JP2810743B2 - アプロチニン同族体およびその製造方法 - Google Patents
アプロチニン同族体およびその製造方法Info
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- JP2810743B2 JP2810743B2 JP1505101A JP50510189A JP2810743B2 JP 2810743 B2 JP2810743 B2 JP 2810743B2 JP 1505101 A JP1505101 A JP 1505101A JP 50510189 A JP50510189 A JP 50510189A JP 2810743 B2 JP2810743 B2 JP 2810743B2
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8114—Kunitz type inhibitors
- C07K14/8117—Bovine/basic pancreatic trypsin inhibitor (BPTI, aprotinin)
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は新規なアプロチニン同族体およびその製法に
関する。
関する。
発明の背景 本明細書中、語句天然のアミノ酸（もしくはアミノ酸
残基）は、個々のアミノ酸残基を示すために用いられる
記号と共に以下に掲げられるα−アミノ酸の一種を言う
ものとする： Asp アスパラギン酸 Ile イソロイシン Thr トレオニン Leu ロイシン Ser セリン Tyr チロシン Glu グルタミン酸 Phe フェニルアラニン Pro プロリン His ヒスチジン Gly グリシン Lys リシン Ala アラニン Arg アルギニン Cys システイン Trp トリプトファン Val バリン Gln グルタミン Met メチオニン Asn アスパラギン アプロチニン（ウシの膵臓トリプシン阻害剤、BPTI）
は、幾つかのウシの器官および組織例えば、リンパ節、
膵臓、肺、耳下腺、脾および肝内に存するポリペプチド
である。
残基）は、個々のアミノ酸残基を示すために用いられる
記号と共に以下に掲げられるα−アミノ酸の一種を言う
ものとする： Asp アスパラギン酸 Ile イソロイシン Thr トレオニン Leu ロイシン Ser セリン Tyr チロシン Glu グルタミン酸 Phe フェニルアラニン Pro プロリン His ヒスチジン Gly グリシン Lys リシン Ala アラニン Arg アルギニン Cys システイン Trp トリプトファン Val バリン Gln グルタミン Met メチオニン Asn アスパラギン アプロチニン（ウシの膵臓トリプシン阻害剤、BPTI）
は、幾つかのウシの器官および組織例えば、リンパ節、
膵臓、肺、耳下腺、脾および肝内に存するポリペプチド
である。
これは、次の配列： において３個のジスルフィド橋によって架橋された58個
のアミノ酸残基から成る単鎖ポリペプチドである。
のアミノ酸残基から成る単鎖ポリペプチドである。
３個のジスルフィド橋は、Cys（５）−Cys（55）間、
Cys（14）−Cys（38）間およびCys（30）−Cys（51）間
のそれぞれに位置する。
Cys（14）−Cys（38）間およびCys（30）−Cys（51）間
のそれぞれに位置する。
アプロチニンは、種々のセリンプロテアーゼ、例えば
トリプシン、キモトリプシン、プラスミンおよびカリク
レインを阻害し、更に急性膵炎ショック症状の種々の状
態、過線維素溶解性出血および心筋梗塞症の治療用に用
いられる。アプロチニンを高用量で投与すると、心臓の
手術に関連して出血の損失を著るしく減少させる。
トリプシン、キモトリプシン、プラスミンおよびカリク
レインを阻害し、更に急性膵炎ショック症状の種々の状
態、過線維素溶解性出血および心筋梗塞症の治療用に用
いられる。アプロチニンを高用量で投与すると、心臓の
手術に関連して出血の損失を著るしく減少させる。
アプロチニンは、種々のウシの器官又は組織、例えば
肺、膵臓および耳下腺から抽出される。動物組織からの
抽出は、やっかいなプロセスでありかつ多量のウシの器
官もしくは組織を必要とする。アプロチニンは又、アプ
ロチニンをコードする遺伝子を適当な微生物（これは適
当な栄養培地中で培養すると目的生産物を与える）に挿
入する組換えDNA技術によっても得ることができる。
肺、膵臓および耳下腺から抽出される。動物組織からの
抽出は、やっかいなプロセスでありかつ多量のウシの器
官もしくは組織を必要とする。アプロチニンは又、アプ
ロチニンをコードする遺伝子を適当な微生物（これは適
当な栄養培地中で培養すると目的生産物を与える）に挿
入する組換えDNA技術によっても得ることができる。
E.コリー（coli）内でのアプロチニン同族体の生産
は、ヨーロッパ公開特許出願第238,993号に記載されて
おり、さらにアプロチニンの酵母内での生産は、デンマ
ーク特許出願第4501/87に記載されている。
は、ヨーロッパ公開特許出願第238,993号に記載されて
おり、さらにアプロチニンの酵母内での生産は、デンマ
ーク特許出願第4501/87に記載されている。
ある種のアプロチニン同族体および誘導体は、例えば
ジェリングH.およびH.ティシェンチェH.によるEur.J.Bi
ochem.61（1976）,453〜456頁に記載されており、これ
はLys（15）をArg Phe又はTrpで置換することを記載し
ており、あるいは又、アプロチニン同族体を記載する米
国特許4,595,674に記載されており、該同族体におい
て、アプロチニンの活性中心の15位のリシン残基はGly,
Ala,Val,Leu,Ile,Met,Arg,L−α−アミノ酪酸、Ｌ−ノ
ルバリン、Ｌ−ノルロイシン、デヒドロアラニンもしく
はＬ−ホモセリンによって置換されている。また、上記
ヨーロッパ特許238,993は、Arg,Val,Ile,Leu,Phe,Gly,S
er,Trp,TyrもしくはAlaによって置換されたLys（15）お
よび／又はGlu,Leu,Val,ThrもしくはSerによって置換さ
れたMet（52）を有するアプロチニン同族体を記載す
る。
ジェリングH.およびH.ティシェンチェH.によるEur.J.Bi
ochem.61（1976）,453〜456頁に記載されており、これ
はLys（15）をArg Phe又はTrpで置換することを記載し
ており、あるいは又、アプロチニン同族体を記載する米
国特許4,595,674に記載されており、該同族体におい
て、アプロチニンの活性中心の15位のリシン残基はGly,
Ala,Val,Leu,Ile,Met,Arg,L−α−アミノ酪酸、Ｌ−ノ
ルバリン、Ｌ−ノルロイシン、デヒドロアラニンもしく
はＬ−ホモセリンによって置換されている。また、上記
ヨーロッパ特許238,993は、Arg,Val,Ile,Leu,Phe,Gly,S
er,Trp,TyrもしくはAlaによって置換されたLys（15）お
よび／又はGlu,Leu,Val,ThrもしくはSerによって置換さ
れたMet（52）を有するアプロチニン同族体を記載す
る。
公知のアプロチニン同族体が、異なるプロテアーゼに
対して変性された効果および有効性を有するため権利請
求されている。例えば、アプロチニン（15Val）は、顆
粒球エラスターゼに対する高選択性並びにコラゲナーゼ
に対する抑制効果を有し、アプロチニン（15Ala）はエ
ラスターゼに対し極めて弱い抑制効果を有しさらにアプ
ロチニン（15Gly）は顕著なアンチトリプシン活性を有
し、更に驚くべきことにカリクレインを阻害する。
対して変性された効果および有効性を有するため権利請
求されている。例えば、アプロチニン（15Val）は、顆
粒球エラスターゼに対する高選択性並びにコラゲナーゼ
に対する抑制効果を有し、アプロチニン（15Ala）はエ
ラスターゼに対し極めて弱い抑制効果を有しさらにアプ
ロチニン（15Gly）は顕著なアンチトリプシン活性を有
し、更に驚くべきことにカリクレインを阻害する。
発明の要約 本発明の目的は、ある種のセリンプロテアーゼ、例え
ばエステラーゼ、カリクレイン、ｔ−PA、ウロキナーゼ
および凝固因子、例えばトロンビンに対しより特異的抑
制効果を有する新規アプロチニン同族体を提供すること
にある。
ばエステラーゼ、カリクレイン、ｔ−PA、ウロキナーゼ
および凝固因子、例えばトロンビンに対しより特異的抑
制効果を有する新規アプロチニン同族体を提供すること
にある。
本発明は以下の知見に基づく。すなわち、アプロチニ
ン（３−58;42Ser）の17位のArgをAlaで置換するか、又
は17位のArgをAlaで置換し更にアプロチニン（３−58;4
2Ser）の19位をIleをGluで置換するとヒト血漿カリクレ
インの抑制を実質的に増加させる。このことは、アプロ
チニン（３−58;42Ser）内の15位のLysをArgで更に17位
のArgをAlaで置換するとより明白である。
ン（３−58;42Ser）の17位のArgをAlaで置換するか、又
は17位のArgをAlaで置換し更にアプロチニン（３−58;4
2Ser）の19位をIleをGluで置換するとヒト血漿カリクレ
インの抑制を実質的に増加させる。このことは、アプロ
チニン（３−58;42Ser）内の15位のLysをArgで更に17位
のArgをAlaで置換するとより明白である。
従って、本発明は16〜19位のアミノ酸残基の内の少な
くとも１個が別の天然に認められるアミノ残基により置
換されているアプロチニン同族体に関する。
くとも１個が別の天然に認められるアミノ残基により置
換されているアプロチニン同族体に関する。
上記のデンマーク特許出願第4501/87においてはある
種のアミノ酸残基の置換および／又は欠失したアプロチ
ニン同族体が開示されている。これらのアミノ酸残基の
置換および／又は欠失の目的は、酵母内でのアプロチニ
ン同族体の生産中において幾つかの塩基性アミノ酸残基
での蛋白質分解を避けることにある。特に、アミノ酸残
基の１位および２位は欠失し得さらに二塩基性配列41−
42位で塩基性アミノ酸残基の一方は、別のアミノ酸残基
により置換され得る。このようなアプロチニン同族体は
酵母内に産生されかつ天然アプロチニンと同じ特性を示
すことが明らかにされている。
種のアミノ酸残基の置換および／又は欠失したアプロチ
ニン同族体が開示されている。これらのアミノ酸残基の
置換および／又は欠失の目的は、酵母内でのアプロチニ
ン同族体の生産中において幾つかの塩基性アミノ酸残基
での蛋白質分解を避けることにある。特に、アミノ酸残
基の１位および２位は欠失し得さらに二塩基性配列41−
42位で塩基性アミノ酸残基の一方は、別のアミノ酸残基
により置換され得る。このようなアプロチニン同族体は
酵母内に産生されかつ天然アプロチニンと同じ特性を示
すことが明らかにされている。
酵母内での高生産を確保するため、本発明のアプロチ
ニン同族体は、同様の方法で更に修飾できる。従って、
16位のアミノ酸から19位のアミノ酸までの配列において
修飾された本発明のアプロチニン同族体は、またそれぞ
れ配列１〜２位および41〜42位で修飾されることができ
る：但し、そのような更なる修飾が本発明の目的に対し
不都合な効果を与えないことを条件とする。
ニン同族体は、同様の方法で更に修飾できる。従って、
16位のアミノ酸から19位のアミノ酸までの配列において
修飾された本発明のアプロチニン同族体は、またそれぞ
れ配列１〜２位および41〜42位で修飾されることができ
る：但し、そのような更なる修飾が本発明の目的に対し
不都合な効果を与えないことを条件とする。
本発明のアプロチニン同族体は、天然のアミノ酸残基
による公知の置換を含めて別の天然アミノ酸残基を15位
で挿入することによりこの位置で更に修飾され得る。
による公知の置換を含めて別の天然アミノ酸残基を15位
で挿入することによりこの位置で更に修飾され得る。
天然のアプロチニンは、Cys（14）とCys（18）間にジ
スルフィド橋を有し、これはLys（15）での活性部位付
近において三次元的構造を強くもたらしている。このジ
スルフィド結合は、還元剤によって開裂しうる。分子内
でのこの位置で、ジスルフィド橋の形成を避けるための
より好都合な方法は、システイン残基を他の残基で置換
するか又は単にこれらの残基を欠失することであろう。
従って本発明のアプロチニン同族体は更に修飾でき、そ
の結果該同族体は、Cys（14）とCys（38）間にジスルフ
ィド結合を有しない。このことは更に分子に興味ある特
性を付与する。
スルフィド橋を有し、これはLys（15）での活性部位付
近において三次元的構造を強くもたらしている。このジ
スルフィド結合は、還元剤によって開裂しうる。分子内
でのこの位置で、ジスルフィド橋の形成を避けるための
より好都合な方法は、システイン残基を他の残基で置換
するか又は単にこれらの残基を欠失することであろう。
従って本発明のアプロチニン同族体は更に修飾でき、そ
の結果該同族体は、Cys（14）とCys（38）間にジスルフ
ィド結合を有しない。このことは更に分子に興味ある特
性を付与する。
12位および13位での最終的修飾が考慮される。
従って、最も広い意味において、本発明は12位から19
位のアミノ酸残基の配列において修飾されたアプロチニ
ン同族体に関する：但し、もしもLys（15）が別のアミ
ノ酸で置換されている場合、該配列において少なくとも
更に１種のアミノ酸残基は置換されているか、又は欠失
している。本発明のアプロチニン同族体は更に上述のよ
うに公知方法で配列１〜２位および41〜42位で修飾され
うる。
位のアミノ酸残基の配列において修飾されたアプロチニ
ン同族体に関する：但し、もしもLys（15）が別のアミ
ノ酸で置換されている場合、該配列において少なくとも
更に１種のアミノ酸残基は置換されているか、又は欠失
している。本発明のアプロチニン同族体は更に上述のよ
うに公知方法で配列１〜２位および41〜42位で修飾され
うる。
本発明の更に別の面によれば、上記アプロチニン同族
体の製法が提供されこの方法はアプロチニン同族体をコ
ードする遺伝子を含有する複製能を有する発現ベクター
を有する酵母菌株を適当な栄養培地中で培養し、次いで
培地より目的産物を回収することを含んでなる。
体の製法が提供されこの方法はアプロチニン同族体をコ
ードする遺伝子を含有する複製能を有する発現ベクター
を有する酵母菌株を適当な栄養培地中で培養し、次いで
培地より目的産物を回収することを含んでなる。
図面の簡単な説明 本発明は更に以下の添付図面によって明らかにされる
であろう： 第１図はアプロチニン（３−58;42Ser）をコードする
合成遺伝子を示し； 第２図は、プラスミドpKFN306の構築を示し； 第３図はプラスミドpKFN504の構築を示し、 第４図はプラスミドpMT636の構築を示し； 第5A図は、天然アプロチニン、アプロチニン同族体KF
N396およびKFN399による血漿カリクレインの抑制を示
し；更に 第5B図は、天然アプロチニン、アプロチニン同族体KF
N396,KFN772およびKFN773による血漿カリクレインの抑
制を示す。
であろう： 第１図はアプロチニン（３−58;42Ser）をコードする
合成遺伝子を示し； 第２図は、プラスミドpKFN306の構築を示し； 第３図はプラスミドpKFN504の構築を示し、 第４図はプラスミドpMT636の構築を示し； 第5A図は、天然アプロチニン、アプロチニン同族体KF
N396およびKFN399による血漿カリクレインの抑制を示
し；更に 第5B図は、天然アプロチニン、アプロチニン同族体KF
N396,KFN772およびKFN773による血漿カリクレインの抑
制を示す。
現在好ましい態様についての詳細な記載 本発明のアプロチニン同族体は次の一般式Ｉによって
表わすことができる： 前記式中、X1はArg−Pro,Proもしくは水素好ましくは
Arg−Proもしくは水素、最も好ましくは水素を意味し;X
2は天然のアミノ酸残基；好ましくはGlyであり;X3は天
然のアミノ酸残基、好ましくはProであり;X4およびX10
は各々天然のアミノ酸残基、好ましくは、双方ともCys
であるか又は双方ともAlaであり、最も好ましくは双方
ともCygであり、X5はLys,Arg,Val,Thr,Ile,Leu,Phe,Gl
y,Ser,Met,Trp,Tyr or Ala、好ましくは、Lys又はArgで
あり（但し、X5がLysと異なる場合、X2〜X4およびX6〜X
9の少なくとも一種は天然のアプロチニンにおいて対応
する位置のアミノ酸残基とは異なる）;X6はAlaもしくは
Gly好ましくはAlaであり;X7は天然のアミノ酸残基好ま
しくはAlaもしくはGlyであり;X8はIle,Leu,Met,Valもし
くはPhe、好ましくはIleであり;X9は天然のアミノ酸残
基好ましくはIleもしくはGluであり;X11は天然のアミノ
酸残基好ましくはLysもしくはArgであり;X12はLys,Ar
g、もしくはSerであり、アミノ酸残基X2〜X9、好ましく
はX5〜X9より好ましくはX6〜X9の少なくとも一種は天然
のアプロチニンにおける対応するアミノ酸残基とは異な
る。
表わすことができる： 前記式中、X1はArg−Pro,Proもしくは水素好ましくは
Arg−Proもしくは水素、最も好ましくは水素を意味し;X
2は天然のアミノ酸残基；好ましくはGlyであり;X3は天
然のアミノ酸残基、好ましくはProであり;X4およびX10
は各々天然のアミノ酸残基、好ましくは、双方ともCys
であるか又は双方ともAlaであり、最も好ましくは双方
ともCygであり、X5はLys,Arg,Val,Thr,Ile,Leu,Phe,Gl
y,Ser,Met,Trp,Tyr or Ala、好ましくは、Lys又はArgで
あり（但し、X5がLysと異なる場合、X2〜X4およびX6〜X
9の少なくとも一種は天然のアプロチニンにおいて対応
する位置のアミノ酸残基とは異なる）;X6はAlaもしくは
Gly好ましくはAlaであり;X7は天然のアミノ酸残基好ま
しくはAlaもしくはGlyであり;X8はIle,Leu,Met,Valもし
くはPhe、好ましくはIleであり;X9は天然のアミノ酸残
基好ましくはIleもしくはGluであり;X11は天然のアミノ
酸残基好ましくはLysもしくはArgであり;X12はLys,Ar
g、もしくはSerであり、アミノ酸残基X2〜X9、好ましく
はX5〜X9より好ましくはX6〜X9の少なくとも一種は天然
のアプロチニンにおける対応するアミノ酸残基とは異な
る。
より狭い面によれば本発明の天然のアプロチニン同族
体は、次式IIによって示される： 式中、X1,X5,X6,X7,X8,X9,X11およびX12は式Ｉに対し
て先に定義した意味であり、アミノ酸残基X5〜X9、好ま
しくはX6〜X9の少なくとも１種は天然のアプロチニンに
おける対応するアミノ酸残基とは異なる。
体は、次式IIによって示される： 式中、X1,X5,X6,X7,X8,X9,X11およびX12は式Ｉに対し
て先に定義した意味であり、アミノ酸残基X5〜X9、好ま
しくはX6〜X9の少なくとも１種は天然のアプロチニンに
おける対応するアミノ酸残基とは異なる。
より狭い面によれば本発明の天然のアプロチニン同族
体は、次式IIIによって示される： 式中、X1,X6,X7,X8,X9,X11およびX12は式Ｉに対して
先に定義した意味であり、アミノ酸残基X6〜X9の少なく
とも１種は天然のアプロチニンにおける対応するアミノ
酸残基とは異なる。
体は、次式IIIによって示される： 式中、X1,X6,X7,X8,X9,X11およびX12は式Ｉに対して
先に定義した意味であり、アミノ酸残基X6〜X9の少なく
とも１種は天然のアプロチニンにおける対応するアミノ
酸残基とは異なる。
本発明による好ましいアプロチニン同族体の例は、ア
プロチニン（３−58;17Ala＋42Ser）であり、これは天
然のアプロチニンの最初の２個のアミノ酸残基を欠きか
つ17位のArgに対して置換されたAlaを有し更に42位のAr
gに対して置換されたSerを有し；またアプロチニン（３
−58;17Ala＋19Glu＋42Ser）であり、これは天然のアプ
ロチニンの最初の２個のアミノ酸残基を欠きかつ17位の
Argに対し置換されたAla、19位のIleに対し置換されたG
luおよび42位のArgに対し置換されたSerを有しており；
更にアプロチニン（３−58;15Arg＋17Ala＋42Ser）であ
り、これは15位のLysに対して置換されたArg、17位のAr
gに対し置換されたAla、42位のArgに対し置換されたSer
をそれぞれを有する。
プロチニン（３−58;17Ala＋42Ser）であり、これは天
然のアプロチニンの最初の２個のアミノ酸残基を欠きか
つ17位のArgに対して置換されたAlaを有し更に42位のAr
gに対して置換されたSerを有し；またアプロチニン（３
−58;17Ala＋19Glu＋42Ser）であり、これは天然のアプ
ロチニンの最初の２個のアミノ酸残基を欠きかつ17位の
Argに対し置換されたAla、19位のIleに対し置換されたG
luおよび42位のArgに対し置換されたSerを有しており；
更にアプロチニン（３−58;15Arg＋17Ala＋42Ser）であ
り、これは15位のLysに対して置換されたArg、17位のAr
gに対し置換されたAla、42位のArgに対し置換されたSer
をそれぞれを有する。
本発明に係るアプロチニン同族体の別の例は次の如く
である： アプロチニン（３−58;17Ala） アプロチニン（３−58;17Ala＋19Glu） アプロチニン（３−58;15Arg＋17Ala） アプロチニン（17Ala＋42Ser） アプロチニン（15Arg＋17Ala＋42Ser） アプロチニン（17Ala） アプロチニン（17Ala＋19Glu） アプロチニン（15Arg＋17Ala） 分泌目的に対し、好ましいアプロチニン同族体をコー
ドするDNA−配列を、シグナルおよびリーダーペプチド
配列をコードするDNA−配列に融合させる。シグナルお
よびリーダーペプチドは、細胞からの発現蛋白質生産物
の分泌中に形質転換された微細物より開裂され、目的生
産物のより簡易な単離手順が確保される。酵母に対して
良好に適合したリーダーペプチド系は、酵母MFα１リー
ダー配列もしくはその一部である（Kurjan,J.and Hersk
owitz,I.,Cell 30（1982）933〜943）。しかし、酵母内
で分泌を与えるシグナル−もしくはリーダー配列を用い
ることができかつ本発明は特定の分泌系に限定されるも
のではない。
である： アプロチニン（３−58;17Ala） アプロチニン（３−58;17Ala＋19Glu） アプロチニン（３−58;15Arg＋17Ala） アプロチニン（17Ala＋42Ser） アプロチニン（15Arg＋17Ala＋42Ser） アプロチニン（17Ala） アプロチニン（17Ala＋19Glu） アプロチニン（15Arg＋17Ala） 分泌目的に対し、好ましいアプロチニン同族体をコー
ドするDNA−配列を、シグナルおよびリーダーペプチド
配列をコードするDNA−配列に融合させる。シグナルお
よびリーダーペプチドは、細胞からの発現蛋白質生産物
の分泌中に形質転換された微細物より開裂され、目的生
産物のより簡易な単離手順が確保される。酵母に対して
良好に適合したリーダーペプチド系は、酵母MFα１リー
ダー配列もしくはその一部である（Kurjan,J.and Hersk
owitz,I.,Cell 30（1982）933〜943）。しかし、酵母内
で分泌を与えるシグナル−もしくはリーダー配列を用い
ることができかつ本発明は特定の分泌系に限定されるも
のではない。
発現の目的に対し、プロモーター配列は目的蛋白質生
産物に対してのDNA−配列の上流に位置する。好ましく
は、酵母宿主器官に固有の遺伝子からのプロモーター、
例えばTPI−（トリロースホスフェートイソメラーゼ）
のプロモーターが用いられる。目的生産物に対してのDN
A−配列は次いで転写終結配列、好ましくは宿主酵母器
官に固有の遺伝子からのターミネーター、例えばTPI−
遺伝子もしくはMFα１遺伝子のターミネーターに続くで
あろう。
産物に対してのDNA−配列の上流に位置する。好ましく
は、酵母宿主器官に固有の遺伝子からのプロモーター、
例えばTPI−（トリロースホスフェートイソメラーゼ）
のプロモーターが用いられる。目的生産物に対してのDN
A−配列は次いで転写終結配列、好ましくは宿主酵母器
官に固有の遺伝子からのターミネーター、例えばTPI−
遺伝子もしくはMFα１遺伝子のターミネーターに続くで
あろう。
適当なプロモーター、シグナル、リーダーおよびター
ミネーター配列に融合される目的アプロチニン同族体を
コードするDNA−配列を、酵母内でアプロチニン同族体
の発現用の発現ベクターに挿入する。
ミネーター配列に融合される目的アプロチニン同族体を
コードするDNA−配列を、酵母内でアプロチニン同族体
の発現用の発現ベクターに挿入する。
発現ベクターは、酵母内で独立に複製可能であるか又
は酵母染色体に組込み可能なプラスミドである。該プラ
スミドは、生存もしくは宿主細胞の正常増殖に対して必
須である遺伝子、例えば細胞分裂、細胞壁生合成、蛋白
質合成等のコードする遺伝子の取込みにより宿主微生物
によるプラスミド欠失に対して好ましく安定化される。
は酵母染色体に組込み可能なプラスミドである。該プラ
スミドは、生存もしくは宿主細胞の正常増殖に対して必
須である遺伝子、例えば細胞分裂、細胞壁生合成、蛋白
質合成等のコードする遺伝子の取込みにより宿主微生物
によるプラスミド欠失に対して好ましく安定化される。
実施例１ アプロチニン（３−58;17Ala＋42Ser）（KFN396） アプロチニン（３−58;42Ser）をコードする配列を多
数のオリゴヌクレオチドを結合して構築した。
数のオリゴヌクレオチドを結合して構築した。
オリゴヌクレオチドを、制御された孔のグラス支持具
上でホスホラミダイト化学を用い自動DNA合成器で合成
した（S.L.Beaucage and M.H.Caruthers（1981）Tetrah
edron Letters 22,1859−1869）。
上でホスホラミダイト化学を用い自動DNA合成器で合成
した（S.L.Beaucage and M.H.Caruthers（1981）Tetrah
edron Letters 22,1859−1869）。
次の10個のオリゴヌクレオチドを合成した： ５個の二重鎖Ａ〜Ｅを第１図および第２図に示すよう
に上記10個のオリゴヌクレオチドから形成した。
に上記10個のオリゴヌクレオチドから形成した。
各々20pmoleの二重鎖Ａ〜Ｅを５′−ホスホリル化オ
リゴヌクレオチドＩ−Ｘの対応対から、90℃で５分間加
熱し次いで75分にわたって室温に冷却することにより形
成した。５個の二重鎖を混合し、T4リガーゼで処理し
た。合成した配列を、２％ゲル上で連結反応混合物を電
気泳動後176bpバンドとして単離した。
リゴヌクレオチドＩ−Ｘの対応対から、90℃で５分間加
熱し次いで75分にわたって室温に冷却することにより形
成した。５個の二重鎖を混合し、T4リガーゼで処理し
た。合成した配列を、２％ゲル上で連結反応混合物を電
気泳動後176bpバンドとして単離した。
合成した配列をMFα１シグナルおよびリーダー配列
（１−85）をコードするプラスミドpKFN9からの330bp・
EcoR I−Hga Iに連結し次いでpUC19からの大きなEcoR I
−Xba Iに連結した。MFα１リーダー配列・直後のHga I
サイトを含有するpKFN9の構成は、ヨーロッパ特許出願
第0214826に記載されている。連結結合混合物を、アン
ピシリン耐性に対して選択された受容能E.コリー菌株
（r-,m+）を軽質転換するために用いた。32P−Xba I−E
coR Iフラグメント（Maxam,A and Gilbert,M.（1980）M
ethods Enzymol.65,499−560）の配列は、生成コロニー
からのプラスミドがアプロチニン（３−58;42Ser）に対
し正しいDNA−配列を有していることを示した。
（１−85）をコードするプラスミドpKFN9からの330bp・
EcoR I−Hga Iに連結し次いでpUC19からの大きなEcoR I
−Xba Iに連結した。MFα１リーダー配列・直後のHga I
サイトを含有するpKFN9の構成は、ヨーロッパ特許出願
第0214826に記載されている。連結結合混合物を、アン
ピシリン耐性に対して選択された受容能E.コリー菌株
（r-,m+）を軽質転換するために用いた。32P−Xba I−E
coR Iフラグメント（Maxam,A and Gilbert,M.（1980）M
ethods Enzymol.65,499−560）の配列は、生成コロニー
からのプラスミドがアプロチニン（３−58;42Ser）に対
し正しいDNA−配列を有していることを示した。
更に使用するため１個のプラスミドpKFN306を選択し
た。プラスミドpKFN306の構築を第２図に示す。
た。プラスミドpKFN306の構築を第２図に示す。
17位にAlaを導入するため、次のオリゴヌクレオチド
を次のように合成した： ATPとT4−キナーゼで処理することにより、オリゴヌ
クレオチドを５′−Ｏ−リン酸化した。
を次のように合成した： ATPとT4−キナーゼで処理することにより、オリゴヌ
クレオチドを５′−Ｏ−リン酸化した。
５′−リン酸化オリゴヌクレオチドI aおよびII aを
アニールすることによって形成した二重鎖を352bp・Eco
R I−PflMIフラグメントおよび3kbp EcoR I−Sty Iフラ
グメントに連結したがそれらの双方はpKFN306から得ら
れる。pKFN306は、合成アプロチニン（３−58;42Ser）
遺伝子に融合した、S.セレビジエ（S.cerevisiae）接合
性因子α１シグナル−リーダー（１−85）をコードす
る。
アニールすることによって形成した二重鎖を352bp・Eco
R I−PflMIフラグメントおよび3kbp EcoR I−Sty Iフラ
グメントに連結したがそれらの双方はpKFN306から得ら
れる。pKFN306は、合成アプロチニン（３−58;42Ser）
遺伝子に融合した、S.セレビジエ（S.cerevisiae）接合
性因子α１シグナル−リーダー（１−85）をコードす
る。
連結混合物を用い、アンピシリン耐性に対して選択し
た適応能のあるE.coli菌株（r-,m+）を形質転換した。
32P−Xba I−EcoR Iフラグメントの配列決定（Maxam,A
and Gilbert,M.（1980）Methods Enzymol.65,499−56
0）は、成成コロニーからのプラスミドがアプロチニン
（３−58;17Ala＋42SeR）に対し正しいDNA−配列を含有
することを示した。
た適応能のあるE.coli菌株（r-,m+）を形質転換した。
32P−Xba I−EcoR Iフラグメントの配列決定（Maxam,A
and Gilbert,M.（1980）Methods Enzymol.65,499−56
0）は、成成コロニーからのプラスミドがアプロチニン
（３−58;17Ala＋42SeR）に対し正しいDNA−配列を含有
することを示した。
１個のプラスミド、pKFN501を選び更に使用した。プ
ラスミドpKFN501の構築を第３図に示す。
ラスミドpKFN501の構築を第３図に示す。
pKFN501をEcoR IおよびXba Iで切断し次いで0.5kbフ
ラグメントをpMT636からの9.5kb Nco I−Xba Iフラグメ
ントおよびpMT636からの1.4kb Nco I−EcoR Iフラグメ
ントに連結し、プラスミドpKFN504を得た（第３図参
照）。プラスミドpMT636を、LEU−２の欠失後pMT608か
らおよびpMT479から構築した（第４図参照）。pMT608は
ヨーロッパ特許出願第195691号に記載されている。pMT4
79はヨーロッパ特許出願第163529に記載されている。pM
T479は、Schizo.pombe TPI遺伝子（POT）、S.セレビジ
エ（S.cerevisiae）トリオホスフェートイソメラーゼプ
ロモーターおよびターミネーターを有する（Alber,T.an
d Kawasaki,G.（1982）J.Mol.Appl.Gen.1,419−434）。
プラスミドpKFN504は、次の配列を有する： TPIP−MFα１−リーダー（１−85）−アプロチニン
（３−58;17Ala＋42Ser）−TPIT ここで、MFα１はS.cerevisiae接合性因子α１コード
配列であり（Kurjan,J.and Merskowitz,I.（1982）Cell
30,933−943）、シグナル−リーダー（１−85）は、MF
α１シグナル−リーダー配列の最初の85個のアミノ酸残
基を有することを意味し、更にアプロチニン（３−58;1
7Ala＋42Ser）は、Ｎ末端で最初の２個のアミノ酸残基
を欠失しさらにそれぞれAlaおよびSerによって置換され
たアミノ酸17位あるいは42位を有するアプロチニン誘導
体をコードする合成配列である。
ラグメントをpMT636からの9.5kb Nco I−Xba Iフラグメ
ントおよびpMT636からの1.4kb Nco I−EcoR Iフラグメ
ントに連結し、プラスミドpKFN504を得た（第３図参
照）。プラスミドpMT636を、LEU−２の欠失後pMT608か
らおよびpMT479から構築した（第４図参照）。pMT608は
ヨーロッパ特許出願第195691号に記載されている。pMT4
79はヨーロッパ特許出願第163529に記載されている。pM
T479は、Schizo.pombe TPI遺伝子（POT）、S.セレビジ
エ（S.cerevisiae）トリオホスフェートイソメラーゼプ
ロモーターおよびターミネーターを有する（Alber,T.an
d Kawasaki,G.（1982）J.Mol.Appl.Gen.1,419−434）。
プラスミドpKFN504は、次の配列を有する： TPIP−MFα１−リーダー（１−85）−アプロチニン
（３−58;17Ala＋42Ser）−TPIT ここで、MFα１はS.cerevisiae接合性因子α１コード
配列であり（Kurjan,J.and Merskowitz,I.（1982）Cell
30,933−943）、シグナル−リーダー（１−85）は、MF
α１シグナル−リーダー配列の最初の85個のアミノ酸残
基を有することを意味し、更にアプロチニン（３−58;1
7Ala＋42Ser）は、Ｎ末端で最初の２個のアミノ酸残基
を欠失しさらにそれぞれAlaおよびSerによって置換され
たアミノ酸17位あるいは42位を有するアプロチニン誘導
体をコードする合成配列である。
S.cerevisiae菌株MT663（E2−7B×E11−36a/α，Δtp
iΔtpi,pep4−3/pep4−３）をYPGaL（１％バクト酵母エ
キス、２％バクトペプトン、２％ガラクトース、１％ラ
クトース）上で増殖させ600nmで光学密度0.6を得た。
iΔtpi,pep4−3/pep4−３）をYPGaL（１％バクト酵母エ
キス、２％バクトペプトン、２％ガラクトース、１％ラ
クトース）上で増殖させ600nmで光学密度0.6を得た。
100mlの培養物を遠心分離によって得、100mlの水で洗
い、再遠心分離し次いで10ml（1.2Mのソルビトール、25
mMのNa2EDTA,pH＝8.0,6.7mg/mlジチオトレイトール）に
懸濁させた。懸濁液を30℃で15分間インキュベートし、
遠心し次いで細胞を10ml（1.2Mのソルビトール、10mMの
Na2EDTA,0.1Mのクエン酸ナトリウム、pH＝5.8、2mgのノ
ボザイム 234）に再懸濁させた。懸濁液を30℃で30分
間インキュベートし、細胞を遠心して集め、10mlの1.2M
ソルビトールおよび10mlのCAS（1.2Mソルビトール、10m
M CaCl2,10mM Tris HCl（Tris＝トリス（ヒドロキシメ
チル）−アミノメタン）pH7.5）で洗い次いで2mlのCAS
中に再懸濁させた。形質転換するため、0.1mlのCAS−再
懸濁細胞を、約１μｇのプラスミドpKFN504と混合し、
次いで室温で15分間放置した。1ml（20％ポリエチレン
グリコール4000,10mM CaCl2,10mM Tris HCl,pH＝7.5）
を加え、混合物を更に30分間室温で放置した。混合物を
遠心し次いでペレットを0.1mlのSOS（1.2Mのソルビトー
ル、33％v/vのYPD,6.7mMのCaCl2,14μg/mlのロイシン）
に再懸濁させ次いで30℃で２時間インキュベートした。
懸濁液を遠心し、ペレットを0.5mlの1.2Mソルビトール
に再懸濁させた。6mlのtop寒天（1.2Mのソルビトール＋
2.5％寒天を有するシカルマン等（Methods in Yeast Ge
netics,Cold Spring Harbor Laboratory,1981）のSC培
地）を52℃で加え、次いで同一の寒天で固化したソルビ
トール含有培地を有するプレートの頂部に懸濁液を注い
だ。軽質転換細胞コロニーを30℃で３日後集め、再分離
し次いで液体培養を開始するため用いた。１個のこのよ
うな軽質転換細胞KFN396を更に特性化するために選択し
た。
い、再遠心分離し次いで10ml（1.2Mのソルビトール、25
mMのNa2EDTA,pH＝8.0,6.7mg/mlジチオトレイトール）に
懸濁させた。懸濁液を30℃で15分間インキュベートし、
遠心し次いで細胞を10ml（1.2Mのソルビトール、10mMの
Na2EDTA,0.1Mのクエン酸ナトリウム、pH＝5.8、2mgのノ
ボザイム 234）に再懸濁させた。懸濁液を30℃で30分
間インキュベートし、細胞を遠心して集め、10mlの1.2M
ソルビトールおよび10mlのCAS（1.2Mソルビトール、10m
M CaCl2,10mM Tris HCl（Tris＝トリス（ヒドロキシメ
チル）−アミノメタン）pH7.5）で洗い次いで2mlのCAS
中に再懸濁させた。形質転換するため、0.1mlのCAS−再
懸濁細胞を、約１μｇのプラスミドpKFN504と混合し、
次いで室温で15分間放置した。1ml（20％ポリエチレン
グリコール4000,10mM CaCl2,10mM Tris HCl,pH＝7.5）
を加え、混合物を更に30分間室温で放置した。混合物を
遠心し次いでペレットを0.1mlのSOS（1.2Mのソルビトー
ル、33％v/vのYPD,6.7mMのCaCl2,14μg/mlのロイシン）
に再懸濁させ次いで30℃で２時間インキュベートした。
懸濁液を遠心し、ペレットを0.5mlの1.2Mソルビトール
に再懸濁させた。6mlのtop寒天（1.2Mのソルビトール＋
2.5％寒天を有するシカルマン等（Methods in Yeast Ge
netics,Cold Spring Harbor Laboratory,1981）のSC培
地）を52℃で加え、次いで同一の寒天で固化したソルビ
トール含有培地を有するプレートの頂部に懸濁液を注い
だ。軽質転換細胞コロニーを30℃で３日後集め、再分離
し次いで液体培養を開始するため用いた。１個のこのよ
うな軽質転換細胞KFN396を更に特性化するために選択し
た。
酵母菌株KFN396をYPD培地（１％酵母エキス、２％ペ
プトン（ディフユラボラトリー市販）および２％グルコ
ース）上で増殖させる。１の菌株培養物を600nmで光
学密度13まで30℃で振とうした。遠心後、上澄みをFPLC
イオン交換クロマトグラフィーで精製した。酵母上澄み
を0.22μm Millex GVフィルター装置でロ過し、次いで
1mlを20mMビシン（pH8.7）で平衡化したMonoSカチオン
交換カラム（0.5×5cm）に適用した。平衡緩衝液で洗浄
後、カラムを平衡緩衝液中線状NaClグレデエント（０〜
1M）で溶出した。トリプシン阻害活性を、溶出分画中、
分光学的分析により更に から280nmでの吸収量を統合することにより測定した。
プトン（ディフユラボラトリー市販）および２％グルコ
ース）上で増殖させる。１の菌株培養物を600nmで光
学密度13まで30℃で振とうした。遠心後、上澄みをFPLC
イオン交換クロマトグラフィーで精製した。酵母上澄み
を0.22μm Millex GVフィルター装置でロ過し、次いで
1mlを20mMビシン（pH8.7）で平衡化したMonoSカチオン
交換カラム（0.5×5cm）に適用した。平衡緩衝液で洗浄
後、カラムを平衡緩衝液中線状NaClグレデエント（０〜
1M）で溶出した。トリプシン阻害活性を、溶出分画中、
分光学的分析により更に から280nmでの吸収量を統合することにより測定した。
収率は約4.3mg/のアプロチニン（３−58;17Ala＋42
Ser）であった。
Ser）であった。
アミノ酸分析に対し、酵母上澄み（7ml）を0.1M NaOH
でpH8.7に調節し、ロ過した（0.22μｍ）。20mMビシン
（pH8.7）で平衡化したＱ−セファロースアニオン交換
カラム（１×4cm）からの溶出物を、MonoSカチオン交換
カラム（0.5×5cm）に適用した。カチオン交換クロマト
グラフィー処理を上記のように行った。勾配溶出アプロ
チニン（３−58）の濃縮をMonoSでの再クロマトグラフ
ィー処理並びに急勾配のNaCl＝勾配による溶出によって
行った。集めた分画を更に減圧遠心により約100μに
濃縮し次いでRP−HPLCカラム（Vydac C4,4.6×250mm）
に適用した。集めた分画を減圧遠心により約100μに
濃縮し、サンプルをアミノ酸分析に対して採取した。
でpH8.7に調節し、ロ過した（0.22μｍ）。20mMビシン
（pH8.7）で平衡化したＱ−セファロースアニオン交換
カラム（１×4cm）からの溶出物を、MonoSカチオン交換
カラム（0.5×5cm）に適用した。カチオン交換クロマト
グラフィー処理を上記のように行った。勾配溶出アプロ
チニン（３−58）の濃縮をMonoSでの再クロマトグラフ
ィー処理並びに急勾配のNaCl＝勾配による溶出によって
行った。集めた分画を更に減圧遠心により約100μに
濃縮し次いでRP−HPLCカラム（Vydac C4,4.6×250mm）
に適用した。集めた分画を減圧遠心により約100μに
濃縮し、サンプルをアミノ酸分析に対して採取した。
アミノ酸分析は次表１から明らかである。この表よ
り、生産物は期待したアミノ酸組成を有することが分か
る。
り、生産物は期待したアミノ酸組成を有することが分か
る。
例 ２ アプロチニン（３−58;17Ala＋19Glu＋42Ser）（KFN39
9） アプロチニン（３−58;17Ala＋19Glu＋42Ser）をコー
ドする合成遺伝子を例１に記載のように構築した。次の
オリゴヌクレオチドI bおよびII bを、I aおよびII aの
代りに用いた： pUC19由来のプラスミドpKFN503を、pKFN501と同様に
構築した。
9） アプロチニン（３−58;17Ala＋19Glu＋42Ser）をコー
ドする合成遺伝子を例１に記載のように構築した。次の
オリゴヌクレオチドI bおよびII bを、I aおよびII aの
代りに用いた： pUC19由来のプラスミドpKFN503を、pKFN501と同様に
構築した。
例１の手順に従い、次の構成を有するプラスミドpKFN
507を得た： TPIP−MFα１−シグナル−リーダー（１−85）−アプ
ロチニン（３−58;17Ala＋19Glu＋42Ser）−TPIT。
507を得た： TPIP−MFα１−シグナル−リーダー（１−85）−アプ
ロチニン（３−58;17Ala＋19Glu＋42Ser）−TPIT。
ここでアプロチニン（３−58;17Ala＋19Glu＋42Ser）
は、Ｎ末端で最初の２個のアミノ酸残基を欠失しかつそ
れぞれアラニン、グルタミン酸およびセリン残基で置換
された天然アプロチニンの残基17,19および42を有する
アプロチニン誘導体をコードする合成遺伝子である。
は、Ｎ末端で最初の２個のアミノ酸残基を欠失しかつそ
れぞれアラニン、グルタミン酸およびセリン残基で置換
された天然アプロチニンの残基17,19および42を有する
アプロチニン誘導体をコードする合成遺伝子である。
プラスミドpKFN507を前記のように酵母菌株MT663内で
形質転換し次いで軽質転換された菌株KFN399を培養し、
約10mg/のアプロチニン（３−58;17Ala＋19Glu＋42Se
r）を得た。
形質転換し次いで軽質転換された菌株KFN399を培養し、
約10mg/のアプロチニン（３−58;17Ala＋19Glu＋42Se
r）を得た。
アミノ酸分析結果を第２表に示すが、この表より期待
されるアミノ酸組成が確認される。
されるアミノ酸組成が確認される。
例 ３ アプロチニン（３−58;15Arg＋17Ala＋42Ser）（KFN77
3） アプロチニン（３−58;15Arg＋17Ala＋42Ser）をコー
ドする合成遺伝子を例１で記載した如く構築した。
3） アプロチニン（３−58;15Arg＋17Ala＋42Ser）をコー
ドする合成遺伝子を例１で記載した如く構築した。
I aおよびII aの代りに次のオリゴヌクレオチドI cお
よびII cを用いた： pUC19由来のプラスミドpKFN707を、pKFN501と同様に
構築した。
よびII cを用いた： pUC19由来のプラスミドpKFN707を、pKFN501と同様に
構築した。
例１の手順に従い、次の構成を有するプラスミドpKFN
807を得た： TPIP−MFα１−シグナル−リーダー（１−85）−アプ
ロチニン（３−58;15Arg＋17Ala＋42Ser）−TPIT。
807を得た： TPIP−MFα１−シグナル−リーダー（１−85）−アプ
ロチニン（３−58;15Arg＋17Ala＋42Ser）−TPIT。
ここでアプロチニン（３−58;15Arg＋17Ala＋42Ser）
は、Ｎ末端で最初の２個のアミノ酸残基を欠失しかつそ
れぞれアルギニン、アラニン、およびセリン残基で置換
された天然アプロチニンの残基15,17、および42を有す
るアプロチニン誘導体をコードする合成遺伝子である。
は、Ｎ末端で最初の２個のアミノ酸残基を欠失しかつそ
れぞれアルギニン、アラニン、およびセリン残基で置換
された天然アプロチニンの残基15,17、および42を有す
るアプロチニン誘導体をコードする合成遺伝子である。
プラスミドpKFN807を前記のように酵母菌株MT663内で
形質転換し次いで形質転換された菌株KFN773を培養し、
約8.5mg/のアプロチニン（３−58;15Arg＋17Ala＋42S
er）を得た。
形質転換し次いで形質転換された菌株KFN773を培養し、
約8.5mg/のアプロチニン（３−58;15Arg＋17Ala＋42S
er）を得た。
アミノ酸分析結果を第３表に示すが、この表より期待
されるアミノ酸組成が確認される。
されるアミノ酸組成が確認される。
理論値と比較してわずかに低い含量のIleは、Ile（1
8）−Ile（19）の不完全加水分解におそらく最も寄与し
ている。このことは当業者に周知である。
8）−Ile（19）の不完全加水分解におそらく最も寄与し
ている。このことは当業者に周知である。
例 ４ アプロチニン（３−58;17Ala＋42Ser）（KFN396）およ
びアプロチニン（３−58;17Ala＋19Glu＋42Ser）（KFN3
99）、アプロチニン（３−58;15Arg＋42Ser）（KFN77
2）およびアプロチニン（３−58;15Arg＋17Ala＋42Se
r）（KFN773）によるプラスミドからのセリンプロテア
ーゼの抑制 アプロチニン（３−58;17Ala＋42Ser）（KFN396）、
アプロチニン（３−58;17Ala＋19Glu＋42Ser）（KFN39
9）およびアプロチニン（３−58;15Arg＋17Ala＋42Se
r）（KFN773）を上記のように精製した。天然のものと
して、ノボ社（バズグバエルト，デンマーク国）市販の
ウシの膵臓アプロチニン（１−58）バッチB 5029−65を
用いた。E280nm＝8.3およびMr＝6500を用いて濃度を計
算した。ヒト血漿カリクレインをシグマ社（セントルイ
ス,MO）から得、ウシ因子XaをH.Nobukazu等（J.Biochem
ical.97（1985）1347−1355）に従って精製した。ヒト
因子II a（スロンビン）はW.Lawson教授（ニューヨーク
ステートデパートメントオブヘルス，アルバニー，ニュ
ーヨーク）から得た。組換え体ヒト因子VII aは、ノボ
社（バズグバエルト，デンマーク国）から得、組換え体
ヒト蛋白質CaはZymo Genetics社（シアトル,WA）から得
た。
びアプロチニン（３−58;17Ala＋19Glu＋42Ser）（KFN3
99）、アプロチニン（３−58;15Arg＋42Ser）（KFN77
2）およびアプロチニン（３−58;15Arg＋17Ala＋42Se
r）（KFN773）によるプラスミドからのセリンプロテア
ーゼの抑制 アプロチニン（３−58;17Ala＋42Ser）（KFN396）、
アプロチニン（３−58;17Ala＋19Glu＋42Ser）（KFN39
9）およびアプロチニン（３−58;15Arg＋17Ala＋42Se
r）（KFN773）を上記のように精製した。天然のものと
して、ノボ社（バズグバエルト，デンマーク国）市販の
ウシの膵臓アプロチニン（１−58）バッチB 5029−65を
用いた。E280nm＝8.3およびMr＝6500を用いて濃度を計
算した。ヒト血漿カリクレインをシグマ社（セントルイ
ス,MO）から得、ウシ因子XaをH.Nobukazu等（J.Biochem
ical.97（1985）1347−1355）に従って精製した。ヒト
因子II a（スロンビン）はW.Lawson教授（ニューヨーク
ステートデパートメントオブヘルス，アルバニー，ニュ
ーヨーク）から得た。組換え体ヒト因子VII aは、ノボ
社（バズグバエルト，デンマーク国）から得、組換え体
ヒト蛋白質CaはZymo Genetics社（シアトル,WA）から得
た。
基質S2302（Ｈ−Ｄ−Pro−Phe−Arg−ｐ−ニトロアニ
リド）基質S2238（Ｈ−Ｄ−Phe−Pip−Arg−ｐ−ニトロ
アニリド）および基質S2366（Glu−Pro−Arg−ｐ−ニト
ロアニリド）は、カビ社（ストックホルム，スウェーデ
ン国）から得た。基質FXa−１（メトキシカルボニルDCH
−Gly−Arg−ｐ−ニトロアニリド）は、NycoMed社（オ
スロ，ノルウェー国）から得た。実験は、100bmM NaCl,
50mMトリス−HCl0.01％トウィーン80 pH7.4中、25℃で
行った。
リド）基質S2238（Ｈ−Ｄ−Phe−Pip−Arg−ｐ−ニトロ
アニリド）および基質S2366（Glu−Pro−Arg−ｐ−ニト
ロアニリド）は、カビ社（ストックホルム，スウェーデ
ン国）から得た。基質FXa−１（メトキシカルボニルDCH
−Gly−Arg−ｐ−ニトロアニリド）は、NycoMed社（オ
スロ，ノルウェー国）から得た。実験は、100bmM NaCl,
50mMトリス−HCl0.01％トウィーン80 pH7.4中、25℃で
行った。
ヒト血漿カリクレイン（3nM）をミクロ−タイターウ
ェル中でアプロチニン（０−20nM）と30分間インキュベ
ートした。基質S2302（0.6mM）を加え最終量300μと
し、次いでニトロアニリン発生速度をダイナテックラボ
ラトリー社市販のELISA オートリーダーMR580を用い40
5nmで測定した。速度は、遊離酵素の濃度に比例してい
る。天然のアプロチニンおよび４個の同族体KFN396,KFN
399,KFN772およびKFN773による血漿カリクレインの抑制
を第5A図および第5B図に示す。天然のアプロチニンにつ
いては適度の抑制が観察された。同族体KFN396および17
位にAlaを有する同族体KFN399によって抑制は強く増加
された。
ェル中でアプロチニン（０−20nM）と30分間インキュベ
ートした。基質S2302（0.6mM）を加え最終量300μと
し、次いでニトロアニリン発生速度をダイナテックラボ
ラトリー社市販のELISA オートリーダーMR580を用い40
5nmで測定した。速度は、遊離酵素の濃度に比例してい
る。天然のアプロチニンおよび４個の同族体KFN396,KFN
399,KFN772およびKFN773による血漿カリクレインの抑制
を第5A図および第5B図に示す。天然のアプロチニンにつ
いては適度の抑制が観察された。同族体KFN396および17
位にAlaを有する同族体KFN399によって抑制は強く増加
された。
更に抑制の増加は、15位のArg（KFN772）について得
られ；更に最も強い抑制が、17位（Ala）と15位（Arg）
の双方で置換した同族体（KFN773）について観察された
（第5B図）。同族体をまた、セリンプロテアーゼ：ウシ
因子Xa、ヒト因子II a、ヒト組換え体因子VII aおよび
ヒト組換え体タンパク質Caのアミド分解活性に対して試
験した。実験は、血漿カリクレインに対して記載したと
同様に行い、適当な基質のみを用いた。最後に、同族体
を２種の凝固試験を用いたヒト血漿の凝固因子に対する
効果について分析した。これらの試験、プロトロンビン
時間（PTT）および活性化トロンボプラスチン時間（APT
T）を、製造者によって示された指示に従いオルグノン
社（ダーハム,NC）市販のGeneral Diagnostics 試剤を
用いて行った。抑制実験の結果を第４表に示すが、この
表は４種のアプロチニン同族体による抑制傾向を示して
いる。KFN773は、ヒト血漿カリクレインの法外に強い抑
制により特徴づけられており、これはArg同族体（KFN77
2）のそれよりも10倍強い。逆の効果が活性化蛋白質Ｃ
について認められる。この場合、Lys15をArgに置換する
ことによって得られる、比較的に強い抑制は、Arg17をA
laに更に置換することによって弱められる。
られ；更に最も強い抑制が、17位（Ala）と15位（Arg）
の双方で置換した同族体（KFN773）について観察された
（第5B図）。同族体をまた、セリンプロテアーゼ：ウシ
因子Xa、ヒト因子II a、ヒト組換え体因子VII aおよび
ヒト組換え体タンパク質Caのアミド分解活性に対して試
験した。実験は、血漿カリクレインに対して記載したと
同様に行い、適当な基質のみを用いた。最後に、同族体
を２種の凝固試験を用いたヒト血漿の凝固因子に対する
効果について分析した。これらの試験、プロトロンビン
時間（PTT）および活性化トロンボプラスチン時間（APT
T）を、製造者によって示された指示に従いオルグノン
社（ダーハム,NC）市販のGeneral Diagnostics 試剤を
用いて行った。抑制実験の結果を第４表に示すが、この
表は４種のアプロチニン同族体による抑制傾向を示して
いる。KFN773は、ヒト血漿カリクレインの法外に強い抑
制により特徴づけられており、これはArg同族体（KFN77
2）のそれよりも10倍強い。逆の効果が活性化蛋白質Ｃ
について認められる。この場合、Lys15をArgに置換する
ことによって得られる、比較的に強い抑制は、Arg17をA
laに更に置換することによって弱められる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:865） (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 21/02 ＤＤＢＪ／Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (5)
- 【請求項１】アプロチニン（３−58;17Ala＋42Ser）（K
FN396）、アプロチニン（３−58;17Ala−19Glu＋42Se
r）（KFN399）、アプロチニン（３−58;15Arg＋17Ala＋
42Ser）（KFN773）、及びアプロチニン（３−58;15Arg
＋42Ser）（KFN772）から成る群から選ばれたアプロチ
ニン同族体。 - 【請求項２】以下の構造： を有する、請求の範囲第１項記載のアプロチニン同族
体。 - 【請求項３】以下の構造： を有する、請求の範囲第１項記載のアプロチニン同族
体。 - 【請求項４】以下の構造： を有する、請求の範囲第１項記載のアプロチニン同族
体。 - 【請求項５】請求の範囲第１項記載のアプロチニン同族
体を酵母内で製造する方法であって、 上記アプロチニン同族体をコードする遺伝子及び上記ア
プロチニン同族体の発現を許容するDNA配列を包含する
複数可能な発現ベクターを含有する酵母株を、好適な栄
養培地中で培養し、次いで成熟かつ活性形で発現された
そのアプロチニン同族体を回収することを包含する、前
記方法。
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|---|---|---|---|
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| US7413537B2 (en) | 1989-09-01 | 2008-08-19 | Dyax Corp. | Directed evolution of disulfide-bonded micro-proteins |
| DE3930522A1 (de) * | 1989-09-13 | 1991-03-21 | Bayer Ag | Rekombinante aprotinin-varianten - gentechnisches verfahren zur mikrobiellen herstellung von homogen prozessierten aprotinin-varianten sowie die therapeutische anwendung derselben |
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| CA2105300C (en) | 1991-03-01 | 2008-12-23 | Robert C. Ladner | Process for the development of binding mini-proteins |
| IL104314A0 (en) * | 1992-01-07 | 1993-05-13 | Novo Nordisk As | Human kunitz-type protease inhibitor and variants thereof,their production and pharmaceutical compositions containing them |
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| US5807980A (en) * | 1992-07-13 | 1998-09-15 | Corvas International, Inc. | Bovine pancreatic trypsin inhibitor derived inhibitors of factor VIIa-tissue factor complex |
| US6057287A (en) * | 1994-01-11 | 2000-05-02 | Dyax Corp. | Kallikrein-binding "Kunitz domain" proteins and analogues thereof |
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| US5780265A (en) * | 1995-06-05 | 1998-07-14 | Genentech, Inc. | Kunitz type plasma kallikrein inhibitors |
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| DE19725014A1 (de) * | 1997-06-13 | 1998-12-17 | Bayer Ag | Aprotininvarianten mit verbesserten Eigenschaften und Bikunine von Aprotininvarianten |
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| GB2188933A (en) * | 1986-04-10 | 1987-10-14 | Bayer Ag | Expression vectors for production of polypeptides, method for enhanced expression of polypeptides, hosts containing the expression vectors, products manufactured thereby |
| DE3724570A1 (de) * | 1987-06-27 | 1989-01-05 | Bayer Ag | Human-aprotinin, dessen lys-rest in position 15 gegen einen anderen protogenen aminosaeurerest ausgetauscht ist |
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-
1988
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-
1989
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|---|---|---|---|
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