JP2537507B2

JP2537507B2 - 組換え宿主から生産されたアプロチニン相同体、それらのための方法、発現ベクタ−および組換え宿主、およびそれらの製薬学的使用

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Publication number: JP2537507B2
Application number: JP62072938A
Authority: JP
Inventors: エルンスト−アウグスト・アウアースバルト; ベルナー・シユレーダー; オイゲン・シユナーベル; ボルフガング・ブルンス; ゲルト・ラインハルト; マイケル・コテイツク
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1986-03-26
Filing date: 1987-03-26
Publication date: 1996-09-25
Anticipated expiration: 2011-09-25
Also published as: FI94876C; FI871288A0; ATE123301T1; AU600475B2; IL81964A0; EP0238993B1; CA1338309C; DE3751324D1; JPS637794A; ZA872181B; EP0238993A2; US4894436A; GB8607523D0; CN87102412A; DK151687D0; FI94876B; KR950000302B1; EP0238993A3; KR870009025A; GB2188322A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、アプロチニン相同体類および組換えDNA技
術によるそれらの生産に関する。

ここに開示する化学的に合成したDNA分子は、アプロ
チニンまたはアプロチニン相同体のアミノ酸配列および
組成が実質的に一致する、新規なポリペプチド類または
ポリプペチド類の遺伝情報を指定しかつアプロチニンま
たはアプロチニン相同体の生物学的活性を有するDNA配
列によって特徴づけられる。

本発明にいうアプロチニン（またはアプロチニン相同
体）の語は、天然アプロチニンをはじめ、天然のアプロ
チニンと同様な活性を示す天然アプロチニンの変異体を
包含する概念で使用している。

天然アプロチニンは58アミノ酸を含みかつトリプシ
ン、キモトリプシン、プラスミンおよびカリクレインを
阻害する作用を有する、よく知られたペプチドである。
それはウシ器官からの塩基性プロイテナーゼ阻害剤であ
り、そして種々の病気、例えば、超線維素溶解性出血お
よびトラウマチン出血ショックの処置のための価値ある
薬物、Trasylol、となった［概観については、H.フリ
ッツ（Fritz）およびG.ウンデレル（Wunderer）、198
3、薬物の研究（Drug.Res.）33、479−494参照］。

最近、位置15にリジンの代わりに他のアミノ酸をもつ
アプロチニン相同体は、アプロチニンに比べて変更され
た作用および効能を有する価値あるプロイテナーゼ阻害
剤であることが示された［ドイツ国公開明細書（DE−O
S）33 39 693号;H.R.ベンゼル（Wenzel）ら、1985、
ペプチドおよび蛋白質の化学、Vol.3］。これらのアプ
ロチニン相同体は膵臓および白血球からのエラステラー
ゼ、およびカテプシンＧに対して強い阻害作用を有す
る。

このようなアプロチニン相同体は、次のエラステラー
ゼの過度の放出、膵臓エラステラーゼ（膵炎）、血清エ
ラステラーゼ［アルセロＳクレオシス（artheroscleros
is）］、結合組織への損傷を伴う急性および慢性の炎
症、血管壁への損傷、壊死の病気および肺組織の変性に
おける白血球エラステラーゼ、に関連する病気において
治療学的に使用することができる。とくに白血球エラス
テラーゼ、免疫学的プロセスによる炎症反応、例えば、
リウマチ性関節炎において、リゾチーム酵素が演ずる部
分は同等に重要である。

アプロチニンおよびアプロチニン相同体はウシ器官か
ら、およびウシトリプシン阻害剤の半合成的転化により
得ることができる［チェシェ（Tschesche）、M.、ベン
ゼル（Wenzel）、M.、シュムク（Schmuck）、R.、シュ
ナベル（Schnabel）、E.、ドイツ国公開明細書（OS−D
E）33 39 693号 A1、1985年５月15日発行］が、収量
は比較的少ない。

組換えDNA技術および関連する技術は高い品質の相同
体を必要な多い量で得る有効な方法であろうことが考え
られた。この目標は、宿主有機体から組換えDNA技術の
生産物として、生物学的に活性なアプロチニン相同体を
生産することであった。

微生物中の異種DNAの発現の方法は現在知られてい
る。

既知のアミノ酸配列のポリペプチドの遺伝情報を指定
するDNAは、ゲノムDNA配列、mRNAに対して相補的である
cDNAを使用することにより、あるいは遺伝暗号に従うコ
ドンを選択することおよび合成遺伝子を調製することに
よって調製することができる。

ウシ膵臓トリプシン阻害剤（BPTI）の遺伝子からのウ
シゲノムクローンの部分的DNA配列は、S.アンダーソン
（Anderson）およびI.B.キングストン（Kingston）、19
83、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、
80、683−6842、によってクローニングされて、BPTIに
関するゲノムクローンが特性決定された。

BPTIおよびウシ脾阻害剤IIの遺伝情報を指定するウシ
ゲノムのより大きいセグメントは、最近配列決定され、
そして発表された［I.B.キングストン（Kingston）およ
びS.アンダーソン（Anderson）、1986、バイオケミカル
・ジャーナル（Biochem.J.）、233。443−450］。

本発明の目的は、アプロチニン相同体類、それらを暗
号化（encode）する核酸類、前記核酸類を組込んだベク
ター類およびそれらで形質転換された細胞およびアプロ
チニン相同体類を得る方法を提供することである。

本発明の目的に対して、適切な設計（design）をもち
かつ広い用途を約束する合成遺伝子を調製するコドンを
選択することは最も重要であった。

これは、とくに、制限酵素の独特認識部位によって停
止するDNAブロックまたはカセットからなる合成マスタ
ー遺伝子を構成する場合である。このような遺伝子の設
計は、このようなDNAブロック内のすべてのDNA配列の容
易な修飾または突然変異を可能とする。

アプロチニン相同体は組換えDNA技術によって調製さ
れた。このようなアプロチニン相同体、例えば、Val−1
5−、Ile−15、Leu−15−、Phe−15−およびAla−15、A
rg−15、Gly−15、Ser−15−、Trp−15−、Tyr−15、ア
プロチニン単独あるいは位置52がGlu、Leu、Val、Argま
たはThrで置換されているアプロチニンとの組み合わせ
は、位置52にMetを有する既知のアプロチニンおよびそ
の相同体類に等しいことが発見され、そしてそれらの生
産と一緒に開示する。Met−52の置換は、遺伝子操作さ
れた融合ポリペプチドが臭化シアンにより融合ポリペプ
チド中のMetで切断（cleave）されたアプロチニンおよ
びアプロチニン相同体の生産を可能とする。

このような相同体類の遺伝情報を指定する合成DNA、
前記相同体類を発現するための構造遺伝子からなる組換
えプラスミド類および前記組換えプラスミド類で形質転
換された大腸菌（以下E.col.という）を、また、開示す
る。

以下において、アプロチニンおよびアプロチニン相同
体の遺伝情報を指定するDNA断片の構成および選択の方
法を示す。

既知の蛋白質配列およびアプロチニンおよびアプロチ
ニン相同体の遺伝暗号を使用して、このようなポリペプ
チドの遺伝情報を指定するDNA配列を決定した。

遺伝暗号の縮重は、任意の所定のアミノ酸配列のため
のコドンの選択に際し、相当な自由度を許す。

この蛋白質のアミノ酸配列を表示するコドンのなかの
すべての可能な塩基置換を決定した。これに従い、可能
なDNA配列内に位置するすべての潜在的な制限部位を決
定した。

マスター遺伝子のためのコドンの選択は、次の考察に
よってガイドされる：第１に、コドンおよび断片を選択し、そして断片の不
都合な相補性を回避するように、断片のアセンブリーを
設計した。

第２に、Ａ−Ｔ塩基対に富んだ領域を回避して、転写
の早期の停止に伴う問題を克服する。

第３に、アプロチニンの修飾を容易に行うことがで
き、構造と活性との間の相関関係を検査できるように、
適切な断片の他の断片との置換による形質転換体または
塩基の置換体の検証を促進するために必要な制限部位を
選択した。

第４に、選択したコドンの大部分は微生物ゲノムの発
現において好ましいものである［H.グロスジーン（Gros
jean）およびW.ファイアース（Fiers）、遺伝子（Gen
e）、18（1982）192−209;M.ゴウイ（Gouy）およびC.ガ
ウチーア（Gautier）、核酸の研究（Nucleic Acids R
esearch）、10（1982）7055−7074参照］。

合成アプロチニン遺伝子類およびそれらの相同体類の
主要な設計は第１図に示されている。

制限エンドヌクレアーゼのための認識部位によって取
囲まれた４つのブロック（α、β、γ、δ）から成る合
成マスター遺伝子の設計は、さらに、融合および非融合
の発現のためのDNA配列の容易な修飾および変更（コド
ン使用、突然変異、蛋白質操作、遺伝子の増幅）を可能
とする。

合成遺伝子は次のようにして構成した：アプロチニンおよびアプロチニン相同体のための合成
遺伝子は、重複する末端領域を有する15の精製したオリ
ゴヌクレオチドのアセンブリーによって、マスター遺伝
子を経て構成した（第１図参照）。この構成は２工程で
実施した。遺伝子の部分ＡについてDNA断片１、２、
３、４および６、および部分ＢについてDNA断片５、
７、８、９、10、11、12、13、14および16の交雑、結合
および精製によって、遺伝子の部分Ａおよび部分Ｂを生
成した（第２図）。第２に、遺伝子の部分ＡおよびＢを
結合し、そして精製した。この構成のため、後述する物
質および方法を使用した。マスター遺伝子のDNA配列は
第３図に示されている。これは開始コドンATG、２つの
終止コドン、TAGおよびTAA、Eco RIのための５′末端
制限部位およびHind IIIおよびBam HIのための３′末
端制限部位、およびまたApa Ｉ、Stu Ｉ、Sac II（S
st II）のための内部の制限部位を含む。これらの部
位、ことに内部の部位は、解読配列のクローニング、他
のアミノ酸の遺伝情報を指定するかあるいは他のコドン
を使用するDNA断片を交換することによるマスター遺伝
子の修飾を促進する。この遺伝子の増幅は、適切なリン
カー（linker）の付加によって容易に実施できる。全範
囲にわたる蛋白質操作がこのような構成を用いて可能で
ある。

アプロチニン相同体のための遺伝子を構成するため、
適当なDNA配列をもつ制限断片のみを交換しなくてはな
らなかった。位置15および52を含むアミノ酸の変更の遺
伝情報を指定するするであろう、このような断片のため
の配列は第2b図に記載されている。

組換えプラスミドは、次のようにして構成した：実験のアプロチニンのクローニングのために選択した
プラスミドはpUC ８であった［J.ビエイラ（Vieira）
およびJ.メッシング（Messing）、1982、遺伝子（Gen
e）、19、259］。このクローニングベクターは、pBR 3
22誘導アンピシリン遺伝子、および１列の独持制限酵素
認識部位を含有するlac Ｚ遺伝子の一部分に結合し
たDNA複数の起源から成る。このベクターをlac^-E.col.
中に導入すると、形質転換体は適当な指示プレート上で
青色のコロニーを生成する。DNA断片を多数の制限部位
のいずれか、例えば、Eco RIとBam HIとの間の中にク
ローニングすると、lac遺伝子は不活性化され、白色の
コロニーが生成する。プラスミドpUC ８はＰ−Ｌバ
イオケミカルス（Biochemicals）から商業的に入手可能
である。

発現プラスミドは次のようにして構成した：融合蛋白質としてアプロチニンおよびアプロチニン相
同体を発現するため、U.リュター（Ｒther）およびB.
ミュラー−ヒル（Ｍller−Hill）、1983、EMBO ジャ
ーナル、３、1791−1794による同様な実験において示さ
れているように、適当な遺伝子がβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子のカルボキシ末端と融合されているプラスミドを
構成した。親プラスミドpUR 278はlac Ｚ遺伝子の
３′末端に単一のクローニング部位、Bam HI、Sal
Ｉ、Pst Ｉ、Xba ＩおよびHind IIIを有する（ま
た、ドイツ国特許出願P3 309 501.9参照）。適切なク
ローニング部位および正しいリーディングフレームの中
に解読DNA配列を挿入すると、そのDNAによって暗号化さ
れたペプチドと結合した活性β−ガラクトシダーゼの融
合蛋白質が生ずる。

発現ベクターpUR 278の制限部位Bam HIおよびHind
IIIを、発現ベクター中でアプロチニンおよびアプロ
チニン相同体のための合成遺伝子をクローニングするた
めに選択した。したがって、Bam HIを遺伝子の５′Eco
RI末端に付加しかつ３′末端にHind III部位を使用
することによって、アプロチニン遺伝子を修飾すること
が必要であった（第６図参照）。

組換えDNAの研究のために次の標準の材料および方法
を使用した：ここに記載する合成遺伝子、このような遺伝子を使用
する組換えプラスミドおよび発現ベクターは、次の材料
および方法によって調製しかつ特徴づけることができ
る。

材料酵素ポリヌクレオチド−キナーゼ（PNK）、5.5単位／μl;ベ
ーリンガー・マンハイム（Boehringer−Mannheim）Nr.6
33 542。

DNAポリメラーゼ；クレノー、ベーリンガー・マンハイ
ム Nr.104 523。

T4 DNAリガーゼ、0.9単位／μl;ベーリンガー・マンハ
イム Nr.481 ２ 20。

制限酵素はベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Beth
esda Research Ｌ bs）ベーリンガー・マンハイム、
バイオラブス（Boehringer−Mannheim523,BioLabs）。

子牛腸アルカリ性ホスファターゼ（CIP）；ベーリンガ
ー・マンハイム。

リゾチーム;Rナーゼ（RNase）；ベーリンガー・マンハ
イム。

試薬ガンマ 32 Ｐ ATP;アマーシャム（Amersham）Nr.PB
10168. アルファ 32 Ｐ−dTTP;アマーシャム167。

ATP;シグマ（Sigma）Nr.A−6144。

ビスアクリルアミド；サーバ（Serva）19195。

アクリルアミド；サーバおよびバイオーラブ（Bio−Ra
b）161−０−03。

TEMED;サーバ 35925。

過硫酸アンモニウム；サーバ 13375。

尿素;BRL 超純粋5505UA。

DE 52（予備膨潤ジエチルアミノエチルセルロース）；
ワットマン（Whatman）Cat.4057−050。

DTE;サーバ 20697。

イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）；シ
グマＩ 5502。

５−ブロモ−４−クロロインドリル−β−Ｄ−ガラクト
シド（Ｘ gal）；ベーリンガー 65 1745。

N,N′−ジメチルホルムアミド；メルク（Merck）２ 20
3 034。

EGTA サッカロース;BBL 5503 UA。

ジアミノピメリン酸；シグマＤ 1377。

Ｍ 13 − ジデオキシヌクレオチドシークエンシン
グ系；ニュー・イングランド・バイオラボラトリーズ
（New England Biolabs）、米国マサチュセッツ州ベ
ベリリイ＊404、＊409。

クロロホルム。

イソアミルアルコール。

チミジン；サーバ 18600。

グルコースＤ（＋）；メルク 8337。

トリス；メルク 8382。

水酸化カリウム；メルク 5033。

塩化カルシウム；メルク 2382。

塩化ルビジウム；シグマＲ 2252。

塩化マグネシウム；シグバＭ 3634。

DMSO;シグマＤ 5879。

EDTA; 酢酸カリウム； SDS; DNA プラスミド pUC 8;ファーマシア（Pharmacia）Ｐ−Ｌ
バイオケミカルス（Biochemicals）27−4916−xx。

Bam HI リンカー。

培地および抗生物質バクト−トリプトン（Bacto−tryptone）；ディフコ（D
ifco）0123−01。

バクト−酵母エキス;0140−01。

LB−培地：（１リットルについて）10gのバクト−トリプトン、5
gのバクト−酵母エキス、10gのNaCl、pH7.5にNaOHで調
節。

カッパ 1776−培地：（１リットルについて）25gのバクト−トリプトン、
7.5gのバクト−酵母エキス、１モルのトリス−HCl（pH
7.5）20ml、950mlにし、オートクレーブ処理し、そして
冷却し、滅菌する;5mlの１モルのMgCl₂、10mlの１％の
ジアミンピメリン酸、10mlの0.4％のチミジン、25mlの2
0％のグルコース。

YT−培地：（１リットについて）8gのバクト−トリプトン、5gの
バクト−酵母エキス、5gのNaCl。

寒天ペトリ皿を15gのバクト−寒天を１リットルの適
当な培地に添加して調製した。

指示ペトリ皿： 1.5％の寒天を含む１リットルのオートクレーブ処理
したYT培地に、次の溶液を添加した:2mlの0.1モルののI
PTG、2mlのN,N′−ジメチルホルムアミド中の２％のＸ
−galおよび2mlの100mg/mlのアンピシリン。

抗生物質：クロラムフェニコール；ベーリンガー・マンハイム 63
4 433。

アンピシリン；サーバ 13397。

テトラサイクリン；サーバ 35865。

緩衝液および溶液 20μＭ［以下、特記しないかぎりモルはモル濃度（Ｍ）
を表わす］のATP 水中 10ミリモルのATP 水中 10×PNK−ミックス： 0.5モルのトリス−HCl（pH7.6）;0.1モルのMgCl 2;5
0ミリモルのDTE;1ミリモルののEDTA。

10×リガーゼ−ミックス： 0.5モルのトリス−HCl（pH7.4）;0.1モルのMgCl 2;
0.1モルのDTE;10モルのATP。

10×SP−50: 100ミリモルのトリス−HCl（pH7.5）;100ミリモルのM
gCl 2;500ミリモルのNaCl;10ミリモルのDTT。

10×SP−100: 100ミリモルのトリス−HCl（pH7.5）;100ミリモルのM
gCl 2;1モルのNaCl;10ミリモルのDTT。

10×SP−0: 100ミリモルのトリス−HCl（pH7.5）;100ミリモルのM
gCl 2;10ミリモルのDTT。

１モルのTBE: １モルのトリス;0.83モルのホウ酸;10モルのEDTA;pH
8.3。

３×ホルムアミド色素ミックス； 70％のホルムアミド;20％のグリセロール;1ミリモル
のEDTA;0.33mg/mlのブロモフェノールブルー;0.66mg/ml
のキシレンシアノールFE;0.66mg/mlのオレンジG. 20×Ｅ−緩衝液： 0.8モルのトリス;0.4モルの酢酸ナトリウム;40ミリモ
ルのEDTA;pH8.3。

10×CIP−緩衝液： 0.5モルのトリス−HCl（pH9.0）;10ミリモルのMgCl
2;1ミリモルのZnCl 2;10ミリモルのスペルミジン。

形質転換緩衝液：次のように調製した:15gのサッカロース、1mlの3.5モ
ルのKOH、1mlの１モルのCaCl₂,2mlの5.0モルのRbClを水
性バイデスト（bidest）で50mlにし、10％の酢酸でpH6.
2に調節し、1mlの4.5モルのNnCl ２を添加し、10％の
酢酸でpH5.8に調節し、アクアバイデスト（Aquabides
t）で100mlにし、そして滅菌濾過する。

TE緩衝液： 10ミリモルのトリス−HCl（pH8.0）、0.1ミリモルのE
DTA。

10×NT−緩衝液：リゾチームミックス： 50ミリモルのグルコース、１ミリモルのEDTA、10ミリ
モルのトリス−HCl（pH8.0）。

フェノール／セバグ（Sevag）：１容量％の80％のフェノールおよび１容量％のセバグ
（クロロホルム：イソアミルアルコール、24:1）。

標準法マニアチス（Maniatis）ら、1982、モレキュラークロ
ーニング（Molecular Cloning）、コールド・スプリン
グ・ハーバー・ラボラトリー、米国コールド・スプリン
グ、に記載されている、組換えDNAの研究のための標準
法を、後述する多少の変更を加えて使用した。

標準のエタノール沈澱 DNAペレットを溶解するか、あるいは溶液を0.3モルの
酢酸ナトリウムに調節し、２容量部のエタノールを添加
し、−70℃で15分間インキュベーションし、そして遠心
した。ペレットを80％のエタノールで２回洗浄し、そし
て真空乾燥した。

標準のフェノール抽出溶液をフェノール／セバグ、容量比1:1、とよく混合
し、遠心し、フェノール相を1/10の緩衝液または水で再
抽出し、水相をプールした。

ポリアクリルアミドゲルの電気泳動後のDNA断片の標準
分離少量のDNA断片（250ヌクレオチドまで）をゲル電気泳
動により分離し、そしてオートラジオグラフィーまたは
UV光により帯を可視化した（予備被覆したTLC−板Silgu
r−25、マーチェレイ−ネイゲル・アンド・カンパニ
ー）。帯をスライスし、シリコーンガラス棒でかきま
ぜ、約400mlTE緩衝液pH8.0で42℃において18時間溶離し
た。この物質を遠心し、そして沈澱物を42℃で４時間再
溶離し、そして遠心した。両者の上澄みを一緒にし、そ
して細いDE−52パスツールピペットのカラムおよび１モ
ルのTEABC緩衝液を使用する陰イオン交換オートラジオ
グラフィーにより精製した。凍結乾燥後、DNAを２回水
中に溶解かつ凍結乾燥した。

標準の結合（リゲーション）標準の結合（ベクターより小さい断片）のため、モリ
（mole）比1:5のベクター：断片を使用した。最終のDNA
濃度は25μg/mlであった。DNAを少量のTE緩衝液中に溶
解し、10×−リガーゼミックス、T4DNAリガーゼを添加
し、１×リガーゼミックス濃度に調節した（50ミリモル
のトリス−HCl pH7.4、10ミリモルのMgCl₂、10ミリモ
ルのDTE、１ミリモルのATP;標準体積30μｌ）。反応は1
4℃で16時間実施した。

DNA断片の標準の５′標識付け脱ホスホリル化DNA（最終濃度約0.2μモル）を１×キ
ナーゼ緩衝液Ｉ（50ミリモルのトリス−HCl pH7.6、10
ミリモルのMgCl₂、５ミリモルのDTE、0.1ミリモルのEDT
A）中に溶解した。標識付けしないATPと一緒に、ガンマ
32 Ｐ ATP（3000Ci/mmole）を添加した。ATPの最終濃
度は常に１μモル）より大きかった。反応は単位の定義
およびDNA濃度に基づいて計算して500〜1000倍過剰量の
ポリヌクレオチドキナーゼを使用して、37℃で30分間実
施した。反応をフェノール抽出のために停止させた。DN
Aをエタノールで沈澱させ、洗浄し、そして乾燥した。

標準の制限エンドヌクレーゼ消化制限エンドヌクレーゼ消化は製造業者のマニュアルに
準じて実施した。精製した塩不含DNAを緩衝液中に溶解
し（使用した酵素に対してそれぞれSP−０、SP−50また
はSP−100）そして適当量の酵素で消化した。最後に、
物質をフェノール抽出し、そしてエタノール沈澱させ
た。

アガロースゲル電気永動後のDNA断片の標準の分離 DNA断片をアガロースゲル電気泳動により分離し［参
照、T.マニアチス（Maniatis）ら、1982、コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー、モレキュラークロ
ーニング（Molecular Cloning）］、エナジウムブロミ
ドで着色し、そして長波長のUV光のもとで切断した。ス
ライスを透析袋の中に入れ、0.5×Ｅ緩衝液を充填し
（容量比、緩衝液：ゲルのスライス、1.5:1）そして緩
衝液でよく囲まなくてはならない。気泡を含まないシー
ルした袋を、0.5×Ｅ緩衝液を充填した電気泳動室内に
入れた。電気泳動を200Vで30分間実施し、次いで電流の
極性を30秒間逆転して、DNAを透析袋から解放した。ゲ
ルのスライスを取囲む緩衝液を注意して除去し、そして
DEAEセルロースまたはDE52カラムでさらに精製した（上
を参照）。

DNAの標準の脱ホスホリル化完全に消化しかつ精製したDNAを水中に溶解し、そし
て１×CIP−緩衝液に調節した（標準の合計体積48μ
ｌ）。１μｌ（20単位）の子牛腸ホスファターゼ（CI
P）の添加により37℃において反応を開始し、30分後再
び１μｌのCIPを添加した。１時間後、５μｌの50ミリ
モルのEGTAを添加することにより反応を停止させ、そし
てインキュベーションを65℃で10分間実施した。ブラト
（blunt）末端またはリセスド（recessed）５′末端を
もつDNAの脱ホスホリル化のため、反復インキュベーシ
ョンを、それぞれ、37℃で15分間および56℃で15分間実
施した。DNAをフェノール／セバグで抽出し、そしてエ
タノールで沈澱させた。

オートラジオグラフィーフィルム:AGFA−ゲベルト、Curix RP １、100AFW、
コダック XAR ５、165 1512 Ｘ線現像剤;AGFA G15
2、コダック LX24 Ｘ線定着液;AGFA G353;コダック
AL4。

標準の形質転換手順形質転換は、D.ハナハン（Hanahan）［1983、ジャー
ナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Bio
l.）166、557−580］の手順を使用して実施した。

単一のコロニーを接種しそしてカッパ1776培地中で生
長させた（37℃、200upmのシェイカー）の宿主株の１昼
夜培養物20mlの中、1mlを100mlの予備加温した（37）カ
ッパ1776に接種した。

この培養物を同一条件下で培養した。細胞の生長を0.
2 OD 500nmで停止させた。４℃に冷却し、そして遠心
した後、細胞沈殿を20ml氷冷形質転換緩衝液中に再懸濁
させ、そして０℃で５分間インキュベーションした。こ
の懸濁液を再び遠心し（3000rpm、４℃、15分）そして4
mlの氷冷形質転換緩衝液中に再懸濁させた。７μｌのDM
SOを200μｌに添加した後、細胞のアリコートを氷冷水
中で15〜60分間さらにインキュベーションした。コンピ
テント（competent）細胞のこのようなアリコートに、2
0μｌのTE中に溶解したDNAを添加し、この混合物を氷水
中で20分間および42℃で３分間インキュベーションし、
1mlの予備加温した（37℃）カッパ1776培地をこのよう
なアリコートで接種し、そして37℃において１時間培養
した。形質転換体を平板培養（plating）するため、細
胞を遠心し（3000rpm、15分、４℃）、YT培地中に再懸
濁させ、そして指示ペトリ皿上で平板培養した。形質転
換体の期待する数に従い、一定量の懸濁液を平板培養に
使用した。

標準の急速分析プラスミド分離この手順はバーボイム（Birnboim）およびドリイ（Do
ly）、1979（参照、また、Ｔ、マニアチスら、1982）か
らの方法の修正である。分析すべき各形質転換体から、
2mlの一夜の培養物を調製し［木製ようじ（wooden too
th pick）、37℃、16時間、回転車］、一夜の培養物の
1.5mlを１分間12000gで遠心した（エッペンドルフ遠心
機）。沈殿物を2mgのリゾチーム/1mlのリゾチームミッ
クスの新しく精製した溶液中に再溶解し、次いで20℃で
５分間インキュベーションした。１％のSDSを含有する
新しく調製した氷冷0.2モルのNaOHの添加後、試料を氷
上で５分間インキュベーションした。染色体DNAおよび
蛋白質の沈殿のため、150μｌの氷冷酢酸カリウムpH4.5
を添加した。０℃で５分間インキュベーションしかつ10
分間12000gで遠心した後、プラスミド含有上澄みを新し
い管に移し、そしてクロロホルム／イソアミルアルコー
ル（24:1）で抽出した。500μｌのイソプロパノールを
水相に添加した。混合物を−20℃で30分間インキュベー
ションした。遠心（10分、12000g）後、沈殿を80％のエ
タノールで洗浄し、そして簡単に真空乾燥した。この物
質はゲル電気泳動による５〜６の異なる制限分析のため
に十分であった。

ポリアクリルアミドゲルの電気泳動によるオリゴヌクレ
オチドの標準の精製オリゴヌクレオチド（約20 OD 260nm）を緩衝化ホ
ルムアミド（0.1モルのTBE）中に溶解し、そして７モル
の尿素、20％のポリアクリルアミドゲルで電気泳動的に
分離した［マクサム（Maxam）およびギルバート（Gilbe
rt）、酵素学における方法（Meth.Enzymol.）、65、500
−560、1980］。ゲルをフルオレセイン化した薄い層状
板に置き、そしてDNAをUV光で可視化した。ポリアクリ
ルアミドゲルの電気泳動後、分離および精製をDNAの分
離の標準の基本的方法について概説したように実施した
（上を参照）。この手順の品質は、ガンマ32P ATPおよ
びポリアクリルアミドゲルの電気泳動で分析的５′ホス
ホリル化により日常的に検査した。

β−ガラクトシダーゼLys−15−Glu−52−アプロチニン
融合蛋白質からのGlu−52−アプロチニンの調製バクテリア中で大量に合成された多数の蛋白質は不溶
性の形態で蓄積する［D.C.ウィリアムス（Williams）、
R.M.バン・フランク（Van Frank）、J.B.バーネット
（Burnett）、W.L.ムス（Muth）、1982、サイエンス（S
cience）215、687］。これらの不溶性蛋白質は封入体と
呼ばれる。これらは通常変性剤（denaturants）でのみ
可溶化でき、それゆえ他の細胞蛋白質から容易に精製す
ることができるであろう。

E.col.RR1△M15（ATCC 35102）をプラスミドpRk48.
1.1で形質転換した。pRk48.1.1は、E.col.のプロモータ
ー、オペレーターおよびリボソーム結合部位より下流の
Glu−52−アプロチニンβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を
暗号化する。15−Glu−52−アプロチニンβ−ガラクト
シダーゼ融合蛋白質の最大の蓄積は、合計の細胞蛋白質
の20％であった。封入体は、一般に、極性（polar）領
域またはサブ極性（sub−polar）領域に局在化し、１つ
の封入体を有する正常の長さの細胞は各極（pole）付近
に存在する。

E.col.RR1△M15の一夜の培養物を遠心し、次いで沈殿
物を破壊的（breaking）緩衝液中に再懸濁した。超音波
処理後、封入体を回収するため細胞リゼイトを遠心し
た。封入体を２モルののグアニジン塩酸塩で洗浄した。
精製工程はラエムリ（Laemmli）［U.K.ラエムリ、197
0、ネイチャー（Nature）、277、680−686）に従うSDS
−ポリアクリルアミドの電気泳動により検査した、第８
図。

完全なLys−15−Glu−アプロチニンを回収するため、
封入体を可溶化し、臭化シアンで切断し、そして折たた
まれないGlu−52−アプロチニンを折たたまなくてはな
らなかった。

封入体を、十分な量のDTTを含有する６モルのグアニ
ジン塩酸塩中に可溶化することができた。非可溶化部分
を分離するため、融合蛋白質を10ミリモルのメルカプト
エタノールを含有する水に対して透析することにって沈
殿させる。この湿った融合蛋白質を70％のギ酸中に溶解
し、そして臭化シアンで切断した［E.グロス（Gros
s）、B.ウィトコップ（Witkop）、1961、アメリカン・
ケミカル・ソサイアティ（Amer.Chem.Soc.）83、1510−
1511］。

Glu−52−アプロチニンをβ−ガラクトシダーゼの臭
化シアン断片からイオン交換クロマトグラフィーによっ
て分離し、そして同時に再び折たたんだ［T.E.レイグト
ン（Creighton）、プロシーディングス・オブ・ジェネ
ックス−UCLA・シンポジウム（Proceedings of Genex
−UCLA Symposium）1985、キングストーンズ；プレ
ス］（第９図）。活性阻害剤はウエスタンブロット分析
により検出できた（第10図）。

活性分画を蒸発により濃縮し、次いで0.1モルのNH₄HC
O₃に対して透析した。凍結乾燥後、阻害剤を高純度のRP
−18カラムのHPLCにより、緩衝液Ａ中の0.1％のTFAおよ
び緩衝液Ｂ中の0.1％TFA、60％のCH₃CNを使用して精製
した。

活性分画をプールし、そして阻害剤をヘウィック（He
wick）［R.M.ヘウィック（Hewick）、M.W.フンカピラー
（Hunkapiller）、L.E.フード（Hood）、W.I.ドレイア
ー（Dreyer）、1981、ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）256、7990−7997］
に従う気相シークエンサー（sequencer）でマイクロシ
ークエンシング（microsequencing）することによって
特性決定した。Ｎ−末端から最初の20残基は期待する阻
害剤と同一である（表２）。アミノ酸分析は、阻害剤が
期待するアミノ酸組成を有することを立証する（表
１）。

アプロチニンおよびGlu−52−アプロチニンのトリプ
シン阻害活性の比較は同一の応答曲線を示す（第11
図）。

これらの実験のすべてが示すように、Glu−52−アプ
ロチニンをE.col.中で融合蛋白質として生産し、そして
変性条件下の切断および分離後にそれを単離することが
可能である。

Val−15−Glu−52−アプロチニンおよび他のアプロチニ
ン誘導体の調製 Val−15−Glu−52−アプロチニンはGlu−52−アプロ
チニンについて説明したのと同様な方法でβ−ガラクト
シダーゼ融合蛋白質から調製できる（第11図、第13
図）。阻害活性をエラスターゼ阻害アッセイによって測
定した。

阻害剤はアミノ酸分析およびＮ−末端シークエンシン
グによって特徴づけた（表１および表２）。

アプロチニンのすべての他の誘導体は、Glu−52−ア
プロチニンおよびVal−15−Glu−52−アプロチニンにつ
いて説明したのと同様な方法で調製できるであろう。

アプロチニン/Glu−52−アプロチニンの比較 BrCNで切断後に得られたGlu−52−アプロチニンを、
真正のアプロチニンと、ブタトリプシンに対する阻害活
性について比較した。両方の基質Pyrglu−Gly−Arg−pN
Aおよびベンゾイル−Arg−pNAをトリプシンの決定に使
用した。

アプロチニンの原溶液は１μg/mlであり、そしてGlu
−52−アプロチニン0.6μg/mlについて、０−100−200
−300−400−500μｌのこの原溶液をベンゾイル−Arg−
pNAを使用する試験に使用した。Pyrglu−Gly−Arg−pNA
を使用する試験において、０−３−６−９−12−15μｌ
を使用した。結果を表３に要約する。

これらの結果が示すように、アプロチニンおよびGlu
−52−アプロチニンは、両者のトリプシン阻害アッセイ
において、同一の投与−応答曲線を示す。このことはGl
u−52−アプロチニンが実際に100％の活性分子を含有す
ることのみならず、かつまたトリプシン−阻害剤複合体
が同一桁数で存在することを立証する。

ウエスタンブロットウエスタンブロットは、トウビン（Towbin）が記載す
るようにして実施する［H.トウビン（Towbin）、T.ステ
ヘリン（Staehelin）、I.ゴートン（Gordon）、1979、
プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、76、
4350−4354］。ニトロセルロースのブロットを、第１抗
体としてウサギポリクローナル抗アプロチニン抗体およ
び第２抗体といしてビオチニル化ロバ抗ウサギ抗体を使
用してプロービング（probing）した。免疫複合体の検
出は、供給業者のマニュアル（AMERSHAM BUCHLER、Bra
unschweig）に記載されるように基質として、４−クロ
ロ−１−ナフトールと複合化したストレプトアビジン−
ビオチニル化西洋ワサビペルオキシダーゼを使用して実
施した。

エリサ（ELISA）固相酵素結合免疫収着アッセイ（ELISA）は、ミュラ
ー−エステル（Ｍller−Esterl）が記載するようにマ
イクロタイター抗体プレートを使用する拮抗的（compet
itive）モードで実施した［W.ミュラー−エステル（Ｍ
ller−Esterl）、A.オエトル（Oettl）、E.ツルツェ
イト（Truscheit）、H.フリッツ（Fritz）、フレセニウ
ス（Fresenius）、Z.Anal.Chem.）（1984）317、718−7
19］。

アミノ酸配列の決定約0.5〜2nmoleの蛋白質を30μｌのTFA中に可溶化し
た。3mgのポリブレンで予備処理したガラス繊維のフィ
ルターに試料を適用した。配列の分析は、アプライド・
バイオシステムス（APPLIED BIOSYSTEMS）［インコー
ポレーテッド（Inc.）、米国］からの気相蛋白質シーク
エンサーにより、ヘウィック（Hewick）［R.M.ヘウィッ
ク（Hewick）、M.W.フンカピラー（Hunkapiller）、L.
E.フード（Hood）、W.I.ドレイアー（Dreyer）、1981、
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.
Biol.Chem.）256、7990−7997］に従い実施した。段階
的に遊離したアミノ酸フェニルチオ水和誘導体を、シア
ノ−HPLCカラム（デュポン）およびベイレウサー（Beyr
euther）が記載する分離システムを使用して分析した
［K.ベイレウサー（Beyreuther）、B.ビースラー（Bies
ler）、J.ボウエンス（Bowens）、R.ディウドロップ（D
ildrop）、K.ネウファー（Neufer）、K.スチュバー（St
ber）、S.ザイス（zais）、R.エーリング（Ehrin
g）、P.ゼイベル（Zabel）1983、蛋白質化学における現
代的方法（Mdern Methods in Protein chemistr
y）、303−325ページ、ワルター・デ・グルイター・ア
ンド・カンパニー、ベルリン］。Ｍ 510 ポンプ、WIS
P 710G オートインジェクター、LC−スペクトロフォ
トメーターＭ 481およびSHIMADZU 積分装置Ｃ−R
3Aを含む、WATER HPLC システムを使用した。

酸加水分解およびアミノ酸分析約1nmoleの蛋白質をパイレックス管に入れ、これに0.
05％の２−メルカプトエタノールを含有する200μｌの
６モルのHClの一定に沸騰するHClを添加した［I.AT.ポ
ッツ（Potts）Jr.1960、アナリティカル・バイオケミス
トリー（Anal.Biochem.）131、１−15］。管を真空中で
シールし、そして110℃で22時間インキュベーションし
た。加水分解物を急速に乾燥し、150μｌの0.2モルのク
エン酸ナトリウム緩衝液pH2.2中に再溶解し、そして濾
過した。アミノ酸分析は、蛍光検出機およびSIMADZU
Ｃ−R2AX積分器を装備するBIOTRONIK LC 5000で実施
した。アミノ酸は、本質的にベンソン（Benson）が記載
するようにしてｏ−フタルジアルデヒドと反応させた
後、実施した［J.R.ベンソン（Benson）、P.E.ヘアー
（Hare）、1975、プロシーディングス・オブ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Aca
d.Sci.）USA 72、619−622］。

標準白血球エラスターゼのアッセイ材料ヒト白血球エラスターゼをエラステイン・プロダクツ
・カンパニー・インコーポレーテッド（Elastin Produ
cts Company,Inc.,米国ミシシッピー州パシフィック、
60069、P.O.Box １ 47、］。

メトキシスクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−
Ｌ−プロリル−Ｌ−バリン−ｐ−ニトロアニリド−K.ナ
カジマ（Nakajima）、J.C.パワーズ（Powers）、M.J.カ
スチロ（Castillo）、B.M.アシェ（Ashe）およびM.ジン
メルマン（Zimmermann）、ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、254、4027（1
979）］を、Fa.ベイシェム（Bachem）、フェインケミカ
リエン・アクチエンゲゼルシャフト（Feinchemikailen
AG）、スイス国CH−4415 ブデンドルフ、ハウプトス
トル、144から入手した。

手順 0.05％のツイーン80を含有する0.2モルのトリス−緩
衝液pH8.0および0.05モルの塩化カルシウムおよび阻害
剤の溶液の混合物の550μｌに、100mlの50％のエチレン
グリコール中に1mlの酵素を溶解して得られた溶液の５
μｌを添加した。この混合物を室温で30分間インキュベ
ーションした。次いで、1mlのジメチルスルホキシド中
の59mgのメトキシスクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラ
ニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−バリン−ｐ−ニトロアニリド
および試験緩衝液中の6.5μｌの混合物の100μｌを撹拌
しながら添加した。405nmにおける光学濃度の増加を記
録した；阻害剤含有試料および酵素対照の光学濃度の増
加係数に100を駆けることによって、阻害率％を決定し
た。

トリプシンの阻害（アッセイ）基質ベンゾイル−DL−アルギニン−ｐ−ニトロアニリ
ド（メルク 1670）またはピログルタミル−グリシル−
アルギニン−ｐ−ニトロアニリド［商業的に入手可能な
ピログルタミル−グリシン（SENN 6886）およびアルギ
ニン−ｐ−ニトロアニリド×HBr（SENN 9123）から、
ジシクロヘキシルカーボジイミド縮合によって合成され
た］によって、トリプシンの阻害を決定した。この基質
は、また、KABIにより、ウロキナーゼ基質として表示Ｓ
−2444で販売されている。

前者は試料中のアプロチニンの量に直線的に応答する
が、感度が低い。後者は高い感度をもつが、アプロチニ
ン−トリプシン複合体がそれらの低い濃度で溶解するた
め、用量−応答曲線は直線ではない。

トリプシンおよびトリプシン阻害剤の測定のための緩
衝液は、0.01モルのCaCl₂および0.05％のツイーン80
を含有する0.2モルのトリス、pH8.0である。

決定は400nmにおいて光学濃度（OD）の読みを可能と
する任意の分光光度計で実施できる。完全に自動化され
た測定のため、分光光度計はマイクロコンピューターを
装備するか、あるいは適当なパーソナルコンピューター
にインターフェースで接続させなくてはならない。

使捨ての1cmのセミマイクロプラスチッククベットを
すべてのアッセイのために使用する。ODは１分の間隔で
８サイクルにわたって読む。１分あたりのODの平均の増
加を活性単位として任意に取る。

阻害のアッセイのため、ブタトリプシン（メルク 83
50）溶液（0.001NのHCl/50％のグリセロール中）を阻害
剤試料と混合し、緩衝液で100μｌに調節し、そして室
温で10分間インキュベーションする。この反応を基質溶
液の添加により開始させる。より詳細な情報を下表に記
載する。阻害活性は検量線から取るか、あるいはこの目
的のために特別に開発されたコンピュータープログラム
によって自動的に計算する。

この分野において、形質転換に適当な多数の種々の微
生物、すなわち、培養または発酵において生長できる単
細胞の有機体、が知られている。形質転換に好ましい有
機体は、バクテリア、酵母菌および菌類（fungi）を包
含する。

ここに開示する研究のために選択した特定の有機体
は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（American Type Culture Collection）にATCC No.
35102で受託されているE.col.RR1△M15であった。他の
適当なE.col.を、また、使用できる。

本発明は、無毒の不活性の製薬学的に適当な賦形剤に
加えて、本発明による化合物の１種またはそれ以上を含
有するか、あるいは本発明の活性化合物の１種またはそ
れ以上から成る製剤、およびこれらの製剤の製造法を包
含する。

本発明は、また、投与単位の形態の製剤を包含する。
これは、製剤が個々の部分の形態、例えば、錠剤、糖
剤、カプセル剤、ピル、坐薬およびアンプル剤の形態で
あることを意味し、その活性物質の含量は個々の投与量
の数分の１あるいは多数倍に相当する。投与単位は、例
えば、１、２、３または４倍の個々の投与量、あるいは
個々の投与量の1/2、1/3または1/4を含有することがで
きる。個々の投与量は、好ましくは、１回の投与で与え
られかつ通常１日量の全部、半分または３分の１または
４分の１に相当する量の活性化合物を含有する。

無毒の不活性の製薬学的に適当な賦形剤とは、すべて
の種類の固体、半固体または液体の希釈剤、充填剤およ
び配合助剤であると解釈すべきである。

錠剤、糖剤、カプセル剤、ピル、丸剤、坐薬、溶液、
懸濁液および乳濁液、泥膏、軟膏、ゲル、クリーム、ロ
ーション、粉剤およびスプレーを好ましい製剤である。

錠剤、糖剤、カプセル剤および丸剤は、活性化合物の
１種またはそれ以上と、次の普通の賦形剤を含有でき
る：（ａ）充填剤および増量剤、例えば、でんぷん、ラ
クトース、グルコース、マンニトールおよびシリカ、
（ｂ）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、
アルギン酸塩、ゼラチンおよびポリビニルピロリドン、
（ｃ）保湿剤、例えば、寒天、炭酸カルシウムおよび重
炭酸ナトリウム、（ｅ）溶解遅延剤、例えば、パラフィ
ン、および（ｆ）吸収促進剤、例えば、第四アンモニウ
ム化合物、（ｇ）湿潤剤、例えば、セチルアルコールま
たはグリセリンモノステアレート、（ｈ）吸着剤、例え
ば、カオリンおよびベントナイト、および（ｉ）潤滑
剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウムおよびス
テアリン酸マグネシウムおよび固体のポリエチレングリ
コール、または（ａ）〜（ｉ）に記載した物質の混合
物。

錠剤、糖剤、カプセル剤、ピルおよび丸剤は、普通の
被膜および外殻を含有することができ、これらは不透明
剤を含むことができ、そしてそれらは、活性化合物の１
種またはそれ以上のみを、あるいは好ましくは、腸管の
特定の部分において、可能ならば長時間にわたって、放
出するような組成物であることができ、使用可能な埋め
込み組成物の例はポリマー物質およびワックスである。

活性化合物の１種またはそれ以上は、賦形剤の１種ま
たはそれ以上と一緒に、マイクロカプセル化した形態に
することができる。

坐薬は、活性化合物の１種またはそれ以上に加えて、
普通の水溶性または非水溶性の賦形剤、例えば、ポリエ
チレングリコール、脂肪、例えば、カカオ脂肪、高級エ
ステル、（例えば、C₁₄−アルコールとC₁₆−脂肪酸との
エステル）またはこれらの物質の混合物を含有すること
ができる。

軟膏、泥膏、クリームおよびゲルは、活性化合物の１
種またはそれ以上に加えて、普通の賦形剤、例えば、動
物性および植物性の脂肪、ワックス、パラフィン、デン
プン、トラガカント、セルソース誘導体、ポリエチレン
グリコール、シリコーン、ベントナイト、シリカ、タル
クおよび酸化亜鉛またはこれらの混合物を含有すること
ができる。

散剤および噴霧剤は、活性化合物の１種またはそれ以
上に加えて、普通の賦形剤、例えば、ラクトース、タル
ク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムお
よびポリアミド粉末またはこれらの物質の混合物を含有
することができる。噴霧剤は、普通の噴射剤、例えば、
クロロフルオロ炭化水素をさらに含有することができ
る。

溶液および乳濁液は、活性化合物の１種またはそれ以
上に加えて、普通の賦形剤、例えば、溶媒、可溶化剤お
よび乳化剤、例えば、水、エチルアルコール、イソプロ
ピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルア
ルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、
1,3−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、
油、ことに綿実油、落花生油、トウモロコシ胚油、オリ
ーブ油、ヒマシ油およびごま油、グリセリン、グリセリ
ン−ホルマール、テトラヒドロフルフリルアルコール、
ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エス
テル、またはこれらの混合物を含有することができる。

非経口的投与に対して、溶液および乳濁液は、血液等
張性の無菌の形態にすることができる。

懸濁液は、活性化合物の１種またはそれ以上に加え
て、普通の賦形剤、例えば、液状希釈剤、例えば、エチ
ルアルコール、プロピレングリコール、懸濁剤、例え
ば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキ
シエチレンソルビトールエステルおよびソルビタエステ
ル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベ
ントナイト、寒天およびトラガカントまたはこれらに混
合物を含有することができる。

また、前述の配合形態は、染料、防腐剤、および芳香
および風味を改良する添加剤、例えば、ペパーミント油
およびユーカリ油、および甘味剤、例えば、サッカリン
を含有することができる。

治療学的に活性な化合物は、好ましくは、前述の製剤
中に、全混合物の約0.1〜99.5重量％、好ましくは約0.5
〜95重量％の量で存在する。

また、前述の製剤は、本発明による化合物に加えて、
他の製薬学的に活性な化合物を含有することができる。

前述の製剤は、既知の方法に従い普通に、活性化合物
の１種またはそれ以上を賦形剤の１種またはそれ以上と
混合することによってつくられる。

活性化合物または製剤は、局所的、経口的、非経口
的、腹腔内および／または経直腸的に、好ましくは経口
的または非経口的、例えば、静脈内または筋肉内に投与
することができる。

一般に、所望の結果を得るためには、活性化合物の１
種またはそれ以上を24時間毎に約0.5〜約500、好ましく
は５〜100mg/kg体重の合計量で、場合によっては数回に
分けて投与することが、人間および獣の医学において有
利であることがわかった。個々の投薬物は、好ましく
は、活性化合物の１種またはそれ以上を約１〜約250、
ことに３〜60mg/kg体重の量で含有する。しかしなが
ら、前述の投薬量からはずれなければならないことがあ
り、特にそのことは処置を受ける患者の性質および体
重、病気の性質および重さ、製剤の性質および薬剤の投
与方法、投与を行う時間または間隔に依存する。

かくして、ある場合には、活性化合物は前述の量より
も少量で十分であり、一方他の場合には前記量を超えな
ければならない場合も起こるであろう。必要な特定の最
適な投与量および活性化合物の投与方法は、この分野に
精通するものにとっては、その専門知識に基づき容易に
決定することができる。

発現プラスミドpRk49.2.1およびpRk48.1.1で形質転換
したE.col.は、ドイチェ・ザンムルング・フォン・ミク
ロオルガニスメン（Deutsche Sammlung von Mikroor
ganismen,Grisebachstr.8,D−3400 Ｇttingen）に受
託番号DSM 3678およびDSM 3679で受託された。

実施例実施例１ Glu−52−およびVal−15−Glu−52−アプロチニンの遺
伝情報を指定するDNA断片の合成および精製遺伝子を含むオリゴヌクレオチドを固相合成法により
調製した。オリゴマーの合成法は概説した通りであり、
そしてプトロン活性化され、保護された２′−デオキシ
リボヌクレオチドホスホルアミダイトを利用した。すべ
ての順次に工程は、アプライド・バイオシステムス380
型DNA合成装置で自動化された方法において、この製造
業者から入手した保護されたヌクレオチド、溶媒、およ
び化学物質および試薬を使用して実施した。同様に同じ
製造業者から入手した固相支持体は調節された孔のガラ
スであり、これに出発３′−ヌクレオチドはすでに付着
されていた。製造業者の操作指導書および使用者の社報
に従う自動化された反応サイクルに、ある種の変更を導
入した。合成が完結したとき、製造業者の推奨に従いDN
A合成装置内で、オリゴマーを脱保護しそして固体の支
持体から切離した。

密封したバイアル中でオリゴマーを含有する水溶液を
濃水酸化アンモニウムとともに55℃に４〜24時間加熱す
ることによって、保護基の除去を完結した。得られる溶
液を蒸発させ、残留物を0.01モルの重炭酸トリエチルア
ンモニウム緩衝液、pH7.0（TEAB緩衝液）中に溶解し
た。この溶液をセファデックス（Sephadex）−Ｇ 50
ゲルの濾過樹脂のクロマトグラフィーにかけた。このカ
ラムを同一のTEAB緩衝液中で調製し、そして同一緩衝液
で溶離した。空隙体積で溶離する物質をプールし、そし
て溶液を蒸発させた。

残留物の一部（260nmにおける吸収単位の10〜40％）
を挿入用緩衝液（組成:0.1％のブロモフェノールブル
ー、0.1％のキシレンシアノール、10ミリモルのEDTA二
ナトリウム、ホルムアミド中）をポリアクリルアミドゲ
ルを電気泳動によりさらに精製した。このゲルの大きさ
は18×32cmであり、厚さは1.5mmであった。この方法に
おいて精製された各オリゴマーのためのウェル（well）
の大きさは幅が２〜5cmであり、そして５オリゴマーま
でを単一のゲルで精製した。ゲル中のアクリルアミドの
濃度は、所望生成物の鎖の長さに依存して14〜20％であ
った。より長いオリゴマーのため、14％のアクリルアミ
ドゲルを調製し、これに対してより短いオリゴマーは20
％までのアクリルアミドゲルで精製した。ゲルは、ま
た、７モルの尿素およびトリス−ホウ酸塩−EDTA緩衝液
（0.1モルのトリス、0.1モルのホウ酸塩、２ミリモルの
EDTA、pH8.3）を含有した。展開用緩衝液は同一のトリ
ス−ホウ酸塩−EDTA混合物であった。電気泳動は20〜60
ワットの一定電力で18〜６時間実施した。このような標
準の技術はアプライド・バイオシステムスから入手でき
る種々の使用者の情報の会報から得られる。

電気泳動の完結後、ゲルをプラスチックラップに包
み、そしてオリゴマーをUV光のシャドウイング（shadow
ing）により可視化した。このシャドウイングは次のよ
うにして実施した。包装したゲルを蛍光性の薄い層状ク
ロマトグラフィー用板上に配置し、そしてゲルを短波長
の紫外線源で見た。所望の生成物は最も遅く移動する主
要ブルーのDNA断片として、このシャドウイング技術に
よって現われる。所望の帯をゲルから切除した。DNAオ
リゴマーを、エピゲン（EpiGene）Ｄ−ゲル（Gel）電
気泳動装置を使用して、ゲルのスライスから粉末状ジエ
チルアミノエチル（DEAE）セルロース上に溶離した。オ
リゴマーをセルロースから１モルのTEAV緩衝液で溶離し
た。オリゴマーを含有する緩衝液を蒸発させ、残留物を
0.001モルのTEAB緩衝液中に溶解し、次いで前述のよう
にセファデックス−Ｇ 50のカラムに通過させて脱塩
した。空隙体積中にれする物質をプールし、そして凍結
乾燥して最終生成物を得た。

上に概説した手順を使用して、精製されたオリゴマー
の各々の約0.5〜5.0A260単位を得た。

実施例２ Glu−52−およびVal−15−Glu−52−アプロチニンのた
めの合成アプロチニンマスター遺伝子の構成これらの特定の合成アプロチニン遺伝子の構成は、15
の精製したオリゴヌクレオチドのアセンブリーを包含す
る（第14図参照）。第３図に示すDNA配列は、開始コド
ンATG、２つの終末コドン、TAGおよびTAA、末端制限部
位Eco RIおよびHind IIIおよびBam HIおよび内部の
制限部位を含む。これらの部位の選択は、解読配列のク
ローニングおよびその修飾を促進した。

この合成遺伝子の発生に使用した構成は、断片のほか
に、材料および方法にいおいて詳述したポリヌクレオチ
ドキナーゼ、T4 DNAリガーゼおよび制限酵素を使用し
た。

15の精製したオリゴヌクレオチド断片を、50ミリモル
のTEABC（重炭酸トリエチルカンモニウム緩衝液、pH7.
5）中に最終濃度10pmole/μｌで溶解した。すべての断
片のホスホリル化は４つの別々の部分（断片（Frag.）
１、3;断片２、４、6;断片５、７、９、11、13;断片
８、10、12、14、16）において実施した。調製の目的
で、各々の断片の80pmoleを、それぞれ、１×PNKミック
ス、２μモルのATP、0.1μCiの32 ＰガンマATP/10pm
oleの断片、10単位のPNK/pmoleの断片の混合物中に溶解
して、合計の体積が断片１、３について300μｌ、断片
２、４、６について400μｌ、断片５、７、９、11、13
について700μｌおよび断片８、10、12、14、16につい
て700μｌであるようにした。各部分の反応は37℃で30
分間実施した。すべての部分をフェノール化し、エタノ
ール沈殿し、洗浄し、そして乾燥した。

交雑の目的で、断片１、３および断片２、４、６（ブ
ロックＡ）を１×リガーゼミックス中に溶解しかつ混合
し、合計の体積を120μｌとし、70℃で５分間インキュ
ベーションし、室温に５時間以内に冷却した。他の断片
（ブロックＢ）を同一手順に従って240μｌ中で交雑し
た。

結合の目的で、ブロックＡの溶液に12μｌの10ミリモ
ルのATP、12μｌの100ミリモルのDTE、20μlTA−DNAリ
ガーゼを供給し、そしてブロックＢの溶液に２倍量を供
給した。反応は14℃で７時間実施した。10μｌのT4 DN
AリガーゼをブロックＡに添加し、そしてブロックＢに2
0μｌを添加し、再び14℃で45分間インキュベーション
した。この混合物をフェノール化し、エタノール沈殿
し、そして乾燥した。

得られたブロックＡを90μｌの１×SP−100および10
μｌのEco RI（10μl/μｌ）中に溶解し、ブロックＢ
を90μｌの１×SP−50および10μｌのBam HI中に溶解
し、そして37℃で１時間インキュベーションした。この
反応をフェノール抽出により停止し、そしてエタノール
沈殿、６％のポリアクリルアミドゲルの電気泳動を実施
し、そしてDNAブロックを前述の同一手段に従い回収し
た。

等量の放射線標識したブロックＡおよびブロックＢを
水中に溶解し、１×リガーゼミックスに調節し、そして
の最終の結合に関して前述したように合成遺伝子へ交雑
させた。その後、３μｌの10ミリモルのATP、３μｌの1
00ミリモルのDTE、３μｌのT4 DNAリガーゼを22μｌの
交雑混合物に添加し、そして４℃で７時間インキュベー
ションした。再び、１μｌのT4 DNAリガーゼを添加
し、そしてこの反応を14℃で45分間実施した。結合生成
物をフェノール抽出およびエタノール沈殿により精製し
た。SP−50中で標準の制限酵素の消化（Bam HI 1.5μ
ｌ、Eco RI 1.5μｌの二重消化）を実施した。この物
質をフェノール沈殿させ、そしてエタノール沈殿前に、
水溶液を３ミリモルのMgCl₂ 0.3モルの酢酸ナトリウム
に調節した。次いで、６％のポリアクリルアミドゲルの
電気泳動を実施し、そして遺伝子を前述と同一の手順に
従い回収した。

実施例３組換えプラスミドpRk63.1.1およびpRk54.1.1の構成実験的アプロチニンクローニングのために選択したプ
ラスミドはpUC ８［J.ビエラ（Viera）およびJ.メッシ
ング（Messing）、1982、遺伝子（Gene）、19、259］で
あった。このクローニングベクターはpBR 322誘導アン
ピシリンリガーゼ遺伝子と、１列の独特制限酵素制限部
位を含有するlac Ｚ遺伝子の一部に結合したDNA複製
起源とから成る。このベクターがlac^-E.col.中に導入さ
れるとき、形質転換は適当な指示ペトリ皿上にブルーの
コロニーを生成する。DNA断片を多数の制限部位のいず
れか、例えば、Eco RIとBam HIとの間にクローニング
すると、lac遺伝子は不活性化されて白色のコロニーが
生成する。

ベクターの調製合成アプロチニンマスター遺伝子をpUC ８中に結合
するため、精製的ベクターの調製を実施した。精製され
たpUC ８ DNA（約30pmole）を、標準の制限エンドヌ
クレアーゼの消化の条件下に、Eco RIおよびBam HIで
２回消化して、小さい内部のEco RI−Bam HI断片を切
断した。この調製物を、上述のように、小牛腸ホスファ
ターゼで脱ホスホリル化し、アガロースゲルの電気泳動
により分離し、そしてこのベクターの大きいEco RI−B
am HI断片を精製した（標準の条件）。この手順はこの
ベクターを使用するそれ以上の研究を著しく促進する。
なぜなら、Eco RIおよびBam HIの末端におけるベクタ
ー分子の自己結合は排除され、そして形質転換体のバッ
クグラウンドは劇的に減少するからである。

結合 pRK 63の構成（第４図参照）を合計量の精製した合
成アプロチニン遺伝子を1pmoleのベクターと結合するこ
とによって実施した（1.4単位のT4−DNA−リガーゼ、１
×リガーゼミックス、合計の体積45μｌ、14℃において
７時間のインキュベーション、１単位のT4−DNA−リガ
ーゼの添加および14℃における45分間の再インキュベー
ション）。

形質転換 D.ハナハン（Hanahan）からの反応転換の手順（詳細
は形質転換の手順参照）を用いて、E.col.RR1△M15［A.
カルニンス（Kalnins）ら（1983）、EMBOジャーナル
２、593;ATCC 35102］を受容体細胞として使用した。2
00μg/mlのアンピシリンを含有する指示ペトリ皿上で結
合物質の50％で形質転換後、15の「白色」形質転換体が
得られた。バーンボイム（Birnbim）およびドリー（Dol
y）1979の急速分析用プラスミドの分離法（上を参照）
の修正法を使用して、すべての15の形質転換体をスクリ
ーニングした。その後、15の試料のペレットを１μｇの
RNaseを含有する30μｌの１×SP−100中の再溶解した。
Eco RIおよびBam HIを使用する制限消化を実施した。

ゲル電気泳動後、15の形質転換体のうちの４つはほぼ
200塩基対長さのEco RI−Bam HI断片を有するプラス
ミドDNAを含有することがわかった。

このEco RI−Bam HI断片を有する形質転換体のすべ
てを大規模で生長させ、そして各々からのプラスミドを
分離し、そしてさらに分析した。それらのうちの２つを
マクサム（Maxam）およびギルバート（Gilbert）の手順
に従ってシークエンシングすると、すべては正しい配列
を示し、極めてすぐれた化学的合成および構成を立証し
た。

プラスミドpRk54.1.1（Val−15−Glu−52アプロチニ
ン）を、合成遺伝子のベータブロック（Apa Ｉ−Stu
Ｉ断片）を、位置15にLysの代わりにValのためのコドン
を含有するベータブロックとの簡単な置換によって構成
した。

約100pmoleの合成ssDNA断片BEA 4AおよびBEA 4B
（第2b図参照）を20μｌの水中に溶解し、95化合物に５
分間加熱し、そして室温にゆっくり冷却した（５時
間）。交雑したホスホリル化していない断片を、Apa
Ｉ−支持体Ｉ断片を欠くpRk63.1.1からの1.5ピコモル
のDNAと結合した。この結合混合物の50％を使用してE.c
ol.RR1△M15の形質転換を実施した。1500の形質転換体
から、24を分析用プラスミドの分離および制限分析によ
って試験した。すべては陽性であり、そしてそれらのう
ちの２つをバイオラブス（Biolabs、米国マサシュセッ
ツ州ベバリー）からのＭ 13 ジデオキシヌクレオチド
シークエンシング系によりシークエンシングした。形質
転換体pRk54.1.1をそれ以上の実験のための使用した。

実施例４発現プラスミドpRk48.1.1およびpRk49.2.1の構成アプロチニンを融合蛋白質として発現させるため、U.
リューサー（Ｒther）およびB.ミュラー−ヒル（Ｍ
ller−Hill）、1983、EMBOジャーナル、２、1791−1794
およびドイツ国公開明細書（DE−OS）33 09 501.9に
よる同様な実験において示されているように、アプロチ
ニン遺伝子がβ−ガラクトシダーゼのカルボキシ末端に
位置するプラスミドを構成した。

合成遺伝子を発現ベクターpUR 278中でクローニング
するため、クローニング部位Bam HIおよびHind IIIを
選択した。その後、Bam HI部位をアプロチニン遺伝子
の５′Eco RI末端に付加しそしてHind III部位を３′
末端において使用して、アプロチニン遺伝子を修飾する
ことが必要であった（第６図参照）。

50pmoleのpRk63.1.1を120μｌの１×SP−100中で37℃
においてEco RI（15pmoleのhit/μｌ）で一夜完全に消
化した。このDNA物質の特記する５′Eco RI末端を、DN
AポリメラーゼＩ（クレノー断片）、dATPおよびdTTとの
酵素反応により充填した（マニアチスら1982）。600pmo
leのの乾燥したアルファ32 Ｐ ATP（250uCi）を溶解
し、そして160μｌのDNA（50pmole）、10μｌの１ミリ
モルのdATP（10 000Pmole）、20μｌのNT緩衝液と混合
した。次いで、10μｌのDNAポリメラーゼＩ（クレノー
断片、50μｌ）を添加し、そして最初のインキュベーシ
ョンを室温で実施した。30分後、10μｌの１ミリモルの
dTTP（10 000ピコモル）を５μｌのポリメラーゼ（25
μｌ）と一緒に添加し、そして第２回のインキュベーシ
ョンを室温で実施した。この物質をフェノール／セバグ
抽出し、放射線標識された分子量の分画をプールし、エ
タノール沈殿させ、洗浄し、50μｌのTE中に溶解し、そ
して20℃で貯蔵した。

フラッシュ（flush）末端をもつこの物質の20μｌをB
am HIリンカーとの結合のために使用した。その後、ガ
ンマ32 Ｐ ATPで標識付けされた５′ Bam HIリンカ
ーの400pmole（標準の５′ホスホリル化手順）を40pmol
eのDNA末端に結合した（標準の結合条件、4.5μｌのT4
DNAリガーゼ、合計の体積60μｌ）。リンカーの結合
の品質を調節するため、分析用ゲル電気泳動を実施し
た。100pmoleのBam HIリガーゼ、1.8単位のT4 DNAリ
ガーゼの添加し、20℃で１時間インキュベーションし、
１単位のT4 DNAリガーゼを添加し、そして14℃で18時
間インキュベーションした後、完全な結合が達成され
た。この反応混合物をフェノール／セバグ抽出し、エタ
ノール沈殿し、洗浄し、乾燥し、そして40μｌのTE中に
溶解した。

Bam HIおよびHind III末端をもつ合成アプロチニン
遺伝子を調製するため、結合した直線状プラスミド（10
pmole）をまずHind III（10.5pmoleのhit/μｌ、５時
間、37℃）で切断し、次いでBam HI（40pmoleのhit/μ
ｌ、20時間、37℃、標準条件）で切断した。断片を６％
んＰポリアクリルアミドゲルの電気泳動による分離後単
離し、そして注意して精製した（参照、標準手順）。

ベクターの調製親ベクターpUR 278（約5pmole）を不味HInd IIIで
切断し（標準条件）フェノール／セバグ抽出により精製
し、エタノール沈殿し、再溶解し、次いでBam HIで消
化した（標準条件）。この物質を、１％のアガロースゲ
ル上に装填し、電気泳動させ、単離し、そして精製し
て、合成アプロチニン遺伝子との結合を完結するであろ
う18塩基対長さのBam HI−Hind III断片が得られた。

標識および形質転換結合のため、0.3pmoleのベクター、1.5pmoleの断片
（ほぼ）、２単位のT4 DNAリウガーゼを使用した（標
準条件、合計の体積30μｌ、14℃における４時間のイン
キュベーション）。

結合混合物の1/3を使用し、宿主としてE.col.RR1△M1
5を使用して形質転換を実施した（標準条件）。合計173
の「ブルー」のコロニーが、200μg/mlのアンピシリン
を含有する指示ペトリ皿上に得られた。これから12の形
質転換体を、急速分析用プラスミド単離によりさらに分
析した（標準条件）。ベクターの再結合により得られた
形質転換体の百分率から計算すると、173の形質転換体
のうちで、30はバックグラウンドの形質転換体であろ
う。この結果は12形質転換体の制限分析により確証され
た。それらのうちの８つは陽性であり、約200塩基対のB
am HI−Hind III制限断片を示した。陽性の形質転換
体を、また、Sst IIおよびアプロチニン遺伝子内の独
特制限部位により直線化した。マクサム（Maxam）およ
びギルバート（Gilbert）に従う塩基配列の分析は、プ
ラスミドpRk48.1.1が所望のアプロチニンDNA断片を挿入
していることを明らかにした（第６図参照）。プラスミ
ドpRk48.1.1を、それ以上の分析および発現の研究に使
用した。

プラスミドpRk48.1.1の個性は、pRk54.1.1からのVal
−15−Glu−52遺伝子を使用する正確に同一の手順によ
って実施した。陽性の組換えプラスミドpRk49.2.1は正
確なDNA配列を示し、そしてこの構成体はそれ以上の分
析および発現の研究に使用した。

β−ガラクトシダーゼ−Glu−52−アプロチニンおよび
β−ガラクトシダーゼ−Val−15−Glu−52−アプロチニ
ンの発現の検出これらの構成体の発現を試みるために、pRk48.1.1（D
SMにDSM No.3679で受託されている）およびpRk49.2.1
（DSMにDSM No.3678で受託されている）を有するE.co
l.菌株を、４μｌの0.1モルのIPTGを補充した2mlのLB−
アンピシリン培地中に接種した。アプロチニン遺伝子を
含まないpUR 278を含有するクローンを、また、培地に
接種して、アッセイの陰性の対照を得た。撹拌しながら
37℃で12〜16時間生長させた後、1mlの試料を100mlのLB
−アンピシリン培地の接種に直接使用した。撹拌しなが
ら37℃で12〜16時間生長させた後、細胞をベックマンJA
10ローター内で5000rpmにおいて10分間遠心することに
よって収穫した。

融合蛋白質の直接検出は、ラエムリ（Laemmli）、U.
K.1970、ネイチャー（Nature）、277、680ページ、およ
びまた、B.D.ヘイムス（Hames）およびD.リックウッド
（Rickwood）、1981、蛋白質のゲル電気泳動（Gel ele
ctrophoresis of proteins）、IRL プレス・リミテ
ッド、オックスフォード、に従うSDS ポリアクリルア
ミドゲルの電気泳動により実施した。

レーン（lane）１つにつき、約１×10E9の細胞を遠心
し、そしてSDS試料用緩衝液（0.3モルのトリス−HCl（p
H8.8）,50％のグリセロール、５％のSDS、25％のメルカ
プトエタノール）の1:5希釈物中に再溶解した。電気泳
動ゲルをクーマッシーブルーで着色した後、第７図は誘
導可能なβ−ガラクトシダーゼGlu−52アプロチニン融
合蛋白質をもつE.col.蛋白質の典型的なパターンを示
す。

溶液：破壊用緩衝液： 50ミリモルのトリス、 100ミリモルの塩化マグネシウム、 10ミリモルのメルカプトエタノール、２モルのグアニジン−HCl−溶液、２モルのグアニジン−HCl、 50ミリモルのトリス−HCl、pH7.7、 100ミリモルの塩化ナトリウム、 10ミリモルのメルカプトエタノール、６モルのグアニジン−HCl−溶液、６モルのグアニジン−HCl、 50ミリモルのトリス−HCl、 100ミリモルの塩化ナトリウム、 10ミリモルのメルカプトエタノール。

実施例５ Glu−52の調製１、 β−ガラクトシダーゼ−融合蛋白質Lys−15−Glu
−52−アプロチニンの単離および臭化シアンによる切断調製の目的で、６リットルのE.col.の一夜の培養物の
菌株RR1△M15を8000rpmで15分間遠心した。約15gの細胞
ペレットを30mlの破壊用緩衝液中に再懸濁させ、そして
６分間腸音波処理した（氷冷）。細胞リゼイトを20000r
pmで20分間遠心した。上澄みを廃棄した。約10gのペレ
ットを20mlの２モルののグアニジン塩酸塩溶液中に再懸
濁し、そして均質化した。20000rpmで20分間遠心した
後、上澄みを廃棄した。約8gのペレットを、N₂雰囲気の
もとに、200mgのDTTを含有する20mlの６モルのグアニジ
ン塩酸塩溶液中に溶解し、そして50℃で１時間再還元し
た。この溶液を10000rpmで10分間遠心し、そして10ミリ
モルのメルカプトエタノールを含有する水に対して24時
間透析した。沈殿した融合蛋白質を20000rpmで20分間遠
心することにより集めた。湿った融合蛋白質を30mlの濃
ギ酸中に溶解し、次いで70％に水で希釈した。融合蛋白
質を、4gの臭化シアンの添加および窒素雰囲気中の暗所
における18時間のインキュベーションにより切断した。
この反応を200mlの水の希釈により停止させた。水およ
び揮発性副生物を凍結乾燥により除去した。臭化シアン
による切断を、ラエムリ（Laemmli）に従うSDSゲル電気
泳動によって検査した。収量は約1.5gの臭化シアン断片
であった。１系列の実験において、収量は0.8〜2.5gで
変化した。

溶液：緩衝液Ａ、pH8.2 50ミリモルのトリス−HCl、１ミリモルのEDTA、 pH8.2に調節、緩衝液Ｂ、pH8.2 ８モルの尿素、１ミリモルのビス−（２−ヒドロキシエチル）−ジサ
ルファイド、１ミリモルの２−メルカプトエタノール、緩衝液Ａ中、緩衝液Ｃ、pH8.2 １ミリモルのビス−（２−ヒドロキシエチル）−ジサ
ルファイド、１ミリモルの２−メルカプトエタノール、緩衝液Ａ中、緩衝液Ｄ、pH8.2 0.6ミリモルの塩化ナトリウム、緩衝液Ａ中。

２、 Glu−52−アプロチニンの分離および再変性約300mgの凍結乾燥したLys−15−Glu−52−アプロチ
ニンβ−ガラクトシダーゼ臭化シアン断片を、300mgのD
TTを含有する300mlの緩衝液Ｂ中に溶解した。この溶液
を窒素雰囲気中で50℃におい１時間還元した。次いで、
この溶液をCM−セファデックスのカラム（25×100mm）
（約15mlのCM−sepharose Fast Floeで充填した）
に適用した。このカラムを、基線が安定となるまで、緩
衝液Ｂで洗浄した。最初の直線の勾配溶離において、カ
ラムを100mlの緩衝液Ｂおよび100mlの緩衝液Ｃで展開し
た。第２直線勾配溶離の適用前に、カラムを基線が安定
となるまで緩衝液Ａで洗浄した。第２勾配を100mlの緩
衝液Ａおよび100mlの緩衝液Ｄで形成した。ピーク分画
をトリプシン阻害活性についておよびELISAおよびウエ
スタンブロットによって試験した（第10図）。１系列の
実験において、異なる試験によって推定した収量は0.4
〜2mgの範囲であった。

３、逆相HPLCによるGlu−52−アプロチニンの精製活性分画を蒸発により濃縮し、次いで0.1モルのNH₄HS
O₃、pH7.5に対して18時間透析した。凍結乾燥した後、
阻害剤を0.1％のTFA中に溶解し、そして高い多孔率のRP
−18カラム（BIORAD）の逆相クロマトグラフィーにか
け、緩衝液Ａ中0.1％のTFAおよび緩衝液Ｂ中0.1％のTFA
60％の勾配を使用した。阻害剤をＮ−末端シークエン
シングおよびアミノ酸分析により特徴づけた。

実施例６ Val−15−Glu−52−アプロチニンの発現および生成物の
特徴づけプラスミドpRk49.2.1をもつE.col.形質転換体の発酵
およびVal−15−Glu−52の精製を実施例５におけるのと
同一の手順に従って実施したが、ただし活性はトリプシ
ン阻害試験の代わりにエラスターゼアッセイにより試験
した。Val−15−Glu−52−アプロチニンは、CMセファロ
ースのカラムから、Glu−52−アプロチニンより速く溶
離する。

１系列の実験において、異なる試験によって推定され
る収量は0.1〜1mgであった。

同一のHPLC精製をVal−15−Glu−52の−アプロチニン
の単離に適用した。阻害活性は白血球エラスターゼ阻害
のアッセイにより決定した。阻害剤はＮ−末端シークエ
ンシングおよびアミノ酸分析によって特徴づけた。

実施例７ Arg−15−Glu−52−アプロチニンの構成、発現および特
性づけ Arg−15−Glu−52−アプロチニン遺伝子を構成するた
め、ベータブロック（第１図）の検査した。このブロッ
クは、pRk54.1.1中でクローニングしたVal−15−Glu−5
2遺伝子のApa Ｉ−Stu Ｉ DNA断片である。

この断片を、コドンSGTによりアルギニンについてア
ミノ酸位置15において解読する対応する断片によって置
換した。得られる組換えベクターをpNH 01.1.1と命名
し、部分的にシークエンシングし、そしてそれ以上の実
験に使用した。

Arg−15−Glu−52−アプロチニン遺伝子の５′末端
に、Bam HI部位を付加し、そして単離した遺伝子をBam
HI−Hind III中に結合し、発現ベクターpUR278を切
除した。

このDNAをE.col.RR1△M15の形質転換に使用し、そし
て新規な発現プラスミドpRk112.1.1を選択した。

この形質転換のため、β−ガラクトシダーゼArg−15
−Glu−52−アプロチニン融合蛋白質を単離し、そしてA
rg−15−Glu−52−アプロチニンを、前述のように臭化
シアンの切断後に、精製した。

驚くべきことには、動力学的研究により、組換えArg
−15−Glu−52−アプロチニンはヒト血漿カリクレイン
（Ki＝3.2×10^-10モル）陽イオン性および陰イオン性の
ヒトトリプシン（Ki値＜10^-11）の非常に効力のある阻
害剤である。Ki値はM.W.エンピー（Empi）およびM.ラス
コウスキー（Laskowski）、Jr.、バイオケミストリー
（Biochem.）、21、2274（1982）の方法によって決定し
た。

Arg−15−相同体、例えば、実施例７の相同体は急性
の炎症、例えば、リウマチ性関節炎、脈管神経性浮腫、
肺炎、膵炎およびショックの処置において非常に有用で
ある。Arg−15−相同体は、さらに、透析法、例えば、
人工膜および体外の循環における保護剤として有用であ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、合成アプロチニンマスター遺伝子の設計であ
る。第２図は、遺伝子の部分ＡについてDNA断片１、２、
３、４および６、および部分ＢについてDNA断片５、
７、８、９、10、11、12、13、14および16の交雑、結合
および精製によって、得られた遺伝子の部分Ａおよび部
分Ｂをを示す。第３図は、合成Glu−52−アプロチニン遺伝子DNA配列
（EcoRI−BamHI、pRk63.1.1の部分的配列）を示す。第４図は、プラスミドpRk63.1.1の構成を示す。第５図は、プラスミドpRk54.1.1の構成を示す。第６図は、プラスミドpRk48.1.1の構成を示す。第７図は、7.5％のSDS−ポリアクリルアミドゲルの電気
泳動の結果を示す。第８図は、還元条件下に８％のSDS−ゲルにより検査し
たHS 2074からのβ−ガラクトシダーゼ融合蛋白質の分
離を示す。第９図は、Glu−52−アプロチニンをβ−ガラクトシダ
ーゼの臭化シアン断片からイオン交換クロマトグラフィ
ーによって分離し、そして同時に再び折たたんだ結果を
示す。第10図は、Lys15 Glu52−アプロチニン−β−ガラクト
シダーゼ融合蛋白質の分画した臭化シアンのウエスタン
ブロットを示す。第11図は、アプロチニンおよびGlu−52−アプロチニン
のトリプシン阻害活性の比較は同一の応答曲線を示す。第12図は、Val15 Gluアプロチニン−β−ガラクトシダ
ーゼ融合蛋白質のラエムリにより８％SDS−ポリアクリ
ルアミドゲル上の電気泳動の結果を示す。第13図は、Val−15−Glu−52−アプロチニンはGlu−52
−アプロチニンについて説明したのと同様な方法でβ−
ガラクトシダーゼ融合蛋白質から調製できることを示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｒ 1:19） 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者ボルフガング・ブルンスドイツ連邦共和国デー5600ブツペルタール１・カイザー−ビルヘルム−アレー 37 (72)発明者ゲルト・ラインハルトドイツ連邦共和国デー5600ブツペルタール１・アムエツクブツシユ 55アー (72)発明者マイケル・コテイツクアメリカ合衆国インデイアナ州46514エルクハート・オールドミルドライブ 54231 (56)参考文献特開昭60−28994（ＪＰ，Ａ) 欧州特許出願公開132732（ＥＰ，Ａ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】52位がグルタミン酸残基であり、15位がバ
リン残基またはリジン残基であるアプロチニン。
【請求項２】15位がバリン残基である特許請求の範囲第
１項記載のアプロチニン。
【請求項３】15位がリジン残基である特許請求の範囲第
１項記載のアプロチニン。