JPH0625289A - 新規ポリペプチド、新規ｄｎａ、医薬組成物およびポリペプチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】プロテアーゼインヒビターとして、新規な阻害
活性を有する新規なポリペプチドの提供。 【構成】下記のアミノ酸配列中の（ｉ）ないし（iii)よ
り選ばれる１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換さ
れてなるアミノ酸配列を、少なくともその一部として有
する、プロテアーゼ阻害活性、特に、ＦＸａに対する阻
害活性の高い新規ポリペプチドとその製造方法、それを
コードする新規ＤＮＡおよびそれを用いた医薬組成物。 Cys Asn Leu Pro Ile Val Arg Gly Pro Cys Arg Ala Phe Ile Gln Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu Phe Pro Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Tyr Ser Glu Lys Glu Cys Arg Glu Tyr Cys （ｉ）Ｎ末端側より数えて１５番目のＧｌｎをＧｌｎ以
外のアミノ酸に置換。 （ii）Ｎ末端側より数えて４２番目のＴｙｒをＴｙｒ以
外のアミノ酸に置換。 (iii) Ｎ末端側より数えて７番目のＡｒｇをＡｒｇ以外
のアミノ酸に置換。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規ポリペプチド、新
規ＤＮＡ、当該新規ＤＮＡを含むベクター、当該新規ポ
リペプチドを産生する形質転換体、当該新規ポリペプチ
ドの製造方法、当該新規ポリペプチドを有効成分とする
医薬組成物および当該新規ポリペプチドを用いたプロテ
アーゼ阻害方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】周知のように、生体内にはトリプシンや
キモトリプシンをはじめとして種々のプロテアーゼが存
在している。これらのプロテアーゼは、生体内において
消化、生体防御、血液の凝固線溶等重要な役割りを担っ
ている一方、これまでの研究で、疾患の直接的あるいは
間接的原因となることが明らかにされている。プロテア
ーゼの異常な活性化が原因であると考えられている代表
的な疾患としては、ショック、膵炎、播種性血管内凝固
症候群（ＤＩＣ）等がある。現在、このようなプロテア
ーゼが関与する疾患の治療を目的として各種プロテアー
ゼインヒビターが使用されている。こうした疾患の治療
のための医薬品として使用されているプロテアーゼイン
ヒビターは化学合成物と天然物に大別できるが、一般的
に、化学合成物は経口投与可能な物質で、かつ、幅広い
酵素阻害スペクトラムを有する場合が多く、天然物は特
定のプロテアーゼに対する阻害活性を有し、かつ、細胞
の増殖促進活性等酵素阻害作用以外の作用をも併せ持つ
場合が多い。天然物のプロテアーゼインヒビターの阻害
スペクトラムには、その活性中心のアミノ酸の種類や配
列が深く関係する。例えば、一般に、プロテアーゼイン
ヒビターの活性中心の主要な部位である位置Ｐ₁ のアミ
ノ酸がＬｙｓまたはＡｒｇである場合にはトリプシン様
の酵素が、ＰｈｅまたはＴｙｒである場合にはキモトリ
プシン様の酵素が、また、Ａｌａ、ＳｅｒもしくはＶａ
ｌである場合にはエラスターゼ様の酵素が阻害される
（Laskowski M., Jr., Biochem. Pharmacol. ２９巻、
２０８９−２０９４頁、１９８０年) 。従って、天然の
プロテアーゼインヒビターの阻害スペクトラムは、その
活性中心を構成しているアミノ酸を置換することによっ
てその阻害スペクトラムを変化させることができると推
定され、既に、いくつかの天然のプロテアーゼインイビ
ターにそのような方法が応用されている。例えば、Brin
kmann 等はアプロチニンの活性中心の位置Ｐ₁ および
Ｐ'₂をＰｈｅ、ＴｙｒあるいはＬｅｕのような疎水性ア
ミノ酸に置換することによりアプロチニンのキモトリプ
シンに対する阻害活性が増強されることを報告している
（Thomas Brinkmann等、Eur J. Biochem.、２０２巻、９
５−９９頁、１９９１年）。また、Fritz 等はビクニン
（ＨＩ−３０）の活性中心のアミノ酸を他のアミノ酸に
置換した物質を作成し、そのエラスターゼ阻害活性およ
びトリプシン阻害活性を測定している（特開平３−２５
５０９９号公報、１９９１年、ヨーロッパ公開公報、Ｅ
Ｐ４０１５０８号、１９９０年）。このようなアミノ酸
の置換によって生じるプロテアーゼインヒビターの性状
の変化は、酵素阻害スペクトラムばかりでなく、投与経
路、薬理作用等にも影響するもので、こうした新しい特
徴を持った各種のプロテアーゼインヒビターを治療用に
開発し、治療対象となる疾患の病態に応じてそれらを使
い分けていくことが重要と考えられる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上述
のような新しい特徴を持ったプロテアーゼインヒビター
として新規ポリペプチドを提供することにある。本発明
の他の目的は、当該新規ポリペプチドをコードする塩基
配列を有するＤＮＡ、当該ＤＮＡを含むベクター、当該
ＤＮＡで形質転換された形質転換体および当該ＤＮＡを
含むベクターで形質転換された形質転換体および当該新
規ポリペプチドを製造する方法を提供することにある。
さらに、本発明の目的は、当該ポリペプチドを有効成分
とする医薬組成物および当該ポリペプチドを用いたプロ
テアーゼ阻害方法を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記の課
題を解決するために、下記式１のアミノ酸配列で示され
るポリペプチドに変異を生じさせて特徴あるプロテアー
ゼインヒビターを作製すべく、鋭意、研究を重ねてき
た。式１のアミノ酸配列で示されるポリペプチドは、活
性型血液凝固第Ｘ因子（以下ＦＸａと略す）に対する阻
害活性を有するポリペプチドとして本発明者らによって
初めて見いだされたものである（特願平０３−３２５２
２０号公報）。このポリペプチドのアミノ酸配列は、尿
中トリプシンインヒビター（ＵＴＩ）もしくはビクニン
（ＨＩ−３０）のアミノ酸配列の一部と一致する。しか
しながら、ＵＴＩもしくはＨＩ−３０はＦＸａ阻害活性
をほとんど示さないのに対し、式１で示されるアミノ酸
配列のポリペプチドは顕著なＦＸａ阻害活性を示し、こ
の点において、式１で示されるポリペプチドは、明らか
に、ＵＴＩやＨＩ−３０とは異なるものである。本発明
者らは、式１のアミノ酸配列で示されるポリペプチドを
より付加価値の高いものにすべく、鋭意、研究を重ね
た。その結果、驚くべきことに、これまでの知見からは
予想し得なかった部位のアミノ酸を他のアミノ酸に置換
することによって新たな特徴を持った新たなポリペプチ
ドを得ることに成功したのである。すなわち、本発明者
らは、Wachter 等やSailerが示した活性中心（Wachter
E. at al.、 Hoppe-Seyler's z. Physiol. Chem.、 ３６
０巻、１２９７−１３０３頁、１９７９年、およびJean
-Philippe Sailer, TIBS、 １５巻、４３５−４３９頁、
１９９０年）とは異なる位置であって、これまでに置換
の効果が確かめられていない位置のアミノ酸を他のアミ
ノ酸に置換することによって新たな特徴を有する新規ポ
リペプチドを得ることに成功し、本発明を完成した。

【０００５】 式１ 5 10 Cys Asn Leu Pro Ile Val Arg Gly Pro Cys 15 20 Arg Ala Phe Ile Gln Leu Trp Ala Phe Asp 25 30 Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu Phe Pro 35 40 Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys 45 50 Phe Tyr Ser Glu Lys Glu Cys Arg Glu Tyr Cys

【０００６】本発明第１の態様は、前記式１で示される
アミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に
置換されてなるアミノ酸配列を、少なくともその一部と
して有することを特徴とする新規ポリペプチドを提供す
る。

【０００７】本発明第２の態様は、本発明第１の態様の
新規ポリペプチドをコードする塩基配列を有することを
特徴とする新規ＤＮＡを提供する。

【０００８】本発明第３の態様は、本発明第２の態様の
新規ＤＮＡを含んでなることを特徴とするベクターを提
供する。

【０００９】本発明第４の態様は、本発明第２の態様の
新規ＤＮＡによって形質転換されたことを特徴とする形
質転換体を提供する。

【００１０】本発明第５の態様は、本発明第３の態様の
ベクターによって形質転換されたことを特徴とする形質
転換体を提供する。

【００１１】本発明第６の態様は、下記ａ）〜ｃ）の工
程を行なうことを特徴とする本発明第１の態様の新規ポ
リペプチドの製造方法を提供する。 ａ）本発明第１の態様の新規ポリペプチドをコードする
塩基配列を有するＤＮＡを得る。 ｂ）ａ）で得たＤＮＡで宿主細胞を形質転換させて形質
転換体を得る。 ｃ）ｂ）で得た形質転換体を培養して本発明第１の態様
の新規ポリペプチドを産生させ、当該ポリペプチドを培
養混合物から回収する。

【００１２】本発明第７の態様は、下記ａ）〜ｄ）の工
程を行なうことを特徴とする本発明第１の態様の新規ポ
リペプチドの製造方法を提供する。 ａ）本発明第１の態様の新規ポリペプチドをコードする
塩基配列を有するＤＮＡを得る。 ｂ）ａ）で得たＤＮＡを含むベクターを得る。 ｃ）ｂ）で得たベクターで宿主細胞を形質転換させて形
質転換体を得る。 ｄ）ｃ）で得た形質転換体を培養して本発明第１の態様
の新規ポリペプチドを産生させ、当該ポリペプチドを培
養混合物から回収する。

【００１３】本発明第８の態様は、本発明第１の態様の
新規ポリペプチドを有効成分として含有することを特徴
とする医薬組成物を提供する。

【００１４】本発明第９の態様は、本発明第１の態様の
新規ポリペプチドを用いることを特徴とするプロテアー
ゼ酵素方法を提供する。

【００１５】以下に、本発明を詳細に説明する。本発明
第１の態様の新規ポリペプチドは、前記式１に示された
アミノ酸配列中の任意の１つ以上のアミノ酸を他のアミ
ノ酸に置換させてなるアミノ酸配列を、少なくともその
一部として有することを特徴とする。

【００１６】本明細書中で「アミノ酸配列をその一部と
して有する」とは、ポリペプチドを一次配列で規定した
場合に、ポリペプチドが、当該アミノ酸配列そのもので
規定されるものであっても、当該アミノ酸配列のＮ末
端、Ｃ末端、もしくはその両方に任意の１つ以上のアミ
ノ酸が追加されてなるアミノ酸配列で規定されるもので
あってもよいことを意味する。ポリペプチドを規定する
一次配列以外の要素、例えば糖鎖の有無等は特に限定さ
れない。

【００１７】アミノ酸の置換は、少なくとも、前記式１
のＮ末端側より数えて７番目の位置、１５番目の位置、
もしくは４２番目の位置のいずれかにおいて生じている
事がよい。すなわち、本発明第１の態様の新規ポリペプ
チドが少なくともその一部として有するアミノ酸配列
は、前記式１において、Ｎ末端側より数えて７番目のＡ
ｒｇのみが他のアミノ酸に置換されているものであって
も、１５番目のＧｌｎのみが他のアミノ酸に置換されて
いるものであっても、４２番目のＴｙｒのみが他のアミ
ノ酸に置換されているのであってもよい。また、７番目
のＡｒｇ、１５番目のＧｌｎ、４２番目のＴｙｒの２つ
以上が、同時に、それぞれ他のアミノ酸に置換されてい
るものであってもよく、これらの置換に加えて、他の１
つ以上のアミノ酸が任意のアミノ酸に置換されたもので
あってもよい。

【００１８】アミノ酸の置換は、当該ポリペプチドのプ
ロテアーゼ阻害活性を変化させる、および／または、遺
伝子工学的に生産する際に生産量を上げる効果を少なく
とももたらすものがよい。より好ましくはアミノ酸の置
換は、少なくとも下記より選ばれるいずれか１つ以上の
効果をもたらすものであることがよい。 （ｉ）当該ポリペプチドのＦＸａに対する阻害活性を増
強させる。 （ii）当該ポリペプチドを遺伝子工学的に産生させる際
に形質転換体からの当該ポリペプチドの分泌量を高め
る。 (iii) 当該ポリペプチドのエラスターゼに対する阻害活
性を増強させる。

【００１９】前記式１において１５番目の位置のＧｌ
ｎ、４２番目の位置Ｔｙｒを他のアミノ酸に置換するこ
とは、前記式１のアミノ酸配列を有するポリペプチドの
プロテアーゼ阻害活性の内、少なくともＦＸａ阻害活性
を変化させるために有効であり、７番目の位置のＡｒｇ
を他のアミノ酸に置換することは、プロテアーゼ阻害活
性のうちでも少なくともエラスターゼ阻害活性を変化さ
せるために有効である。

【００２０】また、７番目の位置のＡｒｇを他のアミノ
酸に置換することは、当該ポリペプチドを、遺伝子工学
的に産生させる際に、宿主細胞から分泌され易くするた
めに有効である。７番目の位置と１５番目の位置と４２
番目の位置の２つ以上を同時に置換した場合には、それ
ぞれを個別に置換した場合に生じる効果が組み合わさっ
た相加的な効果を得ることも可能である。

【００２１】本発明にポリペプチドは好ましくは、前記
式１において、少なくとも下記（１）ないし（１１）よ
り選ばれるいずれか１つ以上の置換が生じてなるアミノ
酸配列を少なくともその一部として有する事が好まし
い。 （１）Ｎ末端側より数えて１５番目のＧｌｎをＬｙｓに
置換。 （２）Ｎ末端側より数えて１５番目のＧｌｎをＡｒｇに
置換。 （３）Ｎ末端側より数えて４２番目のＴｙｒをＧｌｕに
置換。 （４）Ｎ末端側より数えて４２番目のＴｙｒを、Ａｓｐ
に置換 （５）Ｎ末端側より数えて７番目のＡｒｇを、Ｇｌｕに
置換 （６）Ｎ末端側より数えて７番目のＡｒｇを、Ｇｌｎに
置換 （７）Ｎ末端側より数えて７番目のＡｒｇを、Ａｓｐに
置換 （８）Ｎ末端側より数えて７番目のＡｒｇを、Ｌｅｕに
置換 （９）Ｎ末端側より数えて７番目のＡｒｇを、Ａｓｎに
置換 （10）Ｎ末端側より数えて７番目のＡｒｇを、Ｓｅｒに
置換 （11）Ｎ末端側より数えて７番目のＡｒｇを、Ａｌａに
置換

【００２２】以上、述べたような前記式１中の１つ以上
のアミノ酸の置換がポリペプチドの特性に与える効果
は、ポリペプチドが、前記式１のアミノ酸配列に加え、
そのＮ末端側、Ｃ末端側もしくはその両方に任意の１つ
以上のアミノ酸が追加されたアミノ酸配列をを有してい
る場合にも認められる。従って、本発明の新規ポリペプ
チドは、前記式１のアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ
酸を他のアミノ酸に置換させてなるアミノ酸配列のＮ末
端、Ｃ末端もしくはその両方に任意の１つ以上のアミノ
酸がそれぞれ付加されたアミノ酸配列を、少なくともそ
の一部として有するポリペプチドであってもよい。付加
されるアミノ酸の種類およびその数は、本発明の新規ポ
リペプチドの特徴が完全には失われない範囲であれば、
特に限定されない。

【００２３】Ｎ末端側に追加されるアミノ酸配列として
好ましいものは、下記（１）ないし（５）より選ばれる
アミノ酸配列である。Ｎ末端に追加されるアミノ酸配列
は、また、下記（１）ないし（５）のアミノ酸配列中の
任意の１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されて
なる配列、下記（１）ないし（５）のアミノ酸配列中の
任意の１つ以上のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、も
しくは、これら１つ以上のアミノ酸の置換と欠失が同時
に生じてなるアミノ酸配列であってもよい。これらの配
列は、当該新規ポリペプチドを大腸菌を使用して産生さ
せる場合に有用である。特に、下記（１）の配列は、当
該新規ポリペプチドを大腸菌を使用して分泌発現させる
際に有効である。 （１） Asp Asp Ala Ala （２） Thr Val Ala Ala （３） Val Ala Ala （４） Ala Ala （５） Ala

【００２４】Ｃ末端に追加されるアミノ酸配列として好
ましいものは、下記（１）ないし（15）から選ばれるア
ミノ酸配列である。Ｃ末端に追加されるアミノ酸配列
は、また、下記式（１）ないし（15）のアミノ酸配列中
の任意の１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換した
アミノ酸配列、下記式（１）ないし(15)のアミノ酸配列
中の任意の１つ以上のアミノ酸が欠失したアミノ酸配
列、もしくはこれら１つ以上のアミノ酸の置換と欠失が
同時に生じてなるアミノ酸配列であってもよい。これら
の配列は、当該新規ポリペプチドを大腸菌で産生させる
際に有用である。 （１）Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu Leu Leu
Arg Phe Ser Asn （２）Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu Leu Leu
Arg Phe Ser （３）Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu Leu Leu
Arg Phe （４）Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu Leu Leu
Arg （５）Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu Leu Leu （６）Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu Leu （７）Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu （８）Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu （９）Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp （10）Gly Val Pro Gly Asp Gly （11）Gly Val Pro Gly Asp （12）Gly Val Pro Gly （13）Gly Val Pro （14）Gly Val （15）Gly

【００２５】もちろん、これらの好ましい配列は、それ
ぞれＮ末端のみに追加されてもＣ末端のみに追加されて
も、Ｎ末端、Ｃ末端の両方に追加されてもよい。配列表
の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、
１８、２０、２２、２４、２６、２８、２９、３０、３
１に本発明第１の態様の新規ポリペプチドのより好まし
いアミノ酸配列を示した。

【００２６】本発明の新規ポリペプチドには糖鎖を有し
ているものおよび糖鎖を有していないもの、いずれもが
含まれる。また、近年の技術は、ポリペプチドにアルキ
ル化、酸化、還元、加水分解等種々の化学修飾を施すこ
とを可能にした。また、薬理学上許容される酸や塩基と
の塩を形成させたり、ＤＤＳ（Drug Deliverly System)
の点からポリペプチドにポリエチレングリコール等を結
合させることも一般的に行われる技術である。従って、
本発明の新規ポリペプチドにはこれらの修飾が施された
ポリペプチドも包含される。

【００２７】本発明第１の態様の新規ポリペプチドは、
好ましくは、その特徴の１つとして、少なくともプロテ
アーゼ阻害活性を有するのがよい。プロテアーゼ阻害活
性は、好ましくは、少なくともＦＸａ、エラスターゼ、
トリプシンのいずれか１つ以上に対する阻害活性がよ
い。

【００２８】本発明の新規ポリペプチドは、いかなる方
法で得られたものであってもよい。例えば、本発明の新
規ポリペプチドは、ペプチド合成機（例えば、アプライ
ドバイオシステムズ社製、４３１型）を用いて化学合成
されたものであってもよい。また、本発明の新規ポリペ
プチドをコードするＤＮＡを用い、公知の組み換えＤＮ
Ａ技術（例えば、T. Maniatis 等編、Molecular Clonin
g, a laboratory manual, 1982年, Cold Spring Harbor
Laboratory 参照）によって製造されたものであっても
よい。なお、組み換えＤＮＡ技術による本発明の新規ポ
リペプチドの製造方法の好ましい例は、本発明第６、７
の態様で説明する。

【００２９】次に、本発明第２の態様の新規ＤＮＡを説
明する。本発明の新規ＤＮＡは、本発明第１の態様の新
規ポリペプチドをコードする塩基配列を、少なくともそ
の一部として有するＤＮＡである。すなわち、本発明の
ＤＮＡは、前記式１のアミノ酸配列中の１つ以上のアミ
ノ酸を他のアミノ酸に置換させてなるアミノ酸配列を、
少なくとも、その一部として有するポリペプチドをコー
ドする塩基配列を有することを特徴とする新規ＤＮＡで
ある。本明細書中「塩基配列を少なくともその一部とし
て有するＤＮＡ」とは、ＤＮＡが、当該塩基配列そのも
ので規定されるものであっても、当該塩基配列の５’末
端、３’末端、もしくはその両方に、任意の１つ以上の
塩基が追加されてなる塩基配列で規定されるものであっ
てもよいことを意味する。本発明の新規ＤＮＡは、適当
な方法により適当な宿主細胞に当該ＤＮＡを導入して、
宿主細胞を形質転換させた時、その形質転換された宿主
細胞において本発明第１の態様の新規ポリペプチドが産
生され得るようなＤＮＡであれば、いかなる塩基配列を
有するＤＮＡであってもよい。周知のように、１アミノ
酸に対応するコドンが複数個存在することを考慮する
と、本発明第１の態様の新規ポリペプチドをコードする
塩基配列は一種類のみに限定されず、従って、本発明の
新規ＤＮＡの塩基配列も一種類のみに限定されない。し
かしながら、前記式１に記載のアミノ酸配列をコードす
る塩基配列は、好ましくは、下記式２に記載の塩基配列
であることがよい。従って、本発明のＤＮＡは、本発明
第１の態様の新規ポリペプチドをコードする塩基配列で
あって、下記式２に記載の塩基配列のうちの１以上の塩
基がアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミジン
（Ｔ）、シトシン（Ｃ）より選ばれる他の塩基に置換さ
れてなる塩基配列を、少なくともその一部として有して
いるものであることが好ましい。

【００３０】 式２ 1 10 20 30 TGC AAT CTC CCC ATA GTC CGG GGC CCC TGC 40 50 60 CGA GCC TTC ATC CAG CTC TGG GCA TTT GAT 70 80 90 GCT GTC AAG GGG AAG TGC GTC CTC TTC CCC 100 110 120 TAC GGG GGC TGC CAG GGC AAC GGG AAC AAG 130 140 150 TTC TAC TCA GAG AAG GAG TGC AGA GAG TAC TGC 前記式２における塩基の置換は、本発明第１の態様のポ
リペプチドが有するアミノ酸配列を考慮すると、少なく
とも、前記式２の５’末端側より数えて１９番目から２
１番目の塩基配列、４３番目から４５番目の塩基配列、
１２４番目から１２６番目の塩基配列のうち、いずれか
に対して生じている事がよい。すなわち、本発明第２の
態様の新規ＤＮＡが少なくともその一部として有する塩
基配列は、前記式２において、５’末端側より数えて１
９番目から２１番目の塩基配列ＣＧＧのみが他の塩基配
列に置換されているものであっても、４３番目から４５
番目の塩基配列ＣＡＧのみが他の塩基配列に置換されて
いるものであっても、１２４番目から１２６番目の塩基
配列ＴＡＣのみが他の塩基配列に置換されているもので
あってもよい。また、これら塩基配列のうち２つ以上が
同時に他の塩基配列に置換されているものであってもよ
い。さらに、これらの塩基配列の置換に加え、他の１つ
以上の塩基が任意の塩基に置換されているものであって
もよい。

【００３１】上記１９番目から２１番目の塩基配列ＣＧ
ＧはＡｒｇをコードする塩基配列であるが、この塩基配
列は、好ましくは、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、
Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａのいずれかをコードするような
任意の塩基配列に置換されていることがよい。上記４３
番目から４５番目の塩基配列ＣＡＧはＧｌｎをコードす
る塩基配列であるが、この塩基配列は、好ましくはＬｙ
ｓもしくはＡｒｇをコードするような任意の塩基配列に
置換される事がよい。また、上記１２４番目から１２６
番目の塩基配列ＴＡＣはＴｙｒをコードする塩基配列で
あるが、この塩基配列は、ＧｌｕもしくはＡｓｐをコー
ドするような任意の塩基配列に置換される事が好まし
い。

【００３２】本発明の第２の態様の新規ＤＮＡは、より
好ましくは、前記式２において、少なくとも下記（１）
ないし（１１）より選ばれるいずれか１つ以上の置換が
生じてなる塩基配列を少なくともその一部として有する
事が好ましい。 （１）５’末端側より数えて４３から４５番目の塩基配
列ＣＡＧを、ＡＡＧをコードする塩基配列に置換。 （２）５’末端側より数えて４３から４５番目の塩基配
列ＣＡＧを、ＣＧＴをコードする塩基配列に置換。 （３）５’末端側より数えて１２４から１２６番目の塩
基配列ＴＡＣを、ＧＡＡをコードする塩基配列に置換。 （４）５’末端側より数えて１２４から１２６番目の塩
基配列ＴＡＣを、ＧＡＣをコードする塩基配列に置換。 （５）５’末端側より数えて１９から２１番目の塩基配
列ＣＧＧを、ＧＡＡをコードする塩基配列に置換。 （６）５’末端側より数えて１９から２１番目の塩基配
列ＣＧＧを、ＣＡＧをコードする塩基配列に置換。 （７）５’末端側より数えて１９から２１番目の塩基配
列ＣＧＧを、ＧＡＴをコードする塩基配列に置換。 （８）５’末端側より数えて１９から２１番目の塩基配
列ＣＧＧを、ＣＴＧをコードする塩基配列に置換。 （９）５’末端側より数えて１９から２１番目の塩基配
列ＣＧＧを、ＡＡＣをコードする塩基配列に置換。 （10）５’末端側より数えて１９から２１番目の塩基配
列ＣＧＧを、ＡＧＣをコードする塩基配列に置換。 （11）５’末端側より数えて１９から２１番目の塩基配
列ＣＧＧを、ＧＣＧをコードする塩基配列に置換。

【００３３】本発明のＤＮＡは、前記式２の塩基配列中
の任意の１つ以上の塩基に置換が生じてなる塩基配列に
加え、その５’末端、３’末端もしくはその両方に任意
の１つ以上の塩基が追加された塩基配列を、少なくとも
その一部として有するＤＮＡであってもよい。最終的に
得られたＤＮＡが、本発明第１の態様のポリペプチドを
コードする塩基配列を有する限りにおいて、追加される
塩基の種類および数は、いかなるものであってもよい。
例えば、開始コドン、プロモーター、リボゾーム結合部
位、シグナルペプチドをコードする配列が５’末端に追
加されていてもよく、また、終止コドンが３’末端に追
加されていてもよい。さらに、適当な制限酵素により認
識される配列が５’末端および／または３’末端に追加
されていてもよく、また、本発明第１の態様の新規ポリ
ペプチドを他のポリペプチドとの融合蛋白質として産生
させること等を目的として５’末端および／または３’
末端に他のポリペプチドをコードする塩基配列が追加さ
れていてもよい。５’末端に追加される塩基配列として
好ましい配列は、下記（１）ないし（５）に記載の塩基
配列である。５’末端に追加される塩基配列の好ましい
例は、本発明第１の態様のポリペプチドの説明の欄で、
「Ｎ末端に追加される好ましいアミノ酸配列」として示
したアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列に置いて１つ
以上のアミノ酸の欠矢や置換が生じたアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列である。当該塩基配列はこれらのアミ
ノ酸配列をコードするものであればいかなる塩基配列で
もよいが、具体的には下記（１）ないし（５）より選ば
れるいずれかの塩基配列が好ましい。

【００３４】（１） GAC GAC GCC GCC （２） ACC GTC GCC GCC （３） GTC GCC GCC （４） GCC GCC （５） GCC

【００３５】また、３’末端に追加される塩基配列とし
て好ましい例は、本発明第１の態様のポリペプチドの説
明の欄で、「Ｃ末端に追加される好ましいアミノ酸配
列」として示したアミノ酸配列、もしくは該アミノ酸配
列において１つ以上のアミノ酸の欠失や置換が生じたア
ミノ酸配列をコードする塩基配列である。当該塩基配列
は、これらのアミノ酸配列をコードするものであればい
かなる塩基配列であってもよいが、具体的には下記
（１）ないし（１５）より選ばれるいずれかの塩基配列
が好ましい。

【００３６】（１） GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT GA
G GAG CTG CTG CGC TTC TCC AAC （２） GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT GAG GAG CTG CT
G CGC TTC TCC （３） GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT GAG GAG CTG CT
G CGC TTC （４） GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT GAG GAG CTG CT
G CGC （５） GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT GAG GAG CTG CT
G （６） GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT GAG GAG CTG （７） GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT GAG GAG （８） GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT GAG （９） GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT （10） GGT GTC CCT GGT GAT GGT （11） GGT GTC CCT GGT GAT （12） GGT GTC CCT GGT （13） GGT GTC CCT （14） GGT GTC （15） GGT

【００３７】もちろん、これらの好ましい配列は、５’
未満のみに追加されても３’未満のみに追加されても、
５’末端と３’末端の両方に塚されてもよい。なお、配
列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１
５、１７、１９、２１、２３、２４、２５および２７、
３２、３３、３４に本発明第２の態様の新規ＤＮＡのよ
り好ましい塩基配列を示した。

【００３８】本発明の新規ＤＮＡは、いかなる方法で得
られたものであってもよい。例えば、化学的に合成され
たものであってもよく、また、組換えＤＮＡの技術によ
って調製されたものであってもよい。本発明の新規ＤＮ
Ａを化学合成するには、例えば、次のように行なう。す
なわち、所望の塩基配列を適当な断片に分割して設計
し、それらに相当するオリゴマーを全自動ＤＮＡ化学合
成機（例えば、３９４型、アプライドバイオシステムズ
社製）を用いて化学合成する。必要があれば、Ｔ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼを用いて得られたＤＮＡオリゴマ
ーの５’末端をリン酸化処理した後、アニーリングさせ
る。ついで、必要があれば、アニーリングさせた各断片
をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた後、適当なベ
クターにクローン化する。一方、本発明の新規ＤＮＡを
組換えＤＮＡ技術を用いて作製するには、例えば、適当
なｃＤＮＡライブラリー、染色体ＤＮＡライブラリーま
たは前記式１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを材料
に、部位特異的突然変異誘発(Site-directed mutagenes
is) 法（例えばKramer. W 等、Nucleic Acid Res. 、１
２巻、９４４１ー９４５６頁、１９８４年あるいはKunk
el, T.A.等、Methods in Enzymology 、１５４巻、３６
７ー３８２頁、１９８７年参照）やポリメラーゼチェイ
ンリアクション(Polymerase Chain Reaction、ＰＣＲ）
法（例えばPCR Protocols, aguide to methods and app
lications, Michakl A.I 等編、１９９０年、Academic
Press）等の公知の方法で、塩基配列の改変とＤＮＡの
増幅を行えばよい。ここで用いるＤＮＡライブラリー
は、市販のｃＤＮＡライブラリー、染色体ＤＮＡライブ
ラリー等から適当なものを選択すればよい。また、公知
の方法（例えばMolecular Cloning 、a laboratory man
ual 、T.Maniatis等編、Cold SpringHarbor Laboratory
、1982年）に準じて、適当な組織あるいは細胞から、
ｃＤＮＡライブラリーまたは染色体ライブラリーを作成
して、使用してもよい。また、前記式１のアミノ酸配列
をコードするＤＮＡは、化学合成されたものであって
も、ハイブリダーゼーション法（例えば、Wallace R.
B. 等、Nucleic Acid Res.、９巻、８７９−８９４頁、
１９８１年参照）等の公知の組換えＤＮＡの技術を適宜
使用して、適当なＤＮＡライブラリーから得られたもの
であってもよい。

【００３９】本発明の新規ＤＮＡの開示により、それに
相補的配列を有するＤＮＡやＲＮＡを得ることもでき
る。本発明の新規ＤＮＡには、これら相補的配列を有す
るＤＮＡやＲＮＡと結合していてもよい。

【００４０】本発明第３の態様は、本発明第２の態様の
新規ＤＮＡを含むことを特徴とするベクターである。本
発明のベクターは、本発明の第２の態様のＤＮＡととも
に、必要ならば、適当なプロモーター、リボゾーム結合
部位、シグナルペプチドをコードする配列、選択マーカ
ーとなる配列、遺伝子のコピー数の増幅を目的として使
用される配列等の塩基配列を含むものであってもよい。
また、本発明のベクターは、いかなる目的に使用される
ベクターであってもよい。例えば発現ベクターとして使
用されるものであっても、クローニングベクターとして
使用されるものであってもよい。発現に使用されるベク
ターは、通常、プロモーターや任意のリボソーム結合部
位等発現に必要な配列を有しており、これら発現に必要
な配列は、当該ベクターで形質転換させる宿主細胞で機
能し得る配列が使用される。また、ポリペプチドを発現
させ、形質転換体外に分泌させる事を目的とする場合に
は通常、発現に必要な塩基配列の他に、シグナルペプチ
ドをコードする塩基配列を有するベクターが使用され
る。従って、本発明第３の態様のベクターを発現様ベク
ターとして使用する場合には、本発明第２の態様のＤＮ
Ａに加えて、これら発現に必要な塩基配列、また、必要
があれば、シグナルペプチドをコードする塩基配列をも
併せ持つベクターがよい。

【００４１】本発明第３の態様のベクターを得るには、
市販もしくは公知の適当なベクターに公知方法（例えば
Molecular Cloning, a laboratory manual, T. Maniati
s 等編、Cold Spring Harbor Laboratory, 1982)に準じ
て本発明第２の態様のＤＮＡを組み込めばよい。本発明
第２の態様のＤＮＡを組み込むためのベクターの由来
は、特に限定されず、ウイルスベクター、プラスミドベ
クター、ファージベクター等より適宜選んで使用すれば
よい。このようなベクターの例としては、ｐＵＣ１１
８、ｐＢＲ３２２、ｐＥＦＮ−ＢＯＳ、λｇｔ１０、ｐ
ＫＫ２２３−３、ＹＡＣ、バキュロウィルスベクター等
がある。必要があれば、リボゾーム結合部位や選択マー
カーとなる配列等、所望の塩基配列を、化学合成し、本
発明第２の態様のＤＮＡとともに組み込んでもよい。も
しくは、これら所望のベクターを予め含有する市販のベ
クターを選択し、これに本発明第２の態様のＤＮＡを組
み込んでもよい。本発明のベクターであってより好まし
いものは、プラスミドベクターであって、少なくともト
リプトファンプロモーター、カナマイシン耐性遺伝子も
しくはアンピシリン耐性遺伝子、本発明第２の態様のＤ
ＮＡを有するベクターである。

【００４２】本発明第４の態様は、本発明第２の態様の
新規ＤＮＡによって形質転換された形質転換体である。
本発明第４の態様の形質転換体は、本発明第１の態様の
新規ポリペプチドを産生するものが好ましい。当該形質
転換体は、産生された新規ポリペプチドを体内に蓄積す
るものであっても、体外に分泌する形質転換体であって
もよい。

【００４３】本発明第４の態様の形質転換体は、塩化カ
ルシウム法、リン酸カルシウム−ＤＮＡ複合体を用いる
方法、マイクロインジェクション法、電気パルスによる
穿孔法等の公知の方法によって、適当な宿主細胞に本発
明第２の態様の新規ＤＮＡを導入することにより、作成
することができる。なお、ここで用いる本発明第２の態
様の新規ＤＮＡは、本発明第１の態様の新規ポリペプチ
ドをコードする塩基配列に加え、プロモーターやリボゾ
ーム結合部位等、本発明第１の態様の新規ポリペプチド
の発現に必要な塩基配列を有するものが好ましい。必要
があれば、これら発現に必要な塩基配列に加えシグナル
ペプチドをコードする塩基配列をも有していてもよい。
上記プロモーター、リボゾーム結合部位、シグナルペプ
チドをコードする塩基配列等は、使用する宿主内で機能
する配列であればいかなるものであってもよい。

【００４４】本発明第２の態様の新規ＤＮＡを導入する
宿主細胞は、本発明第１の態様の新規ポリペプチドの発
現に適した細胞であれば、ＨｅＬａ細胞、Ｎａｍａｌｗ
ａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、酵母、ＳＦ細胞等に
代表される真核生物細胞であっても、また、大腸菌、枯
草菌等に代表される原核生物細胞であってもよい。これ
らの細胞から適当な細胞を選択し、宿主細胞として使用
すればよい。

【００４５】本発明第５の態様は、本発明第３の態様の
ベクターによって形質転換された形質転換体である。本
発明の形質転換体は、本発明の新規ポリペプチドを産生
するものが好ましい。当該形質転換体は、産生された新
規ポリペプチドを、体内に蓄積するものであっても、体
外に分泌するものであってもよい。本発明第５の態様の
形質転換体は、塩化カルシウム法、塩化ルビジウム法、
ハナハン(Hanahan) の方法（Hanahan, D著、Techniques
for Transformation of E, coli. In: DNA cloning, v
ol 1, Glover, D. M. (ed.),１０９−１３６頁、IRL Pr
ess 、１９８５年）等の公知方法に従い、本発明第３の
態様のベクターで適当な宿主を形質転換することにより
得られる。本発明第３の態様のベクターを導入する宿主
細胞は、本発明第１の態様の新規ポリペプチドの発現に
適した細胞であれば、ＨｅＬａ細胞、Ｎａｍａｌｗａ細
胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、酵母、ＳＦ細胞等に代表
される真核生物細胞であっても、また、大腸菌、枯草菌
等に代表される原核生物細胞であってもよい。

【００４６】周知のように、宿主細胞とベクターとは、
互いに機能し合うので、それを考慮し、ベクターの由
来、ベクター中の発現に必要な配列、宿主細胞を本発明
第１の態様の新規ポリペプチドを発現しうるように組合
わせて用い、本発明の形質転換体を得ることが好まし
い。

【００４７】発現用ベクタ−と宿主細胞の組み合わせの
具体的例を挙げると、シミアンウイルス４０（ＳＶ４
０）の初期プロモーターを含有する発現用ベクターとＣ
ＯＳ−７細胞の組み合わせ、プラスミドｐＢＲ３２２由
来であってトリプトファンプロモーターとトリプトファ
ンＳＤ配列をコ−ドする塩基配列を含有する発現用ベク
ターと大腸菌ＨＢ１０１株との組み合わせ等がある。

【００４８】なお、本発明者等は、後に実施例で詳述す
る本発明第３の態様のベクターにて形質転換された、大
腸菌ＪＥ５５０５株を、茨城県筑波郡谷田部町東１丁目
１番３号にある通産省工業技術院微生物工業技術研究
所、特許微生物寄託センターに寄託している。以下に微
生物を識別するための名称と寄託番号を示す。 寄託日 寄託番号 微生物の表示 平成02年09月11日 微工研菌寄第11726 号 大腸菌JE5505(pM552) （FERM P-11726） 平成03年09月10日 微工研条寄第3561号 （原寄託より移管） （FERM BP-3561） 平成03年07月16日 微工研菌寄第12357 号 大腸菌JE5505(pM575B) （FERM P-12357） 平成03年10月17日 微工研条寄第3613号 （原寄託より移管） （FERM BP-3613） 平成03年07月16日 微工研菌寄第12358 号 大腸菌JE5505(pM576) （FERM P-12358） 平成03年10月17日 微工研条寄第3614号 （原寄託より移管） （FERM BP-3614） 平成04年05月01日 微工研菌寄第12945 号 大腸菌JE5505(pM735) （FERM P-12945） 平成04年05月01日 微工研菌寄第12946 号 大腸菌JE5505(pM736) （FERM P-12946） 平成04年10月21日 微工研条寄第4041号 大腸菌JE5505(pM741) （FERM BP-4041）

【００４９】本発明第６の態様および第７の態様は、い
ずれも、組換えＤＮＡ技術を使用した、本発明第１の態
様の新規ポリペプチドの製造方法である。まず、本発明
第６の態様について説明する。本発明第６の態様の製造
方法は、下記ａ）〜ｃ）の工程を行なうことを特徴とす
る、本発明第１の態様の新規ポリペプチドの製造方法で
ある。 ａ）本発明第１の態様の新規ポリペプチドをコードする
塩基配列を有するＤＮＡを得る。 ｂ）ａ）で得たＤＮＡで宿主細胞を形質転換させて形質
転換体を得る。 ｃ）ｂ）で得た形質転換体を培養して本発明第１の態様
のポリペプチドを産生させ、当該ポリペプチドを培養混
合物から回収する。

【００５０】上記ａ）の、本発明第１の態様の新規ポリ
ペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡとは、好
ましくは本発明第２の態様のＤＮＡである。なかでも、
本発明第１の態様の新規ポリペプチドをコードする塩基
配列に加えて、発現に必要な塩基配列を、また、必要が
あれば、それらに加え、シグナルペプチドをコードする
塩基配列を有するＤＮＡが好ましい。上記ｂ）の形質転
換体は、好ましくは、本発明第４の態様の形質転換体で
ある。当該形質転換体の作製方法は、公知の方法に従え
ば良く、その詳細は本発明第４の態様で述べたとおりで
ある。上記ｃ）の工程では、ｂ）で得られた形質転換体
を使用する。当該形質転換体の培養は、微生物あるいは
動物細胞を培養するのに用いられる一般的な方法、すな
わち、「生物化学工学」（合葉修一等著、１９７６年、
東京大学出版会）あるいは「組織培養」（中井準之助等
編、１９７６年、朝倉書店）等に記載された方法に準じ
て行なえばよい。続いて、当該形質転換体の培養混合物
から、形質転換体によって産生された本発明第１の態様
のポリペプチドを回収する。なお、産生されたポリペプ
チドが形質転換体の体外に分泌されない場合は当該形質
転換体から、また、分泌される場合はその培養上清中か
ら単離することが好ましい。本発明第１の態様の新規ポ
リペプチドを含む培養混合物からの当該新規ポリペプチ
ドの精製、回収は、通常、ポリペプチドの精製のために
用いられている手段、例えば、「生化学実験講座１タン
パク質の化学」（日本生化学会編、１９７６年、東京化
学同人）等の多くの文献や成書に記載された方法を参考
にして実施すればよい。本発明のポリペプチドが、形質
転換体内でインクルージョンボディ（inclusion body
）となっている場合には、精製の際に、可溶化、デネ
イチャーおよびリフォールディングを行うのが好ましい
（例えば、Thomas E. Creighton, J. Mol. Biol.、８７
巻、５６３−５７７頁、１９７４年）。ポリペプチドの
精製法の一例を挙げると、塩析法、限外濾過法、等電点
沈澱法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、
疎水性クロマトグラフィーや抗体クロマトグラフィー等
の各種アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフ
ォ−カシング法、吸着クロマトグラフィーおよび逆相ク
ロマトグラフィー等があるので、これらの中から、本発
明第１の態様の新規ポリペプチドを得ることが好適な方
法を適宜選択し、必要により、ＨＰＬＣシステム等を使
用して適当な順序で行なえばよい。

【００５１】次に、本発明第７の態様の製造方法を説明
する。本発明第７の態様の製造方法は、下記ａ）〜ｄ）
の工程を行なうことを特徴とする本発明第１の態様の新
規ポリペプチドの製造方法である。 ａ）本発明第１の態様の新規ポリペプチドをコードする
塩基配列を有するＤＮＡを得る。 ｂ）ａ）で得たＤＮＡを含むベクターを得る。 ｃ）ｂ）で得たベクターで宿主細胞を形質転換させて形
質転換体を得る。 ｄ）ｃ）で得た形質転換体を培養して本発明第１の態様
のポリペプチドを産生させ、当該ポリペプチドを培養混
合物から回収する。

【００５２】上記ａ）の、本発明第１の態様の新規ポリ
ペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡとは、好
ましくは、本発明第２の態様のＤＮＡである。上記ｂ）
のベクターとは、好ましくは、本発明第３の態様のベク
ターである。なかでも、本発明第１の態様のポリペプチ
ドをコードする塩基配列に加えて、発現に必要な塩基配
列、また、必要があれば、それらに加え、シグナルペプ
チドをコードする塩基配列を有するベクターが好まし
い。当該ベクターの作製は、公知方法に従って行えば良
く、その詳細は、本発明第３の態様で説明した通りであ
る。上記ｃ）の形質転換体は、好ましくは、本発明第５
の態様の形質転換体である当該形質転換体の作成は、公
知の方法に従って行えば良く、その詳細は、本発明第五
の態様で説明した通りである。上記ｄ）の工程では、
ｃ）で得られた形質転換体を使用する。当該形質転換体
の培養、および培養混合物からの本発明の新規ポリペプ
チドの回収、精製方法は、本発明第６の態様で説明した
通りである。

【００５３】以上が、本発明第６の態様および第７の態
様のポリペプチドの製造方法であるが、これらの方法を
実施するに際し、本発明第１の態様の新規ポリペプチド
をコードする塩基配列を有するＤＮＡとして、本発明第
１の態様のポリペプチドをコードする塩基配列と、他の
ポリペプチド（例えば大腸菌βガラクトシダーゼ）もし
くは、その一部をコードする塩基配列とが融合した塩基
配列を有するＤＮＡを使用しても良い。このような場
合、当該ＤＮＡもしくはそれを含むベクターで形質転換
された形質転換体によって産生されるポリペプチドは、
本発明の新規ポリペプチドと他のポリペプチド（例えば
大腸菌βガラクトシダーゼ）との融合ポリペプチドとな
る。その場合は、当該融合ポリペプチドを回収した後、
適当な化学物質や酵素等で処理して他のポリペプチド部
分を切断、除去し、必要があれば、さらに精製を行って
本発明第１の態様の新規ポリペプチドを得ることも可能
である。

【００５４】次に、本発明第８の態様の医薬組成物につ
いて説明する。本発明が提供する医薬組成物は、本発明
第１の態様の新規ポリペプチドを有効成分として含有す
る。含有されるポリペプチドは、本発明第１の態様の新
規ポリペチドであれば、一種類であっても、複数種類で
あってもよい。本発明第８の態様の医薬組成物は、本発
明第１の態様の新規ポリペプチド（例えば、凍結乾燥や
除菌濾過等の製剤学的に必要な工程で処理されたもの）
のみで構成されていても、充分医薬品としての効果を医
療の分野に提供することができるが、上記のポリペプチ
ドに加えて、製剤学的に許容され得る量で製剤学的に許
容されうる補助成分を含んでいてもよい。本発明の医薬
組成物中に含有され得る補助成分とは、基剤、安定化
剤、防腐剤、保存剤、乳化剤、懸濁化剤、溶解剤、溶解
補助剤、滑沢剤、矯味剤、着色剤、芳香剤、無痛化剤、
賦形剤、結合剤、粘稠剤、緩衝剤等のことであり、具体
的には、炭酸カルシウム、乳糖、庶糖、ソルビット、マ
ンニトール、デンプン、アミロペクチン、セルロース誘
導体、ゼラチン、カカオ脂、注射用蒸留水、塩化ナトリ
ウム水溶液、リンゲル溶液、グルコース溶液、ヒト血清
アルブミン（ＨＳＡ）等である。なかでもゼラチン、ア
ルブミンは、蛋白質の安定化剤として有用である。本発
明の医薬組成物に使用する補助成分の選択に際しては、
医薬品添加物一覧表（財団法人東京医薬品工業協会薬事
法規委員会および大阪医薬品協会薬事法規研究委員会発
行）を参考にすることができ、医薬組成物の薬剤形態等
に応じて、適宜決定すればよい。

【００５５】本発明の医薬組成物の剤型は、使用方法に
応じた形態であれば特に限定されない。一般には、医薬
組成物の剤型は、注射剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、顆
粒剤、坐剤、溶液、懸濁液、乳濁液、散剤、軟膏、クリ
ーム、ゲル、パップ剤、ローション等があり、本発明の
医薬組成物はその何れの形態を取ることも可能である。
本発明の医薬組成物の投与量は、有効成分含有量、治療
を受ける患者の状態、年齢、性別、体重等に応じ、適宜
選択される。その投与量の好ましい一例は、有効成分量
で、０．１ｍｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇであり、より好ま
しくは、０．２ｍｇ〜５０ｍｇ／ｋｇである。さらに好
ましくは０．２mg〜２０mg/kg がよい。また、本発明の
医薬組成物は、患者の状態に応じて、経口投与、筋肉内
投与、腹腔内投与、皮内投与、皮下投与、静脈内投与、
動脈内投与、直腸内投与、膣内投与、さらにはエアゾー
ルとして気道吸入する、口腔内で溶解させる、経皮的に
吸収させる、経粘膜的に吸収させる等、様々な投与方法
にて使用され得るが、静脈内に投与する方法にて使用さ
れることが好ましい。

【００５６】本発明の医薬組成物は、好ましくは侵襲、
多臓器不全、ショック、膵炎、播種性血管内凝固症候
群、虚血性心疾患、腎炎、肝硬変、血行再建術時の再閉
塞、血管透過性の昂進による浮腫、成人呼吸困難症候
群、慢性関節リウマチ、関節炎、アレルギー等の疾患の
予防および／または治療に使用されるのがよい。また、
本発明の医薬組成物は、特定の疾患に限らず、血液凝固
阻害剤として使用されることも好ましく、人体に直接投
与される他にも、人口血管、人口臓器、カテーテル等の
医療用器材の表面に、架橋剤等を用いて、結合、吸着さ
せ、血液凝固を防ぐ目的で使用してもよい。

【００５７】次に、本発明第９の態様を説明する。本発
明第９の態様のプロテアーゼ阻害方法は、本発明第１の
態様の新規ポリペプチドを用いることを特徴とするプロ
テアーゼ阻害方法である。本発明のプロテアーゼ阻害方
法は、具体的には本発明第１の態様の新規ポリペプチド
を酵素と反応させることにより、プロテアーゼの活性を
阻害する方法である。

【００５８】本発明の酵素阻害方法で、阻害の対象とな
るプロテアーゼは１種のみであっても、複数種類であっ
てもよい。当該阻害の対象となるプロテアーゼは本発明
第１の態様の新規ポリペプチドが阻害し得るプロテアー
ゼであれば、いかなるプロテアーゼであってもよい。し
かしながら当該阻害の対象となるプロテアーゼは、好ま
しくは、少なくともトリプシンＦＸａエラスターゼのい
ずれか１つ以上であるのがよい。

【００５９】当該方法は、プロテアーゼと本発明第１の
態様の新規ポリペプチドを適当な条件下、例えば、適当
な温度、適当なｐＨ、適当な時間にて反応させることに
より、プロテアーゼの活性を阻害する方法であって、反
応は、試験管内等のin vitroで行なっても、動物体内
（in vivo 、ex vivo)で行なってもよい。また、必要に
応じて本発明第１の態様のポリペプチドの他に、他の物
質や薬剤を加えて反応を行ってもよい。当該プロテアー
ゼ阻害方法で用いる新規ポリペプチドは、補助成分等を
含む組成物の形態でもよい。

【００６０】

【実施例】以下に実施例をもって本発明を一層具体的に
説明するが、これらは一例として示すものであり、本発
明はこれらによって、何等、限定されるものではない。
なお、以下の記載において用いる略号は、当該分野にお
ける慣用略号に基づくものである。また、実施例中の諸
操作は、下記の雑誌、成書を参考として実施した。

【００６１】１．ラボマニュアル遺伝子工学、村松正實
著、1989年、丸善株式会社 ２．遺伝子操作実験法、高木康敬編著、１９８０年、講
談社 ３．遺伝子操作マニュアル、高木康敬編著、１９８２
年、講談社 ４．Molecular Cloning, a laboratory manual、T. Man
iatis 等編、１９８２年、Cold Spring Harbor Laborat
ory ５．Methods in Enzymology 、６５巻、L. Grossman 等
編、１９８０年、Academic Press ６．Methods in Enzymology 、６８巻、R. Wu 編、１９
７９年、Academic Press ７．PCR Protocols 、a guide to methods and applica
tions 、Michadel A. I 等編、１９９０年、Academic P
ress ８．Molecular Cloning, a laboratory manual、Second
editionT. Maniatis 等編、１９８９年、Cold Spring
Harbor Laboratory

【００６２】実施例１．プラスミドｐＭ４６９の調製 プラスミドｐＭ４６３を用いて、実施例２で発現用ベク
ターとして用いるプラスミドｐＭ４６９を以下の方法で
調製した。なお、プラスミドｐＭ４６３は、プラスミド
ｐＢＲ３２２の誘導体であり、大腸菌内にて複製するた
めの配列、アンピシリン耐性遺伝子、トリプトファンプ
ロモーター、アルカリフォスファターゼのシグナルペプ
チドをコードする塩基配列およびヒト膵分泌性トリプシ
ンインヒビター（以下、ＰＳＴＩと略す）をコードする
塩基配列を有するプラスミドである（Kanamori T. 等、
Gene 、６６巻、２９５−３００頁、１９８８年）。プラ
スミドｐＭ４６３を制限酵素ＨｉｎｄIII およびＮｒｕ
Ｉを用いて二重消化し、得られたＤＮＡ断片の混合物を
０．７％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動に
て分離されたサイズ約３．４ｋｂのＤＮＡ断片をジエチ
ルアミノエチルセルロ−ス紙（以後、ＤＥＡＥセルロー
ス紙と略す）に吸着させた後、高濃度塩溶液（２ＭＮａ
Ｃｌ／１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）／１ｍ
ＭＥＤＴＡ）を用いて抽出し、サイズ約３．４ｋｂのＤ
ＮＡ断片を回収した。

【００６３】一方、ＳＤ配列、大腸菌アルカリフォスフ
ァターゼシグナルペプチドをコードする塩基配列および
ＰＳＴＩのＮ末端側のアミノ酸配列の一部をコードする
塩基配列からなるリンカーを６つの断片に分割して設計
し、各断片を化学合成機（３８１Ａ、アプライドバイオ
システムズ社製）を用いて合成した（図１）。ＡＴＰの
存在下に、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造株式
会社）を用いて、これら６つのオリゴヌクレオチドのう
ちＳ３４、Ｓ３５、Ｓ１８およびＳ１９の５’末端をリ
ン酸化した。Ｓ３３とリン酸化Ｓ３４、リン酸化Ｓ３５
とリン酸化Ｓ１８、およびリン酸化Ｓ１９とＳ２０を、
おのおのアニーリングさせた後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
（宝酒造株式会社製）を用いてライゲーションした。こ
れを８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、サイ
ズ約１００ｂｐのＤＮＡ断片（リンカー１）を分離、抽
出し、フェノール処理／エタノール沈澱にて精製した。
得られたサイズ約１００ｂｐのＤＮＡ断片と前述のサイ
ズ約３．４ｋｂのＤＮＡ断片とをライゲーションした。
これで大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換させ、所望の形質
転換体としてアンピシリン耐性コロニーを分離した。得
られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを分離し、プラ
スミドｐＭ４６８と命名した（図２参照）。

【００６４】プラスミドｐＭ４６８を、制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩおよびＤｒａＩで二重消化し、前述の方法と同様
に、ＤＥＡＥセルロース紙を用いてサイズ約２．４ｋｂ
のＤＮＡ断片を分離、回収した。一方、カナマイシン耐
性遺伝子（Ｋｍ^r ）を有するプラスミドｐＫＣ７（Ngar
ajarao R. 等、Gene、 ７巻、７９−８２頁、１９７９
年）を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩで二重消化
し、カナマイシン耐性遺伝子を含むサイズ約１．４ｋｂ
のＤＮＡ断片を調製した。これと前述のサイズ約２．４
ｋｂのＤＮＡ断片とをライゲーションした。これで大腸
菌ＨＢ１０１株を形質転換させ、所望の形質転換体とし
て、カナマイシン耐性コロニーを分離した。得られた形
質転換体からプラスミドＤＮＡを分離し、プラスミドｐ
Ｍ４６９と命名した（図３参照）。

【００６５】実施例２．ポリペプチドＹ４６Ｅの製造 前記式１のＮ末端側より数えて４２番目のＴｙｒがＧｌ
ｕに置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、Ｙ
４６Ｅを以下の方法で製造した。 （１）ＤＮＡのクローニング プラスミドｐＭ５５２（特願平３−３２５２２０号公報
参照）を用いて、部位特異的突然変異誘発法(Site-dire
cted mutagenesis) （Kunkel T. A.等、Methods in Enz
ymology 、１５４巻、３６７頁、１９８７年参照）によ
り、Ｙ４６ＥをコードするＤＮＡを以下の方法で調製し
た。なお、プラスミドｐＭ５５２は、下記式３のアミノ
酸配列で示されるポリペプチドＴＮ７０をコードする塩
基配列、すなわち、下記式４の塩基配列で示されるＤＮ
Ａ（ＴＮ７０ ＤＮＡ）を、プラスミドｐＭ４６９に組
み込んで構築したプラスミドであり、トリプトファンプ
ロモーター、アルカリフォスファターゼシグナルペプチ
ドをコードする塩基配列およびカナマイシン耐性遺伝子
を有するプラスミドである（図４参照）。

【００６６】 式３ Thr Val Ala Ala Cys Asn Leu Pro Ile Val Arg Gly Pro Cys Arg Ala Phe Ile Gln Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu Phe Pro Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Tyr Ser Glu Lys Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu Leu Leu Arg Phe Ser Asn

【００６７】 式４ ACC GTC GCC GCC TGC AAT CTC CCC ATA GTC CGG GGC CCC TGC CGA GCC TTC ATC CAG CTC TGG GCA TTT GAT GCT GTC AAG GGG AAG TGC GTC CTC TTC CCC TAC GGG GGC TGC CAG GGC AAC GGG AAC AAG TTC TAC TCA GAG AAG GAG TGC AGA GAG TAC TGC GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT GAG GAG CTG CTG CGC TTC TCC AAC

【００６８】プラスミドｐＭ５５２を制限酵素Ｈｉｎｄ
III およびＢａｍＨＩで二重消化した後、１％アガロー
スゲル電気泳動に供した。前記式４に示した塩基配列を
含むサイズ約３１０ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル
より抽出し、フェノール処理／エタノール沈澱にて精製
した。一方、ファージベクターＭ１３ｍｐ１８をＨｉｎ
ｄIII およびＢａｍＨＩで二重消化した後、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ（既出）を用いて、前述のサイズ約３１０ｂｐ
のＤＮＡ断片とライゲーションした。これを大腸菌株Ｊ
Ｍ１０９にトランスフェクションして、Ｍ１３ファージ
を得た。次に、ミュータン(Mutan ^TM )-Ｋキット（宝酒
造株式会社）を用いて、その使用説明書に従って、部位
特異的突然変異の導入を行なった。すなわち、大腸菌株
ＢＷ３１３（ＨｆｒＫＬ１６ＰＯ／４５［ｌｙｓＡ（６
１−６２）］，ｄｕｔ１，ｕｎｇ１, ｔｈｉ−１，ｒｅ
ｌＡ１）を指示菌として、得られたＭ１３ファージを感
染させ、ファージプラークを形成させた。シングルプラ
ークを、ＢＷ３１３を指示菌として感染させ、２×ＹＴ
培地で３７℃で６時間培養後、ｓｓＤＮＡ（Single Str
anded DNA ）をフェノール処理／エタノール沈澱にて精
製した。一方、変異導入用に、オリゴマーＹ４６Ｅ（図
５）を、化学合成機（既出）を用いて合成し、ＯＰＣカ
ラム（アプライドバイオシステムズ社）を用いて精製し
た。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼとＡＴＰを用いて、
オリゴマーＹ４６Ｅの５’末端をリン酸化した後、上述
のｓｓＤＮＡを加えて、６５℃で、１５分間、３７℃
で、１５分間反応させてアニーリングした。更に、キッ
ト付属のＴ４ＤＮＡポリメラーゼおよびＥ．ｃｏｌｉＤ
ＮＡリガーゼを加えて２５℃で２時間反応させ、相補鎖
を合成した。ＥＤＴＡを加えて反応を停止させた後、大
腸菌株ＢＭＨ７１−１８ ｍｕｔＳ（△( ｌａｃ−ｐｒ
ｏＡＢ),ｔｈｉ, ｓｕｐＥ, ｍｕｔＳ２１５：：Ｔｎ１
０（ｔｅｔ^r ）／Ｆ’（ｔｒａＤ３６，ｐｒｏＡＢ ｌ
ａｃＩ^q ，ｌａｃＺ△Ｍ１５））にトランスフェクショ
ンし、ＪＭ１０９を指示菌として、ファージプラークを
形成させた。シングルプラークよりファージを回収し、
ＪＭ１０９を指示菌としてファージを培養した。ファー
ジ液よりｓｓＤＮＡをフェノール処理／エタノール沈澱
により精製した。ＤＮＡシークエンサー（３７０Ａ、ア
プライドバイオシステムズ社）を用いて塩基配列を決定
し、所望の変異が導入されたｓｓＤＮＡを選択した。得
られたｓｓＤＮＡを鋳型とし、以下のようにして、ＰＣ
Ｒを行なった。すなわち、センスプライマーとしてＳｃ
ａＩセンスプライマー（図６）を、アンチセンスプライ
マーとして、ＢａｍＨＩプライマー（図７）を、おのお
の化学合成機（既出）を用いて合成し、ＯＰＣカラム
（既出）を用いて精製した。前述のｓｓＤＮＡを含む溶
液１００μｌにＳｃａＩセンスプライマーおよびＢａｍ
ＨＩプライマーを加えた後、ジーンアンプキット^R （Ge
ne Amp^R PCR Reagent Kit ）（宝酒造株式会社）を用い
て、９４℃、１分間、５５℃、２分間および７２℃、３
分間を１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返し、
フェノール処理／エタノール沈澱にて本発明のＤＮＡを
精製した。

【００６９】（２）発現ベクターの構築 実施例１で得たプラスミドｐＭ４６９を制限酵素Ｓｃａ
ＩおよびＢａｍＨＩで二重消化した後、得られたＤＮＡ
断片を０．７％低融点アガロースゲル電気泳動に供し、
サイズ約３．５ｋｂのＤＮＡ断片を含んだアガロースゲ
ルを切り出し、６５℃でゲルを融解後、フェノール処理
／エタノール沈澱により目的のＤＮＡ断片を精製した。
次に、（１）で得た本発明のＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨ
Ｉで消化した後、サイズ約３．５ｋｂのＤＮＡ断片とラ
イゲーションして発現プラスミドｐＭ５７５Ｂを作成し
た（図８）。プラスミドｐＭ５７５Ｂを制限酵素Ｈｉｎ
ｄIII およびＢａｍＨＩで二重消化して、目的とするサ
イズ約３１０ｂｐのＤＮＡ断片を分離、抽出し、フェノ
ール処理／エタノール沈澱により精製した。ＨｉｎｄII
I およびＢａｍＨＩで二重消化したファージベクターＭ
１３ｍｐ１８およびファージベクターＭ１３ｍｐ１９
（宝酒造株式会社）と前述のＤＮＡ断片とをライゲーシ
ョンし、大腸菌ＪＭ１０９にトランスフェクションし
た。得られたそれぞれのプラークよりｓｓＤＮＡを調製
し、ＤＮＡシークエンサー（ＤＮＡシークエンサー３７
０Ａ、アプライドバイオシステムズ社）を用いておのお
のシークエンシングを行なった。プラスミドｐＭ５７５
Ｂの、目的とするＤＮＡを含むＨｉｎｄIII 消化部位か
らＢａｍＨＩ消化部位までの確認された塩基配列および
それに対応するアミノ酸配列を図９（配列表の配列番号
１参照）に示した。

【００７０】（３）形質転換体の作成および培養 ハナハンの方法（Hanahan, D著、Techniques for Trans
formation of E, coli. In: DNA cloning, vol 1, Glov
er, D. M. (ed.),109-136 頁、IRL Press 、1985年）に
より、（２）で得たプラスミドｐＭ５７５Ｂを用いて大
腸菌ＪＥ５５０５株を形質転換させ、大腸菌株ＪＥ５５
０５（ｐＭ５７５Ｂ）を調製した。得られた形質転換
体、大腸菌株ＪＥ５５０５（ｐＭ５７５Ｂ）をカナマイ
シン５０μｇ／ｍｌ含有Ｌ−ブロースにて３７℃、約８
時間、前々培養した後、約１００倍量の同培地に植菌
し、３７℃で終夜培養（前培養）した。その後、主培養
としてカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含む５０倍量のＭ
９ＣＡ培地に植菌し、３７℃、約１時間培養した。培地
に３β−インドールアクリル酸（和光純薬工業株式会社
製）を終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加し、さら
に１６時間培養した。得られた培養混合物を遠心分離
し、上清を回収した。０．１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブ
ミン）／０．２Ｍトリエタノールアミン−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．８）を用いて培養上清を各濃度に希釈し、実
施例１７（１）の方法に準じて、トリプシン阻害活性を
測定した。なお、プラスミドｐＭ５５２から上記式４の
塩基配列を削除したプラスミドｐＭ５５３を作成し、こ
れで形質転換させた大腸菌株ＪＥ５５０５（ｐＭ５５
３）を上述の方法と同様に培養し、得られた培養上清を
活性測定の際のコントロールとして用いた。大腸菌株Ｊ
Ｅ５５０５（ｐＭ５７５Ｂ）の培養上清には、コントロ
ールと比較して、顕著なトリプシン阻害活性が認められ
た。なお、本発明者等は大腸菌株ＪＥ５５０５（ｐＭ５
７５Ｂ）を平成０３年７月１６日付けで通産省工業技術
院微生物工業技術研究所に寄託し〔寄託番号：微工研菌
寄第１２３５７号（ＦＥＲＭＰ−１２３５７）〕、さら
に平成０３年１０月１７日付けで原寄託を国際寄託に移
管した〔寄託番号：微工研条寄第３６１３号（ＦＥＲＭ
ＢＰ−３６１３）〕。

【００７１】（４）大腸菌株ＪＥ５５０５（ｐＭ５７５
Ｂ）の培養上清からの本発明のポリペプチドの精製 （３）で得た形質転換体大腸菌株ＪＥ５５０５（ｐＭ５
７５Ｂ）の培養上清から、以下の方法で本発明の新規ポ
リペプチドを回収、精製した。 塩析 培養上清１ｌに硫酸アンモニウムを８０％飽和になるよ
うに加え、完全に溶解するまで撹拌した後、４℃、一
晩、静置した。４℃、１２０００×ｇ、３０分間遠心分
離し、得られた沈澱を蒸留水２５ｍｌに溶解した。不溶
物を遠心除去した後、上清を分画分子量１０００の限外
ろ過膜（ダイアフローメンブレンＹＭ−１、グレース
社）を用いて濃縮し、液量１ｍｌの濃縮液とした。つい
で、４℃、５８６０×ｇ、１０分間遠心分離し、上清を
回収した。

【００７２】ゲル濾過 セファデックス(Sephadex)Ｇ−５０（ファルマシア社
製）を充填したカラム（１ｃｍφ×１１５ｃｍ）をＰＢ
Ｓ^- （Phosphate Buffered Saline ）にて平衡化した
後、で得た濃縮液を添加した。ＰＢＳ^- を用いて、流
速０．２ｍｌ／分にて展開し、２ｍｌずつ分画した。各
画分の一部を採取して実施例１７（１）の方法に準じて
トリプシン阻害活性を測定し、活性画分をプールした。
分画分子量１０００の透析膜（スペクトラム社製）を用
いて、この活性画分を、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．５）に対して、４℃、一晩透析した。透析後、
の陰イオン交換クロマトグラフィーに供した。

【００７３】陰イオン交換クロマトグラフィー ２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で予め平衡化
したＭｏｎｏＱカラム（５ｍｍφ×５０ｍｍ、ファルマ
シア社製）による陰イオン交換クロマトグラフィーを、
ＦＰＬＣシステム（ファルマシア社製）を用い、以下の
ように行った。すなわち、で得た透析後の活性画分
を、ＭｏｎｏＱカラムに添加し、０−０．４ＭＮａＣｌ
／２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）／４８分間
の直線濃度勾配法にて、流速１ｍｌ／分で、溶出を行な
った。溶出液の波長２８０ｎｍにおける吸光度を指標と
して、溶出液中の蛋白質含量をモニターしながら溶出を
行ない、ピーク毎に分取した。各画分の一部を採取し
て、実施例１７（１）の方法に準じて、トリプシン阻害
活性を測定し、活性の認められた画分をの逆相クロマ
トグラフィーに供した。

【００７４】逆相クロマトグラフィー ０．０４％トリフルオロ酢酸溶液にて予め平衡化したバ
イダックＣ１８カラム（４．６ｍｍφ×２５．０ｃｍ、
ザセパレーショングループ社）による逆相クロマトグラ
フィーを、ウォーターズ６２５ＬＣシステム（ウォータ
ーズ社）を用いて以下のように行った。すなわち、で
得た活性画分を、バイダックＣ１８カラムに添加し、０
〜１００％アセトニトリル／０．０４％トリフルオロ酢
酸／３０分間の直線濃度勾配法にて流速１ｍｌ／分で溶
出を行なった。溶出液の波長２８０ｎｍにおける吸光度
を指標として、溶出液中の蛋白質含量をモニターしなが
ら溶出を行ない、ピーク毎に分取した。分取した各画分
の一部を採取し、トリプシン阻害活性を実施例１７
（１）に記載の方法に準じて測定し、活性画分を遠心濃
縮器（株式会社トミー精工製）にて減圧乾固し、精製ポ
リペプチドとした。得られた精製ポリペプチドを、
（５）のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、
（６）のアミノ酸配列分析および実施例１７の活性測定
に供した。

【００７５】（５）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動 レムリ(Laemmli) の方法（Laemmli U. K., Nature, 227
巻, 680-685 頁, 1970年）を参考にして、（４）で得ら
れた精製ポリペプチドをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（以後ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略す）に供した。
すなわち、精製ポリペプチドを１００μｌの蒸留水に溶
解した後、その一部に等容量のセプラソル（Seprasol)
II（第一化学薬品株式会社製）を添加し、１００℃、５
分間加熱処理した後、１５％ゲル（８ｃｍ×９ｃｍ、厚
さ１ｍｍ）に供し、１５ｍＡにて５０分間、ついで、３
０ｍＡにて３５分間電気泳動した。なお、分子量マーカ
ーとして、市販のキット(Electrophoresis Calibration
Kit、ファルマシア社製）を使用した。電気泳動終了
後、市販の銀染色キット（2D- 銀染色試薬・II，第一化
学株式会社製）にて染色を行ない、電気泳動像を観察し
た。その結果、単一のバンドが認められた。

【００７６】（６）アミノ酸配列の分析 （４）で得た精製ポリペプチドを５０％酢酸に溶解し、
モデル477Aプロテインシークエンシングシステム−120A
PTHアナライザー（アプライドバイオシステムズ社）を
用いてアミノ酸配列の分析を行なった。ＰＴＨアミノ酸
を270nm の紫外部吸収にて検出して、その保持時間を測
定し、予め同一の方法で分離した標準ＰＴＨアミノ酸
（アプライドバイオシステムズ社）の保持時間を基準に
してアミノ酸の同定を行なった。その結果、（４）で得
た精製ポリペプチドが、目的とするポリペプチド、Ｙ４
６Ｅであることが確認された（配列表の配列番号２参
照）。

【００７７】実施例３．ポリペプチドＱ１９Ｋの製造 （１）ＤＮＡのクローニング 前記式１のＮ末端側より数えて１５番目のGln がLys に
置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、Ｑ１９
Ｋを以下の方法により製造した。はじめに、プラスミド
ｐＭ５５２（既出）を用い、以下の方法でプラスミドｐ
Ｍ５５８を調製した。まず、化学合成にて、変異導入用
に、オリゴマーＴＶ１２ＤＤ（図１０）を得た。次に、
実施例２（１）で大腸菌ＪＭ１０９より得たＭ１３ファ
ージを用い、実施例２（１）と同様に、ミュータン^TM−
Ｋ キット（既出）を使用してｓｓＤＮＡを得、オリゴ
マーＴＶ１２ＤＤを使用して所望の変異を導入した。次
いで、所望の変異が導入されたｓｓＤＮＡを鋳型にし
て、実施例２（１）と同様にＰＣＲを行なった。なお、
センスプライマーとしては、実施例２（１）で作成した
ＳｃａＩセンスプライマーを、アンチセンスプライマー
としては、Ｍ１３プライマーＲＶ（宝酒造株式会社）を
使用した。ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで消化し、実施例２
（２）と同様の方法でプラスミドｐＭ４６９に組み込
み、プラスミドｐＭ５５８を調製した。

【００７８】プラスミドｐＭ５５８をＰＣＲ用鋳型とし
て、ランド(Landt) 等の方法(Landt, O.等、Gene, 96,
125-128, 1990 年) を参考にして、部位特異的突然変異
誘発法を２度のＰＣＲにより以下のようにして行った。
すなわち、第一次ＰＣＲ用のセンスプライマーとしてＨ
ｉｎｄIII プライマー（図１１）を、アンチセンスプラ
イマーとして、Ｑ１９Ｋプライマー（図１２）を、おの
おの化学合成にて得た。これらを用い、プラスミドｐＭ
５５８を鋳型とする第一次ＰＣＲを、ジーンアンプキッ
ト^R （既出）を用いて行った。反応は９４℃で１分間、
５５℃で２分間、７２℃で３分間を１サイクルとし、３
０サイクル繰り返した。第一次ＰＣＲ後の増幅産物の一
部を１．５％アガロースゲル電気泳動に供したところ、
目的とする、サイズ約１６０ｂｐのＤＮＡ断片が確認さ
れた。増幅産物をフェノール処理／エタノール沈殿で精
製した後、ＴＥバッファーに溶解した。これをセンスプ
ライマーとして、プラスミドｐＭ５５８を鋳型とする第
二次ＰＣＲを第一次ＰＣＲと同様に行なった。なお、ア
ンチセンスプライマーとしては、化学合成にて得たｐＢ
Ｒ ＢａｍＨＩプライマー（図１３）を使用した。第二
次ＰＣＲ後の増幅産物の一部を１．５％アガロースゲル
電気泳動に供したところ、目的とするサイズ約３５０ｂ
ｐのＤＮＡ断片が確認された。増幅産物をフェノール処
理／エタノール沈殿にて精製し、本発明のＤＮＡを得
た。

【００７９】（２）発現ベクターの構築 プラスミドｐＭ４６３（Kanamori T. 等、既出）を制限
酵素ＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩにて二重消化した
後、得られたＤＮＡ断片を０．７％低融点アガロースゲ
ル電気泳動に供し、サイズ約３．３ｋｂのＤＮＡ断片を
得た。次に、（１）で得たサイズ約３５０ｂｐの本発明
のＤＮＡを、制限酵素ＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩで
二重消化し、得られたＤＮＡ断片と、前述のサイズ約
３．３ｋｂのＤＮＡ断片とＴ４ＤＮＡリガーゼ（既出）
を用いてライゲーションし、発現用プラスミドｐＭ５７
６を作成した（図１４および図１５参照）。プラスミド
ｐＭ５７６をＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩで二重消化
した後、目的とするサイズ約３１０ｂｐの断片を抽出、
精製した。これを、ＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩで二
重消化したファージベクターＭ１３ｍｐ１８およびファ
ージベクターＭ１３ｍｐ１９（既出）とライゲーション
させ、大腸菌ＪＭ１０９にトラスフェクションした。得
られたそれぞれのプラークよりｓｓＤＮＡを調製し、Ｄ
ＮＡシークエンサ−（既出）にてシークエンシングを行
なった。プラスミドｐＭ５７６の、本発明の新規ポリペ
プチドをコードするＤＮＡを含むＨｉｎｄIII 消化部位
からＢａｍＨＩ消化部位までの確認された塩基配列、お
よび対応するアミノ酸配列を図１６に示した（配列表の
配列番号３参照）。

【００８０】（３）形質転換体の作成および培養 （２）で得たプラスミドｐＭ５７６を用いて、ハナハン
の方法により大腸菌株ＪＥ５５０５を形質転換し、大腸
菌株ＪＥ５５０５（ｐＭ５７６）を作成した。大腸菌株
ＪＥ５５０５（ｐＭ５７６）を、実施例２（３）と同様
に培養し、培養上清を回収した。ただし、培地には、カ
ナマイシンの代わりに、アンピシリンを終濃度５０μｇ
／ｍｌとなるように添加した。０．１％ＢＳＡ／０．２
Ｍトリエタノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）を
用いて、培養上清を各種濃度に希釈し、実施例１７
（１）の方法に準じて、トリプシン阻害活性を測定し
た。なお、プラスミドｐＭ５７６よりポリペプチドＱ１
９Ｋをコードする塩基配列を除去したプラスミドｐＭ４
６３Ｃを作成し、、これで形質転換させた大腸菌株ＪＥ
５５０５（ｐＭ４６３Ｃ）を上述の方法と同様に培養
し、得られた大腸菌株ＪＥ５５０５（ｐＭ４６３Ｃ）の
培養上清を、活性測定の際のコントロールとして使用し
た。大腸菌ＪＥ５５０５（ｐＭ５７６）の培養上清に
は、コントロールと比較して顕著なトリプシン阻害活性
が認められた。なお、本発明者等は、大腸菌株ＪＥ５５
０５（ｐＭ５７６）を通産省工業技術院微生物工業技術
研究所に、平成０３年７月１６日付けで寄託し〔寄託番
号：微工研菌寄第１２３５８号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２３
５８）〕、さらに平成０３年１０月１７日付けで原寄託
より国際寄託に移管した〔（寄託番号：微工研条寄第３
６１４号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３６１４）〕。

【００８１】（４）大腸菌ＪＥ５５０５（ｐＭ５７６）
の培養上清からの本発明の新規ポリペプチドの精製 実施例２（４）の方法に準じて、塩析、ゲル濾過、陰イ
オン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー
を行ない、（３）で得た培養上清から、精製ポリペプチ
ドを得た。得られた精製ポリペプチドを、以下の（５）
のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、（６）のアミノ酸配列分析および
実施例１７の活性測定に供した。

【００８２】（５）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ （４）で得た、精製ポリペプチドを、実施例２（５）の
方法で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動終了後、市販
の銀染色キット（既出）にて染色を行なった。その結
果、単一のバンドが認められた。

【００８３】（６）アミノ酸配列分析 （４）で得た精製ポリペプチドを５０％酢酸に溶解し、
実施例２（６）の方法で、アミノ酸配列分析を行った。
その結果、（４）で得た精製ポリペプチドが、目的とす
る本発明のポリペプチド、Ｑ１９Ｋであることが確認さ
れた（配列表の配列番号４参照）。

【００８４】実施例４．本発明の新規ポリペプチドＱ１
９Ｒの製造 前記式１のＮ末端側より数えて１５番目のGln がArg に
置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、Ｑ１９
Ｒを以下の方法で製造した。 （１）ＤＮＡのクローニング はじめに、プラスミドｐＭ５５２を用いて、以下のよう
にプラスミドｐＭ５９４を作成した。まず、ＡＮ６８プ
ライマー（図１７）を化学合成にて得た。これと実施例
３（１）で作製したＨｉｎｄIII センスプライマーを、
それぞれアンチセンスプライマー、センスプライマーと
して用い、上述のｐＭ５５２を鋳型とする第一次ＰＣＲ
をジーンアンプキット^R （既出）を用いて実施例３
（１）と同様に行った。第一次ＰＣＲ後の増幅産物の一
部を、１．５％アガロースゲル電気泳動に供したとこ
ろ、目的とするサイズ約１３０ｂｐのサイズの単一バン
ドが確認された。この増幅産物をフェノール処理／エタ
ノール沈澱で精製した後、ＴＥバッファーに溶解した。
次にこれをセンスプライマーとし、プラスミドｐＭ５５
２を鋳型とする第二次ＰＣＲを、第一次ＰＣＲと同様に
行った。なお、アンチセンスプライマーとしては、実施
例３（１）で作成したｐＢＲ ＢａｍＨＩプライマーを
使用した。ＰＣＲ終了後の増幅産物の一部を、１．５％
アガロースゲル電気泳動に供したところ、目的とするサ
イズ約３５０ｂｐのバンドが確認された。得られた増幅
産物をフェノール処理／エタノール沈澱で精製した後、
制限酵素ＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩで消化し、サイ
ズ約３００ｂｐのＤＮＡ断片を得、実施例３（２）と同
様の方法で、プラスミドｐＭ４６３に組み込み、プラス
ミドｐＭ５９４を作成した。

【００８５】次に、プラスミドｐＭ５９４を用いて、ラ
ンドの方法を参考にして、以下の方法で部位特異的突然
変異法を行った。すなわち、ＳａｃIIプライマー（図１
８）およびＱ１９Ｒプライマー（図１９）を化学合成に
て得た。これらをそれぞれ、センスプライマー、アンチ
センスプライマーとして使用し、前述のプラスミドｐＭ
５９４を鋳型とする第一次ＰＣＲを、（１）と同様に行
なった。第一次ＰＣＲ後の増幅産物の一部を４％アガロ
ースゲル電気泳動に供したところ、目的とするサイズ約
７０ｂｐのＤＮＡ断片が確認された。増幅産物をフェノ
ール処理／エタノール沈殿で抽出、精製した後、ＴＥバ
ッファーに溶解した。これをセンスプライマーとして、
プラスミドｐＭ５９４を鋳型とする第二次ＰＣＲを、第
一次ＰＣＲと同様に行なった。なお、アンチセンスプラ
イマーとしては、実施例３（１）で作成したｐＢＲ Ｂ
ａｍＨＩプライマーを使用した。第二次ＰＣＲ後の増幅
産物の一部を、１．５％アガロースゲル電気泳動に供し
たところ、目的とするサイズ約２６０ｂｐのＤＮＡ断片
が確認された。増幅産物をフェノール処理／エタノール
沈殿にて抽出、精製し本発明のＤＮＡを得た。

【００８６】（２）発現ベクターの構築 プラスミドｐＭ５９４を制限酵素ＳａｃII、ＢａｍＨＩ
で二重消化した後、目的とするサイズ約３．４ｋｂのＤ
ＮＡ断片を、抽出、精製した。得られたＤＮＡ断片と
（１）で得たサイズ約２６０ｂｐのＤＮＡ断片とを、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼ（既出）を使用してライゲーションさ
せた。これで大腸菌発現用プラスミドｐＭ７３５を作成
した（図２０および２１参照）。プラスミドｐＭ７３５
を制限酵素ＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩで二重消化し
たのち、目的とするサイズ約３００ｂｐの断片を、抽
出、精製した。ＤＮＡシークエンサー（既出）を使用し
て実施例２（２）の方法でシークエンシングを行った。
プラスミドｐＭ７３５の、本発明の新規ポリペプチドを
コードするＤＮＡを含むＨｉｎｄIII 消化部位からＢａ
ｍＨＩ消化部位までの確認された塩基配列および対応す
るアミノ酸配列を図２２に示した（配列表の配列番号５
参照）。

【００８７】（３）形質転換体の作成および培養 （１）で得られたプラスミドｐＭ７３５を用い、ハナハ
ンの方法で大腸菌株ＪＥ５５０５を形質転換し、大腸菌
株ＪＥ５５０５（ｐＭ７３５）を作成した。大腸菌株Ｊ
Ｅ５５０５（ｐＭ７３５）を、実施例３（３）と同様に
培養し、培養上清を回収した。０．１％ＢＳＡ／０．２
Ｍトリエタノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）で
培養上清を各濃度に希釈してサンプルとし、実施例１７
（１）の方法に準じて、トリプシン阻害活性を測定し
た。なお、実施例３（３）で作成した大腸菌株ＪＥ５５
０５（ｐＭ４６３Ｃ）の培養上清を、コントロールとし
て使用した。大腸菌株ＪＥ５５０５（ｐＭ７３５）の培
養上清には、コントロールと比較して顕著なトリプシン
阻害活性が認められた。なお、本発明者等は、大腸菌株
ＪＥ５５０５（ｐＭ７３５）を平成０４年５月１日付け
で、通産省工業技術院微生物工業技術研究所に、寄託し
ている〔寄託番号：微工研菌寄第１２９４５号（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１２９４５）〕。

【００８８】（４）大腸菌ＪＥ５５０５（ｐＭ７３５）
の培養上清からの本発明の新規ポリペプチドの精製 実施例２（４）の方法に準じて、塩析、ゲル濾過、陰イ
オン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー
を行ない、（３）で得た培養上清から、精製ポリペプチ
ドを得た。最終的に得られた精製ポリペプチドを、以下
の（５）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、（６）のアミノ酸配列分
析および実施例１７の活性測定に供した。

【００８９】（５）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ （４）で得た、精製ポリペプチドを、実施例２（５）の
方法で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動終了後、市販
の銀染色キット（既出）にて染色を行なった。その結
果、単一のバンドが認められた。

【００９０】（６）アミノ酸配列分析 （４）で得た精製ポリペプチドを５０％酢酸に溶解し
て、実施例２（６）の方法で、アミノ酸配列分析を行っ
た。その結果、（４）で得た精製ポリペプチドが、目的
とする本発明のポリペプチドＱ１９Ｒであることが確認
された（配列表の配列番号６参照）。

【００９１】実施例５．本発明のポリペプチドＱ１９Ｋ
／Ｙ４６Ｅの作成 前記式１のＮ末端側より数えて１５番目のGln がLys に
置換され、かつ４２番目のTyr がGlu に置換されたアミ
ノ酸配列を有するポリペプチド、Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｅを
以下の方法で製造した。 （１）ＤＮＡのクローニング 実施例３（１）で作成したＨｉｎｄIII センスプライマ
ーとＱ１９Ｋプライマーを用い、実施例４（１）で作成
したｐＭ５９４を鋳型とする第一次ＰＣＲをジーンアン
プキット^R （既出）を使用して、実施例３（１）と同様
に行った。第一次ＰＣＲ後の増幅産物の一部を、１．５
％アガロースゲル電気泳動に供したところ、目的とする
サイズ約１７０ｂｐのバンドが確認された。増幅産物を
フェノール処理／エタノール沈澱で精製した後、ＴＥバ
ッファーに溶解した。次に、これをセンスプライマーと
し、プラスミドｐＭ５７５Ｂを鋳型とする第二次ＰＣＲ
を、第一次ＰＣＲと同様に行った。なお、アンチセンス
プライマーとしては、実施例３（１）で作成したｐＢＲ
ＢａｍＨＩプライマーを使用した。第二次ＰＣＲ後の
増幅産物を、１．５％アガロースゲル電気泳動に供した
ところ、目的とするサイズ約３５０ｂｐのバンドが確認
された。増幅産物をフェノール処理／エタノール沈澱で
精製し、本発明のＤＮＡを得た。 （２）発現ベクターの構築 （１）で得られた本発明のＤＮＡを実施例３（２）の方
法で、プラスミドｐＭ４６３に組み込み、発現用プラス
ミドｐＭ７３６を作成した（図２３参照）。プラスミド
ｐＭ７３６を制限酵素ＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩで
二重消化したのち、目的とするサイズ約３００ｂｐの断
片を、抽出、精製した。ＤＮＡシークエンサー（既出）
を使用し、実施例２（２）の方法でシークエンシングを
行った。プラスミドｐＭ７３６の、本発明の新規ポリペ
プチドをコードするＤＮＡを含むＨｉｎｄIII 消化部位
からＢａｍＨＩ消化部位までの確認された塩基配列およ
び対応するアミノ酸配列を図２４に示した（配列表の配
列番号７参照）。

【００９２】（３）形質転換体の作成および培養 （２）で得たプラスミドｐＭ７３６を用いて大腸菌株Ｊ
Ｅ５５０５株を形質転換し、大腸菌株ＪＥ５５０５（ｐ
Ｍ７３６）を作成した。この大腸菌株ＪＥ５５０５（ｐ
Ｍ７３６）を、実施例３（３）と同様に培養し、培養上
清を回収した。０．１％ＢＳＡ／０．２Ｍトリエタノー
ルアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）で培養上清を各濃
度に希釈し、実施例１７（１）の方法に準じて、トリプ
シン阻害活性を測定した。なお、実施例３（３）で作成
した大腸菌株ＪＥ５５０５（ｐＭ４６３Ｃ）の培養上清
を、コントロールとして使用した。大腸菌株ＪＥ５５０
５（ｐＭ７３６）の培養上清には、コントロールと比較
して顕著なトリプシン阻害活性が認められた。なお、本
発明者等は大腸菌ＪＥ５５０５（ｐＭ７３６）を平成０
４年５月１日付けで、通産省工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託している〔寄託番号：微工研菌寄第１２９
４６号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２９４６）〕。

【００９３】（４）大腸菌ＪＥ５５０５（ｐＭ７３６）
の培養上清からの本発明の新規ポリペプチドの精製 実施例２（４）の方法に準じて、塩析、ゲル濾過、陰イ
オン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー
を行ない、（３）で得た培養上清から、精製ポリペプチ
ドを得た。得られた精製ポリペプチドを、以下の（５）
のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、（６）のアミノ酸配列分析および
実施例１７の活性測定に供した。

【００９４】（５）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ （４）で得た精製ポリペプチドを、実施例２（５）の方
法で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動終了後、市販の
銀染色キット（既出）にて染色を行なった。その結果、
単一のバンドが認められた。

【００９５】（６）アミノ酸配列分析 （４）で得た精製ポリペプチドを５０％酢酸に溶解し
て、実施例２（６）の方法で、アミノ酸配列分析を行っ
た。その結果、（４）で得た精製ポリペプチドが、目的
とする本発明のポリペプチド、Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｅであ
ることが確認された（配列表の配列番号８参照）。

【００９６】実施例６．本発明のポリペプチドＲ１１Ｅ
／Ｙ４６Ｅ 前記式１のＮ末端側より数えて７番目のArg がGlu に置
換され、かつ４２番目のTyr がGlu に置換されたアミノ
酸配列を有するポリペプチド、Ｒ１１Ｅ／Ｙ４６Ｅを以
下の方法で製造した。 （１）ＤＮＡのクローニング アンチセンスプライマーとしてＲ１１Ｅプライマー（図
２５）を化学合成にて得、実施例３（１）で作成したＨ
ｉｎｄIII センスプライマーとを用い、（実施例４
（１）で作成した）プラスミドｐＭ５９４を鋳型とする
第一次ＰＣＲをジーンアンプキット^R （既出）を用い、
実施例３（１）と同様に行った。第一次ＰＣＲ後の増幅
産物を、１．５％アガロースゲル電気泳動に供したとこ
ろ、目的とするサイズ約１５０ｂｐのサイズのバンドが
確認された。この増幅産物をフェノール処理／エタノー
ル沈澱で精製した後、ＴＥバッファーに溶解した。これ
をセンスプライマーとし、プラスミドｐＭ５７５Ｂを鋳
型とする第二次ＰＣＲを第一次ＰＣＲと同様に行った。
なお、アンチセンスプライマーとしては、実施例３
（１）で作成したｐＢＲ ＢａｍＨＩプライマーを使用
した。第二次ＰＣＲ後の増幅産物を、１．５％アガロー
スゲル電気泳動に供したところ、目的とするサイズ約３
５０ｂｐのバンドが確認された。この増幅産物をフェノ
ール処理／エタノール沈澱で精製し、本発明のＤＮＡを
得た。

【００９７】（２）発現ベクターの構築 （１）で得たサイズ約３５０ｂｐの本発明のＤＮＡを、
実施例３（２）と同様にして、プラスミドｐＭ４６３に
組み込み、発現用プラスミドｐＭ７２６Ｂを作成した
（図２６参照）。プラスミドｐＭ７２６Ｂを制限酵素Ｈ
ｉｎｄIII およびＢａｍＨＩで二重消化したのち、目的
とするサイズ約３００ｂｐの断片を、抽出、精製した。
ＤＮＡシークエンサー（既出）を使用し、実施例２
（２）の方法でシークエンシングを行った。プラスミド
ｐＭ７２６Ｂの、本発明の新規ポリペプチドをコードす
るＤＮＡを含むＨｉｎｄIII 消化部位からＢａｍＨＩ消
化部位までの確認された塩基配列および対応するアミノ
酸配列を図２７に示した（配列表の配列番号９参照）。

【００９８】（３）形質転換体の作成および培養 （２）で得たプラスミドｐＭ７２６Ｂを用い、ハナハン
の方法により大腸菌ＪＥ５５０５株を形質転換し、大腸
菌ＪＥ５５０５（ｐＭ７２６Ｂ）を作成した。この大腸
菌ＪＥ５５０５（ｐＭ７２６Ｂ）を、実施例３（３）と
同様に培養し、培養上清を回収した。０．１％ＢＳＡ／
０．２Ｍトリエタノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
８）で培養上清を各種濃度に希釈し、実施例１７（１）
の方法に準じて、トリプシン阻害活性を測定した。な
お、コントロールとしては、実施例３（３）で作成し
た、大腸菌株ＪＥ５５０５（ｐＭ４６３Ｃ）の培養上清
を使用した。大腸菌ＪＥ５５０５（ｐＭ７２６Ｂ）の培
養上清には、コントロールと比較して顕著なトリプシン
阻害活性が認められた。

【００９９】（４）大腸菌ＪＥ５５０５（ｐＭ７２６
Ｂ）の培養上清からの本発明の新規ポリペプチドの精製 実施例２（４）の方法に準じて、塩析、ゲル濾過、陰イ
オン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー
を行ない、（３）で得た培養上清から、本発明のポリペ
プチドを精製した。得られた精製ポリペプチドを、以下
の（５）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、（６）のアミノ酸配列分
析および実施例１７の活性測定に供した。

【０１００】（５）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ （４）で得た精製ポリペプチドを、実施例２（５）の方
法で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動終了後、市販の
銀染色キット（既出）にて染色を行なった。その結果、
単一のバンドが認められた。

【０１０１】（６）アミノ酸配列分析 （４）で得た精製ポリペプチドを５０％酢酸に溶解し
て、実施例２（６）の方法で、アミノ酸配列分析を行っ
た。その結果、（４）で得た精製ポリペプチドは、目的
とする本発明のポリペプチド、Ｒ１１Ｅ／Ｙ４６Ｅであ
ることが確認された（配列表の配列番号１０参照）。

【０１０２】実施例７．ポリペプチドＹ４６Ｅ−ＡＮの
作成 前記式１のＮ末端側より数えて４２番目のTyr がGlu に
置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、Ｙ４６
Ｅ−ＡＮを以下の方法で製造した。 （１）ＤＮＡのクローニングおよび発現ベクターの構築 実施例４（１）で作成したＳａｃIIプライマーと実施例
３（１）で得られたｐＢＲ ＢａｍＨＩプライマーとを
用い、プラスミドｐＭ５７５Ｂを鋳型とするＰＣＲを、
ジーンアンプキット^R （既出）を用いて実施例３（１）
と同様に行った。ＰＣＲ後の増幅産物の一部を１．５％
アガロースゲル電気泳動に供したところ、目的とするサ
イズ約２５０ｂｐのサイズの単一バンドが確認された。
この増幅産物をフェノール処理／エタノール沈澱で精製
後、制限酵素ＳａｃIIおよびＢａｍＨＩで消化し、サイ
ズ約２２０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。制限酵素ＳａｃII
およびＢａｍＨＩで二重消化したプラスミドｐＭ５９４
から得られたサイズ約３．４ｋｂの断片と、前述のサイ
ズ約２２０ｂｐのＤＮＡ断片とをライゲーションし、発
現用プラスミドｐＭ５７５Ｃを作成した（図２８参
照）。プラスミドｐＭ５７５Ｃを制限酵素ＨｉｎｄIII
およびＢａｍＨＩで二重消化したのち、目的とするサイ
ズ約３００ｂｐの断片を、抽出、精製した。ＤＮＡシー
クエンサー（既出）を使用し、実施例２（２）の方法で
シークエンシングを行った。プラスミドｐＭ５７５Ｃ
の、本発明の新規ポリペプチドをコードするＤＮＡを含
むＨｉｎｄIII 消化部位からＢａｍＨＩ消化部位までの
確認された塩基配列および対応するアミノ酸配列を図２
９に示した（配列表の配列番号１１参照）。

【０１０３】（２）形質転換体の作成および培養 （１）で得たプラスミドｐＭ５７５Ｃを用い、ハナハン
の方法により大腸菌株ＪＥ５５０５を形質転換し、大腸
菌株ＪＥ５５０５（ｐＭ５７５Ｃ）を作成した。この大
腸菌ＪＥ５５０５（ｐＭ５７５Ｃ）を、実施例３（３）
と同様に培養し、培養上清を回収した。０．１％ＢＳＡ
／０．２Ｍトリエタノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．８）で培養上清を各種濃度に希釈してサンプルと
し、実施例１７（１）の方法に準じて、トリプシン阻害
活性を測定した。なお、コントロールとしては、実施例
３（３）で作成した大腸菌株ＪＥ５５０５（ｐＭ４６３
Ｃ）の培養上清を、使用した。大腸菌株ＪＥ５５０５
（ｐＭ５７５Ｃ）の培養上清には、コントロールと比較
して顕著なトリプシン阻害活性が認められた。

【０１０４】（３）大腸菌ＪＥ５５０５（ｐＭ５７５
Ｃ）の培養上清からの本発明の新規ポリペプチドの精製 実施例２（４）の方法に準じて、塩析、ゲル濾過、陰イ
オン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー
を行ない、（２）で得た培養上清から、精製ポリペプチ
ドを得た。得られた精製ポリペプチドを、以下の（４）
のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、（５）のアミノ酸配列分析および
実施例１７の活性測定に供した。

【０１０５】（４）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ （３）で得た精製ポリペプチドを、実施例２（５）の方
法で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動終了後、市販の
銀染色キット（既出）にて染色を行なった。その結果、
単一のバンドが認められた。

【０１０６】（５）アミノ酸配列分析 （３）で得た精製ポリペプチドを５０％酢酸に溶解し
て、実施例２（６）の方法で、アミノ酸配列分析を行っ
た。その結果、（３）で得た精製ポリペプチドは、目的
とする本発明のポリペプチドＹ４６Ｅ−ＡＮであること
が確認された（配列表の配列番号１２参照）。

【０１０７】実施例８．ポリペプチドＱ１９Ｋ−ＡＮの
作成 前記式１のＮ末端側より数えて１５番目のGln がLys に
置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、Ｑ１９
Ｋ−ＡＮを以下の方法で製造した。（１）ＤＮＡのクロ
ーニングおよび発現ベクターの構築 実施例４（１）で作成したＳａｃIIプライマーと実施例
３（１）で作成したｐＢＲ ＢａｍＨＩプライマーを用
い、プラスミドｐＭ５７６を鋳型とする第一次ＰＣＲ
を、ジーンアンプキット^R （既出）を用い、実施例３
（１）と同様に行った。第一次ＰＣＲ後の増幅産物を、
１．５％アガロースゲル電気泳動に供したところ、目的
とするサイズ約２５０ｂｐのサイズの単一バンドが確認
された。この増幅産物をフェノール処理／エタノール沈
澱で精製後、制限酵素ＳａｃIIおよびＢａｍＨＩで二重
消化し、サイズ約２２０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。プラ
スミドｐＭ５９４を制限酵素ＳａｃIIおよびＢａｍＨＩ
で二重消化し、サイズ約３．４ｋｂのＤＮＡ断片を得
た。これと、前述のサイズ約２２０ｂｐのＤＮＡ断片と
をライゲーションし、発現用プラスミドｐＭ５７６Ｂを
作成した（図３０参照）。プラスミドｐＭ５７６Ｂを制
限酵素ＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩで二重消化したの
ち、目的のサイズ約３００ｂｐの断片を、抽出、精製し
た。ＤＮＡシークエンサー（既出）を使用し、実施例２
（２）の方法で、シークエンシングを行った。プラスミ
ドｐＭ５７６Ｂの、本発明の新規ポリペプチドをコード
するＤＮＡを含むＨｉｎｄIII 消化部位からＢａｍＨＩ
消化部位までの確認された塩基配列、および対応するア
ミノ酸配列を図３１に示した（配列表の配列番号１３参
照）。

【０１０８】（２）形質転換体の作成および培養 （１）で得られたプラスミドｐＭ５７６Ｂを用いて、ハ
ナハンの方法により大腸菌株ＪＥ５５０５を形質転換
し、大腸菌株ＪＥ５５０５（ｐＭ５７６Ｂ）を作成し
た。この大腸菌ＪＥ５５０５（ｐＭ５７６Ｂ）を、実施
例３（３）と同様に培養し、培養上清を回収した。０．
１％ＢＳＡ／０．２Ｍトリエタノールアミン−塩酸緩衝
液（ｐＨ７．８）で培養上清を各種濃度に希釈し実施例
１７（１）の方法に準じて、トリプシン阻害活性を測定
した。なお、コントロールとして、実施例３（３）で作
成した大腸菌株ＪＥ５５０５（ｐＭ４６３Ｃ）の培養上
清を、使用した。大腸菌株ＪＥ５５０５（ｐＭ５７６
Ｂ）の培養上清には、コントロールと比較して顕著なト
リプシン阻害活性が認められた。

【０１０９】（３）大腸菌株ＪＥ５５０５（ｐＭ５７６
Ｂ）の培養上清からの本発明の新規ポリペプチドの精製 実施例２（４）の方法に準じて、塩析、ゲル濾過、陰イ
オン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー
を行ない、（２）で得た培養上清から、精製ポリペプチ
ドを得た。得られた精製ポリペプチドを、以下の（４）
のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、（５）のアミノ酸配列分析および
実施例１７の活性測定に供した。

【０１１０】（４）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ （３）で得た精製ポリペプチドを、実施例２（５）の方
法で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動終了後、市販の
銀染色キット（既出）にて染色を行なった。その結果、
単一のバンドが認められた。

【０１１１】（５）アミノ酸配列分析 （３）で得た精製ポリペプチドを５０％酢酸に溶解し
て、実施例２（６）の方法で、アミノ酸配列分析を行っ
た。その結果、（３）で得た精製ポリペプチドが、目的
とする本発明のポリペプチドＱ１９Ｋ−ＡＮであること
が確認された（配列表の配列番号１４参照）。

【０１１２】実施例９．ポリペプチドＱ１９Ｒ／Ｙ４６
Ｅの調製 前記式１のＮ末端側より数えて１５番目のGln がArg に
置換され、かつ４２番目のTyr がGlu に置換されたアミ
ノ酸配列を有するポリペプチド、Ｑ１９Ｒ／Ｙ４６Ｅを
以下の方法で製造した。 （１）ＤＮＡのクローニング 実施例３（１）で作成したＨｉｎｄIII センスプライマ
ーと実施例４（１）で作成したＱ１９Ｒプライマーを用
い、実施例４（１）で作成したｐＭ５９４を鋳型とする
第一次ＰＣＲを、ジーンアンプキット^R （既出）を用
い、実施例３（１）と同様に行った。第一次ＰＣＲ後の
増幅産物の一部を、１．５％アガロースゲル電気泳動に
供したところ、目的とするサイズ約１７０ｂｐのバンド
が確認された。この増幅産物をフェノール処理／エタノ
ール沈澱で精製した後、ＴＥバッファーに溶解した。次
に、これをセンスプライマーとし、プラスミドｐＭ５７
５Ｂを鋳型とする第二次ＰＣＲを第一次ＰＣＲと同様に
行った。なお、アンチセンスプライマーとしては、実施
例３（１）で作成したｐＢＲ ＢａｍＨＩプライマーを
使用した。第二次ＰＣＲ後の増幅産物を、１．５％アガ
ロースゲル電気泳動に供したところ、目的とするサイズ
約３５０ｂｐのバンドが確認された。この増幅産物をフ
ェノール処理／エタノール沈澱で精製し、本発明ＤＮＡ
を得た。

【０１１３】（２）発現ベクターの構築 （１）で得たサイズ約３５０ｂｐの本発明のＤＮＡを実
施例３（２）の方法で、プラスミドｐＭ４６３に組み込
み、発現用プラスミドｐＭ７３７Ｂを作成した（図３２
参照）。プラスミドｐＭ７３７Ｂを制限酵素ＨｉｎｄII
I およびＢａｍＨＩで二重消化したのち、目的とするサ
イズ約３００ｂｐの断片を抽出、精製した。ＤＮＡシー
クエンサー（既出）を使用して実施例２（２）の方法で
シークエンシングを行った。プラスミドｐＭ７３７Ｂ
の、本発明の新規ポリペプチドをコードするＤＮＡを含
むＨｉｎｄIII 消化部位からＢａｍＨＩ消化部位までの
確認された塩基配列、および対応するアミノ酸配列を図
３３に示した（配列表の配列番号１５参照）。

【０１１４】（３）形質転換体の作成および培養 （１）で得たプラスミドｐＭ７３７Ｂを用いて、ハナハ
ンの方法により大腸菌株ＪＥ５５０５を形質転換し、大
腸菌株ＪＥ５５０５（ｐＭ７３７Ｂ）を作成した。大腸
菌株ＪＥ５５０５（ｐＭ７３７Ｂ）を、実施例３（３）
と同様に培養し、培養上清を回収した。０．１％ＢＳＡ
／０．２Ｍトリエタノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．８）で培養上清を各種濃度に希釈し、実施例１７
（１）の方法に準じて、トリプシン阻害活性を測定し
た。なお、コントロールとして実施例３（３）で作成し
た大腸菌ＪＥ５５０５（ｐＭ４６３Ｃ）の培養上清を、
コントロールとして使用した。大腸菌株ＪＥ５５０５
（ｐＭ７３７Ｂ）の培養上清には、コントロールと比較
して顕著なトリプシン阻害活性が認められた。

【０１１５】（４）大腸菌株ＪＥ５５０５（ｐＭ７３７
Ｂ）の培養上清からの本発明の新規ポリペプチドの精製 実施例２（４）の方法に準じて、塩析、ゲル濾過、陰イ
オン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー
を行ない、（３）で得た培養上清から、精製ポリペプチ
ドを得た。最終的に得られた精製ポリペプチドを、以下
の（５）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、（６）のアミノ酸配列分
析および実施例１７の活性測定に供した。

【０１１６】（５）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ （４）で得た精製ポリペプチドを、実施例２（５）の方
法で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動終了後、市販の
銀染色キット（既出）にて染色を行なった。その結果、
単一のバンドが認められた。

【０１１７】（６）アミノ酸配列分析 （４）で得た精製ポリペプチドを５０％酢酸に溶解し
て、実施例２（６）の方法で、アミノ酸配列分析を行っ
た。その結果、（４）で得た精製ポリペプチドは、目的
とする本発明のポリペプチド、Ｑ１９Ｒ／Ｙ４６Ｅであ
ることが確認された（配列表の配列番号１６参照）。

【０１１８】実施例１０．ポリペプチドＱ１９Ｋ／Ｙ４
６Ｄの作製 前記式１のＮ末端側より数えて１５番目のＧｌｎがＬｙ
ｓに、４２番目のＴｙｒがＡｓｐに置換されたアミノ酸
配列を有するポリペプチド、Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄを以下
の方法で製造した。 （１）プラスミドｐＭ７４８の構築 はじめに、ＰＣＲの鋳型として用いるプラスミドｐＭ７
１０を以下のように作製した。すなわち、まず、図３４
の塩基配列で示されるリンカー７１０を、５つの断片に
分割して設計し、化学合成機（既出）を使用し、実施例
１と同様の方法で化学合成した。一方、実施例７（１）
で作製したプラスミドｐＭ５９４を制限酵素ＨｉｎｄII
I ／ＡｐａＩで消化し、約３．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を
得た。これと、化学合成にて得たＤＮＡ断片とをＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ（既出）を用いてライゲーションし、プラ
スミドｐＭ７１０を作製した。次に、プラスミドｐＭ７
１０を鋳型とし、２度のＰＣＲを行った。ＰＣＲの諸条
件は実施例３（１）に従った。第一次ＰＣＲ用のセンス
プライマーとしては、化学合成して得たＹ４６Ｄプライ
マー（図３５）を、アンチセンスプライマーとしては実
施例３（１）で作製したｐＢＲＢａｍＨＩプライマーを
使用した。得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル
電気泳動に供したところ、目的とするサイズ約１２０ｂ
ｐのバンドが認められた。この増幅産物をフェノール処
理／エタノール沈澱により精製した後、ＴＥバッファー
に溶解した。これをアンチセンスプライマーとし、実施
例３（１）で作製したＨｉｎｄIII プライマーをセンス
プライマーとし、プラスミドｐＭ７１０を鋳型とする第
二次ＰＣＲを行った。得られた増幅産物を１．５％アガ
ロースゲル電気泳動に供したところ目的とするサイズ約
３８０ｂｐのバンドが認められた。この増幅産物をフェ
ノール処理／エタノール沈澱で精製した後、実施例３
（２）の方法で、プラスミドｐＭ４６３に組み込み、発
現用プラスミドｐＭ７４８を作製した。

【０１１９】（２）プラスミドｐＭ７２７の構築 （１）で得られたプラスミドｐＭ７４８を鋳型として、
２度のＰＣＲを行った。ＰＣＲの諸条件は実施例３
（１）に従った。第一次ＰＣＲ用のセンスプライマーと
しては実施例３（１）で作製したＨｉｎｄIII プライマ
ーを、アンチセンスプライマーとしては実施例３（１）
で作製したＱ１９Ｋプライマーを使用した。得られた増
幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動に供したとこ
ろ、目的とするサイズ約２１０ｂｐのバンドが認められ
た。この増幅産物をフェノール処理／エタノール沈澱に
より精製した後、ＴＥバッファーに溶解した。これをセ
ンスプライマーとし、実施例３（１）で作製したｐＢＲ
ＢａｍＨＩプライマーをアンチセンスプライマーとし、
プラスミドｐＭ７４８を鋳型とする第二次ＰＣＲを行っ
た。得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳
動に供したところ目的とするサイズ約３８０ｂｐのバン
ドが認められた。この増幅産物をフェノール処理／エタ
ノール沈澱で精製した後、実施例３（２）の方法で、プ
ラスミドｐＭ４６３に組み込み、発現用プラスミドｐＭ
７２７を作製した。プラスミドｐＭ７２７を制限酵素Ｈ
ｉｎｄIII およびＢａｍＨＩで二重消化した後、目的と
するサイズ約３４０ｂｐの断片を抽出、精製した。ＤＮ
Ａシークエンサー（既出）を使用して実施例２（２）の
方法でシークエンシングを行った。プラスミドｐＭ７２
７における、本発明の新規ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡを含むＨｉｎｄIII 消化部位からＢａｍＨＩ消化部
位までの確認された塩基配列、および対応するアミノ酸
配列を図３６に示した（配列表の配列番号１７参照）。

【０１２０】（３）形質転換体の作製および培養 （２）で得られたプラスミドｐＭ７２７を用いて、ハナ
ハンの方法により大腸菌株ＪＥ５５０５を形質転換し、
大腸菌株ＪＥ５５０５（ｐＭ７２７）を作製した。この
大腸菌株ＪＥ５５０５（ｐＭ７２７）を、実施例３
（３）と同様に培養した。この培養混合物を、Ｂｅｎｃ
ｈｍａｒｋ ＧＸ（メンブレックス（Ｍｅｍｂｒｅｘ）
社、孔径０．２μｍ）を使用して濃縮後、４℃にて、約
１００００×ｇ、２０分間遠心分離を行い菌体を回収し
た。

【０１２１】（４）可溶化、還元処理 （３）で得られた菌体を破砕用溶液（０．５％ Ｔｒｉ
ｔｏｎＸ−１００，１０ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁し、ミ
ニラボ（ＲＡＮＮＩＥ社）を使用し、８００ｂａｒで加
圧破砕した。その後、４℃、２０分間、約１００００×
ｇで遠心分離し、ペレットを回収した。回収したペレッ
トに破砕用溶液を添加し、再び、４℃、２０分間、約１
００００×ｇで遠心分離した。この操作を更に２回行
い、ペレットを回収した。回収したペレットに可溶化バ
ッファー（５Ｍグアニジン塩酸，０．００５％ Ｔｗｅ
ｅｎ８０，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸ｐＨ８．０，５ｍＭ
ＥＤＴＡ，２ｍＭ 還元型グルタチオン，０．０２ｍ
Ｍ 酸化型グルタチオン）を加え、更に、終濃度５０ｍ
Ｍとなるように２−メルカプトエタノールを添加し、４
℃にて終夜撹拌した。この溶液を限外濾過膜（ＹＭ−
５、グレースジャパン社）を使用して濃縮した後、孔径
０．４４μｍのフィルターを使用して濾過した。Ｓｅｐ
ｈａｃｒｙｌ Ｓ−１００ ＨＲ（ファルマシア社製）
を充填したカラム（５cmφ×９５cm）を、前述の可溶化
バッファーで平衡化し、これに濃縮濾液を添加した。前
述の可溶化バッファーを展開液とし、波長２８０ｎｍに
おける吸光度を指標として蛋白質含量をモニターしなが
ら、流速３．５ｍｌ／分でゲル濾過を行った。３０ｍｌ
ずつ分取し、各画分の一部を採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
に供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＰＡＧＥＬ^R （ＳＰＵ
−１５Ｓ、アトー社）を使用し、その使用説明書に従っ
て行った。クマシーブリリアントブルーで染色し、目的
の分子量のポリペプチドを多く含む画分を選択した。こ
の画分の蛋白質含量がほぼ０．５ｍｇ／ｍｌとなるよう
に、可溶化バッファーを使用して調整し、リフォールデ
ィング処理用サンプルとした。

【０１２２】（５）リフォールディング （４）で得たリフォールディング処理用サンプルを、
（４）で使用した可溶化バッファーからグアニジン塩酸
を除いた溶液、１０〜１５倍量に対し、２回透析した。
次いで、１０〜１５倍量の蒸留水に対して３回透析を行
った。透析終了後、塩酸を使用してサンプルをｐＨ２に
調整した。このサンプルについて以下のように精製を行
った。

【０１２３】（６）精製 逆相クロマトグラフィー 予め０．１％ＴＦＡ溶液で平衡化したＰＬＲＰ−Ｓカラ
ム（２５ｍｍφ×１５０ｍｍ、ポリマーラボラトリーズ
社製）に、（６）で得たリフォールディング処理後のサ
ンプルを添加し、０．１％ＴＦＡ溶液を用いて吸着させ
た。溶出は、０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル溶液を用
い、アセトニトリルの直線濃度勾配（０−７０％アセト
ニトリル／０．１％ＴＦＡ溶液／３０分、７０−１００
％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ溶液／３分）によ
り、流速５ｍｌ／分で、波長２８０ｎｍにおける吸光度
をモニターしながら溶出を行い、５ｍｌずつ分取した。
各画分のトリプシン阻害活性を、実施例１７（１）の方
法に準じて測定し、活性の認められた画分を凍結乾燥
後、７０％蟻酸におよそ１００μＭとなるように溶解し
た。次いで、モル濃度比で２０００倍量となるように臭
化シアンを加え、２５℃、２４時間暗所に静置した。こ
れに蒸留水を加えて２倍希釈し、のイオン交換クロマ
トグラフィー用のサンプルとした。 陽イオン交換クロマトグラフィー ＳＰ−トヨパール（３０ｍｍφ×１５０ｍｍ、東ソー株
式会社）を１０％蟻酸溶液で平衡化した後、ＦＰＬＣシ
ステム（既出）を用いて以下の方法で陽イオン交換クロ
マトグラフィーを行った。すなわち、で得られたサン
プルをＳＰ−トヨパールに添加し、１０％蟻酸溶液を用
いて吸着させた。ＮａＣｌ／１０％蟻酸を使用し、Ｎａ
Ｃｌの直線濃度勾配（０−１．２Ｍ ＮａＣｌ／１０％
蟻酸溶液／１００分間）により、流速８ｍｌ／分で、
波長２８０ｎｍの吸光度をモニターしながら溶出した。
３２ｍｌずつ分取し、各画分のトリプシン阻害活性を実
施例１７（１）の方法で測定した。得られた活性画分を
の逆相クロマトグラフィー用サンプルとした。 逆相クロマトグラフィー ＰＬＲＰ−Ｓカラム（２５ｍｍφ×１５０ｍｍ、既出）
を０．１％ＴＦＡ溶液で平衡化した後、で得られた活
性画分を添加し、０．１％ＴＦＡ溶液を用いて吸着させ
た。溶出は０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル溶液を用
い、アセトアニリルの直線濃度勾配（０−７０％アセト
ニトリル／０．１％ＴＦＡ／１５分、７０−１００％ア
セトニトリル／０．１％ＴＦＡ溶液／３分）により流速
１０ｍｌ／分で行った。波長２８０ｎｍの吸光度をモニ
ターしながら溶出を行い、ピークごとに分取し、各画分
のトリプシン阻害活性を実施例１７（１）の方法で測定
した。得られた活性画分を凍結乾燥して、精製標品を得
た。

【０１２４】（７）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ （６）で得られた精製標品をＰＡＧＥＬ^R （既出）を使
用したＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。銀染色の結果、単一
のバンドが認められた。

【０１２５】（８）アミノ酸配列の分析 （６）で得られた精製標品の一部を５０％酢酸に溶解し
て、実施例２（６）と同様の方法でアミノ酸配列の分析
を行った。その結果、この精製標品は目的とするポリペ
プチド、Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄであることが確認された
（配列表の配列番号１８参照）。

【０１２６】実施例１１．ポリペプチドＱ１９Ｒ／Ｙ４
６Ｄの作製 前記式１のＮ末端側より数えて１５番目のＧｌｎがＡｒ
ｇに、４２番目のＴｙｒがＡｓｐに置換されたアミノ酸
配列を有するポリペプチド、Ｑ１９Ｒ／Ｙ４６Ｄを以下
の方法で製造した。

【０１２７】（１）プラスミドｐＭ７４４の構築 実施例１０（１）で得られたプラスミドｐＭ７４８を鋳
型とする２度のＰＣＲを実施例３（１）と同様に行っ
た。ただし、第一次ＰＣＲ用のアンチセンスプライマー
としては、実施例４（１）で作製したＱ１９Ｒプライマ
ーを使用した。第二次ＰＣＲ後の増幅産物を、１．５％
アガロースゲル電気泳動に供したところ、目的とするサ
イズ約３８０ｂｐのバンドが認めれらた。この増幅産物
をフェノール処理／エタノール沈澱で精製し、本発明の
ＤＮＡを得た。これを実施例３（２）の方法で、プラス
ミドｐＭ４６３に組み込み、発現用プラスミドｐＭ７４
４を作製した。制限酵素ＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩ
で二重消化したのち、目的とするサイズ約３４０ｂｐの
断片を抽出、精製した。ＤＮＡシークエンサー（既出）
を使用してシークエンシングを行った。プラスミドｐＭ
７４４における、本発明の新規ポリペプチドをコードす
るＤＮＡを含むＨｉｎｄIII 消化部位からＢａｍＨＩ消
化部位までの確認された塩基配列、および対応するアミ
ノ酸配列を図３７に示した（配列表の配列番号１９参
照）。

【０１２８】（２）形質転換体の作製および培養 （１）で得られたプラスミドｐＭ７４４を用いて、ハナ
ハンの方法により大腸菌株ＪＥ５５０５を形質転換し、
大腸菌株ＪＥ５５０５（ｐＭ７４４）を作製した。この
大腸菌株ＪＥ５５０５（ｐＭ７４４）を、実施例３
（３）と同様に培養した。この培養混合物をＢｅｎｃｈ
ｍａｒｋ ＧＸ（既出）を使用して濃縮後、遠心分離し
て菌体を回収した。

【０１２９】（３）本発明のポリペプチドの精製 （２）で得られた菌体より、実施例１０（４）の方法で
インクルージョンボディを回収し、可溶化および還元処
理を行い、実施例１０（５）の方法でリフォールディン
グを行った。実施例１０（６）の方法で精製を行い、精
製標品を得た。

【０１３０】（４）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ （３）で得られた精製標品を実施例１０（７）の方法で
ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その結果、単一のバンドが
認められた。

【０１３１】（５）アミノ酸配列の分析 （４）で得られた精製標品の一部を５０％酢酸に溶解し
て、実施例２（６）と同様の方法でアミノ酸配列の分析
を行った。その結果、この精製標品は目的とするポリペ
プチド、Ｑ１９Ｒ／Ｙ４６Ｄであることが確認された
（配列表の配列番号２０参照）。

【０１３２】実施例１２．ポリペプチドＲ１１Ｑ／Ｑ１
９Ｋ／Ｙ４６Ｄの作製 前記式１のＮ末端側より数えて７番目のＡｒｇがＧｌｎ
に、１５番目のＧｌｎがＬｙｓに、４２番目のＴｙｒが
Ａｓｐに置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、Ｒ１１Ｑ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄを以下の方法で製造
した。

【０１３３】（１）プラスミドｐＭ７４１の構築 実施例１０（２）で得られたプラスミドｐＭ７２７を鋳
型として２度のＰＣＲを実施例３（１）と同様の方法で
行った。ただし、第一次ＰＣＲ用のアンチセンスプライ
マーとしては、化学合成して得たＲ１１Ｑプライマー
（図３８）を使用した。第二次ＰＣＲ後の増幅産物を、
１．５％アガロースゲル電気泳動に供したところ、目的
とするサイズ約３８０ｂｐのバンドが確認された。この
増幅産物をフェノール処理／エタノール沈澱で精製し、
本発明のＤＮＡを得た。得られた本発明のＤＮＡを実施
例３（２）の方法で、プラスミドｐＭ４６３に組み込
み、発現用プラスミドｐＭ７４１を作製した。プラスミ
ドｐＭ７４１を制限酵素ＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩ
で二重消化し、目的とするサイズ約３４０ｂｐの断片を
抽出、精製した。ＤＮＡシークエンサー（既出）を使用
して実施例２（２）の方法でシークエンシングを行っ
た。プラスミドｐＭ７４１における、本発明の新規ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡを含むＨｉｎｄIII 消化部
位からＢａｍＨＩ消化部位までの確認された塩基配列、
および対応するアミノ酸配列を図３９に示した（配列表
の配列番号２１参照）。

【０１３４】（２）形質転換体の作製および培養 （１）で得られたプラスミドｐＭ７４１を用いて、ハナ
ハンの方法により大腸菌株ＪＥ５５０５を形質転換し、
大腸菌株ＪＥ５５０５（ｐＭ７４１）を作製した。培養
混合物の一部をサンプリングして遠心分離し、上清を回
収した。上清中のトリプシン阻害活性を実施例１７
（１）の方法で測定したところ、実施例１０で得られた
大腸菌株ＪＥ５５０５（ｐＭ７２７）の培養上清中のト
リプシン阻害活性よりも、約５倍高かった。この結果
と、ポリペプチドＱ１９Ｋ／Ｙ４６ＤとＲ１１Ｑ／Ｑ１
９Ｋ／Ｙ４６Ｄのウシトリプシン阻害の比活性を算出し
た結果とから、前記式１のＮ末端側より数えて７番目の
アミノ酸をＡｒｇからＧｌｎへ置換することにより、ポ
リペプチドの形質転換体外への分泌発現量が高くなるこ
とが確認された。大腸菌株ＪＥ５５０５（ｐＭ７４１）
を培養して得られた残りの培養混合物をＢｅｎｃｈｍａ
ｒｋ ＧＸ（既出）を使用して濃縮し、遠心分離して菌
体を回収した。

【０１３５】（３）本発明のポリペプチドの精製 （２）で得られた菌体より、実施例１０（４）の方法で
インクルージョンボディを回収して可溶化および還元処
理を行い、実施例１０（５）の方法でリフォールディン
グを行った。実施例１０（６）の方法で精製を行い、精
製標品を得た。

【０１３６】（４）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ （３）で得られた精製標品を実施例１０（７）の方法で
ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その結果、単一のバンドが
認められた。

【０１３７】（５）アミノ酸配列の分析 （４）で得られた精製標品の一部を５０％酢酸に溶解し
て、実施例２（６）と同様の方法でアミノ酸配列の分析
を行った。その結果、この精製標品は目的とするポリペ
プチド、Ｒ１１Ｑ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄであることが確
認された（配列表の配列番号２２参照）。

【０１３８】実施例１３．ポリペプチドＲ１１Ｄ／Ｑ１
９Ｋ／Ｙ４６Ｄの作製 前記式１のＮ末端側より数えて７番目のＡｒｇがＡｓｐ
に、１５番目のＧｌｎがＬｙｓに、４２番目のＴｙｒが
Ａｓｐに置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、Ｒ１１Ｄ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄを以下の方法で製造
した。

【０１３９】（１）プラスミドｐＭ７４２の構築 実施例１０（２）で得られたプラスミドｐＭ７２７を鋳
型とする２度のＰＣＲを、実施例３（１）と同様に行っ
た。ただし、第一次ＰＣＲ用のアンチセンスプライマー
としては、化学合成して得たＲ１１Ｄプライマー（図４
０）を使用した。得られた第二次ＰＣＲ後の増幅産物を
１．５％アガロースゲル電気泳動に供したところ、目的
とするサイズ約３８０ｂｐのバンドが確認された。この
増幅産物をフェノール処理／エタノール沈澱で精製し、
本発明のＤＮＡを得た。得られた本発明のＤＮＡを実施
例３（２）の方法で、プラスミドｐＭ４６３に組み込
み、発現用プラスミドｐＭ７４２を作製した。プラスミ
ドｐＭ７４２を制限酵素ＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩ
で二重消化し、目的とするサイズ約３４０ｂｐの断片を
抽出、精製した。ＤＮＡシークエンサー（既出）を使用
して実施例２（２）の方法でシークエンシングを行っ
た。プラスミドｐＭ７４２における、本発明の新規ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡを含むＨｉｎｄIII 消化部
位からＢａｍＨＩ消化部位までの確認された塩基配列、
および対応するアミノ酸配列を図４１に示した（配列表
の配列番号２３参照）

【０１４０】（２）形質転換体の作製および培養 （１）で得られたプラスミドｐＭ７４２を用いて、ハナ
ハンの方法により大腸菌株ＪＥ５５０５を形質転換し、
大腸菌株ＪＥ５５０５（ｐＭ７４２）を作製した。この
大腸菌株ＪＥ５５０５（ｐＭ７４２）を、実施例３
（３）と同様に培養した。培養混合物より一部をサンプ
リングして、遠心分離し、上清を回収した。上清中のト
リプシン阻害活性を、実施例１７（１）の方法で測定し
たところ、実施例１０で得られた大腸菌株ＪＥ５５０５
（ｐＭ７２７）の培養上清中のトリプシン阻害活性より
も、約２倍高かった。この結果と、ポリペプチドＱ１９
Ｋ／Ｙ４６ＤとＲ１１Ｄ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄのトリプ
シン阻害の比活性を算出した結果とから、前記式１のＮ
末端側より数えて７番目のアミノ酸をＡｒｇからＡｓｐ
へ置換することにより、形質転換体外へポリペプチドの
分泌発現量が高くなることが確認された。大腸菌株ＪＥ
５５０５（ｐＭ７４２）を培養して得た残りの培養混合
物を、Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ ＧＸ（既出）を使用して濃
縮した後、遠心分離して菌体を回収した。

【０１４１】（３）本発明のポリペプチドの精製 （２）で得られた菌体より、実施例１０（４）の方法
で、インクルージョンボディを回収して可溶化および還
元処理を行い、実施例１０（５）の方法でリフォールデ
ィングを行った。実施例１０（６）の方法で精製を行
い、精製標品を得た。

【０１４２】（４）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ （３）で得られた精製標品を実施例１０（７）の方法で
ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その結果、単一のバンドが
認められた。

【０１４３】（５）アミノ酸配列の分析 （３）で得られた精製標品の一部を５０％酢酸に溶解し
て、実施例２（６）と同様の方法でアミノ酸配列の分析
を行った。その結果、この精製標品は目的とするポリペ
プチド、Ｒ１１Ｄ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄであることが確
認された（配列表の配列番号２４参照）。

【０１４４】実施例１４．ポリペプチドＲ１１Ｌ／Ｑ１
９Ｋ／Ｙ４６Ｄの作製 前記式１のＮ末端側より数えて７番目のＡｒｇがＬｅｕ
に、１５番目のＧｌｎがＬｙｓに、４２番目のＴｙｒが
Ａｓｐに置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、Ｒ１１Ｌ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄを以下の方法で製造
した。

【０１４５】（１）プラスミドｐＭ７４３の構築 実施例１０（２）で得られたプラスミドｐＭ７２７を鋳
型とする２度のＰＣＲを、実施例３（１）と同様に行っ
た。ただし、第一次ＰＣＲ用のアンチセンスプライマー
としては、化学合成にて得たＲ１１Ｌプライマー（図４
２）を使用した。第二次ＰＣＲ後の増幅産物を１．５％
アガロースゲル電気泳動に供したところ、目的とするサ
イズ約３８０ｂｐのバンドが確認された。この増幅産物
をフェノール処理／エタノール沈澱で精製し、本発明の
ＤＮＡを得た。得られた本発明のＤＮＡを実施例３
（２）の方法で、プラスミドｐＭ４６３に組み込み、発
現用プラスミドｐＭ７４３を作成した。プラスミドｐＭ
７４３を制限酵素ＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩで二重
消化し、目的とするサイズ約３４０ｂｐの断片を抽出、
精製した。ＤＮＡシークエンサー（既出）を使用して実
施例２（２）の方法でシークエンシングを行った。プラ
スミドｐＭ７４３における、本発明の新規ポリペプチド
をコードするＤＮＡを含むＨｉｎｄIII 消化部位からＢ
ａｍＨＩ消化部位までの確認された塩基配列、および対
応するアミノ酸配列を図４３に示した（配列表の配列番
号２５参照）

【０１４６】（２）形質転換体の作製および培養 （１）で得られたプラスミドｐＭ７４３を用いて、ハナ
ハンの方法により大腸菌株ＪＥ５５０５を形質転換し、
大腸菌株ＪＥ５５０５（ｐＭ７４３）を作製した。この
大腸菌株ＪＥ５５０５（ｐＭ７４３）を、実施例３
（３）と同様に培養し、得られた培養混合物をＢｅｎｃ
ｈｍａｒｋ ＧＸ（既出）を使用して濃縮した後、遠心
分離して菌体を回収した。

【０１４７】（３）本発明のポリペプチドの精製 （２）で得られた菌体より、実施例１０（４）の方法で
インクルージョンボディを回収して可溶化および還元処
理を行い、実施例１０（５）の方法でリフォールディン
グを行った。実施例１０（６）の方法で精製を行い、精
製標品を得た。

【０１４８】（４）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ （３）で得られた精製ポリペプチドを、実施例１０
（７）の方法で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その結
果、単一のバンドが認められた。

【０１４９】（５）アミノ酸配列の分析 （３）で得られた精製標品の一部を５０％酢酸に溶解し
て、実施例２（６）と同様の方法でアミノ酸配列の分析
を行った。その結果、この精製標品は目的とするポリペ
プチド、Ｒ１１Ｌ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄであることが確
認された（配列表の配列番号２６参照）。

【０１５０】実施例１５．ポリペプチドＲ１１Ｅ／Ｑ１
９Ｋ／Ｙ４６Ｅの作製 前記式１のＮ末端側より数えて７番目のＡｒｇがＧｌ
ｕ、１５番目のＧｌｎがＬｙｓに、４２番目のＴｙｒが
Ｇｌｕに置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、Ｒ１１Ｅ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｅを以下の方法で製造
した。 （１）プラスミドｐＭ７２１の構築 実施例１０（２）で得られたプラスミドｐＭ７２７を鋳
型とし、２度のＰＣＲを行った。ＰＣＲの諸条件は実施
例３（１）に従った。第一次ＰＣＲ用のセンスプライマ
ーとしては、実施例２（１）で作製したオリゴマーＹ４
６Ｅ、アンチセンスプライマーとしては実施例３（１）
で作製したｐＢＲＢａｍＨＩプライマーを使用した。得
られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動に供
したところ、目的とするサイズ約１２０ｂｐのバンドが
認められた。この増幅産物をフェノール処理／エタノー
ル沈澱で精製した後、ＴＥバッファーに溶解した。これ
をアンチセンスプライマーとし、実施例３（１）で作製
したＨｉｎｄIII プライマーをセンスプライマーとし、
プラスミドｐＭ７２７を鋳型とする第二次ＰＣＲを行っ
た。得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳
動法に供したところ目的とするサイズ約３８０ｂｐのバ
ンドが認められた。この増幅産物をフェノール処理／エ
タノール沈澱で精製した後、実施例３（２）の方法で、
プラスミドｐＭ４６３に組み込み、発現用プラスミドｐ
Ｍ７２１を作製した。

【０１５１】（２）プラスミドｐＭ７３８の作製 （１）で得られたプラスミドｐＭ７２１を鋳型として、
２度のＰＣＲを実施例３（１）と同様に行った。ただ
し、第一次ＰＣＲ用のアンチセンスプライマーとしては
実施例６（１）でＲ１１Ｅプライマーを使用した。第二
次ＰＣＲ後の増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳
動に供したところ目的とするサイズ約３８０ｂｐのバン
ドが認められた。この増幅産物をフェノール処理／エタ
ノール沈澱で精製した後、実施例３（２）の方法で、プ
ラスミドｐＭ４６３に組み込み、プラスミドｐＭ７３８
を作製した。プラスミドｐＭ７３８における、制限酵素
ＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩで二重消化したのち、目
的とするサイズ約３４０ｂｐの断片を抽出、精製した。
ＤＮＡシークエンサー（既出）を使用して実施例２
（２）の方法でシークエンシングを行った。プラスミド
ｐＭ７３８における、本発明の新規ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡを含むＨｉｎｄIII 消化部位からＢａｍＨ
Ｉ消化部位までの確認された塩基配列、および対応する
アミノ酸配列を図４４に示した（配列表の配列番号２７
参照）。

【０１５２】（３）形質転換体の作製および培養 （１）で得られたプラスミドｐＭ７３８を用いて、ハナ
ハンの方法により大腸菌株ＪＥ５５０５を形質転換し、
大腸菌株ＪＥ５５０５（ｐＭ７３８）を作製した。この
大腸菌株ＪＥ５５０５（ｐＭ７３８）を、実施例３
（３）と同様に培養した後、培養混合物の一部をサンプ
リングして遠心分離し、上清を回収した。上清中のトリ
プシン阻害活性を実施例１７（１）の方法で測定したと
ころ、（１）で得られたプラスミドｐＭ７２１で形質転
換させた大腸菌株ＪＥ５５０５（ｐＭ７２１）の培養上
清中のトリプシン阻害活性よりも、約５倍高かった。こ
の結果と、ポリペプチドＱ１９Ｋ／Ｙ４６ＥとＲ１１Ｅ
／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｅのウシトリプシン阻害の比活性を
算出した結果とから、前記式１のＮ末端側より数えて７
番目のアミノ酸をＡｒｇからＧｌｕへ置換することによ
り、形質転換体外への、ポリペプチドの分泌量発現量が
高くなることが確認された。残りの培養混合物をＢｅｎ
ｃｈｍａｒｋ ＧＸ（既出）を使用して濃縮後、遠心分
離して菌体を回収した。

【０１５３】（４）本発明のポリペプチドの精製 （３）で得られた菌体より、実施例１０（４）の方法で
インクルージョンボディを回収して可溶化および還元処
理を行い、実施例１０（５）の方法でリフォールディン
グを行った。実施例１０（６）の方法で精製を行い、精
製標品を得た。 （５）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ （３）で得られた精製ポリペプチドを、実施例１０
（７）の方法で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その結
果、単一のバンドが認められた。

【０１５４】（６）アミノ酸配列の分析 （３）で得られた精製標品の一部を５０％酢酸に溶解し
て、実施例２（６）と同様の方法でアミノ酸配列の分析
を行った。その結果、この精製標品は目的とするポリペ
プチド、Ｒ１１Ｅ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｅであることが確
認された（配列表の配列番号２８参照）。

【０１５５】実施例１６．ポリペプチドＲ１１Ｎ／Ｑ１
９Ｋ／Ｙ４６Ｄ、Ｒ１１Ｓ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄおよび
Ｒ１１Ａ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄの作製 前記式１のＮ末端から数えて７番目のアミノ酸がＡｓｎ
に変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドＲ１１Ｎ
／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄ（配列番号２９参照）、７番目の
アミノ酸がＳｅｒに変化したアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドＲ１１Ｓ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄ（配列番号３０
参照）、７番目のアミノ酸がＡｌａに変化したアミノ酸
配列を有するポリペプチドＲ１１Ａ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６
Ｅ（配列番号３１参照）を以下の方法で作製した。ま
ず、それぞれ配列表の配列番号３２、３３、３４に示さ
れる塩基配列を有するＤＮＡを作製し、大腸菌ＪＥ５５
０５を形質転換し、形質転換体ＪＥ５５０５（ｐＭ７６
４）、ＪＥ５５０５（ｐＭ７６５）、ＪＥ５５０５（ｐ
Ｍ７６７）を得た。大腸菌の培養上清の一部をサンプリ
ングして、トリプシン阻害活性を測定したところ、いず
れも、形質転換体ＪＥ５５０５（ｐＭ７２７）の培養上
清中のトリプシン阻害活性に比べて約４倍高かった。こ
れらの結果と、各ポリペプチドのウシトリプシン阻害の
比活性を算出した結果とから、前記式１のＮ末端から数
えて７番目のアミノ酸をＡｓｎ、ＳｅｒもしくはＡｌａ
に置換することにより、当該ポリペプチドが形質転換体
からの分泌発現量が高くなることが確認された。得られ
た形質転換体、ＪＥ５５０５（ｐＭ７６４）、ＪＥ５５
０５（ｐＭ７６５）、ＪＥ５５０５（ｐＭ７６７）を、
実施例３（３）の方法で培養し、実施例１０（６）の方
法で、ポリペプチドの精製を行った。得られた精製標品
を各々実施例２（５）の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し
たところ、単一のバンドが確認された。

【０１５６】実施例１７．酵素阻害活性の測定 実施例２（４）、実施例３（４）、実施例４（４）、実
施例５（４）、実施例６（４）実施例７（３）、実施例
８（３）、実施例９（４）、実施例１０（６）、実施例
１１（３）、実施例１２（３）、実施例１３（３）、実
施例１４（３）、実施例１５（４）および実施例１６で
得た本発明のポリペプチドの精製標品Ｙ４６Ｅ、Ｑ１９
Ｋ、Ｑ１９Ｒ、Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｅ、Ｒ１１Ｅ／Ｙ４６
Ｅ、Ｙ４６Ｅ−ＡＮ、Ｑ１９Ｋ−ＡＮ、Ｑ１９Ｒ／Ｙ４
６Ｅ、Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄ、Ｑ１９Ｒ／Ｙ４６Ｄ、Ｒ１
１Ｑ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄ、Ｒ１１Ｄ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４
６Ｄ、Ｒ１１Ｌ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄ、Ｒ１１Ｅ／Ｑ１
９Ｋ／Ｙ４６Ｅ、Ｒ１１Ｎ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄ、Ｒ１
１Ｓ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６ＤおよびＲ１１Ａ／Ｑ１９Ｋ／
Ｙ４６Ｄのトリプシン、ＦＸａ、エラスターゼ阻害活性
をそれぞれ以下の方法で測定した。

【０１５７】（１）ウシトリプシン阻害活性 本発明の新規ポリペプチドの精製標品を蒸留水１００μ
ｌに溶解した後、０．１％ＢＳＡ／０．２Ｍトリエタノ
ールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）を用いて段階希
釈し、活性測定用溶液とした。合成基質Ｓ−２４４４
（第一化学薬品株式会社製）を用い、カッセル(Kassel
l) の方法（Kassell B.等、Methods in Enzymol.,１９
巻、８４４−８５２頁、１９７０年）に準じて活性測定
用溶液のトリプシン阻害活性を測定した。すなわち、ウ
シトリプシン（Type XIII 、シグマ社製）を、その濃度
が１３６００ＢＡＥＥＵ／ｍｌとなるように０．００１
ＭＨＣｌに溶解した後、さらに０．１％ＢＳＡ／０．２
Ｍトリエタノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に
て希釈し、濃度１．２ＢＡＥＥＵ／ｍｌのトリプシン溶
液を調製した。別に合成基質Ｓ−２４４４をその濃度が
２ｍＭとなるように蒸留水に溶解し、Ｓ−２４４４溶液
とした。前述の活性測定用溶液１００μｌおよびウシト
リプシン溶液１００μｌを混合し、３７℃、１０分間静
置した。これに上記Ｓ−２４４４溶液５０μｌを加え、
３７℃、１５分間反応させた後、５０％酢酸５０μｌを
加えて反応を停止させ、分光光度計を用いて、波長４０
５ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、ここで用いた
各種溶液の吸光度への影響を差し引くため、５０％酢酸
５０μｌを予め加えた上述のウシトリプシン溶液１００
μｌに、活性測定用溶液１００μｌおよびＳ−２４４４
溶液５０μｌを加えたものをブランクとして使用した。
本発明のポリペプチド、Ｙ４６Ｅ、Ｑ１９Ｋ、Ｑ１９
Ｒ、Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｅ、Ｒ１１Ｅ／Ｙ４６Ｅ、Ｙ４６
Ｅ−ＡＮ、Ｑ１９Ｋ−ＡＮ、Ｑ１９Ｒ／Ｙ４６Ｅ、Ｑ１
９Ｋ／Ｙ４６Ｄ、Ｑ１９Ｒ／Ｙ４６Ｄ、Ｒ１１Ｑ／Ｑ１
９Ｋ／Ｙ４６Ｄ、Ｒ１１Ｄ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄ、Ｒ１
１Ｌ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄ、Ｒ１１Ｅ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４
６Ｅ、Ｒ１１Ｎ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄ、Ｒ１１Ｓ／Ｑ１
９Ｋ／Ｙ４６Ｄ、Ｒ１１Ａ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄは、い
ずれも濃度依存的にウシトリプシンを阻害した。

【０１５８】（２）ヒトトリプシン阻害活性 本発明の新規ポリペプチドの精製標品を蒸留水１００μ
ｌに溶解した。ＵＴＩ（持田製薬株式会社製、大西治夫
等、日本薬理学雑誌、８５巻、１−６頁、１９８５年参
照）をスタンダードとして（１）の方法により測定した
ウシトリプシン阻害活性から、この溶液のポリペプチド
の濃度を算出した。ついで０．０３％ＢＳＡ／０．２Ｍ
トリエタノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）を用
いて、ポリペプチド溶液を各種濃度に希釈し、活性測定
用溶液とした。別に濃度が１０００ＳＵ／ｍｌとなるよ
うに１ｍＭＨＣｌに溶解したヒトトリプシン（カルビオ
ケム社製）を０．０３％ＢＳＡ／０．２Ｍトリエタノー
ルアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）を用いて希釈し、
１．２５ＳＵ／ｍｌのヒトトリプシン溶液を調製し、合
成基質Ｓ−２４４４（既出）を基質として、（１）と同
様の方法で、ヒトトリプシン阻害活性を測定した。本発
明のポリペプチド、Ｙ４６Ｅ、Ｑ１９Ｋ、Ｑ１９Ｒ、Ｑ
１９Ｋ／Ｙ４６Ｅ、Ｒ１１Ｅ／Ｙ４６Ｅ、Ｙ４６Ｅ−Ａ
Ｎ、Ｑ１９Ｋ−ＡＮ、Ｑ１９Ｒ／Ｙ４６Ｅ、Ｑ１９Ｋ／
Ｙ４６Ｄ、Ｑ１９Ｒ／Ｙ４６Ｄ、Ｒ１１Ｑ／Ｑ１９Ｋ／
Ｙ４６Ｄ、Ｒ１１Ｄ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄ、Ｒ１１Ｌ／
Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄ、Ｒ１１Ｅ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｅ、
Ｒ１１Ｎ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄ、Ｒ１１Ｓ／Ｑ１９Ｋ／
Ｙ４６Ｄ、Ｒ１１Ａ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄは、いずれも
濃度依存的にヒトトリプシンを阻害した。

【０１５９】（３）ＦＸａに対する阻害活性 本発明の新規ポリペプチドの精製標品を蒸留水１００μ
ｌに溶解した。ＵＴＩをスタンダードとして、（１）の
方法により測定したウシトリプシン阻害活性から、この
溶液のポリペプチドの濃度を算出した。この溶液を０．
１％ＢＳＡ／１５０ｍＭＮａＣｌ／５ｍＭＣａＣｌ₂ ／
５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）を用いて、各
種濃度に希釈し、活性測定用溶液とした。一方、ポリペ
プチドＴＮ７０もしくはＡＮ６８を各種濃度に希釈し
て、コントロール溶液とした。なお、ポリペプチドＴＮ
７０はプラスミドｐＭ５５２で大腸菌株ＪＥ５５０５を
形質転換して得た大腸菌株ＪＥ５５０５（ｐＭ５５２）
〔寄託番号：微工研条寄第３５６１号（ＦＥＲＭ ＢＰ
−３５６１）〕の培養上清より、実施例２（４）の方法
に準じて精製したものであり（特願平３−３２５２２０
号公報参照）、ポリペプチドＡＮ６８は、実施例４
（１）で作製したプラスミドｐＭ５９４で大腸菌ＪＥ５
５０５を形質転換させて得られた、大腸菌ＪＥ５５０５
（ｐＭ５９４）の培養上清から、実施例２（４）の方法
に準じて精製したポリペプチドである。それぞれのアミ
ノ酸配列を下記に示した。 ポリペプチドＴＮ７０ Thr Val Ala Ala Cys Asn Leu Pro Ile Val Arg Gly Pro Cys Arg Ala Phe Ile Gln Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu Phe Pro Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Tyr Ser Glu Lys Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu Leu Leu Arg Phe Ser Asn ポリペプチドＡＮ６８ Ala Ala Cys Asn Leu Pro Ile Val Arg Gly Pro Cys Arg Ala Phe Ile Gln Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu Phe Pro Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Tyr Ser Glu Lys Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu Leu Leu Arg Phe Ser Asn 活性測定用溶液およびコントロール溶液のＦＸａ阻害活
性を、合成基質Ｓ−２２２２（第一化学株式会社製）を
用いて、オーノ（Ｏｈｎｏ）等の方法（OhnoH. 等、 T
hromb. Res., 19 , 579-588, 1980 ）に準じて測定し
た。まず、ヒトＦＸａ（アメリカンダイアグノスティカ
社製）を、その濃度が１０ＰＥＵ／ｍｌになるように蒸
留水に溶解した後、さらに、０．１％ＢＳＡ／１５０ｍ
ＭＮａＣｌ／５ｍＭＣａＣｌ₂ ／５０ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ８．３）を用いて希釈し、０．１ＰＥＵ／ｍ
ｌのＦＸａ溶液を調製した。別にＳ−２２２２を、その
濃度が４ｍＭになるように蒸留水に溶解した後、さらに
０．１％ＢＳＡ／１５０ｍＭＮａＣｌ／５ｍＭＣａＣｌ
₂ ／５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）を用いて
希釈し、濃度２ｍＭのＳ−２２２２溶液を調製した。前
述の活性測定用溶液もしくはコントロール溶液２５μ
ｌ、０．１％ＢＳＡ／１５０ｍＭＮａＣｌ／５ｍＭＣａ
Ｃｌ₂ ／５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）１０
０μｌおよびＦＸａ溶液２５μｌを混合し、３７℃、１
０分間静置した。ついで、Ｓ−２２２２溶液１００μｌ
を加え、３７℃、３０分間反応させた。５０％酢酸５０
μｌを加えて反応を停止させた後、分光光度計を用い
て、波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、
ここで用いた各種溶液の吸光度への影響を差し引くため
に、５０％酢酸５０μｌを予め加えた上述のＦＸａ溶液
２５μｌに、活性測定用溶液もしくはコントロール溶液
２５μｌ、０．１％ＢＳＡ／１５０ｍＭＮａＣｌ／５ｍ
ＭＣａＣｌ₂ ／５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．
３）１００μｌおよびＳ−２２２２溶液１００μｌを加
えたものをブランクとして使用した。

【０１６０】結果を図４５から図５３に示した。図中、
横軸に、反応液中のポリペプチドの濃度をウシトリプシ
ン阻害活性（Ｕ／ｍｌ）で表示した。また、図中、残存
ヒトＦＸａ活性は、上記測定系において、活性測定用溶
液の代わりに０．１％ＢＳＡ／１５０ｍＭＮａＣｌ／５
ｍＭＣａＣｌ₂ ／５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．
３）２５μｌを加えて反応させた時の吸光度を１００％
として、百分率で表示したものである。

【０１６１】実施例２（４）で得た本発明の新規ポリペ
プチド、Ｙ４６Ｅは、コントロールと比べ、有意に高い
ＦＸａ阻害活性を有しており、図４５から判断されるポ
リペプチドＹ４６ＥのＦＸａ阻害活性は、コントロール
であるポリペプチドＴＮ７０の約７倍であった。

【０１６２】実施例３（４）で得た本発明の新規ポリペ
プチド、Ｑ１９Ｋは、コントロールと比べ、有意に高い
ＦＸａ阻害活性を有しており、図４６から判断されるポ
リペプチド、Ｑ１９ＫのＦＸａ阻害活性は、コントロー
ルであるポリペプチドＴＮ７０の約５倍であった。

【０１６３】実施例４（４）で得た本発明の新規ポリペ
プチド、Ｑ１９Ｒは、コントロールと比べて、有意に高
いＦＸａ阻害活性を有しており、図４７から判断される
ポリペプチドＱ１９ＲのＦＸａ阻害活性は、コントロー
ルであるポリペプチドＡＮ６８の約６倍であった。

【０１６４】実施例５（４）で得た本発明の新規ポリペ
プチドＱ１９Ｋ／Ｙ４６Ｅは、コントロールと比べて、
有意に高いＦＸａ阻害活性を有しており、図４８から判
断される本発明の新規ポリペプチドＱ１９Ｋ／Ｙ４６Ｅ
のＦＸａ阻害活性は、コントロールであるポリペプチド
ＡＮ６８の約１０倍であった。

【０１６５】実施例６（４）で得た本発明の新規ポリペ
プチドＲ１１Ｅ／Ｙ４６Ｅは、コントロールと比べて、
有意に高いＦＸａ阻害活性を有しており、図４９から判
断される、ポリペプチドＲ１１Ｅ／Ｙ４６ＥのＦＸａ阻
害活性は、コントロールであるポリペプチドＡＮ６８の
約３倍であった。

【０１６６】実施例９（４）で得た本発明の新規ポリペ
プチド、Ｑ１９Ｒ／Ｙ４６Ｅは、コントロールと比べ
て、有意に高いＦＸａ阻害活性を有しており、図５０か
ら判断されるポリペプチドＱ１９Ｒ／Ｙ４６ＥのＦＸａ
阻害活性は、コントロールであるポリペプチドＡＮ６８
の約１０倍であった。

【０１６７】実施例１０（６）で得た本発明の新規ポリ
ペプチド、Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄは、コントロールと比べ
て、有意に高いＦＸａ阻害活性を有しており、図５１か
ら判断されるポリペプチドＱ１９Ｋ／Ｙ４６ＤのＦＸａ
阻害活性は、コントロールであるポリペプチドＡＮ６８
の約２０倍であった。

【０１６８】実施例１１（３）で得た本発明の新規ポリ
ペプチド、Ｑ１９Ｒ／Ｙ４６Ｄは、コントロールと比べ
て、有意に高いＦＸａ阻害活性を有しており、図５１か
らに判断されるポリペプチドＱ１９Ｒ／Ｙ４６ＤのＦＸ
ａ阻害活性は、コントロールであるポリペプチドＡＮ６
８の約１８倍であった。

【０１６９】実施例１２（３）で得た本発明の新規ポリ
ペプチド、Ｒ１１Ｑ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄは、コントロ
ールと比べて、有意に高いＦＸａ阻害活性を有してい
た。図５２から判断されるポリペプチドＲ１１Ｑ／Ｑ１
９Ｋ／Ｙ４６ＤのＦＸａ阻害活性は、コントロールであ
るポリペプチドＡＮ６８の約２０倍であった。

【０１７０】実施例１３（３）で得た本発明の新規ポリ
ペプチド、Ｒ１１Ｄ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄは、コントロ
ールと比べて、有意に高いＦＸａ阻害活性を有してい
た。図５２から判断されるポリペプチドＲ１１Ｄ／Ｑ１
９Ｋ／Ｙ４６ＤのＦＸａ阻害活性は、コントロールであ
るポリペプチドＡＮ６８の約５倍であった。

【０１７１】実施例１４（３）で得た本発明の新規ポリ
ペプチド、Ｒ１１Ｌ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄは、コントロ
ールと比べて、有意に高いＦＸａ阻害活性を有してい
た。図５２から判断されるポリペプチドＲ１１Ｌ／Ｑ１
９Ｋ／Ｙ４６ＤのＦＸａ阻害活性は、コントロールであ
るポリペプチドＡＮ６８の約１６倍であった。

【０１７２】実施例１５（４）で得た本発明の新規ポリ
ペプチド、Ｒ１１Ｅ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｅは、コントロ
ールと比べて、有意に高いＦＸａ阻害活性を有してい
た。図５３から判断されるポリペプチドＲ１１Ｅ／Ｑ１
９Ｋ／Ｙ４６ＥのＦＸａ阻害活性は、コントロールであ
るポリペプチドＡＮ６８の約１３倍であった。

【０１７３】（３）ヒトエラスターゼ阻害活性 本発明の新規ポリペプチドの精製標品を、１００μｌの
蒸留水に溶解した。この溶液のポリペプチド濃度を、Ｕ
ＴＩ（既出）をスタンダードとして、ウシトリプシン阻
害活性より求めた後、０．１％ＢＳＡ／２７ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ₂ ／１３３ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
で各種濃度に希釈し、ヒトエラスターゼ阻害活性測定用
のサンプルとした。同様に、ポリペプチドＡＮ６８およ
び実施例１０で得た新規ポリペプチドＱ１９Ｋ／Ｙ４６
Ｄをそれぞれ各種濃度に希釈してコントロールとした。
活性測定用サンプルおよびコントロールのヒトエラスタ
ーゼ阻害活性を、合成基質、ＳＴＡＮＡ（ペプチド研究
所製）を基質とし、オガワ(Ogawa) 等の方法(Ogawa M.
等、Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol., 55巻、2
71-274 頁、1987年）に準じて測定した。

【０１７４】まず、ヒト好中球エラスターゼ（カルビオ
ケム社製）を２７ｍＭ ＣａＣｌ₂／１３３ｍＭ トリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて、６Ｕ／ｍｌに調製
し、さらに、０．１％ＢＳＡ／２７ｍＭ ＣａＣｌ₂ ／
１３３ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて希釈
し、０．２４Ｕ／ｍｌのエラスターゼ溶液を調製した。
一方、合成基質ＳＴＡＮＡをＮ−メチル−２−ピロリド
ン(N-methyl-2-pyrrolidone)で１００ｍＭに溶解し、さ
らに、０．１％ＢＳＡ／２７ｍＭ ＣａＣｌ₂ ／１３３
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて希釈し、２０
ｍＭのＳＴＡＮＡ溶液を調製した。

【０１７５】上記ヒトエラスターゼ阻害活性測定用サン
プルもしくはコントロール５０μｌ、エラスターゼ溶液
５０μｌ、および０．１％ＢＳＡ／２７ｍＭ ＣａＣｌ
₂ ／１３３ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）５０μ
ｌを混合し、３７℃にて１０分間静置した。次いでＳＴ
ＡＮＡ溶液５０μｌを加え、反応を開始させた。３７℃
にて２０分間反応後、５０％酢酸５０μｌを加えて反応
を停止させ、分光光度計にて、波長４０５ｎｍにおける
吸光度を測定した。

【０１７６】なお、データ処理の際に、ここで用いた各
種溶液の吸光度への影響を差し引くための対照として
は、上述のエラスターゼ溶液５０μｌに、予め、５０％
酢酸５０μｌを加え、活性測定用サンプルもしくはコン
トロール５０μｌ、０．１％ＢＳＡ／２７ｍＭＣａＣｌ
₂ ／１３３ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）５０μ
ｌ、ＳＴＡＮＡ溶液５０μｌを加えたものを使用した。

【０１７７】結果を図５４から図５５に示した。図中、
残存ヒトエラスターゼ活性は、上記測定系において、活
性測定用サンプルもしくはコントロールの代わりに０．
１％ＢＳＡ／２７ｍＭ ＣａＣｌ₂ ／１３３ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を５０μｌ加えて反応させた
時の吸光度を１００％として、百分率にて示したもので
ある。

【０１７８】実施例１２（３）で得た本発明の新規ポリ
ペプチドＲ１１Ｑ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄは、コントロー
ルと比べて、有意に高いエラスターゼ阻害活性を有して
いた。図５４から判断されるエラスタ−ゼ阻害活性はコ
ントロールであるポリペプチドＡＮ６８の約３倍であ
り、ポリペプチドＱ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄの約３倍であっ
た。

【０１７９】実施例１３（３）で得た本発明の新規ポリ
ペプチドＲ１１Ｄ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄは、コントロー
ルと比べて、有意に高いエラスターゼ阻害活性を有して
いた。図５４から判断されるエラスタ−ゼ阻害活性はコ
ントロールであるポリペプチドＡＮ６８の約３倍であ
り、ポリペプチドＱ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄの約３倍であっ
た。

【０１８０】実施例１４（３）で得た本発明の新規ポリ
ペプチドＲ１１Ｌ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄは、コントロー
ルと比べて、有意に高いエラスターゼ阻害活性を有して
いた。図５４から判断されるエラスタ−ゼ阻害活性はコ
ントロールであるポリペプチドＡＮ６８の約２倍であ
り、ポリペプチドＱ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄの約２倍であっ
た。

【０１８１】実施例１５（４）で得た本発明の新規ポリ
ペプチドＲ１１Ｅ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｅは、コントロー
ルと比べて、有意に高いエラスターゼ阻害活性を有して
いた。図５５から判断されるエラスタ−ゼ阻害活性はコ
ントロールであるポリペプチドＡＮ６８の約５倍であ
り、実施例１５（１）で得られたプラスミドｐＭ７２１
で形質転換させた形質転換体ＪＥ５５０５（ｐＭ７２
１）の培養上清から精製したポリペプチドＱ１９Ｋ／Ｙ
４６Ｅの約６倍であった。

【０１８２】実施例１８．安全性 本発明の新規ポリペプチドの安全性を以下の（１）、
（２）の方法で確認した。

【０１８３】（１） 形質転換体ＪＥ５５０５（ｐＭ５
７５Ｂ）、ＪＥ５５０５（ｐＭ５７６）、ＪＥ５５０５
（ｐＭ７３５）、ＪＥ５５０５（ｐＭ７３６）、ＪＥ５
５０５（ｐＭ７２６Ｂ）、ＪＥ５５０５（ｐＭ５７５
Ｃ）、ＪＥ５５０５（ｐＭ５７６Ｂ）、ＪＥ５５０５
（ｐＭ７３７Ｂ）をそれぞれ培養し、培養上清から実施
例２（４）の方法を参考にして、本発明のポリペプチ
ド、Ｙ４６Ｅ、Ｑ１９Ｋ、Ｑ１９Ｒ、Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６
Ｅ、Ｒ１１Ｅ／Ｙ４６Ｅ、Ｙ４６Ｅ−ＡＮ、Ｑ１９Ｋ−
ＡＮ、Ｑ１９Ｒ／Ｙ４６Ｅの精製標品を得た。おのおの
生理食塩水に溶解し、分画分子量２００００のパイロザ
ルトユニット（ザルトリウス社）を用いて、リポポリサ
ッカライド（以後ＬＰＳと略す）を除去し、以下の動物
実験に使用した。１週間予備飼育した雄性および雌性の
Ｗｉｓｔａｒ系ラットを、１群１０匹として群分けし
た。ポリペプチドの投与量が１００ｍｇ／ｋｇ／日とな
るように上記ポリペプチド溶液をそれぞれ、ラットに静
脈内投与した。これをポリペプチド投与群とし、１週間
にわたって症状と体重変化を観察した。また、生理食塩
水を投与した同数の動物を対照群とした。その結果、い
ずれのポリペプチド投与群においても、顕著な副作用は
認められず、その生存率および体重変化は対照群のそれ
と同様であった。

【０１８４】（２） 形質転換体ＪＥ５５０５（ｐＭ７
２７）、ＪＥ５５０５（ｐＭ７４４）、ＪＥ５５０５
（ｐＭ７４１）、ＪＥ５５０５（ｐＭ７４２）、ＪＥ５
５０５（ｐＭ７４３）、ＪＥ５５０５（ｐＭ７３８）、
ＪＥ５５０５（ｐＭ７６４）、ＪＥ５５０５（ｐＭ７６
５）、ＪＥ５５０５（ｐＭ７６７）をそれぞれ培養し、
培養混合物から実施例１０（４）、（５）、（６）の方
法を参考にして、本発明のポリペプチドＱ１９Ｋ／Ｙ４
６Ｄ、Ｑ１９Ｒ／Ｙ４６Ｄ、Ｒ１１Ｑ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４
６Ｄ、Ｒ１１Ｄ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄ、Ｒ１１Ｌ／Ｑ１
９Ｋ／Ｙ４６Ｄ、Ｒ１１Ｅ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｅ、Ｒ１
１Ｎ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄ、Ｒ１１Ｓ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４
６Ｄ、Ｒ１１Ａ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ａの精製標品を得
た。おのおの生理食塩水に溶解し、オメガセル（１００
Ｋ）（フィルトロン社）を用いた限外濾過によりＬＰＳ
を除去し、以下の動物実験に供した。１週間予備飼育し
た雄性および雌性のＷｉｓｔａｒ系ラットを、１群１０
匹として群分けした。ポリペプチドの投与量が１０ｍｇ
／ｋｇ／日となるように上記ポリペプチド溶液をそれぞ
れ、ラットに静脈内投与した。これをポリペプチド投与
群とし、１週間にわたって症状と体重変化を観察した。
また、生理食塩水を投与した同数の動物を対照群とし
た。その結果、いずれのポリペプチド投与群において
も、顕著な副作用は認められず、その生存率および体重
変化は対照群のそれと同様であった。

【０１８５】実施例１９．製剤の作成 形質転換体ＪＥ５５０５（ｐＭ５７５Ｂ）、ＪＥ５５０
５（ｐＭ５７６）、ＪＥ５５０５（ｐＭ７３５）、ＪＥ
５５０５（ｐＭ７３６）、ＪＥ５５０５（ｐＭ７２６
Ｂ）、ＪＥ５５０５（ｐＭ５７５Ｃ）、ＪＥ５５０５
（ｐＭ５７６Ｂ）、ＪＥ５５０５（ｐＭ７３７Ｂ）をそ
れぞれ培養し、培養上清から実施例２（４）の方法を参
考にして、本発明のポリペプチド、Ｙ４６Ｅ、Ｑ１９
Ｋ、Ｑ１９Ｒ、Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｅ、Ｒ１１Ｅ／Ｙ４６
Ｅ、Ｙ４６Ｅ−ＡＮ、Ｑ１９Ｋ−ＡＮ、Ｑ１９Ｒ／Ｙ４
６Ｅの精製標品を得た。形質転換体ＪＥ５５０５（ｐＭ
７２７）、ＪＥ５５０５（ｐＭ７４４）、ＪＥ５５０５
（ｐＭ７４１）、ＪＥ５５０５（ｐＭ７４２）、ＪＥ５
５０５（ｐＭ７４３）、ＪＥ５５０５（ｐＭ７３８）、
ＪＥ５５０５（ｐＭ７６４）、ＪＥ５５０５（ｐＭ７６
５）、ＪＥ５５０５（ｐＭ７６７）をそれぞれ培養し、
培養混合物から実施例１０（４）、（５）、（６）の方
法を参考にして、本発明のポリペプチドＱ１９Ｋ／Ｙ４
６Ｄ、Ｑ１９Ｒ／Ｙ４６Ｄ、Ｒ１１Ｑ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４
６Ｄ、Ｒ１１Ｄ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄ、Ｒ１１Ｌ／Ｑ１
９Ｋ／Ｙ４６Ｄ、Ｒ１１Ｅ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｅ、Ｒ１
１Ｎ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄ、Ｒ１１Ｓ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４
６Ｄ、Ｒ１１Ａ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄの精製標品を得
た。得られた精製標品をおのおの蒸留水に溶解し、オメ
ガセル（既出）を用いてＬＰＳを除去した後、減圧乾固
した。

【０１８６】（１）注射用蒸留水を用いて調製した発熱
性物質不含ゼラチン０．１％（ｗ／ｖ）を含む１／１５
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に精製ポリペプチドを溶
解し、最終濃度２ｍｇ／ｍｌのポリペプチド溶液とし
た。塩化ナトリウムをその最終濃度が７５ｍＭとなるよ
うに、また、マンニトールをその最終濃度が２％（ｗ／
ｖ）となるように、おのおの、ポリペプチド溶液に加
え、減菌した孔径０．２２μｍのメンブランフィルター
（ディスポーザブル・ステライル・フィルタ・システ
ム、コーニング社製）を用いて濾過減菌した後、ガラス
容器に５ｍｌずつ分注した。

【０１８７】（２）注射用蒸留水を用いて調製した０．
１４Ｍ塩化ナトリウム含有０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）に精製ポリペプチドを溶解し、最終濃度２ｍ
ｇ／ｍｌのポリペプチド溶液とした。ヒト血清アルブミ
ンを最終濃度が１％（ｗ／ｖ）となるように、おのお
の、ポリペプチド溶液に加え、減菌した孔径０．２２μ
ｍのメンブランフィルター（ディスポーザブル・ステラ
イル・フィルターシステム、既出）を用いて濾過減菌し
た後、ガラス溶液に５ｍｌずつ分注し、無菌状態で凍結
乾燥して、密封した。

【０１８８】

【発明の効果】本発明により、新規ポリペプチドおよび
その製造方法が提供される。また、本発明により、上記
ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡの配列を含
むことを特徴とするベクターおよび該ＤＮＡまたは該ベ
クターによって形質転換された形質転換体が提供され
る。さらに、本発明により、上記ポリペプチドを有効成
分として含有する医薬組成物および上記ポリペプチドを
用いることを特徴とする酵素阻害方法が提供される。本
発明のポリペプチドは、医薬組成物として、侵襲、多臓
器不全、ショック、膵炎、播種性血管内凝固症候群、虚
血性心疾患、腎炎、肝硬変、血行再建術時の再閉塞、血
管透過性の昂進による浮腫、成人呼吸困難症候群、慢性
関節リウマチ、関節炎およびアレルギー等の疾患の予防
および／または治療を目的とした医薬品の開発に新しい
道を開くものである。本発明のポリペプチドはまた、血
液凝固阻害活性を有することから、人工血管、人工臓
器、カテーテル等の医用器材の表面に架橋剤などを用い
て結合あるいは吸着させて用いることもできる。

【０１８９】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：３１３ 配列の型：核酸 配列の種類：他の核酸 起源 生物名：大腸菌 株 名：ＪＥ５５０５（ｐＭ５７５Ｂ） 配列 AAGCTTAAAA AAGGGTATAA AATAAA ATG AAA CAA AGT ACT ATT GCA CTG 50 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu -20 -15 GCA CTC TTA CCG TTA CTG TTT ACC CCT GTG ACA AAG GCC ACC GTC 95 Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr Pro Val Thr Lys Ala Thr Val -10 - 5 1 GCC GCC TGC AAT CTC CCC ATA GTC CGG GGC CCC TGC CGA GCC TTC 140 Ala Ala Cys Asn Leu Pro Ile Val Arg Gly Pro Cys Arg Ala Phe 5 10 15 ATC CAG CTC TGG GCA TTT GAT GCT GTC AAG GGG AAG TGC GTC CTC 185 Ile Gln Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu 20 25 30 TTC CCC TAC GGG GGC TGC CAG GGC AAC GGG AAC AAG TTC GAA TCA 230 Phe Pro Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Glu Ser 35 40 45 GAG AAG GAG TGC AGA GAG TAC TGC GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT 275 Glu Lys Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp 50 55 60 GAG GAG CTG CTG CGC TTC TCC AAC TGACAACTGG ATCC 313 Glu Glu Leu Leu Arg Phe Ser Asn 65 70

【０１９０】配列番号：２ 配列の長さ：７０ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Val Ala Ala Cys Asn Leu Pro Ile Val Arg Gly Pro Cys Arg 1 5 10 15 Ala Phe Ile Gln Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys 20 25 30 Val Leu Phe Pro Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe 35 40 45 Glu Ser Glu Lys Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp 50 55 60 Gly Asp Glu Glu Leu Leu Arg Phe Ser Asn 65 70

【０１９１】配列番号：３ 配列の長さ：３１３ 配列の型：核酸 配列の種類：他の核酸 起源 生物名：大腸菌 株 名：ＪＥ５５０５（ｐＭ５７６） 配列 AAGCTTAAAA AAGGGTATAA AATAAA ATG AAA CAA AGT ACT ATT GCA CTG 50 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu -20 -15 GCA CTC TTA CCG TTA CTG TTT ACC CCT GTG ACA AAG GCC GAC GAC 95 Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr Pro Val Thr Lys Ala Asp Asp -10 - 5 1 GCC GCC TGC AAT CTC CCC ATA GTC CGG GGC CCC TGC CGA GCC TTC 140 Ala Ala Cys Asn Leu Pro Ile Val Arg Gly Pro Cys Arg Ala Phe 5 10 15 ATC AAG CTC TGG GCA TTT GAT GCT GTC AAG GGG AAG TGC GTC CTC 185 Ile Lys Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu 20 25 30 TTC CCC TAC GGG GGC TGC CAG GGC AAC GGG AAC AAG TTC TAC TCA 230 Phe Pro Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Tyr Ser 35 40 45 GAG AAG GAG TGC AGA GAG TAC TGC GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT 275 Glu Lys Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp 50 55 60 GAG GAG CTG CTG CGC TTC TCC AAC TGACAACTGG ATCC 313 Glu Glu Leu Leu Arg Phe Ser Asn 65 70

【０１９２】配列番号：４ 配列の長さ：７０ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Asp Asp Ala Ala Cys Asn Leu Pro Ile Val Arg Gly Pro Cys Arg 1 5 10 15 Ala Phe Ile Lys Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys 20 25 30 Val Leu Phe Pro Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe 35 40 45 Tyr Ser Glu Lys Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp 50 55 60 Gly Asp Glu Glu Leu Leu Arg Phe Ser Asn 65 70

【０１９３】配列番号：５ 配列の長さ：３１３ 配列の型：核酸 配列の種類：他の核酸 起源 生物名：大腸菌 株 名：ＪＥ５５０５（ｐＭ７３５） 配列 AAGCTTAAAA AAGGGTATAA AATAAA ATG AAA CAA AGT ACT ATT GCA CTG 50 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu -20 -15 GCA CTC TTA CCG TTA CTG TTT ACC CCT GTG ACA AAG GCC GCG GCC 95 Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr Pro Val Thr Lys Ala Ala Ala -10 - 5 1 TGT AAT CTA CCA ATA GTC CGG GGC CCC TGC CGA GCC TTC ATC CGT 140 Cys Asn Leu Pro Ile Val Arg Gly Pro Cys Arg Ala Phe Ile Arg 5 10 15 CTC TGG GCA TTT GAT GCT GTC AAG GGG AAG TGC GTC CTC TTC CCC 185 Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu Phe Pro 20 25 30 TAC GGG GGC TGC CAG GGC AAC GGG AAC AAG TTC TAC TCA GAG AAG 230 Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Tyr Ser Glu Lys 35 40 45 GAG TGC AGA GAG TAC TGC GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT GAG GAG 275 Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu 50 55 60 CTG CTG CGC TTC TCC AAC TGACAACTGG ATCC 307 Leu Leu Arg Phe Ser Asn 65 68

【０１９４】配列番号：６ 配列の長さ：６８ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Ala Cys Asn Leu Pro Ile Val Arg Gly Pro Cys Arg Ala Phe 1 5 10 15 Ile Arg Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu 20 25 30 Phe Pro Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Tyr Ser 35 40 45 Glu Lys Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp 50 55 60 Glu Glu Leu Leu Arg Phe Ser Asn 65 68

【０１９５】配列番号：７ 配列の長さ：３０７ 配列の型：核酸 配列の種類：他の核酸 起源 生物名：大腸菌 株 名：ＪＥ５５０５（ｐＭ７３６） 配列 AAGCTTAAAA AAGGGTATAA AATAAA ATG AAA CAA AGT ACT ATT GCA CTG 50 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu -20 -15 GCA CTC TTA CCG TTA CTG TTT ACC CCT GTG ACA AAG GCC GCG GCC 95 Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr Pro Val Thr Lys Ala Ala Ala -10 - 5 1 TGT AAT CTA CCA ATA GTC CGG GGC CCC TGC CGA GCC TTC ATC AAG 140 Cys Asn Leu Pro Ile Val Arg Gly Pro Cys Arg Ala Phe Ile Lys 5 10 15 CTC TGG GCA TTT GAT GCT GTC AAG GGG AAG TGC GTC CTC TTC CCC 185 Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu Phe Pro 20 25 30 TAC GGG GGC TGC CAG GGC AAC GGG AAC AAG TTC GAA TCA GAG AAG 230 Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Glu Ser Glu Lys 35 40 45 GAG TGC AGA GAG TAC TGC GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT GAG GAG 275 Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu 50 55 60 CTG CTG CGC TTC TCC AAC TGACAACTGG ATCC 307 Leu Leu Arg Phe Ser Asn 65 68

【０１９６】配列番号：８ 配列の長さ：６８ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Ala Cys Asn Leu Pro Ile Val Arg Gly Pro Cys Arg Ala Phe 1 5 10 15 Ile Lys Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu 20 25 30 Phe Pro Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Glu Ser 35 40 45 Glu Lys Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp 50 55 60 Glu Glu Leu Leu Arg Phe Ser Asn 65 68

【０１９７】配列番号：９ 配列の長さ：３０７ 配列の型：核酸 配列の種類：他の核酸 起源 生物名：大腸菌 株 名：ＪＥ５５０５（ｐＭ７２６Ｂ） 配列 AAGCTTAAAA AAGGGTATAA AATAAA ATG AAA CAA AGT ACT ATT GCA CTG 50 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu -20 -15 GCA CTC TTA CCG TTA CTG TTT ACC CCT GTG ACA AAG GCC GCG GCC 95 Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr Pro Val Thr Lys Ala Ala Ala -10 - 5 1 TGT AAT CTA CCA ATA GTC GAA GGC CCC TGC CGA GCC TTC ATC CAG 140 Cys Asn Leu Pro Ile Val Glu Gly Pro Cys Arg Ala Phe Ile Gln 5 10 15 CTC TGG GCA TTT GAT GCT GTC AAG GGG AAG TGC GTC CTC TTC CCC 185 Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu Phe Pro 20 25 30 TAC GGG GGC TGC CAG GGC AAC GGG AAC AAG TTC GAA TCA GAG AAG 230 Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Glu Ser Glu Lys 35 40 45 GAG TGC AGA GAG TAC TGC GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT GAG GAG 275 Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu 50 55 60 CTG CTG CGC TTC TCC AAC TGACAACTGG ATCC 307 Leu Leu Arg Phe Ser Asn 65 68

【０１９８】配列番号：１０ 配列の長さ：６８ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Ala Cys Asn Leu Pro Ile Val Glu Gly Pro Cys Arg Ala Phe 1 5 10 15 Ile Gln Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu 20 25 30 Phe Pro Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Glu Ser 35 40 45 Glu Lys Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp 50 55 60 Glu Glu Leu Leu Arg Phe Ser Asn 65 68

【０１９９】配列番号：１１ 配列の長さ：３０７ 配列の型：核酸 配列の種類：他の核酸 起源 生物名：大腸菌 株 名：ＪＥ５５０５（ｐＭ５７５Ｃ） 配列 AAGCTTAAAA AAGGGTATAA AATAAA ATG AAA CAA AGT ACT ATT GCA CTG 50 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu -20 -15 GCA CTC TTA CCG TTA CTG TTT ACC CCT GTG ACA AAG GCC GCG GCC 95 Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr Pro Val Thr Lys Ala Ala Ala -10 - 5 1 TGT AAT CTA CCA ATA GTC CGG GGC CCC TGC CGA GCC TTC ATC CAG 140 Cys Asn Leu Pro Ile Val Arg Gly Pro Cys Arg Ala Phe Ile Gln 5 10 15 CTC TGG GCA TTT GAT GCT GTC AAG GGG AAG TGC GTC CTC TTC CCC 185 Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu Phe Pro 20 25 30 TAC GGG GGC TGC CAG GGC AAC GGG AAC AAG TTC GAA TCA GAG AAG 230 Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Glu Ser Glu Lys 35 40 45 GAG TGC AGA GAG TAC TGC GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT GAG GAG 275 Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu 50 55 60 CTG CTG CGC TTC TCC AAC TGACAACTGG ATCC 307 Leu Leu Arg Phe Ser Asn 65 68

【０２００】配列番号：１２ 配列の長さ：６８ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Ala Cys Asn Leu Pro Ile Val Arg Gly Pro Cys Arg Ala Phe 1 5 10 15 Ile Gln Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu 20 25 30 Phe Pro Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Glu Ser 35 40 45 Glu Lys Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp 50 55 60 Glu Glu Leu Leu Arg Phe Ser Asn 65 68

【０２０１】配列番号：１３ 配列の長さ：３０７ 配列の型：核酸 配列の種類：他の核酸 起源 生物名：大腸菌 株 名：ＪＥ５５０５（ｐＭ５７６Ｂ） 配列 AAGCTTAAAA AAGGGTATAA AATAAA ATG AAA CAA AGT ACT ATT GCA CTG 50 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu -20 -15 GCA CTC TTA CCG TTA CTG TTT ACC CCT GTG ACA AAG GCC GCG GCC 95 Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr Pro Val Thr Lys Ala Ala Ala -10 - 5 1 TGT AAT CTA CCA ATA GTC CGG GGC CCC TGC CGA GCC TTC ATC AAG 140 Cys Asn Leu Pro Ile Val Arg Gly Pro Cys Arg Ala Phe Ile Lys 5 10 15 CTC TGG GCA TTT GAT GCT GTC AAG GGG AAG TGC GTC CTC TTC CCC 185 Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu Phe Pro 20 25 30 TAC GGG GGC TGC CAG GGC AAC GGG AAC AAG TTC TAC TCA GAG AAG 230 Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Tyr Ser Glu Lys 35 40 45 GAG TGC AGA GAG TAC TGC GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT GAG GAG 275 Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu 50 55 60 CTG CTG CGC TTC TCC AAC TGACAACTGG ATCC 307 Leu Leu Arg Phe Ser Asn 65 68

【０２０２】配列番号：１４ 配列の長さ：６８ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Ala Cys Asn Leu Pro Ile Val Arg Gly Pro Cys Arg Ala Phe 1 5 10 15 Ile Lys Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu 20 25 30 Phe Pro Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Tyr Ser 35 40 45 Glu Lys Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp 50 55 60 Glu Glu Leu Leu Arg Phe Ser Asn 65 68

【０２０３】配列番号：１５ 配列の長さ：３０７ 配列の型：核酸 配列の種類：他の核酸 起源 生物名：大腸菌 株 名：ＪＥ５５０５（ｐＭ７３７Ｂ） 配列 AAGCTTAAAA AAGGGTATAA AATAAA ATG AAA CAA AGT ACT ATT GCA CTG 50 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu -20 -15 GCA CTC TTA CCG TTA CTG TTT ACC CCT GTG ACA AAG GCC GCG GCC 95 Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr Pro Val Thr Lys Ala Ala Ala -10 - 5 1 TGT AAT CTA CCA ATA GTC CGG GGC CCC TGC CGA GCC TTC ATC CGT 140 Cys Asn Leu Pro Ile Val Arg Gly Pro Cys Arg Ala Phe Ile Arg 5 10 15 CTC TGG GCA TTT GAT GCT GTC AAG GGG AAG TGC GTC CTC TTC CCC 185 Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu Phe Pro 20 25 30 TAC GGG GGC TGC CAG GGC AAC GGG AAC AAG TTC GAA TCA GAG AAG 230 Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Glu Ser Glu Lys 35 40 45 GAG TGC AGA GAG TAC TGC GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT GAG GAG 275 Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu 50 55 60 CTG CTG CGC TTC TCC AAC TGACAACTGG ATCC 307 Leu Leu Arg Phe Ser Asn 65 68

【０２０４】配列番号：１６ 配列の長さ：６８ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Ala Cys Asn Leu Pro Ile Val Arg Gly Pro Cys Arg Ala Phe 1 5 10 15 Ile Arg Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu 20 25 30 Phe Pro Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Glu Ser 35 40 45 Glu Lys Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp 50 55 60 Glu Glu Leu Leu Arg Phe Ser Asn 65 68

【０２０５】配列番号：１７ 配列の長さ：３４３ 配列の型：核酸 配列の種類：他の核酸 起源 生物名：大腸菌 株 名：ＪＥ５５０５（ｐＭ７２７） 配列 AAGCTTAAAA AAGGGTATAA AATAAA ATG AAA CAA AGT ACT ATT GCA CTG 50 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu -20 -15 GCA CTC TTA CCG TTA CTG TTT ACC CCT GTG ACA AAG GCC GCT GTG 95 Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr Pro Val Thr Lys Ala Ala Val -10 -1 1 CTA CCG CAA GAA GAA GAA GGC TCG GGT ATG GCC GCC TGT AAT CTA 140 Leu Pro Gln Glu Glu Glu Gly Ser Gly Met Ala Ala Cys Asn Leu 5 10 15 CCA ATA GTC CGG GGC CCC TGC CGA GCC TTC ATC AAG CTC TGG GCA 185 Pro Ile Val Arg Gly Pro Cys Arg Ala Phe Ile Lys Leu Trp Ala 20 25 30 TTT GAT GCT GTC AAG GGG AAG TGC GTC CTC TTC CCC TAC GGG GGC 230 Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu Phe Pro Tyr Gly Gly 35 40 45 TGC CAG GGC AAC GGG AAC AAG TTC GAC TCA GAG AAG GAG TGC AGA 275 Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Asp Ser Glu Lys Glu Cys Arg 50 55 60 GAG TAC TGC GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT GAG GAG CTG CTG CGC 320 Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu Leu Leu Arg 65 70 75 TTC TCC AAC TGACAACTGG ATCC 343 Phe Ser Asn 80

【０２０６】配列番号：１８ 配列の長さ：６８ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Ala Cys Asn Leu Pro Ile Val Arg Gly Pro Cys Arg Ala Phe 1 5 10 15 Ile Lys Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu 20 25 30 Phe Pro Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Asp Ser 35 40 45 Glu Lys Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp 50 55 60 Glu Glu Leu Leu Arg Phe Ser Asn 65 68

【０２０７】配列番号：１９ 配列の長さ：３４３ 配列の型：核酸 配列の種類：他の核酸 起源 生物名：大腸菌 株 名：ＪＥ５５０５（ｐＭ７４４） 配列 AAGCTTAAAA AAGGGTATAA AATAAA ATG AAA CAA AGT ACT ATT GCA CTG 50 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu -20 -15 GCA CTC TTA CCG TTA CTG TTT ACC CCT GTG ACA AAG GCC GCT GTG 95 Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr Pro Val Thr Lys Ala Ala Val -10 -1 1 CTA CCG CAA GAA GAA GAA GGC TCG GGT ATG GCC GCC TGT AAT CTA 140 Leu Pro Gln Glu Glu Glu Gly Ser Gly Met Ala Ala Cys Asn Leu 5 10 15 CCA ATA GTC CGG GGC CCC TGC CGA GCC TTC ATC CGT CTC TGG GCA 185 Pro Ile Val Arg Gly Pro Cys Arg Ala Phe Ile Arg Leu Trp Ala 20 25 30 TTT GAT GCT GTC AAG GGG AAG TGC GTC CTC TTC CCC TAC GGG GGC 230 Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu Phe Pro Tyr Gly Gly 35 40 45 TGC CAG GGC AAC GGG AAC AAG TTC GAC TCA GAG AAG GAG TGC AGA 275 Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Asp Ser Glu Lys Glu Cys Arg 50 55 60 GAG TAC TGC GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT GAG GAG CTG CTG CGC 320 Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu Leu Leu Arg 65 70 75 TTC TCC AAC TGACAACTGG ATCC 343 Phe Ser Asn 80

【０２０８】配列番号： ２０ 配列の長さ：６８ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Ala Cys Asn Leu Pro Ile Val Arg Gly Pro Cys Arg Ala Phe 1 5 10 15 Ile Arg Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu 20 25 30 Phe Pro Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Asp Ser 35 40 45 Glu Lys Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp 50 55 60 Glu Glu Leu Leu Arg Phe Ser Asn 65 68

【０２０９】配列番号：２１ 配列の長さ：３４３ 配列の型：核酸 配列の種類：他の核酸 起源 生物名：大腸菌 株 名：ＪＥ５５０５（ｐＭ７４１） 配列 AAGCTTAAAA AAGGGTATAA AATAAA ATG AAA CAA AGT ACT ATT GCA CTG 50 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu -20 -15 GCA CTC TTA CCG TTA CTG TTT ACC CCT GTG ACA AAG GCC GCT GTG 95 Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr Pro Val Thr Lys Ala Ala Val -10 -1 1 CTA CCG CAA GAA GAA GAA GGC TCG GGT ATG GCC GCC TGT AAT CTA 140 Leu Pro Gln Glu Glu Glu Gly Ser Gly Met Ala Ala Cys Asn Leu 5 10 15 CCA ATA GTC CAG GGC CCC TGC CGA GCC TTC ATC AAG CTC TGG GCA 185 Pro Ile Val Gln Gly Pro Cys Arg Ala Phe Ile Lys Leu Trp Ala 20 25 30 TTT GAT GCT GTC AAG GGG AAG TGC GTC CTC TTC CCC TAC GGG GGC 230 Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu Phe Pro Tyr Gly Gly 35 40 45 TGC CAG GGC AAC GGG AAC AAG TTC GAC TCA GAG AAG GAG TGC AGA 275 Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Asp Ser Glu Lys Glu Cys Arg 50 55 60 GAG TAC TGC GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT GAG GAG CTG CTG CGC 320 Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu Leu Leu Arg 65 70 75 TTC TCC AAC TGACAACTGG ATCC 343 Phe Ser Asn 80

【０２１０】配列番号：２２ 配列の長さ：６８ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Ala Cys Asn Leu Pro Ile Val Gln Gly Pro Cys Arg Ala Phe 1 5 10 15 Ile Lys Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu 20 25 30 Phe Pro Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Asp Ser 35 40 45 Glu Lys Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp 50 55 60 Glu Glu Leu Leu Arg Phe Ser Asn 65 68

【０２１１】配列番号：２３ 配列の長さ：３４３ 配列の型：核酸 配列の種類：他の核酸 起源 生物名：大腸菌 株 名：ＪＥ５５０５（ｐＭ７４２） 配列 AAGCTTAAAA AAGGGTATAA AATAAA ATG AAA CAA AGT ACT ATT GCA CTG 50 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu -20 -15 GCA CTC TTA CCG TTA CTG TTT ACC CCT GTG ACA AAG GCC GCT GTG 95 Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr Pro Val Thr Lys Ala Ala Val -10 -1 1 CTA CCG CAA GAA GAA GAA GGC TCG GGT ATG GCC GCC TGT AAT CTA 140 Leu Pro Gln Glu Glu Glu Gly Ser Gly Met Ala Ala Cys Asn Leu 5 10 15 CCA ATA GTC GAT GGC CCC TGC CGA GCC TTC ATC AAG CTC TGG GCA 185 Pro Ile Val Asp Gly Pro Cys Arg Ala Phe Ile Lys Leu Trp Ala 20 25 30 TTT GAT GCT GTC AAG GGG AAG TGC GTC CTC TTC CCC TAC GGG GGC 230 Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu Phe Pro Tyr Gly Gly 35 40 45 TGC CAG GGC AAC GGG AAC AAG TTC GAC TCA GAG AAG GAG TGC AGA 275 Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Asp Ser Glu Lys Glu Cys Arg 50 55 60 GAG TAC TGC GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT GAG GAG CTG CTG CGC 320 Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu Leu Leu Arg 65 70 75 TTC TCC AAC TGACAACTGG ATCC 343 Phe Ser Asn 80

【０２１２】配列番号：２４ 配列の長さ：６８ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Ala Cys Asn Leu Pro Ile Val Asp Gly Pro Cys Arg Ala Phe 1 5 10 15 Ile Lys Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu 20 25 30 Phe Pro Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Asp Ser 35 40 45 Glu Lys Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp 50 55 60 Glu Glu Leu Leu Arg Phe Ser Asn 65 68

【０２１３】配列番号：２５ 配列の長さ：３４３ 配列の型：核酸 配列の種類：他の核酸 起源 生物名：大腸菌 株 名：ＪＥ５５０５（ｐＭ７４３） 配列 AAGCTTAAAA AAGGGTATAA AATAAA ATG AAA CAA AGT ACT ATT GCA CTG 50 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu -20 -15 GCA CTC TTA CCG TTA CTG TTT ACC CCT GTG ACA AAG GCC GCT GTG 95 Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr Pro Val Thr Lys Ala Ala Val -10 -1 1 CTA CCG CAA GAA GAA GAA GGC TCG GGT ATG GCC GCC TGT AAT CTA 140 Leu Pro Gln Glu Glu Glu Gly Ser Gly Met Ala Ala Cys Asn Leu 5 10 15 CCA ATA GTC CTG GGC CCC TGC CGA GCC TTC ATC AAG CTC TGG GCA 185 Pro Ile Val Leu Gly Pro Cys Arg Ala Phe Ile Lys Leu Trp Ala 20 25 30 TTT GAT GCT GTC AAG GGG AAG TGC GTC CTC TTC CCC TAC GGG GGC 230 Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu Phe Pro Tyr Gly Gly 35 40 45 TGC CAG GGC AAC GGG AAC AAG TTC GAC TCA GAG AAG GAG TGC AGA 275 Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Asp Ser Glu Lys Glu Cys Arg 50 55 60 GAG TAC TGC GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT GAG GAG CTG CTG CGC 320 Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu Leu Leu Arg 65 70 75 TTC TCC AAC TGACAACTGG ATCC 343 Phe Ser Asn 80

【０２１４】配列番号：２６ 配列の長さ：６８ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Ala Cys Asn Leu Pro Ile Val Leu Gly Pro Cys Arg Ala Phe 1 5 10 15 Ile Lys Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu 20 25 30 Phe Pro Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Asp Ser 35 40 45 Glu Lys Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp 50 55 60 Glu Glu Leu Leu Arg Phe Ser Asn 65 68

【０２１５】配列番号：２７ 配列の長さ：３４３ 配列の型：核酸 配列の種類：他の核酸 起源 生物名：大腸菌 株 名：ＪＥ５５０５（ｐＭ７３８） 配列 AAGCTTAAAA AAGGGTATAA AATAAA ATG AAA CAA AGT ACT ATT GCA CTG 50 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu -20 -15 GCA CTC TTA CCG TTA CTG TTT ACC CCT GTG ACA AAG GCC GCT GTG 95 Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr Pro Val Thr Lys Ala Ala Val -10 -1 1 CTA CCG CAA GAA GAA GAA GGC TCG GGT ATG GCC GCC TGT AAT CTA 140 Leu Pro Gln Glu Glu Glu Gly Ser Gly Met Ala Ala Cys Asn Leu 5 10 15 CCA ATA GTC GAA GGC CCC TGC CGA GCC TTC ATC AAG CTC TGG GCA 185 Pro Ile Val Glu Gly Pro Cys Arg Ala Phe Ile Lys Leu Trp Ala 20 25 30 TTT GAT GCT GTC AAG GGG AAG TGC GTC CTC TTC CCC TAC GGG GGC 230 Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu Phe Pro Tyr Gly Gly 35 40 45 TGC CAG GGC AAC GGG AAC AAG TTC GAA TCA GAG AAG GAG TGC AGA 275 Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Glu Ser Glu Lys Glu Cys Arg 50 55 60 GAG TAC TGC GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT GAG GAG CTG CTG CGC 320 Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu Leu Leu Arg 65 70 75 TTC TCC AAC TGACAACTGG ATCC 343 Phe Ser Asn 80

【０２１６】配列番号：２８ 配列の長さ：６８ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Ala Cys Asn Leu Pro Ile Val Glu Gly Pro Cys Arg Ala Phe 1 5 10 15 Ile Lys Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu 20 25 30 Phe Pro Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Glu Ser 35 40 45 Glu Lys Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp 50 55 60 Glu Glu Leu Leu Arg Phe Ser Asn 65 68

【０２１７】配列番号：２９ 配列の長さ：６８ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Ala Cys Asn Leu Pro Ile Val Asn Gly Pro Cys Arg Ala Phe 1 5 10 15 Ile Lys Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu 20 25 30 Phe Pro Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Asp Ser 35 40 45 Glu Lys Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp 50 55 60 Glu Glu Leu Leu Arg Phe Ser Asn 65 68

【０２１８】配列番号：３０ 配列の長さ：６８ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Ala Cys Asn Leu Pro Ile Val Ser Gly Pro Cys Arg Ala Phe 1 5 10 15 Ile Lys Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu 20 25 30 Phe Pro Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Asp Ser 35 40 45 Glu Lys Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp 50 55 60 Glu Glu Leu Leu Arg Phe Ser Asn 65 68

【０２１９】配列番号：３１ 配列の長さ：６８ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Ala Cys Asn Leu Pro Ile Val Ala Gly Pro Cys Arg Ala Phe 1 5 10 15 Ile Lys Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu 20 25 30 Phe Pro Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Asp Ser 35 40 45 Glu Lys Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp 50 55 60 Glu Glu Leu Leu Arg Phe Ser Asn 65 68

【０２２０】配列番号：３２ 配列の長さ：３４３ 配列の型：核酸 配列の種類：他の核酸 起源 生物名：大腸菌 株 名：ＪＥ５５０５（ｐＭ７６４） 配列 AAGCTTAAAA AAGGGTATAA AATAAA ATG AAA CAA AGT ACT ATT GCA CTG 50 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu -20 -15 GCA CTC TTA CCG TTA CTG TTT ACC CCT GTG ACA AAG GCC GCT GTG 95 Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr Pro Val Thr Lys Ala Ala Val -10 -1 1 CTA CCG CAA GAA GAA GAA GGC TCG GGT ATG GCC GCC TGT AAT CTA 140 Leu Pro Gln Glu Glu Glu Gly Ser Gly Met Ala Ala Cys Asn Leu 5 10 15 CCA ATA GTC AAC GGC CCC TGC CGA GCC TTC ATC AAG CTC TGG GCA 185 Pro Ile Val Asn Gly Pro Cys Arg Ala Phe Ile Lys Leu Trp Ala 20 25 30 TTT GAT GCT GTC AAG GGG AAG TGC GTC CTC TTC CCC TAC GGG GGC 230 Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu Phe Pro Tyr Gly Gly 35 40 45 TGC CAG GGC AAC GGG AAC AAG TTC GAC TCA GAG AAG GAG TGC AGA 275 Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Asp Ser Glu Lys Glu Cys Arg 50 55 60 GAG TAC TGC GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT GAG GAG CTG CTG CGC 320 Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu Leu Leu Arg 65 70 75 TTC TCC AAC TGACAACTGG ATCC 343 Phe Ser Asn 80

【０２２１】配列番号：３３ 配列の長さ：３４３ 配列の型：核酸 配列の種類：他の核酸 起源 生物名：大腸菌 株 名：ＪＥ５５０５（ｐＭ７６５） 配列 AAGCTTAAAA AAGGGTATAA AATAAA ATG AAA CAA AGT ACT ATT GCA CTG 50 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu -20 -15 GCA CTC TTA CCG TTA CTG TTT ACC CCT GTG ACA AAG GCC GCT GTG 95 Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr Pro Val Thr Lys Ala Ala Val -10 -1 1 CTA CCG CAA GAA GAA GAA GGC TCG GGT ATG GCC GCC TGT AAT CTA 140 Leu Pro Gln Glu Glu Glu Gly Ser Gly Met Ala Ala Cys Asn Leu 5 10 15 CCA ATA GTC AGC GGC CCC TGC CGA GCC TTC ATC AAG CTC TGG GCA 185 Pro Ile Val Ser Gly Pro Cys Arg Ala Phe Ile Lys Leu Trp Ala 20 25 30 TTT GAT GCT GTC AAG GGG AAG TGC GTC CTC TTC CCC TAC GGG GGC 230 Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu Phe Pro Tyr Gly Gly 35 40 45 TGC CAG GGC AAC GGG AAC AAG TTC GAC TCA GAG AAG GAG TGC AGA 275 Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Asp Ser Glu Lys Glu Cys Arg 50 55 60 GAG TAC TGC GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT GAG GAG CTG CTG CGC 320 Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu Leu Leu Arg 65 70 75 TTC TCC AAC TGACAACTGG ATCC 343 Phe Ser Asn 80

【０２２２】配列番号：３４ 配列の長さ：３４３ 配列の型：核酸 配列の種類：他の核酸 起源 生物名：大腸菌 株 名：ＪＥ５５０５（ｐＭ７６７） 配列 AAGCTTAAAA AAGGGTATAA AATAAA ATG AAA CAA AGT ACT ATT GCA CTG 50 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu -20 -15 GCA CTC TTA CCG TTA CTG TTT ACC CCT GTG ACA AAG GCC GCT GTG 95 Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr Pro Val Thr Lys Ala Ala Val -10 -1 1 CTA CCG CAA GAA GAA GAA GGC TCG GGT ATG GCC GCC TGT AAT CTA 140 Leu Pro Gln Glu Glu Glu Gly Ser Gly Met Ala Ala Cys Asn Leu 5 10 15 CCA ATA GTC GCG GGC CCC TGC CGA GCC TTC ATC AAG CTC TGG GCA 185 Pro Ile Val Ala Gly Pro Cys Arg Ala Phe Ile Lys Leu Trp Ala 20 25 30 TTT GAT GCT GTC AAG GGG AAG TGC GTC CTC TTC CCC TAC GGG GGC 230 Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu Phe Pro Tyr Gly Gly 35 40 45 TGC CAG GGC AAC GGG AAC AAG TTC GAC TCA GAG AAG GAG TGC AGA 275 Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Asp Ser Glu Lys Glu Cys Arg 50 55 60 GAG TAC TGC GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT GAG GAG CTG CTG CGC 320 Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu Leu Leu Arg 65 70 75 TTC TCC AAC TGACAACTGG ATCC 343 Phe Ser Asn 80

【図面の簡単な説明】

【図１】 オリゴヌクレオチドＳ３３、Ｓ３４、Ｓ３
５、Ｓ１８、Ｓ１９、Ｓ２０の塩基配列を示す図。

【図２】 プラスミドｐＭ４６８の構築方法を示す図。

【図３】 プラスミドｐＭ４６９の構築方法を示す図。

【図４】 プラスミドｐＭ５５２を示す図。

【図５】 オリゴマーＹ４６Ｅの塩基配列を示す図。

【図６】 ＳｃａＩセンスプライマーの塩基配列を示す
図。

【図７】 ＢａｍＨＩプライマーの塩基配列を示す図。

【図８】 プラスミドｐＭ５７５Ｂの構築方法を示す
図。

【図９】 プラスミドｐＭ５７５ＢのＨｉｎｄIII 消化
部位からＢａｍＨＩ消化部位までの塩基配列および対応
するアミノ酸配列を示す図。

【図１０】 オリゴマーＴＶ１２ＤＤの塩基配列を示す
図。

【図１１】 ＨｉｎｄIII プライマーの塩基配列を示す
図。

【図１２】 Ｑ１９Ｋプライマーの塩基配列を示す図。

【図１３】 ｐＢＲ ＢａｍＨＩプライマーの塩基配列
を示す図。

【図１４】 プラスミドｐＭ５７６の構築方法を示す
図。

【図１５】 プラスミドｐＭ５７６の構築方法を示す
図。

【図１６】 プラスミドｐＭ５７６のＨｉｎｄIII 消化
部位からＢａｍＨＩ消化部位までの塩基配列および対応
するアミノ酸配列を示す図。

【図１７】 ＡＮ６８プライマーの塩基配列を示す図。

【図１８】 ＳａｃIIプライマーの塩基配列を示す図。

【図１９】 Ｑ１９Ｒプライマーの塩基配列を示す図。

【図２０】 プラスミドｐＭ７３５の構築方法を示す
図。

【図２１】 プラスミドｐＭ７３５の構築方法を示す
図。

【図２２】 プラスミドｐＭ７３５のＨｉｎｄIII 消化
部位からＢａｍＨＩ消化部位までの塩基配列および対応
するアミノ酸配列を示す図。

【図２３】 プラスミドｐＭ７３６の構築方法を示す
図。

【図２４】 プラスミドｐＭ７３６のＨｉｎｄIII 消化
部位からＢａｍＨＩ消化部位までの塩基配列および対応
するアミノ酸配列を示す図。

【図２５】 Ｒ１１Ｅプライマーの塩基配列を示す図。

【図２６】 プラスミドｐＭ７２６Ｂの構築方法を示す
図。

【図２７】 プラスミドｐＭ７２６ＢのＨｉｎｄIII 消
化部位からＢａｍＨＩ消化部位までの塩基配列および対
応するアミノ酸配列を示す図。

【図２８】 プラスミドｐＭ５７５Ｃの構築方法を示す
図。

【図２９】 プラスミドｐＭ５７５ＣのＨｉｎｄIII 消
化部位からＢａｍＨＩ消化部位までの塩基配列および対
応するアミノ酸配列を示す図。

【図３０】 プラスミドｐＭ５７６Ｂの構築方法を示す
図。

【図３１】 プラスミドｐＭ５７６ＢのＨｉｎｄIII 消
化部位からＢａｍＨＩ消化部位までの塩基配列および対
応するアミノ酸配列を示す図。

【図３２】 プラスミドｐＭ７３７Ｂの構築方法を示す
図。

【図３３】 プラスミドｐＭ７３７ＢのＨｉｎｄIII 消
化部位からＢａｍＨＩ消化部位までの塩基配列および対
応するアミノ酸配列を示す図。

【図３４】 リンカー７１０の塩基配列を示す図。

【図３５】 Ｙ４６Ｄプライマーの塩基配列を示す図。

【図３６】 プラスミドｐＭ７２７のＨｉｎｄIII 消化
部位からＢａｍＨＩ消化部位までの塩基配列および対応
するアミノ酸配列を示す図。

【図３７】 プラスミドｐＭ７４４のＨｉｎｄIII 消化
部位からＢａｍＨＩ消化部位までの塩基配列および対応
するアミノ酸配列を示す図。

【図３８】 Ｒ１１Ｑプライマーの塩基配列を示す図。

【図３９】 プラスミドｐＭ７４１のＨｉｎｄIII 消化
部位からＢａｍＨＩ消化部位までの塩基配列および対応
するアミノ酸配列を示す図。

【図４０】 Ｒ１１Ｄプライマーの塩基配列を示す図。

【図４１】 プラスミドｐＭ７４２のＨｉｎｄIII 消化
部位からＢａｍＨＩ消化部位までの塩基配列および対応
するアミノ酸配列を示す図。

【図４２】 Ｒ１１Ｌプライマーの塩基配列を示す図。

【図４３】 プラスミドｐＭ７４３のＨｉｎｄIII 消化
部位からＢａｍＨＩ消化部位までの塩基配列および対応
するアミノ酸配列を示す図。

【図４４】 プラスミドｐＭ７３８のＨｉｎｄIII 消化
部位からＢａｍＨＩ消化部位までの塩基配列および対応
するアミノ酸配列を示す図。

【図４５】 本発明のポリペプチドＹ４６ＥのＦＸａ阻
害活性を示すグラフ。

【図４６】 本発明のポリペプチドＱ１９ＫのＦＸａ阻
害活性を示すグラフ。

【図４７】 本発明のポリペプチドＱ１９ＲのＦＸａ阻
害活性を示すグラフ。

【図４８】 本発明のポリペプチドＱ１９Ｋ／Ｙ４６Ｅ
のＦＸａ阻害活性を示すグラフ。

【図４９】 本発明のポリペプチドＲ１１Ｅ／Ｙ４６Ｅ
のＦＸａ阻害活性を示すグラフ。

【図５０】 本発明のポリペウチドＱ１９Ｒ／Ｙ４６Ｅ
のＦＸａ阻害活性を示すグラフ。

【図５１】 本発明のポリペプチドＱ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄ
およびＱ１９Ｒ／Ｙ４６ＤのＦＸａ阻害活性を示すグラ
フ。

【図５２】 本発明のポリペプチドＲ１１Ｑ／Ｑ１９Ｋ
／Ｙ４６Ｄ、Ｒ１１Ｄ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６ＤおよびＲ１
１Ｌ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６ＤのＦＸａ阻害活性を示すグラ
フ。

【図５３】 本発明のポリペプチドＲ１１Ｅ／Ｑ１９Ｋ
／Ｙ４６ＥのＦＸａ阻害活性を示すグラフ。

【図５４】 本発明のポリペプチドＲ１１Ｑ／Ｑ１９Ｋ
／Ｙ４６Ｄ、Ｒ１１Ｄ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄ、Ｒ１１Ｌ
／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄのエラスターゼ阻害活性を示すグ
ラフ。

【図５５】 本発明のポリペウチドＲ１１Ｅ／Ｑ１９Ｋ
／Ｙ４６Ｅのエラスターゼ阻害活性を示すグラフ。

【手続補正書】

【提出日】平成５年２月８日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２５】もちろん、これらの好ましい配列は、それ
ぞれＮ末端のみに追加されてもＣ末端のみに追加されて
も、Ｎ末端、Ｃ末端の両方に追加されてもよい。配列表
の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、
１８、２０、２２、２４、２６、２８、２９、３０およ
び３１に本発明第１の態様の新規ポリペプチドのより好
ましいアミノ酸配列を示した。これらは、ＦＸａ阻害活
性が上昇している以外にも、実施例に示した各種効果の
点で好ましい。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３７】もちろん、これらの好ましい配列は、５’
未満のみに追加されても３’未満のみに追加されても、
５’末端と３’末端の両方に追加されてもよい。なお、
配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１
５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、３２、３３
および３４に本発明第２の態様の新規ＤＮＡのより好ま
しい塩基配列を示した。これらは、ＦＸａ阻害活性が上
昇している以外にも実施例に示した各種効果の点で好ま
しい、本発明第１の態様のより好ましいポリペプチドを
コードするＤＮＡとして好ましい。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１５５

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１５５】実施例１６．ポリペプチドＲ１１Ｎ／Ｑ１
９Ｋ／Ｙ４６Ｄ、Ｒ１１Ｓ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄおよび
Ｒ１１Ａ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄの作製 前記式１のＮ末端から数えて７番目のアミノ酸がＡｓｎ
に変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドＲ１１Ｎ
／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄ（配列番号２９参照）、７番目の
アミノ酸がＳｅｒに変化したアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドＲ１１Ｓ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６Ｄ（配列番号３０
参照）、７番目のアミノ酸がＡｌａに変化したアミノ酸
配列を有するポリペプチドＲ１１Ａ／Ｑ１９Ｋ／Ｙ４６
Ｅ（配列番号３１参照）を以下の方法で作製した。ま
ず、実施例１２と同様に、それぞれ配列表の配列番号３
２、３３、３４に示される塩基配列を有するＤＮＡを、
Ｒ１１Ｎプライマー、Ｒ１１ＳプライマーおよびＲ１１
Ａプライマーを第一次ＰＣＲ用アンチセンスプライマー
としてＰＣＲにより作製し、大腸菌ＪＥ５５０５を形質
転換し、形質転換体ＪＥ５５０５（ｐＭ７６４）、ＪＥ
５５０５（ｐＭ７６５）、ＪＥ５５０５（ｐＭ７６７）
を得た。大腸菌の培養上清の一部をサンプリングして、
トリプシン阻害活性を測定したところ、いずれも、形質
転換体ＪＥ５５０５（ｐＭ７２７）の培養上清中のトリ
プシン阻害活性に比べて約４倍高かった。これらの結果
と、各ポリペプチドのウシトリプシン阻害の比活性を算
出した結果とから、前記式１のＮ末端から数えて７番目
のアミノ酸をＡｓｎ、ＳｅｒもしくはＡｌａに置換する
ことにより、当該ポリペプチドが形質転換体からの分泌
発現量が高くなることが確認された。得られた形質転換
体、ＪＥ５５０５（ｐＭ７６４）、ＪＥ５５０５（ｐＭ
７６５）、ＪＥ５５０５（ｐＭ７６７）を、実施例３
（３）の方法で培養し、実施例１０（４）、（５）、
（６）の方法で、ポリペプチドの精製を行った。得られ
た精製標品を各々実施例２（５）の方法でＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥに供したところ、単一のバンドが確認された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/15 15/70 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ０７Ｋ 99:00

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記式１のアミノ酸配列中の１つ以上のア
   ミノ酸を他のアミノ酸に置換させてなるアミノ酸配列
   を、少なくともその一部として有することを特徴とする
   新規ポリペプチド。 式１ 5 10 Cys Asn Leu Pro Ile Val Arg Gly Pro Cys 15 20 Arg Ala Phe Ile Gln Leu Trp Ala Phe Asp 25 30 Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu Phe Pro 35 40 Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys 45 50 Phe Tyr Ser Glu Lys Glu Cys Arg Glu Tyr Cys
2. 【請求項２】前記式１におけるアミノ酸の置換が、下記
   （ｉ）ないし（iii)より選ばれる１つ以上の置換である
   請求項１に記載の新規ポリペプチド。 （ｉ）Ｎ末端側より数えて１５番目のＧｌｎをＧｌｎ以
   外のアミノ酸に置換。 （ii）Ｎ末端側より数えて４２番目のＴｙｒをＴｙｒ以
   外のアミノ酸に置換。 (iii) Ｎ末端側より数えて７番目のＡｒｇをＡｒｇ以外
   のアミノ酸に置換。
3. 【請求項３】前記式１におけるアミノ酸の置換が、下記
   （ｉ）ないし（iii)より選ばれる、いずれかの効果をも
   たらすものである請求項１または２に記載の新規ポリペ
   プチド。 （ｉ）当該ポリペプチドの活性型血液凝固第Ｘ因子（Ｆ
   Ｘａ）に対する阻害活性を増強させる。 （ii）当該ポリペプチドを遺伝子工学的に産生させる際
   に形質転換体からの当該ポリペプチド分泌量を高める。 (iii) 当該ポリペプチドのエラスターゼに対する阻害活
   性を増強させる。
4. 【請求項４】前記式１におけるアミノ酸の置換が、少な
   くとも下記（１）ないし（１１）から選ばれる、いずれ
   か１つ以上の置換である、請求項１ないし３のいずれか
   に記載の新規ポリペプチド。 （１）Ｎ末端側より数えて１５番目のＧｌｎを、Ｌｙｓ
   に置換 （２）Ｎ末端側より数えて１５番目のＧｌｎを、Ａｒｇ
   に置換 （３）Ｎ末端側より数えて４２番目のＴｙｒを、Ｇｌｕ
   に置換 （４）Ｎ末端側より数えて４２番目のＴｙｒを、Ａｓｐ
   に置換 （５）Ｎ末端側より数えて７番目のＡｒｇを、Ｇｌｕに
   置換 （６）Ｎ末端側より数えて７番目のＡｒｇを、Ｇｌｎに
   置換 （７）Ｎ末端側より数えて７番目のＡｒｇを、Ａｓｐに
   置換 （８）Ｎ末端側より数えて７番目のＡｒｇを、Ｌｅｕに
   置換 （９）Ｎ末端側より数えて７番目のＡｒｇを、Ａｓｎに
   置換 （10）Ｎ末端側より数えて７番目のＡｒｇを、Ｓｅｒに
   置換 （11）Ｎ末端側より数えて７番目のＡｒｇを、Ａｌａに
   置換
5. 【請求項５】前記式１のアミノ酸配列中の１つ以上のア
   ミノ酸を他のアミノ酸に置換させてなるアミノ酸配列の
   Ｎ末端にさらに下記（１）ないし（５）より選ばれるい
   ずれかのアミノ酸配列が追加されたアミノ酸配列を、少
   なくともその一部として有することを特徴とする請求項
   １ないし４のいずれかに記載の新規ポリペプチド。 （１） Asp Asp Ala Ala （２） Thr Val Ala Ala （３） Val Ala Ala （４） Ala Ala （５） Ala
6. 【請求項６】前記式１のアミノ酸配列中の１つ以上のア
   ミノ酸を他のアミノ酸に置換させてなるアミノ酸配列の
   Ｃ末端にさらに下記（１）ないし（15）より選ばれるい
   ずれかのアミノ酸配列が追加されたアミノ酸配列を、少
   なくともその一部として有する請求項１ないし５のいず
   れかに記載の新規ポリペプチド。 （１）Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu Leu Leu
   Arg Phe Ser Asn （２）Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu Leu Leu
   Arg Phe Ser （３）Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu Leu Leu
   Arg Phe （４）Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu Leu Leu
   Arg （５）Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu Leu Leu （６）Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu Leu （７）Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu （８）Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu （９）Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp （10）Gly Val Pro Gly Asp Gly （11）Gly Val Pro Gly Asp （12）Gly Val Pro Gly （13）Gly Val Pro （14）Gly Val （15）Gly
7. 【請求項７】前記新規ポリペプチドが、少なくともプロ
   テアーゼに対する阻害活性を有する請求項１ないし６の
   いずれかに記載の新規ポリペプチド。
8. 【請求項８】請求項１ないし７のいずれかに記載の新規
   ポリペプチドをコードする塩基配列を有することを特徴
   とする新規ＤＮＡ。
9. 【請求項９】下記式２の塩基配列中の１つ以上の塩基を
   他の塩基に置換させてなる塩基配列を、少なくともその
   一部として有する請求項８に記載の新規ＤＮＡ。 式２ 1 10 20 30 TGC AAT CTC CCC ATA GTC CGG GGC CCC TGC 40 50 60 CGA GCC TTC ATC CAG CTC TGG GCA TTT GAT 70 80 90 GCT GTC AAG GGG AAG TGC GTC CTC TTC CCC 100 110 120 TAC GGG GGC TGC CAG GGC AAC GGG AAC AAG 130 140 150 TTC TAC TCA GAG AAG GAG TGC AGA GAG TAC TGC
10. 【請求項１０】前記式２における塩基の置換が、少なく
    とも、下記（ｉ）ないし(iii) より選ばれる１つ以上の
    置換である請求項８または９に記載の新規ＤＮＡ。 （ｉ）５’末端側より数えて請求項４３から４５番目の
    塩基配列ＣＡＧ中の塩基を他の塩基に置換。 （ii）５’末端側より数えて請求項１２４から１２６番
    目の塩基配列ＴＡＣ中の塩基を他の塩基に置換。 （iii)５’末端側より数えて１９番目から２１番目の塩
    基配列ＣＧＧ中の塩基を他の塩基に置換。
11. 【請求項１１】前記式２における塩基の置換が、少なく
    とも、下記（１）ないし（１１）より選ばれる１つ以上
    の置換である請求項８ないし１０のいずれかに記載のＤ
    ＮＡ。 （１）５’末端側より数えて４３から４５番目の塩基配
    列ＣＡＧを、Ｌｙｓをコードする塩基配列に置換。 （２）５’末端側より数えて４３から４５番目の塩基配
    列ＣＡＧを、Ａｒｇをコードする塩基配列に置換。 （３）５’末端側より数えて１２４から１２６番目の塩
    基配列ＴＡＣを、Ｇｌｕをコードする塩基配列に置換。 （４）５’末端側より数えて１２４から１２６番目の塩
    基配列ＴＡＣを、Ａｓｐをコードする塩基配列に置換。 （５）５’末端側より数えて１９から２１番目の塩基配
    列ＣＧＧを、Ｇｌｕをコードする塩基配列に置換。 （６）５’末端側より数えて１９から２１番目の塩基配
    列ＣＧＧを、Ｇｌｎをコードする塩基配列に置換。 （７）５’末端側より数えて１９から２１番目の塩基配
    列ＣＧＧを、Ａｓｐをコードする塩基配列に置換。 （８）５’末端側より数えて１９から２１番目の塩基配
    列ＣＧＧを、Ｌｅｕをコードする塩基配列に置換。 （９）５’末端側より数えて１９から２１番目の塩基配
    列ＣＧＧを、Ａｓｎをコードする塩基配列に置換。 （10）５’末端側より数えて１９から２１番目の塩基配
    列ＣＧＧを、Ｓｅｒをコードする塩基配列に置換。 （11）５’末端側より数えて１９から２１番目の塩基配
    列ＣＧＧを、Ａｌａをコードする塩基配列に置換。
12. 【請求項１２】前記式２における塩基の置換が、少なく
    とも、下記（１）ないし（１１）から選ばれるいずれか
    １つ以上の置換である請求項８ないし１１のいずれかに
    記載の新規ＤＮＡ。 （１）５’末端側より数えて、４３から４５番目の塩基
    配列ＣＡＧを、ＡＡＧに置換。 （２）５’末端側より数えて、４３から４５番目の塩基
    配列ＣＡＧを、ＣＧＴに置換。 （３）５’末端側より数えて、１２４から１２６番目の
    塩基配列ＴＡＣを、ＧＡＡに置換。 （４）５’末端側より数えて、１２４から１２６番目の
    塩基配列ＴＡＣを、ＧＡＣに置換。 （５）５’末端側より数えて、１９から２１番目の塩基
    配列ＣＧＧをＧＡＡに置換。 （６）５’末端側より数えて、１９から２１番目の塩基
    配列ＣＧＧをＣＡＧに置換。 （７）５’末端側より数えて、１９から２１番目の塩基
    配列ＣＧＧをＧＡＴに置換。 （８）５’末端側より数えて、１９から２１番目の塩基
    配列ＣＧＧをＣＴＧに置換。 （９）５’末端側より数えて、１９から２１番目の塩基
    配列ＣＧＧをＡＡＣに置換。 （10）５’末端側より数えて、１９から２１番目の塩基
    配列ＣＧＧをＡＧＣに置換。 （11）５’末端側より数えて、１９から２１番目の塩基
    配列ＣＧＧをＧＣＧに置換。
13. 【請求項１３】前記式２の塩基配列中の１つ以上の塩基
    を他の塩基に置換させてなる塩基配列の５’末端にさら
    に下記（１）ないし（５）より選ばれるいずれかの塩基
    配列が追加された塩基配列を、少なくともその一部とし
    て有することを特徴とする請求項８ないし１２のいずれ
    かに記載の新規ＤＮＡ。 （１） GAC GAC GCC GCC （２） ACC GTC GCC GCC （３） GTC GCC GCC （４） GCC GCC （５） GCC
14. 【請求項１４】前記式２の塩基配列中の１つ以上の塩基
    を他の塩基に置換させてなる塩基配列の３’末端にさら
    に下記（１）ないし（15）より選ばれるいずれかの塩基
    配列が追加された塩基配列を、少なくともその一部とし
    て有することを特徴とする請求項８ないし１３のいずれ
    かに記載の新規ＤＮＡ。 （１） GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT GAG GAG CTG CT
    G CGC TTC TCC AAC （２） GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT GAG GAG CTG CT
    G CGC TTC TCC （３） GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT GAG GAG CTG CT
    G CGC TTC （４） GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT GAG GAG CTG CT
    G CGC （５） GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT GAG GAG CTG CT
    G （６） GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT GAG GAG CTG （７） GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT GAG GAG （８） GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT GAG （９） GGT GTC CCT GGT GAT GGT GAT （10） GGT GTC CCT GGT GAT GGT （11） GGT GTC CCT GGT GAT （12） GGT GTC CCT GGT （13） GGT GTC CCT （14） GGT GTC （15） GGT
15. 【請求項１５】請求項８ないし１４のいずれかに記載の
    ＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。
16. 【請求項１６】請求項８ないし１４のいずれかに記載の
    ＤＮＡによって形質転換された形質転換体。
17. 【請求項１７】請求項１５に記載のベクターによって形
    質転換された形質転換体。
18. 【請求項１８】下記ａ）〜ｃ）の工程を行うことを特徴
    とする請求項１ないし７のいずれかに記載の新規ポリペ
    プチドの製造方法。 ａ）請求項１ないし７のいずれかに記載の新規ポリペプ
    チドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを得る。 ｂ）ａ）で得たＤＮＡで宿主細胞を形質転換させて形質
    転換体を得る。 ｃ）ｂ）で得た形質転換体を培養して請求項１ないし７
    のいずれかに記載の新規ポリペプチドを産生させ、当該
    ポリペプチドを培養混合物から回収する。
19. 【請求項１９】下記ａ）〜ｄ）の工程を行なうことを特
    徴とする請求項１ないし７のいずれかに記載の新規ポリ
    ペプチドの製造方法。 ａ）請求項１ないし７のいずれかに記載の新規ポリペプ
    チドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを得る。 ｂ）ａ）で得たＤＮＡを含むベクターを得る。 ｃ）ｂ）で得たベクターで宿主細胞を形質転換させて形
    質転換体を得る。 ｄ）ｃ）で得た形質転換体を培養して請求項１ないし７
    のいずれかに記載の新規ポリペプチドを産生させ、当該
    ポリペプチドを培養混合物から回収する。
20. 【請求項２０】請求項１ないし７のいずれかに記載の新
    規ポリペプチドを有効成分として含有することを特徴と
    する医薬組成物。
21. 【請求項２１】前記医薬組成物が侵襲、多臓器不全、シ
    ョック、膵炎、播種性血管内凝固症候群、虚血性心疾
    患、腎炎、肝硬変、血行再建術時の再閉塞、血管透過性
    の昂進による浮腫、成人呼吸困難症候群、慢性関節リウ
    マチ、関節炎およびアレルギーのうち、少なくとも、１
    つ以上の疾患の予防および／または治療に使用される請
    求項２０に記載の医薬組成物。
22. 【請求項２２】請求項１ないし７のいずれかに記載の新
    規ポリペプチドを用いることを特徴とするプロテアーゼ
    阻害方法。