilon receptorok megjelenését B sejteken; végül, a humán és egér IL-4 bizonyos formái indukálhatják a fő hisztokompatibilitási komplex (MHC = major histocompatibility complex) antigénjeinek a megnyilvánulását B sejteken; a II osztály DR antigénjét humán B sejteken és az la antigént egér B sejteken.

A találmány részben olyan cDNS-ek felfedezésén és klónozásán alapszik, amelyek IL-4 aktivitású proteinek kifejezésére képesek. A találmány szerinti cDNS kiónok közé tartozik a „klón 46” elnevezésű plazmid vektorba beépített humán cDNS (itt pcD-2Fl-13 vagy pcD-46 jelzéssel szerepel) és a „klón 125” elnevezésű plazmid vektorba beépített humán cDNS (itt pcD-125 jelzéssel is szerepel), valamint a pcD-2A-E3 plazmid vektorba beépített egér cDNS. A három vektort letétbe helyeztük az American Type Culture Collection intézményben (Rockville, MD., USA) (ATCC) 53 337, 67 029, illetve 53 330 letéti szám alatt.

A találmány tárgyát képezik azok a nukleinsavak is, amelyeknek a nukleotid szekvenciája hatékonyan homológ a találmány szerinti cDNS klónokéival, és amelyek IL-4 aktivitást mutatnak. A találmány szerinti nukleinsavakat és proteineket előállíthatjuk a fent említett cDNS-ekből nukleinsav szekvenciák mutációjára alkalmas szokásos módszerekkel. Elő lehet állítani a nukleinsavakat de novo az immunrendszerből származó sejtvonalakból, ilyenek a T sejt hybridomák, amelyek IL-4-et kódoló mRNS szekvenciákat tartalmaznak, vagy úgy indukálhatok, hogy ilyen mRNS szekvenciákat tartalmazzanak; és előállíthatók úgy is, hogy DNS vagy RNS kivonatokat vagy gyűjteményeket vizsgálunk olyan próba-anyagokkal, amelyek a találmány szerinti cDNS klónokból származnak.

Az itt használt „hatékonyan homológ” („effectively homologcus”) kifejezés azt jelenti, hogy a nukleotid szekvencia a találmány szerinti cDNS klónból származó hibridizációs próba-anyaggal kimutatható. Az IL-4 aktivitást kódoló nukleinsavak kimutatásához szükséges homológia pontos számszerű mértéke több faktortól függ: 1. mennyire homológ a próbaanyag azokkal a nem-IL-4 kódoló szekvenciákkal, amelyek a cél nukleinsavakkal vannak kapcsolatban;

2. a hibridizációs körülmények meghatározottsága; 3. szimpla-szálú vagy dupla-szálú próba-anyag használata; 4. RNS vagy DNS próba-anyag használata; 5. milyen rendszabályokat alkalmazunk a próba-anyag nem specifikus kötődésének a csökkentésére; 6. a próba-anyag kimutatására szolgáló jelzés természete;

7. a próba-anyagban lévő guanidin- és citozin-bázis frakció; 8. a próba-anyag és célanyag között lévő nem illeszkedő szakaszok eloszlása; 9. a próbaanyag mérete; és ehhez hasonlók.

Előnyös, ha a találmány szerinti cDNS-ből származtatott hatékonyan homológ próba-anyag legalább 50%-ban homológ az izolálandó szekvenciával. Még előnyösebb, ha a hatékonyan homológ próba-anyag legalább 75-80%-ban homológ az izolálandó szekvenciával. A legelőnyösebb, ha a hatékonyan homológ próba-anyag legalább 90%-ban homológ az izolálandó szekvenciával.

A homológia, ahogyan ezt a kifejezést használjuk, két nukleotid (vagy aminosav) szekvencia közötti hasonlóság mértéke. A homológiát az egymáshoz illő bázisok (vagy aminosavak) részarányban vagy százalékában fejezzük ki, miután két szekvencia (feltehetően nem egyenlő hosszúságú) egymás mellé igazodott. Az igazodás (alignment) kifejezést a Sankoff és Kruskal által [Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison c. kiadvány első fejezetében; Addison-Wesley, Reading, MA., USA (1983)] meghatározott értelemben használjuk. Röviden: két szekvencia akkor igazodik egymáshoz, ha minimális számú „üres” vagy „null” bázisnak az egyik szekvenciában való beépítése révén maximális lesz a két szekvencia közti egymáshoz illő bázisok (vagy aminosavak) száma, a maximális átfedés biztosítása érdekében. Két adott szekvencia esetében algoritmusok állnak rendelkezésre homológiájuk komputeres megállapítására [például: Needleham és Wunsch, J. Mól. Bioi., 48, 443-453 (1970); Sankoff és Kruskal (lásd a fent idézett munka 23-29. oldalát)]. Kereskedelmi szervizek is végeznek ilyen összehasonlító vizsgálatokat, például az Intelligenetics, Inc., (Palo Alto, CA., USA).

A jelen találmány azokra a természetes emlős növekedési faktorokra (polipeptidekre) vonatkozik, amelyek széles spektrumú hatást gyakorolnak az immunválaszban részt vevő számos sejtre. A találmány az ilyen faktorok termelésére és emlősök in vivő kezelésére ad módszereket. Ezek a polipeptid készítmények egy olyan, lényegében tisztán előállított emlős faktort tartalmaznak, amely B sejt, T sejt és hízósejt stimuláló hatást fejtenek ki.

Az ilyen faktorok, amelyeket eredetileg különböző T sejtek felülúszó folyadékából izoláltak, természetes polipeptidek - molekulatömegük nem-redukáló körülmények közt körülbelül 20 kD vagy 15 kD - vagy e polipeptidek aktív fragmentumai. A faktorok önállóan vagy más vegyületekkel együtt, különböző diagnosztikus vagy terápiás célokra használhatók, valamint specifikus antitestek termelésére.

, A találmány egy előnyös változata az alábbi I. képlettel jellemzett, glükozilált vagy nem glükozilált humán IL-4 proteinekből álló készlet.

HU 208 710 Β

X(His) - X(Lys) - X(Cys)

X(Leu) - X(Gln) - X(Glu)

X(Thr) - X(Leu) - X(Asn)

X(Glu) - X(Gln) - X(Lys)

X(Thr) - X(Glu) - X(Leu)

X(Asp) - X(ile) - X(Phe)

X(Lys) - X(Asn) - X(Thr)

X(Glu) - X(Thr) - X(Phe)

X(Ala) - X(Thr) - X(Val)

X(Phe) - X(Tyr) - X(Ser)

X(Lys) - X(Asp) - X(Thr)

X(Gly) - X(Ala) - X(Thr)

X(Phe) - X(His) - X(Arg)

X(Leu) - X(lle) - X(Arg)

X(Arg) - X(Leu) - X(Asp)

X(Trp) - X(Gly) - X(Leu)

X(Asn) - X(Ser) - X(Cys)

X(Glu) - X(Ala) - X(Asn)

X(Leu) - X(Glu) - X(Asn)

X(Arg) - X(Leu) - X(Lys)

X(Arg) - X(Glu) - X(Lys)

X(Cys) - X(Ser) - X(Ser)

A képletben az X(Xaa) jelölés az Xaa aminosavval szinonim aminosavak csoportját jelenti. A csoporton belüli szinonim aminosavaknak eléggé hasonló fizikokémiai tulajdonságai vannak, s ha a csoport tagjait egymással helyettesítjük, a molekula biológiai funkciója megmarad [Grantham, Science, 185, 862-864 (1974)]. Természetesen a fent meghatározott szekvenciába aminosavakat építhetünk be és belőle aminosavakat is vehetünk el anélkül, hogy a biológiai funkció megváltozna, különösen, ha a beépítés vagy kivétel csak néhány, azaz tíznél kevesebb aminosavra terjed ki és nem távolítunk el és nem helyezünk át olyan aminosavakat, amelyek meghatározók a funkcionális konformáció szempontjából, mint a cisztein csoportok [Anfinsen: „Principles that Govem the Folding of Protein Chains”, Science, 181, 223-230 (1973)]. Ilyen deléciók és/vagy inszerciók segítségével előállított proteinek is a találmány oltalmi körébe tartoznak. Amikor az I képletű protein aminosav csoportjait a szövegben számmal jelöljük, a számot vagy számokat a protein N-terminális végére vonatkoztatjuk.

Az I. táblázat tartalmazza az előnyös szinonim aminosav csoportokat. Még előnyösebbek azok az aminosav csoportok, amelyek az I. táblázat minden sorában a második választó vonal előtt vannak felsorolva; és a legelőnyösebbek azok a szinonim aminosav csoportok, amelyek az I. táblázatban, minden sorban az első választó vonal előtt vannak felsorolva.

I. táblázat

Szinonim aminosavak előnyös csoportjai

Aminosav	Szinonim csoport
Ser	Ser, //Thr, Gly, Asn
Arg	Arg, /His, Lys, /Glu, Gin
Leu	Leu, He, Met, /Phe, /Val, Tyr

- X(Asp) - X(Ile) - X(Thr) - X(Ile) - X(Ile) - X(Lys) - X(Ser) - X(Leu) - X(Thr) - X(Thr) - X(Leu) - X(Cys) - X(Thr) - X(Val) - X(Thr) - X(Ala) - X(Ala) - X(Ser) - X(Thr) - X(Glu) - X(Lys) - X(Cys) - X(Arg) - X(Ala) - X(Leu) - X(Arg) - X(Gln) - X(His) - X(His) - X(Glu) - X(Arg) - X(Cys) - X(Leu) - X(Ala) - X(Gln) - X(Gln) - X(His) - X(Lys) - X(Gln) - X(Phe) - X(Leu) - X(Lys) - X(Arg) - X(Asn) - X(Leu) - X(Ala) - X(Gly) - X(Leu) - X(Pro) - X(Val) - X(Lys) - X(Gln) - X(Ser) - X(Thr) - X(Phe) - X(Leu) - X(Glu) - X(Thr) - X(Ile) - X(Met) - X(Tyr) - X(Ser) - X(Lys) -

Aminosav	Szinonim csoport
Pro	Pro, /Alá, /Thr, Gly
Thr	Thr, //Pro, Ser, Alá, Gly, His, Gin
Alá	Alá, /Pro, /Gly, Thr
Val	Val, /Met, Ile/Thr, Phe, Leu, Val
Gly	Gly, //Alá, Thr, Pro, Ser
Ile	He, Met, Leu, /Phe, Val, /He, Tyr
Phe	Phe, /Met, T/r, Ile, Leu, /Trp, Val
Tyr	Tyr, /Phe, /Trp, Met, Ile, Val, Leu
Cys	Cys, Ser, //Thr
His	His, /Gin, Arg, /Lys, Glu, Thr
Gin	Gin, /Glu, His, /Lys, Asn, Thr, Arg
Asn	Asn,/Asp, /Ser, Gin
Lys	Lys, /Arg, /Glu, Gin, His
Asp	Asp, /Asn,/Glu
Glu	Glu, /Gin, /Asp, Lys, Asn, His, Arg
Met	Met, Ile, Leu, /Phe, Val/

A találmányhoz tartoznak azok az (I) képletű polipeptidek is, amelyekben aminosav szubsztitúciók (ami50 kor a natív humán IL-4 valamely aminosavját egy szinonim aminosav helyettesíti) találhatók egyetlen pozícióban vagy több pozícióban. Az „n-szer szubsztituált” kifejezést arra használjuk, hogy az (I) képlettel meghatározott polipeptideknek egy alfaját jellemez55 zük, amelyben az eredeti aminosavakat szinonim aminosavakkal helyettesítettük legalább n pozícióban. Tehát: például az (I) képletű 1-szer szubsztituált polipeptidek csoportja 559 polipeptidet tartalmaz az előnyös szinonim aminosav csoportokat illetően, 189 polipepti60 det az előnyösebb szinonim aminosav csoportokat és

HU 208 710 Β polipeptidet a legelőnyösebb szinonim aminosav csoportokat illetően. Ezekhez a számokhoz úgy jutunk, hogy az eredeti lánc minden aminosav típusát összeadjuk és az illető aminosavra nézve szinonim aminosav csoport tagszámával megszorozzuk. Előnyös a humán IL-4 polipeptidek olyan csoportja, amely 10-szer szubsztituált (I) képletű polipeptidekből áll, még előnyösebb, ha 3-szor szubsztituált (I) képletű polipeptidekből áll és a legelőnyösebb, ha 1-szer szubsztituált (I) képletű polipeptidekből áll, s ehhez a csoporthoz főként a natív humán IL-4 polipeptid tartozik, amelynek szekvenciáját az IC ábra mutatja be.

Hasonlóképpen, ha az „n-szer inszertált” kifejezést használjuk az (I) képletű peptidekkel kapcsolatban, úgy a polipeptidek egy olyan csoportját jellemezzük, amelyben az (I) képlettel leírt szekvenciába 1-től n-ig terjedően építettünk be aminosavakat. Előnyös, ha a beépített aminosavakat a beépítést határoló aminosavakhoz szinonim aminosavak (I. táblázat) előnyös csoportjából választjuk ki; előnyösebb, ha ezeket, az inszerciót határoló aminosavakhoz szinonim aminosavak előnyösebb csoportjából (II. táblázat) választjuk ki és a legelőnyösebb, ha ezeket, az inszerciót határoló aminosavakhoz szinonim aminosavak legelőnyösebb csoportjából (III. táblázat) választjuk ki. Tehát például amikor az egyszer inszertált peptidek egy alcsoportjába az N-terminális X(His) és a mellette lévő X(Gly) közé építünk be egy aminosavat. Azokat az inszertumokat, amelyek ezt az alcsoportot jellemzik, a következő aminosavakból álló csoportból választjuk ki: Pro, Alá, Gly, Thr, Ser, Gin, Glu, Arg, His és Lys; előnyösebb, ha ezeket a következő aminosavakból álló csoportból választjuk ki: Gly, His, Gin és Arg és a legelőnyösebb, ha ezeket a His és Gly aminosavakból álló csoportból választjuk ki. Minden (I) képlet szerinti szomszédos aminosav közé építhetünk be aminosavat. Minthogy 128 lehetséges beépítési hely van és minthogy többszörös beépítéseket eszközölhetünk ugyanarra a helyre, az (I) képletű, 2-szer inszertált peptidek 16.384 peptid alcsoportot jelentenek és minden alcsoport nagysága a beépítéseket határoló aminosavakhoz szinonim aminosav csoportok nagyságától függ.

Az „n-szer deletált” kifejezést az (I) képletű polipeptidekre akkor használjuk, ha a peptidek egy olyan csoportját írjuk le, amelyben az (I) képlettel jellemzett szekvenciából 1-től n-ig terjedően aminosavakat távolítunk el. Tehát az 1-szer deletált (I) képlet szerinti polipeptidek csoportja 129 polipeptidből álló alcsoportot jelent, ahol minden polipeptid 128 aminosavból (hosszában) áll (128 merek). Minden alcsoportban, minden 128 mert az előnyös, előnyösebb és a legelőnyösebb szinonim aminosav csoport jellemzi.

A találmány fentiek szerint előnybe helyezett megvalósítása magában foglalja azokat a nukleotid szekvenciákat, amelyek hatékonyan homológok az előnyös, előnyösebb és legelőnyösebb szinonim aminosavak csoportjait magába foglaló (I) képletű polipeptidekkel vagy kódolják ezeket a polipeptideket. Az említett legelőnyösebb nukleotid szekvenciák képesek arra, hogy az előnyös, előnyösebb és legelőnyösebb szinonim aminosavak csoportjait magába foglaló (I) képletű polipeptideket kódolják.

A találmány főként a natív humán IL-4-re vonatkozik - aminosav szekvenciáját az IC ábrán mutatja be és minden olyan nukleotid szekvenciára, amely ezt kódolja.

Az aminosavak, nukleotidok, restrikciós endonukleázok és hasonló anyagok jelölésére mindvégig standard rövidítéseket alkalmazunk. Például: Cohn „Nomenclature and Symbolism of α-Amino Acids” Methods in Enzymology, 106,3-17 (1984); Wood és mun-. katársai, Biochemistry: A Problems Approach, 2. kiadás (Benjámin, Menlo Park, 1981); Roberts „Directory of Restriction Endonukleases”, Methods in Enzymology, 68,27-40 (1979).

A jelen találmány az immunrendszert szabályozó szerekkel kapcsolatos problémák megoldását tűzi ki célul, emberorvosok és/vagy állatorvosok által kezelt rendellenességek gyógyítása érdekében. A találmány főként olyan anyagokkal foglalkozik, amelyek jótékony hatást fejtenek ki, ha ezeket önállóan használjuk vagy más limfokinekkel és immun-mediátorokkal együtt hatásosak és így fejtenek ki jótékony hatást.

A következőkben a találmány előnyös kiviteli módozatait írjuk le, megvilágítva a csatolt ábrákkal (119. ábra).

Az 1A ábrán a pcD-2A-E3 vektor inszertumának nukleotid szekvenciáját és az ebből levezetett aminosav szekvenciát ábrázoljuk. A vektor egér IL-4-et fejez ki.

Az IB ábra a pcD-125 vektor inszertumának nukleotid szekvenciáját és az ebből következő aminosav szekvenciát ábrázolja. A vektor humán IL-4-et fejez ki.

Az IC ábra a pcD-125-tel transzformált COS 7 majom sejtek által kifejezett és szekretált tisztított natív humán IL-4 aminosav szekvenciáját mutatja be.

A 2A ábra a pcD-2A-E3 vektor térképe, melynek inszertuma az egér IL-4-et kódolja.

A 2B ábrán a pcD-2A-E3 vektor inszertumának restrikciós endonukleáz hasítási térképe látható.

A 2C ábrán a pcD-46 vektor térképét látjuk, amelynek inszertuma a humán IL-4-et kódolja.

A 2D ábrán a pcD-46 vektor inszertumának restrikciós endonukleáz hasítási térképe látható.

A 3A ábra különböző tenyészetek felülúszóinak köztük a pcD-2A-E3 vektorral transzficiált COS 7 sejttenyészet felülúszójának (1-es görbe) - viszonylagos TCGF aktivitását (a hígítások bizonyos tartományban) ábrázolja.

A 3B ábra különböző tenyészetek felülúszóinak köztük a pcD-2A-E3 vektorral transzficiált COS 7 sejttenyészet felülúszójának (1-es görbe) - viszonylagos MCGF aktivitását (a hígítások bizonyos tartományban) ábrázolja.

A 3C ábra a pcD-2A-E3-mal transzficiált COS 7 sejtek (1-es görbe), a Cl.Ly l⁺2/9 sejtek (2-es görbe) és az ál-tamszficiált COS 7 sejtek (3-as görbe) felülúszóinak adott mennyiségei által létrehozott la indukció viszonyított értékeit ábrázolja.

A 3D ábra grafikusan ábrázolja a pcD-2A-E3-mal transzficiált COS 7 sejtek felülúszói által kifejtett IgE

HU 208 710 B és IgG) indukció mértékét és különböző kontrollokat T sejtre kimerített egér lép sejtekben.

A 4A ábra számos pcD-125-tel transzficiált és kontroll felülúszó TCGF aktivitását ábrázolja. A mérést kolorimetriás proliferációs vizsgálattal végezzük, az IL-EBV faktor-depedens humán egér helper T sejtvonallal.

A 4B ábra egy pcD-125-tel transzficiált és kontroll felülúszó TCGF aktivitását ábrázolja. A meghatározást kolorimetriás proliferációs módszenei végezzük, PHA-val stimulált perifériás vér limfocitákon.

A 4C ábra egy pcD-125-tel transzficiált és kontroll felülúszó TCGF aktivitását ábrázolja, ahol tríciummal jelzett timidinnek a PHA-val stimulált perifériás vér limfocitákba való beépülését mérjük.

Az 5A ábra egy hisztogram, amely mandulából (tonsilla) származó stimulált B sejtek kontroll populációjának sejt frekvenciáját ábrázolja a fluoreszcencia intenzitással szemben; a B sejtek Fc-epszilon receptorait fluoreszceinnel jelöltük.

Az 5B ábra egy hisztogram, amely mandulából származó stimulált B sejt populáció sejt frekvenciáját ábrázolja a fluoreszcencia intenzitás függvényében; a B sejteket egy olyan közeg hatásának tettük ki, amely pcD-125-tel transzficiált COS 7 sejtek felülúszójából 0,1%-ot tartalmazott és a sejtek Fc-epszilon receptorait fluoreszceinnel jelöltük.

Az 5C ábra egy hisztogram, mely mandulából származó stimulált B sejt populáció sejt frekvenciáját ábrázolja a fluoreszcencia intenzitás függvényében; a B sejteket egy olyan közeg hatásának tettük ki, amely pcD-125-tel transzficiált COS 7 sejtek felülúszójából 1%-ot tartalmazott és a sejtek Fc-epszilon receptorait fluoreszceinnel jelöltük.

Az 5D ábra egy hisztogram, mely mandulából származó stimulált B sejt populáció sejt frekvenciáját ábrázolja a fluoreszcencia intenzitás függvényében; a B sejteket egy olyan közeg hatásának tettük ki, amely pcD-125-tel transzficiált COS 7 sejtek felülúszójából 10%-ot tartalmazott és a sejtek Fc-epszilon receptorait fluoreszceinnel jelöltük.

A 6A ábrán egy olyan szintetikus humán IL-4 gén nukleotid szekvenciáját mutatjuk be, amely natív vagy mutáns IL-4-ek kifejezésére használható E. coliban.

A 6B ábra a pUC18 plazmidba beépített egy szintetikus humán IL-4 gén restrikciós endonukleáz hasítási térképét ábrázolja.

A 7A-7F ábrák az 1A/B - 6A/B duplaszálú DNS fragmentumokat mutatják be, amelyeket a szintetikus humán IL-4 gén szerkesztésére használunk fel.

A 8. ábra az E. coli TAC-RBS expressziós vektorban lévó iniciátor ATG kodonnál szomszédos nukleotid szekvenciákat mutatja be. A szekvenciák egy EcoRI restrikciós hellyel kezdődnek és egy HindlII hellyel végződnek. A riboszóma kötő szekvenciát (RBS), amely a 16S riboszóma RNS 3’ végével komplementer, aláhúztuk és aláhúztuk az ATG iniciátor kodont is.

A 9. ábrán csupasz limfocita szindrómás betegből származó sejtpopulációk hisztogramja látható, amely a sejt frekvenciát a fluoreszcencia intenzitás függvényében ábrázolja. A sejteket fluoreszceinnel jelzett antiDR monoklonális antitestekkel festettük.

A 10. ábra az IL-4 utolsó tisztítási lépésének reverz fázisú HPLC C4 oszloppal - 215 nm-en mért abszorpciós profilját mutatja.

All. ábra a humán IL-4 cDNS-t tartalmazó pEVB178 plazmid szerkezeti képe.

A 12. ábra a TRPC11 plazmid szerkezeti képe.

A 13A ábra a pMF-ct8 plazmid szerkezeti képe.

A 13B ábra olyan élesztő tenyészetek néhány transzficiált felülúszójának TCGF aktivitását ábrázolja, amelyek natív humán IL-4-et fejeznek ki.

A 14. ábra faktor depedens sejtvonalak növekedési görbéi láthatóak: MC/9 hízósejtek (IA), DX-2 hízósejtek (IB), NFS-60 sejtek (IC és HT2 T sejtek (ID); 5xl0³ sejtet tenyésztünk a Cl.l felülúszó (töltött körök), IL-2^r (töltött négyzetek), IL-3^R (üres körök), GM-CSF^R (üres háromszögek), IFN-gamma^R (töltött háromszögek) és P388D1 (üres rombuszok) felülúszóinak különböző koncentrációival. MC/9 sejteket is tenyésztünk (IA) tisztított IL-3 (töltött körök) vagy 200 egység IL-2^R-vel kevert IL-3^R (töltött négyzetek), GM-CSF^R (üres háromszögek), IFN-gamma^R (töltött háromszögek) vagy P388D1 (üres rombuszok) felülúszóinak különböző koncentrációival. A növekedési faktor aktivitását 24 óra múlva mérjük kolorimetriás módszerrel. Dynatek Micro Elisa readerrel, 570 nm-nél (referencia: 630 nm) mérjük az abszorpcióit is.

A 15. ábra a Cl.l felülúszó HPLC kationcserélő kromatográfiáját mutatja be. 7 ml (35 mg protein) koncentrált felülúszót dializálunk 50 nM nátrium-foszfátot és 1 mM EDTA-t (pH = 7,0; 7,8 mS/cm) tartalmazó oldatban, majd ugyanezen pufferrel (A puffer) kiegyensúlyozott Pharmacia Mono S oszlopra (0,5x5 cm) visszük fel. B puffer = A + 1 M NaCl. Kioldás: 0,5 ml/perc átfolyási sebességgel; 0,5 ml/frakció; 0-40% B 40 perc alatt, 40-100% 10 perc alatt. A frakciók alikvot mennyiségeinek proliferációs aktivitását NFS-60 (IL-3, töltött körök), HT2 (TCGF; üres körök) és MC/9 (MCGF) sejteken vizsgáljuk. Az MC/9 válasza nem látható; a nyilak azt a pozíciót mutatják, ahol az MC/9 proliferációs szintje eléri a Cl.l felülúszót.

A 16A ábrán az IL-3-ra kimerített Cl.l felülúszó reverz fázisú C8 kromatográfiás képe látható. 100 μΐ felülúszót (59-61 frakció a 15. ábrán), melyet háromszor Mono S oszlopon engedtünk át, felviszünk 0,l%os trifluor-ecetsavban (TFA) Pharmacia C8 reverz fázisú oszlopra (0,5x2 cm). A puffer = TFA 1%-os vizes oldata, B puffer = 0,1% TFA acetonitrilben. Kioldás: 0,5 ml/perc; 0,5 ml/frakció; 0-25% B 4 perc alatt, 2560% B 50 perc alatt, 60-100% B 4 perc alatt. A frakciók alikvot mennyiségeinek proliferációs aktivitását NFS-60 (IL-3, töltött körök), HT2 (TCGF, üres körök), és MC/9 sejteken (MCGF, töltött háromszögek) vizsgáljuk. A nyilak azokat a frakciókat mutatják, amelyek a TCGF aktivitás csúcsát adják és azokat, amelyek hasonló MC/9 proliferációs értékeket adnak a Cl.l felülúszóhoz viszonyítva, miután minden frakcióhoz hozzáadtuk IL-3^R-ből a telítési szinteket.

A 16B ábrán a GK15-1 egér T sejt felülúszó reverz

HU 208 710 Β fázisú C8 kromatográfiás képét látjuk. 2 mg (0,5 ml) koncentrált felülúszót viszünk fel Pharmacia C8 reverz fázisú oszlopra 0,1 %-os TFA-ban és a kioldás úgy történik, mint fent. A frakciók alikvot mennyiségeinek TCGF aktivitását HT2 sejteken (üres körök) vizsgáljuk. A nyíl azt a helyzetet mutatja, ahol az egér IL-2^R azonos körülmények közt oldódik ki. Inzert: a Cl.l (töltött körök), IL-2^R (töltött négyzetek) és a GK15-1 felülúszó (üres körök) TCGF aktivitásának direkt öszszehasonlító vizsgálata azonos lemezen.

A 17. ábra a reverz fázisú oszlopon részlegesen tisztított RP faktor MCGF és TCGF aktivitását ábrázolja a proliferációt ³(H)-timidin beépüléssel mérjük, 24 órás tenyésztés után. Az MC/9 hízósejteket és a HT2 sejteket a Cl.l felülúszó (töltött körök), IL-3^R (üres körök), IL-2^R (üres háromszögek) és RP faktor (üres négyzetek) különböző koncentrációival, valamint az RP faktor hígításaival 200 egység IL-3^R jelenlétében (töltött négyzetek) vagy az IL-2 hígításaival az RP faktor telítési szintjeinek a jelenlétében (töltött háromszögek) tenyésztjük.

A 18. ábrán a Cl.l felülúszó kromatofokuszálása látható. 1,5 ml felülúszót (3,5 mg) 25 nM-os bisz-triszben (pH = 7,1) Pharmacia Mono P oszlopra (0,5x20 cm) viszünk fel, a kioldást Polybuffer 74-gyel (1: 10; pH = 4,0) végezzük, 0,5 ml/perc átfolyási sebességgel, a szedett frakciók 1 ml-esek. A frakciók alikvot mennyiségeit proliferációra vizsgáljuk NFS-60 (IL-3, üres körök), HT2 (TCGF, töltött körök) és MC/9 (MCGF, nem látható, csak az MCGF aktivitás csúcsát jelöljük nyíllal) sejteken. A TCGF csúcs (12. frakció, pl - 6,2) egybeesik az IL-3 aktivitás minimumával; az MCGF proliferációs értékek a nyílnál a legmagasabbak.

A 19. ábrán a Cl.l felülúszó és a részlegesen tisztított MCGF/TCGF SDS-PAGE képe látható.

A) A nem frakcionált felülúszó nem redukáló SDSPAGE képe. 50 mM-os DTT-vel való előzetes redukció 60 °C, 5 perc) a TCGF csúcsokat eltolja a kissé magasabb molekulatömegek (21 kD és 16 kD) felé és drasztikus aktivitás csökkenéssel is jár.

B) A kationcserélő kromatográfiából származó MCGF/TCGF csúcs-frakciók (59-61 frakció, 15. ábra) nem redukáló SDS-PAGE képe. 50 mM-os DTT-vel való előzetes redukció (60 °C, 5 perc) az MCGF és TCGF csúcsokat eltolja a kissé magasabb molekulatömegek (21 kD és 16 kD) irányába és drasztikus aktivitás csökkenést okoz. A nyilak azokat a frakciókat mutatják, amelyeknél az IL-3 telítés mennyiségeinek a hozzáadása megnöveli az MCGF aktivitást a felülúszó szintekig: IL-3 (üres körök), TCGF (töltött körök), MCGF (üres háromszögek).

A jelen találmány tárgyát olyan glükozilált vagy nem glükozilált emlős polipeptidek képezik, amelyek IL-4 aktivitást fejtenek ki, és amelyek a találmány körébe tartozó IL-4 polipeptidekből származtathatók standard protein előállítási eljárások felhasználásával. A találmány magába foglalja a nukleinsavakat is, amelyeknek a szekvenciái hatékonyan homológok a találmány szerinti cDNS kiónokkal. Végül a találmány tárgyát képezik azok a módszerek, amelyekkel a találmány szerinti glükozilált és nem glükozilált polipeptideket állítjuk elő, az itt szereplő nukleotid szekvenciák felhasználásával, valamint azok a módszerek, amelyek révén a találmány szerinti polipeptidek felhasználhatók.

A találmány szerinti polipeptidek és nukleinsavak előállítására, felhasználására és meghatározására szolgáló módszereket az alábbiakban általános szempontok szerint tárgyaljuk. Ezután számos speciális példát adunk közre, melyekben az általános módszereket speciális sejt típusoknál, vektoroknál, reagenseknél - és így tovább - alkalmazzuk. Először röviden leírjuk a természetes forrásokból való izolálásukat.

Ezeket a polipeptideket teljes homogenitásig tisztíthatjuk a könnyen rendelkezésre álló sejtekből, s mivel tiszta formában gazdaságosan előállíthatók, megteremtjük terápiás vagy egyéb felhasználási lehetőségeiket.

Jellemző a polipeptidre, hogy olyan polipeptid tartozik közéjük, amely B sejt, T sejt- és hízósejt-stimuláló aktivitást fejt ki. E polipeptidek természetes formában - egy fajon belül - SDS-PAGE vizsgálatban körülbelül 20 kD és 15 kD molekulatömeget mutatnak és 21 kD és 16 kD molekulatömegű redukáló körülmények között. A szóban forgó polipeptideket lényegében tiszta formában tartalmazó készítmény izoelektromos pontja (pl) körülbelül 6,2, kromatofokuszálással meghatározva. A növekedési faktorok rendkívül hatékony szerek, rendkívül alacsony koncentrációkban (például ml-enként 1 nanogrammnál kevesebb) is jelentős hatást fejtenek ki. E polipeptideket a hormonoktól és más olyan proteinektől, amelyeket T sejtek természetes módon termelnek, kationcserélő kromatográfiával különíthetjük el vagy reverz fázisú oszlopokkal, megfelelő kioldási körülményeket alkalmazva.

A jelen találmány szerinti néhány polipeptid egér-félékben bizonyos sejtek proliferációját csak csekély mértékben tartja fenn, ilyen az EL-3-depedens hízósejtvonal, de egy második faktor jelenlétében (például IL-3) szinergetikusan fokozza az ilyen sejtek (például hízósejtek) növekedését. E polipeptidek számos T sejtvonal proliferációját képesek stimulálni, de általában kisebb mértékben, mint a tisztított IL-2. Ezek a polipeptidek indukálhatják nyugvó B sejteken az la megnyilvánulását és fokozhatják a B sejtek IgG, és IgE kiválasztását, hasonlóan a BSF-1-hez. Ezek a határok nem választhatók el egymástól sokszoros biokémiai frakcionálás ellenére sem. Egyébként a hatékonyság nagy részét a redukció (például SDS jelenléte) tönkreteszi.

Ezek a faktorok nagyszámú természetes forrásból, különböző módszerekkel állíthatók elő. Alkalmas forrás a számos T sejtvonal bármelyike, amelyik a szóban forgó polipeptideket termeli. Egy ilyen T sejtvonal a C57GL6 egérből származik [G. Nable és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78,1157-1161 (1981)], s a sejtvonal kiegészített DME táoldatban fenntartható [G. Nable és munkatársai, Cell, 23, 19-28 (1982)]. Ez a sejtvonal, melynek jele Cl.Lyl⁺2/9, az American Type Culture Collection intézményben van letétbe helyezve, CRL 8179 letéti számmal. E polipeptidek alkalmas sejt-forrásai közt van bármilyen olyan sejt, amely a polipeptideknek tulajdonított különböző antitesteket

HU 208 710 Β szekretálja, ilyenek a perifériás vér limfocitái és bármelyik jól ismert T sejt forrás, mint a mandula, lép stb.

Ezen forrásként használt sejtek felülúszóit és bizonyos esetekben a feltárt sejtek folyadékát számos jól ismert eljárással tisztíthatjuk, hogy a jelen találmány szerinti proteineket elkülöníthessük. Előnyös, ha a tisztítási eljárást magas tisztasági fok biztosításával kombináljuk. Általában a tisztítási eljárásokban gélszűrő kromatográfiát, SP kationcserélő kromatográfiát, reverz fázisú kromatográfiát, csoport-specifikus kromatográfiát (például: Heparin-Sepharose) vagy más szokásos elválasztási módszereket használunk, amelyek hatékony protein frakcionálási biztosítanak. Magasnyomású folyadék kromatográfiát (HPLC), izoelektromos fokuszálást és SDS poliakrilamid gél elektroforézist (SDS-PAGE) ugyancsak használhatunk.

Például: egy megfelelő sejtvonalból származó felülúszót először erős kationcserélő kromatográfiával frakcionálhatunk, amikor is a jelen találmány szerinti polipeptideket az oszlop megköti, míg a felvitt proteinek mintegy 98%-át átereszti. A kötött protein só-grádiens alkalmazásával kioldható. A találmány egyik kiviteli formájában a nátrium-klorid grádiens körülbelül 0,19 mól/litemél mossa ki az illető polipeptidet. A frakcionálási még kétszer megismételhetjük (főként, hogy a maradék IL-3-at eltávolítsuk), s így 95%-nál nagyobb tisztaságot érünk el. Ezután az anyagot egymást követően Heparin-Sepharose és reverz fázisú (c4 vagy cl8) kromatográfiával ffakcionáljuk. Ez utóbbi esetben a polipeptidek 42% acetonitrilnél eluálódnak. Az egyesített frakciók a szóban forgó polipeptidet rendkívül nagy tisztaságban tartalmazzák és lényegében homogének SDS-PAGE vizsgálatnál ezüst-festéssel egyetlen sávot kapunk körülbelül 20 kD-nál). Ez a tisztított anyag legalább 65 000-szer tisztább, mint a természetes formában előforduló anyag.

E polipeptideket antigénekként használhatjuk antitestek termelésére, amelyek ezután szintén antigénként használhatók anti-idiotípusos antitestek előállítására. A poliklonális vagy monoklonális antitesteket vagy fragmentumaikat - a fragmentumok általában legalább 15 aminosavból állnak - fel lehet használni önállóan, de előnyösebb, ha hozzákötjük vagy kapcsoljuk egy adjuvánshoz vagy olyan antigénhez, amely az immunrendszert aktiválja. Különböző antigének használatosak erre a célra, ilyen a szérum albumin, a hemocianin (keyhole limpet), a globulinok és hasonlók. A módszerek széles változata áll rendelkezésre, hogy adjuvánsokat kössünk a polipeptidekhez, ilyen a glutáraldehid, maleimidobenzoesav, diazobenzoesav vagy hasonlók. Az adjuvánsok közé tartozik a Freund-adjuváns, alumínium-hidroxid és hasonlók. Az antigén szokásos mennyiségeit megfelelő gazdaszervezetekbe oltjuk be és egy vagy több emlékeztető oltást adhatunk 2-4 hetes időközönként. Monoklonális antitestek esetében rendszerint egeret oltunk az alap és emlékeztető oltásokkal, majd a lépet izoláljuk és a lép-sejteket megfelelő fúziós partnerrel fuzionáljuk, konvencionális módszerek szerint. Lásd például: Galfre és munkatársai, Natúré, 266, 550 (1977); Kennet és munkatársai, Current Topics in

Microbiology and Immunology, 81, 77 (1978); és a 4381292 és 4363 799 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírások. Mindazonáltal speciális célokra más emlősök is felhasználhatók, ilyenek a főemlősök, például az emberek, hogy humán F_c láncot tartalmazó antitesteket termeljünk.

A polipeptideket önállóan, vagy antitestekkel kombinálva használhatjuk a polipeptidek diagnosztizálására. Csak az egyik, de mindkettő is lehet jelzett, vagy jelzetlen diagnosztikus vizsgálatok céljára. A szakirodalomban nagyszámú diagnosztikus vizsgáló módszer található, amelyekben a polipeptideket vagy antitesteket különböző anyagokkal jelölik - közvetlenül vagy közvetve - ilyenek az enzimek, a részecskék, például mágneses részecskék vagy ehhez hasonlók. E vizsgálati módszereket illetően lásd például a 3817837, 3850752, 4174384, 4177437 és 4374925 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat.

A különböző meghatározási módszereket önkényesen homogén és heterogén immun-assay-kre osztották fel, s a megkülönböztetés alapja az, hogy a polipeptid és az antitest közt létrejött komplexet el kell-e választani a specifikusan kötött pár nem komplexben lévő tagjaitól. Néhány assay lenevezése: El, ELISA, RIA, homogén EIA, dot-blot, Westem-ek és így tovább.

E polipeptidekkel szembeni antitesteket felhasználhatjuk önállóan, mint antigéneket, anti-idiotípusok termelésére, s ezek mint kompetitív antigének szerepelhetnek, tekintettel arra, hogy epitóp helyeik vannak, amelyek ezen polipeptidek epitóp helyeivel kompetitívek. Az ilyen anti-idiotípusok ennélfogva mint tumor inhibitorok jöhetnek számításba a szóban forgó polipeptidek szubsztituenseiként, vagy mint az illető polipeptidek antagonistái.

Ezek a polipeptidek a természetben előforduló polipeptideknek egy olyan családját alkotják, amelyek mind természetes forrásokból, mind nem természetben előforduló polipeptidekból nyerhetők és, amelyeknek közös fiziológiai tulajdonságaik vannak, ilyen a kötésspecifitás és a B sejt vagy hízósejt stimuláló hatás. A faj és származás miatti kis különbségek a tisztítás eljárás módsítását tehetik szükségessé, ez azonban ismeretes azok számára, akik e szakterületen jártasak. Alternatív megoldás szerint, ezeket a polipeptideket szekventálhatjuk, majd fragmentumokat szintetizálhatunk jól ismert módszerekkel. Például: Bárány és Merrifield: Solid-Phase Peptide Synthesis, „The Peptides, Analysis Synthesis Biology”, Special Methods in Peptide Synthesis, A rész, 2. kötet, szerk.: Gross és Merenhofer, kiadó: Academic Press, N. Y. 1980,1-284. oldal.

A jelen találmány polipeptid készítményei különbözőképpen hasznosíthatók. Például: ezek a polipeptidek a T sejtek és hízósejtek növekedését képesek megindítani akár tenyészetben, akár in vivő. A hízósejt - ahogy az előbbiekben megjegyeztük - fontos forrása a heparinnak, hisztaminoknak, prosztaglandinoknak és más fiziológiásán fontos anyagoknak. Ugyanígy, a növekedési faktorok az olyan B és T sejtek stimulálására használhatók, amelyekről tudjuk, hogy az immunrendszer számára hasznos proteineket (például limfokine10

HU 208 710 Β két és immunglobulinokat) szekretálnak. Ez úgy történik, hogy a faktorokat a sejt-tenyészetekhez szükséges tápoldathoz adagoljuk. A faktorok megfelelő koncentrációja a sejtvonal típusától függ, de a tenyészetekben a faktorok koncentrációja általában körülbelül 0,1 pg/ml-től 1 mg/ml-ig, előnyösebben 1 gg-tól 10 pg/ml-ig terjed. A jelen találmány szerinti növekedési faktorok használata megszünteti azt a követelményt, hogy a kívánt sejtvonalak fenntartásához tápláló (feeder) sejteket kell használni.

A jelen találmány szerinti polipeptid készítmények a különböző immunhiányok in vivő kezelésére vagy a természetes immunválasz növelésére is felhasználhatók. Például: ezek a polipeptid készítmények segítséget jelenthetnek a fertőzések kezelésében és megelőzésében azzal, hogy stimulálják a B sejtek, T sejtek és hízósejtek érését és/vagy növekedését, miáltal csökkentik az állatokban a fertőzésekkel szembeni érzékenységet.

/. Az IL-4 cDNS de novo előállítása

A cDNS-ek de novo előállítására és klónozására, valamint cDNS gyűjtemények létesítésére jelenleg számos módszer áll rendelkezésre. Lásd a legújabb összefoglaló munkákat: Doherty: „Cloning and Expression of cDNA”, a Gottesman-féle „Molecular Cell Genetics” c. kiadvány 10. fejezetében [John Wiley and Sons, N. Y. (1985)]; Brandis és munkatársai: „Preparation of cDNA Libraries and the Detection of Specific Gene Sequences” Setlow és munkatársai „Genetic Engineering” c. kiadványban, 8. kötet, 299-316. oldal [Pleunum Press, N. Y. (1986)].

Például: a kívánt aktivitású sejtekből (például nem transzformált T sejtekből) kivonjuk az össz-mRNS-t [S. Berger és munkatársai, Biochemistry, 18, 51435149 (1979)]. Az ossz mRNS-ből úgy építjük fel a kettős szálú cDNS-t, hogy prímeméi megindítjuk a reverz transzkripciót [I. Verme, Biochem. Biophys, Acta, 473, 1-38 (1977)], miáltal először elkészül minden egyes mRNS szekvencia komplementere, majd a második szál szintézisét indítja meg a primer [H. Land és munkatársai, Nucleic Rés., 9, 2251-2266 (1981)]. Ezt követően a cDNS-eket úgy klónozhatjuk, hogy megfelelő plazmid vagy bakteriofág vektorokhoz kapcsoljuk őket [R Rougeon és munkatársai, Nucleic Acids Rés., 2, 2365-2378 (1975) vagy G. Scherer és munkatársai, Dev. Bioi., 86, 438-447 (1981)] komplementer homopolimer farkak, vagy alkalmas restrikciós helyeket tartalmazó linker szegmentumokkal képzett ragadós végek révén. [A. Efstratiadis és munkatársai, Cell. 10, 571-585 (1977); Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. (1982)], s ezután megfelelő gazdasejteket transzformálunk velük [lásd általában: A. Efstratiadis és L. Villa-Konnaroff: „Cloning of double stranded cDNA” J. Setlow és A. Hollaender Genetic Engineering c. kiadványának 1. kötetében (Plenum Publishing Corp., N. Y„ 1982)].

A kívánt polipeptideket kódoló mRNS előnyös forrásául olyan sejteket használunk, amelyeknek felülúszói B sejt, T sejt és/vagy hízósejt stimuláló hatásúak vagy más, a jelen találmány szerinti polipeptidekhez kapcsolódó hatást mutatnak. Egy ilyen sejtvonal a Cl.Lyl⁺2/9 egérT sejtvonal (ATCC letéti száma CRL 8179) [G, Nabel és munkatársai, Natúré, 291, 332-334 (1981)]. Általában különböző forrásokból kaphatunk megfelelő T sejteket, ilyen az emlős (például humán) lép, mandulák vagy a perifériás vér. A perifériás vér T limfocitáiból izolált T sejt kiónok szintén felhasználhatók [lásd: Research Monographs in Immunology, szerkesztők: H. Doehmer és V. Haaf; D szekció: „Humán T-Cell Clones”, 6. kötet, 243-333 oldal, Elsevier Science Publishers, N. Y. (1985)].

Az IL-4 kódolására képes mRNS-eket előállító sejtek meghatározását úgy végezzük, hogy a kivont mRNS-t Xenopus laevis oocitákba mikro-injiciáljuk. Á mikro-injekciós technikát alább részletesebben is fogjuk írni, de megtalálható a következő összefoglaló munkákban is: Colman és munkatársai, „Export of Proteins from Oocytes of Xenopus Laevis”, Cell, 17, 517-526 (1979)]; Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 350-352. oldal [Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. (1982)].

Ha a kívánt IL-4-et kódoló mRNS-ek az ossz mRNS egy igen kis frakcióját teszik ki, lépéseket kell tennünk a frakciók koncentrációjának növelésére, hogy a gyakorlatban elvégezhessük a kívánt cDNS kiónok kimutatását szolgáló szűrővizsgálatokat. Ezeket a vizsgálatokat ezen a területen általánosan alkalmazzák, de szerepelnek az alábbi példákban, valamint számos előadásban és szakcikkben. Ilyenek a következők: Maniatis és munkatársai fent idézett kiadványának 225-228. oldalán; Suggs és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 6613-6617 (1981); Parnes és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 78,2253-2257 (1981); Davis és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 81,2194-2198 (1984).

Az IL-4 cDNS-ek előnyös de novo előállítási módszere az Okayama és Berg által [Mól. Cell. Bioi., 2, 161-170 (1982) és 3, 280-289 (1983)] kifejlesztett expressziós rendszeren alapszik. A rendszerben a cDNS-ek funkcionális kifejeződése pcD-ben valósul meg. A rendszer a Pharmaciától (Piscataway, N. J. USA) beszerezhető. A pcD expressziós vektor SV40 korai promotert, késői splicing csomópontot és replikációs kezdőpontot tartalmaz. A vektor lehetővé teszi cDNS inszertumok kifejeződését COS 7 majom sejtekben, amelyek T antigént szolgáltatnak a pcD plazmid replikációjához. A cDNS gyűjtemények szűrésekor plazmid DNS poolokkal transzformáljuk a COS 7 sejteket, DEAE-dextrán használatával. Minthogy a limfokinek és különösen az IL-4-ek szekretált proteinek, a transzficiált sejtek felülúszóiban vizsgálhatjuk a biológiai aktivitást, több napos inkubáció után. A pozitív poolokat tovább osztjuk, hogy meghatározzuk azokat az egyedi cDNS kiónokat, amelyek a transzfekció után biológiailag hatékonyak.

Röviden kifejtve: az Okayama és Berg féle expressziós vektort a következőképpen szerkesztjük: a poliadenilált mRNS-t hozzákötjük egy polidezoxitimidilát (oligo dT) farokhoz, amely az SV40 korai promoter szakaszt tartalmazó, KpnI-gyel emésztett

HU 208 710 Β pBR322 plazmid túllógó szálához van kapcsolva. Azaz az egész vektor printerként szolgál a cDNS szintéziséhez. A cDNS szintézise után 3’ polidezoxicitidilát (oligo dC) farkakat fűzünk hozzá, majd HindlII-mal való emésztés következik, amely levágja (egyetlen HindlII helyen) és SV40 DNS egy fragmentumát, amelyhez egy oligo dC farok van kapcsolva. Az SV40 korai promoter érintetlen marad és az inszertumban véletlenszerűen előforduló HindlII helyek is minimálisan károsodnak, mivel a cDNS/RNS hibrid a HindlII emésztéssel szemben rezisztens. Ezután külön megszerkesztettük egy 3’ poliguanidilált (oligo dG) HindlII fragmentumot, amelyet rákapcsolunk a HindlII emésztés után keletkezett ragadós véghez. A vektort ekkor gyűrűbe zárjuk, majd E. coli RNázH-val, DNS polimeráz I-gyel és DNS ligázzal kezeljük, hogy az RNS szálat DNS szálra cseréljük. A vektorokat E. coliban klónozzuk be, hogy kialakítsuk a cDNS gyűjteményt. Az SV40 elemek lehetővé teszik, hogy a vektorok mind sukarióta, mind prokarióta sejtekben kifejeződhessenek, különösen emlős sejtekben, amilyenek például a COS 7 majom sejtek és a kínai hörcsög méh sejtek (CHO = Chinese hamster ovary).

Mihelyst az Okayama/Berg-féle plazmid vektorban kiegészül a cDNS gyűjtemény, a cDNS kiónokat összegyűjtjük és random poolokat vizsgálunk a kívánt cDNS-ek jelenlétére standard módszerekkel, például hibrid szelekcióval vagy a kifejeződött terméken lévő antigén determinánsok kimutatásával és/vagy funkcionális vizsgálatokkal. A pozitív poolokat ezután indukált T sejtvonalból származó cDNS-sel - mint próbaanyaggal - ellenőrizzük. Ezután a pozitív, ellenőrzött poolokat egyedi kiónokra osztjuk és ezeket tovább vizsgáljuk úgy, hogy megfelelő gazdasejtet (ilyen egy emlős sejt tenyészet) transzficiálunk és meghatározzuk a gazdasejt felülúszójának a hatékonyságát.

II. IL-4 cDNS-ek előállítása a találmányban szereplő cDNS-ékből származó próba-anyagokkal való hibridizáció segítségével

Az lL-4-et kódoló nukleotidok de novo izolálása és klónozása mellett, egy másik módszer szerint, a találmányban szereplő cDNS-eket, mint próba-anyagokat használhatjuk homológ szekvenciák azonosítására különböző sejt típusokban. Erre a célra standard mószerek állnak rendelkezésre, például: Beltz és munkatársai, „Izolation of Multigene Families and Determination of Homologies by Filter Hybridization Methods”, Methods in Enzymology, 100,266-285 (1983); Callahan és munkatársai, „Detection and Cloning of Humán DNA sequences Related to the Mouse Mammary Tumor Vírus Genome”, Proc. Natl. Acad. Sci., 79,5503-5507 (1982). Alapjában véve a találmány szerinti cDNS-eket használjuk fel a próba-anyagok szerkesztésére (standard módszerek segítségével, lásd például Maniatis és munkatársai fent idézett munkáját) olyan sejttípusok genomiális vagy cDNS gyűjteményeinek (előállításuk szintén standard módszerekkel történik) szűrése céljára - nem szigorú hibridizációs körülmények mellett - amelyekről feltételezzük, hogy IL-4-et termelnek. Standard szűrési eljárásokat alkalmazunk, lásd például Grunstein és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci., 72, 3961-3965 (1975)] vagy Benton és munkatársai [Science, 196, 180-183 (1977)] közleményeit.

A humán IL-4-et - alább részletesebben írjuk le egér IL-4 próba-anyag segítségével izoláltuk. Az ezután következő analízissel megállapítottuk, hogy 70%os homológia van a humán és egér cDNS-ek kiválasztott szakaszai között. Tekintettel az egér-félék és az emberek közti evolúciós távolságra, azt gondoljuk, hogy a legtöbb, hacsak nem minden emlős IL-4 gén meghatározható a találmány szerinti egy vagy több cDNS-ből szerkesztett próba-anyaggal [Wilson és munkatársai, „Biochemical Evolution”, Ann. Rév. Biochem., 46, 573-639 (1977); Kimura, „The Neutral Theory of Molecular Evolution” c. közlemény a Nei és Koehn által szerkesztett „Evolution of Genes and Proteins” c. kiadvány 11. fejezetében [Sinauer Associates, Sunderland, MA, (1983)].

///. Mutáns 1L-4-ek előállítása protein technológiai módszerekkel

Mihelyst egy natív proteinre vonatkozóan nukleinsav szekvencia és/vagy aminosav szekvencia adatokkal rendelkezünk, számtalan módszert alkalmazhatunk, hogy a natív szekvenciába jóformán minden mutációt bevezethessünk. Shortle [Science, 229, 1193-1201 (1985)] összefoglalja mindazokat a nukleinsav mutációs módszereket, amelyeket a jelen találmányhoz felhasználhatunk. A natív IL-4-ek mutánsait, azaz az IL-4 muteineket előnyösen a hely-specifikus, oligonukleotid-irányított mutagenezissel állítjuk elő [például: Zoller és Smith, Methods in Enzymology, 100, 468-500 (1983)]; Mark és munkatársai, „Humán Recombinanat Interleukin-2 Muteins” című, 4518584 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírása] vagy az ún. „kazettás” mutagenezissel Wells és munkatársai [Gene, 34, 315-323 (1985)] és Esteli és munkatársai [Science, 233, 569-663 (1986)] szerint. Az alábbi fejezetekben az Esteli és munkatársai (idézve fent) által a muteinek azonosítására használt jelöléseket követjük és általánosítjuk. Például a „humán IL-4 mutein leu⁸²” (vagy egyszerűen Leu⁸², ha a natív protein a szövegből már ismert) egy olyan polipeptidet jelent, amelynek az aminosav szekvenciája a natív proteinéval identikus, kivéve az N-terminálistól számított 82-es pozíciót. Ebben a pozícióban Leu van szubsztituálva Phe helyett. Egynél több szubsztitúciót hasonlóképpen jelölhetünk: például, ha egy muteinben a 82-es pozícióban Leu van szubsztituálva Phe helyett és a 111-es pozícióban Asp a szubsztituens Asn helyett, akkor a jele: humán IL-4 mutein (Leu⁸², Asp¹¹¹). A deléciók jele a „Δ”. Például, ha egy muteinben a 71-es pozícióból hiányzik a Gin, annak neve: humán IL-4 mutein Δ⁷¹. Az inszerció jelzése „IS(Xaa)”. Például, ha a 71-es pozícióban a Gin után Leu-t építünk be, akkor a mutein jele: humán IL-4 mutein IS^7!(Leu) lesz. Tehát a humán IL-4 mutein [Ser^{II. * 13}, Δ⁷¹, IS⁹⁴(Gly)] elnevezés azt jelenti, hogy a natív humán IL-4 szekvenciát a következőképpen módosítottuk: a 13-as pozícióban a Thr-t Ser-re cseréljük, a

HU 208 710 Β

71-es pozícióból elvettük a Gln-t és a 94-es pozícióban lévő Alá után közvetlenül Gly-t építettünk be. Ha ugyanarra a helyre több aminosavat inszertálunk, annak jelzése IS'ÍXaa] - Xaa₂ - Xaa₃ - ...) lesz, ahol Xaa] - Xaa₂ - Xaa₃ - ... az i-edik pozíció után beépített szekvencia. Az N-terminálishoz való addíciót „0” indexszel jelöljük, például IS°(Xaa) és a szekvencia deléciókat, például 6-10 aminosav esetén vagy Δ^{6 10} vagy (Δ⁶, Δ⁷, Δ⁸, Δ⁹, Δ¹⁰) jelzéssel látjuk el.

Legelőnyösebben a kazettás mutagenezist alkalmazzuk humán IL-4 muteinek képzésére. Ahogy majd később részletesebben leírjuk, egy szintetikus humán IL-4 gént szerkesztünk, olyan szekvenciával, amelyben ugyanezen restrikciós endonukleáz helyek vannak a gén hosszában egymástól azonos távolságra elhelyezve. A restrikciós helyek egyediségét akkor is meg kell tartani, amikor a gént egy megfelelő vektorba építjük be, s így a gén szegmentumait kényelmesen kivághatjuk és olyan szintetikus oligonukleotidokkal (azaz „kazettákkal”) helyettesíthetjük, amelyek a kívánt muteineket kódolják.

Az egyedi restrikciós helyek számának és eloszlásának a meghatározása számos faktor figyelembevételével jár együtt: 1. az expressziós vektorban már előzőleg meglévő restrikciós helyek; 2. faj-specifikus vagy nem-specifikus kodonok használata kívánt-e; és 3. az egyedi restrikciós helyek közötti szegmentumok szintetizálásának és/vagy szekventálásának a kivihetősége és megbízhatósága.

IV. Az IL-4 aktivitás biológiai tulajdonságai és meghatározási módszerei

A találmány szerinti IL-4 biológiai hatásai alapján és/vagy a találmány szerinti változataival való homológiája alapján határozható meg. A találmány szerinti IL-4-ekhez olyan proteinek és muteinek (az itt szereplő natív polipeptidek muteinjei) tartoznak, amelyek a találmány szerinti natív polipeptidekkel homológok és mind BCGF aktivitást mind TGGF aktivitást fejtenek ki. A találmány szerinti IL-4-eket másként is jellemezhetjük, mégpedig úgy, hogy olyan biológiai hatással rendelkeznek, amelyben bennefoglaltatik a BCGF aktivitás és a TCGF aktivitás (amit itt IL-4 aktivitásnak nevezünk), valamint egy vagy több olyan aktivitás, amely a hatások alábbi csoportjából választható ki: MHC antigén indukciós aktivitás, Fc-epszilon receptor indukciós aktivitás, GM-CSF stimulálta granulocita telep növekedést potenciáló aktivitás, interleukin-2 TCGF potenciáló aktivitás és IgG!- és IgE-indukciós aktivitás.

Azt gondoljuk, hogy az IL-4-ek hatása faj-specifikus. Azaz például, a humán IL-4 TCGF hatást fejt ki, amikor humán T sejtvonaloft vizsgáljuk, de nincs hatása, ha egér T sejtvonalon vizsgáljuk. Megfordítva, az egér IL-4 TCGF hatású, ha egér T sejtvonalon vizsgáljuk, de nem hat, ha humán T sejtvonallal történik a vizsgálat.

A) TCGF aktivitás

A TCGF aktivitás meghatározására számos standard vizsgálati eljárást írtak le [például: Devos és munkatársai, Nucleic Acids Rés., 11, 4307-4323 (1983); Thurman és munkatársai, J. Bioi. Response Modifiers, 5, 85-107 (1986); Robert-Guroff és munkatársai, a Guroff szerkesztésében megjelent „Growth and Matúrádon Factors” c. munka 9. fejezetében (John Wiley, N. Y. (1984)]. A TCGF meghatározások általában a faktornak azon a képességén alapulnak, hogy fokozza a perifériás T limfociták vagy az IL-2 depedens T sejtvonalak proliferációját [például: Gillis és munkatársai, J. Immunoi., 120, 2027 (1978)]. A proliferáció meghatározása standard módszerekkel történik, például tríci- . ummal jelzett timidin beépülésével vagy kolorimetriás módszerekkel [Mosmann, J. Immunoi. Meth., 65, 5563 (1983)].

A humán TCGF aktivitás meghatározása a következő lépésekből áll: 1. Mosott humán perifériás vér limfocitákat (2xlO⁵ sejt 50 μΐ-ben), melyeket előzőleg 7 napon át fitohamagglutininnel (PHA) stimuláltunk, majd 7 napig IL-2-vel tenyésztettünk, mikrotitráló lemez tartályaiba mérünk; 2. minden tartályhoz hozzáadunk a TCGF-tartalmú anyag hígításaiból 50 μΐ-t; 3. a limfocitákat 72 órán át 37 °C-on inkubáljuk; 4. tríciummal jelzett timidint (20 μΐ; 20 pCi/ml) adunk minden tartályhoz; 5. a sejteket szűrőpapír csíkokkal leszüreteljük, mossuk, majd szcintillációs számlálóval mérünk.

Ahogy a példákban részletesebben leírjuk, bizonyos 11-4 formák az BL-2 TCGF aktivitását képesek potenciáim. A „potenciálás” kifejezést itt olyan aktivitásra használjuk, amely azt jelenti, hogy például egy TCGF meghatározási rendszerben az IL-2 által okozott maximális proliferációs szintet az IL-4 hozzáadása megnöveli.

B) BCGF aktivitás

A BCGF aktivitás meghatározását egy Howard és munkatársai által közölt [J. Exp. Med., 155, 914-923 (1982)] módszer szerint végezzük. A BCGF vizsgálatokról általános ismertetőt készített Howard és Paul [Ann. Rév. Immunoi., 1, 307-333 (1983)]. Röviden: a BCGF aktivitás azzal mérhető, hogy milyen mértékig stimulálódnak a nyugvó B sejtek proliferációra, szubmitogén koncentrációjú anti-IgM vagy hasonló antigén jelenlétében. A humán BCGF aktivitás meghatározását például a következőképpen végezhetjük el:

Dúsított B sejt populációt kaphatunk perifériás vérből, lépből, mandulákból és más standard forrásból Ficoll/Hypaque (Pharmacia) sűrűség-grádiens centrifugálással és két ciklusban a T sejtek rozetta képzéssel való eltávolításával 2-amino-etil-izotio-uronium-bromiddal kezelt birka vörösvérsejtekkel. Az ilyen B sejt készítményeknek több mint 95%-ban felületi Ig⁺ sejteket kell tartalmaznia és a sejtek több mint 95%-a pozitív kell legyen humán B sejt specifikus antigénre, amit Coulter-féle (Hialeah, FL., USA) anti-humán B sejt specifikus monoklonális B1 antitest segítségével határozunk meg. A T sejttel való szennyeződés 1 %-nál kisebb kell legyen, s ezt anti-Leu-1 monoklonális antitestekkel való festéssel (Becton-Dickinson, Mountain View, CA., USA) vagy OKT 11 antitestekkel (Ortho Diagnostics, Westwood, MA., USA) határozzuk meg.

HU 208 710 Β

E limfociták 3 ml-ét (körülbelül 5X10⁵ sejt/ml) Ysseltápoldatban [Yssel és munkatársai, J. Immunoi., Meth., 65, 55-63 (1984)] vagy Staphylococcus aureus Cowan I törzzsel (SAC) aktiváljuk [például a SAC 0,01%-os oldatával, melyet Pansorbin márkanéven a Calbiochem forgalmaz, ugyanezt előállíthatjuk Falkoff és munkatársai szerint is: J. Immunoi., 129, 97-102 vagy szemcsékhez kötött anti-IgM antitestekkel (például BRL Gaithersburg, MD., USA) például a Bio-Rad-tól (Richmond, CA., USA) kapható Immunobeadsből 5 mg/mlrel. A B sejteket vagy 24 órán át tenyésztjük (SAC esetén), vagy 72 óra hosszat (anti-IgM-es szemcsék esetén), majd újból tisztítást végzünk Ficoll/Hypaque sűrűség grádiens centrifugálással a SAC részecskék, szemcsék, a nem élő sejtek és hasonlók eltávolítására. A B sejtek szaporodását úgy mérjük, hogy mintegy 5xlO⁴ B limfocitát - 50 μΐ tápoldatban - mérünk mikrotitráló lemezek 0,1 ml-es laposfenekű tartályaiba. A feltételezetten BCGF aktivitású anyagok különböző hígításaiból 50 μΐ-eket mérünk a tartályokban. A tríciumos timidin beépülését 48 óra elteltével (anti-IgM-es tenyészetek esetén), illetve 72 óra elteltével (SAC tenyészetek esetén) mérjük. Hasonló vizsgálatokról számolnak be Muraguchi és munkatársai., 129., 1104— 1108 (1982)] és Yoshizaki és munkatársai [J. Immunoi., 128,1296-1301 (1981)].

C) MHC antigén indukció

Kimutatták, hogy az IL-4 MHC antigének megjelenését indukálhatja (például az la antigénét egérben) az immunrendszer különböző sejt típusainál, különösen a B sejteknél. Roehm és munkatársai (J. Exp. Med., 160, 679-694) bizonyították, hogy egy BCGF aktivitást mutató faktor szintén képes volt MHC antigének megnyilvánulásának az indukálására normál nyugvó B sejteknél. Ebben a közleményben az egér B sejtekre vonatkozó vizsgálatok általánosságban az MHC antigén indukciós vizsgálataira vonatkoznak. Röviden összefoglalva: az immunrendszer sejtjeit IL-4 hatásának tesszük ki, majd meghatározzuk az egyes MHC antigének megjelenését a sejt felületén az illető antigénekre specifikus, jelzett antitestekkel. Az indukció fokát az indukált és kontroll sejtek összehasonlításával határozzuk meg. Számos különböző antitest alkalmazására kerülhet sor valamely adott fajnál. Az ATCC intézménytől számos olyan hybridoma kapható, amelyek monoklonális antiMHC-antitesteket termelnek és számos antitest a kereskedelemben is kapható [például: anti-HIA-DR, melyet a HB103, HB109, HB110 vagy HB151 ATCC letéti számú hybridomák termelnek; anti-I-A^b'^d, amelyet a HB35 ATCC letéti számú hybridoma termel; anti-HLA-DR L243, mely a Becton-Dickinson cégtől kapható (Mountain View, CA., USA); és így tovább]. Néhány rutin kísérlet válhat szükségessé, hogy a meghatározást egy adott fajra adaptálhassuk, és hogy optimalizáljuk a körülményeket az MHC antigén szintek leolvasási érzékenységének növelésére. A humán MHC antigén indukciós vizsgálatokhoz a tisztított B sejteket a fentiek szerint vagy hasonló módszerekkel készíthetjük el. Egy másik változat szerint, az MHC indukciót lép-sejtek tisztítatlan készítményein is vizsgálhatjuk.

Az antitesttel jelzett sejteket előnyösen áramlásos citométerrel, például egy Becton-Dickinson féle FACS-típusú készülékkel, vagy hasonlóval mutathatjuk ki.

D) MCGF aktivitás

Úgy tűnik, hogy az IL-4-ek általában MCGF aktivitást fejtenek ki. Azonban megfelelő vizsgáló módszerek hiányában, az MCGF aktivitást csak rágcsálóknál lehetett kimutatni. Az egér IL-4 MCGF meghatározások a faktor-dependens egér hízó- vagy bazofil-sejtvonalak proliferációján alapúinak. Részletesebben, az MCGF aktivitást az MC/9 egér hízó sejtvonallal lehet kimutatni. Az MC/9 sejtvonal CRL 8306 ATCC letéti szám alatt van letétbe helyezve. Szerepel még a módszer a 4559310 számú amerikai egyesült államokebli szabadalmi leírásban és Nabel és munkatársai [Cell,

23,19 (1981)] közleményében. Az egér MCGF vizsgálatokat Ihle és munkatársai is leírták [J. Immunoi., 127, 794(1981)].

Az MCGF aktivitás a Mosmann (fent idézve) féle kolorimetriás módszerrel - MC/9 sejtek használatával - határozható meg előnyösen. Röviden: MC/9 sejteket tenyésztünk Falcon-féle lapos fenekű mikrotitráló lemezeken (10⁴ sejt/tartály) 4% fetális borjúszérummal, 50 μΜ/liter 2-merkapto-etanollal (2ME), 2 mM/liter glutaminnal, nem esszenciális aminosavakkal és eszszenciális vitaminokkal kiegészített Dulbecco-féle tápoldatban, a vizsgálandó felülúszók különböző koncentrációival, 0,1 ml végtérfogatban. Minden sejt-tenyészethez 20 órás inkubáció után 50 pg 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólium-broinidot adunk 10 μΐ foszfáttal pufferolt konyhasó oldatban. Négy órával később 0,1 ml 0,04 mól/liter sósavat tartalmazó izopropanolt mértünk a tartályokba, hogy a színes formazán reakció-termék feloldódjék. Az abszorpciót 570 nm-en (a referencia 630 nm) mérjük, Dynatek Microelisa Autoreader (MR580) készülékben, vagy hasonló készülékben.

E) Fc-epszilon receptor indukció

Kimutatták, hogy az IL-4 B sejteken és T sejteken, de különösen anti-IgM antitestekkel vagy hasonló antigénekkel stimulált humán B sejteken az Fc-epszilon megjelenését indukálja. Kiderítették azt is, hogy a gamma interferon specifikusan gátolja áz IL-4 által indukált Fc-epszilon megjelenését a B sejteken.

Az Fc-epszilon receptor indukció vizsgálata kezdetben előnyösen úgy indul, mint a BCGF meghatározás. Azaz, tisztított B sejtekte állítunk elő, majd ezeket IgM antitesttel (vagy hasonló antigénnel) stimuláljuk, majd IL-4 hatásának tesszük ki. Végül a sejteket Fc-epszilonra vizsgáljuk.

Számos vizsgálati módszer áll rendelkezésre a sejt felületén lévő Fc-epszilon receptorok mennyiségi meghatározására. Ilyenek például a következők: Yodoi és Ishizaka, J. Immunoi., 122, 2577-2583 (1979); Hudak és munkatársai, J. Immunoi. Meth., 84, 11-24 (1985); Bonnefoy és munkatársai; J. Immunoi. Meth., 88, 2532 (1986). Az Fc-epszilon receptorokat főként áramlásos citometriával mérhetjük, a receptorokra specifikus jelzett monoklonális antitestekkel, Becton-Dickinson FACS-IV készülékkel, vagy hasonlóval. Fc-ep14

HU 208 710 Β szilon monoklonális antitesteket a szokásos eljárásokkal állíthatunk elő.

UF) IgG]- és IgE-indukció

Az IL-4 IgE és IgG] izotípusok szekrécióját indukálja lipopoliszachariddal (LPS) aktivált B sejtekben Coffman és munkatársai, J. Immunoi., 136,4538-4541 (1986); Sideras és munkatársai Eur. J. Immunoi., 15, 586-593 (1985)]. Ezeket az aktivitásokat antitest izotípusok meghatározására szolgáló standard immun-assay-k segítségével határozhatjuk meg, Coffman és munkatársai szerint [J. Immunoi., 136, 949-954 (1986)]. Röviden összefoglalva: B sejteket aktiválunk LPS-sel való tenyésztéssel, például 4 pg/ml Salmonella typhimurium LPS-sel (Sigma) vagy 50 pg/ml E. coli 055 LPS-sel (Sideras és munkatársai szerint, lásd fent),

4-8 napos tenyésztés után a felülúszókat összegyűjtjük és vizsgáljuk. Standard izotípus-specifikus ELISA módszert használhatunk a különböző izotípus koncentrációk meghatározásához. A vizsgálatokhoz szükséges izotípus-antitestek a kereskedelemből vagy az ATCC intézményből beszerezhetők.

G) Telep stimuláló faktor (CSF) aktivitás

A CSF aktivitás meghatározásához egysejt szuszpenziót készítünk hematopoetikus sejtekből, például csontvelő sejtekből vagy fetális köldökzsinór-vér sejtekből. Az egyedi sejteket ezután és rendszerint fetális borjúszérumot tartalmazó szemi-szolid (agar) vagy viszkózus (metil-cellulóz) táptalajban „immobilizáljuk”. Megfelelő stimuláló faktor jelenlétében az egyedi sejtek szaporodnak és differenciálódnak. Minthogy a kezdeti sejtek immobilizáltak, ahogy a sejtek szaporodnak és érnek, telepek fognak keletkezni. Ezeket a telepeket ezután 7-14 nap múlva leszámolhatjuk [A. Burgess: Growth Factors and Stem Cells, 52-55. oldal, Academic Press, N. Y. (1984)]; a granulociták és makrofágok növekedésére való speciális alkalmazást lásd

T. Bradley és D. Metcalf közleményében [Aust. J. Exp. Bioi. Med. Sci., 44, 287-300 (1966)] és általában D. Metcalf „Mehopoietic Colonies c. munkájában (Springer Verlag, Berlin, 1977). Ha kívánt, az egyedi telepeket kiemelhetjük, mikroszkóp tárgylemezen fixálhatjuk és Wright/Giemsa szerint festhetjük [Todd-Sanford, Clinical Diagnosis by Laboratory Methods, 15. kiadás, kiadók: Davidson és Henry (1974)]. Az egyes telepekben lévő sejt-típusok morfológiai vizsgálatát ezután el lehet végezni.

Nem hematológiai beteganyagból csontvelő sejteket veszünk le, s a sejteket Ficollra (Ficoll 400; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO., USA) rétegezzük, lecentrifugáljuk (2000 ford/perc; 20 perc), majd a sejteket a határfelületről eltávolítjuk. Ezeket a sejteket kétszer mossuk és Iscove által módosított Dulbecco-tápoldatban - mely 10% fetális borjúszérumot (FCS) tartalmaz - s ugyanebben a tápoldatban reszuszpendáljuk, majd az adherens sejteket plasztik Petri csészére való kitapadásuk révén eltávolítjuk. A nem adherens sejteket 10⁵ sejt/ml koncentrációig olyan Iscove-féle tápoldathoz adjuk, amely 20% FCS-t, 50 μΜ/liter 2-ME-t, 0,9% metil-cellulózt és különböző koncentrációkban, vagy biztosan telep serkentő hatást kifejtő felülúszókat vagy vizsgálandó felülúszókat tartalmaz. Egy ml-es alikvot mennyiségeket viszünk rá 35 mm-es Petri csészékre, s a tenyésztést 37 °C-on végezzük, 6% CO₂ tartalmú, teljesen nedves levegő atmoszférában. A tenyészet megindulása után 3 nappal 1 egység eritropoetint adunk minden lemezhez. A 10-14. napon - inverz mikroszkóp használatával - kijelöljük a granulocitamakrofág telepeket és az eritroid bursttelepeket.

Heparinba leveszünk köldökzsinór vérsejteket és 6 percig centrifugáljuk. 2000 ford/perc mellett. A plazma és a vörösvérsejtek közti határfelületen lévő fehér vérsejteket átvisszük egy 0,17 n ammónium-kloridot és 6% FCS-t tartalmazó centrifuga csőbe, amelyet 5 percig jégben tartunk, s a szuszpenziót 4 ml FCS alá rétegezzük, majd 6 percig centrifugáljuk 2000 ford/perc mellett. A sejt üledéket a Dulbecco-féle foszfáttal pufferolt konyhasó oldattal mossuk és ezután úgy végezzük Ficollal és a plasztikra való kitapadással kapcsolatos lépéseket, ahogy azt fent a csontvelő sejteknél leírtunk. A kis sűrűségű, nem adherens sejteket összegyűjtjük és szemi-szolid agar táptalajon tenyésztjük - mint fent leírtuk - 10⁵ sejt/ml sűrűségben.

Az eljárás végén meghatározzuk a sejtek összetételét oly módon, hogy az egyedi telepeket tárgylemezre visszük és Wright-Giemsa festéssel megfestjük. Az eozinofil sejteket Suxol Fást Blue-val festjük meg [G. Johnson, D. Metcalf, Exp. Haematol., S, 549-561 (1980)].

A „potenciális” kifejezés, ahogy itt a GM-CSF stimulálta granulocita növekedésre vonatkoztatjuk, azt jelenti, hogy a fent leírt vizsgálatokban a granulocita telepek nagyobbak lesznek, ha a GM-CSF-et IL-4-el együtt használjuk, mint akkor lennének, ha a GM-CSF-et egyedül használnánk a telep növekedés stimulálására.

V. Tisztítás és gyógyszerkészítés

Az E. coliban, élesztőben vagy az egyéb sejtekben kifejeződött jelen találmány szerinti polipeptideket e szakterület standard módszerei szerint tisztíthatjuk, beleértve az ammónium-szulfáttal való kicsapást, az oszlopkromatográfiás frakcionálási (például ioncserélő kromatográfia, gélszűrés, elektroforézis, affinitás kromatográfia stb;) és a véső kristályosítás [lásd általánosságban; „Enzyme Purification and Related Techniques”, Methods in Enzymology, 22, 233-577 (1977) és R. Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer Verlag, N. Y. (1982)]. A találmány szerinti részlegesen vagy homogenitásig tisztított polipeptideket fel lehet használni kísérleti célokra, például sejt tápoldatokhoz, mint kiegészítő anyagokat [például:_; Eagle-féle minimum essential médium = Eagle MÉM; Iscove szerint módosított Dulbecco-tápoldat; RPMI 1640; a táptalajok megvásárolhatók a Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, USA) és a Gibco Division (Chagrin Falls, OH., USA) cégeknél] és mint antigént, olyan specifikus immunglobulinok előállítására, amelyek immun-assay-knél, immunfluoreszcens festéseknél stb. nyernek felhasználást [I. Lefkovits és B. Pemis, Immunological Methods, I és II kötet, Academic Press, N. Y. (1979 és 1981) és D. Weier, Handbook of Experi15

HU 208 710 Β mentái Immunology, Blackwell Scientific Publications, St. Louis, MO„ (1978)].

A jelen találmány szerinti polipeptideket gyógyszerkészítményekben is fel lehet használni, például a különböző fertőzések elleni természetes védekezés fokozására. Tehát rheumatoid arthritises betegeket, akiknél transzplantációra van szükség, vagy a rák-kemoterápia, előrehaladott életkor, immunszuppresszív szerek használata stb. okozta immunhiányos betegeket ilyen polipeptidekkel lehetne kezelni. A készítmények, akár önállóan alkalmazva, akár más, a szakterületen jártas szakemberek előtt jól ismert szerekkel együttesen alkalmazva, szelektív módon stimulálhatják az immunrendszer különböző összetevőit. Nevezetesen, e készítmények, tekintettel a jelen találmány szerinti polipeptidek potenciáló hatására, más immunreaktív anyagokat is tartalmazhatnak, ilyenek a limfokinek (például: IL-1, IL-2 stb.), a telep serkentő faktorok bármelyike, immunglobulinok stb. E polipeptidek olyan esetekben is felhasználást nyerhetnek (in vivő és in vitro), amelyekben fokozott sejt szaporodás vagy immunglobulin termelés kívánatos.

A találmány szerinti gyógyszerkészítményeket előállíthatjuk úgy, hogy a polipeptideket a gyógyszergyártásban elfogadott, előnyös, inért hordozókkal keverjük. A megfelelő hordozók és előállításuk módszerei jól ismertek a szakterületen [lásd például: Remington’s Pharmaceutical Sciences and U. S. Pharmacopeia, National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA., USA (1984)]. Előnybe helyezzük a parenterális alkalmazást, mely magába foglalhat mechanikus adagolási rendszereket.

Előnyös, ha a gyógyszerkészítmény egyadagos kiszerelésű, ahol minden adag az aktív komponens megfelelő mennyiségét tartalmazza. A készítmény egy adagjában lévő aktív komponens mennyiségét 1 gg-tól 100 mg-ig változtathatjuk, illetve állíthatjuk be, az egyedi alkalmazásnak és az aktív anyag hatékonyságának megfelelően. A készítmény, ha kívánt, más terápiás szert is tartalmazhat.

Az adagolás a beteg szükséglete szerint változhat, a kezelendő állapot súlyosságától és az adott felhasználandó anyagtól függően. A „hatásos mennyiség” kifejezés itt azt jelenti, hogy a dózisok mérlegelésénél a faktorokat vesszük számításba. Egy adott esetre megfelelő adagolás meghatározása hozzátartozik e szakterülethez. A kezelést általában a hatóanyag optimális dózisánál kisebb adagokkal kezdjük. Ezután az adagolást kicsinyenként növeljük, amíg a körülményeknek megfelelő optimális hatást el nem érjük. Kényelmi szempontból a teljes napi adagot eloszthatjuk és a nap folyamán részletekben adagolhatjuk.

VI. Expressziós rendszerek

Az expressziós rendszerek (azaz a gazda-vektor kombinációk) széles választékát használhatjuk fel a jelen találmány szerinti proteinek és muteinek előállításához. A gazdasejtek lehetséges típusai közé tartoznak a baktérium és élesztő sejtek, a rovarokból és emlősökből származó sejtek és így tovább, de nincsenek ezekre a sejt típusokra sem korlátozva. Egy adott protein vagy mutein expressziójának optimalizálása számos faktortól függ, többek között 1. a kifejezendő protein vagy mutein tulajdonságaitól, azaz a kifejezett termék mérgező lehet bizonyos gazda-rendszerekre, 2. kívánunk-e egyáltalán, s ha igen, milyen típusú transzlációt követő módosulást kívánunk meg, azaz a kívánt glükoziláció mértéke és típusa befolyásolhatja a gazda kiválasztását, 3. a szóban forgó protein vagy mutein kódoló szakaszait határoló 5’ és 3’ régiók természete, azaz a transzláció szabályozásában szerepet játszó promoterek és/vagy szekvenciák megválasztása meghatározó a hatékony kifejeződés szempontjából, 4. átmeneti vagy stabil expresszióra törekszünk-e, 5. a kifejezett terméket el tudjuk-e könnyen választani a gazdasejt és/vagy táptalaj proteinjeitől és más anyagaitól, 6. a szóban forgó proteint vagy muteint tartalmazó kifejező gazdasejtek transzficiálásának könnyű kivihetősége és hatékonysága, 7. az illető kívánt protein vagy mutein kifejezésére használt tenyészet volumene, 8. és vajon a szóban forgó protein vagy mutein a gazdasejt valamely protein fragmentumával vagy hasonló faktorokkal fuzionáltan fejeződik-e ki.

A találmány szerinti DNS szekvenciák klónozására általában előnybe helyezzük a prokariótákat. A prokarióta expressziós rendszerek felhasználására általános vezérfonalat adnak a következő munkák: Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y,, 1982); Perbal, A Practical Guide to Molecular Gloning (John Wiley and Sons, N. Y., 1984); Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, I és II kötet (IRL Press, Oxford, 1985); De Boer és munkatársai Strategies fór Optimising Foreign Gene Expression in Escherichia coli”, Genes: Structure and Expression c. kiadványban, szerkesztője Kroon, kiadó: John Wiley & Sons, N. Y., 1983. Például az E. coli K12 294 törzs (ATCC letéti száma 31446) különösen hasznos. Az egyéb használható mikrobiális törzsek közé tartozik az E. coli B és az E. coli X 1776 (ATCC letéti száma 31537). Ezek természetesen példák és inkább illusztrációként szerepelnek, mintsem korlátozásként.

A prokarióták expresszió céljára is felhasználhatók. Az előbb említett törzsek, valamint az E. coli W3110 (Fs^_, λ, prototróf, ATCC letéti száma 27325), a bacilusok, mint a Bacillus subtilis és az enterális baktériumok, mint a Salmonella typhimurium vagy Serratia marcescens és a különböző Pseudomonas fajok ugyancsak használhatók.

Általában azokat a plazmid vektorokat használjuk ezen gazdasejtbe beépítve, amelyek a gazdasejttel kompatíbilis fajból származó replikont és szabályozó szekvenciákat tartalmaznak. A vektor rendszerint egy replikációs helyet, valamint olyan marker szekvenciákat tartalmaz, amelyek a transzformált sejtekben a fenotípusos elválasztást lehetővé teszik. Például: az E. colit gyakran transzformáljuk pBR322-vel, mivel ez egy E. coliból származó plazmid [Bolivár és munkatársai, Gene, 2,95 (1977)]. A pBR322 ampicillin és tetraciklin rezisztencia géneket tartalmaz, amelyek kényel16

HU 208 710 Β mes eszközül szolgálnak a transzformált sejtek azonosításánál. A pBR322 plazmidnak vagy a többi mikrobiális plazmidnak tartalmaznia kell még - vagy módosítandók, hogy tartalmazzanak - olyan promotereket, amelyeket a mikroorganizmus a saját proteinjeinek a kifejezésére használhat fel. A rekombináns DNS szerkesztéseknél legáltalánosabban használt promoterek a következők: a β-ΐ3&3ΐηέζ-(ρεηίεί11ίηέζ) és laktóz-promoter rendszer [Chang és munkatársai, Natúré, 275, 615 (1978); Itakuraés munkatársai, Science, 198,1056 (1977); Goeddel és munkatársai, Natúré, 281, 544 (1979)] és a triptofán (trp) promoter rendszer (Goeddel és munkatársai, Nucleic Acids Rés., 8, 4057 (1980); EPO Appl. Publ. No. 0036776], Bár ezek a legáltalánosabban használt promoterek, azonban más mikrobiális promotereket is felkutattak és felhasználtak, nukleotid szekvenciáikat részletesen leközölték, s így egy ügyes kutató össze tudja ezeket is kötni funkcionálisan plazmid vektorokkal [Siebenlist és munkatársai, Cell, 20,269 (1980)].

A prokariótákon kívül eukarióta mikroorganizmusokat - ilyenek az élesztő tenyészetek - is használhatunk. A Saccharomyces cerevisiae, vagy egyszerűen pékélesztő, a legáltalánosabban használt eukarióta mikroorganizmus. Saccharomycesben való kifejezés céljára a legáltalánosabban használt plazmid az YRp7 [Stinchcomb és munkatársai, Natúré, 282, 39 (1979); Kingsman és munkatársai, Gene, 7, 141 (1979); Tschemperés munkatársai, Gene, 10,157 (1980)]. Ez a plazmid már tartalmazza a trpl gént, amely szelekciós markerül szolgál olyan mutáns élesztő törzsek szelekciójánál, amelyek triptofán jelenlétében nem képesek nőni, ilyen például az ATCC 44076 letéti számú mutáns vagy a PEP4-1 [Jones, Genetics, 85, 12 (1977)]. Az élesztő gazdasejt genomjára jellemző trpl károsodás jelenléte hatásos környezetet teremt a transzformáció kimutatására a triptofán hiány melletti növekedései által.

Az élesztő vektorokban alkalmazott promoter szekvenciák közé tartoznak a következők: 3-foszfoglicerát kináz promoter [Hitzeman és munkatársai, J. Bioi. Chem., 255,2073 (1980)] vagy a glükolízis egyéb enzimei [Hess és munkatársai, J. Adv. Enzyme Reg., 7, 149 (1968)]; Holland és munkatársai, Biochemistry, 17,4900 (1978)], ilyen az enoláz, gliceraldehid-3-foszfát-dihidrogénáz, hexokináz, piruvát dekarboxiláz, foszfo-frukto-kináz, glükóz-6-foszfát izomeráz, 3-foszfo-glicerát mutáz, piruvát kináz, tríóz-foszfát izomeráz, foszfo-glükóz izomeráz és glükokináz. Az alkalmas expressziós plazmidok szerkesztésekor az ezekhez a génekhez tartozó terminátor szekvenciákat szintén beépítjük a vektorba - ligáz segítségével - a kifejezendő szekvencia 3’-nél lévő egy pozíciójánál, hogy biztosítsuk a mRNS poliadenilációját és terminációját. Egyéb promoterekhez, amelyeknek ezenkívül még az az előnyük, hogy növekedési körülményekkel szabályozzák a transzkripciót, az alkohol dehidrogénáz-2, izocitokróm C, savanyú foszfatáz, a nitrogén anyagcseréhez tartozó bontó enzimek és a már említett gliceraldehid-3-foszfát dehidrogénáz enzim promoter szakaszai tartoznak, továbbá a maltóz és glükóz hasznosításáért felelős enzimek promoter szakaszai (lásd Holland már idézett munkáját). Bármilyen olyan plazmid vektor alkalmas, amely élesztő-kompatíbilis promotert, replikációs kezdőpontot és terminátor szekvenciákat tartalmaz.

A mikroorganizmusokon kívül többsejtű organizmusokból származó sejt-tenyészeteket is használhatunk gazdaként. Lényegében bármilyen ilyen sejt-tenyészettel dolgozhatunk, akár gerincesekből, akár gerinctelenekből származik. Azonban sokkal lényegesebbek a gerincesek sejtjei és ezek szaporítása tenyészetben (szövet tenyészetekben) rutin eljárássá vált a legutóbbi években [Tissue Culture, Academic Press, szerkesztők: Kruse és Patterson (1973)]. Használható sejtvonalak például a következők: VERŐ és Hella sejtek, a kínai hörcsög ovarium sejtvonalak (CHO), W138, COS 7, egér myeloma (ATCC száma: TIB19 vagy TIB20) és az MDCK sejtvonalak. Az ezekhez a sejtekhez tartozó expressziós vektorok rendszerint (ha szükséges) replikációs kezdőpontot, egy promoter a kifejezendő génnel szemben, a szükséges riboszóma kötő helyekkel együtt, RNS splicing helyeket, poliadeniláció helyet és transzkripció terminátor szekvenciákat tartalmaznak.

Emlős sejtekben való felhasználáskor az expressziós vektor szabályozó funkcióinak ellátását gyakran vírus eredetű anyag biztosítja. Az általánosan használt promoterek polyomából, az adenovírus-2-ből és leggyakrabban a Simian vírus 40-ből (SV40) származnak. Az SV40 vírus korai és késői promoterei különösen alkalmasak, mivel mindkettőt könnyen megkaphatjuk a vírusból olyan fragmentumokként, amelyek az SV40 vírus replikációs kezdőpontját is tartalmazzák [Fiers és munkatársai, Natúré, 273, 113 (1978)]. Kisebb és nagyobb SV40 fragmentumokat is használhatunk, feltéve, ha magukba foglalják azt a mintegy 250 bp hosszú szekvenciát, amely a HindlII helytől addig a BglI helyig terjed, amely a vírus replikációs kezdőpontjában helyezkedik el. Végül, az is lehetséges és gyakran kívánatos is, hogy a kívánt gén szekvenciához normálisan hozzá tartozó promotert vagy szabályozó szekvenciákat használjuk fel, ha ezek a szabályozó szekvenciák a gazdasejt rendszerrel kompatíbilisek.

A vektor replikációs kezdőpontja lehet exogén eredetű, például származhat az SV40-ből vagy más virális forrásból (Polyoma, Adeno, VSV, BPV stb.), vagy endogén eredetű, azaz a gazdasejt kromoszomális replikációs mechanizmusából származó. Gyakran elengedő, ha a vektort a gazdasejt kromoszómájába integráljuk.

Ha alkalmas gazdasejtet óhajtunk kiválasztani a találmány szerinti vektorokkal - ezek a t-Pa (tissue plasminogen activator. szöveti plazminogén aktivátor) proteint és a DHFR (dihidrofolát reduktáz) proteint kódoló DNS szekvenciákat tartalmazzák - való transzficiáláshoz, akkor helyes, ha az alkalmazott DHFR protein típusának megfelelően választjuk meg a gazdát. Abban az esetben, ha a vad típusú DHFR proteint használjuk, előnyös, ha DHFR deficiens gazdasejtet választunk, s így lehetővé válik a DHFR kódoló szekvenciának markerként való felhasználása az eredményes transzfekció kimutatásához olyan szelektív tápta17

HU 208 710 Β lajban, amelyben nincs hipoxantin, glicin és timidin. Ilyen alkalmas gazda a DHFR aktivitás hiányos CHO sejtvonal, amelyet Urlaub és Chasin [Proc. Natl. Acad. Sci., 77, 4216 (1980)] leírása szerint tartunk fenn és szaporítunk.

Másrészt, ha a DHFR proteint használjuk szabályozó szekvenciaként, amelynek alacsony a kötő affinitása az MTX-hez (metotrexát), úgy nem szükséges DHFRrezisztens sejteket alkalmazni. Minthogy a mutáns DHFR metotrexátra rezisztens, MTX tartalmú tápoldatokat használhatunk a szelekcióhoz, feltéve, ha a gazdasejtek maguk metotorexát érzékenyek. Úgy tűnik, hogy a legtöbb eukarióta sejt, amelyek MTX-et képesek abszorbeálni, azok metotrexát érzékenyek. Ilyen hasznos sejtvonal egy CHO vonal, a CHO-K1, amelynek ATCC letéti száma CCL 61.

A gerinctelen expressziós rendszerek közt található a selyemhernyó (Bombyx móri) lárvája, BmNPV baculovírussal fertőzve [Maeda és munkatársai, Natúré, 315, 892-894 (1985); Saibo Koguku, 4, 767-779 (1985)].

Az alábbi példák a jelen találmány megvilágítására szolgálnak. A vektorok és gazdasejtek megválasztása, valamint a reagensek koncentrációja, a hőmérséklet és más változók értékei kizárólag a jelen találmány alkalmazására szolgáló példák adataiként szerepelnek, és nem tekinthetők a találmány oltalmi köre korlátozásaként.

Az alábbiakban a találmányban használt anyagok és módszerek leírása következik.

A Cl.Lyl⁺279 [rövidítve: Cl.l; G. Nabel, J. S. Greenberger, M. A. Sakakeeny és H. Cantor, Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 1157-1161 (1981)] és a GK15-1 T sejtvonalat (M. Giedlintől származik, DNAX Research Institute of Molecular and Cellular Biology, Inc.; DNAX) 5xl0⁵ sejt/ml sűrűségben 50 mM/liter 2-ME (2-merkapto-etanol), 1% FCS és 2 pg/ml ConA (Konkanavanin A) tartalmú RPMI 1640 tápoldatban reszuszpendáljuk. A felülúszókat 24 óra múlva összegyűjtjük és -70 °C-on tároljuk.

Az MC/9 klónozott hízósejtvonalat [G. Nabel, S. J. Galli, H. F. Dvorak és H. Cantor, Natúré, 291, 332334, (1981)] G. Nabeltől kaptuk (Dana Farber Cancer Institute; DFCI). Az MM3 (R. Coffmantól származik, DNAX) és Dx-2 (D. Rennicktől származik, DNAX) hízósejtvonalakat a myelomonocita-markerek hiánya és az IgE receptorok jelenléte jellemzi, továbbá, hogy a hisztamin szint nagyobb, mint. 250 ng/10⁶ sejt. A myeloid NFS-60 sejtvonalat J. Ihle bocsátotta rendelkezésre (Frederick Cancer Research Facility; FCRF). Az NFS-60 sejtvonalat szubklónoztuk, hogy egy IL-3 depedens kiónt kapjunk. A HT2 T sejtvonalat S. Strobertől kaptuk (Stanford University, Palo Alto, CA., USA); a CTLL-2 sejtvonalat W. Farrartól kaptuk (FCRF) és a Ly 23/4 sejtvonalat G. Nabeltől (DFCI). A hízósejt és T sejtvonalakat 10% FCS és 50 μΜ/liter 2-ME tartalmú olyan RPMI 1640 tápoldatban tartottuk fenn, melyet rekombináns IL-3-mal vagy IL-2-vel egészítettünk ki.

A különböző IL-3 depedens sejtek hisztamin szintjeit a P. A. Shore, A. Burkhalter és V. H. Conn [J. Pharm. Exp.

Ther., 127, 182-186 (1959)] által leírt módszerrel határoztuk meg. A T sejt és hízósejt növekedési faktor aktivitásokat a ³(H)-timidin beépülése alapján vagy a T. Mosmann [J. Immunoi. Meth., 65, 55-63 (1983)] által leírt kolorimetriás módszerrel határoztuk meg.

A WEHI-3 felülúszóból tisztított IL-3-at J. Ihle (FCRF) bocsátotta rendelkezésünkre. A rekombináns IL-2, IL-3, GM-CSF és IFN-gamma használata a megfelelő cDNS kiónokkal transzficiált COS 7 majom vese sejtekből származó felülúszók formájában történt. Az IL-2, IL-3 vagy GM-CSF egysége az a faktor mennyiség, amely a faktor-depedens sejtvonalak maximális ³(H)-timidin beépülését 50%-ban stimulálja [D. Rennick és munkatársai, J. Immunoi., 134, 910-919 (1985)]. Az IFN-gamma egy egységes 50%-ban megvédi az egér L sejteket a vezikuláris stomatitis vírus citopátiás hatásával szemben [R. Schreiber és munkatársai, J. Exp. Med., 156, 677689 (1982)].

A T sejtekre kimerített egér lép sejtek egysejtszuszpenziójából a B sejteket, valamint a makrofágokat standard eljárások szerint állítottuk elő [M. Howard és munkatársai, J, Exp. Med., 155, 914 (1982)]. Az itt leírt tisztított faktor azon képességét, hogy indukálja-e B sejteken az la megjelenését, citofluorometriás analízissel állapítjuk meg, és hogy stimulálja-e a B sejtek proliferációját, egy Roehm által leírt [N. Roehm és munkatársai, J. Exp. Med., 160, 679] anti lg ko-stimulációs módszerrel határozzuk meg.

A protein meghatározások vagy UV abszorpció (280 nm vagy 220 nm) alapján történnek vagy festékkötő kapacitásukra felvett standard görbék használata alapján [M. Bradford, Anal. Biochem., 72, 248-254 (1976)]. A felülúszókat először hússzorosára koncentráljuk Pellicon kazettával (Millipore, Bedford, MA., USA), majd (reverz fázisú kromatográfia után) oldószer bepárlással töményítjük Speedvac (Savant, Farmingdale, N. Y., USA) készülékben. Az SDS-PAGE analízist 12%-os géllel, Laemmli rendszerével [U. Laemmli, Natúré, 680-685 (1970)] történik. A marker proteinek a Pharmacia-féle low MW standardok (alacsony molekulatömegű standard anyagok; Pharmacia, Uppsala, Svédország). A gélek ezüst-festése C. Merril és munkatársai [Science, 211, 1437-1438 (1981)] szerint történik. Az MCGF és TCGF aktivitás direkt meghatározása a molekulatömeg függvényében úgy történik, hogy a mintákat 50 mM/liter DTTvel való előzetes redukció után, vagy enélkül, elektroforetizáljuk, a géleket 1 mm-es szeletekre vágjuk, összezúzzuk és a proteint egy éjszakán át 4 °C-on, 5 mg/ml tojásalbumint (ovalbumint, Sigma, St. Louis, MO., USA) tartalmazó 0,5 ml oldattal kioldjuk.

A kromatografálást 18 °C-on végezzük Pharmaciaféle FPLC rendszerben (Fást Protein, Polypeptide and Polynucleotide Liquid Chromatography), kiegészítve egy Kratos Spectroflow 773 UV detektorral (Kratos, Ramsey, NJ., USA). A kationcserélő kromatográfíához a Phaimacia Mono S oszlopot (0,5x5 cm) használjuk, 50 mM/liter nátrium-foszfátot és 1 mM/liter EDTA-t (pH = 7,0) tartalmazó oldattal kiegyensúlyozva. A felül18

HU 208 710 Β úszókat ugyanezen pufferrel visszük fel az oszlopra és NaCl grádienssel - 1 mólosig - történik a kioldás. A reverz fázisú kromatográfiához a Pharmacia C8 oszlopot (0,5x2 cm) használjuk. A mintát 0,1 %-os TFA-val hígítjuk pH = 2-ig és így visszük fel az oszlopra, ezután 0,1% TFA-t tartalmazó acetonitril grádienssel oldjuk le.

Az MCGF és TCGF aktivitások izoelektromos pontját kromatofokuszálással határozzuk meg, Pharmacia Mono P oszlopon (0,5x2 cm). A mintát 0,025 mólos bisztrisz-ben (pH = 7,1) visszük fel a Mono P oszlopra, amelyet ugyanezen pufferrel előzőleg kiegyensúlyoztunk. A gradiens elúciót a Pharmacia-féle Polybuffer 74 használatával végezzük (pH = 4,0; hígítás = 1 : 10; a pH-t amino-diecetsavval állítjuk be). Az effluens pH-ját folyamatosan mérjük a Pharmacia cégtől származó pH monitoron. Injektálás előtt minden mintát Millex GV 0,2 μ-os szűrőn (Millipore) szűrünk meg.

Az SDS-PAGE vagy kromatográfiás menetek frakcióit arra nézve vizsgáljuk, hogy képesek-e fenntartani három sejtvonal - NFS-60 (IL-3), MC/9 (MCGF) és HT2 (TCGF) - proliferációját.

E faktor homogenitásig való tisztításához 8 liter ConA-val aktivált Cl. 1 felülúszót dializálunk 20 mmólos HEPES pufferben (pH = 7,0), majd átengedjük Pharmacia Mono S 10/10 kationcserélő oszlopon, melyet ugyanezen pufferrel kiegyensúlyoztunk. Lineáris só-grádiens alkalmazásánál a csúcs-aktivitás 0,2 mól/liter NaCl-nál oldódik ki. Ezt az anyagot egyesítjük, koncentráljuk, újra dializáljuk 20 mmólos HEPES pufferben (pH = 7,0), majd ugyanezen pufferrel kiegyensúlyozott Heparin-Sepharose oszlopra visszük fel. Lineáris só-grádienssel - 2 M/liter NaCl-ig - a csúcs-aktivitás 0,45 M/liter NaCl-nál eluálódik. Ezt az anyagot poolozzuk, tízszeresére hígítjuk 0,10/TFA/H₂0 (pH = 2) oldattal, majd Vydac reverz fázisú oszlopon (c4) frakcionáljuk. Lineáris acetonitril grádiens alkalmazása esetén - 0,1% TFA-val - az aktivitás 42% acetonitrilnél oldódik le.

/. példa

Egér IL-4 cDNS-ek de novo előállítása Cl.Lyl⁺2~ sejtekből és tranziens expressziójuk COS 7 majom sejtekben

IL-4-et kódoló cDNS kiónokat izolálunk Cl.Ly 1*279 egér helper T sejtvonalból [letétbe helyezve az American Type Culture Collection intézményben CRL 8179 letéti szám alatt; Nabel és munkatársai, Cell, 23, 19-28 (1981) és Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 1157-1161 (1981)]. Egy másik, BCGF aktivitású egér sejtvonal az EL-4 sejtvonal, mely az ATCC-ból TIB 39 letéti számon hozzáférhető. Az ebben a példában használt eljárás leírása megtalálható Lee és munkatársai egy közleményében [Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 2061-2065 (1986)]. Röviden: pcD cDNS gyűjteményt hozunk létre ConA-val indukált Cl.Ly 1*279 sejtekből származó mRNS-sel, Okayama és Berg szerint (lásd fent). Egy randomizált klónokból álló nagy fiók-gyűjteményből eltávolítjuk az IL-3 és GM-CSF kiónokat ³²P-vel jelzett cDNS próba-anyagokkal való hibridizálás segítségével. A fiók-gyűjteményben visszamaradt poolokat és/vagy egyedi kiónokat IL-4 cDNS-re szűrjük úgy, hogy COS 7 majom sejteket transzficiálunk és a tenyészetek felülúszóit MCGF és TCGF aktivitásra vizsgáljuk.

A) IL-4 termelés indukálása

Cl.Ly 1*279 sejteket indukálunk IL-4 mRNS termelésre ConA-val a következőképpen: a sejteket 5x10⁵ sejt/ml - Dulbecco szerint módosított Eagle-tápoldatban (DME) tenyésztjük, amely még 5xl0⁵ M/liter 2-ME-t, 2 mM/liter glutamint, nem-esszenciális aminosavakat, esszenciális vitaminokat és 2 μg/ml ConA-t tartalmaz. A sejteket 12-14 órán át inkubáljuk 37 ’Con, 10% CO₂ tartalmú atmoszférában, majd a sejtszuszpenziót 1500 ford/perc mellett centrifugáljuk 10 percig. A sejtüledékeket összegyűjtjük és azonnal -70 ’C-ra hűtjük.

B) mRNS izolálása

A sejtekből ossz sejt-DNS-t izolálunk a J. Chirgwin és munkatársai szerint guanidin-izotiocianát módszerrel [Biochemistry, 18,5294-5299 (1979)]. A ConA-val indukált Cl.Ly 1*279 sejtekből (a stimulálás után 12 órával) kapott fagyasztott sejtüledékeket guanidinizotiocianátos lizáló oldatban szuszpendáljuk. Húsz ml lizáló oldatot használunk l,5xl0⁸ sejthez. Az üledékeket pipettázással reszuszpendáljuk, majd a DNS-t fecskendővel - 16-os tűvel - való négyszeri átszívással távolítjuk el. A lizátumot egy 40 ml-es poliallomer centrifugacsőben lévő 20 ml 5,7 M/liter cézium-kloridot és 10 mM/liter EDTA-t tartalmazó oldat tetejére rétegezzük. Az oldatot 25 000 ford/perc mellett centrifugáljuk Beckman SW28 rotorban (Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA., USA) 40 órán át 15 ’C-on. A DNS-t tartalmazó guanidin-izotiocianát fázist, mely felülről a fázishatárig terjed, lepipettázuk. A csövet a fázishatár alatt ollóval levágjuk és a CsCl oldatot dekantáljuk. Az RNS üledéket kétszer mossuk hideg 70%-os etanollal. Az üledéket ezután 500 μΐ 10 mM triszxHCl-t (pH = 7,4), 1 mM EDTA-t és 0,05% SDS-t tartalmazó oldatban reszuszpendáljuk. Hozzáadunk 50 μΐ 3 mólos nátrium-acetátot és az RNS-t 1 ml etanollal kicsapjuk. Centrifugálás és az üledék egyszeri mosása következik hideg etanollal, s így mintegy 0,3 mg ossz RNS-hez jutunk.

A mosott és szárított ossz RNS üledéket 900 μΐ oligo (dT) kioldó pufferben [10 mM triszxHCl (pH =

7,4), 1 mM EDTA, 0,5% SDS] reszuszpendáljuk. Az RNS-t 3 percig 68 ’C-on melegítjük, majd jégen lehűtjük, s ezután 100 μΐ 5 mólos NaCl-t adunk hozzá. Az RNS mintát egy 1,0 ml-es oligo(dT) cellulóz oszlopra (3-as típus, Collaborative Research, Waltham, MA., USA) visszük fel, melyet előzőleg kötő-pufferrel [10 mM triszxHCl (pH = 7,4), 1 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 0,5% SDS] kiegyensúlyoztunk. Az oszlopon átfolyt mennyiséget még kétszer átengedjük az oszlopon. Az oszlopot ezután 20 ml kötő pufferrel mossuk. A kioldó pufferrel való mosással szedjük le a poliA* mRNS-t. Az RNS általában az első 2 ml kioldó puferrel jön le. Az RNS-t 0,1 térfogat 3 mólos nátrium-acetáttal (pH = 6) és 2 térfogat etanollal

HU 208 710 Β csapjuk ki. Centrifugálunk, majd az RNS üledéket összegyűjtjük, kétszer mossuk hideg etanollal, majd szárítjuk. Az üledéket ezután vízben reszuszpendáljuk. Alikvot mennyiségeket hígítunk és 260 nm-en mérjük az abszorpciót.

C) pcD cDNS gyűjtemény létesítése

1. Vektor primer és oligo(dG) farokkal ellátott linker DNS-ek előállítása

Okayama és Berg módszerét [Mól. & Cell. Biok, 2, 161-165 (1982)] alkalmazzuk egészen kis módosítással. A pcDVl és pLl plazmidokat Okayama és Berg [Mól. & Cell. Biok, 3, 380-389 (1983)] írták le és a Pharmacia cégtől (Piscataway, NJ., USA) szerezhetők be. Egy speciális, módosított pcDVl plazmidot használunk, amely egy Nsil helyet tartalmaz a KpnI hely előtt.

A pcDVl DNS-ből 80 pg-ot emésztünk 30 °C-on 20 egység KpnI endonukleázzal 450 μΐ reakcióelegyben, mely 6 mM triszxHCl-t (pH = 7,5), 6 mM MgCl₂-t, 6 mM NaCl-t, 6 mM 2-ME-t és 0,1 mg marha szérum albumint (BSA) tartalmaz ml-enként. Az emésztést 16 óra múlva állítjuk le 40 pl EDTA (pH = 8,0) és 20 μΐ 10%-os SDS hozzáadásával. A DNS-t vízzel telített 1 : 1 fenol: kloroform keverékkel (ezután mint fenol-CHCl₃ szerepel) extraháljuk, majd etanollal kicsapjuk. Végződésenként 60, de nem több, mint 80 dezoxitimidilát (dT) csoportból álló homopolimer farkakat kapcsolunk az Nsil endonukleázzal létrehozott végekhez, borjú timusz terminális transzferáz segítségével a következőképpen: a reakcióelegy (38 pl) nátrium-kakodilát - 30 mM triszxHCl puffért (pH = 6,8), 1 mM CoCl₂-t, 0,1 mM DTT-t, 0,25 mM dTTP-t, az Nsil endonukleázzal emésztett DNS-t és 68 egység terminális dezoxinukleotidil transzferázt (P-L. Biochemicals, Inc., Milwaukee, WI., USA) tartalmaz. A reakciót, melyet 30 percig 37 °C-on folytatunk le, 20 μΐ 0,25 mólos EDTA (pH = 8,0) és 10 μΐ 10%-os SDS hozzáadásával állítjuk le, majd a DNS-t többszöri fenol-kloroformos extrahálással és etanolos kicsapással nyerjük vissza. A DNS-t ezután 15 egység EcoRI endonukleázzal emésztjük 5 órán át 37 “C-on, 50 μΐ reakcióelegyben, mely 10 mM triszxHCl-t (pH = 7,4), 10 mM MgCl₂-t, 1 mM DTT-t és 0,1 mg BSA-t tartalmaz ml-enként. A nagy framentumot, amely az SV40 poliadenilációs helyét, a pBR322 replikációs kezdőpontját és az ampicillin rezisztencia gént tartalmazza, agaróz gél (1%-os) elektroforézissel tisztítjuk és egy módosított üvegpor módszerrel [B. Vogelstein és D. Gillespie, Proc. Natl. Acad. Sci., 76, 615-619 (1979)] különítjük el a gélből. A dT-farokkal ellátott DNS-t ezután oligo (dA) cellulóz oszlopra való adszorbeálással és innen való eluálással tovább tisztítjuk a következőképpen: a DNS-t 1 ml 1 mM EDTA és 1 M NaCl tartalmú 10 mmólos triszxHCl pufferben (pH = 7,3) oldjuk, 0 °C-ra hűtjük, majd oligo (dT) cellulóz oszlopra (0,6x2,5 cm) visszük fel, melyet előzőleg ugyanezen pufferrel 0 °C-on kiegyensúlyoztunk, majd vízzel oldjuk ki, szobahőmérsékleten. A kioldott DNS-t etanollal csapjuk ki és 1 mM EDTA tartalmú 10 mmólos triszxHCl-ben (pH = 7,3) oldjuk.

Az oligo(dG)-farkas linker DNS-t úgy készítjük, hogy 75 pg pLl DNS-t 20 egység Pstl-endonukleázzal emésztünk 16 órán át 30 °C-on, 450 μΐ reakcióelegyben, mely 6 mM triszxHCl-t (pH = 7,4), 6 mM MgCl₂-t, 6 mM 2-ME-t, 50 mM NaCl-ot és ml-enként 0,01 mg BSA-t tartalmaz. A reakcióelegyet ezután fenol-CHClj-mal extraháljuk és a DNS-t etanollal kicsapjuk. Ezután végződésenként 10-15 dezoxiguanilát (dG) csoportot adunk a végekhez 46 egység terminális dezoxinukleotidil transzferáz segítségével, ugyanolyan összetételű reakcióelegyben (38 pl), mint amit fent leírtunk, kivéve, hogy 0,1 mM dGTP-t használunk dTTP helyett. Az elegyet 20 percig 37 °C-on tartjuk, majd fenol-CHCl₃-mal extraháljuk, a DNS-t etanollal kicsapjuk, majd 35 egység HindlII endonukleázzal emésztjük 4 órán át 37 °C-on 50 μΐ 20 mM triszxHCl-t (pH - 7,4), 7 mM MgCl₂-t, 60 mM NaCl-t és 0,1 mg BSA-t tartalmazó oldatban. Az oligo(dG)-farokkal ellátott kis linker DNS-t agaróz gél (1,8%) elektroforézissel tisztítjuk és a fentiek szerint nyerjük vissza.

2. cDNS gyűjtemény létesítése

1. lépés: cDNS szintetizálás. A reakcióelegy (10 μΐ) a következő összetételű: 50 mM triszxHCl (pH = 8,3), 8 mM MgCl₂, 30 mM KC1, 0,3 mM DTT, 2-2 mM dATP, dTTP, dGTP és dCTP, 20 pCi ³²P-dCTP (3000 Ci/mmól), 3 g poliA⁺RNS a ConA-val indukált T sejtekből, 60 egység RNasin [a Promega Biotec. Inc., (Madison, WI., USA) által gyártott ribonukleáz inhibitor márkaneve], 2 pg a vektor-primer DNS-ből (a primer-vég 15 pmólja) és 45 egység reverz transzkriptáz. A reakcióelegyet 60 percig 42 “C-on inkubáljuk, majd a reakciót 1 pl 0,25 mólos EDTA (pH = 8,0) és 0,5 pl 10%-os SDS hozzáadásával állítjuk le; ezután 40 pl fenol-CHCl₃-ot adunk az oldathoz, Vortex keverőben erősen megkeverjük, majd centrifugáljuk. A vizes fázishoz 40 pl 4 mólos ammónium-acetátot és 160 pl etanolt adunk, az oldatot szárazjégen hűtjük 15 percig, majd felmelegítjük szobahőmérsékletre, óvatosan rázogatva, hogy feloldódjanak a lereagálatlan dezoxinukleotid-trifoszfátok, amelyek a hűtés alatt kicsapódtak, majd 10 percig Eppendorf mikro-centrifugán centrifugálunk. Az üledéket 10 pl 10 mM triszxHCl (pH = 7,3) és 1 mM EDTA tartalmú oldatban feloldjuk, elkeverjük 10 pl 4 mólos ammónium-acetáttal, kicsapjuk 40 pl etanollal, s ezzel a lereagálatlan dezoxinukleozid-trifoszfátok több mint 99%-át eltávolítjuk. Az üledéket etanollal öblítjük.

2. lépés: Oligodezoxicitidilát [oligo(dC)] addíció. Az üledéket, amely a plazmid-cDNS-t tartalmazza, 20 pl 140 mM nátrium-kakodilát - 30 mM triszxHCl pufferben (pH = 6,8) oldjuk. A puffer 1 mM CoCl₂-t, 0,1 mM DTT-t, 0,2 pg poli(A)-t, 70 mM dCTP-t, 5 pCi ³²P-dCTP-t (3000 Ci/mmól) és 60 egység terminális dezoxinukleotidil transzferázt tartalmaz. A reakciót 37 °C-on 5 percig végezzük, hogy létrejöjjön végződésenként 10-15 dCMP csoport addíciója, majd 2 pl 0,25 mólos EDTA (pH = 8,0) és 1 pl SDS hozzáadásával állítjuk le a reakciót. A reakcióelegyet 20 pl fenolCHCl₃-mal extraháljuk, a vizes fázishoz 20 pl 4 mólos ammónium-acetátot keverünk, a DNS-t kicsapjuk,

HU 208 710 Β majd újra kicsapjuk 80 μΐ etanollal, s az utolsó üledéket etanollal öblítjük.

3. lépés: Emésztés HindlII endonukleázzal. Az üledéket 30 μΐ olyan pufferben oldjuk, mely 20 mM triszxHCl-t (pH = 7,4), 7 mM MgCl₂-t, 60 mM NaCl-t és 0,1 mg/ml BSA-t tartalmaz, majd az oldatot 10 egység HindlII-mal emésztjük 2 órán át 37 ’C-on. A reakciót 3 μΐ 0,25 mólos EDTA (pH = 8,0) és 1,5 μΐ 10%os SDS hozzáadásával állítjuk le. Ezután extrahálás következik fenol-CHCl₃-mal, majd 30 μΐ 4 mólos ammónium-acetátot adunk az elegyhez, végül a DNS-t 120 μΐ etanollal csapjuk ki. Az üledéket etanollal öblítjük, majd feloldjuk 10 μΐ 10 mM triszxHCl (pH = 7,3) és 1 mM EDTA tartalmú oldatban. Az oldathoz 3 μΐ etanolt adunk, hogy a -20 ’C-on való tárolás alatt ne fagyjon le.

4. lépés: Ciklizálás az oligo(dG)-farokkal ellátott linker DNS segítségével. A HindlII-mal emésztett, oligo(dC)-farokkal rendelkező cDNS : mRNS plazmid (a minta mintegy 90%-a) minta 9 pl-ét 90 μΐ következő összetételű oldatban inkubáljuk: 10 mM triszxHCl (pH = 7,5), 1 mM EDTA, 0,1 M NaCl, 1,8 pM oligo(dG)farokkal rendelkező linker-DNS. Az inkubálást 65 ’Con 5 percig, majd 42 ’C-on 60 percig végezzük, utána az elegyet 0 ’C-ra hűtjük. Az oldatot (90 pl) ezután 900 μΐ térfogatra állítjuk be úgy, hogy az 20 mM triszxHCl-t (pH - 7,5), 4 mM MgCl₂-t, 10 mM (NH₄)₂SO₄-t, 0,1 M KCl-t, 50 g/ml BSA-t és 0,1 mM β-NAD-ot tartalmazzon. Az oldathoz ezután 6 pg E. coli DNS-ligázt adunk és egy éjszakán át 12 ’C-on inkubáljuk.

5. lépés: az RNS szál cseréje DNS szálra. Az inszertum RNS szálának kicserélése érdekében a ligáz reakciót úgy állítjuk be, hogy a négy dezoxinukleotidtrifoszfátból 40-40 pmólt, 0,15 mmól β-NAD-ot, még 4 pg E. coli DNS-ligázt, 16 egység E. coli DNS polimeráz I-et (Poll) és 9 egység E. coli RNázH-t tartalmaz. Ezt az oldatot (960 pl) ezután 11 órán át 12 ’Con, majd szobahőmérsékleten inkubáljuk, hogy létrejöjjön az optimális helyreállítás szintézis (repair synthesis) és Poll segítségével a nick transzláció.

6. lépés: E. coli transzformálása. A transzformálást a Cohen és munkatársai által leírt [Proc. Natl. Acad. Sci., 69, 2110-2114 (1972)] eljárás szerint - ezt kissé módosítva - végezzük E. coli K12 MC1061 törzset (ATCC 53 338) [M. Casadeban és S. Cohen, J. Mól. Bioi., 138, 179-207 (1980)] tenyésztünk 300 ml Lbroth táplevesben (GIBCO) 600 nm-en mért 0,5 abszorpció értéket adó sűrűségig. A sejteket centrifugálással gyűjtjük össze és 30 ml 10 mM PIPES (pH = 7,0) puffer, 60 mM CaCl₂ és 15% glicerin tartalmú oldatban szuszpendáljuk, majd 0 ’C-on 5 percig centrifugáljuk. A sejteket a fenti puffer 24 ml-ében reszuszpendáljuk és 0 ’C-on 5 percig inkubáljuk; ezután a sejtszuszpenzió 1,0 ml-es alikvot mennyiségeit 0,1 ml DNS oldattal (5. lépés) keverjük és most 0 ’C-on 20 percig inkubáljuk. Ezután a sejteket 42 ’C-on tartjuk 2 percig, majd szobahőmérsékleten 10 percig; ekkor 1 liter L-broth tápoldatot adunk a sejtekhez és a tenyészetet 37 ’C-on 60 percig inkubáljuk. Ekkor pg/ml koncentrációig ampicillint adunk a tenyészethez, majd még 10 órán át rázzuk 37 ’C-on. A tenyészet hígításait 50 pg/ml ampicillint tartalmazó L-broth levessel készült agarra rétegezzük. A táptalajt 37 ’C-on

12-24 órán át inkubáljuk, majd steril fogpiszkálókkal egyedi telepekkel szúrunk ki. Összesen megközelítőleg lxlO⁵ független cDNS klón keletkezett.

D) A pcD gyűjtemény szűrése

AT sejt cDNS gyűjteményből találomra 10⁴ egyedi kiónt emelünk ki és ezeket egyedileg szaporítjuk mikrotitráló lemezek tartályaiban, amelyek 200 pl 50 pg/ml ampicillin és 7% dimetil-szulfoxid (DMSO) tartalmú L-broth tápoldatot tartalmaznak. Kizárólag az újszerű MCGF aktivitásra való figyelemmel, ötvenhárom IL-3 cDNS kiónt és egy GM-CSF cDNS kiónt azonosítottunk a Lee és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 4360-4364 (1985)], valamint Yokota és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci., 81,1070-1074 (1984)] által közölt klónokból szerkesztett megfelelő ³²P-vel jelzett cDNS próba-anyagokkal való hibridizáció révén, ezután ezeket a kiónokat eltávolítjuk. A 96 tartályos lemezeken lévő tenyészetek mindegyikét nitrocellulóz szűrőkre osztjuk el a hibridizációs szűréshez. A hibridizálásokat 0,1% SDS-t, 100 pg/ml E. coli tRNS-t és 50% formamidot tartalmazó 6xSSPE pufferben [lxSSPE =180 mM NaCl, 10 mM nátrium-foszfát (pH = 7,4), 1 mM EDTA] végezzük 16 órán át 42 ’C-on. A hibridizáló telepek azonosítása a mosott szűrőlemezek autoradiográfiás vizsgálatával történik. Ezeket a kiónokat úgy távolítjuk el, hogy az ezen kiónokat tartalmazó mikrotitráló tartályokat etanollal sterilizáljuk, mielőtt a klón poolokat elkészítjük. Ezután 48 cDNS kiónt tartalmazó poolt készítünk a mikrotitráló lemez tenyészeteiből. Kétszáz ilyen poolból 1 literes tenyészeteket készítettünk, 100 pg/ml ampicillin-tartalmú L-broth táptalajjal. Minden tenyészetből izoláltuk a plazmid DNS-t, amelyet úgy tisztítottunk, hogy kétszer vittük át CsCl grádiensen. Minden DNS poollal COS 7 majom sejteket transzficiáltunk az alábbiak szerint. [A COS 7 sejteket Gluzman írta le: Cell, 23,175-180 (1981), s az ATCC intézményben CRL 1651 letéti szám alatt rendelkezésre áll].

A transzfekció előtt egy nappal, körülbelül 10⁶ COS 7 majom sejtet oltunk egyedi 100 mm-es lemezeken lévő, 10% FCS és 2 mM glutamin tartalmú DME tápoldatba (GIBCO). A transzfekció kiviteléhez minden lemezről leszívjuk a tápoldatot és 4 ml olyan DME táptalajjal helyettesítjük, mely 50 mM triszxHCl-t (pH = 7,4), 400 pg/ml DEAE-dextránt és a vizsgálandó plazmid DNS-ekből 50 pg-ot tartalmaz. A lemezeket órán át 37 ’C-on inkubáljuk, majd a DNS tartalmú tápoldat eltávolítása után a lemezeket kétszer mossuk ml szérummentes DME-vel. Ezután 150 pM Chloroquine (klorokin) tartalmú DME tápoldatot viszünk a lemezekre és további 3 órán át inkubálunk 37 ’C-on. A lemezeket egyszer mossuk DME-vel, majd ráviszünk 4% FCS-t, 2 mM glutamint, penicillint és streptomicint tartalmazó DME-t, a sejteket 72 órán át 37 ’C-on inkubáljuk. Ezután a táptalajt elszívjuk és különböző bioassay-kben kiértékeljük.

HU 208 710 Β

A plazmid poolok egy első csoportját először proliferációs vizsgálatokkal szűrtük TCGF és NCGF aktivitásra HT-2 sejtvonallal (alább részletesebb leírás következik), illetve MC/9 sejtvonallal. Az első 110, ezen két sejtvonallal vizsgált pool közül nyolcnak volt jelentős aktivitása a HT-2 TCGF meghatározásnál. Több poolnak gyenge, de kifejezett MCGF aktivitása volt, de minthogy az MCGF aktivitások általában sokkal gyengébbek és sokkal változóbbak voltak, a pozitív poolok azonosításánál nem erre a módszerre támaszkodtunk.

A random pool transzfekciókból származó COS felülúszóknak mintegy felét la indukáló aktivitásra is vizsgáltuk egér B sejteken. A vizsgált poolok közül mindazok, amelyek TCGF aktivitásúak voltak, Ia-indukciós aktivitással is rendelkeztek. Tehát jó korreláció mutatkozott a TCGF aktivitás és az Ia-indukciós aktivitás között.

Az egyik poolt, a 2A jelűt, amely reprodukálhatóan a legaktívabb volt minden vizsgálatban, 48 kisebb szubpoolra osztottuk. Két szubpool volt pozitív MCGF és TCGF aktivitásra egyaránt. A 2A-E3 egyedi kiónt, amely közös volt mindkét szubpoolban, egyedileg kitenyésztettük és plazmid DNS-ével COS 7 majom sejteket transzficiáltunk, ahogyan fent leírtuk. A kapott COS felülúszót különböző aktivitásokra vizsgáltuk, így MCGF, TCGF, la indukciós és IgE- és IgG-fokozó aktivitásra.

A 2A-E3 kiónból (1A ábra) egy 366 bp hosszú PstI fragmentumot izolálunk, ³²P-vel jelezzük, s ezt használjuk próba-anyagként azoknak a pooloknak a szűréséhez, amelyek biológiai aktivitás szempontjából pozitívak voltak és más nem vizsgált poolok szűrésére. A szűrést hibridizációval végezzük párhuzamos szűrőlemezekre vitt mikrotitráló lemez - tenyészetekkel, mint fent. Kilenc hibridizáló kiónt izoláltunk, s ezek DNS-ét restrikciós térképezéssel analizáltuk. Mindegyik biológiai aktivitást mutató pool legalább egy olyan hibridizáló kiónt tartalmazott, amelynek közös restrikciós hasítási térképe volt a 2A-E3 kiónéval. A kiemelt 10⁴ klónból a hibridizáló kiónok gyakorisága arra enged következtetni, hogy a teljes gyűjteményben megközelítőleg 0,2% a gyakoriság. A megvizsgált hibridizáló kiónok közel 90%-a fejezett ki funkcionális proteint.

E) pcD-2A-E3-mal transzficiált COS 7 majom sejt tenyészetek felülúszóinak biológiai aktivitása.

A pcD-2A-E3-mal transzficiált COS 7 sejtek felülúszóját a HT-2 egér helper T sejtvonalon vizsgáljuk Watson szerint [J. Exp. Med., 150, 1510 (1979)]. A HT-2 sejteknek a Mosmann-féle (fent idézve) kolorimetriás módszenei meghatározott proliferációját használjuk a TCGF aktivitás mértékéül [a proliferáció foka arányos az 570-630 nm-en mért optikai sűrűséggel (OD)]. A 3 A ábra az alábbi felülúszók különböző hígításainak relatív TCGF aktivitását mutatja be: (i) pcD2A-E3-mal transzficiált COS 7 sejtek felülúszója (1-es görbe), (ii) a Cl.Lyl⁺279 tenyészetek felülúszói (2-es görbe), (iii) IL-2 cDNS-t hordozó pcD plazmiddal transzficiált COS 7 majom sejtek felülúszója (3-as görbe), (iv) cDNS inszertumot nem tartalmazó pcD plazmiddal transzficiált (azaz „ál-transzfekció”) COS 7 sejtek felülúszója (4-es görbe).

A pcD-2A-E3-mal transzficiált COS 7 sejtek felülúszóit MC/9 sejteken vizsgáljuk MCGF aktivitásra és az MC/9 sejtek proliferációjának mérésére szintén a Mosmann-féle koiorimetriás módszert használjuk. A 3B ábra az alábbi felülúszók relatív MCGF aktivitását ábrázolja: (i) pcD-2A-E3-mal transzficiált COS 7 sejtek felülúszója (1-es görbe), (ii) IL-3 cDNS-t hordozó pcD plazmiddal transzficiált COS 7 sejtek felülúszója (2-es görbe), (iii) Cl.Ly1*279 sejtek felülúszója (3-as görbe) és (iv) áltranszficiált COS 7 sejtek felülúszója (4-es görbe).

A 3C ábra egy la indukciós vizsgálat eredményét mutatja be, melyet az alábbi felülúszókkal végeztünk: (i) pcD-2A-E3-mal transzficiált COS 7 sejtek felülúszója (1-es görbe), (ii) Cl.Lyl*279 sejtek felülúszója (2-es görbe), (iii) ál-transzficiált COS 7 sejtek felülúszói (3-as görbe). Az la indukciós vizsgálatot Roehm és munkatársai szerint (fent idézve) végeztük. Több DBA/2 egér (2-3 hónapos) leölése után sebészi úton vesszük ki a lépeket. A vörösvérsejteket hipotóniás sokk alkalmazásával, 0,87%-os ammónium-kloriddal lizáljuk. Ezután a T sejteket lizáljuk T sejt specifikus felületi markerek (Thy-1, Lyt-1 és Lyt-2) elleni citotoxikus monoklonális antitestek (Linscott’s Directory of Immunological and Biological Reagents, Mill Valley, Califomia) használatával, s ezt követően nyúl komplementtel való inkubációval. Az elpusztult sejteket Ficoll-Hypaque sűrűség-grádienssel távolítjuk el. Az adherens sejteket előzőleg eltávolítottuk műanyag Petri csészékre való kitapadás révén, 37 °C-on. Ekkor a sejteket mossuk, számoljuk és az élő sejteket megjelöljük. Közel 1 millió sejtet inkubálunk 0,5 ml szövet-tenyésztő tápoldatban (RPMI 1640 vagy Minimal-essential-medium, azaz MEM/Earle sók; Gibco), melyet 10% FCS-vel, 2-ME-vel és különböző anbibiotikumokkal (penicillin, streptomicin, gentamicin) egészítünk ki. Azokban a kísérletekben, ahol a pozitív kontroll a T sejt-mitogén ConA-val indukált T sejt felülúszóból áll, 10 mg/ml (végső koncentráció) a-metilmannozidot adagolunk a mitogén közömbösítésére. A sejteket 24 órás inkubáció után szüreteljük és előkészítjük anti-I-A^d vagy anti-I-A⁶⁰ monoklonális antitestekkel való festéshez. Ezeket az antitesteket első antitestekként használjuk, vagy NIP hepténnel (NIP = 4hidroxi-3-jodo-5-nitrofenil-ecetsav) vagy biotinnal konugálva. A festést fluoreszceinnel jelzett második reagensekkel (vagy anti-NIP antitestek, vagy avidin) fejezzük be. A fluoreszcens-festés intenzitását vagy fluoreszecencia-aktivált sejt-osztályozóval (fluoreszcensactivated cell sorter, Becton-Dickinson, Mountain Vi-, ew, CA., USA) vagy Cytofluorograph-al (Orto Diagnostics, Cabridge, MA., USA) határozzuk meg. A 3C ábrában a fluoreszcencia egységét úgy számoljuk ki, hogy a mintákban lévő pozitív sejtek százalékát megszorozzuk a fluoreszcens festés intenzitásával.

A 3D ábra grafikusan ábrázolja a T sejtekre kimerített egér lép sejtekben az alábbi anyagok által indukált IgE és IgG termelés mértékét: (i) COS 7 táptalaj (a COS 7 sejtek felülúszója) (1-es oszlop), (ii) ál-transzfíciált COS 7 sejtek felülúszójából 20% (2-es oszlop), (iii) Cl.Ly 1+279 sejtek felülúszójából 10% + az ál-transzficiált COS 7 sej22

HU 208 710 Β tek felülúszójából 20% (3-as oszlop), (iv) pcD-2A-E3mal tamszficiált COS 7 sejtek felülúszójából 20% (4-es oszlop). Az IgE és IgGi szinteket izotípus-specifikus ELISA-val határozzuk meg, ahogy fent leírtuk.

Úgy találtuk, hogy az IL-4 fokozza az IL-3 MCGF aktivitását MC/9 sejtekben [Smith és Rennick, Proc. Natl. Acad. Sci., 83,1857-1961 (1986)]. Szintén megállapítást nyert, hogy az egér IL-4 is fokozza az NFS60 IL-3 dependens sejtvonal GM-CSF-fel stimulált proliferációját [Holmes és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 82,6687-6691 (1985)].

F) A pcD-2A-E3 szerkezete és cDNS inszertumának nukleotid szekvenciája

A pcD-2A-E3 szerkezetét a 2A ábra diagram-szerűen ábrázolja és inszertumának kinyújtott restrikciós térképét a 2B ábra mutatja be. Az inszertum szekventálását a Maxam- és Gilbert-féle megközelítéssel [Methods in Enzymology, 65, 499-560 (1980)] és a Sanger-féle megközelítéssel [Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463-5467 (1977)] egyaránt elvégeztük. A szekvenciát az 1A ábrán mutatjuk be és az ATG start kodonnal kezdődő leghosszabb nyílt leolvasási keret mentén a szekvenciából levezetett aminosav szekvenciát is felírtuk. Az egér 2A-E3 cDNS kiónban az egyetlen hosszú nyílt leolvasási keret 140 aminosav csoportból áll. Minthogy ez a limfokin egy szekretált protein, azt várnánk, hogy egy hidrofób vezér szekvencia előzi meg a protein érett szekretált formájának a szekvenciáját. A polipeptid hidrofób voltának az analízise és ennek összehasonlítása a szignál peptidek feldolgozására javasolt megállapodás szerinti szekvenciával [Perlman és munkatársai, J. Mól. Bioi., 167, 391-409 (1983)] azt sugallja, hogy a prekurzor polipeptid lehasadása az 1A ábra szerinti 20. aminosav pozícióban lévő szerin csoport után következik be. Brabstein és munkatársai [J. Exp. Med., 163, 1405-1414 (1986)] megerősítették, hogy a szekretált egér IL-4 N-terminális szekvenciája az 1A ábra szerinti 21. pozícióban lévő His-nél kezdődik.

II. példa

Humán helper T sejt cDNS gyűjteményből egér cDNS próba-anyag alkalmazásával előállított humán IL-4, s ennek tranziens kifejeződése COS 7 majóm sejtekben és egér L sejtekben Az IL-4-et kódoló cDNS kiónokat egér cDNS próba-anyag használatával olyan cDNS gyűjteményekből állítjuk elő, amelyeket a 2F1 indukált humán helper T sejtekből és indukált humán perifériás vér limfocitákból (PBL) hozunk létre. Más humán sejtvonalakról is tudjuk, hogy BCGF aktivitásúak, s ezek közé tartoznak a CEM vonal variánsai, amelyek ATCC letéti számai a következők: CCL 119, CRL 8436 és TIB 195 [Foley és munkatársai, Cancer, 18, 522-529 (1965); Ligler, Lymphokine Research, 3, 183-191 (1984)].

A 2F1 humán helper T sejt kiónokat és a humán PBL sejteket 3% FCS-sel kiegészített Iscove-féle táptalajban (GIBCO) tenyésztjük. A 2F1 sejteket (5xl0⁵ sejt/ml) ConA-val (10 pg/ml) aktiváljuk, míg a PBL sejteket (5X10⁵ sejt/ml) 1 pg/ml PHA-val (fitohemagglutinin) stimuláljuk 12 órán át, majd 5 pg/ml

ConA-t adunk hozzá. A sejteket a ConA hozzáadása után 4 óra múlva (2F1) vagy 10 óra múlva (PBL) szüreteljük. [Spits et al., J. Immunoi., 128,95 (1982)].

Az mRNS kivonása és a cDNS gyűjtemény előállítása az I. példában leírtak szerint történik. Az égér pcD-2A-E3 cDNS kiónból egy PstI fragmentumot izolálunk, nick transzláció segítségével jelezzük (lxlO⁸ cpm/pg) és 10 pool DNS készítményt - ezek mindegyike a 2F1 cDNS gyűjteményből körülbelül lxlO³ kiónt képvisel - tartalmazó nitrocellulóz szűrőn, próba-anyagként használjuk fel. A hibridizációs körülmények nem szigorúak, a hibridizálás egy éjszakán át 42 °C-on történik 100 pl következő összetételű oldatban: 6xSSPE [lxSSPE= 180 mM NaCl/10 mM nátrium-foszfát, pH = 7,4/1 mM EDTA; T. Manitas és munkatársai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y., 1982], 20% (térf./térf.) formamid, 0,1% SDS és 10 pg/ml élesztő carrier tRNS. A szűrőket 2xSSPE és 0,1% SDS tartalmú oldattal mossuk 37 °C-on.

A tíz pool egyikében egyetlen kiónt (pcD-46) azonosítottunk. További kiónokat kaptunk, amikor a PBL cDNS gyűjteményt a pcD-46 (restrikciós térképe a 2D ábrán látható) Nhel-EcoRI fragmentumából szerkesztett próba-anyaggal szűrtük. A restrikciós enzim-analízisek azt mutatták, hogy a PBL kiónok szerkezete megegyezik a pcD-46 szerkezetével. Megállapítottuk, hogy a pcD-46 inszertum kódoló szakaszától az 5’ irányába, azaz felfelé elhelyezkedő guanidinben gazdag szakasz az IL-4 polipeptid kifejeződését gátolja. Ezért a pcD46 inszertumát újra klónoztuk, hogy eltávolítsuk a guanidinben gazdag régiót. A kapott klón a pcD-125 nevet kapta. Azt is megállapítottuk, hogy javult az expreszszió, ha egér L sejteket transzficiáltunk a pcD-46-tal.

A pcD-125 vektor szerkesztését a következőképpen végezzük: a pcD-46-ot Sau3A-val hasítjuk, s így megkapjuk a cDNS inszertum 162 nukleotidját tartalmazó 5’ fragmentumot (a GC szegmentum eltávolításával), majd e fragmentumot a plOl plazmid BglII helyére építjük be. A plOl plazmid a pcD-egér IL-3-ból [lásd

T. Yokota és munkatársai fent idézett munkáját (1984)] származik és hiányzik belőle az a szekvencia, amely a cDNS 5’ végén lévő PstI helytől az egér IL-3 cDNS BglII helyéig terjed. Egy BglII hely van a deletált szekvencia csatlakozásánál. A Sau3A fragmentumot fuzionáljuk az SV40 promoterével, mint a pcD-46-ban, kivéve a GC szegmentumot. A humán cDNS többi részét a pcD-46 HindlII/Nhel fragmentumával állítjuk helyre. Ez a fragmentum a cDNS 3’ végét, az SV40 poli-A helyét és a pcD-46-ban lévő összes pBR322 szekvenciát tartalmazza. [A hasítási és ligálási műveleteket a Maniatis Kézikönyv, Cold Spring Harbor (1982) szerint végezzük.]

A pcD-46-tal és a pcD-125-tel transzficiált COS 7 és L sejtek felülúszóit BCGF és TCGF aktivitásra vizsgáljuk. A TCGF-et az Epstein-Barr vírussal transzformáit JL-EBV humán helper T sejtvonalon [Sly et al., Tissue Antigens, 7, 165 (1976)], és fitohemagglutininnel (PHA) stimulált perifériás vér limfocitákon (PBL) vizsgáljuk.

HU 208 710 Β

A JL-EBV humán helper T sejt kiónt egy EBV-vel transzformált B sejtvonal besugárzott (4500 R) sejtjeivel stimuláljuk [Sly et al., Tissue Antigens 7, 165 (1976)], majd ezután olyan RPMI 1640 tápoldatban tartjuk fenn, mely 10% humán AB szérumot, 50 μΜ 2-ME-t és 20 NE/ml rekombináns humán IL-2-t tartalmaz. A humán PBL sejteket PHA-val (20 pg/ml-enként) stimuláljuk és 10% FCS-t, 50 μΜ 2-ME-t és 20 NE/ml rekombináns humán IL-2-t tartalmazó RPMI 1640 tápoldatban tartjuk fenn. A stimulálás utáni 5-10. napon a JL-EBVvel stimulált sejteket vagy a PHA-val stimulált blaszt sejteket használjuk cél-sejtekként a kétnapos TCGF vizsgálatban, ahol a Mosmann-féle kolorimetriás módszert (lásd fent) használjuk vagy a háromnapos, ³(H)-timidin beépülésén alapuló TCGF vizsgálatban.

A 4A ábra a JL-EBV stimulálta sejtek TCGF aktivitását mutatja be (kolorimetriás meghatározás) = (i) humán EL-2-t kifejező pcD plazmiddal transzficiált COS 7 sejtek felülúszójában (A görbe), (ii) a pcD-125-tel transzficiált L-sejtek felülúszójában (B görbe), (iii) a pcD-125-tel transzficiált COS 7 sejtek felülúszójában (C görbe), (iv) a pcD-46-tal transzficiált COS 7 sejtek felülúszójában (D görbe), (v) ál-transzficiált COS 7 sejtek felülúszójában (E görbe). A 4B ábra a PHA-val stimulált PBL sejtek TCGF aktivitását ábrázolja (kolorimetriás módszer): (i) a humán IL-2-t kifejező pcD plazmiddal transzficiált COS 7 sejtek felülúszójában (A görbe), (ii) a pcD- 125-tel transzficiált COS 7 sejtek felülúszójában (B görbe), (iii) az áltranszficiált COS 7 sejtek felülúszójában (C görbe). A 4C ábra a PHA-val stimulált PBL sejtek TCGF aktivitását ábrázolja (tríciummal jelzett timidin beépülési módszer) = (i) a pcD-125-tel transzficiált COS 7 sejtek felülúszójában (A görbe), (ii) a humán IL-2-t kifejező pcD plazmiddal transzficiált COS 7 sejtek felülúszójában (B görbe), (iii) az ál-transzficiált COS 7 sejtek felülúszójában (C görbe).

A pcD-125 transzfekciós felülúszók különböző hígításainak BCGF aktivitását a Maizei és munkatársai által leírtak szerint egy BCGF („kereskedelmi BCGF”) BCGF aktivitásával hasonlítottuk össze [Proc. Natl. Acad. Sci., 79, 5998-6002 (1982)]; beszerezhető a Cytokine Technology International cégtől (Buffalo, N. Y., USA)]. A II. táblázat a COS 7 transzfekciós felülúszók különböző hígításainak BCGF aktivitását mutatja be. A vizsgálatokhoz anti-IgM antitesttel előaktivált B sejteket használtunk.

II. táblázat

Az IL-4 cDNS transzfekciós felülúszók hatása anti-IgM-mel pre-aktivált B sejtekre

Adagolt felülúszó térfogat/térfogat%-ban	3(H)-timidin beépülése (cpm)
ál-transz- fekció	klón-125	ál-transzfekció + 10% BCGF	klón-125 + 10% BCGF
0	278	278	1835	1835
0,2	189	144	1362	2303
1	323	1313	1699	3784

Adagolt felülúszó térfogat/térfogat%-ban	3(H)-timidin beépülése (cpm)
ál-transz- fekció	klón-125	ál-transzfekció + 10% BCGF	klón-125 + 10% BCGF
5	408	4314	1518	7921
15	397	4289	1093	8487

A III. táblázat a COS 7 transzfekciós felülúszók különböző hígításainak BCGF aktivitását tartalmazza a SAC-preaktivált B sejteken (készítést lásd fent).

III. táblázat

Az IL-4 cDNS transzfekciós felülúszók hatása SAC-preaktivált B sejtekre

Adagolt felülúszó térf./térf.%ban	3(H)-timidin beépülése (cpm)
ál-transz- fekció	klón-125	ál-transzfekció + 10% BCGF	klón-125 + 1%BCGF
0	2237	2237	12,992	12,992
0,2	1789	2682	13,126	5,655
1	740	2374	13,714	6,765
5	1285	2826	5,848	10,023
15	1560	4701	10,128	10,924

Bár mind a találmány szerinti IL-4, mind a kereskedelmi BCGF egyaránt BCGF aktivitást fejt ki, Metha és munkatársai [J. Immunoi., 135, 3298-3302 (1985)] kimutatták, hogy a kereskedelmi BCGF-nél a BCGF aktivitás biokémiai úton elkülöníthető a TCGF aktivitástól, ami azt jelenti, hogy az aktivitásokat különböző molekulák fejtik ki. Ennélfogva a humán IL-4 és a kereskedelmi BCGF két különböző molekula, mivel a humán IL-4-ben a TCGF aktivitás nem választható el a BCGF aktivitástól standard biokémiai frakcionálási technikákkal.

Humán IL-4 cDNS-t hordozó plazmidokkal transzficiált COS 7 sejtek felülúszói a normál humán T sejtek és a JL-EBV humán T sejt klón proliferációját indukálják, s aktivitásuk hasonló az egér IL-4 aktivitásához. Mindazonáltal a humán T sejtek humán IL-4 által indukált proliferációjának maximális mértéke csak fele az IL-2 indukálta proliferációnak. Az IL-4 proliferációt indukáló aktivitását nem lehet IL-2 elleni vagy az IL-2 receptor elleni monoklonális antitestekkel gátolni. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az IL-4 közvetlenül hat a T sejtekre és nem az IL-2 indukciója útján és aktivitását nem közvetíti az IL-2 receptor. A COS-humán IL-4 felülúszók a szemcsékhez kötött anti-IgM antitestek optimális koncentrációival előaktivált humán B sejtek proliferációját is stimulálják és a BCGF meghatározásoknál a kereskedelmi BCGF telítési értékeihez proliferáció kapacitással járulnak hozzá. Ez arra enged következtetni, hogy a humán IL-4 és a kereskedelmi BCGF más úton hatnak a B sejtekre, azaz feltehetően különböző receptor-készletek révén. A felülúszók nem indukálják jelentősen a SAC-preaktivált

HU 208 710 Β

B sejtek proliferációját, míg a PHA-val stimulált PBL tenyészetek felülúszóiból tisztított kereskedelmi BCGF erős indukciós hatással van a SAC-preaktivált humán B sejtek proliferációjára. Ezek az eredmények ezenfelül azt is jelentik, hogy a humán IL-4 cDNS másfajta BCGF aktivitást kódol, mint ami a kereskedelmi BCGF-ben van jelen.

A pcD-125-tel transzficiált COS 7 sejtek felülúszóját arra is vizsgáltuk, hogy a mandulából származó B sejtek Fc-epszilon receptorait képes-e indukálni. A humán mandula sejteket egy-sejt szuszpenzióvá diszpergálunk standard módszerek használatával. A B sejt populációt feldúsítjuk a fent leírt eljárás szerint és a táptalajban a feldúsított sejteket IgM antitesttel stimuláljuk 24 órán át 37 ’C-on. Az Fc-epszilon receptorhordozó sejteket Becton-Dickinson FACS IV sejtosztályozó készülékkel vizsgáljuk, a receptorra specifikus flureszceinnel jelzett monoklonális antitesttel, Bonnefoy és munkatársai által közölt módszer szerint [J. Immunoi. Meth., 88, 25-32 (1986)]. Az 5A-5D ábrák olyan hisztogramok, amelyek a sejt-frekvenciát (ordináta) a fluoreszcencia intenzitással (abszcissza) szemben ábrázolják. A fluoreszcencia intenzitás arányos a sejten lévő Fc-epszilon receptorok számával. Az ábrákon szereplő sejteket anti-IgM-mel stimuláltuk. Az 5A-5D ábrákon a pcD-125-tel transzficiált COS 7 sejtek felülúszóiból 0, 0,1, 1 és 10%-ot tartalmazó közegek hatásának kitett sejtekről van szó.

A 46-os számú klón cDNS inszertumának DNS szekvenciáját meghatároztuk és ezt az 1B ábrán mutatjuk be. A cDNS inszertum 615 bp hosszú a poli(A) farok nélkül. Egyetlen nyitott leolvasási rendszere van, ahol az első ATG kodon az 5’ végtől számított 64-66. nukleotidnál helyezkedik el, ezután 153 kodon következik, majd az 523-525. nukleotid pozícióban a TAG terminátor kodonnal végződik. A várható polipeptid N-terminális szegmentuma hidrofób, amint az egy szekretált protein esetében várható.

A jelen találmány szerinti humán és egér cDNS kódoló szakaszainak összehasonlítása megmutatta, hogy a pcD-46-ban a humán cDNS-t kódoló szekvenciában az 1-90 és 129-149 aminosavak által meghatározott szakaszok mintegy 50%-ban homológok az egér cDNS (2AE3) kódoló szekvenciájának megfelelő szakaszaival. Ezek a szakaszok és az 5’-nél és 3 ’-nál lévő nem transzlatált szakaszok körülbelül 70%-ban homológok a két különböző faj két cDNS szekvenciáiban, míg a humán protein 91-128 aminosavai által jellemzett szakasznak igen csekély a homológiája a megfelelő egér régióval. A humán proteinben lévő hét cisztein csoportból hat cisztein csoportból hat található a rokon egér proteinben. Bizonyos aminosav szekvencia homológia fellelhető a jelen találmány egy humán polipeptidjének natív formája és az egér IL-3 között. A 7-16 és 120-127 aminosav csoportok 50, illetve 55%-ban homológok az egér IL-3 prekurzorpolipeptid 16-27 és 41-49 aminosav csoportjaival [T. Yokota és munkatársai, Proc. Natl. Acad., Sci., 81,10701074(1984)].

Amint azt alább részletezzük, azt találtuk, hogy a pcD-125-tel transzficiált COS 7 felülúszókból tisztított humán IL-4 egy 129 aminosavból álló polipeptid, s ezt az IC ábrán mutatjuk be.

JJI. példa

A humán IL-4 kifejeződésének fokozása COS 7 majom sejtekben, RSV-LTR promotert tartalmazó Epstein-Barr vírusból (EBV) származó vektor alkalmazásával

A humán IL-4 tíz-hússzorosára fokozott kifejeződését érjük el, ha a pcD-125 Xhol fragmentumát beklónozzuk egy EBV-ből származó olyan vektorba, amely . a Rous-szarkóma vírus hosszú-terminális-ismétlődő szakaszú (RSV-LTR; LTR = long terminál repeat) promoterét tartalmazza. Az EBV-ből származó vektort és az RSV-LTR promotert Gorman és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci., 79, 6777-6781 (1982)] és Yatos és munkatársai [Natúré, 313, 812-813 (1985)] írták le.

A C. M. Gorman és munkatársai által leírt módszerrel [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79,6777-6781 (1982)] egy pSRl plazmidból származó, RSV-LTR-t tartalmazó PvuII/BstNI fragmentumot [lásd Yamamoto, t. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6777-6781 (1982)] HindlII linkerekkel módosítva RSV-LTR-t tartalmazó PvuII/HindlII fragmentummá alakítunk, és agarózgélelektroforézissel tisztítjuk és izoláljuk. Ezt a fragmentumot inszertáljuk az Okayama és Berg által előállított [Okayama, H. and Berg, P. Mól. Cél. Bioi. 3, 280 (1983)] és a Pharmacia cég (Uppsala, Svédország) által kereskedelmi forgalomba hozott pcDVl plazmid HindlII és KpnI hasítási helyei közé úgy, hogy előzőleg a KpnI hasítási helyet T4 DNS polimeráz és a négy dezoxinukleozid-trifoszfát alkalmazásával tompa végűvé feltöltjük; így az kompatíbilis lesz az RSV-LTR-t tartalmazó fragmentum PvuII hasítási helyével való ligáláshoz. A kapott plazmidot ezután Xhol-gyel és HindlII-mal emésztjük; tisztítás és izolálás után így egy RSV-LTR-t tartalmazó XhoI/HindlII fragmentumot kapunk.

Egy másik XhoI/HindlII fragmentumot is készítünk a szintén a Pharmacia cég által forgalmazott és az SV40 replikációs kezdőpontot (SV40 őri) tartalmazó, oligo(dG)-farkas pLl plazmidból Xhol-gyel és HindUI-mal végzett emésztéssel. A gélelektroforézissel végzett elválasztás és tisztítás után izolált legnagyobb fragmentum az SV40 ori-t tartalmazó tiszta XhoI/HindlII fragmentum. Ezt úgy módosítjuk, hogy Xhol hasítási végét T4 DNS polimeráz és a négy dezoxinukleozid-trifoszfát alkalmazásával tompa végűvé feltöltjük, majd HindlII linkerekkel kapcsoljuk, és végül HindlII-mal emésztjük. így egy mindkét végén HindlII hasítási helyeket tartalmazó fragmentumot kapunk.

Ezt az SV40 ori-t tartalmazó fragmentumot kapcsoljuk az RSV-LTR-t tartalmazó XhoI/HindlII fragmentummal, és HindlII-mal és Xhol-gyel hasított pcDVl plazmidba ligáljuk. A restrikciós analízis azt bizonyítja, hogy mindegyik fragmentum egyetlen kópiában van jelen a plazmidban. Mivel az SV40 ori-t tartalmazó fragmentum mindkét végén HindlII hasítási helyek vannak, bármely orientációban inszertálódhat. Az orientáció azonban nem lényeges, mert az RSV25

HU 208 710 Β

LTR csak egy irányban (unidirectionally) klónozható. A kapott pcD vektor - egy AatlI és Ndel hasítási helye között - sorban (az AatlI hasítási helytől számítva) egy SV40 őri szakaszt, egy RSV-LTR promotert és egy SV40 poliA szakaszt tartalmaz. Miután a pcD-125 Xhol fragmentumát izoláltuk és beépítettük az újonnan izolált pcD vektor Xhol helyére, standard módszerekkel segítségével Sáli helyekké konvertáljuk a vektor egyetlen AatlI és Ndel helyét. Röviden vázolva: A pcD vektort AatlI-vel és Ndel-gyel emésztjük, izoláljuk az IL-4-et tartalmazó fragmentumot, majd az izolált fragmentumot T4 DNS polimerázzal kezeljük a nukleozid trifoszfátok megfelelő koncentrációinak jelenlétében. A T4 DNS polimeráz, 5’ —> 3* DNS polimeráz aktivitása révén, betölti a restrikciós hasításoknál lévő 5’-nél túllógó részeket és 3’ -> 5’ exonukleáz aktivitása révén, leemészti a restrikciós hasításoknál lévő 3’ túllógó részeket, miáltal tompa végű fragmentumok keletkeznek, amelyekhez kinázzal kezelt Sáli linkereket (New England Biolabs) kötünk T4 DNS ligáz alkalmazásával. (Az enzimes műveleteket a gyártók előírásai szerint végezzük.)

A fenti Sáli fragmentumot (a 11. ábrán látható) beépítjük a Yates és munkatársai (fent idézve) által leírt EBV-ből származó p201 vektorban lévő egyetlen Clal helyre, amelyet Sáli hellyé konvertálunk standard módszerekkel. Röviden: a p201-et (a 11. ábrán mutatjuk be) Clal-gyel emésztjük, a DNS polimeráz I-gyel (Klenow fragment) és a nukleozid trifoszfátok megfelelő koncentrációival. Ezzel az eljárással betöltjük a Clal hasítási helyeknél túllógó végeket, s így tompa végű fragmentumot kapunk. Ezután a tompa végekhez kinázzal kezelt Sáli linkereket kötünk. A kapott EBVvektor származékot, amely az RSV-LTR promotert és a humán IL-4 cDNS inszertumot tartalmazza, a pEBV178 névvel láttuk el.

A pEBV-178 vektorral COS 7 sejteket transzficiálunk standard módszerek használatával és a tenyészet felülúszóit TCGF aktivitásra vizsgáljuk, mintegy az IL-4 kifejeződés mértékéül.

IV. példa

A natív humán IL-4 és az 75° (Ala-Glu-Phe) műiéin kifejeződése E. coliban

Két humán IL-4 cDNS inszertumot tartalmazó vektort szerkesztünk humán IL-4-nek E. coliban való kifejezése céljára: a pIN-III szekréciós vektort, amely az ompA protein („pIM-III-ompA2”) szignál peptid szekvenciáját tartalmazza és a pUC12 plazmidot, amely a trp promotert és egy szomszédos riboszóma kötő hely (RBS = ribosome binding site) szakaszt tartalmaz („TRPC11”).

A) pIN-III-ompA2

Két vektort szerkesztünk a pIM-III-ompA2 plazmid felhasználásával [Ghrayeb és munkatársai, EMBO I, 3, 2437-2442 (1984) és Masui és munkatársai, Biotechnology, 2, 81-85 (1984)].

Az első vektort, melyet pIN-III-ompA2(l) jelzéssel láttunk el, úgy szerkesztjük, hogy folytatólagosan öszszekapcsoljuk az EcoRI/BamHI-gyel emésztett pINIII-ompA2 plazmidot, egy szintetikus linker és a pcD125 BamHI/EcoRV fragmentumát. A szintetikus linker használata eredményeként egy olyan biológiailag aktív IL-4 polipeptid szekretálódik, aminek három különleges N-terminális aminosava az Al-Glu-Phe; azaz az IS° (Ala-Glu-Phe) mutein szekretálódik. A szintetikus linker nukleotid szekvenciája a következő:

AA TTC CAC AAG TGC GAT

G GTC TTC ACG CTA

Az EcoRI/BamHI-gyel emésztett pIN-III-ompA2-t és a pcD-125 BamHI/EcoRV fragmentumát egy standard ligációs oldatban (lásd Maniatis és munkatársai fent idézett munkájában) keverjük össze, mely a szintetikus linkerből 0,1 pmól-t tartalmaz. Ezután az Ab 1899 E. coli törzset megfertőzzük a pIN-IIl-ompA2(l) plazmiddal és a transzformált sejteket telep-hibridizálással szelektáljuk, ³²P-vel jelzett IL-4 cDNS próba-anyag segítségével. A vizsgálandó humán IL-4 kivonatokat a következőképpen készítjük: ultrahangos feltárás után a baktérium tenyészetet centrifugáljuk és az üledékről eltávolítjuk a felülúszót. Az üledéket 1%-os SDS-sel és 2 mmólos DTT-vel és 6 mólos guanidinnel kezeljük. Az anyagot újra centrifugáljuk, a felülúszót elöntjük és az üledéket 45 °C-on 3%-os SDS-sel és 2 mmólos DTT-vel kezeljük. Az anyagot újra centrifugáljuk és elvégezzük a felülúszó SDS-PAGE vizsgálatát.

A pIN-III-ompA2(2) szerkesztését úgy végezzük, hogy az natív humán IL-4-et fejezzen ki. A ρΙΝ-ΙΠompA2(l) szerkesztésében lévő három addíciós aminosavat eltávolítjuk a pIN-III-ompA szignál peptid szekvenciájának hely-specifikus mutagenezisével. A hely-specifikus mutegenezist Zoller és Smith (fent idézve) szerint végezzük. Röviden: az ompA szignál pepiidet kódoló szekvenciát tartalmazó pIN-III-ompA2 Xbal/BamHI fragmentumát (Ghrayeb és munkatársai fent idézett közleményében lévő 1. ábra) tisztítjuk, összekeverjük az M13mpl9 Xbal/BamHI-gyel emésztett és tisztított replikációs formával (RF = replicating forma), ligázzal összekapcsoljuk ezeket, majd E. coli K12 JM101 sejteket transzficiálunk, s a sejteket lemezre visszük. Egy tiszta plakkot szelektálunk IPTG (izopropil-tio-galaktozid) és X-gal (= BCIG = 5-bróm-4klór-4-indolil-P-D-galaktopiranozid) jelenlétében, a sejteket elszaporítjuk, és az egyszálú DNS-ek izolálását például Messing módszere szerint [Methods in Enzymology, 101. kötet, Academic Press, New York (1983)] végezzük el. Külön szintetizáljuk és foszforiláljuk az alábbi oligonukleotid prímért (23 mer). A printerben lévő tiszta bázis szubsztitúciókat bekereteztük:

Ez a szekvencia egy második HindlII helyet visz be a mutáns pIN-III-ompA2 szignál peptidjének kódoló szakaszába. Az oligonukleotid prímért hozzáfűzzük a pIN-III-ompA2 Xbal/BamHI fragmentumát tartalmazó M13ml9 RF-hez és DNS polimerázzal kezeljük nukleotid trifoszfátok megfelelő koncentrációinak jelenlétében. A keletkező RF-eket használjuk a JM101 E. coli sejtek transzficiálásához és a mutánst tartalmazó plak26

HU 208 710 B kokat jelzett oligonukleotid próba-anyaggal szűrjük. A szelektált RF szekvenciáját didezoxi szekvenálással, univerzális M13 primer használatával állapítjuk meg. A szelektált RF-et elszaporítjuk, izoláljuk és Xbal-gyel és BamHI-gyel emésztjük és a tisztított Xbal/BamHI fragmentumot egy Xbal/BamHI-gyel emésztett pIN-III-ompA2-be építjük be. A pIN-III-ompA2(2) képzéséhez a pIN-III-ompA2 mutánst szaporítjuk, tisztítjuk, HindlII-mal és BamHI-gyel emésztjük, összekeverjük a pcD-125 BamHI/EcoRV fragmentumával egy olyan standard ligációs oldatban, amely 0,1 μΜ/litert tartalmaz az alábbi linkerekből:

A GCT CAC AAG TGC GAT GTG TTC ACG CTA

Az Ab1899 E. coli törzset megfertőzzük a ρΙΝ-ΙΠompA2(2) plazmiddal és a transzformált sejteket telephibridizációval - ³²P-vel jelzett IL-4 cDNS próbaanyagot használva - különítjük el. Az IL-4 kivonatok, amelyeket fent leírtak szerint készítettünk, TCGF aktivitást mutattak, hasonlóan a pcD-125 COS 7 sejtek felülú szójához.

B) TRPC 11

A TRPC11 vektort (lásd 12. ábra) úgy szerkesztjük, hogy egy szintetikus konszenzus RBS fragmentumot (GTAAGGAGGTITAAC) Clal linkerekkel (ATGCAT) kapcsolunk össze ligáz alkalmazásával, majd a keletkezett fragmentumokat Clal-gyel hasított pMTl lhc vektorba (amelyet előzőleg úgy módosítottunk, hogy a Clal helyet tartalmazzon) klónozzuk be [lásd Zurawsky, S. M. et al., J. Immunology 137,3354-3360 (1986)]. ApMTllhc egy kisméretű (2,3 kb), magas másolatszámú Amp^R, Tét⁵ származéka a pBR322 vektornak, amely a 7tVX plazmid (Maniatis és munkatársai írják le a fent már idézett munkában) EcoRI-HindlII poli-linker szakaszát hordozza. Ezt módosítjuk úgy, hogy Clal helyet tartalmazzon, mégpedig olyan módon, hogy a pMTllhc-t EcoRI-gyel és BamHI-gyel hasítjuk, a keletkező ragadós végeket betöltjük és a Clal linkerrel (CATCGATG) kötjük össze (ligázzal), s ezáltal helyreállítjuk az EcoRI és BamHI helyeket, továbbá a Smal helyet Clal hellyel helyettesítjük. A TRPC11 szerkezetében van egy Clal helyekkel határolt tandem RBS szekvencia. A Clal helyek egyikét és az RBS szekvencia második másolatának egy részét eltávolítjuk. Úgy járunk el, hogy a plazmidot Pstl-gyel emésztjük, Bal31 nukleázzal kezeljük a gyártó előírásai szerint, EcoRI-gyel hasítjuk és T4 DNS polimerázzal kezeljük a négy dezoxiribonukleozid trifoszfát jelenlétében. A keletkező 30-40 bp fragmentumokat PAGE segítségével izoláljuk és beklónozzuk Smal-gyel hasított pUC12-be. A pKCIOl-ből származó, 248 bp hosszú E. coli trip-et hordozó fragmentumot [Nichole és munkatársai, Methods in Enzymology, 101. kötet, 155. old. (Academic Press N. Y. 1983)] beklónozzuk és EcoRI helyre, s így teljessé tesszük a TRPC 11 szerkezetét, melyet a 12. ábrán mutatunk be.

A TRPCll-et vektorként használjuk a humán IL-4 cDNS-nél, miután először Clal-gyel és BamHI-gyel emésztettük, tisztítottuk, majd a pcD-125 EcoRV/BamHI fragmentumával összehoztuk standard ligációs oldatban, mely az alábbi szintetikus linkerből 0,1 gmólt tartalmaz literenként.

TCG ATG CAC AAG TGC GAT AC GTG TTC ACG CTA

Az inszertumot tartalmazó vektort szelektáljuk lásd fent - és E. coli K12 JM101 törzsben szaporítjuk. Az IL-4-et a következőképpen extraháljuk. A JM101 sejtek tenyészetét ultrahanggal feltárjuk és centrifugáljuk. Az üledéket 4 M guanidint és 2 mM DTT-t tartalmazó oldatban reszuszpendáljuk, újra centrifugáljuk. A felülúszót biológiai aktivitásra vizsgáltuk és azt találtuk, hogy a pcD-125-tel transzficiált COS 7 sejtek felülúszóival összevethető TCGF aktivitást fejt ki.

VI. példa

A natív humán IL-4 és a Δ^1-4 és IS° (Gfy-Asn-PheVal-His-Gly) muteinek kifejezése Saccharomyces cerevisiaeben

A natív humán IL-4-et és ennek két mutánsát beklónozzuk a pMF-alfa8 plazmidba és élesztőben, a Saccharomyces cerevisiaeben fejezzük ki. A pMF-alfa8 szerkesztését és nem-élesztő proteinek kifejezésére való alkalmazását részletesen leírták Miyajima és munkatársai [Gene, 37, 144-161 (1985); EMBO J., 5, 11931197 (1986)]. A pMF-alfa8 letétbe van helyezve az ATTC intézményben (Rockville, MD., USA) 40140 letéti szám alatt. A plazmid térképe a 13A ábrán látható. Az ábrán lévő jelöléseket Miyajima és munkatársai fent idézett közleményéből (Gene) vettük át.

A) Humán IL-4 mutein Δ^{1 4}

A pcD-125 plazmidot izoláljuk és EcoRV-tel és BamHI-gyel emésztjük. A humán IL-4 cDNS-t tartalmazó EcoRV/BamHI fragmentumot izoláljuk, DNS polimeráz I-gyel (Klenow fragment) kezeljük, hogy betöltsük a BamHI hasítási helyet, majd kinázzal kezeljük (azaz foszforiláljuk).

A pMF-alfa8-at Stul-gyel emésztjük és a pcD-125 kinázzal kezelt EcoRV/BamHI fragmentumával kombináljuk - standard ligációs oldatban - s ezáltal a phIL-4-2 plazmid keletkezik. A phIL-4-2 plazmidot használjuk a S. cerevisiae 20B-12 (MATalfa trpl-289pept4-3) transzformálására. A törzset a Yeast Genetic Stock Center (University of Califomia, Berkeley, USA) bocsátotta rendelkezésünkre. Az élesztő sejteket 0,67% aminosavat nem tartalmazó Yeast Nitrogén Base tartalmú szintetikus táptalajban tenyésztjük, amely még 2% glükózt és 0,5% Casamino acid (Difco) készítményt tartalmaz. Az élesztő sejteket Ito és munkatársai [J. Bacteriol., 153, 163-168 (1983)] lítiumacetátos módszere szerint transzformáljuk plazmiddal, majd a transzformált sejteket triptofán mentes szintetikus táptalajon szelektáljuk. A transzformált sejtek tenyészetének felülúszóját TCGF aktivitásra vizsgáljuk. A 13B ábra (D görbe) a phIL-4-2-vel transzformált élesztő sejt-felülúszók különböző hígításainak TCGF aktivitását ábrázolja, összehasonlítva más faktorok ak27

HU 208 710 Β ti vitásával (A görbe: humán IL-2; B görbe: pcD-125tel transzficiált COS 7 sejtek felülúszói; C görbe: a phIL-4-l-gyel transzformált élesztő sejtek felülúszói). Az E görbe annak az élesztő sejt-tenyészet felülúszójának a TCGF aktivitását mutatja, amelyet az IL-4 cDNS inszertum nélküli pMF-alfa8 plazmiddal transzformálunk, azaz „ál”-transzformált sejtek felülúszóját.

B) Humán IL-4 mutein IS° (Gly-Asn-Phe-ValHis-Gly)

Az IS° (Gly-Asn-Phe-Val-His-Gly) mutein expreszsziójához szükséges pMF-alfa8 inszertumot pontosan úgy állítjuk elő, mint a Δ^1-4 inszertumét, azzal a különbséggel, hogy a pcD-125-ből származó Nael/BamHI fragmentumot használjuk. A keletkező plazmid a phIL-4-1 nevet kapta. A phIL-4-l-gyel transzformált élesztő sejtek felülúszóinak különböző hígításait vizsgáltuk TCGF aktivitásra. Az eredményeket a 13B ábra C görbéje ábrázolja. A felülúszót BCGF aktivitását is vizsgáltuk, anti-IgM- és SAC-aktiviált B Iimfocitákon. A vizsgálatot a fent leírtak szerint végeztük, az eredményeket a IV. táblázatban foglaljuk össze.

TV. táblázat phIL-4-l-gyel transzformált élesztő sejt felülúszók BCGF aktivitása

Felülúszó adagolás térf./térf.%-ban	3(H)-timidin beépülés (cpm)
SAC-aktivált B limfociták	Anti-IgM szemcsékkel aktivált B limfociták
0	3633 + 1239	641 ± 69
0,09	7610 ± 310	13221 ±472
0,19	9235 ±181	-
0,39	10639 ±786	16681 ±310
0,78	10 372 ±572	18090 ± 1248
1,56	9905 ±328	17631 ±1216
3,12	11 354 ±836	18766± 1179
6,25	10481 ±541	19810± 1349
12,5	9641 ± 30	18136± 1126
25	8253 ± 857	14750+1125

C) Natív humán IL-4 kifejezése élesztőben A natív humán IL-4-et kódoló cDNS-t beklónozzuk a pMF-alfa8 plazmidba úgy, hogy a bázisokat először beépítjük az N-terminális His kodontól felfelé, miáltal egy KpnI restrikciós helyet alakítunk ki. Ezután a KpnI-gyel hasítjuk, DNS polimeráz I-gyel kezeljük, majd a tompa végű IL-cDNS-t beépítjük a pMF-alfa8 Stul helyére. A KpnI helyet standard hely-specifikus mutagenezissel alakítjuk ki. Röviden: a pcD-125 plazmidot BamHI-gyel emésztjük, majd a teljes humán IL-4 cDNS-t tartalmazó fragmentumot izoláljuk és beépítjük az M13mp8 (Bethesda Research Labs, Bethesda, Maryland) BamHI helyére. Az inszertumot tartalmazó szimpla-szálú M13mp8-at izoláljuk és az alábbi szintetikus oligo-nukleotiddal hibridizáljuk, amely primerül szolgál:

5' - TCCACGGA GGTAC CACAAGTG - 3'

A beépített nukleotidokat bekereteztük. A mutáns IL-4 cDNS-t tartalmazó plazmidot egy oligonukleotid próba-anyaggal azonosítjuk, szaporítjuk, izoláljuk, majd KpnI-gyel és MabHI-gyel kezeljük. A Kpnl/BamHI fragmentumot izoláljuk, DNS polimeráz I-gyel (Klenow ffagment) kezeljük a tompa végek kialakítása érdekében, ezután kinázzal kezeljük és összekapcsoljuk a Stul-gyel emésztett pMF-alfa8-cal, ligáz alkalmazásával. Élesztőt transzformálunk a keletkezett phlL4-3 elnevezésű pMF-alfa8 plazmiddal - mint fent - és a felülúszókat TCGF aktivitásra vizsgáljuk. Ezek a felülúszók a phIL-4-l-gyel transzformált élesztő felülúszóknál megfigyelt TCGF aktivitásokhoz hasonló aktivitást fejtenek ki.

VII. példa

Szintetikus humán IL-4 szerkesztése és kifejezése

E. coliban

Egy olyan szintetikus IL-4 gént szerkesztünk, amely alapjában véve baktériumok számára előnyös kodonokat tartalmaz és egy sorozat kivételes restrikciós endonukleáz helyet (ezeket mint „kivételes restrikciós helyeket” említjük) foglal magába, és ez a humán IL-4 muteinek széles változatainak gyors és megfelelő kifejezését teszi lehetővé. A szintetikus gén nukleotid szekvenciáját a 6A ábra mutatja be. A példa szerinti szintetikus gén szerkesztésére és kifejezésére szolgáló módszerek a molekuláris biológiai standard eljárásai [például: Sproat és Gait, Nucleic Acids Rés., 13,2959— 2977 (1985); Ferretti és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 599-603 (1936); Mullenbach és munkatársai, J. Bioi. Chem., 261, 719-722 (1986); Wells és munkatársai, Gene, 34, 315-323 (1985); Esteli és munkatársai, Science, 233,659-663 (1986)]. Röviden kifejtve: a szintetikus humán IL-4 gént többségében kémiailag szintetizált dupla-szálú DNS fragmentumokból szereljük össze. A szintetikus gén bázis-szekvenciát úgy választjuk ki, hogy az összeállított szintetikus gén egy sor kivételes restrikciós helyet tartalmazzon.

A kivételes restrikciós helyek sorozata egy sor olyan szegmentumot határoz meg, amelyek könnyen kihasíthatók és más bázis szekvenciákat tartalmazó szegmentumokkal helyettesíthetők. A szintetikus fragmentumokat vagy közvetlenül, vagy más fragmentumokkal összekapcsolva, beépíthetjük egy alkalmas vektorba, ilyen egy pUC plazmid vagy hasonlók. A fent említett szegmentumok nagyjából megfelelnek a Wells és munkatársai (idézve fent) szerinti „kazettáknak”. A szintetikus fragmentumokat standard módszerekkel szintetizáljuk [például: Gait, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, (IRL Press, Oxford, UK, 1984)]. Előnyös, ha automata szintetizátort használunk, mint amilyen az Appleid Biosystems Inc., (Foster City, CA., USA) 380A modellje. A pUC plazmidok és az ehhez hasonló vektorok a kereskedelemben kaphatók (például a Pharmacia P-L. vagy Boehringer Mannheim cégektől). A klónozást és a kife28

HU 208 710 Β jezést standard bakteriális rendszerekben, például az E. coli K. 12 JM101, JM103 törzsekben, vagy ehhez hasonlókban elvégezhetjük, Viera és Messing szerint [Gene, 19, 259-268 (1982)].

A restrikciós endonukleáz emésztéseket és a ligáz reakciókat standard eljárások alkalmazásával végezzük [például: Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning: a Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982)].

Az alkáli módszert (Maniatis és munkatársai fent idézett munkája) kis mennyiségű plazmid előállítására használjuk. Nagyméretű előállítás esetén a módosított alkáli módszert használjuk, amikor is a nukleinsavaknak a derített lizátumból való kicsapására azonos mennyiségű izopropanolt használunk. Az RNS-t hideg

2,5 mólos ammónium-acetáttal távolítjuk el, majd céziumkloridos egyensúlyi sűrűséggrádiens centrifugálás következik etídium-bromidos kimutatással.

A szűrőlemez hibridizációkhoz kerek Whatman 540-es szűrőkre visszük fel a telepeket, s ezeket ezután lizáljuk és fixáljuk úgy, hogy a lemezeket egymás után kezeljük 0,5 mól/liter NaOH és 1,5 mól/liter NaCl, majd 1 mól/liter triszxHCl (pH = 8,0) és 1,5 mól/liter NaCl tartalmú oldattal (2-2 percig); ezután 30 percig 80 °C-on tartjuk a szűrőket. A hibridizálást 42 °C-on 6 órán át végezzük 6xSSPE, 20% formamid, 0,1% SDS, 100 pg/ml E. coli tRNS és 100 pg/ml Coomassie Brilliant Blue G-250 (Bio-Rad) tartalmú oldatban, ³²Pvel jelzett (kinázzal kezelt) szintetikus DNS-ek használatával (A 20XSSPE a következőképpen készül: 174 g NaCl-t, 27,6 g NaH₂PO₄xH₂O-t és 7,4 g EDTA-t feloldunk 800 ml vízben, pH-ját 7,4-re állítjuk be NaOHval, feltöltjük 1 literre és autoklávban sterilizáljuk).

A szűrőket kétszer mossuk (15 percig szobahőmérsékleten) 0,1% SDS tartalmú lxSSPE-ben. Autoradiográfiás vizsgálat (Fuji RX film) után a pozitív telepeket úgy lokalizáljuk, hogy a szűrőkön kékre színeződött telepekkel bejelöljük az újból kinőtt telepeket.

A DNS-eket vagy a Maxam- és Gilbert-féle [Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)] kémiai lebontásos módszerrel vagy a Sanger és munkatársai féle [Proc. Natl. Acad. Sci., 74,5463 (1977)] didezoxi módszerrel szekvenáljuk. A didezoxi reakcióhoz vagy az M13mp vektorokba klónozott lényeges szakaszok szimpla-szálú DNS-ei szolgálnak templátul [Messing és munkatársai, Nucleic Acids Rés., 9, 309 (1981)], vagy olyan dupla-szálú DNS-ek, amelyeket mini-alkáli módszerrel készítünk, majd 2,5 mólos NaOH-val denaturáljuk (5 perc; szobahőmérséklet) és 0,2 mól/liter NaOH és 1,43 mól/liter ammónium-acetát tartalmú oldatból 2 térfogat etanollal csapjuk ki. A didezoxi reakciókat 42 °C-on végezzük.

A DNS szintetizálás foszforamidit módszerrel történik az Applied Biosystems 380A típusú szintetizátorának alkalmazásával. A szintézis, a deprotekció, a hasítás és tisztítás (7 mólos karbamidos PAGE, kioldás DEAE-cellulóz kromatográfia) úgy történik, ahogyan a 380A szintetizátor kézikönyve leírja. A klónozandó szintetikus DNS-ek komplementer szálait (egyenként 400 ng) összekeverjük és 50 pl reakcióelegybe polinukleotid kinázzal foszforiláljuk. Ezt a DNS-t a megfelelő restrikciós enzimmel emésztett vektor DNS 1 pgjával kapcsoljuk össze (ligázzal). A ligáz reakció 50 pihen, szobahőmérsékleten, 4-12 órán át megy végbe. A foszforilálás, restrikciós emésztés, a polimeráz reakciók és a ligáz reakció megtalálható Maniatis és munkatársai fent idézett munkájában. A telepeket lacZ⁺-re keressük (ha kívánt) L-agar lemezeken. Az L-agar ki van egészítve ampicillinnel, 0,4 mM/liter IPTC-vel és 40 pg/ml X-gal-lal.

A TAC-RBS vektort lépések sorozatán át állítjuk elő, azzal kezdve, hogy a tacP-t hordozó pDR540 plazmid (Pharmacia) egyetlen BamHI helyét DNS polimerázzal betöltjük. A terméket ezután nem foszforilált szintetikus oligonukleotidokkal (Pharmacia) kapcsoljuk össze - ligázzal - úgy, hogy egy dupla-szálú konszenzus riboszóma kötő helyet kódoló fragmentumot (RBS, GTAAGGAGGTTTAAC) alakítunk ki. A ligáz reakció után a keveréket foszforiláljuk és az ATGAGCTCAT SstI linkerrel kötjük össze, újfent ligázzal. A keletkező komplexet Sstl-gyel és EcoRI-gyei hasítjuk és a 173 bp fragmentumot PAGE segítségével izoláljuk, melyet az EcoRI/Sstl-gyel hasított pUC18-ba (Pharmacia) klónozunk (leírását lásd alább). A végső szerkezet (neve: TAC-RBS) RBS-ATG-polilinker szakaszainak a szekvenciáját a 8. ábrán mutatjuk be.

A szintetikus humán IL-4 gént a pUC18 plazmidban szereljük össze, hat lépésben. Minden lépésnél a deléció-mentes inszertumokat és/vagy inszertumokat klónozással mutathatjuk ki úgy, hogy megtartjuk a pUC18 lacZ(alfa) génjét az első lépésben beépített ATG start kodon irányítása alatt. A deléció és/vagy inszerció változásokat tartalmazó kiónokat ki lehet szűrni, ha X-gal és IPTG tartalmú L-ampicillin lemezekről kiemeljük a kék telepeket. Vagy másként; az inszertumok szekvenciáját könnyen meghatározhatjuk minden lépésnél, amennyiben egy univerzális szekvenáló prímért használunk a kis méretekben előállított plazmid DNS készítménynél (például a Boehringer Mannheim cégtől beszerezhető).

Az 1. lépésben a TAC-RBS vektort Sstl-gyel mésztjük, T4 DNS polimerázzal kezeljük (ennek 3’ exonukleáz aktivitása leemészti az SstI hasítási helynél a 3’ túllógó szálakat, s így tompa végű fragmentumokat kapunk), majd a T4 DNS polimeráz inaktiválása után EcoRI-gyel kezeljük, s így egy 173 bp hosszú olyan fragmentumot kapunk, mely tartalmazza a TAC-RBS régiót, az ATG start kodonnál tompa vége van és a másik végén az EcoRI hasítási hely található. Végül izoláljuk a 173 bp TAC-RBS fragmentumot.

A 2. lépésben az 1. lépésben izolált TAC-RBS fragmentumot összekeverjük az EcoRI/Sstl-gyel emésztett pUC18 plazmiddal és az 1A/B szintetikus fragmentummal, amely, mint a 7A ábrán látható, fenti végén tompa végű és lenti végén - az SstI hasításnak megfelelően - ragadós végű. A fragmentumokat összekapcsoljuk és így a 2. lépés szerinti pUC18 keletkezik.

A 3. lépésben a 2A/B és a 3A/B szintetikus fragtumokat (a 7B és 7C ábrán láthatók) elkeverjük a 2. lépés szerinti SstFBamHI-gyel emésztett pUC18-cal (szapo29

HU 208 710 Β rítás és tisztítás után) és ligáz segítségével összekapcsoljuk őket. így jutunk a 3. lépés szerinti pUC18-hoz. Megjegyzendő, hogy a 2A/B fragmentum lefelé eső végén olyan extra bázisok vannak, amelyek a BamHI ragadós vég kialakításában vesznek részt. Ezeket az 5 extra bázisokat a 4. lépésben lehasítjuk. A 2A/B és 3A/B fragmentumoknak komplementer 9 csoportból álló egy-szálú vége van, ezek segédanyag hatására egymáshoz kötődnek, de megmarad a pUCl8-hoz való kapcsoláshoz (ligázzal) és 2A/B fenti SstI helye és a 10 3A/B lenti BamHI helye.

A 4. lépésben a 3. lépés szerinti pUC18-at (szaporítás és tisztítás után) MluI/Xbal-gyel emésztjük, újra tisztítjuk, összekeverjük a 4A/B szintetikus fragmentummal (7D ábra) és összekapcsoljuk őket (ligázzal). 15 így kapjuk a 4. lépés szerinti pUC18-at.

Az 5. lépésben az Xbal/Sall-gyel emésztett 4. lépés szerinti pUC18-at (szaporítás és tisztítás után) az 5A/B szintetikus fragmentummal (7E ábra) hozzuk össze és hozzákapcsoljuk (ligázzal). így kapjuk az 5. lépés sze- 20 rinti pUC18-at.

A 6. lépésben a 4. lépés szerinti pUC18-at (szaporítás és tisztítás után) Sall/HindlII-mal emésztjük és hozzákötjük (ligázzal) a hozzákevert 6A/B fragmentumot (7F ábra). így jutunk a végső szerkezethez. 25

A 6B ábrán az előbbiekben leírt pUC18 szerkezetbe lévő különleges restrikciós helyek hasítási térképét mutatjuk be. Amennyiben a szóban forgó szintetikus humán IL-4 gént a pUC18 inszertumaként óhajtjuk haszGA GCT GCT ACC GTT ATC

ACG TCT CGA CGA TGG CAA TAG CAC CAC CAA AAA GAC A GTG GTG CTT TTT CTG TGC GC

Tenyésztés után a proteint standard módszerekkel kivonjuk a JM101 sejtekből és a kivonatok hígításait biológiai aktivitásra vizsgáljuk.

IX. példa

A humán IL-4 (Ile⁵², Asp^{] 1}') mutein szerkesztése és kifejezése

A VIII. példa szerinti pUC18 módosított plazmidot (amely az Ile⁵² kódoló szekvenciáját tartalmazza) Sallgyel és Xhol-gyel emésztjük és a nagy fragmentumot izoláljuk. Az izolált fragmentumot elkeverjük az alant bemutatott szintetikus dupla-szálú fragmentummal standard ligációs oldatban. A szekvencia megváltoztatott részét bekereteztük. A keletkezett plazmiddal E. coli K12 JM101 törzset vagy hasonlót fertőzünk és kifejezzük.

Sall/Xhol csere-fragmentum:

TCG ACT CTG GAA

GA GAC CTT

GAC TTC C

CTG AAG GAG CT

Tenyésztés után a proteint standard módszerekkel kivonjuk a JM101 sejtekből és a kivonatok hígításainak biológiai aktivitását vizsgáljuk. 60 nálni, úgy minden kivételes restrikciós hely párral olyan szegmentum van meghatározva, melyet könnyen kihasíthatunk és más szintetikus szegmentumokkal helyettesíthetünk. A kivételes restrikciós hely készlet a következőket foglalja magába: EcoRI, Hpal, SacI (SstI), EcoRV, PstI, Miül, Bell, Xbal, Nael, Sáli, Xhol és HindlII.

A szintetikus IL-4 gént tartalmazó pUC18-at az E. coli K12 JM101 törzsbe visszük be. Tenyésztés után a proteint kivonjuk a JM101 sejtekből és a kivonatok hígításait biológiai aktivitásra vizsgáljuk.

VIII. példa

A humán IL-4 mutein Ile⁵² szerkesztése és kifejezése E. coliban

Az 52-es pozícióban (a natív humán IL-4 N-terminális végéhez viszonyítva) lévő Leu-t Ile aminosavra cseréljük, s így képezzük a humán IL-4 Ile⁵² muteint. A VII. példa szerinti pUC18 plazmidot, amely a 6A ábrán bemutatott szintetikus humán IL-4 gént tartalmazza, Pstl-gyel és Mlul-gyel emésztjük, majd tisztítjuk. A fenti, tisztított pUCl8-at összekeverjük az alant bemutatott szintetikus dupla-szálú fragmentummal és összekapcsoljuk őket (ligázzal). A bázis szekvencia változtatott része be van keretezve. A keletkezett pUC18-cal, E. coli K12 JM 101 törzset vagy hasonlót transzficiálunk és ott kifejezzük.

Pstl/Mlul csere-fragmentum a humán IL-4 Ile⁵² mutein képzéséhez:

CFT CAG TTC TAC TCT

GCA GTC AAG ATG AGA

X. példa

Transzfekciós felülúszókból tisztított humán 11-4 szekvenciája

Humán 11-4 cDNS-t tartalmazó vektorokkal tranziensen transzficiált sejt-tenyészetek felülúszóiból humán IL-4-et tisztítunk. A szekretált natív humán IL-4 szekvenciáját a tisztított anyagból határozzuk meg.

A) A tisztítás biológiai ellenőrzése

Az elválasztási eljárások folyamán a TGGF aktivitást használjuk fel a humán IL-4 meghatározásokhoz. E vizsgálat lényegében ugyanúgy történik, mint amit a II. példában leírtunk. Röviden: egészséges donortól vért veszünk heparinos csőbe, majd Ficoll-Hypaque-ra rétegezzük; például 5 ml vérhez 3 ml Ficoll-Hypaque kerül 15 ml-es centrifuga csőbe. Centrifugálás következik 3000 g mellett 20 percig, majd a határfelületen lévő sejteket leszívatjuk és olyan tápoldattal hígítjuk, amely 10% FCS-t, 50 μΜ 2-ME-t, 20 μg/ml PHA-t és rekombináns humán IL-2-t tartalmazó RPMI 1640-ből áll. A sejteket 5-10 napig 37 °C-on inkubáljuk, majd ezután a perifériás vér limfocitákkal (PBL) mossuk és a Mosmann-féle [J. Immunoi. Methods, 65, 55-63 (1983)] 2 napos kolorimetriás módszerben használjuk fel. Az IL-4 standardból (vagy a pcD-125-tel vagy a pEBT30

HU 208 710 Β

178-cal transzficiált COS 7 sejtek felülúszói) vagy a vizsgálandó frakcióból kétszeres hígítási sorokat készítünk 96 tartályos lemezeken a fent leírt táptalajjal úgy, hogy a végső térfogat tartályonként 50 μΐ legyen. Minden tartályhoz hozzáadunk 50 μΐ-ben 4-8xl0⁶ sejt/ml sűrűségű PHA-val stimulált PBL sejtet, majd a lemezt 37 “C-on inkubáljuk 2 napig. A sejt növekedést akkor Mosmann szerint (az idézetet lásd fent) vizsgáljuk.

A humán IL-4 TCGF aktivitásának egységét vagy a pcD-125-tel transzficiált COS 7 sejtekre (II. példa) vagy a pEBV-178-cal transzficiált COS 7 sejtekre (III. példa) vonatkoztatva határozzuk meg.

Ami a tisztítást illeti, az egységek a pcD-125 transzfekciós felülúszókra vannak alapozva, s ezeket a következőképpen állítjuk elő: 10% FCS-sel és 4 mM L-glutaminnal kiegészített Dulbecco-féle módosított Eagle-táptalajt (DME) tartalmazó szövet-tenyésztő lemezeket beoltunk körülbelül lxlO⁶ COS 7 sejttel. A beoltás után 24 óra múlva a táptalajt leszívjuk a lemezekről és a sejteket kétszer mossuk pufferolt (50 mM trisz) DME-vel. Minden lemezhez 4 ml szérium-mentes pufferolt DME-t (4 mM glutaminnal), 80 μΐ DEAEdextránt és 5 pg pdC-125 DNS-t adunk. A sejteket ebben az elegyben inkubáljuk 4 órán át 30 °C-on, ezután az oldatot leszívatjuk és a sejteket egyszer mossuk szérum-mentes pufferolt DME-vel. Mosás után 4 mM L-glutamint, 100 pM klorokint és 2% FCS-t tartalmazó 5 ml DME-t adunk minden lemezhez, a sejteket 3 órán át inkubáljuk, majd kétszer mossuk szérum-mentes pufferolt DME-vel. Ezután 4 mM L-glutamin és 4% FCS tartalmú 5 ml DME-t adunk a sejtekhez és 37 °Con 24 órán át inkubáljuk a lemezeket. Ezután a sejteket 1-3-szor mossuk DME-vel vagy PBS-sel, majd 5 ml szérum-mentes DME-t (4 mM L-glutaminnal) adunk a sejtekhez, 37 °C-on inkubálunk és 5 nap múlva leszüreteljük a sejteket.

Egy egység - ahogyan itt használjuk - az a faktor mennyiség, amely egy tartályban (0,1 ml) 2xl0⁴ PHAstimulált PBL sejtek maximális proliferációját 50%ban stimulálja 48 óra időtartamon keresztül.

B) Tisztítás

A tisztítást a következő eljárások egymás után történő alkalmazásával végezzük: kation-cserélő kromatográfia, gélszűrés, és reverz fázisú HPLC. Minden műveletet 4 °C-on végzünk.

Miután a COS 7 sejteket centrifugálással eltávolítottuk, a felülúszót tizedére koncentráljuk ultraszűréssel, majd -80 °C-on tároljuk feldolgozásig. Az IL-4 titerek meghatározása úgy történik, hogy megvizsgáljuk, mennyire képes a protein a PHA-val indukált PBL sejtek proliferációját stimulálni, azaz a TCGF aktivitást a fent leírt standard módszerrel határozzuk meg.

A bekoncentrált COS 7 felülúszót, melynek TCGF aktivitása mintegy 10⁴-10⁶ egység/ml és protein tartalma körülbelül 10-20 mg/ml, 50 mmólos nátrium-HEPES pufferrel (pH = 7,0) szemben dializáljuk 24 órán át, kétszer cserélve a puffért (minden cserénél a koncentrátum térfogatának mintegy 10-15-szörösét veszszük). A dializátumot S-Sepharose oszlopra [1x25 cm; előzőleg 50 mmólos nátrium-HEPES pufferrel (pH =

7,0) kiegyensúlyozva] visszük fel. Az oszlopot 15-szörös oszloptérfogatnak megfelelő kiegyensúlyozó pufferral mossuk, majd 20-szoros oszloptérfogatnak megfelelően, lineáris nátrium-klorid gradiens elúciót végzünk [az NaCl grádiens 0-0,5 mólosig terjed 50 mM nátrium-HEPES pufferben (pH = 7,0)]. A grádiens után ötszörös oszloptérfogatnak megfelelő változatlan koncentrációjú oldattal eluálunk. Egy sarzson belül 1,5 ml-es, illetve 1,8 ml-es frakciókat szedünk. Két kromatografálásnál úgy találtuk, hogy az IL-4 titerek a 300 és 500 mmól NaCl koncentráció közt eluálódnak.

Mindegyik S-Sepharose oszlopról hat IL-4 titerű frakciót külön egyesítettünk, s így 9,0 és 10,8 ml összmennyiségű oldatot kaptunk. Mindkét oldatot ultraszűréssel (Amicon YM5 membrán, mely 5000 móltömegnél vág le) koncentráltuk. Ennél a lépésnél a proteinek 80%-át kapjuk vissza. A koncentrált IL-4 oldatot Sephadex G100 oszlopra (1,1x58 cm) visszük. Az oszlopot előzőleg 0,4 M NaCl tartalmú 50 mmólos HEPES pufferrel (pH = 7,0) egyensúlyoztuk ki. Az oszlop kioldása azonos pufferrel történik, 0,15 ml/perc mellett. Összesen 50x1,0 ml-es frakciót szedünk, s ezek IL-4 titerét meghatároztuk. A biológiai aktivitás csúcsát a 22 000 daltonos molekulatömegnél észleljük. A Sephadex GlOO-at marha szérum albuminnal (65000 dalton), szénsav anhidrázzal (30000 dalton) és citokróm C-vel (11700 dalton) kalibráltuk be a molekulatömeg meghatározásához.

Egy IL-4 aktivitású Sephadex G100 oszlop-frakciót 3-4-szeresére koncentráltuk vákuumban és beinjektáltuk egy Vydac C-4 guard oszlopra (4,6x20 mm). Lineáris grádienst hoztunk létre 0,1 %-os (térf./térf.) trifluor-ecetsavban (TFA) 0-72% (térf./térf.) acetohitrillel 15 perc alatt, 35 °C-os oszlop hőmérsékletnél,

I, 0 ml/perc átfolyási sebesség mellett. Három csúcsot kaptunk 214 nm-en való méréssel, 7, 8,2 és 8,7 perces retenciós időkkel (a 10. ábra látható 1-es, 2-es és 3-as csúcs). A 2-es csúcs (8,2 perces elúciós idő) 40 pl-es alikvot részét liofilizáltuk és 10% FCS tartalmú MÉM tápoldatban (GIBCO) oldottuk vissza. Az oldat pozitív TCGF választ adott. A 2-es csúcs egy 300 pl-es alikvot részét szárazra pároltuk és 20 pl 0,1 %-os (tömeg/térf.) SDS-ben oldottuk fel. Egy 2 pl-es alikvot részt 20 pl 1%-os (térf./térf.) TFA-val hígítottunk és újra kromatografáltuk. Ennek a mintának a HPLC analízise egyetlen csúcsot mutatott 215 nm-nél. A 2-es csúcs anyagának az aktivitása mintegy 7x 10⁸ egység/mg.

C) Aminosav szekvencia analízise

Az aminosav szekvencia meghatározását automata gáz-fázisú Edman-féle degradációs módszerrel [R. M. Hewick, M. W. Hunkapillar, L. E. Hood és W, J. Dryer,

J. Bioi. Chem., 256, 7990 (1981)] végeztük Applied Biosystems féle szekvenátor alkalmazásával. A HPLC 2-es csúcs frakció 90 pl-es alikvot részét 0,1 %-os SDS-ben oldjuk, mint fent, s ezt üvegszálas szűrő-patronra (glass fiber filter cartridge) visszük Polybrene (Sigma) jelenlétében. Az aminosav szekvenciáról a 35. csoportig kaptunk információt. Az N-terminális szekvencia a következő:

HU 208 710 Β

His -	Lys -	Asp -	Ile - Thr	- Leu -	Gin	- Glu -
Ile -	Ile - Lys	- Thr -	Leu - Asn	- Ser -	Leu	- Thr -
Glu -	Gin - Lys	- Thr -	Leu - _	Thr -	Glu	- Leu -

- Val - Thr - Asp - Ile - Phe - Alá - Alá

Az üres helyeken lévő aminosavak nincsenek meghatározva.

Az amino-terminális 3. és 23. pozíció üres helyei értelemszerűen cisztein jelenlétét mutatják, amelyet ebben a rendszerben nem lehet meghatározni. A 28. pozícióban lévő üres hely, amely a cDNS-ből következtetett szekvencia szerint treoninnak felel meg, vagy a fenil-tio-hidantoin-treonin észlelés változékony voltának tudható be, vagy pedig az oxigénen keresztüli glükozil- vagy észter-kötésnek tulajdonítható.

A HPLC frakció 100 μΐ-nyi alikvot részét, amely- 20 bői az amino-terminális szekvencia meghatározása történhet, szárazra pároltuk és 70%-os hangyasavban feloldottuk. Brómciánt adtunk az oldathoz 50-szeres moláris feleslegben és 2,5 órát hagytuk állni szobahőmérsékleten. A hasított proteint az Applied Biosystems 25 gáz-fázisos szekvenátorával szekvenáltuk, mint fent.

Két szekvencia volt meghatározható:

(1) Arg - Glu - Lys - Tyr - Ser - Lys (2) His - Lys ---- Asp - Ile - Thr 30

Az (1) szekvencia azonos azzal a szekvenciával, amely a cDNS-ből következtethetően akkor válik szabaddá, amikor a 120-as pozícióban lévő metionin csoportot brómciánnal hasítjuk. A C-terminális utolsó két csoportja jelen lehetett, de nem lehetett kimutatni, mivel nem volt elég minta. A (2) szekvencia a natív IL-4 proteinre kapott amino-terminális szekvenciával azonos. A szabaddá vált amino-terminális és karboxiterminális fenil-tio-hidantoin-aminosavak relatív mennyiségeiből arra lehet következtetni, hogy a mintában a két szekvencia ekvimoláris mennyiségben volt jelen. Ez az eredmény azt a következtetést támasztja alá, hogy a szekvenált protein minta egyetlen olyan polipeptid láncot tartalmazott túlsúlyban, mely a humán IL-4 cDNS szekvenciája alapján előre megjósolható amino- és karboxi-terminális véggel rendelkezik.

XI. példa

A humán IL-4 mutein [Ile^S2, Δ⁷¹, ÁS⁹⁴ (Alá)] szerkesztése és kifejezése

A VHI. példa szerinti módosított pUC18 plazmidot (az Ile⁵²-t kódoló szekvenciát tartalmazza) Mlul-gyel és BclI-gyel emésztjük, majd a nagy fragmentumot izoláljuk. Az izolált fragmentumot az alább bemutatott szintetikus dupla-szálú fragmentummal keverjük standard ligációs oldatban.

Mlul/Bcll csere-fragmentum:

CG CGT TGT CTC GGC GCC ACT GCG CAG TTC CAC

A ACA GAG CCG CGG TGA CGC GTC AAG GTG

T deléció

CGT CAC AAA GAG CT

GCA GTG TTT GTC GAC TAG

A kapott plazmidot E. coli K12 JM101 vagy hasonló sejtekbe visszük be és a sejteket szaporítjuk.

A módosított plazmidot izoláljuk, Xbal-gyel és Nael-gyel emésztjük, majd a nagy fragmentumot izoláljuk. Az izolált fragmentumot az alább bemutatott í szintetikus dupla-szálú fragmentummal keverjük standard oldatban. A hozzáadott kodont bekereteztük. A kapott plazmidot E. coli K12 JM101 sejtekbe, vagy hasonlókba visszük be és ott kifejezzük.

Xbal/Nael csere-fragmentum: ί

CTA GAC CGT AAC CTG TGG GGC CTG GCC GCC

TG GCA TTG GAC ACC CCG GAC CGG CGG

Tenyésztés után a proteint - standard módszerek alkalmazásával - a JM101 sejtekből kivonjuk és a kivonatok hígításait biológiai aktivitásra vizsgáljuk.

XII. példa

DR antigének indukciója csupasz limfocita szindrómás betegekből származó sejteken A csupasz limfocita szindrómát az jellemzi, hogy nem nyilvánulnak meg a sejt felületén az I és/vagy II osztályhoz tartozó HLA antigének és, hogy ez a tünetcsoport gyakran együttjár súlyos immunhiányos állapottal [például: Touraine, Láncét, 1981. február 7-i száma, 319-321 old.; Touraine és Bethel, Humán Immunology, 2, 147-153 (1981); Sullivan és munkatársai, J. Clin. Invest., 76, 75-79 (1985)]. Megfigyeltük,

HU 208 710 Β hogy a humán IL-4 a csupasz limfocita szindrómás betegekből származó sejtek felületén a II osztály DR antigénjének megjelenését képes indukálni.

Perifériás vér limfocitákat (PBL) vettünk le egy olyan betegtől, akinél nem nyilvánultak meg a Π osztály HLA antigénjei. A B sejteket PBL-ből különítettük el - lényegében úgy, ahogy fent már leírtuk - és egy B sejtvonalat hoztunk létre Epstein-Barr vírussal (EBV) való transzformáció révén. Az EBV-vei transzformált sejteket 48 órán át Yssel-féle tápoldatban (lásd fent) tenyésztjük, amely FCS-ből 2%-os és pcD-125-tel transzficiált COS 7 sejtek felülúszójából 5%-ot (térf./térf.) tartalmaz. A sejteket leszüreteljük, fixáljuk, megfestjük fluoreszceinnel jelölt anti-DR monoklonális antitesttel (Becton Dickinson, L243), majd áramlásos citométerrel analizáljuk. A 9. ábrán a sejt frekvencia és a fluoreszcencia intenzitás összefüggésének hisztogramjai láthatók: az A görbe az IL-4 kezelés előtt leszüretelt EBV-vel transzformált sejtek kontroll populációjára vonatkozik, a B görbe az IL-4 kezelés utáni EBV-vel transzformált sejt-populációra vonatkozik.

XIII. példa

A Cl.Lyl*2~!9 (Cl.1) sejt-felülúszók MCGF aktivitása

A tisztított IL-3 és egy IL-3 cDNS kiónnal transzficiált COS 7 sejt felülúszó (rekombináns IL-3; IL3^R) az M/9 hízó sejtvonal proliferációját egyenlő mértékben stimulálja (14A ábra). Azonban ez a szint csak harmada-fele annak, amit a Cl.l T sejt-felülúszóval való indukció eredményez. A ConA jelenléte a T sejt felülúszóban (2 gg/ml) nem járul hozzá jelentősen az MCGF aktivitáshoz. A fent leírt hatás egyik magyarázata az, hogy az IL-3-hoz nem rendelhető mindaz az MCGF aktivitás, amit a Cl.l sejtek fejtenek ki. Egy másik magyarázat, hogy a vizsgálatokban használt hízó sejtvonal (elméletileg) egy más faktor-dependens sejt populációval lehet szennyezve. Ez utóbbi lehetőség azonban kizárt, mivel az MC/9 sejtvonal újbóli klónozása olyan szubklónokat eredményezett, melyek mindegyike IL-3-ra és a sejt felülúszóra azonos módon válaszolt, mint az eredeti MC/9 klón.

Minthogy a Cl.l felülúszó az IL-3 mellett más limfokineket is tartalmaz, ezeket is vizsgáltuk, hogy képesek-e az MC/9 sejtek növekedését elősegíteni. Azonban az MC/9 sejtek nem válaszoltak a rekombináns IL-2, IFN és GM-CSF, sem az IL-1 tartalmú felülúszó (P388D-1 sejtek) különböző koncentrációinak hatására (14. ábra). Ezenkívül, ha a tenyészeteket, amelyek különböző koncentrációkban tartalmaztak rekombináns IL-3-at, IL-2-vel, GM-CSF-fel, IFN-gamma-val vagy IL-1-gyei egészítettük ki, akkor sem stimulálódott az MC/9 sejtek proliferációja jobban, mint az IL-3-mal egyedül. Ez azt jelenti, hogy a T sejt felülúszó megnövekedett TCGF aktivitása nem ezen ismert faktoroknak köszönhető.

Összehasonlító vizsgálatok más faktor-depedens sejtvonalakkal

Két másik hízó sejtvonal, a DX-2 és MM3, szintén erősebb proliferációs választ adott a Cl.l felülúszóra, mint az IL-3-ra (a DX-2-vel kapott adatok a 14B ábrán láthatók). Ezek a sejtek sem válaszoltak az IL-2, IFN-γ, GM-CSF vagy a P388D-1 sejt-felülúszó hatására. Tehát az MC/9 sejtek fokozott proliferációs válasza a T sejt felülúszó hatására, általában jellemző lehet a hízó' sejtekre. Ezzel szemben, a granulocita típus sejteket (NFS-60) majdnem egyformán stimulálja az IL-3 és Cl.l felülúszó (14C ábra). Bár az NFS-60 sejtek nem válaszoltak IL-2-re, IFN-y-ra és P388D-1 felülúszóra, egy csekély, de reprodukálható stimuláció jelentkezett GM-CSF-re. Abból a tényből, hogy az IL-3 és a T sejt felülúszó hasonló szintű proliferációt indukál, arra lehet következtetni, hogy az NFS-60 sejtvonal viszonylag érzéketlen a T sejt felülúszóban jelen lévő egyéb faktorokkal szemben. Ennélfogva az NFS-60 sejteket használtuk az IL-3 vizsgálatára annak a kísérletnek a folyamán, amikor megkíséreltük az IL-3-at az egyéb MCGF aktivitástól protein frakcionálási módszerekkel elkülöníteni.

A Cl.l felülúszó TCGF aktivitásának megállapítására az IL-3 depedens HT2 T sejtvonalat használtuk. A Cl.l felülúszó telítési koncentráció a rekombináns IL2-vel elért maximális szinteknél jóval alacsonyabban stimulálják a ³(H)-timidin beépülését (14D ábra). Hasonló eredményeket kaptunk két másik sejtvonallal is. A felülúszó nem tartalmaz gátló anyagot, mivel ha hozzáadjuk az IL-2 tartalmú HT2 tenyészetekhez, nem csökkenti a ³(H)-timidin beépülését (14D ábra). Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a Cl.l felülúszó az IL-2-től eltérő TCGF aktivitást tartalmaz. E következtetést az alábbiakkal támasztjuk alá.

A Cl.l felülúszó előzetes kromatográfia frakcionálása

A Cl.l felülúszót különböző kromatográfiás módszerekkel frakcionáljuk azzal a céllal, hogy az EL-3-at az egyéb MCGF aktivitásoktól elválasszuk. A NFS-60 sejtek proliferációját használjuk az IL-3 specifikus nyomon követésére az MC/9 proliferációjánál kimutatható ossz MCGF aktivitás hátterével szemben. A TCGF aktivitást a HT2 sejt-proliferációjával állapítjuk meg.

Amikor Cl.l felülúszót kationcserélő kromatográfiával frakcionáljuk semleges pH-η, az átengedett folyadék (flow through) a felvitt proteinnek mintegy 98%-át tartalmazza, az IL-3 egységek 97%-át (meghatározva az NFS-60 proliferációval) és a TCGF egységek 1%-át (15. ábra). A megkötött proteinnek nátrium-klorid grádienssel való elúciójakor a TCGF aktivitás 0,19 mólos NaCl-nál (60. frakció) oldódik le. Egy kicsi, de reprodukálható TCGF aktivitás-csúcs 1 mólos NaCl-nál is megjelemik. További jelentős TCGF aktivitás nem oldható ki magasabb NaCl koncentrációknál (3 mólosig) sem. Egy kis mennyiségű IL-3 szintén kioldódik közel ugyanabban a szakaszban, ahol a TCGF csúcs van (észlelhető NFS-60 válasz). Csak a TCGF aktivitás-csúcsnak (59-61. frakció) és az átengedett folyadéknak (1-20. frakció) megfelelő frakciók stimulálják magas szinten az MC/9 sejtek proliferációját, a nem frakcionált felülúszóhoz hasonlóan (15. ábra, nyilak). Minthogy a

HU 208 710 Β titrálási görbék által jelzett 59-61. frakciókban magasabb szintű volt az MCGF aktivitás, mint az átengedett folyadékban, megkíséreltük a TCGF csúccsal együtt eluálódó IL-3 aktivitás további kimerítését és újra megállapítani az MC/9 proliferációs szinteket. Ezért az 59-61. frakciókat még kétszer kromatografáltuk azonos körülmények között.

A harmadik oszlop-menetnél a TCGF aktivitás több mint 95%-a következetesen kioldódott 0,19 mólos NaCl-nál. Nem volt mérhető IL-3 (NFS-60 válasz) az átengedett folyadékban vagy bármelyik másik oszlop-frakcióban. Azonban a TCGF csúccsal még mindig együtt eluálódott egy MCGF aktivitás, amely most az MC/9 sejtek proliferációját egy plató szintig stimulálta, ami azonban jelentősen alacsonyabb, mint amit a Cl.l felülúszóval vagy az IL-3mal kapunk (lásd alább). Minthogy ezekben a frakciókban nincs mérhető IL-3 aktivitás (nincs NFS-60 válasz), kétségtelen, hogy az új MCGF önmagában nem volt képes az MC/9 sejteket a nyers T sejt felülúszóval azonos mértékben stimulálni.

Az MCGF-nek a TCGF-től való elválasztására úgy végeztük a következő kísérletet, hogy a háromszor frakcionált anyagot (59-61. frakció) tízszeresére hígítottuk 0,1 %-os vizes TFA-val, pH - 2-ig és közvetlenül rávittük egy C8 reverz-fázisú oszlopra (Applied Biosystems). A 16A ábra a megkötött protein elúciós képét mutatja. A kioldás acetonitril-grádienssel történik, 0,1 %-os TFA-ban. Az átengedett folyadékban (flow through) nem jelent meg sem MCGF sem TCGF aktivitás. Mindkét aktivitás együtt oldódott le 37% acetonitrilnél (26-29. frakció). Most azonban a telítési MCGF válasz csak mintegy a fele volt annak, mint amit az IL-3 hoz létre egyedül alkalmazva (17A ábra). Amikor minden frakciót újra vizsgáltunk az IL-3 telítési szintjére, csak a 26-29. frakciók mutattak MC/9 proliferációs választ IL-3 feleslegével (egyedül alkalmazva, nyíl, 16A ábra). Valójában a válasz mértéke hasonló volt, mint a nem frakcionált felülúszóra adott válaszé (17A ábra). Ezenkívül a nem frakcionált felülúszóval azonos proliferációs szinteket figyeltünk meg a 26-29. frakciókkal, melyeket az IL-3 tartalmú átengedett folyadék vagy WEHI-3-ból tisztított EL-3 jelenlétében vizsgáltunk. Tehát az IL-3 és az egyedi MCGF/TCGF kombinációja olyan MC/9 proliferációs szinteket stimulál, ami az eredeti T sejt felülúszó jellemzője.

Bár a reverz fázisú kromatográfiával nem sikerült az MCGF-et a TCGF-től elválasztani, kimutattuk, hogy a TCGF megkülönböztethető az IL-2-tőI két jellegzetessége folytán. Az első: ha COS 7 felülúszóban lévő rekombináns IL-2-t (IL-2^R) és egy Il-2-termelő (ConAval stimulált) egér T sejtvonal (GF 15-1) felülúszóját ugyanazon az oszlopon kromatografáljuk azonos körülmények között, a TCGF aktivitás 45% acetonitrilnél eluálódik éles csúcs formájában, amely nem fedi a 37% acetonitriles pozíciót jelző Cl.l TCGF-et (16B ábra, inzert). Ezenkívül nem tudtunk nyilvánvaló szinergizmust megfigyelni a részlegesen tisztított TCGF és IL-2 között (17B ábra).

A Cl.l felülúszó kromatofokuszálásáról ad képet a 18. ábra. Az IL-3 aktivitás (NFS-60 válasz) igen heterogén profilt mutat, 7,1-nél magasabb pl értékeket is tartalmaz, azonban a TCGF aktivitás homogénebb, s a fő TCGF hordozó 12-es frakció pl értéke körülbelül 6,2. Ez a frakció - IL-3-ból a telítési szintek hozzáadása után - a maximális MCGF aktivitással esik egybe.

A Cl.l felülúszó és a részlegesen tisztított faktor

SDS-PAGE analízise

A 19. ábrán összehasonlítjuk a nem frakcionált Cl.l felülúszó (19A ábra) és a felülúszó kationcserélt anyagának (59-61. frakció; 19B ábra) elektroforetikus képét. A proteint közvetlenül a gél-szeletkéból vontuk ki és az aktivitást proliferációval határoztuk meg. Mind a kationcserélt frakció, mint a Cl.l felülúszó TCGF csúcsot ad: 20 kD, illetve 15 kD nem redukáló közegben és 21 kD, illetve 16 kD redukáló közegben. Minthogy a kationcserélt anyagot IL-3-ra kimerítettük, az MC/9 proliferáció indukciója csak alacsony szinteket adott és ez az MCGF aktivitás összeesett a TCGF csúccsal. Amikor telítési mennyiségű IL-3^R-t adunk minden frakcióhoz, a Cl.l felülúszó szintekre adott MC/9 proliferációs válasz csak az MCGF/TCGF csúcs-frakciókban emelkedik meg (nyilak, 19B ábra). A felülúszó IL-3 aktivitása a 24 kD pozícióban volt a legnagyobb, de széles csúcsokban a 20 kD területe körül is megjelent. Az elektroforetizált felülúszó 20 kD pozíciójú anyaga lényegesen magasabb MC/9 proliferációs szinteket ad, mint az IL-3 (nyíl, 19A ábra). A legtisztább MCGF/TCGF anyag (a reverz fázisú oszlop 28. frakciója) ezüsttel festett gélje ugyancsak erős protein sávot mutat 20 kD-nál és 15 kD-nál.

A faktor 20 kD formájából pg-nyi mennyiségeket tisztítottunk homogenitásig Cl.l T sejtek ConA-felülúszójának egymást követő frakcionálásával: (1) kationcserélő kromatográfiával, (2) Heparin-Sepharose kromatográfiával és (3) C4 reverz fázisú kromatográfiával, mint előzőleg leírtuk. A végső anyag egyetlen sávot mutatott 20 kD-nál ezüst-festéssel, SDS-PAGE vizsgálatban, amely egyetlen UV abszorpciós csúcsnak felelt meg a C4 elúciós profilnál. A tisztított faktor biológiai vizsgálata megerősítette, hogy az anyag T sejtek és hízó sejtek proliferációját - alacsony szinten stimulálja és fokozza az IL-3 depedens hízó sejtek proliferációját.

Az V. táblázat azt mutatja, hogy a faktor számos B sejt stimuláló aktivitással rendelkezik, amely a BSF1nek tulajdonítható [N. W. Roehm és munkatársai, J. Exp. Med., 169, 679-694 (1984); M. Howard és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 78,5788 (1981); N. W. Roehm és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci,, 81, 6149-6153 (1984)]. Először indukálja az la megnyilvánulásának fokozódását nyugvó B sejteken, a kontroll populációhoz képest (V. táblázat). Másodszor: a faktor anti-Ig antitestekkel együttesen, jelentősen indukálja a ³(H)-timídin beépülését, amely azt jelenti, hogy mint egy kiegészítő faktor működik a B sejtek proliferációjának stimulálásában.

HU 208 710 Β

V. táblázat

Eredet	3(H)-timidin beépülés anti-lg-vel kezelt B sejteknél'	la indukció”
Cl.Ly l*2/9 felülúszó frakcionálás nélkül	33,788 cpm ± 4,454	162,3
Tisztított faktor	44,125 cpm ± 2,775	157,1
Tápoldat (negatív kontroll)	4,128 cpm ±734	35,5

* - a közölt eredmények a faktor telítési mennyiségeivel kiegészített triplikátum tenyészetekben mért cpm ± SEM átlagát jelentik (cpm - count per minute, percenkénti beütés száma; SEM = standard error of mean, a középérték standard hibája).

- a közölt eredmények a faktor telítési mennyiségeivel kiegészített triplikátum tenyészetekben mért fluoreszcencia relatív középértékének átlagát jelentik.

Ezek a polipeptidek számos biológiai aktivitással rendelkeznek, amelyek abban különbözhetnek egymástól, hogy a megnyilvánuló funkciót hogyan közvetítik, és hogy milyen típusúak az érintett sejtek. Amint leír-

Claims (30)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK tűk, az aktivitások közé tartozik a szinergista hatás, amely a B sejtek és hízó sejtvonalak proliferációjának inkubálásában jelenik meg, a nyugvó B sejtek korai aktiválása, a T sejtek proliferációjának stimulálása és a mitogénnel aktivált B sejtek IgG, és IgE termelésének szelektív fokozása. A polipeptidek homogenitásig való tisztítása tisztázta ezen aktivitások természetét.

   Az előzőekből megítélhető, hogy a jelen találmány szerinti tisztított proteinek, azok számára, akik e szakterületen jártasak, új terápiás lehetőségeket teremtenek. Az a tény, hogy ezeket a faktorokat jelentős mennyiségben tudjuk előállítani, lehetővé teszi a kiválasztott emlős sejtvonalak in vitro tenyésztésének tökéletesítését, valamint az emlősök immunválaszának átfogó jobb 15 megértését.

   A pcD-2A-E3, pcD-46 (pcD-2Fl-13), pcD-125 cDNS kiónokat és a pMF-alfa8 élesztő vektort letétbe helyeztük az American Type Culture Collection (Rockville, MD., USA) intézményben 53 330, 53 337, 20 67029, illetve 40 140 letéti szám alatt. A letétek a szabadalmi eljárások céljára letétbe helyezett mikroorganizmusok nemzetközi elismeréséről intézkedő Budapesti Egyezmény (1977) alapján történtek.

   1. Eljárás humán, interleukin-4 aktivitást kifejtő polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy

   i) az 30

   X(His) - X(Lys) X(Leu) - X(Gln) X(Thr) - X(Leu) X(Glu) - X(Gln) X(Thr) - X(Glu) X(Asp) - X(Ile) X(Lys) - X(Asn) X(Glu) - X(Thr) X(Ala) - X(Thr) X(Phe) - X(Tyr) X(Lys) - X(Asp) X(Gly) - X(Ala) X(Phe) - X(His) X(Leu) - X(Ile) X(Arg) - X(Leu) Trp - X(Gly) X(Asn) - X(Ser) X(Glu) - X(Ala) X(Leu) - X(Glu) X(Arg) - X(Leu) X(Arg) - X(Glu) Cys - X(Ser) -

   Cys - X(Asp) X(Glu) - X(Ile) X(Asn) - X(Ser) X(Lys) - X(Thr) X(Leu) - X(Thr) X(Phe) X(Ala) X(Thr) - X(Thr) X(Phe) - Cys X(Val) - X(Leu) X(Ser) - X(His) X(Thr) - X(Arg) X(Thr) - X(Ala) X(Arg) - X(His) X(Arg) - X(Phe) X(Asp) - X(Arg) X(Leu) - X(Ala) Cys - X(Pro) S(Asn) - X(Gln) X(Asn) - X(Phe) X(Lys) - X(Thr) X(Lys) - X(Tyr) X(Ser)

   általános képlettel ábrázolt aminosavszekvenciájú, glükozilezett vagy glükozilezetlen, legfeljebb N szubsztitúciót, legfeljebb N deléciót és/vagy legfeljebb N inszerciót és kívánt esetben vezérszekvenciát vagy annak egy részét tartalmazó polipeptidet amely képletben

   - X(Ile) - X(Thr) - X(Ile) - X(Lys) - X(Leu) - X(Thr) - X(Leu) - Cys

   - X(Val) - X(Thr) - X(Ala) - S(Ser) - X(Glu) - X(Lys) - X(Arg) - X(Ala) - X(Arg) - X(Gln) - X(His) - X(Glu) Cys - X(Leu) - X(Gln) - X(Gln) - X(Lys) - X(Gln) - X(Leu) - X(Lys) - X(Asn) - X(Leu) - X(Gly) - X(Leu) - X(Val) - X(Lys) - X(Ser) - X(Thr) - X(Leu) - X(Glu) - X(Ile) - X(Met) - X(Ser) - X(Lys) X(Ser) a szerin, treonin, glicin és aszparagin által alkotott csoportba tartozó aminosavat jelent;

   X(Arg) az arginin, hisztidin, glutamin, lizin és glutaminsav által alkotott csoportba tartozó aminosavat jelent;

   X(Leu) a leucin, izoleucin, fenilalanin, tirozin, metio35

   HU 208 710 Β nin és valin által alkotott csoportba tartozó aminosavat jelent;

   X(Pro) a prolin, glicin, alanin és treonin által alkotott csoportba tartozó aminosavat jelent;

   X(Thr) a treonin, prolin, szerin, alanin, glicin, hisztidin és glutamin által alkotott csoportba tartozó aminosavat jelent;

   X(Ala) az alanin, glicin, treonin és prolin által alkotott csoportba tartozó aminosavat jelent;

   X(Val) a valin, metionin, tirozin, fenilalanin, izoleucin és leucin által alkotott csoportba tartozó aminosavat jelent;

   X(Gly) a glicin, alanin, treonin, prolin és szerin által alkotott csoportba tartozó aminosavat jelent;

   X(Ile) az izoleucin, metionin, tirozin, fenilalanin, valin és leucin által alkotott csoportba tartozó aminosavat jelent;

   X(Phe) a fenilalanin, triptofán, metionin, tirozin, izoleucin, valin és leucin által alkotott csoportba tartozó aminosavat jelent;

   X(Tyr) a tirozin, triptofán, metionin, fenilalanin, izoleucin, valin és leucin által alkotott csoportba tartozó aminosavat jelent;

   X(His) a hisztidin, glutaminsav, lizin, glutamin, treonin és arginin által alkotott csoportba tartozó aminosavat jelent;

   X(Gln) a glutamin, glutaminsav, lizin, aszparagin, hisztidin, treonin és arginin által alkotott csoportba tartozó aminosavat jelent;

   X(Asn) az aszparagin, glutaminsav, aszparaginsav, glutamin és szerin által alkotott csoportba tartozó aminosavat jelent;

   X(Lys) a lizin, glutaminsav, glutamin, hisztidin és aiginin által alkotott csoportba tartozó aminosavat jelent; X(Asp) az aszparaginsav, glutaminsav és aszparagin által alkotott csoportba tartozó aminosavat jelent; X(Glu) a glutaminsav, aszparaginsav, lizin, aszparagin, glutamin, hisztidin és arginin által alkotott csoportba tartozó aminosavat jelent;

   X(Met) a metionin, fenilalanin, izoleucin, valin, leucin és tirozin által alkotott csoportba tartozó aminosavat jelent;

   Trp jelentése triptofán;

   Cys jelentése cisztein; és az „N szubsztitúció” kifejezés azt jelenti, hogy az

   IC ábrán megadott szekvenciájú természetes polipeptid aminosavszekvenciájához képest legfeljebb N aminosav a fentebb említett szinonim aminosavak valamelyikével van helyettesítve;

   az „N deléció” azt jelenti, hogy az IC ábrán megadott szekvenciájú természetes polipeptid aminosavszekvenciájához képest legfeljebb N aminosav hiányzik a szekvenciából;

   az „N inszerció” kifejezés azt jelenti, hogy az IC ábrán megadott szekvenciájú természetes polipeptid aminosavszekvenciájához képest legfeljebb N aminosav van a fentebb említett szinonim aminosavak közül a szekvenciába betoldva;

   N szubsztitúció esetén N jelentése 3;

   N deléció és N inszerció esetén N jelentése 2, azzal a fenntartással, hogy a deléció vagy inszerció a szekvencia 3-29., 35-66., 78-87., 98-99. és 105-125. helyzetű aminosavai által meghatározott szakaszokon belül fordul elő kódoló, egy bakteriális, élesztő vagy emlős gazdasejtben kifejeződésre képes, az IC ábrán megadott szekvenciájú természetes polipeptidet kódoló pcD-125 inszertumához legalább 90% homológiával rendelkező nukleotid szekvenciát - kívánt esetben vezérszekvenciával kiegészítve - tartalmazó vektort szerkesztünk;

   ii) a vektorral egy gazdasejtet transzformálunk; és iii) a vektort tartalmazó gazdasejtet a nukleotidszekvenciának az illető polipeptiddé való kifejezésére alkalmas körülmények között tenyésztjük, és a polipeptidet izoláljuk a tenyészetből. (Elsőbbsége: 1985. 11.19.)
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan polipeptid előállítására, amelynek képletében

   X(Arg) jelentése arginin;

   X(Leu) a leucin, izoleucin és metionin által alkotott csoportba tartozó aminosavat jelent;

   X(Pro) jelentése prolin;

   X(Ala) jelentése alanin;

   X(Val) jelentése valin;

   X(Ile) az izoleucin, metionin és leucin által alkotott csoportba tartozó aminosavat jelent;

   X(Phe) jelentése fenilalanin;

   X(Tyr) jelentése tirozin;

   X(His) jelentése hisztidin;

   X(Gln) jelentése glutamin;

   X(Asn) jelentése aszparagin;

   X(Lys) jelentése lizin;

   X(Asp) jelentése aszparaginsav;

   X(Glu) jelentése glutaminsav; és

   X(Met) a metionin, izoleucin és leucin által alkotott csoportba tartozó aminosavat jelent, azzal jellemezve, hogy a tárgyi körben meghatározott polipeptidet kódoló nukleotid-szekvenciát tartalmazó vektort szerkesztünk. (Elsőbbsége: 1986.09.17.)
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás legfeljebb 1 szubsztitúciót, 1 deléciót és 1 inszerciót tartalmazó glükozilezett vagy glükozilezetlen polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a tárgyi körben meghatározott polipeptidet kódoló nukleotid-szekvenciát tartalmazó vektort szerkesztünk. (Elsőbbsége: 1986.09.17.)
4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás a szekvencia 329., 35-66., 78-87., 98-99. és 105-125. helyzetű aminosavai által meghatározott szakaszokon belül legfeljebb 1 szubsztitúciót tartalmazó, glükozilezett vagy glükozilezetlen polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a tárgyi körben meghatározott polipeptidet kódoló nukleotid-szekvenciát tartalmazó vektort szerkesztünk. (Elsőbbsége: 1986. 09, 17.)
5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás a

   H-His-Lys-Cys-Asp-Ile-Thr-Leu-Gln-Glu-IleIle-Lys-Thr-Leu-Asn-Ser-Leu-Thr-Glu-GlnLys-Thr-Leu-Cys-Thr-Glu-Leu-Thr-Val-Thr36

   HU 208 710 Β

   Asp-Ile-Phe-Ala-Ala-Ser-Lys-Asn-Thr-ThrGlu-Lys-Glu-Thr-Phe-Cys-Arg-Ala-Ala-ThrVal-Leu-Arg-Gln-Phe-Tyr-Ser-His-His-GluLys-Asp-Thr-Arg-Cys-Leu-Gly-Ala-Thr-AlaGln-Gln-Phe-His-Arg-His-Lys-Gln-Leu-IleArg-Phe-Leu-Lys-Arg-Leu-Asp-Arg-Asn-LeuTrp-Gly-Leu-Ala-Gly-Leu-Asn-Ser-Cys-ProVal-Lys-Glu-Alá-Asn-Gin-Ser-Thr-Leu-GluAsn-Phe-Leu-Glu-Arg-Leu-Lys-Thr-Ile-MetArg-Glu-Lys-Tyr-Ser-Lys-Cys-Ser-Ser-OH képlettel meghatározott, glükozilezett vagy glükozilezetlen polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a tárgyi körben meghatározott polipeptidet kódoló nukleotid-szekvenciát tartalmazó vektort szerkesztünk. (Elsőbbsége: 1986.03.25.)
6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás IS° (Gly-AsnPhe-Val-His-Gly) vezérszekvenciával kiegészített humán interleukin-4 mutein előállítására, azzal jellemezve, hogy a tárgyi körben meghatározott polipeptidet 20 kódoló nukleotid-szekvenciát tartalmazó vektort szerkesztünk. (Elsőbbsége: 1986. 09.17.)
7. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás IS° (Ala-GluPhe) vezérszekvenciával kiegészített, humán interleukin-4 mutein előállítására, azzal jellemezve, hogy a tár- 25 gyi körben meghatározott polipeptidet kódoló nukleotid-szekvenciát tartalmazó vektort szerkesztünk. (Elsőbbsége: 1986. 09.17.)
8. 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás a szekvencia 3-29., 35-66., 78-87., 98-99. és 105-125. helyzetű aminosavai által meghatározott szakaszokon belül leg15 feljebb 1 inszerciót, legfeljebb 1 deléciót vagy legfeljebb 1 szubsztitúciót tartalmazó, glükozilezett vagy glükozilezetlen polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a tárgyi körben meghatározott polipeptidet kódoló nukleotid-szekvenciát tartalmazó vektort szerkesztünk. (Elsőbbsége: 1986. 09. 17.)
9. 9. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vektorral egy emlős gazdasejtet transzformálunk. (Elsőbbsége: 1986. 03. 25.)
10. 10. Az 1. igénypont szerinti eljárás az 5. igénypont tárgyi körében meghatározott aminosavszekvenciájú és még egy vezérszekvenciával kiegészített polipeptid, azaz a

    H-Met-Gly-Leu-Thr-Ser-Gln-Leu-Leu-Pro-ProLeu-Phe-Phe-Leu-Leu-Ala-Cys-Ala-Gly-AsnPhe-Val-His-Gly-His-Lys-Cys-Asp-Ile-ThrLeu-Gln-Glu-Ile-Ile-Lys-Thr-Leu-Asn-SerLeu-Thr-Glu-Gln-Lys-Thr-Leu-Cys-Thr-GluLeu-Thr-Val-Thr-Asp-Ile-Phe-Ala-Ala-SerLys-Asn-Thr-Thr-Glu-Lys-Glu-Thr-Phe-CysArg-Ala-Ala-Thr-Val-Leu-Arg-Gln-Phe-TyrSer-His-His-Glu-Lys-Asp-Thr-Arg-Cys-LeuGly -Alá-Thr-Alá-Gin-Gin-Phe-His-Arg-HisLy s - Gin - Leu -1 le - Arg - Phe - Leu - Lys - Arg - Leu Asp-Arg-Asn-Leu-Trp-Tly-Leu-Ala-Gly-LeuAsn-Ser-Cys-Pro-Val-Lys-Glu-Ala-Asn-GlnSer-Thr-Leu-Glu-Asn-Phe-Leu-Glu-Arg-LeuLys-Thr-Ile-Met-Arg-Glu-Lys-Tyr-Ser-LysCys-Ser-Ser-OH képlettel ábrázolt aminosavszekvenciájú polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a tárgyi körben meghatározott polipeptidet kódoló nukleotid-szekvenciát tartalmazó vektort szerkesztünk, és a vektorral egy emlős gazdasejtet transzformálunk. (Elsőbbsége: 1986.03.25.)
11. 11. Az 5. igénypont szerinti eljárás humán, interleukin-4 aktivitást kifejtő polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a

    CAC AAA TGT GAC ATC ACT CTG CAA GAA ATC ATC AAA ACT CTG AAC TCG TTA ACC GAA CAG AAA ACC CTG TGC ACC GAG CTC ACT GTT ACT GAT ATC TTC GCT GCT TCC AAA AAC ACT ACT GAA AAA GAA ACT TTC TGC AGA GCT GCT ACC GTT CTG CGT CAG TTC TAC TCT CAC CAC GAA AAA GAC ACG CGT TGT CTC GGC GCC ACT GCG CAG CAG TTC CAC CGT CAC AAA CAG CTG ATC AGA TTC CTG AAA CGT CTA GAC CGT AAC CTG TGG

    1 HU 208 710 Β 2

    GGC CTG GCC GGC CTG AAC TCT TGT CCG GTT AAA GAA GCT AAC CAG TCG ACT CTG GAA AAC TTC CTC GAG CGT CTG AAA ACC ATC ATG CGT GAA AAG TAC TCT AAA TGC TCT TCT

    képlettel ábrázolt nukleotid-szekvenciát tartalmazó vektort szerkesztünk. (Elsőbbsége: 1986.03.25.)
12. 12. Eljárás hatóanyagként humán, interleukin-4 aktivitást kifejtő polipeptidet tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított polipeptidet a gyógyszertechnológiában szokásosan használt hordozó, hígító és/vagy egyéb segédanyagokkal keverjük, és a keveréket gyógyszerkészítménnyé alakítjuk. (Elsőbbsége: 1986.09.17.)
13. 13. Eljárás az 1. igénypont tárgyi körében megadott aminosav-szekvenciájú polipeptidek kifejezésére képes gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy élesztősejteket, baktériumsejteket - vagy emlős sejteket egy, a kívánt polipeptidet kódoló nukleotid-szekvenciát tartalmazó expressziós vektorral transzformálunk. (Elsőbbsége: 1986. 09. 17.)
14. 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Escherichia coli sejteket, Saccharomyces cerevisiae sejteket, COS 7 majomsejteket vagy egér L sejteket transzformálunk. (Elsőbbsége: 1986. 09. 17.)
15. 15. Eljárás baktériumsejtek humán, interleukin-4 aktivitást kifejtő, az 1. igénypontban megadott általános képletű polipeptidek kifejezésére képes gazdasejtekké való transzformálására alkalmas vektorok előállítására, azzal jellemezve, hogy egy baktériumsejtben kifejeződésre képes plazmidba egy, a kívánt polipeptidet kódoló nukleotid-szekvenciát tartalmazó polinukleotidot inszertálunk. (Elsőbbsége: 1986. 09. 17.)
16. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy all. igénypontban megadott nukleotid-szekvenciát tartalmazó polinukleotidot pIN-IIIompA2, TRPC11 vagy TAC-RBS plazmidba inszertáljuk. (Elsőbbsége: 1986.09.17.)
17. 17. Eljárás élesztősejtek humán, interleukin-4 aktivitást kifejtő polipeptidek kifejezésére képes gazdasejtekké való transzformálására alkalmas vektorok előállítására, azzal jellemezve, hogy egy élesztősejtben kifejeződésre képes plazmidba a 11. igénypontban megadott nukleotid-szekvenciát tartalmazó polinukleotidot inszertálunk. (Elsőbbsége: 1986.09.17.)
18. 18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy all. igénypontban megadott nukleotid-szekvenciát tartalmazó polinukleotid pMF-alfa8 plazmidba inszertáljuk. (Elsőbbsége: 1986. 09. 17.)
19. 19. Eljárás emlős sejtek humán, interleukin-4 aktivitást kifejtő polipeptidek kifejezésére képes gazdasejtekké való transzformálására vagy átmeneti transzfektálására alkalmas vektorok előállítására, azzal jellemezve, hogy egy emlős sejtben kifejeződésre képes plazmidba a 10. iránypontban megadott aminosavszekvenciának megfelelő nukleotid-szekvenciát vagy all. igénypontban megadott nukleotid-szekvenciát tartalmazó polinukleotidot inszertáljuk. (Elsőbbsége: 1986.09.17.)
20. 20. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 10. igénypontban megadott aminosavszekvenciának megfelelő nukleotid-szekvenciát vagy a 11. igénypontban megadott nukleotid-szekvenciát tartalmazó polinukleotidot egy pcD plazmidba inszertáljuk. (Elsőbbsége: 1986.09.17.)
21. 21. A 20. igénypont szerinti eljárás a pcD-125 vagy pcD-46 plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a

    10. igénypontban megadott nukleotid-szekvenciát tartalmazó polinukleotidot inszertáljuk egy pcD plazmidba. (Elsőbbsége: 1986.09. 17.)
22. 22. Eljárás humán, interleukin-4 aktivitást kifejtő, az 1. igénypontban megadott általános képletű polipeptideket kódoló nukleotid-szekvenciához legalább 90% homológiával rendelkező nukleotid-szekvenciát és kívánt esetben vezérszekvenciát tartalmazó nukleinsavak előállítására, azzal jellemezve, hogy

    i) egy, a tárgyi körben meghatározott aktivitást kifejtő polipeptidet termelő sejtből mRNS-t izolálunk;

    ii) az izolált mRNS-t cDNS-sé átírjuk;

    iii) majd a cDNS-t hibridizálással szűrjük. (Elsőbbsége: 1986. 03. 25.)
23. 23. A 22. igénypont szerinti eljárás a pcD-46 vagy a pcD-125 vektor cDNS inszertumában lévő DNS szekvenciával legalább 90%-ban homológ nukleotid-szekvenciát tartalmazó nukleinsavak előállítására, azzal jellemezve, hogy

    i) egy, a tárgyi körben meghatározott nukleotidszekvencia által kódolt polipeptidet termelő sejtből mRNS-t izolálunk;

    ii) az izolált mRNS-t cDNS-sé átírjuk;

    iii) majd a cDNS-t hibridizálással szűrjük. (Elsőbbsége: 1986. 03. 25.)
24. 24. A 22. igénypont szerinti eljárás az 1. igénypontban megadott általános képletű polipeptideket kódoló nukleotid-szekvenciát tartalmazó nukleinsavak előállítására, azzal jellemezve, hogy

    i) egy, a tárgyi körben meghatározott nukleotidszekvencia által kódolt polipeptidet termelő sejtből mRNS-t izolálunk;

    ii) az izolált mRNS-t cDNS-sé átírjuk;

    iii) majd a cDNS-t hibridizálással szűrjük. (Elsőbbsége: 1986. 09. 17.)
25. 25. A 24. igénypont szerinti eljárás a 2. igénypont tárgyi körében megadott aminosavszekvenciájú polipeptideket kódoló nukleotid-szekvenciát tartalmazó nukleinsavak előállítására, azzal jellemezve, hogy

    i) egy, a tárgyi körben meghatározott nukleotidszekvencia által kódolt polipeptidet termelő sejtből mRNS-t izolálunk;

    ii) az izolált mRNS-t cDNS-sé átírjuk;

    iii) majd a cDNS-t hibridizálással szűrjük. (Elsőbbsége: 1986. 09. 17.)
26. 26. A 24. igénypont szerinti eljárást a 4. igénypont tárgyi körében megadott aminosavszekvenciájú polipeptidet kódoló nukleotid-szekvenciát tartalmazó nukleinsavak előállítására, azzal jellemezve, hogy

    HU 208 710 Β

    i) egy, a tárgyi körben meghatározott nukleotidszekvencia által kódolt polipeptidet termelő sejtből mRNS-t izolálunk;

    ii) az izolált mRNS-t cDNS-sé átírjuk;

    iii) majd a cDNS-t hibridizálással szűrjük. (Elsőbbsége: 1986.09.17.)
27. 27. A 26. igénypont szerinti eljárás az 5. igénypont tárgyi körében megadott aminosavszekvenciájú polipeptideket kódoló nukleotid-szekvenciát tartalmazó nukleinsavak előállítására, azzal jellemezve, hogy

    i) egy, a tárgyi körben meghatározott nukleotidszekvencia által kódolt polipeptidet termelő sejtből mRNS-t izolálunk;

    ii) az izolált mRNS-t cDNS-sé átírjuk;

    iii) majd a cDNS-t hibridizálással szűrjük. (Elsőbbsége: 1986. 09. 17.)
28. 28. A 22. igénypont szerinti eljárás az 1B ábrában megadott nukleotid-szekvencia 64-től 522-ig terjedő helyzetű nukleotidjai által meghatározott aminosavszekvenciájú polipeptideket kódoló nukleotid-szekvenciát tartalmazó nukleinsavak előállítására, azzal jellemezve, hogy

    i) egy, a tárgyi körben meghatározott nukleotidszekvencia által kódolt polipeptidet termelő sejtből mRNS-t izolálunk;

    ii) az izolált mRNS-t cDNS-sé átírjuk;

    iii) majd a cDNS-t hibridizálással szűrjük. (Elsőbbsége: 1986.03.25.)
29. 29. A 28. igénypont szerinti eljárás az 1B ábrában megadott nukleotid-szekvencia 136-tól 522-ig terjedő helyzetű nukleotidjai által meghatározott aminosavszekvenciájú polipeptideket kódoló nukleotid-szekvenciát tartalmazó nukleinsavak előállítására, azzal jellemezve, hogy

    i) egy, a tárgyi körben meghatározott nukleotidszekvencia által kódolt polipeptidet termelő sejtből mRNS-t izolálunk;

    ii) az izolált mRNS-t cDNS-sé átírjuk;

    iii) majd a cDNS-t hibridizálással szűrjük. (Elsőbbsége: 1986.03. 25.)
30. 30. A 22. igénypont szerinti eljárás all. igénypont tárgyi körében megadott nukleotid-szekvenciát tartalmazó nukleinsavak előállítására, azzal jellemezve, hogy

    i) egy, a tárgyi körben meghatározott nukleotidszekvencia által kódolt polipeptidet termelő sejtből mRNS-t izolálunk;

    ii) az izolált mRNS-t cDNS-sé átírjuk;

    iii) majd a cDNS-t hibridizálással szűrjük. (Elsőbbsége: 1986.09.17.)