CZ414191A3 - Human interleukin-4 - Google Patents

Description

Tento vynález se týká proteinových, a muteinových faktorů lidského imunitního systému a nukleových kyselin, které je kódují. Tento vynález se konkrétně týká proteinových a muteinových faktorů (spolu s nukleovými kyselinami, které je kódují), které vykazují aktivitu jak jako růstový faktor T buněk tak jako růstový faktor B-buněk.

Dosavadní stav techniky

Technologií rekombinantní DNA se obvykle rozumí technika integrace genetické informace ze zdroje dárce do vektorů pro následné opracování (procesí), jako je například zavedení do hostitele, čímž še přenesená genetická informace kopíruje a/nebo dochází k expresi v novém prostředí. Obecně existuje genetická informace ve formě komplementární DNA (cDNA) odvozené od informační SNA (mRNA) kódující žádaný proteinový produkt. Nosičem je často plasmid, který má schopnost inkorporovat cDNA pro pozdější replikaci v hostiteli a v některých případech skutečně regulovat expresi oDNA a tím řídit syntézu kódovaného produktu v hotiteli.

Je známo, že imunitní odpověč savců je založena na sérii složitých buněčných interakcí, které se nazývají imunitní sít?’. Nedávné výzkumy přinesly nové pohledy na vnitřní práci této sítě. I když je jasné, že mnoho z odpovědí souvisí se sítí-podobnými interakcemi lymfocytů, mar^ofágů, granulocytů a jiných buněk, imunologové se nyní obvykle přidržují názoru, že rozpustné proteiny (například tak zvané lymfokiny nebo monokiny) hrají rozhodující úlohu při regulaci těchto buněčných interakcí. Existuje tedy značný zájem i isolaci, charakterizaci a mechanismus působení buněčných modulačních faktorů. Jejich porozumění by mělo přinést průlom do diagnosy a terapie ciS?obných stavů.

Lymfokiny zřejmě zprostředkovávájí buněčné akřivíty ráznými způsoby. Bylo ukázáno, že podporují proliferaci, růst a diferenciaci pluripotenciálních hernatopoletických, kmenových buněk v obrovském množství progsnitorů sestavených do různých buněčných linií zodpovědných za imunitní odpověo. Tyto linie často odpovídají různým způsobem, jestliže se lymfokiny používají ve spojení s jinými činidly.

Linie buněk, které jsou zvláště důležité pro imunitní odpověď, zahrnují dvě třídy lymfocytů: B-buňky, které mohou produkovat a áekretovat imunoglobuliny (proteiny se schopností rozeznávat a vázat cizí látku, aby ji bylo možno odstranit) a T-buňky různých podřad, které sekretují lymfo- . kiny a indukují nebo potlačují B-buňky a některé další buňky (včetně jiných T-buněk), čímž se vytváří imunitní síň.

Jinou důležitou buněčnou linií je žirná buňka (která nebyla positivně identifikována u všech savčích druhů) ·

- granule obsahující spojovací tkáňová buňka umístěná bezprostředně vedle kapilár v celém těle, ve zvláště vysokých koncentracích v plicích, kůži a v gastrointestinální a v genitourinárním •faktu, žirné buňky hrají hlavní roli v poruchách souvisejících s alergií’, zvláště anafylaxí: jestliže vybrané antigeny zesíňují jednu třídu imunoglobulinů navázaných na receptory na povrchu žirné buňky, tato žirná buňka degranuluje a uvolňuje mediátory (například histamin, serotonin, heparin, prostaglandiny atd.), které způsobují alergické reakce, například anafylaxí.

Při výzkumu směřujícímu k lepšímu pochopení (a tedy potenciální terapeutické léčbě) různých imunitních poruch překáží obecná neschopnost uchovávat buňky imunitního systému in vitro. Imunologové objevili^ že kultivování těchto buněk lze dosáhnout s použitím supernatantů T-buněk a jiných buněk, které obsahují růstové faktory, jako jsou například některé lymfokiny.

Detekce, isolace a čištění faktorů, jako jsou napři03 žná a je často komplikována povahox ?: -i *\.> -. — n · · «r ' ~ --zkříženými aktivitami různých, složek ve směsích, citlivostí (nebo nedostatkem citlivosti) analýz, které se používají pro stanovení faktorů, častými podobnostmi v molekulových hmotách a jinými vlastnostmi faktorů, a velmi nízkou koncentrací faktorů v jejich přírodním prostředí.

Jak se stává dostupnými stále více lymfokinů, primárně molekulárním klonováním, zvýšil se zájem o nalezení klinických aplikací pro tyto lymfokiny. Díky své fysiologické podobnosti s hormony (například rozpustné faktory, růstové mediátory, působení prostřednictvím receptorů buněk) je popenciální používání lymfokinů analogické běžnému používání hormonů, například: Dexter: Nátuře 321, 198 (1936). Jednou možností je, že hladiny lymfokinů u pacienta lze přímo nebo nepřímo upravovat tak, aby tyto úpravy přinesly prospěšné imunitní odpovědi, například potlačení zánětu, alergie nebo odmítání tkáně nebo stimulaci nebo zvýšení potence proti infekci nebo proti malignímu růstu. Mezi další potenciální klinická použití lymfokinů patří uchovávání a expandování in vitro populace jistých buněk imunitního systému od jedné osoby pro případné zpětné zavedení do stejné nebo do jiné osoby, aby se tak dosáhlo prospěšného účinku. Například se běžně provádějí výzkumy, kterými se zjišňuje, jestli populace lymfokinem aktivovaných zabxjeoích T-buňěk (zabiječů) pacienta mohou být expandovány mimo jeho nebo její tělo a potom zpětně injekcí vneseny tak, aby se dosáhlo zvýšené protinádorové odpovědi. Jiným potenciálním klinickým použitím lymfokinů, zvláště faktorů stimulujících kolonie, jako je například faktor stimulující kolonii granulocyt-makrofág (Glá-CSF), a faktorů zvyšujících jejich aktivity, je stimulace generace krevních buněk, napříkla3^rjřed- nebo post-chemoterapii nebo před- či post-radiační terapii proti nádorůyi při léčení myeloidní hypoplasie nebo při léčení syndromy deficience neutrofilů ÍDexter: Nátuře 321, 198 (1986).J. Takové faktory by mohly být užitečné také při terapii transplantátem kostní dřeně, používá při léčení aplastické anemie který se stále více nebo jistých leukémií.

Existují dvě vlastnosti lymfokinů, které mají důležitý důsledek při takových klinických aplikacích: jednotlivé lymfokiny jsou často pleiotropní; biologické účinky jednoho lymfokinu lze obvykle modulovat alespoň jedním jiným lymfokinem, bua inhibici nebo zesílením. Například nádorový nekúSrický faktor, který vykazuje synergismus s gama-interferonem, stimuluje produkci interleukinu-1 (IL-1) a může aktivovat fagocytovou aktivitu neutrofilů. L-l, protein produkovaný aktivovanými makrofágy, zprostředkovává rozmanité biologické aktivity včetně stimulace proéerace thg^ocytů indukcí uvolňování interleukinu-2 (IL-2), stimulace maturace a prolifeřace B-lymfocytú, aktivity fibroblastového růstového faktoru a indukce syntézy proteinů v akutní fázi hepatocyty. 0 IL-1 bylo také popsáno, že stimuluje uvolňování prostaglandinu a kolagenasy ze synoviálních buněk a že je identický s endogenním pyrogenem: Krampschmidt: J. Leuk. Biol. $6, $41 až $55 (1984).

Interleukin-2, dříve označovaný jako růstový faktor T-buněk, je lymfokin, který je produkován T-buňkami, které jsou aktivovány lektinem nebo antigenem. Mezi popsané biologické aktivity IL-2 patří stimulace dlouhodobého in vitro růstu klonů aktivovaných T-buněk, zvýšení mitogenese thymocytů a indukce reaktivity cytotoxických T-buněk a odpovědí plaky tvořících buněk v kulturách buněk ze sleziny nahých myší. Navíc bylo ukázáno, že podobně jako interferony (IEN) IL-2 zvyšuje aktivitu přirozených zabiječů, z čehož vyplývá možnost potenciálního použití při léčení nádorových onemocnění: Henney a spol.: Nátuře 291, $35 sž $$8 (1981). V této terapii již byly popsány některé úspěchy, např. Lotze a Rosenberg: Treatment of Tumor Patients with Purified Euman Interleukin-2, strany 711 až 719 v publikaci Sorga a spol. (red.): Cellular and Molecular Biology of Lymphokines” (Academie Press, lne., New York, 1985) a Rosenberg a Lotze: Cancer Immunotherapy Using Interleukin-2 and Interleukin-2-Activated Lymphocytes, Ann. Rev. Immunol. 4, 681 až /0$ (1930). Avšak ΰοχίοΐι lze použít u pacientů trpících nádorovým onemocněním), ktc rým. o.y ca ucsunxo vynounocux teciiuo v^ssuiiucui · xvuZc a Rosenberg, strany 711 e.ž 71$ a Welte a spol.: strany 755 až 759 ve shora uvedené citaci Sorgs a spol.(red.)·

Metcalf D. :The Hematopoietic Colony Stimulating Factors (Elsevier, Masterdam, 1984) poskytuje přehled výzkumu týkajícího se lymfokinů z různých faktorů, které spadají do imunitní odpovědi savců. Yung Y. P. a spol.: J. Immunol. 122, 794 (1931) popisuje částečně čištění proteinu o molekulové hmotě 55 000,který vykazuje aktivitu růstové/xaktoru žirných buněk (MCGF) a jeho oddělení od interleukinu-2 (IL-2), také známého jako růstový faktor T-buněk. Nabel G, a spol. (Nátuře 291, 552 (1981).) popisují MCGF s molekulovou hmotou asi 45 000 a s pí asi 6,0. Clark-Lev/is I. a Schrader J. (J. Immunol. 127, 1941 (1981).) popisují protein s aktivitou růstového faktoru podobající se MCGF aktivitě o molekulové hmotě asi 29 000 ve fosforečnanem pufrovaném solném roztoku a asi 25 000 v 6M hydrochloridu guanidinu s pí asi 4 až 8, ale š pí’asi 6 až 8 po zpracování s neuraminidasou. Myší IL-2 a interleukin-5 (IL-5) byly částečně charakterizovány biochemicky Gillisem S. a spol.: J. # Immunol. 124, 1954 až 1962 (1980) a Ihlem J. a spol.: J. Immunol. 129 , 2451 až 2456 (1982); IL-2 měl zdánlivou molekulovou hmotu (možná jako dimer) asi 50 000 až 55 000, IL-5 měl molekulovou hmotu asi 28 000. Lidský IL-2 má zdánlivou molekulovou hmotu asi 15 000 a byl popsán Gillisem S. a spol. (Imrnun. Rev. 65, 167 až 209 (1982).). Srovnání aktivit IL-5 a MCGF supernatantů T-buněk bylo popsáno Yungem Y. a spol.: Contemp. Top. Mol. Immunol. 10, 147 až 179 (1985) a Rennickem D. a spol.: J. Immunol. 154, '910 až 919 (1985).

Existuje rozsáhlá literatura týkající se regulace růstu 3-buněk a diferenciace rozpustnými faktory: pro přehled viz například Howard a Paul: ánn. Rev. Immunol. 1, 507 až 555 (1985)t Hov/ard a spol.: Immunol. Rev. 73, 1^5 až 210 (1934), Kishimoto a spol.: Immunol. Rev. 73, 97 až 118 (1$ a Kishimoto: Ann. Rev. Immunol. 3.» 1>3 ač 1>7 <1985). Existuji jisté zmatky kolem nomenklatury používané pro značení různých, faktorů, které vyplývají z toho, že se používají různé výchozí materiály, z obtíží při čištění a z rozdílů v analýzách používaných pro definování jejich biologických aktivit. V některých případech bylo v otázkách nomenklatury dosaženo dohody: Paul: Immunology Today 4,

322 CI933) a Paul: Molecular Immunol. 21, 343 (1984).

Aktivita růstové faktoru B-buněk (BCGF) je charakterizována schopností vyvolat syntézu DNA v B-buňkách, které jsou současně stimulovány vystavením působení anti-IgM nebo podobných antigenů. Předpokládá se, že interleukin-1 (IL-1) je zapotřebí také pro to, aby došlo k projevu BCGF· aktivity, alespoň tehdy, jestliže se analýza provádí s nízkými hustotami B-buněk. Pro lidský BCGF jsou popsány také jiné analýzy, například Maizel a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. 80, 5047 až 5051 (1983) (podpora dlouhotrvajícího růstu lidských B-buněk v’kultuře). Aktivita, která souvisí s dřívější analýzou, byla označena také jako aktivita stimulujícího faktoru -1 B-buněk (BSF-1) a BCGF I, aby se odlišovaly od podobných a/nebo souvisejících aktivit. Podobně byla popsána aktivita označená BCGF II. Je charakterizována schopností vyvo/sfsyntézu DNA v B-buňkách, které jsou stimulovány mitogenem nebo v transformovaných liniích B-buněk. Mezi mitogeny, které souvisejí s BCGF II aktivitou, patří dextran-sulfát, lipopolysacharid a extrakty Staphylocoocus. BCGF I v těchto testech neregistruje žádnou odpověň. U lidí sd předpokládá, že BCGF II je molekula s molekulovou hmotou asi 50 000 a že působí synergicky s BCGF I (tj. BSF-1) při podpoře proliferace B-buněk v imunitní odpovědi: Yoshizaka a spol.:

J. Immunol. 130. 1241 až 1246 (1983)· Howard a spol.:

J. Exp. Med. 155. 91¼ až 923 (1982) byli první, kteří ukázali existenci mršího BCGF (později byl nazýván různě:

BCGF I, BSF-1 nebo indukční faktor IgGj) rozdílného od interleukinu-2. Podobná pozorování byla popsána téměř současně pro lidský systém Yoshizakim a spol.: J. Immunol.

123, 1296 až I3OI (1982) a později Okadou a spol.: J. Exp. Med. 157, 583 až 590 (1983).

.o.:

;

vy tesu jí BCGF	(nebo	BSF-1) aktivitu	cd těchto
stále stoupá.		2 sool. (Proč.	' «t- *1 A Λ r* w h- » O
5993 až 6002 (	;iss2).	) popsali na try	psin citl

pr vnicn o o 3 evú — Q

BCGF s molekulovou hmotou 12 000 až 13 000 a s isoelektrickým bodem (pí) asi 6,3 až 6,6. Farrar a spol. (J. Immunol. 131, 1338 až 134-2 (1983).) popsali částečné čištění heterogenního myšího BCGF s molekulovými hmotami 11 000 a 15 θθθ (podle

SDS-PAGE) s pí 6,4- až 8,7. Ohara a Psul (Nátuře 315. 333 až 335 (1935).) popisují monoklonální protilátku specifickou pro myší BSF-1. Pro BSF-1 uvádějí molekulové hmoty 14- 000 a 19 000 až 20 000 s pí 6,7. Butler a spol. (J. Immunol.

135, 251 až 255 (1984-).) popisují lidský BCGF o molekulové hmotě 18 000 až 20 000 s pí 6,3 až 6,6. Rubis a spol. (Proč. Nati. Acad. Sci. 82, 2935 až 2939 (1935)·) popisuje, žé predinkubace klidových B-buněk s BSF-1 před vystavením působeni anti-IgM protilátek zvyšuje buněčný objem a později zrychluje vstup do S-fáze po vystavení působení anti-IgM protilátek. Vitetta s pol. (J. Exp. Med. 162, 1726 až 1731 (1935)·) popisuje částečné čištění myších BSF-1-supernatantů EL-4 buněk neobsahujících sérum HPLC na obrácených fázích. Podle SDS-PAGE má protein molekulovou hmotu asi 20 000 až 22 000. Ohara a spol. (J. Immunol. 130» 2513 až 2523 (1985)·) také popisuji částečné čištěni myšího BSF1 podobným postupem a současně uvádějí, že faktor je proteinem o molekulové hmotě asi 13 000 až 21 700. Sideras a spol. (Eur. J. Immunol. 15,

586 až 593 a 593 až 598 (1935) popisuji částečné čištění myšího IgG^-indukujícího faktoru, tj. BSF-1, a uvádějí, že faktor je proteinem o molekulové hmotě asi 20 000 s pí 7,2 až 7,4- a 6,2 až 6,4-. Smith a Rennick (Proč. Nati. Acad. Sci. 83« 1357 až 1361 (1986).) popisují dělení faktoru od IL-2 a IL-3, který vykazuje aktivitu růstového faktoru T buněk a aktivitu rnstového faktoru žirných buněk. Později No^ma a spcuL· (Nátuře 319, 64-0 až 64-6 (1936).) klonovali a sekvenovali nukleovou kyselinu kódující faktor podle Siderase a spol. a Lee a spol. (Proč. Nati. Acad. Sci, 33, 2061 až 2065 (1936).) klonovali a sekvenovali nukleovou kyselinu kódující fakt o Med.

r podle Smitha a Rennicka. Nedávno Grabstein 163, 14-05 až 14-14- (1936).) popsali čištění a srno

BSF-1 (J. Exp. sekvenování

MLlancse a spol. (Science 231, 1113 až 1122 (1936).) popisuje lymfokin, který se nepodobá i a ircery provisorně označili inrorem o .skulov knote 10 000 až 12 000, který je vylučován pomocnými T buňkami po zesilováni T3-Ti reoeptorů. Stimuluje klidové lymfocyty interakcí s Til receptory a následující indukcí receptorů interleukinu-2 (IL-2).

Sanderson a spol_e (Proč. Nati. Acad. Sci. 83, 437 až 440 (1986).) navrhli pojmenovat eosinofilní diferenciální faktor interleukin 4 na základě důkazu, že je zřejmě shodný s růstovým faktorem II B buněk·

Z předcházejícího je zřejmé, že objev a vývoj nových lymfokinů by mohl přispět k rozvoji terapií pro široký' rozsah degeneracních stavů, které přímo nebo nepřímo zahrnují imunitní systém a/nebo hernatopoietické buňky. Objev a vývoj lymfokinů, které zvyšují potenciál příznivých aktivit známých lymfokinů, by byl velice výhodný· Například dávku omezující toxicita IL-2 při léšení nádoru by mohla být snížena tím, kdyby byly dostupné lymfokiny nebo kofaktory se zesilujícími účinky. Nebo by bylo možné zvýšit účinnost transplantátů kostní dřeně, kdyby byly dostupné’faktory, které by zesilovaly aktivitu faktorů stimulujících kolonie.

Podstata vynálezu

Tento vynález se týká lidského interleukinu-4 (IL-4). Tento vynález zahrnuje nukleové kyseliny, které kódují polypeptidy vykazující IL-4 aktivitu, tyto peptidy samotné a způsoby jejich výroby. Nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu jsou definovány 1) jejich homologií s klonovanými komplementárními DNA (cDNA) sekvencemi popsanými zde a 2) funkčními analýzami IL-4 aktivity polypeptidů kódovaných těmito nukleovými kyselinami. Pojem ”IL-4 aktivita'tak, jak je zde používán u proteinu nebo polypeptidů, znamená, že protein nebo polypeptid vykazuje jak aktivitu růstového faktoru B buněk (BCGP aktivitu) tak aktivitu růstového faktoru T buněk (TCG? aktivitu). IL-4 aktivita ^stanovuje druhové-spe— o.

IDu. ‘4TÍ.' cnai.ysanL· uoz zcto oucie cta^ ! ZI--- Ί “f vysvětleno, specifická uspořádání IL-4 mohou být dále ciiarak terizováns dalšími analýzami. Například některé formy lidské ho IL-4 zesilují aktivitu TCGP IL-2, některé formy lidského IL-4 zesilují GM-CSF stimulovanou proliferaei jistých typů buněk, některé formy lidského IL-2 mohou indukovat expresi Fc-epsilon receptoru v B buňkách a některé formy lidského IL-4 mohou indukovat expresi MHC (Major compatibility complex) v B buňkách: třída II DR antigenu v lidských B buňkách a la antigenu v myších B buňkách.

Tento vynález je založen zčásti na objevu a klonování cDRA, které jsou schopny expresí poskytovat proteiny s IL-4 aktivitou. Mezi cDRA klony podle tohoto vynálezu patří lidské cDRA inserty plasmidových vektorů “klon 46” (také zde označovaný jako pcD-2Fl-13 nebo pcD-465 a “kloň 125” (také zde označovaný jako pcL-125). Jiným zajímavým klonem je cDRA insert plasmidového vektoru pcD-2A-E2. Tyto třřVektory jsou uloženy v American Type Culture Collection (ATCC), Rockville Md., pod ATCC číslem 53 337, 67 029 a 53 330.

Tento vynález se týká nukleových kyselin s nukleotidovými sekvencemi, které jsou efektivně homologní s cDRA klony podle tohoto vynálezu a které expresí poskytují 'IL-4 aktivitu. Rukleové kyseliny a proteiny podle tohoto vynálezu mohou být odvozeny od shora uvedených cDRA standardními těch nikami mutace sekvencí nukleových kyselin. Mohou se připravovat de novo z buněčných linií odvozených od imunitního systému, jako jsou například hybridomy T buněk, které obsahují nebo mohou být indukovány tak, aby obsahovaly sekvence informační RRA (mRRA) kódující IL-4. Mohou se získávat sondováním DITA nebo SRA extraktů nebo bank sondami odcizenými od cDRA klonů podle tohoto vynálezu.

Pojem “efektivně homologní“ tak, jak je zde používán, znamená, že sekvence nukleotidů'je schopna být detegována hybridizační sondou odvozenou od cDRA klonu podle tohoto vynálezu. Přesné číselné vyjádření homologie nutné pro detekci nukleových kyselin kódujících IL-4 aktivitu závisí na něko10 lika faktorech, mezi než patří: 1) homologie. sondy s ne—II—4 hodujícími sekvencemi asociovanými s cílovými nukleovými kyselinami, důrsznost hybridizečních podmínek, 5) skutečnosti, zds se používají jednovláknové nebo dvouvláknové sondy, 4) skutečnosti, zda se používají sondy H3A nebo DHA, 5) velikosti redukce nespecifické vazby sondy, 6) povahy markéru, který se používá pro detekci sondy, 7) frakce guanidinových s cytosinových basí v sondě, 3) distribuce chybných párování mezi sondou a cílem, 9) velikosti sondy apod.

Efektivně homologní sonda odvozená od cDUA podle tohoto vynálezu je s výhodou alespoň z 50 procent (50 %) homologní se sekvencí, která se isoluje. Efektivně homologní sonda odvozená od eDNA podle tohoto vynálezu je výhodněji alespoň ze sedmdesáti pěti až osmdesáti procent (75 až 80 %) homologní se sekvencí, která se isoluje. Efektivně homologní sonda odvozená od cDHA podle tohoto vynálezu je nejvýhodněji alespoň z devadesáti procent (90 %) homologní se sekvencí, která še isoluje.

Homologie, jak je zde tento pojem používán, znamená míru podobností mezi dvěma sekvencemi nukleotidů (nebo aminokyselin). Homologie se vyjadřuje jako zlomek nebo procento baží s ohybným párováním (nebo procento aminokyselin s chybným párováním) po tom, co'se obě sekvence (možné, že nemají stejné délky) seřadí vedle sebe. Pojem seřazení je zde používán ve smyslu podle Sankoffa a Kruskala, viz kapitola prvá v Time Warps, String Edits, and M_acromolecules: The Theory ahd Practice of Sequence Comparison (Addison-Wesley, Eeading, Ma.., 1933)· Zhruba řečeno - dvě sekvence se seřadí tak, že se maximalizuje počet baží (nebo aminokyselin) s chybným párováním mezi těmito dvěma sekvencemi s vložením minimálního počtu “prázdných nebo nulových baží v kterékoliv sekvenci tak, aby došlo k maximálnímu překryvu. Pro dané dvě sekvence jsou dostupné algoritmy pro výpočet jejich homologie: např. Needleham a Wunsch: J. Ivío4l Biol. 48, 44 5 až 455 (1970) a Sankoff a Hruskal (shora uvedená citace), strana 23 až 29· Pro provádění takových srovnání jsou dostupné také komerční služby, např. Intelligenetics, lne. (Palo Alto, Ka., USA).

Tento vynález se také týká přircásieh lidských růstový: faktorů. (polypeptidů), které vykazují široké spektrum aktivity pro různé buňky spadající do imunitní odpovědi. Způsoby přípravy takových faktorů a jejich použití pro in vivo léčení lidí je rovněž předmětem tohoto vynálezu. Tyto polypeptidové prostředky obsahují lidský faktor v podstaě v čistém stavu schopný vykazovat stimulační aktivitu na B buňky, T buňky a na žirné buňky.

Tyto faktory, které byly původně isolovány z kapaliny supernatantu různých T buněk, obsahují přírodní polypeptidy, které mají za nereduku jících podmínek molekulovou hmotu asi

000 nebo 15 000, nebo aktivní fragmenty takových polypeptídů. Tyto faktory se mohou používat samotné nebo společně s jinými sloučeninami pro různé diagnostické nebo terapeutické účely včetně přípravy specifických protilátek.

Výhodným uspořádáním podle tohoto vynálezu je řada · glykosylovaných. nebo neglykosylovaných lidských IL-4 proteinů a muteinů následujícícho obecného vzorce I :

X(His) - X(Lys) - X(Cys) - X(Asp) - X(Ile) - X(Ihr) X(Leu) - X(Sln) - X(Glu) - X(Ile) - X(Ile) - X(Lys) X(Thr) - X(Leu) - X(Asn) - X(Ser) - X(Leu) - X(Thr) X(C-lu) - X(Gln) - X(Lys) - X(Thr) - X(Leu) - X(Cys) X(Thr) - X(Glu) - X(Leu) - X(Thr) - X(V_al) - X(Thr) X(Asp) - X(Ile) - X(Phe) - X(ila) - X(Ala) - X(Ser) X(Lys) - X(Asn) - X(Thr) - X(Thr) - X(Glu) - X(Lys) X(Glu) - X(Thr) - X(PEe) - X(Cys) - X(Arg) - X(Ala) X(Ala) - X(Thr) - X(Val) - X(Leu) - X(Arg) - X(Gln) X(Phe) - X(Tyr) - X(Ser) - X(His) - X(Eis) - X(Glu) X(Lys) - X(Asp) - X(Thr) - X(Arg) - X(Oys) - X(Eeu) X(Gly) - X(Ala) - X(Thr) - X(Ala) - X(Gln) - X(Gln) X(Phe) - X(His) - X(Agr) - X(His) - X(Lys) - X(Gln) X(leu) - X(Ile) - X(Arg) - X(Phe) - X(Leu) - X(Lys) X(Arg) - X(Leu) - X(Asp) - X(Arg) - X(Asn) - X(Leu) X(Trp) - X(Gly) - X(Leu) - X(Ala) - X(Gly) - X(Leu) X(Asn) - X(Ser) - X(Oys) *· X(Pro) - X(Val) - X(lys) X(Glu) - X(Ala) - X(Asn) - X(Gln) - X(Ser) - X(Thr) X(Leu) - X(Glu) - X(Asn) - X(Phe) - X(leu) - X(Glu) -

Yfr.-vay _ ΥΓ3οτΛ _ ν/.Οο-π'ι

pině mají podstatné podobné fyzikálně-chemické vlastnosti při substituci mezi členy této skupiny, kterými se zachovává biologická funkce molekuly (Grantham: Science 185» 862 až 864 (197¼) ·)· Je zřejmé, že ve shora uvedené sekvenci lze provést inserce a delece aminokyselin aniž by došlo ke změně biologické funkce, zvláště jestliže inserce nebo delece obsahují pouze několik aminokyselin, například pod deset, a jestliže se neodstraňují nebo nenahrazují aminokyseliny, které jsou rozhodující pro funkční konformaci, například cysteinových skupin, viz např. Anfinsen: ”Principles That Govern the Folding of Protein Chains”, Science 181» 225 až 250 (1975)· Proteiny a muteiny produkované takovými delecmi a/nebo insercemi jsou v rozsahu tohoto vynálezu. Pokud je na zbytek aminokyselin proteinu obecného vzorce I odkazováno číslem, toto číslo nebo čísla jsou vztažena k N-konci proteinu.

Synonymními aminokyselinami jsou s výhodou ty aminokyseliny, které jsou uvedeny v tabulce I. Výhodnějšími aminokyselinami jsou ty aminokyseliny, které jsou v tabulce I uvedeny před druhým lomítkem v každé řádce. Ne jvýhodně jši aminokyseliny jsou ty aminokyseliny, které jsou v tabulce I uvfieny před prvním lomítkem v každé řádce.

Tabulka I

Výhodně skupiny synonymních aminokyselin aminokyselina synonymní skupina

Ser

Arg

Leu

Pro

Thr

Ser,//Thr, Gly, Asn Arg,/His, Lys,/Glu, Gin Leu, Ile, Met,/ Phe, /Val, Tyr Pro,/Ala,/Thr, Gly Thr,//Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin

	-i. C- á. JL **'J — kyselím	; p o -ir 2 c o vmj ΐ
-	Thr Ala	Thr, // Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin Ala, / Pro, / Gly, Thr
t	Val Gly	Val, / Met, Ile / Tyr, Phe, Leu, Val Gly, // Ala, Thr, Pro, Ser
	Ile	Ile, Met, Leu, /Phe, Val, / Ile, Tyr
	Phe	Phe, /Met , Tyr, Ile, Leu, /Trp , Val
	Tyr Cys His	Tyr, / Phe, / Trp, Met, Ile, Val, Leu Cys, Ser, // Thr His, / Gin, Arg, /Lys, Glu, Thr
	C-ln Asn Lys Asp	Gin, / Glu, His, / Lys, Asn, Thr, Arg Asn, / Asp, / Ser, Gin Lys, / Arg, / Glu, Gin, His Asp, / Asn, / Glu
	Glu Met	Glu, / Gin, / Asp, Lys, Asn, His, Arg Met, Ile, Leu, / Phe, Val

I- Tento vynález se týká polýpeptidů obecného vzorce I s ) Q. aminokyselinovými substitucemi (m&zi aminokyselinou přírodního lidského IL-4 a synonymní aminokyselinou) v jedné nebo ve více polohách. 'Pojem ”N-krát substituovaný” se zde používá k popsání podřady polýpeptidů obecného vzorce I, v němž jsou přírodní aminokyseliny substituovány synonymními aminokyselinami a to alespoň v N-polohách. Tak například skupina 1-krát substituovaných’ polýpeptidů obecného vzorce I sestáλ vá z 559 polýpeptidů výhodných skupin synonymních ^n^inokyselin, 139 výhodnějších 3kupin synonymních aminokyselin a 56 nejvýhodnějsich skupin synonymních aminokyselin. Tyto počty se spočítají tak, že se sečte počet aminokyselin každého druhu v přírodním řetězci a vynásobí se velikostí skupiny synonymních aminokyselin pro každou aminokyselinu. Skupina lidských IL-4 polýpeptidů s výhodou sestává z 10-krát substituovaných polýpeptidů obecného vzorce I, výhodněji sestává z 5-krát substituovaných polýpeptidů obecného vzorce I a nejvýhodněji sestává z 1-krát substituovaných polypeptidů obecného vzorce I, kterou je zvláště přírodní lidaký IÍ.-4 polyoeptid, obrázku 10 výkresů.

no;

•ΓΛ. r r*.

je ilustrované no

Podobně pojem H-krát-vložený” ve vztahu k polypeptidů obecného vzorce I sé zde používá k popsání řady polypeptidů, v níž bylo do sekvence definované obecným vzorcem I vloženo od 1 do N aminokyselin. Vložené aminokyseliny se s výhodou vyberou z výhodných skupin synonymních aminokyselin (Tabulka I) z aminokyselin obklopujících inserci, výhodněji se vyberou z výhodnějších aminokyselin (tabulka I) aminokyselin obklopujících inserci a nejvýhodněji’se vyberou z nejvýhodnějších aminokyselin (tabulka I) aminokyselin obklopujících inserci. Tak například jedna podskupina skupiny s í-krát vloženými peptidy obsahuje aminokyselinu vloženou mezi N-konec (X(His) a přilehlý X(Gly). Inserce, které jsou definovány členy této podskupiny, jsou s výhodou vybrány ze skupiny sestávající z Pro, Ala, Gly, Thr, Ser, Glu, Gin,

Arg, His a Lys, výhodněji jsou vybrány ze skupiny sestávající ž Gly,“His, Gin a Arg a nejvýhodněji jsou vybrány ze skupiny sestávající z His a Gly. Inšerce lze zavést mezi jakékoliv přilehlé aminokyseliny obecného vzorce I. Jelikož je možných 128 míst inserce a jelikož je možné provádět násobné inserce do stejného místa, pro 2-j^át vložený peptid obecného vzorce I existuje tedy 16 584· podskupin peptidů. Velikost každé podskupiny závisí na velikosti skupin ami* nokyselin synonymních s aminokyselinami ob^Lojkípující inserci.

Pojem N-krát deletovaný” ve vztahu k polypeptidům obecného vzorce I je používán*k popsání řady peptidů s 1 až N aminokyselinami deletovanými ze sekvence obecného vzorce

I. Sada 1-krát deletovaných polypeptidů obecného vzorce I tedy sestává ze 129 podskupin polypeptidů každého o délce 128 aminokyselin (128-mer). Každá z pod^supin dále sestává ze všech 123-merů definovaných výhodnými, výhodnějšími a nejvýhodnějšími skupinami synonymních aminokyselin.

Shora uvedené výhodné uspořádání podle tohoto vynálezu zahnuje sekvence nukleotidů efektivně homologních schopných kodovat polypeptidy obecného vzorce I pro výhodné, výhodnější

skupiny synonymních aminokyselin.

Tento vynález se zvláště týká přírodního lidského IL-4, sekvence aminokyselin, která je ilustrována na obrázku 1, a všech sekvencí nukleotidů, které jsou schopny ji kodovat.

Pro označování aminokyselin, nukleotidů, restrikčních endonukleas apod. jsou v tomto spisu používány standardní zkratkyj například Cohn: Nomenclature and Symbolism of α-Amino Acids” v Methodsin Enzymology” 106, 3 až 17 (1984) a Wooďa spol.: Biochemistry: A'Problems Approach, druhé vydání (Benjamin,Menlo Park, 1981) a také Eoberts:* Directory of Hestriction Endonucleases” v Methods in Enžymology 68, 27 až 40 (1979)·

Tento vynález se týká problémů, které souvisejí s použitím imunoregulačních činidel pro léčení humánních nebo veterinárních chorob. Podle tohoto vynálezu se zvláště získávají sloučeniny, které mají příznivé účinky, jestliže se používají samotné. Nebo mohou tyto sloučeniny působit společně s jinými lymfokiny a mediátory imunitního systému tak, aby se uískaly příznivé účinky.

Nyní budou popsána výhodná uspořádání tohoto vynálezu, zčásti v souvislosti s doprpovázejícími výkresy, tj. obrázky 1 až 19.

Obrázek 3A ilustruje sekvenci nukleotidů a odvozenou sekvenci aminokyselin insertu vektoru pcD-2A-E3, který expresí poskytuje myší IL-4.

Obrázek 1B ilustrujžekvenci nukleotidů a odvozenou sekvenci aminokyselin insertu vektoru pcD-125, který expresí poskytuje myší IL-4.

Obrázek 10 ilustruje sekvenci aminokyselin vyčištěného — 16 přírodního lid reci v opičích kého ±L-4, který je získáván expresí a sekbuňkách COS 7 transfektovaných pcD-125.

Obrázek 2A je mapa vektoru pcD-2 kóduje myší IL-4.

3, insertu, který

Obrázek 2B je mapa štěpení insertu vektoru pcB-2A-3E restrikčními éndonukleasami.

Obrázek 20 je mapa vektoru pcD-46, insertu, který kóduje lidský IL-4.

Obrázek 2D je mapa štěpení insertu vektoru pcD-46 restrikčními éndonukleasami.

Obrázek 3A ilustruje relativní TCGF aktivity (v závislosti na zředěni) různých kultur supernatantu včetně supernatantu z kutlury buněk COS 7 transfektovaných pcD-2A-E3 (křivka 1). ' *

Obrázek 3B ilustruje relativní MCGF aktivity (v závislosti na zředění) různých kultur supernata^ňů včetně supernatantu z kultury buněk COS 7 transfektovaných pcD-2A.E3 (křivka 1).

Obrázek 30 ilustruje relativní stupeň indukce Ia produkovaného označenými mnpžstvími supernatantu z buněk COS 7 transfektovaných pcD-2A-E3 (křivka 1), buněk Cl.Lyl⁺2“/9 (křivka 2) a planě transfektovaných buněk COS 7 (křivka 3)·

Obrázek 3D graficky ilustruje rozsah indukce IgE a IgG^ supernatanty buněk COS 7 transfektovaných pcD-2A-E3 a různých kontrol v myších slezinových buňkách bez T buněk.

Obrázek 4A ilustruje TCGF aktivity několika pcD-125 transfektovaných supernatantu a kontrol měřených analýzou kolorimetrické proliferace linie na faktoru závislých lidských pomocných T buněk, JL-EB7.

I ’aze ύ i lustruj ·:· a Car ;;oD-12 transfektovaných supernatantů a kontrol měřených analýzou kolorimetricko proliferace ?Ih»-stimulovaných periferních krevních lymfocytů.

Obrázek 40 ilustruje TCGF aktivity pcD-125 transfektovaných supernatantů a kontrol měřených inkorporací triciovaného thymidinu PHA-stimulovanými per^ierními krevními lymfocyty.

Obrázek 5A je histogram četnosti buněk v závislosti na intensitě fluorescence pro kontrolu populace stimulovaných lidských tonsilních B buněk, jejichž Fc-epsilon receptory byly označen^ fluorescencí.

Obrázek 5B je histogram četnosti buněk v závislosti na inensitě fluorescence pro kontrolu populace stimulovaných lidských tonsilních B buněk, které byly vystaveny působení media sestávajícího z 0,1 % supernatantu buněk COS 7 transfektovaných pcD-125 a jejichž Fc-epsilon receptory byly označeny fluorescencím

Obrázek je histogram četnosti buněk v závislosti na intensitě fluorescence pro kontrolu populace stimulovaných lidských tonsilních B buněk, které byly Ostaveny působení media sestávajícího z 1 % supernatantu buněk COS 7 transfektovaných pcD-125 a jejichž Fc-epsilon receptory byly označeny fluorescencí.

Obrázek 5D je histogram četnosti buněk v závislosti na intensitě fluorescence pro kontrolu populace stimulovaných lidských tonsilních buněk B, které byly vystaveny působení media sestávajícího z 10 % supernatantu buněk GOS 7 transfektovaných pcD-125 a jejichž Fc-epsilon receptory byly označeny fluorescencí.

Obrázek 6A ilustruje sekvenci nukleotidů syntetického lidského IL-4 genu, který se používá pro expresi přírodního nebo mutovaného IL-4 v B.coli.

- 13 Obrázek 63 je mapa

S 1>C;

restrixcnimi endonukleasaai syntetického lidského IL-4 (genu) vloženého do plasmidu pUCIS.

Obráz ky 7A až 7E ilustrují dvojvláknové DNA fragmenty 1A/3 až 6A/B používané pro zkonstruování syntetického genu lidského IL-4.

Obrázek 8 ilustruje sekvence nukleotidů přilehlých k iniciačnímu ATG kodonu v E. colí expresním vektoru TAC-RBS. Tyto sekvence začínají u restrikčního místa EcoRI a končí u místa HindlII· Ribosomová vazebná sekvence (RBS), která vykazuje komplementaritu k $' konci 16S robosomové DNA je podtržená a ATG iniciační kodon je podtržen.

Obrázek 9 ilustruje histogramy četnosti buněk v závislosti na intensitě fluorescence pro populace buněk odvozených od pacienta se syndromem holých lymfocytů. Buňky byly barveny fluorescenčně značenými anti-DR monoklonálními protilátkami.

Obrázek 10 ilustruje absorpční profil při 215 nm koneč· ného stupně čištění lidského IL-4, který spočívá v EPLC na C-4 koloně na obrácených fázích.

Obrázek 11 je mapa konstrukce plasmidu pEBV-178 obsahu· jící cDNA lidskému IL-4.

Obrázek 12 je mapa konstrukce plasmidu TEPC11.

Obrázek 1$A je mapa konstrukce plasmidu pmF-alfa8.

Obrázek 1$B ilustruje TGGE aktivity několika transfekčních supernatantů z kultury kvasinek, které expresí poskytují lidský IL-4 _a jeho různé muteiny.

Obrázek 14 ukazuje růstové křivky na faktoru závislých buněčných linií: MC/9 žirných buněk (1A), DX-2 žirných buněk (13), NFS-60 buněk (10) a HT2 T buněk (ID). Kultivuje se ,3 ,/12. x uxS 0 Θ2; 2_ L/lel S-- 03 j? C.3 ~ 3 -i £ ^;x ^>/χΓ*3.

S R kolečka), IL-2 (plné čtverečky), IL*-)^X‘ (prázdná kolečka), Cli-CSF^ (prázdné trojúhelníky), IFN-^? (plné trojúhelníky) nebo P338D1 supernatantu. (prázdné diamanty). MC/9 buňky (IA) byly kultivovány také s různými koncentracemi vyčištěného R

IL-3 (prázdná kolečka) nebo IL-jT smíchaného s 200 jednotkami IL-2 (plné čtverečky), GM-CSF* (prázdné trojúhelníky), IPN-ýt? (plně trojúhelníky) nebo P3388L1 supernatantem (prázdné diamanty). Aktivita růstového faktoru byla měřena po 24 hodinách kolorimetricky. Absorbance při 570 nm (reference 630 nm) byla měřena na přístroji Dynatek Micro Elisa reader.

Obrázek 13 ilustruje FPLC chromátografii na iontoměniči supernatantu Cl·!· Sedm ml (35 mg proteinu) koncetrováného supernatantu se dialysuje v 50nM fosforečnanu sodného, lmM EDTA, pH 7,0 (7,8 m S/cm), nanese se na kolonu Pharmacia Mono S (0,5 x 5 cm) ekvilibrovanou stejným pufrem .(pufr A). Pufr B je pufr A s 1M chloridem sodným. Podmínky eluce: průtok: 0,5 ml/minutu, frakce po 0,5 ml, eluce 0 až 40% B čtyřicet minut, 40 až 100% B deset minut. Každá frakce byla testována na proliferační aktivitu na NFS-60 (IL-3, plná kolečka), HT2 (TCG2, oo.o kolečka) a MC/9 (MCGF) buňky. Odpověď MC/9 není uvedena. Šipky ukazují polohy, kde hladiny proliferace MC/9 dosáhly hladiny proliferace supernatentem Cl.l.

Obrázek 16 ade iluj^ruje 08 chromátografii IL-3 zbaveného supernatantu Cl.l na obrácených fázích. 100 /Ul 3 x mono-S prošlého supernatantu (frakce 59 až 61, obrázek 15) v 0,1% TPA se nanese na kolonu Pharmacia 03 (0,5 x 2 cm) s obrácenými fáze mi. Pufr A = 0,1% TPA ve vodě, pufr B = 0,1% TPA

V v acetonitrilu. Eluce: 0,5 ml/minutu, frakce po 0,5 ml, čtyři minuty 0 až 25% 3, padesát minut 25 až 60% 3, čtyři minuty 60 až 100% B. Každá frakce se testuje na proliferační aktivitu na NPS-60 (IL-3, plná kolečka), HT2 (TCGP, prázdná kolečka) a MC/9 buňky (MCGF, plné trojúhelníky). Šipka označuje frakci, která měla maximum TOGF aktivity a která poskytovala hladiny proliferace MC/9 podobné jako supernatant

Ό

Cl.l po cřidání nasycených 13-3^ hladin ke každé frakci.

Obrázek 163 ilustruje CS chromátografii supernatantu GK15-1 myších T-buněk na obrácených fázích. 2 mg (0,5 ml) koncentrovaného C-Kly-l supernatantu v 0,1% TFá se nanese na kolonu Pharmacia 03 s obrácenými fázemi a eluuje se jak shora uvedeno. Každá frakce se testuje na TCGF aktivitu na HT2 buňkách (prázdná kolečka). Šipka označuje místo, kde se myší IL-2 eluoval za stejných podmínek. Vložený graf: titrace Cl.l (plná kolečka) a IL-2^ (plné Čtverečky) a GK15—1 supernatantové (prázdná kolečka) TCGF aktivitx přímo srovnané na stejné desce.

Obrázek 17 ukazuje MCGF a TCGP aktivity částečně vyčištěného faktoru z kolony s obrácenými fázemi (BP faktor). Proliferaoe byla měřena jako inkorporaoe I%]*-thymidinu po 24 hodinách kultivace, žirné buňky MC/9 a buňky HT2 T byly kultivovány s různými koncentracemi supernatantu Cl.l (plná kolečka), IL-3^R (prázdná kolečka), IL-2^S (prázdné trojúhelníky), BP faktoru (prázdné čtverečky) a‘zředěními BP faktoru v přítomnosti 200 jednotek IL-3 (plné čtverečky) nebo zředěními IL-2 v přítomnosti nasycených'hladin BP faktoru (plné trojúhelníky).

Obrázek 18 ilustruje chromatofokusaci supernatantu Cl.l. 1,5 ml (3>5 mg) supernatantu ve 25 nM bis-tris, pH 7,1, se nanese na kolonu Pharmacia Mono P (0,5 x 20 cm) a eluuje se pufrem Polybuffer 74” (1 : 10),'pH 4,0, průtok: 0,5 ml/minutu, frakce po 1 ml. Každá frakce se'testuje na proliferační aktivitu na NFS-60 (IL-3, prázdná kolečka),

HT2 (TGGF, plná kolečka) a MC/9j0íCGP, neuváděno až'na to, že maximum MCGF aktivity je označeno šipkou). Maximum TCGM (frakce 12, pí = 6,2) odpovídá minimu IL-3 aktivity; hladiny MGGF proliferaoe jsou nejvyšší v místě označeném šipkou.

Obrázek 19 charakterizuje SDS PAGS supernatantu Cl.l a částečně vyčištěných MOGF/TCGF. (A): Neredukující SDS PAGS nefrakcionovaného supernatantu. Před redukcí 50mM DTT (60 °C, pět minut) se maximum TCGF posunuje nepatrně k vyšším molekulovým hmotám (21 000 a 16 000). Tento posun

- 21 je doprovázen drastrc.

jící SDS PA GB frakcí maxima MCG2 katexu (frakce 59 až 61, obrážel xima (redukce 50 °, 5 minut, 50n (2) '/TOGF z ohromatografie na . 15). Před redukcí se mail DTT) MCGF a TCGF posunují k nepatrně vyšším molekulovým hmotám (21 000 a 16 000).

Tento posun je doprovázen drasti^Gým snížením aktivity. Šipky označují jediné frakce, u nichž přidání nasycených množství IL-3 zvyšuje MCGF aktivitu na úrovně supernatanťu: IL-3 (prázdná kolečka), TCGF (plná kolečka), MCGF (prázdné trojúhelníčky).

Tento vynález se týká glykosylovaných nebo neglykosylovaných lidských polýpeptidů, které vykazují IL-4 aktivitu a které jsou odvozeny od IL-4 polýpeptidů popsaných, zde pomocí standardních způsobů přípravy proteinů. Tento vynález se také týká nukleových kyselin se sekvencemi schopnými kodovat polypeptidy podle tohoto vynálezu a nukleových kyselin, jejichž sekvence jsou efektivně homologní s cDNA klonů podle tohoto vynálezu. A konečně tento vynález se týká způsobů přípravy glykosylovaných nebo neglykosylovaných polýpeptidů podle tohoto vynálezu, které využívají sekvence nukleotidů zde popsané a způsobů použití polypeptidů podle tohoto vynálezu.

Způsoby přípravy, používaní a identifikace polypep_ tidů a nukleových kyselin podle tohoto vynálezu jsou diskutovány níže v obecných pojmech. Potom je uvedeno několik případů, v nichž jsou použity obecné způsoby na specifických typech buněk, vektorů, reakčních činidel apod. Nejdříve bude stručně popsána jejich isolace z přírodních zdrojů.

Tyto polypeptidy lze vyčistit do zdánlivé homogenity ze supernatantů snadno dostupných buněčných zdrojů. Lze je tedy ekonomicky vyrábět v čisté formě. Tím jsou umožněna různá terapeutická a jiná použití.

Tyto polypeptidy jsou charakteristické tím, že obsahují polypeptid vykazující stimulační aktivitu na B-buňky, T-bunky a žirné buňky. V přírodní formě jednoho druhu mají poxypeptrďy molekulovou hmotu na bDS rAGE asi 20 000 a 15 000 za neredukujících podmínek a 21 000 a 16 000 za redukujících podmínek. Prostředek, který obsahuje tyto polypeptidy v vpodstate čisté formě vykazuje isoelektrický bod (pí) asi 6,2 chromátofokusací· Růstové faktory jsou mimořádně silná činidla, která vykazují významnou aktivitu v mimořádně nízkých koncentracích (např. méně než 1 nanogram na ml). Tyto polypeptidy lze odlišit od hormonů a jiných proteinů přirozeně produkovaných T buňkami (např. IL-2, IL-5, GM-CSF a IFN-^t) chromátografií na katexu nebo za jedinečných elučních podmínek z kolony s obrácenými fázemi.

TJ myší některé polypeptidy podle tohoto vynálezu podporují pouze nízké hladiny proliferace některých buněk, jako jsou například linie žirnýoh buněk závislých na IL-5, avšak synergicky zvyšují růst takových buněk (například žirných buněk) v přítomnosti druhého faktoru (např. IL-5). Polypeptidy mohou stimulovat proliferaci některých linií T-buněk, ale obvykle v menším rozsahu než vyčištěný IL-2. Takové polypeptidy mohou také indukovat expresi Ia v klidových B-buňkách a zvyšovat sekreci IgG^ a IgE B-bunkami, podobně jako BSP-1. Tyto aktivity nejsou oddělitelně, přes všechny provedené biochemické frakcionace. Většina těchto aktivit však mizí po redukci, například v pří to,, mnosti SDS. Tyto faktory lze získat z četných přírodních zdrojů rozmanitými způsoby. Jedním z vhodných zdrojů je jakákoliv z četných linií T-buněk, která produkuje přísluš né polypeptidy. Jedna taková linie T-buněk byla odvozena od myší C57GL6 (Nable G. a spol. : Proč. Nati. Acad. Sci. USA 73, 1157 až 1161 (1931).), kterou lze uchovávat v modifikovaném doplněném DME (Nable G. a spol.: Cell 25, až 28 (1932).). Tato buněčná linie, původně označená Cl.Lyl⁺2~I9, byla uložena v Americké sbírce typů kultur (ATCC) a označena číslem CRL8179· Mezi jiné vhodné buněčné zdroje těchto polypeptidů patří téměř jakékoliv buňky, kte ré vylučují různé protilátky připisované polypeptidúm, jako jsou například lidské periferní krevní lymfocyty stejně tak jako jakékoliv dobře známé zdroje T-buněk, _ú J .0^;w i.' 33. w3. 3 <.· Z 33 áu v,

J Λ.Λ. KS droju. nebo v nbkteryori připcaecn -spcj-ins z rosoitycn ounek se muže oourobrt rozmanitým dobře známým čistícím postupům, aby se oddělily proteiny podle tohoto vynálezu. Čistící techniky se s výhodou používají ve vzájemných kombinacích, aby se zajistila vysoká úroveň čistoty. Typicky se při čištění používá chromatografie filtrací na gelu, chromátografie na SP katexu, chromátografie na obrácených fázích, skupinově specifická chromatografie (například na Heparin/sepharose) nebo jiné obvyklé způsoby dělení, pokud zajišťují efektivní frakoionaci proteinu. Lze použít také vysokotlaké kapalinové chromatografie (HPLC), isoelektrickou fokusaci a elektroforesu na SDS polyakrylamidovém gelu.

Súpernatant z příslušné buněčné linie se může nejdříve rozdělit na frakce chromatografií na silném katexu. Typicky se to provádí tak, že polypeptidy podle tohoto vynálezu zůstávají navázány na koloně, zatímco asi 98 % proteinů, které byly naneseny na kolonu, kolonou projde. Zbývající navázaný protein se může eluovat solným gradientem. V jednom uspořádání podle tohoto vynálezu gradient chloridu sodného uvolňuje předmětný polypeptid při asi 0,19M koncentraci. Tato frakcionace se zopakuje dvakrát. (Primárně, aby se odstranil zbývající IL-3·). Tím se získá čistota větší než asi 95 %· Potom se materiál frakcionuje na Heparin-Sepharose a ohromatografu je se na obrácených fázích (c!3 nebo c4). V druhém případě se tyto polypeptidy eluují 42% acetonitrilem. Spojené frakce obsahující předmětný polypeptid v extrémně vysoké čistotě, v podstatě homogenní, se jeví jako jediný pás o molekulové hmotě asi 20 000 na SDS-PAGE potažené stříbrem. Takto vyčištěný materiál je alespoň 65 QOQ-krát čistší než materiál v ořírodní formě.

Tyto polypeptidy se mohou používat jako antigeny pro přípravu protilátek, které dále mohou být použity jako antigeny pro přípravu anti-idiotypových protilátek.

Konvenčními způsoby se mohou připravit bud. monoklonální nebo polyklonální protilátky. Tyto polypeptidy nebo jejich fragmenty, obecná fragmenty s alespoň asi 15 aminokyselinami, se mohou používat jako takové. 8 výhodou jsou vsak navázány nebo napojeny na adjuvant nebo antigen, který aktivuje imunitní systém. Mohou se používat různé antigeny, jako jsou například sérové albuminy, KLH, globuliny nebo podobné.

Pro navázání adjuvantů na polypeptidy jsou dostupné rozmanité způsoby, jako je například glutaraldehyd, meleimidobenzoová kyselina, diazobenzoová kyselina nebo podobné sloučeniny. Mezi adjuvanty patří Freundův adjuvant, hydroxid hlinitý nebo podobné. Antigen se hostiteli podává injekcí v konvenčních množstvích. Během dvou až čtyřtýdenních intervalů se může podat jedna nebo více dalších injekcí. Jestliže se používá monoklonální protilátka, normálně se myšíái podá jedna původní injekce a jedna zesilující injekce, slezina se isoluje a splemocyty se pak napojí s příslušným napojovacím partnerem konvenčními způsoby. Viz například Galfre a spol.: Nátuře 266, 55θ (1977), Kennett a spol.: Current Topics in Microbíology and Immunology 81, 77 (1978) a USA patenty čísla 4 381 292 a 4 3°3 799· Pro speciální účely lze však použít pro přípravu protilátek s lidskými Fó řetězci jiné savce, jako je například primát, například člověk.

Polypeptidy se mohou používat samotné nebo v kombinaci s protilátkami při diagnose polypeptidů. V obou případech při použití pro diagnostické analýzy mohou být buú zhačené nebo neznačené. V literatuře je popsán velký počet diagnostických analýz včetně navázání bud. přímo nebo nepřímo těchto polypeptidů nebo protilátek ha různé marejícry, jako jsou například enzymy, radionuklidy, fluorescenční činidla, substráty, koenzymy, částice, například »a^fletické částice nebo podobné. Jako ilustrace těchto analýz viz například USA patenty č. 3 817 337, 3 350 752, 4 174 384,

177 437 a 4 374 925·

Různé analýzy se podle dohody dělí na homogenní a heterogenní imunoanalýzy. Rozdíl je dán tím, jestli komplex polypeptidů a jeho protilátky musí být oddělen od nezkom-

Protilátky těchto polypeptidů se mohou používat samotné jako antigeny produkující anti-idiotypy, které mohou sloužit jako kompetitivní antigeny s epitopickými místy kompetitivními s epitopickými místy těchto polypeptidů. Tyto anti-idiotypy mohou tedy sloužit jako inhibitory nádorů, jako náhrady předmětných polypeptidů nebo jako antagonisté předmětných polypeptidů.

Tyto polypeptidy tvoří rodinu přirozeně se vyskytujících polypeptidů, které mohou být odvozeny,od přírodních zdrojů, a také nepřirozeně se vyskytujících polypeptidů, které sdílejí fysiologické vlastnosti, jako jsou například vazebná specifičnost a stimulační aktivity na B buňky nebo žirné buňky. Menší rozdíly mezi druhy nebo původu mohou vyžadovat modifikaci čistících postupů, erož je známé odborníkům. ‘4‘yto polypeptidy mohou být také sekvenovány a fragmenty lze pak syntetizovat dobře známými způsoby - viz například: Barany a Merrifield: Solid-Phase Peptide Synthesis“, The Peptides, Análysis, Syňthesis, Biology, Speciál Methods in Peptide Synthesis, část A, díl 2., Grossa Merenhofer (red.), Academie Press, N.Y. 1930, strany 1 až 284·.

Polypeptidové prostředky podle tohoto vynálezu jsou užitečné v různých směrech. Například tyto polypeptidy mohou indukovat růst T-buněk a žirných buněk, bud v kultuře nebo in vivo. Žirné buňky, jak bylo shora uvedeno, jsou důležitými zdroji heparinu, histaminů, prostaglandinů a jiných biologicky /důležitých materiálů. Podobně růstové faktory lze používat jako stimulátory pro B- a T-buňky, zvláště pro takové, o nichž je známo, že sekretují proteiny (např. Lymfokiny a imunoglobuliny) užitečné v imunitním systému. Tyto faktory se typicky zahrnují do kultivačního media, které se přidá k buněčné kultuře. Vhodná koncentrace faktorů závisí na typu buněčné linie, obvykle bude faktor ale pří-

2S růstový::2-. :3../:v.t /u/ia vohoto vynálezu nůše odstranit požadavek používání krmných hunck pro zachováni žádaných buněčných linii, což vodě k podstatnému zvýšení čistot teohro buněčných linií.

Polypeptidové prostřed!^ podle tohoto vynálezu najdou použití také in vivo při léčení různých imunodeficiencí nebo při zvyšování přirozené imunitní odpovědi. Například mohou polypeptidové prostředky podle tohoto vynálezu napomáhat při léčení nebo prevenci infekce stimulováním maturace a/nebo růstu B-buněk, T-buněk a žirných buněk, čímž se snižuje vnímavost živočicha k infekci.

V další části tohoto spisu je popsána de novo příprava IL-4 cDNA. Pro přípravu de novo a pro klonování cDNA a pro zkonstruování cDNA bank jsou nyní dostupný rozmanité způsoby, viz například nedávno uvězněný souborný člábek Dohertyho Cloning and Expression of cDNA, kapitola 10. v Gotesman'(red.) Molecular Cell Geneticš (John Wiley and Sons, New York, 1985) a Brandis a spol.:'Preparation of cDNA Libraries and the Detection of Specific Gene Sequences v Setlow a spol. (red.)í Genetic Engineering 8, 299 až 516 (plenům Press, New York, 1986).

Například celková mRNA se extrahuje (například jako popisuje Berger S. a spol.: Biochemistry 18, 5145 až 5149 (1979)·) z buněk (například netransformovaných lidských T buněk) produkujících polypeptidy, které vykazují žádanou aktivitu. Z této celkové mRNA lze zkonstruovat dvojvláknové DNA primerem iniciovanou reversní transkripcí (Verme I»: Bíochem. Biophys. Acta 475, 1 až 58 (1973)·). Získá se tak první část každé mRNA sekvence, načež se syntetizuje druhé vlákno (Land H. a spol·: Nucleic Acids Ses. % 2251 až 2266 (1931).). Potom se cDNA klonují napojením na vhodný plasmidový nebo bakteriofágový vektor (Rougeon P. a spol.: Nucl. Acids Res. 2, 2565 až 2573 (1975) nebo Scherer G. a spol.: Dev. Biol. 86, 458 až 447 (1931). )komplemenájtrními homopolymerními konci (Efstratíádis A. a spol.: Cell 11, 571 až 535 (1977)·) nebo kohesivními konci vytvořenými segmenty lin;ol.: “Moleculař Gloning: A Labóratory Manusl, ~~ ‘-'her™

U uX u.

ix<JÍ i

4Í<3 :oratory, N.Y. 19-32).) a následujíc formováním vhodného hostitele (obecně viz Efstratiadis A·, Villa-Kormaroff L.: Cloning oř double stranded cDRA v Setlow J. a Hollaender A. (red.): Genetic Engineeriňg 1, Plenům Publishing Corp., R.Y., USA, 1982).).

Výhodným zdrojem m^SRA kódujícím žádané polypeptidy jsou buňky, jejichž supernatanty obsahují stimulační aktivity B-buňěk, T-buněk a/nebo žirnýoh buněk nebo jiné aktivity související s polypeptidy podle tohoto vynálezu. Jednou takovou linií je linie myších T-buněk Cl.Lyl⁺2~/9 (ATCC č.

CRL8179) (Rabel G. a spol.: Rature 291, 332 á2 534 (1981).). Obecně lze vhodné buňky získat z rozmanitých zdrojů, jako je například lidská slezina, mandle a periferní krev. Mohou se používat také klony T-buněk, jako jsou například ty, které se isolují z T-lymfooytů periferní krve (viz “Research Monographs in Immunology”, (red.) von Doehmer H. a Saaf V.t Section D: Human T-CellOlónes, díl 8., strany 245 až 533, Elsevier Science Publishers, R.*Ύ. , 1985)·

Přípravu mRRA, které jsou schopny kodovat IL-4, těmito buňkami lze potvrdit tím, že se extrahovaná mRRA podá mikroinjekcí oocytům Xenopus laevis. ^ato technika mikroinjekcí je níže popsána plně, obecně ji popsalColman a spol»: “Export of Proteins from Oooytes of Xenopus Laevis“, Cell'17, 517 až 526 (1979) a Maniatis a spol.: Moleculař Cloning:

A Laboratory Manual“ str. 250 až 552 (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1932).

Jestliže mRRA, které kódující žádaný IL-4 představují velmi malou frakci celkové mRRA, mohou být zapotřebí další stupně, kterými se obohatí tak, aby to bylo praktické při vyhledávání (testování) cDRA klonů, o které jde. Takové postupy jsou odborníkům známé. Jsou popsány níže v několika příkladech a v několika pracích a odkazech: napříkad Maniatis a spol na str. 225 es 223 ve shora uvedené citaci, Suggs a spol.: Proč. Ratl. Acad. Sci. 73, 5615 až 6617 itl. Acad. Sci. 73, 2255 až _kxýál), Parn sool.: Proč.

2257 (1931) a Davis a spol.! Proč. Natl„ Acad. Sci. 81, 2194 až 2193 (1984).

Výhodný způsob přípravy IL-4 cDNA de novo se spoléhá ns funkční expresi cDNA v pcD expresním vektoru, který vyvinuli Okayama a Berg: Mott. Cell. Biol. 2, 161 až 170 (1970) a Mol. Cell. Biol. 230 až 239 (1983) a který je dostupný od firmy Pharmaoia (Piscataway, N.J.). Expresní vektor pcD obsahuje časný promotor SV40, pozdní místo střihu a počátek replikace. Tento vektor umožňuje expresi cDNA insertů do opičích buněk COS 7, které poskytují T antigen pro replikaci pcD plasmidu, Testování cDNA bank zahrnuje transfekci sestavy plasmidových DNA do buněk COS 7 pomocí DEAE Dextranu. Jelikož lymfokiny, a zvláště IL-4, jsou proteiny, které se sekretují, je možné testovat sůpernatanty transfektovaných buněk na biologickou aktivitu po několika dnech inkubace. Positivní sestry se dále rozdělí, aby se identifikovaly jednotlivé cDNA klony, které po transfekci dávají biologickou aktivitu.

Okayama a Berg-expresní vektor se stručně zkonstruuje ' následujícím způsobem. Polyadenylovaná mSNA se aneluje na konec polydeoxythymidylové kyseliny (oligo-dT) napojené na ^přečnívající vlákno plasmidu pBR322^štěpeného působením ) KpnI, kté^ obsahuje oblast časného promotoru SV40. Tento celý vektor slouží jako primer pro syntézu cDNA. Po syntéze cDNA se připojí ^polydeoxycytidylové (oligo dC) konce. Následuje rozštěpení působením HindlII, které odstřihne (v jedinečném HindlII místě) fragment SV40 DNA, na nějž je připojen jeden z oligo dC konců. Časný promotor SV40 zůstává neporušen. Nahodile se vyskytující místa HindlII insertu jsou ovlivněna minimálně, protože hybrid cDNA/RNA je odolný vůči štěpení působením Hind III. Na přečnívající konec nalevo od místa štěpení HindlII se aneluje odděleně zkonstruovaný fragment HindlII s 3'-polyguanidylovaným (oligo dG) koncem. Tento vektor se cirkularizuje a nechá se zreagovat s E. coli SNasou E, DNA polymerasou I a DNA ligasou, aby se nahradilo vlákno DNA. Tyto vektory se klonují v B. coli. Vytvoří se tak banka cDNA. Prvky SV40 umožňují, aby došlo k

J o -

Γ* Ύ T | .“λ i ·*— , ™ * — *.·· cj v X ck -J U -w 7 O CÍ .· 4* __ w v/k*xJ> ( a - 3 3 U'

Jakmile je zkompletována tato banka cDNA v Okayma-Bergvektoru, seberou se cDNA klony a náhodné sestavy se testují na přítomnost žádoucích cDNA standardními postupy, např. selekcí hybridů, detekcí antigenních determinant produktů získaných expresí a/nebo funkčními analýzami. Positivní sestavy se pak sondují cDNA z indukovaných linií T-buněk. Potom se positivní sondované sestavy rozdělí na jednotlivé klony, které se dále testují transfekcí do vhodného hostitele (jako je například kultur_a savčích buněk) a supernatant hostitele se testuje na aktivitu.

IL-4 cDNA se připraví hybridizačními sondami odvozenými od objevených cDNA následujícím způsobem. Zde popsané cDNA se mohou používat jako sondy pro identifikaci homologních sekvencí u různých buněčných typů, jako alternativa isolace de novo a klonování nukleotidů kódujících IL-4, Používají se standardní techniky, např. Beltz a spol.: Isólation of Mnltigene Pamilies and Determination of Homoíógies by Pilter Hybridization Methods v Methods in Enzymology 100, 266 až 285 (1983) a Callahana spol.: Detection and Oloning of Human DNA Sequences Selated to the Mouše Mammary Tumor Virus Genome v Proč. Nati. Acad. Sci. 79« 5^03 až 55θ7 (1982). cDNA podle “vynálezu se používají při konstruování sond (standardními technikami, např. Maniatis a spol.i viz shora.) pro testování (při nízkých stupních hybridizace) genomových nebo cDNA bank (opět zkonstruovaných standardními způsoby) buněčných typů, o nichž se předpokládá, že produkují IL-4. Používají se standardní testovací postupy, např. viz Gruňstein a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. 22» až 3^5 (1975) nebo Benton a spol.: Science 196, 180 až 183 (1977).

Jak zde bude dále popsáno podrobněji, lidský IL-4 byl isolován myší IL-4 sondou. Následující analýza ukazuje asi 70 % homologie mezi vybranými oblastmi lidských a myších cDNA

Na základě evoluční vzdálenosti mez myší a člověkem se

- 3θ předpokládá, ze vetam?, ^esnize ne vsecnny savci ±x»-4 geny jsou detegovatelné sondami zkonstruovanými z jedné nebo víoe οΝβλ podle tohoto vynálezu, viz: Wilson a spol.: 3iochemical Svolution, Ann. Sev. 3ioohem. 46, 573 až 639 (1977), Kimura: The Neutrál Theory of ^i!ioleeular Svolution, kapitola 11 v Nei a Koehn (red.): Svolution of Genes and Proteins (Sinauer Associates, Sunderlánd, Ma., 1933)·

V další části bude popsána příprava mutovaných IL-4 metodou proteinového inženýrství. Jakmile je jednou dostupná informace o sekvenci aukleových kyselin a/nebo sekvenci aminokyselin přírodního proteinu, lze pro přípravu skutečně jakékoliv mutace v přírodní sekvenci použít různé způsoby. Shortleí Science 229, 1193 až 1201 (1935) souhrnně popisuje způsoby mutace nukléových.kyselin, které jsou použitelné podle tohoto vynálezu, tóutanty přírodních IL-4, tj. IL-4 muteiny, se připravují místně specifickou oligonukleotidem řízenou mutagenesi (např. Zoller a Smith: tóethods in Enzymology 100, 468 až 5θθ (1933), Marka spol.: USA patent č. 4 518 584 nazvaný Human Eecombinant Inter^Lukin-2 tóuteíns, nebo tzv. kazetovou mutagenesou, kterou popisuje Wells a spol.: Gene 54, 315 až 523 (1985) a Estell a spol.: Science 233, 659 až'665 (1986).' V dále uvedených sekcích bude používána notace podle Estella a spol. (viz shora uvedená citace) pro identifikováni muteinů. Například lidský IL—4 mutein Leu^ (nebo jeddoduše Leu®^, jestliže se přírodní protein rozumí přímo ze souvislosti textu) označuje polypeptid, jehož sekvence aminokyselin je identická se sekvencí aminokyselin přírodního proteinu až na polohu 82 vzhledem k N-konci. V této poloze je Phe substituován Leu. Podobně lze označovat i více než jednu substituci, např. mutein, který má Phe v poloze 32 substituován Leu a Asn v poloze 111 je substituován Asp, se označuje jako lidský IL-4 mutein (Leu , Asp^-1· ). Delece se označují výřezem A . Například mutein, jemuž chybí Gin v poloze 71, se označuje jako lidský IL-4 mutein Δ?¹. Inserce se označuje IS(Xaa). Například mutein s Leu vloženým za Glu v poloze 71 se označuje jako lidský IL-4 mutein (Leu).

Lidský IL-4 mutein (Ser¹^,Λ⁷¹, IS^⁴(Gly)) znamená tedy sekvenci ořírodního lidského IL-4, který je modifikován

- 51 ;0„ ' J. ci irm ůly :ico~ tzprostředné za Ala do v poloze >4, laserea vi'V

-*^-3 3 i.3 3 , . · . « ) , λλλ^ /Las -, -ka a ~-Xaa -,ji I3’~(Xaa₁znaměna sek— věnci, která je vložena za polohu i. Adice na N-konec se označí indexem ”0”, například Ιδθ (Xaa). Belece skunci, například delecé aminokyselin v polohách 6 sž 10, se označuje bučí /J⁵“¹⁰ nebo (^f z?, J⁰).

Pro získání muteinů lidského IL-4 se nejvýhodněji používá kazetová mutagenese. Jak bude dále podrobněji popsáno, syntetický gen lidského IL-4 se zkonstruuje se sekvencí jedinečných míst štěpeni restrikčními endonukleasami, která jsou umístěna přibližně stejnoměrně podél genu. Jedinečnost restrikčních míst by měla být zachována i po vložení genu do příslušného vektoru. Segmenty tohoto genu se pak mohou vhodně štěpit a nahrazovat syntetickými oligonukleotidy (tj. “kazetami), které kódují žádají mutein·

Při stanovení počtu a distribuci jedinečných restrikčn£ch míst se bere v úvahu několik faktorů: 1) již existující restrikční místa v expresním vektoru, 2)_: jestli je žádoucí použití druhově-specifického nebo rodově-specifického kodonu a 5) vhodnost a spolehlivost syntézy a/nebo sekvenování segmentů mezi jedinečnými restrikčními místy.

Lidský IL-4 podle tohoto vynálezu je definován v pojmech biologických aktivit a/nebo homologie s popsanými uspořádáními. Mezi lidské IL-4 podle tohoto vynálezu patří proteiny a muteiny (od objevených přírodních polypeptidů), které jsou homologní s objevenými přírodními polypeptidy a které vykazují jak BGGP aktivitu tak TGGP aktivitu. Lidské IL-4 podle tohoto vynálezu jsou také definovány jejich biologickými aktivitami (definovanými podrobněji níže), které zahrnují BCGSéktivitu, TGGP aktivitu (která je zde také alespoň jednu nebo víaktivit sestávající z aktioznačována jako IL-4 aktivita) a ce aktivit vybraných ze skupiny vity indukce MHC antigenu, aktivity indukce P^-epsilon receo toru,. aktivity potenciace růstu kolonie granulocytů stimulované GM-GSP

TCGr pocencující aktivity interleukinu-2 a

liniemi myších. T-buněk.

TCGF aktivita se stanovuje následujícím způsobem: Je popsáno několik standardních analýz TCGF aktivity, např

Devos a spol.: Nucleic Acids Resaerch 11, 4307 až 4323 (1933), Thurman a spol.: J. Biol. Response Modifiers'2» 35 až 107 (1936) a Robert-Guroff a spol., kapitola 9· v Guroff (red.) Growth and Maturation Factors” (John

lymfocytů ne na IL-2 závislých linií T buněk, např· Gillis a spol.: ϊ. Immunol. 120. 2027 (1978)· Proliferaci lze stanovit standardními apůsoby, například inkorporací triciovaného thymidinu nebo kolorimetrickými způsoby (Mosmann:

J. Immunol. Meth. 62, 55 až 63 (1983).)·

Lidskou TCGF aktivitu lze testovat například následujícími stupni: (1) promyté lidské periferní krevní lymfo-

hemaglutininem (PHA) sedm dnů a potom kultivovány sedm dnů s IL-2, se přidají do mikrotitrovací jamky, (2) do každé jamky se přidají zředění (50 mikrolitrů) materiálu obsahujícího TCGF, (3) lymfocyty se inkubují 72 hodiny při 37 °C, (4) do každé jamky se přidá triciovaný thymidin (asi 20 , mikrolitrů, 20 mikrocurie na mililitr) a (5) buňky se přenesou na proužky filtračního papíru, promýjí a spočítají se scintilačním počítačem.

Jak je podrobněji popsáno v příkladech, některé formy IL-4 mají schopnost zesilovat TCGF aktivitu IL-4, Pojem zesílení (potenciace)”, jak je zde používán, v souvislosti š takovou aktivitou, znamená, že maximální hladina proliferace v TCGF analyzovaném systému způsobená IL-2 se zvýší ořidáním IL-4.

restuje nasicdujicrm způsobem:

suu-' sxrivxoa ;

aktivita je definována analýzou popsanou Ho^srdem a spol.:

J. *xp. hled. 155, 514 až 92$ (1982). Analýzy 3GGF jsou uvedeny v souborném článku. Howarda a Paula: Ann. Rev. Immunol. 1, $07 až $$$ (193$). Ve stručnosti - BGG? aktivita se měří stupněm, kterým jsou vyčištěné klidové buňky stimulovány proliferovat v přítomnosti submitogenní koncentrace anti-IgM nebo podobného antigenu. Analýza lidské BCGF aktivity se může provádět podle následujících stupňů:

Obohacené populace B buněk se získají z periferní krve, sleziny, mandlí nebo jiných standardních zdrojů odstřelováním hustotním gradientem (Ficoll/Hypague) (např. Pharmacia) s dvěma cykly s ovčími erytřocyty, které bylý zpracovány s

2-aminoethylisothiouroniumbromidem, aby se odstranily T buňky. Tyto přípravky B buněk by měly obsahovat vice než 95 % povrchových Ig buněk a více než 95 % buněk positivních ha antigen specifický pro lidské B buňky, což se stanoví . monoklonální protilátkou Bl specifickou na lidské Br-buňky, které je dostupná od firmy Coulter (Hialeah, Fl·). Znečištění T-buňkami by mělo být menší něž 1 % (stanovuje se vybavením anti-Leu-l monoklonálními protilátkami (Becton-Dickinson, Mountain View, Ka.) nebo OET 11 protilátkami (Ortho Diagnostice, Westwood, Ma.)). Tři mililitry kultury těchto B lymfocytů (asi 5*10^ buněk na mililitr) v Ysselově mediu (Yssel a spol.: J. Immunol. Meth. 65, 55 až 6$ (198φ.) se aktivuje bul kmenem Staphylococcus aureus 'Cowan I (SAC) (např. 0,01% roztokem SAC, který je dostupný od Calbiochem ,. pod obchodním označením Pansorbin nebo který lze připravit postupem popsaným Falkoffem a spol.: J. Immunol. 129, 97 až 102 (I932).) nebo anti-IgM protilátkami (např. BR1, Gaithersburg, Md.) navázanými na perličky, například 5 yug/ml perliček Imunobeads”, které lze získat od Bio-Rad (Richmond, Ka.). B buňky se kultivují bua dvacet čtyři hodiny (v případě SAG) nebo 72 hodiny (pro anti-IgM perličky) a potom se přečistí Ficoll/Eypaque hustotním odstřelováním, aby se odstranily částice SAG, perličky, neživotaschopné buňky? a podobné. Proliferace 3 buněk se měří vysátím asi 5*10^ 3 lymfocytů v 50 _zul media v 0,2ml mikrotitrovacích jamkách £3 x”_l .j-kxc j_ o o j? u Zí n <7. rečt^ixj. ma íse^xc^l!-*., ix. KuS^jc.!

předpokládáme BCG? aktivitu, na konečný objem 5θ mikrolitrů. Inkorporace triciovsného thymidinu se stanoví po 43 hodinách. (anti-IgM kultury) nebo 72 hodinách (SAC kultury). Podobné analýzy byly popsány také Muraguchim'a spol.: J. immunol. 129, 1104 až 1103 (1982) a Yoshizaki a spol.: J. Immunol. 123, 1296 až 1301 (1931).

Indukce MHO antigenu se zjištuje následujícím způsobem. Bylo ukázáno, že IL-4 mohou indukovat expresi MHO antigenů (např. Ia u myší) v různých typech buněk imunitního systému, zvláště u B buněk. Roehm a spol. (J. Exp. Med. ^60, 679 až 694.) popisuje důkaz, že faktor, který vykazuje BCPG aktivitu, byl schopný indukovat také expresi MHC systému antigenů u normálních klidových B buněk. Analýzy indukce MHC antigenu jsou zobecněny analýzami myších B buněk uvedenými v tomto odkazu. Ve stručnosti se postupuje tak, že buňky imu» nitního systému se vystaví působení IL-4. Potom se značenými protilátkami specifickými pro MHC antigeny stanoví exprese těchto antigenů na povrchu buněk. Stupeň indukce se stanoví srovnáním indukovaných buněk s kontrolami. Pro dané druhy lze použít několikero různých protilátek. Některé hybridomy jsou dostupné z ATCC (ty produkují monoklonální anti-MHC antigenové protilátky). Některé jsou dostupné komerčně (například antu-HLA-DR produkované hybridomy pod ATCC čísly HB103, HB109, HB110 nebo HB151, anti-I-A^b,d produkované hybridomy pod ATCC číslem ΗΒ35» anti-HLA-DR L243 dostupné . od fy. Bencton Dickinson (Mountain View, Ka.) nebo podob- . né). Může být potřebné rutinním experimentováním přizpůsobit analýzu příslušným druhům a optimalizovat podmínky analýz;; tak, aby se získal nejcitlivější způsob zjišňování hladiny MHO antigenu. Pro test indukce lidského MHC antigenu se shora popsaným nebo podobným způsobem připraví vyčištěné B buňky. MHO indukci lze zjištovat také pro nevyčištěné přípravky z buněk sleziny. Protilátkou označené buňky se s výhodou detegují průtokovou cytometrií, například přístrojem Becton Dickinson PACS nebo ekvivalentním způsobem.

;oxJ

Dg ±5

- S X. V Λ C Ί Si Vha*- J »' h⁴. ý· £x -.>Ákj _ ··.,;. <·. jj J_ -^> GOkj \J *s '-Jš — * -s- — θ ádá se, že IL-4 obecné vykazují MGGF aktivitu. Avšak ecLem k nedostatku příslušných analytických technik prokázána pouze u hlodávčího IL-4. MGGF

MGGF aktiv! tí analýzy myšího IL-4 jsou založeny na proliferaci na faktoru závislých myších žirných nebo bazofilních buněčných linií. MGGF aktivitu lze testovat pro linie myších žirných buněk MC/9, které jsou uloženy v ATCC pod číslem CRL 8306 a je popsána v USA patentu č. 4 559 310, stejně tak i Kabelem a spol.: Cell 23, 19 (31). '

Myší MCGF analýzy jsou popsány také Ihlem a spol.: J. Immunol. 127 , 794 (1981). MCGF aktivita se s výhodou stanovu je kolorimetricky podle Mosmanna (shora uvedená citace)s použitím buněk MC/9· Ve stručnosti lze tento postup popsat takto - buňky MC/9 se kultivují ve Falconových mikrotitrovacích. miskách s plochým dnem (1(Λ buněk na jamku) v Dulbeccově modifikovaném mediu doplněném o 4 % plodového sera, 50 yuM 2-merkaptoethanolu, 2 mM glutaminu, neesenciální aminokyséliny, esenciální vitaminy a různé koncentrace testovaných supernatantů na konečný objem 0,1 ml. Po dvaceti hodinách inkubace se ke každé buněčné kultuře přidá 50 ^ug

5-(4,5-ůimethy lthia zol-2-y l)-2,5-dif eny 1-tetra zolium-bromidu (Sigma) v 10 yul fosforečnanem pufrovaného solného roztoku. Po čtyřech hodinách se přidá 0,1 ml 0,04M kyseliny chlorovodíkové v isopropanolu, aby se rozpustil barevný formazanový produkt. Absorbance při 57θ nm (reference 630 nm) se měří na přístroji Dynatech Microelisa Autoreader (ME580) nebo na podobném přístroji.

V další části bude popsána indukce recpetoru F —epsio/Ln. Bylo objeveno, že IL-4 indukuje expresi F -epsilon v B buň, » ^G w kach a T buňkách, zvláště pak na lidských B buňkách, které jsou stimulovány anti-IgM protilátkami neoo podobným antigenem. Bylo také objeveno, že gama-interferon specificky inhibuje IL-4 indukovanou expresi F -epsilon na B-buňkách.

c

Analýza indukce reďptoru Fc-epsilon se s výhodou provádí stejně jako BCFG analýza. To znamená, že získané vyčištěné 3-buňky se stimulují anti-IgM protilátkou (nebo podobným antigenem) a vystaví se působení 11-4. Nakonec se buňky analyzují na receptory Fc-epsilon. Je dostupno několik analýz kvantitativního vyhodnocení Fc-epsilon receptorů na povrchu buněk, například Yodoi a Ishizaka: J. Immunol. 122, 2577 až 2583 (1979), Hudak a spol.: J. Immunol. Metli. 84, 11 až 24 (1985) a Bonnefoy a spol.: J. Immunol. Meth.88, 25 až 52 (1988). Fc-epsilon receptory se mohou měřit průtokovou cytometrií s označenými monoklonálními protilátkami specifickými pro receptory, např. přístrojem Becton Dickinson FACS-IV nebo podobným pří- . strojem. Monoklonální protilátky specifické pro Fc-epsilon receptor lze zkonstruovat konvenčními způsoby.

IL-4 indukuje sekreci IgE a IgG^ isotypů v lipopolysacharidý (LPS) aktivovaných B-buňkách, např. Coffman a spol.: J. Immunol. 156, 4558 až 4-541 (1986), Sideras a spol.: Eur. J. Immunol. 15. 586 až 593 (1985)· Tyto aktivity lze měřit standardní imunoanalýzou pro protilátkový isotyp, jak to popsal Coffman a spol.:.J. Immunol. 156, 94-9 až 954 (1986). Ve stručnosti se to provádí tak, že B-bunky se aktivují EPS kultivováním s těmito pólysacharidy, například asi 4 mikrogramy/ml Salmonella typhimurium LPS (dostupná od firmy Sigma) nebo asi 5θ yUg/ml EPS extrahovaného z E. coli 055 (jak shora popisuje Sideras a spol·). Po 4 až 8-denní kultivaci se isolují supernatanty pro analýzu. Pro měření různých koncentrací isotypů se mohou používat standardní analýzy typu ELISA specifické pro isotyp. Anti-isotypové protilátky pro analýzu jsou komerčně dostupné nebo se mohou získat z ATCC.

Aktivita faktoru stimulujícího kolonie (CSF) se stanovuje následujícím způsobem: Pro stanovení CSF aktivity se homopoietické buňky, například buňky kostní dřeně nebo buňky krve z pupeneční šňůry, uvedeou do suspense jednotlivých buněk. Tyto buňky se pak imobilizují v polopevném (agaro- Dí “ vén) nebo ve viukozníu (ne-hyleeiulosověm) o živné látky 3 obvykle plodové telecí sérum. V přítomnosti příslušného stimulačního faktoru budou jednotlivé buňky proliferovat a diferencovat se. Jelikož původní buňky jsou zmobilizované, kolonie se vyvinou jako buňky proliferované a maturované. Tyto kolonie se pak vyhodnotí po 7 až 14 dnech (Burgess A.: “Growth Factors and Stem Cells, str. 52 až 55» Academie ^resá, New York, 1984.). (Pro specifické aplikace růstu granulocytů a makrofágů, viz Braděly T. a Metcalf D.: Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 44, 287 až 3θθ (1966) a obecně viz Metcalf D.: Hemopoietic Cóloníes, Springer-Verlag, Berlin, 1977·)· Jestliže je to žádoucí, jednotlivé kolonie se mohou extrahovat, umístit na mikroskopická sklíčka, fixovat a obarvit barvivé, Wright/Geimsa (Todd-Sanford:Clinical Diagnosis by Laboratory Methods,'15. vydání, (řed.) Davidson a Henry (1974).)· Potom lze provést morfologickou analýzu typů buněk přítomných v jednotlivé kolonii.

Buňky kostní dřeně se odeberou pacientovi s nehematologickou chorobou a převrství se přes Ficoll (typ 400, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), odstřelují sě (2000 otáček za minutu) (dvacet minut) a buňky na rozhraní'še odstraní, '^yto buňky še promyjí dvakrát Dulbeccovým mediem modifikovaným podle Is^vea, které obsahuje 10 % plodového telecího sera (PCS), resuspendují se ve stejném mediu a adherentní buňky'se odstraní adherencí na Petriho desky z umělé hmó^ty. Neadherentní buňky se v množství 10^ buněk/ml přidají k Iscoveově mediu obsahujícímu 20 % FCS, 5θ /UM 2-merkaptoethanolu, 0,9 % methylcelulosy a různé koncentrace buu supernatantů, o nichž je známo, že obsahují kolonie stimulující aktivitu, nebo testovaných supernatantu. Jednomililitrové podíly se vysejí do 35imn Petriho misek a kultivují se při 57 °C ve vodou nasycené aínosféře se 6 % oxidu uhličitého ve vzduchu·Po třech dnech kultivace se na každou desku přidá jedna jednotka erytropoietinu. Desátý den as čtrnáctý den se inversním mikroskopem spočtou kolonie granulocyt-makrofág a erythroidní bursty.

Buňkv a krve ouoeneční šňůr^- v heoarinu se odstřeňují o X. - v )0Q otaehacn. ze minutu. Buňky oílých krv v mezifází mezí plasmou a maximem buněk červených krvinek se íaesou.

mna Vk-v oosaňl·

0,171;

bri rub, ³o pěti minutách v ledu se susoense nřevrství 4 ml

EEGS a odstřeďuje se šest minut při 2000 otáčkách za minutu. Buněčné pelet-, se promyjí Dulbeccovým fosforečnanem sodným pufrováným solným roztokem a postupně se postupuje stejně jak shora uvedeno pro buňky kostní dřeně (stupeň s Ficollem a adherence na umělé hmotě). Neadherentní buňky’s nízkou hustotou se isolují a v množství 10^ buněk na kulturu se umístí do polopevného kultivačního media jak shora popsáno.

•^a konci analýz se složení buněk stanoví po aplikaci jednotlivých kolonií na skleněné deštily a vybarvení baroví vem Wright-Giemsa. Eosinofily se vybraví barvivém Luxol Past Blue” (Johnson G. a Metcalf D.: Exp. Hematol. 8/549 až 561 (1980).

Pojem potenciace” (zesílení), jak je zde používán v odkazech na růst gcaňulócytú stimulovaný GM-CSF, znamená, že kolonie granulocytů ve shora popsaných analýzách jsou větší, jestliže se používá’GM-CSF společně s IL-4 než u GM-CSF samotného.

Čistění získaných polypeptidů a příprava farmaceutických prostředků se provádí následujícím způsobem: Polypeptidy podle tohoto vynálezu, které se získávají expresí v E. coli, v kvasinkách nebo v jiných buňkách, mohou být čištěny standardními postupy známými odborníkům, mezi· než patří srážení síranem amonným, frakcionace chromátografií na sloupci (například na iontoměniči, gelová filtrace, elektroforesa, afinitní chromátografie atd.) a konečně rekrystalizace (obecně viz Enzyme Purification and Related Techniques, Methods in Enzymology 22, 255 až 577 (1977) a Soopes S.: Protein Puriification: Principles and Practice”, Springer-Verlag, New York, 1982.). Jednou vyčištěné, búd částečně nebo do homogenity, mohou se tyto polypeptidy podle tohoto vynálezu používat pro výzkumné účely, například jako doplňky pro media určená ke kultivaci buněk (příkladem je minimální esenciální medium podle Ea gly ho, Iscoveem modifikované

Chemieai Como , St. Louis, Mo.) a Gibco Divisoři (Chagrin Falls, Oh.)) a jako antigenní látka pro vyvolání specifických imunoglobulinů použitelných v imunoanalýzách, imunofiuorescenčních barvivech atd. (viz obecně “Immunological Methods”, díly I a II, (red.:) Lefkovits I. á Pernis B., Academie Press, New York, N.Y. (1979 a 1931) a “Handbook of Expeánental Immunology” (red.:) Weih D., Blackwell Sci_ entific Publications, St.'Louis, Mo. (1973)·)·

Polypeptidy se mohou používat také ve farmaceutických prostředcích, například pro zvýšení obranyschopnosti proti různým infekcím. Tak pacienti s reymatickouartritidou, v případě potřeby transplantu, nebo s imunodeficiencí způsobenou chemoterapií rakoviny, pokročilým věkem, imunosupresivními činidly atd., mohou být léčeni takovými polypeptidy. Tyto prostře^? mohou stimulovat selektivně různé složky imunitního systému, bučí samotné nebo s jinými činidly dobře známými odborníkům. Mezi tyto prostředky patří imuno-reaktivní činidla, jako jsou například lymfokiny (například IL-1, IL-2 atd.), jakékoliv faktory stimulující kolonie, imunoglobuliny atd·, z hlediska vlivu na zesílení aktivit . polypeptidů podle tohoto vynálezu. Tyto polypeptidy naleznou použití také v situacích (in vivo nebo in vitro), v nichž je žádoucí zvýšená proliferace buněk nebo zvýšení produkce imunoglobulinů.

Farmaceutické prostředky podle tohoto vynálezu se mohou připravovat tak, že se tyto polypeptidy smíchají s výhodou s inertními farmaceuticky přijatelnými nosiči. Vhodné nosiče a vhodné způsoby přípravy farmaceutických prostředků jsou dobře známé odborníkům (viz např. Remington*s Phag/raceutical Sciences and U.S. Pharmacopeía: National Formulary**,

Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1934.). Výhodným’způsobem podávání je parenterální podávání, které může zahrnovat použití mechanických dodávacích systémů.

ar, -r, '-'J

Farmaceutický prostředek s$ připravuje s výhodou tak, existoval v jednotkové dávkové formě. Každá jednotka ob- 4u -

složky v jednotkové dávce prostředku může být různé nebo se upravuje na 1 yUg až 100 mg podle toho kterého použití a oodle aktivity účinné složky. Jestliže je to žádoucí, může prostředek obsahovat jiná terapeutická činidla.

Dávkováni je různé. Závisí na potřebách pacienta, na intensitě stavu poruchy, která je léčena, a na sloučenině, která se používá. Pojem efektivní množství jak je tento pojem používán, zde znamená, že se tyto faktory berou do úvahy při stanovování žádoucích dávek. Stanovení příslušného dávkování pro konkrétní situaci je v rukou odborníků. Obvykle se léčení počíná s menšími dávkami, které jsou menší než je optimální dávka sloučeniny. Potom se dávka zvyšuje z # po malých množstvích a£ do dosaženi optimálního učinku pro daný případ. Je-li vhodné, pak se celková denní dávka může rozdělit a podat se v několika menších dávkách během dne.

Na závěr této části spisu budou popsány používané expresní systémy. Pro přípravu proteinů a muteinů podle tohoto vynálezu se mohou používat rozmanité expresní systémy (tj. kombinace hostitel-vekfcor). Mezi možné typy hostitelských buněk patří buňky (ale nejsou omezeny jenom na ně) bakterií, kvasinek, hmyzu, savců a podobně. Optimalizace exprese příslušného proteinu nebo muteinu závisí na mnoha faktorech, jako je například 1) povahu proteinu nebo muteinu, které mají být expresí připraveny, například zda produkt exprese je jedovatý pro některé hostitelské systémy, 2) zda je žádoucí a jaké typy po-translačních modifikací jsou žádoucí, například rozsah a druh glykosylace může ovlivnit výběr hostitele, 5) povaha 5'a ?>' oblastí obklopujících oblast kódující protein nebo mutein, o který nám jde, například výběr promotorů a/nebo sekvencí potřebných pro regulaci translace je rozhodující pro účinnost exprese, 4) jestli jde o přechodnou nebo stabilní expresi, 5) snadnost oddělení produktu získaného expresí od proteinů a dalších látek hostitelských buněk a/nebo kultivačního prostředí, 6) snadnost a účinnost transfekce hostitelů, které přechodně expresí poskytují protein nebo mutein, o který nám jde, 7) množství.

buněčné .	knirur,,, které se porzív	a prc expresi prsu
muteinu,	o který nám jde, 3) jes	tli protein nebo m
který ná	m jde, je při expresi zi	snuvan nopOjen.y í-cí
proteinu	endogenní pro hostitele	a podobné faktory

neoo * .m. 4“

Obecně jsou pro klonování DNA sekvencí podle tohoto vynálezu výhodné prokaryoty. Obecným průvodcem pro používání prokaryotických expresních systémů jsou následující citace: Maniatis a spol.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor'Laboratory, N.Y., 1932, Perbal: ”A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley and Sons, N.Y., 1984, Glover: DNA Cloning: A Practical Approach, díl I. a

II., ISL PressÍ Oxford, 1985 a de Boer a spol.: Strategies for Optimizing Foreign Gene Expression in Escherichia Coli” v Genes: Structure and Expression, Kroom (red.) , John Wiley and Sons, N.Y., 1983. Zvláště užitečný je například E. coli K12 kmen 294 (ATCC č. 31446). Mohou se používat i jiné mikrobiělní kmeny, ’například kmeny E. coli. jako je například E. coli B a E. coli X1776 (ATCC č. 31557). Tyto příklady jsou ovšem zamýšleny spíše jako ilustrující než omezující.

Pro expresi se mohou používat také prokaryoty. Mohou se používat shora uvedené kmeny, E. coli W3110 (Fs, λ~, prototrofní, ATCC č. 27 325)» bacily, jako je například Bacillus subtilis a jiné enterobaktaie, jako je například Salmonella typhimurium nebo Serratia marcesans, a různé druhy pseudomonas.

Plasmidové vektory obsahující sekvence replikonu a regulace, které jsou odvozeny od druhů slučitelných s buňkou hostitele, se používají ve spojení s těmito hostiteli. Tento vektor obvykle nese místo replikace a sekvence markéru, který je schopen poskytnout transformované buňce fenotypovou selekci. Například E. coli se často transformuje plasmidem p3S322, plasmidem odvozeným od druhu E. coli (Bolivar a spol.: Gene 2, 95 (1977).)· Plasmid p3S322 obsahuje geny ampicilinové a tetracyklinové resistence. Tato skutečnost představuje snadný prostředek pro identifikaci transformo- -Η-2 váných ounek. '~lnm/sh.d ρ33ρ22 něco jiný nii musí obsahovat také, neoo musí být upraven tak, orono uory, ntere luCíio u. v^/CLz»lvcc 2,k-c*oc-.5J.h2 oí? prc expresi jejich vlastních proteinů. Mezi tyto promotory nejobvykleji používané při konstrukci rekombinantní DNA patří β-laktamasa (penicilinasa), promotorové systémy laktosy (Chang a spol.: Nátuře 275» 615 (1973), Itakura a spol.: Science 198« 1056 (1977)» Goeddel a spol.: Nátuře 281, 544 (1979)) a promotorovy systém tryptofanu (trp) (Goeddel a ' ' spol.: Nucleic Acids Pes. 8, 4057 (1930), přihláška evropského patentového úřadu č. 0036776). I když tyto promotory jsou nejobvykleji používány, byly objeveny a jsou využívány 7 jiné mikrobielní promotory. Podrobnosti týkající se jejich sekvencí nukleotidů byly publikovány. Tyto znalosti umožňují, aby je zručný odborník mohl funkčně ligovat s plašmidovými vektory (Siebenlist: Cell 20, 269 (1980).).

obsahoval,

Vedle pro kary o tů se mohou používat také eukaryotické ... mikroby, jako jsou například kultury kvasinek. Mezi nejobvykleji -používané eukaryotické mikroorganismy patří Saccharo- . myces cerevisiae neboli obyčejné pekařské kvasnice. Pro expresi v Saccharomyoes cerevisiae se obvykle používá plasmid YPp7 (Stinchcomb a spol.: Nátuře 282, 39 (1979), Kingsman a spol.: Gene Z., 141 (1979)» Tschémper a špol.: Gene 10,

157 (1980).). Tento plasmid již obsahuje gen trp 1, který poskytuje selekční markére pro mutovaný kmen kvasinek tím, že mu chybí schopnost růstu v tryptofanu, například ATCC č. 44 076 nebo PEP4-1 (Jones: Genetics 85, 12 (1977)·)· Přítomnost: části trpí, jako charakteristiky genomu buňky kvasinkového hostitele tak poskytuje efektivní způsob detekce transformace růstem za nepřítomnosti tryptofanu.

Mezi vhodné pron&orové sekvence kvasinkových vektorů patří promotory 3-f°sfoglycerátkinasy (Hitzeman a spol.:

J. Biol. Chem. 255» 2073 (1980).) nebo jiných glykolytických enzymů (Hess a spol.: J. Adv. Enzyme 3eg. 2.» 149 (1968), Holland a spol.: Biochemistry 1(7, 49ΟΟ (1978)·), jako jsou například enolasa, glyceraldehyd-3-fosfát-dehydrogenasa, hexokinasa, pyruvát-dekarboxylasa, fosfofruktokinasa, glukosoΜ· <-*· —

0/ ο ·~ ί

triosefosfát-isomerasa, fos nass. Při konstrukci vhoén; načni sekvence asociované i 'oglukoso-isomerasa a glukokih expresních, plasmidů se termitími to geny také liguji do expresního vektoru v poloze 3' sekvence, která má být získána expresí. Tím dojde k pólyadenyláci mRNA a k terminaci. Jinými promotory, které mají další výhody v transkripci regulo váné podmínkami růstu, jsou prostorové oblasti alkohol-dehydrogenasy 2, isocytochromu C, kyselinové fosfatasy, degradativních enzymů souvisejících s metabolismem dusíku, shora uvedená glycer_gldehyd-3-fosfát-dehydrogenasa a enzymy zodpovědné za využití maltosy a galaktosy (Hollandí viz výše.). Jakýkoliv plasmidový vektor obsahující s kvasinkou slučitelný promotor, počátek replikace a sekvenci terminace, je vhodný.

Jako hostiteleé se kromě mikroorganismů mohou používat také kultury buněk odvozené od vícebuněčných organismů. V principu lze použit jakoukoliv buněčnou kulturu, aň od obratlovců nebo bezobratlých. Největší zájem byl však soustředěn na buňky obratlovců a množení buněk obratlovců v kultuře (tkáňová kultura) se stalo v nedávných dobách rutinním postupem (Tissue Culture”, Academie Press, Kruše a Patterson (redaktoři), 1973.)Příklady takových užitečných linií hostitelských buněk jsou VĚRO a Hela buňky, buňky vaječníků čínského křečka (CHO) a buněčné linie WI38, BHK,

COS 7, myšího myelomu (ATCG č. TIB 19 nebo TIB 20) a MDCK. Expresní vektory pro takové buňky obvykle obsahují (jestliže je to nutné) počátek replikace* a promotor umístěný v čele genu, který má být expresí získáván, spolu s jakýmikoliv nutnými ribosomovými vazebnými místy, místy střihu RNA, pólyadenylačním místem a sekvencemi terminace transkribce.

Při používání savčích buněk se regulačních funkcí na expresních vektorech dosahuje často virovým materiálem. Obvykle používané promotory jsou odvozeny od polyoma, adenoviru 2 a nejčastěji od SV40 (Simian Virus 40). Zvláště užitečnými jsou časný a pozdní promotor viru SV40, protože oba jsou snadno získatelné z tohoto viru jako fragment, také

ÍV40 virový počátek replikace (Piers a spol·: Nátuře 275, 113 (1978)·). Je možné používat také menší nebo větší fragmenty SV4O za předpokladu, že obsahují sekvenci o přibližně 250 párech nukleotidů od místa Hi;ndIIl k místu BglI umístěnému ve virovém počátku replikace. Bále je také možné a často žádoucí využít sekvence promotoru nebo regulace normálně asociované se žádanou sekvencí genu za předpokladu, že taková sekvence regulace je slučitelná se systémy buněk hostitele.

Počátkem replikace může být buď exogenní počátek na vektoru, například počátek odvozený od SV40 nebo jiných virových zdrojů (např. Polyoma, Adeno, VSV, BPV atd.) nebo endogenní.od chrómosomového replikačního mechanismu buňky hostitele. Často je postačující integrovat vektor do ohromo somu buňky Hostitele.

Při výběru výhodné buňky hostitele pro transfekci vektory podle tohoto vynálezu,’ které obsahují DRA sekvence kódující jak tJPA tak DHFR protein, je vhodné vybrat hostitele podle typu použitého DHFR proteinu. Jestliže se používá DHFR protein přírodního typu, je výhodné vybrat takovou hostitelskou buňku, která je deficitní na DHFR. Tím se umožní použít sekvenci kódující DHFR jako markér pro úspěšnou transfekci v selektivním mediu, kterému chybí hypoxanthin, glycin a thymidin. Takovými příslušnými hostitel skými buňkami jsou buněčné linie vaječníků čínského křečka (CHO) deficitní na DHFR aktivitu, připravené a množené jak popisují Urlaub a Chazin: Proč. Ratl. Acad. Sci. (USA) 77,

4216 (1930).

Ra druhé straně - jestliže se jako regulační sekvence používá DHFR protein s nízkou vazebnou afinitou na MTX, není nutné používat buňky resistentní vůči DHFR. Jelikož mutant DHFR je resistentní na methotrexát, mohou se jako prostředky přo selekci používat media obsahující IvITX za předpokladu, že hostitelské buňky jsou samy citlivé na methotrexát. Jednou z takových užitečných buněčných linií je linie CHO, CH0-K1, ATCC číslo CCL 61.

Příklad;/ provedení vynálezu

Následující příklady slouží jako ilu^srace tohoto vynálezu. Výběr hostitelů a vektorů a stejně tak i koncentrace reakčních činidel, teploty a hodhoty dalších proměnných veličin jsou zde uvedeny pouze jako příklady aplikace podle tohoto vynálezu a neměly by být považovány jako jeho omezení.

V příkladech budou používány následující materiály a metody: T buněčné linie Gl.Lyl⁺2”/9 (označované jako Cl.l), Babel G., Greenberger J. S., Sakakeeňy lví. A. a Cantor H.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 28, 1157 až 1161 (1981) a GEL5-1 (dodané M. Giedlinem, DNAX Research Institute óf Molecůlar and Cellular Biology, Inc.j DNAX) byly resuspendovány v

1% PCS a 2 yug/ml Con A po 24 hodin. Tyto supernatanty byly spojeny a skladovány při - 70 °C.

Klonované linie žirných buněk MC/9 (Nable G., Galii

S. J., Dvorak Η. P. a Cantor H.s Nátuře 291« 332 až 3£4 (1981) byly získány od G. Nabela (Dana Fárber Cáncer Institute} DPCI). Linie žirných buněk MM3 (poskytnuté R. Coffmanem, DNAX) a Dx-2 (odvozené D. fíennickem, DNAX) byly charakterizovány nepřítomností markérů asociovaných s myelomonocyty a přítomností IgE receptorů a hladin histaminu větších než 250 ng/ΙΟθ buněk. Linie myeoloidních NFS-60 buněk se získá podle J. Ihleho (Prederick Cancer Research. Pacilityj FCRP). Subklonováním NFS-60 buněčné linie se získá klon závislý na IL-3. T-buněčná linie HT2 byla získána od

S. Strobera (Stanford University, Palo Alto, Ca.), CTLL-2 byla dodána W. Farrasem (FCSF) a Ly 23/4 byla dodána G. ' Nabelem (DPCI), Linie žirných buněk a T buněk byly kultivovány v RPivH 1640, 10% PCS, 50/UM 2ME doplněném o rekom— binant IL-3 nebo IL—2.

— 46 xilfí din.'/ linií byly analyzován;/ několika na IL-5 závislých buněčných způsobem podle Shoreho P. A., Burkhsltera A. s Conna V.H.: c. Phamfl· xxp. Ther. 127, 132 až 136 (1959)· Aktivita růstového faktoru T buněk a žirných buněk byla stanovena pomocí inkorporace Í^Hj-thymidinu nebo kolorimetrickou analýzou, jak popisuje Mósmann T.i J. Immunol. Methods 65, 55 až 65 (1985)·

IL-5 vyčištěný ze supernatantů WEHI 5 byl darován J.

Ihlem (FCRF). Rekombinantní IL-2, IL-5, GM-CSF a IFN-/' byly používány Ve formě supernatantů z ledvin buněk opice (COS 7) transfektovaných odpovídajícími cDNA klony. Jedna jed- notka IL-2, IL-5 nebo GM-CSF byla definována jako množství faktoru', které stimuluje 5θ % maximální inkorporace I^Llthymidinu na faktoru závislých buněčných linií (Renníck D. a spol.í-J. Immunol. 154, 91θ až 919 (1985)·)· Jedna jednotka IFN-ochrání 50’% myších L buněk proti cytopathogenním vlivům viru vesikůlární stomatitidy (Schreiber R. a spol.: J. Exp. Med. 156, 677 až 689 (1982).).

B-buňky se připraví ze suspense jediného typu buněk myších slezinných buněk zbavených T buněk a makrofágů podle standardních postupů (Howard M. a spol.: J. Exp. Med. 155*

914 (1982).). Zde popsaný vyčištěný faktor byl testován na svoji schopnost indukovat la expresi na B-buňkách cytofluorometrickou analýzou a stimulováním prolifeřace B-buněk anti-Ig kostimulující analýzou, jak je to popsáno v práci Roehma a spol.: J. ^xp. Med. 160, 679·

Stanovení proteinů byla založena buž na UF absorpci (230 nm nebo 220 nm) nebo na standardních křivkách zkonstruovaných pomocí analýzy vážící barvivo (Bradford M.: Annual Biochem. 22, 248 až 254 (197θ)·)· Supernatanty se na počátku. dvacetinásobně zkoncentrují kazetovou jednotkou Pellicon (Millipor, Bedford, Ma.) nebo (po chromátografii s obrácenými fázemi) odpařením rozpouštědla v přístroji Speedvac” (Savant, Farmingdale,,NY). SDS PAGE byla prováděna pomocí Laemmliho systému (Laemmli U.: Nátuře 227, 680 až 685 (197θ)·)·

- ^z+ í ,mm tanaarey ;

Švedí '-j :XO kou molekulovou hmotou phamjPacia (Pharmacia, Uppsala, oGely byly vybavovány stříbrem způsobem popsaným Merrilem 0. a spol.; Science 211, 1437 ač 143S (1981). Při analýzách MGGF a TGG? aktivity jako funkce molekulových hmot se vzorky s nebo bez předcházející redukce 50 mM DTT elektroforesují, gely se roz. řežou na lmm sekvence, rozdrtí a protein se eluuje přes noc při 4 °C v 0,5 ml analyzovaného media doplněného o 5 mg/ml ovl^buminu (Sigma, St. Louis, Mo_e).

Chromatografie se provádí při 18 °G na systému Pharmacia FPLC s detektorem Kratos Spectroflow 773 UV” (Kratos, Ramsey, RJ. ). Chromatografie na katexu používá kolonu'Pharmacia Mono S” (0,5 x 5 cm) ekvilibrovanou 50mM fosforečnanem sodným a lmM EDTA o pH 7,0. Supernatanty byly na kolonu naneseny ve stejném pufru, eluovány byly gradientem chloridu sodného do 1M koncentrace.

Pro chromatografií s převrácenými fázemi byla požita kolona Pharmacia 08 (0,5 x 2 cm). Vzorek zředěný 0,1% TPA (pH 2)se nanese na kolonu a eluuje se acetonitrilovým gradientem s 0,1 % TPA.

Isoelektrické body MCGF a TCGF aktivit byly zjišťovány chro matofokusací na koloně Pham/racia Mono S (0,5 x 5 cm). Vzorek v 0,025M bis tris, pH 7,1, se nanese na kolonu Mono P ekvilibrovanou stejným pufrem. Gradientova eluce se provádí pufrem Pharmacia Polybuffer 74 , pH 4,0 (Zředění 1 · 10, pH se upravuje 0,2M aminodioctovou kyselinou). pH eluátu se nepřetržitě sleduje pH monitorem (Pharmacia). Před injekcemi se všechny vzorky zfiltrují jednotkou Millex GV 0,2/U (Millipore).

Frakce z SDS PAGE z chromatografie se analyzují na schopnost podporovat proliferaci tří buněčných linií; NFS-60 (IL-3), MC/9 (MCGF) a HT2 (TCGP).

Pri čištěni tohoto faktoru do homogenity se osm litrů Con-A-aktivovaného 01.1 supernatantu dialyzuje ve 20mM pufru HEPES, pH 7,0, potom se nechá projít kolonou s katexem Pharmacia Mono S 10-10 ekvilibrovanou stejným pufrem. Maximunaktivity bylo eluováno lineárním gradientem solným pufrem při 0,2M koncentraci chloridu sodného. Tento materiál byl spojen, zahuštěn, redialyzován ve 2Cml pufru HEPSS, pH 7,0, a nanesen na Heparin-Sepharosovou kolonu ekvilibrovanou stejným pufrem. Maximum aktivity bylo eluováno lineárním solným gradientem od O,45M koncentrace do 2M koncentrace chloridu sodného. Tento materiál byl spojen, zředěn 10 x 0,10/TFA/H₂0, pH 2, a frakcionován na koloně s obrácenými fázemi Vydac (c4). Eluce lineárním gradientem acetonitrilu, 0,1% TFA, poskytla aktivitu při 42% koncentraci acetonitrilu.

Příklad 1

Nová příprava myších IL-'4 cDNA z Cl.Lyl⁺2~/9 buněk a přechodná exprese v opicích buňkách COS 7 cDNA klony kódující IL-4 byly isolovány z myší pomocné buněčné linie Cl.Lyl⁺2“/9, která je uložena v ATCC pod číslem CRL 8179, a která je popsána Kabelem a spol.í Cell 23, až 28 (1981) a Proč. Nati. Acad. Sci. 78, 1157 až 1161 (1981). Mezi jiné myší bůžky, o nichž je známo, že produkují BCGF aktivitu, patří linie EL-4, která je dostupná od ATCC pod číslem TIB 39· Postupy, které jsou v tomto příkladu používány, byly popsány Leemem a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. 83, 2061 až 2065 (1986). Ve stručnosti se postupuje tak, že se zkonstruuje pCD cDNA banka z informační RNA (mRNA) z konkanavalinem A·. (ConA) indukovaných buněk Cl.Lyl⁺2“/9 podle postupu popsaného Okayamou a Bergem, jak shora uvedeno. Klony IL-3 a GM-CSF se z velké podbanky náhodně vybraných klonů odstraní hybridizací P_ značenými cDNA sondami. Sestaf vy a/nebo jednotlivé klony ze zbytku podbanky se analyzují na IL-4 cDNA transfekcí opičích buněk COS 7 a testováním supernatantů kultury na MCGF a TCGF aktivitu.

A. Indukce produkce IL-4

Buňky Cl.Lyl⁺2“/9 se indukují ConA tak, aby produkovaly IL-4 mRNA následujícím způsobem: Buňky se kultivují v množství 5.10^ na mililitr v Dulbeccem modifikovaném Eagleho bnuje εο vazebným pufrem (lOrň'. Trio, p~ 7,4, lr.f.I EDTA, 0,5M chlorid sodný, 0,5% SDS). Eluent z kolony byl nechán ječte dvakrí nro,i kolonou. Kolona se ?orr *Í* z ho pufru. PolyA mRNA se isoluje promytím elušním pufrem. RNA se obvykle eluuje v prvních dvou ml elučního pufru. SNA se vysráží 1,1 objemu 3M octanu sodného (pH 6) a dvěma objemy ethanolu. RNA peleta se isoluje odstřelováním, promyje se dvakrát studeným ethanolem a vysuší. Peleta se pak resuspenduje ve vodě. Jednotlivé podíly se zředí a stanoví se absorbance při 260 nra.

C. Konstrukce banky pcD cDNA

l)Příprava vektorového primeru a oligo&G)-končících linkerových DNA

Použije se postup podle Okayamy a Berga (Mol. and Cell. Biol. 2, 161 až 170 (1982).) s pouze malými modifikacemi. Plasmidy pcDVl z pLl jsou popsány Okayamou a Bergem (Mol. and Cell. Biol. 2» 380 až 389 (1983).^Tyto plasmidy jsou dostupné od f^mi Pharmacia (Piscataway, H.J. ). Byl pouzíván modifikovaný plasmid pcDVl, který obsahuje Nsil místo v dřívějším umístění místa KpnI.

Vzorek 80 mikrogramů pcDVl se při 30 °C rozštěpí působením 20 jednotek endonukleasy KpnI v rěakční směsi 450 ^ul obsahující 6 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM chloridu horečnatého, 6 mM chloridu sodného, 6 mM 2-merkaptoethanolu a 0,1 mg hovězího sérového albuminu (BSA) na mililitr. Po 16 hodinách se štěpení ukončí přidáním 40 mikrolitrů O,25M EDTA (pH 8,0) a 20 mikrolitrů 10% dodecylsulfátu sodného (SDS). DNA se isoluje extrakcí směsí vody nasycenou směsí (1:1) fenolu s chloroformem (dále zde označovanou jako směs fenolu s chloroformem) a následujícím vysrážením ethanolem. Homopolymerní konce o průměru 60, ale ne více než 80, deoxythymidylátových. zbytků (dT) na konec se přidají k endonukleasou Nsil generovaným koncům s koncovou transferasou telecího brzlíku následujícím způsobem· reakční směs (38 mikrolitrů) obsahovala kakodylát 3odný-30mM Tris.HCl, pH 6,8, jako pufr s lmM chloridem kobaltnatým, 0,lmM dithiothreitolem, O,25mM dTTP, DNA rozštěpenou endonukleasou Nsil a 68 jednotek koncové deoxy49 čtrnáctihodinove inkubaci pri se supense buněk odstřeluje za minutu. Isolují se buněčné mediu (DLÍŠ) se 4 % tepelně inaktivovaného plodového telecího sera, 5.10“2-merkap to ethanolem (2-LÍS), 2mM glutaminem, neesenciálními aminokyselinami, esenciálními vitaminy a 2 /ug/ml ConA. Po dvanácti až °C s 10 % oxidu uhličitého deset minut při 1500 otáčkách pelety, které se okamžitě zmrazí na - 70 °C.

B. Isolace mRNA

Celková buněčná DNA se isoluje z buněk guanidin-isothiokyanátovým postupem podle Chfrgwina J. a spol. (Biochemistry 18, 5294 až 5299 (1979)0). Zmrazené buněčné pelety z ConA-indukovaných Cl.Lyl⁺2”/9 buněk (12 hodin po stimulaci) se suspendují v lysovacím roztoku guanidin-isothiokyanátu. Dvacet mililitrů lysovacího roztoku se použije pro 1,5.10θ buněk. Pelety se resuspendují pipetováním, DNA se pak rozstříhá čtvero projitím injekční stříkačkou s jehlou (16 gauge).

Tento lysát se navrství na 20 ml 5,7M chloridu česného a lOmM EDTA ve 40ml polyallomerní zkumavce pro odstřelování. Tento roztok se odstřeluje při 25 000 otáčkách na odstředivce Beckman SW28 rotor” (Beckman Instruments, lne., Palo Alto, Ka.) čtyřicet hodinpři teplotě 15 °C. Guanidin-isothiokyanatová fáze obsahující DNA se odpipetuje až do mezifází. Stěny zkumavky a mezifází se promyjí dvěma až třemi ml guanidin-isothiokyanatového lysovacího roztoku. Zkumavka byla odříznuta pod mezifázím nůžkami. Roztok chloridu česného se dekantuje. RNA pelety se promyjí dvakrát studeným 70% ethanolem. Pelety se pak resuspendují v 500 ^ul 10mM Tris. oHCl, pH 7,4, ImM EDTA a 0,5% SDS. Přidá se 50 yui 3M octanu sodného a RNA se vysráží 1 ml ethanolu. Odstřelováním se isoluje asi 0,3 mg celkové RNA. Pelety se promyjí jednou studeným ethanolem.

Pelety promyté a vysušené celkové RNA se resuspendují v 900 /ul oligo(dT) elučního pufru (lOmM Tris-HCl, pH 7,4, ImM EDTA, 0,5% SDS). RNA se zahřívá tři minuty na 68 °C. Potom se ochladí v ledu. Přidá se 100 ^ul 5N chloridu sodného. Vzorek RNA se nanese na 1-ml oligo(dT) celulosovou kolonu (typ 3, Collaboration Research, Waltham, Ma.), ekvili51 nuklso tily!transfer· Po třiceti minutách O,25X 3DTA (pH 8,0) při 37 a 10 m °C se reakce zastaví 20 raikrolitry .krolitry 10% SOS. DNA se isoluje několika extrakcemi směsí fenolu s chloroformem a vysrázenam ethanolem. DNA se pak rozštěpí 15 jednotkami endonukleasy EcoRI v 50 mikrolitrech obsahujících 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM chloridu horečnatého, 1 mM dithiothreitolu a 0,1 mg BSA na mililitr pět hodin při 37 °C. Velký fragment, který obsahuje SV40 polyadenylační místo, počátek replikace pBR322 a gen ampicilinové resistence, se vyčistí elektroforesou na agarosovém (1%) gelu a isoluje se z gelu modifikací postupu se skleněným práškem (Vogelstein B. a Gillespie D.: Proč. Nati. Acad. Sci. 76, 615 až 619 (1979).). dT-koncová DNA se pak dále vyčistí absorpcí a elucí z kolony s oligo (dA)celulosou následovně: DNA se rozpustí v 1 ml lOmM Tris.HCl, pH 7,3, pufru obsahujícím lmffi EDTA a 1M chlorid sodný, ochladí se na 0 °C a aplikuje se na kolonu s oligo(dA)-celulosou (0,6 x 2,5 cm) ekvilibrovanou stejným pufrem při 0 °C a eluovanou vodou za teploty místxřsti. Eluovaná DNA se vysráží ethanolem a rozpustí se v lOmffi Tris-HCl, pH 7,3, s lmffi ethylendiaminotetraoctovou kyselinou (EDTA).

DNA s napojeným oligo(dGQkoncem se připraví tak, že se 75 mikrogramů pLl DNA rozštěpí 20 jednotkami endonukleasy Pstl ve 450 mikrolitrech směsi obsahující 6 mffi Tris-HCl, pH 7,4, 6 mffi chloridu hořečnatého, 6 mffi 2-merkaptoethanolu, 50 mM chloridu sodného a 0,01 mg BSA v mililitru. Po šestnácti hodinách při 30 °C se reakční směs extrahuje směsí fenolu s chloroformem a DNA se vysráží alkoholem. Konce 10 až 15 deoxyguanylátových (dG) zbytků se pak přidají na konec se 46 jednotkami terminální deoxynukleotidyl-transferasy ve stejné reakční směsi (38 mikrolitrů) jak shora popsáno s tím, ze se 0,1 mM dGT? nahradí dTTP. Po dvaceti minutách pri 37 °0 se reakční směs extrahuje směsí fenolu s chlorofor. mem a DNA se vysráží ethanolem. Potom se štěpí působením 35 jednotek endonukleasy HindlII v 50 mikrolitrech směsi obsahující 20mM Tris-HCl, pH 7,4, 7mM chlorid hořečnatý, 60mM chlorid sodný a 0,1 mg BSA čtyři hodiny při 37 °C. Malá DNA s oligo(dG) linkerem se vyčistí na agarosovém gelu (l%)elek troforesou a sroluje ss j;

tK shora popsáno.

2) Příprava banky cDNA

Stupeň 1: syntéza cDNA. Reakční směs (10 _zul) obsahovala 50™:.: Tris-HCl, pH 8,3, SýnN chlorid horečnatý, 30mM chlorid draselný, 0,3mM dithiothreitol a 2 mM každého z dATP, dTTP, dGTP a dCTP, 20 yuCi ³²?-dCT? (3000 Ci/mmol), 3 yug polyA⁺ RNA z Con-A indukovaných T-buněk, 60 jednotek RNasinu (obchodní označení inhibitoru ribonukleasy od Promega Biotec, lne., Madison, Wi.), dva mikrogramy DNA primeru vektoru (15 pmolů primerového konce) a 45 jednotek reversní transkriptasy. Reakce se inkubuje 60 minut při 42 °C. Reakce se potom zastaví přidáním 1 mikrolitru 0,25M EDTA (pH 8,0)a 0,5 mikrolitrů 10% SDS. Přidá se 40 mikrolitrů směsi fenolu s chloroformem, rozťok se intensivně míchá v míchači Vortex a potom se odstřeďuje. K vodné fázi se přidá 40 mikrolitrů 4M octanu amonného a 160 mikrolitrů ethanolu. Roztok se ochladí suchým ledem (15 minut) , zahřeje se na teplotu místnosti za mírného třepání, aby se rozpustily nezreagované deoxynukleotidftrifosfáty, které se vysrážely během ochlazování a odstřeluje se deset minut v Eppendorfově mikroodstředivce. Peleta se rozpustí v 10 mikrolitrech 10mM Tris-HCl, pH 7,3, a lmM EDTA, smíchá se s 10 mikrolitry 4M octanu amonného a vysráží se 40 mikrolitry ethanolu. Tento postup odstraňuje více než 99 % nezreagovaných deoxynukleotid-trifosfátů.

Peleta se promyje ethanolem.

Stupeň 2: Oligodeoxycytidylátové (oligo(dC)) přidávání. Pelety, které obsahují plasmidovou cDNAsmRNA, se rozpustí ve 20 mikrolitrech'140mM kakodylátu sodného - 30 mM-Tris-HCl, pH pufru 6,8, obsahujícího lmM chlorid kobaltnatý, 0,lmM dithiothreitol, 0,2 ^ug poly(A), 70/uM dCTP, 5 ýCi ³²P-dCTP, 3000 Ci/mmol, a 60 jednotek deoxynukleotidyl-transferasy.

Tato reakce se provádí pět minut při 37 °C, čímž se umožní přidaní 10 az 15 zbytků dCMP na konec. Reakce se potom ukončí přidáním dvou mikrolitrů O,25M EDTA (pH 8,0) a 1 mikrolitru 10% SDS. po extrakci 20 mikrolitry směsi fenolu s chle-¹ roformem se vodná fáze smíchá s dvaceti mikrolitry 4M octanu amonného. DNA se vysráží a přesráží se 80 mikrolitry ethanolu.

Výsledné

Stuoen 3:

eth ?lety se promyj šteuení endonukleasou Hind III. Tato peleta se rozpustí ve 30 /ul puzru, kter obsahuje 20 mH Tris-HCl, pH 7,4, 7 mM chloridu horečnatého, 60 mM chloridu sodného a 0,1 mg BSA na mililitr. Potom se štěpí působením deseti jednotek íýedonukleasy Hind III dvě hodiny při 37 °C. Reakce se ukončí přidáním 3 χπΐ O,25M EDTA (pH 8,0) a 1,5 /ul 10% SDS. Po extracki směsí fenolu s chloroformem a přidání 30 /Ul 4M octanu amonného se DNA vysráží přidáním 120 mikrolitrů ethanolu. Peleta se promyje ethanolem a rozpustí se v 10 /Ui lOmM Tris-HCl, pH 7,3, a lmM EDTA. Přidá se ethanol (3 χηΐ), aby se zabránilo zmrznutí během skladování při - 20 °C.

v

Stupen 4: Cyklizace zprostředkovaná oligo(dG)-koncovým linkerem DŇÁ. 9/ul vzorek endonukleasou HindlII rozštěpeného oligo(dC)-zakončeného cDNA: mRNA plasmidu (asi 90 % vzorku) se inkubuje ve směsi (90 ^ul) obsahující lOmM Tris.HCl, pH, 7,5,-lmM EDTA, O,1M chloridu sodného a 1,8 pmolu oligo(dG)-’ zakončeného linkeru DNA 5 minut při 65 °C. Teplota se pak zvýší na 42 °C na dobu 60 minut, načež se ochladí na 0 °C. Objem této směsi (90 mikrolitrů)se upraví na 900 mikrolitrů obsahujících 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 4 mM chloridu hořečnatého, 10 mM síranu amonného, 0,1 M chloridu draselného, mikrogramů BSA v jednom militru a 0,1 mM β-NAD. Přidá se 6 mikrogramů E« coli DNA ligasy a roztok se inkubuje přes noc při 12 °C.

Stupeň 5: náhrada RNA vláknem DNA. Pro náhradu vláknem DNA insertu se ligační směs upraví tak, aby obsahovala 40 mikromolů každého ze čtyř deoxynukleosid-trifosfátů,

0,15 mM β-NAD, 4 mikrogramy další E. coli DNA ligasy, 16 jednotek E. coli DNA polymerasy I (Poli) a 90 jednotek ~· coli RNAsy H. Tato směs (960 mikrolitrů) se inkubuje no— stupně pri 12 C a za teploty místnosti po dobu jedné' hodiny. Tím se podporuje optimální opravná (reparační) syntéza a zářezová translace Poli.

Stupeň 6 transformace Ξ. coli ransfomace se orovádí

ΌΟ:

c em:

(Proο.

) < 'Pkh ->0V _v y · -j Γ7 oj. i 5 í

65, 2110 až : - o coi kulPivován ^re ICO

2114 (1572).'.

C,5 j· ' o

OU<

.no'

-,unky se isolují odstřelováním. Suspendují se ve 30 ml lOmM Pipes (ph 7,0), 60mK chloridu vápenatého, 15% glycerolu a odstřelují se pět minut při 0 °C. Buňky se resuspendují ve 24 ml shora uvedeného pufru a opět se iňkůbují pět minut při 0 °C. Potom se l,0ml podíly suspense buněk smíchají s 0,1 ml DNA roztoku (stupeň 5) a směs se inkubuje dvacet minut při 0 °C. Buňky se pak udržují dvě minuty za 42 °C a pak deset minut za teploty místnosti. Přidá se leden litr L-živné půdy a kultura se inkubuje 60 minut při 37 °C. Přidá se ampicilin na koncentraci 50 ^ug/ml. Tato kultura se třepe, dalších deset hodin při 37 °C. Zředění této kultury se nastříkají na agarovou L-živnou půdu obsahující 50 ^ug/ml ampicilinu. Po 12 až 24 hodinách inkubace při 37 °C se jednotlivé kolonie vyberou sterilní zubařskou špachtlí. Celkem se získá přibližně 1.10^ nezávislých cDNA klonů.

D. Testování (skríning) pcD banky

104. jednotlivých klonů se náhodně vybere z banky cDNA

T-buněk a množí se jednotlivě v jamkách mil&titrovacích deeek/misek, které obsahují 200 yul L-živné půdy s 50 /Ug/ml ampicilinu a 7 % dimethylsulfoxidu. Při soustředění se pouze na novou MCGP aktivitu bylo identifikováno 53 IL-3 cDNA klonů a jeden GM-CSF cDNA klon hybridizací příslušnými ^^Pznačenými cDNA sondami zkonstruovanými z klonů objevených Leeem a spol. (Proč. Nati. Acad. Sci. 82, 4360 až 4364 (1985)«) a Yokotou a spol. (Proč. Nati. Acad. Sci. 81, 1070 až 1074 (1984). ). Tento postup se provede následujícím způsobem: Každá deska s 96 kulturami se replikuje na nitrocelulosové filtry pro testování hybridizací. Hybridizace se provádí v 6 x SSPE (1 x SSPE znamená 180nM chlorid sodný, lOmM fosforečnan sodný, pH 7,4, M EDTA, 0,1% SDS, 100 /Ug Ε.coli tRNA na mililitr, 50% formamid) 16 hodin při 42 °C. Hybridizační klony se identifikují autoradiografií na promytých filtrech. Tyto klony byly odstraněny sterilizací

-o-p/r οο'ή'lumících. tvto klon*.’· ethanolem ořei přípravou sestav klonů. Sestavy obsahují až 48 cDNA ví ^rtn pachav-i b¹ v or^ve^v z mikrotitrovacích kvltur. Dvě stě takových sestav bylo necháno růst v jednolitrových kulturách a L-živnou půdou obsahující 100 /Ug/ml ampicilinu. Plasmidová DNA se isoluje z každé kultury a vyčistí se dvakrát projitím gradienty chloridu česného. DNA každé sestavy se transfektuje do opičích buněk COS 7 následujícím postupem (Buňky C0S7 jsou popsány Gluzmanem: Cell 23, 175 až 180 (1981) a j sou ^g/^stupne od ATTC pod č. CRL 1651)·

Jeden den před transfekcí se přibližně 10^b opičích buněk COS 7 vyseje na jednotlivé lOOmm desky v DME obsahujícím 10% plodové telecí sérum a 2mM glutamin. Aby se provedla transfekce, medium se odebere z každé desky a nahradí se 4 ml DME obsahujícího 50mM Tris.HCl, pH 7,4, 400 /Ug/ml DEAE-Dextranu a 50 /ug plasmidových DNA, které mají být testovány.

Tyto desky se inkubují čtyři hodiny při 37 °C, potom se mediJ um obsahující DNA odstraní a desky se promyjí dvakrát 5 ml DME bez sera. DME (se 150 ^uM Chloroquine)se dánzpět na desku, která se pak dále Inkubuje další tři hodiny při 37 °C. Tyto desky se promyjí jednou DME, potom DME obsahující 4% plodové telecí sérum, 2mM glutamin, penicilín a streptomycin. V posledně uvedeném DME s přísadami se buňky inkubují 72 hodiny při 37 °C. Kultiajřční medium se odebere a vyhodnotí se různými bioanalýzami.

Původní řada sestav plasmidů se testuje primárně pomocí prolieračních analýz na aktivity TCGF a MCGF buněčnými liniemi HT-2 (podrobuji popsanými níže), a také buněčnou linií MC/9. Z prvních 110 sestav testovaných na těchto dvou buněčných liniích osm poskytovalo významnou aktivitu v HT—2 TCGF analýze. Několik těchto sestav mělo slabou, ale významnou MCGF aktivitu, ale jelikož MCGF aktivity byly obvykle slaoší a variabilnější, nespoléhali jsme na tuto analýzu pro identifikování positivních sestav.

Přibližně polovina z těchto COS supernatantů z trans— fekcí náhodných sestav bylo analzováno také na Ia-indukující aktivitu na myších B buňkách. Mezi testovanými sestavami u každé sestavy, která vykazovala aktivitu TCGF, bylo zjištěno, že vykazuje také Ia-indukující aktivitu. Existuje tedy zde perfektní korelace mezi TCGF aktivitou a Ia-indukující aktivitou.

Jedna sestava, 2A, která byla reprodukovatelnš nejaktivnější ve všech analýzách, byla rozdělena na 48 menších podsestav. Dvě podsestavy byly positivní jak na MCGF tak TCGF aktivitu. Jeden klon, 2A-EC, obecný pro obě sestavy, byl potom nechán samostatně růst. Jeho plasmidová DNA byla transfektovana do buněk COS 7 jak shora popsáno. Výsledný COS supernatanrfc se pak testuje na přítomnost různých aktivit včetně MCGF, TCGF, Ia-indukující aktivity a IgE- a IgG-zvysující aktivity.

Pstl fragment dlouhý 366 párů nukleotidů, isolovaný z klonu 2A-E3 (obrázek lA)a označený se pak použije jako sonda pro testování sestav, které byly positivní, na biologickou aktivitu stejně jako ostatních netestovaných sestav. Testování se provádí hybridizací na filtrech replikací mikrotitrovacími kulturami jak shora popsáno. Bylo isolováno devět hybridizujících klonů. Jejich DNA byly analyzovány restrikčním mapováním. Všechny sestavy, které vykazovaly biologickou aktivitu, obsahovaly alespoň jeden hybridizující klon, který sdílel obecnou mapu restrikčního štěpení s klonem 2A-E3· Frekvence hybridizujících klonů z lo^ klonů, které byly vybrány, ukazuje na frekvenci přibližně 0,2 % v celé bance. Z hybridizujících klonů, které byly testovány, přibližně 90 % expresí poskytovalo funkční protein.

E. Biologické aktivity kultur supernatantů opičích bu-’ něk COS 7 transfektováných pcD-2A-E3 ·

Supernatant buněk COS 7, které byly transfektovány pcD-2A-E3, byl testován na TCGF aktivitu na myších buněčných liniích HT-2 pomocných T-buněk, popsaných 7/atsonem v J. Exp. Med. 15Θ, 1510 (1979)· Proliferace buněk HT-2, stanovovaná c-r?

- 9 í i:o.

Ό0 (vis snora uvec citace) byla použita faraee ss koreluj© s jako míra TCGF aktivity ootickou hustotou (OD) o

630 nm). 0hráze'

3A ilustruje relativní TCGF (stupen proiid 570 nu do aktivitu různých zředení i) supernatantu z buněk COS 7 transfektovaných pcD-2A-E3 (křivka 1), ii)supernatantu z kultur Cl.Lyl⁺2“/9 (křivka 2), iii) supernatantu z buněk 00S 7 transfek to vaných pcD plasmidem nesoucím Il»-2 cDNA (křivka 3) a iv)supernatantu z buněk COS 7 transfektovaných pcD plasmidem neobsahujícím žádný cDNA insert (tj. mock” (=simulovaná) transfekce) (křivka 4).

Podobně byly supernatanty z buněk COS 7 transfektovaných pcD-2A-E3 testovány na MCGF aktivitu na MC/9 buňkách,, opět kolorimetrickou analýzou podle Mosmanna, kterou se měří proliferaoe MC/9· Obrázek 3B iluiýsruje relativní MCGF ak tivitu i) supernatantu z buněk COS 7 transfektovaných pcD-2A-E3 (křivka 1), ii) supernatantu z buněk COS 7 transJ fektovaných pcD plasmidem nesoucím IL-3 cDNA (křivka 2),. iii) supernatantu buněk Cl.Lyl⁺279 (křivka 3) a iv)supernatantu z buněk COS 7 transfektovaných simulovanou transfekcí (křivka 4).

Obrázek 3C ilustruje výsledky Ia indukční analýzy provedené na i) supernatantu z buněk COS 7 transfektovaných pcD-2-E3 (křivka 1), ii)supernatantu buněk Cl.Lyl⁺2“/9 (křivka 2) a iii) supernatantů z buněk COS 7 transfetovaných simulovanou transfekcí (křivka 3)· Analýza Ia-indukce ae provádí postupem podle Roehma a spol. (shora uvedená citace). Několik myší D3A/2 (ve stáří dva až tři měsí ce) bylo usmrceno. Chirurgicky byla odebrána slezina. Erytrocyty byly lysovány hypotonickým šokem 0,87% chloridem amonným. Potom byly T-buňky lysovány cytotoxickými monoklonálními protilátkami namířenými proti povrchovým markérům specifickým pro T-buňky (Thy-1, Lyt-1 a lyt-2), načež následovala inkubace v 'králičím komplementu. Mrtvá buňky se pak odstraní pomocí ficoll-hypaque hust&tních gradientů. Adherentní buňky byly před tím odstraněny adherencí na plas58 acne Perrino msíy pr:

nromyty, spočítány a zjištěna biižna jeden milion buněk byl

V tomto oka :u oyiy ouoxy jejich životaschopnost, přiinkubován v 0,5 ml media tká nové kultury (RPMI 1640 nebo minimální esenciální medium - MEM (Earleho sůl)) (Gibco) dopí^ného 10 % plodového telecího sera, 2-merkaptoethanolem a různými antibiotiky ( penicilín, střeptomycin a gentamycin). V pokusech, při nichž positivní kontroly sestávaly ze supernatantu z T-buněk indukovaných mitogenem T-buněk a pro neutralizaci mitogenu se přidá 10 mg/ml (konečná koncentrace) α-methylmanosidu. Po

24-hodinové inkubaci se buňky isolují a připraví se pro vybarvení anti-I-A^ nebo anti-I-A^ monoklonálními protilátkami. Tyto protilátky byly použity jako protilátky prvního stupně konjugované buď s haptenem N.I.P. nebo s biotinem. Vybavení se Xončí inkubací těchto buněk fluoreskujícími reakčními činidly druhého stupně (buď anti-NIP protilátky nebo avidin). Intensita fluorescenčního zabarvení se pak stanovuje buď na fluorescenci sorterem buněk (Becton-Dickinson, Mountaiň View, Ka.) nebo cytofluorografem (Ortho ‘ Dia-', gnostics, Cambridge, Ma. ). Fluorescenční jednotky na obráz-2 ku 3C byly vypočteny násobením procenta positivních buněk v každém vzorku intensitou fluorescenčního zabarvení.

Obrázek 3D graficky ilustruje stupně, kterými jsou produkce IgE a IgG^ indukovány v myších slezinných buňkách zbavených T-buněk i) mediem COS 7 samotným (sloupeček 1), ii) 20% supernatantem z COS 7 buněk transfektovaných simulovanou transfekcí (sloupeček 2), iii) 10% supernatantem z Cl.Lyl⁺2“/9 buněk plus 20% supernatantem z COS 7 buněk transfektovaných simulovanou transfekcí (sloupček 3) a iv) 20% supernatantem z pcD-2A-E3 transfektovaných buněk COS 7 (sloupeček 4). Hladiny IgE a IgG^ byly stanoveny shora popsanou ELISou specifickou pro isotyp.

Bylo zjištěno, že myší IL-4 zvyšují MCGP aktivitu IL-3 v MC/9 buňkách (Smith a Rennick: Proč. Nati. Acad. Sci. 83, 1857 až 1861 (1986)_O). Bylo zjištěno, že myší IL-4 zvyšují GM-CSP-stimulovanou proliferaci na IL-3 závislé buněčné linie

Ocr

Hc • ti

82, •7.7

691 (1935

F. Struktura pcD-2A-E3 a sekvence nukleotidů jeho cDNA insertu Struktura pcD-2A-E3 je ilustrována na obrázku 2A. Expandovaná restrikční mapa jeho insertu je Hudrována na obrázku 2B. Insert byl sekvenován jak podle Maxama a Gilberta (Methods in Enzymology 65., 499 až 560 (1980)<>) tak podle Sangera (Proč. Nati. Acad. Sci. 74, 5463 až 5467 (1977)·).

Tato sekvence je ilustrována na obrázku 1A spolu s odvozenou aminokyselinovou sekvencí nejdelší čtecí oblasti ve fázi s prvním ATG počátečním kodonem. Jediná dlouhá otevřená čtecí oblast v myším 2A-E3 cDNA klonu sestává ze 140 aminokyselinových zbytků. Jelikož tento lymfokin je sekretovaný protein, lze očekávat, že hydrofobní leader sekvence by měla předcházet sekvenci maturované sekretované formy proteiny. Analýza hydrofobosti plasmidu a srovnání s navrženou souhlasnou sekvencí pro pročeši signálních peptidů (Perlman a spol.: J.

Mol. Biol. 167, 391 až 409 (1983 )·) vede k tomu, že ke štěJ pění polypeptidového prekursoru by mohlo dojít v místě za serinovým zbytkem v poloze 20 aminokyselin na obrázku 1A. Grabstein a spol. (J. Exp. Med. 163, 1405 až 1414 (1986).) potvrdil, že N-koncová sekvence sekretovaného myšího IL-4 začíná v poloze 21 His na obrázku 1A.

Příklad 2

Příprava lidského IL-4 myší cDNA sondou na banku cDNA lidských pomocných T buněk a přechodná exprese v opičích buňkách COS 7 a v myších L buňkách cDNA klony kódující IL-4 byly isolovány z bank cDNA zkonstruovaných z indukovaných lidských pomocných T buněk, 2F1, a indukovány lymfocyty lidské periferní krve (PBL) způsobem myší cDNA sondy. Mezi další lidské buněčné linie, o nichž je známo, že poskytují BCGF aktivitu, se zahrnují varianty linie OEM, která je dostupná od ATCC pod č. COL 119, CRL 8436 a TIB 195, popsané Foleym a spol.: Cancer 18, 522 az 529 (1965) a Liglerem: Lymphokine Research 3, 183 až 191 (1984).

Klon lidských pomocných buněk T, 2F1,a lidské PEL byly kultivovány v Iscoveově mediu doplněném 3 % plodového telecího sera. Buňky 2P1 byly aktivovány ConA (10 ^ug/ml). PEL byly stimulovány 1 /Ug/ml PNA po dobu 12 hodin. Potom bylo přidáno 5 /ug/ml ConA. Buňky byly isolovány čtyři hodiny (2P1) nebo deset hodin (PBL) po přidání· OonA.

Extrakce mRNA a konstrukce banky cDNA se provádí jak popsáno v příkladu 1. Z klonu myší pcD-2A-E3 cDNA se isoluje Pstl fragment, označí se zářezovou translaceí (1.10 impulsů za minutu na mikrogram) a použije se jako sonda pro nitro celulosové filtry obsahující přípravky plasmidové DNA z deseti sestav, každé představující přibližně 1.10^ klonů 2P1 cDNA banky. Byly použity mírné hybridizační podmínky (přes noc při 42 °C): 6 x SSPE (1 x SSPE znamená 180mM chlorid sodný, lOmM fosforečnan sodný, pH 7,4» lmM EDTA) (Maniatis Τ» a spol. ϊ ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (Gold Spring Harbór Laborátory, N.Y., 1982.).), 20% formamid (objemové díly k objemovým dílům), 0,1% dodečylsulfát sodný, tRNA kvasinkový nosič-na 100 ^ul. Piltry se promyjí dvakrát SSPE, 0,1% sodným/Úodecylsulfátem při 37 °C.

, V jedné z deseti sestav byl identifikován jediný klon (pcD-46). Další klony byly získány testováním PBL cDNA bank sondou zkonstruovanou z Nhel-EcoRl fragmentů pcD-46 (ijLustrovaného na restrikční mapě na obrázku 2D). Analýza restrikčními enzymy ukazuje, že PBL klony byly identické se strukturou pcD-46.

Bylo objeveno, že na guanidin bohatá oblast v 5nebo proti směru vlákna, směru od kódující oblasti insertu pcD-46 vykazovala expresi IL-4 polypeptidu. Potom se insert pcD-46 reklonuje, aby se odstranila oblast bohatá na guanidin. Výsledný klon se označí pcD-125. Bylo také objeveno, že exprese se zlepší transfektováním myších buněk pcD-46.

Vektor pcD-125 byl vytvořen následujícím způsobem: pcD-46 se rozštěpí působením Sau3A. Isoluje se fragment obsahující 5 162 nukleotidů cDNA insertu (odstraněním GC sermentu). Potom se ten midu plCl. Plasmid plOl (viz Yokota T. a spol.; letuje se sekvence od ?

to fra byl o shora gnent vloží do místa Bglll plas· dvožen od pcD-mysího 11-3 uvedená citace (1984). ). Desta na 5 konci cOHA do Bglli místa v myší 11-3 cDYA. Bglll místo je obsaženo v místě napojení deletované sekvence. Fragment Sau3A je napojen na promotor SV40 jako v pcD-46 až na GC segment. Zbytek lidské. cDNA byl pak zrekonstruován a HindlII/Hhel fragmentu z pcD-46, který nese 3 konec cDNA, SV-40 poly-A místa a všech pBR322 sekvencí pcD-46.

Supernatanty pcD-46- a pcD-125-transfektováných COS 7 a L buněk byly analyzovány na BCGF a TCGF aktivitu. TCGF byla analyzována linií lidských pomocných T buněk JL-EBV trans formovanou virem Epstein-Barr a fytohema glutininem stimulovaných lidských periferních krevních lymfocytů.

Klon linií lidských pomocných T buněk JL-EBV byl stimulován ozářenými (4500 R) buňkami lidských EBV-transformovaných B-buněčných linií. Potom byl uchováván v mediu RPMI 1640, které obsahuje 10% lidského AB sera, 50/ůM 2-merkaptoethanol (2ΜΞ) a rekombinantní lidský IL-2. Lidské PBL byly stimulovány PHA (20 />ug/ml) a uchovávány v RPMI 1640 obsahujícím 10% plodové telecí sérum, 50/UM 2-merkaptoethanol a rekombinantní lidský IL-2. Po pěti až deseti dnech od stimulace se buňky JL-EBV nebo PHA blasty použijí jako cíle v dvoudenní TCGF analýze s využitím Mosmannovy kolorimetrické metody (shora popsané) nebo v třídenní TCGP analýze s využitím inkorporace [j^Hj-thymidinu.

Obrázek 4A ilustruje TCGP aktivity měřené JL-EBV buňkami (Kolorimetrická analýza): i)supernatantů buněk C0S7 transfekuovanycn pcD plasmidy, ktere expres?* ooskytují lidsky IL-2 (křivka A), ii) supernatantů buněk L transfektovanycn pcD125 (křivka 3), iii) supernatantů buněk COS 7 transfektovaných poC125 (křivka C), iv) supernatantů buněk COo 7 transfektovanych poD-46 (křivka D) a v) suneme.tanuu buněk COS 7 transfektovaných simulovanou transfekcí (křivka E). Obrázek 43 ilustruje TCGP aktivity měřené PHAj. .. , i -^z--- -. _· *γί ”E,'p ( ' ' ' f—) *>'* η η ’Ί—~· Ί ρ * < ο Ο ϊ ’ Μ '- ’ Ί ’.'j 7^j_ tantu buněk COS 7 trans? ektováných plasmidy pcD, které exnnssí poskytují lidský IL-2 (křivka A), ii) supernatantů buněk COS 7 transfektovaných pcD-125 (křivka B) a iii) supernatantů buněk COS 7 transfektovaných simulovanou transfekcí (křivka C). Obrázek 4C ilustruje TCGF aktivity měřené PHA-stimulovanými PBL (analýza inkorporací triciovaného thymidinu): i) supernatantů buněk COS 7 transferovaných pcD-125 (křivka A), ii)supernatantů buněk COS 7 transfektovaných plasmidy pcD, které expresí poskytují lidský IL-2 (křivka B) a iii) supernatantů buněk COS 7 transfektovaných simulovanou transfekcí (křivka C).

BOGF aktivita různých ředění pcD-125 transfektováných supernatantů byly srovnávány s BCGF (komerční BCGF’’) popsanými Maizelem a spol.: Proč. Nati,Acad. Sci. 79, 5998 až 6002 (1982), který je komerčně dostupný od Cytokine Technology International (Buffalo, NY). Tabulka II ilustruje BCGF aktivity různých zředění supernatantů transfektováných COS 7 -na anti-IgM protilátkami předem aktivované B-buňky. B-buňky se připraví jak shora popsáno v sekci analýzy.

Tabulka II

Vliv supernatantů IL-4 cDNA transfektů na B-buňky předem ak tivované anti-IgM

%v(obj. díly) přidaných supernatantů	inkorporace 3H-thymidinu
simulo- vaná trans- fekce	klon 125	simulovaná transfekce + 10 % BCGF	klon 125 + 10% BCGF
. 0	278	278	L835	1835
0,2	189	144	1362	2303
1	323	1313	1699	3784
5	408	4314	1518	7921
15	397	4289	1093	8487
Tabulka	III ilustruje	BCGF ak	tivity různých	zředění

supernatantů transfektovaných COS 7 na B—buňky oředem aktivované SAC (připravené jak shora uvedeno).

> s .a O > — “

Tabulka III

Aktivita supernatantu IL-4 cDNA transfekce na dem aktivované SAC bun

	inkorporac	e ^H-thymidinu
%v(obj. díly) přidaných supernatantu	(počet impul	sů za minutu)
simu- lovaná trans- fekce	klon 125	simulovaná transfekce + 10 % BCGP	klon 125 + 10 % BCGP
0	2237	2237	12 992	12 992
0,2	1789	2682	13 126	5 655
1	740	2374	13 714	6 765
5	1285	2826	5 848	10 023
15	1560	4701	10 128	10 924

I když lidský IL-4 podle vynálezu i komerční.BCGP vykazují BCGP aktivitu (Mehta a spol.: J. Immunol. 135, 3298. až 3302 (1985)·), znamená to, že TCGP aktivitu lze bioche-’ micky oddělit od BCGP aktivity komerčního BCGP. To ukazuje, že tyto aktivity jsou způsobeny různými molekulami. Lidský IL-4 a komerční BCGP jsou tedy různé molekuly, neboí TCGP aktivita je u lidského IL-4 neoodělitelná od BCGP aktivity standardními technikami biochemické frakcionace.

Supernatanty buněk COS 7 transfektované plasmidy nesoucími lids^u IL-4 cDNA indukují proliferaci normálních lidských T buněk a klonu JL-EBV lidských T buněk. Avšak maximální rozsah proliferace lidských T buněk indukovaných jako odpověď na lidský IL-4 je asi polovinou odpovědi indukované lidským IL-2. Proliferaci indukující aktivita IL-4 by neměla být inhibována monoklonálními protilátkami proti IL-2 nebo proti IL-2 receptorům při testování. Tyto výsledky předpokládají, že IL-4 působí přímo na T-buňky a nikoliv cestou incukce IL—2 a že tato aktivita není zprostředkována IL—2 rektorem. Supernatanty lidského IL-4 COS stimulují také proliferaci lidských B buněk předem aktivovaných optimálními koncentracemi anti-IgM protilátek navázaných na perličky a mají další proliferační kapacitu s komerčním BCGP v hladinách nasycenosti^vBCGP analýze. To předpokládá, že lid- 64 ský IL-4 a komerční BCGF působí na 3 buňky různými cestami, například možná různými řadami receptorů. Supernatanty významné neindukují proliferaci B buněk předem aktivovaných působením SAC, zatímco komerční BCGF vyčištěný od supernatantů PBL kultur stimulovaných působením PHA silně indukuje proliferaci lidských B buněk předem aktivovaných působením SAC. Tyto výsledky dále ukazují, že cDNA lidského IL-4 kóduje jinou BCGF aktivitu než je aktivita přítomná v komerčním BCGF o

Supernatant pcD-125 transfektovaných buněk COS 7 byl testován také na schopnost indukovat Pc-ep silon receptory na tonsilních B buňkách. Lidské tonsilní buňky se dispergují na suspensi jednotlivých buněk standardními způsoby. Populace B buněk se obohatí podle shora popsaného postupu a obohacené buňky se stimuluji anti-IgM protilátkou 24 hodiny v kultivačním mediu při 37 °C. Buňky, které nesou receptor Fc-epsilon, se analyzují sortérem buněk Becton Dickinson FACS IV” s použitím fluorescenčně značenémonoklonální protilátky ‘specifické pro tento receptor způsobem, který popisuje Bonnefoy a spol.: J. Immunol. Meth. 88, 25 až 32 (1986). Obrázky 5A až 5D jsou histogramy ilustrující frekvenci buněk (svislá osa) v závislosti na intensitě fluorescence (vodorovná osa). Intensita fluorescence je přífao úměrná počtu Fc-epsilon receptorů přítomných na buňce. Ve všech těchto obrázcích byly buňky stimulovány působením Anti-IgM. Obrázky 5A až 5D odpo’vídají působení 0 %, 0,1 %, % a 10 % supernatantů z buněk COS 7 transfektovaných působením pcD-125.

Byla stanovena sekvence DNA cDNA insertu klonu č. 46. Tato sekvence je uvedena na obrázku 1B. cDNA insert je dlouhý 615 párů nukleotidů vyjma póly(A)konce. Jde o jedinou otevřenou cteci oblast s prvním ATG kodonem umístěným u 64 nukleotidu od 5 konce, následuje 153 kodonů končících ter— minačním kodonem TAG v poloze 523 až 525 nukleotidů. N-koncový segment předpověděného polypeptidu je hydrofobní, jak lze pro sekretovaný protein očekávat.

— 65 - -i o

Srovnání kódujících oblosti lidské a nysi cDZLA tohoto vynálezu ukazuje, še oblasti sekvence kódující lidskou cDNA v pcD-46 zahrnující polohy aminokyselin 1 až 90 a 129 až 149 sdílejí přibližně 50% homologii s odpovídajícími oblastmi sekvence kódující myší cDNA (2A-E3)· ^yto oblasti a 5' a 3' nepřekládané oblasti 'sdílejí přibližně 70% homologii u dvou cDUA sekvencí různých druhů, při čemž tato oblast zahrnující aminokyseliny 91 až 128 lidského proteinu sdílí velmi omezenou homologii s odpovídající myší oblastí. Celkem je šest ze sedmi cysteinových zbytků v lidském proteinu zachováno v příbuzném myším proteinu. Jistá homologie sekvence aminokyselin existuje mezi přírodní formou lidského polypeptidu podle tohoto vynálezu a myším IL-3. Zbytky aminokyselin 7 až 16 a 120 až 127 vykazují 50% a 55% homologii se zbytky 16 až 27 a 41 až 49 polypeptidu prekursoru myšího IL-3 (Yokota T. a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81, 1070 až 1074 (1984).).

Jak je dále podrobněji popsáno, bylo zjištěno, že lid-’ ský IL-4 vyčištěný ze supernatantů COS 7 transfektováných působením pcD-125 je polypeptid o 129 aminokyselinách se sekvencí ilustrovanou na obrázku IC.

Příklad 3

Zvýšená exprese lidského IL-4 v opičích buňkách COS 7 pomocí vektoru odvozeného od EBV (Epstein-Baár virus) obsahujícího promotor RSV-LTR

Deseti až dvaceti-násobné zvýšení exprese lidského IL-4 se získá reklonováním Xhol fragmentu pcD-125 do EBV-odvozeného vektoru obsahujícího promotor RSV-LTR (s dlouhým koncovým opakováním viru Rousova sarkomu). Od EBV-odvozený vektor a RSV-LTR promotor jsou popsány Gormanem a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79, 6777 až 6781 (1982) a Yatesem a spol.: Nátuře 313, 312 až 815 (1985).

Fragment HindlII/Xhol obsahující promotor RSV-LTR byl isolován z plasmidu pcD předem zkonstruovaného z RSV-LTR obsahujícího AccI/HindlII fragment poosaný Gormanem a snol.

(s^ora uvedená citace) a komerčně dostupný pcD vektor (například Pharmacia). Shora uvedený KindlII/Xhol fragment a KindlII/Xhol fragment z plasmidu pLl (Pharmacia) se sestřihnou do plasmidu pcDVi (dostupného od Pharmacia). Orientace oblasti počátku replikace SV40 není rozhodující. Mezi místem AatlI a místem Ndel výsledný vektor pcD obsahuje v sekvenci (od AatlI místa) oblast počátku replikace SV4O, promotor RSV-LTR a SV4O polyA oblast. Po tom, co se isoluje fragment Xhol z pcD-125, a po tom, co se vloží do místa Xhol nově zkonstruovaného pcD vektoru, jedinečná místa AatlI a Ndel ve vektoru se převedou standardními technikami na místa Sáli. Stručně - vektor pcD se rozštěpí působením AatlI a Ndel, isoluje se fragment obsahující IL-4 a isolovaný fragment se nechá zreagovat s T4 DNA polymerasou v přítomnosti příslušných koncentrací nukleosid-trifosfátů. 5*—*3 DNA polymerasová aktivita T4 DNA polymerasy doplňuje 5* přečnívající konce restrikčních štěpů a 3—>5 endonukleasová aktivita T4 DNA polymerasy štěpí 3* přečnívající konce restrikčních štěpů. Zůstanou tak fragmenty se zarovnanými konci, s nimiž se ligují T4- DNA ligasou kinasované Sáli linkery (New England Biolabs).

Shora uvedený Sáli fragment (ilustrovaný na obrázku 11) se vloží do vektoru p20l odvozeného od EBV a popsaného Yatesem (viz shora uvedená citace) a to v místě jedinečného místa Clal, které bylo převedeno na místo Sáli standardními technikami. Ve stručnosti - p201 (ilustrovaný na obrázku 11) se rozštěpí působením Clal a nechá se zreagovat s DNA polymerasou I (Klenowův fragment) a příslušnými koncentracemi nukleosid-trifosfátů. Tento postup doplňuje přečnívající konce štěpů Clal tak, že se získá fragment se zarovnanými konci. Dále se zarovnané konce ligují s kinasovým Sáli linkerem. Výsledný od EBV odvozený vektor obsahující promotor RSV-LTR a cDNA insertu lidského IL-4 jsou zde označovány jako pEBV-178.

pEBV-178 se transfektuje do buněk COS 7 standardními technikami. Kultury supernatantů se analyzují na TCGP aktivitu jako míru exnrese IL-4.

'i

- -> i Příklad 4

Exprese přírodního lidského IL4 v S. coli muteinu IS° (Ala-Glu-Phe)

Pro expresi lidského IL-4 v E. coli byl;/ zkonstruovány dva vektory obsahující inserty cDNA lidského IL-4: pIN-III sekreční vektor, který obsahuje sekvenci signálního peptidu ompA proteinu (”pIN-III-ompA2) a plasmid pUC12, který obsahuje promotor trpp a přilehlé ribosomové vazebné místo (RBS) oblasti (TRPC11).

A. pIN-III-ompA2

Byly zkonstruovány dva vektory pomocí plasmidu pIN-III-ompA2, který je popsán Ghrayebem a spol.: EMBO Journal j?, 2437 až 2442 (1984) a Masuiim a spol.: Biotechnology 2, 81 až 85 (1984).

První vektor, označený pIN-IIIompA2(l) byl zkonstruován ligací, v sérii, EcoRI/BamHI-rozštěpeného plasmidu, syntetického linkeru a BamHI/EcoRV fragmentu z pcD-125. Použití syntetického linkeru v této konstrukci vede k sekreci biologicky aktivního polypeptidu IL-4 se třemi N-koncovými aminokyselinami navíc Ala-Glu-Phe-, tj. sekretuje se mutein IL° (Ala-Glu-Phe). Syntetický linker sestává z následujících sekvencí nukleotidů:

AA TTC CAC AAG TGC GAT

G GTG TTC ACG CTA

EcoRI/BamHI rozštěpený pIN-III-ompA2 a BamHI-EcoRV frag ment z plasmidu pcD-125 se smíchají ve standardní ligační směsi (např. viz Maniatis a spol.: shora uvedená citace.) obsahující 0,lmikromolární koncentraci syntetického linkeru.

E. coli kmen Abl899 se infektuje plasmidem pIN-III-ompA2(1>

transformanty se vyberou hybridizací kolonií cDNA sondou 32

P-označeného IL-4. Extrakty lidského IL-4 pro analýzu se získají následujícím způsobem: Po sonikování (působení ultrazvuku) se bakteriální kultury odstřelují a supernatant se odstraní z pelet. Pelety se nechají zreagovat s 1% SDS, 2mJ>í dithiothreitolem a 6M guanidinem. Tento materiál se odstjfeďuj e, supernatant se odstraní a peleta se nechá zreagovat s 3% SDS a 2mK dithiothreitolem při 45 °C. Materiál se onět ^r-,7<

odstředuje a supernata se analyzuje SDS-PAGE.

Zkonstruuje se pIN-III-ompA(2)tak, aby se expresí získával přírodní lidský IL-4. Přidání třech aminokyselin v konstrukci pIN-III-ompA(l) se odstraní místně-specifickou mutagenesí sekvence ompA signálního peptidu pII'I-III-ompA2. Mí stně-specifická mutagenese se provádí podle Zollera a Smitha (shora uvedené citace). Ve stručnosti - Xbal/BamHI fragment z pIN-III-ompA2 obsahující sekvenci kódující ompA signální peptid (viz obrázek 1 ve shora uvedené citaci Ghrayeba a spol.) se vyčistí, smíchá se s vyčištěnou Xbal/BamHI-rozštěpenou replikační formou (RP) M13mpl9, liguje, transfektuje se do E. coli K-12 JM101 a vyseje se. Vybere a namnoží se jasný plak v přítomnosti IPTG a X-gal„ Připraví se jednovláknová DNA, například podle Messinga: Methods in Enzymology¹; díl 101, Academie Press, New York, 1983»Odděleně se syntetizuje a fosforyluje oligonukleotidový primer (23-mer) obsahující vyznačené substituce nukleotidů (uvedeno ve čtverečku):

.....,..._r5' - GGAATTCAGAAGCT , |tg] C £3] GCTAC - 3*.

Tato sekvence zavádí druhé HindlII místo do oblasti kódující signální peptid mutovaného pIN-III-ompA2. Oligonukleotidový primer se aneluje s í£L3mpl9 RP obsahující Xbal/BamHI fragment plasmidu pIN-III-ómpA2 a zpracuje se s DNA polymerasou v přítomnosti příslušných koncentrací nukleosid-trifosfátů. Výsledné replikační formy se použijí pro transfektování JM101 E. coli. Plaky, které obsahují mutant, se testují značenou oligonukleotidovou sondou₀ Sekvence vybrané replikační formy se potvrdí dideoxy-sekvenováním s použitím uversálního Ml3 primeru. Vybraná replikační forma se namnoží, isoluje a rozštěpí působením Sbal a BamHI. Vyčištěný Xbal/BamHI fragment se vloží do Xbal/BamHI rozštěpeného pIN-III-ompA.

Aby se vytvořil pIN-III-ompA2(2), mutant pIN-III-ompA2 se namnoží, vyčistí, rozštěpí působením HindlII a BamHI a smíchá se s BamHI-EcoRV fragmentem plasmidu pcD-125 ve standardním ligačním roztoku obsahujícím 0,lmikromolární koncentraci následujícího syntetického linkeru:

A GCT CAC AAG TGC GAT GTG TTC ACG CTA r ,O> ÍN- í±I-ompA2(2) )li kmen AblSS9 byl infekte o o _v

Transformanty se vyberou hýbridizací kolonií *~p-znacenou

II-4 cDNA sondou. IL-4 extrakty, ořinravene jak shora uvedeno, vykazují TGGN aktivitu srovnatelnou se supernatanty pcD-125 COS 7 buněk.

B. TRPCÍ1

Vektor TRPC11 byl zkonstruován ligací syntetického souhlasného RBS fragmentu β Clal linkery (ATGCAT) a klonováním výsledných fragmentů do Clal-rozštěpeného pMTllhc (který byl předem up^ren tak, aby obsahoval místo Clal). pMTllhc je malý (2 300 nukleotidů), AMP^, TBU? derivát plasmidu pBR322 o vysokém počtu kopií, který nese EcoRI-HindlII polylinkerovou oblast 'TfVX plasmidu (popsaného Maniatisem a spol. i . viz shora uvedené citace). Byl modifikován tak, aby obsahoř val místo Clal rozštěpením pMTllhc působením EcoRI a BamHI, doplněním výsledných, přečnívajících konců a ligací linkerem Clal (CATCGATG). Tím se zrestaurují místa EcoRI a BamHI a místo Smál se nahradí Clal. · ·

Jeden transformant z konstrukce TRPC11 měl tandem RBS sekvence obklopený místy Clal. Jedno z míst Clal a část druhé kopie sekvence RBS byly odstraněny rozštěpením tohoto plasmidu působením Pstl, zreagováním s nukleasou Bal31, rozštěpením působením EcoRI a reakcí s T4 DNA polymerasou v přítomnosti všech Čtyř deoxynukleotid-trifosfátů. Výsledné fragmenty o 30 až 40 párech, nukleotidů byly isolovány PAGE a klonovány do pUC12 rozštěpeného působením Smál. E. coli trpP-nesoucí EcoRI fragment o 248 párech nukleotidů odvozený od pKClOl (popsaný Nicholsem a spol.: Methods in Enzymology 101, 155 (Academie Press, N. Y., 1983).) byl potom klonován do místa EcoRI. Ukončí se tak konstrukce TRPC11, která je uvedena na obrázku 12.

TRPC11 byl použit jako vektor pro cDNA lidského IL-4. Nejdříve se rozštěpí působením Clal a BamHI, £otom se vyčistí a smíchá se s fragmentem EcoRV/BamHI z plasmidu pcD-125 se standardním ligačním roztokem obsahujícím 0,lmiki

Ledujícího syntetického linkcru: AAG TGC kouč e-.kraci ní

TCG ian:

ATG CAO A0 GTG TTG AGG Vybere se insert obsahující vektor, ja a množí se v Ξ. coli K-12 kmenu JML01

GAT OTA o je to shora popsáno, IL-4 byl extrahován následujícím způsobem. Na buňky JK1Q1 se působí ultrazvukem v jejich kultivačním mediu. Směs se pak odstřeďuje. Peleta se re suspenduje ve 4LI guanidinu a 2mM dithi^fchreitolu a opět se odstřeďuje. Supernatant se testuje na biologickou aktivitu. Bylo zjištěno, že vykazuje TCGF aktivitu srovnatelnou s aktivitami supernatantů buněk COS 7, které jsou transfektovány pcD-125.

Příklad 5

Příprava cDNA hovězího IL-4 pomocí sond cDNA myšího a lidského IL-4 na banku cDNA hovězích pomocných T buněk a dočasná exprese v opičích buňkách COS 7 _r- Klony cDNA kódující IL-4 se isolují z bank cDNA zkonstruovaných z indukovaných hovězích periferních krevních lymfocytů (PBL) způsobem kombinace myších a lidských cDNA sond.

Mezi alternativní zdroje hovězích cDNA patří linie několika hovězích buněk uchovávané ve sbírce živočišných linií ATCC NBL. Postupy jsou v podstatě identické s těmi, které byly popsány v příkladu 2. Buňky se isolují asi deset hodin po indukci Con A. Extrakce mRNA a zkonstruování banky cDNA se provedou stejně jako v příkladu 2.

Sondy myší a lidské cDNA se mohou používat soolečně jako směs nebo postupně pro detekce cDNA hovězího IL-4

Jako v příkladu 2 se fragment Pstl isoluje pcD-2A-E3. Podobně fragment Pstl se lidského pcD-125. Některé další fra.

z myšího klonu cDNA isoluje z klonu cDNA ;menty jsou také dostupné pro zlmenty sů za instruování sond. 3uď společně nebo odděleně se Pstl označí zářezovou translací (asi 1.10⁸ počet minutu na mikrogram) a použijí se pro sondování fragimpulnitrocelulosových filtrů obsahujících plasmidové deseti sestav, každá představující asi 1000

DNA přípravky z klonů indukované kladu 2« Positiv·/ vyhodnocené klony 20 identifikují a například 6 řírodního lidského IL-4 a muteinů ^a IS° (Gly•ese p r^>

Αεη-phe-Val-His-Gly) v Saccharomyces cevisiae cDNA přírodního lidského IL-4 a dva jeho mutanty byly klonovány do plasmidu pMF-alfaS a získávány expresí v kvasinkách Saccharomyces cerevisiae. Konstrukce a aplikace pMF-alfaS pro expresi nekvasinkovych proteinů je plně popsána Miyajimou a spol.: Gene 21, 155 až 161 (1985) a Miyajimou a spol.: EM30 Journal 5, 1193 až 1197 (1986). Plasmid pLIF-alfa8 je uložen v Americké sbírce typů kultur(American Type Culture Collection, Rockville, Md. )pod číslem 40 140. Mapa plasmi-’ du je uvedena na obrázku 13A (popis obrázku uvádí Miyajima a spol.: Gene (shora uvedená citace).).

A. Mutein lidského IL-4

Isoluje se plasmid pcD-125 a rozštěpí se působením

EcoRV a BamHI. Fragment EcoRV/BamHI obsahující cDNA lidského IL-4 se isoluje, nechá se zreagovat s DNA polymerasou I (Klenowův fragment), kterou se doplní BamHI rozštěpení, načež se kznasuje (tj. fosforyluje). pMF-alfa8 se rozštěpí působením Stul a spojí se s kinasovým EcoRV/BamHI fragmentem z plasmidu pcD-125 ve standardním ligačním roztoku. Vznikne tak plasmid phjL-4-2. Plasmid phIL-4-2 se použije pro transformaci S. cerevisiae 20Ξ-12 (MATalfa trp 1-289 pep4-3), která byla získána z Yeast Genetic Stock Center (Středisko kvasinkových genetických zásob), University v Kalifornii, Berkeley. Buňky kvasinek se nechají růst v syntetickém mediu obsahujícím 0,67 % kvasinkových dusíkatj^ch baží bez aminokyselin, 2 % glukosy a 0,5 % kasaminokyselin (Difcc). Kvasinkové buňky se transformují plasmidy způsobem s octanem lithným podle Ito a spol.: J. Bacteriol. 153, 163 as 168 (1983). Selekce transformantů se provádí v syntetickém mediu, ktersmu chybí tryptofan. Supernatant kultury transformantů se testuje na TCGF aktivitu.

Obrázek

133 (křivka D) ilustruje TCGF aktivitu několika ředění sunernatantu z phIL-4-2-tranformovaných buněk kvasinek ve srovnání s jinými faktory (křivka A znamená lidský IL-2, křivka 3 znamená supernatant pcD-125-transfektovaných buněk COS 7 a křivka C znamená supernatanty z buněk kvasinek, která jsou transformovány phIL-4-1). Křivka E ilustruje TCGF aktivitu supernatantu z kvasinek, které byly transformovány působením pMF-alfaS, kterému chybí insert cDNA IL-4, tj» jde o simulovaný transformant.

B. Mutein IS° (Gly-Asn-Phe-Val-His-Gl^,) lidského IL-4

Insert pMF-alfa8 pro expresi muteinu IL° (Gly-Asn-PheVal-His-Gly) se připraví přesně jako mutein Δ ^“,⁴ až na to, že se použije fragment Nael/BamHI z plasmidu pcD-125· Výsledný plasmid se označí phIL-4-1. Některá ředění supernatantu z buněk kvasinek transformovaných phIL-4-1 byla testována na TCGF aktivitu. Výsledky jsou ilustrovány křivkou C na obrázku 13B. Tyto supernatanty byly testovány také na BCGF aktivitu jak na B-lymfocytech^teré byly aktivovány anti-TgM tak na těch, které byly aktivovány SAC. Analýzy byly prováděny shora popsaným způsobem. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce IV.

Tabulka IV

BCGF aktivity supernatantů buněk kvasinek transformovaných phIL-4-3 %_v(obj. díly) přidaných supernatantů

H-thymidinová inkorporaoe (počet impulsů za minutu)

3-lymfocyty aktivo- S-lymfocyty aktivané SAC vované anti-IgM s perličkami

0,0 0,09	3633 + 1239	641 + 13221 +	69 472
7610 +	310
0,19	9235 +	181
0,39	10639 +	786	16681 +	310
0,78	10372 +	572	18090 +	1248
1,56	9905 +	328	17631 +	1216
3,12	11354 +	836	/ 13766 +	1179
6,25	10481 +	541	' 19810 +	1349
12,5	9641 +	30	18136 +	1126
25,0	8253 +	857	14750 +	1125

lidského IL-4 v kvasinkách rodní lidský IL-4 byla klonována do ercí nukleotidů proti směru vlákna za vzniku restrikčního místa KpnI.

cDNA kódující pří' pMF-alfaS nejdříve ins N-koncového His kouonu

Po štěpení působením KpnI a zpracování s DNA polymerasou I se cDNA IL-4 se zarovnanými konci vloží do místa Stul plasmidu pMF-alfaS. Standardní místně-specifickou mutagenesí se vytvoří místo KpnI. Stručně - pcD-125 se rozštěpí působením BamKI. Tento fragment obsahující úplnou cDNA lidského IL-4 se isoluje a vloží se do místa BamHI plasmidu M13mp8. Isoluje se jednovláknový M13mp8 obsahující insert. Ten se hybridizuje syntetickým oligonukleotidem, který slouží jako primer:

TCCACGGA

GGTAC

CACAAGTG - 3

Vložené nukleotidy jsou označeny orámováním obdélníkem. Pla^sd, který obsahuje cDNA mutovaného IL-4 » byl identifikován oligonukleotidovou sondou, namnožen, isolován a nel Chán zreagovat s KpnI a BamHI. Fragment KpnI/BamHI byl isolován, nechán zreagovat s DNA polymerasou I (Klenowův fragment), čímž se získaly zarovnané konce, kinasován a ligován s pMF-alfa8, který byl rozštěpen působením Stul. Kvasinky byly transformovány výslednými plasmidy pMF-alfa8, označenými phIL-4-3, jak shora popsáno. Supernatanty byly testovány na TCGF aktivitu. Tyto supernatanty vykazovaly TCGF aktivitu srovnatelnou s aktivitou, která byla pozorována u supernatantů kvasince transformovaných phIL-4-1.

Příklad 7

Konstrukce a exprese syntetického genu lidského IL-4 v

S. coli

Zkonstruuje se syntetický gen lidského IL-4, který v podstatě obsahuje bakteriální výhodné kodony, včetně řady jedinečných míst pro restrikcni endonukleasy (zde označovaných jako jedinečná restrilcční místa) a který umožňuje rychlou a vhodnou expresi rozmanitých muteinů lidského IL-4. Sekvence nukleotidů syntetického genu je ilustrována na obrázku 6a, Způsoby konstrukce a exprese syntetického genu tohoto příkladu .jsou standardní způsoby molekulární biologie, nanřo zvláště viz Sproat a Gait: Nucleic Acids Research 13, 2959 až 2977 (1985) a Ferretti a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83, 599 až 603 (1986), ale taká hullenbach a spol.: J. Biol. Chem. 261, 719 až 722 (1986),

Wells a spol.: Gene 34, 315 až 323 (1985) a Estell a spol.: Science 233, 659 až 663 (1986). Ve stručnosti - syntetický gen lidského IL-4 se sestaví z více chemicky syntetizovaných dvojvláknových DNA fragmentů. Sekvence nukleotidů syntetického genu jsou vybrány tak, aby sestavený syntetický gen obsahoval řadu jedinečných restrikčních míst.

Řada jedinečných restrikčních míst znamená' řadu segmentů, které mohou být snadno vyštěpeny a nahrazeny segmenty se změněnými sekvencemi baží. Syntetické fragmenty se vloží bučí přímo nebo po ligaci s jinými fragmenty do vhod-, ného vektoru, jako je například plasmid pUC nebo pod. Shora uvedené segmenty zhruba odpovídají kazetám” podle Wel-’, lse a spol. (viz shora uvedená citace). Syntetické fragmenJ tý se syntetizují standardními technikami, např. Gait: 01igonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, Anglie, 1984). S výhodou se používají automatické syntetizátory, jako je například Applied Biosystems, lne. (Foster City, Ka, ) model 380A. Plasmidy pUC a podobné vek-S tory jsou komerčně dostupné například od Pharmacia-PL nebo Boehriger-Mannheim. Klonování a exprese se mohou provádět standardními bakteriálními systémy, například E. coli K-12 kmenem JM101, JM103 nebo podobnými, které jsou popsány Vierou a Messingem ; Gene 19, 259 až 268 (1982).

Štěpení restrikčními endonukleasami a ligační reakce se provádějí podle standardních postupů, např. podle postupů, které popisuje Maniatis a spol.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982).

Alkalický způsob (Maniatis a spol.: viz shora uvedená citace) se používá pro přípravu plasmidů v malém měřítku.

Pro pnpravy ve velkých měřítcích se používají modifikace alkalického způsobu, kde se pro vysrážení nukleových kyselin

IVZLít-l ijný obj cm isogronanolUc ní studeným 2,511 o etanem amonným se použije pro odstranění RNA nřed odstřelováním hustotním gradientem chloridu česného a detekcí ethidiumbromidsm.

Při hybričfeaci na filtrech se používají kruhové filtry Whatman 540 pro přenos kolonií, které se pak lysují a fixují postupným zpracováním s 0,5M hydroxidem sodným, 1,5M chloridem sodným; 1M Tris-HCl, pH 8,0, 1,5M chloridem sodným (vždy po dvou minutách) a zahřátím na 80 °C po dobu 30 minut. Hybridizace se provádí v 6 x SSPE, 20% formamidu,

0,1% dodecylsulfátu sodném (SDS), 100 ^ug/ml. E. coli tRNA, 100 /ug/ml barviva Coomasie Brilliat Blue G-250” (Biorad) . šest hodin při 42 °G s použitím ^²P-značených (kinasovaných) syntetických DNA. (20 x SSPE se připraví rozpuštěním 174 g chloridu sodného, 27,6 g hydrátu dihydrogenfosforečnanu sodného a 7,4 g EDTA v 800 ml vody, upravením pH tohoto roztoku na hodnotu 7,4 hydroxidem sodným, upravením objemu na jeden litr a sterilizací v autoklávu.) . .

Filtry se dvakrát promyjí (15 minut, teplota místnosti) 1 x SSPE, 0,1% SDS. Po autoradiografií (Fuji RX film) se positivní kolonie umístí seřazením vyrostlých kolonií s modře vybarvenými koloniemi na filtrech.

DNA se sekvenuje bul chemickou degradační metodou podle Maxama a Gilberta: Methods in Enzymology 65, 499 (1980) nebo dideoxy-metodou podle Sangera a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977). Templáty pro dideoxy-reakce jsou bučí. jednovlaknove DNA odpovídajících oblastí reklonované do vektorů M13mp (např. Messing a spol.: Nucleic Acids Res.

9, 309 (1981) nebo dvouvláknová DNA připravená minialkalickým způsobem, denaturovaná 0,2M hydroxidem sodným (pět minut, teplota místnosti) a vysrážená ze směsi 0,2M hydroxidu sodného s 1,43M octaném amonným přidáním dvou objemů ethanolu. Dideoxy-reakce se provádějí při 42 °C.

DNA se syntetizuje fosforamiditovou chemií s použitím syntetizátorů Applied Biosystems 380A. Syntéza, odstranění tečeni a :unm,

C-iramcccn jištění (PAGE, eluce 7M močovinou, chromatografie na DEAE-celulose) se provádí jako je to cop sáno v příručce výrobce pro syntetizátor 380A. Komplementární vlákna syntetických DMA, které se mají klonovat ($zdého po 400 ng) se smíchají a fosforylují polynukleotid-kinssou v reakčním objemu 50 ^ul. Tato DNA se liguje s 1 /ug vektorové DNA rozštěpené příslušnými restrikčními enzymy. Ligace se provádí v objemu 50 ^ul za teploty místnosti po dobu čtyři až dvanáct hodin. Podmínky pro fosforylaci, štěpení restrikčními enzymy, polymerasové reakce a pro ligaci jsou popsány (Maniatis a spol.: shora uvedená citace). Kolonie se vyhodnotí na lacZ⁺ (jestliže je to, žádoucí) vysetím na L-%ar doplněný o ampicilin, isopropyl-l-thio-P-D-galaktosid (IPTG)^a 5-brom-4-chlor-3-indolyl-3-D-galaktopyranosid (x-gal) (40 .ug/ml).

f

Vektor TAC-RBS se zkonstruuje řadou stupňů/doplněním (výchozí stupeň) DNA polymerasou jediného BamHI místa tacP-nesoucího plasmidu pDR540 (Pharmacia). Tento produkt se pak dále liguje s nefosforylovánými syntetickými oligonukleotidy (Phanj/Pacia). Vytvoří se tak dvouvláknový fragment, který kóduje souhlasné ribosomové vazebné místo (RBS, GTAAGGAGGTTTAAC). Po ligaci se směs fosforyluje a religuje Sstl linkerem ATGAGCTCAT. Výsledný komplex se pak štěpí působením Sstl a EcoRI. Elektroforesou na polý^crylamidovém gelu (PAGE) se isoluje fragment o 173 párech nukleotidů. Tento fragment se klonuje do plasmidu pUC18 rozštěpeného působením EcoRI a Sstl (Pharmacia)(jak popsáno níže). Sekvence RBS-ATG—polylinkerových oblastí konečné konstrukce (nazývané TAC-RBS) je uvedena na obrázku 8.

Syntetický gen lidského IL-4 se sestaví do píasmjdn pUC18 v šesti stupních. V každém stupni lze detegovat inserty bez delecí a/nebo insercí po klonování podle zachován?: lacZ(tx)' genu z plasmidu pUC18 ve fázi s ATG počátečním kodonem vloženým ve stupni 1. Klony obsahující deleční a/nebo inserční změny se mohou odfiltrovat vyhodnocením modrých kolonií na L-ampicilinových deskách obsahujících x-gal •a ITT ~τ každém stupni ss sekvence insertů mohou snadno potvrdit universálním sekvenačním primerem na plasmiaové DNA připravené v malém měřítku, například dostupným od Boehrinver Mannheim.

- Ve stupni 1 se vektor TAC-RBS rozštěpí působením Sstl, zpracuje se s T4 DNA polymerasou (jejíž 3 exonukleasová aktivita štěpí 3* přečnívající vlákna štěpu Sstl za vzniku fragmentů se zarovnanými konci). Po deaktivaci T4 DNA polymerasy se zpracuje s EcoRI za vzniku fragmentu o 173 párech nukleotidů (bp) obsahujících oblast TAC-RBS se zarovnaným koncem v místě ATG počátečního kodonu a s EcoRI štěpem na opačném konci. Nakonec se isoluje fragment TAC-R3S se 173 páry nukleotidů.

Ve stupni 2 se isolovaný TAC-RBS fragment ze stupně 1 smíchá s plaamidem pUC18, který je rozštěpen působením EcoRI a Sstl, a se syntetickým fragmentem 1A/B, který, jak ukazuje obrázek 7A, má zarovnaný konec na konci proti smělou vlákna a přečnívající konec, který odpovídá štěpení působením Sstl na konci po směru vlákna. Tyto fragmenty se ligují za vzniku plasmidu pUC18 ze stupně 2.

Ve stupni 3 se syntetické fragmenty 2A/B a 3A/B (ilustrované na obrázku 7B a 7C) smíchají s pUC18 ze stupně 2 rozštěpeným působením Sstl a BamHI (po amplifikaci a vyčištění) a ligují se za vzniku pUC18 ze stupně 3. Povšimněte si, že konec fragmentu 2A/B po směru vlákna obsahuje další báze, které tvoří BamHI přečnívající konec. Tyto další nukleotidy se odštěpí ve stupni 4· Také fragmenty 2A/3 a 3A/B mají komplementární jednovláknové konce o 9 zbytcích, které se po smíchání anelují. Zůstane tak 2A/B rozštěpený působením Sstl proti směru vlákna a 3A/B rozštěpený působením BamHI po směru vlákna. Ligací se získá pUCIS.

Ve stupni 4 se pUC18 ze stupně 3 rozštěoený oůsobením Mlui a Xbal (po amplifikaci a vyčištění) opětovně vyčistí, smíchá se se syntetickým fragmentem 4A/3 (obrázek 7D)a ligací se získá pUCIS ze stupně 4.

- 78 ni 5 se pUCIS ze stupně 4 rozštěpeny působením

Ve stunn

Xbal a Sáli (po amplifikaci a vyčistění) smíchá se syntetickín fragmentem 5A/3 (obrázek 7E) a liguje se za vzniku nuClS ze slunně 5·

Ve stupni 6 se pUC18 ze stupně 5 rozštěpený působením Sáli a HindlII (po amplifikaci a vyčištění) smíchá se syntetickým fragmentem 6A/B (obrázek 7F) a liguje se za vzniku konečné konstrukce.

Obrázek 6B je mapa štěpení těchto jedinečných restrikčních míst přítomných v konstrukci pUCIS právě popsané. Jestliže se popsaný syntetický gen lidského IL-4 použije jako insert pUC18, každý pár jedinečných restrikčních míst definuje segment, který lze snadno vystřihnout a nahradit jinými syntetickými segmenty. Řada jedinečných restrikčních míst zahrnuje EcoRI, Hpal, Sací (Sstl), EcoRV, Pstl, Mlul, Bell, Xbal, Nael, Sall, Xhol a HindlII.

Plasmid pUCIS, který obsahuje syntetický gen IL-4 se vloží do E. coli K-12 kmen JM101. Po kultivaci se protein extrahuje z buněk JM101. Zředění extraktů se testují na biologickou aktivitu.

Příklad 8

Konstrukce a exprese muteinu Ile^ lidského IL-4 v E. coli

Leu v poloze 52 (vzhledem k N-konci přírodního lidského IL-4) se změní na Ile. Vytvoří se tak mutein Ile^ lidského IL-4. Plasmid pUC18 z příkladu 7, který obsahuje syntetický gen lidského IL-4 (obrázek 6A), se rozštěpí působením P^stl a Mlul a vyčistí. Shora uvedený vyčištěný pUCIS se smíchá se syntetickým dvouvláknovým fragmentem ilustrovaným níže a liguje se. Ta část sekvence nukleotidů, v níž došlo ke změně, je uvedena v obdélníku. Výsledný plasmid pUC18 se transfektuje do E. coli K-12 kmene JLCLOl nebo do podobného kmene. Nechá se probíhat exprese.

	jí i-.	G G T	.Ί :*n J —	ACC			, .· U ' J.	'Ύ í ;'l -Ti-''*
•,nr Jí	rppm j- X/ -u	L· jí λ	rt s~i Λ · > -JÍáÍ	TGG	CAA	•Ti f iAU	CT ft u j Λ	Γ» rrin a λ •jr i. Á. i 4
n a π J. ±- V		p * í1	η λ π v	GAA	AAA	r Λ n	t ři
ATG	AGA	GTG	n nr* U-X.U	CTT	TTT	CTG	TGC	GC
					(P	stl/lllul	substituční

pro generaci muteinu Ile lidského IL-4)

Po kultivaci se protein extrahuje z buněk J1T1O1 standardními technikami. Zředění extraktů se testují na biologickou aktivitu.

Příklad 9

Konstrukce a exprese muteinu (Ile^, Asp¹“¹) lidského IL-4

Modifikovaný plasmid pUC18 z příkladu 8 (obsahující Ile^ kódující sekvenci) se rozštěpí působením Sáli a Xhol. Isoluje se velký fragment. Isolovaný fragment se smíchá se syntetickým dvojvláknovým fragmentem ilustrovaným níže ve standardním ligačním roztoku. Změněná část sekvence je ohraničena obdélníkem. Výsledný plasmid se transfektuje do E. coli K-12 kmen JH101 nebo podobných. Nechá se probíhat exprese.

TCG ACT CTG GAA GA GAC CTT

GAC

CTG

TTC c

AAG GAG CT (Sall/Khoi substituční frasment)

PO kultivaci se protein extrahuje s buněk JM101 standardními technikami. Zředění extraktů se testují na liologickou aktivitu.

Příklad 10

Sekvence lidského IL-4 vyčištěného ze supernatantů trans íj. exc e lidský ±1-4 se vyčistí z kultury supernatantů ounek c.o- 80 časně transfektovaných vektory obsal· IL-4. Sekvence sekretovaného přírod? stanovena u vyčištěného materiálu.

.ujícíni cDNA :ího lidského lid eno

A. Biologická analýza pro čištění

TCGF aktivita byla použita pro analyzování lidského IL-4 během separačních postupů. Analýza je v podstatě stejná jako je to posáno shora v příkladu 2. Ve stručnosti - krev od žhavého dárce se přenese do heparinizované zkumavky a navrství se na Ficoll-Hypaque, například 5 ml krve na 3 ml Ficoll-Hypaque v 15ml zkumavce pro odstřeáování. Po odstřeČLování při 3000 x g dvacet minut se buňky v mezifází odeberou a zředí se kultivačním mediem sestávajícím z RPMI 1640, které obsahuje 10% plodové telecí sérum, 50mikromolání 2merkaptoethanol, 20 mikrogramů/ml fytohemaglutininu (PHA)a rekombinantní lidský IL-2. Po pěti až deseti dnech inkubace při 37 °C se PHA-stimulované lymfocyty periferní krve (PBL) promyjí a použijí se pro dvoudenní kolorimetrické analýzy: Mossmann: J. Immunol. Methods 65, 55 až ,63 (1983). Seriálová dvojnásobná zředění standardního IL-4 (supernatanty z bul COS 7 buněk transfektovaných pcD-125 nebo C(y7 buněk transfektovaných pEBT-178) nebo frakce, které se restují, se dají do misek s 96 jamkami s růstovým mediem shora popsaným tak, aby konečný objem byl 50 mikrolitrů na jamku. 50 mikrolitrů PHA-stimulovaných PBL v množství 4 až 8.10^ buněk na ml se přidá do každé jamky a misky se inkubují dva dny při teplotě 37 °C. Růst buněk se pak změří podle Mosmanna (shora uvedená citace).

Jednotky TCGF aktivity lidského IL-4 jsou definovány vzhledem k supernatantům COS 7 buněk transfektovaných pcD-125 (příklad 2) nebo buněk COS 7 transfektovaných pEBV-178 (příklad 3).

Při čištění jsou jednotky vztaženy na aktivity supernatantů pcD-125 transfekce, které se produkují následujícím způsobem. Asi 1.10 buněk COS 7 se vyseje na lOOmm desky pro tkáňové kultury obsahující Dulbeccovo· modifikované Eagleho medium (DME), 10% plodové telecí sérum a 4mM L-glutamin.

Asi dvacet čtyři hodiny po vysetí se medium odebere z desek a buňky se promýjí dvakrát pufrovaným QMS (50mM Tzás) bez sera. Na každou desku se přidá po 4 ml pufrovaného DME bez sera (se 4mM L-glutaminem), 80 mikrolitrů DEAE-dextranu a 5 mikrogramů pcD-125 DNA. Buňky se pak inkubují v této směsi čtyři hodiny při 30 °C₀ Potom se směs odebere a buňky se pro— myjí jednou pufrovaným DME bez sera. Po promytí se přidá 5 ml DME se 4mM L-glutaminem, lOOmikromolárním Chloroquinem a 2% plodovým telecím šerem do každé jamky. Buňky se inkubují tři hodiny, načež se promýjí pufrovaným DME bez sera. Dále se přidá 5 ml DME se 4mM L-glutaminem a 4% plodovým telecím šerem. Buňky se inkubují 24 hodin při 37 °C. Potom se buňky promýjí jednou až třikrát DME nebo PBS, přidá se 5 ml DME bez sera (se 4mM L-glutaminem) a buňky se inkubují při 37 °C. Kultura supernatantů se isoluje po třech dnech.

Jedna jednotka, jak se toto množství používá zde, zna—¹ mená množství faktoru, které v jedné jamce (0,1 ml) stimuluje 50 % maximální proliferace 2.10^ PHA-stimulováných PBL během 4S-hodinové období.

B. Čištění

Čištění se provádí postupnou aplikací chromátografie na katexu, gelové filtrace Vysokotlaké kapalinové chromá— tografie na obrácených fázích. Všechny operace byly prováděny při 4 °C.

Po odstranění buněk COS 7 odstřelováním se supernatant zahustí asi desetinásobně ultrafiltrací a skladuje se při -80 C až do dalšího postupu. IL-4 byly stanoveny analyzováním schopnosti proteinu stimulovat proliferaci fytohema— glutininem indukovaných lidských lymfocytů periferní krve, tj. TCGF aktivitou podle shora popsané standardní analýzy.

Zahuštěný COS 7 supernatant, který má TCGF aktivitu asi 10 až 10 jednotek na mililitr a obsah proteinu přibližně 15 až 20 mg/ml, se dialysuje proti dvěma změnám 50mM sodné soli HEPES, pH 7,0, dvacet ctyri hodiny (každá změna je přibližně desetinásobek až patnáctinásobek objemu jednoho koncentrátu). Dialysát se nanese na kolonu (1 x 2,5 cm) s náplní S-Sepharose (průtok kolonou: 0,2 ml za minutu), která se předem ekvilibruje^áodnou solí HEPES, pH 7,0. Kolona se promyje 15 objemy kolony ekvilibračního pufru, následuje eluce dvaceti objemy kolony od 0 do 0,5% gradientu chloridu sodného v 50mM sodné soli HEPES, pH 7,0. Gradient se ukončí elucí pěti objemy kolony roztokem stejné koncentrace: 50mM sodná sůl HEPES, 0,5M chlorid sodný, pH 7,0. Z jednotlivých dávek byly získány frakce 1,5 ml a 1,8 ml. Bylo zjištěno, že IL-4 titry se u obou chromátografií eluovaly mezi 300mM a 500mM koncentrací chloridu sodného.

Šest frakcí z každé kolony s náplní S-Sepharose obsahující IL-4 titry se odděleně spojí na celkové objemy 9,0 a 10,8 ml. Oba objemy se zahustí na 1,9 ml ultrafiltrací membránou Amicon YM5 (předěl molekulové hmoty: 5000). V tomto stupni bylo získáno přibližně 80 % proteinu. Zkoncen3 trovaný IL-4 roztok se nanese na kolonu s nosičem Sephadex G-TOO (1,1 x 58 cm), předem ekvilibrovanou v 50mM HEPES,

0,4M chloridu sodném, pH 7,0. Kolona se eluuje stejným puf-rem rychlostí 0,15 ml/min. Bylo odebráno celkem 50 frakcí , (1,0 ml/frakcej. Byly analyzovány na IL-4 titry. Maximum biologické aktivity bylo zjištěno při zdánlivé molekulové hmotě 22 000. Sephadex G-100 byla kalibrován na stanovení zdánlivé molekulové hmoty hovězím sérovým albuminem (molekulová hmota 65 000), karbonatdehydratasou (molekulová hmota 30 000) a cytochromem C (molekulová hmota 11 700).

Frakce z kolony s náplní Sephadex G-100 obsahující IL-4 aktivitu se zahustí tři- až čtyřikrát ve vakuu a injekcí se nanese na předkolonu (4,6 x 20 mm) s náplní Vydac C-4. Pro eluci byl použit lineární gradient od 0 do 72 % (objemové díly) acetonitrilu v 0,1% (objemové cíly) kyseliny trifluoroctové (TFA); doba 15 minut; teplota kolony 35 °q. průtok

1,0 ml/minutu. Výsledkem bylo, že se získal tři maxima, která byla detegována při 214 nm s retenční dobou 7, 8,2 a 8,7 minuty (maxima 1, 2 a 3 na obrázku 10). 40mikrolitrový podíl maxima 2 (s eluční dobou 8,2 minuty) byl lyofilizován a znovu rozpuštěn v minimálním esenciálním mediu obsahujícím 10% plodové telecí sérum. Tento roztok vykazoval positivní TCGM odoověň. 300mikrolitrový podíl maxima 2 se odpaří dosucha a odparek se znovu rozpustí ve 200 mikrolitrech 0,1% (hmotnostní díly k objemovým dílům) dodecylsulfátu sodného (SDS). Dvoumikrolitrový podíl se zředí 200 ^ul 1% (objemové díly) TPA a rechromatografuje se. HPLC tohoto roztoku ukazuje jediné maximum gři 215 nm. Materiál maxima 2 vykazoval aktivitu asi 7.10° jednotek na miligram.

C. Analýza sekvence aminokyselin

Stanovení sekvence aminokyselin se provádí automatickou Edmanovou degradací v plynné fázi (Hewick R. M., Hunkapillar W. M., Hood L. E. a Dryer W. J.: J. Biol. Chem. 256,

7990 (1981).) mikrosekvenátorem Applied Biosystems. 90mikrolitrový podíl maxima 2 z frakcí HPLC se rozpustí v 0,1% SDS jak shora popsáno a nanese se na filtrační náplň ze skleněných vláken v přítomnosti Polybrenu. Byly získány informace o sekvenci_;aminokyselin až do 35· zbytku. Sekvence od S-konce byla stanovena takto: His - Lys - __- Asp - Ile / Thr J

Leu Gin - Glu - Ile - Ile - Lys - Thr Leu - Asn / Ser Leu - Thr - Glu - Gin J Lys - Thr - Leu - ___ - Thr - Glu Leu - _ J Val - Thr J Asp - Ile J Phe J Ala - Ala, kde podtržená prázdná místa znamenají, že chybí identifikoval telná aminokyselina. Prázdná místa na2tninovém konci v polo/ hách 3 a 23 souvisejí s přítomností cysteinu, který může být tímto systémem detegován. Prázdné místo v poloze 28, které odpovídá tbreoninu v předpovězené (podle cDNA) sekvenci, může pocházet buč od variability detekce fenylthiohydantion-threoninu nebo od přítomnosti 0—glykosylace nebo 0-esterifikace.

lOOmikrolitrový podíl HPLC frakce, u níž se provádí sekvenace od aminového konce, se odpaří dosucha, načež se znovu rozpustí v 70% kyselině mravenčí. Přidá se padesátinásobný molární nadbytek bromkyanu. Roztok se nechá stát

2,5 hodiny za teploty místnosti. Štěpený protein se sekvenuje na sekvenatoru firmy Applied Biosystems v plynné fázi jak shora popsáno. Dvě sekvence byly identifikovatelné:

- 84 Arg - Glu - Lys - Tyr - Ser - Lys (1)

His - Lys - _ - Asp - Ile - Thr (2)

Sekvence (l)je identická se sekvencí předpovězenou podle cDNA. Tato sekvence byla uvolněna odštěpením methioninového zbytku v poloze 120 působením bromkyanu. Poslední dva zbytky na C-konci mohou být přítomny, ale nemusí bít detegovatelné díky nedostatku vzorku. Sekvence (2) je identická se sekvencí na aminovém konci získanou pro přírodní IL-4 protein, jak shora popsáno. Na základě relativních množství uvolněných fenylthiohydantóin-aminokyselin na aminovém konci a na karboxylovém konci lze předpokládat ekvimolární množství obou sekvencí ve vzorku. Tento výsledek podporuje závěr, že vzorek proteinu, který byl sekvenován, obsahuje , převážně jediný polypeptidový řetěz s aminovým a karboxylo·* vým koncem předpovězeným podle sekvence cDNA lidského IL-4·

Příklad 11

Konstrukce a exprese muteinu (Ile^², A⁷-»-IS⁹⁴ (Ala))lidX ského IL-4

Modifikovaný plasmid pUC18 z příkladu 8 (obsahující sekvenci kódující Ile⁹²) se rozštěpí působením Mlul a Bell. Isoluje se velký fragment. Isolovaný fragment se smíchá se syntetickým dvouvláknovým fragmentem ilustrovaným níže ve standardním ligacním roztoku. Výsledný plasmid se transfektuje do E. coli K-12 JM101 nebo do podobného a namnoží se.

CG	CGT	TGT	CTC	GGC	GCC ACT GCG CAG TTC	CAC CGT
	A	ACA	GAG	CCG	CGG TGA CGCfGTC AAG Delece	GTG GCA
CAC	AAA	GAG	CT
GTG	TTT	GTC	GAC	TAG	(MluI/BclI substituční	fragment)

Modifikovaný plasmid se isoluje a rozštěpí se působením Xbal a Nael. Isoluje se velký fragment. Isolovaný fragment se smíchá se syntetickým dvouvláknovým fragmentem ilustrovaným níže ve standardním ligacním roztoku. Přidaný kodon je uveden v rámečku. Výsledný plasmid se transfektuje do E. coli K-12 kmene JM101 nebo do podobného a nechá se proběhnout exprese.

- 85 CTA GAC CGT AAC CTG TGG GGC CTG GCC GCC

TG GCA TTG GAC ACC CCG GAC CGG CGG (Xbal/Mael substituční frag^nnt)

Po kultivaci se protein extrahuje standardními způsoby z buněk JM101. Zředění extraktů se testují na biologickou aktivitu.

Příklad 12

Indukce DR antigenů na buňkách od pacientů tr*pících syndromem holých lymfocytů

Syndrom holých lymfocytů je charakterizován nedostatkem exprese HLA antigenů třídy I a/nebo II na površích buněk. Často souvisí s těžkou imunodeficiencí, například Touraine: Lancet 319 až 321 (7. února 1981), Touraine a Bethel! Human Immunology 2, 147 až 153 (1981) a SuRivan a spol. í J. Cl.in, Invest. 76, 75 áž 79 (1985)· Bylo objeveno, že lidský Il>..4 je schopen indukovat expresi DR antigenů třídy II na površích buněk odvozených od pacienta trpícího syndromem holých lymfocytů.

Periferní krevní lymfocyty (PBL) byly získány od pacientů trpících na HLA antigeny třídy II bez exprese. B-buňky byly vyčištěny od PBL v podstatě jak shora uvedeno. B-buněčná linie (označená UD31) byla získána transformací virem Epstein-Barr (EBV). EBV-transformované buňky byly kultivovány 48 hodin v mediu podle Yssela (shora popsaného) s 2 % plodového telecího sera a 5 % (objemové díly k objemovým dílům) koncentrace supernatantu z buněk COS 7 transfektovaných plasmidem pcD-125· Buňky byly isolovány, fixovány, obarveny fluorescenčně označenou anti-DR monoklonální protilátkou (napr. Becton Dickinson, 1243) a analyzovány průtokovou cytometrii. Obrázek 9 ilustruje histogramy frekvence buněk proti intensitě fluorescence pro kontrolní populaci EBV-transformovaných buněk isolovaných před působením IL-4 (křivka A) a populaci EBV—transformovaných buněk isolovaných po působení IL-4 (křivka B).

příklad 13

MCGF aktivita supernatantů Cl.Lyl⁺2“/9 (Cl.l)

Vyčištěný IL-3 a supernatant z buněk COS 7 transfektovaných IL-3 cDNA klonem (rekombinantní IL-3; IL-3R) stimulovaly do jisté míry proliferaci linie žirných buněk MC/9 (obrázek 14A). Avšak hladina této proliferace byla třetinou až polovinou proliferace, kterou indukuje supernatant Cl.l T buněk. Přítomnost ConA v supernatantů T buněk (2 ^ug/ml.) nepřispívá nijak významně k jeho MCGF aktivitě. Jedním vysvětlením tohoto jevu je, že IL-3 není zodpovědný za veškerou MCGF aktivitu produkovanou buňkami Cl.l. Linie žirných buněk, které byly použity pro tyto analýzy, by také mohly být (teoreticky) znečištěny populací buněk závislou na druhém faktoru. Tato druhá možnost je však vyloučena, protože reklonování buněčné linie MC/9 poskytuje subklony, z nichž každý odpovídá IL-3 a supernatantů buněk stejným způsobem jako originální klon MC/9 ·

J.elikož supernatant Cl.l také obsahuje lymfokiny jiné než IL-3, byly tyto lymfokiny testovány na jejich schopnost podporovat růst buněk MC/9· Buňky MC/9, však neodpovídaly různým koncentracím rekombinantního IL-2, IFN a GM-CSí a také supernatantů obsahujícího IL-1 (buňky P388D 1)(obrázek 14A). Navíc doplnění kultur obsahujících různé koncentrace rekombinantního IL-3 o IL-2, GM-CSF, IFN-JP nebo IL-1 nestimuluje proliferaci buněk MC/9 nad hladinu, která byla získána s IL-3 samotným. To ukazuje na to, že ke zvýšené MCGF aktivitě supernatantů T buněk nedochází díky obsahu těchto jiných známých faktorů.

Srovnávací studie s jinými buněčnými liniemi závislými na faktoru byly prováděny následujícím způsobem: Dvě jiné linie žirných buněk, DX-2 a MM3, také dávají vyšší proliferační odpovědi se supernatantem Cl.l než s IL-3 (representativní data pro DX-2 jsou uvedena na obrázku 14B). Tyto buňky také neodpovídají na IL-2, IFN-JK, GM-CSF nebo supernatant buněk P388D-1. Zvýšená proliferační odpověň buněk MC/9 ^ηθ· supernatant T buněk může být typická u žirných buněk

- 87 obecně. Naproti tomu buňky typu granulocytů (NFS-60) byly stimulovány téměř stejně supernatantem Cl.l a IL-3 (obrázek 14C). I když buňky NFS-60 neodpovídají na IL-2, IFN-^ a supernatant P388D-1, existuje malá, ale reprodukovatelná stimulace GM-CSF. Ze skutečnosti, že IL-3 a supernatant T buněk indukují srovnatelné hladiny proliferace, lze předpokládat, že buněčná linie NFS-βΟ může být relativně necitlivá na další faktory přítomné v supernatantu T buněk. Buňky NFS-60 se mohou tedy používat pro analyzování IL-3 při pokusech oddělit IL-3 od jiných MCGF aktivit frakcionací proteinů.

TCGF aktivita supernatantu Cl.l byla analyzována pomocí linie T buněk závislých na IL-2, HT2. Nasycené koncentrace supernatantů Cl.l neproměnně stimulovaly inkorporaci ?H-thymidinu pod maximální hladinou dosaženou s rekombinantním IL-2 (obrázek 14D). Podobné výsledky byly získány se dvěma jinými buněčnými liniemi. Supernatanty neobsahují žádnou inhibiční sloučeninu, jelikož její přidání ke kulturám HT2 obsahujícím IL-2 nevykazovalo žádnou redukci inkorporace ..... ⁹H-thymidinu (obrázek 14D). Tyto výsledky předpokládají, že supernatant Cl.l obsahuje TCGF aktivitu odlišnou od TCGF aktivity IL-2. Biochemický důkaz na podporu tohoto závěru je uveden níže.

Předběžná chromatografická frakcionace supernatantu Cl.l se provádí následovně. Supernatant Cl.l se frakcionuje různými chromátografickými metodami s bezprostředním cílem oddělení IL-3 od jiných MCGF aktivit. Proliferace buněk NFS-60 byla použita pro sledování IL-3 specificky proti pozadí celkové MCGF aktivity dané proliferaci MC/9. TCGF aktivita byla hodnocena proliferaci buněk HT2.

Jelikož se supernatant Cl.l frakcionuje chromátografii na katexu při neutrálním pH, v průtoku (frakce 1 až 20) se objevuje přibližně 98 % naneseného proteinu, 97 % jednotek IL-3 (sledovaného proliferaci NFS-60) a 1 % jednotek TCGF (obrázek 15). Eluce navázaného proteinu gradientem chloridu sodného eluuje TCGF aktivitu při 0,19M koncentraci chloridu sodného (frakce 60). Male, ale reprodukovatelné maximum

- 88 TCGF aktivity se objevuje také při 1M koncentraci chloridu sodného. Žádnou další významnou aktivitu TCGF se nepodařilo eluovat při vyšších koncentracích chloridu sodného (a to až do 3M koncentrace). V přibližné stejné oblasti jako TCGF maximum (detegovatelná NFS-odpověď) byla eluována také malá množství IL-3· Pouze frakce, které odpovídají maximu TCGF aktivity (frakce 59 až 61 )a průtoku (frakce 1 až 20) stimulovaly vysoké hladiny proliferace MC/9, srovnatelné s proliferací nefrakcionovaného supernatantu (šipky, obrázek 15,). Jelikož titrační křivky ukazují, že frakce 59 až 61 obsahují více z vysokých hladin MCGF aktivity než průtok, byly dělány pokusy zmenšit další IL-3 aktivitu eluující se současně s maximem TCGF a hodnocenou hladinou proliferace MC/9. Frakce 59 až 61 byly tedy ještě dvakrát rechromátografovány , za stejných podmínek. Po třetím projití kolonou se 0,19M konJ centrací chloridu sodného eluovalo současně více než 95 %

TCGF aktivity. V průtoku ani v jakýchkoliv frakcích z kolony však nebylo přítomno žádné měřitelné množství IL-3 (NFS-60, odpověď). Avšak stále se ještě společně s maximem TCGF eluovala ÉCGF aktivita, která nyní stimulovala ustálenou hladinu proliferace MC/9 , která byla významně nižší než hladina získaná se supernatantem Cl.l nebo IL-3 (viz níže). Jelikož tyto frakce postrádaly měřitelnou IL-3 aktivitu (nepřítomnost NFS-60 odpovědi), zřejmě nový MCGF samotný byl neschopen stimulovat buňky MC/9 do stejného stupně jako surový supernatant T-bunek.

Při dalším pokusu oddělit MCGF od TCGF byl třikrát frakcionovaný materiál (frakce 59 až 61) zředěn destkrát 0,1% kyselinou trifluoroctovou ve vodě na pH 2 a nanesen přímo na kolonu s náplní C8 s obrácenými fázemi. Obrázek 16A ukazuje eluční profil navázaného proteinu, který byl uvolněn gradientem acetónitrilu v 0,1% TFA. V průtoku se neobjevila zadna MCGF ani TCGF aktivita. Obě aktivity byly elu— ovány společně 37% acetonitrilem (frakce 26 až 29). Avšak nasycená MCGF odpověď byla nyní pouze asi polovinou toho, co produkoval IL-3 samotný (obrázek 17A). Když byly všechny frakce znovu analyzovaný v přítomnosti nasycených hladin IL-3, pouze frakce 26 až 29 vykazovaly odpověď proliferace

- 39 MC/9 v nadbytku IL-3 samotného (šipka, obrázek ISA). Ve skutečnosti velikost odpovědi byla podobná odpovědi nefrakcionovaného supernatantu samotného (obrázek 17A). Dále byly také pozorovány proliferační hladiny ekvivalentní s hladinami nefrakcionovaného supernatantu u frakcí 26 až 29 testovaných v přítomnosti IL-3 obsaženého v průtoku nebo IL-3 vyčištěné , formy WEHI 3. Kombinace IL-3 a jedinečného MCGF/TCGF stimuluje hladiny proliferace MC/9, což je Charakteristické pro původní supernatant T buněk.

I když chromatografie na obrácených fázích selhala při oddělení MCGF od TCGF, bylo ukázáno, že TCGF se liší od IL-2 dvěma hledisky. Za prvé, jestliže rekombinantní IL-2 v supernatantech buněk COS 7 (IL-2 )a supernatant' z linií myších T buněk (GF15-1) produkujících (stimulovaných ConA)

IL-2 jsou oba chromátografovány na stejné koloně za stejných podmínek, TCGF aktivita se eluuje 45% acetonitrilem jako ostré maximum, které nepřekrývá polohu eluce 37% acetinitrilem označující Cl.l TCGF (obrázek 16B). Za druhé, nasycená odpověď HT2 buněk na IL-'2^R je velice odlišná od odpovědi, která charakterizuje supernatant Cl.l (obrázek 16B, insert). Dále, nebyla detegována žádná zřejmá synergie mezi částečně vyčištěným TCGF a IL-^?2 (obrázek 17B).

Průběh chromatofokusace supernatantu Cl.l je ukázán na obrázku 18_o IL-3 aktivita (NFS-60 odpověď) vykazuje velmi heterogenní profil, indukující aktivitu^spl hodnotami vyššimi než 7,1, ale TCGF aktivita se zdá být homogennější s hlavním TCGF pásem (frakce 12) vykazujícím pí přibližně 6,2. To odpovídá maximu MCGF aktivity (MC/9 odpověď) po přidání nasycených hladin IL-3.

této části tohoto spisu bude popsána SDS PAGE supernatantu Cl.l a cástečne vyčištěného faktoru. Obrázek 19 porovnává elektroforeticke profily nefrakcionovaného supernatantu Cl.l (obrázek 19A) s materiálem, který prošel chromatografii na katexu, s frakcemi 59 až 61 (obrázek 19B). Protein byl eluován přímo z gelových vrstev. Aktivita byla

- 90 stanovena croliferací» Jak frakce z katexu tak supernatant Clol vykazují TCGP maxima: při molekulových hmotách 20 000 a 15 000 za neredukujících podmínek a při molekulových hmotách 21 000 a 16 000 za redukujících podmínek. Jelikož katex byl zbaven IL-3, byly indukovány pouze nízké hladiny pro· liferace MC/9 a tato MCGP. ještě odpovídala TCGP maximům. Přidání nyscených množství IL_3^R ke všem frakcím zvýšilo odpověď proliferace MC/9 na hladiny supernatantu Cl.l pouze, u frakcí s maximem MCGP/TCGP (šipky, obrázek 19B). IL-3 akJ tivita supernatantu byla největší v poloze molekulové hmoty 24 000, ale objevuje se také v širokých pásech kolem oblasti molekulové hmoty 20 000., Významné je, že hladiny proliferace MC/9 nad hladinami IL-3 se vyskytovaly v oblasti molekulové hmoty 20 000 elektroforesovaného supernatantu (šip-⁴ ka, obrázek 19A). Stříbrem potažený SDS gel nejvíce vyčištěného materiálu MCGP/TCGP (frakce 28 z kolony s obrácenými fázemi) také vykazoval silné proteinové pásy u molekulových hmot 20 000 a 15 000.

Mikrogramová množství faktoru ve formě s molekulovou hmotou 20 000 byla vyčištěna do homogenity postupnou frakcionací ConA-supernatantů z aktivovaných Cl.l T-buněk: l)chromatografií na katexu, 2) chromatografií na nosiči HeparinJ --Sepharosa a 3) chromatografií na nosiči c4 s obrácenými fázemi jak shora popsáno. Výsledný materiál vykazuje pouze jediný pás u molekulové hmoty 20 000 podle stříbrem potažené, SDS-PAGE, což odpovídá jedinému maximu s DP absorbcí při e-¹ luci na c4. Biologická charakterizace vyčištěného faktoru po tvrdila jeho schopnost stimulovat nízké hladiny proliferace T-buněk a žirných buněk a zvyšovat proliferaci žirných buněk závislých na IL-3.

Jak je uvedeno v tabulce V, tento faktor má několik aktivit stimulujících B-huňky, které jsou připisovány BSP1 (Roehm S. W. a spol.: J. Exp. Med. 169, 679 až 694 (1984), Howard M. a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78, 5788 (1981), Roehm N. W. a spol.: Proč. Nati.Acad. Sci. USA 81, 6149 až 6153 (1984)o)« Za prvé indukuje zvýšenou expre-^!

- 91 si la na klidových 3-buňkách ve srovnání s kontrolní populací (tabulka V). Za druhé, tento faktor, ve spojení s anti-Ig protilátkami, indukuje významnou inkorporaci Kthymidinu, což znamená že působí jako dopro^g/vdný faktor při stimulaci proliferace B-buněk.

Tabulka V Analýzy stimulace B-buněk
--------—— -——-T-- inkroporace ^H-thymidinu anti-Ig zdroj zpracovaných?buněk+ (počet impulsů za minutu)	indukce I-A-n·
ne f r ak c io no váný
CleLyl+2’/9 supernatant 33 788 + 5 454	162,3
vyčištěný faktor 44 125 + 2 775	157,1
medium (negativní kontrola) 4 128 + 734	35,5

⁺ Uvedené výsledky jsou píjrměrem počtu impulsů za minutu +

-··+ střední odchylka třech kultivací doplněných o nasycené hladiny faktoru ** Uvedené výsledky jsou průměrem relativní střední fluorescence třech kultivací doplněných o nasycené hladiny faktoru.

Tyto polypeptidy vykazují několik biologických aktivit, které se liší jak ve zdánlivých zprostředkovaných funkcích tak v typu ovlivňovaných buněk. Jak bylo popsáno, mezi tyto aktivity patří synergie indukce proliferace linií B-buněk a žirných buněk, časná aktivace klidových Bbuněk, stimulace proliferace T-^buněk a selektivní zvýšení produkce IgG^ a IgE mitogenem aktivovaných B-buněk. Vyčištění polypeptidů do homogenity vyjasnilo rozsah těchto aktivit.

Na základě předcházející ho bude oceněno, že vyčištěné proteiny podle tohoto vynálezu poskytují odborníkům nové terapeutické možnosti. Možnost produkovat významná množství těchto faktorů umožní zlepšená in vitro kultivace vybraných

- 92 linií savčích buněk, rovněž tak i celkově zlepšené porozumění imuntní odpovědi.

cDNA klony pcD-2A-B3, pcD-46 (pcD-2Fl-13)» pcD-125 a kvasinkového vektoru pMF-alfa8 byly uloženy v Americké sbírce typu kultur, Rockville, Md, USA (ATCC: American Type Culture Gollection) pod čísly 53 330, 53 337, 67 029 a 40 140o Tato uložení jsou provedena v souladu s Budapešt, skou dohodou o ukládání mikroorganismů pro patentové účely (Budapešt Treaty on the International Recognition of the Deposit of Micro—organisms for the purposes of Patent Pro-³ cedure) z roku 1977.

— -Π ,.

, , i ) -< 'π > ~

Claims (10)

1. Lidský interleukin-4.

2. Lidský interleukin-4, vyznačující se tím, že má alespoň 9.10^ jednotek/mg ^ativity TCGF (faktor růstu T-buněk).

3. Lidský interleukin-4, vyznačující se tím, že vykazuje alespoň jednu aktivitu, s výhodou dvě aktivity, které jsou vybrány ze skupiny sestávající z aktivity indukce MHC antigenu, aktivity indukce Fc-epsilon rec^\etoru, aktivity zesilující růst kolonií GM-CSF stimulovaných granulocytů, aktivity zesilující TCGF interleukinu-2 a aktivity IgG^- a IgE-indukce.

4· Lidský interleukin-4, vyznačující se tím, že v podstatě neobsahuje společně bílj^vinný materiál.

5· Protein s aktivitou interleukinu-4, vyznačuj ící se tím , že obsahuje desetinásobně substituovaný polypeptid se sekvencí aminokyselin obecného vzorce:

X(His) - X(Lys) - X(Cys) - X(Asp) - X(Ile) - X(Thr) (

6)X(Leu) - X(Gln) J X(Glu) - X(Ile) - X(Ile) - X(Lys) (12)X(Thr) - X(Leu) J X(Asn) - X(Ser) - X(Leu) - X(Thr) (18)X(Glu) - X(Gln) - X(Lys) - X(Thr) - X(Leu) - X(Cys) (24)X(Thr) J X(Glu) - X(Leu) J X(Thr) - X(Val) - X(Thr) (30)X(Asp) _ X(lle) - X(Phe) - X(Ala) - X(Ala) - X(Ser) (36)X(Lys) - X(Asn) - X(Thr) J X(Thr) - X(Glu) - X(Lys) (42)X(Glu) - X(Thr) - X(Phe) - X(Cys) - X(Arg) - X(Ala) (48)X(Ala) - X(Thr) - X(Val) - X(Leu) - X(Arg) - X(Gln) (54)X(Phe) - X(Tyr) _ X(Ser) - X(His) - X(His) - X(Glu) (60 )X(Lys) - X(Asp) - X(Thr) - X(Arg) - X(Cys) - X(Leu) (66)X(Gly) - X(Ala) - X(Thr) - X(Ala) - X(Gln) - X(Gln) (72)X(Phe) - X(His) - X(Arg) - X(Jíis)- X(Lys) - X(Gln) (78)X(Leu) - X(ile) - X(Arg) - X(Phe) - X(Leu) - X(Lys) (84)X(Arg) _ Z(Leu) - X(Asp) - X(Arg) - X(Asn) - X(Leu) (90)X(Trp) - X(Gly) - X(Leu) - X(Ala) - X(Gly) - X(Leu) (96)X(Asn) _ X(Ser) _ X(Cys) - X(Pro) - X(Val) - X(Lys) (102)- 94 X(Glu) - X(Ala) - X(Asn) - X(Gln) - X(Ser) - X(Thr) (108)X(Leu) - X(Glu) - X(Asn) - X(Phe) - X(Leu) - X(Glu) (114)X(Arg) - X(Leu) - X(Lys) - X(Thr) - X(Ile) - X(Met) (120)X(Agr) - X(Glu) - X(Lys) - X(Tyr) - X(Ser) - X(Lys) (126)X(Cys) - X(Ser) - X(Ser) (129), v němž

X(Ser) znamená skupinu sestávající ze Ser, Thr, Gly, a Asn,

X(Arg) znamená skupinu Lys a Glu, sestávající z Arg, His, Gin, X(Leu) znamená skupinu Tyr, Met a Val, sestávající z Leu, Ile, Phe, X(Pro) znamená skupinu Thr, sestávající z Pro, Gly, Ala a X(Thr) znamená skupinu Ala, Gly, His a Gin, sestávající z Thr, Pro, Ser, X(Ala) znamená skupinu a Pro, sestávající z Ala, Gly, Thr X(Val) znamená skupinu Phe, Ile a Leu, sestávající z Val, Met, Tyr, X(Gly) znamená skupinu Thr a Ser, sestávající z Gly, Ala, Pro, X(Ile) znamená skupinu Phe, Val a Leu, sestávající z Ile, Met, Tyr, X(Phe) znamená skupinu Tyr, Ile, Val a Leu, sestávající z Phe, Trp, Met, X(Tyr) znamená skupinu Phe, Ile, Val a Leu, sestávající z Tyr, Trp, Met, X(His) znamená skupinu Gin, Thr a Arg, sestávající z His, Glu, Lys, X(Gln) znamená skupinu Asn, His, Tfrr a Arg, sestávající z Gin, Glu, Lys, X(Asn) znamená skupinu Gin a Ser, sestávající z Asn, Glu, Asp, X(Lys) znamená skupinu His a Arg, sestávající z Lys, Glu, Gin, X(Asp) znamená skupinu sestávající z Asp, Glu-a Asn, X(Glu) znamená skupinu sestávající z Glu, Asp, Lys,

Asn, Gin, His a Arg a

- 95 y(Met) znamená skulinu sestávající z Met, Phe, Ile,

Val, Leu a Tyr.

flíOlFlfót protein podle Jae-au 5, vyznačující se tím, že uvedený glj^yosylovaný nebo neglykosylovaný polypeptid je tro jnásobě/ř substituován, s výhodou že je jednou substituován.

zAo.hfyízL

7. (Arg) z namená skupinu sestávající z Δ o> His, Gin, Lys a Glu, Z(Leu) znamená skupinu sestávající z Leu, Ile, Phe, Tyr, Met a Val, Z(Pro) znamená skuninu sestávající rv Pro, Gig, A1 s o X(Thr) znamená skupinu sestávající z Thr, Pro, Ser,

Ala, Gly, His a Gin,

X(Ala) znamená skupinu sestávající z Ala, Gly, Thr a Pro, X(Val) znamená ε skupinu sestávající z Val, Met, Tyr, Phe, Ile a Leu, X(Gly) znamená skupinu sestávající z Gly, Ala, Thr, Pro a Ser, X(Ile) znamená skupinu sestávající z Ile, Met, Tyr, Phe, Vál a Leu, X(Phe) znamená skupinu sestávající z Phe, Trp, Met, Tyr, Ile, Val a Leu, X(Tyr) znamená skupinu sestávající z Tyr, Trp, Met, Phe,“Ile, Val a Leu, X(His) znamená skupinu sestávající z His, Glu, Lys, Gin, Thr a Arg, X(Gln) znamená skupinu sestávající z Gin, Glu, Lys, Asn, His, Thr a Arg, X(Asn) znamená skupinu sestávající z Asn, Glu, Asp, Gin a Ser, X(Lys) znamená skupinu sestávající z Lys, Glu, Gin, His a Arg, X(Asp) znamená skupinu sestávající z Asp, Clu a Asn X(Glu) znamená skupinu sestávající z Glu, Asp, Lys, Asn, Gin, His a Arg a X(Met) znamená skupinu sestávající z Met, Phe, Ile,

Val, Leu a Tyr.

Protein podle bo čhi 15, vyznačující se tím , že uvedený glykosylovaný nebo neglykosylovaný polypeptid neobsahuje více než jednu inserci, jednu dele~ ci a jednu substituci.

Protein podle bťrdrrl6, vyznačující s e

- 99 tím , že uvedený glykosylovaný nebo neglykosylovaný polypeptid neobsahuje více než jednu inserci v oblasti zbytků aminokyselin 3 až 29 včetně, 35 až 66 včetně, 7S až 87 včetně, 98 až 99 včetně a 105 až 125 včetně.

Protein podle bu d CT15, vyznačující se tím , že uvedený glykosylovaný nebo neglykosylovaný polypeptid neobsahuje více než jednu inserci, jednu deleci nebo jednu substituci v oblasti zbytků aminokyselin 3 až 29 včetně, 35 až 66 včetně, 78 až 87 včetně, 98 až 99 včetně a 105 až 125 včetně.

19· Protein podle boďuíb, vyznačující se

t í m , že X(Arg) X(Leu) X(Ser) Znamená znamená znamená skupinu skupinu Ser, sestávající sestávající z z Arg, His a Lys, Leu, Ile, Phe a Met, X(Pro) X(Thr) znamená znamená skupinu Thr, sestávající z Pro a Ala, X(Ala) znamená skupinu sestávající z Ala a Pro, X(Val) X(Gly) znamená znamená skupinu Gly, sestávající z Val, Met a Ile, Val X(Ile) a Leu, znamená skupinu sestávající z Ile, Met, Phe, Ile X(Phe) a Leu, znamená skupinu sestávající z Phe, Met, Tyr, X(Tyr) znamená skupinu sestávající z Tyr a Phe, X(His) znamená skupinu sestávající z His, Gin a Arg, X(Gln) znamená skupinu sestávající z Gin, Glu a His, X(Asn) znamená skupinu sestávající z Asn a Asp, X(Lys) znamená skupinu sestávající z Lys a Arg, X(Asp) znamená skupinu sestávající z Asp a Asn, X(Glu) znamená skupinu sestávající z Glu a Gin a Val X(Met) a Leu. znamená skupinu sestávající z Met, Phe, Ile,

20.» Protein podle bodu 19, vyznačující se tím , že uvedený glykosylovaný nebo neglykosylovaný polypeptid neobsahuje více než dvě inserce, dve delece

100 nebo dv§ substituce v oblasti zbytků aminokyselin 3 až 29 včetně, 35 až 66 včetně, 78 až 87 včetně, 98 až 99 včetně a 105 až 125 včetně.

21. Protein podle bodů 15, vyznačující se tím , že uvedený glykosylovaný nebo neglykosylovaný polypeptid znamená mutein lidského interl^kinu-4.

22. Protein podle bodu 15, vyznačující se tím , že uvedený glykgúylováný nebo neglykosylovaný polypeptid znamená mutein IS° (Gly-Asn~The-.Val-His_.Gly) nebo mutein IS° (Ala^Glu-Phe) lidského interleukinu-4.

23. Farmaceutický prostředek pro stimulaci imunitního systému, vyznačující se tím , že obsahuje terapeuticky slučitelný nosič a efektivní množství lidského interleukinu-4.

24.

25.

26.

Farmaceutický prostředek, vy značující s e tím , že obsahuje terapeuticky slučitelný nosič a efektivní množství lidského interleukinu-4 pro zesílení terapeutických účinků interleukinu-2, při čemž lidský interleukin/4 je vybrán ze sloučenin p°dle bodu 7.

Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím , že obsahuje terapeuticky slučitelný nosič a efektivní množství lidského interleukinu-4 pro zesílení terapeutických účinků interleukinu-2, při čemž lidský inteřfeukin-4 je vybrán ze sloučenin podle 13.

Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím , že obsahuje terapeuticky slučitelný nosič a efektivní množství lidského interleukinu-4 pro zesílení terapeutických efektů GM-CSF, při čemž uvedený lidský interleukin-4 je vybrán ze sloučenin podle bodu 7, s výhodou znamená sloučeninu podle -bodu 13.

Farmaceuticky prostředek podle bodu- 22, vyznačující se tím , že/stimuluje expresi MHC anti

27.

101 genů třídy II na 3-buňkách.

28. Nukleová kyselina, vyznačující se tím že obsahuje sekvenci nukleotidů schopných kodovat polypeptid vykazující aktivitu savčího interleukinu-4 a alespoň jednu další aktivitu vybranou ze skupiny sestávající z aktivity indukce MHO antigenu, aktivity indukce Fc-epsi Ion receptoru, aktivity zesilující růst kolonie granulocy· tů stimulovaných GM-CSF, aktivity zesilující TCGF interleukinu-2 a aktivity indukce IgG^ a IgE.

29. Nukleová kyselina podle běrťtn 28, vyznačující se tím , že sekvence nukleotidů je alespoň ze sedmdesáti pěti procent homologní se sekvencí DNA v cDNA insertu vektoru vybraného z pcD-46 a pcD-125·

30. Nukleová kyselina podle 29, vyznačující se t í m , že uvedená sekvence je alespoň z devade„ sáti procent .homologní se sekvencí DNA v cDNA insertu vektoru vybraného z pcD-46 a pclůl25.

31. Sloučenina, vyznačující se tím , že je vybrána ze skupiny sestávající z nukleových kyselin ob sáhujíc^. sekvenci kodonů schopných kodovat polypeptidy podle bodu 15.

32. Sloučenina, vyznačující se tím , že je vybrána ze skupiny sestávající z nukleových kyselin ob sáhujících sekvenci kodonů ^hapných kodovat polypeptidy podle bo-ctu 7.

33. Sloučenina, vyznačující se tím , že je vybrána ze skupiny sestávající z nukleových kyselin obsahujících sekvenci kodonů schopných kodovat polypepti-⁵ dy podle bodu 18.

34. Sloučenina, vyznačující se tím , že je vybrána ze skupiny sestávající z nukleových kyselin obsahujících sekvenci kodonů schopných kodovat polypeptidy podle Jiqj&u 9.

102

35o Sloučenina, vyznačující se tím , že je vybrána ze skupiny sestávající z nukleových kyselin obsahujících sekvenci kodonů schopných kodovat polypeptidy podle bodu 13«

36. Sloučenina podle rodu 35» vyznačující se tím , že uvedená sekvence kodonů je definována sekvencí nukleotidů kódujících tento polypeptid:

Met- Gly-Leu- Thr-Ser- Gln-Leu-Leu-Pro-Pro-Leu-Phe-Phe-LeuLeu-Ala-Cys-Ala-Gly-Asn-Phe-Val-His-Gly-His-Lys-Cys-AspIIe-Thr-L eu-Gln-Gin-IIe-Ile-Ly s-Thr-Leu-A sn-S er-Leu-ThrGlu- Gln-Ly s- Thr-Leu- Gy s- Thr- Glu-’L eu- Thr-Val- Thr-Asp-II e-^; Phe-Ala-Al a-S er- Ly s-Asn- Thr-Thr- Glu-Ly s- Glu- Thr-Phe-Cy sArg-Ala-’Ala-'Thr-Val-Leu-Arg-Gln-Phe-Tyr- Ser-His-His-GluJ Ly s-Ά sp-Thr-Arg-Cy s-Leu-Gly-Ala- Thr-Ala-Gln-Gln-PheřHisř) Arg-His-Lys-Gln-I^-Ile-Arg-Phe-Leu-Lys-Arg-Leu-Asp-ArgA sn-L eu- Trp- Gly-Leu-AI a- Gly- Leu-A sn- S er-Cy s-Pro-Val-Ly sGlu-Ala-Asn- Gln-S er- Thr-Leu- Glu-Asn-Phe-Leu-Glu-Arg-LeuLys-Thr-Ile-Met-Ařg-Qlu-Lys- Tyr-Ser-Lys-Cys-Ser-Ser.

37« Nukleová kyselina podle hodtt 35, vyznačující se tím i že uvedená sekvence kodonů je definována následujícím vzorcem: CAC AAA TGT GAC ATC ACT CTG CAA GAA ATC

ATC AAA ACT CTG AAC TCG TTA ACC GAA CAG AAA ACC CTG TGC ACC GAG CTC ACT GTT ACT GAT ATC TTC GCT GCT TCC AAA AAC ACT ACT GAA AAA GAA ACT TTC TGC AGA GCT GCT ACC GTT CTG CGT CAG TTC TAC TCT CAC CAC GAA AAA GAC ACG CGT TGT CTC GGC GCC ACT GCG CAG CAG TTC CAC CGT CAC AAA CAG CTG ATC AGA TTC CTG AAA CGT CTA GAC CGT AAC CTG TGG GGC CTG GCC GGC CTG AAC TCT TGT CCG GTT AAA GAA GCT AAC CAG TCG ACT CTG GAA AAC TTC CTC GAG CGT CTG AAA ACC ATC ATG CGT GAA AAG TAC TCT AAA TGC TCT TCT.

38. Způsob přípravy polypeptidů vykazujícího aktivitu lidského interleukinu-4, vyznačující se tím, že sestává ze stupňů:

- zkonstruování vektoru obsahujícího sekvenci nukleotidů kódujících uvedený polypeptid, při čemž tuto sekvenci je možné získávat expresí hostitelem obsahujícím tento

103 vektor a tato sekvence .je s alespoň 75 % homologní s insertem pcD-125,

- inkorporace vektoru do hostitele a

- uchovávání hostitele obsahujícího vektor za podmínek vhodných pro expresi sekvencí nukleotidů na uvedený polypeptid.

39. Způsob podle budtf 38, vyznačující se tím, že uvedená sekvence nukleotidů je vybrána ze sekvencí podle

-budu' 34.

40. Způsob podle bodu 38, vyznačující se tím, že uve^egá^sekvence nukleotidů je vybrána ze sekvencí po/ dle bodře 36 a jako hostitel se používá savčí buňka.

41. Buňka, která je vybrána ze skupiny buněk sestávající z buněk kvasinek, bakteriálních buněk a savčích buněk, v y / značující se tím , že tato buňka je transformována nebo přechodně transfektována yektorem obsahujícim sekvenci nukleove kyseliny podle beďu 34.

42. Buňka, která je vybrána ze skupiny buněk sestávající z buněk kvasinek, bakteriálních buněk a savčích buněk, vy/ značující se tím , že tato buňka je transformována nebo přechodně transfektována vektorem obsahujícím sekvenci nukleove kyseliny podle teStujU.

43» Buňka podle bodu 42, vyznačující se tím, že uvedená skupina sestává z buněk Esch^ichia coli. buněk Saccharomyces cerevisiae. opičích buněk COS 7, buněk vaječniku čínského křečka, myších L buněk a myších myelomových buněk.

44. Vektor, který je schopen transformovat bakteriálního hos/ titele, vyznačující se tím, že obsahuje sekvenci nukleove kyseliny podle froda 34.

45. Vektor podle 44, vyznačující setím že je vybrán ze skupiny sestávající z pIN-IIl/ompA2, TRPC11 a TAC-RBSo

46 ·

47.

48.

49.

- 104 Vektor, který je schopen transformovat kvasinkového hostitele, vyznačující se tím , že obsahuje sekvenci nukleové kyseliny podle -bodu 34.

Vektor podle hodu 46, vyznačující se že sestává z pMF-alfa8.

tím

Vektor, který je schopen transformovat fektovat savčího hostitele, v y ,z na tím , že obsahuje sekvenci nukleové

Vektor podle 48, vyznačuj že sestává z pcD plasmidu.

nebo dočasně transčující se kyseliny podle bodu· 34.

ící se tím, /UoířOlb*·'

50. Vektor podle .hodu 49, vyznačující se tím, že se jako pcD plasmid používá pcD-125 nebo pcD-46.

51. Použití farmaceutického pjzístředku podle bodu 22 pro léčení syndromu holých lymftfcytů stimulací exprese HLA-DR antigenů třídy II \a 23 buňkách podáváním efektivní dávky uvedeného farmaceutického prostředku, vyznačuj ící se tím , že/se\ako lidský interleukin-4 používá polypeptid vzorce: \

Hi s-Ly s- Cy s-Asp- II e- Thr-leu- Gin- Glu-Il e-Il e-Ly s-Thr-LeuAsn-S er-LetyfThr-Glu- Gin-Lys-Thr-Leu-Oys-Thr- Glu-Leu- ThrVal- Thr- A/p-II ft-Ph e-AI a-Al aůS er- Ly s- A sn- Thr- Thr- Gl u- Ly sGlu- Thr^-Ph e-Cys-Arg-Ala-AI a- Thr- Val-L eu- Ar g- Gin- Phe- TyrS er- Hié- His- Glu-Lys-A sp- Thr- Ar gXjy _S- Leu- Gl y- AI a- Thr-AI aGln- GÍ n-Phe-Hi s-Arg-Hi s-Ly s- Gln-LeU-Il e- Ar g- Phe- Leu- Ly sArg--Leu-Asp-Arg-Asn-Leu-Trp-Gly-Leu-jtla- Gly-Leu-Asn-S er-’ Cy^-Pro-Val-Lys-Glu-Ala-Asn-Gln-Ser-Thr^Leu-Glu-Asn-PheL eu— Gl u-Ar g- L eu—Ly s- Thr- II e-M e t—Ar g- G1 u- Lys— Tyr- S er-LysOys-Ser-Ser. '

Zastupuje:

7. Protein p^ole -be-dtř 5, vyznačující se tím, že uvedený glykosylovaný nebo neglykosylovaný polypeptid není vícekrát substituován než jednou v oblasti zbytků aminokyselin 3 až 29 včetně, 35 až 66 včetně, 78 až 87 včetně, 98 až 99 včetně a 105 až 125 včetně.

8. Protein podle -bědu 5, vyznačující se tím, že: X(Ser )znamená Ser,

X(Arg) znamená skupinu sestávající z Arg, His a Lys, X(Leu) znamená skupinu sestávající z Leu, Ile, Phe a

Met,

X(Pro) znamená skupinu sestávající z Pro a Ala,

X(Thr) znamená Thr,

X(Ala)znamená skupinu sestávající z Ala a Pro,

X(Val) znamená skupinu X(Gly) znamená Gly, X(Ile) znamená skupinu

Val a Leu,

X(Phe) znamená skupinu Ile a Leu,

X(Tyr) znamená skupinu X(His) znamená skupinu X(Gln) znamená skupinu X(Asn) znamená skupinu X(Lys) znamená skupinu X(Asp) znamená skupinu X(Glu) znamená skupinu X(Met) znamená skupinu

Val a Leu.

9. Protein podle feedti 8, sestávající z Val, Met a Ile, sestávající z Ile, Met, Phe, sestávající z Phe, Met, Tyr,’ sestávající z Tyr a Phe, sestávající z His, Gin a Arg, sestávající z Gin, Glu a His, sestávající z Asn a Asp, sestávající z Lys a Arg, sestávající z Asp a Asn, sestávající z Glu a Gin a sestávající z Met, Phe, Ile, tím vyznačující

- 96 že uvedený glykosylovaný nebo neglykosylovaný polypeptid je jednou substituován.

10. Protein podle bodtr 9, vyznačující se tím, že uvedený glykosylovaný nebo neglykosylovaný po lypeptid není substituován více než jedenkrát v oblasti zbytků aminokyselin 3 až 29 včetně, 35 až 66 včetně, 78 až 87 včetně, 98 až 99 včetně a 105 až 125 včetně.

/XaW^H

11. Protein podle ketřcr 7, t vyznačující s e

m , že: X(Arg) znamená Arg, X(Leu) znamená skupinu sestávající z Leu, 11 e a X(Pro) znamená Pro, X(Ala) znamená Ala, X(Val) znamená Val, X(Ile) znamená skupinu sestávající z 11 e, Met a X(Phe) znamená Phe, X(Tyr) znamená Tyr, X(His) znamená His, X(Gln) znamená Gin, • ' X(Asn) znamená Asn, X(Lys) znamená Lys, X(Asp ) znamená Asp, X(Glu) znamená Glu a X(Met) znamená skupinu sestávající z Met, 11 e a

12. Protein podle -beder 11, vyznačující se tím , že uvedený glykosylovaný nebo neglykosylovaný polypeptid není substituován více než jednou v oblasti zbytků aminokyselin 3 až 29 včetně, 35 až 66 včetně, 78 až87 včetně, 98 až 99 včetně a 105 až 125 včetně.

13· Protein podle -ho-d-u 12, kterým je maturovaný lidský inter. leukin-4, vyznačující se tím , že uvedený glykosylovaný nebo neglykosylovaný polypeptid znamená polypeptid vzorce: His-Lys-Oys-Asp-Ile-Thr-LeuGin- Glu- II e-Il e-Lys- Thr-Leu-Asn-Ser-Leu- Thr- Glu- Gln-LysThr-Leu- Cy s- Thr- Glu-Leu-Thr-Val- Thr- A sp- II e-Phe-Al a-Al aS er-Lys-Asn- Thr- Thr- Glu-Ly s- Glu- Thr-Phe-Cy s-Arg-Al a-AlaThr-V al- L eu -Arg- Gin- Phe- Tyr- S er- Hi s- Hi s- G1 u_ Ly s- A sp-Thr.

- 97 Arg-Cys-Leu- Gly-Al a- Thr-Ala-Gln-Gln-Phe-His-Arg-His-LysGln-Leu-lle-Arg-Pne-Leu-Lys-Arg-Leu-Asp-Arg-Asn-Leu-TrpGly-Leu-Ala-Gly-Leu-Asn-Ser-Cys-Pro-Val-Lys-Glu-Ala-AsnGln-Ser-Thr-Leu-Glu-Asn-Phe-Leu-Glu-Arg-Leu-Lys-Thr-IleMet-Arg-^ys-Tyr-Ser-Lys-Cys-Ser-Ser.

14. Protein podle boárr 13, vyznačující se tím , že obsahuje leader sekvenci vzorce: Met-Gly-Leu-^: Thr-Ser-Gln-Leu-Leu-Pro-Pro-Leu-Phe-Phe-Leu-Leu-Ala-CysAla-Gly-Asn-Phe-Val-His-Gly.

15. Glykosylovaný nebo neglykosylovaný protein s aktivitou lidského interleukinu-4, vyznačující se tím , že je vybrán ze skupiny sestávající z polypeptidů s deseti insercemi, deseti delecemi a deseti substitucemi obecného vzorce:

X(His) - X(Lys) - X(Cys) -^J X(Asp) - X(Ile) - X(Thr) ,X(Leu) - X(Gln) - X(Glu) - X(lle) - X(lle) - X(Lys)

X(Thr) - X(Leu) - X(Asn) - X(Ser) - X(Leu) - X(Thr) X(Glu) - X(Gln) - X(Lys) - X(Thr) - X(Leu) J X(Cys). X(Thr) - X(Glu) - X(Leu) - X(Thr) - X(Val) J X(Thr)'’X(Asp) - X(Xle) - X(Phe) - X(Ala) - X(Ala) - X(Ser) X(Lys) - X(Asn) J X(Thr) _ X(Thr) _ X(Glu) - X(Lys) X(Glu) - X(Thr) - X(phe) J X(Cys) - X(Arg) - X(Ala) X(Ala) - X(Thr) - X(Val) - X(Leu) - X(Arg) _ X(Gln) X(Phe) - X(Tyr) - X(Ser) - X(His) - X(His) - X(Glu) X(Lys) - X(Asp) - X(Thr) - X(Arg) - X(Cys) - X(Leu) X(Gly) - X(Ala) - X(Thr) _ X(Ala) - X(Gln) - X(Gln) X(Phe) - X(His) - X(Arg) - X(His) - X(Lys) - X(Gln)X(Leu) - X(Ile) - X(Arg) - X(Phe) - X(Leu) - X(Lys)X(Arg)— X(Leu) - X(Asp) - XÍlrg) - X(Asn) - X(Leu)X(Trp) — X(Gly) — X(Leu) - X(Ala) - X(Gly) — X(Leu)—

X(Asn) — X(Ser) - X(Cys) — X(Pro) - X(Val) - X(Lys)—

X(Glu) _ X(Ala) - X(Asn) - X(Gln) - X(Ser) - X(Thr)X(Leu) - X(Glu) _ X(Asn) - X(Phe) - X(Leu) - X(Glu)X(Arg) - X(Leu) - X(Lys) - X(Thr) - X(Ile) - X(Met)X(Arg) - X(Glu) _ X(Lys) - X(Tyr) _ X(Ser) _ X(Lys)2(Cys) - X(Ser) _ X(Ser), v němž

X(Ser) znamená skupinu sestávající ze Ser, Thr, Gly a Asn,

10 20 30 40 50

TTAGCATCTC TTGATAAACT TAATTGTCTC TCGTCACTGA CGCACAGAGC TATTG ATG GGT CTC