JPH0841098A

JPH0841098A - 新規阻害剤

Info

Publication number: JPH0841098A
Application number: JP7000681A
Authority: JP
Inventors: Hans Fritz; フリッツハンス; Dr Christian Sommerhoff; ゾンマーホフクリスティアン; Dr Jutta Heim; ヘイムユッタ
Original assignee: Ciba Geigy AG; UCP Gen Pharma AG
Current assignee: UCP Gen Pharma AG; Novartis AG
Priority date: 1994-01-07
Filing date: 1995-01-06
Publication date: 1996-02-13
Also published as: NZ270194A; IL112244A0; AU8159594A; AU701136B2; SG49610A1; US5861377A; KR950032284A; CA2139612A1; ZA9570B

Abstract

(57)【要約】【目的】本発明はアンチスタシン型セリン・プロテイ
ナーゼ阻害剤の族に属する新規の阻害剤を提供すること
を目的とする。【構成】本発明は、上記の新規阻害剤、医療用ヒルで
あるヒルド・メディシナリス(Hirudo medicinalis)から
のそれらの単離、新規阻害剤をコードするＤＮＡ配列、
組換え体ＤＮＡ技術又はペプチド合成により得られる変
異体、阻害剤を含有する製剤組成物、並びに診断及び治
療におけるそれらの使用にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はアンチスタシン型セリン
・プロテイナーゼ阻害剤の族に属する新規の阻害剤、医
療用ヒルであるヒルド・メディシナリス(Hirudo medici
nalis)からのそれらの単離、新規阻害剤をコードするＤ
ＮＡ配列、組換え体ＤＮＡ技術又はペプチド合成により
得られる変異体、阻害剤を含有する製剤組成物、並びに
診断及び治療におけるその使用に関する。

【０００２】

【従来の技術】アンチスタシンは、メキシコヒル即ちヘ
メンテリア・オフィシナリス(Haementeria officinali
s)の唾液腺から最初に単離されたシステイン−リッチな
セリン・プロテイナーゼである(Tuszynski et al., J.
Biol. Chem.(1987), 262, 9718-9723)。血液凝固因子Ｘ
ａの高度選択的緊密結合阻害剤であり、したがってinvi
tro及びin vivo の強力な抗凝固剤であるので、１１９
個のアミノ酸を有するこのポリペプチドにかなりの関心
が集まった（Vlasuk et al., Thromb. Haemostasis(199
1), 65, 257-262 ）。さらにアンチスタシンは顕著な抗
転移特性を有すると思われる(Tuszynski et al., J.Bio
l. Chem.(1987),262,9718-9723) 。アミノ酸配列分析に
より、アンチスタシンが２つの相同ドメインを含有する
ことが明らかになった。他の公知のタンパク質との配列
類似性は見出されなかったが、これはアンチスタシンが
セリンプロテイナーゼ阻害剤の新しい族の原型である
ことを示唆する(Nutt et al., J.Biol.Chem.(1988), 26
3,10162-10167)。一方、アンチスタシンに関連したタン
パク質が１つだけ同定されている；ジャイアントアマゾ
ンヒル即ちヘメンテリア・ジリアニイ(Haementeria ghi
lianii) から単離されるジランテンは、アミノ酸配列
（＞90% ）及び機能的特性に関してアンチスタシンとほ
ぼ同一である。最近、アンチスタシン- ドメインのＣ末
端ハーフとの相同を有する高度保存６倍反復を含有する
ｃＤＮＡ配列がヒドラ(Hydra) で同定された(Holstein
et al., FEBS Lett.,(1992),309,288-292)。しかしなが
ら、このｃＤＮＡ配列によりコードされる推定タンパク
質がプロテイナーゼ阻害剤又は抗転移剤としていかなる
活性を有するかは明らかでない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明においては、ア
ンチスタシン型阻害剤族の新規メンバーを提示する。ヒ
ルスタシン（Hirudoアンチスタシン）と呼ばれるこれら
のポリペプチドは医療用ヒル(Hirudo medicinalis)から
単離され、それらのアミノ酸配列及びプロテイナーゼ阻
害剤としての特性が確定された。下記でさらに詳細に説
明するように、組換え体ＤＮＡ技術又はペプチド合成に
より得られるヒルスタシン及びその変異体は、セリン・
プロテイナーゼ、例えばトリプシン、キモトリプシン、
組織カリクレイン及びカテプシンＧの作用に関連した障
害に治療能力を有する。ヒルスタシン及びアンチスタシ
ンの推定反応部位残基はほぼ同一である（図１）けれど
も、ヒルスタシンは単離因子Ｘａの触媒活性にもin vit
roの血液凝固カスケードにも影響を及ぼさない。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、配列番号１
（ヒルスタシン）に示されるようなアミノ酸配列を含む
ポリペプチド、あるいはその突然変異体、機能性断片又
は誘導体に関する。その発現突然変異体、機能性断片又
は誘導体としては、セリン・プロテイナーゼ、例えばト
リプシン、キモトリプシン、組織カリクレイン及びカテ
プシンＧと依然として結合するか又はそれを阻害する、
あるいは抗転移剤として作用する上記ポリペプチドの全
断片又は誘導体が挙げられる。好ましい態様において、
本発明のポリペプチドは抗凝固剤として用いられる。突
然変異体は、例えば１つ又はそれ以上の位置で置換又は
欠失されたアミノ酸を有するポリペプチドである。発現
誘導体としては、酸、例えば塩酸のようなハロゲン化水
素酸；硫酸、リン酸、ピロリン酸、ベンゼンスルホン
酸、ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、乳
酸、＊palmic acid 、酒石酸、アスコルビン酸、クエン
酸による製薬上許容可能な塩；窒素含有塩基のような塩
基、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム又はア
ンモニウム窒素含有塩基による塩、あるいは内部塩が挙
げられる。さらに、上記ポリペプチドの修飾形態、例え
ば検出可能なマーカー、例えば蛍光性、化学発光性又は
放射性マーカー、あるいはアビジン、ビオチン等を有す
るポリペプチドが挙げられる。

【０００５】上記ポリペプチドの断片は、Ｃ−又はＮ−
末端短縮化断片、並びにセリン・プロテイナーゼ、例え
ば組織カリクレイン及びカテプシンＧ、及び因子Ｘａ
と結合するか又はそれを阻害する、あるいは抗転移剤と
して作用する上記ポリペプチド内からの断片を包含す
る。例えばＣ末端Ｇｌｎを欠く断片が包含される。これ
らの断片は単独で、あるいは他のもの、例えば他のタン
パク質（融合タンパク質）又は化学化合物と組み合わせ
て用い得る。組合せの例としては、例えばタンパク質分
解に対する安定性を増大するためのヒルスタシンの結合
ドメインと化学的合成阻害剤との組合せ；例えば異なる
基質に対する阻害ドメインの作用を指図する、又はヒル
スタシンの特異性を増大するためのヒルスタシンの阻害
ドメインと異なるポリペプチドの結合ドメインとの組合
せ；例えばある区画中への特異的取り込みを誘発するた
めのヒルスタシンと別のポリペプチド又はオリゴペプチ
ドとの組合せが挙げられる。本発明のポリペプチドは、
ペプチド合成又は組換え体ＤＮＡ技術により得られる
か、あるいは慣用的方法により、例えばａ）ヒルの、好ましくは医療用ヒルであるヒルド・メデ
ィシナリス(Hirudo medicinalis)の抽出物を生成し；そ
してｂ）透析及びカラム・クロマトグラフィーにより、例え
ば陽イオン交換クロマトグラフィー、生物特異的アフィ
ニティークロマトグラフィー及び／又は別のイオン交換
クロマトグラフィー工程により抽出物を精製することにより、ヒルから、特にヒルド・メディシナリス(H
irudo medicinalis)から単離される。本発明の他の態様
は、本発明のポリペプチドをコードする組換え体ＤＮＡ
又は上記ＤＮＡの断片である。上記ＤＮＡの断片は、例
えば本発明のポリペプチドの機能性断片をコードする
か、又はスクリーニング操作におけるハイブリダイゼー
ション・プローブとして適している。選択的スクリーニ
ング操作のためのハイブリダイゼーション・プローブは
通常は１５以上のヌクレオチドから成る上記核酸の断片
である。

【０００６】発現カセット本発明のさらに別の態様は、上記のような本発明のポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ配列と、そして転写終結シ
グナルを含有するＤＮＡ配列と操作可能的に結合するプ
ロモーターを含むポリペプチド発現カセットである。発
現ポリペプチドを分泌し得る宿主においては、発現カセ
ットは好ましくは適正な読み枠中で本発明のポリペプチ
ドをコードする二次ＤＮＡ配列と結合するシグナルペプ
チドをコードする一次ＤＮＡ配列及び転写終結シグナル
を含有するＤＮＡ配列と作用可能な状態で結合するプロ
モーターを含む。好ましい態様において、プロモータ
ー、シグナル配列及びターミネーターは酵母菌発現系に
より認識される。

【０００７】ある種の宿主中での発現に適したプロモー
ターは十分公知である。その例としては、ＴＲＰ１遺伝
子、ＡＤＨＩ又はＡＤＨＩＩ遺伝子、酸性ホスファター
ゼ（ＰＨＯ５）遺伝子、ＣＵＰ１遺伝子、イソチトクロ
ームｃ遺伝子のプロモーター、又は解糖酵素をコード
する遺伝子、例えばＴＤＨ３、グリセルアルデヒド−３
−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ＧＡＰＤＨ
の短縮型（ＧＡＰＦＬ）、３−ホスホグリセリン酸キナ
ーゼ（ＰＧＫ）、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボ
キシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６
−リン酸イソメラーゼ、３−ホスフォグリセリン酸ムタ
ーゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラ
ーゼ、ホスフォグルコースイソメラーゼ、インベルター
ゼ及びグルコキナーゼ遺伝子のプロモーターが挙げられ
るし、あるいはａ−又はα因子をコードする酵母菌接合
フェロモン遺伝子のプロモーターを用い得る。本発明の
好ましいベクターは、例えば成育条件の変動によりオン
/ オフし得る転写制御を有するプロモーター、例えばＰ
Ｈ０５又はＣＵＰ１遺伝子のプロモーターを含有する。
例えば、専ら培地中の無機リン酸塩の濃度を増大又は低
減することによりＰＨＯ５プロモーターを随意に抑制又
は脱抑制し得るし、例えば銅塩の形態で培地にＣｕ2+イ
オンを付加することによりＣＵＰ１プロモーターをオン
し得る。特に好ましいのはＧＡＰＤＨ及び酵母菌ＣＵＰ
１プロモーターである。

【０００８】シグナルペプチド（”シグナル配列”）、
例えば酵母菌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列
は、好ましくは通常分泌されるポリペプチドをコードす
る遺伝子、例えば酵母菌遺伝子に由来する。例えば酵母
菌シグナル配列は、酵母菌インベルターゼ（ＳＵＣ
２）、α因子、フェロモンペプチダーゼ（ＫＥＸ
１）、”キラー毒素”及び抑制酸性ホスファターゼ（Ｐ
Ｈ０５）遺伝子のシグナル及びプレプロ配列、並びにア
スペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori) からの
グルコアミラーゼ・シグナル配列である。特異的プロセ
ッシング・シグナルを有し得るプロ- 又はスぺーサー配
列のような付加的配列を構築に用いて前駆体分子の精確
なプロセッシングを促すこともできる。例えばプロセッ
シング・シグナルはＬｙｓ−Ａｒｇ残基を含有するが、
これはゴルジ膜中にある酵母菌エンドペプチダーゼによ
り認識される。本発明の好ましいシグナル配列は、酵母
菌ＰＨ０５遺伝子、α因子の配列及び酵母菌インベルタ
ーゼ遺伝子の配列（ＳＵＣ２）である。転写終結シグナ
ル、例えば酵母菌転写終結シグナルを含有するＤＮＡ配
列は、好ましくは転写終結及びポリアデニル化のための
適正なシグナルを含有する遺伝子、例えば酵母菌遺伝子
の３’側位配列である。好ましい側位配列は、酵母菌Ｐ
Ｈ０５及びα因子遺伝子の配列である。

【０００９】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
は、当業界で公知の方法により天然宿主（医療用ヒルの
ヒルド・メディシナリス(Hirudo medicinalis ）の遺伝
子バンクから単離するか、又は例えば宿主の好ましいコ
ドン使用を用いたＰＣＲにより合成してもよい。プロモ
ーター、シグナル・ペプチドをコードするＤＮＡ配列、
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列及び転写終結シグ
ナルを含有するＤＮＡ配列は互いに作用可能な状態で結
合される。即ちそれらはその正常機能が維持されるよう
な方法で並列される。列は、プロモーターがシグナル配
列−ポリペプチド遺伝子複合体の適正な発現を遂行し、
転写終結シグナルが転写の適正な終結及びポリアデニル
化を遂行し、そしてシグナル配列最終コドンがポリペプ
チドのための遺伝子の一次コドンと直接結合されるよう
な方法でシグナル配列がポリペプチド遺伝子と適正な読
み枠内で結合されるような列である。酵母菌プロモータ
ーは、好ましくは主ｍＲＮＡ起始及びプロモーター遺伝
子と天然に結合するＡＴＧとの間のシグナル配列と結合
する。シグナル配列は翻訳開始のためのそれ自身のＡＴ
Ｇを有する。これらの配列の接続は、例えばエンドヌク
レアーゼの認識配列を有する合成オリゴデオキシヌクレ
オチド・リンカーにより遂行される。例えば関連する発
現カセットは、例えば欧州特許出願第341215号に記載さ
れている。好ましい発現カセットは、ＣＵＰ１又はＧＡ
ＰＤＨプロモーター、α因子又は酵母菌インベルターゼ
・リーダー配列、ヒルスタシン遺伝子及びα因子ターミ
ネーターを含む。特に好ましい発現カセットは、配列番
号：２又は配列番号：３に示すような組換え体ＤＮＡ分
子、あるいはその機能性断片又はその誘導体を含む。

【００１０】組換え体プラスミド本発明のさらに別の態様は、上記のようなポリペプチド
発現カセットを含む組換え体プラスミドに関する。ポリ
ペプチド発現カセットの他に、本発明の発現プラスミド
は複製起点を含有する２ミクロンＤＮＡから、２ミクロ
ンＤＮＡを有していない酵母菌株を用いる場合には総計
２ミクロンのＤＮＡから生じるＤＮＡセグメントを包含
し得る。後者の型のプラスミドが好ましい。例えば本発
明のプラスミドは連続形態で完全２ミクロンＤＮＡを含
有する。即ち２ミクロンＤＮＡを制限エンドヌクレアー
ゼで１度切断し、再環状化前に線状化ＤＮＡをベクター
の他の成分と結合させる。ＲＥＰ１、ＲＥＰ２及びＦＬ
Ｐ遺伝子の正常機能そして２ミクロンＤＮＡのＯＲＩ、
ＳＴＢ、ＩＲ１及びＩＲ２部位並びにＦＬＰレコンビナ
ーゼが作用する各々の逆方向反復（ＩＲ）の中心近くに
位置する”ＦＬＰ認識ターゲット”（ＦＲＴ）部位の正
常機能が維持されるように制限部位を選択する。任意
に、２ミクロンＤＮＡのＤ遺伝子も損なわれずに保持さ
れるように制限部位を選択する。適切な制限部位は、例
えばＤ遺伝子内に位置する独特のＰｓｔＩ部位、並びに
上記遺伝子及び部位のすべての外側に位置する独特のＨ
ｐａＩ及びＳｎａＢＩ部位である。しかしながら、同様
に発現カセット及びさらに別の成分を２ミクロンＤＮＡ
内の異なる（例えば２つの）制限部位、特に上記の部位
に挿入できる。

【００１１】このようなプラスミド誘導体は、２つの逆
方向反復ＦＲＴ部位又は追加の第三ＦＲＴ部位を含む。
前者種のプラスミドは以後”対称性２ミクロン様ハイブ
リッド・ベクター”と呼ぶ。後者種のプラスミドは、真
正対称性プラスミドではないにもかかわらずそれにより
形質転換される酵母菌細胞中に対称性２ミクロン様ハイ
ブリッド・ベクターを生じるので、以後”対称性２ミク
ロン様壊変ベクター”と呼ぶ。本発明の対称性２ミクロ
ン様ハイブリッド・ベクターは、好ましくは細菌又はウ
イルスＤＮＡ配列、即ち細菌ゲノム、プラスミド又はウ
イルス由来のＤＮＡを含有しない。しかしながら、本発
明の２ミクロン様壊変ベクターは、対称性２ミクロン様
ハイブリッド・ベクターが壊変ベクターから生成される
形質転換酵母菌鎖簿中のベクターから切り取られる２つ
の直接反復ＦＲＴ部位間の原核生物起源のＤＮＡ配列を
含み得る。これらのＤＮＡ配列は下記のように細菌性配
列であり、ベクターに不可欠な構造的及び機能的特徴を
供給し得るか、あるいは対称性２ミクロン様ハイブリッ
ド・ベクター又は対称性壊変ベクターを構築するため
に、非対称性２ミクロン様プラスミド誘導体の又は”非
対称性”壊変ベクターの２つの逆方向反復ＦＲＴ部位間
の２つの領域を埋める機能を有し得るだけである。

【００１２】本発明の意味内で対称性である２ミクロン
様ハイブリッド・ベクターにおいて、又はこのような対
称性２ミクロン様ハイブリッド・ベクターを生じる壊変
ベクターにおいて、２つの逆方向反復ＦＲＴ部位間に位
置する領域の長さは約１：１〜約５：４の比を有する。
即ち大きい方の領域は小さい方の領域より約20% まで大
きい。本発明の好ましい一態様において、環状形態の２
ミクロンＤＮＡの反対方向反復ＦＲＴ部位間の２つの領
域はほぼ同じ長さを有する。好ましくは、本発明の発現
プラスミドは１つ又はそれ以上の、特に１つ又は２つの
選択遺伝子マーカー、例えば酵母菌のためのマーカー、
並びに細菌宿主、特に大腸菌エスケリキア・コリ(Esche
richia coli)のためのマーカー及び（対称性２ミクロン
様ハイブリッド・ベクターを除いて）複製の原型を含有
する。選択遺伝子マーカーに関しては、マーカー遺伝子
の表現型発現による形質転換株に対する選択を促すあら
ゆるマーカー遺伝子を用い得る。適切なマーカーは、例
えば抗生物質耐性を発現するもの、あるいは栄養要求性
酵母菌突然変異株の場合は宿主領域を補足する遺伝子で
ある。対応する遺伝子は、例えば抗生物質Ｇ４１８、ハ
イグロマイシン又はブレオマイシンに対する耐性を授与
するか、あるいは栄養要求性酵母菌突然変異体、例えば
ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＨＩＳ３又はＴＲＰ１
遺伝子において原栄養株性に必要な手段を講じる。発現
プラスミドの増幅は原核生物、例えば大腸菌(E. coli)
中で行うのが便利であるので、原核生物、例えば、大腸
菌(E.coli)遺伝子マーカー、及び原核生物、例えば大腸
菌(E. coli) 複製起点を含有すると有益である。これら
は対応する原核生物プラスミド、例えば大腸菌(E. col
i) プラスミド、例えばともに原核生物、例えば大腸菌
(E. coli) 複製起点及びアンピシリンのような抗生物質
に対する耐性を授与する遺伝子マーカーを含有するｐＢ
Ｒ３２２又はｐＵＣプラスミド、例えばｐＵＣ１８又は
ｐＵＣ１９から得られる。

【００１３】ポリペプチド発現カセット、（単数又は複
数の）複製原型及び（単数又は複数の）遺伝子マーカー
の他に、本発明の発現プラスミドは１〜３個の追加のポ
リペプチド発現カセット及び／又は１つの追加の転写活
性化因子ＡＣＥ１発現カセットのような付加的発現カセ
ットを任意に含有し得る。（単数又は複数の）追加の発
現カセットは互いに同一であっても異なってもよく、且
つベクター上にすでに存在するポリペプチド発現カセッ
トと同一であっても異なってもよく、且つ各々が、適切
な読み枠内でポリペプチドをコードする二次ＤＮＡ配列
及び適切な転写終結シグナルを含有するＤＮＡ配列と結
合するシグナル・ペプチドをコードする一次ＤＮＡ配列
と操作可能的に結合する適切なプロモーターを含む。こ
のような追加のポリペプチド発現カセット中の適切な酵
母菌プロモーターは、例えば上記のように複合培地中で
酵母菌によりポリペプチドの発現のために用いられるあ
らゆる構成的又は誘発性酵母菌プロモーターである。適
切なシグナル配列及び転写終結シグナルは特に上記のも
のである。追加のＡＣＥ１発現カセットは、それ自身の
転写及び翻訳開始及び終結シグナルを含むか、あるいは
ＡＣＥ１プロモーターとは異なる構成的又は誘発性酵母
菌プロモーター、例えばＣＵＰ１又は構成的（短縮化）
ＧＡＰＤＨプロモーター（例えばＧＡＰＦＬプロモータ
ー）により転写制御される。適切なＡＣＥ１発現カセッ
トは、例えばサッカロミセス・セレビシエ(S. cerevisi
ae) ゲノム1.7 kb ＥｃｏＲＶ断片中に含有される(Fur
st etal., Cell(1988),55,705-717) 。慣用的手段及び
方法により、純種ＡＣＥ１プロモーターをその中で別の
酵母菌プロモーター、例えばＣＵＰ１プロモーターに置
き換え得る。追加のポリペプチド及び／又はＡＣＥ発現
カセットの転写の方向は決定的なものではなく、本発明
のベクター中にすでに存在するポリペプチド発現カセッ
トの転写の方向と同じであっても反対方向であってもよ
い。

【００１４】宿主本発明のさらに別の態様は、上記のようなハイブリッド
・プラスミドを含有する宿主に関する。適切な宿主は、
原核生物又は真核生物起源のものである。その例として
は、細菌、真菌、植物又は昆虫細胞のような微生物学的
宿主が挙げられる。好ましい宿主は細菌及び真菌細胞、
例えば大腸菌(E. coli) 又は真菌、例えば、サッカロミ
セス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、黒色ア
スペルギルス即ちアスペルギルス・ニガー( Aspergillu
s niger) 、アスペルギルス・ニドゥランス(Aspergill
us nidulans)又はアカパンカビ即ちネウロスポラ・クラ
ッサ(Neurosporacrassa) である。好ましい酵母菌株は
上記のもの、例えば内因性２ミクロン・プラスミド（”
ｃｉｒ0 株”）を矯正されたビール酵母菌(S. cerevisi
ae) の株、特に酵母菌プロテアーゼが一つだけ又は多数
欠けている株である。ＣＵＰ１プロモーターを用いる場
合には、酵母菌株は染色体ＡＣＥ１遺伝子の１〜３個の
追加のコピーを含有する。種々のプロテイナーゼが、上
記のものと同様に、酵母菌サッカロミセス・セレビシエ
(Saccharomyces cerevisiae)において特性化されている
(Achstetter et al., Yeast(1985),1,139-157)。これら
のプロテアーゼのほとんどの活性を欠く突然変異体が単
離され、生化学的に調べられた。ある種のプロテアーゼ
が存在しないことの結果が明らかにされ、いくつかの特
性が異種タンパク質の産生に有用であることが立証され
た。本発明の酵母菌中に欠けているプロテアーゼは細胞
代謝に不可欠な機能を遂行しない。したがってこれらの
タンパク質の活性を完全に破壊する突然変異は致死性で
ない。例えば酵母菌株は、カルボキシペプチダーゼｙｓ
ｃα、ｙｓｃＢ、ｙｓｃＡ、ｙｓｃＹ及びｙｓｃＳの群
から選択されるプロテアーゼを１つ又はそれ以上欠いて
いる。

【００１５】このような酵母菌株の産生方法は、例えば
欧州特許出願第340170号及び欧州特許出願第341215号に
記載されている。ゲノムＣＵＰ１遺伝子生成物活性を欠
く酵母菌株は公知であるか、又は例えば特定部位の突然
変異誘発又は遺伝子分裂又は遺伝子置換によりそれ自体
公知の方法で調製し得る(Rudolph et al., Gene(1985),
36, 87-95) 。不活性化される遺伝子の配列が公知であ
るならば、適切に案出された突然変異性オリゴデオキシ
リボヌクレオチド・プライマーの調製を包含する十分公
知の特定部位の突然変異誘発手法（例えば、M.J.Zoller
and M.Smith Methods Enzymol. (1983),100,468 参
照）を使用する挿入、置換又は欠失により遺伝子を欠損
させ得る。遺伝子置換又は特定部位の突然変異誘発手法
は当業界では普通に用いられ、無条件に再現可能であ
る。所望の遺伝子背景を有する、例えば染色体ＣＵＰ１
分裂遺伝子を有する及び／又はある種のプロテアーゼの
欠損を有する酵母菌株を作るためのさらに一般的な方法
は、適切な酵母菌株を有糸分裂交叉させ、次いで四分子
分析を行う方法である。二倍体細胞から得られる四分子
を、標準遺伝子技術により切断する。四分子の４つの胞
子間の無作為類別により、その後の交叉における適切な
突然変異体の構築がなされる。無作為胞子分析は、代替
系としても用い得る。染色体ＡＣＥ１遺伝子の１〜３個
の付加的コピーを含有する酵母菌株も、慣用的方法で調
製し得る。例えばＡＣＥ１遺伝子（単数又は複数）を染
色体遺伝子の適切な制限部位（単数又は複数）に挿入し
て抗生物質耐性を付与するか、あるいはアミノ酸もしく
はプリン又はピリミジン塩基合成を引き起こす遺伝子
（単数又は複数）においては、その結果生じるＡＣＥ１
遺伝子のこのような追加のコピー（単数又は複数）を含
有する酵母菌株を抗生物質感受性にし、且つそれぞれ対
応するアミノ酸、プリン又はピリミジン塩基に関して栄
養要求性にする。本発明のハイブリッド・プラスミドに
よる宿主の形質転換は、当業界で公知の方法により達成
し得る。

【００１６】ポリペプチドの製造方法本発明のさらに別の部分は、上記のような宿主を培養
し、上記のようなポリペプチド発現カセットで形質転換
させ、それにより産生されるタンパク質を単離すること
から成る上記のようなヒルスタシン、あるいはその機能
性断片又はその誘導体の製造方法である。ポリペプチド
は慣用的方法により単離し得る。例えば第一工程は通
常、細胞壁を溶解し、遠心分離によって細胞破片を除去
し、あるいは分泌タンパク質の場合には遠心分離により
培養液から細胞を分離することから成る。その結果生じ
る上清は、非タンパク質様物質のほとんどを除去するた
めにポリエチレンイミンで処理することによりポリペプ
チドに富んだものにし、溶液を硫酸アンモニウムで飽和
させることによりタンパク質を沈殿させ得る。宿主タン
パク質は、存在する場合には、例えば酢酸（例えば0.1
% ，pH４〜５）で酸性化することにより沈殿させること
ができる。他の精製工程としては、例えば脱塩、クロマ
トグラフィー法、例えばイオン交換クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過クロマトグラフィー、分配クロマトグラフ
ィー、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ等が挙げられる。混合物
の構成成分の分離は、透析により、電荷によってゲル電
気泳動又は無担体電気泳動により、分子サイズによって
適切なセファデックス(Sephadex(登録商標))カラムによ
り、例えば抗体、特にモノクローナル抗体を用いたアフ
ィニティー・クロマトグラフィーにより遂行する。ヒル
スタシンの場合には、使用する酵母菌株、プロモーター
及びシグナル・ペプチドに関係なく、産生されるヒルス
タシンは主に培地中に分泌され、そこから単離される。
遠心分離後、アフィニティー・クロマトグラフィーに適
した担体と結合するトリプシン、キモトリプシン又はカ
テプシンＧを用いて、他の方法、特に文献から公知の
方法と同様にヒルスタシンを分離し得る。さらに化学的
合成による、例えば固相合成（Merrifield合成）の形態
での、上記のようなポリペプチドの製造も含まれる。

【００１７】製剤組成物本発明に従って生成されるヒルスタシンあるいはその突
然変異体、機能性断片又は誘導体は有益な薬理学的特性
を有し、ヒト又は動物体の処置のために予防的に、又は
特に治療的に用い得る。本発明のポリペプチドは、セリ
ン・プロテイナーゼ、例えばトリプシン、キモトリプシ
ン、組織カリクレイン及びカテプシンＧの強力な阻害
剤であり、例えば抗転移剤として用い得る。それらは、
例えば10^-9M 〜10^-13のＫ1 値を有する。これらのポリ
ペプチドは、例えば組織カリクレインに対して完全に特
異的であり、血液凝固系の他のプロテイナーゼとの相互
作用を示さず、したがって特異的カリクレイン阻害剤と
して用い得る。したがって本発明の新規のポリペプチド
は、（例えば敗血症又は多外傷性ショックのための）急
性ショック療法のために、消費性凝固障害の治療のため
に、血液透析、血液分離において、及び体外血液循環に
おいて、術後血栓症を含めた血栓症及び塞栓症の治療及
び予防に用い得る。カリクレインは、全身性血圧維持の
病態生理学的方法にも含まれる。したがって本発明のポ
リペプチドは高血圧症の管理にも用い得る。本発明はさ
らに、治療的有効量の少なくとも１つの本発明のポリペ
プチド又は製薬上許容可能なその塩を、任意に製薬上許
容可能な担体及び／又は付加物と一緒に含有する製剤組
成物に関する。これらの組成物は、例えば非経口的に、
例えば静脈内に、皮内に、皮下に又は筋内に、任意に慣
用的担体と一緒に投与する場合、特に上記の適応症に用
い得る。

【００１８】本発明はさらに、本発明の新規のポリペプ
チドの使用、並びにヒト又は動物体の予防的及び治療的
処置のための、特に上記臨床症候のためのそれらを含有
する製剤組成物に関する。用量は、特に投与の特定の形
態、及び治療又は予防の目的に依っている。この投与量
のサイズ及び投与養生法は、特定の症例についての個々
の判断によって決めるのが最もよい。このために必要な
関連血液因子を確定するための方法は、当業者には公知
である。一般に、注射の場合には、本発明のポリペプチ
ドの治療的有効量は約0.005 〜約0.1 mg/kg 体重の用量
範囲である。約0.01〜約0.05 mg/kg体重の範囲が好まし
い。投与は、静注、筋注又は皮下注射により実行する。
したがって、一回投与形態での非経口的投与のための製
剤組成物は、投与様式により、一回の用量当たり約0.4
〜約7.5 mgの本発明のポリペプチドを含有する。活性成
分の他に、これらの製剤組成物は通常はpH値を約3.5 〜
7 に維持するための緩衝剤、例えばリン酸緩衝剤、及び
等張性を調整するための塩化ナトリウム、マンニトール
又はソルビトールも含有する。それらは凍結乾燥又は溶
解形態でもよく、抗菌的に活性な防腐剤、例えば0.2 〜
0.3 % ４- ヒドロキシ安息香酸メチルエステル又はエチ
ルエステルを含有すると溶液にとっては有益である。ヒ
ト又は動物の身体内に直接医療用に用いるための上記の
組成物の他に、本発明はさらにヒト又は動物の生体の外
側に医療用に用いるための製剤組成物に関する。このよ
うな組成物、例えば保存溶液、あるいは一回投与形態の
組成物はその構成が上記の注射組成物と同様である。し
かしながら、活性成分の量又は濃度は、処置される血液
の用量を基礎にするのが有益である。特定の目的によっ
て、適切な用量は約0.01〜約1.0 mgの活性成分/ 血液１
リットルであるが、しかし上限を超えると依然として危
険である。

【００１９】以下の実験部分では、本発明の種々の態様
を以下の添付の図面を参照しながら説明する。実験部分：ａ）阻害活性：精製操作中に、トリプシン及びキモトリ
プシンのアミド分解活性の阻害を測定することにより、
阻害活性を検定した。標本を50mM Tris/HCl(pH 7.8)，
1.0 %( 質量/ 容量) Triton X-100に溶解したトリプシ
ン（225 nM）を用いて25℃で12分間インキュベートし
た。検定は、基質ベンゾイル- Ｌ- アルギニンｐ-
ニトロアニリド(0.4 mM, 最終濃度) の付加により開始
した。ＵＶＩＫＯＮ９３０( 登録商標) 光度計（Kont
ron; Eching, Germany）を用いて405 nmで3.5 分測光的
に放出ニトロアニリドをモニタリングした。同様に、10
0mM Tris/HCl,pH 7.8 ，1.0 % ( 質量/ 容量) Triton X
-100中で基質としてＡｃ- Ｌ- チロシンｐ- ニトロア
ニリド（0.7 mM, 最終濃度）を用いてキモトリプシン
(1.3 mM）の阻害を調べた。１阻害単位（ＩＵ）は、１
mmol/ 分で基質加水分解を低減する阻害剤の量と定義し
た。ｂ）タンパク質検定：基準として牛血清アルブミンを用
いるビシンコニン酸(bicinchoninic acid)法（Smith et
al., Anal.Biochem.(1985),150,76-85 ）を用いてタン
パク質濃度を測定した。ｃ）ＤＮＡ操作：標準プロトコールに従って、（別記し
ない限り）全ＤＮＡ操作を実施した（例えば、Sambrook
et al.,Molecular Cloning; A laboratory manual, 2n
dEdn.(1989) ）。

【００２０】

【実施例】実施例１：ヒルスタシンの精製ＷＯ86/03493に記載されているようにアセトンで均質化
ヒルを抽出し、引き続いてエタノールを付加して不純物
を沈殿させることにより、医療用ヒルであるヒルドメ
ディシナリス Hirudo medicinalisからの抽出物を調製
した。分解溶液を真空下で濃縮し、アセトンで分別沈殿
後、最高アセトン濃度で得られた沈殿を水で抽出し、親
液化した。ａ）ＳＰ−セファデックス Sephadex(登録商標) 上での
クロマトグラフィー親液化ヒル抽出物（〜3.5 g ）を脱イオン化水（77 m
l）中に溶解し、４℃で一夜、20mMリン酸ナトリウム（p
H 8.0 ）に対して透析した。透析物質を、同一緩衝液
で平衡させたＳＰ- セファデックス(Sephadex(登録商
標))カラム（1.6 x20 cm ）上に置いた。流出液の光学
濃度（280 nm）が基準線値に達するまでカラムを洗浄
し、500 mM ＮａＣｌ（pH 8.0 ）を含有する20 mMリ
ン酸ナトリウム緩衝液で１ml/ 分の流量で溶離した。阻
害活性物質を含有する分画をプールした。ｂ）無水トリプシン- セファロース(Sepharose( 登録商
標))上でのアフィニティー・クロマトグラフィー Ako 等（Ako et al., Biochem. Biophys. Res. Comm.(1
972),47,1042-1047 ）が記載したようにトリプシンから
無水トリプシンを調製した。Pharmacia 社のガイドライ
ンに従って、臭化シアン−活性化セファロース４Ｂ( 登
録商標) （Pharmacia ）上にそれを固定化した。

【００２１】陽イオン交換クロマトグラフィーからのプ
ール物質（〜20ml）を、20 mMリン酸ナトリウム緩衝液
（pH 8.0 ）で平衡させた無水トリプシン−セファロー
スSepharoseRカラム（1.6 x 3.6 cm）上に載せた。用い
た阻害活性物質の約50% が結合した。流液中の残余物を
再クロマトグラフィー用に集めた。カラムを広範に洗浄
（〜10カラム容量）後、100 mM ＫＣｌ/ ＨＣｌ（pH
2.1 ）を0.3 ml/ 分の流量で加えて溶離を開始した。分
画を収集し、１ M Trisを加えて直ちに中和した。プー
ルした溶離液を20 mMリン酸ナトリウム（pH 8.0 ）に
対して４℃で一夜透析した。ｃ）モノ Mono Ｓ( 登録商標) 上でのクロマトグラフ
ィーアフィニティークロマトグラフィーからの透析溶離液
を、20 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 8.0 ）で平衡
させたモノ Mono Ｓ( 登録商標) 陽イオン交換カラム
（0.5 x 5 cm, Pharmacia ）上に載せた。カラムを同一
緩衝液で洗浄し、次いで60〜120 mM ＮａＣｌの直線勾
配を１ml/ 分の流量で用いて溶離した。この最終クロマ
トグラフィー工程の溶離プロフィルから、トリプシン及
びキモトリプシン阻害活性が同時溶離し、〜100 mM Ｎ
ａＣｌで主要タンパク質ピークを有することが明らかに
なった。阻害活性物質を含有する分画をプールし（〜６
ml）、アリコートにして、−20℃で保存した。ヒルスタ
シンの代表的精製結果を表１に要約する。表１：

【００２２】

【表１】

【００２３】単離ヒルスタシンはＳＤＳ−ＰＡＧＥ（10
〜20% ポリアクリルアミド）により均質となり、これ
は銀染色後にウシ膵臓トリプシン阻害剤よりいくぶんゆ
っくり移動する１本のバンドを示した。同様に、逆相Ｈ
ＰＬＣ及びＮ末端配列分析は、＞90% の純度を示唆し
た。ＨＰＬＣのための条件：標本（〜１ nmol タンパク質）
をリクロスフェア Lichrospher RP8(登録商標) R 逆相
カラム（125 x 4 mm; Merck ）上に載せ、0.1 % （重量
% ）トリフルオロ酢酸に溶解した０% 〜40% （容量% ）
アセトニトリルの直線勾配を用いて１ml/ 分の流量で40
分以内に溶離した。見掛Ｍ_rが5738及び5866である２種
の阻害剤を分光分析法により検出した。これらのＭ_r値
は、ヒルスタシンの、そして１個のアミノ酸によりＣ末
端で平滑末端にされた阻害剤形態のアミノ酸配列から算
出したものとよく一致した（それぞれＭ_r5741及び586
9，５ジスルフィド結合と仮定する）。質量分光分析法のための条件注入ポンプを用いてタンデム四極子計器ＡＰＩＩＩＩ
（Sciex, Thomhill, Ontario, Canada）に取付けられる
大気圧イオン化源中にＨＰＬＣ精製阻害剤を注入した。
ポリプロピレングリコールのアンモニウム付加物イオン
を用いて計器を検量した。多荷電イオンの電荷分布プロ
フィルのｍ／ｚピークから、タンパク質の平均分子質量
値を算出した。

【００２４】実施例２：ヒルスタシンのアミノ酸組成アミノ酸分析：酸化阻害剤の標本を5.7 M 塩酸中で110
℃で20時間、真空下で加水分解し、Biotronik LC 5000
高性能分析器（Puchheim, Germany ）で分析した。結果
を表２に示す。表２：

【００２５】

【表２】

【００２６】ａ）還元及びＳ−β−ピリジルエチル化：
本質的にFriedman等(Friedman et al., J. Biol. Chem.
(1970), 245,3868-3871)が記載したようにＳ−β−ピリ
ジルエチル化を実施した。阻害剤（〜１ nmol）を100 m
l緩衝液（６ M グアニジニウム−ＨＣｌ，0.25 M Tris
/HCl, 1 mM EDTA, 5%(vol/vol) β−メルカプトエタ
ノール；pH 8.5 ）に溶解し、室温で一夜インキュベー
トした。５mlの４−ビニルピリジンの付加及び90分間イ
ンキュベーション後、蟻酸で酸性化して反応を停止させ
た。アクアポア Aquapore ＲＰ３００( 登録商標) カ
ラム（2.1 x 30 mm; Applied Biosystems, Weiterstad
t, Germany ）上での逆相クロマトグラフィーにより、
Ｓ−ピリジルエチル化阻害剤を脱塩した。ｂ）阻害剤の酸化：蟻酸（100 容量% ; 45 ml ）及び過
酸化水素（30容量% ; 5 ml）の混合物を室温で１時間予
備インキュベートした。その後、阻害剤（〜１ nmol ）
を加えた。４℃で１時間インキュベーション後、１mlの
脱イオン化水で希釈し、親液化して反応を停止させた。
天然阻害剤の自動エドマン分解（ガス相シーケンサー
４７３Ａ Applied Biosystems）によりヒルスタシンの
Ｎ末端２１アミノ酸残基を確定した（配列番号：１）。
トリプシン及びキモトリプシンによる天然、並びに還元
及びＳ−ピリジルエチル化阻害剤の断片化後に、さらな
る配列情報を得た。阻害剤（〜１ nmol ）を１ M 炭酸
水素アンモニウム緩衝液（pH 8.0） 100mlに溶解した
トリプシン、キモトリプシン又はエンドプロテイナーゼ
Ｇｌｕ−Ｃ（シーケンシング等級；Boehringer Mannh
eim ）を用いて37℃で14時間インキュベートした。トリ
プシン及びキモトリプシンに関しては１：40、エンドプ
ロテイナーゼＧｌｕ−Ｃに関しては１：20の酵素/ 阻
害剤比（質量/ 質量）を用いた。蟻酸で酸性化して反応
を終結させ、その結果生じた断片をＨＰＬＣ（上記）に
より分離して、主ペプチドをシーケンシングした。最後
に、ペプチドＣｙｓ２２−Ａｒｇ３０及びＩｌｅ３１
−Ｐｒｏ４７と重複する断片を得るために、そして付加
的Ｃ末端ペプチドを生成するために、阻害剤をエンドプ
ロテイナーゼＧｌｕ−Ｃで消化した。ヒルスタシンの及
びシーケンシングした大型断片の完全構造を配列番号：
１に示す。得られた配列はアミノ酸分析の結果とよく一
致した（表２）。

【００２７】実施例３：ヒルスタシンの特異性トリプシン及びキモトリプシンによる単離タンパク質の
滴定により確定した反応部位の濃度は同一であった。こ
の滴定に関しては、ｐ- ニトロフェニルｐ’- グアニ
ジノベンゾエートを用いて活性部位滴定により、ウシ膵
臓トリプシンを標準化した（Chase et al., Methods in
Enzymol.(1970), XIX, 20-27 ）。阻害剤と酵素との間
の等モル相互作用を仮定して活性阻害剤の濃度を算出し
た。ヒルスタシンの特異性を確定するために、種々のセ
リン・プロテイナーゼのアミド分解活性に及ぼすその作
用を測定した（表３参照）。したがって、プロテイナー
ゼを阻害剤（1.3 mM）を用いて15及び30分間インキュベ
ートし、適切な基質を加えた後に残留酵素活性を測定し
た。本質的にはBeith(Bull. Europ. Physopat. Resp.(1
980),16,183-195)が記載したように、ヒルスタシンと個
々のプロテアーゼとの複合体に関する平衡解離定数（Ｋ
_i）を確定した。要するに、漸増濃度の阻害剤を一定濃
度の酵素と一緒にインキュベートした。酵素−阻害剤複
合体が平衡に達するのに要する時間を予備実験で各プロ
テアーゼに関して測定した。次に基質を加え、残留酵素
活性を測定した。非直線回分析を用いて帰緊密結合阻害
剤に関する等式に定常状態速度を当てはめて、見掛Ｋ_i
値を算出した（Morrison, Biochem. Biophys. Acta (19
69),185,269-286 ）。ヒルスタシンは、ほぼ同一の親和
性を有するウシトリプシンとウシ・キモトリプシンを
阻害した。それぞれトリプシンとの及びキモトリプシン
との複合体に関しては、７及び6.4 nM のＫ_i値を算出
した（表３）。さらに、ヒルスタシンは、ナノモル範囲
の親和性を有する（それぞれ複合体に関してＫ_i13及び
2.9 nM）組織カリクレイン及びカテプシンＧを阻害し
た。プラスミン（Ｋ_i138 nM）に関しては弱い阻害が観
察された。これに対比して、用いた最高濃度（1.3 mM）
でさえ、阻害剤は、ヒトα−トロンビン及びＸａ因子を
含めて試験した他のプロテイナーゼに影響を及ぼさなか
った。表３：

【００２８】

【表３】

【００２９】実施例４：In vitro血液凝固に及ぼすヒル
スタシンの作用ヒルスタシンが血液凝固をin vitroで阻害するか否かを
調べるために、メーカーのガイドラインに従って、Amel
ung KC10凝固計（Lemgo, Germany）及びBehringwerke A
G(Marburg, Germany) からの試薬セットを用いて、プロ
トロンビン時間及び半トロンボプラスチン時間に及ぼす
その影響を測定した。1.3 mMの濃度では、阻害剤は血液
凝固のこれらの全体的パラメーターに及ぼす有意の作用
を示さなかった（表４）。したがって、阻害剤は、Ｘａ
因子又は血液凝固カスケードに付随するいかなる他のプ
ロテイナーゼも有意に阻害しなかった。表４：

【００３０】

【表４】

【００３１】実施例５：ｐＦＢＹ１３９の構築ｐＦＢＹ１３９は、1048 bp ＢａｍＨＩ断片を含有す
るｐＵＣ１８由来プラスミドである。この断片は、α因
子リーダー（スタッファー断片）及びα因子ターミネー
ターのＡＴＧと融合するＧＡＰＤＨプロモーターを含有
する。融合を工作する精確な方法によって、ＥｃｏＲＩ
部位を用いることによりＡＴＧに、ＰｓｔＩ部位を用い
ることによりシグナル配列の後ろに、又はＢｇＩＩＩ部
位の後ろに挿入することによりα因子リーダー配列の後
ろに、断片を含有するＯＲＦを挿入することができる。
発現されるＯＲＦは理想的にはそれらの３’末端にＳａ
ＩＩ部位を有してＳａＩＩ部位に先行されるターミネー
ターとの融合を促す必要があるし、２つのＢａｍＨＩ部
位でのこのプラスミドの切断はそれが酵母菌シャトルベ
クター中に容易にクローン化され得るように全発現カセ
ットを切り取るので、それらの配列内にＢａｍＨＩ部位
を有さない。

【００３２】ＢａｍＨＩ部位を含有する合成配列ＧＡ
ＴＣＣＣＣＡＧＣＴＴ（配列番号２）は−３９２から−
１まで酵母菌ＧＡＰＤＨプロモーター配列に先行する
が、この場合、−１はＧＡＰＤＨＯＲＦのＡＴＧのＡ
に先行する塩基である。これはＥＭＢＬＧＥＮＢＡＮ
Ｋ受入番号Ｍ１３８０７のヌクレオチド２８７〜６５
３、並びにＥＭＢＬＧＥＮＢＡＮＫ受入番号Ｊ０１３
２４のヌクレオチド１２８〜１５０に相当するが、但
し、ＡＴＧの直前にＥｃｏＲＩ部位（これはｐＦＢＹ１
３９における唯一の部位である）を生成するために塩基
−９〜−５をＧＡＡＴＴに置換する。ＡＴＧは、Ｌｙｓ
ＡｒｇＫＥＸ２切断部位に関する正常位置の直前に、
α−１因子フェロモンシグナル配列及びリーダー（ＥＭ
ＢＬＧＥＮＢＡＮＫ受入番号Ｘ０１５８１のヌクレオ
チド２９３〜５２７）として提供され、その後にＢｇＩ
ＩＩ部位（これはｐＦＢＹ１３９における唯一の部位で
ある）に位置する配列ＡＧＡＴＣＴＴＧＣがくる。Ｅ
ｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ又はＢｇＩＩＩ部位とＳａＩＩ部位
（スタッファー断片の終点とα−１因子フェロモン・タ
ーミネーター配列の始点を示す（ＥＭＢＬＧＥＮＢＡ
ＮＫ受入番号Ｘ０１５８１ヌクレオチド８２５〜１１０
０））との間のプラスミド中に入ってくるＯＲＦがクロ
ーン化される場合には常に除去されるので、ＢｇＩＩ部
位の後には重要な配列は来ない。この直後には、発現カ
セットのこの末端と結合するＢａｍＨＩ部位をコードす
る配列ＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣがくる。

【００３３】酵母菌ゲノムＤＮＡからのポリメラーゼ鎖
反応（ＰＣＲ）断片を用いて、このプラスミドを構築し
うる。ＰＣＲ反応に用いるオリゴヌクレオチドはすべ
て、自動ＤＮＡ合成機を用いて合成した。ＰＣＲ反応
は、以下の条件下でPerkin Elmer社製のＰＣＲユニット
中で実行した：当該する20mMのオリゴヌクレオチドを、
2.5 単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ及び0.2 mMのｄ
ＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＧＴＰとともに 0.1
mlの緩衝液（10mM Tris-HCl, pH 8.3, 50mM MgCl2）中
でインキュベートした。反応液は、92℃で30秒、42℃で
１分及び72℃で１分で、30サイクルインキュベートし
た。

【００３４】ＰＣＲ断片配列番号４及び配列番号５配列番号４ 5' GCATGGATCCCAGCTTAGTTCATAGGTCCATTCTCTTAGCGC 3' 配列番号５ 5' CTCGGAATTCTTATGTGTGTTTATTCGAAACTAAGTTC 3' を用いてＧＡＰＤＨプロモーターを含む断片をゲノム酵
母菌ＤＮＡから生成し、その後ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲ
Ｉで切断した。ＰＣＲ断片配列番号６及び配列番号７配列番号６ 5' GTGCGAATTCAAAATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAG 3' 配列番号７ 5' CAAAGTCGACTTTATCCAGCAAGATCTCTTCTTCTTTAGCAGCAATGC 3' を用いてα因子シグナル及びリーダー配列のほとんどを
含む断片をゲノム酵母菌ＤＮＡから生成した。

【００３５】ＰＣＲ断片配列番号８及び配列番号９配列番号８ 5' GAAGAGATCTTGCTGGATAAAGTCGACTTTGTTCCCACTGTACTTTTAGC 3' 配列番号９ 5' CCGGGGATCCGAATTAATTCTCTTAGGATTCG 3' を用いてα因子ターミネーターを含む断片をゲノム酵母
菌ＤＮＡから生成した。α因子シグナル及びリーダー配
列のほとんどを含む断片並びにα因子ターミネーターを
含む断片を混合し、配列番号６及び配列番号８とのＰＣ
Ｒ反応で再増幅し、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断し
た。後者増幅断片及びＧＡＰＤＨプロモーターを含む断
片をＢａｍＨＩで切断したｐＴＺ１８Ｒ中でクローン化
し、細菌アルカリ性ホスファターゼで処理して、ｐＦＢ
Ｙ１３９を生成した。

【００３６】実施例６：ｐＦＢＹ１６６の構築ｐＦＢＹ１６６は、1085 bp ＢａｍＨＩ断片を含有す
るｐＵＣ１８由来プラスミドである。この断片は、α因
子リーダー（スタッファー断片）及びα因子ターミネー
ターのＡＴＧと融合するＣＵＰ１プロモーターを含有す
る。融合を工作する精確な方法によって、ＥｃｏＲＩ部
位を用いることによりＡＴＧに、ＰｓｔＩ部位を用いる
ことによりシグナル配列の後に、又はＢｇＩＩＩ部位の
後に挿入することによりα因子リーダー配列の後に、断
片を含有するＯＲＦを挿入することができる。発現され
るＯＲＦは理想的にはそれらの３’末端にＳａＩＩ部位
を有してＳａＩＩ部位に先行されるターミネーターとの
融合を促す必要があるし、２つのＢａｍＨＩ部位でのこ
のプラスミドの切断はそれが酵母菌シャトルベクター中
に容易にクローン化され得るように全発現カセットを切
り取るので、それらの配列内にＢａｍＨＩ部位を有さな
い。本プラスミドは、ＧＡＰＤＨプロモーターを含有す
るＢａｍＨＩ〜ＥｃｏＲＩ断片がＥＭＢＬＧＥＮＢＡ
ＮＫ受入番号Ｋ０２２０４のヌクレオチド１０８０〜１
５０５に対応する断片（これは銅調整方式で発現させる
ＣＵＰ１プロモーターを含有する）に置換されることを
除いては、ｐＦＢＹ１３９と同じである。

【００３７】ＰＣＲ断片配列番号10及び配列番号11 配列番号10 5' TAGAGGATCCCCATTACCGACATTTGGGCGCTATACGTGC 3' 配列番号11 5' CGACGAATTCACAGTTTGTTTTTCTTAATATCTATTTCG 3' を用いてＣＵＰ１プロモーターを含む断片をゲノム酵母
菌ＤＮＡから生成し、その後ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ
で切断した。実施例５に記載されているようにα因子シ
グナル及びリーダー配列のほとんどを含む断片並びにα
因子ターミネーターを含む断片を生成し、増幅し、切断
して、その後ＣＵＰ１プロモーターを含む断片と一緒に
ＢａｍＨＩで切断したｐＴＺ１８Ｒ中でクローン化し、
細菌アルカリ性ホスファターゼで処理して、ｐＦＢＹ１
６６を生成した。

【００３８】実施例７：ｐＨＥ１６８の構築：調節ＣＵＰ１プロモーターの制御下でのヒルスタシンの
発現好ましい酵母菌コドンを使用したヒルスタシンをコード
する合成遺伝子をＰＣＲ反応で３つの合成オリゴヌクレ
オチドから組み立てた。さらに、遺伝子を５’末端で延
長してｐＦＢＹ１６６中のα因子リーダーとの枠内融合
を便利にした。自動ＤＮＡ合成機を用いて以下の３つの
オリゴヌクレオチドを合成した： 5'-AAAGATCTTG CTGGATAAAA GAACCCAAGG TAACACCTGT GGTGGTGAAA CCTGTTCTGC CGCCCAAGTT TGTTTGAAGG GTAAGTGTGT -3' （配列番号12） 5'- GTATTCACAA CCGTTTTCGT CCTTCTTCAA ACCGTACTTA CAACGAATAC GACAGTGAAC TTCGTTACAA ACACACTTAC CCTTCAAACA -3' （配列番号13） 5'- TTGTCGACTC ATTGAGAGGC CTTGGCACAA GAACATGGGT ATTCACAACC GTTTTCGT -3' （配列番号14）これら３つのオリゴヌクレオチドから、Perkin Elmer社
製のＰＣＲユニット及び以下の条件を用いて以下のポリ
メラーゼ鎖反応で198 bp断片を組み立てた：20mMのオリ
ゴヌクレオチド１及び３なら20 nM のオリゴヌクレオチ
ド２を、2.5 単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ及び0.
2 mMのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＧＴＰとと
もに 0.1mlの緩衝液（10mM Tris-HCl, pH 8.3, 50mM K
Cl,1.5mM MgCl2 ）中でインキュベートした。反応液
は、92℃で30秒、42℃で１分及び72℃で１分で、30サイ
クルインキュベートした。198 bp ＰＣＲ断片を２% ア
ガロースゲル上で単離し、ＢｇＩＩＩ及びＳａＩＩで制
限して、ｐＦＢＹ１６６（上記）で切断したＢｇＩＩＩ
及びＳａＩＩ中に結紮した。大腸菌 E. coli ＨＢ１０
１をその結果生じたプラスミドｐＨＥ１６８で形質転換
した。形質転換大腸菌 E. coli 株を大腸菌 E. coli
ｐＨＥ１６８で消化した。ＰＣＲ断片とα因子リーダー
との正確な融合及びヒルスタシンＯＲＦの正確な配列
は、シーケンシングにより確証した。酵母菌ＯＲＦ及び
α因子ターミネーターを含有する完全発現カセットを配
列番号３に示す。

【００３９】実施例８：ｐＨＥ１７０及び１７０Ｒの構
築ヒルスタシン発現カセットを有する２ミクロンベクター酵母菌中での発現のために、ｐＤＰ３４をベクターとし
て用いた。ｐＤＰ３４（欧州特許出願第340,170 号の図
３）は大腸菌 E. coli に関するアンピシリン耐性マー
カー、並びにＵＲＡ３及びｄＬＥＵ２酵母菌選択マーカ
ーを有する酵母菌- 大腸菌(E. coli) シャトルベクター
である。それは完全２ミクロン配列をＡ形態で含有し、
ＲＥＰ１、ＲＥＰ２及びＦＬＰ熟達性である。プラスミ
ドｐＤＰ３４をＢａｍＨＩで消化し、付着端をアルカリ
性ホスファターゼ処理により脱リン酸化した。ｐＨＥ１
６８をＢａｍＨＩで消化し、完全ヒルスタシン発現カセ
ットを含有する1146bp断片をＢａｍＨＩ切断ｐＤＰ３４
に結紮した。大腸菌 E. coli ＨＢ１０１をその結果生
じたプラスミドｐＨＥ１７０及び１７０Ｒで形質転換し
た。挿入物の配向は、ＳａＩＩを用いた消化により調べ
た。ｐＨＥ１７０はｄＬＥＵ２に関して時計回り方向の
配向でヒルスタシン発現カセットを含有し、ｐＨＥ１７
０ＲはｄＬＥＵ２マーカーに関して反時計回り方向の配
向でヒルスタシン発現カセットを含有した。

【００４０】実施例９：ｐＨＥ１６９の構築構成ＧＡＰＤＨプロモーターの制御下でのヒルスタシン
の発現ヒルスタシンをコードする198 bp ＰＣＲ断片（上記）
をＢｇＩＩＩ及びＳａＩＩで消化して、ＢｇＩＩＩ及び
ＳａＩＩ切断ベクターｐＦＢＹ１３９中に結紮した。大
腸菌 E. coli ＨＢ１０１をその結果生じたプラスミド
ｐＨＥ１６９で形質転換した。形質転換大腸菌 E. col
i 株を大腸菌 E. coli ｐＨＥ１６９で消化した。ＰＣ
Ｒ断片とα因子リーダーとの正確な融合及びヒルスタシ
ンＯＲＦの正確な配列は、シーケンシングにより確証し
た。発現カセットは配列番号３で示したものと同一であ
ったが、但しＣＵＰ１プロモーターの代わりにＧＡＰＤ
Ｈ400 bpプロモーター断片を用いた（配列番号２）。

【００４１】実施例10：ｐＨＥ１７１及び１７１Ｒの構
築ヒルスタシン発現カセットを有する２ミクロンベクター実施例９（上記）と同様に、ヒルスタシン発現カセット
を含有する1109bpＢａｍＨＩ断片をＢａｍＨＩ消化によ
りｐＨＥ１６９から切り出して、ＢａｍＨＩ切断ｐＤＰ
３４中に挿入した。大腸菌(E. coli) ＨＢ１０１をその
結果生じたプラスミドｐＨＥ１７１及び１７１Ｒで形質
転換した。挿入物の配向は、ＳａＩＩを用いた消化によ
り調べた。ｐＨＥ１７１はｄＬＥＵ２に関して時計回り
方向の配向でヒルスタシン発現カセットを含有し、ｐＨ
Ｅ１７１Ｒは反時計回り方向の配向で含有した。

【００４２】実施例11：ｐＨＥ１７２の構築インベルターゼシグナル配列（ＳＵＣ２）と融合するヒ
ルスタシンＯＲＦ代替分泌系に備えるために、ヒルＯＲＦを酵母菌インベ
ルターゼ遺伝子ＳＵＣ２のシグナル配列と融合させた。
以下の２つのオリゴヌクレオチドを合成した： 5'-AAGAATTCAT GCTTTTGCAA GCTTTCCTTT TCCTTTTGGC TGGTTTTGCA GCCAAAATAT CTGCAACCCA AGGTAACACC TGTG -3' （配列番号15） 5'- TTGTCGACTC ATTGAGAGGC -3' （配列番号16）実施例７に記載したようなポリメラーゼ鎖反応のため
に、ｐＨＥ１６８を鋳型ＤＮＡとして用いた。実施例７
に記載の実験条件下で、20ngの鋳型ｐＨＥ１６８を20mM
のオリゴヌクレオチド・プライマーとともにインキュベ
ートした。237 bp 増幅ＰＣＲ断片を２% アガロースゲ
ル上で単離し、ＥｃｏＲＩ及びＳａＩＩで制限して、Ｅ
ｃｏＲＩ及びＳａＩＩ切断ベクターｐＦＢＹ１６６中に
結紮した。大腸菌 E. coli ＨＢ１０１をその結果生じ
たプラスミドｐＨＥ１７２で形質転換した。ＳＵＣ２シ
グナル配列−ヒルスタシン融合の正確な配列は、シーケ
ンシングにより確証した。

【００４３】実施例12：ｐＨＥ１７３及び１７３Ｒの構
築ＳＵＣ２シグナル配列を有するヒルスタシン発現カセッ
トを有する２ミクロンベクター実施例８と同様に、ヒルスタシン発現カセットを含有す
る945 bp ＢａｍＨＩ断片をＢａｍＨＩ消化によりｐＨ
Ｅ１７２から切り出して、ＢａｍＨＩ切断ｐＤＰ３４中
に挿入した。大腸菌(E. coli) ＨＢ１０１をその結果生
じたプラスミドｐＨＥ１７３及び１７３Ｒで形質転換し
た。挿入物の配向は、ＳａＩＩを用いた消化により調べ
た。ｐＨＥ１７３はｄＬＥＵ２に関して時計回り方向の
配向でヒルスタシン発現カセットを含み、ｐＨＥ１７３
Ｒは、反時計回り方向の配向で有した。

【００４４】実施例13：ビール酵母菌サッカロミセス・
セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)株ＴＲ１４５６
の構築欧州特許出願第341,215 号に記載されているようにビー
ル酵母菌サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces c
erevisiae)株ＴＲ１４５６を構築した。サッカロミセス
・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)株Ｈ４４９を
用いて開始し、その後の２シリーズの実験において、２
つのカルボキシペプチダーゼｙｓｃα及びｙｓｃＹ
を、それぞれそれらのコード遺伝子ＫＥＸ１及びＰＲＣ
１の分裂によりＨ４４９株から除去した。まず、ｙｓｃ
αをコードする遺伝子ＫＥＸ１を分裂させた。このため
に、Ｈ４４９株をＫＥＸ１遺伝子をコードするＤＮＡ断
片で形質転換し、全ＵＲＡ３遺伝子とともにＫＥＸ１コ
ード領域に挿入した。ウラシル原栄養性形質転換体を選
択し、ｙｓｃα活性の非存在に関して調べた。次に、Ｋ
ＥＸ１遺伝子座に挿入したＵＲＡ３遺伝子を、分裂型遺
伝子ＵＲＡ３Ｄ５を含有するプラスミドで形質転換し
た（欧州特許出願第341,215 号参照）。ウラシル要求性
である形質転換体を選択し、その後の工程でカルボキシ
ペプチダーゼｙｓｃＹをコードする遺伝子をそれらの
内因性ＰＲＣ１中で分裂させた。実験は、全体的にＫＥ
Ｘ１の分裂に関して記載されたと同様の方法で実施し
た。最終的にその結果生じたＨ４４９株の同一遺伝子誘
導体をＴＲ１４５６と呼ぶが、これは以下の遺伝子型を
有する：ＴＲ１４５６＝ＭＡＴａ、ｌｅｕ２−３，１１２，ｕｒ
ａ３，ｐｒｂ１，ｋｅｘ１：：ｕｒａ３，ｐｒｃ１：：
ｕｒａ３，［ｃｉｒ0 ］

【００４５】実施例14：プラスミドｐＨＥ１７０，１７
０Ｒ，１７１，１７１Ｒ，１７３，１７３ＲによるＴＲ
１４５６株の形質転換 Hinnen等（Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1978),75,192
9）が記載した形質転換プロトコルを用いて、プラスミ
ドｐＨＥ１７０，１７０Ｒ，１７１，１７１Ｒ，１７
３，１７３Ｒを宿主ＴＲ１４５６株中に導入した。さら
に詳細な操作は、欧州特許出願第341,215 号に説明され
ている。形質転換酵母菌細胞を、ロイシンを補充し、ウ
ラシルを欠いた酵母菌最小培地上で選択した。単一形質
転換酵母菌クローンを単離し、以下のように名付けた：サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e)ＴＲ１４５６/ ｐＨＥ１７０サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e)ＴＲ１４５６/ ｐＨＥ１７０Ｒサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e)ＴＲ１４５６/ ｐＨＥ１７１サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e)ＴＲ１４５６/ ｐＨＥ１７１Ｒサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e)ＴＲ１４５６/ ｐＨＥ１７３サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e)ＴＲ１４５６/ ｐＨＥ１７３Ｒ

【００４６】実施例15：プラスミドｐＨＥ１７０，１７
１，１７３で形質転換させたＴＲ１４５６によるヒルス
タシン分泌ビール酵母菌サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyc
es cerevisiae)ＴＲ１４５６/ ｐＨＥ１７０，１７０
Ｒ，１７１，１７１Ｒ，１７３，１７３Ｒの細胞を、以
下の成分で構成される20ml合成培地中での２連続予備培
養で各々増殖させた： 6.7 g/l Difco 酵母菌ナイトロジェン・ベース
（アミノ酸無含有） 10 g/l L - アスパラギン 1 g/l L - ヒスチジン 20 g/l グルコース 0.02 g/l L - ロイシン培地のpHを5.8 に調整した。一次予備培養を28℃で180
r.p.m.で60時間増殖させた。二次予備培養に、２% （容
量/ 容量）の一次予備培養を接種して、28℃で180 r.p.
m.で24時間インキュベートした。主培養の培地は以下の成分で構成された： 5 g/l ペプトン 10 g/l 酵母エキス 20 g/l グルコース 40 g/l ショ糖 3 g/l 硫酸アンモニウム 2 g/l リン酸二水素カリウム 0.5 g/l 硫酸マグネシウム七水和物 0.1 g/l 塩化ナトリウム 0.1 g/l 塩化カルシウム 10^-5 g/l ビオチン主培養（100 ml培地）に約10⁶細胞/ mlを接種し、28℃
で180 r.p.m.で72時間インキュベートした。接種直後
に、１mMの濃度で滅菌硫酸銅をビール酵母菌サッカロミ
セス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)培養Ｔ
Ｒ１４５６/ ｐＨＥ１７０，１７０Ｒ及びＴＲ１４５
６/ ｐＨＥ１７３，１７３Ｒに加えた。ＴＲ１４５６/
ｐＨＥ１７１，１７１Ｒは銅を含まずに増殖させた。発
酵終了時に、培養のアリコートを採集して、細胞を遠心
分離により除去し、培養上清をヒルスタシン活性に関し
て実施例３に記載の酵素検定で分析した。

【００４７】

【配列表】

（１）一般情報：（ｉ）出願人：（Ａ）名称：チバ−ガイギ− ＡＧ (CIBA-GEIGY AG) （Ｂ）番地：クリベック街１４１ Klybeckstr. 141 （Ｃ）市名：バーゼル Basel （Ｅ）国名：スイス（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：４００２（Ｇ）電話番号：＋４１６１６９１１１１（Ｈ）テレファックス：＋４１６１６９６７９
７６（Ｉ）テレックス：９６２９９１（Ａ）名称：ＵＣＰＧＥＮ−ＰｈａｒｍａＡＧ（Ｂ）番地：クラフト街６ (Kraftstrasse 6) （Ｃ）市名：チューリッヒ（Ｅ）国名：スイス（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：８０４４（ｉｉ）発明の名称：新規阻害剤（ｉｉｉ）配列数：１６（ｉｖ）コンピューター読み取り書式：（Ａ）媒体：フロッピー・ディスク（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣ互換性（Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ/ ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：Patent In Release #1.0,Version
#1.25(EPO) （ｖｉ）従来の出願データ：（Ａ）出願番号：欧州特許第94810006.0号（Ｂ）提出日：１９９４年０１月０７日

【００４８】配列番号：１配列の長さ：５５アミノ酸配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列の特徴特徴を表す記号：ｐｒｏｔｅｉｎ存在位置：１．．５５他の情報：/ 標識＝ヒルスタシン配列： Thr Gln Gly Asn Thr Cys Gly Gly Glu Thr Cys Ser Ala Ala Gln 1 5 10 15 Val Cys Leu Lys Gly Lys Cys Val Cys Asn Glu Val His Cys Arg 20 25 30 Ile Arg Cys Lys Tyr Gly Leu Lys Lys Asp Glu Asn Gly Cys Glu 35 40 45 Tyr Pro Cys Ser Cys Ala Lys Ala Ser Gln 50 55

【００４９】配列番号：２配列の長さ：１１１４塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）配列の特徴特徴を表す記号：ｍｉｓｃｆｅａｔｕｒｅ存在位置：１１１０．．１１１４他の情報：/ 機能＝”ＢａｍＨＩ部位” 配列の特徴特徴を表す記号：ｍｉｓｃｆｅａｔｕｒｅ存在位置：６３９．．６４７他の情報：/ 機能＝”ＢｇｌＩＩ部位” 配列の特徴特徴を表す記号：ｐｒｏｍｏｔｅｒ存在位置：１．．４０３他の情報：/ 機能＝”ＧＡＰＤＨプロモーター” 配列の特徴特徴を表す記号：ｓｉｇｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：４０４．．６５８他の情報：/ 機能＝”アルファ因子一本鎖ペプチド” 配列の特徴特徴を表す記号：ｍａｔｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：６５９．．８２３他の情報：/ 生成物＝”ヒルスタシン” 配列の特徴特徴を表す記号：ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ存在位置：８２６．．１１０９他の情報：/ 標準名＝”アルファ因子ターミネーター” 配列 GATCCCCAGC TTAGTTCATA GGTCCATTCT CTTAGCGCAA CTACAGAGAA 50 CAGGGGCACA AACAGGCAAA AAACGGGCAC AACCTCAATG GAGTGATGCA 100 ACCTGCCTGG AGTAAATGAT GACACAAGGC AATTGACCCA CGCATGTATC 150 TATCTCATTT TCTTACACCT TCTATTACCT TCTGCTCTCT CTGATTTGGA 200 AAAAGCTGAA AAAAAAGGTT GAAACCAGTT CCCTGAAATT ATTCCCCTAC 250 TTGACTAATA AGTATATAAA GACGGTAGGT ATTGATTGTA ATTCTGTAAA 300 TCTATTTCTT AAACTTCTTA AATTCTACTT TTATAGTTAG TCTTTTTTTT 350 AGTTTTAAAA CACCAAGAAC TTAGTTTCGA ATAAACACAC ATAAGAATTC 400 AAAATGAGAT TTCCTTCAAT TTTTACTGCA GTTTTATTCG CAGCATCCTC 450 CGCATTAGCT GCTCCAGTCA ACACTACAAC AGAAGATGAA ACGGCACAAA 500 TTCCGGCTGA AGCTGTCATC GGTTACTTAG ATTTAGAAGG GGATTTCGAT 550 GTTGCTGTTT TGCCATTTTC CAACAGCACA AATAACGGGT TATTGTTTAT 600 AAATACTACT ATTGCCAGCA TTGCTGCTAA AGAAGAAGAG ATCTTGCTGG 650 ATAAAAGAAC CCAAGGTAAC ACCTGTGGTG GTGAAACCTG TTCTGCCGCC 700 CAAGTTTGTT TGAAGGGTAA GTGTGTTTGT AACGAAGTTC ACTGTCGTAT 750 TCGTTGTAAG TACGGTTTGA AGAAGGACGA AAACGGTTGT GAATACCCAT 800 GTTCTTGTGC CAAGGCCTCT CAATGAGTCG ACTTTGTTCC CACTGTACTT 850 TTAGCTCGTA CAAAATACAA TATACTTTTC ATTTCTCCGT AAACAACATG 900 TTTTCCCATG TAATATCCTT TTCTATTTTT CGTTCCGTTA CCAACTTTAC 950 ACATACTTTA TATAGCTATT CACTTCTATA CACTAAAAAA CTAAGACAAT 1000 TTTAATTTTG CTGCCTGCCA TATTTCAATT TGTTATAAAT TCCTATAATT 1050 TATCCTATTA GTAGCTAAAA AAAGATGAAT GTGAATCGAA TCCTAAGAGA 1100 ATTAATTCGG ATCC 1114

【００５０】配列番号：３配列の長さ：１１５４塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）配列の特徴特徴を表す記号：ｍｉｓｃｆｅａｔｕｒｅ存在位置：４３５．．４３９他の情報：/ 機能＝”ＥｃｏＲＩ部位” 配列の特徴特徴を表す記号：ｍｉｓｃｆｅａｔｕｒｅ存在位置：６７９．．６８７他の情報：/ 機能＝”ＢｇｌＩＩ部位” 配列の特徴特徴を表す記号：ｐｒｏｍｏｔｅｒ存在位置：１．．４４３他の情報：/ 機能＝”ＣＵＰ１プロモーター” 配列の特徴特徴を表す記号：ｓｉｇｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：４４４．．６９８他の情報：/ 機能＝”アルファ因子一本鎖配列” 配列の特徴特徴を表す記号：ｍａｔｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：６９９．．８６３他の情報：/ 生成物＝”ヒルスタシン” 配列の特徴特徴を表す記号：ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ存在位置：８６７．．１１４９他の情報：/ 標準名＝”アルファ因子ターミネーター” 配列の特徴特徴を表す記号：ｍｉｓｃｆｅａｔｕｒｅ存在位置：１１５０．．１１５４他の情報：/ 機能＝”ＢａｍＨＩ部位” 配列 GATCCCCATT ACCGACATTT GGGCGCTATA CGTGCATATG TTCATGTATG 50 TATCTGTATT TAAAACACTT TTGTATTATT TTTCCTCATA TATGTGTATA 100 GGTTTATACG GATGATTTAA TTATTACTTC ACCACCCTTT ATTTCAGGCT 150 GATATCTTAG CCTTGTTACT AGTTAGAAAA AGACATTTTT GCTGTCAGTC 200 ACTGTCAAGA GATTCTTTTG CTGGCATTTC TTCTAGAAGC AAAAAGAGCG 250 ATGCGTCTTT TCCGCTGAAC CGTTCCAGCA AAAAAGACTA CCAACGCAAT 300 ATGGATTGTC AGAATCATAT AAAAGAGAAG CAAATAACTC CTTGTCTTGT 350 ATCAATTGCA TTATAATATC TTCTTGTTAG TGCAATATCA TATAGAAGTC 400 ATCGAAATAG ATATTAAGAA AAACAAACTG TAACGAATTC AAAATGAGAT 450 TTCCTTCAAT TTTTACTGCA GTTTTATTCG CAGCATCCTC CGCATTAGCT 500 GCTCCAGTCA ACACTACAAC AGAAGATGAA ACGGCACAAA TTCCGGCTGA 550 AGCTGTCATC GGTTACTTAG ATTTAGAAGG GGATTTCGAT GTTGCTGTTT 600 TGCCATTTTC CAACAGCACA AATAACGGGT TATTGTTTAT AAATACTACT 650 ATTGCCAGCA TTGCTGCTAA AGAAGAAGAG ATCTTGCTGG ATAAAAGAAC 700 CCAAGGTAAC ACCTGTGGTG GTGAAACCTG TTCTGCCGCC CAAGTTTGTT 750 TGAAGGGTAA GTGTGTTTGT AACGAAGTTC ACTGTCGTAT TCGTTGTAAG 800 TACGGTTTGA AGAAGGACGA AAACGGTTGT GAATACCCAT GTTCTTGTGC 850 CAAGGCCTCT CAATGAGTCG ACTTTGTTCC CACTGTACTT TTAGCTCGTA 900 CAAAATACAA TATACTTTTC ATTTCTCCGT AAACAACATG TTTTCCCATG 950 TAATATCCTT TTCTATTTTT CGTTCCGTTA CCAACTTTAC ACATACTTTA 1000 TATAGCTATT CACTTCTATA CACTAAAAAA CTAAGACAAT TTTAATTTTG 1050 CTGCCTGCCA TATTTCAATT TGTTATAAAT TCCTATAATT TATCCTATTA 1100 GTAGCTAAAA AAAGATGAAT GTGAATCGAA TCCTAAGAGA ATTAATTCGG 1150 ATCC 1154

【００５１】配列番号：４配列の長さ：４２塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）配列の特徴特徴を表す記号：ｍｉｓｃｆｅａｔｕｒｅ存在位置：１．．４２他の情報：/ 機能＝”ＰＣＲのための合成オリゴ” 配列の特徴特徴を表す記号：ｍｉｓｃｆｅａｔｕｒｅ存在位置：５．．１６他の情報：/ 機能＝”ＢａｍＨＩ部位を含有する合成配
列” 配列 GCATGGATCC CAGCTTAGTT CATAGGTCCA TTCTCTTAGC GC 42

【００５２】配列番号：５配列の長さ：３８塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）配列の特徴特徴を表す記号：ｍｉｓｃｆｅａｔｕｒｅ存在位置：１．．３８他の情報：/ 機能＝”ＰＣＲのための合成オリゴ” 配列 CTCGGAATTC TTATGTGTGT TTATTCGAAA CTAAGTTC 38

【００５３】配列番号：６配列の長さ：４１塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）配列の特徴特徴を表す記号：ｍｉｓｃｆｅａｔｕｒｅ存在位置：１．．４１他の情報：/ 機能＝”ＰＣＲのための合成オリゴ” 配列 GTGCGAATTC AAAATGAGAT TTCCTTCAAT TTTTACTGCA G 41

【００５４】配列番号：７配列の長さ：４８塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）配列の特徴特徴を表す記号：ｍｉｓｃｆｅａｔｕｒｅ存在位置：１．．４８他の情報：/ 機能＝”ＰＣＲのための合成オリゴ” 配列 CAAAGTCGAC TTTATCCAGC AAGATCTCTT CTTCTTTAGC AGCAATGC 48

【００５５】配列番号：８配列の長さ：５０塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）配列の特徴特徴を表す記号：ｍｉｓｃｆｅａｔｕｒｅ存在位置：１．．５０他の情報：/ 機能＝”ＰＣＲのための合成オリゴ” 配列 GAAGAGATCT TGCTGGATAA AGTCGACTTT GTTCCCACTG TACTTTTAGC 50

【００５６】配列番号：９配列の長さ：３２塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）配列の特徴特徴を表す記号：ｍｉｓｃｆｅａｔｕｒｅ存在位置：１．．３２他の情報：/ 機能＝”ＰＣＲのための合成オリゴ” 配列 CCGGGGATCC GAATTAATTC TCTTAGGATT CG 32

【００５７】配列番号：１０配列の長さ：４０塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）配列の特徴特徴を表す記号：ｍｉｓｃｆｅａｔｕｒｅ存在位置：１．．４０他の情報：/ 機能＝”ＰＣＲのための合成オリゴ” 配列 TAGAGGATCC CCATTACCGA CATTTGGGCG CTATACGTGC 40

【００５８】配列番号：１１配列の長さ：３９塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）配列の特徴特徴を表す記号：ｍｉｓｃｆｅａｔｕｒｅ存在位置：１．．３９他の情報：/ 機能＝”ＰＣＲのための合成オリゴ” 配列 CGACGAATTC ACAGTTTGTT TTTCTTAATA TCTATTTCG 39

【００５９】配列番号：１２配列の長さ：９０塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）配列の特徴特徴を表す記号：ｍｉｓｃｆｅａｔｕｒｅ存在位置：１．．９０他の情報：/ 機能＝”ＰＣＲのための合成オリゴ” 配列 AAAGATCTTG CTGGATAAAA GAACCCAAGG TAACACCTGT GGTGGTGAAA 50 CCTGTTCTGC CGCCCAAGTT TGTTTGAAGG GTAAGTGTGT 90

【００６０】配列番号：１３配列の長さ：９０塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）配列の特徴特徴を表す記号：ｍｉｓｃｆｅａｔｕｒｅ存在位置：１．．９０他の情報：/ 機能＝”ＰＣＲのための合成オリゴ” 配列 GTATTCACAA CCGTTTTCGT CCTTCTTCAA ACCGTACTTA CAACGAATAC 50 GACAGTGAAC TTCGTTACAA ACACACTTAC CCTTCAAACA 90

【００６１】配列番号：１４配列の長さ：５８塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）配列の特徴特徴を表す記号：ｍｉｓｃｆｅａｔｕｒｅ存在位置：１．．５８他の情報：/ 機能＝”ＰＣＲのための合成オリゴ” 配列 TTGTCGACTC ATTGAGAGGC CTTGGCACAA GAACATGGGT ATTCACAACC 50 GTTTTCGT 58

【００６２】配列番号：１５配列の長さ：８４塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）配列の特徴特徴を表す記号：ｍｉｓｃｆｅａｔｕｒｅ存在位置：１．．８４他の情報：/ 機能＝”ＰＣＲのための合成オリゴ” 配列 AAGAATTCAT GCTTTTGCAA GCTTTCCTTT TCCTTTTGGC TGGTTTTGCA 50 GCCAAAATAT CTGCAACCCA AGGTAACACC TGTG 84

【００６３】配列番号：１６配列の長さ：２０塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）配列の特徴特徴を表す記号：ｍｉｓｃｆｅａｔｕｒｅ存在位置：１．．２０他の情報：/ 機能＝”ＰＣＲのための合成オリゴ” 配列 TTGTCGACTC ATTGAGAGGC 20

【図面の簡単な説明】

【図１】アンチスタシン型阻害剤のアミノ酸配列。ヒル
スタシンの配列、アンチスタシンの両ドメインの配列
（Nutt et al., Biol.Chem.(1988),263, 10162-10167)
、及びヒドラ- アンチスタシンの６反復の最初の配列
（Holstein et al,.FEBS Lett.,(1992),309,288-292 ）
を並べる。同一アミノ酸残基を矩形で囲み、システイン
はくまどりで示す。矢印はアンチスタシン（ドメイン
１）及びヒルスタシンの切れ易いペプチド結合を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 38/55 ＡＥＤＣ０７Ｈ 21/04 ＢＣ０７Ｋ 1/16 8318−4ＨＣ１２Ｎ 1/19 8828−4Ｂ 1/21 8828−4Ｂ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＥＤ 9281−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者ハンスフリッツドイツ連邦共和国，82057 イーキンク, アムブヘット 33 (72)発明者クリスティアンゾンマーホフドイツ連邦共和国，81927 ミュンヘン, デニンガーシュトラーセ 146 (72)発明者ユッタヘイムスイス国，4433 ラムリンスブルク，ツェルグリリンク 17

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１に示されるアミノ酸配列を有
するポリペプチドあるいはその突然変異体、機能性断片
又は誘導体。
【請求項２】セリン・プロテイナーゼと結合するか又
はそれを阻害する請求項１に記載の機能性断片。
【請求項３】Ｃ−末端Ｇｌｎを欠く請求項１に記載の
ポリペプチド。
【請求項４】検出可能なマーカーを有する請求項１に
記載のポリペプチド。
【請求項５】ａ）ヒルの抽出物を生成し；そしてｂ）透析及びカラム・クロマトグラフィーにより抽出物
を精製する、ことから成る請求項１に記載のポリペプチドの製造方
法。
【請求項６】請求項１に記載のポリペプチドをコード
する組換え体ＤＮＡ又は上記ＤＮＡの断片。
【請求項７】請求項１に記載のポリペプチドをコード
するＤＮＡ配列及び転写終結シグナルを含有するＤＮＡ
配列と作用可能な状態で結合するプロモーターを含むポ
リペプチド発現カセット。
【請求項８】適正な読み枠内で請求項１に記載のポリ
ペプチドをコードする二次ＤＮＡ配列と結合するシグナ
ル・ペプチドをコードする一次ＤＮＡ配列及び転写終結
シグナルを含有するＤＮＡ配列と作用可能な状態で結合
するプロモーターを含む請求項７に記載のポリペプチド
発現カセット。
【請求項９】ＧＡＰＤＨ又は酵母菌ＣＵＰ１プロモー
ターを含む請求項７に記載のポリペプチド発現カセッ
ト。
【請求項１０】酵母菌ＰＨ０５遺伝子シグナル配列、
α因子シグナル配列又は酵母菌インベルターゼ遺伝子
（ＳＵＣ２）シグナル配列を含む請求項７に記載のポリ
ペプチド発現カセット。
【請求項１１】酵母菌ＰＨ０５又はα因子転写終結シ
グナル配列を含む請求項７に記載のポリペプチド発現カ
セット。
【請求項１２】ＣＵＰ１又はＧＡＰＤＨプロモータ
ー、α因子又は酵母菌インベルターゼ・リーダー配列、
ヒルスタシン遺伝子及びα因子ターミネーターを含む請
求項７に記載のポリペプチド発現カセット。
【請求項１３】配列番号２又は配列番号３に示すよう
な断片を含む請求項７に記載のポリペプチド発現カセッ
ト。
【請求項１４】請求項７に記載のポリペプチド発現カ
セットを含む組換え体プラスミド。
【請求項１５】完全２ミクロンＤＮＡを含む請求項１
４に記載の組換え体酵母菌プラスミド。
【請求項１６】１〜３個の追加のポリペプチド発現カ
セットを含む請求項１４に記載の組換え体酵母菌プラス
ミド。
【請求項１７】請求項１４に記載の組換え体プラスミ
ドを含有する宿主。
【請求項１８】微生物学的宿主であることを特徴とす
る請求項１７に記載の宿主。
【請求項１９】細菌及び真菌から成る群から選択され
る請求項に１７記載の宿主。
【請求項２０】酵母菌である請求項１７記載の宿主。
【請求項２１】サッカロミセス・セレビシエ(Sacchar
omyces serevisiae)である請求項１７に記載の宿主。
【請求項２２】単一又は多数プロテアーゼ欠損体であ
る請求項１７に記載の宿主。
【請求項２３】ｙｓｃα、ｙｓｃＢ、ｙｓｃＡ、ｙｓ
ｃＹ及びｙｓｃＳから成る群から選択される１つ又はそ
れ以上のプロテアーゼを欠く請求項２２に記載の宿主。
【請求項２４】請求項１７記載の宿主を培養し、それ
により産生されるポリペプチドを単離することから成る
請求項１に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項２５】請求項１に記載のポリペプチドが培地
中に分泌され、そこから単離されることを特徴とする請
求項２４に記載の方法。
【請求項２６】請求項１に記載の化合物及び製剤組成
物の調製のための慣用の担体の使用。
【請求項２７】請求項１に記載のポリペプチドを含む
又は慣用の補助剤、一般に担体及び希釈剤と一緒に上記
ポリペプチドを含む製剤組成物。
【請求項２８】ヒト又は動物の体の治療又は予防的処
置の方法に用いるための請求項１に記載のポリペプチ
ド。
【請求項２９】セリン・プロテイナーゼの作用に関連
したヒト又は動物の体の治療又は予防的処置の方法に用
いるための請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３０】血液凝固を阻止するためのそして抗転
移剤としての請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３１】高血圧症を管理するための請求項１に
記載のポリペプチド。
【請求項３２】血栓症、塞栓症及び高血圧症の治療及
び予防の方法に用いるための治療的有効量の少なくとも
１つの請求項１に記載のポリペプチド又はその製薬上許
容可能な塩を含む製剤組成物。
【請求項３３】抗転移剤として治療及び予防の方法に
用いるための治療的有効量の少なくとも１つの請求項１
に記載のポリペプチド又はその製薬上許容可能な塩を含
む製剤組成物。