JPH01503353A - 免疫グロブリンｅに対するポリペプチド競争体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫グロブリンＥに対するポリペプチド競争体技術分野 本発明は、ヒトの免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に対するポリペプチド競争体（ｃ ｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）に関する。より詳細には本発明は、次のようなポリペプチ ドに関する。即ち、ヒトの細胞（特にマスト細胞及び好塩基球）に存在するＩｇ Ｅに対する高親和性Ｆｃレセプタ部位に特異的に結合する能力を持ち、これによ り、抗原特異ＩｇＥが抗原の存在下で該レセプタ部位に結合及び架橋結合した時 に起きる生物反応（エキソサイト−シスまたは顆粒減少等）を抑制するポリペプ チドである。また本発明は、このようなポリペプチドを有効成分とする調合薬に 関する。更に本発明は、遺伝学的に変異した細菌を用いたこのようなポリペプチ ドの生成方法に関する。

背景技術 ヒトの免疫系におけるＩｇＥの主な役割は、寄生生物に対する免疫を提供するこ とにあると考えられている。しかしながらＩｇＥは、タイプＩ過敏症（枯草熱や ぜん息等の症状の発現をもたらすアレルギー反応）を媒介する。簡潔にいえば、 アレルギー反応のメカニズムは、通常は無害な抗原（花粉等）への遭遇時に、Ｂ −細胞によって抗原特異ＩｇＥの合成が開始されるというものである。この抗原 特異１ｇＥは、次にＦｃ領域を介してマスト細胞のレセプタ部位に結合する。そ の後、再びこの抗原に遭遇すると、メゾイエイタ（主にヒスタミン）を放出する マスト細胞の脱顆粒反応（ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）を誘発し、その結果、 タイプＩ過敏症の特徴である急性の炎症症状が起こる。

構造的にはＩｇＥは、他の免疫グロブリンと同様に、２本のＨ鎖と２本のし鎖と を含んでいる。イプシロンＨ鎖は、５つのドメイン（可変ドメインＶＨと定常ド メインＣＨＩからＣＨ４）を有している。ＩｇＥの分子量は約１８８，０００で あり、Ｈ鎖はそのうちの約７２，５００を占めている。Ｈ鎖は、約５５０個のア ミノ酸残基が配列（シーケンス）したものである。

ペプチド配列（シーケンス）した３３０個のアミノ酸（ベーニッヒ氏によるＰｒ ｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ＩＩ、第１巻、１９゛７４年７月 、４９〜５８頁記載の番号付けによれば、ＩｇＥのイプシロンＨ鎖のアミノ酸残 基２１８番から５４７番に相当するもの）は、ヒトのマスト細胞からのメゾイエ イタの放出に対して抑制効果を有していることが報告されている（　Ｎａｔｕｒ ｅ誌第３１５巻、１９８５年、Ｎｏ、６０２０．５７７〜５７８頁）。

この３３０個のアミノ酸配列は、２本のアミノ酸の鎖（各々アミノ酸３３０個分 の長さであり、ジスルフィド結合により配列している）から成る二量体として存 在している。

米国特許第４１７１２９９号及び４１６１５２２号は、ヒトのＩｇＥのＦｃ領域 のアミノ酸２６５番から５３７番の部位（ベーニッヒ氏の分類命名法［上記Ｎａ ｔｕｒｅ誌を参照のこと］による）から選択した３個ないし１０個のアミノ酸の 配列を含んだオリゴペプチドが、マスト細胞のＦｃレセプタを遮断しくｂｌｏｃ ｋ）、これによって脱顆粒反応及びメゾイエイタ（ヒスタミン等）の放出を抑制 する、ということを開示している。これらのオリゴペプチドのうち最も活性が強 いものは、ＩｇＥのＨ鎖のアミノ酸配列３２０番から３２４番から誘導されたペ ンタペプチドＡｓｐ−８ｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ　（ヒト免疫グロブリン Ｅポリペプチド［ＨＥＰＰ］と呼ぶ）であることが確認されている。元のＩｇＥ では、アミノ酸３２２番はアスパラギンである。しかし、この米国特許には、ア スパラギン酸によるアスパラギンの置換が、ＦＣレセプタ遮断活性の大幅な増進 をもたらす、ということが示唆されている。

上記特許では、ベーニッヒ氏の研究成果である配列全体（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉ ｎ　Ｉａ＋ｍｕｎｏｌｏｇｙ　ＩＩ、第１巻、１９７４年７月、４９から５８頁 ）が引用されており、その配列の位置３２２番にアスパラギン酸が示されている 。しかし、ベーニッヒ氏自身、その位置にはアスパラギンが存在するということ を後に主張している（　Ｉｎｔ、　Ａｒｃｈ、　Ａｌｌｅｒｇｙ　Ａｐｐｌ、　 Ｉｍｍｕｎｏｌ、５３．４５９）。

またベーニッヒ氏は、ペプチドＡｓｐ−Ｓｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＡｒｇとＡｓ ｐ−Ｓｅｔ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇのいずれも、ＦＣレセプタ遮断活性を有し ていないということを報告している。遺伝子配列の測定により、アミノ酸３２２ 番はアスパラギン酸ではなくアスパラギンであることが明らかになっている。ヨ ーロッパ特許出願第１０２６３４号では、アスパラギン酸ではなくアスパラギン が位置３２２番に正しく引用されている。

更に、ＨＥＰＰの特異活性は低いので、有意の生理学的効果ということも報告さ れている。

ＩｇＥイプシロン鎖の断片の合成を、大腸菌の中で、ＩｇＥ鎖の適当なドメイン の遺伝情報を指定するＤＮＡ配列のクローン化及び発現によって行い得る、とい うことが知られている（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９８５年、１５： ９６６から９６９頁及び　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ、　ＵＳ Ａ、第８１巻、１９８４年、２９５５から２９５９頁）。

発明の開示 本発明の目的の１つは、抗アレルギー治療で用いる新規なペプチドを提供するこ とにある。

本発明によれば、ヒト免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に対するポリペプチド競争体 であって、次のような配列を持つアミノ酸の単量体の鎖を含んだものが提供され る。

Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−９ｅｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ− Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ− Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ− Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−８ｅｔ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ− Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−８ｅｔ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−８ｅｔ−Ｐｒｏ− Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−１１ｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ− Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ− Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ− Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ上記７６個のアミノ酸のコア配列は、ヒトＩｇ Ｅに対する高親和性レセプタ部位と結合する能力がある。この配列（第２図で１ 番から２９８番として番号付けされたもの）は、ヒトＩｇＥのＨ鎖の３０１番か ら３７６番の残基（ベーニッヒ氏の分類命名法による）にわたるアミノ酸配列に 相当している。

更に、このコア配列は、該配列を開始（Ｘ−）及び終了（−Ｙ）させ且つ該配列 の３′及び／または５′末端と共有結合するアミノ酸の短配列を持っていてもよ い。この短配列は、ＩｇＥレセプタとの結合には関与せず、生理学的には無害で ある。

更に本発明によれば、次のようなヌクレオチド配列を持つＤＮＡが提供される。

ＣＡＧ　ＡＡＧ　ＣＡＣＴＧＧ　ＣＴＧ　ＴＣＡ　ＧＡＣＣＧＣＡＣＣＴＡＣＡ ＣＣＴＧＣＣＡＧ　ＧＴＣＡＣＣＴＡＴ　ＣＡＡ　ＧＧＴ　ＣＡＣＡＣＣＴＴＴ 　ＧＡＧ　ＧＡＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧ　ＡＡＧ　ＴＧＴ　ｃｃＡＧＡＴＴＣＣＡ ＡＣＣＣＧ　ＡＧＡ　ＧＧＧ　ＧＴＣＡＧＣＧＣＣＴＡＣＣＴＡＡＧＣＣＧＧ　 ＣＣＣＡＧＣＣＣＧ　ＴＴＣＧＡＣＣＴＧ　ＴＴＣＡＴＣＣＧＣＡＡＧ　ＴＣＧ 　ＣＣＣＡＣＧ　ＡＴＣＡＣＣＴＧＴ　ＣＴＧ　ＧＴＣＧＴＣＧＡＣＣＴＧ　Ｇ ＣＡ　ＣＣＣＡＣＣＡＡＧ　ＧＧＧ　ＡＣＣＧＴＧＡＡＣＣＴＧ　ＡＣＣＴＧＧ 　ＴＣＣＣＧＧまた本発明は、ＤＮＡが上記ヌクレオチド配列を含んでいる形質 転換細胞を提供する。形質転換細胞の宿主は、大腸菌であるのが好ましい。

この形質転換細胞は、プラスミドｐＥ２−３を寄生させた大腸菌Ｎ４８３０　（ １９８６年７月１日にロンドンのＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ 　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓに寄託された寄託番号ＮＣＴＣ１１９９３のもの ）であるのが最も好ましい。

更に本発明は、次のようなベクターを提供する。即ち、ＤＮＡが上記のように定 義されており、ベクター内でのこのＤＮＡ断片の配向が、宿主中でこのＤＮＡ断 片の表現によりポリペプチドが生成されるようなものであるベクター°である。

また本発明は、上記ベクターによって形質転換された宿主生体を提供する。

更に本発明によれば、上記ポリペプチドを生成する方法が提供される。この方法 は、上記宿主生体を培養する過程と、この培養物からポリペプチドを単離する過 程とを含んでいる。

この方法を用いる場合、結果として生じたポリペプチド生成物は、上記Ｘ基及び Ｙ基を含んでいるかもしれない。もし必要または希望があれば、これらの基を、 標準的な化学分解処理によってアミノ酸のコア配列から除去してもよい。しかし 、生理学的に無害なので、強いてこれらの基を除去しなければならない理由はな い。後述する例では、ｒＸＪで表される基はＮＨ。

−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−であり、ｒＹＪで表される基は　−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ である。

あるいは、上記ポリペプチドを周知の化学的合成法によって合成してもよい。

マタ本発明は、上記ポリペプチドを有効成分とする調合薬を含んでいる。

この調合薬には、適宜の仕方での上記ポリペプチドの投与（例えば鼻孔からの投 与）を可能にする基剤（ｃａｒｒｉｅｒ　）をも含めてよい。

本発明に係るポリペプチドを、他の治療または診断薬（即ち他の分子）に共有結 合または会合させてもよい。そうすれば、ＴＨＥに対する高親和性レセプタを持 つ細胞がこの治療または診断薬の標的になるようにポリペプチドが作用する、と う効果がもたらされる。

例として、本発明に係るポリペプチドのコア配列は、ＩｇＥのイプシロン鎖定常 領域の第２及び第３のドメインを橋かけ結合する。従来の研究（Ｊ、　Ｉｍｍｕ ｎｏｌ　１１４．　１８３８、　１９７５年、及び　Ｉａａ＋ｕｎｏ１．　Ｒｅ ｖ、　４１　、３　、　１９７８年）は、第２のドメイン及び第４のドメインの 両方が結合部位の形成のために必要であると推論している。従って、ＣＨ２ドメ インまたはＣＨ３ドメインに大きな欠失があるか、ＣＨ４ドメイン全体が欠失し ているか、またはこれらの欠失の組み合わせが存在するポリペプチドに関しては 、元のＩｇＥの結合能力に匹敵する結合能力が生じるということは予想されてい なかった。

本発明に係る単量体ポリペプチドが、マスト細胞や好塩基性体の高親和性レセプ タへの結合能力を有しているということは、全く驚くべきことである。第１に、 この鎖が単量体であるといつ事実は、思いがけないものである。何故なら、ペプ チド鎖の合成後には、該鎖の位置３２８番（第２図の２８番）のシスティンによ りただちにペプチド鎖同士の自発的な二量体化が起こるであろうと予想されてい たからである。位置２４１番及び３２８番のシスティンは、既にＩｇＥにおける イプシロン鏡開ジスルフィド結合に関与している。システィンを位置３２８番に 含んだ単量体ポリペプチドが存在するという驚くべき事実は、一つの説明として 、ＩｇＥのインプシロン鏡開ジスルフィド対合が、従来考えられていたような同 型（ＡＡ、ＢＢ）のものではなく異型（２ＡＢ）のものではないかと°いうこと を示唆゛するものである。第２に、単量体ポリペプチドパが結合活性を持つとい う事実は、全く思いがけないものである。何故なら、マスト細胞のレセプタ部位 での結合によってエキソサイト−シスを誘発するためには２本のイプシロン鎖が 必要である、と従来考えられていたからである。同じ研究からは１１位置３２８ 番でのイプシロン鏡開結合が解かれたときには、一層重性のあるジスルフフィド 鏡開結合により共有結合を維持した鎖がこの２つのシスティンを位置２４１番で 結合していると考えられるにもかかわらず、結合活性の喪失が発見されている。

本発明に係るポリペプチドは、ヒトのＩｇＥ中に存在する３つの免疫グロブリン ドメインのうちのいずれのドメインの形成にとって必要な配列をも欠いている。

従って本発明は、この二量体構造が、マスト細胞の高親和性レセプタによる識別 にとってそっくりそのまま不可欠なわけではない、ということを指摘するもので ある。

本発明に係るコア配列の大きさは、ＩｇＥのＨ鎖のＦｃ領域の大きさの４分の１ 未満である。このポリペプチドのアミノ酸配列は、ＣＨ２ドメインのＣ端部及び ＣＨ３ドメインのＮ端部に及んでおり、これら２つのドメインおよびその間のい わゆる「ヒンジ」から、ベーターターンを取り入れている。

遺伝学的に変位した大腸菌（コアアミノ酸配列の遺伝情報を指定するＤＮＡ挿入 物を含んだもの）を用いたこのポリペプチドの生成法を、以下の例において説明 しよう。

発明を実施するための最良の形態 に胤匠 ヒト骨髄腫細胞系統２６６Ｂ１　（既にベーニッヒ氏もこの細胞系統を用いてい る［　Ｐｒｏｇ、ｉｎ　Ｉｍｍｍｕｎｏｌ、第１巻、ＮｏｒｔｈＨｏｌｌａｎｄ 　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　４９〜５８頁、１９７４年］）に は、容易にクローン化できる機能的イプシロン遺伝子配列が含まれている。

ＩｇＥの周知のアミノ酸配列には、２６６Ｂ１細胞系からＣＤＮＡ　（補体Ｄ　 Ｎ　Ａ　）ライブラリーをみつけるオリゴヌクレオチドプローベ（探索子）の生 成のために必要な全情報が備わりり２ないし７マイクログラムのＩｇＥを合成し た。懸濁液培養でのこの細胞系の増殖及び成長への適応の間、ＩｇＥの合成は明 らかに減退し、細胞１０６個につき４８時間あたり約２０ナノグラムのＩｇＥＬ か合成されなかった。ＩｇＥ合成の確認は、培養中の蛋白質の標識付けと、抗ヒ トＩｇＥＦｃ抗血清によって培養の上澄から沈澱した断片のＳＤＳポリアクリル アミドゲル電気泳動とによって確認された。抗ヒトラムダＬ鎖抗血清によって沈 澱した断片の同様な分析により、分泌された免疫グロブリン中のＩｇＥ会合ラム ダし鎖に対する単量体の２０倍超過の存在が立証された。細胞系２６６Ｂｌ中で はイプシロン遺伝子の表現は乏しいにもかかわらず、ｍＲＮＡ（伝令ＲＮＡ）の レベルは、ｃＤＮＡの合成及びクローニングの仕事のために十分なレベルである 。

全ＲＮＡが２６６Ｂ　１！ｆｔ胞から抽出され、ｍ　ＲＮ　Ａがオリゴ−ｄＴク ロマトグラフィーによって精製された。完全なイプシロン鎖ｍ　ＲＮ　Ａの存在 が、次のようなポリペプチド鎖への翻訳によって立証された。即ち、ヤギの抗ヒ トＩｇＥにより免疫沈降し、且つ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル中における予 想電気泳動移動度が、６６．０００ドルトンのグリコジル化していないヒトのイ プシロン鎖と一致しているポリペプチド鎖である。

このイプシロン鎖ｍ　ＲＮ　Ａが、庶糖勾配遠゛心分離により、１０倍濃縮され た。様々な画分におけるイプシロン鎖ｍ　ＲＮ　Ａの相対濃度の測定が、翻訳の アッセイと、予期された長さのｃＤＮＡのオリゴヌクレオチドをプライマーとし て使用した合成との両方によって行われた。

二重螺旋ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａが、通常の製法を用いて酵素的に合成された。このｃＤ ＮＡは、リンカ−によりプラスミドベクター中の適当な制限部位に組み込まれ、 大腸菌１こ形質転換した。

１１（［））’クレオチドから成るオリゴヌクレオチドブ。−べが、通常のアミ ノ酸配列法１こより予め決定された蛋白質。ア５ノ酸配列に基礎づいて設計され 、化学合成された。このブローベ自体ニは、ｃＤＮＡのクローンを検出されなか ったが、ｃＤＮＡの合成のための申し分ないプライマーとして役立ち、ＤＮＡ配 列決定による追加の配列情報の獲得を可能にした。ヌクレオチド２２個分の長さ の新たなプローベが、この配列に基づいて構成された。この一層長いプローベは 、合計５００個の中から５個の陽性（ポジティブ）ｃＤＮＡクローンを検出した 。この陽性クローンのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ挿入物が、適宜の制限エンドヌクレアーゼ による消化によって切断された。切断されたこの挿入物の長さは、０．６ないし ２．０ｋｂの範囲にあることがわかった。そのうちの最も長い２ｋｂの挿入物（ ＰＪＪ７１と呼ぶ）だけが、徹底的な特徴付けをされた。この挿入物は、ｍ　Ｒ Ｎ　Ａの５′及び３′非翻訳領域に相当した配列と、アミノ酸２０個から成るア ミノ末端分泌ペプチド及び完全に成熟したイプシロン鎖をコードする配列と、を 含んでいる。

添付図面を参照して、該図面は、プラスミドｐＥ２−３の誘導を示している。こ の表現型プラスミドは、本発明に係るポリペプチドの合成を管理する。ヒトイプ シロンＤＮＡをコードする配列は、可変領域及び４つの定常領域Ｃ１から０４を 示す囲み線Ｖによって表されている。切れ目のない矢は、下流にクローン化され た配列の転写を媒介する誘導性プロモータを示す。

ｐｔａｃ−８５とその誘導体ｐＥ４９には、ｔａｃプロモータが存在している。

ラムダＰ１プロモータが、ベクターｐＡｓ１及び組換体ｐＡＳＥ１及びｐＥ２− ３によって用いられる。ｐＥ２−３の合成りＮＡ翻訳ターミネータは、配列５’ 　−ＧＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＧＣ−３’を持っている。

大腸菌中でのポリペプチドの表現は、ＰＪＪ７１中でクローン化したイプシロン Ｆ　ｃ　ｃＤＮＡの３つのサブクローニングによって達成された。第１に、５ａ ｌＩ−ＰｖｕＩＩ断片（イプシロンＰｃと約４０の塩基対の翻訳されない配列と に相当）が、Ｓｌヌクレアーゼによる消化の後、ｐ　ｔ　ａ　ｃ　８５の一杯に なったＮｃｏＩ部位に結紮される。その結果生じたプラスミドｐｅ４９は、イプ シロンＰｃの表現を管理し、先端を切ったｆｌａｎｋｉｎｇ配列の３′端部に均 一な５ａｌＩ部位を導入する。第２に、ｐｅ４９（ＳａｃＩにより線状にされ、 二重らせんエキソヌクレアーゼＢａ１３１で処理されたもの）が、５ａｌＩによ り再び分割され、イプシロンＦｃのアミノ酸３０１から５４７番に相当するＤＮ Ａ断片がｐＡＳ　Ｉ内に、サブクローン化された。ＰＡＳ　Ｉは、断片をｐｅ４ ９から境界付けするものに対する融和性の終点を持たせるために、ＢλｍＨＩ及 び５ａｉＩ制限酵素で予め処理されていた。結果として生じたプラスミドｐＡＳ ｅｌは、第３及び第４のドメインと第２のドメインの一部とを含むイプシロン断 片のアミノ酸３０１からの合成を管理した。第３に、ｐＡｓｅｌの表現生成物は 、アミノ酸３７５に相当する位置で、ＳｍａＩ部位でクローン化したＤＮＡに翻 訳終結信号を導入することにより、そのカルボキシ末端で小さくされた。構造物 ｐＥ２−３が、ＳｍａＩで線状にされたｐＡＳＥＩ　ＤＮＡに対する全部の３つ の読み取りフレーム内に翻訳停止コードンを含んだ合成りＮＡ断片の鈍い結紮（ ｂｌｕｎｔｌｉｇａｔｉ　・ｏｎ　）によって発生した。

本発明に係るポリペプチドは、ｐＥ２−３を寄生させた大腸現は、ラムダＰＬプ ロモータからの転写を止めるラムダｃＩリプレッサによって制御される。大腸菌 Ｎ４８３０株は、３０’Ｃで活性を有し４２℃で不活性になる不耐熱性のｃＩレ セプタを含ンでいる。Ｎ４８３０／Ｐ２−３の培養は、非誘導状態の下で３０℃ で、０．８のＡ８゜。にまで成長せしめられた。そしてこの密度で、６５℃の等 量の媒体を加えることによって熱的衝撃を与えた。リプレッサー（抑制因子）に よる不活性化の後、コノ培養ハ、３０℃で更に３時間成長させられ、それから収 穫された。この培養の溶解物（１ｙｓａｔｅ　）の電気泳動により、１０にのペ プチドの存在が明らかになった（誘導がない場合には存在しない）。このペプチ ドは、Ｃｏｏｒｎａｓｉｅ染色によって目に見えるようになり、遺伝学的にはイ ブシ。ン誘導体であることがウェスタンプロット法によって明らかになった。こ の遺伝子断片の生成物の大きさは、９，５００ドルトンであると予想される。

ポリペプチドは、この溶解物の中に不溶性物質として存在しており、８グラム分 子の尿素の中での溶解によって回収された。

このペプチドは、透析により尿素から分離した後も可溶性であり、抗ヒトイプシ ロン親和性クロマトグラフィーによってほとんど均質に精製された。非還元状態 （還元状態でも同様）でのポリアクリルアミドゲル電気泳動から、この精製され たポリペプチドの分子量が約１０，０００であることが明らかになり、非還元ペ プチドが単量体であることが示された。

例２ 本発明に係るポリペプチドの有効性が、受動性皮膚過敏症（ＰＣＡ）反応［Ｎａ ｔｕｒｅ誌３１５：５７７から５７８頁（１９８びその様々な断片と比較された 。その結果が、次の表１に示されている。

表１ 源　アミノ酸　Ｈ鎖ドメイン　活性 ＶＨＣＨＩ　ＣＨ２ＣＨ３ＣＨ４ 骨髄１１ｇＥ（ＰＳ）　１−４５７　＋　＋　＋　＋　十　＋ｐｓｃ２１３　２ １８−５４７　−　−　＋　十　＋　十ｐＥｓＥ１　３１０−５４７　−　−　 ｐ　＋　十　＋ＰＥｄｅｌｔａ４２１９−４３９−−＋　＋−士ｐＥ２−３　３ ０１−３７６★　−−ｐｐ−＋ｐ＝ドメインの一部分 ★＝第２図に示されたアミノ酸配列１番から７６番本発明で採用したアレルギー 反応への干渉法は、本発明に係るポリペプチドの一定量を患者に投与することに より、ＩｇＥに対する高親和性レセプタ部位を遮断することである。この方法は 、低親和性レセプタには影響を及ぼさず、それらの見掛けの免疫学的役割に自由 に関与できる状態のままにしておくものと考えられる。

表１に要、約された結果からは、引用した全ての配列に関して陽性の効果が達成 され、これによりマスト、細胞へのＩｇＥの結合部位が本発明の７６個のアミノ 酸配列に制限されているということがわかる。この配列は、ヒトの好塩基性球レ セプタに対して５　Ｘ　１０　”／ｍｏｌという親和性率を示した。これは、骨 髄腫ＩｇＥの親和性率と区別がつかない値である。

Ｐｒａｕｓｎｉｔｚ−Ｋｕｓｔｎｅｒ反応の抑制も、表１に列挙した断片（つま り第２図の配列１番から７６番を含んだアミノ酸配列）によって示された。しか し、次に示すＩｇＥの他の３つの断片に関しては、抑制はみられなかった。

（ｉ）　ＩｇＥ配列の位置４４０番から５４７番に及び、従って本発明に係るポ リペプチドと共通の残基を全く含まないアミノ酸 （ｉｉ）　残基２１８番から３３６番に及び、従って本発明に係るポリペプチド の残基１から３５番を含んだアミノ酸（１ｉｉ）　残基３３９番から５４７番に 及び、従って本発明に係るポリペプチドの残基３８から７６番を含んだアミノ酸 Ｐｒａｕｓｎｉｔｚ−Ｋｕｓｔｎｅｒ反応検査の結果は、以下の通りである。

ＩｇＥ断片によるＰｒａｕｓｎｉｔｚ−Ｋｕｓｔｎｅｒ反応の抑制受動性感作に 関して１人の被検者を選んだ。この被検者の血清ＩｇＥは４　１０／ｍｌ　（約 １０　ｎｇ／＋１　）であった。感作血清（Ｂ。

ｃ、）は、３８０　１Ｕ／ｍｌ　（約９１２　ｎｇ／ｍｌ　）のＩｇＥを含んで いた。セファローゼ４Ｂブタクサ抗原カラムにこの血清を吸収させた後、血清Ｉ ｇＥの特異性の低下を対照セファローゼ４Ｂヒト血清アルブミンと比較すること によって測定した場合、このＩｇＥのうちの８．７％がブタフサ抗原に向けられ たものである。血清Ｅ、Ｃ，は、検出可能な肝炎Ｂ抗原には結び付いておらず、 この抗原及びヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）に対する抗体にも結び付いてい なかった。血清Ｅ、Ｃ，は１９８３年に採取された。その提供者は、現在（１９ ８７年）も、健康であり、ＨＩＶ抗体反応が陰性である。

イプシロン鎖断片は、血清Ｅ、Ｃ，の注射の１時間前に皮膚部位に注射された。

皮膚部位は、４８時間後にブタフサ抗原（大きなブタフサと小さなブタフサの混 合物１，０００蛋白質窒素単位／ｍ１）で刺激された。２０分後、この皮膚部位 が膨疹及び紅斑の存在に関して検査された。反応の現れた表面積が、次のように して概算された。即ち、透明なテープを用いて反応の輪郭を紙に写し、その輪郭 の写った紙の部分を切りとって分析用天秤でその重さを測定した。この表面積は 、標準曲線から読み取られた。全ての注射は、皮内注射であり、０．０２ｍ１の 量であった。各実験毎に、１組の皮膚部位は希釈剤での感作もされた。これらの 部位のいずれにも、ブタフサ抗原で刺激したとき、膨疹やフレア（ｒｌａｒｅ） は現れなかった。上記希釈剤は、０．１５グラム分子の塩化ナトリウムと０．０ ３％のヒト血清アルブミンとから成るものであった。以下の表２に報告された２ つの実験の両方において、皮膚部位は、５×１０−目グラム分子のＩｇＥを含ん だ希釈度１：１００の血清Ｅ、Ｃ，で感作された。

表２ 抑制剤　膨疹またはフレアの面積 実験ｌ　実験２ １０　ｕｇ／　ｍｌ　１　ｕｇ／　ｍｌ希釈剤　６５　／　３８０　９２　／　 ４５５Ｉ　ｇＥ　（Ｐ、Ｓ、）　０１０　０１０ａ　ａ　２１８−５４７　０　 ／　ＯＯ／　Ｏａ　ａ　３０１−５４７　０　／　ＯＯ／　Ｏａ　ａ　２１９− ４３９　０　／　ＯＯ／　０ａａ３１０−３７６★　０１０　０１０ａａ４４０ −５４７　６０／４１６　８５／４３８ａ　ａ　２１８−３３６　７０　／　３ ５０　８０　／　４０５ａ　ａ　３３９−５４７　６９　／　３７５　７８　／ 　３９８Ｐｒａｕｓｎｉｔｚ−Ｋｕｓｔｎｅｒ反応の抑制における組換体Ｉ　ｇ Ｅ　（ＮＤ）ペプチドの相対的活性イプシロン鎖断片のモル濃度が、各標本中の 二量体と単量体との比率を考慮に入れて計算された。単量体を計算に含めた理由 は、本発明に係るポリペプチドは検出可能な二量体または低重合体（オリゴマー ）の形では決して存在せず、このポリペプチドは　Ｐｒａｕｓｎｉｔｚ−Ｋｕｓ ｔｎｅｒ反応の強い抑制剤であったからである（表２参照）。各断片は、ＩＱ− １３から１０−”グラム分子の範囲にわたって１０倍の増分で用いられた。その 結果が、以下の表３に示されている。

」影 Ｐｒａｕｓｎｉｔｚ−Ｋｕｓｔｎｅｒ反応を５０％抑制するのに必要なモル濃度 実験１　実験２ 源　ｍ１ｉＥ、ｃ、Ｉ釈ｉ１：１００　血清Ｅ、Ｃ，希釈度１：２０・５Ｘ１０ −”グラム分子ＩｇＥ　・２．５Ｘ１０−”グラム分子１ｇＥモル濃宝　％１　 モルｉ度　■能 ＩｇＥ（Ｐ、Ｓ、）　２Ｘ１０−”　１００　２ＸＩＯ−”　１００ａａ２１８ −５４７　４Ｘ１０−”　５０　４Ｘ１０−”　５０ａａ３０１−５４７　５Ｘ １０−”　４０　４Ｘ１０−”　５０ａａ２１９−４３９　５Ｘ１０−”　４０ 　６Ｘ１０−”　３３ａａ３０１−２７６★　６Ｘ１０−”　３３　５ＸＩＯ− ’　４０★・第２図の１番から７６番 Ｐｒａｕｓｎｉｔｚ−Ｋｕｓｔｎｅｒ反応抑制の持続時間以下の表４には、抑制 剤の注射後　Ｐｒａｕｓｎｉｔｚ−Ｋｕｓｔｎｅｒ反応が盛んになるまでの経過 日数が示されている。健康な被検者の様々な皮膚部位に、０日に、ＩｇＥまたは 本発明に係るポリペプチドまたは希釈剤が注射された。０．４．９．１２．１４ ．１７．１９．２１日の間隔で、個々の皮膚部位が、１：１００希釈度の血清Ｅ 、Ｃ，（５Ｘ１０ログラム分子のＩｇＥ）で感作され、それから４８時間後にブ タフサ抗原で刺激された。希釈剤で予め処理された部位は、８回の連続的測定に 関して３９２±５８＋ａｍのフレアの平均標準偏差で、陽性の膨疹及びフレア反 応を示した。表４に示した日は、刺激された皮膚に最初にフレア及び／または紅 斑が現れたときを表している。

」Ｌ 抑制剤　抑制剤の濃度 １０−７グラム分子　１０−８グラム分子ＩｇＥ（Ｐ、Ｓ、）　１２　１９ ａａ３０１−３７６　★　９　１４ ★＝第２図の１番から７６番 ＦＩＧ、２ １　（Ｘ　）−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｈｉ　５−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ａｓｐ− Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｉ　ＣＡＧんｋＧ　ＣＡＣＴＧＧ　ＣＴＧ　ＴＣＡ　 ＧＡＣＣＧＣＡＣＣＴＡＣｌｌ　Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｔ ｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−３１ＡＣＣＴＧＣＣＡＧ　ＧＴＣＡＣ ＣＴＡＴ　Ｃ晶ＧＧＴ　ＣＡＣＡＣＣ２１Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−５ｅｒ−Ｔ ｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−６１ＴＴＴ　ＧＡＧ　ＧＡＣ ＡＧＣＡＣＣＡＡＧ以Ｇ　ＴＧＴ　ＧＣＡ　ＧＡτ３１　Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒ ｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−５ｅｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−９１ＴＣＧ　 ＡＡＣＣＣＧ　ＡＧＡ　ＧＧＧ　ＧＴＣＡＧＣＧＣＣＴＡＣＣτＡ４１　Ｓｅｒ −Ａｒｇ−Ｐｒｏ−５ｅｔ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＡＳｐ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−１１ｅ −１２１ＡＧＣＣＧＧ　ＣＣＣＡＧＣＣＣＧ　ＴＴＣＧＡＣＣＴＧττＣＡＴＣ ５１Ａｒｇ−Ｌｙｓ−５ｅｔ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅ ｕ−Ｖａｌ−１５１ＣＧＣＡＡＧ　ＴＣＧ　ＣＣＣＡＣＧ　ＡＴＣＡＣＣＴＧＴ 　ＣＴＧ　ＧＴＣ６１Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｌｙ ｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−１８１ＧＴＣＧＡＣＣＴＧ　ＧＣＡ　ＣＣＣＡＣ ＣＡＡＧ　ＧＧＧ　ＡＣＣＧτＧ補正書の写しく翻訳文）提出書 （特許法第１８４条の８） 圓 昭和６３年１２月２９日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、国際出願番号　ＰＣＴ／ＧＢ８７１００４６６２、発明の名称　免疫グロブ リンＥに対するポリペプチド競争体３、特許出願人 住　所　イギリス国　ロンドン　ＳＥＩ　８ＸＰ　ワーテルロ　ロード氏　名　 リサーチ　コーポレーション　リミテッド国　籍　イギリス国 ４、代理人 住　所　東京都中央区八重洲２丁目１番５号６、添付書類の目録 ■　補正書の写しく翻訳文）　１通 ７、前記以外の代理人 住　所　東京都中央区八重洲２丁目１番５号このペプチドは、透析により尿素か ら分離した後も可溶性であり、抗ヒトイプシロン親和性クロマトグラフィーによ ってほとんど均質に精製された。非還元状態（還元状態でも同様）でのポリアク リルアミドゲル電気泳動から、この精製されたポリペプチドの分子量が約１０， ０００であることが明らかになり、非還元ペプチドが単量体であることが示され た。

例２ 本発明に係るポリペプチドの有効性が、受動性皮膚過敏症（ＰＣＡ）反応［Ｎａ ｔｕｒｅ誌３１５：５７７から５７８頁（１９８５年）に記載コを利用した一連 の検査において、元のＩｇＥ及びその様々な断片と比較された。その結果が、次 の表１に示されている。

表１ 源　アミノ酸　Ｈ鎖ドメイン　活性 ＶＨＣＨＩ　ＣＨ２ＣＩ（３ＣＨ４ １１１１ｇＥ（ＰＳ）　１−４５７　＋　＋　＋　＋　＋　＋ｐｓｃ２１３　２ １ｇ−５４７−−＋　＋　＋　＋ｐＥｓＥ１　３０１−５４７　−　−　ｐ　＋ 　＋　＋ＰＥｄｅｌｔａ４　２１９−４３９　−　−　＋　十　−±ｐＥ２−３ 　３０１−３７６★−ｐｐ−十ｐ＝ドメインの一部分 ★＝第２図に示されたアミノ酸配列１番から７６番量であった。各実験毎に、１ 組の皮膚部位は希釈剤での感作もされた。これらの部位のいずれにも、ブタフサ 抗原で刺激したとき、膨疹やフレア（ｆｌａｒｅ）は現れなかった。上記希釈剤 は、０．１５グラム分子の塩化ナトリウムと０．０３％のヒト血清アルブミンと から成るものであった。以下の表２に報告された２つの実験の両方において、皮 膚部位は、５　Ｘ　１０−１１グラム分子のＩｇＥを含んだ希釈度１　：　１０ ０の血清Ｅ、Ｃ，で感作された。

肚 抑制剤　膨疹またはフレアの面積 実験ｌ　実験２ １０　ｕｇ／　ｍｌ　１　ｕｇ／　ｍｌ希釈剤　６５　／　３８０　９２　／　 ４５５Ｉ　ｇＥ　（Ｐ’、　Ｓ、　）　０１０　０１０ａ　ａ　２１８−５４７ 　０　／　ＯＯ／　Ｏａ　ａ　３０１−５４７　０　／　ＯＯ／　０２Ｌａ　２ １９−４３９　０　／　０　０　／　Ｏａ　ａ　３０１−３７６　＊　Ｏ／　Ｏ Ｏ／　０ａａ４４０−５４７　６０／４１６　８５／４３８ａ　ａ　２１８−３ ３６　７０　／　３５０　８０　／　４０５ａλ３３９−５４７　６９／３７５ 　７８／３９８★＝第２図の３１１番から７６番 Ｐｒａｕｓｎｉｔｚ−Ｋｕｓｔｎｅｒ反応の抑制における組換体Ｉ　ｇＥ　（Ｎ Ｄ）ペプチドの相対的活性イプシロン鎖断片のモル濃度が、各標本中の二量体と 単量体との比率を考慮に入れて計算された。単量体を計算に含めた理由は、本発 明に係るポリペプチドは検出可能な二量体または低重合体（オリゴマー）の形で は決して存在せず、このポリペプチドは　Ｐｒａｕｓｎｉｔｚ−Ｋｕｓｔｎｅｒ 反応の強い抑制剤であったからである（表２参照）。各断片は、ＩＱ−１３から １０−６グラム分子の範囲にわたって１０倍の増分で用いられた。その結果が、 以下の表３に示されている。

表１ Ｐｒａｕｓｎｉｔｚ−Ｋｕｓｔｎｅｒ反応を５０％抑制するのに必要なモル濃度 実験ｌ　実験２ 源　ｍ１ｌＥ、ｃ、ＭＥｆｌ：１００　ｍｆｆ１Ｅ、ｃ、希釈Ｈ：２０・５×１ ０−ロダラム分子１ｇＥ　・２．５Ｘ１０−”グラム分子１ｇＥモＬＨ５；！ｄ 　ｔルミｚ　ｓｉｉ ＩｇＥ（Ｐ、Ｓ、）　２Ｘ１０−”　１００　２Ｘ１０−”　１００ａａ２１８ −５４７　４Ｘ１０−”　５０　４Ｘ１０−”　５０ａａ３０１−５４７　５ｘ ｌＯ−”　４０　４Ｘ１０−”　５０ａａ２１９−４３９　５ｘ１ｏ−”　４０ 　６Ｘ１０−”　３３ａａ３０１−２７６★　６Ｘ１０−”　３３　５Ｘ１０− ”　４０★・第２図の１番から７６番 請求の転回 １．以下のアミノ酸配列を持った、ヒト免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）Ｊこｆｆす るポリペプチド競争体。

Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ− Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ− Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−（ｉｌｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ −Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−８ｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ −８ｅｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−８ｅｔ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−３ｅｔ−Ｐｒｏ −Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−１１ｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−３ｅｒ−Ｐｒｏ −Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ −Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＶａｌＡｓｎ−Ｌｅｕ− Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−８ｅｒ−Ａｒｇ２、以下のアミノ酸配列を持ち、Ｘ及びＹはこ の鎖を開始及び終了させるオリゴペプチド配列である、ＩｇＥに対するポリペプ チド競争体。

Ｘ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｈ ｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌ ｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙ ｓ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｓｅｔ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｖａ ｌ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｔ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−８ｅｔ−Ｐｒ ｏ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−１１ｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒ ｏ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｅ ｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｌｅ ｕ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−８ｅｒ−Ａｒｇ−Ｙ３、請求の範囲第１項または第２項で 定義されたアミノ酸配列と同一または同様な競争特性を持ち、第２図中の残基３ ６番から３９番をブリッジする連続的配列を含んだ、請求の範囲第１項または第 ２項記載のポリペプチドの断片。

４、請求の範囲第１項または第２項記載のポリペプチドまたは請求の範囲第３項 記載の生物学的に活性のある断片を有効成分として含み、基剤または結合剤（ｅ ｘｃｉｐｉｅｎｔ）を組み合わせた調ＣＡＧ　ＡＡＧ　ＣＡＣＴＧＧ　ＣＴＧ　 ＴＣＡ　ＧＡＣＣＧＣＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＣＡＧ　ＧＴＣＡＣＣＴＡＴ　 ＣＡＡ　ＧＧＴ　ＣＡＣＡＣＣＴＴ’ｒ　ＧＡＧ　ＧＡＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧ　 ＡＡＧ　ＴＧＴ　ＧＣＡ　ＧＡＴＴＣＣＡＡＣＣＣＧ　ＡＧＡ　ＧＧＧ　ＧＴＣ ＡＧＣＧＣＣＴＡＣＣＴＡＡＧＣＣＧＧ　ＣＣＣＡＧＯＣＣＧ　ＴＴＣＧＡＣＣ ＴＧ　ＴＴＣＡＴＣＣＧＣＡＡＧ　ＴＣＧ　ＣＣＣＡＣＧ　ＡＴＣＡＣＣＴＧＴ 　ＣＴＧ　ＧＴＣＧＴＣＧＡＣＣＴＧ　ＧＣＡ　ＣＣＣＡｃｅ　ＡＡＧ　ＧＧＧ 　ＡＣＣＧＴＧＡＡＣＣＴＧ　ＡＣＣＴＧＧ　ＴＣＣＣＣＣ６、宿主／ベクター 系中で請求の範囲第３項記載の断片を特徴する請求の範囲第５項記載のＤＮＡの 断片。

７、ＤＮＡが請求の範囲第５項または第６項記載のヌクレオチド配列を含んだ、 形質転換細胞。

国際調査報告 −！−〜−鴫−＾・両畦Φ＾−・　？ＣＴ／ＧＢ　８７／Ｃ０４６６国際調査報 告

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．以下のアミノ酸配列を持った、ヒト免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に対するポ リペプチド競争体。 【配列があります】
2. ２．以下のアミノ酸配列を持ち、Ｘ及びＹはこの鎖を開始及び終了させるオリゴ ペプチド配列である、ＩｇＥに対するポリペプチド競争体。 【配列があります】
3. ３．請求の範囲第１項または第２項で定義されたアミノ酸配列と同一または同様 な競争特性を持つ、請求の範囲第１項または第２項記載のポリペプチドの断片。
4. ４．請求の範囲第１項または第２項記載のポリペプチドまたは請求の範囲第３項 記載の生物学的に活性のある断片を有効成分として含み、基剤または結合剤（ｅ ｘｃｉｐｉｅｎｔ）を組み合わせた調合薬。
5. ５．以下のヌクレオチド配列を持つＤＮＡ。 【配列があります】
6. ６．宿主／ベクター系中で請求の範囲第３項記載の断片を表現する、請求の範囲 第５項記載のＤＮＡの断片。
7. ７．ＤＮＡが請求の範囲第５項または第６項記載のヌクレオチド配列を含んだ、 形質転換細胞。
8. ８．請求の範囲第５項または第６項記載のＤＮＡ部分を含み、該ＤＮＡ部分が宿 主中で表現してポリペプチドを生成するようにように該ＤＮＡ部分を配向してい るベクター。
9. ９．プラスミドｐＥ２−３（大腸菌Ｎ４８３０中に寄生させて１９８６年７月１ 日にロンドンのＮａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆＴｙｐｅ　Ｃｕ ｌｔｕｒｅｓに寄託された寄託番号ＮＣＴＣ１１９９３のもの）を含んだ、請求 の範囲第８項記載のベクター。
10. １０．請求の範囲第９項記載のベクターによって形質転換された宿主。
11. １１．プラスミドｐＥ２−３を寄生させた大腸菌Ｎ４８３０（１９８６年７月１ 日にロンドンのＮａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＴｙｐｅＣｕ ｌｔｕｒｅｓに寄託された寄託番号ＮＣＴＣ１１９９３のもの）を含んだ請求の 範囲第１０項記載の宿主／ベクター。
12. １２．請求の範囲第１０項記載の宿主生体を培養し、該培養からポリペプチドを 単離する、請求の範囲第２項記載のポリペプチドの生成方法。
13. １３．請求の範囲第１０項記載の宿主／ベクターを培養し、該培養からポリペプ チドを単離することにより請求の範囲第２項記載のポリペプチドを得、鎖開始基 Ｘ及び鎖終了基Ｙを取り除く処理を該ポリペプチドに施す、請求の範囲第１項記 載のポリペプチドの生成方法。
14. １４．請求の範囲第１項または第２項または第３項記載のポリペプチドを競争体 として用いる、競争的結合検定法。
15. １５．競争的結合検定の実施のための手段を含み、請求の範囲第１項または第２ 項または第３項記載のポリペプチドを競争体としての使用のために含んだ、診断 用キット。