JPH07506334A

JPH07506334A - ヒトＫｕｎｉｔｚ型プロテアーゼ阻害剤変異体

Info

Publication number: JPH07506334A
Application number: JP5511990A
Authority: JP
Inventors: ビョルン，セーレン　エリク; ノリス，クヨルト; ノリス，ファニィ; ペテルセン，ラルス　クリスティアン; オルセン，オレ　フビルステズ
Original assignee: ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ
Priority date: 1992-01-07
Filing date: 1993-01-07
Publication date: 1995-07-13
Also published as: CZ164694A3; ZA9398B; NO942552D0; IL104327A0; US5629176A; AU3345793A; FI943231A0; FI943231A; NO942552L; WO1993014119A1; DE69310141D1; AU671611B2; NZ246567A; HU9401993D0; RU94036776A; ATE152129T1; CA2127248A1; EP0621869B1; EP0621869A1; HUT70292A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明は、ヒトＫｕｎ　ｉ　ｔ　ｚ型プロテアーゼ阻害剤ドメインの変異体、その変異体をエンコードしているＤＮＡ　、その変異体及びその変異体を含む医薬組成物の製造方法に関する。

発明の背景多形核白血球（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ　１ｅｕｃｏｃｙｔｅｓ（好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉＩｓ）又はＰＬＩＮＳ））及び単核食細胞（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ（単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）））は、組織損傷、感染、急性及び慢性炎症及び外傷治癒において重要な役割を演している。これらの細胞は、血液から炎症部位に移動し、そして適当な刺激の後、それらは、酸化化合物（０２・、０２−１ＨｚＯ＊及びＨＯＣＩ）並びに様々な蛋白分解酵素を含む顆粒を放出する。この分泌顆粒は、アルカリ性ホスファターゼ、メタロプロテイナーゼ、例えば、ゼラチナーゼ及びコラ−ゲナーゼ及びセリン・プロテアーゼ、例えば、好中球エラスターゼ、カテプシンＧ及びプロテイナーゼ３を含む。

潜伏性のメタロプロテイナーゼが、組織のメタロプロテイナーゼ阻害剤（ｔｉｓｓｕｅ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＴｒＭＰ））と−緒に放出される。この活性化機構は、完全に明らかにされていないが、チオール基の酸化及び／又はタンパク質分解がその過程に参加しているようである。また、遊離のメタロブテイナーゼ活性は、ＴＩＭＰの不活性化に依存する。

白血球のアズール性の（ａｚｕｒｏｐｈｉｌ）顆粒においては、セリン・プロテアーゼ好中球エラスターゼ、カテプシンＧ及びプロテイナーゼー３が、ゲルコサミノグリカンと複合体を形成する活性酵素として包まれている。これらの複合体は、不活性であるが、その活性酵素を放出するための分泌の間に解離する。このプロテアーゼ活性を中和するために、多量の阻害剤、α１−プロテイナーゼ阻害剤（α＋　−Ｐｌ）及びα、−キモトリプシン阻害剤（α１−Ｃｈｌ）が、血漿中にある。

しかしながら、好中球エラスターゼの最も重要な阻害剤であるα１−ＰＩは、引き金を引かれたＰＭＮｓにより作られた酸素代謝により活性中心（ｌＪｅｔ−３５８）において酸化を受けやすい。これは、約２０００倍径、好中球エラスターゼについてのα１−Ｐｌのアフィニティーを減少させる。

α、−ＰＩの局所的中和の後、エラスターゼは、他のタンパク質分解酵素の多数の阻害剤を分解することができる。エラスターゼは、α＋−Ｃｈｉを解裂し、そしてそれにより、カテプシンＧ活性を促進させる。また、それは、ＴＩＭＰをも解裂させ、メタロプロテイナーゼによる組織分解をもたらす。その上、エラスターゼは、アンチトロンビンＩ［［及びヘパリン補因子Ｉ＋、並びに組織因子経路阻害剤（ＴＦＰ［）であって土塊形成をおそらく促進するものを、解裂させる。

他方においては、好中球エラスターゼの血液凝固因子分解能力は、エラスターゼの全体的な効果が明確にならないように逆の効果をもていると推定される。フィブリン溶解現象（ｆ　１ｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ）に対する好中球エラスターゼの効果は、曖昧ではない。フィブリン溶解活性は、エラスターゼがプラスミノーゲン活性物質阻害剤及びα、プラスミン阻害剤を解裂させる。なお、これらの阻害剤の両方が０３代謝物質により酸化及び不活性化される。

ＰｌＩＮｓは、多量のセリン・プロテアーゼを含み、そして白血球プロテアーゼのそれぞれ約２００ｍｇが体内の侵入性剤を処理するために毎日放出されている。急性炎症は、放出された酵素の量の多数倍の増加を導く。正常の条件下、タンパク質分解は、多量の阻害剤α、　−Ｐｌ、α、−Ｃｈｌ及びα２マク０グロブリンにより許容される低レベルにおいて保たれる。しかしながら、多くの慢性疾患がＰＭＮｓの過剰刺激を原因とする病的なタンパク質分解により引き起こされる、例えば、自己免疫応答、慢性感染、タバコの煙又は他の刺激物等により引き起こされるといういくつかの兆候がある。

アプロチニン（ウシ膵臓トリプシン阻害剤）は、トリプシン、キモトリプシン、プラスミン及びカリクレインを含む各種のセリン・プロテアーゼを阻害することが知られており、そおして急性膵臓塩、様々な症状のショック症候群、高フィブリン溶解性出血及び心筋梗塞（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　１ｎｆａｒｃｔｉｏｎ）の治療において治療的に使用される（ｉｆ、　Ａｕｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｃｔａ　Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒ、　４９．　＋９７９．　ｐ、　２０７；　Ｇ、　５ｈｅｒ、　Ａｍ、　Ｊ、　０ｂｓｔｅｔ、　Ｇｙｎｅｃｏｌ、　１２９．　＋９７７、　ｐ、１６４：及びＢ、　５ｃｈｎｅｉｄｅｒ、　Ａｒｊｚｎｅｉｍ、− Ｆｏｒｓｃｈ、　２６．　１９７６、　ｐ、　１６０６を参照のこと。）。高い投与量におけるアプロチニンの投与は、心肺バイパス手術を含む心臓外科手術に関する血液損失を有意に減少させる（例えば、Ｂ、Ｐ、　Ｂｉｄｓｔｒｕｐ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｔｈｏｒａｃ、　Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ、　Ｓｕｒｇ、　９７．　＋９８９．　ｐｐ、　３６４−３７２：　Ｗ、　Ｖａｎ　０ｅｖｅｒｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎｎ、　Ｔｈｏｒａｃ、　Ｓｕｒｇ、　４４．１９８７．　ｐｐ。

６４０−６４５を参照のこと。）。先に証明されているが（Ｈ，Ｒ，Ｗｅｎｚｅｌ　ａｎｄ　Ｈ，Ｔｓｃｈｅｓｃｈｅ、　Ａｎｇｅｗ、　Ｃｈｅｍ、Ｉｎｔｅｒｎａｔ、　Ｅｄ、　２０．１９８１．　ｐ、　２９５）、あるアプロチニン同族体、例えば、アプロチニン（１−５８，Ｖａｌ１５）が顆粒球エラスターゼについての比較的高い選択性及びコラ−ゲナーゼに対する阻害効果をもち、アプロチニン（１−５８，Ａｌａ１５）がエラスターゼに対する弱い効果をもち、一方、アプロチニン（３−５８゜Ａｒｇ１５．　Ａｌａ１７．５ｅｒ４２）が優れた血漿カリクレイン阻害効果をもつ（Ｗｏ　８９／＋０３７４参照）。

しかしながら、インビボにおいて投与されたとき、アプロチニンは、ラット、ウサギ及びイヌにおいて、比較的高い投与量のアプロチニンの反復注射の後に、腎臓毒性効果をもつことが見つかった（Ｂａｙｅｒ、　Ｔｒａｓｙｌｏｌ、　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ：　Ｅ、　Ｇｌａｓｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　ｉｎ”Ｖｅｒｈａｎｄｌｕｎｇｅｎ　ｄｅｒ　Ｄｅｕｔｓｃｈｅｎ　Ｇｅ５ｅｌｌｓｃｈａｆｔ　ｆｕｅｒ　Ｉｎｎｅｒｅ　ｍｅｄｉｚｉｎ、　７８．　Ｋｏｎｇｒｅｓｓ−１Ｂｅｒｇｍａｎｎ、　Ｕｕｅｎｃｈｅｎ、　＋９７２、ｐｐ、　１６１２−１６１４）。このアプロチニンについて観察された腎臓毒性（すなわち、病的形態での顕れ）は、その管の負電荷表面に結合されることを引き起こすアプロチニンの正味の高い正電荷の結果としての腎臓の基部の管細胞内でのアプロチニンの蓄積に起因するかもしれない。この腎臓毒性は、アプロチニンを、臨床目的に、特に、阻害剤の多量の投与量を投与する必要があるようなもの（例えば、心肺バイパス手術）に、好適でないものにしている。その上、アプロチニンは、ウシのタンパク質であり、これは、それ故、ヒトへのアプロチニンの投与の間の不所望の免疫応答を生じさせることができる１以上のエピトープを含むことができる。

それ故に、本発明の目的は、アプロチニンと同型のヒト・プロテアーゼ阻害剤（すなわち、Ｋｕｎｉｔｚ型阻害剤）であって同様の阻害特性をもち又は所望の阻害特性を示すように修飾されているものを同定することである。

発明の要約本発明は、ヒトＶｌ型コラーゲンのα３鎖のＣ−末端にυ旧【２型プロテアーゼ阻害剤ドメインの変異体であって、以下のアミノ酸配列：Ｘ’　Ａｓｐ　工１ｅ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｎ２　Ｇｌｙ　χ”　Ｃｖｓ　Ｘ’　Ｎ５　Ｘ’　Ｘ’　Ｘ’@Ｘ’ （配列番号ｌ）（ここで、Ｘ’がＨ又はＣｙｓを除＜１−５の天然アミノ酸残基であり、ｘ　’ −ｘ”がそれぞれ独立して天然アミノ酸残基を表し、そしてＸＩＩがＯＨ又はＣｙｓを除＜１−５の天然アミノ酸残基である。但し、アミノ酸残基ｘ　’−ｘ目の中の少なくともｌが生来配列の対応アミノ酸残基とは異なっている。）を含んで成る変異体に関する。

本文においては、用語“天然アミノ酸残基”は、２０の一般的に生じたアミノ酸、すなわち、Ａｌａ　、　Ｖａｌ　、　ｌｅｕ　、　［ｌｅ　、　Ｐｒｏ　５Ｐｈｅ、Ｔｒｐ　＋Ｍｅｔ　、　Ｇｌｙ　５Ｓｅｒ　、　Ｔｈｒ　、Ｃｙｓ　、　Ｔｙｒ　、　Ａｓｎ　、　Ｇｌｎ　５Ａｓｐ　。

Ｇｌｕ　、　Ｌｙｓ　、　Ａｒｇ及びＨｉｓの中のいずれが１つを示していると意図されている。

ヒトＶｌ型コラーゲンは、Ｒ，Ｔｉｍｐｌ　ａｎｄ　Ｊ、　Ｅｎｇｅｌ　（１９８７）により、Ｋ、Ｍａｙｎｅ　ａｎｄ　Ｒ，Ｅ、Ｂｕｒｇｅｓｏｎ　（Ｅｄｓ、）、　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆ　ＣｏｌＣｏ１１ａ　Ｔｙｐｅｓ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｒｌａｎｄｏ、　ＰＬ、　ｐｐ、　＋０５−１４３中に記載されており、そしてそのタンパク質をコーディングしていこのタンパク質のα３鎖がアミノ酸２８７４からアミノ酸２９３１までのＣ−末端においてＫｕｎｉｔｚ型阻害剤ドメインを含むことを示した。

先に示した１以上の位置において１以上のアミノ酸を置換することにより、それが優先的に好中球エラスターゼ、カテプシンＧ及び／又はプロテアーゼ−３を阻害するようにＫｕｎｉｔｚ型ドメイン（以下、α３　ＶＩ　Ｋｕｎｉｔｚ型ドメインという）の阻害特性を変更することができる。その上、血液凝固又はフィブリン溶解現象に関連する酵素（例えば、プラスミン又は血漿カリクレイン）又は補体カスケードを特異的に阻害する変異体を構築することを可能とするとかできる。

α３　Ｖ［Ｋｕｎｉｔｚ型ドメインの１つの利点は、それが、先に示したように強い正味の正電荷をもつアプロチニンに対して正味のゼロの電荷をもつことである。それ故、アプロチニンよりも低い正味の正電荷をもつ本発明の変異体を構築し、これにより、その変異体の大投与量の投与の間の腎臓損傷の危険を減少することが可能である。

他の利点は、アプロチニンに対して、それが、ヒトへの投与に対する不所望の免疫学的応答をかなり減少させるようなヒトのタンパク質（断片）であるということである。

発明の詳細な開示 α３　ＶＩ　Ｋｕ旧ｔＺ型ドメインの好ましい変異体の例は。

ＸｌがＧｌｕ−Ｔｈｒてあり：又はＮ２がＡｌａ　、　Ａｒｇ　、　Ｔｂｒ　、　Ａｓｐ　、　Ｐｒｏ　、　Ｇｌｕ　、　Ｌｙｓ　、　Ｇｌｎ　５Ｓｅｒ　。

ｌｉｅ及びＶａｌから成る群から選ばれたアミノ酸残基であり、特にＮ２がＴｈｒ又はＧｌｕであり：又はＮ３がＰｒｏ　、　Ｔｈｒ　、Ｌｅｕ　ＳＡｒｇ　、Ｖａｌ及びｌｉｅから成る群から選ばれたアミノ酸残基であり、特にＮ２がＰｒｏ又はＴｈｒであり；又はＸ　４　がしｙｓ　、Ａｒｇ　、Ｖａｌ　、Ｔｈｒ　、［ｌｅ　、Ｌｅｕ　、Ｐｈｅ　Ｓ　Ｇｌｙ　Ｓ　Ｓｅｒ　、Ｌｌｅｔ　、　Ｔｒｐ　５Ｔｙｒ　、Ｇｉｎ　、　Ａｓｎ及びＡｌａから成る群から選ばれたアミノ酸残基であり、特にＮ４がＬｙｓ　、Ｖａｌ　、　Ｌｅｕ　、　ｌｌｅ　、　Ｔｈｒ　、　Ｍｅｔ　、　Ｇｉｎ又はＡｒｇであり：又はＮ５がＡｌａ　、　Ｇｌｙ　、　Ｔｈｒ　、　Ａｒｇ　５Ｐｈｅ　５Ｇｌｎ及びＡｓｐから成る群から選ばれたアミノ酸残基であり、特にＮ５がＡｌａ　、　Ｔｈｒ　、　Ａｓｐ又はＧｌｙであり、又はＮ６がＡｒｇ　５Ａｌａ　、　Ｌｙｓ　、　Ｌｅｕ　、　Ｇｌｙ　、　Ｈｉｓ　、　Ｓｅｒ　、　Ａｓｐ　、　Ｇｉｎ　。

ら選ばれたアミノ酸残基てあり、特にＸＩがＡｒｇ　、　Ｐｈｅ　、　Ａｌａ　、　ＬｅＵ又はＴｙｒてあり、又はＮ７がｌｉｅ　、　Ｎ１ｅｔ　、　Ｇｉｎ　、　Ｇｌｕ　、　Ｔｈｒ　、　Ｌｅｕ　５Ｖａｌ及びＰｈｅから成る群から選ばれたアミノ酸残基てあり、特にＮ７が［ｌｅであり：又はＸ　ｌ　がｌｌｅ　、Ｔｈｒ　、　Ｌｅｕ　、Ａｓｎ　、Ｌｙｓ　、Ｓｅｒ　、Ｇｌｎ　、Ｇｌｕ　、Ａｒｇ　、Ｐｒｏ及びＰｈｅから成る群から選ばれたアミノ酸残基てあり、特にＸｌがｌｉｅ又はＬｅｕであり、又はＮ９がＡｒｇ　、　Ｓｅｒ、Ａｌａ　、　Ｇｌｎ　、　Ｌｙｓ及びＬｅｕから成る群から選ばれたアミノ酸残基であり、特にＮ９がしｙｓ又はＡｒｇであり：又はｘｔｏがＧｉｎ　、　Ｐｒｏ　、Ｐｈｅ　、［ｌｅ　、　Ｌｙｓ　、　Ｔｒｐ　、　Ａｌａ　、　Ｔｈｒ　、　Ｌｅｕ、Ｓｅｒ　、　Ｔｙｒ　、　Ｈｉｓ　、　Ａｓｐ　、　Ｌｌｅｔ　、　Ａｒｇ及びＶａｌから成る群から選ばれたアミノ酸残基であり、特にＸＩＯがＶａｔ又はＴｒｐてあり：又はＸｌｌがＧｌｙ　、　Ｉｎ１ｅｔ　、　Ｇｉｎ　、　Ｇｌｕ　、　Ｌｅｕ　ＳＡｒｇ、　Ｌｙｓ　、　Ｐｒｏ及びＡｓｎから成る群から選ばれたアミノ酸残基であり、特にＸｌｌがＡｒｇ又はＧｌｙてあり：又はＸ１２がＡｌａ又はＧＩＶであり；又はＸ１２がＬｙｓ　、　Ａｓｎ及びＡｓｐから成る群から選ばれたアミノ酸残基であり、特にＸ１３がＬｙｓ又はＡｓｎてあり、又はＸ　１４がＶａｌ　、　Ｔｙｒ　、　Ａｓｐ　、　Ｇｌｕ　、　Ｔｈｒ　、　Ｇｌｙ　、　Ｌｅｕ　、　Ｓｅｒ　、　ｌｉｅ、Ｇｉｎ　、　Ｈｉｓ　、　Ａｓｎ　、　Ｐｒｏ　５Ｐｈｅ　、　Ｍｅｔ　、　Ａｌａ　、　Ａｒｇ　、　Ｔｒｐ及びＬｙｓから成る群から選ばれたアミノ酸残基であり、特にＸｌ４がＬｙｓ又はＧｌｙであり、又はＸＩＳがＶａｌである変異体である。好ましい態様においては、ＸｌがＧｌｕ− Ｔｈｒてあり、そしてＸＩＳがＶａｌであり、一方ｘ　’　−Ｎ１４が先に定めたものである。

本発明のα３　Ｖｌ　ｋｕｎｉｔｚ型ドメインの変異体は、好ましくは、プロテアーゼ結合部位内にｈ＋ｅｔ残基（すなわち、ｘ　’　−ｘ”により提示されるアミノ酸残基）を含んではならない。先に記載したα、　−ＰＩへの類似性により、これらの位置の中のいずれかｌ内の＾ｌｅｔ残基は、ＰＡＩＮｓにより作られた酸素代謝物による酸化的不活性化に感受性のある阻害剤を作るであろうし、そして反対に、これらの位置内のλｌｅｔ残基の欠如は、このような酸素代謝物の存在中でその阻害剤をより安定にするはずである。

本発明の目下好ましい変異体は、Ｋｕｎｉｔｚドメインのプロテアーゼ結合部位に位置する１以上のアミノ酸残基（すなわち、アプロチニンの１３．１５．１６．１７．１８．１９．２０．３４．３９．４０．４１及び４６位に対応するＸ　３−Ｘ１４の中の１以上）が生来のアプロチニンの同−位置に存在するアミノ酸に置換されているようなものである。この変異体は、以下のアミノ酸配列：Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　工１ｅ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌａλ巧工１ｅ　ＸＩＩ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　ｐｒｏ　ＡＳｎ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｓｅａ：　ｃｙｓλｌａ　ＡｒｇＰｈｅ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｃ”Ｓ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｌｙ５　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎを含んで成る。

他の態様においては、本発明は、本発明に係るヒトＫｕｎｉｔｚ型阻害剤ドメイン変異体をコードしているＤＮＡ構築物に関する。本発明のＤＮＡ構築物は、確立された標準的な方法により、例えば、Ｓ、Ｌ、　Ｂｅａｕｃａｇｅ　ａｎｄλ １．Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅ、ｒｓ　２２．１９８１．　ｐｐ。

１８５９〜１８６９により記載されているようなホスホアミジット法、又はＭａｓｈｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、　ＩＩＪＩＢＯ、Ｊｏｕｒｎａｌ　３．１９８４．　ｐｐ、　８０１−８０５により記載されているような方法により、合成的に、製造されることができる。

上記ホスホアミジット法に従って、オリゴヌクレオチドを、例えば、自動ＤＮＡ合成装置内で合成し、精製し、アニールし、連結し、そして好適なベクター内でクローン化される。

あるいは、Ｃ３Ｖ［Ｋｕ旧【ｚ梨ドメインをコードしているゲノム又はｃＤＮＡ（例えば、合成オリゴヌクレオチド・プローブを使用してＶＩ型コラーゲンをコーディングしているＤＮＡについてゲノム又はｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、そしてそれらからＫｕｎｉｔｚ型ドメインをコーディングしているＤＮＡ配列を単離することにより得られる）を使用することが可能である。このＤＮＡ配列は、アミノ酸置換を、例えば、よく知られた手順に従って相同的組換えのための望ましいアミノ酸配列をエンコードしている合成オリゴヌクレオチドを使用した部位指定突然変異誘発により導入することが望ましいところの部位に対応する１以上の部位において、修飾される。

さらなる態様においては、本発明は、本発明のＤＮＡ構築物を含んで成る組換え発現ベクターに関する。この組換え発現ベクターは、便利には組換えＤＮＡ手順に供されることができるベクターのいずれかあることができ、そしてベクターの選択は、しばしば、それが導入されるべき宿主細胞に依存することができるであろう。したがって、本ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外存在物として存在するベクターであり、その複製は染色体の複製と独立しているもの、例えば、プラスミドである。あるいは、このベクターは、宿主細胞中に導入されたとき、その宿主のゲノム中に組み込まれ、そしてそれが組み込まれている染色体と一緒に復製されるものであることができる。

ベクター内においては、本発明のＣ３ＶＩ　Ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン型具メイン変異体ドしているＤＮＡ配列は、好適なプロモーター配列に作用可能な状態て結合されなければならない。このプロモーターは、選択された宿主細胞内で転写活性を示すＤＮＡ配列のいずれかであることができ、そしてその宿主細胞に同種の又は異種のいずれかである蛋白をエンコードしている遺伝子から得られることができる。哺乳類細胞における本発明のＣ３ＶＩ　Ｋｕｎｉｔｚ　梨ドメイン変異体をエンコードしているＤＮＡの転写に向けられるための好適なプロモータ−アデノウィルス２主要後期プロモーターである。酵母宿主細胞における使用のための好適なプロモーターは、酵母の解糖遺伝子（Ｈｉｔｚｅｅｄｓ、）、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８２）からのプロモーター、又また、本発明のＣ３ＶＩ　Ｋｕｎｉｔｚ　Ｗドメイン変異体をエンコードしているＤＮＡ配列は、好適なターミネータ−１例えば、ヒト成長ホルることができる。このベクターは、さらに、ポリアデニル化ソゲナルのような要素（例えば、ＳＶ　４０又はアデノウィルス５　Ｅｌｂ領域からのもの）、転写エンハンサ− 配列（例えば、ＳＶ　４０エンハンサ−）及び翻訳エンハンサ−配列（例えば、アデノウィルスＶＡ　ＲＮＡ５をエンコードしているもの）を、含んで成る二とができる。

本発明の組換え体発現ヘクターは、さらに、そのベクターが問題の宿主細胞内で複製できるようにするＤＮＡ配列を含んで成ることができる。このような配列の例（その宿主細胞が哺乳類細胞であるとき）は、ＳＶ　４０の複製起点、又は（その宿主細胞が酵母細胞であるとき）酵母プラスミド２μ複製遺伝子ＲＥＰＩ− ３及び複製起点である。

また、このベクターは、選択マーカー、例えば、その生成物が宿主細胞内て欠損を補うような遺伝子、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターセ（ＤＨＰＲ）をコーディングしている遺伝子又は薬剤、例えば、ネオマイシン、ハイグロマイノン又はメトトレキサートに対する耐性を与える遺伝子、又はシゾサツカロミセス・ボンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）のＴＰ［遺伝子（Ｐ、　Ｒ，Ｒｕ５ｓｅ１１．　Ｇｅｎｅ　４０．　＋９８５．　ｐｐ、　１２５ −１３０により記載されているようなもの）を、含んで成ることができる。

本発明のＣ３Ｖｌ　ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン型具メイン変異体ングしているＤＮＡ配列、それぞれ、そのプロモーター及びターミネータ−を連結するために、並びに複製のために必要な情報を含む好適なベクターにそれらを挿入するために使用される手順は、当業者によく知ら本発明の発現ベクターが導入されるところの宿主細胞は、本発明のＣ３ＶＩ　Ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン型具メイン変異体ができる細胞のいずれかであることかでき、そして好ましくは、真核細胞、例えば、哺乳類の、酵母の又は真菌の細胞である。

本発明に従って宿主として使用される酵母生物は、培養の間、多量の本発明のＣ３Ｖ［Ｋｕ旧【２型ドメイン変異体を作る酵母生物のいずれかであることができる。好適な酵母生物の例は、酵母種サッカえは、プロトプラスト形成その後のそれ自重公知のやり方での形質転換により、行われることができる。

好適な哺乳類細胞系の例は、Ｃ０５（ＡＴＣＣＣＲＬ　１６５０）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣＣＲＬ＋６３２．　ＡＴＣＣＣＣＬ　１０）又はＣ）１０（ＡＴＣＣＣＣＬ　６１）細胞系である。哺乳類細胞のトランスフェクト方法及びその細胞内に導入されたＤＮＡ配列る。

あるいは、真菌細胞が、本発明の宿主細胞として使用されるとかできる。好適な真菌細胞の例は、糸状菌、例えば、アスペルギルスだめのアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉ　ｆｌｕｓ）種の使用は、例えば、ＥＰ　２３８０２３中に記載されている。

本発明は、さらに、本発明に係るＣ３　Ｖ［Ｋｕｎｉｔｚ　梨ドメイン変異体の製造方法、すなわち、その変異体の発現を誘導する条件下で先に記載したような細胞を培養し、そして得られた変異体をその培養物から回収することを含んで成る方法を含んで成る。

細胞を培養するために使用される培地は、その宿主細胞の選択に依存して、哺乳類の細胞又は真菌（酵母を含む）細胞を培養するために好適な慣用培地のいずれかであることができる。その変異体は、宿主細胞によりその培養培地に分泌されるであろうし、そして遠心分離又は濾過によるその培地からの細胞分離、塩例えば硫酸アンモニウムによる上澄液又は濾液のタンパク質成分の沈殿、様々なりコツトグラフィー手順、例えば、イオン交換クロマトグラフィー又はアフィニティー・りａマドグラフィー等による精製を含む慣用の手順により、それから回収されることができる。

また、本発明は、医薬として許容される担体又は賦形剤と一緒に本発明のＣ３Ｖ［Ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン型具メイン変異体る医薬組成物に関する。本発明の組成物中では、本変異体は、医薬組成物の確立された配合方法のいずれか、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、　＋９８５中に記載されているようなものにより、配合されることができる。本組成物は、典型的には、全身的注射又は注入に好適な形懇に在ることができ、そして滅菌水又は等優性生理食塩水又はグルコース溶液により、そのように、配合されることができる。

本発明のＣ３ＶＩ　Ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン型具メイン変異体、生来のアプロチニン又は他の阻害特性をもったアプロチニン同族体、特により大きなアプロチニン投与量の使用を必要とするもののために提案された治療的用途のための使用に有利であるべく、もくろまれている。ヒト・セリン・プロテアーゼ、例えば、トリプシン、プラスミン、カリクレイン、エラスターゼ、カテプシンＧ及びブロティナーゼ〜３を阻害するその能力の結果として本発明の変異体の使用が示されているところの治療的用途は、急性膵臓炎、炎症、血小板減少症（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ）、血小板機能の保存、臓器の保存、外傷の治疲、高フィブリン溶解性出血を含むショック（ショック肺を含む）及び症状、気腫（ｅｍｐｈｙｓｅｍａ）　、’Ｊウマチ様関節炎、成人呼吸不全症候群、慢性炎症性内蔵疾患及び乾廁（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）を、言い換えれば、引き金を引かれたＰ！、ＩＮｓから放出されたエラスターゼ、カテプシンＧ及びプロテイナーゼー３による病的なタンパク質分解により引き起こされると推定される病気を含む（がこれに限定されない）。

その上、本発明は、過剰刺激されたｐＨ１Ｎｓから放出されたプロテアーゼによる病的なタンパク質分解と関連した疾患又は症状の防止又は治療のための医薬の製造のために、先に記載したようなＣ３Ｖ［Ｋｕｒ＋ｊｔ、ｚ型阻害剤ドメイン又はその変異体を使用することに関する。

先に示したように、Ｃ３ＶＩ　Ｋｕｎｉｔｚ型阻害剤ドメイン又は変異体と同時にヘパリンを投与することが有利であることができる。

のプロテアーゼ又はレセプタであって例えばスクリーニング検定又はアフィニティー・クロマトグラフィーによりＣ３ＶＩ　Ｋｕｎｉｔｚ型ドメイントドメイン間接的に結合するものを、単離するために使用されることができる。

本発明を、以下の例中でさらに詳細に記載するが、これは、請求に係る本発明の範囲をいかようにも限定することを意図されていない。

実施例一般的方法標準的なりＮ、Ａ技術を記載されているように行った（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、。

Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ、、　ａｎｃｌ　Ａｌａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、（＋９８９ン　八ＩｏｌｅｃｕＩａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　＆Ｉａｎｕａ１．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ）。合成オリゴヌクレオチドを、制御された細孔ガラス支持体上のホスホアミチット化学を使用して自動ＤＮＡ合成装置（３８０Ｂ、　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上て合成した（ｂｅａｕｃａｇｅ、　Ｓ、乙、、ａｎｄ　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、λ１．Ｈ，，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２．　（＋９８１）　＋８５９−１８６９）　、　ＤＮＡ配列決定を、ジデオキシ鎖停止技術（ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、、　Ｍｉｃｋｌｅｎ、　Ｓ、、　ａｎｄ　Ｃｏｕｌｓｏｎ、　Ａ、Ｒ，、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４　（１９７７）　５４６３−５４６７）により行った。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、ＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）上で行った。

アミノ酸分析を、６Ｍ　ＨＣｌ中の１１０°Ｃにおける加水分解後、２４時間真空ノール・チューブ内で行った。分析を、マイクロホア操作（ｍｉＣｒｏｂｏｒｅ　ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）について変更されたＢｅｃｋｍａｎ　１２１１＋ＩＢ自動アミノ酸分析装置上で行った。

Ｎ−末端アミノ酸配列分析を、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４７０Ａ気相シーケンサ−を使用して自動エドマン分解により得た。オンライン逆相ＨＰＬＣによる分析を、それぞれのシーケンサ−・サイクルからの解放されたＰＴＨアミノ酸の検出及び定量化のために行った。

分子量測定値を、約１５ｃｍのフライト・チューブを備え、そしてポジティブ・モードにおいて操作されたＢＩＯ−１ＯＮ　２０プラズマ脱着質量分析計（ＰＤＡＩＳ）上で得た。５μｍのアリコツトを、１５ｋＶまでの加速電圧設定において分析し、そしてイオンを５ミリオンの分裂事象の間に回収した。指定した分子イオンに対する確かさは、よい形のビークについては、他の状態ではいくぶんより少ないが、約０．１％であった。

１　μｇのヒト・ゲノムＤＮＡ（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　ＣＡ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、　ｃａｔ、　ｎｏ、　６５５０−２）を、フライ７−ＮＯＲ−３０６７（ＧＡＣＧＧＡＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＡＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＡＡＣＣＴＴＴＴＣＡＣＡ）及びＮ０Ｒ−３０６６（ＧＣＴＧＡＧＡＧＡＴＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＣＡＧＡＴＡＴＡＴＧＣＡＡＧＴＴＧＣＣ）のそれぞれ＋００ｐモルを含むＰＣＲ反応液中のテンプレートとして使用した。Ｎ０Ｒ− ３０６７は、ヒトα３（Ｖｌ）コラーゲンのｃＤＮＡ配列中の塩基番号９１００ −９１２３と相補的であり（Ｃｈｕ、＾Ｉ−Ｌ、、　Ｚｈａｎｇ、Ｒ−Ｚ、、Ｐａｎ、Ｔ−Ｃ，、５ｔｏｋｅｓ、Ｄ、、Ｃｏｎｗａｙ、Ｄ、、Ｋｕｏ、Ｈ−Ｊ、、Ｇｌａｎｖｉｌｌｅ、Ｒ，、ｋｌａｙｅｒ、［１，、Ｌｌａｎｎ、Ｋ、、Ｄｅｎｚｍａｎｎ、Ｒ，、ａｎｄ　Ｔｉｍｐｌ、Ｒ，εＮＩＢＯＪ、　９　（１９９０）　３８５−３９３）、そしてそして翻訳終止コドンその後のＸｂａ　１部位を含む５′伸長を担持している。２３のＮ０Ｒ−３０６６の３−末端塩基は、ヒトα３（Ｖｌ）コラーゲンのｃＤＮＡ配列内の８９５０〜８９７２と同一であり、そして２１のＮ０Ｒ−３０６６の５゛−末端塩基は、以下に記載するｐＫＦＮ −１０００由来の合成リーダー遺伝子（配列番号３）内の塩基２１５〜２３５と同一である。

ＰＣＲ反応を、商業的キット（ＧｅｎｅＡｍｐ、　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）及び以下のサイクル：９４°Ｃにおいて２０秒間、５０°Ｃにおいて２０秒間、及び７２°Ｃにおいて３０秒間、を使用して１００μｌの容量において行った。

ガロース・ゲル上の電気泳動により単離した。

フグナル−リーダー。以下に記載するＩＩＫＥＮ−１０００からの０．７ｋｂ　ＰｖＩＩ　Ｉ　ｉ断片の０．１　μｇを、プライマーＮ０Ｒ−＋４７８（ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ）及びＮ０Ｒ−２５２３（ＴＣＴＣＴＴＣＴＣＣＡＡＴＣＴＣＴＣＡＧＣ）のそれぞれ１００９モルを含むＰＣＲ反応液中のテンプレートとして使用した。Ｎ０Ｒ−１４７８は、配列番号３内のＥｃｏＲｆ部位の直上流の配列にマツチングする。プライマーＮ０Ｒ−２５２３は、１ｙＫＦＮ −１０００の合成リーダー遺伝子の１７の３°末端の塩基に相補的である。図１を参照のこと。ＰＣＲ反応を、先に記載するように行い、２５７塩基対の断片をもたらした。

プラスミドｐＫＦＮ−１０００は、合成酵母シグナル−リーダー・ペプチドをエンコードしているＤＮＡを含むプラスミドｐＴＺ１９Ｒの誘導体Ｑｌｅａｄ、Ｄ、Ａ、、５ｚｃｚｅｓｎａ−３ｋｏｒｕｐａ、Ｅ、ａｎｄ　Ｋｅｍｐｅｒ、Ｂ、、Ｐｒｏｔ、Ｅｎｇｉｎ、＋（＋９８６）　６７−７４）である。プラスミドｐＫＥＮ−１０００は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ９０１０００５８号中に記載されている。ｐＫＦＮ−１０００のＥｃｏＲ１部位から２３５塩基下流のＤＮＡ配列及び合成酵母シグナル−リーダーのエンコードされたアミノ酸配列を、配列番号３内に与えた。

シグナル−リーダー−α３ｍ）：先に記載したような２つのＰＣＲ断片のそれぞれ０．１ｐｇを、混合した、ＰＣＲ反応を、プライマーＮ０Ｒ−１４７８及びＮ０Ｒ−３０６７のそれぞれ１００ｐモルを、そして以下のサイクル・９４°Ｃにおいて１分間、５０°Ｃにおいて２分間、及び７２°Ｃにおいて３分間を使用して行った。！６サイクル後、最終サイクルを行った。ここで、７２°Ｃの段階を、１０分間維持した。

得られた４４１塩基対断片を、１％アガロース・ゲル上の電気泳動により精製し、そして次に、ＥｃｏＲｌ及びＸｂａ　［により消化した。得られた４１２塩基対断片を、ｐｈ＋Ｔ６３ｓからの９．５ｋｂ　Ｎｃｏｌ−ＸｂａＩ断片及びｐ＆ｌＴ６国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ８８１００１３８中に記載されている。

ｐｋ１７６３６は、シゾサツカロミセス・ボンベＴＰＩ遺伝子（ＰＯＴ）を含む大１１！１（Ｅ、ｃａｌｉ）−サツカロミセス・セレビシェのシャトル・ベクタ１００ｍ１の培養物を、遠心分離によりａ薄ｉ−１０ｍ１のｙｋ＋二上りヰ滲− （Ｒｕｓｓｅｌｌ、　Ｐ、Ｒ，、Ｇｅｎｅ　４０　（＋９８５）　１２５−１３０）　、サツカロミセス・セレビシェのトリオースホスフェート・イソメラーゼのプロモーター及びターミネータ−１ＴＰ［、及びＴＰＩ　Ｔ　（Ａｌｂｅｒ、　Ｔ、、　ａｎｄ　Ｋａｗａｓａｋｉ、　Ｇ、　Ｊ、　＆ｌｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎ、　Ｉ　（１９８２）、　４１９−４３４）である。

この連結混合物を、コンピテント大腸菌株Ｃｒ−、ｍ　”　）を形質転換するために使用し、アンピシリン耐性について選択した。ＤＮＡ配列決定は、得られたコロニーからのプラスミドが合成酵母シグナル−リーダー遺伝子に正確に融合されたＣ３（Ｖｌ）Ｋｕｎｉｔｚ　’Ｊｌドメインのための正しいＤＮＡ配列を含んでいたことを示した。

１つのプラスミドｐＫＦＮ−１７４５を、さらなる使用のために選択した。

プラスミドｐＫＦＮ−１７４５の構築を、図１中に説明する。

プラスミドｐＫＦＮ−１７４５の発現カセットは、以下の配列：ＴＰＩ　、　− ＫＦＮ１００Ｏシグナル−リーダー−Ｃ３（Ｖｌ）−ＴＰＩ　７を含む。

ｐＫＦＮ−１７４５からの４１２塩基対のＥｃｏＲＩ−Ｘｂａｌ断片のＤＮＡ配列を、配列番号５中に示す。

酵母の形質転換：サツカロミセス・セレビシェ株ＡＩＴ６６３（Ｅ２−７Ｂ　ＸＥｌｌ−３６ａ／　ａ、　Δｔｐｉ／Δｔｐｉ、　ｐｅｐ　４−３／ｐｅｐ　４ −３）を、ＹＰＧａＬ（１％Ｂａｃｔ。

酵母エキス、２％ＢａＣｔＯペプトン、２％ガラクトース、１％ラクトース）上で６００ｎｍにおける０、６の吸光度まで増殖させた。

＋　１ＪＩＪＩＩ１１　−、／　−０買’ｌ刀　Ｃｓ　入ｎ’Ｌ　ツノ　ＦＩＩＬＩ−ｄｋ　ノ１へｉＪＥ　１．／　％　ムυＩｌｌ　＋　hノｌ」＼１−６　ソＵＬＩＦし、再遠心分離し、そして１．２Ｍソルビトール、２５ｍｋｌ　Ｎａ　２　ＥＤＴＡ　ＰＨ＝８０及び６゜７ｍｇ／ｍ　ｌンチオトレイトールを含む溶液の１０ｍｌ中に、再懸濁させた。この懸濁液を、３０°Ｃにおいて１５分間インキュベートし、遠心分離し、そして細胞を、１．２１ｔ＋ソルビトール、１０ｍＭ　Ｎａ　ｚ　ＥＤＴＡ。

０、団のクエン酸ナトリウム、ｐＨ＝５．８及び２ＨＮｏｖｏｚｙｍ　＠２３４を含む溶液の１０ｍ１中に、再懸濁させた。この懸濁液を、３０°Ｃにおいて１０分間インキュベートし、遠心分離し、その細胞を、遠心分離により回収し、１０ｍ１の１．２１１ソルビトール及び１０ｍ１のＣＡＳ（１，２λ１ソルビトール。

１０ｍ１　ＣａＣ１２、ｌｏｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ（Ｔｒｉｓ＝Ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタン）ｐＨ・７．５）中で洗浄し、そして２ｍｌのＣＡＳ中に再懸濁させた。形質転換のために、Ｏ，１ｍｌのＣＡＳ−再懸濁細胞を、約１μｇのプラスミドｐＫＦＮ−１７４５と、混合し、そして室温において１５分間放置した。

１ｍｌの（２０％ポリエチレン・グリコール４０００．２０ｎｔｌ　ＣａＣ１２，１０ｍＭ　ＣａＣ１２，ＩＯｍＭＴｒｉｓ　）ＩＣ１，ｐＨ＝７．５）を、添加し、そしてその混合物をさらに３０分間室温において放置した。この混合物を遠心分離し、そしてそのペレットを、Ｏ，１ｍｌの５Ｏ３（１，２ＡＩ　ソルビトール、　３３ｖ／ｖ％ＹＰＤ、　６．７ｍ＾ｌ　ＣａＣＩｚ　、　Ｊ４ｕｇ／ｍ１０４ｐン）中に再懸濁させ、そして３０°Ｃにおいて２時間インキュベートした。次にこの懸濁液を遠心分離し、そしてそのペレットを０．５ｍｌの１．２Ａｌソルビトール中に再懸濁させた。次に、５２°Ｃにおける６＋ｎｌの頂上寒天（Ｓｈｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　（八Ｉｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８２））のＳＣ培地てあって１．２λ１ソルビトールに加え２．５％寒天を含むもの）を添加し、そして懸濁液を、同一寒天固化のソルビトール含有培地を含むプレート上に注いだ。

形質転換体コロニーを、３０°Ｃにおいて３日間後、拾い上げ、再単離し、そして液体培養を開始するために使用した。１つのこのよう発酵：酵母株ＫＦＮ−１７５８を、”ｌ’ＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ペプトン（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのもの）、及び３％グルコース）上で増殖させた。この株の１リツター培養物を、２４の６５０ｎｍにおける吸光度まで３０°Ｃにおいて振とうした。遠心分離後、その上澄液を単離した。

酵母上澄を、５％酢酸及びリン酸によりｐＨ３，０に調整し、そしてＳ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗのカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に適用し、そして５０ｍ＾１の蟻酸、ｐＨ３，７により平衡化した。平衡化バッファーによる洗浄の後、このＨＫＩ　ドメインを、ｌλＩ塩化ナトツナトリウム溶出させた。

脱塩を、０．１％炭酸水素アンモニウム、ｐＨ＝７．９により平衡化され且つ溶出された５ｅｐｈａｄｅｙ、　Ｇ−２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で得た。真空遠心分離及びｐＨ３，０の調整の後、さらなる精製を、５０關蟻酸、ｐｉ（３，７により平衡化されたｋＩｏｎｏ　Ｓカラム（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ）上で行った。平衡バッファーによる洗浄の後、グラジェント溶出を、平衡バッファー中のＯからＩＩ＋までの塩化ナトリウムにより行った。最終精製を、０から５５％までのアセトニトリル、０．１％ＴＦＡのグラジェント溶出によりＶｙｄａｃ　ＣＪカラム（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｇｒｏｕｐ、　ＣＡ）上の逆相ＨＰＬＣにより行った。

アリコツトを、質量Ｐ叶質量スペクトロメトリーにより分析しく実Ｊ１１：八ＩＷ　６８５３，５、計算ＮＩＷ　６８５３−８）　、そして４５のエドマン分解サイクルにわたるＮ−末端アミノ酸配列決定により、Ｃ３Ｖ［Ｋｕｎｉｔｚ型ドメインの一次構造を確認した。

実施例２酵母株ＫＦＮ−１９００及びＫＦＮ−１９０１からの［ＲＩ５に、　ＧＩ６Ａ］ −Ｃ３（Ｖ［）及び［］］６Ａ］−α３Ｖｌ）　Ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン同族体の生産プラスミドｐＫＦＮ−１７４５からのＣ３（Ｖｌ）Ｋｕｎｉｔｚ型ドメインをエンコードしている１、３ｋｂ　Ｓｐｈ［−Ｂａｍｆ（ｌ断片のＯ，ｌ１１ｇを、２つのＰＣＲ反応においてテンプレートとして使用した。第−ＰＣＲ反応においては、プライマーＮ０Ｒ−２０２２（ＧＧＡＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＴＴＧＣ）及び八ｌ−７５３（ＧＴＡＣＣＡＴＴＴＴＡＡＴＡＴＧＡＡＡＧＣＣ（Ｃ／Ｔ）ＴＧＣＡＡＧＴＴＣＣ）のそれぞれ１ｏｏｐモルを使用した。第二ＰＣＲ反応においては、プライマーＮ０Ｒ−１４９５（ＴＡＡＧＴＧＧＣＴＣＡＧＡＡＴＧＡ）及び八ｌ−７５４（ＧＧＡＡ　ＣＴＴＧＣＡ　（Ａ／Ｇ　）ＧＧＣＴＴＴＣＡＴＡＴＴＡＡＡＡＴＧＧＴＡＣ）のそれぞれｌ００９モルを使用した。Ｎ０Ｒ−２０２２は、ｓｐｈ＋部位の９４塩基対下流の位置でプライムスル。ｋｌ −７５３ハ、（２３（Ｖｌ）　ＤＮＡ配列ノ２６９−３０１位（配列番号５）に、２つのミスマツチを除き、相補的である。Ｎ０Ｒ−１４９５は、Ｂａｍ８１部位から５６１塩基対上流の位置でプライムする。Ｍ−７５４は、Ｍ−７５３に相補的である。

ＰＣＲ反つを、商業的キット（ＧｅｎｅＡｍｐ、　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）及び以下のサイクル９５°Ｃにおいて１分間、５０°Ｃにおいて１分間、及び７２°Ｃにおいて２分間、を使用して１００μｌ容量において行った。２４サイクル後、最終サイクルを行った。そこでは、その７２°Ｃ段階が１０分間維持された。このＰＣＲ生成物、すなわち、第−ＰＣＲからの４４１塩基対断片及び第二からの２７９塩基対断片を、２％アガロース・ゲル上の電気泳動により単離した。先に記載した２つのＰＣＲ断片のそれぞれ約０．１　μｇを、混合した。ＰＣＲ反応を、プライマーＮ０Ｒ−２０２２及びＮ０Ｒ−１４９５のそれぞれ１ｏｏｐモル及び以下のサイクル９５℃において１分間、５０°Ｃにおいて２分間及び７２℃において３分間、を使用して行った。２２サイクルの後、最終サイクルを行った。そこで、７２°Ｃ段階を１０分間維持した。

得られた６９３塩基対断片を、１％アガロース・ゲル上の電気泳動により精製し、そして次に、ＥｃｏＲｌ及びＸｂａｌにより消化した。得られた４１２塩基対断片を、プラスミドｐＴＺ１９Ｒ（Ｍｅａｄ、　Ｄ、　Ａ、、　５ｚｃｚｅｓｎａ−Ｓｋｏｐｕｒａ、　Ｅ、、　ａｎｄ　Ｋｅｍｐｅｒ、　Ｂ、　Ｐｏｒｔ、　Ｅｎｇｉｎ、　ｌ　（＋９８６）　６７−７４）からの２．８ｋｂのＥｃｏＲｌ −Ｘｂａ［断片に連結させた。

連結混合物を、コンピテント大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌ　ｉ）株（ｒ−、ｍ′″）を形質転換するために使用し、アンピノリン耐性について選択した。ＤＮＡ配列決定により、合成酵母シグナルーリーダー遺伝子に融合された表示α３（ＶＤ同族体をエンコードしている以下の２つのプラスミドを、同定した・プラスミド　同族体ｐＫＴＮ−４６８９［Ｒ１５に、　Ｄ１６Ａ］−Ｃ：３（Ｖｌ）ｐＫＦＮ−Ｌ８ＳＬ　［Ｄ１６Ａ］−ａコ（Ｖｌ）これらのプラスミドからの４１２塩基対のＥｃｏＲＩ−Ｘｂａ［断片を、実施例１中に記載した発現プラスミドの構築のために使用した。

実施例１中に記載したような酵母株１ｔｌＴ６６３の形質転換は、以下の酵母株をもたらした：酵母株　同族体ＫＦＮ　１９００　［Ｒ１５に、Ｄ１６Ａ］−ａｌ（Ｖｌ）ＫＦＮ−１９０１［０１６λ］　−ｃａｌ　（Ｖｌ）ＹＰＤ培地中ての形質転換酵母株の培養、上澄中のα３（Ｖｌ）同族体についての分析、及び精製を、実施例１中に記載したように行った。

上記変異体を、実施例１中に記載したように酵母培養基から精製した。にＦＮ　＋６５１の濃度を、標準としてアプロチニンを使用して２１４１ｍにおける吸光度から測定した。ブタ・トリプシンを、Ｎｏｖｏ　ＮｏｒｄｉｓｋＡ／Ｓから得た。ヒト・プラスミンをＫａｂｉ（Ｓｊｏｃｋｈｏｌｍ、　Ｓｗｅｄｅｎ）から得た。ヒト好中球カテプシンＧ及びエラスターゼを、Ｂａｕｇｈ　ａｎｄ　Ｔｒａｖｉｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１５．１９７６．８３６−８４３　により記載された方法に従ってＰ　ｋｌＮ　ｓの抽出物から精製した。

ペブチンル・ニトロアニリド基質５２２５１及び５２５８６は、Ｋａｂｉ（Ｓｔ。

ｃｋｈｏｌｍ、　Ｓｗｅｄｅｎ）からのものであり、５７３８８及び＆Ｉ４７６５はＳｉｇｍａ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、（Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ，ＵＳＡ）からのもノテあった。

セリン・プロテイナーゼを、様々な濃度のＫＦＮ　１９００又は１９０１と共に３０分間インキュベートした。次に基質（０，６ｍＭ）を添加し、そして残存ブロテイナーセ活性を、４０５０ｍにおいて測定した。ＫＦＮ１９００及びにＦＮ１９０１は、トリプシンの阻害剤であることが分かった。それぞれ、Ｋ　、　＝５０ｎ＆Ｉ及び３５５ｎＭである。ＫＦＮ１９００及びＫＦＮＩ９０１は、ｌμ ｈ１においてプラスミンの弱い阻害剤であるが、好中球エラスターゼ又はカテブンンＧを阻害しなかった。

配列表（１）一般情紺（１）出願人：（Ａ）名称　ノボ　ノルディスク　アクテイーゼルスカプ（８）番地　ノボ　アレ（Ｎｏｖａ　Ａ１１ｅ）（Ｃ）市：　ＤＫ−２８８０バグスバード（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ）（Ｅ）国、デンマーク（Ｄｅｎｍａｒｋ）（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）・ＤＫ−２８８０ＣＧ）　を話　＋４５　４４４４　８８８８（Ｈ）ファックス：　＋４５４４４９３２５６（１）テレックス：　３７３０４（ｉ　ｉ）発明の名称　ヒｈＫｕｎｉｔｚ型プロテアーゼ阻害剤変異体（ｉｉｉ）配列数、６（１ｖ）コンピューター読込形態（Ａ）媒体形式　フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：［Ｂ＆Ｉ　ｐｃ互換機（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェアー：Ｐａｔｅｎｔｌｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　＃１．Ｏ，Ｖｅｒｓｉｏｎ　＃１．２５（ＥＰＯ）（２）配列番号ｌに関する情報：（ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長さ：５７アミノ酸ＣＢ）形二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（百）配列の種類：タンパク質（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名１合成（ｘｉ）配列：配列番号１（２）配列番号２に関する情報（１）配列の特徴（Ａ）長さ、５８アミノ酸（Ｂ）形、アミノ酸（Ｄ）　トポロジー・直鎖状（１１）配列の種類・タンパク質（ｖｉ）起源（Ａ）生物名　合成（ｘｉ）配列　配列番号２（２）配列番号３に関する情報（１）配列の特徴（Ａ）長さ：２３５塩基対（Ｂ）形：核酸（Ｃ）鎖４一本鎖（Ｄ）トポロジー　直鎖状（１１）配列の種類　ｃＤＮＡ（ｖｌ）起源。

（Ａ）生物名・合成（ｌＸ）特徴（Ａ）ＮＡ氏ＩＥ／ＫＥＹ　：　ＣＤ５（Ｂ）位置・７７、　、２３５（λ１）配列　配列番号３゜（２）配列番号４に関する情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ・５３アミノ酸（Ｂ）形　アミノ酸（Ｄ）トポロン−直鎮状（ｉｉ）配列の種類　タンパク質（ｘｉ）配列　配列番号４Ｔｉｕｘｌｅ工１ｅ　Ａｈａ　Ｇｌｕ　Ａ５ｎ　Ｔｈｒ　’Ｉｈｒ　Ｉｊ！ＬＩ　Ａｌａ　ｆｉ５’、Ｖａｊ、ンユａ　冷ｔ　Ａｌａ　Ｇｌ■ （２）配列番号５に関する情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ　４１８塩基対（Ｂ）形　核酸（Ｃ）鎖、一本鎖（Ｄ）トポロジー、直鎮状（ｉｉ）配列の種類　ｃＤＮＡ（ｖｉ）起源（Ａ）生物名　合成（ｉｘ）特徴（Ａ）ＮＡにＩＥ／ＫＥＹ：ＣＤ５（Ｂ）位置　７７、　、４０９（Ａ）ＮＡ＆ｌＥ／ＫＥＹ：　ｓｉｇ　ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｂ）位置　７７゜、２３５（ＩＸ）特徴。

（Ａ）ＮＡ＆ＩＥ／ＫＥＹ：　ｍａｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｂ）位置　２３６．　、４０９（ｘｉ）配列、配列番号５・Ｇ７：Ｃ−Ｃ：に石ＧＣｒＧＳ　？ｎｌ　ＴＴＧ　ＣＡＧ　？；ｒｓ　に詰ＧＡＡ　ＡＣＡ　ＧＡＴ　−”１ｍ；’Ｉ　ＴＧＣＡＡＧ　２５n ＴｒＧ　Ｃ５１ｌｌ　？；Ａ　ＧＡＣＧ；＝Ａ　ＧこＡ　ＡＣｒ　ＴＧＣ入３Ｇ　ＣＡＴＴＴＣＡ工ＡτＴＡＡＡＡ　τＧＧ　’＋Ｔｈｅ　R０１ π℃α：αコσに：す：ＣフシＡ４１Ｂ（２）配列番号６に関する情報、（ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長さ：　ＩＩＩ　アミノ酸（Ｂ）形、アミノ酸（Ｄ）トポロジー・直鎖状（ｉｉ）配列の種類・タンパク質（ｘｌ）配列：配列番号６Ｉｊ＊　７５＝　工１ａ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｖ　Ｔｈｒ　’Ｔａｘ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ａｓｒｑ　Ｖａｎ　Ａｌａ　Ｆｒｅｔ　Ａｌａ　fｉｕ壱≧Ｇｌｕ　Ｌ”ｙ’５　ｋ−”’ｑ　Ｇｌｕ　’Ｉｈｒ　ＡＪｐ工１ａ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　ＬｅｓＨ−１ｇｓ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ０１ｙ都２砂に１喫ｉ佃工１ｅ蝕す準ｌ沖芋輩碧ｌ−勘計Ｌ：ｓ　Ｓａｒ　Ｃ％”ｉ　ＡＬａ　）Ｘｑ　Ｅｈｅ　Ｔｒｐ　Ｔ２Ｔ　（−１ｙＧＩＹ　Ｏ／Ｓ　ＧＩＹ　ＧＩＹ　ＡＳｉｎ　Ｇｌｕ　ｆ奄唐■ コ０　コ５　４０ｃｏＲＩＦｉｇ、１フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３８１５５　ＡＣＢＣＯ７Ｈ２１１０４Ｂ　８６１５−４ＣＣ１２Ｎ　１／１９　８８２８−４８Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ９２８２−４Ｂ／／ＣＣＩ２　Ｎ　１／１９Ｃ１２Ｒ１：８６５）（Ｃ１２Ｐ　２１１０２Ｃ１２Ｒ１：８６５）８３１４−４Ｃ（７２）発明者　ノリス、ファニイデンマーク国、デーコー−２９００へレルップ、アールマンス　アレ　あＩＡ６１Ｋ　３７／６４　ＡＢＮＢＳ（７２）発明者　ペテルセン、ラルス　クリスティアンデンマーク国、デーコー −２９７０ヘールスホルム、ハベバイ　４（７２）発明者　オルセン、オレ　フビルステズデンマーク国、デーコー−２７００ブレーンスヘーイ、ベクケスコウバイ　３８

Claims

【特許請求の範囲】

１．ヒトＶＩ型コラーゲンのα３鎖のＣ−末端Ｋｕｎｉｔｚ型プロテアーゼ阻害剤ドメインの変異体であって、以下のアミノ酸配列：【配列があります】（配列番号１）｛ここで、Ｘ１がＨ又はＣｙｓを除く１−５の天然アミノ酸残基であり、Ｘ２− Ｘ１４がそれぞれ独立して天然アミノ酸残基を表し、そしてＸ１５がＯＨ又はＣｙｓを除く１−５の天然アミノ酸残基である。但し、アミノ酸残基Ｘ１−Ｘ１５の中の少なくとも１が生来配列の対応アミノ酸残基とは異なっている。｝を含んで成る変異体。
２．Ｘ１がＧｌｕ−Ｔｈｒである、請求項１に記載の変異体。
３．Ｘ２がＡｌａ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ及びＶａｌから成る群から選ばれたアミノ酸残基である、請求項１に記載の変異体。
４．Ｘ２がＴｈｒ又はＧｌｕである、請求項３に記載の変異体。
５．Ｘ３がＰｒｏ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｖａｌ及びＩＩｅから成る群から選ばれたアミノ酸残基である、請求項１に記載の変異体。
６．Ｘ３がＰｒｏ又はＴｈｒである、請求項５に記載の変異体。
７．Ｘ４がＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ及びＡｌａから成る群から選ばれたアミノ酸残基である、請求項１に記載の変異体。
８．Ｘ４がＬｙｓ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｎｅｔ、Ｇｌｎ又はＡｒｇである、請求項７に記載の変異体。
９．Ｘ５がＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ及びＡｓｐから成る群から選ばれたアミノ酸残基である、請求項１に記載の変異体。
１０．Ｘ５がＡｌａ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ又はＧｌｙである、請求項９に記載の変異体。
１１．Ｘ６がＡｒｇ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ及びＭｅｔから成る群から選ばれたアミノ酸残基である、請求項１に記載の変異体。
１２．Ｘ６がＡｒｇ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ又はＴｙｒである、請求項１１に記載の変異体。
１３．Ｘ７がＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ及びＰｈｅから成る群から選ばれたアミノ酸残基である、請求項１に記載の変異体。
１４．Ｘ７がＩＩｅである、請求項１３に記載の変異体。
１５．Ｘ８がＩｌｅ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ及びＰｈｅから成る群から選ばれたアミノ酸残基である、請求項１に記載の変異体。
１６．Ｘ■がＩＩｅ又はＬｅｕである、請求項１５に記載の変異体。
１７．Ｘ９がＡｒｇ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ及びＬｅｕから成る群から選ばれたアミノ酸残基である、請求項１に記載の変異体。
１８．Ｘ９がＬｙｓ又はＡｒｇである、請求項１７に記載の変異体。
１９．Ｘ１０がＧｌｎ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ及びＶａｌから成る群から選ばれたアミノ酸残基である、請求項１に記載の変異体。
２０．Ｘ１０がＶａｌ又はＴｒｐである、請求項１９に記載の変異体。
２１．Ｘ１１がＧｌｙ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ及びＡｓｎから成る群から選ばれたアミノ酸残基である、請求項１に記載の変異体。
２２．Ｘ１１がＡｒｇ又はＧｌｙである、請求項２１に記載の変異体。
２３．Ｘ１２がＡｌａ又はＧｌｙである、請求項１に記載の変異体。
２４．Ｘ１３がＬｙｓ、Ａｓｎ及びＡｓｐから成る群から選ばれたアミノ酸残基である、請求項１に記載の変異体。
２５．Ｘ１３がＬｙｓ又はＡｓｎである、請求項２４に記載の変異体。
２６．Ｘ１４がＶａｌ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ及びＬｙｓから成る群から選ばれたアミノ酸残基である、請求項１に記載の変異体。
２７．Ｘ１４がＬｙｓ又はＧｌｙである、請求項２６に記載の変異体。
２８．Ｘ１５がＶａｌである、請求項１に記載の変異体。
２９．Ｘ１がＧｌｕ−Ｔｈｒであり、そしてＸ１５がＶａｌである、請求項１に記載の変異体。
３０．以下のアミノ酸配列：【配列があります】（配列番号２）
３１．請求項１〜３０のいずれかに記載のヒトＫｕｎｉｔｚ型プロテアーゼ阻害剤変異体をエンコードしているＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ構築物。
３２．請求項３１に記載のＤＮＡ構築物を含んで成る組換え発現ベクター。
３３．請求項３１に記載のＤＮＡ構築物又は請求項３２に記載の発現ベクターを含む細胞。
３４．請求項１〜３０のいずれかに記載のヒトＫｕｎｉｔｚ型プロテアーゼ阻害剤変異体の製造方法であって、そのタンパク質の発現を誘導する条件下で請求項３３に記載の細胞を培養し、そして得られたタンパク質をその培養物から回収することを含んで成る方法。
３５．請求項１〜３０のいずれかに記載のヒトＫｕｎｉｔｚ型プロテアーゼ阻害剤変異体及び医薬として許容される担体又は賦形剤を含んで成る医薬組成物。
３６．ヘパリンをさらに含んで成る請求項３５に記載の組成物。
３７．病的なタンパク質分解に関連する疾患又は症状の防止又は治療のための医薬の製造のための、請求項１〜３０のいずれかに記載のヒトＶＩ型コラーゲンの α３鎖のＣ−末端Ｋｕｎｉｔｚ型プロテアーゼ阻害剤ドメイン又はそれの変異体の使用。