JPS63501401A - 哺乳動物インタ−ロイキン−４ - Google Patents

哺乳動物インタ−ロイキン−４

Info

Publication number
JPS63501401A
JPS63501401A JP61506135A JP50613586A JPS63501401A JP S63501401 A JPS63501401 A JP S63501401A JP 61506135 A JP61506135 A JP 61506135A JP 50613586 A JP50613586 A JP 50613586A JP S63501401 A JPS63501401 A JP S63501401A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
group
cells
activity
phe
leu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP61506135A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2557361B2 (ja
Inventor
リー、フランク
ヨコタ，タカシ
アライ，ケンイチ
モスマン，ティモシー
レニック，ドナ
スミス，クレイグ
Original Assignee
シェリング・バイオテック・コ−ポレ−ション
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US06/843,958 external-priority patent/US5552304A/en
Priority claimed from US06/908,215 external-priority patent/US5017691A/en
Application filed by シェリング・バイオテック・コ−ポレ−ション filed Critical シェリング・バイオテック・コ−ポレ−ション
Publication of JPS63501401A publication Critical patent/JPS63501401A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2557361B2 publication Critical patent/JP2557361B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/247—IL-4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5406—IL-4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16211—Lymphocryptovirus, e.g. human herpesvirus 4, Epstein-Barr Virus
    • C12N2710/16241—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/16243—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Auxiliary Devices For Music (AREA)
  • Fertilizers (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 哺乳動物インターロイキン−４ 本発明は哺乳動物の免疫系のタンパク質因子および突然変異タンパク質（ムティ ン、　ｏ＋ｕｔｅｉｎ）因子、ならびにそれらをコードする核酸に関する。より 詳細には、本発明はＴ細胞増殖因子活性およびＢ細胞増殖因子活性の両方を示す タンパク質因子および突然変異タンパク質因子（ならびにそれらをコードする核 酸）に関する。
組換えＤＮＡ技術は一般に供給源からの遺伝情報をベクター内に組み込み、その 後宿主への導入のようなプロセッシングを行って、新しい環境のもとてその転移 遺伝情報を複製および／または発現させる技術に関する０通常、遺伝情報は目的 のタンパク質産物をコードするメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）から誘導さ れる相補ＯＮＡ　（ｃＤＮＡ）の形で存在する。キャリアは往々にしてプラスミ ドであり、プラスミドは宿主内での複製のためにｃＤＮＡを組み入れる能力を有 し、いくつかの場合には実際にｃＤＮＡの発現を制御し、それにより宿主内での コード化産物の合成を導く能力をもっている。
しばらくの間、哺乳動物の免疫応答は“免疫ネットワーク”と呼ばれる一連の複 雑な細胞相互作用に基づくことが知られていた。最近の研究は、このネットワー クの内部機構への新たな洞察を与えた。多くの免疫応答が実際にリンパ球、マク ロファージ、顆粒球および他の細胞のネットワーク様相互作用を中心に動いてい ることは確かであるが、今や免疫学者達は一般にこれらの細胞の相互作用を制御 する上で可溶性タンパク質（例えば、いわゆる“リンフ才力イン”や“モノカイ ン″）が重要な役割を演じていると考えている。従って、細胞調節因子の単離、 同定および作用機構には多大の関心が寄せられ、これらの理解は数多くの病気の 診断および治療に画期的な躍進をもたらすでリンフ才力インは明らかにいろいろ なやり方で細胞の活動を仲介する。それらは多分化能性造血幹細胞の増殖、成長 および分化を促進して、免疫応答に関与する種々の細胞系統を構成する膨大な数 の前駆細胞へと分化させることが知られている。これらの細胞系統は、リンフ才 力インを他の作用物質と共に使用する場合、しばしば異なる方法で応答する。
免疫応答にとって特に重要な細胞系統は２種類のリンパ球：すなわちＢ細胞とＴ 細胞であり、Ｂ細胞は免疫グロブリン（異物を認識し、それと結合してそれを除 去する能力をもつタンパク質）を生産・分泌することができ、−力積々のサブセ ットのＴ細胞はリンフ才力インを分泌し、Ｂ細胞と免疫ネットワークを構成する 他の細胞（他のＴ細胞を含む）を誘発または抑制することができる。
その他の重要な細胞系統は肥満細胞（すべての哺乳動物種においてポジティブに 同定されたわけではない）・・−・・一体中の毛細管に接近して、特に肺、皮膚 、胃腸管および泌尿生殖器官に高濃度で存在する顆粒含有結合組繊細胞である。
肥満細胞はアレルギー関連疾患（特にアナフィラキシ−）において中心的な役割 を演じ、すなわち所定の抗原が肥満細胞表面上の受容体に結合したあるクラスの 免疫グロブリンと交差結合するとき、肥満細胞は顆粒を放出してアレルギー反応 （例えばアナフィラキシ−）を引き起こす媒介物質（例えばヒスタミン、セロト ニン、ヘパリン、プロスタグランジンなど）を放出する。
種々の免疫疾患をより一層理解するための研究（これは免疫疾患を治療すること につながる）は、一般に免疫系の細胞を１ｎｖｉｔｒｏで維持することが困難で あるために妨げられている。免疫学者達は、これらの細胞の培養が種々の増殖因 子（例えばリンフ才力イン類）を含むＴ細胞および他の細胞の上清を使用するこ とにより達成できることを見出した。
リンフ才力インや免疫反応の他の可溶性媒介物質のような因子の検出、単離およ び精製は非常に困難であり、そしてしばしばそれらを含む上清の性質そのもの、 混合物中の諸成分の活性の分散および乗り換え（ｃｒｏｓｓ−ｏｖｅｒ）、因子 の性質を調べるために利用するアッセイの感度（またはその欠如）、因子の分子 量範囲および他の特性における類似性、ならびにそれらの自然環境における因子 濃度の低さにより複雑になっている。
リンフ才力インが主に分子クローニングによって次第に利用可能になるにつれて 、それらの臨床上の用途を見出すことに関心が高まった。ホルモンとの生理学的 類似性（例えば可溶性因子、増殖媒介物、細胞受容体を介しての作用）のために 、リンフ才力インの使用可能性はホルモンの最近の用途に類推して論じられた： 例えばデクスター（Ｄｅｘｔｅｒ）、　Ｎａｔｕｒｅ、　ｖｏｔ＋３２１＋Ｐ。
１９８（１９８６）を参照されたい。１つの期待は、患者におけるリンフ才力イ ン　レベルが有益な免疫応答（例えば炎症、アレルギーまたは組織拒絶反応の抑 制、あるいは感染症または悪性増殖に対する刺激もしくは増強）を引き起こすた めに直接的または間接的に操作し得るということである。リンフ才力インの他の し一床上の用途には、あるヒトのある種の免疫系細胞を有益な作用のために同じ ヒトまたは別のヒトへ終局的に再導入すべく、これらの細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏ 集団を維持・増殖させることが含まれる。例えば、患者のリンフォカイン活性化 キラーＴ細胞の集団を患者の体外で増殖させて、その後高められた抗腫瘍応答を 引き起こすために再注入し得るかどうかを調べる研究が現在進行中である。リン フ才力イン、特に顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ３Ｆ）の ようなコロニー刺激因子およびそれらの活性を高める因子、の他の臨床上の用途 は、例えば腫瘍に対する化学療法または放射線療法の前後に、骨髄形成不全の治 療のために、あるいは好中球欠損症候群の治療のために、血液細胞の発生を刺激 することである：デクスター（Ｄｅｘｔｅｒ）、　Ｎａｔｕｒｅ。
Ｖｏｌ、３２１．Ｐ、１９８（１９８６）を参照されたい。この種の因子はまた 、再生不良性貧血やある種の白血病の治療に次第に使用されつつある骨髄移植療 法において有用であるだろう。
このような臨床用途にとって重要なリンフ才力インの２つの性質がある：すなわ ち個々のリンフ才力インはしばしば多面作用性（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ）であ り；また１つのリンフ才力インの生物学的作用は一般に少なくとも１つの他のリ ンフ才力インによって調節（抑制または増強）しうる。例えば、Ｔ−インターフ ェロンと相乗的な腫瘍壊死因子はインターロイキン−１（ＩＬ−１）の生産を刺 激し、且つ好中球の食作用を活性化することができる。
活性化マクロファージによって生産されるタンパク質ＩＬ−１は、インターロイ キン−２（ＩＬ−２）放出の誘導による胸腺細胞増殖の刺激、Ｂリンパ球の成熟 および増殖の刺激、線維芽細胞増殖因子活性、および肝細胞による栄、性期タン パク質（ａｃｕ　ｔｅｐｈａｓｅｐｒｏｔｅｉｎ）合成の誘導を含めた広範囲の 生物学的作用を仲介する。
また、ＩＬ−１はプロスタグランジンおよ滑液細胞からのコラゲナーゼ放出を刺 激し、且つ内因性発熱因子に一致することが報告された：クランプシュミット（ Ｋｒａｍｐｓｃｈｎ＋１ｄｔ）＋Ｊ、Ｌｅｕｋ、Ｂｉｏ１．。
Ｖｏｌ　、３６．　ｐ、３４１〜３５５　（１９８４）を参照されたい。
インターロイキン−２（以前はＴ細胞増殖因子と呼ばれていた）はレクチン活性 化または抗原活性化Ｔ細胞によって生産されるリンフ才力インである。　ＩＬ− ２の報告された生物学的活性には、活性化Ｔ細胞クローンの長期ｉｎ　ｖｉｔｒ ｏ増殖、胸腺細胞の有糸分裂増強、およびヌードマウス牌細胞培養物における細 胞障害性Ｔ細胞の反応性およびプラーク形成細胞の応答の誘導が含まれる。さら に、インターフェロン（ＩＦＮ）　と同様に、ＩＬ−２は天然キラー細胞の活性 を増大させることがわかり、新生物疾患の治療への使用可能性が示唆された：ヘ ネイ（Ｈｅｎｎｅｙ）ら。
Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ、２９１．ｐ、３３５〜３３８（１９８１）を参照された い。このような治療法においていくつかの成功が報告された：例えばロツゼ（Ｌ ｏｔｚｅ）およびローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）＋　”精製ヒトインタ ーロイキン−２による腫瘍患者の治療”、ソーブ（Ｓｏｒｇ）ら編集。
Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　ｏｆ　Ｌ　ｍ　 ｈｏｋｉｎｅｓ　（アカデミツクブレス社、ニューヨーク、１９８５）　；　お よびローゼンバーグおよびロッゼ、　“インターロイキン−２およびインターロ イキン−２活性化リンパ球を使用する癌の免疫療法”、ハムＲｅｖ、　Ｉｍｍｕ ｎｏｌ、　、　Ｖｏｌ、４．　ｐ、６８１〜７０９（１９８６）を参照されたい 。しかしながら、ＩＬ−２の毒性はこれらの性質を利用するために癌患者に投与 しうるＩＬ−２の投与量を制限した：ソーブら編集の上記文献中のロッゼおよび ローゼンバーグ、ｐ、７１１〜７１９；およびウェルテ（Ｗｅｌｔｅ）　ら、　 ｐ、７５５〜７５９を参照されたい。
メントカーフ（Ｍｅｔｃａｌｆ、Ｄ、）、Ｔｈｅ　Ｈｅｍａｔｏ　ｏｉｅｔｉｃ 　ＣｏｌｏｎＳｔｉｍｕｌａ」Ｆａｃｔｏｒｓ　（エルセピア−、アムステルダ ム、　１９８４）は哺乳類の免疫応答に関与するリンフ才力インおよび種々の増 殖因子に関する研究の概要を開示している。ヤング（Ｙｕｎｇ、Ｙ、Ｐ、）ら、 　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｖｏｌ、１２７．＋１．７９４（１９８１）は肥満細胞 増殖因子（ＭＣＧＦ）活性を示す約３５ｋｄのタンパク質の部分精製およびＴ細 胞増殖因子（ＴＣＧＦ）とも呼ばれるインターロイキン−２（ＩＬ−２）からの その分離を開示している。ナベル（Ｎａｂｅｌ、Ｇ、）ら、　Ｎａｔｕｒｅ、Ｖ ｏｌ、２９１゜ｐ、３３２（１９８１）は約４５ｋｄの分子量および約６．５の ｐｉをもつＭＣＧＦを報告している。クラークルイス（Ｃ１ａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ 、　Ｉ）およびシュレーダー（Ｓｃｈｒａｄｅｒ）、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、 Ｖｏｌ、１２７．ｐ、１９４１（１９８１）はリン酸緩衝溶液中で約２９ｋｄお よび６Ｍグアニジン塩酸塩中で約２３ｋｄの約６〜８のｐｉ）をもつ肥満細胞様 増殖因子活性を示すタンパク質を開示している。ネズミＩＬ−２およびインター ロイキン−３Ｖｏ１．１２９．ｐ、２４３１〜２４３６　（１９８２）によって 生化学的に部分同定され、ＩＬ−２は約３０〜３５ｋｄの見かけ分子量（恐らく は二量体として）をもち、そしてＩＬ−３は約２８ｋｄの分子量をもつことが報 告された。
ヒトＩＬ−２は明らかに約１５ｋｄの分子量をもち、ギリスら９回。
Ｒｅｖ、、Ｖｏｌ、６３．ｐ、１６７〜２０９（１９８２）に記載されている。
ＩＬ−３とＴ細胞上清のＭＣＧＦ活性との比較はヤング（Ｙｕｎｇ、Ｙ、）およ びムーア（Ｍｏｏｒｅ、Ｍ、）＋　Ｃｏｎｔｅｍ　、Ｔｏ　、Ｍｏ１．Ｉｍｍｕ ｎｏｌ、、Ｖｏｌ、１０＋ｐ、１４７〜１７９（１９８５）およびレニック（Ｒ ｅｎｎｉｃｋ、Ｄ、）ら、　Ｊ、Ｉ＋ｎｍｕｎｏ１．、Ｖｏｌ、１３４゜ｐ、９ １０〜９１９　（１９８５）に報告された。
可溶性因子によるＢ細胞の増殖および分化の調節に関して多数の文献が存在する ：例えばハワード（Ｈｏｗａｒｄ）およびポール（Ｐａｕｌ）＋Ａｎｎ、Ｒｅｖ 、Ｉｍｍｕｎｏ１．、Ｖｏｌ、１．ｐ、３０７〜３３３（１９８３）　；ハワー ドら、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｒｅｖ、、１９８４．Ｎｏ、７８．ｐ、１８５〜２１ ０；　キシモト（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ）　ら、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｒｅｖ、、１ ９８４．Ｎｏ、７８＋ｐ、９７〜１１８　；およびキシモト、　Ａｎｎ、Ｒｅｖ 、Ｔｍｍｕｎｏｌ、、Ｖｏｌ、３．ｐ、１３３〜１５７（１９８５）を参照され たい。種々の因子を分類するために用いた命名法には、供給源物質の相違、精製 の困難性、およびそれらの生物学的活性を定めるのに使用したアッセイの相違の ために幾分かの混乱が生じた。命名法に関するコンセンサスは明らかにいくつか の場合に達成された二ポール（Ｐａｕｌ）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　Ｔｏｄａ　＋Ｖ ｏ１．４．ｐ。
３２２（１９８３）　；およびポール（Ｐａｕｌ）＋Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｔｎ ＋ｎ＋ｕｎｏ１．、Ｖｏｌ、２１＋ｐ、３４３（１９８４）を参照されたい。Ｂ 細胞増殖因子（ＢＣＧＦ）活性は、抗ｔｇｒまたは類似の抗原にさらすことによ り刺激したＢ細胞においてＤＮＡ合成を引き起こす能力により特徴づけられる。
インターロイキン−１（ＩＬ−１）もまた、少なくともアッセイを低密度のＢ細 胞の存在下で行う場合には、ＢＣＧＦ活性を証明するために必要であると考えら れる。ヒトＢＣＧＦについての別のアッセイは例えばメイゼル（Ｍａｉｚｅｌ） ら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｖｏｌ、８０＋ｐ。
５０４７〜５０５１（１９８３）　（培養下でのヒ）Ｂ細胞の長期増殖の維持） に記載されている。前者のアッセイに関連した活性はまた、類似のおよび／また は関連した活性からそれを区別するために、Ｂ細胞刺激因子−１（ＢＳＦ−１） 活性およびＢＣＧＦ　Ｉとして分類された。特にＢＣＧＦ　Ｉｔと呼ばれる活性 が明示された。これはマイトジェン刺激Ｂ１１１胞または形質転換Ｂ細胞株にお いてＤＮＡ合成を誘発する能力によって特徴づけられる。ＢＣＧＦ　Ｉｔと関係 したマイトジェンにはデキストラン硫酸、リポ多糖およびぶどう球菌（Ｓｔａｐ ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）抽出物が含まれる。ＢＣＧＦ　１はこれらのアッセイに おいて何の応答も示さない、ヒトの場合に、ＢＣＧＦ　ｎは約５０キロダルトン （ＫＤ）の分子量をもつ分子であり、それは免疫応答においてＢ細胞増殖を促進 する際にＢＣＧＦＩ（すなわちＢＳＦ−１）と相乗的に作用すると考えられる： ヨシザカ（Ｙｏｓｈ　１ｚａｋａ）　ら。
Ｊ、　Ｉｍ＋ｎｕｎｏ１．　＋νｏ１．１３０．ｐ、１２４１〜１２４６（１９ ８３）を参照されたし）。ノ１ワードら、　ムエ狂ａμＬ、Ｖｏ１．１５５．＋ ）、９１４〜９２３（１９Ｂ２）は初めてインターロイキン−２と異なるネズミ ＢＣＧＦ　（のちにＢＣＧＦ−１，ＢＳＦ−１，。
またはＩｇＧ、誘導因子といろいろな名称で呼ばれた）の存在を明らかにした。
同じような観察がヨシザキら、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、Ｖｏｌ。
１２８、　Ｐ、　１２９６〜１３０１（１９８２）によりほとんど同時にヒトの 系につし）て報告され、その後オカダ（Ｏｋａｄａ）　ら、　、Ｌ１ソシμｌユ 、　Ｖ　ｏ　ｌ　、　１５　？　。
ｐ、５８３〜５９０によっても報告された。
ＢＣＧＦまたはＢＳＦ−１活性を示す分子の生化学的および生物学的性状決定は これらの初期発見以来たゆまず進行している。メイゼル（Ｍａｉｚｅｌ）ら、　 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｖｏｌ、７９＋ｐ、５９９８〜６０ ０２（１９８２）は１２〜１３ＫＤの分子量および約６．３〜６．６の等電点（ ｐｌ）をもつトリプシン惑受性ヒトＢＣＧＦを報告した。ファージ−（Ｆａｒｒ ａｒ）ら、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、Ｖｏｌ、１３１．ｐ、１８３８〜１８４２ （１９８３）は５ＩＩＳ−ＰＡＧＥによりＩＩＫＤと１５）ＣＤの分子量および ６．４〜８．７のｐＩをもつ不均一のネズミＢＣＧＦの部分精製を報告した。オ ノ＼う（Ｏｈａｒａ）およびポール（Ｐａｕｌ）、　Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ、３ １５．ｐ、３３３〜３３６（１９８５）はネズミＢＳＦ−１に特異的なモノクロ ーナル抗体を開示し、そして１４ＫＤおよび１９〜２０ＫＤの分子量および６． ７のｐＩをもつｌｌｌ５Ｆ−１を示した。ノくトラ−（Ｂｕｔｌｅｒ）　ら、Ｊ 、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、Ｖｏｌ、１３３＋１１．２５１〜２５５（１９８４）　番 よ１８〜２０ＫＤの分子量および６．７〜６．６のｐｉをもつヒト−ＢＣＧＦを 報告している。ルピン（Ｒｕｂｉｎ）　ら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、、Ｖｏｌ、８２＋１）、２９３５〜２９３９　（１９８５）は抗ＩｇＭ 抗体にさらす前に休止Ｂ細胞とＢＳＦ−１とをブレインキュベーションすると細 胞容量が増大し、その後抗ＩｇＭ抗体にさらした際に５期へ入るのが早まること を報告している。ビテッタ（Ｖｉｔｅｔｔａ）　ら、　ムハム厘虹、Ｖｏｔ、１ ６２．ｐ、１７２６　”’１７３１　（１９８５）はＥＬ−４細胞の血清不含上 清の逆相ＨＰＬＣによるネズミＢＳＦ−１の部分精製を開示している。５ＯＳ− ＰＡＧＥは約２０〜２２ＫＤのタンパク質を示した。オハラ（Ｏｈａｒａ）　ら 、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　Ｖｏｌ、１３５＋ｐ、２５１８〜２５２３　（１ ９８５）はまた類似の方法によるネズミＢＳＦ−１の部分精製を報告し、その因 子が約１８〜２１．７ＫＤのタンパク質であることを示した。サイダース（Ｓｉ ｄｅｒａｓ）　ら、　Ｅｕｒ、Ｊ、ｌｍｌ１ｕｎｏ１．Ｖｏｌ。
１５、　ｐ、ｓｓｓ〜５９３および５９３〜５９８　（１９８５）はネズミＩｇ Ｇ、誘導因子（すなわちＢＳＦ−１）の部分精製を報告し、その因子が７．２〜 ７．４および６．２〜６．４のｐｉをもつ約２０ＫＤのタンパク質であることを を示した。スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびレニツク（Ｒｅｎｎｉｃｋ）、Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ。
のＴ細胞増殖因子活性および肥満細胞増殖因子活性を示す因子の分離を報告して いる。その後、ツマ（Ｎｏｍａ）ら、　Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ。
３１９、　ｐ、６４０〜６４６　（１９８６）はサイダースらの因子をコードす る核酸をクローニングして、その塩基配列を決定し、またリー（Ｌｅｅ）ら、　 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｖｏｌ、８３．ｐ、２０６１〜２０ ６５（１９８６）はスミスとレニックの因子をコードする核酸をクローニングし てその塩基配列を決定した。比較的最近になって、グラブスタイン（Ｇｒａｂｓ ｔｅｉｎ）　ら、　ムエ旺」μＬ、Ｖｏ１．１６３．　ｐ、１４０５〜１４１４ （１９８６）はネズミＢＳＦ−１の精製およびアミノ酸配列決定を報告している 。
ミネラス（Ｍｉｌａｎｅｓｅ）ら、　５ｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ、２３１．ｐ、１ １１８〜１１２２（１９８６）は彼らが暫定的にＩＬ−４Ａと命名したＢＳＦ− １とは無関係のリンフ才力インを報告した。彼らのＩＬ−４ＡはＴ３−Ｔｉ受容 体の交差結合後にヘルパーＴ細胞から分離された１０〜１２［）のタンパク質で ある。それはＴｌｌ受容体との相互作用およびインターロイキン−２（ＩＬ−２ ）受容体のその後の誘導により休止リンパ球を刺激する。
サンダーソン（Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ）　ら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、＋Ｖｏ１．８３＋ｐ、４３７〜４４０（１９８６）は好酸球分化因子が Ｂ細胞増殖因子■と明らかに同じであるという証拠に基づいて、そのＢ細胞分化 因子にインターロイキン−４という名称を与えることを提案した。
前述のことから、新しいリンフ才力インの発見および開発が、免疫系および／ま たは造血細胞と直接的または間接的に関係する広い範囲の変性症状の治療法の開 発に寄与することは明らかである。特に、既知のリンフ才力インの有効性を増強 するリンフ才力インの発見および開発は非常に有利であるだろう０例えンフォカ インまたはコファクターの利用によって減少し、また骨髄移植物の効力はコロニ ー刺激因子の活性を増強する因子の使用により増加するであろう。
本発明は哺乳動物のインターロイキン−４（ＩＬ−４）に関する。
それはＩＬ−４活性を示すポリペプチドをコードする核酸、およびポリペプチド 自体、ならびにそれらの生産方法を包含する０本発明の核酸は（１）本明細書に 記載のクローン化相補ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）配列に対するそれらの相同性、およ び（２）その核酸によってコードされるポリペプチドに適用されるＩＬ−４活性 の機能検定により規定される０本明細書において使用する場合、タンパク質また はポリペプチドに関する“ＩＬ−４活性”なる用語は、そのタンパク質またはポ リペプチドがＢ細胞増殖因子（ＢＣＧＦ）活性およびＴ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ ）活性の両方を示すことを意味する。所定の哺乳類の場合、ルー４活性は種特異 的ＴＣＧＦおよびＢＣＧＦ検定により測定される。以下でより詳細に説明するよ うに、ＩＬ−４の特定態様は別のアッセイによってさらに同定される。例えば、 いくつかの形のネズミＩＬ−４は肥満細胞増殖因子（？１ＣＧＦ）活性を示し； いくつかの形のヒトおよびネズミＩＬ−４はともにＩＬ−２のＴＣＧＦ活性を増 強し；いくつかの形のネズミおよびヒトＩＬ−４はあるタイプの細胞におけるＧ Ｍ−ＣＳＦ刺激増殖を増強し；いくつかの形ヒトおよびネズミＩＬ−４はＢ細胞 上のＦｃ−イプシロン受容体発現を誘導することができ；そしていくつかの形の ヒトおよびネズミＩＬ−４はＢ細胞上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）抗 原：すなわちヒトＢ細胞上のクラスｎＤＲ抗原およびマウスＢ細胞上のＩａ抗原 、の発現を誘導することができる。
本発明はその一面がＩＬ−４活性をもつタンパク質を発現し得るｃＤＮＡの発見 およびクローニングに基づいている。本発明のｃＤＮＡクローンにはプラスミド ベクター゛クローン４６”　（またここではｐｃＤ−２Ｆ１−１３やｐｃＤ−４ ６と呼ばれる）および“クローン１２５″（またここではｐｃＤ−１２５と呼ば れる）のヒトｃＤＮＡ挿入物、ならびにプラスミドベクターｐｃＤ−２Ａ−Ｅ３ のマウスｃＤＮＡ挿入物が含まれる。３種のベクターはメリーランド州ロックビ ルのアメリカン・タイプ°・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託番号 ５３３３７　、６７０２９および５３３３０としてそれぞれ寄託された。
本発明は、本発明のｃＤＮＡクローンに事実上相同であり且つＴＬ−４活性を示 すヌクレオチド配列をもつ核酸を含む。本発明の核酸およびタンパク質は、核酸 配列の標準突然変異誘発技術により上記ｃＤＮＡから誘導される。それらはＩＬ −４をコードするメツセンジャーＲＮＡ　（＋ｎＲＮ＾）配列を含むか又はそれ を含むように誘導し得る免疫系誘導細胞株（例えばＴ細胞ハイブリドーマ）から 新たに作ることができ、それらは本発明のｃＤＮＡクローンから誘導されるプロ ーブを用いてＤＮＡまたはＲＮＡの抽出物もしくはライブラリーを検索すること により得られる。
本明細書で用いる“　事実上相同”なる用語は、ヌクレオチド配列が本発明のｃ ＤＮＡクローンから誘導されるハイブリダイゼーションプローブによって検出さ れ得ることを意味する。ＩＬ−４活性をコードする核酸を検出するために必要な 相同性の正確な数値測定は（１）標的核酸に関連した非ＩＬ−４コード配列に対 するプローブの相同性、（２）ハイブリダイゼーション条件の緊縮性、（３）１ 本鎖プローブを使用するか又は２本鎖プローブを使用するか、（４）ＲＮ　Ａプ ローブを使用するか又はＤＮＡプローブを使用するか、（５）その測定がプロー ブの非特異的結合を減らすように行われるか、（６）プローブを検出するために 用いる標識の性質、（７）プローブ中のグアニンおよびシトシン塩基の割合、（ ８）プローブと標的との誤対合の分布、（９）プローブの大きさなどを含めたい くつかの要因により左右される。
好ましくは、本発明のｃＤＮＡから誘導される事実上相同なプローブは単離すべ き配列と少なくとも５０％相同である。より好ましくは、事実上相同なプローブ は単離すべき配列と少なくとも７５〜８０％相同である。最も好ましくは、事実 上相同なプローブは単離すべき配列と少なくとも９０％相同である。
本明細書で用いる“相同“なる用語は２つのヌクレオチド（またはアミノ酸）配 列間の類似性の尺度である。相同は２つの配列（恐らくは等しくない長さのもの ）を整列させた後の対合塩基（またはアミノ酸）の割合すなわち百分率として表 される。“整列”なる用語はＴｉｍｅ　Ｗａｒ　ｓ、５ｔｒｉｎ　Ｅｄｉｔｓ、 ａｎｄ　Ｍａｃｒｏ−ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：　Ｔｈｅ　Ｔｈｅｏｒ　ａｎｄ　Ｐ ｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　Ｓｅ　ｕｅｎｃｅ　Ｃｏｍ　ａｒｉｓｏｎ（アジソンー ウェスレー、リーディング、　？ＩＡ、　１９８３）の第１章にサンコツ（Ｓａ ｎｋｏｆｆ）およびクラスカル（Ｋｒｕｓｋａｌ）によって定義された意味で使 用される。概略的に述べると、２つの配列は最大オーバーラツプをもたらすよう にいずれかの配列に最小限の゛ブランク（ｂｌａｎｋ）”または“ナル（ｎｕｌ ｌ）”　塩基を挿入することにより、２つの配列間の対合塩基（またはアミノ酸 ）の数を最大にすべく整列される。２つの配列が与えられると、それらの相同を コンピュータで算定するためにアルゴリズムが利用可能である：例えばニードル ハム（Ｎｅｅｄｌｅｈａｍ）およびヴアンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）、Ｊ、Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、、Ｖｏｌ、４８．ｐ、４４３〜４５３（１９７０）　、およびサンコ ツおよびクラスカルの上記文献ｐ、２３〜２９を参照されたい。
、また、このような比較を行うための商業サービス、例えばインテリジェネティ クス社（パロアルト、　ＣＡ）を利用をすることもできる。
本発明はまた免疫応答に必要不可欠な種りの細胞に対して広範囲の活性スペクト ルを示す天然哺乳類増殖因子（ポリペプチド）に関する。この種の因子の生産方 法および哺乳類のｉｎｖ　ｉ　ｔｒｏ治療におけるそれらの使用が提供される。
このようなポリペプチドにはＢ細胞、Ｔ細胞および肥満細胞刺激活性を示すこと ができる実質的に純粋な哺乳動物因子が含まれる。
最初に種々のＴ細胞の上清から単離されたこれらの因子には非還元条件で約２０ ｋｄまたは１５ｋｄの分子量を示す天然ポリペプチド、またはこのようなポリペ プチドの活性断片が含まれる。これらの因子は様々な診断および治療目的（特定 抗体の生産を含む）のために単独でまたは他の化合物と共に使用される。
本発明の好適な態様は下記の式Ｉで表されるグリコジル化または非グリコジル化 ヒ）　ＩＬ−４タンパク質および突然変異タンパク質である： メ’Ｉ Ｘ（Ｈｉｓ）　−Ｘ（Ｌｙｓ）　−Ｘ（Ｃｙｓ）　−Ｘ（Ａｓｐ）　−Ｘ（Ｉｌ ｅ）　−Ｘ（Ｔｈｒ）　−Ｘ（Ｌｅｕ）　−Ｘ（Ｇｉｎ）　−Ｘ（Ｇｌｕ）　− Ｘ（Ｉｌｅ）　−Ｘ（工１ｅ）　−Ｘ（Ｉ、ｙｓ）　−Ｘ（’ｒｈｒ）　−Ｘ（ Ｌｅｕ）　−Ｘ（Ａｓｎ）　−Ｘ（Ｓｅｒ）　−Ｘ（Ｌｅｕ）　−Ｘ（Ｔｈｅ） 　−Ｘ（Ｇｌｕ）　−Ｘ（Ｇｉｎ）　−Ｘ（Ｌｙｓ）　−Ｘ（Ｔｈｒ）　−Ｘ（ Ｌｅｕ）　−Ｘ（Ｃｙｓ）　−Ｘ（Ｔｈｒ）　−Ｘ（Ｇｌｕ）　−Ｘ（Ｌｅｕ） 　−Ｘ（Ｔｈｒ）　−Ｘ（Ｖａｌ）　−Ｘ（Ｔｈｒ）　−Ｘ（ＡｓＰ）−Ｘ（Ｉ ｌｅ）−Ｘ（Ｐｈｅ）−Ｘ（Ａｌａ）−Ｘ（Ａｌａ）−Ｘ（Ｓｅｒ）−Ｘ（Ｉｙ Ｓ）　−、Ｘ（ＡＳｎ）　−Ｘ（Ｔｈｒ）　−Ｘ（Ｔｈｒ）　−Ｘ（Ｇｌｕ）　 −Ｘ（ＬｙＳ）　−Ｘ（Ｇｌｕ）　−Ｘ（Ｔｈｒ）　−Ｘ（Ｐｈｅ）　−Ｘ（Ｃ ｙｓ）　−Ｘ（Ａｒｇ）　−Ｘ（Ａｌａ）　−Ｘ−（Ａｌａ）　−Ｘ（Ｔｈｔ） 　−Ｘ（Ｖａｌ）　−Ｘ（Ｌｅｕ）　−Ｘ（Ａｒｇ）　−Ｘ（Ｇｉｎ）　−Ｘ（ Ｐｈｅ）　−Ｘ（Ｔｙｒ）　−Ｘ（Ｓｅｒ）　−’　Ｘ（Ｈｉｓ）　−Ｘ（Ｈｉ ｓ）　−Ｘ（Ｇｌｕ）　−Ｘ（ＬＹＳ）　−Ｘ（Ａｓｐ）　−Ｘ（Ｔｈｒ）　− Ｘ（Ａｒｇ）　−Ｘ（ＣＹＳ）　−Ｘ（Ｌｅｕ）　−Ｘ（ＧＩＹ）　−Ｘ（Ａｌ −ａ）　−Ｘ（Ｔｈｒ）　−Ｘ（Ａｌａ）　−Ｘ（Ｇｉｎ）　−Ｘ（Ｇｉｎ）　 −Ｘ（Ｐｈｅ）　−ｘ（Ｅ（ｉｓ）　−Ｘ（Ａｒｑ）　−Ｘ（Ｈｉｓ）　−Ｘ（ Ｌｙｓｌ　−Ｘ（Ｇｉｎ）　−Ｘ（Ｌｅｕ）　−Ｘ（Ｉｌｅ）　−Ｘ（Ａｒｇ） 　−Ｘ（Ｐｈｅ）　−Ｘ（Ｌｅｕ）　−Ｘ（Ｌｙｓ）　−Ｘ（Ａｒ９）　−Ｘ（ Ｌｅｕ）　−Ｘ（Ａｓｐ）　−Ｘ（Ａｒｇ）　、−Ｘ（ＡＳｎ）　−Ｘ（Ｌｅｕ ）　−Ｘ（Ｔｒｐ）　−Ｘ（Ｇｌｙ）　−Ｘ（Ｌｅｕ）　−Ｘ（Ａｌａ）　−Ｘ （Ｇｌｙ）　−Ｘ（Ｌｅｕ）　−Ｘ（Ａｓｎ）　−Ｘ（Ｓｅｒ）　−Ｘ（Ｃｙｓ ）　−Ｘ（Ｐｒｏ）　−Ｘ（Ｖａｌ）　−Ｘ（Ｌｙｓ）　−Ｘ（Ｇｌｕ）　−Ｘ （Ａｌａ）　−Ｘ（Ａｓｎ）　−Ｘ（Ｇｉｎ）　−Ｘ（Ｓｅｒ）　−Ｘ（Ｔｈｒ ）　−Ｘ（Ｌｅｕ）　−Ｘ（Ｇｌｕ）　−Ｘ（Ａｓｎ）　−Ｘ（Ｐｈｅ）　−Ｘ （Ｌｅｕ）　−Ｘ（Ｇｌｕ）　−Ｘ（Ａｒｇ）　−Ｘ（Ｌｅｕ）　−Ｘ（Ｌｙｓ ）　−Ｘ（Ｔｈｒ）　−Ｘ（工１ｅ）　−Ｘ（Ｍｅヒ）　−Ｘ（Ａｒｇ）　−Ｘ （Ｇｌｕ）　−Ｘ（Ｌｙｓ）　−Ｘ（Ｔｙｒ）　−Ｘ（Ｓｅｔ）　−Ｘ（Ｌｙｓ ）　−Ｘ（Ｃｙｓ）−Ｘ（Ｓｅｒ）−Ｘ（Ｓｅｔ）式中、Ｘ　（Ｘａａ）はアミ ノ酸Ｘａａと同義のアミノ酸群を表す、１つの群に含まれる同義アミノ酸は、そ の群のアミノ酸同士を置換にその分子の生物学的ａ能を保存するのに十分なＬｔ ど類（以した物理化学的性質を持っているニゲランサム（Ｇｒａｎｔｈａｍ）　 ＊アミノ酸の挿入および欠失が生物学的機能を変えることなく上しかも機能的な コンホメーションに重要なアミノ酸（例えばシスティン残基）を除去または置換 しない場合に、アミノ酸の挿入および欠失が可能である：アンフィンセン（Ａｎ ｆ　ｔｎｓｅｎ）　、“タンパク質鎖の折りたたみを支配する原理”、　５ｃｉ ｎｃｅ、Ｖｏｌ、１８１゜ｐ、２２３〜２３０　（１９７３）を参照されたい。
このような欠失および／または挿入によって生じるタンパク質および突然変異タ ンパク質は本発明の範囲に含まれる。式■のタンパク質のアミノ酸残基が数字で 表される場合、その数字はいつでもタンパク質のＮ末端からのものである。
好ましくは、同義アミノ酸群は表１で定義されるものである。
より好ましくは、同義アミノ酸群は表■のそれぞれの列の第２斜線の前に表示さ れるものであり、最も好ましくは同義アミノ酸群は表■のそれぞれの列の第１斜 線の前に表示されるものである。
表■８女′な６　アミノ酸群 アミノ酸　詞１０＝しりｉ匡 Ｓｅｔ　Ｓｅｔ、／Ｔｈｒ、　Ｇｌｙ、　ＡｓｎＡｒｇ　Ａｒｇ、／Ｈｉｓ、　 Ｌｙｓ、／Ｇｌｕ、　ＧｌｎＬｅｕ　Ｌｅｕ、　ｌｉｅ、　Ｍｅｔ、／Ｐｈｅ、 ／Ｖａｌ、ＴｙｒＰｒｏ　Ｐｒｏ、／Ａｌａ、／Ｔｈｒ、　ＧｌｙＴｈｒ　Ｔｈ ｒ＋／Ｐｒｏ、　Ｓｅｒ、　Ａｌａ、　Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、ＧｉｎＡｌａ　Ａｌａ 、／Ｐｒｏ、／Ｇｌｙ、　ＴｈｒＶａｌ　Ｖａｌ、／Ｍｅｔ、　１１ｅ、／Ｔｈ ｅ、　Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌＧｌｙ　Ｇｌｙ、／Ａｌａ、　Ｔｈｒ＋　Ｐｒｏ 、　５ｅｔｌｉｅ　Ｉｌｅ、　Ｍｅｔ、　Ｌｅｕ、／Ｐｈｅ、　Ｖａｌ、／Ｉｌ ｅ、ＴｙｒＰｈｅ　Ｐｈｅ、／Ｍｅｔ、　Ｔｙｒ、　Ｉｌｅ、　Ｌｅｕ、／Ｔｒ ｐ、ＶａｌＴｙｒ　Ｔｙｒ＋／Ｐｈｅ＋／Ｔｒｐ＋　Ｍｅｔ、　１１ｅ、Ｖａｌ 、Ｌｅｕ＋Ｃｙｓ　Ｃｙｓ、　Ｓｅｒ、／Ｔｈｒ Ｈｉｓ　Ｈｉｓ＋／Ｇｌｎ、＾ｒｇ＋／Ｌｙｓ、　Ｇｌｕ、ＴｈｒＧｉｎ　Ｇｌ ｎ、／Ｇｌｕ、旧ｓ、／Ｌｙｓ、　Ａｓｎ＋Ｔｈｒ＋ＡｒｇＡｓｎ　Ａｓｎ、／ Ａｓｐ＋／Ｓｅｒ＋　ＧｌｎＬｙｓ　Ｌｙｓ、／Ａｒｇ、／Ｇｌｕ、　Ｇｌｎ＋ 　）ＩｉｓＡｓｐ　Ａｓｐ＋／Ａｓｎ、／Ｇｌｕ Ｇｌｕ　Ｇ１ｕ＋／Ｇｌｎ、　Ａｓｐ＋　Ｌｙｓ、　Ａｓｎ、　Ｈｉｓ、Ａｒｇ Ｍｅｔ　Ｍｅｔ、　ｌｉｅ、　Ｌｅｕ、／Ｐｈｅ、　Ｖａｌ／本発明は１個所ま たは複数の個所にアミノ酸置換（天然ヒトＩＬ−４のアミノ酸と同義アミノ酸と の置換）をもつ式Ｉのポリペプチドを包含する。“Ｎ重置換”なる用語は、天然 アミノ酸が少なくともＮ個所で同義アミノ酸によって置換された式■のポリペプ チドのサブセットを説明するために用いられる。従って、例えば式Ｉの１重置換 ポリペプチド群は同義アミノ酸の好適な群の場合に５５９種のポリペプチドから 成り、同義アミノ酸のより好適な群の場合に１８９種のポリペプチドから成り、 そして同義アミノ酸の最適な群の場合に５６種ポリペプチドから成る。これらの 数字は天然鎖中のそれぞれの種類のアミノ酸の数にそのアミノ酸の同義アミノ酸 群の数を掛けたものを合計することによって得られた。好ましくは、ヒトＩＬ− ４ポリペプチドの群は弐Ｉの１０重置換ポリペプチドから成り、より好ましくは 式Ｉの３重置換ポリペプチドから成り、そして最も好ましくは式Ｉの１重置換ポ リペプチドから成り、とりわけ第１Ｃ図に示す配列をもつ天然ヒトＩＬ−４ポリ ペプチドが含まれる。
同様に、式ｌのペプチドに関する°“Ｎ重挿入”なる用語は、１〜Ｎ個のアミノ 酸が式■の配列中に挿入されたポリペプチドを表すために用いられる。好ましく は、挿入アミノ酸は挿入の両側に位置するアミノ酸の好適な同義アミノ酸群（表 Ｉ）から選ばれ、より好ましくはそれらは挿入の両側に位置するアミノ酸のより 好適な同義アミノ酸群（表■）から選ばれ、そして最も好ましくはそれらは挿入 の両側に位置するアミノ酸の最適な同義アミノ酸群（表■）から選ばれる。従っ て、例えば１重挿入ペプチド群の１つのサブグループはＮ末端Ｘ（Ｈｉｓ）と隣 接Ｘ（Ｇｌｙ）との間に挿入された。１個のアミノ酸を含む。このサブグループ のアミノ酸を規定する挿入は好ましくはＰｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ。
Ｔｈｒ、　Ｓｅｒ、　Ｇｉｎ、　Ｇｌｕ、　Ａｒｇ、　Ｈｉｓ　およびＬｙｓよ りなる群から選ばれ、より好ましくはそれらはＧＩＹ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ　Ａよび Ａｒｇよりなる群から選ばれ、そして最も好ましくはそれらは旧＄およびｃｌｙ よりなる群から選ばれる。挿入は式■のどの隣接アミノ酸の間でも行うことがで きる。可能な挿入個所は１２８存在し、しかも同一位置での多重挿入が可能であ るので、式Ｉの２重挿入ペプチドは１６３８４サブグループのペプチドをもたら し、それぞれのサブグループの大きさは挿入の両側に位置するアミノ酸の同義ア ミノ酸群の大きさに関係している。
式■のポリペプチドに関する″Ｎ重欠失”なる用語は、１〜Ｎ個のアミノ酸が式 Ｉの配列から欠失されたペプチド群を表すために用いられる。従って、式■の１ 重欠失ポリペプチド群は１２９サブグループのポリペプチドから成り、それぞれ のポリペプチドは１２８個のアミノ酸から成る鎖長（１２Ｂ−＋ｗｅｒ）を有す る。
それぞれのサブグループは好適な、より好適な、および最適な同義アミノ酸群に よって定められるすべての１２８−ｍａｒを包含する。
本発明の好適な態様はさらに好適な、より好適な、および最適な同義アミノ酸群 のための弐Ｉのポリペプチドをコードすることができるヌクレオチド配列または 事実上相同なヌクレオチド配列を含む、より好ましくは、上記ヌクレオチド配列 は好適な、より好適な、および最適な同義アミノ酸群のための式Ｉポリペプチド をコードすることができる。
特に、本発明は天然ヒトルー４（そのアミノ酸配列は第１Ｃ図に示す）、および それをコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。
本明細書の全体を通して、アミノ酸、ヌクレオチド、制限工ンドヌクレアーゼな どを示すために標準的な略号が用いられる：例えばコーン（Ｃｏｈｎ）、”α− アミノ酸の命名法および略号″′。
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　、Ｖｏｌ、１０６＋ｐ、３〜１７（ １９８４）；ウッド（Ｗｏｏｄ）ら、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　：　Ａ　Ｐｒ ｏｂｌｅｍｓ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　、第２版。
（ベンジャミン、メンロパーク、　１９８１）；　およびロバーツ７、シｏ１． ６８．ｐ、２７〜４０（１９７９）を参照されたい。
本発明は医学および／または獣医学疾患を治療するための免疫調節剤の応用に関 連した諸問題に向けられる。とりわけ、本発明は単独で使用するとき有益な効力 をもつ化合物、または他のリンフ才力インおよび免疫系媒介物と協力して有益な 効力を生ずることができる化合物を提供する。
本発明の好適な態様は今や添付の図面（第１〜１９図）を参照することにより説 明されるであろう。
第１Ａ図はネズミＩＬ−４を発現するベクターｐｃＤ−２Ａ−Ｅ３の挿入物のヌ クレオチド配列および推定上のアミノ酸配列を示す。
第１Ｂ図はヒ１−ＩＬ〜４を発現するベクターｐｃＤ−１２５の挿入物のヌクレ オチド配列および推定上のアミノ酸配列を示す。
第１Ｃ図はｐｃＤ−１２５でトランスフェクションされたＣＯ３７サル細胞によ り発現・分泌された精製天然ヒトＩＬ−４のアミノ酸配列を示す。
第２Ａ図はベクターｐｃＤ−２Ａ−Ｅ３の地図であり、その挿入物はネズミＩＬ −４をコードする。
第２Ｂ図はベクターｐｃＤ−２Ａ−Ｅ３の挿入物の制限エンドヌクレアーゼ切断 地図である。
第２Ｃ図はベクターｐｃＤ−４６の地図であり、その挿入物はヒトＩＬ−４をコ ードする。
第２Ｄ図はベクターｐｃＤ−４６の挿入物の制限エンドヌクレアーゼ切断地図で ある。
第３Ａ図はｐｃＤ−２Ａ−Ｅ３でトランスフェクションされたＣＯ５７細胞から の１つの（曲線１）を含む種々の培養上清の（希釈範囲にわたる）相対的なＴＣ ＧＦ活性を示す。
第３Ｂ図はｐｃＤ−２Ａ−Ｅ３でトランスフェクションされたＣ０Ｓ７細胞から の１つの（曲線１）を含む種々の培養上清の（希釈範囲にわたる）相対的なＭＣ ＧＦ活性を示す。
第３Ｃ図はｐｃＤ−２Ａ−Ｅ３でトランスフェクションされたＣＯＳ？細胞（曲 線１　）　、Ｃ１，Ｌｙｌ”　２−　／９細胞（曲線２）、および擬似トランス フェクションされたＣＯ３７細胞（曲線３）からの表示量の上清によって生じた Ｉａ誘導の相対変を示す。
第３Ｄ図はｐｃＤ−２Ａ−Ｅ３でトランスフェクションされたＣＯ５７細胞およ びＴ細胞を除いたマウス牌細胞の種々の対照からの上清によるＩｇＥおよびＩｇ Ｇ、誘導の度合を示す。
第４Ａ図は因子依存性ヒトヘルパーＴ細胞株ＪＬ−ＥＢＶに対する比色定量増殖 検定により測定された、数種のｐｃＤ−１２５トランスフェクション上清および 対照のＴＣＧＦ活性を示す。
第４Ｂ図はＰＨＡ刺激末梢血リンパ球に対する比色定量増殖検定により測定され た、ｐｃＤ−１２５）ランスフエクション上清および対照のＴＣＧＦ活性を示す 。
第４Ｃ図はＰＨＡ刺激末梢血リンパ球によるトリチウム化チミジン取り込みによ り測定されたｐｃＤ−１２５）ランスフェクション上清および対照のＴＣＧＦ活 性を示す。
第５Ａ図はＦｃ−イプシロン受容体を蛍光標識した刺激ヒト扁桃腺Ｂ細胞の対照 集団についての細胞相対数対蛍光強度のヒストグラムである。
第５Ｂ図はｐｃＤ−１２５でトランスフェクションされたＣＯ５７細胞からの０ ．１χ上清より成る培地にさらした刺激ヒト扁桃腺Ｂ細胞集団（そのＦｃ−イプ シロン受容体を蛍光標識したもの）についての細胞相対数対蛍光強度のヒストグ ラムである。
第５Ｃ図はｐｃＤ−１２５でトランスフェクションされたＣＯ５７細胞からの１ ％上滑より成る培地にさらした刺激ヒト扁桃腺Ｂ細胞集団（そのＦｃ−イプシロ ン受容体を蛍光標識したもの）についての細胞相対数対蛍光強度のヒストグラム である。
第５Ｄ図はｐｃＤ−１２５でトランスフェクションされたＣ０Ｓ７細胞からの１ ０％上清より成る培地にさらした刺激ヒト扁桃腺Ｂ細胞集団（そのＦｃ−イプシ ロン受容体を蛍光標識したもの）についての細胞相対数対蛍光強度のヒストグラ ムである。
第６Ａ図は天然または突、然変異ＩＬ−４を大腸菌内で発現させるのに有用な合 成ヒトＩＬ−４遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
第６Ｂ図はプラスミドｐＵｃ１８に挿入された合成ヒトＩＬ−４遺伝子の制限エ ンドヌクレアーゼ切断地図を示す。
第７Ａ−７Ｆ図はそれぞれ合成ヒ目Ｌ−４遺伝子を構築するために使用される２ 本鎖ＤＮＡフラグメントＩＡ／Ｂ〜６Ａ／Ｂを示す。
第８図は大腸菌発現ベクターＴＡＣ−ＲＢＳ中のイニシェーターＡＴＧコドンに 隣接するヌクレオチド配列を示す。その配列はＥｃｏＲＩ制限部位から始まり、 ｌｌｉｎｄｌｌｉ部位で終わる。１６ＳリボソームＲＮＡの３′末端に相補性を 示すリポソーム結合配列（ＲＢＳ）およびＡＴＧイニシェークーコドンには下線 が施されている。
第９図は裸リンパ球症候群の患者から誘導される細胞集団についての細胞相対数 対蛍光強度のヒストグラムである。これらの細胞は蛍光標識抗ＤＲモノクローナ ル抗体で染色した。
第１０図はＣ−４カラムでの逆相ＨＰＬＣによるヒトＩＬ−４の最終精製工程に おける２１５ｎｍ　＠収プロフィールである。
第１１図はヒトＩＬ−４ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＥＢＶ−１７８の作製地図 である。
第１２図はプラスミドＴＲＰＣＩＩの作製地図である。
第１３Ａ図はプラスミドｐＭＦ−アルファ８の作製地図である。
第１３Ｂ図は天然ヒ）　ＩＬ−４および種々のその突然変異タンパク質を発現す る酵母培養物からの数種のトランスフェクション上清のＴＣＧＦ活性を示す。
第１４図は因子依存性細胞株：　ＭＣ／９肥満細胞（ＩＡ）、ＤＸ−２肥満細胞 （ＩＢ）、ＮＦＳ−６０細胞（ＩＣ）およびＨＴ２　Ｔ細胞（ＩＤ）の増殖曲線 を示す。５Ｘ１０３個の細胞をいろいろな濃度の０１．１上清（中実の円）ＩＬ −２”　（中実の正方形）　、ＩＬ−３”　（中空の円”）　、ＧＭ−Ｃ５Ｆ” 　（中空の三角形）　、ＩＦＮ−７Ｒ（中実の三角形）、またはＰ３８８Ｄ１上 清（中空のひし形）の存在下に培養した。ＭＣ／９細胞（ＩＡ）はまたいろいろ な濃度の精製ＩＬ−３（中実の円）、または２００単位のＩＬ−２”（中実の正 方形）　、ＧＭ−Ｃ３Ｆ”　（中空の三角形）、ＩＦＮ−ｒ”　（中実の三角形 ）またはＰ３８８Ｄ１上清（中空のひし形）と混合したＩＬ−３”の存在下で培 養した。増殖因子活性は比色定量検定により２４時間後に測定した。５７０ｎｍ 　（基準６３０ｎｏ＋　）での吸光度はダイナテク・マイクロ・エリザ・リーダ ーを使って測定した。
第１５図はＣ１，１上滑のＦＰＬｃカチオン交換クロマトグラフィーを示す。濃 縮上滑７ｊｌｌ！（タンパク質３５■）は５０ｎＭリン酸Ｎａ、ＩＯＩＭＥＤＴ 八、ｐＨ７，０中で透析しく７．８ｍＳ／印）、同じ緩衝液（緩衝液Ａ）で平衡 化したファーマシア・モノＳカラム（０，５Ｘ５　ｃｍ）に加えた。緩衝液Ｂ　 ＝Ａ＋　Ｉ　Ｍ　ＮａＣ＋　、溶出条件：流速０．５Ｉｄ１分；０．５−／分画 ；４０分で０〜４０％Ｂ、１０分で４０〜１００χＢ、各分画のアリコートはＮ ＦＳ−６０（ＩＬ−３，中実の円）　、ＨＴ２（ＴＣＧＦ、中空の円）およびＭ Ｃ／９　（？ＩＣＧＦ）細胞に対する増殖活性について検定した。　ＭＣ／９応 答は示されていない一矢印はＭＣ／９増殖レベルが０１．１上滑のそれらに到達 した位置を示す。
第１６Ａ図はＩＬ−３を除去したＣ１．１上清の逆相Ｃ８クロマトグラフィーを 示す。モノＳカラムに３回通過させた０、１ｘＴＦＡ中の上滑（分画５９〜６１ ．第１５図）１００μｌはファーマシアＣ８逆相カラム（０，５Ｘ２Ω）に装填 した。緩衝液Ａ＝Ｈ，０中の０．１χＴＦＡ　ｉ緩衝液Ｂ＝アセトニトリル中の ０．１χＴＦ＾。溶出条件＝０．５　ｄ／分；０．５　ｄ／分画；４０分でＯ〜 ２５％Ｂ、５０分で２５〜６０％Ｂ、４分で６０〜１００χＢ０各分画のアリコ ートはＮＦＳ−６０（ＩＬ−３，中実の円）、ＨＴ２（ＴＣＧＦ、中空の円）お よびＭＣ／９細胞（ＭＣＧＦ、中実の三角形）に対する増殖活性について検定し た。矢印は各分画に飽和レベルのＩＬ−３”を添加後に０１．１上清と類似のＭ Ｃ／９増殖レベルを生じた、ピークＴＣＧＦ活性を含む分画を示す。
第１６Ｂ図はＧＫ１５−１ネズミＴ細胞上清の逆相Ｃ８クロマトグラフィーを示 す、０．１１ＴＦＡ中の濃縮ＧＫ１５−１上清２■（０，５ｄ）はファーマシア Ｃ８逆相カラムに加え、上記のように溶出した。各分画のアリコートはＨＴ２細 胞（中空の円）に対するＴＣＧＦ活性について検定した。矢印はネズミＩＬ−２ ”が同一条件で溶出した位置を示す。挿入：同一プレートで直接比較されたＣ１ ．１　（中実の円）およびＩＬ−２１１（中実の正方形）およびＧＫ１５−１上 清（中空の円）のＴＣＧＦ活性の滴定。
第１７図は逆相カラムからの部分精製因子（ＲＰ因子）のＭＣＧＦおよびＴＣＧ Ｆ活性を示す。増殖は２４時間の培養期間の経過後の〔３Ｈ〕−チミジン取り込 みにより測定した。ＭＣ／９肥満細胞およびＨＴ２Ｔ細胞はいろいろな濃度の０ １．１上清（中実の円）、ＩＬ−３’（中空の円）　、ＴＬ−２”　（中空の三 角形）　、ＲＰ因子（中空の正方形）および２００単位のＩＬ−３”の存在下で のＲＰ因子の希釈物（中実の正方形）または飽和レベルのＲＰ因子の存在下での ＩＬ−２の希釈物（中実の三角形）と共に培養した。
第１８図はＣ１，１上滑のクロマトフオーカシングを示す。２５ｎＭビスートリ ス、ｐＨ７，１中の上清１．５　ｄ（３５■）はファーマシア・εノＰカラム（ ０，５Ｘ２０ＣＩ１１）に加え、ポリバッフｙ　−７４（１：　１０）　ｐＨ４ ，０を用いて流速０．５　ｔｄ／分、１−／分画で溶出した。各分画のアリコー トはＮＦＳ−６０（ＩＬ−３，中空の円）　、ＨＴ２　（ＴＣＧＦ、中実の円） およびＭＣ／９　（ＭＣＧＦ、図示せず、但しピークＭＣＧＦ活性は矢印で示す ）に対する増殖活性について検定した。ＴＣＧＦピーク（分画１２．　ｐＩ＝６ ．２　）は最小ＩＬ−３活性と一致し、ＭＣＧＦ増殖レベルは矢印で示したとこ ろで最も高い。
第１９図はＣ１，１上清および分精製？ＩＣＧＦ／ＴＣＧＦの５ＤＳ−ＰＡＧＥ を示す。
Ａ）　非分画化上清の非還元５Ｏ５−ＰＡＧＥ、　５０ｍＭ　ＤＴＴでの先行還 元（６０″Ｃで５分間）はＴＣＧＦピークをわずかに高分子量（２１ｋｄおよび １６ｋｄ）へ移し、これは活性の急激な消失を伴う。
Ｂ）　カチオン交換クロマトグラフィーからのピーク？ＩＣＧＦ／ＴＣＧＦ分画 （分画５９〜６１．第１５図）の非還元５ＯＳ−ＰＡＧＥ、５０ｍＭ　ＤＴＴで の先行還元（６０°Ｃで５分間）はＭＣＧＦおよびＴＣＧＦピークをわずかに高 分子量（２１ｋｄおよび１６ｋｄ）へ移し、これは活性の急激な消失を伴う。矢 印は飽和量のＩＬ−３の添加によりＭＣＧＦ活性が上清レベルにまで高まる分画 のみを示す：　Ｉｔ−３（中空の円）　、ＴＣＧＦ（中実の円）　、ＭＣＧＦ　 （中空の三角形）。
本発明はｒＬ−４活性を示し且つ標準的なタンパク質工学技術を用いてここに記 載のＩＬ−４ポリペプチドから誘導し得るグリコジル化または非グリコジル化咄 乳動物ポリペプチドを包含する本発明はまた本発明ポリペプチドをコードする核 酸配列を含み、その核酸配列は本発明のｃＤＮＡクローンと事実上相同である。
最後に、本発明はここに記載のヌクレオチド配列を使用する本発明のグリコジル 化または非グリコジル化ポリペプチドの製法、ならびに本発明ポリペプチドの使 用方法を包含する。
本発明のポリペプチドおよび核酸を製造、使用および同定する技術は以下で一般 的に説明される。その後、−Ｊ’Ｇ技術を特定の細胞型、ベクター、試薬などと 共に使用するいくつかの特定実施例が提供される。まず初めに、天然源からのそ れらの単離を簡潔に説明するであろう。
これらのポリペプチドは容易に入手しうる細胞源の上清から見かけ上物−になる まで精製することができ、こうして種々の治療用途または他の用途を可能にすべ く純粋な形で経済的に製造することができる。
これらのポリペプチドはＢ細胞−１Ｔ細胞−および肥満細胞−刺激活性を示すポ リペプチドを含むことにより特徴づけられる。ある種の天然型ポリペプチドは非 還元条件下で約２０ｋｄおよび１５ｋｄ、そして還元条件で約２１ｋｄおよび１ ６ｋｄの５ＤＳ−ＰＡＧＥ上での分子量を示す、実質的に純粋な形の本発明ポリ ペプチドを含む組成物はクロマトフオーカシングで約６．２の等電点（ｐＩ）を 示す。
この増殖因子は極めて低濃度（例えばｌｎｇ／ｒｄ以下）で顕著な活性を示し、 非常に効力のある物質である。このポリペプチドはカチオン交換クロマトグラフ ィーまたは逆相カラムからの特定溶出条件を使用することにより、自然界でＴ細 胞によって生産されるタンパク質（例えばＩＬ−２，ＩＬ−３、ＧＭ−Ｃ３Ｆお よびＩＦＮ−γ）およびホルモン類から区別することができる。
ネズミの場合では本発明のいくつかのポリペプチドはＩＬ−３依存性肥満細胞株 のようなある種の細胞を低レベルで増殖させるにすぎないが、第２因子（例えば ＩＬ−３）の存在下ではこの種の細胞（例えば肥満細胞）の増殖を相乗的に高め る。このポリペプチドは数種のＴ細胞株の増殖を刺激するが、一般に精製ＩＬ− ２よりは増殖の度合が劣る。またこの種のポリペプチドは休止Ｂ細胞上でのＩａ 全発現誘導し、またＢＳＦ−１と同様にＢ細胞によるＩｇＧ、およびＩｇＥ発現 を高めることができる。これらの活性は多数の性化学的分函化にもかかわらず分 画不能である。しかしながら大部分の活性は還元後、例えばＳＯ５の存在下で破 壊される。
これらの因子はいろいろな方法で多数の天然源から得られる１つの適当な源はこ のようなポリペプチドを生産する多数のＴ細胞株のうちのいずれかである。１つ のこのようなＴ細胞株はＣ５７ＧＬ６マウス〔ネーブル（Ｎａｂｌｅ）　ら、　 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ。
７８：１１５７〜１１６Ｈ１９８１）を参照〕から誘導され、この細胞株は修飾 補充ＤＭＥ　（ネーブルら、Ｃｅ１１，２３：１９〜２８（１９８２）を参照〕 中に維持される。初めにＣ１，Ｌｙｌ”　２−　／９と呼ばれたこの細胞株はア メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託番号ＣＲＬ８１７９として 寄託された。これらのポリペプチドの他の適当な細胞源には、ヒト抹消血リンパ 球およびよく知られたＴ細胞源（例えば扁桃腺、肺臓など）のいずれかのような 、そのポリペプチドに対する種々の抗体を分泌するほとんど全ての細胞が含まれ る。
このような細胞源からの上清または、いくつかの場合には破壊細胞からの液体は 、本発明タンパク質を分離するために多種多様の公知精製法に付される。好まし くは、精製法は高い純度を確保するために組合せて使用される。一般的に、精製 はゲル濾過クロマトグラフィー、ＳＰカチオン交換クロマトグラフィー、逆相ク ロマトグラフィー、官能基特異的クロマトグラフィー（例えばヘパリンセファ０ −スによるクロマトグラフィー）、または有効なタンパク質の分画化をもたらす 他の慣用分離法を使用するだろう。高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、 等電点フォーカシングおよび５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動も使用す ることができる。
例えば、適当な細胞株からの上清は初めに強力チオン交換クロマトグラフィーに より分画化される。一般に、本発明のポリペプチドはカラムに結合されたままで あり、一方負荷タンパク質の約９８％は通り抜ける。残存する結合タンパク質は 塩勾配をを用いて溶離しうる。本発明の１つの態様では、塩化ナトリウム勾配が 約０．１９Ｍで本発明ポリペプチドを遊離させた。この分画化を２回以上（主に 残留ＩＬ−３を除くために）繰り返すと、約９５％以上の純度が得られた。その 後、この物質は順次ヘパリンセファロースおよび逆相（Ｃ４またはＣ８）クロマ トグラフィーで分画化される。後者の場合に、これらのポリペプチドは４２％ア セトニトリルで溶離した。プールしたこれらの分画は本発明ポリペプチドを極め て高純度で、本質的に均一（銀染色５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で約２０ｋｄの単一バン ド）に含有する。この精製物質はそれが天然形で存在するときよりも少な（とも ６５０００倍純粋である。
これらのポリペプチドは抗体生産用の抗原として使用され、続いてその抗体は抗 イデイオタイプ抗体生産用の抗原として使用される。ポリクロナール抗体または モノクロナール抗体が慣用方法に従って作られる。これらのポリペプチドまたは その断片（一般に断片は少なくとも約１５個のアミノ酸をもつ）は単独で使用し うるが、好ましくは免疫系を活性化するアジュバントまたは抗原に結合もしくは 架橋される。血清アルブミン、キーホール・リンペット（Ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉ ｍｐｅｔ）、ヘモシアニン、グロブリンなどの種々の抗原が使用される。アジュ バントをポリペプチドに架橋させるためには、グルタルアルデヒド、マレイミド 、安息香酸、ジアゾ安息香酸のような種々の技法が利用される。
アジュバントにはフロインドアジュバント、水酸化アルミニウムなどが含まれる 。通常の量の抗原は適当な宿主に注射され、その後１回またはそれ以上の２次免 疫注射が２〜４週間おきに行われる。モノクロナール抗体を使用する場合、−ｍ にマウスに１次および２次免疫注射を行い、肺臓を摘出し、その後その肺細胞を 慣用技法に従って適当な融合パートナ−と融合させる。
例えば、ガルフレ（Ｇａｌｆｒｅ）ら、　Ｎａｔｕｒｅ、２６６：５５０（１９ ７７）；ケネッ’ｔ−（Ｋｅｎｎｅｔｔ）　ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏ　ｉｃｓ 　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ−蛙■ｙ、旦ニア７（１９ ７８）　；および米国特許第４３８１２９２号、同第４３６３７９９号を参照さ れたい。しかしながら、特殊な目的のために他の哺乳類（例えば霊長目動物）も 使用され、例えばヒ）Ｆｃ鎖をもつ抗体を生産するためにヒトが使用される。
ポリペプチドはそのポリペプチドの診断において単独で、または抗体と組合せて 使用される。診断アッセイで使用するために、いずれか一方または両方が標識さ れるか、あるいは標識されない。これらのポリペプチドまたは抗体を直接または 間接に種々の標識（例えば酵素、放射性核種、蛍光体、基質、補酵素、磁性粒子 のような粒子など）に結合させることを含めた多くの診断アッセイが文献中に記 載されている。これらのアッセイの例としては、例えば、米国特許第３８１７８ ３７号、同第３８５０７５２号、同第４１７４３８４号、同第４１７７４３７号 および同第４３７４９２５号を参照されたい。
種々のアッセイは任意に均質イムノアッセイと不均質イムノアッセイに分けられ 、その区分はポリペプチドとその抗体との複合体を特異的結合対の非結合量子か ら分離しなければならないかどうかに基づいている。種々のアッセイはＥｌ、　 ＥＬＩＳＡ、Ｒ１八、均質ＥＴＡ　、トントープロット、ウェスターンなどと呼 ばれている。
これらのポリペプチドに対する抗体は、これらのポリペプチドのエピトープ部位 と競合するエピトープ部位をもつ競合的抗原として役立ちうる抗イデイオタイプ を作るために、抗原として単独で使用される。従って、これらの抗イデイオタイ プは腫瘍抑制剤として、本発明ポリペプチドの代替物として、または本発明ポリ ペプチドの拮抗物質として使用することができる。
これらのポリペプチドは天然源から誘導される自然界に存在するポリペプチド、 ならびに結合特異性およびＢ細胞または肥満細胞刺激活性のような生理学的特性 を共有する自然界に存在しないポリペプチドの一群を形成する。種または源の間 の小さな差異は、当分野で習熟した者には明らかなように、精製プロトコルにお いて何らかの変更を必要とするかもしれない、またこれらのポリペプチドはその アミノ酸配列を決定し、その後公知技術に従ってポリペプチド断片を合成するこ とができる。例えば、バラニー　（Ｂａｒａｎｙ）およびメリーフィールド（Ｍ ｅｒｒｉｆ　１ｅｌｄ）Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈ ｅｓｉｓ、“ペプチド、分析・合成・生物学”、特別なペプチド合成法、パート Ａ、　Ｖｏｌ、２．グロス（Ｇｒｏｓｓ）およびメーレンホッフｙ　（Ｍｅｒｅ ｎｈｏｆｅｒ）ｍ集、アカデミツクプレス、ニューヨーク、　１９８０．　ｐ、 １〜２８４を参照されたい。
本発明ポリペプチドはいろいろな方法で有用性を見出せるであろう。例えば、こ れらのポリペプチドは培養下で又はｉｎνｉｖｏ　でＴ細胞および肥満細胞の増 殖を誘発することができる。
先に述べたように、肥満細胞はヘパリン、ヒスタミン、プロスタグランジンおよ び他の生理学的に重要な物質の大切な供給源である。同様に、この増殖因子はＢ 細胞およびＴ細胞、特に免疫系において有用なタンパク質（例えばリンフ才力イ ンおよび免疫グロブリン）を分泌することが知られているもの、を刺激するため に使用される。一般に、この増殖因子は細胞培養物に添加される培地中に混入さ れるであろう。その因子の適当な濃度は細胞株の型により変化しうるが、一般に 約０．１　μｇ／ｄ〜約１■／ｄ、より好ましくは約ｌｕｇ／ｒｎＲ〜約ｌＯμ ｇ／−で培地中に存在するであろう。本発明増殖因子の使用は、所望の細胞株を 維持するための支持細胞（ｆｅｅｄｅｒ　ｃｅｌｌ）の必要性を排除することが でき、その結果その細胞株からの生産物の純度を実質的に高めることができる。
また、本発明のポリペプチドは各種の免疫不全症を治療するために、あるいは自 然の免疫応答を増強させるために、１ｎｖｉν０での用途を見出せるであろう。
例えば、この種のポリペプチドはＢ細胞、Ｔ細胞および肥満細胞の成熟および／ または増殖を刺激し、それにより感染症に対する動物の感受性を低下させること により、感染症の治療または防御に役立つであろう。
１、ＩＬ−４ｃＤＮＡの　たな８周１ ｃＤＮＡの新たな調製およびクローニング、ならびにｃＤＮＡライブラリーの構 成のために現在では種々の方法がある。たとえば、最近の総説が下記に示されて いる。ドハーティ、”ｃＤＮＡのクローニングおよび発現”、ゴッテスマン績、 圀ヱ坦盗這仮７．１０章（ジョン・ワイリイ・アンド・サンズ、ニューヨーク、 　１９８５）；およびブランディスら、“’　ｃＤＮＡライブラリーの調製およ び特異的遺伝子配列の検出”、セトロウら魂、遺伝土工望、８巻。
２９９−３１６頁（プレナム・プレス、ニューヨーク、　１９８６）。
たとえば、目的活性を示すポリペプチドを産生ずる細胞（たとえば形質転換され ていないヒ）Ｔ細胞源）から総量ＲＮＡを抽出する〔たとえばニス・バーガーら 、バイオケミストリー１８：５１４３−５１４９　（１９７９〕）　、二重鎖Ｄ ＮＡはこの総量ｉ？ＮＡから、プライマー開始により逆転写して（アイ・ベルメ ・ビオヘミ・ビオフィシ・アクタ・　（旦匹閃ム肛並ｈｈ紅田）、４７３巻、　 １−３８頁（１９７７）　）　、まず各ｍＲＮＡ配列の相補体を作成し、次いで 第２鎖合成を開始することにより（エッチ・ランドら、ヌクレイツク・アシッヅ ・リサ、、　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）、９：２２５１−２２ ６６（１９８１）　）構成される。次いでｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを適切なプラスミドま たはバクテリオファージベクターに（エフ・ルージョンら、ヌクレイツク・アシ ッヅ・リサ＋ｌ　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）＋２，２３６５− ２３７８　（１９７５）またはジー・シェラ−ら、ディベ・バイオ口・（［ｌｅ ｖ、Ｂｉｏｌ、）　８６．４３８−４４７　（１９８１）　）　、相補的ホモポ リマーチイルを介して（ニー・エフストラチアジスら、　−ｂｔ３１０，５７１ −５８５（１９７７）　）または適宜な制限部位を含むリンカ−セグメントによ り作られた粘着末端を介して（マニアチスら、モレキュラークローニング：　験 室の　、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、ニューヨーク、　１ ９８２）結合させ、次いで適切な宿主を形質転換することによってクローニング しうる。
（一般的にはニー・エフストラチアジスおよびエル・ビラーコルマロフ、“二重 鎖ｃＤＮＡのクローニング、ジエイ・セトロウおよびニー・ホレンダー（編者） 、１旦王エヱ、１巻、プレナム・パブリッシング社、ニューヨーク、米国（１９ Ｂ２）を参照されたい、） 目的とするポリペプチドをコードする好ましいｍＲＮＡ源はそれらの上層液がＢ 細胞、Ｔ細胞および／またはマスト細胞に対する刺激活性、あるいは本発明のポ リペプチドに付随する他の活性を含む細胞である。このような系列の１つはマウ スＴ細胞系列Ｃ１，Ｌｙｌ”　２−　／９（Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，受理番号ＣＲＬ８ １７９）である（ジー・ナーベルら、ネイチャー２９１　：３３２−３３４　（ １９８１）。一般に、適切なＴ細胞を各種の供給源、たとえば哺乳動物（たとえ ばヒト）、肺臓、扁桃腺および末梢血から得ることができる。Ｔ細胞クローン、 たとえば末梢血Ｔリンパ球から単離されたものも使用できる（　疫　における　 六論　９編者、エッチ・フォノ・デーマーおよびブイ・ハーフ；０章：　“′ヒ トＴ細胞クローン”、８巻、　２４３−３３３　；エルスフィール・サイエンス ・パブリッシャーズ、ニューヨーク、（１９８５））。
これらの細胞によりＩＬ−４をコードしうるｍＲＮＡが産生されることは、抽出 されたｍＲＮＡをゼノプス・レビスーΩ旦那２Ｊａｅｖ±５）（７）卵母細胞に マイクロインジェクションすることにより確認できされ、−］’Ｇ的には下記に 示されている。コールマンら、　“ゼノプス・レビスのの卵母細胞からの蛋白質 の排出“田、１７巻。
５１７−５２６頁（１９７９）　ｉおよびマニアチスら１分３ｊユ≧−と乙久： 実験室の手引き、　３５０−３５２頁（コールド・スプリング・ハーバ−・ラボ ラトリ−、ニューヨーク、　１９８２）。
目的とするＩＬ−４をコードするｍＲＮＡが総量ＲＮＡのうちのきわめて小さな 画分をなす場合は、目的とするｃＤＮへクローンを検出するためのスクリーニン グ法を実用的なものにするために両分濃度を高める工程が必要になるであろう、 この種の方法は当技術分野で標準的であり、後記の具体的ならびに幾つかの雑文 および参考文献に示されている。たとえばマニアチスら、２２５〜２２８頁、前 掲；サグズら、プロシ・ナショナル・アカデ・サイ、。
（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）＋７８巻、　６６１３−６６１７ 頁（１９８１）　；ハーネスら、プロシ・ナショナル・アカデ・サイ、＋　（Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。
Ｓ０ユ）、７８巻、　２２５３−２２５７頁（１９８１）　；ディビスら、プロ シ・ナショナル・アカデ・サイ、＋　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ 、）、８１巻、２１９４−２１９８頁（１９８４）。
ＩＬ−４ｃＤＮＡを新たに製造するための好ましい方法はオカヤマおよびバーブ （モレ・セル・バイオ口・（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）、２巻、１６１− １７０頁（１９８２）　；および３巻、２８０−２８９頁（１９８３）により開 発された、ｐｃＤ発゛現系におけるｃＤＮＡの機能的発現に依存し、これはファ ルマシアにュージャージー州、ビスカタウエイ）から入手できる。ｐｃＤ発現ベ クターはＳν４０初期プロモーター、後期スプライシングジャンクション、およ び複製原点を含む。このベクターは四〇プラスミドの複製に関するＴ抗原を提供 するＣＯ５７モンキー細胞においてｃＤＮＡ挿入物の発現を可能にする。
ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングにはプラスミドＤＮＡのプールをＤＥＡ Ｅ−デキストランの使用によりＣ０Ｓ７細胞中へトランスフェクションすること がふくまれる。リンフ才力イン（特にＩＬ−４，）は分泌蛋白質であるので、ト ランスフェクションした細胞から得た上層液を数日間インキュベートしたのち生 物活性につきアッセイすることができる。陽性のプールをさらに分割して、トラ ンスフェクション後に生物活性を与える単−ｃＤＮＡりローンを固定する。
要約するとオカヤマおよびバーブの発現ベクターは下記の構成をもつ。ＳＶ４０ 初期プロモーター領域を含むＫｐｎＬ　Ｉ消化ｐＢＲ３２２プラスミドの突出鎖 に結合したポリデオキシチミジル酸（オリゴｄＴ）テイルにポリアデニル化ｍＲ ＮＡがアニールしている。すなわちベクター全体がｃＤＮＡ合成のプライマーと して作用する。
ｃＤＮＡ合成後に３′−ボリデオキシシチジレート（オリゴｄＣ）テイルを結合 させ、次いで…ｎｄｎｌ消化し、これによりオリゴｄＣテイルのうち１個が結合 したＳＶ４０　ＤＮＡの断片が切り取られる（唯一のでＨ４ｎｄ１１１部位にお いて）。ＳＶ４０初期プロモーターは無傷のまま残り、挿入物の偶発生で）Ｉｉ ｎｄＩ［Ｉ部位が受ける影響は最小である（ハイブリッドｃＤＮＡ／ＲＮＡはで 監ｎｄＩ［Ｉ消化に対して抵抗生であるため）。別個に構成された、３′−ポリ グアニジル化（オリゴｄＧ）テイルをもつＨｉｎｄＩ［［断片を、で…ｎｄＩ［ ［消化により残された粘着末端にアニールする。このベクターを環化し、大腸菌 ＲＮアーゼＨ，ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＤＮＡ　リガーゼで処理し、ＲＮＡ 鎖をＤＮＡで置換する。これらのベクターを大腸菌にクローニングして、ｃＤＮ Ａライブラリーを形成する。ＳＶ４０由来の要素はベクターを真核細胞において も原核細胞、特に哺乳動物細胞、たとえばＣＯＳ？モンキー細胞またはチャイニ ーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞においても発現可能にする。
オカヤマ／バーグプラスミドベクターにおけるｃＤＮＡライブラリーが完成する と、ｃＤＮＡクローンを採取し、ランダムプールを目的のｃＤＮＡの存在につい て、標準的方法、たとえばハイブリッド選択、発現生成物における抗原決定因子 の検出、および／または機能アッセイにより調べる。次いで陽性のプールを、誘 導されたＴ細胞系列から得たｃＤＮＡでプローブ検出する。次いで陽性のプロー ブ検出プールを個々のクローンに分け、さらに適切な宿主（たとえば哺乳動物培 養細胞）中へトランスフェクションし宿主上層液を活性につきアッセイすること により試験する。
■１本本発明ＤＮＡから誘導されたハイブリダイゼーションプローブによるＩＬ −４ｃＤＮＡの調製 ここに開示されたｃＤＮＡをプローブとして使用し、ＩＬ−４コード化ヌクレオ チドの新たな単離およびクローニングの代わりとして異なる細胞型における相同 配列を同定することができる。標準法が用いられる。たとえばベルブら、“フィ ルターハイブリダイゼーション法によるマルチジーン　ファミリーの単離および 相同体の決定”、メソッズ・イン・エンサイモロジー。１ｏＯ巻、　２６６−２ ８５頁（１９８３）　；およびカラハンら、′マウス乳腺腫瘍ウィルスゲノムに 関連するヒトＤＮＡ配列の検出およびクローニングパプロシ・ナショナル・アカ デ・サイ、、（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）、７９巻、　５５０ ３−５５０７頁（１９８２）、基本的には本発明のｃＤＮＡを用いて、ＩＬ−４ 産生が推定される細胞型のゲノムまたはｃＤＮＡライブラリー（同様に標準法に より構成）を低いハイブリダイゼーションストリンジエンシーにおいてスクリー ニングするためのプローブを構成する（標準法による；たとえばマニアチスら。
前掲文献を参照されたい）。標準スクリーニング法を用いる。
たとえばグリュンシュタインら、プロシ・ナショナル・アヵデ・サイ、、（Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）、７２巻、３９６１−３９６５頁（１９ ７５）　；またはベントンら、サイエンス、１９６巻、　１８０−１８３頁（１ ９７７）　。
のちにより詳細に記述するように、ヒトＩＬ−４をネズミＩＬ−４プローブによ り単離した。後述の分析によりヒトｃＤＮＡとマウスｃＤＮＡの選ばれた領域間 に約７０χの相同性が示された。マウスとヒトの進化の差を仮定すると、大部分 （すべてではなくても）哺乳動物ＩＬ−４遺伝子を本発明のｃＤＮＡ一種または ２種以上から構成されたプローブにより検出しうると考えられる。ウィルソンら 、′生化学的進化”、アナ・レビ・バイオケミ・（Ａｎｎ、Ｒｅｖ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、４６巻、　５７３−６３９頁（１９７７）　；キムラ、′ 分子進化の中性理論”９１１章、ナイおよびケーン績　伝　および−白　の准匙 ユサイナウエル・アソシエーツ、マサチュセソッ州、サンダーランド、　１９８ ３）。
ＩＩ［、Ｗ亘叉エヱ茎スｌズ懲Ｉ夛体ＩＬ−４，の調製天然蛋白質について核酸 配列および／またはアミノ酸配列がめられると、天然配列において実質上いかな る突然変異をも得るために各種方法を用いることができる。ジョートルはサイエ ンス、２２９巻、　１１９３−１２０１頁（１９８５）に、本発明に通用できる 核酸突然変異誘発法につき概説している。好ましくは天然ＩＬ−４゜の突然変異 体、すなわちＩＬ−４ムテイン（ｍｕｔｅｉｎ）が部位特異性オリゴヌクレオチ ド指向性突然変異誘発、たとえばシラーおよびスミス、メソッズ・イン・エンサ イモロジー。１００巻、４６８−５００頁（１９８３）　；マークら、米国特許 第４，５１８，５８４号明細書。
“ヒト組換インターロイキン−２ムティンパにより、あるいはいわゆる゛カセッ ト突然変異誘発、ウェルズら、ジーン、３４巻、３１５−３２３頁（１９８５） 　：およびエステルら、サイエンス、２３３巻。
６５９−６６３真（１９８６）により得られる。以下の節ではエステルら（上記 ）ガムティンの識別に用いた表記法に従い、−最北する。
たとえば“ヒトＩＬ−４ムティンＬｅｕ””　（または天然蛋白質が状況から理 解される場合は簡単に’ＬｅｕＩＩ！　ＩＩ　）はそのアミノ酸配列がＮ末端に 関して８２の位置以外は天然蛋白質のものと等しいポリペプチドを示す。この位 置において、ＰｈｅがＬｅｕにより置換されている。２以上の置換も同様に指示 できる。たとえば位置８２のＰｈｅがＬｅｕにより、位置１１１の八ｓｎがＡｓ ｐにより置換されているムティンはヒトＩＬ−４ムティン（１ｅｕ＠２　、　Ａ ｓｐＩｌ＋）　と呼ばれる。欠失は“Δ′３”により示される。たとえば位置７ １のＧｉｎを欠如するムティンはヒトＩＬ−４ムティンΔ月と呼ばれる。
挿入はｌ５（Ｘａａ）″により示される。たとえば位置７１のＧｌｎの後ろにＬ ｅｕが挿入されたムティンはヒトＩＬ〜４ムティンＩｓ”　（Ｌｅｕ）と呼ばれ る。従ってヒトＩＬ−４ムティン（Ｓｅｔ”＋　Δ”、ＩＳ”（Ｇｌｙ））は位 置１３のＴｈｒをＳｅｒによって交換し、位置７１のＧｌｎを欠失させ、かつ位 置９４のＡｌａの直後にＧｌｙを挿入することにより修飾された天然ヒ）　ＩＬ −４配列を表す。多数のアミノ酸を同一部位に挿入したものはＩｓ　’　（Ｘａ ａ、−Ｘａａ、−Ｘａａ、−・・−）により示され、ここでχａａ、−χａａｚ −Ｘａａ３−・・・は位置ｉの後ろに挿入された配列である。Ｎ末端追加は上部 添字“Ｏ”によって示され（たとえばＩｓ’　（Ｘａａ）　）　、たとえばアミ ノ酸６−１０の欠失はΔ６−１０としてまたは（Δ６．Δ７．Δ８．Δ９．Δ１ ０）として示される。
きわめて好ましくは、ヒトＩＬ−４ムティンを与えるカセット突然変異が採用さ れる。のちにより詳細に記述するように、□遺伝子に沿ってほぼ均一な間隔を置 いた唯一の制限部位の配列を含む合成し）ＩＬ−４遺伝子が構成された。制限部 位の唯−性は遺伝子が適宜なベクターに挿入された隙に保持されなければならず 、これにより遺伝子の各部分を適宜切除して、目的とするムティンをコードする 合成オリゴヌクレオチド（すなわち“カセツ″）と置換することができる。
唯一の制限部位の数および分布を決定するためには、（１）発現ベクター中の既 存の制限部位、（２）種特異性コドンまたは属特異性コドンのいずれを使用した いか、ならびに（３）唯一の制限部位間の各部分の合成および／または配列決定 の簡便さおよび信転性を含む幾つかの因子を考慮する必要がある。
ＩＶ、　ＩＬ−４活性についての生　“・与件およびアッセイ本発明のヒ）ＩＬ −４を生物活性および／または示された具体例との相同性に関して定める。本発 明のヒトＩＬ−４，は示された天然ポリペプチドと相同であり、かつＢＣＧＦ活 性およびＴＣＧＦ活性の双方を示す蛋白質およびムティン（示された天然ポリペ プチドの）を含む。あるいは本発明の哺乳動物ＩＬ−４，はそれらの生物活性（ のちにより詳細に定める）によっても定められ、これにはＢＣＧＦおよびＴＣＧ Ｆ活性（ここではＩＬ−４活性と呼ぶ）のほか、ＭＨＣ抗原誘導活性、Ｆｃイプ シロンレセプター誘導活性、Ｇｌ’１−Ｃ３Ｆ刺激顆粒白血球コロニー増殖増強 活性、インターロイキン−２７ＣＧＦ増強活性、ならびにＩｇＧ＋−およびＩｇ Ｅ−誘導活性よりなる群から選ばれる少な（とも１種またはそれ以上が含まれる 。
ＩＬ−４，の活性は種特異性であると考えられる。すなわち、たとえばヒトＩＬ −４はヒトＴ細胞系列によりアッセイしてＴＣＧＦ活性を示すが、ネズミＴ細胞 系列によりアッセイして活性は示さない。逆にネズミＩＬ−４はネズミＴｍ胞系 列によりアッセイしてＴＣＧＦ活性を示すが、ヒトＴ細胞系列によりアッセイし て活性は示さない。
Ａ、ＴＣＧＦ活性 ＴＣＧＦ活性については幾つかの標準アッセイ法が報告されてい５巻、８５−１ ０７頁（１９８６）　；およびロバートーグロフら、グロフ編。
増殖および　塾因子、９章（ジョン・ワイリイ、ニューヨーク。
１９８４）。一般にＴＣＧＦ活性はある因子が末梢Ｔリンパ球またはＩＬ−２依 存性Ｔ細胞系列の増殖を促進する効力に基づく。たとえばギリスら、ジェイ・イ ムノロ（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）、　１２０巻、　２０２７頁（１９７８）増 殖は標準法、たとえばトリチル化チミジンの取込みにより、または比色法により 測定できる。モスマン、ジエイ・イムノロジ・メソ（Ｊ、ＩｍｃＡｕｎｏｌ、Ｍ ｅｔｈ、）、６５巻、５５−６３頁（１９６Ｂ）たとえばヒ）　ＴＣＧＦ活性は 下記の各工程によりアッセイすることができる。（１）あらかじめフィトヘマグ ルチニン（ＰＨＡ）で７日間刺激したのちＴＬ−２と共に７日間培養され、洗浄 されたヒト末梢血リンパ球（５０μ！中に約２　ＸＩＯ’個）をマイクロタイタ ーウェルに添加し；　（２）ＴＣＧＦ含有材料の希釈液（５０μりを各ウェルに 添加し；（３）リンパ球を３７°Ｃで７２時間インキュベートし；（４）トリチ ル化チミジン（約２０μ！、２０μＣｊ）を各ウェルに添加し；そして（５）　 ｔａ胞を濾紙片上に採取し、洗浄し、シンチレーションカウンターで計数する。
具体例中により詳細に記述するように、ある種のルー４はＩＬ−２のＴＣＧＦ活 性を増強しうる。ここでこの種の活性に関連して用いられる“増強（ｐｏｔｅｎ ｔｉａｔｉｏｎ）”　は、ＩＬ−２により生じる、ＴＣＧＦアッセイ系における 最高水準の増殖がＩＬ−４の添加によって高められることを意味する。
Ｂ、ＢＣＧＦ活性 ＢＣＧＦ活性ハハワーＶら、’ｉミノ仁二コ≧色２ニーＬゲヨに工り呈すエ傾ム ）、１５５巻、９１４−９２３頁（１９８２）に示されたアッセイ法により定め られる。ＢＣＧＦアッセイ法はハヮードおよびポール、アナ・レビ・イムノロ（ Ａｎｎ、Ｒｅｖ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）＋　１巻、３０７−３３３頁（１９８３ ）に一般的に概説されている。要約するとＢＣＧＦ活性は精製された休止Ｂ細胞 が分裂促進濃度以下の抗１ｇＭなどの抗原の存在下で増殖を刺激する程度によっ て測定される。たとえばヒ）　ＢＣＧＦ活性のアッセイは下記の各工程により行 うことができる。
末梢血、肺臓、扁桃腺その他の標準的供給源から、ファイコル／ハイバーク（Ｆ ｉｃｏｌｌ／ＨｙｐａＱｕｅ）密度勾配遠心分離法（たとえばファルマシア）、 および２−アミノエチルイソチオウロニウト形成サイクル２回によって、濃縮Ｂ 細胞集団を得る。これらのＢ細胞は表面１ｇ’細胞９５％以上を含有し、抗ヒト Ｂ細胞特異性モノクロナール抗体Ｂｌ（コールタ−より入手、フロリダ州、バイ アリース）により測定して９５％以上の細胞がヒトＢ細胞特異性抗原に対し陽性 でなければならない。Ｔ細胞の混入は、抗Ｌｅｕ−１モノクロナール抗体（ベク トンーディッキンソン、カリフォルニア州、マウンテン・ビュー）またはＯＫＴ 　１１抗体（オルト・ディアグノスティックス、マサチュウセッッ州、ウェスト ウッド）を用いる染色法により測定して１％以下でなければならない、このＢリ ンパ球の培養物３ｄ（約５Ｘ１０’個／ｄ・イッセル培地、イッセルら、ジェイ ・イムノロ・メソ（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。
Ｍｅｔｈ、）、６５巻、５５−６３頁（１９８４））を黄色ぶどう球菌コーワン ■旦田ｈ　Ｉｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　Ｃｏｗａｎ　Ｉ）菌株（ＳＡＣ） 　（たとえばＳＡＣの０．０１χ溶液、パンソルビン（Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ）の 商品名でカルヒオヘミから得られる；またはファルコフ、ジェイ・イムノロリ。
Ｉｍｍｕｎｏｌ）　＋　１２！Ｌ巻、９７−１０２頁（１９８２）の記載に従っ て調製できる）またはビーズに結合させた抗ｒｇｈ抗体（たとえばＢＲＬ　、ガ イタースバーズ、ＭＤ）、たとえばバイオ−ラド（リッチモンド、ＧＡ）で活性 化する。Ｂ細胞を２４時間（ＳＡＣの場合）または７２時間（抗ＩｇＭビーズの 場合）培養し、次いでファイコル／ハイバーク密度勾配遠心法により再精製して ＳＡＣ粒子、ビーズ、生存していない細胞を除去する。培地５０μ！中約５Ｘ１ ０’個のＢリンパ球を０．２　ｍの平底マイクロタイターウェル中で平板培養す ることによりＢ細胞の増殖を測定する。ＢＣＧＦ活性をもつと推定される材料の 各種希釈液を添加して最終容積５０μｉとなす。４８時間後（抗１ｇＭ培養）ま たは７２時間後（ＳＡＣ培養）にトリチル化チミジンの取込みを測定する。同様 なアッセイ法がムラグチら。
ジェイ・イムノロ（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）　、　１２９巻、１１０４−１１ ０８頁（１９８２）　。
よびヨシザキら、ジェイ・イムノロ（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ）　、　１２８巻、 １２９６−１３０１頁（１９８１）にも示されている。
Ｃ，ＭＨＣ抗原誘導 ＩＬ−４が種々の免疫系の細胞、特にＢ細胞においてＭＨＣ抗原（たとえばマウ スにおけるＴａ）の発現を誘導しうろことが証明されている。レームら、　（ジ ェイ・エクス・メディ・　（！、Ｌ！Ｊ！ユ厘ｄ、）　、　１６０巻、　６７９ −６９４頁）はＢＣＧＦ活性を示す因子が正常な休止Ｂ細胞においてＭＨＣ抗原 の発現をも誘導しうろことを証明した。
ＭＨＣ抗原誘導に関するアッセイ法は、この文献に示されたネズミＢ細胞につい てのアッセイ法を一般化したものである。要約すると、免疫系細胞をＩシー４に 暴露し、次いで細胞表面における特定のＭ）ＩＣ抗原の発現を、この抗原に特異 的な標識付き抗体によって測定する。誘導の程度は、誘導された細胞を対照と比 較することによって判定される。いずれの特定の種についても数種の抗体を用い ることができる。モノクロナール抗ＭＨＣ抗原抗体を産生ずるハイプリドーマ数 種がＡＴＣＣから入手され、数種が市販さている（たとえばΔＴＣＣ受理番号１ （Ｂ１０３．ＨＢ１０９．ＨＢＩＩＯ，またはＨＢ　１５１のハイブリドーマに より産生される抗ＨＬＡ−ＤＲ；　ＡＴＣＣ受理番号ＨＢ３５のハイブリドーマ により産生される抗ｒ−Ａｂ−４。
ベクトン・ディッキンソン（カリフォルニア州、マウンテン・ビュー）から入手 される抗ＨＬＡ−ＤＩ’ｌ　Ｌ２４３など）。このアッセイ法を個りの種に適応 させるためには、また最も怒度の高いＭＨＣ抗原水準の読みを得るのに最適な条 件にするためには、若干のルーティン実験が必要であろう。ヒトＭＨＣ抗原誘導 アッセイのためには、精製Ｂ細胞を上記により、または同様な方法により調製す ることができる。あるいは肺臓細胞の精製調製物につきＭ）ＩＣ誘導をアッセイ することができる。抗体標ｆｆ１（＝Ｊき細胞は好ましくはフローサイトメトリ ーにより、たとえばベクトン・ディッキンソンＦＡＣ５型機器などにより検出さ れる。
Ｄ、ＭＣＧＦ活性 ＩＬ−４，は一般に１１ＣＧＦ活性を示すと考えられている。しかし適切なアッ セイ法がないため、ＭＣＧＦ活性はけっ歯頚ＩＬ−４について証明されていたに すぎない。ネズミＩｔ、４　ＭＣＧＦアッセイ法は因子依存性ネズミ肥満細胞ま たは好塩基細胞系列の増殖に基づく。
特にＭＣＧＦ活性はネズミ肥満細胞系列ＭＣ／９を用いてアッセイすることがで きる。この細胞系はＡＴＣＣに受理番号ＣＲＬ　８３０６で寄託され、米国特許 第４，５５９，３１０号明細書、およびナーベルら、旦。
２３巻、１９頁（１９８１）に記載されている。ネズミＭＣＧＦアッセイ法はイ ーレら、ジェイ・イムノロ（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）、１２７巻、　７９４　（ １９８１）によっても報告されている。
好ましくはＭＣＧＦ活性はＭＣ／９細胞を用いてモスマン（前掲）の比色アッセ イ法によって測定される。要約すると、ＭＣ／９細胞を平底ファルコンマイクロ タイタートレー（細胞１０４／ウエル）内で、４％ウシ胎仔血清、５０μＨ・２ −メルカプトエタノール、２ｎ＋ＭＩグルタミン、非必須アミノ酸、必須ビタミ ン、および種々の濃度の被験上層液を補充したダルベンコの改良培地（最終容量 ０．１ｍＲ）中において培養する。リン酸塩緩衝化量塩液１０μＥ中５０μｇの ３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）　−２，５−ジフェニルテトラ ゾリウムプロミド（シグマ）を、２０時間のインキュベーション後に各細胞培養 物に添加する。４時間後にイソプロパツール中の０．０４Ｍ　・）ＩＣＩを０． １　ｍ添加して、有色のホルマゲン系反応生成物を可溶化する。５７０ｎ１１１ （参考６３０ｒ＋ｍ）における吸光をダイナチック・マイクロエリザ・オートリ ーダー（ＭＲ５８０）またはこれに類する機器により測定する。
Ｅ、Ｆｃ−イプシロンレセプター誘導 ＩＬ−４がＢ細胞およびＴ細胞、特に抗１ｇＭ抗体または同様に抗原により刺激 されたヒトＢ細胞においてＦｃ−イプシロンの発現を誘導することが見出された 。またガンマインターフェロンがＢ細胞におけるＩシー４誘導Ｆｃ−イプシロン の発現を特異的に抑制することも見出された。
好ましくはＦｃ−イプシロンレセプター誘導のアッセイ法は最初はＢＣＧＦアッ セイの場合と同様に行われる。すなわち精製Ｂ細胞を得て、これを次いで抗Ｉｇ Ｍ抗体（または同様に抗原）で刺激し、ＩＬ−４に暴露する。最後にこれらの細 胞をＦｃ−イプシロンレセプターにつきアッセイする。
細胞表面のＦｃ−イプシロンレセプターの定量については数種のアッセイ法があ る。たとえばヨドイおよびイシザカ、ジエイ・イムノロ（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ 、）、　１２２巻、　２５７７−２５８３頁（１９７９）　、ハダツクら、’； ｘ４ユ（ムノＯユ）　７　Ｕ、Ｉｎ＋ｍｕｎｏ１．Ｍｅｔｈ、）、８４巻、１１ −２４頁（１９８５）　；およびボンネフォイら、ジヱイ・−（Ｊ、ノロ・メη 二慈セ戸見り惠し、ル用ユ）、８８巻、　２５−３２頁（１９８６）　、特にＦ ｃ−イプシロンレセプターはぞのレセプターに特異的な標識付きモノクロナール 抗体を用いたベクトン・ディソキンソンＦＡＣ３−ＩＶなとの機器によるフロー サイトメトリーにより測定することができる。Ｆｃ−イプシロンレセプター特異 性モノクロナール抗体は常法により構成することができる。
Ｆ、　ＩｇＧ、−およびＩｇＥ誘導 ＩＬ−４はリポ多Ｈｇ類（ＬＰＳ）活性化したＢ細胞においてＩｇＥおよびＩｇ Ｇ、同基準標本の分泌を誘導する。たとえばコツマンら、ジェイ・イムノロ・（ Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）、１３６巻、４５８３−４５４１頁（１９８６）　；サ イプラスら、ユーロ・ジェイ・イムノロ（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）＋１ ５巻、５８６−５９３頁（１９８５）・これらの活性は抗体同基準標本の標準イ ムノアッセイ法、たとえばコツマンら、２ヱイ・イムノロ（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ 、）、１３６１巻、９４９−９５４頁（１９８６）に記載された方法により測定 することができる。要約すると、Ｂ細胞をたとえばネズミチフス菌」迫りヨ夏佳 しす刃山副１見ｗＬＰｓ（シグマより入手）約４μｇ／ｍＲまたは大腸菌０５５ から抽出したＬＰＳ　（サイプラスらが報告した方法による、前掲）と共に培養 することによりＬＰＳ活性化する。４〜８日間培養したのち、上層液をアッセイ 用に採取する。標準的な同基準標本特異性ＥＬＩＳＡ型アッセイ法を用いて各種 同基準標本濃度を測定することができる。アッセイ用の抗−同基準標本抗体が市 販されており、あるいはＡＴＣＣから入手できる。
Ｇ、コロニー刺激因子（Ｃ３Ｆ）活性 Ｃ３Ｆ活性を測定するために造血細胞、たとえば骨髄細胞または調帯（ｆｅｔａ ｌ　ｃａｒｄ）血球を単−細胞縣濁液状にした。次いで栄養素および通常はウシ 胎仔血清を含有する半固体状の（寒天）または粘稠な（メチルセルロース）培地 中で個々の細胞を“固定化する”。適宜な刺激因子の存在下で個々の細胞が増殖 し、分化するであろう。最初の細胞は固定化されているので、細胞が増殖し、成 熟するのに伴ってコロニーが発達する。これらのコロニーを７〜１４日後に採点 することができる。ニー・バーゲス、”　因−および幹細胞、　５２−５５頁、 アカデミツク・プレスニューヨーク、（１９８４）、（顆粒球およびマクロファ ージの増殖への特異的通用については、ティー・ブラッドリーおよびディー・メ トカーフ、オースト・ジェイ・エクスペ・バイオ口・ファイ・サイ・（Ａｕｓｔ 、Ｊ、Ｅｘ　、Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ、Ｓｃｉ、）＋４４巻、　２８７−３００頁（ １９６６）を、また一般的にはディー・メトカー乙造血コロ三二、スブリンガー 、フェルラーク、ベルリン（１９７７）を参照されたい。）所望により個々のコ ロニーを抽出し、顕微鏡用スライドに乗せ、固定し、ライト／ギームザにより染 色することができる。（トッド−スタンフォード、　−室・　法による臨床並逝 、第１５版９編者、ディビッドソンおよびヘンリー（１９７４）　”）。
単一コロニーにつき存在する細胞型の形態学的分析を次いで行うことができる。
非血液学的疾患を伴う患者から採取した骨髄細胞をファイコル（４００型、シグ マ・ケミカル社、セントルイス、ＭＯ）上に広げ、遠心分離しく２．００Ｏｒｐ ｍ、　２０分）、界面の細胞を取出す。ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）　ＩＯＸを含有 するイスコブ（Ｉｓｃｏｖｅ）の改良ダルベツコ培地中でこれらの細胞を２回洗 浄し、同培地に再縣濁し、プラスチック製シャーレに付着させることにより付着 性細胞を除去する。２０χＦＣ３、５０μＮ　・２−メルカプトエタノール、０ ．９％メチルセルロース、およびコロニー刺激活性を含むことが知られている上 層液または被験上層液（種々の濃度）を含有するイスコブの培地に、非付着性細 胞を１０’個／ｄにおいて添加する１ｄのアリコートを３５胴のシャーレに広げ 、３７°Ｃで空気中６％ＣＯ□の飽和湿度雰囲気内において培養する。培養開始 の３日後にエリスロボイエチン１単位を各プレートに添加する。
顆粒球−マクロファージコロニーおよび赤血球バーストラ１０〜１４日月に倒立 顕微鏡により計数する。
ヘパリン中に採取した謄帯（ｃｏｙｄ）血細胞を２．　ＯＯＯｒｐｍで６分間遠 心分離する。血漿と赤血球のピーク間の界面にある白血球を０．１７Ｎ塩化アン モニウムおよび６％ＦＣ３を含有する試験官に移す。氷上で５分間保持したのち 、縣濁液の下部にＦＣＳ４ｄを積層し、２．０００ｒｐｍで６分間遠心分離する 。細胞ペレットをダルベツコのりん酸塩緩衝化食塩液で洗浄し、先に骨髄細胞に 関して記載したファイコルおよびプラスチック付着工程を行う。低密度の非付着 性細胞を採取し、前記の半固体培地に１０５個／培地において広げる。
アッセイの終了時に個々のコロニーをガラススライドに施しライト／ギームザで 染色したのち細胞組成を調べる。好酸球はルキソール・ファスト・ブルー（Ｌｕ ｘｏｌ　Ｆａｓｔ　Ｂｌｕｅ）で染色することにより測定される（ジー・ジョン ソンおよびディー・メトカーフ、エクスペ・ヘマト口（Ｅｘｐ、Ｈｅｍａｔｏｌ ）　Ｖｏｌ、８巻、　５４９−５６１頁（１９８０） ＧＭ−ＣＳＦ刺激顆粒球の増殖に関してここで用いられる°“増強（ｐｏｔｅｎ ｔｉａｔｉｏｎ）”は上記アッセイ法において顆粒球コロニーがコロニーの増殖 を刺激するためにＧＭ−ＣＳＦをＩＬ−４と共に用いた場合の法がＧＭ−Ｃ５Ｆ を単独で用いた場合よりも大きいことを意味する。
ｖ、Ｂ制および薬Ｊ 大腸菌、酵母その他の細胞中で発現された本発明のポリペプチドは当技術分野に おける標準法に従って精製される。これには硫酸アンモニウム沈澱法、分画カラ ムクロマトグラフィー（たとえばイオン交換、ゲル濾過、電気泳動、アフィニテ ィクロマトグラフィーなど）および最終的な結晶化（一般的に“酵素の精製およ び関連法”、メソッズ・イン・エンザイモロジ−２２；　２３３−５７７　（１ ９７７）およびアール・スコープス、ｌ亘ｉ少慧裂二厘旦すｌｘ、　スブリンガ ー・フェルラーク、ニューヨーク（１９８２）を参照されたい）が含まれる。精 製されると（部分的に、または均質に）、本発明のポリペプチドを研究の目的で 、たとえば細胞増殖用培地への補充として（たとえば最小必須培地　イーグル、 イスコブの改良ダルベツコ培地、またはＲＰ？ｌ１１６４０；　シグマ・ケミカ ル社（ミズーリ州、セントルイス）およびジコプ・ディビジョン（チャグリン・ オハイオ州、フォールズ）から入手される）、またイムノアッセイ、免疫蛍光染 色などに有用な特異的免疫グロブリンを誘導するための抗原物質として使用でき る（一般的に九皮笠煎方迭、■および■巻９編者：アイ・レフコビッツおよびビ ー・ペルニス、アカデミツク・プレス、ニューヨーク州、ニューヨーク、１９７ ９．１９８１）　；　および・　疫学ハンドブック、編者：ディー・ワイル、ブ ラックウェル・サイエンティフィック・パブリケーションズ、ミズーリ州、セン トルイス（１９７９）を参照されたい）。
本発明のポリペプチドは薬剤組成物中にも、たとえば各種感染に対する天然の防 御を強化するために使用できる。たとえば慢性関節リウマチを伴う患者、移植を 要する患者、または癌の化学療法、高齢化、免疫抑制剤などにより起こる免疫欠 損を伴う患者をこれらのポリペプチドで処置することができる。これらの組成物 は単独で、または当業者に周知の他の薬剤と組合わせて、免疫系の種々の部分を 選択的に刺激することができる。
特にこれらの組成物は本発明のポリペプチドがもつ増強活性の点からみて他の免 疫反応性薬剤、たとえばリンフ才力イン（たとえばＩＬ−１、ＩＬ−２など）、 コロニー刺激因子、免疫グロブリンなどを含有することができる。これらのポリ ペプチドは細胞増殖または免疫グロブリン産生の強化を目的とする際の刺激（イ ンビボまたはインビトロ）にも使用される。
本発明の薬剤組成物はこれらのポリペプチドを好ましくは不活性の、薬剤学的に 受容できるキャリヤーと混合することにより調製できる。適切なキャリヤーおよ びそれらの調製法は当技術分野で周知である（たとえばレミントンの′ｉ　ヒ８ および′ｍ方：米国処方集、マック・パブリッシング・カンパニーペンシルバニ ア州、イーストン（１９８４）を参照されたい）。好ましい投与経路は非経口で あり、機械的デリバリ−システムの使用も含まれる。
好ましくは薬剤組成物は単位用量刑形であり、各単位は適宜な量の有効成分を含 有する。単位用量製剤中の有効化合物の量は、個々の用途および有効成分の効力 に応じてｌμｇから１００■まで変化または調整することができる。所望により 組成物は他の治療薬を含有してもよい 用量は患者の要求条件、処置すべき状態の程度、および用いられる個々の化合物 に基づいて変えることができる。ここで用いる“有効量′”という語は、用量を 考慮する際にこれらの因子を計算に入れることを意味する。個々の状況に適した 用量を決定することは当業者が容品になしうる範囲のものである。一般に処置は その化合物の最適用量よりも少ない小用量から開始する。その後、用量を少量ず つ増し、その状況下で最適な効果を達成する。便宜的に総−日量を分割して、そ の日に少量ずつ投与することもできる。
■、光咀糸 本発明の蛋白質およびムティンを産生させるために広範な発現系（すなわち宿主 −ベクターの組合わせ）を用いることができる。可能な種類の宿主細胞には細菌 、酵母、昆虫、哺乳動物などからの細胞が含まれるが、これらに限定されない。
特定の蛋白質またはムティンの発現を最適なものにするのは多くの因子に依存し 、これには以下のものが含まれる。（１）発現すべき蛋白質またはムティンの性 質、たとえば発現産物がある種の宿主系にとって有毒であるかも知れない、（２ ）翻訳後修飾が望ましいか否か、またいかなる型の修飾が望ましいか、たとえば 希望するグリコジル化の程度および種類が宿主の選択に影響をあたえる可能性が ある、（３）目的とする蛋白質またはムティンのコード部位をフランキングする ５′および３′領域の性質、たとえば翻訳の制御に関与するプロモーターおよび ／または配列の選択が効果的発現にとって重要である、（４）一過性の発現また は持続的な発現のいずれかをめるか、（５）発現産物を宿主細胞および／または 培地の蛋白質および他の物質から分離する際の難易、（６）一過性に目的の蛋白 質またはムティンを発現する宿主のトランスフェクションの難易および効率、（ ７）目的とする蛋白質またはムティンを発現するために用いられる細胞培養の規 模、（８）目的とする蛋白質またはムティンが宿主にとって内生の蛋白質断片に 融合した形で発現されるか否か。
−１’Ｒに本発明のＤＮＡ配列のクローニングには原核生物が好ましい。原核生 物発現系を提供するための一般的ガイドはマニアチスらの分子クローニング：実 験室の手引き（コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、ニューヨーク 、　１９８２）　；パーパル、分子クローニングの実用ガイド（ジョン・ワイリ ー・アンド・サンズ、ニューヨーク、　１９８４）；グローバー、　ＤＮＡクロ ーニング：　際の研六法、■および■巻（ＩＲＬプレス、オフスフオード、　１ ９８５）　ｉならびにデ・ベールら、“大腸菌における最適な外来遺伝子発現の ための方法、′伝　：　浩と　。
クルーン編（ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、ニューヨーク、　１９８３） により得られる。たとえば大苗に１２株２９４（ＡＴＣＣＮｏ。
３１４４６）が特に有用である。使用できる他の微生物株には大腸菌の菌株、た とえば大腸菌Ｂおよび大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣＮｏ、３１５３７）が含まれ る。これらの例はもちろん例示のためのものであって限定ではない。
原核生物は発現のためにも使用できる。上記の菌株のほか、大腸菌−３１１０（ Ｆｓ−、λ−５原栄養体、ＡＴＣＣＮｏ、２７３２５）、杆菌、たとえば枯草菌 （Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）、および他の腸内細菌、たとえばネズ ミチフス菌もしくは霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓａｎｓ）＋および種 々のシュードモナス属菌種も使用できる。
−ＪＧに、宿主細胞と適合性の種に由来するレプリコンおよび制御配列を含むプ ラスミドベクターがこれらの宿主と組合わせて用いられる。ベクターは通常は複 製部位、および形質転換細胞において表現型を選定しうるマーキング配列を保有 する。たとえば大腸菌はしばしばｐＢＲ３２２、すなわち大腸菌の一菌種に由来 するプラスミドを用いて形質転換される（ポリパーラ、乏ニヱ、２巻、９５頁（ １９７７））　、　ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性に 関する遺伝子を含むので、形質転換細胞を識別するだめの容易な手段を提供する 。ｐＢＲ３２２プラスミドまたは他の微生物プラスミドは微生物が自身の蛋白質 の発現のために利用しうるプロモーターをも含むか、またはこれを含むべく修飾 されなければならない。組換えＤＮＡの構成に最も一般的に用いられるプロモー ターにはβ−ラククマーゼ（ベニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系 （チャンら、ネイチャー５２７５巻、６１５頁（１９７Ｂ）　ｉイタクラら、サ イエンス、１９８巻、　１０５６頁（１９７７）　；ゲンテルら、ネイチャー、 ２８１巻、５４４頁（１９７９））、４０５７頁（１９８０）　；欧州特許出願 公開第００３６７７６号明細書）が含まれる。これらが最も一般的に用いられる が、他の微生物のプロモーターも見出されて利用されており、それらヌクレオチ ド配列に関する詳細は公表され、当業者はこれらをプラスミドベクターと機能的 にリゲートさせることができる（シーベンリストら、セル２０巻、２６９頁（１ ９８０））原核微生物、真核微生物のほかに酵母培養物も使用できる。
ビール酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、または一 般のパン酵母が真核微生物のうちでは最も慣用されるものである。サツカロミセ ス属において発現させるために慣用されるプラスミドはＹＲｐ７である（スティ ンヒコームら、ネイチャニ、２８２巻、３９頁（１９７９）　、キンゲスマンら 、ジーン、７巻、１４１頁（１９７９）　ｉチェンバーら、ジーン、１０巻、１ ５７頁（１９８０））　、このプラスミドは、トリプトファン中で増殖する能力 を欠如した酵母の突然変異株（たとえばＡＴＣＣＮｏ、４４０７６またはＰＥＰ ４−１）に対する選択マーカーを備えた旦と１遺伝子をすでに含んでいる（ジョ ーンズら。
ジエネティックス、８５巻、１２頁（１９７７））、そこで、酵母細胞ゲノムの 特色として丘１傷害（ｌｅｓｉｏｎ）が存在することは、トリプトファンの不在 下での増殖により形質転換を検出するために有効な状況を与える。
酵母ベクターにおける適切なプロモーター配列には３−ホスホグリセレートキナ ーゼ（ヒッツェマンら、ジエイ・バイオ口・ケミ（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、） 、２５５巻、　２０７３頁（１９８０））　、あるいは他の解糖酵母（ヘスら、 ジェイ・アドバ・エンザイム・レギ（Ｊ、Ａｄν。
旦Ｕ憇」町、）、７巻、１４９頁（１９６８）　；ホランドら、バイオケミスト ユニ、１７巻、　４９００頁（１９７８））　、たとえばエノラーゼ、グリセル アルデヒド−３−リン酸　デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカ ルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラー ゼ、３−ホスホグリセリン酸ムダーゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸 イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼが含まれる 。適切な発現プラスミドを構成する際には、これらの遺伝子に付随する終止配列 も、発現ベクターの発現すべき配列の３′位にリゲートさせ、ｍＲＮへのポリア デニル化および終止を行わせる。増殖条件によって転写が制御されるという付加 的な利点をもつ他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチト クロームＣ１酸性ホスフアターゼ、窒素の代謝に付随する変性酵素、前記のグリ セリルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガ ラクトースの利用に関与する酵素に関するプロモーター領域である（ホランド。
前掲）。酵母適合性プロモーター、複製原点、および終止配列を含むプラスミド ベクターはいずれも適している。
微生物のほかに、多細胞生物に由来する細胞培養物も宿主として利用できる。原 則として、この種の細胞培養物はを椎動物または無を椎動物のいずれであっても 有効である。しかしを椎動物細胞における関心がきわめて大きく、培養における を椎動物の増殖（組織培養）が近年ルーティンな方法となっている〔組織Ｉｔ、 アカデミツク・プレス、クルーズおよびバターマンＩ　（１９７３）　）。この 種の有用な宿主細胞系の例はＶＥＲＯおよび）１ｅＬａ細胞、チャイニーズハム スター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、ならびに讐１３８、ＢＨＫ、ＣＯ５７、マウス骨 髄腫（ＡＴＣＣＮｏ、ＴｌＢ１９またはＴｌＢ２０）およびＭＤＣＫ細胞系列で ある。この種の細胞に対する発現ベクターには通常は（必要ならば）、発現すべ き遺伝子の前方に位置する複製原点およびプロモーターが、必要なリポソーム結 合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネ ータ−配列と共に含まれる。
哺乳動物細胞に用いるためには、発現ベクターに対する制御機能がしばしばウィ ルス材料によって供給される。たとえば慣用されるプロモーターはポリオーマ、 アデノウィルス２、きわめて頻繁にシミアンウィルス４０　（ＳＶ４０）に由来 する。ＳＶ４０ウィルスの初期および後期プロモーターは特に有用である。両者 とも、ＳＶ４０ウィルス由来の複製原点をも含む断片としてウィルスから容易に 得られるからである（フイールズら、ネイチャー。
２７３巻、１１３頁（１９７Ｂ）、これよりも小さいかまたは大きいＳＶ４０断 片も、Ｈｉｎｄｎ［部位からウィルス由来の複製原点に位置する」Ｌ１部位へ向 かって伸びる約２ｓｏｂｐの配列を含む限り使用できる。
さらに、普通は目的とする遺伝子配列に付随するプロモーターまたは制御配列を 用いることも、これらの制御配列が宿主細胞系に適合しうる限り可能であり、し ばしば望ましい。
複製原点は外来原点によってベクターに（たとえばＳＶ４０または他のウィルス （たとえばポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、　ＢＰＶなど）源に由来するもの）与 えられるか、あるいは内的に宿主細胞染色体複製機構よって与えることができる 。ベクターを宿主細胞染色体中に挿入することでしばしば十分である。
ｔ−ＰＡおよびＤ）ＩＰＲ蛋白質双方をコードするＤＮＡ配列を含む本発明のベ クターによるトランスフェクションのために好ましい宿主細胞を選ぶ際には、用 いるＤＨＰＲ蛋白質の型に従って宿主を選ぶことが適切である。野性型ＤＨＦＲ 蛋白質を用いる場合は、ＤＩ（ＰＲを欠如する宿主細胞を選ぶことが好ましい。
これによりヒボキサンチン、グリシンおよびチミジンを欠如する選択培地におい てトランスフェクション成立のマーカーとしてＤ）ＩＰ＋？コード配列を使用す ることができる。このような適切な宿主細胞はＤＨＦＲ活性を欠如するチャイニ ーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系列であり、これはウルラウプおよびチェイ シン、プロシ・ナショナル・アカデ・サイ０．（ニーニスニー）　（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）（ＩＩｓＡ）　７７巻、４２１６頁（１９８０ ）に記載された方法に従って調製され、増殖する。
他方、Ｉ’ｌＴＸに対し低い結合親和性をもつＤＨＰＲ蛋白質を制御配列として 用いる場合、ＤＨＦＲｉ５′を性細胞を用いる必要はない、突然変異Ｄ）ＩＦＩ ？はメトトレキセート耐性であるので、宿主細胞自体がメトトレキセート感受性 である限り、ＭＴＸ含有培地を選択の手段として用いることができる。ＭＴＸを 吸収することができる。
真核細胞は大部分がメトトレキセート感受性であると思われる。
これらの有用な細胞系列の１つは、Ｃ）１０系列、Ｃ）１０−ＫＩ　ＡＴＣＣＮ 。
ＣＣＬ　６１である。
無を椎動物の発現系にはバキュロウィルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）ベクター 、ＢｍＮＰＶを感染させたカイコ−建旦鮭α工」且ツー）の幼虫が含まれる。こ れについてはマエダら、ネイチャー、３１５巻、８９２−８９４頁（１９８５） 　、および細胞工学、４巻、　７６７−７７９頁（１９８５）に記載されている 実−一」Ｌ−一医 以下の実施例は本発明を説明するためのものである。ベクターおよび宿主、なら びに試薬濃度、温度および他の変数の値は本発明の応用を例示するためのものに すぎず、本発明の限定と考えるべきではない。
財旦旦よグ方迭 細胞系列Ｃ１，Ｌｙｌ”　２　”　／９　（Ｃ１，１と呼ぶ）（ジー・ナーベル 。
ジェイ・ニス・グリーンバーガー、エム・サカキ−ニー、およびエッチ・カント −（１９８１）プロシ・ナショナル・アカデ・サイ。
ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ）　、　７８． １１５７−１１６１）　、およびＧＫ１５−１　（エム・キードリン提供。モレ キュラー・アンド・セルラー・バイオロジー社　ＤＮＡＸ研究所ｉ　ＤＮＡＸ） を、　ＲＰＭＩ　１６４０゜５０　ｔｔ　ｔａ　２ＭＥ、１χＦＣＳおよび２　 μｇ／ｄｃｏｎＡ中に細胞５Ｘ１０’個／Ｉｄで２４時間再縣濁した。上層液を 採取し一７０°Ｃに保存した。
クローン化マスト細胞系列、　ＭＣ／９　（ジー・チーベル。ニス・ジェイ・ガ リ、エッチ・エフ・トポラックおよびエッチ・カント−（１９８１）ネイチャー ２９１．３３２−３３４はジー・ナーベル（ダナ・フッルベル癌研究所１ＤＦｃ Ｉ）から得られた。マスト細胞系側聞３　（アール・コツマンにより提供、ＤＮ ＡＸ）およびＤＩ２（ディー・レニックにより誘導、ＤＮＡＸ）は骨髄単球付随 マーカーの不在によって、また１ｇεレセプターおよび２５０ｎｇ／１０’　ｍ 抱板上の水準のヒスタミンの存在によって明らかにされた。骨髄性ＮＦＳ−６０ 細胞はジェイ・イーレ（フレデリック癌研究施設、　ＦＣＲＦ）により提供され た。　ＮＦＳ−６０細胞系列をサブクローニングしてＩＬ−３依存性クロージを 得た。Ｔ細胞系列ＨＴ２はニス・ストロバー（スタッフォード大学、カリフォル ニア州、パロ・アルド、カら得られ；　ＣＴＬＬ−２はダブりニー・ファラル（ ＦＣＲＦ）により供給され；　Ｌｙ２３／４はジー・ナーベル（ＯＦＣＩ）によ り供給された。マスト細胞およびＴ細胞系列は組換えＴＬ−３またはＩＬ−２を 補充したＲＰＭ１１６４０、１０χＦＣ５，５０μ？’ｌ　２ＭＥ　中で増殖さ せた。
数種のＩＬ−３依存性細胞系列のヒスタミン水準をビー・ニー・ショア、ニー・ パークハルターおよびブイ・エッチ・コン（１９５９）　ジエイ・ファルマ・エ クスペ・テラ・見、Ｐｈａｒｗ、Ｅｘ　。
Ｔｈｅｒ、）１２７．１８２−１８６の方法によりアッセイした。Ｔ細胞および マスト細胞発育因子の活性は〔３Ｈ〕−チミジンの取込みにより、または比色ア ッセイ法により測定された（ティー・モスマン。
（１９８３）に記載）。
ＷＥＨＩ　３月層液より精製したＩＬ−３はジェイ・イーレ（ＦＣ１’ｌＦ）か ら与えられた。組換えＩＬ−２，ＩＬ−３，Ｇ１１−Ｃ３ＦおよびＩＮＦ−γは 、対応するｃＤＮＡクローンをトランスフェクションさせたＣＯ５−７モンキー Ｖ細胞からの上層液の形で用いられた。ＩＬ−２，ＩＬ−３またはＧＭ−Ｃ５Ｆ の１単位は、因子依存性細胞系列の最大〔３Ｈ〕−チミジン取込みを５０％刺激 した量の因子と定義された（ディー・レニックら（１９８＆）ジェイ・イムノロ （Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ＋、１３４：９１０−９１９）　、１単位のＩＦＮ−ｒプロ モーターは５０′１のマウスＬ細胞を水庖性口内炎ウィルスの細胞変性作用から 保護する。（アール・シュライバーら、　（１９８２）ジェイ・エクスペ・メデ イ・（Ｊ、Ｅｘ　、Ｍｅｄ、）１５６：６７７−６８９　）　。
Ｂ細胞はマウス肺臓細胞の単−細胞縣濁液から、Ｔ細胞およびマクロファージを 標準法により除去することによって調製された（エム・ハワードら、ジェイ・エ クスペ・メディ・（Ｊ、εＸ、Ｍｅｄ、）１５５：９１４（１９８２））、ここ に記載された精製因子はそれがＢ細胞におけるＴａの発現を誘発する効力につい てサイトフルオロメトリー分析により、またＢ細胞増殖を刺激する効力にづいて 抗Ｉｇ同時刺激（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）アッセイ法により評価した（ エヌ・レームら、ジェイ・エクスペ・メデイ・（Ｊ、Ｅｘ　、Ｍｅｄ、Ｎ６０： ６７９に記！！２）。
蛋白質測定はＵＶ吸収（２８Ｏｒ＋ａ＋または２２０ｎｍ　）に基づくか、ある いは色素結合アッセイ法により作成された標準曲線に基づいてなされた（エム・ ブラッドフォード、　（１９７６）アナリ・バイオケミ・（＾ｎｎａ１．Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、）　７２：　２４８−２５４）、上層液をまずペリコ・カセットユニ ット（ミリポア、マサチュセッツ州、ベッドフォード）によって、あるいは（逆 相クロマトグラフィーののち）スピードバク（セイバント、ニューヨーク州、フ ァーミングデール）中での溶剤蒸発によって２０倍に濃縮した。ＳＤＳ　ＰＡＧ Ｅはレムリのシステム（ニー・レムリ、　（１９７０）ネイチャー２２７　：６ ８０−６８５）により１２％分離用ケルを用いて行われた。マーカー蛋白質はフ ァルマシア低分子量標品（ファルマシア、スウェーデン、ウプサラ）であった。
ゲルはシー・メリルら（１９８１）サイエンス２１１：　１４３７４４３８の記 載に従って銀染色された。ＭＣＧＦおよびＴＣＧＦ活性を分子量の関数として直 接に評価するために、５０ＩＩＩＭ・ＤＴＴであらかじめ還元したまたは還元し ない試料を電気泳動し、ゲルを１胴の切片にスライスし、破砕し、卵アルブミン （シグマ、ミズーリ州、セントルイス）５■／＃Ｌｉ！を補充したアッセイ培地 ０．５　、ｄ中へ４°Ｃで一夜、蛋白質を溶離させた。
クロマトグラフィーは１８°Ｃで、クラスト・スペクトロフロー７７３　ＵＶ検 出器（クラトス、ニューシャーシー州、ラムゼー）を備えたファルマシアＦＰＬ Ｃシステムにより行われた。陽イオン交　・換クロマトグラフィーには５０＋Ｍ リン酸ナトリウム、１ｍＭ　・ＥＤＴ＾（ｐＨ７，０）で平衡化したファルマシ ア・モノＳカラム（０，５Ｘ５ａｍ）を用いた。同緩衝液中の上層液をこのカラ ムに施し、ＮａＣ］濃度勾酸（ＩＭまで）で溶離した。逆相クロマトグラフィー にはファルマシア０８カラム（Ｑ、５Ｘ２（２））を用いた。０．１χＴＦ＾（ ｐＨ２）で希釈した試料をカラムに乗せ、０．１χＴＦＡを含有するアセトニト リル濃度勾配により溶離した。
ＭＣＧＦおよびＴＣＧＦ活性体の等電点はファルマシア・モノＳカラム（０，５ ｘ２０ｃｍ）上でクロマトフオーカシング（ｃｈｒｏｍａｔｏｆｏｃｕ−ｓｓｉ ｎｇ）により推定された。０．０２５Ｍビストリス（ｐＨ７，１）中の試料を同 緩衝液で平衡化したパモノＰ”カラムに装填した。濃度勾配溶離はファルマシア ・ポリバッファー７４　（ｐＨ４，０）　（１：１０希釈、０．２Ｍアミノジ酢 酸でｐｉ（ｔｅｌ整）を用いて行われた。溶出液のｐＨはファルマシアｐＨモニ ターにより連続的に測定された。
注入前に試料はすべてミレックスＧＶ０．２μユニット（ミリポア）により濾過 された。
ＳＤＳ　ＰＡＧＥまたはクロマトグラフィー実験で得た両分はそれらが３種類の 細胞系列ＮＦＳ−６０（ＩＬ−３）、ＭＣ／９（ＭＣＧＦ）、およびＨＴ２（Ｔ ＣＧＦ）の増殖を支持する効力についてアッセイされた。
この因子を精製均質化するために、Ｃｏｎ−１活性化したＣ１．１月層液８！を ２０ＩＩＭヘペス緩衝液（ｐＨ７，０）中へ透析し、次いで同緩衝液で平衡化し たファルマシア・モノＳ　１０／１０陽イオン交換カラムニ導通した。ピーク活 性は直線的塩濃度勾配により０．２Ｍ・ＮａＣ１において溶出した。この材料を プールし、濃縮し、２０ｍＭヘベス緩衝液（ｐＨ７，０）中へ再透析し、同緩衝 液で平衡化したヘパリン−セファロースカラム上へ装填した。ピーク活性は２月 ・ＮａＣｌまでの直線濃度勾配により０．４５Ｍ−ＮａＣ１で溶出した。この材 料をプールし、０．１０／ＴＦＡ／）１２０　（ｐＨ２）で１０倍希釈し、バイ ダック逆相カラム（Ｃ４）で分画した。アセトニトリルの直線濃度勾配（０，ｌ χＴＦＡ）を施すことにより活性が４２％アセトニトリルにおいて放出された。
実施例Ｉ、Ｃ１几ド２−／９細胞からのネズミＩＬ−４ｃＤＮＡの　たな調製お よびＣＯ５７モンキー細胞における一時・　１−ＩＬ−４をコードするｃＤＮＡ クローンをネズミヘルパーＴ細胞系列Ｃ１，Ｌｙｌ”　２−　／９から単離した 。この細胞系列はＡＴＣＣに受理番号ＣＲＬ　８１７９で寄託され、ナーベルら により旦、２３巻、　１９−２８頁（１９８１）、およびブロク・ナショナル・ アカデ・サイ−＋　（Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）　７８巻、１１５７−１１６１頁（１９８１） に記載されている。
ＢＣＧＦ活性を生じることが知られている他のマウス細胞にはＥＬ−４系列が含 まれ、これはＡＴＣＣから受理番号ＴｌＢ５９で入手できる。
この例に用いた方法はリーら、ブロク・ナショナル・アカデ・サイ、ｌ　（Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）　８３巻、　２０６１−２０６５頁（１ ９８６）に示されている。要約すると、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）誘発Ｃ１ ，Ｌｙｌ’　２−　／９細胞からオカヤマおよびバーブ（前掲）の方法により、 ｐｃＤ　ｃＤＮＡライブラリーを構成した。ランダムに選ばれたクローンの大型 サブライブラリーからｆｆ２ｐ標ｆ５　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａプローブとのハイブリダ イゼーションによりＩＬ−３およびＧ？ｌ−Ｃ３Ｆを除去した。このサブライブ ラリーの残りからなるプールおよび／または各クローンを、ＣＯ５７モンキー細 胞の感染およびＭＣＧＦおよびＴＣＧＦ活性についての培養物上層液の試験によ って、ＩＬ−４につきスクリーニングした。
Ａ、ＩＬ−４産生の誘導 Ｃ１，Ｌｙｌ”　２−　／９細胞を下記に従ってＣｏｎＡにより誘導し、ＩＬ− ４ｍＲＮＡを産生させた。細胞を５　Ｘ１０ｓ＃ｔｅにおいて、４％熱不活性化 ウつ胎仔血清、５　Ｘｌ０−５Ｍ　・２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）、 ２ｍＭ、グルタミン、非必須アミノ酸、必須ビタミン、およびＣｏｎＡ　２Ｍｇ ／ａｒｔを含むダルベツコの改良イーグル培地（ＤＭＥ）中で培養した。３７° ＣＴ：ｌＯ％ＣＯ□中において１２〜１４時間インキュベートシたのち、細胞縣 濁液を１５０Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離した。
細胞ペレットを採取し、直ちに一７０°Ｃで凍結した。
Ｂ１ｍＲＮＡの単離 ジェイ・チルブラインら（バイオケミストリー＋１８：　５２９４−５２９９（ １９７９］　）のグアニジンイソチオシアヌレート法により細胞から総細胞ＤＮ Ａを分離した。ＣｏｎＡ誘導Ｃ１，Ｌｙｌ”　２−　／９細胞からの凍結細胞ペ レット（刺激の１２時間後）をグアニジンイソシアヌレート細胞熔解用溶液に両 温した。細胞溶解用溶液２０ｄを１．５×１０”個の細胞につき用いた。ペレッ トをピペッティングにより再両温し、次いで１６ゲージの針を用いて注射器に４ 回導通することによりＤＮＡを剪断した。細胞溶解物を４０ｄ容ポリアロマ−（ ｐｏｌｙａｌｌｏｍｅｒ）遠心管中で２０−の５．７Ｍ　・ＣｓＣ１，１０ｍＭ 　・ＥＤＴＡの上部に積層した。この溶液を２５．０ＯＯｒｐｒａでベックマン 舖２８０−ター（ベックマン・インスッルメンツ社、カリフォルニア州、バロ・ アルド）中において１５°Ｃで４０時間遠心分離した。ＤＮＡを含有するグアニ ジンイソシアヌレート相をピペットで上から下方の界面にまで下降させた。管壁 および界面をグアニジンイソシアヌレート細胞溶解用溶液２〜３ｍｌで洗浄した 。試験管を界面の下方ではさみにより切断し、ＣｓＣ１溶液をデカントした。Ｒ ＮＡペレットを冷７０％エタノールで２回洗浄した。次いでペレットを１０ｍＭ 　トリス・ＨＣｌ　（ｐＨ７，４）、１ｍＭ４ＤＴＡ、０．０５！　ＳＤＳ　５ ００μｊ！に再両温した。３Ｍ酢酸ナトリウム５０μｌを添加し、ＲＮＡをエタ ノール１雄で沈澱させた。総ＲＮＡ約０．３■を遠心分離により採取し、ペレッ トを冷エタノールで１回洗浄した。
洗浄および乾燥した総ＲＮＡベレットをオリゴ（ｄＴ）溶離緩衝液（１０ｄ）リ ス・ＨＣＩ　（ｐＨ７，４）、１ｍＭ−ＥＤＴＡ、０．５χ５ＤＳ）９００　ｄ に両温した。ＲＮＡを６８°Ｃで３分間加熱し、次いで氷上で冷却した。
１００　ｊ２の５Ｍ　・ＮａＣ１を添加した。ＲＮＡ試料を結合緩衝液（１０ｍ Ｍ　）リス・ＨＣＩ（ｐＨ７，４）、１ｍＭ　・ＥＤＴＡ、０．５Ｍ　・ＮａＣ １，０，５χＳＤＳ、）で平衡化した１、０威のオリゴ（ｄＴ）セルロースカラ ム（タイプ３、コラポラティプ・リサーチ、マサチュウセッツ州、ウオルサム） に装填した。カラムからの流出液をさらに２回カラムに導通した。
次いでカラムを結合緩衝液２０磁で洗浄した。溶離緩衝液で洗浄することにより ポリＡ′″ｍＲＮＡを採取した。ＲＮＡは通常、最初の２ｄの溶離緩衝液中に溶 出した。　ＲＮＡを０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６）および２倍容量 のエタノールで沈澱させた。
ＲＮＡペレットを遠心分離によって採取し、冷エタノールで２回洗浄し、乾燥さ せた。次いでペレットを水に再両温した。アリコートを希釈し、２６０ｎｍにお ける吸光度を測定した。
Ｃ，ｐｃＤ　ｃＤＮＡライブラリーの構成１）　ベクタープライマーおよびオリ ゴ（ｄＧ）テイル付きリンカ−ＤＮＡの調製 オカヤマおよびバーブ（モレ・アンド・セル・バイオ口（Ｍ０１＆　Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、）　２巻、１６１−１７０頁（１９８２）　）の方法をわずかに変更 して用いた。ｐｃＤＶｌおよびｐＬ１プラスミドはオカヤマおよびバーブ（モレ ・アンド・セル・バイオ口（Ｍｏｌ　＆　Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）３：　３８０ −３８９　（１９８３）　）により記載されており、ファルマシアにュージャー ジー州ピスカタウェイ）から入手できる。詳細には、先のＫＰ！Ｌ１部位の位置 にハ辷■部位を含む修飾されたｐｃＤＶ１プラスミドを用いた。
ｐｃＤＶＩ　ＤＮＡ　（７）試料８０ｕｇを３０°Ｃで２０Ｕのｂｌ」エンドヌ クレアーゼにより、６ＩＩＩＭトリス・ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）、６ｍ１１Ｍｇ Ｃ１ｚ、６ｎ＋Ｍ　−ＮａＣ１，６ａ＋Ｍ　・２−ＭＥ、および０．１ｍｇ／− ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する４５０μＥの反応混合物中で消化した 。、１６時間後に０．２５Ｍ　−ＥＤＴＡ　（ｐ）１８．０）４０μ４２および １０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）　２０μ！で消化を停止し、水−飽和 １：１フェノール−ＣＨＣｌ：＋　（以下フェノール−Ｃ）ｌｃｈと呼ぶ）で抽 出したのちエタノールで沈澱させることによりＤＮＡを採取した。平均６０（た だし８０を越えない）のデオキシチミジレート（ｄＴ）残基（末端当たり）のホ モポリマーチイルを下記によりウシ胸腺ターミナルトランスフェラーゼにより、 Ｎｓｉ　Ｉエンドヌクレアーゼ産生末端に付加した。反応混合物（３８μｆ）は カコジル酸ナトリウム−３０ｍＭとりす・ｔ（Ｃ１（ｐ）１６．８）　（緩衝液 として）、ならびに１ｍＭ・ＣｏＣ１ｚ　、０．１ｍＭジチオスレイトール、０ ．２５ｍＭ　・ｄＴＴＰ、　Ｎｓｉ　Ｉエンドヌクレアーゼ消化ＤＮＡ　、およ び６８Ｕのターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Ｐ−Ｌバイ オケミカルズ社分後ニ０．２５Ｍ　−ＥＤＴＡ（ｐｔ（８，０）２０μｌおよび １ｏ％ＳＤＳ　１０／７１！、　ｋ−より反応を停止し、フェノール−ＣＨＣｈ で数回抽出したのちエタノール沈澱によりＤＮＡを採取した。次いでＤＮＡを１ ５ＵのＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼにより、１０酵トリス−ＨＣＩ　（ｐＨ７ ，４）、１０ｎ＋１ＭｇＣ１ｚ　、１−Ｍジチオスレイトール、および０．１　 ｍｇ／　ｄＯ）ＢＳＡを含有する５０μ！中で３７°Ｃにおいて５時間消化した 。ＳＶ４０ポリアデニル化部位およびｐＢＲ３２２複製原点およびアンピシリン 耐性遺伝子を含む大型断片を、アガロース（１χ）ゲル電気泳動により精製し、 ガラス粉末法の変法によりゲルから採取した（ビー・フォーゲルシュタインおよ びディー・ジレスピー、ブロシ・ナショナル・アカデ・サイ、＋　（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）７６：　６１５−６１９　（１９７９）　’） 　、　ｄＴ−テイル付きＤＮＡをさらに下記に従ってオリゴ（ｄＡ）−セルロー スカラムの吸収および溶離によって精製した。　１ｍＭ　・ＥＤＴＡおよびＩＭ ・ＮａＣ１を含有する１０ｍＭ　）リス−ＨＣＩ（ｐＨ７，３）緩衝液ｌＩｄに ＤＮＡを熔解し、０°ｃに冷却し、同緩衝液で平衡化したオリゴ（ｄＡ）−セル ロースカラム（０，６Ｘ２．５　ｃｍ）に施し、水により室温で溶離した。溶離 したＤＮＡをエタノールで沈澱させ、１ａ＋Ｍ　・ＥＤＴＡを含む１０１Ｍ　） リス・Ｉ（ＣＩ　（ｐＨ７，３）に溶解した。
オリゴ（ｄＧ）テイル付きリンカ−ＤＮＡは下記により製造された。
７５μｇのｐＬｌ　・ＤＩＩＩＡを２００のＰｓｔ　Ｉエンドヌクレアーゼによ り、６ＩＩＩＭ・トリス・ＨＣＩ（ｐＨ７，４）、６＋ｎ？１ＭｇＣＩｚ、６Ｉ ＩＩＭ　・２−ＭＥ、５０ｍＭ　・Ｎ　ａ　Ｃｌ　％および０．０１　ｔｗ：／ ｄのＢＳＡを含有する４５０μｆ中で消化した。３０°Ｃで１６時間後に反応混 合物をフエーノールーＣＨＣｌ　ｓにより抽出し、ＤＮＡをアルコールで沈澱さ せた０次いで１０〜１５デオキシグアヌレート（ｄＧ）残基のティルを各末端に 、前記と同じ反応混合物（３８，ｃｚｆ）（ただしｄＴＴＰの代わりに０．１ｍ Ｍ　・ｄＧＴＰを含む）中で４６Ｕのターミナルデオキシヌクレオチジルトラン スフェラーゼにより付加した。３７°Ｃで２０分後に混合物をフェーノールーＣ ＨＣｌ：Ｉで抽出し、ＤＮＡをエタノールで沈澱させたのち、これを３０ＵのＨ ｉｎｄＩ［Ｉエンドヌクレアーゼにより、２０ｍＭ・トリス・ＨＣｌ（ｐＨ７， ４）、７ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、　６０ｎ＋Ｍ　ＮａＣ１、および０．１■のＢＳＡ を含有する５０μ！中で３７゛ｃにおいて４時間消化した。少量のオリゴ（ｄＧ ）テイル付きリンカ−ＤＮＡをアガロースゲル（１，８χ）電気泳動により精製 し、上記に従って採取した。
２）　ｃＤＮＡライブラリーの調製： 工程１：ｃＤＮＡ合成。反応混合物は５０ｍＭ　トリス・ＨＣＩ　（ｐＨ８，３ ）８　ｍＭ　・ＭｇＣ１ｚ　、　３０ｍＭ−ＫＣＩ　、　０．３　ｍＦＩジチオ スレイトール、各２ｍＭのｄＡＴＰ、　ｄＴＴＰ、　ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ 、　２０　μｃｉ　”Ｐ−ｄＣＴＰ（３０００Ｃ４／ミリモル）、３μｇのＣｏ Ａ誘導Ｔ紺胞由来ポリＡ゛　・ＲＮＡ　。
６０単位のＲＮアシン（ＲＮａｓｉｎ、リボヌクレアーゼ阻害剤の商品名。
プロメガバイオチック社より、ワイオミング州、マジソン）および２μｇのベク ター−プライマーＤＮＡ　（プライマー末端１５ピコモル）、および４５Ｕのリ バーストランスクタプターゼを含有していた。反応物を４２°Ｃで６０分間イン キュベートし、次いで０．２５Ｍ　−ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）　１　ｕ　１２ および１０％ＳＤＳ　Ｏ，５ｐ　ｌの添加により停止し；フェノール−ＣＨＣｌ ：＋　４０μ！を添加し、溶液をボルテックスミキサー中で激しくブレンドした のち遠心分離した。
４Ｍ酢酸アンモニウム４０μ！およびエタノール１６０μｌを水相に添加し、溶 液をドライアイスで１５分間冷却し、緩和に振とうしながら室温にまで加温して 、冷却に際して沈澱していた未反応のデオキシヌクレオシド三リン酸を溶解し、 エッペンドルフ微量遠心機で１０分間遠心分離した。ペレットを１０μ！０１０ ｍＭトリスーＨＣｌ　（ｐＨ７，３）および１　ｍ卜ＥＤＴＡに溶解し、４Ｍ酢 酸アンモニウム１０μβと混合し、エタノール４０μ！で再沈澱させた。この処 理により９９％以上の未反応デオキシヌクレオチド三リン酸が除去された。ペレ ットをエタノールでリンスした。
工程：２　オリゴデオキシシチジレート〔オリゴ（ｄＣ））の付加。プラスミド −ｃＤＮＡ　：　ｍＲＮＡを含有するペレットを１ｍＭ・ＣＯＣｌ２゜０．１　 ｍＭジチオスレイトール、０．２　ｐｇのポリ（Ａ）　、７０，１／Ｍ　−ｄＣ ＴＰ、　５μＣｉ　”Ｐ−ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／　ミリモル）、および６０ Ｕのターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼを含有する１４０　 ｎ＋ＦＩカコジル酸ナトリウム−３０ｍＭ　）リス−ＨＣ１（ｐＨ６，８）緩衝 液２０μ！に溶解した。反応を３７°Ｃで５分間行い、各末端に１０〜１５残基 のｄＣ肝を付加させ、０．２５Ｍ　−ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）　２μ２および １０％ＳＤＳ　１　μＰで終結させた。フェノール−ＣＨＣｌ３２０μ！で抽出 したのち水相を４Ｍ酢酸アンモニウム２０μ！と混合し、ＤＮＡを沈澱させ、エ タノール８０μｌで再沈澱させ、最終ペレ・ントをエタノールでリンスした。
工程３　：　Ｈｉｎｄ　Ｉ［Ｉエンドヌクレアーゼ消化。２０ｍＭトリス・ＨＣ Ｉ（ｐＨ７，４）、７ｍＭ・ＭｇＣＩｚ　、　６０ｍ？ｌ　ＮａＣ１、および０ ．１　ｍｇ／ｄのＢＳＡを含有する緩衝液３０μ！にペレットを溶解し、ＩＯＵ の…屁■エンドヌクレアーゼにより３７°Ｃで２時間消化した。反応を０．２５ 　Ｍ　−ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）　３μ２および１０％ＳＤＳ　１．５μ！で 終結させ、フェノール−ＣＨＣｌ：＋で抽出したのち４Ｍ酢酸アンモニウム３０ μｌを添加し、エタノール１２０μ！によりＤＮＡを沈澱させた。ペレットをエ タノールでリンスし、次いで１０μｌの１０ｍＭ）リス・ＨＣＩ　（ｐＨ７，３ ）および１　ｍＭ　・ＥＤＴＡに溶解し、エタノール３μ尼を添加して一２０° Ｃでの貯蔵に際して凍結するのを防止した。
工程４：オリゴ（ｄＣ）テイル付きリンカ−ＤＮＡにより媒介された環化。Ｈ４ ｎｄＩ［［エンドヌクレアーゼ消化したオリゴ（ｄＣ）テイル付きｃＤＮＡ　： 　ｍＲＮＡプラスミド（試料の約９０％）の試料９μｌを、１０ｍＭ）リス・） ＩｃＩ　（ｐＨ７，５）、１＋ｎＭ４：ＤＴＡ、　０．１１Ｌ　ＮａＣ１、およ び１．８ピコモルのオリゴ（ｄＣ）テイル付きリンカ−ＤＮＡを含有する混合物 （９０μりの中で６５°Ｃにおいて５分間インキュベートし、４２°Ｃに移行さ せ（６０分間）、次いで０°Ｃに冷却した。混合物（９０μりを９００μ！の容 量に調整した。２０Ｌ卜）リス・）１ｃＩ　（ｐＨ７，５）、４ｍＭ−ＭｇＣＩ ｚ　、　１０ｍＭ・（ＮＨ４）ＺＳＯ４，０，ＩＭｌ＜ＣＩＢＳＡ　５０μｇ　 ／ｍ１および０．１ｎ＋？ｌβ−ＮＡＤを含有していた。大腸菌ＤＮＡ　リガー ゼ６μｇを添加し、次いで溶液を１２°Ｃで一夜インキユベートした。
工程５：ＤＮＡによるＲＮＡ鎖の置換。挿入物のＲＮＡ鎖を置換するために、リ ゲーシジン混合物を、４種の　デオキシヌクレオシド三すン酸各４０μＭ　、０ ．１５ｍＭ　・β−ＮＡＤ、追加の大腸菌ＤＮＡ　リガーゼ４μｇ　、　１６Ｕ の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ　（む上Ｊ）および９Ｕの大腸菌１１１Ｎアーゼ Ｈを含有すべく調整した。この混合物（９６０μｍ２＞　を順次、１２゛Ｃおよ び室温で各１時間インキュベートして、Ｐｏｌ　Ｉによる修複合成およびニック トランスレーションを促進した。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、）、６９：　２１１０−２１１４　（１９７２ ）　）の方法をわずかに変更したものにより行われた。大腸菌に一１２株ｈｃｘ ０６１　（エム・カサダバンおよびニス・コーエン、ジェイ・モレ・バイオ口・ （Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）　１３８：　１７９−２０７　（１９８０）を３７ °ＣでＬ−プロス３００ｄ中において、６００ｎｍで０．５吸光単位になるまで 増殖させた。細胞を遠心分離により採取し、３０戚の１０ｍＦバイパス（ｐ）１ ７）６０ｍ＋’ｌ−ＣａＣ１ｚ　、１５％グリセリンに縣濁し、０°Ｃで５分間 遠心分離した。細胞を上記緩衝液２４ｄに再両温し、再びＯ″Ｃで５分間インキ ュベートした。次いでアリコートの細胞縣濁液をＤＮＡ溶液（工程５）０．１ｍ と混合し、０°Ｃで２０分間インキュベートした。次いで細胞を４２°Ｃに２分 間保持したのち室温に１０分間保持した。次いでＬ−プロス１２を添加し培養物 を３７°Ｃで６０分間インキュベートした。アンピシリンを５ｃＩｇ／ｍｆｌの 濃度にまで添加した。培養物を３７°Ｃでさらに１０時間振とうした。
この培養物の希釈液を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含有するし一ブロス寒天 上に広げた。３７°Ｃで１２〜２４時間インキュベートしたのち各コロニーを無 菌のつまようじで採取した。全体として約ｌＸｌ０’の独立したｃＤＮＡクロー ンが得られた。
Ｄ、　ｐｃＤ　ライブラリーのスクリーニング。
Ｔ細胞ｃＤＮＡライブラリーから１０４の単一クローンをランダムに採取し、ア ンピシリン５０μｇ／ｄおよびジメチルスルホキシド７％を含むＬ−ブロス２０ ０μｌを入れたマイクロタイクーデイソシュのウェル中で別個に増殖させた。新 規なＭＣＧＦ活性のみに注目するために、５３個のＩＬ−３ｃＤＮＡクローンお よび１個のＧＭ−Ｃ５Ｆ　ｃＤＮＡクローンを、リーら、ブロシ・ナショナル・ アカデ・サイ、＋　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）、８２巻、　 ４３６０−４３６４頁（１９８５）およびヨコタら、ブロシ・ナショナル・アカ デ・サイｘ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、）＋　８１巻、　１０ ７０−１０７４頁（１９８４）により示されたクローンから構成された適宜な３ Ｚｐ標識ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａプローブとのハイブリダイゼーションにより同定し、除 いた。この処理は下記に従って行われた。培養物９６種の各プレートのレプリカ をニトロセルロースフィルター上に作成し、ハイブリダイゼーションスクリーニ ングに用いた。ハイブリダイゼーションは６ＸＳＳＰＥ　（ＩＸＳＳＰＥ・１８ ０　ｍＭ　・ＮａＣ１；　１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，４）　；　１　 ｍＭ　・ＥＤＴＡ）０．１χＳＤＳ　、　１００μｇ／ｄ大腸菌ｔＲＮＡ、　５ ０％ホルムアミド中で４２°Ｃにおいて１６時間行われた。ハイブリダイズする クローンは洗浄フィルターのオートラジオグラフィーにより同定された。これら のクローンを含むミクロタイターウェルをクローンプールの調製前にエタノール で滅菌することにより、これらのクローンを除いた。４８個までのｃＤＮＡクロ ーンを含むプールをミクロタイター培養物から調製した。この種のプール２００ 個を、アンピシリン１００μｇ／ｄを含有するし一プロスの培養物ｌｌ中で増殖 させた。プラスミドＤＮＡを各培養物から単離し、２回のＣｓＣ１濃度勾配によ り精製した。各プールを表すＤＮＡを下記によりＣＯ３７モンキー細胞にトラン スフェクションした（ＣＯ５７細胞についてはグルラマンにより旦２３巻、　１ ７５−１８０頁（１９８１）に記載されており、ＡＴＣＣから受理番号ＣＲＬ１ ６５１で入手できる。）トランスフェクションの１日前に、１０％ウシ胎仔血清 および２＋ａＭグルタミンを含有するＤＭＥに、１００　ｎｕｎのプレート上に おいて、約１０’個のＣＯ５７モンキー細胞を接種した。トランスフェクション を行うために、培地を各プレートから吸引除去し、５０ｍＭトリス・ＨＣＩ　（ ｐＨ７，４）、４００μｇ／ｄ・ＤＥＡＥ−デキストランおよび被験プラスミド ＤＮＡ　５０μｇを含有するＤＭＥ４ｍで置換した。
プレートを３７”Ｃで４時間インキュベートし９次いでＤＮＡ含有培地を除去し 、各プレートを血清王台の０Ｍ２５ｄで２回洗浄した。
クロロキン１５０μｈを含有するＤＭＥをプレートに添加し、次いで３７°Ｃで さらに３時間インキュベートした。プレートをＤＭＥで１回洗浄し、次いで４％ ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加 した。次いで細胞を３７°Ｃで７２時間インキュベートした。増殖培地を採取し 、種々のバイオアッセイ法において評価した。
最初の１組のプラスミドプールを主として増殖アッセイ法により、ＴＣＧＦ活性 およびＭＣＧＦ活性についてそれぞれＨＴ−２細胞系列（下記に、より詳細に記 述する）およびＭＣ／９細胞配列を用いてスクリーニングした。これら２細胞系 列についてアッセイした最初の１１０プールのうち８プールはＨＴ−２ＴＣＧＦ アツセイにおいて有意の活性を生じた。これらのプールのうち数種は弱いが有意 のＭＣＧＦ活性を示したけれども、ＭＣＧＦ活性は一般により弱くかつより変動 性であったため、本発明者らは陽性プールの同定のためこのアッセイ法を信顛し なかった。
ランダムプールトランスフヱクションによるＣＯ３７上層液の約半数はマウスＢ 細胞に対するＩａ誘導活性についてもアッセイされた。被験プールのうちＴＣＧ Ｆ活性について有効であることが示された各プールはＩａ誘導活性も備えている ことが認められた。
従ってＴＣＧＦ活性と！ａ誘導活性の間には完全な相関関係があった。
すべてのアッセイにおいて再現性をもって最も有効であった１プール（２Ａ）を 、より小さな４８のサブプールに小分割した。これらのサブプールはＭＣＧＦお よびＴＣＧＦ活性の双方について陽性であった０両サブプールに共通の単一クロ ーン、（２Ａ−Ｅ３）を次いで別個に増殖させ、そのプラスミドＤＮＡを前記の ＣＯ５７細胞にトランスフェクションした。次いで生じたＣＯ３上層液を各種活 性の存在についてアッセイした。これにはＭＣＧＦ、　ＴＣＧＦ、　Ｉａ誘導、 ならびにＩｇＥおよびＩｇＧ増強活性が含まれていた。
クローン２Ａ−Ｅ３から単離し、２ｔｐで標識した３６６塩基対の長さをもつＰ ｓｔ　Ｉ断片（第１Ａ図）をプローブとして用いて、生物活性について陽性であ ったプールおよび他の未試験プールをスクリーニングした。スクリーニングは前 記のようにマイクロタイター培養物のレプリカを作成したフィルターへのハイブ リダイゼーションによって行われた。ハイブリダイズした９クローンを単離し、 それらのＤＮＡを制限マツピングにより分析した。
生物活性を示したプールはすべて、クローン２Ａ−Ｅ３と共通の制限開裂地図を 共有する少なくとも１種のハイブリダイズクローンを含んでいた。採取したクロ ーン１０’のうちハイブリダイズクローンは、総うイブラリー中約０．２％の頻 度を示す。被験ハイブリダイズクローンのうち約９０％が機能性蛋白質を発現し た。
Ｅ、ｐｃＤ　２Ａ−Ｅ３でトランスフェクションしたＣＯＳ？モンキー細胞の培 養上層液の生物活性 ｐｃＤ−２Ａ−Ｅ３でトランスフェクションしたＣ０Ｓ７細胞からの上層液ヲ、 ネズミヘルパーＴ細胞系列ＨＴ−２においてＴｃＧＦ活性ニつき試験した（ワト ソン、−２）、仁ニノ≧乞２ごｔユノｊ−不ユーＬ飄エヮエＭｅｄ、）、Ｖｏｌ 、１５０巻、　１５１０頁（１９７９）に記載）。モスマン（前掲）の比色アッ セイ法により測定した）ＩＴ−２細胞の増殖をＴＣＧＦ活性の尺度として用いた （増殖の程度は５７０〜６３０ｎｍの光学濃度（ＯＤ）と相関関係にあった）。
第３Ａ図は種々の希釈度における（ｉ）　ｐｃＤ−２Ａ−Ｅ３でトランスフェク ションしたＣＯ５７細胞から得た上層液（曲線１）　、（ｉｉ）　Ｃ１，Ｌｙｌ ”　２−　／９培養物から得た上層液（曲線２）、（ｉｉ　）　ＩＬ−２ｃＤＮ Ａを保有するｐｃＤプラスミドでトランスフェクションしたＣＯＳ？細胞から得 た上層液（曲線３）および（ｉｖ）　ｃＤＮＡ挿入物を含まないｐｃＤプラスミ ドでトランスフェクションしたＣＯ３７細胞（すなわち“モック（ｍｏｃｋ）” 　トランスフェクション）から得た上層液（曲線４）の相対的ＴＣＧＦ活性を示 す。
同様に、ｐｃＤ−２Ａ−Ｅ３　）ランスフエクションしたＣＯ５７１！Ｉ胞から 得た上層液をＭＣ／９細胞におけるＭＣＧＦ活性について試験した。この場合も モスマンの比色アッセイ法を採用してＭＣ／９増殖を測定した。第３Ｂ図は（ｉ 　）　ｐｃＤ−２Ａ−Ｅ３でトランスフェクションしたＣ０Ｓ７細胞から得た上 層液（曲線１）、（ｉｉ　）　ＩＬ−３ｃＤＮＡを保有するｐｃＤプラスミドで トランスフェクションしたＣ０Ｓ７細胞から得た上層液（曲線２）、（ｉｉ　） 　Ｃ１，Ｌｙｌ’　２−　／９細胞から得た上層液（曲線３）、および（ｉｖ　 ）モックトランスフェクションしたＣＯ５７細胞から得た上層液（曲線４）の相 対的ＭＣＧＦ活性を示す。
第３Ｃ図は（ｉ）　ｐｃＤ−２Ａ−Ｅ３でトランスフェクションしたＣＯ５７細 胞の上層液（曲線１）、（ｉｉ　）　Ｃ１，Ｌｙｌ”　２−　／９細胞の上層液 （曲線２）、および（ｉｊ）モックトランスフェクションしたＣＯ５７細胞の上 層液（曲線３）について行ったＩａ誘導アッセイの結果を示す。Ｉａ誘導アッセ イはレームら（前掲）により記載された方法に従って行われた。数匹のＤＢＡ／ ２マウス（２〜３が方今）を層殺し、肺臓を外科処置により採取した。０．８７ ！塩化アンモニウムを用いる低張ショックにより赤血球を細胞溶解した。
次いで、Ｔ細胞特異性表面マーカー（Ｔｈｙ−ｔ、　Ｌｙｔ−１＋およびｔ、ｙ ｔ−２）指向性の細胞毒性モノクロナール抗体を用いてＴ細胞を溶解し、次いで 家兎補体中でインキュベートした０次いで、ファイルコル−ハイバーク密度勾配 により死細胞を除去した。
付着性細胞は３７°Ｃプラスチック製シャーレに付着させることによりあらかじ め除去されていた。この時点で細胞を洗浄し、計数し、生存率につき採点した。
１０％のウシ胎仔血清、２−メルカプトエタノールおよび各種構成物質（ペニシ リン、ストレプトマイシンおよびゲンタマイシン）を補充した組織培養用培地（ ＲＰＭ１１６４０、または最小必須培地−ＭＥＭ／アーレの塩（ジブコ）０．５ 　ｄ中で約１００万個の細胞をインキュベートした。陽性の対照がＴ細胞首糸分 裂誘発因子コンカナバリンＡで誘発したＴ細胞からの上層液よりなる実験におい ては、１０■／ｄ　（最終濃度）のα−メチルマンノシドを添加して、有糸分裂 誘発因子を中和した。２４時間のインキュベーションののち、細胞を採取し、抗 −Ｉ−Ａ’または抗−Ｉ　Ａｈａ　モノクローナル抗体による染色のために調整 した。これらの抗体をハプテンＮ、１．Ｐまたはビオチンのいずれかに結合した 第１段階抗体として用いた。次いで細胞を蛍光処理した第２段階試薬（抗−ＮＩ Ｐ抗体またはアビジン）と共にインキュベートすることにより、染色を完了した 。
次いで蛍光活性化細胞ソーター（ベクトンーディッキンソン、カリフォルニア州 、マウンテンビュー）またはサイトフルオログラフ（オルト・ダイアグノスティ ックス、マサチュセソツ州ケンブリッジ）を用いて蛍光染色の強度を測定した。
第３Ｃ図の蛍光単位は、各試料中の陽性細胞の％に蛍光染色の強度を掛けること により算出された。
第３Ｄ図はＩｇＥおよびｒｇｃ、の産生がＴ細胞枯渇したマウス肺臓細胞におい て（ｉ　）　ＣＯ３７培地のみ（棒１）、（ｉｉ）モックトランスフエクション したＣＯ５７細胞からの上層液２０％（棒２）、８（ｉｉｉ　）　Ｃ１，Ｌｙド ２−７９からの上層液１０χブラスモツクトランスフエクシジンしたＣＯ３７細 胞からの上層液２０％（棒３）、および（ｉｖ）　ｐｃＤ−２Ａ−Ｅ３　）ラン スフエクションしたＣ０Ｓ７細胞からの上層液２０％（棒４）により誘発される 程度をグラフで示す。ＩｇＢおよびＩｇＧ、の水準は前記の同基準標本特異性Ｅ ＬＩＳＡにより測定された。
ネズミｌシー４はＭＣ／９細胞においてＩＬ−３のＭＣＧＦ活性を高めることが 認められた（スミスおよびレニツク、ブロシ・ナショナル・アカデ・サイ、、（ Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）、８３巻、　１８５７−１８６１頁 （１９８６））、ネズミＩＬ−４はＩＬ−３依存性細胞系列のＧＭ−ＣＳＦ刺激 による増殖を高めることも認められた（ホームズら、ブロク・ナショナル・アカ デ・サイ、、（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）＋８２巻、６６８７ −６６９１　（１９８５）に記載）。挿入物はマキサマおよびギルバー法（Ｌソ ッズ・イン・エンサイモロジー。６５巻、４９９−５６０頁（１９８０））、な らびにサンガー法（ブロク・ナショナル・アカデ・サイ、。
（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）、７４巻、　５４６３−５４６７ 頁（１９７７））の双方により配列決定された。第１Ａ図にその配列を、第１　 ＡＴＧ開始コドンと同相の最長オーブンリーディングフレームについての推定ア ミノ酸配列と共に示す。マウス２Ａ−Ｅ３　ｃＤＮＡクローンにおける単一長鎖 オープンリーディングフレームは１４０アミノ酸残基からなる。このリンフ才力 インは分泌蛋白質であるので、疏水性リーダー配列が分泌形の成熟蛋白質に関す る配列に先行すると予想される。ポリペプチドの疏水性を分析し、先行するシグ ナルペプチドに関して提示されたコンセンサス配列（パールマンら、ジェイ・モ レ・バイオ口・（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）、１６７巻、３９１−４０９頁（１ ９８３）　）と比較することにより、前駆ポリペプチドの開裂は第１Ａ図のアミ ノ酸位置２０におけるセリン残基に続いて起こることが示唆される。グラブシュ タインら（ジェイ・エクスペ・メディ・（Ｊ、Ｅｘ　、Ｍｅｄ、）、１６３巻、 　１４０５−１４１４頁（１９８６））は分泌されたネズミＩＬ−４のＮ−末端 配列が第１Ａ図の位置２１Ｈｉｓにおいて開始することを確認した。
実施例■、ヒトヘルパーＴｉ胞ｃＤＮＡに・するネズミｃＤＮＡプローブによる ヒトＩＬ−４の産生ならびにＣＯ５７モンキー細およびマウスＬ細胞における一 過性 誘導ヒトヘルパーＴ細胞、２Ｆ１、および誘導ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）か ら構成されたｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーより、ネズミｃＤＮＡプローブによっ てＩＬ−４をコードするｃＤＮＡクローンを単離した。
ＢＣＧＦ活性を生じることが知られている他のヒト細胞系列にはＣＥＭ系列の変 種が含まれ、ＡＴＣＣから受理番号ＣＣＬ　１１９．　ＣＲＬ８４３６、および ＴＩＢ　１９５で入手でき、フォーシーら、キャンサー。
１８巻、５２２−５２９頁（１９６５）　、およびクグラー、リンフォヵイン・ リサーチ、３巻、１８３−１９１頁（１９８４）に記載されている。
ヒトヘルパーＴ細胞クローン、２Ｆ１、およびヒトＰＢＬを、ウシ胎仔血清３％ を補充したイスコブの培地で増殖させた。２Ｆ１細胞をＣｏｎＡ　（１０ｕ　ｇ 　／　ｍｌ　）で活性化し、ＰＢＬをＰＮＡ　１　ｐｇ　／ｍＲで１２時間刺激 したのち５μｇ／ｒｎＲのＣｏｎＡを添加した。ＣｏｎＡ添加の４時間後（２Ｆ １）または１０時間後（ＰＢＬ　）に細胞を採取した。
ｍＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡライブラリーの構成は実施例■の記載に従って行 われた。Ｐｓｔ　Ｉ断片をマウスｐｃＤ−２Ａ−Ｅ３　ｃＤＮＡクローンから単 離し、ニックトランスレージジンにより標識し、（ＩＸＩＯ＠ｃｐｍ／μｇ　） 　１．１０個のプール（それぞれ約１×１０３クローンの２Ｆ　１　ｃＤＮＡラ イブラリーを表わす）からのプラスミドＤＮＡ　ｌｉ製物を含むじトロセルロー スフィルターのプローブ検出に用いた。低ストリンジエンシーハイブリダイゼー ション条件（４２°Ｃで一夜）を採用しした。６ｘＳＳＰＥ（１ｘＳＳＰＥ＝１ ８０　ｍＭ　−ＮａＣ１／１０ａ＋Ｍリン酸ナトリウム（ｐ’Ｈ７，４）　／　 １　ａ＋Ｍ・ＥＤＴＡ）　（ティー・マニアチスら、＼　クローニング二　−室 の　（コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、ニューヨーク、１９８ ２））、　２０％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒド、０．１％　ドデシル硫酸ナトリ ウム、酵母キャリヤーｔＲＮＡ　１００μ！。フィルターを２　Ｘ５ＳＰＥ、　 ０．１％ドデシル硫酸ナトリウムで３７°Ｃにおいて洗浄した。
単一クローン（ｐｃＤ−４６）が１０中１個のプールにおいて同定さた。他のク ローンが、　ｐｃＤ−４６のＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片（第２Ｄ図の制限地図に 示す）から構成されたプローブを用いてＰＢＬ　ｃＤＮＡライブラリーをスクリ ーニングすることにより得られた。制限酵素による分析からこれらのＰＢＬクロ ーンの構造はｐｃＤ−４６と等しいことが示された。
ｐｃＤ−４６のコード部位挿入物から５′　（すなわち上流）方向のグアニジン に冨む領域がＩＬ−４ポリペプチドの発現を抑制することが見出された。従って ｐｃＤ−４６の挿入物を再クローニングしてグアニジンに冨む領域を除去した。
得られたクローンはｐｃＤ−１２５と表示される。マウスＬ細胞をｐｃＤ−４６ でトランスフェクションすることによっても発現が改良されることが見出された 。
ベクターｐｃＤ−１２５は下記により形成さた。ｐｃＤ−４６を虱３Ａで開裂し て、ｃＤＮＡ挿入物の５′側１′６２ヌクレオチドを含む断片（ＧＣセグメント を除く）を単離し、次いでこの断片をｐｌｏｌのＩＩＩ部位に挿入した。プラス ミドｐ１０１はｐｃＤマウスＩＬ−３（ヨココタら、（１９８４）前掲文献参照 ）から誘導され、ｃＤＮＡの５′末端のＰｓｔ　Ｔ部位からマウスＩＬ−３ｃＤ ＮＡ内の１Ｈ部位までの配列を欠失していた。」Ｌ■部位は欠失配列のジャンク ションに含まれる。Ｓａｕ　３Ａ断片をｐｃＤ−４６断片の場合と同様にＳＶ４ ０プロモーターに融合させた（ＧＣセグメントを除く）。次いでｃＤＮＡの３′ 末端、ＳＶ４０ポリＡ部位、およびｐｃＤ−４６のすべてのｐＢ！２３２２配列 を保有するｐｃＤ−４６からのＨｉｎｄ　ｍ　／　Ｎｈｅｉ断片を用いてヒ）　 ｃＤＮＡの残部を再構成した。
ｐｃＤ−４６−およびｐｃＤ−１２５−）ランスフェクションされたＣ０Ｓ７お よびＬ細胞の上層液をＢＣＧＦおよびＴＣＧＦ活性についてアッセイした。ＴＣ ＧＦはエプスタイン−パルウィルスで形質転換されたヒトヘルパーＴ細胞系列北 −ＥＢＶ、およびフィトヘマグルチニン刺激されたヒト末梢血リンパ球を用いて アッセイされた。
ヒトヘルパーＴ細胞りローン几−ＥＢＶを、ヒ）　ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系列の 照射（４５００Ｒ）細胞で刺激したのち、１０％ヒ）ＡＢ血清、５０μ）’ｌ− ２メルカプトエタノール（２ＭＥ）および組換えヒトＩＬ−２を含有するＲＰＭ １１６４０培地中に維持した。ヒトＰＢＬをＰＨＡ　（２０μｇ／ｄ）で刺激し 、１０％ウシ胎仔血清、５０μＨ・２肝および組換えヒ）　ＩＬ−２を含有する ＲＰＭ１１６４０中に維持した。刺激の５〜１０日後にＪＬ−ＥＢＶ細胞または ＰＨＡブラスト（ｂｌａｓｔ）をモスマンの比色法（前記）による２日間のＴＣ ＧＦアッセイ法または（３Ｈ）　−チミジン取込みによる３日間のＴＣＧＦアッ セイ法においてターゲットとして用いた。
第４Ａ図は、ＪＬ−ＥＢＶ細胞により測定した（比色アッセイ法）（ｉ）ヒトＩ Ｌ−２を発現するｐｃＤプラスミドでトランスフェクションしたＣ０Ｓ７細胞か らの上層液（曲線Ａ）　；　（ｉｉ　）　ｐｃＤ−１２５でトランスフェクショ ンしたし細胞からの上層液（曲線Ｂ）；（ｎｉ　）　ｐｃＤ−１２５でトランス フェクションしたＣＯ５７細胞からの上層液（曲線Ｃ）　；　（ｉｖ）　ｐｃＤ −４６でトランスフェクションしたＣＯ５７細胞からの上層液（曲線Ｄ）；およ び（Ｖ）モックトランスフェクションしたＣ０Ｓ７細胞からの上層液（曲線Ｅ） のＴＣＧＦ活性を示す。第４Ｂ図はＰＨＡ刺激したＰＢＬにより測定した（比色 アッセイ法）（ｉ）ヒトＩＬ−２を発現するｐｃＤプラスミドでトランスフェク ションしたＣ０Ｓ７細胞からの上層液（曲線Ａ）、（ｉｉ）ｐｃＤ−１２５でト ランスフェクションしたＣＯ３７細胞からの上層液（曲線Ｂ）、および（ｉｊ） モックトランスフエクションしたＣＯ３７細胞からの上層液（曲線Ｃ）のＴＣＧ Ｆ活性を示す。第４Ｃ図はＰＨＡ刺激されたＰＢＬにより測定された（トリチル 化チミジン取込みアッセイ法）　（ｉ　）　ｐｃＤ−１２５でトランスフェクシ ョンしたＣ０Ｓ７細胞からの上層液（曲線Ａ）、（ｉｉ）ヒ）　ＩＬ−２を発現 するｐｃＤプラスミドでトランスフェクションしたＣ０Ｓ７細胞からの上層液（ 曲線Ｂ）、および（ｉｊ）モックトランスフェクションしたＣＯＳ？細胞からの 上層液（曲線Ｃ）のＴＣＧＦ活性を示す。
ｐｃＤ−１２５）ランスフェクション上層液の各種希釈液のＢＣＧＦ活性を、マ イゼルら、（ブロシ・ナショナル・アカデ・サイ、。
（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）＋　７９巻、　５９９８−６００ ２頁（１９８２））により報告されたＢＣＧＦ　（″市販ＢＣＧＦ”）（サイト カイン・テクノロジー・インターナショナルにューヨーク州バッファロー）から 市販されている）の活性と比較した。表■は抗１ｇＭ抗体により予備活性化した Ｂ細胞に対するＣ０Ｓ７　）ランスフェクション上層液の各種希釈液のＢＣＧＦ 活性を示す。Ｂ１１１ｌ胞は前記アッセイの章の記載に従って調製された。
表１１　、　ＩＬ−４ｃＤＮＡ　）ランスフェクション上層液が抗１ｇＭ予備活 　ヒされたＢ細胞に与える≦響 表■はＳＡＣ予備活性化されたＢ細胞（前記により調製）における、ＣＯ５７ト ランスフエクシヨン上層液の各種希釈液のＢＣＧＦ活性を示す。
表Ｉ［１，ＳＡＣ予備活性化されたＢ細胞におけるＩＬ−４ｃＤＮＡ上５ｙ入Ｚ 五又之ｌ）上ｌ掻（２）蛮立−−−−−一本発明のヒトＩＬ−４および市販のＢ ＣＧＦは共にＢＣＧＦ活性を示すがメータら（ジェイ・イムノロ・（Ｊ、Ｉｍｍ ｕｎｏｌ、）、１３５巻、　３２９８−３３０２頁（１９８５）は市販のＢＣＧ ＦのＢＣＧＦ活性から生化学的にＴＣＧＦ活性を分離できることを証明した。こ れはその活性が別個の分子によって生じていることを示している。従ってヒトＩ Ｌ−４と市販のＢＣＧＦは異なる分子である。ヒトＩＬ−４の場合、ＴＣＧＦ活 性を標準的な生化学約分画技術によってＢＣＧＦ活性から分離することはできな いからである。
ヒトＩＬ−４ｃＤＮ八を保有するプラスミドでトランスフェクションされたＣＯ ５７細胞からの上層液は正常なヒ）Ｔ細胞およびヒトＴ細胞りローン几−ＥＢＶ の増殖、ならびにマウスＩＬ−４に類似の活性を誘発する。しかしヒトＩＬ−４ に応答して誘発されたヒトＴ細胞の最大増殖度はヒ）ＩＬ−２により誘発された ものの約半分である。
ＩＬ−４の増殖誘発活性は試験に際しＩＬ−２に対する、またはＩＬ−２レセプ ターに対するモノクローナル抗体により阻害されなかった。
これらの結果は、ＩＬ−４はＴ細胞に直接に作用し、ＩＬ−２の誘導によるもの ではないこと、またその活性はルー２レセプターにより媒介されないことを示唆 する。ＣＯＳヒトＴＬ−４上層液はビーズに結合した最適濃度の抗１ｇＭ抗体で 予備活性化されたヒ）Ｂ細胞の増殖も刺激し、ＢＣＧＦアッセイの飽和水準にお いて市販のＢＣＧＦに付加的な増殖容量をもつ。これは、ヒトルー４と市販のＢ ＣＧＦが異なる経路で、たとえば恐らく異なる組のレセプターによりＢ細胞に作 用することを示唆する。各上層液はＳＡＣで予備活性化されたＢ細胞の増殖を有 意に誘発しなかったが、ＰＨＡで刺激されたＰＢＬ培養物の上層液から精製した 市販のＢＣＧＦはＳＡＣ予備活性化されたヒ）Ｂ細胞の増殖を著しく誘発した。
これらの結果はさらに、ヒトＩＬ−４ｃＤＮＡが市販のＢＣＧＦに存在するもの と異なるＢＣＧＦ活性をコードすることを示す。
ｐｃＤ−１２５）ランスフェクションしたＣＯ７細胞の上層液を、それが扁桃［ Ｂ細胞のＦｃ−イプシロンレセプターを誘発する効力についても試験した。ヒト 扁桃腺細胞を標準法により分散させ、単一細胞Ｉ！濁液となした。前記のプロト コールによりＢ細胞集団を濃縮し、濃縮された細胞を３７°Ｃの培地中で２４時 間、抗１ｇＭ抗体により刺激した。Ｆｃ−イプシロンレセプター保有細胞をベク トン・ディッキンソンＦＡＣ５ＩＶ細胞ソーターにより、ｇ亥しセプターに特異 的な蛍光標識モノクローナル抗体を用いてボンネフォイら、　（ジェイ・イムノ ロ・メソ（（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、）＋８８巻、２５−３２頁（１９ ８６）により示された方法によりアッセイした。第５Ａ−５Ｄ図は細胞頻度（縦 軸）対蛍光強度（横軸）を示すヒストグラムである。蛍光強度は細胞上に存在す るＦｃ−イプシロンレセプターの数に比例する。すべての図において細胞は抗Ｔ ｇＭで刺激された。第５Ａ〜５Ｄ図はｐｃＤ−１２５）ランスフェクションした ＣＯ５７細胞からの０％、０．１％、１％および１０％上層液からなる培地への 暴露に相当する。
クローンＮｏ、４６のｃＤＮＡ挿入物のＤＮＡ配列を決定し、第１Ｂ図に示す、 　ｃＤＮＡ挿入物は６１５ｂｐの長さである（ポリ（Ａ）ティルを除（）。単一 オープン解読フレームがあり、最初のＡＴＧコドンは５′末端から６４ヌクレオ チドの位置にあり、これに１５３コドンが続き、ヌクレオチド位置５２３〜５２ ５の終止コドンＴＡＧで終わる。予言されたポリペプチドのＮ末端セグメントは 分泌蛋白質について予期されたように疏水性である。
本発明のヒトおよびマウスｃＤＮＡのコード部位間の比較によって、アミノ酸位 置１−９０および１２９−１４９に包含される、ｐｃＤ−４６のヒトｃＤＮＡコ ード配列の各領域は、対応するマウスｃＤＮＡ　（２Ａ−Ｅ３）コード配列領域 とほぼ５０％相同域を共有することが明らかになった。これらの領域、ならびに ５′および３・′非翻訳領域はこれら異種からの２種のｃＤＮＡ配列間でほぼ７ ０％の相同域を共有するが、ヒト蛋白質のアミノ酸９１−１２８により包含され る領域はマウスの対応する領域と共有する相同域がごく限られている。全体的に ヒト蛋白質における７個のシ又ティン残基のうち６個は関連するマウス蛋白質に おいて保守されている。天然の形の本発明のヒトポリペプチドをマウスＴＬ−３ のものとの間には若干のアミノ酸配列相同性がある。アミノ酸残基７−１６およ び１２０−１２７は、それぞれマウスＩＬ−３前駆ポリペプチドの残基１６−２ ７および４１−４９に５０％および５５％相同である（ヨコタら、ブロシ・ナシ ョナル・アカデ・サイ１．ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ。
Ｕ、Ｓ、Ａ、）　８ｔ：　１０７０−１０７４　（１９８４）　）。
のちに、より詳細に記述するように、ｐｃＤ−１２５トランスフェクションした ＣＯ３７上層液から精製したヒトＴＬ−４は第１Ｃ図に示した配列をもつ１２９ アミノ酸ポリペプチドであることが見出された。
実施例ｍ、＆式」Ｊエニ乙ヨｊ葺二り１１１食（Ｌ工１霞と王ル追２ヱＳ児ター イルス（’ＥＢＶ）由　のベクターのイ用によるＣ０Ｓ７モンキー細胞における ヒトＩＬ−４の　の増ラウス肉腫ウィルス長鎖末端反復（ＲＳＶ−ＬＴＲ）プロ モーターを含むＥＢＶ由来のベクター中へｐｃＤ−１２５のＸｈｏ　Ｔ断片を再 クローニングすることにより、ヒ）　ＩＬ−４発現が１０〜２０倍増強された。
ＥＢＶ由来のベクターおよびＲＳＶ−ＬＴＲプロモーターはボルマンら。
ブロシ・ナショナル・アカデ・サイ、、（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、）７９巻、　６７７７−６７８１頁（１９８２）　；およびエイテスら、ネ イチャー。
３１３巻、８１２−８１５頁（１９８５）に記載されている。
ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーターを含むＨ４ｎｄＩＩＩ／Ｘｈｏ　Ｉ断片を、ボルマ ンら（前掲）により記載されたＡｃｃＣＩ／Ｈｉ閃■断片を含むＲＳＶ−ＬＴＲ および市販のｐｃＤベクター（たとえばファルマシア）よりあらかじめ構成され たｐｃＤプラスミドから単離した。Ｓν４０複製原点（ｏｒｉ）を含むｐＬ１プ ラスミド（ファルマシア）から得た上記の肚己Ｉ［［／Ｘｈ虹■断片および肛ｎ ｄＩ［［／ハｏＩ断片をプラスミドＰＣＤν１　（ファルマシアから入手できる ）中へ挿入した。５Ｖ４０ｏｒｉ　ｉｉ域の向きは決定的ではない。得られるｐ ｃＤベクターはＡａｔ　１１部位とＮｄｅ　１部位の間に順次（Ａａｔ　Ｉｆ部 位から）　５Ｖ４０ｏｒｉ領域、ＲＳシーＬＴＲプロモーター、およびＳＶ４０ ポリＡ領域を含む。ｐｃＤ−１２５のＸｈｏ　Ｉ断片を単離し、新たに構成され たｐｃＤベクター中に挿入したのち、ベクター上の唯一のＡａｔ　ＵおよびＮｄ ｅ　１部位を標準法によりＳａｌ　Ｉ部位に変える。要約すると、ｐｃＤベクタ ーをＡａｔ　■およびＮｄｅ　Ｉで消化氏、ＩＬ−４を含む断片を単離し、単離 された断片を適宜な濃度のヌクレオシドトリホスフェートの存在下でＴ４　ＤＩ ＪＡポリメラーゼの５′→３　’　ＤＮＡポリメラーゼ活性が制限切断部の５′ 突出末端をフィルインし、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼの３′→５′エキソヌクレ アーゼ活性が制限切断部の３′突出末端を消化して平滑末端断片を残し、これに キナーゼ処理Ｓａｌ　Ｉリンカ−（二ニー・イングランド・バイオラポズ）をＴ ４　ＤＮＡリガーゼによりリゲートする。
上記Ｓａｌ　Ｉ断片（第１１図に示す）をエイテスら（前掲）により記載された ＥＢＶ由来ベクターｐ２０１の唯一のＣ１ａ　１部位の位置（標準法によりＳａ ｌ　ＩＩ部位に変えられている）に挿入する。要約すると、ｐ２０１　（第１１ 図に示す）をＣ１ａ　Ｉで消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩ　（クレノー断片）お よび適宜な濃度のヌクレオシド三リン酸類で処理する。この方法により、Ｃ１ａ 　Ｉ切断部の突出末端がフィルインされ、平滑末端断片が残される。次いで平滑 末端をキナーゼ処理Ｓａｌ　１リンカ−にリゲートする。得られたＲＳＶ−ＬＴ ＲＴＲ上−ターおよびＩＬ−４ｃＤＮＡ挿入因子を含むＥＢＶ由来のプロモータ ーをここではｐＥＢＶ−１７８と呼ぶ。
ｐＥＢＶ−１７８を標準法によりＣＯ５７細胞中にトランスフェクションし、培 養上層液をＩＬ−４発現の尺度としてのＴＣＧＦ活性についてアッセイした。
実施例■、大腸菌における　然のヒトＩＬ−４およびムティンＩｓ’（Ａｌａ− Ｇｌｕ−Ｐｈｅ）の ヒｌ−ＩＬ−４ｃＤＮＡ挿入物を含む２種のベクターを大腸菌におけるヒトＩＬ −４の発現用として構成した。すなわシ１己蛋白質のシグナルペプチド配列を含 むｐｌＮ−ｍ分泌ベクター（ｐｌＮ−ＩＩＩ　−ｏｍｐＡ２″）、ならびにｗＬ Ｐプロモーターおよび隣接するリポソーム結合部位（ＲＢＳ）　ＳＭ域を含むｐ Ｕｃ１２プラスミド（ＴＲＰＣＩＩ”）である。
Ａ、ｐｌＮ−Ｈｌ　−ｏｍｐＡ２ ｐｌＮ−■−ｏｍｐＡ２プラスミド（グラニブ（Ｇｈｒａｙｅｂ）　ら、　ＥＩ ＩＢＯジャーナル、３巻、　２４３７−２４４２頁（１９８４）　、およびマツ イら、バ盃オテクノロジー、２巻、　８１−８５頁（１９８４）に記載）を用い て２種のベクターを構成した。
ｐＩＮ−ＩＩＩ−ｏｍｐＡ２（１）と表示される第１ベクターは順次ＥｃｏＲＩ ／回■−消化ｐｌＮ−１１１ｏｍｐＡ２プラスミド、合成リンカ−１およびｐｃ Ｄ−１２５のＢａｍ）Ｉ　Ｉ　／ＥｃｏＲν断片をリゲートすることにより構成 された。この構成に用いた合成リンカ−は３個の追加Ｎ末端アミノ酸Ａ　］　ａ 　−Ｇ　］　ｕ　−Ｐ　ｈ　ｅ−をもつ生物活性ＩＬ−４ポリペプチドを分泌し た。
すなわちムティンＩＬ’（Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ）が分泌された。合成リンカ −は下記のヌクレオチド配列からなっていた。
ＡＡ　ＴＴＣＣＡＣＡＡＧ　ＴＧＣＧＡＴＧ　ＧＴＧ　ＴＴＣＡＣＧ　ＣＴＡ ＥｃｏＲＩ／Ｂａｎ＋旧−消化ｐＩＮ−ＩＩＩ−ｏｍｐＡ２およびｐｃＤ−１２ ５のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶ断片を、０．１μＨ合成リンカーを含有する標準リ ゲーション溶液（たとえばマニアチスら、前掲）中で混合した。大腸菌株Ａｂ１ ８９９をｐｌＮ−ｍ−ｏｍｐＡ２（１）プラスミドで感染し、形質転換体を３１ ｐ−標識付きＩＬ−４ｃＤＮＡプローブによるコロニーハイブリダイゼーション により選択した。アッセイ用のヒトＩＬ−４ちゅうしゅつ物は下記により得られ た。音波処理後に細菌培養物を遠心分離し、上層液をペレットから除去した。ペ レットを１％ＳＤＳ　、　２ｍＭジチオスレイトール、および６Ｍグアニジンで 処理した。材料を再遠心分離し、上層液を廃棄し、ペレットを４５゛ｃで３％Ｓ ＤＳおよび２Ｃジチオスレイトールで処理した。材料を再び遠心分離し、上Ｎ液 をＳ［ｌＳ　−ＰＡＧＥによりアッセイした。
ｐｌＮ−ＩＩＩ−ｏｍｐ直２）は天然ヒトＩＬ−４発現すべく構成された。
ｐｌＮ−ｆｆＪ−ｏｍｐＡ（１）構成における３種のアミノ酸付加物をｐｒＮ− ｍ−ｏｍｐＡ２のｏｍｐＡシグナルペプチド配列の部位特異性突然変異により除 去した。部位特異性突然変異はシラーおよびスミス（前掲）の記事に従って行わ れた。要約すると、匣シグナルペプチドをコードする配列を含むｐｌＮ−Ｉ［１ −ｏｍｐＡ２のハ旺／　ＢａｍＨＩ断片（グラニブらの第１図を参照されたい、 前掲）を精製し、精製された劫旦／並飢Ｉ消化した複製形（ＲＦ）のＭ１３ｍｐ １９と混合し、リゲートし、大腸菌に−１２ＪＭＩＯＩにトランスフェクション し、平板培養した。ＩＰＩＧおよびＸ−ｇａｌの存在下で透明なプラークを選択 し、増殖させ、たとえばメッシング、メソッズ・イン・エンゲイモロジー。１０ １巻（アカデミツク・プレス、ニューヨーク、１９８３）に示された方法により 一重鎖ＤＮＡを調製した。別個に、指示された塩基置換体（四角で囲んだもの） を含む下記のオリゴヌクレオチドプライマー（２３−ｍｅｒ）を合成し、リン酸 化した。
５　’　−ＧＧＡＡＴＴＣＡＧＡＡＧＣＴ田Ｃ０ＧＣＴＡＣ−３’この配列は突 然変異ｐｌＮ−１１１ｏｍｐＡ２のシグナルペプチドコード部位に第２のＨｉｎ ｄ　ｍ部位を導入する。ｐｌＮ−ＩＩＩ−ｏｍｐＡ２の旦虹／Ｂａｇ）ＩＩ　ｌ ！ｙｒ片を含むＭ１３ｍｐ１９　ＲＦにこのオリゴヌクレオチドプライマーをア ニールし、適宜な濃度のヌクレオシド三リン酸類の存在下にＤＮＡポリメラーゼ で処理した。得られたＲＦを用いてＪＦ１１０１大腸菌をトランスフェクション し、突然変異を含むプラークを標識付きオリゴヌクレオチドプローブによりスク リーニングした。選ばれたＲＦの配列はユニバーサルｌ’ｌ１３プライマーを用 いるジデオキシ配列決定法により確認された。選ばれたＲＦを増殖させ、単離し 、Ｘｂａ　ＩおよびＢａｍＨＩで消化し、精製Ｘｂａｌ／ＢａｍＨＩ断片をＸｂ ａｌ／ＢａｍＨＩ消化したｐｌＮ−Ｉ［１ｏｍｐＡ２に挿入した。　ｐＩＮ−ｍ 　ｏｍｐＡ２（２）を形成するために、ｐＩＮ−ｍ−ｏｍｐＡ２を増殖させ、精 製し、肚ｎｄｌＩｌおよびハ飢Ｉで消化し、ｐｃＤ−１２５のハ■Ｉ／ＥｃｏＲ Ｖ断片と、０．１　μＨの下記合成リンカ−を含有する標準リゲーション溶液中 で混合した。
Ａ　ＧＣＴ　ＣＡＣＡＡＧ　ＴＧＣＧＡＴＧＴＧ　ＴＴＣＡＣＧ　ＣＴ八 へ腸菌株Ａｂ１８９９にｐｌＮ−ｍ−ｏｍｐＡ２（２）プラスミドを感染させ、 形質転換体を３２Ｐ−標ｔ６ＩＬ−４ｃｏＮｐ、プローブによるコロニーハイブ リダイゼーションにより選択した。前記により調製されたＩＬ−４抽出物はｐｃ Ｄ−１２５ＣＯ５７細胞上層液に匹敵するＴＣＧＦ活性を示した。
Ｂ、ＴＲＰＣＩＩ ＴＲＰＣＩＩベクターは合成コンセンサスＲＢＳ断片をＣ１ａ　Ｉリンカ−（Ａ ＴＧＣＡＴ）にリゲートし、得られた断片をＣ１ａ　Ｉ制限ｐＭＴ１１ｈｃ（あ らかじめＣ１ａ　１部位を含むべく修飾されている）中へクローニングすること により構成された−　１）ＭＴｌｌｈｃはπシＸブラスミカー領域を保有するｐ ＢＲ３２２の小型（２，３Ｋｄ）高コピー＾ＭＰ”。
ＴＥＴＳ誘導体である。これはｐＭＴｌｌｈｃをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで （ＣＡＴＣＧＡＴＧ）　とリゲートさせ、これによりＥｃｏＲＩおよびｌｌａｍ Ｈ１部位を再形成し、Ｓｍａ　１部位をＣ１ａ　１部位で置換することによって 、Ｃ１ａ　１部位を含有すべく修飾された。
ＴＲＰＣＩＩ構成からの一形質転換はＣ１ａ　１部位によりフランクされた縦列 ＲＢＳ配列を含んでいた。Ｃ１ａ　１部位の１つおよびＲＢＳ配列の第２コピー の一部は、このプラスミドを、　、　Ｐｓｔ　Ｉで消化し、皿１ヌクレアーゼで 処理し、ＥｃｏＲＩで制限し、４種すべてのデオキシヌクレオチド三リン酸類の 存在でＴ４　ＤＮ八へリメラーゼで処理することにより除去された。得られた３ Ｏ−４０ｂｐ断片をＰＡＧＥにより採取し、Ｓｍａ　Ｉ制限ｐＵｃ１２中へクロ ーニングしンザイモロジー、１０１巻、１５５頁（アカデミツク・プレス・ニュ ーヨーク、１９８３）に記載）から誘導された２４８８ｂｐ　大腸菌旦Ｐ保有Ｅ ｃｏＲＶ断片をＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、ＴＲＰＣＩＩの構成を完了し た。これを第２図に示す。
ＴＲＰＣＩＩをまずＣ１ａ　ＩおよびＢａｍＨＩで消化し、これを精製し、次い で０．１　μＭの下記合成リンカ−を含有する標準リゲーション溶液中でｐｃＩ ｌｌ二１２５のＥｃｏＲＶ　／Ｂａｍ）ＩＩ断片と混合することによって、ＴＲ ＰＣＩＩをヒ）　ＩＬ−４ｃＤＮＡに関するベクターとして用いた。
ＴＣＧ　ＡＴＧ　ＣＡＣＡＡＧ　ＴＧＣＧＡＴＡＣＧＴＧ　ＴＴＣＡＣＧ　ＣＴ Ａ 挿入物を含むベクターを前記に従って選択し、大腸菌に一１２株ＪＭＩＯＩ中で 増殖させた。■シー４は下記により抽出された。ＪＭＩＯＩ細胞をそれらの培地 中で音波処理し、遠心分離した。ペレットを４Ｍグアニジンおよび２ｎ＋Ｍジチ オスレイトールに再両温し、再び遠心分離した。上層液を生物活性につき試験し 、ｐｃＤ−１２５トランスフエクシヨンしたＣＯＳ？細胞の上層液のものに匹敵 するＴＣＧＦ活性を示すことが認められた。
実施例Ｖ、ウシヘルパーＴ細胞ｃＤＮＡライブラリーに・するマウスおよびヒト ＩＬ−４ｃＤＮＡブローフ゛によるウシＴＬ−４の言周ＩおよびＣ０Ｓ７モンキ ー細胞における一過性マウスおよびヒ）　ｃＤＮＡプローブの組合わせにより誘 発されたウシ末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から構成されたｃＤＮＡライブラリーよ り、ＩＬ−４をコードするｃＤＮＡクローンを単離する。ウシｃＤＮＡの代替供 給源にはＡＴＣＣのＮＢＬ動物系列コレクションに維持される数種のウシ細胞系 列が含まれる。処理法は実施例２に記載されたものと実質的に等しい。ＣｏｎＡ による誘発の約１０時間後に細胞を採取する。ｍＲＮＡの抽出の場合と同様に行 われる。
マウスおよびヒトｃＤＮＡプローブを共に混合物として、または順次用いて、ウ シＩＬ−４ｃＤＮＡを検出する。実施例■の場合と同様に、ハ［ト断片をマウス ｐｃＤ−２Ａ−Ｅ３　ｃＤＮＡクローンから単離する。
同様にハ↓」断片をヒトｐｃＤ−１２５ｃＤＮＡクローンから単離する。
他の数種の断片もこれからプローブを構成するためにもちいることができる。単 離されたハ（Ｉ断片を一緒に、または別個にニックトランスレーションにより標 識しく約Ｉ　ＸＩＯ”　ｃｐｍ／μｇ）、これを用いて１０プールからのプラス ミドＤＮＡ　ｔＡ製物を含むニトロセルロースフィルターをプローブ検出する。
各プローブは約１０００クローンのｇ導ＰＢＬ　ｃＤＮＡライブラリーを示す。
フィルターハイブリダイゼーションは実施例■の場合と同様に行われた。
陽性に採点されるクローンを同定し、増殖させた。
実施例■、ビール酵母菌における　然ヒトＩＬ−４およびムティンΔ１−４およ びＩＳ’（Ｇｌ　−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｇｌ　）の。
天然ヒトＩＬ−４ｃＤＮＡおよびそれらの２種の突然変異体をプラスミドｐＭＦ −２８中にクローニングし、ビール酵母菌において発現させた。ｐＭＦ−２８の 構成および非酵母蛋白質発現への利用についてはミャジマら、ジーン、３７巻、 　１５５−１６１頁（１９８５）　：おミャジマされている。ｐ）’ＩＰ−２８ はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（マリーランド州、ロックビ ル）に受理番号４０１４０で寄託されており、プラスミドの地図は第１３Ａ０図 に示されている（図中の表示はミャジマら、ジーン、（前掲）に詳細に定義され ている）。
Ａ、ヒトＩＬ−４ムティンΔ１−４ プラスミドｐｃＤ−１２５を単離し、ＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで消化した。
ヒトＩＬ−４ｃＤＮＡをふくむＥｃｏＲＶ　／Ｂａ■■を単離し、ＤＮＡポリメ ラーゼ■　（ルレノー断片）で処理してハ１■切断部をフィル−インし、キナー ゼ処理した（すなわちリン酸化）。ｐＭＦ−２８をＳｔｕ　Ｉで消化し、ｐｃＤ −１２５のキナーゼ処理ＥｃｏＲＶ　／ＢａｍＨＩ断片と標準リゲーション溶液 中で混和し、プラスミドｐｈｌＬ−４−２を形成した。ｐｈＩＬ−４−２を用い てビール酵母菌２０Ｂ−１２（ＭＴＡアルファｔｒｐ　１−２８９　ｐｅｐ４− ３）　（酵母遺伝子保存センター、カルフォルニア大学、バークレーから入手し た）を形質転換した。アミノ酸不含のイースト・ナイトロジェン・ベース０．６ ７χ、グルコース２％およびカザミノ酸（ディフコ）０．５χを含有する合成培 地で酵母を増殖させた。酵母細胞を上記プラスミドでイト−ら、（ジェイ・バタ テリオロ・（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）、１５３巻、　１６３−１６８頁（１ ９８３）　）の酢酸リチウム法により形質転換し、形質転換体をトリプトファン 欠如合成培地において選択した。形質転換体培養物上層液をＴＣＧＦ活性につい て試験した。第１３Ｂ図（曲線Ｄ）はｐｈＩＬ−４−２形質転換した酵母細胞か ら得た上層液の希釈液数種のＴＣＧＦ活性を他の因子と比較して示す（曲線Ａ− ・−・−ヒ）　ＩＬ−２；曲線Ｂ・−・・・−・ｐｃＤ−１２５）ランスフェク ションしたＣＯ５７細胞からの上層液；および曲線Ｃ−・−−−−−ｐ　ｈ　Ｉ 　Ｌ　−４−２形質転換した酵母細胞がらの上層液）。曲線ＥはＩＬ−４ｃＤＮ Ａ挿入物を欠如したｐＭＦ−２８で形質転換した酵母（すなわち“千ツク（ｍｏ ｃｋ）”形質転換体からの上層液のＴＣＧＦ活性を示す。
Ｂ、ヒトＩＬ−４ムティンｌ５０（Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ− Ｇｌｙ）ムティンＩｓ’　（Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ ）の発現のためのｐＭＦ−２８挿入物をムティンΔト４の場合と同様に調製した 。ただしｐｃＤ−１２５由来のＮａｅ’ｌ／　ＢａｍＨＩ断片を用いた。得られ たプラスミドをｐｈｌＬ−４−１と表示した。ｐｈｌＬ−４−１形質転換した酵 母細胞から得た上層液の希釈液数種類をＴＣＧＦ活性につき試験した。結果は第 １３Ｂ図の曲線Ｃによって示される。上層液を抗１ｇＭおよびＳＡＣ活性化Ｂリ ンパ球の双方においてＢＣＧＦ活性についても試験した。これらのアッセイは前 記に従って行われ、結果は表■にＣ０酵母における天然ヒ）　ＩＬ−４の発現ま ずＮ末端旧Ｓコドンの上流に塩基を挿入することによりｂ工」制限部位を形成す ることによって、ヒト天然ＩＬ−４をコードするｃＤＮＡをｐＭＦ−Ｃ８にクロ ーニングした。カｗ−■で開裂し、ＤＮＡポリメラーゼＩで処理したのち、平滑 末端ＩＬ−４ｃＤＮＡをｐＭＦ−Ｃ８のＳｔｕ　１部位に挿入した。紅と１部位 は標準的な部位特異性突然変異誘発を採用して形成された。要約すると、ｐｃＤ −１２５をＢａｍＨＩで消化し、ヒ）　ＩＬ−４ｃＤＮＡ全体を含む断片を単離 し、Ｍ１３ｍｌ）８のＢａｍ）ＩＩ部位へ挿入した。この挿入物を含む一重鎖Ｍ １３ｍｐ８を単離し、プライマーとして作用する下記の合成オリゴヌクレオチド にハイブリダイゼーションした。
５’　−ＴＣＣＡＣＧＧＡロロＣＡＣＡＡＧＴＧ　−３’挿入されたヌクレアー ゼを四角で囲んだ。突然変異ＩＬ−４ｃＤＮＡを含むプラスミドをオリゴヌクレ オチドプローブにより同定し、増殖させ、単離し、Ｋｐｎ　ｌおよびＢａｍＨＩ で処理した。にｐｎＩ／ＢａｍＨＩ断片を単離し、ＤＮＡポリメラーゼ■　（ク レノー断片）で処理して平滑末端となし、キナーゼ処理し、Ｓｔｕ　Ｉ消化ｐＭ Ｆ−。
Ｃ８とリゲートさせた。得られたｐｊｐ−α８プラスミド（ｐｈｌＬ−４−３と 表示）により前記に従って酵母を形質転換し、上層液をＴＣＧＦ活性について試 験した。上層液はｐｈｌＬ−４−１形質転換した酵母について観察されたものに 匹敵するＴＣＧＦ活性を示した。
実施例■、　陽画における合　ヒ）　ＩＬ−４４伝　の構　および咀 実質的に好細胞コドンからなり、一連の唯一の制限エンドヌクレアーゼ部位（こ こでは“唯一の制限部位”と呼ぶ）を含み各種のヒトＩＬ−４ムティンを速やか にかつ筒便に発現させることができる合成ヒトＩＬ−４遺伝子を構成する。この 合成遺伝子のヌクレオチド配列を第６Ａ図に示す。この例の合成遺伝子を構成お よび発現するための方法は分子生物学の分野で標準的である。
たとえば特にスプロートおよびゲイト、ヌクレイツク・アシッヅ・リサーチ０， １３巻、　２９５９−２９７７頁（１９８５）　；およびフェレッテイら、ジェ イ・バイオ口・ケミ、　（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、２６１巻、７１９−７ ２２頁（１９８６）　；　ウェルズら、ジーン、３４巻、　３１５−３２３頁（ １９８５）　；およびエステルら、サイエンス、２３３巻、　６５９−６６３頁 （１９８６）も参照される。すなわち合成ヒ）　ＩＬ−４遺伝子は化学的に合成 された複数の二重鎖ＤＮＡ断片から組立てられる。組立てられた合成遺伝子が一 連の唯一の制限部位を含むように合成遺伝子の塩基配列が選ばれる。
この一連の唯一の制限部位が、容易に切除されかつ異なる塩基配列をもつセグメ ントと置換されうる一連のセグメントを規定する。かく合成断片は直接に、また は他の断片とのリゲーションに、適切なベクター、たとえばｐＵｃプラスミドな どに挿入される。上記各セグメントはウェルズら（前掲）の“′カセット°゛に ほぼ対応する。合成断片は標準法により合成さる。たとえばゲイト、オリゴヌク レオチド合”：　−用的な　法（ＩＲＬプレス。
英国オックスフォード、　１９８４）。好ましくは自動合成装置、たとえばアプ ライド・バイオシステムズ社（カリフォルニア州、フォスター・シティ−）モデ ル３８１Ａが用いられる。ｐＵｃプラスミドなどのベクターは市販されている（ たとえばファルマシア−ＰＬ、またはベーリンガーーマンハイム）。クローニン グおよび発現は標準的な細胞系、たとえば大腸菌に一１２株、ＪＭＩＯＩ　、　 ＪＭ１０３などにおいて行うことができる。（ビエラおよびメツシング。
ジーン、１９巻、　２５９−２６８頁（１９Ｂ２）に記載）。
制限エンドヌクレアーゼ消化およびリガーゼ反応は標準法により行われる。たと えばマニアチスらち、′　クローニング二実験至０ｇ１（コールド・スプリング ・ハーバ−・ラボラトリーズ、ニューヨーク、１９８２）。
小規模プラスミド調製にはアルカリ法（マニアチスら、前掲）が採用される。大 規模調製にはアルカリ法の変法が採用され、この場合は等容量のイソプロパツー ルを用いて、透明化された細胞溶解液から核酸を沈澱させる。２．５Ｍ酢酸アン モニウムを用いる沈澱法によりＲＮＡ除去したのち塩化セシウム平衡密度勾配遠 心分離、および臭化エチジウムによる検出を行う。
ハイブリダイゼーション後の濾過のためにはワットマン５４０フイルターサーク ルを用いてコロニーを取り上げ、ついでこれを０．５Ｍ−ＮａＯ）ｌ、　１．５ Ｍ−ＮａＣ１；ｌｌ’ｌ　）リス）ＩｃＩ　（ｐ）１８．０）、１．５Ｍ　−Ｎ ａＣ１（各２分）；および８０°Ｃにおける加熱（３０分）により、順次処理す ることによって細胞溶解し、固定する。ハイブリダイゼーションは６ＸＳＳＰＥ 　、２０％ホルムアミド、０．１χドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）　、１０ ０　ｐｇ　／ｄ大腸陽画ＲＮＡ、１００　μｇ　／成り−マシー・ブリリアント ・ブルーＧ２５０　（バイオラド）中で４２°Ｃにおいて６時間、３２ｐ標識（ キナーゼ処理）合成りＮＡを用いて行われる。（２０Ｘ５ＳＰＥはＮａＣ１１７ ４ｇ；　ＮａＨｚＰＯ４・ＨｚＯ２７，６ｇ、およびＥＤＴＡ７．４　ｇをＨｚ ｏ　８００　ｍに溶解し、ＮａＯＨによりｐＨを７．４に調整し、容量を１２に 調整し、オートクレーブ処理により滅菌することによって調製される）。
フィルターを１ｘＳＳＰＥ０．１χＳＤＳで２回（室温で１５分間）洗浄する。
オートラジオグラフィー（フジＲＸフィルム）後に、再増殖したコロニーをフィ ルター上の青色に着色したコロニーに整列させることにより陽性コロニーの位置 を決定する。
ＤＮＡ　Ｎｅ列はマキサムおよびギルバート（メソッズ・イン・エンザイモロジ ー、６５巻、４９９頁（１９８０）の化学的分解法、またはサンガーら（ブロク ・ナショナル・アカデーサイ）＋　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、５ｃｉ） 、、７４巻、５４６３頁（１９７７）のジデオキシ法により決定される。ジデオ キシ反応の鋳型はＭ１３ｍｐベクター中に再クローニングされた関連領域の一重 鎖ＤＮＡ　（たとえばメッシングら、ヌクレイツク・アシソヅ・リサ、、　（Ｎ ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）＋νｏｌ。
９巻、３０９頁（１９８１）、またはミニアルカリ法により調製され、０．２Ｍ 、　ＮａＯＨで変性され（５分、室温）　、０．２Ｍ、　ＮａＯＨ，１，４３Ｍ 。
酢酸アンモニウムから２容量のエタノールの添加により沈澱した二重鎖ＤＮＡで ある。ジデオキシ反応は４２°Ｃで行われる。
ＤＮＡはアプライド・バイオシステムダ３８０Ａ合成装置を用いてホスファ−ア ミダイト化学により合成される。合成、脱保護基、開裂および精製（°７Ｍ尿素 ＰＡＧＥＳ溶離、ＤＥＡＥ　セルロースクロマトグラフィ）は３８０Ａ合成装置 取扱い説明書の記載に従って行われる。クローニングすべき相補的な合成りＮＡ 鎖（各４００ｎｇ）を混合し、５０μ！の反応容積でポリヌクレオチドキナーゼ によってリン酸化する。このＤＮＡを適宜な制限酵素で消化したベクターＤＮＡ 　１ｇｇとリゲートし、１）ゲーションする。リゲーションは５０μ！の容量で 室温において行われる。リン酸化、制限酵素による消化、ポリメラーゼ反応、お よびリゲーシジンの条件は文献に記載されている（マニアチスら、前掲）。アン ピシリン、イソプロピル−１−チオーβ−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＩＧ）　（０ ，４ｍＭ）および５−ブロム−４−クロル−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクト ピラノシド（ｘ−ｇａｌ）　（４０μｓ／ｍ）を補充したし寒天上で平板培養す ることにより、コロニーを１ａｃＺ”について採点する（所望により）。
ＴＡＣ−ＲＢＳベクターは、ｔａｃＰ−保有プラスミドｐＤＲ５４０（ファルマ シア）の単−Ｂａｍ）ＩＴ部位をＤＮＡポリメラーゼによりフィル−インするこ とに始まる一連の工程により構成される０次いで生成物を非リン酸化合成オリゴ ヌクレオチドにリゲートさせるとコンセンサスリポソーム結合部位（ＲＢＳ　、 　ＧＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡＡＣ）をコードする二重鎖断片が形成される。リ ゲーション後に混合物をリン酸化し、ΣｌユＩリンカーＡＴＧＡＧＣＴＣＡＴ　 と再すゲートさせる。得られた複合体を次いでＳｓｔ　ＩおよびＥｃｏＲＩで開 裂し、１７３ｂｐの断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により 単離し、ｋル■／鉢［■制限ｐＵｃ　１８　（ファルマシア）中にクローニング する（後述）。最終構成物（ＴＡＣ−ＲＢＳと呼ぶ）のＲＢＳ−ＡＴＧポリリン カー領域の配列を第８図に示す。
合成ヒ）　ＩＬ−４遺伝子は６エ程でｐｕｃ　１８プラスミド中へ組込まれる。
各工程１で挿入されたＡＴＧ開始コドンと共にフレーム内に維持することにより 、欠失を含まない挿入物および／または挿入物を検出することができる。欠失お よび／または挿入変化をｔむクローンはｘ−ｇａｌおよびＩＰＩＧを含有するし 一アンピシリン平板上で青色のコロニーを計数することによって排除することが できる。あるいは各工程で、小規模プラスミドＤＮＡ　Ｊ製動についての万能配 列決定プライマー、たとえば（ベーリンガー・マンハイムから得られるもの）を 用いて挿入物の配列を容易に確認することができる。
工程１ではＴＡＣ−ＲＢＳベクターをＳｓｔ　Ｉで消化し、Ｔ４　ＤＮＡポリメ ラーゼ（その３′エキソヌクレアーゼ活性がＳｓｔ　Ｉ切断部の３′突出鎖を消 化して、平滑末端断片を形成する）で処理し、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼを不活 化したのちＥｃｏＲＩで処理すると、ＴＡＣ−ＲＢＳ　領域を含み、ＡＴＧ開始 コドン部に平滑末端をもち、その反対側に匡憇Ｔ末端をもつ１７３塩基体（ｂｐ ）の断片が形成される。最後に］、７３ｂｐのＴＡＣ−ＲＢＳ断片を単離する。
工程２では、工程１の単離されたＴＡＣ−ＲＢＳ断片を旦堕Ｉノ皿消化プラスミ ドｐｏｃ　１８および合成断片ＩＡ／Ｂと混合する。後者は第７Ａ図に示すよう にその上流末端に平滑末端をもち、その下流末端にはＳｓｔ　Ｉに対応する粘着 末端をもつ。この断片をリゲートして工程２のｐｕｃ　１Ｂを形成する。
工程３では、合成断片２Ａ／Ｂ　（第７Ｂ図および７０図に示す）を工程２のＳ ｓｔ　Ｉ／Ｂａｎ）ＩＩ消化ｐＵｃ　１８　（増幅および精製ののち）と混合し 、リゲートして、工程３のｐＵＣ１８を形成する。断片２Ａ／Ｂの下流末端が付 加的な塩基を含み、これがＢａｍＨＩ粘着末端を形成する点を留意されたい。こ れらの付加的塩基は工程４で開裂する。同様に２Ａ／Ｂおよび３Ａ／Ｂは相補的 な９残基−重鎮末端を備えており、これらが混和された際にアニールし、２Ａ／ Ｂの上流Ｓｓｔ　Ｉ切断部および３Ａ／Ｂの下流Ｂａｌ１）ＩＩ切断部を残し、 ｐＵＣ１Ｂに工程４では、工程３のＭｌｕ　Ｉ　／Ｘｂａ　Ｉ消化ｐｕｃ　１８ 　（増幅および精製ののち）を再精製し、合成断片４Ａ／Ｂ８　（第７Ｄ図）と 混合し、リゲートしして、工程４のｐｕｃ　１８を形成する工程５では、工程４ の、χｂａ　Ｉ／　Ｓａｔ　Ｉ消化ｐＵｃ１８　（増幅および精製ののち）を５ 　Ａ／Ｈの合成断片（第７Ｅ図）と混合し、リゲートして、工程５のｐＵｃ１８ を形成する。
工程６では、工程５のＳｓＩ　Ｌ　／　Ｈ４ｎｄ　ｍ消化ｐｔｌｃ１８　（増幅 および精製ののち）を合成断片６Ａ／Ｂ　（第７Ｆ図）と混合し、リゲートして 、最終構成を形成する。
第６Ｂ図は上記のｐＵｃ１８構成に存在する唯一の制限部位の開裂マツプである 。開示された合成ヒ日Ｌ−４遺伝子をｐＬｌｃ１８の挿入物として用いた場合、 唯一の制限部位各月は、容易に切除され、他の合成断片と置換しうるセグメント を規定する。この唯一の制限部位の組にはＥｃｏＲＴ、」巳Ｉ、　５ａｃｌ、　 （Ｓｓｔｒ）、ＥｃｏＲＶ　、　ＰｓｔＩ。
■虱、匡旦、ｕ社、旦旦、錘旦、…虹、および■屁■が含まれる。
合成ＩＬ−４遺伝子を含むｐ’Ｕｃ１８を大腸菌に一１２株ＪＭＩＯＩに挿入す る。培養後にＪＭＩＯＩから蛋白質を抽出し、抽出液の希釈液を生物活性につき 試験する。
位置５２（天然ヒトＴＬ−４のＮ末端に対し）のＬｅｕをＩｌｅに変えて、ヒ） 　ＩＬ−４ムテインＩｌｅ”を形成する。第６Ａ図の合成ヒトＩＬ−４遺伝子を 含む実施例■のｐＵｃ１８プラスミドを皿および旦旦で消化し、精製する。この 精製プラスミドを下記の合成二重鎖断片と混合し、リゲートさせる。変化させた 部分の塩基配列を四角で囲む。得られたｐＵｃ１８を大腸菌に一１２株ＪＰＩＩ Ｏ１などにトランスフェクションし、発現させる。
ＣＡＧ　ＴＴＣＴＡＣＴＣＴ　ＣＡＣＣＡＣＧＡＡ　ＡＡＡＧＴＣＡＡＧ　ＡＴ Ｇ　ＡＧＡ　ＧＴＧ　ＧＴＧ　ＣＴＴ　ＴＴＴＡＣＡ ＣＴＧ　ＴＧＣＧＣ ヒトＩＬ−４ムティンｌｉｅ”をえるためのＰｓｔｌ　／Ｍｌｕ１ｍυ兄兇 培養後に標準法により蛋白質をＪＭＩＯＩ細胞から抽出し、抽出液の希釈液を生 物活性につき試験する。
実施例■、一覧」１Ｖ」フヨとイ受二工υ上ｓｚユ」」已”）（’）ｔｊり又圭 ｊ辷り主要 実施例〜１の修飾されたｐＨｃ１８プラスミド（ｌｉｅ”コード配列を含む）を ５ａｉｌおよび■旦で消化し、大型断片を単離する。単離された断片を標準リゲ ーション溶液中で下記の合成二重鎖断片と混合する。セグメントの変化させた部 分を四角で囲む。得られたプラスミドを大腸菌に一１２株ＪＭＩＯ１などにトラ ンスフェクションし、発現させる。
５ａｌＩＸｈｏＩｌ用 培養後に標準法により蛋白質をＪＭＩＯＩから抽出し抽出液の希釈液を生物活性 につき試験する。
実施例１０．トランスフェクションした上゛′から　＋ｌＬ、たヒトＩＬ」■に 死 ヒトＩＬ−４ｃＤＮＡを含むベクターで一過性トランスフェクションした細胞の 培養上清からヒ）　ＩＬ−４を精製した。精製した物質を用いて分泌された天然 型ヒトＩＬ−４の配列を決定した。
Ａ、精製のための生物学的アッセイ 分離工程を通じてヒトＩＬ−４をアッセイするためにＴＣＧＦ活性を用いた。こ のアッセイは実施例■で記載した方法と実質的に同じである。簡単に述べると、 健康な給与者（ドナー）から得た血液ヲヘパリン化チューブに入れて、フエコー ルーヒバーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）の上に層とした；例えば１５ｍ ！の遠沈管中でフェコールーヒバーク３ｄあたり血液５戚とする。３０００ｘｇ で２０分間遠心分離した後、表面の細胞を吸引し、１０％ウシ胎児血清、２−メ ルカプトエタノール５０ｕ１．フィトヘマグルチニン（Ｐ）ＩＡ）２０μｇｏｄ および組換えヒトＩＬ−２を含むＲＰ［１６４０からなる成長培地中に希釈した 。３７°Ｃで５〜ｌＯ日間インキュベーションした後、ＰＨＡ−刺激末梢血リン パ球（ＰＢＬ）を洗浄し、モスマン（Ｍｏｓｓｍａｎｎ）、　Ｊ、Ｉｍｍｏｎｏ ｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、　６　、５５〜６３（１９８３）に記載の２日間の比色分 析アッセイに用いた。ＩＬ−４ｉ単品（ｐｃＤ−１２５）またはｐＥＢＴ−１７ ８でトランスフェクションされたＣＯ３７細胞からの上清）の連続２倍希釈物ま たは試験すべき分画を９６ウエルのトレーうえに上記した成長培地を用いて調製 し、最終容量を５０μ２／ウェルとした。各ウェルに約４〜８Ｘ１０’細胞／ｄ のＰＨＡ　−刺激ＰＢＬ　５０μｌを加え、トレーを３７°Ｃで２日間インキュ ベートした。次いでモスマン（同上）の方法によって細胞成長を刺激した。
ヒトＩＬ−４７ＣＧＦ活性の単位はｐｃＤ−１２５でトランスフェクションした ＣＯＳ？細胞（実施例■）またはｐＥＢＶ−１７８でトランスフェクションした ＣＯ５７細胞（実施例■）のいずれかに関して定められる。
精製のためには、以下のようにして産生されるｐｃＤ−１２５でトランスフェク ションした上滑の活性に基づいて単位をさだめる。
約１×１０６個のＣＯ５７細胞をダルベツコの改変イーグル培地（ＤＭＥ）、　 １０％０％ウシ胎清および４ａ＋ＭＬ−グルタミンを含有する１００皿の組織培 養プレート上に播種した。播種２４時間後に培地をプレートから吸引し、そして 細胞を血清不合緩衝化（５０ｎ＋Ｍトリス）　ＤＭＥで２回洗浄した。各プレー トに血清不合緩衝化ＤＭＥ　４ｄ　（４＋ｏＭＬ−グルタミンを含む）　、　Ｄ ＥＡＥ−デキストラン８０μ！およびｐｃＤ４２５　ＯＮＡ　５μｇをくわえた 。この混合物中で細胞を３０°Ｃにて４時間インキュベーションし、その後混合 物を吸引除去し、そして細胞を血清不合緩衝化ＤＭＥで１回洗浄した。
洗浄後、４ｍＭＬ−グルタミンを含む叶Ｅ　５ｄ、　１００μｉクロロキンおよ び２％ウシ胎児血清を各プレートに加え、細胞を３時間インキュベーションし、 その後血清不合緩衝化ＤＭＥで２回洗浄した。次いで、４ｍＭＬ−グルタミンお よび４％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ５ｄを加えて細胞を３７°Ｃにて２４時間イ ンキュベーションした。細胞をＤＭＥまたはＰＢＳで１〜３回洗浄した後、血清 不合ＤＭＥ　３　ｒｄ　（４ｍＭＬ−グルタミン含有）を加え、そして細胞を３ ７°Ｃで培養し、５日後に培養上清を回収した。
本明細書中で使用する１単位とは、２Ｘ１０’個のＰＨＡ−刺激ＰＢＬの５０％ 最大増殖を刺激する１ウエル（０，１ｄ）あたりの因子量である。
Ｂ、精製 精製は陽イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過および逆相高速液体クロマト グラフィーを順次用いて行った。全ての操作を４°Ｃで実施した。
遠心分離によってＣＯ３７細胞を除去した後、上清を限外濾過によって約１０倍 に濃縮し、そして次の工程に用いるまで一８０°Ｃで保存した。ＩＬ−４の力価 は上記の標準的アッセイ法を用いることによってフィトヘマグルチニン−誘導ヒ ト末梢血リンパ球の増殖を刺激するタンパク質の活性、即ちＴＣＧＦ活性をアッ セイすることによって決定した。
約１０４〜１０６単位／ＩｄのＴＣＧＦ活性と約１５〜２０■／Ｉｎｌ１のタン パク質含量を有する濃縮ＣＯ３７の上清を５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳナトリウム、　 ｐＨ７，０を２回取りかえて２４時間透析する（１回の外液量は濃縮分物の約１ ０〜１５倍容量である）。透析液をあらかじめ５０ｎＭ　ＨＥＰＥＳナトリウム 、　ｐＨ７，０で平衡化しておいたＳ−セファロースのカラム（Ｉ　Ｘ２．５　 ｃｍ、流速：０．２ｒｒｄｌ／分）にかけた。カラムをカラムの１５倍容量の平 衡緩衝液で洗浄し、次いでカラムの２０倍容量の直線的塩化ナトリウムグラジェ ント（５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳナトリウム、　ｐＨ７，０中の０〜０．５Ｍ塩化ナ トリウム）を用いて溶出した。
５倍容量の固定濃度液（５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳナトリウム、　０．５Ｍ　ＮａＣ １ｐ！（７，０）で溶出することによってグラジェントを終了させた。
夫々のバンチから１．５　ｄおよび１．８−の分画を回収した。３００１から５ ００ｍＭ塩化ナトリウムで溶出した両方のクロマトグラフィーにＩＬ−４力価が 見い出された。
ＩＬ−４力価を含む各Ｓ−セファロースカラムからの６つの分画を全容量が９． ０および１０．８−となるように別途台せた。両方の容量をアミコンＹＭ５膜（ 分子量カットオフ：５，０００）を用いる限外濾過によって１．９−に濃縮した 。この工程からのタンパク質の回収率は約８０％であった。濃縮したＩＬ−４溶 液をあらかじめ５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、　０．４Ｍ　ＮａＣｌ　、　ｐＨ７，０ で平衡化しておいたセファデックスＧ−１００カラム（１，Ｉ　Ｘ５８ｃｍ）に 装填し、カラムを同じ緩衝液で０．１５＋ｆ！／分の速度で溶出した。全部で５ ０分画（１，０ｄ／分画）を回収し、そのＩＬ−４力価を分析した。生物活性の ピークはみかけ分子量２２，０００ダルトンのあたりに認められた。ウシ血清ア ルブミン（６５，０００ダルトン）、炭酸脱水酵素（３０，０００ダルトン）お よびチトクロームＣ（１１，７００ダルトン）を用いてセファデックスＧ−１０ ０カラムのみかけ分子量の決定を行った。
ＩＬ−４活性を有するセファデックスＧ−１００カラムからの分画を真空下に３ 〜４倍に濃縮し、これをバイダックＣ−４ガードカラム（４，６Ｘ２０ｍｍ）に 注入した。０．１χ（ｖ／ν）トリフルオル酢酸（ＴＦＡ）中の０〜７２χ（ｖ ／ｖ）アセトニトリルの直線的グラジェントで１５分かけて力゛ラム温度３５° Ｃ１流速１．０　ｄ／分にて溶出した。
２１４ｎｍで検出したところ、保持時間１．８．２および８．７分に３つのピー ク（それぞれ第１０図のピーク１，２および３）が観察された。ピーク２（溶出 時間８．２分）の４０μｌアリコートを凍結乾燥し、そして１０％０％ウシ胎清 を含む最小必須培地中に再熔解した。この溶液は陽性のＴＣＧＦ反応を示した。
ピーク２の３００μ２を蒸発乾固して０．１χ（ｗ／ｖ）　ドデシル硫酸ナトリ ウム（ＳＯ５）２０Ｏｕｆ中に再溶解した。その２ｕｌを１％（ｖ／ｖ）　ＴＦ Ａ２００μｍ２中に希釈して再クロマトグラフに付した。この試料のＨＰＬＣは ２１５ｎｍに単一ビークを示した。ピーク２の物質は約７Ｘ１０”単位／■の活 性を有することを示した。
Ｃ，アミノ酸配列分裂 アミノ酸配列の決定はアプライド・バイオシステムズ社の微量配列分析機を用い て自動ガス相エンドマン分解法（Ｒ，Ｍ　、ヘラインク（Ｈｅｗｉｃｋ）、　Ｍ 、Ｗ、フン力ビラ−（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌａｒ）、　Ｌ、Ｅ、フッド（Ｈｏｏｄ ）および−、Ｊ、ドレイヤ−（Ｄｒｙｅｒ）、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５ ６７９９０　（１９８１）参照〕によって実施した。ピーク２の）ＩＰＬＣ分画 ９０μｌを上記のように０．１χＳＤＳに溶解して、ポリブレン（Ｐｏｌｙｂ− ｒｅｎｅ）の存在下にグラスファイバーフィルターカートリッジに装填した。３ ５番目の残基までのアミノ酸配列の情報が得られた。
Ｎ−末端の配列は以下の通りである。
Ｈｉｓ　−Ｌｙｓ　−Ａｓｄ　−１１ｅ　−Ｔｈｒ　−Ｌｅｕ　−Ｇｉｎ　−Ｇ ｌｕ　−１１ｅ　−ｌｉｅ　−Ｌｙｓ　−Ｔｈｒ　−Ｌｅｕ　−Ａｓｎ　−Ｓｅ ｒ　−Ｌｅｕ　−Ｔｈｒ　−Ｇｌｕ　−Ｇｌｎ　−Ｌｙｓ　−Ｔｈｒ　−Ｌｅｕ 　−−Ｔｈｒ　−Ｇｌｕ　−Ｌｅｕ　−−Ｖａｌ　−Ｔｈｒ　−Ａｓｐ　−Ｔｉ ｅ　−Ｐｈｅ　−Ａｌａ　−Ａｌａ（式中、空欄は同定しうるアミノ酸が欠如し ていることを示す。）アミノ末端におけ第３位および２３位の空欄はこの決定で では検出されないシスティンの存在と一致した。ｃＤＮＡの予測配列ではトレオ ニンに対応する第２８位の空欄はフェニルチオヒダントイン・トレオニン検出の 代わり易さによるものか或いは０−結合グリコジル化またはエステル化の存在に よるものであるかも知れない。
アミノ末端配列に用いた）ＩＰＬＣ分画１００μｌを蒸発乾燥して７０％ギ酸に 再熔解した。５０倍モル過剰の臭化シアンを加えてこの溶液を室温に２．５時間 おいた。開裂したタンパク質を上記のようにアプライド・バイオシステム社のガ ス相配列決定機にかけて配列の決定を行った。以下の２つの配列が同定された。
（］）　Ａｒｇ　−Ｇｌｕ　−Ｌｙｓ　−Ｔｙｒ　−Ｓｅｒ　−Ｌｙｓ（２）　 Ｈ４ｓ　−Ｌｙｓ　−−Ａｓｐ　−１１ｅ　−Ｔｈｒ配列（］）は、第１２０位 のメチオニン残基を臭化シアン分解することにより得られたｃＤＮＡの予測配列 と同じである。Ｃ末端の最後の２残が存在していたかも知れないが、試料が不十 分であったために検出されなかったのかも知れない。配列（２）は上記したよう に、天然型ＩＬ−４タンパク質として得られたアミノ末端配列と同じである。得 られたアミノ末端およびカルボキシル末端のフェニルチオヒダントイン−アミノ 酸の相対的量は試料中に両配列が等モル量存在することを示唆した。この結果は 、配列決定に用いたタンパク質試料がヒトＩＬ−４のｃＤＮＡ配列から予測され たアミノ末端およびカルボキシル末端を有する単一のポリペプチド鎖を主として 含んでいたという結論を支持する。
実施例■、ヒ目Ｌ−４突然変異タンパク譬（ｌ１ｅ５２．Δ７＋。
Ｉｓ”（Ａｌａ）　）の創製および発現実施例〜皿の修飾プラスミドｐＵｃ１８ 　（ｌｉｅ”をコードする配列を含む）をＭｌｕ　ＩおよびＢｃｌｌで切断し、 大きいフラグメントを単離した。単離したフラグメントを標準連結よう溶液中で 以下に記載の合成二本鎖フラグメントと混合した。得られたプラスミドを大腸菌 に一１２株ＪＭＩ０・１株等にトランスフェクションして増殖した。
ＣＧ　ＣＧＴ　ＴＧＴ　ＣＴＣＧＧＣＧＣＣＡＣＴＡ　ＡＣＡ　ＧＡＧ　ＣＣＧ 　ＣＧＧ　ＴＧＡＧＣＧ　ＣＡＧ　ＴＴＣＣＡＣＣＧＴ　ＣＡＣＡＡＡ　ＧＡＧ 　ＣＴＣＧ（ＩＧＴｃ　ＡＡＧ　ＧＴＧ　ＧＣＡ　ＧＴＧ　ＴＴＴ　ＧＴＣＧＡ ＣＴＡＧ欠失 Ｍｌｕｌ／　Ｂｃ１１置換フラグメント修飾プラスミドを単離してＸｂａ　Ｉお よびＮａｅｌで切断し、大きいフラグメントを単離した。単離したフラグメント を標準連結溶液中で以下に記載の合成二本鎖フラグメントと混合した。追加した コドンを箱で囲んだ。得られたプラスミドを大腸菌に一１２ＪＭＩＯＩ株等にト ランスフェクションして発現させた。
ＣＴＡ　ＧＡＣＣＧＴ　ＡＡＣＣＴＧ　ＴＧＧ　ＧＧＣＴＧ　ＧＣＡ　ＴＴＧ　 ＧＡＣＡＣＣＣＣＧＸｂａ　Ｉ／　ＮａｅＩ置換フラグメント培養後、タンパク 質を標準手法によってＪＭＩＯＩ細胞から抽出し、抽出物の希釈物の生物活性を アッセイした。
実施例ｘｎ、リンパ球症　（ｂａｒｅ　Ｉ　ｍ　ｈｏｃ　ｔｅ　ｓ　ｎｄｒｏｍ ｅ）患者からの細胞上にあるＤＮ抗原の誘導裸リンパ球症候群は細胞表面のＨＬ Ａ抗原クラりＩおよび／またはクラスＨの発現を欠くことを特徴とし、またしば しば重篤な免疫不全を伴う〔例えばツーレイン（Ｔｏｕｒａｉｎｅ）ｌａｎｃｅ ｔ。
３１９〜３２Ｎ１９８１．２．７）；ツーレインおよびベテル（Ｂｅｔｈｅｌ） 　。
Ｈｕｍａｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　、２．１４７〜１５３（１９８１）；　および サリバン（Ｓｕｌｌ−ｉｖａｎら、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、７６．７ ５〜７９（１９８５）を参照のこと〕。
ヒ）ＩＬ−４は裸リンパ球症候群患者に由来する細胞表面上のクラスＩ［ＤＲ抗 原の発現を誘導しうろことが見い出された。
ＨＬＡクラス■抗原の非発現に悩む患者から末梢ちリンパ球（ＰＢＬ）を採取し た。このＰＢＬがら上記の方法でＢ細胞を精製。
そしてエプソンーバールウィルス（ＥＢＶ）を用いて形質転換することによって Ｂ細胞系（ＵＤ３１と命名）を樹立した。ＥＢＶで形質転換された細胞は、２ウ シ胎児血清および５％（Ｖ／Ｖ）濃度のｐｃＤ−１２５でトランスフェクション したＣ０Ｓ７細胞を含むイッセル培地（上述）中で４８時間培養した。細胞を収 穫し、固定し、蛍光標識した抗−ＤＲモノクローナル抗体（例えばベクトン・デ ィッキンソン社のＬ２４３）で染色し、そしてフローサイトメトリーでふんせき した。第９図はＩＬ−４処理前に収穫したＥＢＶ−形質転換細胞の対照数（曲線 Ａ）およびＩＬ−４処理後のＥＢＶ−形質転換細胞数（曲線Ｂ）の各蛍光強度に 対する細胞頻度のヒ、ストグ精製ＩＬ−３およびＴＬ−３ｃＤＮＡ　クローンで トランスフェクトしたＣＯ５７細胞からの上清（組換えＩＬ−３；　ＩＬ−３” 　）は肥満細胞系ＭＣ／９の増殖を同程度に刺激した（第１４Ａ図）。しかしな がら、このレベルはＣ１，ＩＴ細胞上清によって誘導されたレベルの１７３〜１ ／２であった。Ｔ細胞上滑中のＣｏｎＡの存在（２μｇ／ＩｄりはそのＭＣＧＦ 活性に有意に寄与しない。上記効果の説明として、Ｃ１，１細胞によって産生さ れるＭＣＧＦ活性の全てがＩＬ−３によるものではないということが考えられる 。或いは、アッセイに使用した肥満細胞系が細胞の第２の要因に依存する集団で 汚染されていたということも（理論的には）がんかえられる。しかしながら、後 の説は排除される。何故なら、ＭＣ／９細胞の再クローン化はサブクローンを生 産し、各サブクローンはＩＬ−３および元のＭＣ／９クローンと同様の細胞上清 に対応する。
Ｃ１，１の上清はニジ−３以外のリンホカインもふくんでいるのでこれらのもの のＭＣ／９細胞のせいいく増強能を試験した。しかしながら、ＭＣ／９細胞は各 種濃度の組換えＩＬ−２ｊＦＮ　ＪおよびＧＭ−Ｃ５Ｆに対して反応を示さず、 またＩＬ−１を含む上清（Ｐ３８８Ｄ１細胞）に対しても反応を示さなかった（ 第１４Ａ図）。更に、各種濃度の組換えＩＬ−３とＩＬ−２，ＧＭ−ＣＳＦ、　 ＩＦＮ−γまたは！し−１を含む培養物を補充してもＩＬ−３単独で得られるレ ベル以上にＭＣ／９細胞の増殖を刺激しなかった。このことは、Ｔ細胞上清のＭ ＣＧＦ活性の増加は、これらの既知の因子を含有することによるものではないこ とを示唆している。
他の因　に依存する細胞系との　軒研７他の２種の肥満細胞であるＤＸ−２およ び聞３もまたＩＬ−３よりもＣ１，１上清を用いた方より高い増殖反応を示した （ＤＸ−２についての代表的なデータを第１４Ｂ図に示す）。これらの細胞は、 ＩＬ−２，ＩＦＮ−γ、　ＧＭ−ＣＳＦまたはＰ３８８１１−１細胞に対して反 応しなかった。従って、Ｔ細胞上清に対する？ＩＣ／９細胞の増殖増強反応は肥 満細胞一般にいえることなのかも知れない、これとは対照的に、顆粒球性細胞（ ＮＦＳ−６０）はＩＬ−３およびＣ１，１上清によってほぼ同等に刺激された（ 第１４Ｃ図）。ＮＦＳ−６０細胞はＩＬ−２、ＩＦＮ−ｒおよびＰ３８８Ｄ−１ 上清に対して反応しなかったが、ＧＭ−Ｃ５Ｆによって少しではあるが再現性の ある刺激をしめした。ＩＬ−３およびＴ細胞上清が同程度のレベルの増殖を誘導 するという事実は。
ＮＦＳ−６０細胞系がＴ細胞上清中に存在する付加的な因子に対して比較的非感 受性であるかも知れないということを示唆する。従って、ＮＦＳ−６０細胞を、 タンパク質分画によってＩＬ−３をその他のＭＣＧＦ活性体から分離する試みに おいてＩＬ−３のアッセイに用いた。
Ｃ１，１上清のＴＣＧＦ活性をＩＬ−２依存性Ｔ細胞系１（Ｔ２を用いて評価し た。Ｃ１，１上滑の飽和濃度は、組換えＩＬ−２で達成される最高レベルよりも 十分低いレベルでの３Ｈ−チミジンの取り込みを一定に刺激した（第１４０図） 。同様の結果が他の２つの細胞系でも得られた。上記上清をＩＬ−２を含有する ＨＴ２培養物に添加しても３Ｈ−チミジンの取り込みを全く減少させなかったの で該上清は阻害物質を含んでいない（第１４Ｄ図）。これらの結果はＣ１，１上 清がＩＬ−２とは異なるＴＣＧＦ活性を含んでいることを示している。
この結論を支持する性化学的根拠を以下に示す。
Ｃ１，１上滑の予備的クロマトグラフィー＼画ＩＬ−３を他の？ＩＣＧＦ活性体 から分離するという目的のために各種のクロマトグラフィー法をもちいてＣ１， １上滑を分画した。ＭＣ／９増殖によって明らかにされた全ＭＣＧＦ活性のバッ クグランドに対するＩＬ−３を特異的に追跡するためにＮＦＳ−６０細胞の増を 用いた。
ＴＣＧＦ活性は）ｌＴ２　Ｅｌｆ胞増殖によってアッセイした。
Ｃ１，１上清を中性ｐ）ｌにおいて陽イオン交換クロマトグラフィーで分画した ところ、充填したタンパク質の約９８％、　ＩＬ−３単位の９７％（ＮＦＳ−６ ０増殖によるアッセイにおいて）およびＴＣＧＦ単位の１％がフロースルー中に 出現した（第１５図）。結合したタンパク質を塩化ナトリウムのグラジェントで 溶出したところ、０．１９Ｍ　ＮａＣ１（フラクション６０）でＴＣＧＦ活性が 放出された。小さいながらも再現可能なＴＣＧＦ活性のピークもＩ　Ｍ　ＮａＣ １でみられた。
これ以上の高いＮａＣ１濃度（３Ｍまで）にしても更に有意なＴＣＧＦ活性は溶 出しなかった。ＴＣＧＦのピークとほぼ同じ領域に少量のＩＬ−３にも溶出した （ＮＦＳ−６０応答にて検出可能）。ＴＣＧＦ活性のピークに対応する分画（フ ラクション５９〜６１）およびフロースルー（フラクション１〜２０）のみがひ 分画上清に比較して高レベルのＭＣ／９増殖を刺激した（第１５図、矢印）。滴 定曲線はフラクション５９〜６１の方がフロースルーよりも高レベルのＭＣＧＦ 活性を含んでいることを示唆したので、　ＴＣＧＦビークと同時溶出するＴＬ− ３活性を更に減らして再度ＭＣ／９増殖レベルを評価する試みを行った。そこで フラクション５９〜６１を同じ条件で更に２回再クロマトグラフィーに付した。
３回カラムを通した後は、９５％以上のＴＣＧＦ活性が終止−貫して０．１９Ｍ 　ＮａＣ１で溶出した。フロースルー中、或いはどのカラムフラクションも測定 しうるＩＬ−３（ＮＦＳ−６０応答）は見られなかった。しかしながら、ＴＣＧ Ｆピークとなおかつ同時溶出するものは、Ｃ１，１上清またはＩＬ−３で得られ たよりも有意に低いプラトーレベルのＭＣ／９増殖を刺激した（以下参照）。こ れらフラクションは測定しうるＩＬ−３活性を欠いていた（ＮＦＳ−６０応答の 欠如）きで、あらたなＭＣＧＦ自体は粗Ｔ細胞上清と同程度にＭＣ／９ｍ胞を刺 激することができなかった。
ＴＣＧＦからＭＣＧＦを更に分離するために、上記３回分画したもの（フラクシ ョン５９〜６１）を水中の０．１％ＴＦＡで１０倍に希釈してｐＨ２とし、これ を直接Ｃ８逆相カラムに装填した。第１６Ａ図は結合したタンパク質を０．１％ ＴＦＡ中のア七ト二トリルのグラジェントで溶出した溶出パターンを示す図であ る。フロースルー中にはＭＣＧＦおよびＴＣＧＦ活性は何ら見られなかった。こ れらの活性はいずれも３７％アセトニトリル（フラクション２６〜２９）で同時 溶出した。しかしながら、飽和ＭＣＧＦ応答は今や、ＩＬ−３で得られた約半分 しかなかった（第１７Ａ図）。全フラクションを飽和レベルのＩＬ−３存在下で 再アッセイしたところ、フラクション２６〜２９のみが過剰ΦＩＬ−３単独中で ＭＣ／９増殖応答を示した（第１６Ａ　ＩＩＺ矢印）。事実、その応答強度は未 分画の上清自体の応答強度と似ていた（第１７Ａ図）。更に、未分画の上清と同 等な増強レベルはＩＬ−３含有フロースルーまたはＷＥＩ（１３から精製したＩ Ｌ−３の存在下でアッセイしたフラクション２６〜２９に観察された。従ってＩ Ｌ−３とユニークなＭＣＧＦ／ＴＣＧＦとの組合わせがもとのＴ細胞上清に特徴 的なＭＣ／９増殖レベルを刺激する。
逆相クロマトグラフィーによってはＭＣＧＦをＴＣＧＦから分離することができ なかったけれども、　ＴＣＧＦは２つの基準によってＩＬ−２とは異なるもので あることがしめされた。第１に、Ｃ０Ｓ７細胞上清中の組換えＩＬ−２（ＩＬ− ２”　）およびＩＬ−２産生性（ＣｏｎＡ刺激）ネズミＴ細胞系（ＧＦ１５−１ ）からの上清をいずれも同じ条件で同じカラムにかけてクロマトグラフィーに付 したところ、ＴＣＧＦ活性は４５％アセトニトリルでシャーフ゛なピークで？容 出するが、このピークはＣ１，Ｉ　ＴＣＧＦを示す３７％アセトニトリルの位置 とオーバーラツプしない（第１６Ｂ図）。第２に、ＩＬ−２”に対するＨＴ２細 胞の飽和応答はＣ１，１上清の特徴とは全く異なっている（第１６Ｂ図、挿入図 ）。更に、部分精製したＴＣＧＦとＩＬ−２との間に明らかな相乗効果は何ら見 られなかった（第１７図）。
Ｃ１，１上清のクロマトフオーカシングを第１８図に示す。ＩＬ−３活性（ＮＦ Ｓ−６０応答性）は７．１よりも大きい等電点を有する活性を含む非常に不均質 のものであることを示したが、ＴＣＧＦ活性の方は主要ＴＣＧＦ　（フラクショ ン１２）が等電点約６．２を有するより均質なものであることを示した。このこ とは飽和レベルのＴＬ−３を添加後にＭＣＧＦ活性（ＭＣ／９応答）が最大とな ったことと一致する。
Ｃ１，１上・′および部ハ精製因子　ＳＡＣＰＡＧＥ第１９図は未分画Ｃ１，１ 上清（第１９八図）の電気泳動パターンを陽イオン交換クロマトグラフィーにか けた物質であるフラクション５９〜６１の電気泳動パターン（第１９Ｂ図）とを 比較したものである。ゲ切断物からタンパク質を直接溶出し、増殖力により活性 を測定した。陽イオン交換フラクションと０１．１上清はいずれもＴＣＧＦピー ク（非還元条件下では２９Ｋｄおよび１５Ｋｄに、そして還元条件下では２１Ｋ ｄおよび１６Ｋｄ）を示す。陽イオン交換した物質はＩＬ−３を減じているため 、ごく低レベルのＭＣ／９増殖のみが誘導され、このＭＣＧＦ活性はなおＴＣＧ Ｆビークと一敗していた。全フラクションに飽和量のＩＬ−３Ｒを加えたところ 、ＭＣＧＦ／ＴＣＧＦフラクションピークにおいてのみＣ１，１上清レベルに対 するＭＣ／９増殖応答が上昇した（第１９Ｂ図、矢印）。該上清のＩＬ−３活性 は２４Ｋｄの位置で最大であったが、約２０Ｋｄの領域にも幅広のピークが見ら れた。ＩＬ−３よりも十分大きなＭＣ７９増殖レベルは電気泳動した上清の１０ Ｋｄの位置に見られることは重要である（第１９Ａ図、矢印）。最も高度に精製 したＭＣＧＦ／ＴＣＧＦ物質（逆相カラムのフラクション２８）の銀染色ＳＤＳ ゲルも２０Ｋｄおよび１５にｄに顕著なタンパク質のバンドをしめした。
上記因子の２０Ｋｄの物質８ｇ量を活性化Ｃ１，ＩＴ細胞からのＣｏｎＡ上清を 上述した連続的分画： （１）　陽イオ・ン交換クロマトグラフィ（２）　ヘパリン・セファロース・ク ロマトグラフィ、および（３）Ｃ４逆相クロマトグラフィ を行うことによって均質に精製した。最終精製物質は銀染色ＳＯ５−ＰＡＧＥに おいて２０Ｋｄ　に単一バンドのみを示し、これはＣ４逆相カラムの溶出物の単 一のＵＶ吸収と対応する。この精製因子の生物学的性質は低いレベルのＴ細胞お よび肥満細胞増殖刺激能ならびにＩＬ−３依存性肥満細胞増殖増強能であること が確かめられた。
表Ｖに示すように、この因子はＢＳＦ−１について報告されてぃδこ咳因子は対 照群に比較して体止Ｂ細胞上におけるＩａの発現増加を誘導する（表Ｖ）。第２ 図にこの因子は抗−１ｇ抗体と結合して有意〔３Ｈ〕−チミジンの取り込みを誘 導するが、このことは該因子がＢ細胞増殖の刺激において補助的な因子として機 能すくことを示している。
表Ｖ Ｂ細胞刺激アッセイ 抗−１ｇ処処理箱細胞 物　質　〔３Ｈ〕−チミジン　Ｉ−Ａ誘導″″０゛入み１ 未分画Ｃ１，Ｌｙｌ”　２−　／９上清　３３．７８８ｃｐ＋＋＋±５．４５４ 　１６２．３精製因子　４４，１２５ｃｐｍ±２．７７５　１５７．１媒質　４ ，１２３ｃｐｍ±　７３４　３５．５（ネガティブコントロール） ＊　結果は飽和レベルの因子を補充した３個の培養物の平均ｃｐｍ　＋ＳＥＭ　 （標準偏差）で示す。
＊＊結果は飽和レベルの因子を補充した３個の培養物の平均相対蛍光量で示す。
これらのポリペプチドは機能および影響を及ぼす細胞の型の双方において異なる 数種の生物学的活性を示すことができる。
上述したように、これらの活性はＢ細胞および肥満細胞系の増殖誘導、休止Ｂ！ ｉｌ胞の初期活性化、Ｔ細胞の増殖刺激およびマイトジェン−活性化Ｂ細胞にお けるＩｇＧ、およびＩｇＥｇ生増強における相乗作用を含んでいる。
以上詳しく説明したように、本発明の精製タンパク質が当業者に新規な治療の可 能性を提供することが理解されよう。これらの因子を有意な量産生することがで きたことは、選択された補乳動吻細胞系のｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養における改良お よび哺乳動物免疫応答の全体的な理解の向上に寄与することであろう。
ｃＤＮＡクローンｐｃＤ　−２Ａ−Ｅ３　、　ｐｃＤ−４６（ｐｃＤ−２Ｆ１− １３　）。
ｐｃＤ−１２５および酵母ベクターｐｈｐ−アルファ８はアメリカンタイプカル チャーコレクション（米国メリーランド州、ロックビル）（ＡＴＣＣ）ニソレソ れ受託番号５３３３０．５３３３７．６７０２９および４０１４０として寄託さ れている。これらの寄託は特許手続きのための微生物の寄託に関する国際的理解 に基づ（ブタペスト条約（１９７７）上の寄託である。
ＭＥＴ　ＧＴｙ　Ｌｌ！！Ｊ ＣＧＴ　ＡＴＡ　ＴＴＴ　ＴＡＴ　ＴＴＡ　ＡＡＡ　ＣＡＴ　ＧＧＧ　ＡＡＡ　 ＡＣＴ　ＣＣＡ　ＴＧＣＴＴＧ　ＡＡＧ　ＡＡＧ　ＡＡＣＴbＴ　ＡＧＴ Ａｒｇ　［１ｅ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｈｆｓ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　 Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ@Ｓｅｒ　５ｅｒ ＧＴＴ　ＣＴＣＡＴＧ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＣＡＧ　ＡＧＡ　ＣＴＣＴＴＴ　ＣＧ Ｇ　ＧＣＴ　ＴＴＴ　ＣＧＡ　ＴＧＣＣＴＧ　ＧＡＴ　ＴＣ`　ＴＣＧ Ｖａｌ　Ｌｅｕ　ＭＥＴ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　 Ａｒｇ　Ａ４ａ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ@Ｓｅｒ　５ａｒ ＡＡＴＡＴＴＴＧＴＡ　ＴＡＡＴＧＴＡＡＣＡ　ＧＡＡＡＡ、ＡＡＦＩＧ　ＩＡ Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−工１ｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ− 工１ｅ−工１ｅ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ＝ Ｇ１ｕ−Ｇｌｎ　−Ｌｙｓ　−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅ ｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ　−Ａｓｐ−工１ｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−５ ｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ　−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ− Ｐｈｅ−Ｃｙｓ　−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ　−Ｖａｌ　−Ｌｅｕ−Ａ ｒｇ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ　−Ｌｙｓ− Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ− Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ− 工１ｅ−Ａｒｇ−Ｐｈ　ｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｒｇ −Ａｓ　ｎ−Ｌｅ　ｕ　−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ− Ａｓｎ−３ｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ　−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ −Ｇｉｎ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ −Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−工１ｅ−Ｍｅｔ−−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙ ｓ−Ｔｙｒ−３ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−３ｅｒ−５ｅｒ　。
Ｓａｃ工　Ｐ５７Ｉ　Ｘｍｎ工 ＦＩＧ　２Ｃ ＦＩＧ　２Ｄ ０°５７０−６３０ ０Ｄ５７０−６３０ ＰＬ１上令我 ＩｇＥ　（ｎｇ／ｍｌ） ＩｇＧ、　（Ｐｇ／ｍｌ） ＬＯ９「９ｑ Ｌｏｇ□４級展 鵞光弛臭 Ａ１岱上■仁０ＩＪ ＣＡＣＡＡＡ　ＴＧＴ　にＡＣＡＴＣＡＣＴ　ＣＴＧ　ＣＡＡ　ＧＡＡ　人ＴＣ 人ＴＣＡＡＡ　ＡＣＴ　ＣＴ（：　ＡＡＣＴＣＣ；　ＴＴＡ　ＡＣＣにＡＡ　Ｃ ＡＧ　ＡＡＡ　ＡＣＣＣＴＣ；　ＴＧＣＡＣＣＣＡＧ　ＣＴＣＡＣＴ　ＧＴＴ　 ＡＣＴにＡＴ　ＡＴＣＴＴＣＧＣＴ　ＧＣＴ　ＴＣＣＡＡＡ　ＡＡＣＡＣＴ　Ａ ＣＴ　Ｃ，ＡＡ思Ｃ品ＡＣＴ　ＴＴＣＴＣＣＡＣ人　ＣＣＴ　ＧＣＴ　ＡＣＣＧ ＴＴ　ＣＴＧ　ＣＧＴ　ＣＡＧ　ＴＴＣＴＡＣＴＣＴ　ＣＡＣＣＡＣＧＡＡＡＡ Ａ　Ｃ，ＡＣＡＣＧ　ＣＯＴ　ＴＧＴ　ＣＴＣＣＧＣＣＣＣＡＣＴ　ＧＣＧ　Ｃ ＡＧ　ＣＡＧ　ＴＴＣＣＡＣＣＣ：ＴＣＡＣ人ＡＡ　ＣＡＧ　ＣＴＧ　ＡＴＣＡ Ｇ人ＴＴＣＣＴＧ　ＡＡＡ　ＣＧＴ　ＣＴＡ　ＧＡＣＣＧＴ　人ＡＣＣＴＧＴＣ ；Ｇ　ＧＣ；ＣＣＴＧ　にＣＣＧにＣＣＴＧ　ＡＡＣＴＣＴ　ＴＣ；Ｔ　ＣＣＧ 　ＧＴＴ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＧＣＴん和ＣＡＣＴＣＧ　人ＣＴ　ＣＴＣＧＡＡ　 人ＡＣＴＴＣＣＴＣＣＡＣ；　ＣＧＴ　ＣＴＧ　ＡＡＡ　ＡＣＣＡＴＣＡＴＣＣ ＧＴ　０人人　人人ＧＴ人ＣＴＣＴ　人人Ａ　ＴＣＣＴＣＴ　ＴＣＴＦＩＧ　６ Ａ ＜　ｃｏ　（Ｊ ■　（ワ　（ワ 口−　ＬＬ　ＬＬ ｏ　口」　ロー ロー　ＬＬ　ＬＬ 「う　μ− 一口 才目　々１１１）月１ ＦＩＧ　１１ Ｘｈｏ　Ｉ　Ｘｈｏ　Ｉ　Ｈ７ｎｄ　ＩＩＩＴＲＰＣＩＩ　ベア７− １ａｌ ＦＩＧ　１２ ｏＤ５７０−６３０ ０、Ｄ、５７０−６３０ ［ＮａＣｌ］　（Ｍ）−−−− 〜　ｈ　の　ｃｏ　５　応　＝ Ｕ、　ＩＬ−３（ＮＦＳ−６０）ｘ　１０−２ト→Ｎ　ｈｃｈ　中　６　、ｌＪ 　＝ Ｕ、　ＴＣＧＦ　（Ｈ７２）ｘ　（１０’）　Ｏ−０Ａ２２０− Ｕ、　ＩＬ−３（ＮＦＳ−６０）　ｘ　１０°２ＨＵ、ＭＣＧＦ（ＭＣ／９）　 ＆−４ ｏｅ：Ｍａｓｓｃｌ：ｇ８ｉ ＬＯ９２佛扱友 ■ 国際調査報告 ”＋ｔ＋＃ｊ＋、”ｅ”＊＃＋＋Ｉ＋、＃＋Ｎｔ　？Ｃ’：ｒ”：Ｓ　＝６／： ：：＝４　＋＝−１＾ニー１＾コス　τ〇　二五Ｅ　ｚＮ″：！シ詰’：’：Ｑ ）ｌＡｍ　５＝＾スＣ＝　λエデＯ：’ｔＴ　ＣＮＩＮ−＝ミＲＮＡ：：ＯＮＡ 、ｌ−Ａ？？ＬＺＣ？、：二ＣＮＮｏ、ＰＣＴ／ＩＪＳａ６／Ｃ２４６４（ＳＡ ＬＳ２＋ｉ：２）

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. １．哺乳動物インターロイキン−４，好ましくは霊長類インターロイキン−４， げっ歯類インターロイキン−４または有蹄類インターロイキン−４，特にヒトイ ンターロイキン−４であって、とりわけ少なくとも９×１０７単位／ｍｇのＴＣ ＧＦ活性を有するインターロイキン−４からなるタンパク質。
  2. ２．インターロイキン−４がヒトインターロイキン−４であって、ＭＨＣ抗原誘 導活性，Ｆｃ−イプシロン受容体誘導活性，ＧＭ−ＣＳＦ刺激顆粒球コロニー成 長増強活性，インターロイキン−２ＴＣＧＦ増強活性，およびＩｇＧ１−ならび にＩｇＥ−誘導活性から選択される少なくとも１つの活性，好ましくは少なくと も２つの活性を更に示し、そして特に以下の式：【配列があります】 〔式中、 Ｘ（Ｓｅｒ）は，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｇｌｙ，およびＡｓｎからなる群を表し，Ｘ （Ａｒｇ）は、Ａｒｇ，Ｈｉｓ，Ｇｌｎ，ＬｙｓおよびＧｌｕからなる群を表し Ｘ（Ｌｅｕ）は、Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，ＭｅｔおよびＶａｌからな る群を表しＸ（Ｐｒｏ）は、Ｐｒｏ，Ｇｌｙ，ＡｌａａおよびＴｈｒからなる群 を表しＸ（Ｔｈｒ）は、Ｔｈｒ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓおよ びＧｌｎからなる群を表し Ｘ（Ａｌａ）は、Ａｌａ，Ｇｌｙ．ＴｈｒおよびＰｒｏからなる群を表しＸ（Ｖ ａｌ）は、Ｖａｌ，Ｍｅｔ，Ｔｙｒ，Ｐｈｅ，ＩｌｅおびＬｅｕからなる群を表 しＸ（Ｇｌｙ））は、Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｔｈｒ，ＰｒｏおよびＳｅｒからなる群 を表しＸ（Ｉｌｅ）は、Ｉｌｅ，Ｍｅｔ，Ｔｙｒ，Ｐｈｅ，ＶａｌおよびＬｅｕ からなる群を表しＸ（Ｐｈｅ）は、Ｐｈｅ，Ｔｒｐ，Ｍｅｔ，Ｔｙｒ，Ｉｌｅ、 ＶａｌおよびＬｅｕからなる群を表し Ｘ（Ｔｙｒ）は、Ｔｙｒ，Ｔｒｐ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｉｌｅ，ＶａｌおよびＬｅ ｕからなる群を表し Ｘ（Ｈｉｓ）は、Ｈｉｓ，Ｇｌｕ，Ｌｙｓ，Ｇｌｎ，ＴｈｒおよびＡｒｇからな る群を表しＸ（Ｇｌｎ）は、Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｌｙｓ，Ａｓｎ，Ｈｉｓ，Ｔｈｒ およびＡｒｇからなる群を表し Ｘ（Ａｓｎ）は、Ａｓｎ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ，ＧｌｎおよびＳｅｒからなる群を表 しＸ（Ｌｙｓ）は、Ｌｙｓ，Ｇｌｕ，Ｇｌｎ，ＨｉｓおよびＡｒｇからなる群を 表しＸ（Ａｓｐ）は、Ａｓｐ，ＧｌｕおよびＡｓｎからなる群を表しＸ（Ｇｌｕ ）は、Ｇｌｕ，Ａｓｐ，Ｌｙｓ，Ａｓｎ，Ｇｌｎ，ＨｉｓおよびＡｒｇからなる 群を表し、そして Ｘ（Ｍｅｔ）は、Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｈｅ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，ＬｅｕおよびＴｙ ｒからなる群を表す〕 で定義されるアミノ酸配列を有するグリコシル化または非グリコシル化ポリペプ チドである請求の範囲第１項記載のタンパク質。
  3. ３．該グリコシル化または非グリコシル化ポリペプチドが１０重置換まで置換さ れており、特にポリペプチドが３〜２９位，３５〜６６位，７８〜８７位，９８ 〜９９位および１０５〜１２５位のアミノ酸残基で定義される領域内でせいぜい １重置換されている，請求の範囲第２項記載のタンパク質。
  4. ４．Ｘ（ｎｒｇ）はＡｒｇであり、 Ｘ（Ｌｅｕ）はＬｅｕ，ＩｌｅおよびＭｅｔからなる群を表し、Ｘ（Ｐｒｏ）は Ｐｒｏであり、 Ｘ（Ａｌａ）はＡｌａであり、 Ｘ（Ｖａｌ）はＶａｌであり、 Ｘ（ＩＬｅ）はＩｌｅ，ＭｅｔおよびＬｅｕからなる群を顕し、Ｘ（Ｐｈｅ）は Ｐｈｅであり、 ｘ（Ｔｙｒ）はＴｙｒであり、 Ｘ（Ｈｉｓ）はＨｉｓであり、 Ｘ（Ｇｌｎ）はＧｌｎであり、 Ｘ（Ａｓｎ）はＡｓｎであり、 Ｘ（Ｌｙｓ）はＬｙｓであり、 Ｘ（Ａｓｐ）はＡｓｐであり、 Ｘ（Ｇｌｕ）はＧｌｕであり、そして Ｘ（Ｇ１ｕ）はＭｅｔ，ＩｌｅおよびＬｅｕからなる箒群をあらわし特に、該ポ リペプチドが３〜２９位，３５〜６６位，７８〜８７位，９８〜９９位および１ ０５〜１２５位のアミの酸残基で定義される領域内で１０重置換され、とりわけ せいぜい１重置換されており好適には該ポリペプチドが以下の式：【配列があり ます】 で定義される，請求の範囲第２項記載のタンパク質。
  5. ５．以下の式： 【配列があります】 〔式中、 Ｘ（Ｓｅｒ）はＳｅｒ，Ｔｈｒ，ＧｌｙおよびＡｓｎからなる群を表しＸ（Ａｒ ｇ）はＡｒｇ，Ｈｉｓ，Ｇｌｎ，ＬｙｓおよびＧｌｕからなる群を表しＸ（Ｌｅ ｕ）はＬｅｕ，Ｉｌｅ，Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，ＭｅｔおよびＶａｌからなる群を表し Ｘ（Ｐｒｏ）はＰｒｏ，Ｇｌｙ，Ａｌａ，およびＴｈｒからなる群を表しＸ（Ｔ ｈｒ）はＴｈｒ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，ＡｌａＧｌｙ，ＨｉｓおよびＧｌｎからなる 群を表し Ｘ（Ａｌａ）はＡｌａ，Ｇｌｙ，ＴｈｒおよびＰｒｏからなる群を表しＸ（Ｖａ ｌ）はＶａｌ，Ｍｅｔ，Ｔｙｒ，Ｐｈｅ，ＩｌｅおよびＬｅｕからなる群をしＸ （Ｇｌｙ）はＧｌｙ，Ａｌａ，Ｔｈｒ，ＰｒｏおよびＳｅｒからなる群を表しＸ （Ｉｌｅ）はＩｌｅ，Ｍｅｔ，Ｔｙｒ，Ｐｈｅ，ＶａｌおよびＬｅｕからなる群 を表しＸ（Ｐｈｅ）はＰｈｅ，Ｔｒｐ，Ｍｅｔ，Ｔｙｒ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，およ びＬｅｕからなる群を表し Ｘ（Ｔｙｒ）はＴｙｒ，Ｔｒｐ、Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｉｌｅ，ＶａｌおよびＬｅｕ からなる群を表し Ｘ（Ｈｉｓ）はＨｉｓ，Ｇｌｕ，Ｌｙｓ、Ｇｌｎ，Ｔｈｒ，およびＡｒｇからな る群を表しＸ（Ｇｌｎ）はＧｌｎ、，Ｇｌｕ，Ｌｙｓ，Ａｓｎ，Ｈｉｓ，Ｔｈｒ およびＡｒｇからなる群を表し Ｘ（Ａｓｎ）はＡｓｎ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ，ＧｌｎおよびＳｅｒからなる群を表し Ｘ（Ｌｙｓ）はＬｙｓ，Ｇｌｕ，Ｇｌｎ，ＨｉｓおよびＡｒｇからなる群を表し Ｘ（Ａｓｐ）はＡｓｐ，Ｇｌｕ，およびＡｓｎからなる群を表しＸ（Ｇｌｕ）は Ｇｌｕ，Ａｓｐ，Ｌｙｓ，Ａｓｎ，Ｇｌｎ，ＨｉｓおよびＡｒｇからなる群を表 し，そして Ｘ（Ｍｅｔ）はＭｅｔ，Ｐｈｅ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，ＬｅｕおよびＴｙｒからなる 群を表す； 特に Ｘ（Ｓｅｒ）はＳｅｒであり、 Ｘ（Ａｒｇ）はＡｒｇ，ＨｉｓおよびＬｙｓからなる群を表し、Ｘ（Ｌｅｕ）は Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，ＰｈｅおよびＭｅｔからなる群を表し、Ｘ（Ｐｒｏ）はＰｒｏ ，およびＡＩａからなる群を表しＸ（Ｔｈｒ）はＴｈｒであり、 Ｘ（Ａｌａ）はＡ１ａおよびＰｒｏからなる群を表し、Ｘ（Ｖａｌ）はＶａｌ， ＭｅｔおよびＩｌｅからなる群を表しＸ（Ｇｌｙ）はＧｌｙであり、 Ｘ（Ｉｌｅ）はＩｌｅ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，ＶａｌおよびＬｅｕからなる群を表し Ｘ（Ｐｈｅ）はＰｈｅ，Ｍｅｔ，Ｔｙｒ，ＩｌｅおよびＬｅｕからなる群を表し Ｘ（Ｔｙｒ）はＴｙｒ，およびよびＰｈｅからなる群を表しＨ（Ｈｉｓ）はＨｉ ｓ，ＧｌｎおよびＡｒｇからなる群を表しＸ（Ｇｌｎ）はＧｌｎ，Ｇｌｕおよび Ｈｉｓからなる群を表しＸ（Ａｓｎ）はＡｓｎおよびＡｓｐ，からなる群を表し Ｘ（Ｌｙｓ）はＬｙｓ，およびＡｒｇからなる群を表しＸ（Ａｓｐ）はＡｓｐ， およびＡｓｎ，からなる群を表しＸ（Ｇｌｕ）はＧｌｕ，およびＧｌｎからなる 群を表し、そしてＸ（Ｍｅｔ）はＭｅｔ，Ｐｈｅ，Ｉｌｅ、ＶａｌおよびＬｅｕ からなる群を表す〕を有するグリコシル化または非グリコシル化１０重挿入、１ ０重欠失および１０重置換ポリペプチドから選択され；とりわけ該ポリペプチド が３〜２９位，３５〜６６位，７８〜８７位，９８〜９９位および１０５〜１２ ５位のアミノ酸残基によって定義される領域内でせいぜい２重挿入，せいぜい２ 重欠失またはせいぜい２重置換されているものであり；特にヒトインターロイキ ン−４突然変異タンパク質Δ１−４，ヒトインターロイキン−４突然変異タンパ ク質１Ｓ■（Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ）またはヒトイ ンターロイキン−４突然変異タンパク質１Ｓ■（Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ）であ る請求の範囲第１項記載のタンパク質。
  6. ６．該げっ歯類インターロイキン−４がネズミイソターロイキン−４であって、 とりわけＭＣＧＦ活性，ＭＨＣ抗原誘導活性，Ｆｃ−イプシロン受容体誘導活性 ，ＧＭ−ＣＳＦ刺激顆粒球コロニー成長増強活性、インクーロイキン−２ＴＣＧ Ｆ増強活性およびＩｇＧ１−ならびにＩｇＥ−誘導活性からなる群から選択され る少なくとも１つの活性，好ましくは少なくとも２つの活性を更に示し、そして 特に以下の式： 【配列があります】 で定義されるネズミインクーロイキン−４である、請求の範囲第２項記載のタン パク質。
  7. ７．治療上適合性のある担体および有効量のヒトインターロイキン−４が請求の 範囲第３項または第４項に記載のタンパク質である，免疫系を刺激するための医 薬組成物。
  8. ８．哺乳動物インターロイキン−４活性を示し、ＭＨＣ抗原誘導活性、Ｆｃ−イ プシロン受容体誘導活性，ＧＭ−ＣＳＦ刺激顆粒球コロニー成長増強活性，イン ターロイキン−２ＴＣＧＦ増強活性およひＩｇＧ１−ならびにＩｇＥ−誘導活性 からなる群から選択される少なくとも１つの追加的な活性を示すポリペプチドを コードすることのできるヌクレオチド塩基配列、好ましくはｐｃＤ−４６，ｐｃ Ｄ−１２５およびｐｃＤ−２Ａ−Ｅ３から選択されるベクターのｃＤＮＡ挿入物 中のＤＮＡ配列と事実上相同であるヌクレオチド塩基配列，特に該事実上相同な 配列がｐｃＤ−４６，ｐｃＤ−１２５およびｐｃＤ−２Ａ−Ｅ３からなる群から 選択されるベクターのｃＤＮＡ挿入物中のＤＮＡ配列と少なくとも５０％相同で あり、好ましくは少なくとも７５％相同であるヌクレオチド塩基配列からなる核 酸。
  9. ９．請求の範囲第３項〜第５項記載のいずれか１項に記載のポリペプチドをコー ドすることのできるコドン配列，とりわけ第１Ｂ図の６４位，好ましくは１３０ 位から５２２位までの塩基配列で定義されるコドン配列，特に以下の式：【配列 があります】 で定義されるコドン配列を含む核酸からなる群から選択される化合物。
  10. １０．ヒトインターロイキン−４活性を示すポリペプチドをコードするヌクレオ チド配列を含むベクターを創製し、ここで該ヌクレオチド配列は該ベクターを含 む宿主に８，２発現可能であり、そして該ヌクレオチド配列はｐｃＤ−１２５の 挿入物に対して少なくとも５０％相同であり； 該ベクターを宿主に組み込み；そして 該ベクター含有宿主をヌクレオチド配列をポリペプチドに発現させるのに適した 条件下に維持する、ことからなるヒトインターロイキン−４活性を示すポリペプ チドを産生する方法、とりわけ該ヌクレオチド配列が請求の範囲第９項で定義さ れるものから選択され、かつ該宿主が好ましくは哺乳動物である上記方法。
  11. １１．酵母細胞，細菌細胞および哺乳動物細胞，好ましくは大腸菌（Ｅｓｃｈｅ ｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）細胞，サッカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｍ ｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞，ＣＯＳ７モンキー細胞、チャイニーズハ ムスター卵巣細胞，マウスＬ細胞およびマウスミエローマ細胞から選択される細 胞であって、請求の範囲第９項で定義される核酸配列を含むベクターで形質転換 または−過性トランスフェクションされる上記細胞。
  12. １２．請求の範囲第５項で定義される核酸配列を含むベクターであって、特にｐ ＩＮ−ＩＩＩ−ｏｍｐＡ２，ＴＲＰＣ１１およびＴＡＣ−ＲＢＳから選択される 、細菌宿主を形質転換することのできるベクター，または 請求の範囲第５項で定義される核酸配列を含むベクター、例えばベクタ−ｐＭＦ −アルファ８である、酵母宿主を形質転換することのできるベクター，または 請求の範囲第５項で定義される核酸配列を含むベクター、好ましくはｐｃＤプラ スミド、例えばｐｃＤ−１２５またはｐｃＤ−４６からなる哺乳動物宿主を形質 転換または−過性トランスフェクションすることのできるベクター。
  13. １３．有効量の請求の範囲第７項記載の医薬組成物を投与することによってＢ細 胞上のクラスＩＩＨＬＡ−ＤＲ抗原の発現を刺激することからなる裸リンパ球症 候群の治療方法。
JP61506135A 1985-11-19 1986-11-19 哺乳動物インタ−ロイキン−４ Expired - Lifetime JP2557361B2 (ja)

Applications Claiming Priority (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US79966985A 1985-11-19 1985-11-19
US79966885A 1985-11-19 1985-11-19
US799669 1985-11-19
US799668 1985-11-19
US06/843,958 US5552304A (en) 1985-11-19 1986-03-25 CDNA Clones coding for human protein exhibiting a broad cellular activity spectrum (human interleukin-4)
US843958 1986-03-25
US88155386A 1986-07-03 1986-07-03
US881553 1986-07-03
US06/908,215 US5017691A (en) 1986-07-03 1986-09-17 Mammalian interleukin-4
US908215 1986-09-17

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS63501401A true JPS63501401A (ja) 1988-06-02
JP2557361B2 JP2557361B2 (ja) 1996-11-27

Family

ID=27542219

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP61506135A Expired - Lifetime JP2557361B2 (ja) 1985-11-19 1986-11-19 哺乳動物インタ−ロイキン−４
JP7217072A Expired - Lifetime JP2568394B2 (ja) 1985-11-19 1995-08-25 哺乳動物インターロイキン−４活性を示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP7217072A Expired - Lifetime JP2568394B2 (ja) 1985-11-19 1995-08-25 哺乳動物インターロイキン−４活性を示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸

Country Status (23)

Country Link
EP (3) EP0230107A1 (ja)
JP (2) JP2557361B2 (ja)
KR (1) KR940007773B1 (ja)
CN (1) CN1020472C (ja)
AT (2) ATE140009T1 (ja)
AU (1) AU610057B2 (ja)
CZ (1) CZ414191A3 (ja)
DE (2) DE3650538T2 (ja)
DK (1) DK371087A (ja)
ES (2) ES2153444T3 (ja)
FI (1) FI102075B1 (ja)
GR (1) GR3021198T3 (ja)
HK (2) HK1005594A1 (ja)
HU (1) HU208710B (ja)
IE (1) IE80828B1 (ja)
IL (1) IL80678A (ja)
MY (1) MY101972A (ja)
NO (1) NO301234B1 (ja)
NZ (1) NZ218332A (ja)
OA (1) OA08947A (ja)
PT (1) PT83761B (ja)
SK (1) SK414191A3 (ja)
WO (1) WO1987002990A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05502274A (ja) * 1989-11-23 1993-04-22 シェムレック・アクチボラゲット 高い硫化度を有する、硫酸塩パルプ蒸解用蒸解液の製造方法

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0740943B2 (ja) * 1985-09-30 1995-05-10 佑 本庶 新規なポリペプチドをコードするｄｎａ及びその製造方法
US5912136A (en) * 1985-11-19 1999-06-15 Schering Corporation Monoclonal antibodies against human interleukin-4 and hybridomas producing the same
US5700915A (en) * 1985-11-19 1997-12-23 Schering Corporations Human interleukin immunopurification processes
US5041381A (en) * 1986-07-03 1991-08-20 Schering Corporation Monoclonal antibodies against human interleukin-4 and hybridomas producing the same
US5082927A (en) * 1986-09-24 1992-01-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Selectively cytotoxic IL-4-PE40 fusion protein
AU620537B2 (en) * 1986-12-19 1992-02-20 Immunex Corporation Human interleukin-4 muteins
SE8701004D0 (sv) * 1987-03-11 1987-03-11 Astra Ab Method for therapy of leukemias and certain other malignancies
WO1989001046A1 (en) * 1987-07-29 1989-02-09 Schering Biotech Corporation Purification of human interleukin-4 expressed in escherichia coli
JPH02485A (ja) * 1987-08-03 1990-01-05 Yuu Honshiyo 新規なヒトインターロイキン４、該因子を発現させるための組換えベクター及びそのベクターにより形質転換された形質転換体
DE3882611T2 (de) * 1987-08-03 1993-12-23 Tasuku Honjo Menschliches Interleukin-4, Expressionsvektoren dafür und diese enthaltende Transformanten.
ES2058490T3 (es) * 1988-02-02 1994-11-01 Schering Biotech Corp Metodo de reducir respuestas de inmunoglobulina e.
GB8808015D0 (en) 1988-04-06 1988-05-05 Ritter M A Chemical compounds
GB2218420B (en) * 1988-04-12 1992-07-15 British Bio Technology Synthetic gene encoding interleukin 4
WO1989010939A1 (en) * 1988-05-13 1989-11-16 University Patents, Inc. Immunogens and biologically active peptides derived from shared sequences from antigens and anti-idiotypic antibodies or antibodies specific for cellular receptors of the antigens
US4958007A (en) * 1988-05-17 1990-09-18 Schering-Plough Corp. Extraction of human interleukin-4- from bacteria
AU643427B2 (en) * 1988-10-31 1993-11-18 Immunex Corporation Interleukin-4 receptors
WO1990006765A1 (en) * 1988-12-21 1990-06-28 Schering Corporation Use of interleukin-4 for lowering blood glucose levels and/or effecting weight reduction
WO1990007932A1 (en) * 1989-01-20 1990-07-26 The University Of Melbourne Fibrinolysis
US5077388A (en) * 1990-05-31 1991-12-31 Schering Corporation Purification of human interleukin-4 from a secreted escherichia coli mutant
WO1991007186A1 (en) * 1989-11-21 1991-05-30 The University Of Melbourne Anti-inflammatory compositions and methods
US5188827A (en) * 1989-12-18 1993-02-23 Schering Corporation Use of interleukin-4- for lowering blood-cholesterol levels
IL96714A0 (en) 1989-12-20 1991-09-16 Schering Corp Antibody antagonists of human interleukin-4
CA2078676A1 (en) * 1990-03-21 1991-09-22 Jerome Schwartz Use of il-4 to enhance immune response to infectious antigenic challenges
EP0563254B1 (en) * 1990-12-19 1995-11-08 Schering Corporation Use of il-4 to enhance immune response to immunogens in vaccines
ATE135233T1 (de) * 1991-01-10 1996-03-15 Schering Corp Verwendung von il-4 zur verstärkung von wundheilung und besserung und zur heilung von infizierten wunden und wunden bei diabetischen säugetieren
US5494662A (en) * 1992-04-27 1996-02-27 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Stimulator for bone formation
US5716612A (en) * 1994-09-07 1998-02-10 Schering Corporation Use of IL-4 for potentiation of chemotherapeutic agents
AUPN481295A0 (en) * 1995-08-16 1995-09-07 Medvet Science Pty. Ltd. Agonists of haemopoietic growth factors
US6335426B1 (en) 1996-06-14 2002-01-01 Bayer Corporation T-cell selective interleukin-4 agonists
US5986059A (en) * 1996-06-14 1999-11-16 Bayer Corporation T-cell selective interleukin-4 agonists
US6028176A (en) 1996-07-19 2000-02-22 Bayer Corporation High-affinity interleukin-4 muteins
CA2331726C (en) * 1998-05-12 2010-03-09 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of molecular interaction sites on rna and other biomolecules
AUPQ005399A0 (en) * 1999-04-29 1999-05-27 Medvet Science Pty. Ltd. Agonists or antagonists for haemopoietic growth factors
LT2665486T (lt) 2011-01-18 2020-04-10 Bioniz, Llc Kompozicijos, skirtos gama-c-citokino aktyvumui moduliuoti
WO2015089217A2 (en) 2013-12-10 2015-06-18 Bionz, Llc Methods of developing selective peptide antagonists
CN102212888A (zh) * 2011-03-17 2011-10-12 靳海峰 一种基于高通量测序的免疫组库构建方法
US11400134B2 (en) 2015-10-09 2022-08-02 Bioniz, Llc Modulating gamma-c-cytokine activity
WO2020227019A1 (en) 2019-05-03 2020-11-12 Bioniz, Llc Modulating the effects of gamma-c-cytokine signaling for the treatment of alopecia and alopecia associated disorders

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US799669A (en) * 1905-07-27 1905-09-19 Eugene S Regnier Combined cutting and raking implement.
US799668A (en) * 1905-05-29 1905-09-19 Albert R Pritchard Dough kneader and mixer.
US843958A (en) * 1905-11-20 1907-02-12 Whitehead & Hoag Co Key-ring tag.

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4613459A (en) * 1982-10-20 1986-09-23 Dana-Farber Cancer Institute Lymphocyte growth factor
US4695542A (en) * 1983-10-04 1987-09-22 Dnax Research Institute Of Molecular And Cellular Biology, Inc. cDNA clones coding for polypeptides exhibiting multi-lineage cellular growth factor activity
WO1987004723A1 (en) * 1986-02-11 1987-08-13 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant human b-cell growth factor
ZA872781B (en) * 1986-05-19 1987-10-05 Immunology Ventures B-cell stimulating factor
AU620537B2 (en) * 1986-12-19 1992-02-20 Immunex Corporation Human interleukin-4 muteins

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US799668A (en) * 1905-05-29 1905-09-19 Albert R Pritchard Dough kneader and mixer.
US799669A (en) * 1905-07-27 1905-09-19 Eugene S Regnier Combined cutting and raking implement.
US843958A (en) * 1905-11-20 1907-02-12 Whitehead & Hoag Co Key-ring tag.

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05502274A (ja) * 1989-11-23 1993-04-22 シェムレック・アクチボラゲット 高い硫化度を有する、硫酸塩パルプ蒸解用蒸解液の製造方法
JP2815701B2 (ja) * 1989-11-23 1998-10-27 シェムレック・アクチボラゲット 高い硫化度を有する、硫酸塩パルプ蒸解用蒸解液の製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
DE3650751D1 (de) 2001-02-22
CZ414191A3 (en) 1993-04-14
ES2153444T3 (es) 2001-03-01
IE80828B1 (en) 1999-03-10
FI873141A0 (fi) 1987-07-16
CN86108579A (zh) 1988-01-27
EP0230107A1 (en) 1987-07-29
DE3650751T2 (de) 2001-08-02
EP0675136B1 (en) 2001-01-17
EP0249613A1 (en) 1987-12-23
SK414191A3 (en) 1995-07-11
ATE140009T1 (de) 1996-07-15
WO1987002990A1 (en) 1987-05-21
OA08947A (en) 1990-11-30
HK1008823A1 (en) 1999-05-21
JP2557361B2 (ja) 1996-11-27
KR940007773B1 (ko) 1994-08-25
CN1020472C (zh) 1993-05-05
JPH0884591A (ja) 1996-04-02
NZ218332A (en) 1993-04-28
IE863042L (en) 1987-05-19
DK371087A (da) 1987-09-21
ES2088858T3 (es) 1996-10-01
PT83761B (pt) 1989-06-30
IL80678A (en) 1999-05-09
AU610057B2 (en) 1991-05-16
NO301234B1 (no) 1997-09-29
HUT43630A (en) 1987-11-30
NO872988L (no) 1987-09-18
JP2568394B2 (ja) 1997-01-08
EP0675136A3 (en) 1996-03-13
NO872988D0 (no) 1987-07-17
DK371087D0 (da) 1987-07-16
IL80678A0 (en) 1987-02-27
DE3650538D1 (de) 1996-08-08
FI873141A (fi) 1987-07-16
AU6733487A (en) 1987-06-02
GR3021198T3 (en) 1996-12-31
FI102075B (fi) 1998-10-15
DE3650538T2 (de) 1996-12-12
EP0249613B1 (en) 1996-07-03
PT83761A (en) 1986-12-01
EP0675136A2 (en) 1995-10-04
HK1005594A1 (en) 1999-01-15
MY101972A (en) 1992-02-29
FI102075B1 (fi) 1998-10-15
HU208710B (en) 1993-12-28
ATE198754T1 (de) 2001-02-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPS63501401A (ja) 哺乳動物インタ−ロイキン−４
US5017691A (en) Mammalian interleukin-4
KR940010865B1 (ko) 종양 괴사 인자의 생산 방법 및 종양 괴사 인자의 수율을 증가시키는 방법
FI106044B (fi) Menetelmä nisäkkään interleukiini-4-reseptorin (IL-4R) ja sen vasta-aineen tuottamiseksi ja IL-4R:ä koodaava DNA, vektori ja isäntäsolu
JP3260368B2 (ja) インターロイキン−１０による腫瘍性疾患の処置
JPH09508625A (ja) インターロイキン−３変異体とコロニー刺激因子との併用投与
JP2001502915A (ja) 新規な幹細胞因子受容体アゴニストとしての環状に並べ替えたポリペプチド
US5208218A (en) T cell growth factor glycoproteins
US5955315A (en) Nucleic acids encoding human interleukin-4
US4758511A (en) CDNA clones coding for polypeptides exhibiting IGE binding factor activity
US5951973A (en) Use of interleukin-4 (IL-4) to treat rheumatoid arthritis
JPH10506538A (ja) Ｇｐ１３０に全く結合することができないヒトインターロイキン−６の拮抗薬、および医薬化合物の製造におけるそれらの使用
JPH01503353A (ja) 免疫グロブリンｅに対するポリペプチド競争体
KR930009084B1 (ko) 포유동물의 인터로이킨-4, 이를 포함하는 조성물 및 이의 제조방법
CA1341299C (en) Mammalian interleukin-4
WO1992004377A1 (en) HUMAN INTERFERON-η4-134, FUNCTIONAL EQUIVALENTS THEREOF AND METHODS OF USING AND COMPOSITIONS EMPLOYING THESE MATERIALS
US5807996A (en) Fused polypeptides comprising interleukin-4 polypeptide fragments
EP0267779A2 (en) Human pleiotropic immune factor and muteins thereof
JPH04103599A (ja) 融合ポリペプチド
JPS60176597A (ja) 多系細胞成長因子活性および／または肥満細胞成長因子活性を示すポリペプチドをコ−ド化するｃＤＮＡクロ−ン
JPS63146798A (ja) ヒト多機能性免疫因子及びその突然変異タンパク

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term