JPH01503275A - 酵母ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 酵母ベクタ一 本発明は、酵母、特に５ａｃｃｈａｒｏｚｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞 に取込まれ、次いで遺伝的に継承されて該ＤＮＡの発現が行なわれる。形質転換 についての最初の報告は１９７０年代の後半に行なわれ、その時の形質転換は、 酵母の細胞壁を酵素の作用によって除いてプロトプラストを得、これにＤＮＡを 加える方法を用いるものであった（　Ｈｉｎｎｅｎ　ｅｔａｌ−＋　１９７８　 ；　Ｂｅｇｇｓ、　１９７８　）。

最近ではインタクト酵母細胞を用いた形質転換が証明されている（　Ｈｉｓａｃ 　ｅｔａｌ、＋　１９８３　）。

酵母は適当なプラスミドを用いて形質転換することができ、この目的のために通 常、”シャトルベクター”として構築されたシラスミドが使用されておシ、この シャトルベクターはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌユあるいは酵母のいずれに おいても増殖することができる（　Ｈｌｎｎｅ。

ｅｔａｌ、、１９７８　；　Ｂｅｇｇｓ、　１９７８　；　５ｔｒｕｈｌ、ｅｔ 　ａｌ、。

１９７９）。

ｐＢＲ５２２（Ｂｏｌｉｖａｒ、　１９７８　）などのＥ、ｃＯ１ｉグラスミド ＤＮＡ配列がＥ、ｃＯ１ｉ中に取込まれることによってＥ、　’　ｃｏｌｉ中で のベクターＤＮＡの量産が促進され、その結果酵母の形質転換を効率良く行なう ことができる。

酵母形質転換に一般的に使用されているプラスミドベクターは次の２つに大別さ れる。即ち、（Ｉ）ＤＮＡ複製オリジンを有しているために、クロモシームＤＮ Ａに依存することなく自己を維持することが出来る複製ベクター；及びＯ）クロ モシームＤＮＡと組換えを起こし、宿主細胞中の組換えＤＮＡとして複製し自己 を維持するインチブレイトベクターの２つである。複製ベクターは更に、（ａ） 酵母の同種２μｍプラスミドから得られＧＮＡ複製オリジンを含む２μｍ由来プ ラスミドベクター；（ｂ）酵母のクロモシームＤＮＡから得られる見掛けの複製 オリジンを含む自己複製ベクター；及び（ｃ）上記のＤＮＡ複製オリジンの１つ と更にセントロメアを含むことが知られている酵母クロモシームＤＮＡ配列を有 するセントロメアプラスミド（ＯＥＭ）に分けられる。

上記したベクターで有効に酵母を形質転換するためには、組換えＤＮＡを保持す る形質転換体を同定して選択することが必要である。この選択は、ベクターＤＮ Ａ内に識別可能な表現型を有する遺伝子を導入することによって達成される。実 験室で酵母を形質転換するのに使用するベクターの場合には、ＬＥＵ　２．　Ｕ ＲＡ　３゜ＴＲＰ　１（Ｈｉｏｃｅｎ　ｅｚ　ａｌ−＋　１９７８　；　Ｂｅｇ ｇｓ　、１９７８；Ｇｅｒｂａｕｄｅｉ　ａｌ、＋　１９７９　）などの原栄養 性遺伝子が酵母及び他の工業用途に用いられる酵母はしばしば倍数体であるため 栄養要求性を示さず、従って強力な選択遺伝子に基づいた選択系を利用すること が必要である。この点に関連して、各種の耐性を発揮する遺伝子を保持した２μ ｍ由来複製プラスミドベクターが報告　。

されている。即ち、（ｉ）　（）　４１８　（Ｊｉｚｉｑｅｚ　ｅｔａｌ、。

１９８０　；　Ｗｅｂｓｚｅｒ　ｅｔａｌ、＋　１９８３　）、ノ１イグＯｆイ シｙＢ　（Ｇｒｉｚ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３　）、クロラムフェニコール（ Ｃｏｂｅ：１ｅｔ　ａｌ−＊、　１９８０　；　Ｈａｄｆｉｅｌｄ　ｅｚａｌ、 、１９８６）などの抗生物質に対して；及び（１）除草剤、Ｘ　／ｌ／　ホ７１ 　ツ０７メチ／ｌ／　（Ｆａｌｃｏ　ｅｔａｌ、、　１９８５）、コンパクチン （ＲｉＱｅ　ｅｔａｌ、、　１９８３　）、銅（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ　ｅｔａｌ Ｂ　１９８５　）などの他の毒性物質に対して耐性を発揮する遺伝子を用いた例 がある。

酵母中で組換え遺伝子が安定に継承されるか否かは、形質転換に用いた酵母ベク ターのタイプに依っている。

前記した２つのタイプのベクターのうちで安定なベクターはインチブレイトベク ターである。酵母のインチブレイト形質転換の原理及び実際については文献ＣＢ ｏｔｓＺｅｉｎ　＆　Ｄａｖｘｓ　ｙ　１　９　８　２　；　ＷユＣ””’　ｅ ｔ　ａユ　、。

１　９　８　３　；　Ｏｒｒ　−Ｗｅａｖｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　ｉ　９　８３ 　；ＲＯ７ｈＳｔ６ｉＪ１９８３）に記載されている。一般にインチブレイト形 質転換は比較的その効率が低く、閉環状インチグレイドブラスミドの場合にはＤ ＮＡ　１μｇ当シ約１−１０個の形質転換体が得られることが報告されている（ 　三１ｎｃｅｃ　ｅｔ　ａｌＢ　１　９　７　９　；　Ｒｉｃｋｓ　ｅ−ｖ　ａ ｌ、、　１９７９　）。

しかしながら、酵母クロモシームＤＮＡと相同性を有するフリー末端を持つ線状 ＤＮＡは高い効率（１００−１０００倍）で酵母を形質転換し、形質転換に用い たＤＮＡは一般に開裂部位に対して相同性を有する配列中に組込まれる（Ｏｒｒ 　−Ｗｅａｖｅｒ　ｅｔａｌ、、１９８１　）　。

従って、適当な制限酵素を用いてベクターＤＮＡを開裂することによって、形質 転換の効率を高め、クロモシームのインチブレイト部位を定めることが可能であ る。

形質転換の効率が十分に高く、かつクロモシーム内に組込まれろタービン）　Ｄ ＮＡ配列が、宿主細胞の代謝に必須の遺伝子内に組込まれない場合には、発酵用 酵母の遺伝子的モディフィケーションにインチブレイト形質転換を用いることが できる。最近、発酵用酵母に用いるインチブレイト酵母ベクターについて報告さ れている（　Ｙｏｃａｎ、　１９８５　）。

インチブレイトベクターは選択を受けずに遺伝的に高度に安定に継承されるが、 複製ベクターはこれとは相違して不安定である。遺伝的に継承される安定性は用 いる複製ベクターのタイプに依る。ＡＰ、Ｓプラスミドは高コピー数で存在しく 細胞１個当シ約２０−５０コピー）、よシ安定した傾向にあるが、１世代当シ約 １０％以上の頻度で失なわれる（　Ｋｉｋｕｃｈｉ、　１９８５’）。

しかし々から、ＡＲＳプラスミドの安定性はセントロメアが結合することによっ て上昇する。セントロメアプラスミドは細胞１個当り１又２コピーの割合いで存 在しく　Ｃ１ａｒ’ｘｅ　＆　Ｃａｒｂｏｎ、　１９８０　）、１世代当りわず かに１チが失なわれるにすぎない（Ｗａｌｍｓｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８３）／。キメラ２μｍ由来プラスミドは、宿主の株及び該プラスミド中に 存在する２μｍ　ＤＮＡ配列に依って名種の程度の遺伝的安定性を示す。

２μｍシラスミドは細胞の核に存在していることが知られている（　Ｎｅ１ｓｏ ｎ　＆　ＦａＣ１ｇｆｌａｆｌ＋　１９７９　；Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ　＆　Ｈ ａｈｏｅ、１　９　７　９　；　Ｓｅｌｉｇｙ　ｅｔ　ａｌ、＋１　９　８　０ 　；　Ｔａｋｅｏ　ｅｔ　ａｌ−＋　１　９　８　０　；　Ｓｉｇｕｒｄｓｏａ 　ｅｔａｌ、、１９８１）が、メンデルの方法のように遺伝されない（ＬｉＶｉ （ＩｇＳｔＯＣＬ　１９７７　）。２μｍシラスミドを持たない細胞（ｃｉｒｏ 　）が、細胞１当り２μｍプラスミドの平均コピー数が５０である半数体酵母集 団から１世代当すｏ、ｏ　ｏ　ｉ％″″０．０１％の割合いで発生することが示 されている（　Ｆｕｔｃｈｅｒ　＆　ＣＯｘ＋　１９８３）。

このような低レベルの遺伝的不安定性の原因を説明するものとして、２μｍシラ スミドは通常の成長条件下で細胞に対して何んらの利点を有していないことが考 えられる（　ｐｒｏａｃｈ、　１９８１　；　Ｆｕｔｃｈｅｒ　＆　Ｃｏｘ＋　 １９８３；Ｓｉｇｕｒｄｓｏｎ　８ｔａｌ−＋　１９８１　）　ｏしかしながら 、２μｍプラスミドを有している株について２μｍプラスミドが成長速度に対し てわずかながら効果を及ぼしていることが報告されている（　Ｗａｌｚｓｌｅｙ 　ｅｔ　ａユ、、１９８３）。

Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの各種の株を分析した所、発酵用酵母（Ｔｕｂｂ、 １　９８０　；Ａｉｇｌｅ　ｅＺａｌ−＋　１９８４　：Ｈｉｏｃｈｌｉｆｆｅ 　＆　Ｄａｕｂｎｅ７＋　１９８６　）などの酵母のほとんどの株に２μｍプラ スミドが存在していたことが報告されている（　Ｃ１ａｒｋ　−Ｗａｌｋｅｒ　 ＆　Ｍｉｋｌｏｓ、　１９７４　）。

従って、２μｍシラスミドは常に存在しており、このことが本質的に高度の遺伝 的安定性を有していることを示していると考えられている。

２μｍプラスミドについての遺伝子分析及び分子分析の結果、２μｍプラスミド の複製及び安定性に関して多くの情報が得られている（　Ｖｏｌｋｅｒｚ　＆　 Ｂｒｏａｃｈ。

１９８７）。本質的にはこのプラスミドは６３１８塩基対の環状ＤＮＡ分子から なっている（　Ｈａｒｔｌｅｙ　＆Ｄｏｎｅｌｓｏｎｙ　１９８０　）　ｏそし てこのプラスミドはユニークな二方向性のＤＮＡ複製オリジンを有しておシ（Ｎ ｅｗｌｏｃ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８１　）、これがすべての２μｍ由来ベクタ ーの必須成分となっている。２μｍプラスミドは４つの遺伝子、即ちＲＥＰ　１ 　、　ＲＥＰ　２．　ＲＥＰ　５及びＦＬＰを含んでおり、これらが細胞１個当 シのコピー数を高く安定に維持するために必要とされている。

ＲＥＰ　ｉとＰ、ＥＰ　２遺伝子はトランス作用蛋白質をコードしておシ、この 蛋白質は、ＲＥＰり遺伝子座と相互に作用して協力して機能を発揮し、細胞分裂 の際に２μｍプラスミドの分割が安定に行なわれるのを可能ならしめていると考 えられている（　Ｖｏｌｋｅｒｔ　＆　Ｂｒｏａｃ！：、１９８７）。

この点に関して、ＰＥＰ′５遺伝子は、２μｍプラスミドの安定な分離を行なう シス作用遺伝子座として作用しておシ、り；モゾームセントロメアと類似の表現 型を有している（　Ｊａｙａｒａｐ　ｅ＝、　ａｌ−＋　１９８５　；　Ｋユｋ ｕｃ′！：、ｉ。

１９８３　”）。２μｍプラスミドの重要な特徴は、２つの逆方向反復ＤＮＡ配 列（それぞれ５５９塩基対）が存在することであシ、この配列によって環状分子 が２つのユニーク領域に分離されている。逆方向反復ＤＮＡ配列の間で分子内組 換えが起こシ、一方のユニーク領域が他のユニーク領域に対して逆方向となり、 Ａ及びＢと言われるプラスミドの構造異性体が生じてｉｎ　ｖｉｖ。

で２つの異性体を有する混合集団が産生される（Ｂｅｇｇｓ。

１９７８）。２つの逆方向反復配列間での組換えは、ＦＬＰと言われる遺伝子の 産生蛋白質によって仲介され、ＦＬＰ蛋白質が逆方向反復領域内での高頻度の組 換えを仲介することができる。この部位特異的組換えによって、プラスミドコピ ー数の増幅が実現されていると考えられている（　Ｆｕｔｃｈｅｒ＋　１９８６ 　；ＶＯｌｋｅｒｔ　＆Ｂｒｏａｃｈ＋１９８６　；　５ｏｒＤｅｔａｌ−＋　 １９８８　；　Ｍｕｒｒａｙ　ｅｔａｌ、。

１９８７）。

それぞれの逆方向反復配列は、６つのＤＮＡ反復配列サブユニット（第６図に三 角形で示されている）を含んでおシ、そのうちの２つの隣接サブユニットはお互 いに同じ方向性を有しておシ、他１つのサブユニットは逆方向であって８塩基対 結合又はスペーサー領域を介して他の２つのサブユニットのうちの１つに結合し ている。このスペーサー領域；＝ユニークＸビａ１部位を有しておシ、ＦＬＰ遺 伝子の生成物を認識しそしてその生成物によってその末端が切断される。そｔに 隣接している配列は、他の逆方向反復配列１で対応する配列に対して相同性を有 してお９、従って末端が切断された後に正確に組換えが行なわれる。Ａｎｄｒｅ ｗｓらによって、８　ｂ　Ｈｐ＋スペーサー領域を含む７４塩基対の配列が暦部 位特異的組換えには最低限必要であることが見出された（　Ａｏａｒｅｖｙｓ　 ｅｔ　ａｌ、、　１９８５　）。

２μｍプラスミドの複製系に基づいた酵母ベクターは、２μｍ　７９−）スミド の複製に必須ではない領域に異種ＤＮＡ配列を挿入することによって構築される （Ｂｅｇｇｓ。

１９８１）。このようなベクターには基本的に２つのタイプがある。即ち、（１ ）全２μｍベクター及び（−）２μｍオリジンベクターである。前者の場合には 、２μｍベクターの全てを有しておシ、そこにＥ、ｃｏｌｉゾ２スミドＤＮＡな どの各種の異種配列が挿入されている。このように挿入されたプラスミドは、Ｃ ｉｒ”　（２μｍ含有）及びＣｉｒ’（２μｍ欠損）宿主のいずれにおいても、 高い遺伝的安定性を有しておシ高いコピー数で維持される。他方後者の２μｍオ リジンベクターは、通常、２μｍのＤＮＡ複製オリジンと２μｍの５９９塩基対 反復配列のシングルコピーを有する最少ＤＮＡ配列を持つのみであって、このよ うなベクターはＣｉｒ＋宿主株でしか維持できない。何故なら、安定に維持され るためには、これらのベクターは、内因性のシラスミドのＦ、ＥＰ　１及びＲＥ Ｐ　２遺伝子によってコードされる蛋白質をトランス作用蛋白質として用いる必 要があるためである。

異種遺伝子を発現して商業的に重要なポリペプチドを高レベルで産生ずることの できる遺伝子的に修正された酵母を構築する場合には、通常、高コピー数の酵母 ベクターを選択することが望ましい。２μｍ由来ベクターは発現シラスミドとし て用いるには非常に好適であることが証明されておシ、今日ではしばしば２μｍ 由来ベクターが用いられている（　Ｋｉ口ｇｓｍａｏ　ｅｔ　ａｌ・。

１９８５）。

欧州特許出ＭＡ８６３０５０５９．１（公開番号０２０１２３９ＡＩ、出肛人デ ルタ・バイオテクノロジーＬｔｄ）には、最初のビール発酵時期には異種遺伝子 の発現が起こらず、酵母の量が蓄積されその後ビールから酵母を取シ出すと異種 蛋白質の合成が誘導されろように、工業用酵母株を遺伝子的に修正して発酵用酵 母中で異種蛋白質を産生ずる方法が記載されている。

かかる方法は、強力な選択マーカーｃｕｐ　−１と修正ヒト血清蛋白質Ｎ−メチ オニルアルブミン（Ｍｅｔ　−Ｈ３Ａ　）をコードする遺伝子とを有する２μｍ 由来ベクターであって該蛋白質の発現がガラクトース誘導プロモーターによって 転与レベルで調節されているベクターで、発酵用酵母を形質転換することによっ て達成される。

上記の方法の実施期間中に、異種蛋白質の合成収量な最大にするためには次のこ とを実現するのが必要である。即ち、（１）発現される遺伝子（Ｎｅｔ−Ｈ８Ａ をコードする）の高コピー数；（Ｉ）非選択的な生育条件下において目的とする 遺伝子の遺伝的安定性が高いこと；（山）発酵用酵母に導入される組換え遺伝子 は、酵母及び該酵母のビール並びに異種蛋白質の産生能に有害な効果を与えない こと；及び（１ｖ）酵母中に存在する組換え遺伝子は、出来る限シ、目的する遺 伝子及びそれに隣接する調節遺伝子に限るべきであること、である。上記（１） は特に重要であシ、通常の発酵用酵母の生育メディウム、即ちポツプが添加され た麦芽抽出物に銅イオンなどの毒性物質を添加することは望ましくなくまた実用 的でない。銅イオンを添加する場合には、工程コストが上昇し、第１の発酵生産 物であるビールの質に有害で許容し得ない効果を与えることになる。上記（１ｖ ）に関しては、遺伝子的に修正された酵母は、組換えシラスミドのバクテリア由 来の配列部分に起因する配列などの余分なりＮＡ配列を有していないのが望まし い。

本発明者の出願であってＥＰ−Ａ−２５１７４４と１、て公開された明細書には 、目的するＤＮＡ配列を含有する相同性２μｍ７ｃ′ラスミドＤＮＡ配列の２つ のコぎ−が同じ方向性を有しているインチブレイトベクターを構築し、このベク ターで酵母を形質転換し、次いで得られる形質転換酵母から、目的とするＤＮＡ 配列が取込まれて修正された内因性２μｍプラスミドを保持する細、抱を単離す ることによって、内因性２μｍプラスミドに目的とする蛋白質又はペプチドをコ ードする二Ｎ人配列を導入して、酵ｆ３細胞を修正する方法が記載されている。

インチブレイトベクター自体は、形質転換酵母細胞中で存続できない。相同性２ μｍ７ｃラスミドフＮ人配列は、通常はそうではないが、２μｍプラスミド反復 配列のコピーであってもよい。

本発明者は、修正された２μｍシラスミドを導入することによって酵母細胞を形 質転換することのできる、上記明細書に記載された方法の変法を見出した。

本発明の方法では、使用するプラスミドベクターは、２つの同じ方向性を有して いる相同性２μｍプラスミドＤＮＡ　ＦＬＰ組換え部位の間に導入されているバ クテリア中でのベクターの増殖を可能にするＤＮＡ配列、目的とする蛋白質又は ペプチドをコードするＤＮＡ配列であって必ずしも必要ではないが好ましくは酵 母に対して異種のＤＮＡ配列、及び好ましくは選択マーカーＤＮＡ配列も含むベ クターである。本発明の２μｍ！ラスミドベクターは、ＦＬＰ組換え部位の６つ のコピーを有しておシ、その１対は同じ方向性を有しておシ、他の２対は逆の方 向性を有している。このような構成を有するプラスミドベクターで酵母を形質転 換すると、バクテリア中でのベクターの増殖を可能にするＤＮＡ配列は自然に失 われ、プラスミドベクターは、形質転換酵母の内因性２μｍｆラストと置換し得 る修正２μｍプラスミｒとなる。この種のプラスミドベクターを以後ディスイン チグレイジョンベクターという。このようなベクターで形質転換された酵母は、 目的とする遺伝子を含みバクテリアＤＮ人は含まない修正２μｍプラスミドの多 数の染色体外；−一を有しておシ、これらは非選択的生育条件下において遺伝的 に安定に継承されることが見出されている。

１９８６年秋の第１６回目の”酵母遺伝子及び分子生物学”についてのコンフエ ランスで、Ｂｒｕｓ＋：’＋ｉは、２μ−由来プラスミドの組換えによってバク テリアＤＮＡ配列が除去されることを報告したが、それは、その系がＤＮＡ分子 の構造と機能との関係を研究するのに用いることができることを示唆したにすぎ ない。本発明者らは、同様の系が、予期せぬ安定性を有する有利な発現ベクター の構築に用いることができることを見出した。

本明細書で用いる”ＦＬＰ組換え部位”とは、ＦＬＰ遺伝子生産物との相互作用 の結果、組換えが可能な部位のいずれをも意味する。もしＡｎｄｒｅｗらの知見 （１９８５）が正しいならば、ＦＬＰ組換え部位は、通常波らによって同定され た７　Ａ　ｂ、ｐ配列をその最少配列として有している。実際に、全反復配列の ５９９塩基対以上を含んでいたとしても何んらの特徴もない。

本発明の２μｍ由来ディスインチグレイジョンベクターは、実験室及び工業用の いずれの酵母も形質転換できることが見出された。このベクターは、細胞１個当 り高コピー数で維持され且つ非常に高い遺伝的安定性を有している。更には、こ れまで報告されている他の２μｍ由来ベクターと異なって、本発明のディスイン チグレイジョンベクターは、酵母が形質転換される際に、バクテリアプラスミド ＤＮＡ配列が自然に除去されるように構築されている。かくして、２μｍプラス ミドに導入された目的とする遺伝子が、非選択的生育条件においても余分なバク テリアプラスミドＤＮＡ配列が存在することなく細胞１当りのコピー数が高い状 態で維持される発酵用酵母の遺伝子的修正法が構築できる。このようなベクター を用いて遺伝子的に修正された発酵用酵母を構築することにより、目的とする遺 伝子のみが発酵用酵母の後の世代まで安定に維持てれ、これによって、付加的な りＮＡ配列が酵母の挙動及び／又は酵母によって産生されるビールの香り並びに 特質に与える有害な効果を除去できる。

実際には、目的とする遺伝子はいずれの組換え遺伝子であってもよく、また酵母 に対して異種のものでも同種のものでもよい。本発明のディスインチグレイジョ ンベクターは例えば、発酵用酵母にＭｅｔ　−Ｈ３−Ａ遺伝書に記載された方法 に従ってホスホグリセレートキナーゼプロモーター（ＰＧＫ　）により、あるい は例えばＥＰ−Ａ−２０１２３９号明細書に記載されたＧＡＬｌ　０／　ＣＹＣ ｉハイブリッドプロモーターあるいはＥＰ−Ａ−２５８０６７号明細書に記載さ れた（）ＡＬ　／　Ｐ（）Ｋプロモーターなどの調節酵母プロモーターによって 発現される。

本発明の系によって安定に維持される付加的な遺伝子は、例えば、発酵用酵母で の細胞外グルコアミラーゼ酵素の産生を規定するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　 ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓのＤＥＸ　１遺伝子９発酵用酵母でのエンド−１，２− １，４−β−グルカナーゼの産生を規定するＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉ ｓのβ−グルカナーゼ遺伝子（）：１ｎｃｈｌｉｆｆ　＆　Ｂｏｘ、１９８５） などである。このような遺伝子は、遺伝子の発現レベルをコントロールし及び／ 又は遺伝子によって産生される蛋白質が発酵用酵母から分泌されるように、最初 に遺伝子的に修正することができる。

本発明の新しいディスインチグレイジョンベクターは、ＥＰ−Ａ−２０１２１９ 号明細書に記載された工程に用いるのが特に有利である。なぜなら、この工程に よれば、目的とする遺伝子はビールの発酵の間は発現てれずまた酵母の通常の生 育条件下でも発現されず、発酵後の工程で発現されるように調節されているため である。従って、目的とする遺伝子の高レベル発現の時期と、細胞増殖によって 酵母のバイオマスが合成てれる時期とが分離されており、これによって、プラス ミド安定性に及ぼす遺伝子発現の悪影響を最少にすることができる。

本発明のベクターは、（１）バクテリア宿主中での当該ベクターの増殖に必要な バクテリアプラスミドＤＮＡ配列；（Ｕ）エキストラ２μｍ　ＦＬＰ組換え部位 ：　（ｉｉｉ）目的とする蛋白質又はペプチドをコードするＤＮＡ配列；及びＱ ｖ）酵母形質転換体用の選択マーカーＤＮＡ配列七有する完全２μｍプラスミド を含むディスインチグレイジョンベクター（前記定義の通り）であって、２μｍ プラスミドの２つの逆方同反復配列の１つの配列内の制限酵素部位に該バクテリ アプラスミドＤＮＡ配列が存在し且つ該エキストラ２μｒｎ　ＦＬＰ組換え部位 が作成されていて、該逆方向反復配列の１つの配列内の内因性ＦＬＰ組換え部位 に対して同じ方向性を有して該エキストラＦＬＰ組換え部位が存在しており、該 エキストラＦＬＰ組換え部位と該逆方向反復配列の１つの配列内の内因性ＦＬＰ 組換え部位との間に該バクテリアプラスミドＤＮＡ配列がはさまれているディス インチグレイジョンベクターが好ましい。

このような本発明の好ましいディスインチグレイジョンベクターは、１つもしく はそれ以上のバクテリアプラスミドＤＮＡ配列と、２μｍプラスミドから得られ る７４塩基対ＦＬＰ組換え部位のエキストラコピーとが挿入された完全２μｍプ ラスミドからなる。更には、酵母形５転換体用の選択１−カー例えばＣＵＰ　− １と共に線状に並んだ目的とする遺伝子が、２μｍプラスミドの第２の部位に挿 入されている。バクテリアプラスミドＤＮＡ配列と酵母ＤＮＡ反復配列とが、全 ２μｍプラスミドの２つの逆方向反復配列の１つのフビー内の例えばＸｂａ　１ 部位に挿入されている。ＤＮＡ反復配列の正しい方向は、プラスミドの機能に必 須であり、例えばＥ、　ｃｏｌｉでの増殖に必要なバクテリアプラスミド配列は 、２μｍプラスミドのＦＬＰ組換え部位の同じ方向性を有する２つのコピーの間 にはさまれるようにプラスミドが構築される。ＤＮＡ配列の配置は、第６図に詳 しく説明されている。このように構築することによって、プラスミド安定性に導 入し１こ時に２つの同じ方向性を有するＤＮＡ反復配列の間で生じる部位特異的 組換えによりプラスミドから除かれるようなりＮＡの領域内に、バクテリアプラ スミドＤＮＡ配列を配置することができる。この部位特異的組換えは、２μｍプ ラスミドのＦＬＰ遺伝子生童物によって仲介てれ、この生産物は、ｃｉｒ＋細胞 七形５ＥＥ換し１こ場合には募母の内因性２μｍプラスミドによって供給芒れ、 ｃｉｒ９−細胞を形質転換した場合にはディスイッチグレイジョンベクター自身 によって供給される。本発明のベクターは、形質転換扉母の内因性２μｍプラス ミド亡補セラのに使用丁ことかでき、１７：組換えはｃｉｒ０細胞の方が速く起 こることから、本発明のベクターは完全２μｍプラスミドに基づくのが好ましい 。しかしながら、本発明のベクターが内因性２μｍプラスミドと共に存在する場 合には、該ベクター中にない五Ｐ　１　、ＲＥＰ　２．ＲＥＰ　３゜ＦＬＰなど の遺伝子は、これら遺伝子の生産物でちるトラ／ス作用蛋白質として供給される 。これらのすべては複製のオリジンに必要なものである。

以下に詳述するように、バクテリアＤＮＡ配列を有する挿入用ＤＮＡ配列は、そ のそれぞれの末端に反復配列のそれぞれの部分を保持していてもよく、この場合 には該挿入用ＤＮＡ配列は、内因性組換え部位が破壊されて新たに２つの新しい ＦＬＰ組換え部位が形成てれるように内因性反復配列内に挿入逼れ、このＦＬＰ 組換え部位はそれぞれ内図性組換え部位と挿入された挿入用ＤＮＡの相補性部分 とからなっている。あるいはま１こ、完全なＦＬＰ組換え部位を挿入用ＤＮＡ配 列の一鴻に導入し、次いで得られるＤＮＡ配列を、バクテリアＤＮＡ配列が内因 性反復配列と挿入用反復配列との間に存在するように、内因性反復配列に隣接し て又は離れて挿入てれる。挿入用ＤＮＡ配列が、内因性反復配列から離れ１こ位 置に挿入逼れる場合には、内因性反復配列と挿入埒れた反復ＤＮＡ配列との間の 内因性ＤＮＡ配列はバクテリアＤＮＡ配列とともに除去てれる。従ってこのＤＮ Ａ配列が必要な場合には、挿入用反復配列の内因性反復配列から離れた側に（好 ましくは挿入されるＤＮＡ配列上に）更にこのＤＮＡ配列の１つのコピーを置く 必要がある。

目的とする遺伝子を挿入するインテグラル２μｍプラスミドの部位は、該挿入に よるプラスミドコを一数及び遺伝的安定性への効果が最少になるように選択され る。従って、ＦＬＥＰ　１　、　Ｆ、ＥＰ　２　ｔ　部Ｐ３及びＦＬＰ遺伝子に 対して害を与えないような部位に目的とする遺伝子を挿入するのが好ましく、特 に、プラスミドを酵母のｃｉｒ０宿主株の形質転換に用いる場合にはそのように するのが好ましい。

本発明のディスインチグレイジョンベクターの１つの有利な特徴点は、それ１ｅ ｉｒ”酵母株に導入した場合にはそれがインテグラル２μｍプラスミドを有して いる１こめにバクテリアプラスミド配列が除去てれる間または除去てれた後にそ れが内因性２μｍプラスミド七補ｌ５ことができることである。同様の状態につ いては酵母のａｉｒ＋宿主株に導入され１こ全２μｍベクターについても報告さ れている（　Ｈａｒｆｏｒｄ　＆　Ｐｅｔｅｒｓ　。

１９８７）。本発明のディスインチグレイジョンベクターは、酵母株の内因性２ μｍプラスミドを補なうために用いることもできる。

添付した図面においては以下のことが示されている。

第１図（；、プラスミドｐｅｔＡ１１２　（Ａｎｄｒｅｗｓ、　ｅｔ、　ａｌ、 。

１９８５）’を示す。細い緑は、バクテリアプラスミドｐＵＣ９から誘導される ＤＮＡ配列全示し、太い棒状の囲いは、ＦＬＰ組換え部位を含む７４塩基対ＤＮ Ａフラグメント？示し、三角形は、それぞれのＦＬｐ組換え部位内の６つの内部 ＤＮ人反復配列の方向を示す（ムコｄｒｅｗｓ。

ｅｔａｌ、、　１９８５　）。

第２図は、プラスミドｐＳＡ０１１２　を示す。プラスミドｐｓＡｃ　１１２は 、Ｂａｍ　Ｈｌ　、Ｐｓ＝ｕ　］及びＥｉ！１ｄｌ１部位が除去でれている以外 は９日Ａ１１２と同じである。

第３図は、プラスミドｐｓＡｃ　３　ｆ示す。太い線は、バクテリアプラスミド ｐＵＣ９のＤＮＡ配列を示し、太い棒状の囲いは、ＦＬＰ組換え部位を含む７４ 塩基対ＤＮＡフラグメントを示し、細い線は２μｍプラスミドＤＮ人配列？示し 、三角形は、それぞれのＦＬＰ組換え部位内の６つの内部ＤＮＡ反復配列の方向 を示す。

算４図は、プラスミドｐｓＡｃ　３　Ｕ　１　’ｆ示し、記号は第３図と同じで ある。

算５図は、ｐｓＡｃ３Ｕ２のプラスミドマツプ全示し、記号は第３図と同じであ る。

第６図は、ｐＳ人Ｃ３０Ｄのプラスミドマツプを示し、記号は第６図と同じであ る。

第７図は、ｐｓＡｃ　３１　Ｄのプラスミドマツプに示し、記号は第６図と同じ である。

篤８図は、ｐＳＡＣ３Ｃ１のプラスミドマツプを示し、記号は第３図と同じであ る。

笑９図は、半数体酵母の生育を示す写真に基づいた図ｆであｐ　、　ＵＰＡ３及 びバクテリアｂｌａ遺伝子の遺伝的安定性を示す。

第１０図は、：２Ｐでラベル化し１こｐ９人Ｃ３ＤＩＣ人でプローブし１こ全酵 ５　ＤＮＡのオートラジオグラフィーを示す。

以下に、本発明を実施例によ＃）証明テる。

プラスミドｐＢＡ　１１２　（第１図９人ｒ１ａｒｅｗｓ、　ｅｔ　ａｌ、。

１９８５）ｔ、制限酵素ＢａｚＨｌ及びＨｉｎｄ　ｍ　Ｔ同時に消化することに よってプラスミドｐＳＡＣ１１２（８２図＞ｔａ築した。線状プラスミドＤＮＡ 　ｔ、０．３　ｚｙｄＮＴＰ　（ｄＡＴＰ　、ｄＴＴＰ、　ｄＣＴＰ　、及びｄ ＧＴＰ　）の存在下で３７°Ｃで１０分間、ＤＮＡポリメラーゼｌ（クレノー） で処理し１こ。ＤＮＡ　’７フエノール：クロロホルムで抽出し、エタノール沈 殿し、次いでＴ、　ＤＮＡ　’Ｊガーゼの存在下で１５℃で１晩インキユベート シタ。連結てれたＤＮＡ　ｆ　Ｅ、　ｃｏｌｉ株Ｍ　Ｃ１Ｑ　６　ｊ　（Ｃａ５ ａｄａｂａｎとＣｏｈｅｎ　１１９８０）に導入し、得られる形質転換体からプ ラスミ）”　ｐＳ、ＡＣ１１２を率離し、ＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙ　（１９ ８０）の方法に二って同定し特徴付けを行なった。

以下のようにしてプラスミドｐＳ、ａ−Ｃ３（第３図）七ＰＩ−築し７：。Ｇｕ ｅｒｉｎｅａｕ、　ｅｔ　ａｌ、、　（１９７４）に記載でれＴこ方法と同様に してＤＲＩ　９株から、酵母２μｍプラスミドＤＮＡ　’ｚ単離し１こ。精製し た２μｍプラスミドＤＮＡ　ｆ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　ｅｔ　ａユ、、（１９８ ２）に記載されアこ方法と同様にして、制限壽素Ｘｂａ　１で部分消化し、Ｘｂ ａ　１で開裂したｐｓＡｃ　１１２に連結し１こ。連結して得られるＤＮＡ　ｆ 　Ｅ、　ｃｏｌｉ株ＡＧ　１　（ＮＢＬ　Ｅｐｚｙｍｅｓ　Ｌｔｄ、。

Ｃｒａ！ｎｌｌｎｇｔｏｎ＊　Ｅｎｇｌａｎａから入手した）に導入した。

得られるアンビシリン耐性の形質転換体について、プラスミドｐＹＦ　９２（Ｓ ｔｏｒｍｓ、　Ｒ，に、　ｅｔ　ａｌ、、　１９７９）から得た３２ｐラベル化 ２．２キロ塩基対ＥｃｏＲ１フラグメントとのコロニーハイブリダイゼーション により（ＧｒｕｎｓｔｅｉｎとＨｏｇｎｅｓｓ、　１９７５　）、２μｍプラス ミドに対する相同性をスクリーニングした。２μｍプラスミドに特異的−ｊ　Ｄ ＮＡグローブに対して相同性を示すコロニーを単離し、そのプラスミドＤＮＡ　 ’ｉ制限酵素マツピング法により特徴付けした。かくしてプラスミドｐｓＡｃ　 ３　を得た。

プラスミドｐｓＡ０３　ｋ制限酵素Ｐｓｔ　ｌで開裂することによって、プラス ミドｐｓＡｃ　３　Ｕ　１　（第４図）及びｐＳＡＣ３Ｕ　２　（第５図）を構 築した。線状ＤＮＡを、０．３　ｍＭ　ｄＮＴＰ　（ｄＡＴＰ　、ｄＴＴＰ　、 ｄｃＴＰ及びｄＧＴＰ　）の存在下で３７℃で１０分間、Ｔ、ＤＮＡポリメラー ゼで処理してプラント末端とした。ＤＮＡ　’にフェノール：クロロホルムで抽 出し、リゾ−ジョンを行なう前にエタノール沈殿に付した。プラスミドｐ、ＴＤ Ｂ　１１０　（ＢｅｇｇＳ。

１９８１　）’ｋ、制限酵素Ｂｉｎｄ　ｌｌで消化し、ＤＮＡフラグメント七１ 係デルの７ガロースデル電気泳動に付した。酵母のＵＲＡ　３遺伝子を有する１ 、１キロ塩基対ＤＮＡフラグメントをゲルから単離しく　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　 ｅｔｌｌｉ、　。

１９８２）、０．３　ｍＭ　ｄＮＴＰ　（ｄＡＴＰ　、　ｄＴＴＰ　、　ｄｃＴ Ｐ及びｄＧ’ｐｐ　）の存在下でＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー〕で処理した 。１．１キロ塩基対Ｈｉｐｄ　ｍフラグメントをフェノール：クロロホルムで抽 出し、エタノール沈殿に付し、上記で調製した線状ｐＳＡＣ３ＤＮＡとプラント 末端で連結し１こ。得られる連結ＤＮＡ　ｆ　Ｅ、　ｃｏｌｉ株ＡＧ１に導入し た。得られるアンピシリン耐性形質転換体について、プラスミドマツプ已１１０ から精製される１、１キロ塩基対Ｈｉｎｄ　ｍフラグメントの３２ｐラベル体を 用いたコロニーハイブリダイゼーションにより（ＧｒｕｚｓｔｅｉｎとＨｏｇ！ １ｅｓｓ　、１９７５　）、ＵＲＡ　３遺伝子に対する相同性ｔスクリーニング した。ＵＲＡ　５遺伝子グローブに対して相同性を示すコロニーから、プラスミ ドｐＳＡＣ３Ｕ　１（笑４図）及びｐｓＡｃ　３　Ｕ　２　（第５図）會単離し １こ。ま１こ、ＵＲＡ３遺伝子を含む１．１キロ塩基対Ｈｉｎｄ　ｍＤＮＡフラ グメントｔＪ　ｐｓＡｃ　３のユニークＥａｇ　１部位及び５ｎａＢ１部位にプ ラント末端で連結して、１）ＳＡＣ３００（第６図）及びｐｓＡｃ　３１０　（ 第７図）と命名されたプラスミドをそれぞれ２４り。

プラスミドｐＥＴ　１３　：　１　（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ、　ｅｔａｌ、。

１９８５）から得られるＣＵＰ　１遺伝子七保持する６９４塩基対Ｘｂａ　Ｉ　 −Ｋｐｎ　Ｉ　ＤＮＡフラグメントを、ｐｓＡｃ　５のユニークＰｓｔ　１部位 へプラント末端で連結することによって、プラスミドｐＳＡ０３　Ｃ１（第８図 ）を構築した。

プラスミドｐｓＡｃ　３　Ｕ　１及びｐＳＡＣ３Ｕ　２による酵母デイスイ／テ グレイションベクターｐＳＡＣ３Ｕ１　（８４図）及びｐＳＡＣ３Ｕ　２　（第 ５図）は、２１ｒｍ　８７　オー　ムのユニークＰｓｔ１部位に挿入された選択 酵母遺伝子ＵＲＡ　３　ｋそれぞれ含むように構築されている。更には、それぞ れのプラスミドは、同じ方向性を有するＦＬＰ組換え部位の２つのコぎ−に接し ているバクテリアプラスミドｐＵＣ９から得られるＤＮＡ配列を保持している。

ｐＵｃ　９　ＤＮＡの位置は、これらの同じ方向性を有する２つのＦＬＰ組換え 部位の間でのＦＬＰ　’ｚ介しての組換えが起こり、その結果、酵母の形質転換 の際にバクテリアプラスミドＤＮＡが除去されるような位置にある。Ｉｔ。

（１９８３）の方法に従って、プラスミドｐＳＡＣ３Ｕ　１及びｐｓＡｃ３Ｕ２ で、半数体酵母株５１５０−２Ｂのｃｉｒ＋及びｃｉｒ０誘導体株（Ｃａｓｈｍ ｏｒｅ　、ｅｔ　ａｌ、＋　１９８６）を形質転換してウラシル原栄養株とし１ こ。得られるＵＰ、Ａ形質転換体について、ＣｈｅｖａｌｉｅｒとＡｉｇｌｅ　 （１９７９）の方法により、酵母でのβ−ラクタム特異的酵素β−ラクタマーゼ 七コードするバクテリアｂｌａ遺伝子の遺伝的継承性をスクリーニングした。第 ９図にその結果が示されており、それによれば、両者のプラスミドは、全てのＣ ｌｒＯ株の形質転換体においてＵＲＡ＋遺伝子からｂｌａ遺伝子を分離（ｓｅｇ ｒｅｇａｔｅ　）　しており、酵母の形質転換の際に、プラスミドからバクテリ アＤＬＡ配列が除去てれアこことを示している。しかしながら、Ｃ１ｒ”株のＴ ″ＲＡ＋形５転換体の大部分については、ｂｌａ遺伝子が遺伝的に継承されてい ることが観察され１こ（ｐＳＡＣ３Ｕ１　については２０のうち１５株、ｐＳＡ Ｃ３Ｕ２については２０のうち１８株）。これらのデータから、プラスミドの分 解、部ちＦＬＰによるバクテリアプラスミドＤＮＡ配列の除去は、ｃｉｒ＋株よ りもＣｌｒＯ株の形質転換の際により多く生じることが示てれている。

形質転換体の分子分析 ｂｌａ遺伝子を分離し１こＵＲＡ＋形質転換体（部ち、β−ラクタマーゼ・ネガ ティブ・クローン、ｂｌａ−）が、　′実際にｂｌａ遺伝子とそれに隣接し１こ バクテリアプラスミドＤＮＡ配列を失なっているか否かを調べるために、酵母Ｄ ＮＡ七分析した。ｐＳＡＣ３Ｕ１又はｐＳＡＣ３Ｕ２で形質転換芒れＨｅ１ｒ＋ 及びｃｉｒ０株の２つのＵＲＡ”　ｂｌａ−形質転換体を、ウラシルを含まない 選択最少培地で生育セしめて、以下に示す方法でその全ＤＮＡ　’ｉ油抽出た。

：く生育し１こ細胞を採取し、それらｉ、１Ｍソルビトール、０．Ｃｌ２５１Ｊ 、エチレンジアミンテトラ酢酸ＣＥＤＴＡ）ｐＨ８，Ｏｔ　８　ｍｙ　／　ｍｌ ジチオスＬ／イトールの５　ｍｌに２８°Ｃで１５分間再芒濁し１こ。次いで、 細胞を採取し、１．２ＭソルビトールＴＯ’１Ｍクエン酸ナトリウム、０．０１ Ｍ　ＥＤＴＡｐＨ５−８、Ｏ−０２５ｐｌ　／　ｍ１Ｍ’イモ！Ｊ７−’ｅｃｄ Ｐリンビール、Ｃｏ、　Ｌｔｄ）の５　ｍｌに２８°Ｃで、プロトプラストが得 られるまで再Ｚ濁しアこ。得られるプロトプラス）’ｔ、１．２Ｍソルビトール で３回洗浄し、３係サルコシル、０．５Ｍ）リス／　ＨＣｊ　ｐＨ７，５、０， ２Ｍ　ＥＤＴＡ　。

１００　ｐｌ　７ｍｌプロティンアーゼにのｉ　ａｔに５５℃で６０分間再懸濁 した。クロロホルム：イソプロパツール、フェノール、クロロホルム、次いでエ ーテルでＤＮＡ調製物を抽出し、１０ｍＭトリス／　ＨＩＪ、１　ｍＭＥＤＴＡ ｐＨ８に対して透析した。酵母量ＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲ１、Ｘｂａ　１及 びＰｓｔ　ｌで消化し、得られるＤＮＡフラグメントヲ７ガロース電気泳動で分 離した。

サザントランスファー（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　ｅｔ　ａｌ、＊　１９８２　）に 従い、酵母量ＤＮＡを３２ｐラベル化ｐＳＡＣ３ＤＮＡにハイブリダイズさせた 。その結果は第１０図に示されており、第１０図は、３２ｐラベル化ｐｓＡｃ　 ３　ＤＮＡでプローブてれた酵母量ＤＮＡのオートラジオグラフィーを示してい る。プラスミドｐｓＡｃ３Ｕ１又はｐＳＡＣ３Ｕ　２で形質転換芒れたＳ　１５ ０−２　Ｂ　ｃｉｒ＋株からＤＮＡ　’ｚ単離した。それぞれの株／プラスミド の組合わせの２つの形質転換体’！Ｉ−Ａ、Ｂと命名し、それらを分析した。Ｄ ＮＡは次のように制限酵素で消化した。

Ｘｂａｌ　：　）ラック１−４及び２ｌ−２４Ｐｓｔｌ　：　）ラック５−１２ ＥｃｏＲ１：　）ランク１３−２０゜ トラック　プラスミド　ｃｉｒ”／ｃｉｒ０ｊ！Ｌ離（Ａ／”−）６＊　１４ｖ 　２２　ｐＳＡＣ３Ｕ１　ｃｌｒ”　Ａ８、　１６．　２４　ｐＳＡＣ３Ｕｉ　 ｃｉｒ”　Ｂ５＋　１３ｔ　２１　ｐＳＡＣ３Ｕ１　ｃ１ｒ０Ａ７、　１５．　 ２３　Ｉ）ＳＡＣ３Ｕ１　ｃｉｒ’　Ｂ２＋　１０．　１８　ｐｓＡｃ３Ｕ２　 ｃｉｒ”　Ａ４、　１２．　２０　ｐｓＡｃ３Ｕ２　ｃｉｒ”　Ｂ１、９．　１ ７　ｐｓＡｃ３Ｕ２　ｃｉｒ０Ａ３、　１１．　１９　ｐＳＡＣ３Ｕ２−　ａｉ ｒＯＢ酵母の内因性２μｍプラスミドに存在する公知の制限酵素部位（Ｈａｒｔ ｌｅｙとＤｏｎｅｌｓｏｎ、　１９８０　）及び組換えプラスミドｐＳＡＣ３Ｕ １及びｐＳＡＣ３Ｕ２に基づき、プラスミドｐｓＡｃ　３に対するハイブリダイ ゼーションパターンを予忍することが出来る。予りされるハイブリダイゼーショ ンパターンを表１に示した。

カッコ内に示した数字は、分解したプラスミドが７二？に：るＰ５部変交全受け た場合に生じるフラグメントを示すものである。

ハイブリダイゼーションの姑果（第１０図）とその予想（衣１）とを比較すると 、それぞれの形質転換体に２いて、同じ１同を有するＦＬＰ組換え部位内にある バクテリアプラスミドＤＮＡ配列の除去に相当する欠失を組供えプラスミドが受 けたことが判る。爽には、ｐｓＡｃ３ｔＪ）　／　Ｂと命名でれた形Ｊ転換体の 場合にｉ、５１５０−２Ｂ休の内因性２μニブラスミドにもにＪＰ存在していな い。このことは、シラスミドｐｓＡｃ３Ｕ２でａｉｒ＋が形質転換されることに よってろ力性２μニブラスミドが補なわれたことを示している。

東に、プラスミドｐｓＡＣ３Ｕ１とｐＳＡＣ３Ｕ２が酵母の形質転換の際にバク テリアグラスミドＤＮＡ配列の除云會受けたことは、：５２Ｐラベル化ｐＵＣ９ ＤＮＡ　（Ｖｉｅｉｒａと１／、ｅｓｓｉ＝ｇ　、　１９８２　）に河する上記 したＤＮＡ　論％物のハイブリダイゼーションからも明らかである。ＵＲＡ”ｂ ａａ−形質転換体ＩＣ％　このＤＫＡプローブに幻してハイブリダイズしなかっ た。

ＵＰ、Ａ＋グラスミドｐｓｚ−Ｃ３００及びｐｓＡＣ３１０七用い℃、Ｓ　１５ Ｏ−２Ｂ　（Ｄ　ｃｉｒ”及びＣｉｒ’　ｌ’　４　俸保に形質転換し、得られ る形質転換体のＵＰＡ及びｂｌａ衣埃をを論べた。

全ての場合において、それらの茨現型が失なわれていることが観察された。　Ａ ｌｌ］ち、ｐｓＡｃ３００及びｐｓＡｃ３１　［１ｒｉ酵母の形質転換の際にバ クテリアベクターＤＮＡを除去することができる。この点に関して、シラスミド ｐｓＡｃ３［］０の場合には、３１５０−２Ｂのｃ＝ｒ＋誘導体株のｂｌａ−形 質転換体が有意に高い比率で生じることが観察ざｈた。このことについてはどの ように説明すべきかは判らない。しかしながら、次の可能性がある。部ち、ｐｓ ＊ｃ３００にＵＲＡ　３遺伝子が挿入されたことによってＥａｇ１部位がこわれ 、隣接しているＦＬＰ遺伝子の発現が障害を受け、その結果ＦＬＰレコンビナー ゼの発現が高くなった可能性がある。

プラスミドｐｓＡｃ３ｃ１を、銅感受性工業用酵母、特に発酵用酵母の形ｉ転換 に用いることを考えた。即ち、ＨｉｎｃｈｌｉｆｆｅとＤａｕｂｎｅｙ　（１９ ８６）に記載されているＢａ５ｓラーガービール＃ｉ　ＢＢ　１１　、Ｏｋ　ｐ ｓＡｃ３ｃ１で形質転換した。次いで、得られＳ餉耐仁形員転洪体について、β −ラクタマーゼゾレートアツセイによりｂｌａ衣現型が存在するか否かをチェッ クした。テストした形質転換体の約１８％がｂｌａ−銅耐性？示し、このことは 、発酵用酵母宿主においてプラスミドｐＳＡＣ３Ｃ１の１）１　ｖｉｖｏ　９塀 が起ったことを示している。

シラスミドｐｓＡｃ３００　、　ｐｓＡｃ３１０及びｐｓ／−Ｃ３Ｃ１のｌコｖ ｉｖｏ分解について、艮現型が失なわれた過当な宿三株の分子上の特徴付けを十 分に行なうことに二つ℃分解が生じていることを確認した。肌ち、上記した”Ｐ −３）ＵＣ９ＤＮＡに対して酵母全ＤＮＡをハイブリダイズさせた所、ｂｌａ− 誘導体株については何んらの福岡性も検出されなかった。

”分解”形質転換体のプラスミド安定性ｐｓＡｃ３Ｕ１　、　ｐＳＡＣ３Ｕ２　 、　ｐｓＡｃ３００及びｐｓＡｃ３１０の分解されたプラスミド誘導体を保持す るＳｌ　５Ｏ−２Ｂのｃｉｒ＋及びｃｉｒ’株におけるＵＲＡ”　戒現型の遺伝 的安定性を、２％ｗ／ｖグルコースを含ＹＰＤ中で非選択的に酵母を生育せしめ 、同じ最少培地上にプレートし、次いでウラシルを欠いた最少培地にレプリカプ レートすることによって調べ大。１世代当シのプラスミド欠損パーセントを計算 し、衣２に示した。

ｐｓＡｃ３Ｕ１　０．２２　０．１９ ＰＳＡＣ３Ｕ２　０．３１　０．１４ ｐｓＡｃ３００　２．５ ｐｓＡｃ３１０　０　０．８９ 隈２の結果から判る：うに、すべての分解さ？した（ディスイッチブレイトざｈ た）ベクターは、３１５０−２Ｂのｃｉｒ＋及びｃｉｒＯ誘導体誘導体年中定で ある。しかしながら、特にｐｓＡｃ３Ｕ１　、　ｐｓＡｃミＵ２及びｐＳＡＣ３ １０の不安定性のレベルは、Ｓｌ　５Ｏ−２Ｅ中での他のＵＲＡ”　２μ二由来 組俟えベクター（Ｃａｓ二ｗｏｒｅ。

ｅｔａｌ、、１９８６）よりも少なくともワンオーダー低い０ ｐＳＡＣ３の２μｍプラスミド部分のユニーク三ａｇ　１部位にＵＲＡ　３遺伝 子を挿入することによって、ｐ　５−ＡＣ３Ｕ１　ｒｐ　ＳＡＣ３Ｕ２及びｐｓ Ａｃ３１０から誘導される分解されたプラスミド誘導体よシも安定性が低い分解 されたプラスミド誘導体が得られることは注目に値する。従って、選択マーカー の挿入部位が、得られる分解されｆｃｆラスミド誘導体の安定性に対して犬ぎな 効果を与えることが明らかである。この点に関して、２μｍプラスミドのユニー ク５ｎａＢａ及びＰＳＺ１部伍が組換え遺伝子の導入に適した遺伝子Ｍｔ−形底 することが明らかである。

何故なら、このような部位への挿入によつ℃プラスミドの安定性が悪影譬を受け ないからである。

三Ｅ　１１　、ＯＶ）　ｐＳＡＣ３Ｃ１形負転侠体の分解されたプラスミド誘導 体を鳴する分鮮形負転洪体につい℃、銅耐性＠現型の安定性を調べた。上１口し たと同様にしてり０ラスミド安定住Ｃ案験を行なった所、非選択８９竺育条件下 で１世代当り口、０１４％のプラスミド欠損が観察さ引た。この結果から、ｐＳ ＡＣ３Ｃ１の分解されたプラスミド誘導体は発酵用酵母株ＢＥ１１．Ｄ中で非常 に安定であシ、組供え２μ＝白米酵母ベクターについてこれまで観察さ？したこ とのない程度の安定性を有している。

プラスミドｐ　５ｐ−ｃ３　ｉ２ユニークＰＳｚ１部位及びユニークＳ二ａＢ　 １部位を有しており、これらのいずれにＤＮＡ配列を挿入しても、酵母でのプラ スミドの分解誘導体の茨現型の安定性に対して患い影響を与えることなく、ＤＩ ＣＡ　６口列を挿入することができる。これらのｂ口は、目的とする遺伝子、例 えばＳ、　６ｉａｓｚａｚｉｃｕｓのＤＥＸ　−１遺伝子及び酵母ゾロモーター で発現されるヒト血清アルブミン遺伝子の導入のための遺伝子座とし”Ｃ＃いる ことができる。公却の方法を加いて、酵母形質転換体の選択マーカーとともにこ のような遺伝子をこのようなユニーク遺伝子＆に挿入することができる。あるい に、プラスミドルＳ人Ｃ３Ｕ１　、１）ＳＡＣ３Ｕ２　、　ｐｓＡｃ３１０及び ｐ　５ＡＣ３ＣＩ　ＣＳ　、、目的とする遺伝子を挿入するための受容体として 用いることができる。この点に関してに１プラスミドｐｓＡｃ３’Ｕ１　、　ｐ ｓＡｃ３ｔｉ２　ｋひｐｓＡｃ３１０は、ＴＪＰ、Ａ　３遺伝子の３′−非翻訳 領域にユニークＳｍａ　Ｉｂ１ｔ有している（　Ｒａ５ｅ　ｅｘ　ａｌ−＋　１ ９８４　）。この５ｒ−ａ　Ｉ部位を、適当な目的とする遺伝子を挿入するため の遺伝子座として用いることができる。

目的とする遺伝子を直接的にあるいは間接的に挿入するために（例えばＵＲＡ遺 伝子を挿入し、次いでそのＳｍａ　１部位に目的とする遺伝子を挿入するような 場合）Ｓｒ、ａ　Ｂ　１部位を用いることが望ましいか否かは、ベクターの分解 に依っている。部ち、バクテリアＤＮＡ配列の除去に依っており、このことが不 発明の他の１つの局面を形成している。一般に、挿入された遺伝子から内因性２ μ二領域、特に酵母の複製オリジン（ｏｒｌ）から離れたＳｈａ　Ｂ　１部位側 のＳ’ｒＢ領域まで転写が行なわれるのを止めるのが望まれている。従って、挿 入される配列は、（ａ）目的とする遺伝子、（ｂ）そのｏｒｉ側に隣接した部泣 上にあるブロモ−ター及び（ｃ）目的とする遺伝子の下流であって且つ目的とす る遺伝子とＳＴＢ領域との間にある３′−転写ターミネータ−からなるのが好５ ｏｃｉｅｚｙ　ｃｆ　Ｂｒｅｗｉｎｇ　Ｃｈｅｓｉｓｚｓｙ　Ａ２＋　１゜Ｂｅ ｇｇｓ＋　（１９８１）＋　Ｉｎ：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ−ｅｎｅｚｉｃｓ 　１ｎＹａａｓｚ　’　Ａｌｆｒｅｄ　Ｂｅｎｚｏｎ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　Ｎ ｏ：　１６ｍＭｕｎｋｓｇａａｒｄ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ。

Ｂｏｚｓｚｅｉｎ　＆　Ｄａｖｉｓ＋　（１９８２）＋　Ｉｎ　”Ｔｈｅ　Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｓｈｅ　Ｙｅａｓｔ＋　５ａｃｃｈａｒ ｏｒｘ１ｙｃｅｓ：Ｍｅｚａｂｏｌｉｓｍ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｏｎ″、Ｅｄｓ、５ｚｒａｚｈｅｒｎｅｚ　ａｌ、、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ ｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｚｏｒｙ、Ｎｅｗｏｒ１ １７９゜ Ｃ１ａｒｋ−Ｗａｌｋｅｒ　＆　Ｍｉｋｌｏｓ、（１９７４）＋　Ｅｕｒｏｐｅ ａｎ　ＪｏｕｒｎａｌＦｕｚｃｈｅｒ＋　（１９Ｂ６）、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ 　Ｔｈｅｏｒｅｚｉｃａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ＋３１５゜ 三ａｒｚｌｅｙ　＆　Ｄｏｎｅｌｓｏｎ、（１９８０）ｔ　Ｎａｚｕｒｅ、２８ ６＋　２８０゜１１３゜ Ｈｅ１ｓｉｎｋｉ＋　２６７゜ Ｋｉｎｇｓｍａｎ、ｅｚ　ａｌ−＋　（１９８５）、Ｂｉｏｚｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙ　ａｎｄＣｌｏｎｉｎｇ：　ａ　Ｌａｂｏｒａｚｏｒｙ　ｙａｎｕａｌ″、　 Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

４２０５゜ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”、　Ｅａｓ、　Ｗｕ、　ｅｘ　ａｌｓｏ　皿、２２ＥＬ Ａｃａｃｉｅｏｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＋Ｎａｚｉｏｐａｌ　Ａｃ ａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃ１ｅｈｃｅｓ、ＵＳＡ、８ＣＬ　６７５０゜Ｒｏｚｈｓ ｚｅｉｎ＋　（１９８３：Ｌ　Ｉｎ　”Ｍｅｚｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ ｏｇｙ″。

Ｅａｓ、Ｗｕ、ｅｔ　ａｌ−＋　１ｏｉ、２０２＋　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ ｓｓ。

Ｎ＠ｖ　Ｙｏａｋ＋ Ｔａｋｅｚｏ　ｅｚ　ａｌ、＋　（１９８０）ｅ　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏ ｆ　ｓｈｅｖ〇二ｋｓｒ”ｖ　＆　Ｂｒｅａｃｈ、（１９８６）＋　Ｃｅ１１＋ 　４６＋　５４１゜Ｖｏｌｋｅｒｚ　＆　Ｂｒｏａｃ二、（１９８７）、Ｉｐ　 ？ｒｅｓｓ。

Ｗ＊、ｅｚ　ａｌ、、　（１９８６）、　工ｎ　ｕｃＬＡ　５ｙ＝ｐｏｓｌｕｒ Ｑ　ｏｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎａ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　 Ｙｅａｓｚ　ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ　”　、　三ａ、Ｆ、１ｃｋｓ＋　３２３ ゜ＹＯＣｕｍ＋　（１９８５）、欧州特許出願＆　１６３４９１　。

組換え前においては、同じ方向を胸する２つのＦＬＰ組換え部口のみと、希望し ない例えばそれらの間にあるバクテリアＤＮＡ　（例えば組供え部−のペアーに よって分能されたプラスミドの２つのｂ分の短い配列として）とを１するプラス ミドを金集してもよい。組換え後は、このようなプラスミドは１１画の組換え部 恒を有し、従って通常の２μｍ組侠見金起こさず、Ａ良とＢ型の原付集団となら ない。このようなプラスミドは上記したグラスミドよシも不安定であるが、不発 明の１局面を形既しそのものもクレームされる。

ｐｓＡｃ３ＬＪ２ ｐｓＡｃ３００ ｐｓＡｃ３１０ ｐｓＡｃ３ｃＩ （ｐｓＡｃ３０２）　（ｐｓＡｃ＝ｕ２）（ｐ５Ａ（ｊｕｌ）　（ｐｓＡｃ３Ｌ Ｊす国際調査報告 １＋ｍ’＋＋ａｌｎｌｎｌ＾−−１１−一・Ｐ：τ／ＧＢ　εε／ＣＣ２７ε国 際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．組換えによつて失なわれるＤＮＡ配列、その１対が同じ方向性を有し他の２ 対が逆の方向性を有する３個の２μｍＦＬＰ組換え部位、及び目的とする蛋白質 又はペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むベクターであつて、上記組換えによ つて失なわれるＤＮＡ配列が上記同じ方向性を有する１対の２μｍＦＬＰ組換え 部位の間にある２μｍプラスミドベクター。 ２．選択マーカーＤＮＡ配列を含む請求の範囲第１項記載の２μｍプラスミドベ クター。 ３（ｉ）バクテリア宿主中でのベクターの増殖に必要なバクテリアプラスミドＤ ＮＡ配列；（ｉｉ）エキストラ２μｍＦＬＰ組換え部位；（ｉｉｉ）目的とする 蛋白質又はペプチドをコードするＤＮＡ配列；及び（ｉｖ）酵母形質転換用の選 択マーカーＤＮＡ配列を保持する完全２μｍプラスミドであつて、２μｍプラス ミドの２つの逆方向反復配列の１つの配列内の制限酵素部位に上記バクテリアプ ラスミドＤＮＡが存在し且つ上記エキストラＦＬＰ組換え部位が作成されており 、上記エキストラＦＬＰ組換え部位は上記逆方向反復配列の１つの配列内の内因 性ＦＬＰ組換え部位に対して同じ方向性を有しており、上記バクテリアプラスミ ドＤＮＡ配列はエキストラＦＬＰ組換え部位と上記逆方向反復配列の１つの配列 内の内因性ＦＬＰ組換え部位との間にある完全２μｍプラスミドを含む請求の範 囲第２項記載の２μｍプラスミドベクター。 ４．上記制限酵素部位がュニークＸｂａＩ部位である請求の範囲第３項記載の２ μｍプラスミドベクター。 ５．全てのバクテリアＤＮＡ配列が上記のようにエキストラＦＬＰ組換え部位と 内因性ＦＬＰ組換え部位との間にある請求の範囲第３項又は第４項記載の２μｍ プラスミドベクター。 ６．目的とする蛋白質又はペプチドをコードするＤＮＡ配列が酵母に対して異種 である請求の範囲第１項から第５項のいずれか１項記載の２μｍプラスミドベク ター。 ７．目的とする蛋白質文はペプチドをコードするＤＮＡ配列が、ＨＳＡをコード するＤＮＡ配列であつて、該ＤＮＡ配列はその５′末端が酵母において機能する 分泌リーダー配列を介して酵母において機能する遺伝子プロモーターと融合して おり、その３′末端が酵母において機能する転写ターミネーシヨンシグナルに融 合している請求の範囲第６項記載の２μｍプラスミドベクター。 ８．目的とする蛋白質又はペプチドをコードするＤＮＡ配列が、その５′末端か ＧＡＬ／ＣＹＣ１又はＧＡＬ／ＰＧＫハイブリツドプロモーターと融合しており その３′末端が酵母において機能する転写ターミネーシヨンシグナルに融合して いるＭＥＴ−ＨＳＡ遺伝子である請求の範囲第６項記載の２μｍプラスミドベク ター。 ９．目的とする蛋白質又はペプチドをコードする遺伝子が、ＤＥＸ−遺伝子、あ るいは、その５′末端が酵母において機能する分泌リーダー配列を介して酵母に おいて機能する遺伝子プロモーターに融合しておりその３′末端が酵母において 機能する転写ターミネーシヨンシグナルに融合しているＢａｃｉｌｕｓ　ｓｕｂ ｔｉｌｉｓのβ−グルカナーぜをコードするＤＮＡ配列である請求の範囲第１項 から第５項のいずれか１項記載の２μｍプラスミドベクター。 １０．添付した第３図のｐＳＡＣ３の配置を実質的に有する請求の範囲第１項記 載の２μｍプラスミドベクター。 １１．請求の範囲第１項から第１０項のいずれか１項記載の２μｍプラスミドベ クターの製造法であつて、（ｉ）酵母形質転換体を選択するためのＤＮＡ配列； （ｉｉ）目的とする蛋白質又はペプチドをコードするＤＮＡ配列；及び（ｉｉｉ ）（ａ）バクテリア内てでのベクターの増殖を可能にするバクテリアプラスミド ＤＮＡと（ｂ）ＦＬＰ組換え部位のエレメントを含む挿入用ＤＮＡ配列を、エキ ストラＦＬＰ組換え部位がベクター内に作成され且つ互いに逆の方向性を有する ２つのＦＬＰ組換え部位の間に上記バクテリアプラスミドＤＮＡがはさまれるよ うに、該挿入用ＤＮＡ配列を完全２μｍプラスミドに挿入することを含む上記の 製造法。 １２．上記挿入用ＤＮＡ配列を内因性ＦＬＰ組換え部位のユニークＸｂａＩ部位 に挿入し、該押入用ＤＮＡ配列の一方の末端に２μｍプラスミドの反復配列の１ 部を有し、他方の末端に２μｍプラスミドの反復配列の残りの部分を有する請求 の範囲第１１項記載の製造法。 １３．酵母に対して異種の蛋白質又はペプチドをコードするＤＮＡ配列を含み、 バクテリアＤＮＡは含またい２μｍプラスミドベクター。 １４．請求の範囲第１項から第１０項のいずれか１項又は第１３項記載の２μｍ プラスミドベクターで形質転換された発酵用酵母又は実験室用酵母。 １５．請求の範囲第１４項記載の酵母を発酵することによつて得られる目的とす る蛋白質又はペプチド。 １６．目的とする遺伝子がＳｎａＢＩ部位に直接的に又は間接的に挿入されてい る２μｍプラスミドベクター。