JP2001502915A

JP2001502915A - 新規な幹細胞因子受容体アゴニストとしての環状に並べ替えたポリペプチド

Info

Publication number: JP2001502915A
Application number: JP10520526A
Authority: JP
Inventors: ワーター，チャールズ，エイ．マック; フェン，イーキン
Original assignee: ジー．ディー．サールアンドカンパニー
Priority date: 1996-10-25
Filing date: 1997-10-23
Publication date: 2001-03-06
Also published as: EP0941321A1; US5969105A; AU734594B2; WO1998018924A1; AU4905797A; CA2268023A1

Abstract

(57)【要約】新規な幹細胞因子（ｃ−ｋｉｔリガンド）受容体アゴニストタンパク質、幹細胞因子受容体アゴニストタンパク質をコードするＤＮＡ、環状置換による幹細胞因子受容体アゴニストタンパク質の製造方法および幹細胞因子受容体アゴニストタンパク質の使用方法が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】新規な幹細胞因子受容体アゴニストとしての環状に並べ替えたポリペプチド本発明は、米国特許法（合衆国法典第３５巻）第１１９条に従って、１９９６年１０月２５日出願の米国仮出願番号６０／０２９，１６５号の優先権を主張する。発明の分野本発明は、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）受容体アゴニストに関する。これらの幹細胞因子受容体アゴニストは、未変性の幹細胞因子の１つまたはそれ以上の活性を保持しており、そしてさらに造血細胞刺激活性の改善および／または未変性の幹細胞因子に関連する有害な生物学的活性の低下を含む活性プロフィールの改善を示すか、および／または溶解度、安定性および再折り畳み効率の上昇を含む物理的性質が改善していることもある。発明の背景骨髄細胞の分化および／または増殖を刺激するコロニー刺激因子は、造血幹細胞由来細胞のレベルの低下を回復させるその治療可能性のため、大きな関心を呼んでいる。ヒトとネズミの両方の系のコロニー刺激因子は、その活性により同定及び識別されてきた。例えば、顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）とマクロファージ −ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）は、それぞれ好中性顆粒球とマクロファージのコロニーのインビトロの形成を刺激するが、一方ＧＭ−ＣＳＦとインターロイキン−３（ＩＬ−３）は、より広い活性を持ち、マクロファージ、好中性および好酸性顆粒球の両方のコロニーの形成を刺激する。幹細胞因子のようなある種の因子は、主として幹細胞に作用することができる。少量のある種の造血系増殖因子が、種々の血球への少数の幹細胞の分化、これらの細胞の増殖、およびこれらの株からの成熟血球の最終分化を担っている。しかし、化学療法、放射線または自然脊髄異形成障害によりストレスを受けると、結果として、患者が重篤に白血球減少、貧血、好中球減少、または血小板減少した時期が生じる。造血系因子の使用は、この段階の造血系の再生を促進する。幹細胞因子は、赤芽球、巨核球、顆粒球、リンパ球およびマクロファージ細胞に成熟させることができる、初期造血系始原細胞の増殖を刺激する能力を有する。哺乳動物の幹細胞因子治療により、骨髄系およびリンパ球系細胞の両方の造血系細胞の絶対的な上昇が起こる。ＥＰ０，４２３，９８０号は、ＳＣＦ^1-148、ＳＣＦ^1-157、ＳＣＦ^1-160、ＳＣＦ^1-161、ＳＣＦ^1-162、ＳＣＦ^1-164、ＳＣＦ^1-165、ＳＣＦ^1-183、ＳＣＦ¹ ^-185 、ＳＣＦ^1-188、ＳＣＦ^1-189、ＳＣＦ^1-220、ＳＣＦ^1-248を含む、新規な幹細胞因子（ＳＣＦ）ポリペプチドを開示している。タンパク質配列の再編成進化において、ＤＮＡ配列の再編成は、タンパク質の構造と機能の多様性を生み出すのに重要な役割を果たしている。遺伝子の複製とエクソン組み替えは、特に基本的突然変異速度が低いため、急速に多様性を生成し、そのため競争上の優位性を有する生物を提供するための重要な機作を提供する(ドーリトル(Doolittl e)，ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ１：１９１−２００，１９９２)。組換えＤＮＡ法の開発により、タンパク質折り畳み、構造および機能に及ぼす配列転位の効果を研究することが可能になった。新しい配列を作成するのに使用されたアプローチは、そのアミノ酸配列の線状再編成により関係付けられる、天然のタンパク質の対のそれに似ている(カニングハム（Cunningham）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７６：３２１８−３２２２，１９７９；ティーザー（Teather）とアーフル(Erfle)，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：３８３７−３８４１，１９９０；シミング（Schimming）ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０４：１３−１９，１９９２；ヤミウチ（Yamiuchi）とミナミカワ(Minamikawa)，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．２６０：１２７−１３０，１９９１：マグレガー（MacGregor）ら，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．３７８：２６３−２６６，１９９６)。タンパク質に対するこの型の再編成の最初のインビトロの応用は、ゴールデンバーグ（Goldenberg）とクレイトン（Creighton）により報告された(Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６５：４０７−４１３，１９８３)。新しいＮ末端は、元の配列の内部の部位(切断点(breakpoint))で選択されて、新しい配列は、元のＣ末端またはその付近のアミノ酸に達するまで、切断点から元の配列と同じ順序のアミノ酸を有する。この点で新しい配列は、直接または配列の追加部分（リンカー）を介して、元のＮ末端またはその付近のアミノ酸につなげられ、そして新しい配列は、元の配列の切断点部位に対してＮ末端であるアミノ酸またはその付近の点に達するまで、元の配列と同じ配列を続けて、この残基は、鎖の新しいＣ末端を形成する。このアプローチは、５８〜４６２アミノ酸の大きさの範囲のタンパク質に適用された(ゴールデンバーグ（Goldenberg）とクレイトン(Creighton)，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６５：４０７−４１３，１９８３；リー（Li）とコッフィーノ(C offino)，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：２３７７−２３８３，１９９３) 。検討したタンパク質は、主にα−らせん(インターロイキン−４；クライトマン（Kreitman）ら，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ７：３１１−３１８，１９９５)、β− シート(インターロイキン−１；ホーリック（Horlick）ら，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．５：４２７−４３１，１９９２)、またはこの２つの混合物（酵母ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ；ルガー（Luger）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４３：２０６−２１０，１９８９）を含有するタンパク質を含む、広範な構造分類を代表していた。タンパク質機能の広いカテゴリーは、これらの配列再編成研究において代表される：酵素Ｔ４リゾチームチャン（Zhang）ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３２：１２３１１−１２３１８（１９９３）;チャン（Zhang）ら，ＮａｔｕｒｅＳｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１：４３４−４３８（１９９５）ジヒドロ葉酸レダクターゼブックワルダー（Buchwalder）ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３１：１６２１ −１６３０（１９９４）;プロタソバ（Protasova）ら，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．７：１３７３−１３７７（１９９５）リボヌクレアーゼＴ１マリンズ（Mullins）ら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：５５２９−５５３３（１９９４）;ギャレット（Garrett）ら，ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ５：２０４−２１１（１９９６）バチルス（Bacillus）β−グルカナーゼハーン（Hahn）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１０４１７−１０４２１（１９９４）アスパラギン酸トランスカルバモイラーゼヤン（Yang）とシャチマン(Schachman)，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：１１９８０−１１９８４（１９９３）ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼルガー（Luger）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４３：２０６−２１０（１９８９）;ルガー（Luger）ら，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．３：２４９−２５８（１９９０）ペプシン／ペプシノーゲンリン（Lin）ら，ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ４：１５９−１６６（１９９５）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼビグナイス（Vignais）ら，ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ４：９９４−１０００（１９９５）オルニチンデカルボキシラーゼリー（Li）とコッフィーノ(Coffino)，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：２３７７−２３８３（１９９３）酵母ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼリトコーボンソビチ（Ritco-Vonsovici）ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３４：１６５４３−１６５５１（１９９５）酵素インヒビター塩基性膵臓トリプシンインヒビターゴールデンバーグ（Goldenberg）とクレイトン(Creighton)，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６５：４０７−４１３（１９８３）サイトカインインターロイキン−１β ホーリック（Horlick）ら，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．５：４２７−４３１（１９９２）インターロイキン−４クライトマン（Kreitman）ら，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ７：３１１−３１８（１９９５）チロシンキナーゼ認識ドメイン α−スペクトリンＳＨ３ドメインビグエラ（Viguera）ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４７：６７０−６８１（１９９５）膜貫通タンパク質ｏｍｐＡ：６１７−６２６（１９９５）キメラタンパク質インターロイキン−４−シュードモナス（Pseudomonas）外毒素融合分子クライトマン（Kreitman）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：６８８９−６８９３(１９９４)。これらの研究の結果は、非常に多様であった。多くの場合に実質的に低い活性、溶解度または熱力学的安定性が観察された(大腸菌（E．coli）ジヒドロ葉酸レダクターゼ、アスパラギン酸トランスカルバモイラーゼ、ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、ｏｍｐＡ、酵母ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ)。他の場合に、配列が再編成したタンパク質は、その天然のものと多くのほぼ同一の性質を有すると考えられる(塩基性膵臓トリプシンインヒビター、Ｔ４リゾチーム、リボヌクレアーゼＴ１、バチルスβ−グルカナーゼ、インターロイキン−１β、α−スペクトリンＳＨ３ドメイン、ペプシノーゲン、インターロイキン−４)。例外的な場合に、天然配列のいくつかの性質に予想外の改善が観察された（例えば、再編成されたα−スペクトリンＳＨ３ドメイン配列の溶解度と再折り畳み速度、および転位したインターロイキン−４−シュードモナス外毒素融合分子の受容体親和性と抗腫瘍活性）(クライトマン（Kreitman）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：６８８９−６８９３，１９９４；クライトマン（Kreitman）ら，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５５：３３５７−３３６３，１９９５)。これらの型の研究の主要な動機は、タンパク質の折り畳みと安定性における短期および長期の相互作用の役割を研究することであった。この型の配列再編成は、元の配列で長期である相互作用のサブセットを、新しい配列では短期の相互作用に変換し、そしてその逆もある。これらの配列再編成物の多くが、少なくともある程度活性のあるコンホメーションを獲得することができるという事実は、タンパク質の折り畳みが、多くの折り畳み経路により起こることの説得力のある証拠である(ビグエラ（Viguera）ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４７：６７０−６８１，１９９５)。α−スペクトリンのＳＨ３ドメインの場合は、β−ヘアピンターンに対応する位置の新しい末端を選択することにより、わずかに安定性の低いタンパク質が得られたが、これは折り畳みが可能であった。ここで引用した研究において使用された内部切断点の位置は、専らタンパク質の表面上に見い出され、そして末端または中間に対して何ら明白な偏りがなく線状配列全体にわたって分布する(元のＮ末端から切断点までの相対距離の変動は、全配列長の約１０〜８０％である)。これらの研究において元のＮ末端とＣ末端をつなぐリンカーは、０〜９残基の範囲であった。１つの例（ヤン（Yang）とシャチマン(Schachman)，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：１１９８０−１１９８４，１９９３）では、配列の一部を元のＣ末端セグメントから欠失させ、そして端を切ったＣ末端から元のＮ末端までを連結させた。ＧｌｙやＳｅｒのような柔軟な親水性残基がしばしばリンカーに使用される。ビグエラ（Viguera）ら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４７：６７０−６８１，１９９５）は、元のＮ末端とＣ末端と３−または４−残基リンカーによる連結とを比較した；３−残基リンカーは熱力学的安定性が低かった。プロタソバ（Prot asova）ら（ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．７：１３７３−１３７７，１９９４）は、大腸菌（E．coli）ジヒドロ葉酸レダクターゼの元のＮ末端を連結するのに３ −または５−残基リンカーを使用した；３−残基リンカーだけが良好な収率でタンパク質を産生した。発明の要約本発明の修飾ヒト幹細胞因子受容体アゴニストは、式：Ｘ¹−（Ｌ）_a−Ｘ² ［式中；ａは、０または１であり；Ｘ¹は、残基ｎ＋１からＪの配列に対応するアミノ酸配列を含むペプチドであり；Ｘ²は、残基１からｎの配列に対応するアミノ酸配列を含むペプチドであり；ｎは、１からＪ−１までの範囲の整数であり；そしてＬは、リンカーである］により表すことができる。上記式においてヒト幹細胞因子の構成アミノ酸残基は、アミノ末端からカルボキシル末端まで１からＪの連続した番号を付けられる。このタンパク質内の隣接する一対のアミノ酸は、それぞれｎとｎ＋１の番号を付けられる(ここでｎは、１からＪ−１までの範囲の整数である)。残基ｎ＋１は、新しい幹細胞因子受容体アゴニストの新しいＮ末端になり、そして残基ｎは、新しい幹細胞因子受容体アゴニストの新しいＣ末端になる。本発明は、下記式：の新規な幹細胞因子受容体アゴニストに関する[式中、場合により１〜１０６アミノ酸は、該幹細胞因子受容体アゴニストのＣ末端から欠失させることができ；Ｎ末端は、直接、またはＮ末端をＣ末端につなぐことができかつそれぞれアミノ酸：に新しいＣ末端とＮ末端を有することができるリンカーによりＣ末端に連結され；そして該幹細胞因子受容体アゴニストポリペプチドは、場合により直前に(メチオニン^-1)、（アラニン^-1）または（メチオニン^-2、アラニン^-1）が置かれる]。本発明の好ましい実施態様は、下記式：の新規な幹細胞因子受容体アゴニストに関する[式中、場合により１〜２３アミノ酸は、該幹細胞因子受容体アゴニストのＣ末端から欠失させることができ；Ｎ末端は、直接、またはＮ末端をＣ末端につなぐことができかつそれぞれアミノ酸：に新しいＣ末端とＮ末端を有することができるリンカーによりＣ末端に連結され；そして該幹細胞因子受容体アゴニストポリペプチドは、場合により直前に(メチオニン^-1)、（アラニン^-1）または（メチオニン^-2、アラニン^-1）が置かれる]。新しいＣ末端とＮ末端を作成することができるさらに好ましい切断点は、それぞれ２３−２４、２４−２５、２５−２６、３３−３４、３４−３５、３５−３６、３６−３７、３８−３９、３９−４０、４０−４１、６４−６５、６５−６６、６６−６７、６７−６８、６８−６９、６９−７０、７０−７１、８９−９０、９０−９１、９１−９２、９２−９３、９３−９４、９４−９５、９５−９６、９６−９７、９７−９８、９８−９９、９９−１００、１００−１０１、１０１−１０２、１０２−１０３、１０３−１０４、１０４−１０５および１０５ −１０６である。新しいＣ末端とＮ末端を作成することができる、最も好ましい切断点は、それぞれ６４−６５、６５−６６、９２−９３および９３−９４である。本発明の幹細胞因子受容体アゴニストは、アミノ酸置換、欠失および／または挿入を含有してよい。また、本発明の幹細胞因子受容体アゴニストが、元のタンパク質のＮ末端とＣ末端のいずれか／または両方でアミノ酸欠失を有するか、および／または上に示される式における配列再編成タンパク質の新しいＮ−および／またはＣ末端からの欠失を有することも意図される。本発明の幹細胞因子受容体アゴニストは、アミノ酸置換、欠失および／または挿入を含有してよい。本発明の好適な実施態様では、Ｎ末端をＣ末端につなぐリンカー（Ｌ）は、よりなる群から選択されるポリペプチドである。本発明はまた、サイトカイン、リンホカイン、インターロイキン、造血系増殖因子を含む１つまたはそれ以トの別のコロニー刺激因子(ＣＳＦ)[ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ｃ−ｍｐｌリガンド(ＴＰＯまたはＭＧＤＦとしても知られている)、Ｍ−ＣＳＦ、エリスロポイエチン(ＥＰＯ)、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ− ２、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＬＩＦ、ヒト成長ホルモン、Ｂ細胞増殖因子、Ｂ細胞分化因子、および好酸球分化因子を含むが、これらに限定されない(本明細書ではまとめて「因子」と称する)]と同時または逐次投与した組換えヒト幹細胞因子受容体アゴニストを包含する。これらの同時投与される混合物は、それらの因子の通常の活性を有することを特徴とするか、あるいはこの混合物は、幹細胞因子受容体アゴニストまたは第２の因子単独の存在下の単なる相加的機能よりも大きな生物学的または生理学的活性を有することをさらに特徴とする。同時投与はまた、その活性、または幹細胞因子（ＳＣＦ）または第２の因子の存在により予測される活性とは異なる活性、に及ぼす増強作用を提供しうる。同時投与はまた、未変性ヒト幹細胞因子に関係する有害な生物学的活性の低下を含むような、活性プロフィールの改善を有する。上記リストに加えて、ＷＯ９４／１２６３９とＷＯ９４／１２６３８に示されるＩＬ−３変種、ＷＯ９５／２１１９７とＷＯ９５／２１２５４に示される融合タンパク質、ＷＯ９７／１２９７７に開示されるＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストＷＯ９７／１２９７８に開示されるｃ−ｍｐｌ受容体アゴニスト、ＷＯ９７／１２９７９に開示されるＩＬ−３受容体アゴニストおよびＷＯ９７／１２９８５に示される多機能性受容体アゴニストを本発明の幹細胞因子受容体アゴニストと共に同時投与することができる。本明細書で使用される「ＩＬ−３変種」とは、ＷＯ９４／１２６３９とＷＯ９４／１２６３８に示されるＩＬ−３変種のことをいう。本明細書で使用される「融合タンパク質」とは、ＷＯ９５／２１１９７とＷＯ９５／２１２５４に示される融合タンパク質のことをいう。本明細書で使用される「Ｇ−ＣＳＦ受容体アゴニスト」とは、ＷＯ９７／１２９７８に開示されるＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストのことをいう。本明細書で使用される「ｃ−ｍｐｌ受容体アゴニスト」とは、ＷＯ９７／１２９７８に開示されるｃ−ｍｐｌ受容体アゴニストのことをいう。本明細書で使用される「ＩＬ−３受容体アゴニスト」とは、ＷＯ９７／１２９７９に開示されるＩＬ−３受容体アゴニストのことをいう。本明細書で使用される「多機能性受容体アゴニスト」とは、ＷＯ９７／１２９８５に示される多機能性受容体アゴニストのことをいう。さらに、インビトロの使用とは、拡張胞を患者に注入する前に、骨髄と血球の活性化と増殖を刺激する能力を含むことが構想されている。別の意図される使用は、インビボおよびエクスビボでの樹状細胞の拡張である。図面の簡単な説明図１は、タンパク質の配列再編成の概略図を示している。未変性タンパク質のＮ末端（Ｎ）とＣ末端（Ｃ）はリンカーにより連結されているか、または直接つながれている。タンパク質は切断点で開環されて、新しいＮ末端（新Ｎ）と新しいＣ末端（新Ｃ）を作り、新しい線状アミノ酸配列を有するタンパク質が生じる。再編成した分子は、線状分子として新たに合成され、元のＮ末端とＣ末端を連結して切断点でタンパク質を開環する工程を経ることはない。図２は、新しいタンパク質を作り出すための方法Ｉの概略図を示すが、ここで未変性タンパク質の元のＮ末端とＣ末端はリンカーで連結されて、タンパク質の異なるＮ末端とＣ末端が作られる。記載の例において、配列の再編成により、元のタンパク質のアミノ酸９７に作られた新しいＮ末端、リンカー領域を介してアミノ酸１１（アミノ酸１〜１０は欠失している）に連結した元のＣ末端(アミノ酸１７４)、および元の配列のアミノ酸９６に作られた新しいＣ末端を有するタンパク質をコードする新しい遺伝子が生じる。図３は、新しいタンパク質を作り出すための方法IIの概略図を示すが、ここで未変性タンパク質の元のＮ末端とＣ末端はリンカーなしに連結されて、タンパク質の異なるＮ末端とＣ末端が作られる。記載の例において、配列の再編成により、元のタンパク質のアミノ酸９７に作られた新しいＮ末端、元のＮ末端に連結した元のＣ末端(アミノ酸１７４)、および元の配列のアミノ酸９６に作られた新しいＣ末端を有するタンパク質をコードする新しい遺伝子が生じる。図４は、新しいタンパク質を作り出すための方法IIIの概略図を示すが、ここで未変性タンパク質の元のＮ末端とＣ末端はリンカーで連結されて、タンパク質の異なるＮ末端とＣ末端が作られる。記載の例において、配列の再編成により、元のタンパク質のアミノ酸９７に作られた新しいＮ末端、リンカー領域によりアミノ酸１に連結した元のＣ末端(アミノ酸１７４)、および元の配列のアミノ酸９６に作られた新しいＣ末端を有するタンパク質をコードする新しい遺伝子が生じる。図５ａと５ｂは、マーチン（Martin）ら（Ｃｅｌｌ６３：２０３−２１１，１９９０）の配列に基づく未変性幹細胞因子をコードするＤＮＡ配列を示す。図６は、ラングレー（Langley）ら（ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａ３１１：５５−６１，１９９４）の配列に基づく可溶性幹細胞因子をコードするＤＮＡ配列を示す。発明の詳細な説明本発明の幹細胞因子受容体アゴニストは、造血系細胞のレベルの低下を特徴とする疾患の治療において有用である。幹細胞因子受容体アゴニストは、造血系障害の治療または予防に有用である。多くの薬物は、骨髄抑制または造血不全を引き起こすことがある。このような薬物の例としては、化学療法において使用されるＡＺＴ、ＤＤＩ、アルキル化剤および抗代謝薬、クロラムフェニコール、ペニシリン、ガンシクロビル、ダウノマイシンおよびサルファ剤のような抗生物質、フェノチアゾン（phenothiazones）、メプロバメートのようなトランキライザー、アミノピリンやジピロンのような鎮痛剤、フェニトインまたはカルバマゼピンのような抗痙彎薬、プロピルチオウラシルやメチマゾールのような抗甲状腺薬および利尿薬がある。幹細胞因子受容体アゴニストは、これらの薬物で治療される患者でしばしば起こる骨髄抑制または造血不全を予防または治療するのに有用である。造血不全はまた、ウイルス、微生物または寄生虫感染症、および火傷の結果として、および腎疾患または腎不全の治療、例えば、透析の結果として起こる。本ペプチドは、このような造血不全を治療するのに有用である。本発明の別の側面は、これらの新規な幹細胞因子受容体アゴニストの発現の方法において使用するためのプラスミドＤＮＡベクターを提供する。これらのベクターは、本発明の新規なポリペプチドをコードする前述の新規なＤＮＡ配列を含有する。幹細胞因子受容体アゴニストを発現することができる宿主細胞を形質転換できる適切なベクターには、使用される宿主細胞により選択される転写および翻訳制御配列に連結した、幹細胞因子受容体アゴニストをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターがある。前述の修飾配列を組み込むベクターは、本発明に包含され、そして修飾幹細胞因子受容体アゴニストポリペプチドの製造において有用である。本方法に使用されるベクターはまた、本発明のＤＮＡコード配列に機能的に結合し、選択された宿主細胞においてその複製と発現を指令することができる選択された制御配列を含有する。本発明の別の側面として、ヒト幹細胞因子受容体アゴニストの新規なファミリーを製造するための方法が提供される。本発明の方法は、新規な幹細胞因子受容体アゴニストポリペプチドの発現をコードするＤＮＡ配列を含有するベクターで形質転換した、適切な細胞または細胞株の培養を伴う。適切な細胞または細胞株は、大腸菌（E．coli）のような多様な種の細菌、酵母、哺乳動物細胞、または昆虫細胞を含んでよく、本発明の方法における宿主細胞として利用することができる。本発明の他の側面は、前述の症状を治療するための方法と治療用組成物である。このような組成物は、治療上有効量の１つまたはそれ以上の本発明の幹細胞因子受容体アゴニストを、薬剤学的に許容される担体との混合物として含む。この組成物は、非経口的、静脈内または皮下のいずれかで投与することができる。投与の際、本発明における使用のための治療用組成物は、好ましくは発熱物質を含まない非経口的に許容される水溶液の形態である。このような非経口的に許容されるタンパク質溶液の製剤は、ｐＨ、等張性、安定性などを考慮されるが、当業者の技術の範囲内である。上述の症状を治療するための方法に伴う薬剤投与計画は、薬剤の作用を調節する種々の要因（例えば、患者の症状、体重、性別および食餌、感染の重篤度、投与の時間および他の臨床的要因）を考慮して、担当医により決定される。一般に、一日用量は、体重１キログラム当たり０．５〜１５０μｇ/kgの非グリコシル化幹細胞因子受容体アゴニストタンパク質の範囲であろう。用量は、所定の受容体アゴニストの活性に応じて調整され、かつ薬剤投与計画が、１日に体重１キログラム当たり０．１マイクログラムという低用量から１ミリグラムという高用量までを含むとしても非現実的ではない。さらに、幹細胞因子受容体アゴニストの用量が、体重１キログラム当たり０．５〜１５０マイクログラムの範囲よりも高く、または低く調整される特異的な状況が存在しうる。これは、他の増殖因子との同時投与；化学療法薬および／または放射線との同時投与；グリコシル化幹細胞因子受容体アゴニストの使用；およびこのセクションに前述した種々の患者関連の問題を含む。上述のように、治療法および組成物もまた、他のヒト因子との同時投与を含んでよい。本発明のポリペプチドと一緒の同時または逐次の投与のための、他の適切なヘマトポイエチン類(hematopoietins)、コロニー刺激因子類およびインターロイキン類の非限定的リストには、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ｃ−ｍｐｌリガンド(ＴＰＯまたはＭＧＤＦとしても知られている)、Ｍ−ＣＳＦ、エリスロポイエチン(ＥＰＯ)、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＬＩＦ、ヒト成長ホルモン、Ｂ細胞増殖因子、Ｂ細胞分化因子、および好酸球分化因子(本明細書では集合的に「造血系増殖因子」と称する)、あるいはこれらの組合せを含む。上記リストに加えて、ＷＯ９４／１２６３９とＷＯ９４／１２６３８に示されるＩＬ−３変種、ＷＯ９５／２１１９７とＷＯ９５／２１２５４に示される融合タンパク質、ＷＯ９７／１２９７７に開示されるＧ−ＣＳＦ受容体アゴニスト、ＷＯ９７／１２９７８に開示されるｃ−ｍｐｌ受容体アゴニスト、ＷＯ９７／１２９７９に開示されるＩＬ−３受容体アゴニスト、およびＷＯ９７／１２９８５に示される多機能性受容体アゴニストを本発明のポリペプチドと共に同時投与することができる。本発明の幹細胞因子受容体アゴニストは、末梢血中の造血始原細胞および幹細胞の動員に有用であろう。末梢血由来始原細胞は、自家骨髄移植の設定において患者を再構成するのに有効であることが証明された。Ｇ−ＣＳＦやＧＭ−ＣＳＦを含む造血系増殖因子は、末梢血における循環始原細胞と幹細胞の数を増大させることが証明された。これによって、末梢幹細胞採集の手順が単純になり、必要なフェレーシスの回数を減少させることによりこの手順の費用が劇的に下がった。本発明の幹細胞因子受容体アゴニストは、幹細胞の動員において有用であり、さらに末梢幹細胞移植の有効性を増強する。本発明の幹細胞因子受容体アゴニストはまた、造血始原細胞のエクスビボ拡張において有用であろう。Ｇ−ＣＳＦのようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）は、単独で投与されるか、他のＣＳＦと一緒に投与されるか、または貧血、好中球減少症および血小板減少症（これらは、しばしばそのような治療の結果である）を治療するための高用量化学療法に続く、骨髄移植と組合せて投与される。しかし、重篤な貧血、好中球減少症および血小板減少症は、全く消失するわけではない。単球(マクロファージ)、顆粒球（好中球を含む）および巨核球からなる骨髄細胞系は、生命を脅かしうる感染および出血を防止する上で決定的に重要である。貧血、好中球減少症および血小板減少症はまた、疾患、遺伝子障害、薬物、毒素、放射線および従来の腫瘍治療のような多くの治療処置の結果であることもある。骨髄移植は、この患者集団を治療するのに使用されてきた。しかし、障害された造血系を再構築するための骨髄の使用には、１）骨髄、または脾臓または末梢血のような他の組織の幹細胞の数に限りがあること、２）移植片対宿主疾患(Gra ft Versus Host Disease)、３）移植片拒絶および４）腫瘍細胞の混入の可能性を含むいくつかの問題が関係している。幹細胞および始原細胞は、骨髄、脾臓および末梢血における非常に低い割合の有核細胞を構成する。多分化能造血系始原細胞の数が多いほど、造血系の回復が増強されるような、用量応答が存在することは明白である。したがって、幹細胞のインビトロ増殖は、造血系の回復および患者の生存率を増強するはずである。同種ドナーからの骨髄が、移植用の骨髄を提供するために使用されてきた。しかし、移植片対宿主疾患および移植片拒絶が、ＨＬＡ適合の同胞のドナーによるレシピエントでさえ骨髄移植を限定している。同種骨髄移植の代替法は、自家骨髄移植である。自家骨髄移植では、少量の患者自身の骨髄を、骨髄剥離療法（例えば、高用量化学療法）の前に回収して、後で患者に移植して戻す。自家移植は、移植片対宿主疾患および移植片拒絶のリスクを排除する。しかし、自家骨髄移植はなお、骨髄の幹細胞の数が限定されていること、および腫瘍細胞の混入の可能性に関する問題を示す。多分化能造血始原細胞の数が限定されているという問題は、多分化能造血始原細胞のエクスビボ拡張により克服することができる。さらに、幹細胞は、骨髄移植片の腫瘍細胞混入を低下させるために、ＣＤ３４＋のような特異的表面抗原の存在に基づいて特異的に単離することができる。以下の特許は、幹細胞、ＣＤ３４＋細胞の分離、造血因子による細胞の培養、造血障害の患者の治療のための細胞の使用、および細胞増殖および遺伝子治療のための造血因子の使用に関するさらなる詳細を含む。５，０６１，６２０号は、分化した細胞からの幹細胞の分離により提供されるヒト造血幹細胞を含む組成物に関する。５，１９９，９４２号は、（１）患者からの造血始原細胞の入手;（２）ＩＬ −３、ｆ１ｔ３リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＧＭ −ＣＳＦ／ＩＬ−３融合タンパク質およびその組合せよりなる群から選択される増殖因子による細胞のエクスビボ拡張;（３）患者への細胞調製物の投与からなる、自家造血細胞移植の方法を記載している。５，２４０，８５６号は、細胞分離プロセスを自動コントロールするための装置を含む、細胞分離機に関する。ＷＯ９１／１６１１６は、細胞の混合物から標的細胞を選択的に単離および分離するための装置および方法を記載している。ＷＯ９１／１８９７２は、中空繊維バイオリアクターを使用して骨髄細胞の懸濁液をインキュベートすることによる、骨髄のインビトロ培養のための方法を記載している。ＷＯ９２／１８６１５は、サイトカインの特異的混合物を含有する培地で、移植に使用するための骨髄細胞を維持および増殖するプロセスに関する。ＷＯ９３／０８２６８は、（ａ）他の細胞からＣＤ３４＋幹細胞分離する工程、および（ｂ）幹細胞が選択的に拡張するような選択培地中で、分離した細胞をインキュベートする工程を含む、選択的に幹細胞を拡張するための方法を記載している。ＷＯ９３／１８１３６は、末梢血由来の哺乳動物細胞のインビトロの維持のためのプロセスに関する。ＷＯ９３／１８６４８は、遺伝的または後天的好中球減少症を治療するための、骨髄芽球と前骨髄球が高含量のヒト好中球前駆細胞を含む組成物に関する。ＷＯ９４／０８０３９は、ｃ−ｋｉｔタンパク質を発現する細胞の選択によるヒト造血幹細胞の濃縮のための方法を記載している。ＷＯ９４／１１４９３は、向流水簸法（counterflow elutriation method）を用いて単離される、ＣＤ３４＋かつサイズが小さい幹細胞集団を記載している。ＷＯ９４／２７６９８は、異種細胞混合物から有核異種細胞集団の選択的分離のための、免疫親和性分離と連続流遠心分離とを合わせた方法に関する。ＷＯ９４／２５８４８は、標的細胞の収集と操作のための細胞分離装置を記載している。ＩＬ−１α、ＩＬ−３、ＩＬ−６またはＧＭ−ＣＳＦを含有する培地での、ヒト骨髄からの非常に濃縮した造血始原細胞のＣＤ３４＋前駆細胞の長期培養が、ブラント（Brandt）ら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８６：９３２−９４１，１９９０）に考察されている。本発明の１つの側面は、幹細胞の選択的エクスビボ拡張のための方法を提供する。「幹細胞」という用語は、多分化能造血細胞並びに骨髄、脾臓または末梢血から単離することができる初期骨髄性始原細胞および前駆細胞をいう。「増殖」という用語は、細胞の増殖および分化をいう。本発明は、（ａ）他の細胞から幹細胞を分離するＴ程、（ｂ）幹細胞因子受容体アゴニストおよび場合により第２のコロニー刺激因子を含有する選択培地に用いて分離した幹細胞を培養する工程、および（ｃ）培養幹細胞を回収する工程を含む、幹細胞の選択的エクスビボ拡張のための方法を提供する。幹細胞、さらには好中球、赤血球、血小板などになることが運命づけられた単分化能始原細胞は、これらの細胞の表面上に存在するＣＤ３４のような特定の始原細胞マーカー抗原の存在または非存在により、および／または形態学的特徴により、多くの他の細胞から区別される。非常に濃縮したヒト幹細胞画分の表現型は、ＣＤ３４＋、Ｔｈｙ−１＋およびｌｉｎ−と報告されているが、本発明がこの幹細胞集団の増殖に限定されると理解してはならない。ＣＤ３４＋濃縮ヒト幹細胞画分は、ＣＤ３４＋のような表面抗原に対する抗体を使用する、親和性カラムまたはビーズ、磁気ビーズまたはフローサイトメトリーを含む、多くの報告された方法により分離することができる。さらに、向流水簸法のような物理的分離法を、造血始原細胞を濃縮するために使用することができる。ＣＤ３４＋始原細胞は、異成分からなり、異なる細胞系に関連する細胞表面関連分子の同時発現の存在または非存在を特徴とする、いくつかの亜集団に分割することができる。最も未成熟な始原細胞は、ＨＬＡ−ＤＲまたはＣＤ３８のような既知の細胞系関連マーカーのいずれをも発現しないが、ＣＤ９０（ｔｈｙ−１）を発現しうる。ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ７１、ＨＬＡ−ＤＲまたはｃ−ｋｉｔのような他の表面抗原もまた、造血始原細胞を選択的に単離するために使用することができる。分離した細胞は、培養フラスコ、無菌バッグまたは中空繊維中の選択培地中でインキュベートすることができる。選択的に細胞を増殖させるために、種々のコロニー刺激因子を使用することができる。骨髄のエクスビボ拡張に使用されてきた代表的因子は、ｃ−ｋｉｔリガンド、ＩＬ−３、Ｇ− ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ｆｌｔ−３リガンドまたはこれらの組合せを含む。幹細胞の増殖は、標準法（例えば、血球計数器、ＣＦＵ、ＬＴＣＩＣ）またはインキュベーションの前後のフローサイトメトリーにより、幹細胞と他の細胞の数を数えることでモニターすることができる。ｃ−ｋｉｔリガンド(ブラント（Brandt）ら，Ｂｌｏｏｄ８３：１５０７− １５１４，１９９４；マッケンナ（McKenna）ら，Ｂｌｏｏｄ８６：３４１３ −３４２０，１９９５)、ＩＬ−３(ブラント（Brandt）ら，Ｂｌｏｏｄ８３：１５０７−１５１４，１９９４；サトー（Sato）ら，Ｂｌｏｏｄ８２：３６００−３６０９，１９９３)、Ｇ−ＣＳＦ(サトー（Sato）ら，Ｂｌｏｏｄ８２：３６００−３６０９，１９９３)、ＧＭ−ＣＳＦ(サトー（Sato）ら，Ｂｌｏｏｄ８２：３６００−３６０９，１９９３)、ＩＬ−１(ミュンチ（Muench）ら，Ｂｌｏｏｄ８１：３４６３−３４７３，１９９３)、ＩＬ−６(サトー（Sato）ら，Ｂｌｏｏｄ８２：３６００−３６０９，１９９３)、ＩＬ−１１(レモリ（Lemo li）ら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍ．２１：１６６８−１６７２，１９９３；サトー（Sato ）ら，Ｂｌｏｏｄ８２：３６００−３６０９，１９９３)、ｆｌｔ−３リガンド（マッケンナ（McKenna）ら，Ｂｌｏｏｄ８６：３４１３−３４２０，１９９５）および／またはその組合せ（ブラント（Brandt）ら，Ｂｌｏｏｄ８３：１５０７−１５１４，１９９４；ヘイロック（Haylock）ら，Ｂｌｏｏｄ８０：１４０５−１４１２，１９９２；コラー（Koller）ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１１：３５８−３６３，１９９３；レモリ（Lemoli）ら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍ．２１：１６６８−１６７２，１９９３；マッケンナ(McKenna)ら，Ｂｌｏｏｄ８６：３４１３−３４２０，１９９５；ミュンチ（Muench）ら，Ｂｌｏｏｄ８１：３４６３−３４７３，１９９３；パッチェン（Patchen）ら，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ７：１３−２６，１９９４；サトー（Sato）ら，Ｂｌｏｏｄ８２：３６００−３６０９，１９９３；スミス（Smith）ら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍ．２１：８７０−８７７，１９９３；スティーン（Steen）ら，ＳｔｅｍＣｅｌ１ｓ１２：２１４−２２４，１９９４；ツジノ（Tsujino）ら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍ．２１：１３７９−１３８６，１９９３）を含む、種々のコロニー刺激因子を使用する、多くの選択方法および増殖法を利用する、幹細胞のエクスビボ拡張のためのいくつかの方法が報告されている。個々のコロニー刺激因子の中で、ｈＩＬ− ３は末梢血ＣＤ３４＋細胞を増殖させるのに最も強力なものの１つであることが証明された(サトー（Sato）ら，Ｂｌｏｏｄ８２：３６００−３６０９，１９９３；コバヤシ（Kobayashi）ら，Ｂｌｏｏｄ７３：１８３６−１８４１，１９８９)。しかし、複数の因子の組合せと同じくらい有効であることが証明された単一の因子はなかった。本発明は、新規な幹細胞因子受容体アゴニストを利用する、エクスビボ拡張のための方法を提供する。本発明の別の側面は、造血前駆細胞の維持および／または増殖の方法を提供し、この方法は、細胞を、本発明の幹細胞因子受容体アゴニストを補足した、ＨＳ −５（ＷＯ９６／０２６６２、ロエクライン（Roecklein）とトロクーストロブ( Torok-Strob)，Ｂｌｏｏｄ８５：９９７−１１０５，１９９５）のような間質細胞株に暴露することにより馴らした培地を含有する培養容器に接種することを含む。また、本発明の幹細胞因子受容体アゴニストの使用は、血液銀行への応用を含むことが構想されている。この設定において、血球の数を増大させるために患者に幹細胞因子受容体アゴニストが投与される。ある医療処置の前に、患者から血液産物を取り出す。そして血液産物を保存し、その医療処置後に輸液法により患者に戻す。さらに、幹細胞因子受容体アゴニストの使用は、献血前に供血者に幹細胞因子受容体アゴニストを投与して血球の数を増やすことにより、供血者が安全に多量の血液を供与できるようにすることを含むことが構想されている。増殖因子の別の計画される臨床的使用は、遺伝子治療のための造血始原細胞および幹細胞のインビトロ活性化にある。造血始原細胞の長い寿命および全身にわたるその娘細胞の分布のため、造血始原細胞はエクスビボ遺伝子トランスフェクションのための良好な候補である。目的の遺伝子を造血始原細胞または幹細胞のゲノム中に組み込むためには、細胞分裂およびＤＮＡ複製を刺激することが必要である。造血幹細胞は、非常に低い頻度で循環するが、このことは、増殖因子が遺伝子の形質導入を促進し、そのため遺伝子治療のための臨床的な見込みを増強するのに有用であることを意味する。遺伝子治療（クリスタル(Crystal)，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７０：４０４−４１０，１９９５を再検討のこと）の可能性ある応用は、１）多くの先天性代謝障害および免疫不全(カイ（Kay）とウー（Woo），ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ．１０：２５３−２５７，１９９４)、２）神経障害(フリードマン(Friedmann)，ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ．１０：２１０−２１４，１９９４)、３）癌(カルバー（Culver）とブレーズ(Blaese)，ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ．１０：１７４−１７８，１９９４)、および４）感染症（ギルボア（Gilboa）とスミス(Smith)，ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ．１０：１３９−１４４，１９９４）を含む。遺伝物質を宿主細胞に導入するための種々の方法が当業者には公知である。初代細胞に治療用遺伝子を転移させるための、ウイルス性および非ウイルス性の両方の多くのベクターが開発されている。ウイルス性ベクターは、１）複製不全組換えレトロウイルス（ボリス−ローリー（Boris-Lawrie）とテミン(Temin)，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．３：１０２−１０９，１９９３；ボリス−ローリー（Boris-Lawrie）とテミン(Temin)，Ａｎｎａｌ．ＮｅｗＹｏｒｋＡｃａｄ．Ｓｃｉ．７１６：５９−７１，１９９４；ミラー(Miller)，ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：１−２４，１９９２）および複製不全組換えアデノウイルス（バークナー(Berkner)，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：６１６−６２９，１９８８；バークナー(Berkn er)，ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３９−６６，１９９２；ブロディー（Brody）とクリスタル(Crystal)，Ａｎｎａｌ．ＮｅｗＹｏｒｋＡｃａｄ．Ｓｃｉ．７１６：９０−１０３，１９９４）を含む。非ウイルス性ベクターは、タンパク質／ＤＮＡ複合体(クリスティアーノ（Cristiano）ら，ＰＮＡＳＵＳＡ．９０：２１２２−２１２６，１９９３；カリエル（Curiel）ら，ＰＮＡＳＵＳＡ８８：８８５０−８８５４，１９９１；カリエル(Curiel)，Ａｎｎａｌ．ＮｅｗＹｏｒｋＡｃａｄ．Ｓｃｉ．７１６：３６−５８，１９９４)、電気穿孔法およびカチオン性リポソームのようなリポソーム介在性送達（ファーフッド（Farhood）ら，Ａｎｎａｌ．ＮｅｗＹｏｒｋＡｃａｄ．Ｓｃｉ．７１６：２３−３５，１９９４）を含む。本発明は、生物学的活性および／または物理的性質が改善した幹細胞因子受容体アゴニストを利用する方法を提供するため、新しい遺伝物質を導入した造血細胞を増殖する現行の方法に改良を加える。本発明の幹細胞因子受容体アゴニストの別の意図される用途は、前駆細胞からの、免疫用のアジュバントとして使用するための多数の樹状細胞の作成である。樹状細胞は、免疫系において決定的に重要な役割を演じる。これらは、静止Ｔ細胞の活性化に最も有効な抗原提示専門細胞であり、そして未熟Ｔ細胞のインビボでの活性化、およびこのため、１次免疫応答の開始のための主要な抗原提示細胞である。これらは、可溶性腫瘍特異的抗原（Ａｇ）を効率よく内面化し、加工して提示する。樹状細胞は、未熟Ｔ細胞を集団化するユニークな能力、および主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）と同時刺激分子の発現、サイトカインの産生およびリンパ器官への遊走の迅速なアップ−レギュレーションにより、Ａｇ遭遇に対して応答するユニークな能力を有する。樹状細胞は、ＣＤ４依存性免疫応答では新生抗原に対して宿主を感作させるために最も重要な細胞であるため、腫瘍免疫の発生と調節においても決定的に重要な役割を演じる。樹状細胞は、顆粒球とマクロファージに共通の骨髄ＣＤ３４＋前駆細胞に由来し、そして純粋な樹状細胞コロニーを増大させる分離した樹状細胞コロニー形成単位（ＣＦＵ−ＤＣ）の存在は、ヒトにおいて確立している。さらに、ポスト− ＣＦＵＣＤ１４＋中間細胞は、別個のサイトカイン条件下で樹状細胞またはマクロファージの経路に沿って分化する能力があると報告されている。この両能力前駆細胞は、骨髄、臍帯血および末梢血中に存在する。樹状細胞は、培養樹状細胞の成熟を描写するために、成熟樹状細胞上で発現する細胞特異的マーカーのＣＤ８３により単離することができる。樹状細胞に基づく方策は、腫瘍および感染性物質に対する免疫応答を増強するための方法を提供する。ＡＩＤＳは、樹状細胞がＨＩＶ−１複製を促進する際に主要な役割を演じうるため、樹状細胞に基づく治療を使用することができるもう１つの疾患である。ある免疫療法は、癌患者からの樹状細胞の作成、外科的に取り除いた腫瘍塊由来の腫瘍Ａｇへのそのインビトロ暴露、および腫瘍患者へのこれらの細胞の再注入を必要とする。腫瘍細胞の比較的粗製の膜調製物が腫瘍抗原の供給源として充分であり、これによって腫瘍抗原の分子的同定に対する必要性を回避できる。腫瘍抗原はまた、合成ペプチド、炭水化物または核酸配列であってもよい。さらに、本発明の幹細胞因子受容体アゴニストのようなサイトカインの同時投与が、腫瘍免疫の誘導をさらに促すこともある。免疫療法は、樹状細胞の数を増大させるために、本発明の幹細胞因子受容体アゴニストが、単独または他の造血系増殖因子と共に腫瘍を有する患者に投与され、かつ内因性腫瘍抗原が樹状細胞上に存在するという、インビボの設定で行いうることが予測されている。また、インビボ免疫療法は、外因性抗原によっても行いうることが構想されている。また、免疫療法の処置が、単独または他の造血系増殖因子と共に本発明の幹細胞因子受容体アゴニストを患者に投与し、患者から樹状細前駆細胞または成熟樹状細胞を取り出し、樹状細胞を抗原に暴露して、樹状細胞を患者に戻すことによる、樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞の動員を含むことも構想されている。さらには、取り出した樹状細胞は、抗原に暴露する前に樹状細胞の数を増大させるために、単独または他の造血系増殖因子と共に本発明の幹細胞因子受容体アゴニストによりエクスビボで培養することができる。樹状細胞に基づく方策はまた、自己免疫疾患の免疫応答を低下させる方法を提供する。樹状細胞に関する研究は、充分な数および適度に純粋な形態で細胞を調製することが困難なため、大きく妨げられてきた。エクスビボの細胞増殖の設定では、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）と腫瘍壊死因子−α （ＴＮＦ−α）が、骨髄、臍帯血、または末梢血から回収した造血始原細胞（ＣＤ３４＋細胞）からの樹状細胞のエクスビボの生成において協力し、そしてｆｌｋ−２／／ｆｌｔ−３リガンドとｃ−ｋｉｔリガンド(幹細胞因子[ＳＣＦ])が共同して、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＴＮＦ−α誘導性の樹状細胞の生成を増強する(エス・シエナ（Siena，S.）ら，ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＨｅｍａｔｏｌｏｇｙ２３：１４６３−１４７１，１９９５)。また、免疫療法に充分な量の樹状細胞を提供するための、本発明の幹細胞因子受容体アゴニストを使用する樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞のエクスビボ拡張の方法が提供される。リンカーの決定リンカーのアミノ酸配列の長さは、経験的に、または構造情報を指針にして、または２つのアプローチの組合せを使用して選択することができる。構造情報が入手できないとき、その長さが０〜５０Åの範囲にわたるように変化し、かつその配列が、表面露出（親水性、ホップ（Hopp）とウッズ(Woods),Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４８３−４８９，１９８３；カイト（Kyte）とドーリトル(Doolittle)，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２，１９８２；溶媒に露出した表面領域、リー（Lee）とリチャード(Richards)，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：３７９−４００，１９７１）と、幹細胞因子受容体アゴニストの立体配置を乱すことなく必要なコンホメーションをとる能力（コンホメーション的柔軟性；カープラス（Karplus）とシュルツ(Schulz)，Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ７２：２１２−２１３，１９８５）に、一致するように選択されるデザインを用いて、試験用に小さい一連のリンカーを調製することができる。１残基当たり２．０〜３．８Åの平均を仮定すると、このことは、試験すべき長さが０〜３０残基の間であり、０〜１５残基が好ましい範囲であることを意味する。このような経験的なシリーズの例は、ｎ回反復するＧｌｙ −Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ここでｎは、１、２、３または４である）のようなカセット配列を使用してリンカーを作成することである。当業者であれば、リンカーが長すぎも短すぎもしないことを第一に考えて、リンカーとして役立つ長さや組成が異なる、多くのこのような配列が存在することを認めるであろう(サンデュー(Sandhu)，ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：４３７− ４６２，１９９２を対照のこと)；もしこれらが長すぎるならば、エントロピー効果が三次元折り畳みを不安定にしがちであり、また折り畳みを速度論的に実現できないものにし、そしてもしこれらが短すぎるならば、ねじれまたは立体ひずみのためにこれらは分子を不安定にしがちである。タンパク質構造情報の解析における熟練者であれば、ｃ−アルファ炭素の間の距離として定義される鎖末端の間の距離の使用が、使用すべき配列の長さを画定するためにまたはリンカーの経験的選択において試験する必要のある可能性の数を少なくとも限定するために、使用できることを認めるであろう。彼らはまた、Ｘ線回折または核磁気共鳴分光学データに由来する構造モデルにおいて、ポリペプチド鎖の末端の位置が間違っていることがあること、およびこれが真であるとき、必要なリンカーの長さを正確に推定するためにはこの状況を考慮に入れなければならないことがあることを認めるであろう。その位置が充分に明確な残基から、配列内で鎖末端に近い２つの残基が選択され、そしてそのｃ−アルファ炭素の間の距離は、これらの間のリンカーについて概算の長さを計算するために使用される。計算した長さを指針として使用して、ある範囲の数の残基（１残基当たり２〜３．８Åを用いて計算）を有するリンカーを次に選択する。これらのリンカーは、元の配列、必要に応じて短縮または延長した配列からなり、そして延長するとき追加の残基は、前述のように柔軟かつ親水性であるように選択することができる；あるいは場合により元の配列は、一連のリンカーを使用して置換することができる(一例として、前述のＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒカセットアプローチがある);あるいは場合により適切な全長を有する元の配列と新しい配列の組合せを使用することができる。幹細胞因子受容体アゴニストのアミノ末端とカルボキシル末端の決定生物学的に活性な状態に折り畳むことができる幹細胞因子受容体アゴニストの配列は、前述のリンカー配列を使用しながら、元のポリペプチド鎖内からの起点（アミノ末端）と終点（カルボキシル末端）位置の適切な選択により調製することができる。アミノおよびカルボキシル末端は、後述のガイドラインを用いて、切断点領域と呼ばれる配列の共通ストレッチ内から選択される。こうして新規なアミノ酸配列が、同じ切断点領域内からアミノおよびカルボキシル末端を選択することにより生成する。多くの場合新しい末端の選択は、カルボキシル末端の元の位置がアミノ末端の元の位置の直前になるように行われる。しかし、当業者であれば、領域内のどこで末端を選択しても機能しうるし、かつこの選択が新しい配列のアミノまたはカルボキシル部分への欠失または付加を、有効に引き起こすことを認めるであろう。タンパク質の一次アミノ酸配列が、その生物学的機能の発現に必要な三次元構造への折り畳みを指令することは、分子生物学の中心的教義である。タンパク質単結晶のＸ線回折またはタンパク質溶液の核磁気共鳴分光学を用いて三次元構造情報を入手および解釈するための方法は、当業者には知られている。切断点領域の同定に関連した構造情報の例としては、タンパク質二次構造の位置と型（アルファおよび３〜１０らせん、平行および逆平行ベータシート、鎖の反転とターン、およびループ；カブシュ（Kabsch）とサンダー(Sander)，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ２２：２５７７−２６３７，１９８３；アミノ酸残基の溶媒暴露の程度、残基間の相互作用の程度と型（チョージア(Chothia)，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：５３７−５７２，１９８４）およびポリペプチド鎖に沿ってのコンホメーションの静的および動的分布（アルバー（Alber）とマシューズ(Math ews)，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１５４：５１１−５３３，１９８７）を含む。ある場合には、残基の溶媒暴露に関して追加的情報がわかっている；１つの例は、必然的にタンパク質の表面上にある炭水化物の翻訳後結合の部位である。実験的構造情報が入手できないかまたは入手が困難なとき、タンパク質の三次および二次構造、溶媒接近可能性およびターンとループの出現を予測するために、一次アミノ酸配列を解析するための方法もまた利用可能である。時には生化学的方法もまた、直接構造方法が実施不可能であるとき、経験的に表面露出を求めるために適用可能である；例えば、表面露出を推論するため、鎖の切断部位を同定し、および次に限定的タンパク質分解を用いる(ジェンティール（Gentile）とサルバトーレ(Salvatore)，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：６０３− ６２１，１９９３)。こうして親のアミノ酸配列は、実験的に得られた構造情報または予測方法のいずれかを使用して(例えば、スリニビサン（Srinivisan）とローズ(Rose)，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ.，Ｆｕｎｃｔ．＆Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２２：８１−９９，１９９５)、これらが二次および三次構造の維持に絶対必要であるかどうかによって分類するために調べられる。周期的二次構造（アルファおよび３〜１０らせん、平行および逆平行ベータシート）に関係することが知られている領域内の配列の出現は、回避すべき領域である。同様に、溶媒暴露の程度が低いことが観察または予測されるアミノ酸配列の領域は、タンパク質のいわゆる疎水性コアの一部になり易く、これもアミノおよびカルボキシル末端の選択には回避すべきである。対照的に、表面ターンまたはループ内にあることが知られているかまたは予測される領域、そして特に生物活性のために必要でないことが知られている領域は、ポリペプチド鎖の両端の位置として好ましい部位である。上記基準に基づいて好ましいアミノ酸配列の連続ストレッチは、切断点領域と呼ばれる。材料と方法組換えＤＮＡ法他に記載がなければ、全ての専門化学物質は、シグマ社（Sigma Co.）(セントルイス、ミズーリ州)から入手した。制限エンドヌクレアーゼとＴ４ＤＮＡリガーゼは、ニューイングランドバイオラブズ（New England Biolabs）(ビバリー、マサチューセッツ州)またはベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim） (インディアナポリス、インディアナ州)から入手した。大腸菌（E．coli）株の形質転換ＤＨ５α（登録商標）(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、ゲーサーズバーグ、メリーランド州)とＴＧＩ（アマーシャム社(AmershamCorp.)、アーリントンハイツ、イリノイ州）のような大腸菌の株は、連結反応の形質転換のために使用し、哺乳動物細胞のトランスフェクション用のプラスミドＤＮＡの供給源である。ＭＯＮ１０５とＪＭ１０１のような大腸菌の株は、細胞質または細胞周辺腔で本発明の幹細胞因子受容体アゴニストを発現するために使用することができる。ＭＯＮ１０５ＡＴＣＣ＃５５２０４：Ｆ−、ｌａｍｄａ−、ＩＮ（ｒｒｎＤ、ｒｒＥ）１、ｒｐｏＤ＋、ｒｐｏＨ３５８ＤＨ５α（登録商標）:Ｆ−、ｐｈｉ８０ｄｌａｃＺｄｅｌｔａＭ１５、ｄｅｌｔａ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９、ｄｅｏＲ、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｈｓｄＲ１７(ｒｋ−、ｍｋ＋)、ｐｈｏＡ、ｓｕｐＥ４４ｌａｍｄａ−、ｔｈｉ−１、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｌＡ１ＴＧ１：ｄｅｌｔａ(ｌａｃ−ｐｒｏ)、ｓｕｐＥ、ｔｈｉ−１、ｈｓｄＤ５／Ｆ'（ｔｒａＤ３６、ｐｒｏＡ＋Ｂ＋、ｌａｃｌｑ、ｌａｃＺｄｅｌｔａＭ１５）ＤＨ５α（登録商標）サブクローニング効率細胞は、コンピテント細胞として購入して、製造業者のプロトコールを用いて形質転換する準備ができており、一方大腸菌株ＴＧ１とＭＯＮ１０５は、ＣａＣｌ₂法を用いてＤＮＡを集めるためにコンピテントにされる。典型的には、２０〜５０mLの細胞を、ボシュロムスペクトロニック（Baush & Lomb Spectronic）分光光度計（ロチェスター、ニューヨーク州）により測定するとき６００ナノメートル（ＯＤ６００）で約１．０光学密度単位になるまで、ＬＢ培地（１％バクトートリプトン(Bacto-trypton)、０．５％バクト−酵母抽出物、１５０mM ＮａＣｌ）で培養する。細胞を遠心分離により回収して、１／５培養物容量のＣａＣｌ₂溶液（５０mM ＣａＣｌ₂、１０mMトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．４）に再懸濁して、４℃で３０分間維持する。再度細胞を遠心分離により回収して、１／１０培養物容量のＣａＣｌ₂溶液に再懸濁する。連結したＤＮＡを０．２mLのこれらの細胞に加えて、この試料を４℃で１時間維持する。試料を２分間４２℃にして、１mLのＬＢを加え、次に試料を３７ ℃で１時間振盪する。これらの試料からの細胞を、アンピシリン耐性形質転換体を選択するときはアンピシリン(１００マイクログラム/mL、μｇ/mL)、またはスペクチノマイシン耐性形質転換体を選択するときはスペクチノマイシン(７５μ ｇ/mL)を含有するプレート（ＬＢ培地＋１．５％バクト−寒天）に広げる。プレートを３７℃で一晩インキュベートする。単一のコロニーを採集して、適切な抗生物質を補足したＬＢで３７℃で振盪しながら６〜１６時間増殖させる。コロニーを採集して、ＬＢ＋適切な抗生物質（１００μｇ／mLアンピシリンまたは７５μ ｇ/mLスペクチノマイシン）に接種して、３７℃で振盪しながら増殖させる。培養物の回収前に、１μｌの細胞を、幹細胞因子遺伝子の存在についてＰＣＲにより解析する。ＰＣＲは、幹細胞因子遺伝子および／またはベクターにアニーリングするプライマーの組合せを使用して行われる。ＰＣＲ終了後、荷電染料を試料に加えて、次に前述のように電気泳動に付す。目的のサイズのＰＣＲ産物が観察されるとき、遺伝子をベクターに連結した。新しいＮ末端／Ｃ末端を有する遺伝子の作成方法方法Ｉ．リンカー領域を含有する新しいＮ末端／Ｃ末端を有する遺伝子の作成。元のＣ末端とＮ末端を分離するリンカー領域を含有する新しいＮ末端／Ｃ末端を有する遺伝子は、本質的にエル・エス・マリンズ（L.S．Mullins）ら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６，５５２９−５５３３（１９９４）に記載される方法により作成することができる。多段階のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を使用して、タンパク質の一次アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を再編成する。本工程を、図２に例示する。第１工程において、プライマーセット（「新しい開始点」と「リンカー開始点」）を使用して、元の遺伝子配列から、元のタンパク質のＣ末端とＮ末端をつなぐリンカーが後ろに続く、新しいタンパク質の新しいＮ末端部分をコードする配列を含有するＤＮＡ断片（「断片開始点(Fragment Start)」）を、作成および増幅する。第２工程では、プライマーセット（「新しい終止点」と「リンカー終止点」）を使用して、元の遺伝子配列から、新しいタンパク質の新しいＣ末端部分が後ろに続く、上で使用されるのと同じリンカーをコードするＤＮＡ断片（「断片終止点( Fragment Stop)」）を、作成および増幅する。この「新しい開始点」と「新しい終止点」プライマーは、発現プラスミドへの新しい遺伝子のクローニングが可能である適切な制限酵素認識部位を含むように設計される。典型的なＰＣＲ条件は、１サイクルの９５℃２分間融解；２５サイクルの９４℃１分間変性、５０℃１分間アニーリングおよび７２℃１分間伸長；＋１サイクルの７２℃７分間の伸長である。パーキンエルマー・ジーンアンプ・ＰＣＲコア試薬(Perkin Elmer Gene Amp PCR Core Reagents）キットを使用する。１００μｌの反応物は、１００pmo lの各プライマーと１μｇの鋳型ＤＮＡ；および１×ＰＣＲ緩衝液、２００μＭｄＧＴＰ、２００μＭｄＡＴＰ、２００μＭｄＴＴＰ、２００μＭｄＣＴＰ、２．５単位のアンプリタック（AmpliTaq）ＤＮＡポリメラーゼおよび２mM ＭｇＣｌ₂を含有する。ＰＣＲ反応は、モデル４８０ＤＮＡサーマルサイクラー（パーキンエルマー社(Perkin Elmer Corporation)、ノーウォーク、コネチカット州）で行われる。「断片開始点」と「断片終止点」は、リンカー領域とリンカーの両側の２つのアミノ酸のコード配列に相補的配列を持っており、これらは第３ＰＣＲＴ程で一緒に結合して、新しいタンパク質をコードする全長遺伝子を作成する。ＤＮＡ断片の「断片開始点」と「断片終止点」は、１％ＴＡＥゲルで分解し、臭化エチジウムで染色して、キアエックスゲル抽出（Qiaex Gel Extraction）キット（キアジェン(Qiagen)）を使用して単離する。これらの断片は、等モル量で合わせて、７０℃で１０分間加熱し、ゆっくり冷却して「リンカー開始点」と「リンカー終止点」にあるこれらの共有配列の端から端までアニーリングさせる。第３ＰＣＲ工程では、プライマーである「新しい開始点」と「新しい終止点」をアニーリングした断片に加えて、全長の新しいＮ末端／Ｃ末端遺伝子を作成および増幅する。典型的なＰＣＲ条件は、１サイクルの９５℃２分間融解；２５サイクルの９４℃１分間変性、６０℃１分間アニーリングおよび７２℃１分間伸長；＋１サイクルの７２℃７分間の伸長である。パーキンエルマー・ジーンアンプ・ＰＣＲコア試薬（Perkin Elmer GeneAmp PCR Core Reagents）キットを使用する。１００ μｌの反応物は、１００pmolの各プライマーと約０．５μｇのＤＮＡ；および１ ×ＰＣＲ緩衝液、２００μＭｄＧＴＰ、２００μＭｄＡＴＰ、２００μＭｄＴＴＰ、２００μＭｄＣＴＰ、２．５単位のアンプリタック（AmpliTaq）ＤＮＡポリメラーゼおよび２mM ＭｇＣｌ₂を含有する。ＰＣＲ反応物は、ウィザードＰＣＲプレップス（Wizard PCR Preps）キット（プロメガ(Promega)）を使用して精製する。方法II．リンカー領域を含まない新しいＮ末端／Ｃ末端を有する遺伝子の作成。元のＮ末端とＣ末端をつなぐリンカーを含まない新しいＮ末端／Ｃ末端遺伝子は、２Ｔ程のＰＣＲ増幅と平滑末端連結を使用して作成することができる。本工程をは図３に例示する。第１工程では、プライマーセット（「新しい開始点」と「Ｐ−ｂｌ開始点」）を使用して、元の遺伝子配列から、新しいタンパク質の新しいＮ末端部分をコードする配列を含有するＤＮＡ断片（「断片開始点」）を、作成および増幅する。第２工程では、プライマーセット（「新しい終止点」と「Ｐ−ｂｌ終止点」）を使用して、元の遺伝子配列から、新しいタンパク質の新しいＣ末端部分をコードする配列を含有するＤＮＡ断片（「断片終止点」）を、作成および増幅する。「新しい開始点」と「新しい終止点」プライマーは、発現ベクターへの新しい遺伝子のクロ−ニングを可能にする適切な制限部位を含むように設計される。典型的なＰＣＲ条件は、１サイクルの９５℃２分間融解；２５サイクルの９４℃１分間変性、５０℃４５秒間アニーリングおよび７２℃４５秒間の伸長である。ディープヴェント（Deep Vent）ポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラブズ(New England Biolabs)）を使用して、製造業者により推奨される条件でオーバーハング（overhangs）の発牛を低下させる。「Ｐ−ｂｌ開始点」と「Ｐ−ｂｌ終止点」ブライマーは、５’末端でリン酸化して、次の「断片開始点」と「断片終止点」の相互の平滑末端連結を助ける。１００μｌの反応物は、１５０pmolの各プライマーと１μｇの鋳型ＤＮＡ；および１×ヴェント（Vent）緩衝液(ニューイングランドバイオラブズ(New England Biolabs))、３００μＭｄＧＴＰ、３００ｐＭｄＡＴＰ、３００μＭｄＴＴＰ、３００μＭｄＣＴＰ、および１単位のディープヴェント（Deep Vent）ポリメラーゼを含有する。ＰＣＲ反応は、モデル４８０ＤＮＡサーマルサイクラー（パーキンエルマー社(P erkin Elmer Corporation)、ノーウォーク、コネチカット州）で行われる。ＰＣＲ反応産物は、ウィザードＰＣＲプレップス（Wizard PCR Preps）キット（プロメガ(Promega)）を使用して精製する。プライマーは、発現ベクターへの新しい遺伝子のクローニングを可能にする適切な制限酵素認識部位を含むように設計される。典型的には「断片開始点」は、ＮｃｏＩ制限部位を生み出すように設計され、そして「断片終止点」は、Ｈｉｎｄ III制限部位を生み出すように設計される、制限消化反応物は、マジックＤＮＡクリーンアップシステム（Magic DNA Clean-up System）キット（プロメガ(Prom ega)）を用いて精製する。断片開始点と終止点は、１％ＴＡＥゲルで分解し、臭化エチジウムで染色して、キアエックスゲル抽出（Qiaex Gel Extraction）キット（キアジェン(Qiagen)）を使用して単離する。これらの断片を、５０℃で１０分問加熱することによりｐＭＯＮ３９３４の〜３８００塩基対ＮｃｏＩ／Ｈｉｎｄ IIIベクター断片の末端と一緒にしてアニーリングし、徐々に冷却させる。３つの断片は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム(Boehringer Ma nnheim)）を用いて一緒に連結する。全長の新しいＮ末端／Ｃ末端遺伝子を含有するプラスミドが得られる。連結反応物の一部は、大腸菌株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、ゲーサーズバーグ、メリーランド州）を形質転換するのに使用する。プラスミドＤＮＡを精製して、配列を以下のように確認する。方法III．直列−複製法による新しいＮ末端／Ｃ末端遺伝子の作成新しいＮ末端／Ｃ末端遺伝子は、アール・エー・ホーリック（R.A．Horlick）ら，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．５：４２７−４３１（１９９２）に記載される方法に基づいて作成することができる。新しいＮ末端／Ｃ末端遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅は、直列に複製した鋳型ＤＮＡを使用して行われる。本工程を図４に例示する。直列に複製した鋳型ＤＮＡは、クローニングにより作成され、そして遺伝子の２つのコピーの元のＣ末端とＮ末端をつなぐリンカーをコードするＤＮＡ配列により分離された、２つのコピーの遺伝子を含有する。特異的なプライマーセットを使用して、直列に複製した鋳型ＤＮＡから全長の新しいＮ末端／Ｃ末端遺伝子を作成および増幅する。これらのプライマーは、発現ベクターへの新しい遺伝子のクローニングを可能にする適切な制限部位を含むように設計される。典型的なＰＣＲ条件は、１サイクルの９５℃２分間融解；２５サイクルの９４℃１分間変性、５０℃１分間アニーリングおよび７２℃１分間伸長；＋１サイクルの７２℃ ７分間の伸長である。パーキンエルマー・ジーンアンプ・ＰＣＲコア試薬（Perk in Elmer GeneAmp PCR Core Reagents）キット（パーキンエルマー社(Perkin El mer Corporation)、ノーウォーク、コネチカット州）を使用する。１００μｌの反応物は、１００pmolの各プライマーと１μｇの鋳型ＤＮＡ；および１×ＰＣＲ緩衝液、２００μＭｄＧＴＰ、２００μＭｄＡＴＰ、２００μＭｄＴＴＰ、２００μＭｄＣＴＰ、２．５単位のアンプリタック（AmpliTaq）ＤＮＡポリメラーゼおよび２mM ＭｇＣｌ₂を含有する。ＰＣＲ反応は、モデル４８０ＤＮＡサーマルサイクラー（パーキンエルマー社(Perkin Elmer Corporation)、ノーウォーク、コネチカット州）で行われる。ＰＣＲ反応物は、ウィザードＰＣＲプレップス（Wizard PCR Preps）キット（プロメガ(Promega)）を使用して精製する。ＤＮＡの単離および性状解析ブラスミドＤＮＡは、多くの異なる方法により、および当業者には公知の市販のキットを使用して単離することができる。このような方法のいくつかを本明細書で示す。プラスミドＤＮＡは、プロメガ（Promega）のウィザード（Wizard）（登録商標）ミニプレップ（Miniprep）キット（マディソン、ウィスコンシン州）、キアジェン（Qiagen）のキアウェルプラスミド（QIAwell Plasmid）単離キット（チャッツワース(Chatsworth)、カリホルニア州）またはキアジェン（Qiag en）のプラスミドミディ（Plasmid Midi）キットを使用して単離される。これらのキットは、プラスミドＤＮＡ単離のための同じ一般方法に従う。簡単に述べると、細胞を遠心分離（５０００×ｇ）によりペレット化し、プラスミドＤＮＡを連続的ＮａＯＨ／酸処理により放出させ、そして細胞破砕物を遠心分離（１００００×ｇ）して除去する。上清（プラスミドＤＮＡを含有する）を、ＤＮＡ結合樹脂を含有するカラムに充填し、カラムを洗浄し、そしてプラスミドＤＮＡをＴＥにより溶出する。目的のプラスミドを含むコロニーをスクリーニング後、大腸菌細胞は、５０〜１００mLのＬＢ＋適切な抗生物質中に接種して、空気インキュベーター中で３７℃で振盪しながら一晩培養する。精製したブラスミドｎＮＡは、ＤＮＡ配列決定、さらなる制限酵素消化、ＤＮＡ断片の追加のサブクローニングおよび哺乳動物、大腸菌または他の細胞へのトランスフェクションのために、使用する。配列の確認。精製プラスミドＤＮＡは、ｄＨ₂Ｏに再懸濁して、ボシュロムスペクトロニック（Baush and Lomb Spectronic）６０１ＵＶ分光計で２６０／２８０nmで吸光度を測定することにより定量する。ＤＮＡ試料は、エービーアイ（ABI）のプリズム（PRISM）（登録商標）ダイデオキシ（DyeDeoxy）（登録商標）末端配列決定化学（パーキンエルマー社のアプライド・バイオシステムズ部門(Applied Biosy stemsDivision of Perkin Elmer Corporation)、リンカーンシティー、カリホルニア州）キット（パーツ番号４０１３８８または４０２０７８）を使用して、通常配列決定混合物へ５％ＤＭＳＯを添加して修飾される、製造業者の提唱するプロトコールにより配列決定する。配列決定反応は、モデル４８０ＤＮＡサーマルサイクラー（パーキンエルマー社(Perkin Elmer Corporation)、ノーウォーク、コネチカット州）で、推奨される増幅条件により行われる。試料は、過剰の染色停止剤を除去するためにセントリーセップ（Centri-Sep）（登録商標）スピンカラム（プリンストンセパレーションズ(Princeton Separations)、アデルフィア(Adelphia)、ニュージャージー州）で精製して、凍結乾燥する。蛍光染料標識配列決定反応物は、脱イオンホルムアミドに再懸濁して、変性４．７５％ポリアクリルアミド−８Ｍ尿素ゲル上で、エービーアイ（ABI）モデル３７３Ａ自動ＤＮＡ配列決定機を使用して配列決定する。重複ＤＮＡ配列断片を解析して、シーケンサー（Sequencher）ＤＮＡ解析ソフトウェア（遺伝子コード社(Gene Codes Corporation)、アナーバー(Ann Arbor)、ミシガン州）を使用してマスターＤＮＡコンティグ（contigs）に組み立てる。哺乳動物細胞での幹細胞因子受容体アゴニストの発現哺乳動物細胞トランスフェクション／調整培地の製造ＢＨＫ−２１細胞株はＡＴＣＣ（ロックビル、メリーランド州）から入手することができる。この細胞は、２mM（mM）Ｌ−グルタミンと１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補足したダルベッコー修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ／高グルコース）で培養する。この処方は、ＢＨＫ増殖培地と呼ぶ。選択培地は、４５３単位/mL のヒグロマイシンＢ（カルビオケム(Calbiochem)、サンジエゴ、カリホルニア州）を補足したＢＨＫ増殖培地である。ＢＨＫ−２１細胞株は、ＨＳＶトランス活性化タンパク質ＶＰ１６（プラスミドｐＭＯＮ３３５９に見い出されるＩＥ１１０プロモーターをトランス活性化する）で前もって安定にトランスフェクションした(ヒッペンマイヤー（Hippenmeyer）ら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１０３７−１０４１，１９９３を参照のこと)。ＶＰ１６タンパク質は、ＩＥ１１０プロモーターの後ろに挿入された遺伝子の発現を推進する。トランス活性化タンパク質ＶＰ１６を発現するＢＨＫ−２１細胞は、ＢＨＫ−ＶＰ１６と呼ばれる。プラスミドｐＭＯＮ１１１８（ハイキン（Highkin）ら，ＰｏｕｌｔｒｙＳｃｉ.，７０：９７０−９８１，１９９１を参照のこと）は、ＳＶ４０プロモーターからヒグロマイシン耐性遺伝子を発現する。同様なプラスミド（ｐＳＶ２−ｈｐｈ）は、ＡＴＣＣから入手可能である。ＢＨＫ−ＶＰ１６細胞は、トランスフェクションの前に２４時間シャーレ当たり３×１０⁵細胞で、６０ミリメートル（mm）の組織培養シャーレに接種する。細胞は、１シャーレ当たり、１０μｇの目的の遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ、３μｇのヒグロマイシン耐性プラスミド、ｐＭＯＮ１１１８、および８０μｇのギブコ社（Gibco-BRL）「リポフェクタミン(LIPOFECTAMINE)」（登録商標）を含有する３mLの「オプティメム(OPTIMEM)」（登録商標）（ギブコ社(Gibco-BRL)、ゲーサーズバーグ、メリーランド州）中で１６時間トランスフェクシヨンする。次に培地を吸引して、３mLの増殖培地で置換する。トランスフェクションの４８時間後、各シャーレから培地を回収して、活性を測定する(一時的調整培地)。トリプシン−ＥＤＴＡにより細胞をシャーレから取り出し、１：１０希釈して、１０mL.の選択培地を含有する１００mm組織培養シャーレに移す。選択培地で約７日後、耐性細胞が増殖して直径数ミリメートルのコロニーを形成する。濾紙（コロニーとほぼ同じサイズに切って、トリプシン／ＥＤＴＡに浸漬した）によりコロニーをシャーレから取り出して、１mLの選択培地を含有する２４ウェルプレートの個々のウェルに移す。クローンがコンフルエンスになるまで増殖後、調整培地を再度測定し、そして陽性クローンを増殖培地に広げる。大腸菌（E．coli）中の幹細胞因子受容体アゴニストの発現目的のプラスミドを収容する大腸菌株ＭＯＮ１０５またはＪＭ１０１は、Ｍ９＋カザミノ酸培地中で３７℃で振盪しながら、ニューブランズウィックサイエンティフィック（New Brunswick Scientific）（エジソン、ニュージャージー州）の空気インキュベーターモデルＧ２５で増殖させる。増殖は、ＯＤ６００で１の値に達するまでモニターし、その時点で０．１ＮＮａＯＨ中のナリジキシン酸（１０ミリグラム/mL）を最終濃度５０μｇ/mLまで加える。次に培養物を３７℃でさらに３〜４時間振盪する。高度の通気を培養時間中維持することにより、目的遺伝子産物の最大産生を達成する。細胞を、封入体（ＩＢ）の存在について光学顕微鏡下で検査する。タンパク質含量の分析のために、ペレット化細胞の煮沸、これらの還元緩衝液での処理、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動により、１mLアリコートの培養液を取り出す(マニアティス（Maniatis）ら，「分子クローニング：実験室マニユアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)」，１９８２を参照のこと)。培養物を遠心分離（５０００×ｇ）して、細胞をペレット化する。大腸菌（E．coli）における遺伝子の高レベル発現を達成するためのさらなる方策は、シー・エム・サッヴァス（Savvas，C.M.）（ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ６０：５１２−５３８，１９９６）に見い出すことができる。大腸菌（E．coli）中の封入体として蓄積する幹細胞因子受容体アゴニストの、封入体調製、抽出、再折り畳み、透析、ＤＥＡＥクロマトグラフィーおよび性状解析。封入体の単離：３３０mLの大腸菌培養液からの細胞ペレットを１５mLの超音波処理緩衝液（１０mM ２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール塩酸塩(トリス−ＨＣｌ)、ｐＨ８．０＋１mMエチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)）に再懸濁する。これらの再懸濁した細胞を、ソニケーター細胞破砕機（Sonicator Cell Disruptor）（モデルＷ−３７５、ヒートシステムズ−ウルトラソニックス社(Heat Systems-Ultrasonics，Inc.)、ファーミングデール(Farmingdale)、ニューヨーク州）のマイクロチッププローブを使用して超音波処理する。超音波処理緩衝液中で３ラウンドの超音波処理とこれに続く遠心分離を行って、細胞を破砕し、封入体（ＩＢ）を洗浄する。第１ラウンドの超音波処理は、３分のバーストとこれに続く１分のバーストであり、そして最後の２ラウンドの超音波処理は、それぞれ１分である。封入体ペレットからのタンパク質の抽出と再折り畳み：最後の遠心分離工程後、ＩＢペレットを１０mLの５０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．５、８Ｍ尿素および５mMジチオスレイトール（ＤＴＴ）に再懸濁して、室温で約４５分間撹拌し、発現したタンパク質を変性させる。抽出溶液を、７０mLの５mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．５および２．３Ｍ尿素を含有するビーカーに移して、通気しながら４℃で１８〜４８時間穏やかに撹拌し、タンパク質を再折り畳みさせる。再折り畳みは、ヴァイダック（Vydac）（ヘスペリア(Hesperia)、カリホルニア州）Ｃ１８逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラム（０．４６×２５cm）で分析してモニターする。０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する４０％から６５％のアセトニトリルの線形勾配を利用して、再折り畳みをモニターする。この勾配は、１分に１．５ mLの流速で３０分にわたり展開させる。変性タンパク質は、一般に再折り畳みタンパク質よりも勾配の後の方で溶出する。精製：再折り畳み後、混入大腸菌タンパク質を酸性沈殿により除去する。再折り畳み溶液のｐＨは、１５％（ｖ／ｖ）酢酸（ＨＯＡｃ）を用いてｐＨ５．０とｐＨ５．２の間で滴定する。この溶液を４℃で２時間撹拌して、次に１２，０００×ｇで２０分間遠心分離していずれの不溶性タンパク質をもペレット化する。酸性沈殿工程からの上清は、３，５００ダルトンの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）のスペクトラ／ポル３（Spectra/Por3）膜を使用して透析する。透析は、４リットル（５０倍過剰）の１０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を２回交換して、全体で１８時間行う。透析により、試料の導電性が低下して、ＤＥＡＥクロマトグラフィーの前に尿素が除去される。次に試料を遠心分離（１２，０００×ｇで２０分）して、透析後の不溶性タンパク質をペレット化する。バイオラッド（Bio-Rad）のバイオースケールＤＥＡＥ２（Bio-Scale DEAE2）カラム（７×５２mm）をイオン交換クロマトグラフィーに使用する。カラムを、１０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を含有する緩衝液中で平衡化する。タンパク質は、平衡緩衝液中で０〜５００mM塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）勾配を使用して、４５カラム容量にわたって溶出する。溶出中、１分当たり１mLの流速を使用する。カラム画分（１画分当たり２mL）は勾配の全域で回収し、ヴァイダック（Vy dac）（ヘスペリア(Hesperia)、カリホルニア州）Ｃ１８カラム（０．４６×２５cm）でＲＰＨＰＬＣにより解析する。０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する、４０％〜６５％のアセトニトリルの線形勾配を使用する。この勾配は、１分当たり１．５mLの流速で３０分間にわたって展開する。次にプールした画分を４リットル（５０〜５００倍過剰）の１０mM酢酸アンモニウム（ＮＨ₄Ａｃ）、ｐＨ４．０を２回交換して、全体で１８時間透析する。透析は、３，５００ダルトンのＭＷＣＯのスペクトラ／ポル３（Spectra/Por3）膜を使用して行う。最後に、試料を０．２２μｍシリンジフィルター（ミュースターＬＢシリンジフィルター(μStar LB syringe filter)、コスター(Costar)、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）を用いて無菌濾過して、４℃で保存する。ある場合には、折り畳んだタンパク質は、適切なマトリックスに結合した、ｍＡｂまたは受容体サブユニットのような親和性試薬を使用して親和性精製することができる。あるいは（または、さらに）精製は、任意の種々のクロマトグラフィー法（例えば、イオン交換、ゲル濾過または疎水性クロマトグラフィー、または逆相ＨＰＬＣ）を使用して達成することができる。これらおよび他のタンパク質精製方法は、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８２巻、「タンパク質精製へのガイド(Guide to Protein Purific ation)」、マレー・ドイツチャー（Murray Deutscher）編、アカデミック出版(Ac ademic Press)、サンジエゴ、カリホルニア州（１９９０年）に詳細に記載されている。タンパク質の性状解析：精製タンパク質は、ＲＰ−ＨＰＬＣ、エレクトロスプレー（electrospray）質量分析、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析する。タンパク質の定量は、アミノ酸組成、ＲＰ−ＨＰＬＣ、およびブラッドフォード（Bradford）タンパク質測定法により行われる。ある場合には、タンパク質の同一性を確認するために、エレクトロスプレー質量分析と共にトリプシンのペプチドマッピングが行われる。メチルセルロース測定本測定法は、異なる型の造血系コロニーをインビトロで産牛するように正常骨髄細胞を刺激する、コロニー刺激因子の能力を反映する(ブラッドリー（Bradle y）ら，Ａｕｓｔ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．４４：２８７−３００，１９６６；プランツニク（Plunznik）ら，Ｊ．ＣｅｌｌＣｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏ．６６：３１９−３２４，１９６５）。方法約３０mLの新鮮な健常骨髄吸引物を、インフォームドコンセント後に個人から入手する。無菌条件下で、試料を５０mL円錐管（＃２５３３９−５０コーニング(Corning)、コーニング、メリーランド州）中の１×ＰＢＳ（＃１４０４０．０５９、ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、ゲーサーズバーグ、メリーランド州）で１：５希釈する。フィコール（Ficoll）（ヒストパーク（Histop aque）１０７７シグマ（Sigma）Ｈ−８８８９）を、希釈試料の下に重ねて、３００×ｇで３０分間遠心分離する。単核細胞バンドを取り出して、１×ＰＢＳで２回および１％ＢＳＡＰＢＳ（セルプロ社(CellPro Co.)、ボーテル(Bothel )、ワシントン州）で１回洗浄する。単核細胞をカウントして、セブラートＬＣ（Ceprate LC）（ＣＤ３４）キット（セルプロ社(CellPro Co.)、ボーテル(Both el)、ワシントン州）カラムを使用してＣＤ３４＋細胞を選択する。この分画は、骨髄内の全ての幹細胞と始原細胞がＣＤ３４表面抗原を表示するため、行われる。培養は、３５×１０mmシャーレ（ヌンク（Nunc）＃１７４９２６）中１．０mL の最終容量で三重に設定される。培地はテリーフォックスラブズ（Terry Fox La bs）から購入する。ＨＣＣ−４２３０培地（テリーフォックスラブズ(Terry Fox Labs)、バンクーバー、ブリティッシュコロンビア州、カナダ）とエリスロポイエチン（アムジェン(Amgen)、サウザンドオークス、カリホルニア州）を培地に加える。１シャーレ当たり３，０００〜１０，０００個のＣＤ３４＋細胞を加える。トランスフェクションした哺乳動物からの調整培地中の、またはトランスフェクションした哺乳動物細胞または大腸菌からの調整培地から精製した、ＥＰＯ受容体アゴニストタンパク質を加えて、０．００１ｎＭ〜１０nMの範囲の最終濃度にする。培養物を、３ccシリンジを使用して再懸濁して、１シャーレ当たり１．０mLを加える。対照（ベースライン応答）培養物にはコロニー刺激因子を加えなかった。陽性対照培養物には、調整培地（ＰＨＡ刺激ヒト細胞：テリーフォックスラブ（Terry Fox Lab.）Ｈ２４００）を加えた。培養物は、３７℃、加湿空気中の５％ＣＯ₂でインキュベートする。５０細胞を超えるとして定義される造血系コロニーは、４０×対物レンズを組合せたニコン（Nikon）の倒立顕微鏡を用いて、ピーク応答の日（１０〜１１日目）にカウントする。５０未満の細胞を含有する細胞の群は、クラスターと呼ばれる。あるいはコロニーは、スライドへのコロニーの塗布により同定して染色することができるか、あるいはこれらは、採集し、再懸濁して、染色のためにサイトスピンスライド上に広げることができる。ヒト臍帯血の造血系増殖因子測定造血系コロニー刺激因子（ＣＳＦ）活性のインビトロ測定には骨髄細胞が伝統的に使用される。しかしヒト骨髄は常に利用可能なわけではなく、そしてドナーには大きな多様性がある。臍帯血は、造血幹細胞と始原細胞の供給源として骨髄に匹敵する(ブロクスメイヤー（Broxmeyer）ら，ＰＮＡＳＵＳＡ８９：４１０９−１１３，１９９２；マヤニ（Mayani）ら，Ｂｌｏｏｄ８１：３２５２− ３２５８，１９９３)。骨髄とは対照的に、臍帯血は規則的に容易に利用可能である。また数人のドナーから新たに得た細胞をプールすることにより測定変動を減少させるか、またはこの目的のために低温保存細胞のバンクを作る可能性もある。トランスフェクションした細胞株：ＢＨＫまたはマウスｐｒｏＢ細胞株Ｂａｆ／３のような細胞株は、その細胞株が持たない、ヒト幹細胞因子受容体のようなコロニー刺激因子受容体によりトランスフェクシヨンすることができる。これらのトランスフェクションした細胞株は、トランスフェクションした受容体のリガンドの活性を求めるために使用することができる。例１配列再編成幹細胞因子リガンドをコードする遺伝子は、本明細書に記載される方法のいずれか１つにより、または当業者に公知の他の組換え方法により作成することができる。この例の目的のための置換の部位は、幹細胞因子の残基９２（Ｇｌｕ）と９３（Ａｓｎ）の間である。この例では、新しいＮ末端と新しいＣ末端は、元の末端をつなぐリンカーなしで作られる。これは、方法IIに記載されるように、２Ｔ程のＰＣＲと平滑末端連結で行われる。第１のＰＣＲ工程では、鋳型として配列番号：４６のＤＮＡ配列、およびプライマー「新しい開始点」と「平滑開始点」を含有するベクターを使用して、新しいＮ末端をコードするＤＮＡ断片を作成する。この断片は「断片開始点」と命名される。新しい開始点プライマー中の下線を付した配列は、ＮｃｏＩ制限部位である。新しい開始点プライマー＝ｃｇｃｇｃＣＣＡＴＧＧＡＣＡＡＣＴＣＡＴＣＴＡＡＧＧＡＴ配列番号：８３平滑開始点プライマー＝ＧＣＴＧＣＡＡＣＡＧＧＧＧＧ配列番号：８４第２のＰＣＲ工程では、鋳型として配列番号：１２０のＤＮＡ配列、およびプライマー「新しい終止点」と「平滑終止点」を含有するベクターを使用して、新しいＣ末端をコードするＤＮＡ断片を作成する。この断片は「断片終止点」と命名される。新しい終止点プライマー中の下線を付した配列は、Ｈｉｎｄ III制限部位である。新しい終止点プライマー＝ｃｇｃｇｃＡＡＧＣＴＴＡＴＴＡＴＴＴＣＴＴＴＧＡＣＧＣＡＣＴＣＣＡＣＡＡＧＧＴＣＡＴＣ列番号：８５平滑末端プライマー＝ＡＡＧＧＧＡＴＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＣＧＴ列番号：８６連結工程では、２回のＰＣＲ反応で作成される２つの断片は一緒に連結し、ＮｃｏＩとＨｉｎｄ IIIで消化して、発現ベクターにクローン化する。クローンは、制限解析によりスクリーニングして、ＤＮＡは配列決定して正しい配列を確認する。プライマーは、他の発現ベクターにクローン化するためにＮｃｏＩとＨｉｎｄ III以外の制限部位を作成するように設計することができる。例２本発明の配列再編成幹細胞因子受容体アゴニストは、本明細書に記載される方法、または当業者に公知の他の測定法により、生物活性について測定することができる。変種遺伝子の作成、組換えタンパク質発現、タンパク質精製、タンパク質性状解析、生物学的活性測定のためのさらなる方法は、ＷＯ９４／１２６３９、ＷＯ９４／１２６３８、ＷＯ９５／２０９７６、ＷＯ９５／２１１９７、ＷＯ９５／２０９７７、ＷＯ９５／２１２５４およびＷＯ９６／２３８８８に見い出すことができるが、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に引用される全ての参考文献、特許または出願は、その全体が本明細書に記載されているかのように参照により本明細書に組み込まれる。種々の他の例は、本発明の開示を読んだ後に、本明細書の精神と範囲から逸脱することなく当業者には明らかであろう。全てのそのような他の例は、添付した請求の範囲に含まれることが意図されている。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年１２月２日（１９９８．１２．２）【補正内容】請求の範囲１．ヒト幹細胞因子受容体アゴニストポリペプチドであって、式：［式中、場合により１〜２３アミノ酸は、該幹細胞因子受容体アゴニストポリペプチドのＣ末端から欠失させることができ；配列番号：１の配列のＮ末端は、直接、またはＮ末端をＣ末端につなぐことができるリンカーにより、配列番号：１の配列のＣ末端にまたは１〜２３アミノ酸が欠失した配列番号：１のＣ末端に連結され、かつ該幹細胞因子受容体アゴニストポリペプチドは、それぞれアミノ酸：に新しいＣ末端とＮ末端を有し；そして該幹細胞因子受容体アゴニストポリペプチドは、場合により直前に（メチオニン^-1）、（アラニン^-1）または（メチオニン^-2、アラニン^-1）が置かれる］の修飾幹細胞因子アミノ酸配列を含んでなる、上記ポリペプチド。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 31/00 48/00 35/00 Ａ６１Ｐ 31/00 37/02 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 37/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ０７Ｋ 14/47 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 37/24 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者フェン，イーキンアメリカ合衆国63130 ミズーリ州セントルイス，ミッションコート 423

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒト幹細胞因子受容体アゴニストポリペプチドであって、式：［式中、場合により１〜２３アミノ酸は、該幹細胞因子受容体アゴニストポリペプチドのＣ末端から欠失させることができ；Ｎ末端は、直接、またはＮ末端をＣ末端につなぐことができかつそれぞれアミノ酸：に新しいＣ末端とＮ末端を有することができるリンカーによりＣ末端に連結され；そして該幹細胞因子受容体アゴニストポリペプチドは、場合により直前に(メチオニン^-1)、（アラニン^-1）または（メチオニン^-2、アラニン^-1）が置かれる］の修飾幹細胞因子アミノ酸配列を含んでなる、上記ポリペプチド。２．該リンカーは、よりなる群から選択される、請求の範囲第１項に記載の幹細胞因子受容体アゴニストポリペプチド。３．配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５および配列番号：３６よりなる群から選択される、請求の範囲第１項に記載の幹細胞因子受容体アゴニストポリペプチド。４．配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：２３および配列番号：２４よりなる群から選択される、請求の範囲第３項に記載の幹細胞因子受容体アゴニストポリペプチド。５．請求の範囲第１項に記載の幹細胞因子受容体アゴニストポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んでなる、核酸分子。６．請求の範囲第２項に記載の幹細胞因子受容体アゴニストポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んでなる、核酸分子。７．請求の範囲第３項に記載の幹細胞因子受容体アゴニストポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んでなる、核酸分子。８．請求の範囲第４項に記載の幹細胞因子受容体アゴニストポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んでなる、核酸分子。９．請求の範囲第５、６、７または８項に記載の該核酸分子を含む複製可能なベクターで形質転換またはトランスフェクションした宿主細胞を、該幹細胞因子受容体アゴニストポリペプチドを発現させることができる方法で、適切な栄養条件下で、増殖させ、そして該幹細胞因子受容体アゴニストポリペプチドを回収すことを含んでなる、幹細胞因子受容体アゴニストポリペプチドの製造方法。１０．請求の範囲第１、２、３または４項に記載の幹細胞因子受容体アゴニストポリペプチド、および薬剤学的に許容される担体を含んでなる組成物。１１．請求の範囲第１、２、３または４項に記載の幹細胞因子受容体アゴニストポリペプチド；コロニー刺激因子、サイトカイン、リンホカイン、インターロイキン、および造血系増殖因子よりなる群から選択される、因子；および薬剤学的に許容される担体、を含んでなる組成物。１２．因子は、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ｃ−ｍｐｌリガンド、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ− １５、ＬＩＦ、ｆｌｔ３／ｆｌｋ２リガンド、ヒト成長ホルモン、Ｂ細胞増殖因子、Ｂ細胞分化因子、ＥＰＯ、および好酸球分化因子；ＩＬ−３変種、融合タンパク質、Ｇ−ＣＳＦ受容体アゴニスト、ｃ−ｍｐｌ受容体アゴニスト、ＩＬ−３受容体アゴニスト、多機能性受容体アゴニスト；および薬剤学的に許容される担体よりなる群から選択される、請求の範囲第１１項に記載の組成物。１３．請求の範囲第１、２、３または４項に記載の幹細胞因子受容体アゴニストポリペプチドを該患者に投与する工程を含んでなる、患者の造血細胞の産生を刺激する方法。１４．造血細胞の選択的エクスビボ拡張のための方法であって、（ａ）請求の範囲第１、２、３または４項に記載のポリペプチドを含む培地中で該造血細胞を培養し；そして（ｂ）該培養細胞を採取する、工程を含んでなる、上記方法。１５．造血細胞の選択的エクスビボ拡張のための方法であって、（ａ）他の細胞から該造血細胞を分離し；（ｂ）請求の範囲第１、２、３または４項に記載のポリペプチドを含む培地で該分離造血細胞を培養し；そして（ｃ）該培養細胞を採取する、工程を含んでなる、上記方法。１６．造血系疾患を有する患者の治療方法であって、（ａ）該患者から造血細胞を取り出し；（ｂ）請求の範囲第１、２、３または４項に記載のポリペプチドを含む培地中で該造血細胞を培養し；（ｃ）該培養細胞を採取し；そして（ｄ）該培養細胞を該患者に移植する、工程を含んでなる、上記方法。１７．造血系疾患を有する患者の治療方法であって、（ａ）該患者から造血細胞を取り出し；（ｂ）造血細胞を他の細胞から分離し；（ｃ）請求の範囲第１、２、３または４項に記載のポリペプチドを含む培地中で該分離造血細胞を培養し；（ｄ）該培養細胞を採取し；そして（ｅ）該培養細胞を該患者に移植する、工程を含んでなる、上記方法。１８．ヒト遺伝子治療の方法であって、（ａ）患者から造血細胞を取り出し；（ｂ）請求の範囲第１、２、３または４項に記載の造血タンパク質を含む培地で該造血細胞を培養し；（ｃ）該培養細胞にＤＮＡを導入し；（ｄ）該形質導入細胞を採取し；そして（ｅ）該形質導入細胞を該患者に移植する、工程を含んでなる、上記方法。１９．ヒト遺伝子治療の方法であって、（ａ）患者から造血細胞を取り出し；（ｂ）該造血細胞を他の細胞から分離し；（ｃ）請求の範囲第１、２、３または４項に記載の造血タンパク質を含む培地中で該分離造血細胞を培養し；（ｄ）該培養細胞にＤＮＡを形質導入し；（ｅ）該形質導入細胞を採取し；そして（ｆ）該形質導入細胞を該患者に移植する、工程を含んでなる、上記方法。２０．該造血細胞は末梢血から単離される、請求の範囲第１５項に記載の方法。２１．該造血細胞は末梢血から単離される、請求の範囲第１６項に記載の方法。２２．該造血細胞は末梢血から単離される、請求の範囲第１７項に記載の方法。２３．該造血細胞は末梢血から単離される、請求の範囲第１８項に記載の方法。２４．該造血細胞は末梢血から単離される、請求の範囲第１９項に記載の方法。２５．樹状細胞の産生のための方法であって、ａ）造血始原細胞またはＣＤ３４＋細胞を他の細胞から分離し；そしてｂ）請求の範囲第１、２、３または４項に記載の幹細胞因子受容体アゴニストを含む増殖培地中で該造血始原細胞またはＣＤ３４＋細胞を培養する、工程を含んでなる、上記方法。２６．さらに、ｃ）該培養造血始原細胞またはＣＤ３４＋細胞に抗原を適用する、工程を含んでなる、請求の範囲第２５項に記載の方法。２７．該増殖培地は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、融合タンパク質、および多機能性受容体アゴニストよりなる群から選択される、１つまたはそれ以上の因子をさらに含んでなる、請求の範囲第２５または２６項に記載の方法。２８．該増殖培地は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、融合タンパク質、および多機能性受容体アゴニストよりなる群から選択される、１つまたはそれ以上の因子をさらに含んでなる、請求の範囲第２６項に記載の方法。２９．腫瘍、感染症または自己免疫疾患を有するヒトを治療するための方法であって、請求の範囲第１、２、３または４項に記載の幹細胞因子受容体アゴニストを該ヒトに投与する工程を含んでなる、上記方法。３０．ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、融合タンパク質、および多機能性受容体アゴニストよりなる群から選択される、１つまたはそれ以上の因子を投与することをさらに含んでなる、請求の範囲第２９項に記載の方法。３１．抗原を該患者に投与する工程をさらに含んでなる、請求の範囲第２９項に記載の方法。３２．抗原を該患者に投与する工程をさらに含んでなる、請求の範囲第３０項に記載の方法。３３．腫瘍、感染症または自己免疫疾患を有するヒトを治療するための方法であって、ａ）請求の範囲第１、２、３または４項に記載の幹細胞因子受容体アゴニストを該ヒトに投与することにより、樹状細胞始原細胞または成熟樹状細胞を動員し；ｂ）血液掃引またはフェレーシスにより、該樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞を取り出し；ｃ）該樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞に抗原を適用し；そしてｄ）該抗原を適用した樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞を該ヒトに戻す、工程を含んでなる、上記方法。３４．工程ａ）において、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、融合タンパク質、および多機能性受容体アゴニストよりなる群から選択される１つまたはそれ以上の因子を投与することをさらに含んでなる、請求の範囲第３３項に記載の方法。３５．工程ｂ）からの該樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞を、該樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞に抗原を適用する前に、請求の範囲第１、２、３または４項に記載の幹細胞因子受容体アゴニストを含んでなる増殖培地で培養する工程をさらに含んでなる、請求の範囲第３３項に記載の方法。３６．工程ｂ）からの該樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞を、該樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞に抗原を適用する前に、請求の範囲第１、２、３または４項に記載の幹細胞因子受容体アゴニストを含んでなる増殖培地で培養する工程をさらに含んでなる、請求の範囲第３４項に記載の方法。３７．該増殖培地は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、融合タンパク質、および多機能性受容体アゴニストよりなる群から選択される１つまたはそれ以上の因子をさらに含んでなる、請求の範囲第３５項に記載の方法。３８．腫瘍、感染症または自己免疫疾患を有するヒトを治療するための方法であって、ａ）血液掃引またはフェレーシスにより、該ヒトから造血始原細胞またはＣＤ３４＋細胞を取り出し；ｂ）該造血始原細胞またはＣＤ３４＋細胞を、請求の範囲第１、２、３または４項に記載の幹細胞因子受容体アゴニストを含む増殖培地で培養して、樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞を産生させ；ｃ）該樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞を該ヒトに戻す、工程を含んでなる、上記方法。３９．腫瘍、感染症または自己免疫疾患を有するヒトを治療するための方法であって、ａ）血液掃引またはフェレーシスにより、該患者から造血始原細胞またはＣＤ３４＋細胞を取り出し；ｂ）該造血始原細胞またはＣＤ３４＋細胞を、請求の範囲第１、２、３または４項に記載の幹細胞因子受容体アゴニストを含む増殖培地で培養して、樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞を産生させ；ｃ）該樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞に抗原を適用し；そしてｄ）該抗原適用樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞を該ヒトに戻す、工程を含んでなる、上記方法。４０．培養の前に、他の細胞から該造血始原細胞またはＣＤ３４＋細胞を分離する工程をさらに含んでなる、請求の範囲第３８項に記載の方法。４１．培養の前に、他の細胞から該造血始原細胞またはＣＤ３４＋細胞を分離する工程をさらに含んでなる、請求の範囲第３８項に記載の方法。４２．該増殖培地は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、融合タンパク質、および多機能性受容体アゴニストよりなる群から選択される１つまたはそれ以上の因子をさらに含んでなる、請求の範囲第３８項に記載の方法。４３．該増殖培地は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、融合タンパク質、および多機能性受容体アゴニストよりなる群から選択される１つまたはそれ以上の因子をさらに含んでなる、請求の範囲第３９項に記載の方法。４４．該増殖培地は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、融合タンパク質、および多機能性受容体アゴニストよりなる群から選択される１つまたはそれ以上の因子をさらに含んでなる、請求の範囲第４０項に記載の方法。４５．該増殖培地は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、融合タンパク質、および多機能性受容体アゴニストよりなる群から選択される１つまたはそれ以上の因子をさらに含んでなる、請求の範囲第４１項に記載の方法。