WO2018110641A1 - 酵母でタンパク質を過剰発現させる方法 - Google Patents

酵母でタンパク質を過剰発現させる方法 Download PDF

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赤田　倫治
尚司 星田
幸恵 美澄
整 松田
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国立大学法人山口大学
Ｊｘｔｇエネルギー株式会社
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    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a protein by overexpressing the protein in yeast, for example.
  • Non-patent Document 1 plasmid groups called episomal plasmids or YEp plasmids have shown high expression.
  • plasmids are unstable and are lost from the host at a constant rate, so as an alternative, they are often inserted into the chromosome for expression.
  • insertion into a chromosome is complicated, and there is a need for an expression method that has a high copy number and high stability.
  • the YEp plasmid uses the replication mechanism of the 2 ⁇ m (2 micrometer) plasmid (Non-patent Document 2), which is maintained in the natural state in most yeasts, and only the replication origin (2 ⁇ m origin) portion is used as the plasmid. It is incorporated. This is frequently used because it is multicopyed and maintained in the cell (the YEp plasmid is not stably maintained unless it is a strain that holds a 2 ⁇ m plasmid) (Non-patent Document 3).
  • Non-patent Document 4 when the expression level of the selectable marker gene is reduced by deleting the promoter region, it is known that selective copy cannot be performed unless the copy number becomes high, so that a high copy number can be maintained (leu2-d marker; Non-patent document 4). However, in this case, since it is necessary to proliferate while giving selectivity, a selective medium is used as the medium, and the growth is actually delayed. In addition, the stability of the YEp plasmid is not perfect, and the YEp plasmid escapes from the yeast cells with a certain frequency, so that the stability is not sufficient (Non-patent Document 5).
  • the present invention has been made in view of the above-described circumstances, and an object thereof is to provide a method for stably and highly expressing a protein in yeast.
  • the present invention includes the following.
  • a method for producing a protein comprising a step of culturing a yeast transformant in which a 2 ⁇ m plasmid is reconstituted in yeast not retaining a 2 ⁇ m plasmid, wherein the reconstituted 2 ⁇ m plasmid contains a gene encoding a target protein.
  • the target protein can be stably and highly expressed in yeast, and the production efficiency of the protein can be greatly improved.
  • the protein production method according to the present invention includes a step of culturing a yeast transformant in which a 2 ⁇ m plasmid is reconstituted in a yeast not retaining a 2 ⁇ m plasmid.
  • the reconstituted 2 ⁇ m plasmid contains the gene encoding the target protein.
  • the gene encoding the target protein is stably and highly expressed from the reconstituted 2 ⁇ m plasmid to produce the target protein. be able to.
  • yeast that does not hold the 2 ⁇ m plasmid examples include, for example, the Association No. 7 yeast, which is a yeast strain belonging to Saccharomyces cerevisiae, or a derivative thereof (including mutant strains: , RAK2359 strain (a / a ura3 ⁇ :: LYS4 / ura3 ⁇ :: LYS4 his3 / his3 lys4 / lys4, Ano et al., Biosci. Biotechnol. Biochem.
  • association No. 7 yeast which is a yeast strain belonging to Saccharomyces cerevisiae, or a derivative thereof (including mutant strains: , RAK2359 strain (a / a ura3 ⁇ :: LYS4 / ura3 ⁇ :: LYS4 his3 / his3 lys4 / lys4, Ano et al., Biosci. Biotechnol. Biochem.
  • the gene encoding the target protein may be any gene encoding any protein or peptide.
  • a yeast transformant in which a 2 ⁇ m plasmid is reconstituted in the cir0 strain is prepared.
  • a gene encoding the entire 2 ⁇ m plasmid and the target protein is prepared as one or a plurality of (for example, three or more) fragments or a circular plasmid, and the one or more fragments or the circular plasmid is cir0 strain To introduce.
  • the gene encoding the target protein is preferably operably linked to a regulatory sequence (eg, promoter, terminator, etc.).
  • any conventionally known method known as a yeast transformation method can be applied.
  • the electroporation method, the spheroplast method, the lithium acetate method, and the like can be used, but the method is not limited thereto.
  • a yeast transformant having a reconstituted 2 ⁇ m plasmid (hereinafter referred to as “YHp (yeast hyper-copy plasmid)”) is cultured under conventionally known yeast culture conditions.
  • YHp yeast hyper-copy plasmid
  • YPD medium 1% yeast extract, 2% polypeptone, 2% glucose
  • shaking culture or stationary culture is performed at 27 to 33 ° C. and pH 5 to 7.
  • the obtained culture may be used as the target protein as it is, or the target protein may be isolated or purified from the culture.
  • the primers, yeast (Saccharomyces cerevisiae) strains and plasmids used in the following examples are shown in Tables 1 to 3, respectively.
  • 1 mL of the pre-cultured solution was inoculated into 9 mL of YPD medium and cultured with shaking at 30 ° C. for 5 h (main culture).
  • the total amount of 10 mL of the main culture was centrifuged at 3000 rpm for 1 minute, the supernatant was discarded, and washed with 10 mL of sterilized water.
  • 500 ⁇ L of a transformation solution (60% polyethylene glycol 3350: 2400 ⁇ L, 4M lithium acetate: 100 ⁇ L, 10 mg / mL carrier DNA: 200 ⁇ L) was added to obtain a competent cell.
  • each DNA fragment was added to 100 ⁇ L of competent cells, mixed well, and incubated at 42 ° C. for 30 minutes. After incubation, transform the yeast-containing transformation solution into uracil-deficient (-U) agar medium (0.17% Yeast Nitrogen Base, 0.5% ammonium sulfate, 2% glucose, 0.0024% adenine sulfate, 0.1% L-Histidine HCl, 0.2% L- Leucine, 0.1% L-Lysine® HCl, 0.1% L-Methionine, 0.1% L-Tryptophan, 2% agar). After culturing at 30 ° C. for 2 to 3 days, transformant YHp (K7) (RAK17606) was obtained.
  • uracil-deficient (-U) agar medium 0.17% Yeast Nitrogen Base, 0.5% ammonium sulfate, 2% glucose, 0.0024% adenine sulfate, 0.1% L-Histidine
  • FIG. 1 A map of the plasmid YHp17606 contained in the YHp (K7) (RAK17606) strain is shown in FIG. In FIG. 1, each abbreviation is as follows.
  • FLP1 site-specific recombinase
  • repeat_region repeat sequence region
  • REP1 replication gene 1
  • Dprotein RAF1 gene
  • TDH3p constant high expression promoter
  • yEmRFP red fluorescent protein yEmRFP gene
  • URA3 uracil-requiring complementary gene
  • REP2 replication gene 2
  • D + 546c primer of SEQ ID NO: 1
  • REP2 + 30c primer of SEQ ID NO: 2
  • FLP1 + 30c primer of SEQ ID NO: 3
  • D + 547 primer of SEQ ID NO: 4
  • D + 547 ( +40) c-YEp primer of SEQ ID NO: 5
  • D + 546 (-40) -TDH3 primer of SEQ ID NO: 6.
  • DNA fragment 1 From the start of REP2 to FLP1-repeat_region-REP1-Dprotein (D + 546c), DNA fragment 2: From the start of URA3 (D + 547) to the start of repeat_region-REP2-FLP1 DNA fragment 3: Up to TDH3p-yEmRFP-URA3.
  • red fluorescent protein expressing gene fragment into the genome of a required mutant strain (RAK2359) of K7 strain 2-1.
  • Preparation of DNA fragment by PCR For the purpose of incorporating the red fluorescent protein yEmRFP gene into the genome of the K7 requirement mutant (RAK2359), PCR was performed using the template and primers shown in Table 5 below.
  • FIG. 2 A map of the plasmid YCp21477 contained in the strain YCp (K7) (RAK21477) is shown in FIG. In FIG. 2, each abbreviation is as follows.
  • EcoliOri replication origin of E.coli plasmid
  • MCS multicloning site
  • TDH3p constant high expression promoter
  • yEmRFP red fluorescent protein yEmRFP gene
  • URA3 uracil Requirement complementary gene
  • CEN6 / ARSH4 Centromere 6 / autonomous replication origin H4
  • KanMX kanamycin resistance drug selection marker gene
  • KanMX-334 primer of SEQ ID NO: 9
  • URA3 + 771c primer of SEQ ID NO: 10
  • KanMX + 200c SEQ ID NO: SEQ ID NO: 11 primer
  • ScURA3 + 881 SEQ ID NO: 12 primer
  • DNA fragment 1 slightly before the start of the KanMX arrow from the middle of the arrow to the middle of the KanMX-CEN6 / ARSH4-URA3
  • DNA fragment 2 from the middle of the KanMX arrow to the front of the KmARS7-E.coli ori-TDH3p Until ScURA3 + 881 (30)
  • DNA fragment 3 TDH3p-yEmRFP-URA3 halfway through the arrow.
  • red fluorescent protein expression YEp plasmid (YEpGAP-Cherry) is stably required K7 mutant
  • PCR was performed using the templates and primers shown in Table 7 below for the purpose of retaining the YHpHIS3 plasmid containing the entire 2 ⁇ m plasmid in the K7 requirement mutant (RAK2359).
  • PCR and fragments were introduced into RAK2359 strain, and instead of uracil-deficient (-U) agar medium, histidine-deficient (-H) agar medium (0.17% 7Yeast Nitrogen Base, 0.5% ammonium sulfate, Transformant YHpHIS3 (2% glucose, 0.0024% adenine sulfate, 0.2% L-Leucine, 0.1% L-Lysine HCl, 0.1% L-Methionine, 0.1% L-Tryptophan, 0.1% Uracil, 2% agar) K7) was obtained.
  • uracil-deficient (-U) agar medium histidine-deficient (-H) agar medium (0.17% 7Yeast Nitrogen Base, 0.5% ammonium sulfate, Transformant YHpHIS3 (2% glucose, 0.0024% adenine sulfate, 0.2% L-Leucine, 0.1% L-Lysine HCl, 0.
  • PCR was performed using the templates and primers shown in Table 8 below.
  • FIG. 3 The map of plasmid YEpGAP-Cherry is shown in FIG. In FIG. 3, each abbreviation is as follows.
  • TDH3p constant high expression promoter
  • yEmRFP red fluorescent protein yEmRFP gene
  • URA3 uracil-requiring complementary gene
  • 2 ⁇ micro ori origin of 2 ⁇ m plasmid replication
  • AmpR ampicillin resistance selection marker gene
  • E.coli ori E.coli Plasmid replication origin
  • DNA fragment 1 From the beginning of the arrow of TDH3p to the middle of yEmRFP-URA3
  • DNA fragment 2 From the middle of URA3 to the middle of 2micro ori-AmpR-E.coli ori-TDH3p.
  • the transgenic yeast obtained in Sections 1 to 5 was made a single colony on YPD agar medium (1% yeast extract, 2% polypeptone, 2% glucose, 2% agar), and randomly Three selected single colonies were measured for red fluorescence, and the average value was determined.
  • the transgenic yeast was inoculated into YPD medium (1% yeast extract, 2% polypeptone, 2% glucose) placed in 1 mL per well of a 24 well plate, followed by shaking culture at 30 ° C. for 24 hours. Dilute the culture solution so that OD650 is 0.16-0.26, dispense 100 ⁇ L each into a 96-well plate, and use a 96-well photometer Synergy (Biotek) to measure 650 nm (turbidity due to bacterial cells) and 588-613 nm (red). It was measured.
  • YPD medium 1% yeast extract, 2% polypeptone, 2% glucose

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Abstract

本発明は、酵母においてタンパク質を安定して高発現させる方法を提供することを目的とし、具体的には、2μmプラスミドを保持していない酵母において2μmプラスミドを再構成した酵母形質転換体を培養する工程を含み、前記再構成した2μmプラスミドは目的タンパク質をコードする遺伝子を含有する、タンパク質の生産方法に関する。

Description

酵母でタンパク質を過剰発現させる方法
　本発明は、例えば、酵母でタンパク質を過剰発現させることによりタンパク質を生産する方法に関する。
　これまでに酵母宿主による遺伝子工学的なタンパク質の高発現は、様々な方法で行われてきた。例えば、高発現プロモーターの開発や、プラスミドベクターの開発等が挙げられる。
　特に、高発現における多コピープラスミドの影響は強く、episomalプラスミド、又は、YEpプラスミドと呼ばれるプラスミド群は、高い発現を示してきた(非特許文献１)。しかしながら、プラスミドは、不安定で、宿主から一定の割合で失われるので、代わりの方法として、染色体へ挿入して発現させることもよく行われる。しかしながら、染色体への挿入は、方法が煩雑であり、またコピー数が高く、さらに安定性の高い発現方法が求められている。
　ところで、YEpプラスミドは、ほとんどの酵母が自然状態で保持している2μm(2マイクロメーター)プラスミド(非特許文献２)の複製機構を利用し、その複製起点(2μm origin)の部分だけをプラスミドに組み込んだものである。これは、細胞内で多コピー化し、維持される(YEpプラスミドは2μmプラスミドを保持する株でないと安定に保持されない)ので頻繁に利用されている(非特許文献３)。特に、選択マーカー遺伝子の発現量を、プロモーター領域を削除することで減らした場合、高いコピー数にならない限り選択増殖ができないので、高コピー数が維持できることが知られている(leu2-dマーカー；非特許文献４)。しかしながら、この場合、選択能を与えて増殖させる必要があるので、培地として選択培地を使用することとなり、実際には増殖が遅くなる。また、YEpプラスミドの安定性は完全ではなく、ある程度の頻度で酵母細胞から抜けてしまうので、安定性が十分とは言えない(非特許文献５)。
Jane C. Schneider, Methods in Enzymology, 1991年, Vol. 194, pp. 373-388 Futcher AB, Yeast, 1988年, Vol. 4, No. 1, pp. 27-40 Chen Y, FEMS Yeast Res., 2012年, Vol. 12, No. 5, pp. 598-607 Erhart E, J Bacteriol., 1983年, Vol. 156, No. 2, pp. 625-35 Schwartz LS, Biotechnol Bioeng., 1988年, Vol. 32, No. 6, pp. 733-40
　本発明は、上述した実情に鑑み、酵母においてタンパク質を安定して高発現させる方法を提供することを目的とする。
　上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、2μmプラスミドを保持していない酵母細胞(例えば、協会7号酵母：K7株)に、目的タンパク質をコードする遺伝子を含有する2μmプラスミド全体を再構成するようにその断片を使って形質転換することで、当該形質転換体が非常に高く、且つ安定した目的タンパク質の発現を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下を包含する。
（１）2μmプラスミドを保持していない酵母において2μmプラスミドを再構成した酵母形質転換体を培養する工程を含み、前記再構成した2μmプラスミドは目的タンパク質をコードする遺伝子を含有する、タンパク質の生産方法。
（２）2μmプラスミドを保持していない酵母が協会7号酵母又はその誘導株である、（１）記載の方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2016-242650号の開示内容を包含する。
　本発明によれば、酵母において目的のタンパク質を安定して高発現させることができ、当該タンパク質の生産効率を大幅に向上させることができる。
プラスミドYHp17606のマップである。 プラスミドYCp21477のマップである。 プラスミドYEpGAP-Cherryのマップである。
　本発明に係るタンパク質の生産方法(以下、「本方法」と称する)は、2μmプラスミドを保持していない酵母において2μmプラスミドを再構成した酵母形質転換体を培養する工程を含む。当該再構成した2μmプラスミドは目的タンパク質をコードする遺伝子を含有し、酵母形質転換体の培養により、再構成した2μmプラスミドから目的タンパク質をコードする遺伝子が安定して高発現され、目的タンパク質を生産することができる。
　2μmプラスミドを保持していない酵母(以下、「cir0株」と称する)としては、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)に属する酵母株である協会7号酵母又はその誘導株(変異株を含む：例えば、RAK2359株(a/a ura3Δ::LYS4/ura3Δ::LYS4 his3/his3 lys4/lys4, Ano et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 73, 633, 2009)、BY1847株（（SH1847, NA87-11A-H [cir0] ）MATα ho trp1 his3 leu2-3,112 pho3-1 pho5-1 can1[cir0]）、並びにBY21887株（（YAT285, R-2-5D 1-36）MATα ade1 leu2 [cir0] cyh）、およびその他多くの清酒酵母、泡盛酵母（Nakazato et al., Jour. Agri. Sci. Tokyo Univ. of Agric., 47（3）,226-230, 2002）等が挙げられる。協会7号酵母(清酒酵母 協会7号)は、例えば日本醸造協会から市販されている。
　また、目的タンパク質をコードする遺伝子としては、いかなるタンパク質やペプチドをコードする遺伝子であってもよい。
　本方法では、先ずcir0株において2μmプラスミドを再構成した酵母形質転換体を準備する。例えば、2μmプラスミド全体及び目的タンパク質をコードする遺伝子を、1つ若しくは複数の(例えば、3つ若しくはそれ以上の)断片又は環状プラスミドとして作製し、当該1つ若しくは複数の断片又は環状プラスミドをcir0株に導入する。目的タンパク質をコードする遺伝子は、制御配列(例えば、プロモーター、ターミネーター等)に機能的に連結されていることが好ましい。
　また、上述した断片又は環状プラスミドを導入する方法としては、酵母の形質転換方法として知られている従来公知のいかなる手法をも適用することができる。具体的には、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
　次いで、本方法では、再構成した2μmプラスミド(以下、「YHp(yeast hyper-copy plasmid)」と称する)を有する酵母形質転換体を、従来公知の酵母の培養条件下で培養する。例えば、培地としてYPD培地(1％酵母エキス、2％ポリペプトン、2％グルコース)を用いて、27～33℃及びpH5～7下で振盪培養又は静置培養を行う。
　培養後、得られた培養物をそのまま目的タンパク質として使用してもよく、あるいは培養物から目的タンパク質を単離又は精製してもよい。
　以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
　以下の実施例において使用するプライマー、酵母(サッカロミセス・セレビシエ)の菌株及びプラスミドをそれぞれ表１～３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
１．赤色蛍光タンパク質発現YHpプラスミドの作製とK7株の要求性変異株（RAK2359）への導入
１－１．PCRによるDNAフラグメントの作製
　2μmプラスミドに赤色蛍光タンパク質yEmRFP遺伝子を組み込む目的で、以下の表４に示すテンプレート及びプライマーを用いてPCRを行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　上記のPCR(PrimeSTAR GXL(TAKARA-bio社製)、98℃ 10sec、60℃ 15sec、68℃ 2min、30サイクル)により、3つのフラグメントを増幅し、この3つのフラグメントを協会7号酵母(K7酵母)の要求性変異株RAK2359(a/a ura3Δ::LYS4/ura3Δ::LYS4 his3/his3 lys4/lys4, Ano et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 73, 633, 2009)に以下の方法で導入した。
１－２．遺伝子導入
　2 mLのYPD培地(1％酵母エキス、2％ポリペプトン、2％グルコース)にRAK2359株を植菌し、30℃で一晩振盪培養した(前培養)。
　前培養液1mLをYPD培地9mLに稙菌し、30℃で5h振盪培養した(本培養)。
　本培養液10mL全量を3000rpmで1分間遠心して上清を捨て、滅菌水10mLで洗浄した。次いで、酵母菌を滅菌水200μLに懸濁後、形質転換液（60％ポリエチレングリコール3350：2400μL、4M酢酸リチウム：100μL、10mg/mLキャリアDNA：200μL)を500μL加えてコンピテントセルとした。
　コンピテントセル100μLにDNAフラグメント各2μLを加えて十分に混合し、42℃、30分インキュベートした。インキュベート後、酵母を含む形質転換液を全量ウラシル欠損（－U）寒天培地(0.17％ Yeast Nitrogen Base、0.5％硫酸アンモニウム、2％グルコース、0.0024％ adenine sulfate、0.1％ L-Histidine HCl、0.2％ L-Leucine、0.1％ L-Lysine HCl、0.1％L-Methionine、0.1％ L-Tryptophan、2％寒天)に塗布した。30℃で2～3日培養し、形質転換体YHp(K7)(RAK17606)を得た。
　YHp(K7)(RAK17606)株が含有するプラスミドYHp17606のマップを図１に示す。図１において、各略語は以下の通りである。FLP1：部位特異的組換え酵素、repeat_region：リピート配列領域、REP1：複製遺伝子１、Dprotein：RAF1遺伝子、TDH3p:恒常的高発現プロモーター、yEmRFP：赤色蛍光タンパク質yEmRFP遺伝子、URA3：ウラシル要求性相補遺伝子、REP2：複製遺伝子２、D+546c：配列番号１のプライマー、REP2+30c：配列番号２のプライマー、FLP1+30c：配列番号３のプライマー、D+547：配列番号４のプライマー、D+547(+40)c-YEp：配列番号５のプライマー、D+546(-40)-TDH3：配列番号６のプライマー。また、表４に示す各DNAフラグメントは、プラスミドYHp17606における以下の領域に相当する。DNAフラグメント1：REP2の開始部分からFLP1-repeat_region-REP1-Dprotein (D+546c)まで、DNAフラグメント2：URA3の開始部分（D+547）からrepeat_region-REP2-FLP1の開始部分を含むところまで、DNAフラグメント3：TDH3p-yEmRFP-URA3まで。
２．赤色蛍光タンパク質発現遺伝子断片のK7株の要求性変異株（RAK2359）のゲノムへの導入
２－１．PCRによるDNAフラグメントの作製
　K7の要求性変異株(RAK2359)のゲノムに赤色蛍光タンパク質yEmRFP遺伝子を組み込む目的で、以下の表５に示すテンプレート及びプライマーを用いてPCRを行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　上記第１節と同様の方法でPCR及びフラグメントのRAK2359株への導入を行い、形質転換体Genome(K7)を得た。
３．赤色蛍光タンパク質発現YCpプラスミドの作製とK7株の要求性変異株（RAK2359）への導入
３－１．PCRによるDNAフラグメントの作製
　シングルコピープラスミドであるが安定に保持されるYCpプラスミドに赤色蛍光タンパク質yEmRFP遺伝子を組み込む目的で、以下の表６に示すテンプレート及びプライマーを用いてPCRを行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　第１節と同様の方法でPCR及びフラグメントのRAK2359株への導入を行い、形質転換体YCp(K7)（RAK21477）を得た。
　YCp(K7)（RAK21477）株が含有するプラスミドYCp21477のマップを図２に示す。図２において、各略語は以下の通りである。KmARS7(201-260)：酵母Kluyveromyces marxianusの自律複製起点、EcoliOri：E.coliプラスミドの複製起点、MCS：マルチクローニングサイト、TDH3p:恒常的高発現プロモーター、yEmRFP：赤色蛍光タンパク質yEmRFP遺伝子、URA3：ウラシル要求性相補遺伝子、CEN6/ARSH4：セントロメア6/自律複製起点H4、KanMX：カナマイシン耐性薬剤選択マーカー遺伝子、KanMX-334：配列番号９のプライマー、URA3+771c：配列番号１０のプライマー、KanMX+200c：配列番号１１のプライマー、ScURA3+881(30)：配列番号１２のプライマー、pKS716URA3+881(+31)-TDH3-698：配列番号１３のプライマー、URA3+650：配列番号１４のプライマー。また、表６に示す各DNAフラグメントは、プラスミドYCp21477における以下の領域に相当する。DNAフラグメント1：KanMXの矢印開始部分の少し手前から矢印方向へKanMX-CEN6/ARSH4-URA3の矢印途中まで、DNAフラグメント2：KanMXの矢印途中からKmARS7-E.coli ori-TDH3pの矢印開始部分手前のScURA3+881(30)まで、DNAフラグメント3：TDH3p-yEmRFP-URA3の矢印途中まで。
４．赤色蛍光タンパク質発現YEpプラスミド(YEpGAP-Cherry)の作製とK7株の要求性変異株（RAK2359）への導入
　先ず、赤色蛍光タンパク質発現YEpプラスミド(YEpGAP-Cherry)を安定的にK7の要求性変異株（RAK2359）に保持させるために、2μmプラスミド全体を含むYHpHIS3プラスミドをK7の要求性変異株（RAK2359）に保持させる目的で以下の表７に示すテンプレート及びプライマーを用いてPCRを行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　第１節と同様の方法でPCR及びフラグメントのRAK2359株への導入を行い、ウラシル欠損（－U）寒天培地の代わりにヒスチジン欠損（－H）寒天培地(0.17％ Yeast Nitrogen Base、0.5％硫酸アンモニウム、2％グルコース、0.0024％ adenine sulfate、0.2％ L-Leucine、0.1％ L-Lysine HCl、0.1％L-Methionine、0.1％ L-Tryptophan、0.1％ Uracil、2％寒天)を用いて形質転換体YHpHIS3(K7)を得た。
　次に、YEpGAP-Cherryを組み込む目的で、以下の表８に示すテンプレート及びプライマーを用いてPCRを行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　第１節と同様の方法でPCR及びフラグメントのYHpHIS3(K7)株への導入を行い、形質転換体YEp with YHp (K7)を得た。
　プラスミドYEpGAP-Cherryのマップを図３に示す。図３において、各略語は以下の通りである。TDH3p:恒常的高発現プロモーター、yEmRFP：赤色蛍光タンパク質yEmRFP遺伝子、URA3：ウラシル要求性相補遺伝子、2 micro ori：2μmプラスミドの複製起点、AmpR：アンピシリン耐性選択マーカー遺伝子、E.coli ori：E.coliプラスミドの複製起点、TDH3-698(50)：配列番号１７のプライマー、URA3+650：配列番号１４のプライマー、URA3+771c：配列番号１０のプライマー、TDH3-545c：配列番号１８のプライマー。また、表８に示す各DNAフラグメントは、プラスミドYEpGAP-Cherryにおける以下の領域に相当する。DNAフラグメント1：TDH3pの矢印開始部分からyEmRFP-URA3の途中まで、DNAフラグメント2：URA3の途中から2micro ori-AmpR-E.coli ori-TDH3pの途中まで。
５．赤色蛍光タンパク質発現YEpプラスミド(YEpGAP-Cherry)の作製とBY4741株への導入
　第４節で作製したプラスミドYEpGAP-Cherryのフラグメントを、第１節と同様の方法でBY4741株(2μmプラスミドを保持する株、Brachmann, et al., Yeast, 14, 115, 1998)へ導入し、形質転換体YEpGAP-Cherry(BY4741)を得た。
６．作製した株の評価
　第１節～第５節で得られた遺伝子導入酵母をYPD寒天培地(1％酵母エキス、2％ポリペプトン、2％グルコース、2％寒天)上でシングルコロニーにして、ランダムに選んだ3個のシングルコロニーを赤色蛍光測定し、平均値を求めた。
　24wellプレートの1well当たり1mL入れたYPD培地(1％酵母エキス、2％ポリペプトン、2％グルコース)に遺伝子導入酵母を植菌し、30℃で24時間振盪培養を行った。培養液をOD650が0.16-0.26になるように希釈し、96wellプレートに100μLずつ分注し、650nm(菌体による濁度)と588-613nm(赤色)を96well光度計Synergy(Biotek社製)で測定した。
　結果を表９に示す。
　表９から明らかなように、YHpプラスミドを用いた場合はゲノムに直接導入した場合の50倍以上、YEpプラスミドを用いた場合の5～7倍の発現を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (2)

  1. 　2μmプラスミドを保持していない酵母において2μmプラスミドを再構成した酵母形質転換体を培養する工程を含み、前記再構成した2μmプラスミドは目的タンパク質をコードする遺伝子を含有する、タンパク質の生産方法。
  2. 　2μmプラスミドを保持していない酵母が協会7号酵母又はその誘導株である、請求項１記載の方法。
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