JP2007515961A

JP2007515961A - ２ミクロン系プラスミドおよびその使用

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Publication number: JP2007515961A
Application number: JP2006546328A
Authority: JP
Inventors: ダレル、スリープ; クリストファー、ジョン、アーサー、フィニス
Original assignee: Novozymes Delta Ltd
Current assignee: Albumedix Ltd
Priority date: 2003-12-23
Filing date: 2004-12-23
Publication date: 2007-06-21
Anticipated expiration: 2024-12-23
Also published as: EP1711602B1; US20080261861A1; ATE483812T1; ZA200605589B; CN1922326A; DK1711602T3; CN101128587B; DE602004029503D1; AU2004303597B2; CN101128587A; NZ548154A; AU2004303597A1; CN1922326B; EP1711602A1; CA2551496A1; GB0614610D0; GB2424888B; KR101298157B1; WO2005061719A1; KR20070004585A

Abstract

本発明によれば、ＲＥＰ２遺伝子またはＦＬＰ遺伝子の少なくともいずれか一方の最後の機能的コドンの１つ後の塩基と、該遺伝子に隣接する逆方向反復内のＦＲＴ部位の１つ前の塩基との間に、ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換を含んでなる、２μｍ系プラスミドが提供される。

Description

発明の背景

発明の分野
本願は改変プラスミドおよびその使用に関する。

発明の背景
発芽酵母のある近縁種は天然の環状二本鎖ＤＮＡプラスミドを含むことが示されている。これらのプラスミドは２μｍ系プラスミドと総称され、チゴサッカロミセス・ルクシー(Zygosaccharomyces rouxii)（以前はチゴサッカロミセス・ビスポルス(Zygosaccharomyces bisporus) として分類されていた）由来のｐＳＲ１、ｐＳＢ３およびｐＳＢ４、チゴサッカロミセス・バイリー(Zygosaccharomyces bailii)由来のプラスミドｐＳＢ１およびｐＳＢ２、チゴサッカロミセス・フェルメンタチ(Zygosaccharomyces fermentati)由来のプラスミドｐＳＭ１、クルイベロミセス・ドロソフィラルム(Kluyveromyces drosphilarum)由来のプラスミドｐＫＤ１、ピキア・メンブラネファシエンス(Pichia membranaefaciens)由来の命名されていないプラスミド（以下、「ｐＰＭ１」と呼ぶ）、ならびにサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) (Volkert, et al., 1989, Microbiological Reviews, 53, 299; Painting, et al., 1984, J. Applied Bacteriology, 56, 331)およびその他のサッカロミセス種、例えば、Ｓ．カルスベルゲネシス(S. carlsbergensis)由来の２μｍプラスミドおよび変異体（例えば、Ｓｃｐ１、Ｓｃｐ２およびＳｃｐ３）が挙げられる。１つのプラスミドファミリーとして、これらの分子はプラスミドの反対側に２つの逆方向反復を有し、６ｋｂｐ前後（４７５７〜６６１５ｂｐの範囲）の類似の大きさ、少なくとも３つのオープンリーディングフレーム（そのうちの１つは部位特異的レコンビナーゼ（例えば、２μｍのＦＬＰ）をコードする）、および逆方向反復の１つの末端付近に位置する、複製起点（ｏｒｉ）としても知られる自立複製配列（ＡＲＳ）を有するという一連の共通の特徴を持っている(Futcher, 1988, Yeast, 4, 27; Murray et al., 1988, J. Mol. Biol. 200, 601およびToh-e et al., 1986, Basic Life Sci. 40, 425)。それらの認識できるＤＮＡ配列の相同性の欠如はあるものの、それらの共有の分子構造およびオープンリーディングフレームの機能の保存は、これらのファミリーメンバー間の一般的な連関を証明している。

２μｍプラスミド（図１）は、ほとんどのサッカロミセス・セレビシエ株に半数性ゲノム当たり６０〜１００コピーで内在する６，３１８ｂｐの二本鎖ＤＮＡプラスミドである。この２μｍプラスミドは、２つの５９９ｂｐ逆方向反復配列によって隔てられたスモールユニーク（ＵＳ）領域とラージユニーク（ＵＬ）領域を含む。この逆方向反復配列の部位特異的組換えの結果、in vivoにおいてこのプラスミドのＡ型およびＢ型の間で相互変換が生じる(Volkert & Broach, 1986, Cell, 46, 541)。２μｍのこの２つの形態は、それらのユニーク領域の相対的方向だけが異なる。

サッカロミセス・セレビシエからクローニングした２μｍプラスミド（Ｓｃｐ１としても知られる）のＤＮＡ配列決定から６，３１８ｂｐの大きさが得られたが(Hartley and Donelson, 1980, Nature, 286, 860)、ＳＴＢとして知られる領域における、それぞれ１２５ｂｐおよび２２０ｂｐの小さな欠失の結果として、他の若干小さい２μｍの変異体Ｓｃｐ２およびＳｃｐ３が存在することが知られている(Cameron et al., 1977, Nucl. Acids Res., 4, 1429; Kikuchi, 1983, Cell, 35, 487およびLivingston & Hahne, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 3727)。世界中の天然サッカロミセス株の８０％についてのある研究では、２μｍと相同なＤＮＡを含んでいた（サザンブロット解析による）(Hollenberg, 1982, Current Topics in Microbiology and Immunobiology, 96, 119)。さらにまた、Ｓ．セレビシエおよびＳ．カルルスベルゲネシスに見られる天然の２μｍプラスミド集団内にはバリエーション（遺伝多型）が存在し、ＮＣＢＩ配列（受託番号ＮＣ＿００１３９８）がその一例である。

２μｍプラスミドは核局在性を有し、高レベルの有糸分裂安定性を示す(Mead et al, 1986, Molecular & General Genetics, 205, 417)。２μｍプラスミドの遺伝安定性はプラスミドによりコードされているコピー数の増幅および分割機構に起因するものであり、これはキメラベクターの開発の際に簡単に損なわれる(Futcher & Cox, 1984, J. Bacteriol., 157, 283; Bachmair & Ruis, 1984, Monatshefte fur Chemie, 115, 1229)。２μｍプラスミドを含む酵母株は［ｃｉｒ^＋］として知られ、一方、２μｍプラスミドを含まない酵母株は［ｃｉｒ^０］として知られる。

ＵＳ領域はＲＥＰ２およびＦＬＰ遺伝子を含み、ＵＬ領域はＲＥＰ１およびＤ（ＲＡＦとしても知られる）遺伝子、ＳＴＢ遺伝子座および複製起点を含む(Broach & Hicks, 1980, Cell, 21, 501; Sutton & Broach, 1985, Mol. Cell. Biol., 5, 2770)。Ｆｌｐレコンビナーゼは、逆方向反復内のＦＲＴ部位（Ｆｌｐ認識標的）と結合し、部位特異的組換えを媒介するが、これはin vivoにおける天然プラスミド増幅とプラスミドコピー数の制御に不可欠なものである(Senecoff et al, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 82, 7270; Jayaram, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A., 82, 5875)。２μｍ系プラスミドのコピー数は、Ｆｌｐレコンビナーゼ活性の変化によって有意に影響を受け得る(Sleep et al, 2001, Yeast, 18, 403; Rose & Broach, 1990, Methods Enzymol., 185, 234)。Ｒｅｐ１およびＲｅｐ２タンパク質はプラスミドの分離を媒介するが、それらの作用様式は明らかでない(Sengupta et al, 2001, J. Bacteriol., 183, 2306)。それらはまた、ＦＬＰ遺伝子の転写を抑制する(Reynolds et al, 1987, Mol. Cell. Biol., 7, 3566)。

ＦＬＰおよびＲＥＰ２遺伝子は互いに異なるプロモーターから転写され、それらの間で介在配列は明らかに定義されていない。ＦＬＰおよびＲＥＰ２転写物は両者とも、それらの翻訳終結コドンの後のそれぞれ２４ｂｐおよび１７８ｂｐにおいて、逆方向反復配列内の同じ配列モチーフで終わる(Sutton & Broach, 1985, Mol. Cell. Biol., 5, 2770)。

ＦＬＰの場合、Ｃ末端コード配列もまた逆方向反復配列内にある。さらに、この２つの逆方向反復配列は５９９ｂｐにわたって高度に保存されており、この特徴はin vivoにおいて効率的なプラスミド複製および増幅に有利であると考えられるが、in vitro部位特異的組換えに不可欠なのはＦＲＴ部位（６５ｂｐ未満）のみである(Senecoff et al, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, 7270; Jayaram, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, 5875; Meyer-Leon et al, 1984, Cold Spring Harbor Symposia On Quantitative Biology, 49, 797)。Ｆｌｐの重要な触媒残基はアルギニン−３０８とチロシン−３４３（必須）であり、鎖の切断はヒスチジン−３０９およびヒスチジン−３４５により容易となる(Prasad et al, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, 2189; Chen et al, 1992, Cell, 69, 647; Grainge et al, 2001, J MoL BioL, 314, 717)。

Ｒｅｐ２については２つの機能的ドメインが報告されている。残基１５〜５８はＲｅｐ１結合ドメインを形成し、残基５９〜２９６は自己会合およびＳＴＢ結合領域を含む(Sengupta et al, 2001, J. Bacteriol., 183, 2306)。

２μｍプラスミドの必須の機能的領域の多くを欠損しているが、機能的なシスエレメントＡＲＳおよびＳＴＢを保持している２μｍのキメラまたは欠失の大きな変異誘導体は、細胞分裂時に母細胞と娘細胞との間で有効な分割ができない。このようなプラスミドは、これらの機能が、例えば宿主内に機能的２μｍプラスミドを提供することによりトランスで提供されれば有効に分割しうる（いわゆる、［ｃｉｒ^＋］宿主）。

目的の遺伝子はこれまで、２μｍプラスミドのＵＬ領域に挿入されてきた。例えば、ＥＰ０２８６４２４のプラスミドｐＳＡＣ３Ｕ１参照。しかしながら、ＵＳ領域とＵＬ領域が過度に非対称にならずに２μｍプラスミドのＵＬ領域に注意深く挿入できるＤＮＡの量には限界があると思われる。従って、２μｍプラスミドのＵＳ領域は、逆方向反復の両側のＤＮＡ断片の長さを均等にする傾向があるので、さらなるＤＮＡ配列の挿入にとって特に魅力的である。

これは、図２に示されているものなどの発現ベクターには特に当てはまり、このプラスミドは酵母選択マーカーおよび隣接するＤＮＡ配列の導入によってすでに過密になっている。例えば、図２に示すプラスミドは、β−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性のため）、ＬＥＵ２選択マーカーおよびオリゴヌクレオチドリンカー（最後の２つのものは２μｍ系非組込みベクターｐＳＡＣ３（ＥＰ０２８６４２４参照）のＵＬ領域内のユニークなＳｎａＢＩ部位に挿入される）を含む。酵母に形質転換した後、図２に示されるプラスミドから、ＸｂａＩ部位間の、アンピシリン耐性遺伝子を含む大腸菌ＤＮＡが欠失される。このことはChinery & Hinchliffe, 1989, Curr. Genet, 16, 21およびＥＰ０２８６４２４に記載されており、これらのタイプのベクターは「非組込みベクター」と呼ばれる。図２に示されている過密状態では、どこにさらなるポリヌクレオチド挿入ができるか、容易には明らかにならない。リンカー内のＮｏｔＩ部位がさらなるＤＮＡ断片の挿入に用いられているが、これはＵＬ領域とＵＳ領域の間のさらなる非対称性をもたらす(Sleep et al, 1991, Biotechnology (NY), 9,183)。

発明者らはこれまでに、２μｍプラスミドのＵＳ領域にさらなるＤＮＡを挿入し、そのプラスミドの高い固有安定性を維持しようと試みてきた。２μｍ系非組込みプラスミドｐＳＡＣ３００では、ＵＲＡ３遺伝子を含む１．１ｋｂのＤＮＡ断片が、ＵＳ領域のＲＥＰ２とＦＬＰの間のＥａｇＩ部位に、ＵＲＡ３遺伝子からの転写がＲＥＰ２転写と同じ方向になるように挿入されている（ＥＰ０２８６４２４参照）。Ｓ１５０−２Ｂ［ｃｉｒ^０］は、ｐＳＡＣ３００によりウラシル原栄養性へと形質転換された場合、２μｍのＵＬ領域にＵＲ４Ｓが挿入された比較ベクター（３０世代で０〜１０％のプラスミド欠損）よりもかなり安定性が低い（３０世代で５０％のプラスミド欠損）ことが示された(Chinery & Hinchliffe, 1989, Curr. Genet., 16, 21; ＥＰ０２８６４２４)。このように、ＥａｇＩ部位における挿入はＦＬＰと干渉している可能性があり、Bijvoet et al., 1991, Yeast, 7, 347によって確認されたように、挿入の位置が得られるプラスミドの安定性に多大な影響を及ぼし得ると結論づけられた。

２μｍ系プラスミドにさらなるポリヌクレオチド配列を挿入することが望ましい。例えば、宿主由来タンパク質、組換えタンパク質、または非コードアンチセンスもしくはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）転写物をコードするポリヌクレオチド配列の挿入が望ましい場合がある。さらに、複数のさらなるポリヌクレオチド配列を２μｍ系プラスミドに導入することで、例えば、複数個別にコードされているマルチサブユニットタンパク質、同じ代謝経路の異なるメンバー、付加的選択マーカーまたは組換えタンパク質（シングルサブユニットまたはマルチサブユニット）、および組換えタンパク質の発現を目的としたシャペロンをコードするプラスミドを提供することが望ましい。

しかしながら、６，３１８ｂｐの２μｍプラスミドおよび他の２μｍ系プラスミドは機能的遺伝エレメントで過密になっており(Sutton & Broach, 1985, Mol. Cell. Biol., 5, 2770; Broach et al, 1979, Cell, 16, 827)、プラスミドの安定性の低下を伴わずに、さらなるＤＮＡ配列の挿入のために存在している明瞭な位置がない。実際、複製起点とＤ遺伝子の遺伝子座との間の領域を除いて、２μｍプラスミドゲノム全体が少なくとも一つのポリ（Ａ）^＋種に転写され、多くの場合にはさらに多くのポリ（Ａ）^＋種に転写される(Sutton & Broach, 1985, Mol. Cell. Biol., 5, 2770)。結局のところ、ほとんどの挿入がin vivoにおいてプラスミド機能に悪影響を有するものと考えられる。

実際、当業者は２μｍ系プラスミドへの異種ポリヌクレオチド配列挿入に見切りをつけている。

Robinson et al, 1994, Bio/Technology, 12, 381-384には、サッカロミセス・セレビシエにおける付加的組換えＰＤＩ遺伝子コピーを用いて、ヒト血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）Ｂホモ二量体の組換え発現を１０倍増強でき、また、シゾサッカロミセス・ポムベ(Schizosacharomyces pombe)の酸性ホスファターゼの組換え発現を４倍増強できたことが報告されている。Robinsonは、付加的な染色体組込み型のＰＤＩ遺伝子コピーを用いて、ＰＤＧＦおよびＳ．ポムベ酸性ホスファターゼの発現に増強を認めた。Robinsonは、マルチコピー２μｍ発現ベクターを用いてＰＤＩタンパク質レベルを増強させる試みが異種タンパク質分泌に悪影響を及ぼしたことを報告している。

Shusta et al, 1998, Nature Biotechnology, 16, 773-777には、サッカロミセス・セレビシエにおける単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）の組換え発現が記載されている。Shustaは、酵母系において、宿主染色体への導入遺伝子の組込みとエピソーム発現ベクターの使用との間の選択が分泌に大きな影響を及ぼし得ることを報告しており、Parekh & Wittrup, 1997, Biotechnol. Prog., 13, 117-122によれば、δ組込みベクターを用いた宿主染色体へのｓｃＦｖ遺伝子の安定組込みは、２μｍ系発現プラスミドを使用するよりも優れていた。Parelkh & Wittrup（前掲）は、これまでに、ウシ膵臓トリプシンインヒビター（ＢＰＴＩ）の発現が、２μｍ系発現プラスミドよりも、δ組込みベクターを用いることにより大幅に増強されたことを教示している。この２μｍ系発現プラスミドは、異種分泌タンパク質の産生に関しては逆効果であるとされていた。

Bao et al, 2000, Yeast, 16, 329-341には、ＫｌＰＤＩ１遺伝子をＫ．ラクチス(K. luctis)のマルチコピープラスミドｐＫａｎ７０７に導入したこと、そして、このプラスミドの存在がこの株に低い増殖をもたらしたことが報告されている。これらのBao et al, 2000における初期の知見に鑑みて、Bao & Fukuhara, 2001, Gene, 272, 103-110では、宿主染色体上にＫｌＰＤＩ１の１回の重複を導入することが選択された。

よって、この技術は、マルチコピーベクターではなく、酵母染色体に導入遺伝子を組み込むことを当業者に教示している。従って、酵母を形質転換する別の方法が必要とされている。

本発明は、組換え改変型の２μｍ系プラスミドに関する。

２μｍ系プラスミドは環状二本鎖ＤＮＡプラスミドである。これは一般に、組換え挿入された配列を除いて、３，０００〜１０，０００ｂｐ、好ましくは４，５００〜７，０００ｂｐといった小さなものである。本発明での使用に好ましい２μｍ系プラスミドは、チゴサッカロミセス・ルクシーから得られるようなプラスミドｐＳＲ１、ｐＳＢ３またはｐＳＢ４、双方ともチゴサッカロミセス・バイリーから得られるようなｐＳＢ１またはｐＳＢ２、チゴサッカロミセス・フェルメンタチから得られるようなｐＳＭ１、クルイベロミセス・ドロソフィラルムから得られるようなｐＫＤ１、ピキア・メンブラネファシエンスから得られるようなｐＰＭ１、ならびに、例えば、Volkert et al, 1989, Microbiological Reviews, 53(3), 299-317, Murray et al, 1988, Mol. Biol., 200, 601-607およびPainting, et al., 1984, J. Applied Bacteriology, 56, 331に記載されている、サッカロミセス・セレビシエから得られるような２μｍプラスミドおよび変異体（例えば、Ｓｃｐ１、Ｓｃｐ２およびＳｃｐ３）の１以上に由来する配列を含む。

２μｍ系プラスミドは酵母集団内で安定なマルチコピー維持が可能であるが、必ずしも総ての２μｍ系プラスミドが総ての種類の酵母集団内で安定なマルチコピー維持が可能である必要はない。例えば、２μｍプラスミドは、とりわけ、サッカロミセス・セレビシエおよびサッカロミセス・カルスベルゲネシス内で安定なマルチコピー維持が可能である。

「マルチコピー維持」とは、プラスミドが各酵母細胞内において複数コピーで存在することを意味する。２μｍ系プラスミドを含む酵母細胞は［ｃｉｒ^＋］と呼ばれ、２μｍ系プラスミドを含まない酵母細胞は［ｃｉｒ^０］と呼ばれる。［ｃｉｒ^＋］酵母細胞は一般に、半数性ゲノム当たり１０〜１００コピー、例えば２０〜９０、より一般には３０〜８０、好ましくは４０〜７０、より好ましくは半数性ゲノム当たり５０〜６０コピーの２μｍ系プラスミドを含む。さらに、このプラスミドコピー数は、２μｍ様プラスミドのプラスミドコピー数を、半数性ゲノム当たり１００を超えるまでに高め得る宿主の遺伝的背景によって影響を受け得る(Gerbaud and Guerineau, 1980, Curr. Genetics, 1, 219, Holm, 1982, Cell, 29, 585, Sleep et al., 2001, Yeast, 18, 403およびＷ０９９／００５０４)。マルチコピー安定性は下記に定義される。

２μｍ系プラスミドは一般に、少なくとも３つのオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）を含み、その各々はマルチコピープラスミドとしての２μｍ系プラスミドの安定な維持において機能を持つタンパク質をコードしている。この３つのＯＲＦによりコードされているタンパク質は、ＦＬＰ、ＲＥＰ１およびＲＥＰ２と呼ばれている。２μｍ系プラスミドは、ＦＬＰ、ＲＥＰ１およびＲＥＰ２をコードする３つ総てのＯＲＦを含んでない場合には、不足しているタンパク質をコードするＯＲＦが、別のプラスミド上か、または染色体組込みによりトランスで提供されなければならない。

「ＦＬＰ」タンパク質は、ＦＬＰにより認識される逆方向反復配列の間での部位特異的組換えを触媒することができるタンパク質である。これらの逆方向反復配列はＦＬＰ組換え標的（ＦＲＴ）部位と呼ばれ、各々、一般に、さらに大きな逆方向反復の一部として存在する（下記参照）。好ましいＦＬＰタンパク質は、プラスミドｐＳＲ１、ｐＳＢ１、ｐＳＢ２、ｐＳＢ３、ｐＳＢ４、ｐＳＭ１、ｐＫＤ１、ｐＰＭ１、および、例えば、Volkert et al（前掲）、Murray et al（前掲）およびPainting et al（前掲）に記載の２μｍプラスミドの１つによりコードされているＦＬＰタンパク質の配列を含んでいる。これらのＦＬＰタンパク質の変異体および断片もまた本発明に含まれる。「断片」および「変異体」は、同じＦＲＴ配列の間の部位特異的組換えを触媒する天然タンパク質の能力を保持するものである。このような変異体および断片は通常、プラスミドｐＳＲ１、ｐＳＢ１、ｐＳＢ２、ｐＳＢ３、ｐＳＭ１、ｐＫＤ１および２μｍプラスミドの１つによりコードされているＦＬＰタンパク質と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上の相同性を有する。異なるＦＬＰタンパク質は異なるＦＲＴ配列特異性を有する可能性がある。典型的なＦＲＴ部位は逆方向反復配列によりフランキングされたコアヌクレオチド配列を含み得る。２μｍプラスミドでは、ＦＲＴコア配列は８ヌクレオチド長であり、フランキングしている逆方向反復配列は１３ヌクレオチド長である(Volkert et al, 前掲)。しかしながら、所定のＦＬＰタンパク質により認識されるＦＲＴ部位は、２μｍプラスミドＦＲＴ部位とは異なるものであり得る。

ＲＥＰ１およびＲＥＰ２は、細胞分裂の際のプラスミドコピーの分割に関与するタンパク質であり、また、ＦＬＰ発現の調節にも役割を果たし得る。異なる２μｍ系プラスミドに由来するＲＥＰ１タンパク質間で著しい配列の多様性が見られたが、異なる２μｍ系プラスミドに由来するＲＥＰ２タンパク質間では、これまでのところアライメントが可能な配列はない。好ましいＲＥＰ１およびＲＥＰ２タンパク質は、プラスミドｐＳＲ１、ｐＳＢ１、ｐＳＢ２、ｐＳＢ３、ｐＳＢ４、ｐＳＭ１、ｐＫＤ１、ｐＰＭ１、および、例えば、Volkert et al（前掲）、Murray et al（前掲）およびPinting et al（前掲）に記載の２μｍプラスミドの１つによりコードされているＲＥＰ１およびＲＥＰ２タンパク質の配列を含む。また、これらのＲＥＰ１およびＲＥＰ２タンパク質の変異体および断片も本発明に含まれる。ＲＥＰ１およびＲＥＰ２の「断片」および「変異体」は、天然ＯＲＦの代わりにプラスミドによってコードされている場合、好適な酵母集団内でプラスミドの安定なマルチコピー維持を妨げないものである。このようなＲＥＰ１およびＲＥＰ２の変異体および断片は通常、プラスミドｐＳＲ１、ｐＳＢ１、ｐＳＢ２、ｐＳＢ３、ｐＳＢ４、ｐＳＭ１、ｐＫＤ１、ｐＰＭ１および２μｍプラスミドの１つによりコードされているＲＥＰ１およびＲＥＰ２タンパク質と、それぞれ、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上の相同性を有する。

プラスミド上のＯＲＦによりコードされているＲＥＰ１およびＲＥＰ２タンパク質は適合するものでなければならない。ＲＥＰ１およびＲＥＰ２は、それらをコードするプラスミドの安定なマルチコピー維持に、プラスミドの他の機能的エレメントとの組合せにおいて寄与するものであれば適合している。ＲＥＰ１およびＲＥＰ２のＯＲＦが、それらをコードするプラスミドの安定なマルチコピー維持に寄与しているかどうかは、ＲＥＰ１およびＲＥＰ２のＯＲＦの各々が特異的に分断されている、このプラスミドの変異体を作製することにより判定することができる。ＯＲＦの分断によりプラスミドの安定なマルチコピー維持が損なわれれば、そのＯＲＦは非変異型においてプラスミドの安定なマルチコピー維持に寄与しているものと結論づけることができる。ＲＥＰ１およびＲＥＰ２タンパク質は、ｐＳＲ１、ｐＳＢ１、ｐＳＢ２、ｐＳＢ３、ｐＳＢ４、ｐＳＭ１、ｐＫＤ１、ｐＰＭ１および２μｍプラスミドなど、同じ天然の２μｍ系プラスミドによりコードされているＲＥＰ１およびＲＥＰ２タンパク質の配列、またはその変異体もしくは断片を有するのが好ましい。

２μｍ系プラスミドは２つの逆方向反復配列を含む。これらの逆方向反復は、それらが各々ＦＲＴ部位（上記参照）を含んでいる限り、どんな大きさであってもよい。これらの逆方向反復は一般に相同性が高い。それらは５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上の配列同一性を持ち得る。好ましい実施態様では、それらは同一である。一般に、これらの逆方向反復は各々２００〜１０００ｂｐの長さである。好ましい逆方向反復配列は、各々、２００〜３００ｂｐ、３００〜４００ｂｐ、４００〜５００ｂｐ、５００〜６００ｂｐ、６００〜７００ｂｐ、７００〜８００ｂｐ、８００〜９００ｂｐ、または９００〜１０００ｂｐの長さを持ち得る。特に好ましい逆方向反復は、プラスミドｐＳＲ１（９５９ｂｐ）、ｐＳＢ１（６７５ｂｐ）、ｐＳＢ２（４７７ｂｐ）、ｐＳＢ３（３９１ｂｐ）、ｐＳＭ１（３５２ｂｐ）、ｐＫＤ１（３４６ｂｐ）、２μｍプラスミド（５９９ｂｐ）、ｐＳＢ４およびｐＰＭ１のものである。

逆方向反復の配列は可変である。しかしながら、各逆方向反復のＦＲＴ部位の配列は、プラスミドによりコードされているＦＬＰタンパク質の特異性と適合し、それにより、コードされているＦＬＰタンパク質がプラスミドの逆方向反復配列間の部位特異的組換えを触媒する働きをすることができるものでなければならない。逆方向反復配列の組換え（つまり、ＦＬＰタンパク質が、そのプラスミドでＦＲＴ部位を認識する能力）は、当技術分野で公知の方法によって判定することができる。例えば、ＦＬＰの発現に有利な条件下の酵母細胞内のプラスミドを、プラスミドのある領域の別の領域に対する方向の変化によってもたらされる該プラスミドの制限プロフィールの変化に関してアッセイすることができる。制限プロフィールの変化の検出は、そのＦＬＰタンパク質がプラスミドのＦＲＴ部位を認識できること、従って、各逆方向反復のＦＲＴ部位がプラスミドによりコードされているＦＬＰタンパク質の特異性と適合することを示す。

特に好ましい実施態様では、ＦＲＴ部位をはじめとする、逆方向反復配列は、ｐＳＲ１、ｐＳＢ１、ｐＳＢ２、ｐＳＢ３、ｐＳＢ４、ｐＳＭ１、ｐＫＤ１、ｐＰＭ１または２μｍプラスミドなどの、ＦＬＰタンパク質をコードするＯＲＦと同じ２μｍ系プラスミドに由来するものである。

これらの逆方向反復は一般に、逆方向反復間に定義された２領域（例えば、２μｍプラスミドのＵＬおよびＵＳとして定義されるもの）が、導入遺伝子などの外から導入される配列を除いてほぼ同じ大きさとなるように２μｍ系プラスミド内に配置する。例えば、この２領域の一方は、他方の領域の長さの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上、１００％までに相当する長さであり得る。

２μｍ系プラスミドは、ＦＬＰをコードするＯＲＦと一方の逆方向反復（次の段落で述べる他の逆方向反復と区別するために、本明細書では「ＩＲ１」と呼ぶ）とを、例えば２μｍプラスミドに見られるような介在コード配列なしで、ＦＬＰＯＲＦの遠位末端にＩＲ１が来るように並列して含む。ここで「遠位末端」とは、プロモーターが転写を開始する末端とは反対側のＦＬＰＯＲＦ末端を意味する。好ましい実施態様では、ＦＬＰＯＲＦの遠位末端はＩＲ１と重複する。

２μｍ系プラスミドは、ＲＥＰ２をコードするＯＲＦと他方の逆方向反復（前の段落で述べたＩＲ１と区別するために、本明細書では「ＩＲ２」と呼ぶ）とを、例えば２μｍプラスミドに見られるような介在コード配列なしで、ＲＥＰ２ＯＲＦの遠位末端にＩＲ２が来るように並列して含む。ここで「遠位末端」とは、プロモーターがその転写を開始する末端とは反対側のＲＥＰ２ＯＲＦ末端を意味する。

一つの実施態様では、このＲＥＰ２およびＦＬＰをコードするＯＲＦは、２μｍ系プラスミドの逆方向反復間で定義された２領域のうち同じ領域に存在してもよく、この領域は大きい方の領域であっても小さい方の領域であってもよい（２領域の大きさが不等である場合）。

一つの実施態様では、このＲＥＰ２およびＦＬＰをコードするＯＲＦは互いに異なるプロモーターから転写され得る。

一般に、２μｍ系プラスミドの逆方向反復間に定義された領域（例えば、２μｍプラスミドのＵＬおよびＵＳとして定義されるもの）は、マルチコピープラスミドとして２μｍ系プラスミドの安定な維持において機能を果たすタンパク質をコードする多くとも２つの内因性遺伝子を含み得る。よって、好ましい実施態様では、逆方向反復に定義されたプラスミドの一方の領域は、内因性コード配列として、多くともＦＬＰとＲＥＰ２；ＦＬＰとＲＥＰ１；またはＲＥＰ１とＲＥＰ２をコードするＯＲＦを含み得る。

２μｍ系プラスミドは複製起点（自立複製配列「ＡＲＳ」としても知られる）を含み、これは一般に双方向性である。適当なＡＲＳ配列のいずれが存在してもよい。酵母染色体複製起点に典型的なコンセンサス配列が適当であり得る(Broach et al, 1982, Cold Spning Harbor Symp. Quant. Biol., 47, 1165-1174; Williamson, Yeast, 1985, 1, 1-14)。好ましいＡＲＳとしては、ｐＳＲ１、ｐＳＢ１、ｐＳＢ２，ｐＳＢ３、ｐＳＢ４、ｐＳＭ１、ｐＫＤ１、ｐＰＭ１および２μｍプラスミドから単離されたものが挙げられる。

よって、２μｍ系プラスミドは一般に、少なくとも、ＦＬＰおよびＲＥＰ２をコードするＯＲＦ、２つの逆方向反復配列（各々、ＦＬＰタンパク質に適合するＦＲＴ部位を含む逆方向反復）、およびＡＲＳ配列を含む。好ましくは、このプラスミドはまた、ＲＥＰ１をコードするＯＲＦも含むが、上述のように、それはトランスで提供されてもよい。好ましくは、ＦＲＴ部位は、コードされているＦＬＰタンパク質の配列と同じ２μｍ系プラスミドに由来するものとされる。好ましくは、コードされているＲＥＰ１およびＲＥＰ２タンパク質の配列は、互いに同じ２μｍ系プラスミドに由来するものとされる。より好ましくは、ＦＲＴ部位は、コードされているＦＬＰ、ＲＥＰ１およびＲＥＰ２タンパク質の配列と同じ２μｍ系プラスミドに由来するものとされる。さらに好ましくは、ＦＬＰ、ＲＥＰ１およびＲＥＰ２をコードするＯＲＦの配列ならびに逆方向反復の配列（ＦＲＴ部位を含む）は同じ２μｍ系プラスミドに由来するものとされる。さらに好ましくは、ＡＲＳ部位は、ＦＬＰ、ＲＥＰ１およびＲＥＰ２のＯＲＦの１以上のもの、ならびに逆方向反復の配列（ＦＲＴ部位を含む）と同じ２μｍ系プラスミドに由来するものとされる。好ましいプラスミドとしては、チゴサッカロミセス・ルクシーから得られるようなプラスミドｐＳＲ１、ｐＳＢ３またはｐＳＢ４、双方ともチゴサッカロミセス・バイリーから得られるようなｐＳＢ１またはｐＳＢ２、チゴサッカロミセス・フェルメンタチから得られるようなｐＳＭ１、クルイベロミセス・ドロソフィラルムから得られるようなｐＫＤ１、ピキア・メンブラネファシエンスから得られるようなｐＰＭ１、および、例えば、Volkert et al, 1989（前掲）, Murray et al（前掲）およびPainting et al（前掲）に記載のサッカロミセス・セレビシエから得られるような２μｍプラスミドが挙げられる。

場合によっては、２μｍ系プラスミドは、Volkert et al（前掲）に記載のような２μｍプラスミドのＳＴＢ領域（ＲＥＰＳとしても知られる）に相当する領域を含み得る。本発明による２μｍ系プラスミドにおけるこのＳＴＢ領域は、２以上の、例えば、３つ、４つ、５つまたはそれ以上のタンデム反復配列を含み得る。あるいは、タンデム反復配列は存在しなくてもよい。これらのタンデム反復はどんな大きさでもよく、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｂｐまたはそれ以上の長さである。２μｍプラスミドのＳＴＢ領域におけるタンデム反復は６２ｂｐの長さである。タンデム反復の配列は必ずしも同じでなくてもよい。若干の配列バリエーションは許容される。ＲＥＰ１およびＲＥＰ２ＯＲＦのいずれかまたは双方と同じプラスミド由来のＳＴＢ領域を選択するのが好ましい場合がある。ＳＴＢ領域はシス作用エレメントであると考えられ、好ましくは転写されない。

場合によっては、２μｍ系プラスミドは、マルチコピープラスミドとしての２μｍ系プラスミドの安定な維持において機能を果たすタンパク質をコードする付加的ＯＲＦを含んでもよい。この付加的タンパク質はＲＡＦまたはＤと呼ばれる。ＲＡＦまたはＤ遺伝子をコードするＯＲＦは、例えば、２μｍプラスミドおよびｐＳＭ１に見られる。よって、ＲＡＦまたはＤＯＲＦは、２μｍプラスミドまたはｐＳＭ１によりコードされているＲＡＦまたはＤ遺伝子ＯＲＦのタンパク質産物、またはその変異体および断片をコードするのに好適な配列を含み得る。よって、２μｍプラスミドまたはｐＳＭ１のＲＡＦまたはＤ遺伝子のタンパク質産物の変異体および断片もまた本発明に含まれる。２μｍプラスミドまたはｐＳＭ１のＲＡＦまたはＤ遺伝子のタンパク質産物の「断片」および「変異体」は、天然ＯＲＦの代わりに２μｍプラスミドまたはｐＳＭ１によりコードされていても、好適な酵母集団内でのプラスミドの安定なマルチコピー維持を妨げないものである。このような変異体および断片は、通常、２μｍプラスミドまたはｐＳＭ１によりコードされているＲＡＦまたはＤ遺伝子ＯＲＦのタンパク質産物と少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上の相同性を有する。

本発明によれば、ＲＥＰ２遺伝子またはＦＬＰ遺伝子の少なくともいずれか一方の最後の機能的コドンの１つ後の塩基と、該遺伝子に隣接する逆方向反復内のＦＲＴ部位の１つ前の塩基との間に、ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換を含んでなる２μｍ系プラスミドが提供される。

ポリヌクレオチド配列挿入は、プラスミドに挿入される任意の付加的ポリヌクレオチド配列である。好ましいポリヌクレオチド配列挿入は以下に説明する。欠失とは、１以上の塩基対の除去、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００まで、またはそれ以上の塩基対の除去であり、これはＤＮＡ配列内の１つの連続配列としてのものでも、離れた領域からのものでもよい。置換とは、１以上の塩基対の置き換え、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００まで、またはそれ以上の塩基対の置き換えであり、これはＤＮＡ配列内の１つの連続配列としてのものでも、離れた領域からのものでもよい。挿入、欠失または置換のいずれか２つ、あるいは３つ総てで領域を改変することもできる。

ＲＥＰ２遺伝子またはＦＬＰ遺伝子のいずれかの最後の機能的コドンとは、Chinery & Hinchliffe (1989, Cuir. Genet., 16, 21-25)で定義されるような試験によって判定した場合に、そのコドンを停止コドンで置換するとプラスミドのマルチコピー安定性に許容されない低下が起こるという、遺伝子のプロモーターから最下流にある該遺伝子のオープンリーディングフレームのコドンである。例えば、接種または継代培養計画に修正を加えることで、目的の世代数まで指数関数的対数増殖を維持するためには、Chinery & Hinchcliffeによって定義された試験を改変するのが適当であろう。これは、分析下の宿主株とChinery & Hinchcliffeが用いたＳ．セレビシエＳ１５０−２Ｂの間の違いを説明する助けとなり、かつ／あるいは２μｍ様プラスミドの小ＵＳ領域内の挿入部位、ならびに／または２μｍ様プラスミド内の挿入配列および／もしくは２μｍ様プラスミドの他所の挿入の大きさおよび性質など、２μｍ様プラスミドの他の違いの同定によって判定できるアッセイ下のプラスミドの個々の特徴に対して試験を最適化する助けとなり得る。Chinery & Hinchliffe (1989, Curr. Geneet., 16, 21-25)で定義されている非選択培地（ＹＰＤ、ＹＥＰＤとも呼ばれる）で増殖しない酵母には、他の非選択培地を用いてもよい。好適な別の非選択培地は、一般に、目的の世代数まで指数関数的対数増殖を可能とするものである。例えば、スクロースまたはグルコースを択一的炭素源として用いてもよい。プラスミドの安定性は、所定の世代数の後の、選択マーカーに対して原栄養性を残している細胞のパーセンテージとして定義することができる。世代数は、好ましくは、ｐＳＡＣ３５またはｐＳＡＣ３１０などの対照プラスミドとの違いを示すのに十分なものであるか、またはこのような対照プラスミドに匹敵する安定性を示すのに十分なものである。世代数は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上であってよい。世代数は多いほうが好ましい。許容されるプラスミド安定性は、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または実質的に１００％であり得る。パーセンテージは高いほうが好ましい。当業者ならば、プラスミドが非選択培地で増殖させた際には１００％に満たない安定性であったとしても、選択培地で培養する場合にも使用できることが分かるであろう。例えば、実施例に記載されているプラスミドｐＤＢ２７１１は、実施例１に従って安定性を判定した場合には１０％に過ぎなかったが、選択増殖条件下での振盪フラスコ培養では組換えトランスフェリン生産性に１．５倍の増強をもたらす。

よって、ＲＥＰ２またはＦＬＰ遺伝子を、どちらかの遺伝子における最後の機能的コドンの下流のいずれの点でポリヌクレオチド配列挿入、欠失または置換により分断しても、プラスミドのマルチコピー安定性の許容されない低下には至らない。本発明者らは、驚くべきことに、２μｍプラスミドのＦＬＰ遺伝子をコドン５９の後で分断できること、および２μｍプラスミドのＲＥＰ２遺伝子をコドン３４４の後で分断できること、そして、いずれもそのプラスミドのマルチコピー安定性に許容されない低下をもたらさないことを見出した。他の２μｍ系プラスミドにおける等価の遺伝子の最後の機能的コドンは、通常、上記のように関連遺伝子を改変し、安定性を判定することによって決定することができる。よって、一般に、本発明による改変プラスミドは、それらに対して行われた改変がプラスミドのマルチコピー安定性に許容されない低下をもたらさないという点で安定である。

本発明による２μｍプラスミドにおけるＲＥＰ２およびＦＬＰ遺伝子は、それぞれ隣接する逆方向反復を有する。逆方向反復は、（逆転させれば）同じプラスミド内の別の逆方向反復と一致するので、確認することができる。「隣接する」とは、ＦＬＰまたはＲＥＰ２遺伝子およびその逆方向反復が、例えば２μｍプラスミドに見られるようにコード配列に介在することなく、逆方向反復が遺伝子の遠位末端に来るように隣接していることを意味する。ここで「遠位末端」とは、プロモーターが転写を開始する末端とは反対側の遺伝子の末端を意味する。好ましい実施態様では、この遺伝子の遠位末端は逆方向反復と重複する。

本発明の第一の好ましい態様によれば、ポリヌクレオチド配列挿入、欠失および／または置換は、ＲＥＰ２遺伝子の最後の機能的コドンの１つ後の塩基と、該遺伝子に隣接する逆方向反復内のＦＲＴ部位の１つ前の塩基との間、好ましくは、逆方向反復の最初の塩基とＦＲＴ部位の１つ前の塩基との間、より好ましくは、ＲＥＰ２遺伝子の翻訳終結コドンの後の位置とＦＲＴ部位の１つ前の塩基との間に存在する。

ここで「〜の間」とは、定義された外側の限界点を含み、従って、例えば、「ＲＥＰ２遺伝子の最後の機能的コドンの１つ後の塩基とＦＲＴ部位の１つ前の塩基との間」の挿入、欠失および／または置換は、ＲＥＰ２遺伝子の最後の機能的コドンの１つ後の塩基における挿入、欠失および／または置換と、ＦＲＴ部位の１つ前の塩基における挿入、欠失および／または置換を含む。

本発明の第二の好ましい態様によれば、ポリヌクレオチド配列挿入、欠失および／または置換は、ＦＬＰ遺伝子の最後の機能的コドンの１つ後の塩基と、該遺伝子に隣接する逆方向反復内のＦＲＴ部位の１つ前の塩基との間、好ましくは、逆方向反復の最初の塩基とＦＲＴ部位の１つ前の塩基との間、より好ましくは、ＦＬＰコード配列の終末端の１つ後の塩基とＦＲＴ部位の１つ前の塩基との間、例えば、ＦＬＰコード配列の終末端の１つ後の塩基に存在する。このポリヌクレオチド配列挿入、欠失および／または置換は、ＦＬＰの終末端の１つ後の塩基と逆方向反復内のＦｓｐＩ部位との間に存在してもよいが、場合によっては、ＦｓｐＩ部位内にはない。

一つの実施態様では、ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換を除き、ＦＬＰ遺伝子および／またはＲＥＰ２遺伝子は、天然２μｍ系プラスミドに由来する、それぞれＦＬＰ遺伝子および／またはＲＥＰ２遺伝子の配列を有する。

「〜に由来する」とは、それらが由来する配列と同一の配列を有する配列を含む。しかしながら、上記で定義したように、その変異体および断片も含まれる。例えば、２μｍプラスミドのＦＬＰ遺伝子に由来する配列を有するＦＬＰ遺伝子は、改変型プロモーターまたは天然遺伝子のものに匹敵する他の調節配列を有してもよい。あるいは、２μｍプラスミドのＦＬＰ遺伝子に由来する配列を有するＦＬＰ遺伝子は、天然遺伝子と同じタンパク質をコードし得るか、または改変ＦＬＰタンパク質をコードし得るオープンリーディングフレーム内に、改変されたヌクレオチド配列を有していてもよい。同じ考え方が、特定の供給源に由来する配列を有するＲＥＰ２遺伝子にも当てはまる。

天然２μｍ系プラスミドは、２μｍ系プラスミドに不可欠な特徴として上記で定義した特徴を有するいずれのプラスミドであってもよく、このプラスミドは酵母に天然に存在することが分かっており、すなわち、異種配列を含むように組換え改変されていない。好ましくは、天然２μｍ系プラスミドは、チゴサッカロミセス・ルクシーから得られるようなｐＳＲ１（受託番号Ｘ０２３９８）、ｐＳＢ３（受託番号Ｘ０２６０８）またはｐＳＢ４、双方ともチゴサッカロミセス・バイリーから得られるようなｐＳＢ１またはｐＳＢ２（受託番号ＮＣ＿００２０５５またはＭ１８２７４）、チゴサッカロミセス・フェルメンタチから得られるようなｐＳＭ１（受託番号ＮＣ＿００２０５４）、クルイベロミセス・ドロソフィラルムから得られるようなｐＫＤ１（受託番号Ｘ０３９６１）、ピキア・メンブラネファシエンスから得られるようなｐＰＭ１、または最も好ましくは、サッカロミセス・セレビシエから得られるような２μｍプラスミド（受託番号ＮＣ＿００１３９８またはＪ０１３４７）から選択される。受託番号はＮＣＢＩにおける寄託物を参照したものである。

好ましくは、ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換を除き、該ＦＬＰおよび／またはＲＥＰ２遺伝子に隣接する逆方向反復の配列は、その遺伝子が由来する配列と同じ天然２μｍ系プラスミドの対応逆方向反復の配列に由来している。よって、例えば、ＦＬＰ遺伝子がＳ．セレビシエから得られるような２μｍプラスミドに由来しているならば、ＦＬＰ遺伝子に隣接する逆方向反復は、Ｓ．セレビシエから得られるような２μｍプラスミドにおけるＦＬＰ遺伝子に隣接する逆方向反復に由来する配列を有することが好ましい。ＲＥＰ２遺伝子がＳ．セレビシエから得られるような２μｍプラスミドに由来しているならば、ＲＥＰ２遺伝子に隣接する逆方向反復は、Ｓ．セレビシエから得られるような２μｍプラスミドにおけるＲＥＰ２遺伝子に隣接している逆方向反復に由来する配列を有することが好ましい。

ここで、本発明の第一の好ましい態様によれば、ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換を除き、ＲＥＰ２遺伝子および逆方向反復配列がＳ．セレビシエから得られるような２μｍプラスミドの対応領域に由来する配列を有している場合には、ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換は、ＲＥＰ遺伝子のコドン５９の最初の塩基と、隣接する逆方向反復内のＦＲＴ部位の１つ前の塩基の間の位置に存在するのが好ましく、逆方向反復の最初の塩基とＦＲＴ部位の１つ前の塩基との間の位置に存在するのがより好ましく、ＲＥＰ２遺伝子の翻訳終結コドンの後の位置とＦＲＴ部位の１つ前の塩基との間に存在するのがさらに好ましく、例えば、ＲＥＰ２コード配列の終末端の１つ後の塩基に存在する。

ここで、ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換を除き、ＲＥＰ２遺伝子および逆方向反復配列はＳ．セレビシエから得られるような２μｍプラスミドの対応領域に由来する配列を有し、一つの態様では、ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換を除き、ＲＥＰ２遺伝子および隣接する逆方向反復の配列は配列番号１で定義されるようなもの、またはその変異体である。配列番号１では、ＲＥＰ２遺伝子のコドン５９の第一の塩基は塩基番号１７５で表され、ＦＲＴ部位の１つ前の塩基は塩基番号１２１６で表される。ここで示したＦＲＴ配列は、Sadowski et al, 1986, pp7-10, Mechanisms of Yeast Recombination (Current Communications in Molecular Biology) CSHL. Ed. Klar, A. Strathern, J. N.からの５５塩基対の配列である。配列番号１では、逆方向反復の最初の塩基は塩基番号８８７で表され、ＲＥＰ２遺伝子の翻訳終結コドンの１つ後の塩基は塩基番号８９２で表される。

本発明の第一の態様のさらに好ましい実施態様によれば、ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換を除き、ＲＥＰ２遺伝子および逆方向反復配列は、Ｓ．セレビシエから得られるような２μｍのプラスミドの対応領域に由来する配列を有し、ポリヌクレオチド配列挿入、欠失および／または置換による介在がない場合には逆方向反復内にＸｃｍＩ部位またはＦｓｐＩ部位を含み、このポリヌクレオチド配列挿入、欠失および／または置換はＸｃｍＩ部位またはＦｓｐＩ部位に存在する。配列番号１では、ＸｃｍＩ部位は塩基番号９３５〜９４９で表され、ＦｓｐＩ部位は塩基番号１１７２〜１１７７で表される。

ここで、本発明の第二の好ましい態様によれば、ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換を除き、ＦＬＰ遺伝子および隣接する逆方向反復配列は、Ｓ．セレビシエから得られるような２μｍプラスミドの対応領域に由来する配列を有し、このポリヌクレオチド配列挿入、欠失および／または置換は、ＦＬＰ遺伝子のコドン３４４の最初の塩基とＦＲＴ部位の１つ前の塩基との間に存在するのが好ましく、逆方向反復の最初の塩基とＦＲＴ部位の１つ前の塩基との間に存在するのがより好ましく、ＦＬＰコード配列の終末端の１つ後の塩基とＦＲＴ部位の１つ前の塩基との間に存在するのがさらに好ましく、例えば、ＦＬＰコード配列の終末端の１つ後の塩基に存在する。ＦＬＰ遺伝子とＦＲＴ部位の間のＦｓｐＩ部位は挿入部位として避けることができる。

ここで、ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換を除き、ＦＬＰ遺伝子および隣接する逆方向反復配列は、Ｓ．セレビシエから得られるような２μｍプラスミドの対応領域に由来する配列を有し、一つの実施態様では、ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換を除き、ＦＬＰ遺伝子とＦＬＰ遺伝子の後に続く逆方向反復の配列は、配列番号２で定義されるようなもの、またはその変異体である。配列番号２では、ＦＬＰ遺伝子のコドン３４４の最初の塩基は塩基番号１０３０で表され、ＦＲＴ部位の１つ前の塩基は塩基番号１４１９で表され、逆方向反復の最初の塩基は塩基番号１０９０で表され、ＦＬＰコード配列の終末端の１つ後の塩基は塩基番号１２７３で表される。

本発明の第二の好ましい態様のさらに好ましい実施態様によれば、ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換を除き、ＦＬＰ遺伝子および隣接する逆方向反復配列は、Ｓ．セレビシエから得られるような２μｍプラスミドの対応領域に由来する配列を有し、ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換が存在しない場合には、逆方向反復内にＨｇａＩ部位またはＦｓｐＩ部位を含み、ポリヌクレオチド配列挿入、欠失および／または置換は、ＨｇａＩ部位上のＨｇａＩの作用により生じる切断部（ＨｇａＩはそれが認識する５ｂｐの配列の外側を切断する）か、またはＦｓｐＩ部に存在する。配列番号２では、ＨｇａＩ部位は塩基番号１２６２〜１２６６で表され、ＦｓｐＩ部位は塩基番号１３７５〜１３８０で表される。

当業者ならば、本発明の第一および第二の好ましい態様によって定義されたプラスミドの特徴が相容れないものではないことが分かるであろう。よって、本発明の第三の好ましい態様によるプラスミドは、ＲＥＰ２遺伝子およびＦＬＰ遺伝子の双方の最後の機能的コドンの１つ後の塩基と、該遺伝子の各々に隣接する逆方向反復内のＦＲＴ部位の１つ前の塩基との間にポリヌクレオチド配列挿入、欠失および／または置換を含むことができ、これらのポリヌクレオチド配列挿入、欠失および／または置換は同じであっても異なっていてもよい。例えば、本発明の第三の態様によるプラスミドは、ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換を除き、配列番号１の配列またはその変異体と配列番号２の配列またはその変異体を含み、その各々は、それぞれ本発明の第一および第二の好ましい態様に関して上記で定義したような位置にポリヌクレオチド配列挿入、欠失および／または置換を含む。

当業者ならば、本発明の第一、第二および第三の好ましい態様によって定義されたプラスミドの特徴が他の配列改変も有するプラスミドの可能性を排除するものではないことが分かるであろう。よって、本発明の第一、第二および第三の好ましい態様による２μｍ系プラスミドは、上記で定義した位置にはないポリヌクレオチド配列挿入、欠失および／または置換もさらに含み得る。従って、このプラスミドは、本発明による挿入部位以外の部位にも導入遺伝子をさらに含み得る。

２μｍプラスミドにおける別の挿入部位も当技術分野では公知であるが、本発明によって定義される挿入部位を用いる利点が得られない。しかしながら、やはり、当技術分野で公知の部位におけるポリヌクレオチド配列挿入、欠失および／または置換をすでに含んでいるプラスミドを、本発明の第一、第二および第三の好ましい態様によって定義される１以上の部位において１以上のさらなる改変を作出することによりさらに改変することができる。当業者ならば、本明細書の導入部で述べたように、本発明の第一および第二の態様によって定義されたもの以外の２μｍ系プラスミドの部位における導入遺伝子の挿入の際に存在する大きな技術的限界があることが分かるであろう。

当技術分野で公知の典型的な改変型２μｍプラスミドとしては、Rose & Broach (1990, Methods Enzymol., 185, 234-279)に記載されているもの、例えば、ＦＬＰのＥｃｏＲＩにおける挿入を用いるプラスミドｐＣＶ１９、ｐＣＶ２０、ＣＶ_ｎｅｏ；ＤのＥｃｏＲＩを挿入部位として用いるプラスミドｐＣＶ２１、ｐＧＴ４１およびｐＹＥ；ＤのＰｓｔＩを挿入部位として用いるプラスミドｐＨＫＢ５２；ＤのＰｓｔＩおよびＤのＥｃｏＲＩにおける挿入を用いるプラスミドｐＪＤＢ２４８；ＤのＰｓｔＩおよびＦＬＰのＥｃｏＲＩを挿入部位として用いるプラスミドｐＪＤＢ２１９；プラスミドＧ１８；ＦＬＰのＣｌａＩにおける挿入を用いる、プラスミドｐＡＢ１８；プラスミドｐＧＴ３９およびｐＡ３；ＤのＰｓｔＩを挿入部位として用いるプラスミドｐＹＴ１１、ｐＹＴ１４およびｐＹＴ１１−ＬＥＵ；ならびにＦＬＰのＥｃｏＲＩを挿入部位として用いるプラスミドＰＴＹ３９が挙げられる。他の２μｍプラスミドとしては、ｐＳＡＣ３、ｐＳＡＣ３Ｕ１、ｐＳＡＣ３Ｕ２、ｐＳＡＣ３００、ｐＳＡＣ３１０、ｐＳＡＣ３Ｃ１、ｐＳＡＣ３ＰＬ１、ｐＳＡＣ３ＳＬ４、およびｐＳＡＣ３ＳＣ１が挙げられ、ＥＰ０２８６４２４およびChinery & Hinchliffe (1989, Curr, Genet., 16, 21-25)に記載されており、これにはまた適当な２μｍ挿入部位としてＰｓｔＩ、ＥａｇＩまたはＳｎａＢＩが記載されている。２μｍプラスミドとしては、さらに、ｐＡＹＥ２５５、ｐＡＹＥ３１６、ｐＡＹＥ４４３、ｐＡＹＥ５２２(Kerry-Williams et al, 1998, Yeast, 14, 161-169)、ｐＤＢ２２４４（ＷＯ００／４４７７２）およびｐＡＹＥ３２９(Sleep et al, 2001, Yeast, 18, 403-421)が挙げられる。

一つの好ましい実施態様では、本発明の第一、第二および第三の態様によって定義される２μｍ系プラスミドはさらに、ＡＲＳ配列の前後の非転写領域内に存在するポリヌクレオチド配列挿入、欠失および／または置換を含む。例えば、Ｓ．セレビシエから得られる２μｍプラスミドでは、このＡＲＳ配列前後の非転写領域はＤ遺伝子の終末端からＡＲＳ配列の開始部にまで及ぶ。ＳｎａＢＩへの挿入（配列ＡＲＳの複製起点付近）はChinery & Hinchliffe, 1989, Curr. Genet., 16, 21-25に記載されている。当業者ならば、付加的なポリヌクレオチド配列挿入、欠失および／または置換は、Chinery & Hinchliffeにより記載されている非転写領域内のＳｎａＢＩ部位付近の位置に存在し得ることが分かるであろう。

本発明の第一、第二および第三態様のいずれかによるプラスミドは、酵母、例えば、サッカロミセス属、クルイベロミセス属、チゴサッカロミセス属またはピキア属のメンバー、例えば、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・カルルスベルゲネシス、クルイベロミセス・ラクチス、ピキア・パストリスおよびピキア・メンブラネファシエンス、チゴサッカロミセス・ルクシー、チゴサッカロミセス・バイリー、チゴサッカロミセス・フェルメンタチ、またはクルイベロミセス・ドロソフィラルムにおいて自己複製可能なプラスミドであり得る。Ｓ．セレビシエおよびＳ．カルルスベルゲネシスが既知の総ての２μｍプラスミドの自己複製に好適な宿主細胞となると考えられる。

好ましい実施態様では、本発明による２μｍ系プラスミドに含まれている前記ポリヌクレオチド配列挿入、欠失および／または置換、またはその少なくとも一つは、ポリヌクレオチド配列挿入とされる。プラスミドの安定性に対して許容されないほどの害がない限り、どんなポリヌクレオチド配列挿入でも使用可能であり、これは、このプラスミドが非改変プラスミドに比べて、ＹＥＰＤなどの非選択培地上で少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または実質的に１００％安定であることを意味し、この最後のものは１００％の安定性と呼ばれる。好ましくは、上述の安定性のレベルは、培養培地中で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上の世代の間、改変型プラスミドおよび非改変型プラスミドを含む酵母細胞を個別に培養した後に見られる。

プラスミドが選択マーカーを含む場合、形質転換体を選択条件下（例えば、最小培地中）で増殖させると、この培地はプラスミドを保持するように宿主に選択圧をかけることができるので、高いレベルの安定性が得られる。

非選択培地および選択（例えば、最小）培地における安定性は、上記した方法を用いて判定することができる。選択培地における安定性は、そのプラスミドを用いて酵母を原栄養性へと形質転換できるかどうかを調べることによって証明することができる。

一般に、ポリヌクレオチド配列挿入は、少なくとも４、６、８、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００塩基対またはそれ以上の長さである。通常、このポリヌクレオチド配列挿入は、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂまで、またはそれ以上の長さである。当業者ならば、本発明による２μｍプラスミドはプラスミド内の異なる部位に複数のポリヌクレオチド配列挿入を含み得ることが分かるであろう。一般に、ポリヌクレオチド配列挿入の全長は、多くとも５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂまたは３０ｋであるが、それより大きい全長の挿入も可能である。

このポリヌクレオチド配列は、新たな制限部位を導入するために用いるリンカー配列であってもなくてもよい。例えば、さらなる制限部位（例えば、ＢａｍＨＩ）を導入するために、合成リンカーをＦＬＰ遺伝子の後のＦｓｐＩ部位に導入してもしなくてもよい。

このポリヌクレオチド配列挿入は転写領域を含んでもよいし、転写領域を含まなくてもよい。転写領域はオープンリーディングフレームをコードしてもよいし、非コードでもよい。このポリヌクレオチド配列挿入は転写領域と非転写領域の双方を含んでもよい。

転写領域とは、ＲＮＡポリメラーゼ、一般には酵母ＲＮＡポリメラーゼによって転写可能なＤＮＡの領域である。転写領域は機能的ＲＮＡ分子、例えば、リボゾームＲＮＡもしくはトランスファーＲＮＡ、またはアンチセンスもしくはＲＮＡ干渉（「ＲＮＡｉ」）分子として働き得るＲＮＡ分子をコードすることができる。あるいは、転写領域はメッセンジャーＲＮＡ分子（ｍＲＮＡ）をコードすることができ、このｍＲＮＡは、in vivoで翻訳されてタンパク質を産生できるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むことができる。本明細書において「タンパク質」とは、天然および非天然のタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドのあらゆるものを含む。好ましくは、ＯＲＦは異種タンパク質をコードしている。「異種タンパク質」とは、２μｍ系プラスミドにより、天然ではコードされていないタンパク質（すなわち、「非２μｍ系プラスミドタンパク質」）を意味する。便宜上、「異種タンパク質」および「非２μｍ系プラスミドタンパク質」は、本明細書を通じて同義で用いる。よって、好ましくは、異種タンパク質は、Ｚ．ルクシーから得られるようなｐＳＲ１、ｐＳＢ３またはｐＳＢ４；双方ともＺ．バイリーから得られるようなｐＳＢ１またはｐＳＢ２；Ｚ．フェルメンタチから得られるようなｐＳＭ１；Ｋ．ドロソフィラルムから得られるようなｐＫＤ１；Ｐ．メンブラネファシエンスから得られるようなｐＰＭ１；およびＳ．セレビシエから得られるような２μｍプラスミドのいずれか一つによりコードされているＦＬＰ、ＲＥＰ１、ＲＥＰ２、またはＲＡＦ／Ｄタンパク質ではない。

ポリヌクレオチド配列挿入がオープンリーディングフレームをコードしている場合、それは、オープンリーディングフレームをコードしてないポリヌクレオチド配列（「非コード領域」と呼ばれる）もいくらかさらに含んでもよい。

ポリヌクレオチド配列挿入中の非コード領域は、オープンリーディングフレームに作動可能なように連結された１以上の調節配列を含んでよく、これにより、オープンリーディングフレームの転写および／またはその結果生じた転写物の翻訳が可能となる。

「調節配列」とは、それが作動可能なように連結されたオープンリーディングフレームの発現（すなわち、転写および／または翻訳）を調節する（すなわち、促進する、または低下させる）配列を意味する。調節領域は一般に、プロモーター、ターミネーター、リボソーム結合部位などを含む。当業者ならば、調節領域の選択が意図する発現系によって異なることが分かるであろう。例えば、プロモーターは構成型であっても誘導型であってもよく、細胞種または組織種に特異的であっても非特異的であってもよい。

発現系がサッカロミセス・セレビシエなどの酵母である場合、Ｓ．セレビシエの好適なプロモーターとしては、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＡＬ１またはＧＡＬ１０遺伝子、ＴＥＦ１、ＴＥＦ２、ＰＹＫ１、ＰＭＡ１、ＣＹＣ１、ＰＨＯ５、ＴＲＰ１、４ＤＨ１、ＡＤＨ２、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコキナーゼ、α−接合因子フェロモン、ａ−接合因子フェロモン、ＰＲＢ１プロモーター、ＰＲＡ１プロモーター、ＧＰＤ１プロモーター、および５’調節領域の部分と他のプロモーターの５’調節領域の部分との、または上流活性化部位とのハイブリッドを含むハイブリッドプロモーター（例えば、ＥＰ−Ａ−２５８０６７のプロモーター）と会合するものが挙げられる。

好適な転写終結シグナルは当技術分野で周知のものである。宿主細胞が真核生物である場合、転写終結シグナルは、好ましくは転写終結およびポリアデニル化に適切なシグナルを含む真核生物遺伝子の３’フランキング配列に由来するものである。好適な３’フランキング配列は、例えば、用いる発現制御配列に本来会合している遺伝子のものであってよく、すなわち、そのプロモーターに対応し得る。あるいは、それらは異なってもよい。その場合、宿主が酵母、好ましくはＳ．セレビシエ、であれば、Ｓ．セレビシエＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＣＹＣ１、またはＰＧＫ１遺伝子の終結シグナルが好ましい。

２μｍ遺伝子などの隣接する遺伝子への転写の読み過ごしを防ぐためには、シャペロンＰＤＩ１のものなど、異種遺伝子のプロモーターおよびオープンリーディングフレームに転写終結配列がフランキングしていて、転写終結配列がプロモーターおよびオープンリーディングフレームの上流および下流の双方に配置されていることが有利であり得る（また、その逆の場合もある）。

一つの実施態様では、サッカロミセス・セレビシエなどの酵母において有利な調節配列としては、ＥＰ４３１８８０で教示されているような酵母プロモーター（例えば、サッカロミセス・セレビシエＰＲＢ１プロモーター）；および転写ターミネーター、好ましくはＥＰ６００５７で教示されているようなサッカロミセスＡＤＨ１由来のターミネーターが挙げられる。

翻訳の読み過ごしを最小限とし、ひいては、延長された非天然融合タンパク質の生産を避けるためには、非コード領域には、ＵＡＡ、ＵＡＧまたはＵＧＡなどの翻訳停止コドンをコードする１を超えるＤＮＡ配列を組み込むことが有利であり得る。翻訳停止コドンＵＡＡが好ましい。好ましくは、少なくとも２つの翻訳停止コドンを組み込む。

「作動可能なように連結される」とは、その意味の範囲内に、調節配列が、その調節領域が意図した様式でオープンリーディングフレームに作用を発揮できるオープンリーディングフレームとの関係を形成するように非コード領域内に配置されることを含む。このように、オープンリーディングフレームに「作動可能なように連結される」調節領域は、その調節領域が、調節配列に適合した条件下、意図した様式でオープンリーディングフレームの転写および／または翻訳に影響を及ぼし得るように配置される。

本発明の第一、第二または第三の態様によって定義されるポリヌクレオチド配列挿入が、タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む場合、コードされているタンパク質が分泌されるのが有利であり得る。この場合、分泌リーダー配列をコードする配列がオープンリーディングフレームに含まれていてよい。

酵母サッカロミセス・セレビシエ、チゴサッカロミセス種、クルイベロミセス・ラクチスおよびピキア・パストリスなどの真核生物種におけるタンパク質の生産では、既知のリーダー配列としては、Ｓ．セレビシエ酸性ホスファターゼタンパク質（Ｐｈｏ５ｐ）（ＥＰ３６６４００参照）、インベルターゼタンパク質（Ｓｕｃ２ｐ）（Smith et al. (1985) Science, 229, 1219-1224参照）および熱ショックタンパク質−１５０（Ｈｓｐ１５０ｐ）（ＷＯ９５／３３８３３参照）由来のものが挙げられる。さらに、Ｓ．セレビシエ接合因子α−１タンパク質（ＭＦα−１）由来、ならびにヒトリゾチームおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）タンパク質由来のリーダー配列が使用されており、ヒトアルブミン分泌のためには後者のものが特に使用されているが、他を排除するものではない。ＷＯ９０／０１０６３は、ＭＦα−１とＨＳＡリーダー配列の融合を記載しており、これはＭＦα−１リーダー配列を使用するよりも、混入するヒトアルブミン断片の生産を有利に減じる。さらに、天然トランスフェリンリーダー配列を用いて、トランスフェリンおよび他の異種タンパク質の分泌を指示してもよい。

あるいは、コードされているタンパク質は細胞内のものであってもよい。

１つの好ましい実施態様では、本発明の第一、第二または第三の態様によって定義される少なくとも一つのポリヌクレオチド配列挿入には、酵母タンパク質をコードする配列を含むオープンリーディングフレームが含まれる。もう１つの好ましい実施態様では、本発明の第一、第二または第三の態様によって定義される少なくとも一つのポリヌクレオチド配列挿入には、２μｍ様プラスミドが由来している同じ宿主からの酵母タンパク質をコードする配列を含むオープンリーディングフレームが含まれる。

もう１つの好ましい実施態様では、、本発明の第一、第二または第三の態様によって定義される少なくとも一つのポリヌクレオチド配列挿入には、タンパク質フォールディングに関与するか、またはシャペロン活性を有するか、または折り畳み異常タンパク質応答に関与するタンパク質をコードする配列を含むオープンリーディングフレームが含まれる（スタンフォードゲノムデータベース（ＳＧＤ）、http:://db.yeastgenome.org）。好ましいタンパク質は、ＡＨＡ１、ＣＣＴ２、ＣＣＴ３、ＣＣＴ４、ＣＣＴ５、ＣＣＴ６、ＣＣＴ７、ＣＣＴ８、ＣＮＳ１、ＣＰＲ３、ＣＰＲ６、ＥＲＯ１、ＥＵＧ１、ＦＭＯ１、ＨＣＨ１、ＨＳＰ１０、ＨＳＰ１２、ＨＳＰ１０４、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ３０、ＨＳＰ４２、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７８、ＨＳＰ８２、ＪＥＭ１、ＭＤＪ１、ＭＤＪ２、ＭＰＤ１、ＭＰＤ２、ＰＤＩ１、ＰＦＤ１、ＡＢＣ１、ＡＰＪ１、ＡＴＰ１１、ＡＴＰ１２、ＢＴＴ１、ＣＤＣ３７、ＣＮＳ１、ＣＰＲ６、ＣＰＲ７、ＨＳＣ８２、ＫＡＲ２、ＬＨＳ１、ＭＧＥ１、ＭＲＳ１１、ＮＯＢ１、ＥＣＭ１０、ＳＳＡ１、ＳＳＡ２、ＳＳＡ３、ＳＳＡ４、ＳＳＣ１、ＳＳＥ２、ＳＩＬ１、ＳＬＳ１、ＯＲＭ１、ＵＢＩ４、ＯＲＭ２、ＰＥＲ１、ＰＴＣ２、ＰＳＥ１およびＨＡＣ１または末端切断型イントロンレスＨＡＣ１(Valkonen et al. 2003, Applied Environ. Micro. 69, 2065)によりコードされているタンパク質から選択することができる。

タンパク質フォールディングに関与する好ましいタンパク質、またはシャペロン活性を有するタンパク質、または折り畳み異常タンパク質応答に関与するタンパク質としては次のものが挙げられる。

・熱ショックタンパク質、例えば、ｈｓｐ７０ファミリータンパク質のメンバーであるタンパク質（Ｋａｒ２ｐ、ＳＳＡおよびＳＳＢタンパク質、例えば、ＳＳＡ１、ＳＳＡ２、ＳＳＡ３、ＳＳＡ４、ＳＳＢ１およびＳＳＢ２タンパク質によりコードされているタンパク質を含む）、ＨＳＰ９０ファミリーのメンバーであるタンパク質、またはＨＳＰ４０ファミリーのメンバーであるタンパク質もしくはそれらの調節に関与するタンパク質（例えば、Ｓｉｌｌｐ）（ＤＮＡ−ＪおよびＤＮＡ−Ｊ様タンパク質（例えば、Ｊｅｍ１ｐ、Ｍｄｊ２ｐを含む）。
・カリオフェリン／インポーチンファミリータンパク質のメンバーであるタンパク質、例えば、カリオフェリン／インポーチンタンパク質のαまたはＢファミリー、例えば、ＰＳＥ１によりコードされているカリオフェリンβタンパク質。
・Hjelmqvist et al, 2002, Genome Biology, 3(6), research0027.1-0027.16が記載しているＯＲＭＤＬファミリーのメンバーであるタンパク質、例えばＯｒｍ２ｐ。
・小胞体または分泌経路の他所、例えばゴルジ体に本来存在するタンパク質。例えば、小胞体（ＥＲ）の管腔、特にＰＤＩなどの分泌細胞で本来働くタンパク質。
・ＥＲに固定されているトランスメンブランタンパク質であるタンパク質、例えば、Hjelmqvist et al, 2002, 前掲が記載しているＯＲＭＤＬファミリーのメンバー（例えば、Ｏｒｍ２ｐ）。
・サイトゾルで働くタンパク質、例えば、ｈｓｐ７０タンパク質（ＳＳＡおよびＳＳＢタンパク質、例えば、ＳＳＡ１、ＳＳＡ２、ＳＳＡ３、ＳＳＡ４、ＳＳＢ１およびＳＳＢ２によりコードされているタンパク質を含む）。
・核、核エンベロープおよび／または細胞質で働くタンパク質、例えば、Ｐｓｅ１ｐ。
・細胞の生存力に必須のタンパク質、例えば、ＰＤＩまたは必須カリオフェリンタンパク質、例えば、Ｐｓｅ１ｐ。
・スルヒドリル酸化またはジスルフィド結合の形成、切断または異性化に関与するタンパク質、または特に分離タンパク質および細胞表面タンパク質の生合成中にタンパク質のチオール：ジスルフィド交換反応を触媒するタンパク質、例えば、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（例えば、Ｐｄｉ１ｐ、Ｍｐｄ１ｐ）、ホモログ（例えば、Ｅｕｇ１ｐ）および／または関連タンパク質（例えば、Ｍｐｄ２ｐ、Ｆｍｏ１ｐ、Ｅｒｏ１ｐ）。
・タンパク質合成、アセンブリまたはフォールディングに関与するタンパク質、例えば、ＰＤＩおよびＳｓａ１ｐ。
・成熟タンパク質よりも折り畳まれていないタンパク質に優先的または排他的に結合するタンパク質、例えば、ｈｓｐ７０タンパク質（ＳＳＡおよびＳＳＢタンパク質、例えば、ＳＳＡ１、ＳＳＡ２、ＳＳＡ３、ＳＳＡ４、ＳＳＢ１およびＳＳＢ２によりコードされているタンパク質）。
・サイトゾルにおいて前駆体タンパク質の凝集を防ぐタンパク質、例えば、ｈｓｐ７０タンパク質（ＳＳＡおよびＳＳＢタンパク質、例えば、ＳＳＡ１、ＳＳＡ２、ＳＳＡ３、ＳＳＡ４、ＳＳＢ１およびＳＳＢ２によりコードされているタンパク質）。
・損傷したタンパク質に結合して安定化させるタンパク質、例えば、Ｓｓａ１ｐ。
・折り畳み異常タンパク質応答に関与するか、または折り畳み異常タンパク質応答を誘導する薬剤（例えば、ツニカマイシンおよびジチオトレイトール）に対する耐性の増強をもたらすタンパク質、例えば、Hjelmqvist et al, 2002, 前掲が記載しているＯＲＭＤＬファミリーの（例えば、Ｏｒｍ２ｐ）またはストレス応答に関与する（例えば、Ｕｂｉ４ｐ）。
・コシャペロンであるタンパク質、ならびに／またはタンパク質フォールディングおよび／もしくは折り畳み異常タンパク質応答に間接的に関与するタンパク質（例えば、ｈｓｐ１０４ｐ、Ｍｄｊ１ｐ）。
・高分子の核−細胞質間輸送に関与するタンパク質、例えば、Ｐｓｅ１ｐ。
・核局在配列と核輸出配列を認識し、核膜孔複合体と相互作用することにより、核膜を通過する高分子の輸送を媒介するタンパク質、例えば、Ｐｓｅ１ｐ。
・ＥＰ０７４６６１１およびHillson et al, 1984, Methods Enzymol., 107, 281-292に記載されているようなスクランブルリボヌクレアーゼのＤＮＡに対してリボヌクレアーゼ活性を復活させ得るタンパク質、例えば、ＰＤＩ。
・酸性ｐＩ（例えば、４．０〜４．５）を有するタンパク質、例えば、ＰＤＩ。
・Ｈｓｐ７０ファミリーのメンバーであり、好ましくは、Ｎ末端ＡＴＰ結合ドメインとＣ末端ペプチド結合ドメインを有するタンパク質、例えば、Ｓｓａ１ｐ。
・ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼであるタンパク質（例えば、Ｃｐｒ３ｐ、Ｃｐｒ６ｐ）。
・既知シャペロンのホモログであるタンパク質（例えば、Ｈｓｐ１０ｐ）。
・ミトコンドリアシャペロンであるタンパク質（例えば、Ｃｐｒ３ｐ）。
・細胞質または核シャペロンであるタンパク質（例えば、Ｃｎｓ１ｐ）。
・膜結合シャペロンであるタンパク質（例えば、Ｏｒｍ２ｐ、Ｆｍｏ１ｐ）。
・シャペロンアクチベーター活性またはシャペロンレギュレーター活性を有するタンパク質（例えば、Ａｈａ１ｐ、Ｈａｃ１ｐ、Ｈｃｈ１ｐ）。
・未熟型のタンパク質と一時的に結合して適切なフォールディング輸送、および／または分泌誘導するタンパク質、例えば、小胞体への効率的な輸送に必要なタンパク質（例えば、Ｌｈｓ１ｐ）またはそれらの細胞内の作用部位に必要なタンパク質（例えば、ＰｓｅＩｐ）。
・タンパク質複合体アセンブリおよび／またはリボソームアセンブリに関与するタンパク質（例えば、Ａｔｐ１１ｐ、ＰｓｅＩｐ、Ｎｏｂ１ｐ）。
・シャペロニンＴ複合体のンパク質（例えば、Ｃｃｔ２ｐ）。または
・プレフォルディン複合体のタンパク質（例えば、Ｐｆｄ１ｐ）。

１つの好ましいシャペロンは、小胞体（ＥＲ）の管腔内でジスルフィド結合の形成を触媒することのできる等価物を有するタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）またはその断片もしくは変異体である。「ＰＤＩ」とは、ＥＰ０７４６６１１およびHillson et al, 1984, Methods Enzymol., 107, 281-292に記載されているようなスクランブルリボヌクレアーゼのＲＮＡに対するリボヌクレアーゼ活性を復活させる能力を有するいずれのタンパク質も含む。

タンパク質ジスルフィドイソメラーゼは、一般にチオール：ジスルフィド交換反応を触媒する酵素であり、分泌細胞のＥ．Ｒ．管腔の主要な常在タンパク質成分である。一連の証拠は、それが分泌タンパク質の生合成において役割を果たすことを示唆し(Freedman, 1984, Trends Biochem. Sci., 9, 438-41)、これはin situにおける直接的架橋研究によっても裏付けられている(Roth and Pierce, 1987, Biochemistry, 26,4179-82)。ＰＤＩが欠損しているミクロソーム膜が同時翻訳タンパク質のジスルフィド形成に特異的な欠陥を示すという知見(Bulleid and Freedman, 1988, Nature, 335, 649-51)は、この酵素が、分泌タンパク質および細胞表面タンパク質の生合成の際に本来のジスルフィド結合形成の触媒として働くことを意味する。この役割はin vitroにおいてこの酵素の触媒特性に関して知られているものと一致し、チオール：ジスルフィド交換反応を触媒し、正味のタンパク質ジスルフィド、切断または異性化をもたらし、また、一般に、多様な還元型の折り畳まれていないタンパク質基質におけるタンパク質フォールディングおよび本来のジスルフィド結合の形成を触媒することができる(Freedman et al., 1989, Biochem. Soc. Symp., 55, 167-192)。また、ＰＤＩは、イソメラーゼ活性を欠いた変異型ＰＤＩがタンパク質フォールディングを加速させるので、シャペロンとしても働く(Hayano et al, 1995, FEBS Letters, 377, 505-511)。最近、ジスルフィドの異性化ではなく、スルヒドリルの酸化がＳ．セレビシエにおいてタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの主要な機能であることが報告された(Solovyov et al., 2004, J. Biol. Chem., 279 (33) 34095-34100)。酵素のＤＮＡおよびアミノ酸配列はいくつかの種では既知であり(Scherens et al, 1991, Yeast, 7, 185-193; Farquhar et al, 1991, Gene, 108, 81-89；ＥＰ０７４６６１；ＥＰ０２９３７９３；ＥＰ０５０９８４１)、哺乳類肝臓から均一となるまで精製された酵素の作用機序に関する情報が増えつつある(Creighton et al, 1980, J Mol. Biol., 142, 43-62; Freedman et al, 1988, Biochem. Soc. Trans., 16, 96-9; Gilbert, 1989, Biochemistry, 28, 7298-7305; Lundstrom and Holmgren, 1990, J. Biol. Chem., 265, 9114-9120; Hawkins and Freedman, 1990, Biochem. J., 275, 335-339)。これまでに細胞においてタンパク質フォールディング、アセンブリおよび輸送のメディエーターとして含められている多くのタンパク質因子(Rothman, 1989, Cell, 59, 591-601)のうち、ＰＤＩは十分適宜された触媒活性を有する。

宿主における内在性ＰＤＩ遺伝子の欠失または不活性化の結果、生存力のない宿主が生じる。言い換えれば、この内在性ＰＤＩ遺伝子は「必須」遺伝子である。

ＰＤＩは哺乳類組織から容易に単離され、この均一な酵素は、特徴的な酸性ＰＩ（４．０〜４．５）を伴うホモ二量体（２×５７ｋＤ）である(Hillson et al, 1984, Meyhods Enzymol., 107, 281-292)。また、この酵素はコムギおよび藻類クラミドモナス・レインハルジー(Chlamydomonas reinhardii)(Kaska et al, 1990, Biochem. J., 268, 63-68)、ラット(Edman et al, 1985, Nature, 317, 267-270)、ウシ(Yamauchi et al, 1987, Biochem. Biophys. Res. Comm., 146, 1485-1492)、ヒト(Pihlajaniemi et al, 1987, EMBO J., 6, 643-9)、酵母(Scherens et al, 前掲; Farquhar et al, 前掲)および雛鳥(Parkkonen et al, 1988, Biochem. J., 256, 1005-1011)からも精製されている。これらの脊椎動物種由来のタンパク質は高度の配列保存性を示し、総てラットＰＤＩ配列で最初に示された全体的な特徴を示す(Edman et al., 1985, 前掲)。

酵母タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ前駆体ＰＤＩ１は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＡ４２３７３またはＢＡＡ００７２３として見出すことができる。それは次の５２２アミノ酸の配列を有する。

別のＰＤＩ配列はＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＡ３８４０２として見出すことができる。それは次の５３０アミノ酸の配列を有する。

上記のＰＤＩ配列の変異体および断片、ならびに他の天然ＰＤＩ配列の変異体も本発明に含まれる。ＰＤＩに関して「変異体」とは、１以上の位置においてアミノ酸挿入、欠失または置換（保存的または非保存的）を持ったタンパク質を意味し、ただし、このような変化は、基本的特性、例えば、酵素活性（典型的活性および比活性）、あるｐＨ範囲における熱安定性（ｐＨ安定性）が有意に変化していないタンパク質を生じる。ここで「有意に」とは、当業者が、その変異体の特性が異なり得るが、元のタンパク質と比べて不明瞭なものではないとする場合を意味する。

「保存的置換」とは、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｍｅｔ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｉｐなどの組合せを意図する。好ましい保存的置換としては、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒが挙げられる。

「変異体」は、一般に、それが由来するポリペプチドと少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％または少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、いっそうより好ましくは少なくとも９５％、なおより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは少なくとも９９．５％の配列同一性を有する。

２つのポリペプチド間の配列同一性％は、後述のように、好適なコンピュータープログラムを用いて判定することができる。このような変異体は天然のものであっても、当業者に周知のようなタンパク質工学および部位特異的突然変異誘発の方法を用いて作出されたものであってもよい。

ＰＤＩに関して「断片」とは、１以上の位置に欠失が存在しているタンパク質を意味する。よって、断片は完全成熟ＰＤＩタンパク質の全配列の多くて５、１０、２０、３０、４０または５０％、一般に６０％まで、より一般には７０％まで、好ましくは８０％まで、より好ましくは９０％まで、いっそうより好ましくは９５％まで、なおより好ましくは９９％までを含み得る。ＰＤＩタンパク質の特に好ましい断片は目的のタンパク質の１以上のドメイン全体を含む。

ＰＤＩの断片または変異体は、Ｓ．セレビシエなどの宿主細胞において組換え発現させた場合に宿主細胞において内因的にコードされているＰＤＩ遺伝子の欠失を補うことができるタンパク質であってもよく、例えば、別の生物、例えば、別の酵母もしくは他の真菌、または別の真核生物、例えば、ヒトもしくは他の脊椎動物、または動物により、あるいは植物によりコードされているホモログのようなＰＤＩの天然ホモログであってもよい。

別の好ましいシャペロンとしては、ＳＳＡ１、または同等のシャペロン様活性を有するその断片または変異体がある。ＳＳＡ１は、ＹＧ１００としても知られ、Ｓ．セレビシエゲノムの第Ｉ染色体上にあり、１．９３ｋｂｐの大きさである。

公開されているＳＳＡ１のタンパク質配列の１つは次の通りである。

公開されているＳＳＡ１のコード配列は次の通りであるが、この配列は、同一のタンパク質産物をコードする別のヌクレオチド配列を得るための縮重置換により改変することができると考えられる。

タンパク質Ｓｓａ１ｐはＨｓｐ７０ファミリーのタンパク質に属し、サイトゾルに常在している。Ｈｓｐ７０はいくつかのシャペロン活性を遂行する能力を持ち；タンパク質の合成、アセンブリおよびフォールディングを助け；種々の細胞内の場所へにポリペプチドの輸送およびタンパク質凝集塊の溶解を媒介する(Becker & Craig, 1994, Eur. J: Biochem. 219, 11-23)。Ｈｓｐ７０遺伝子は高度に保存され、Ｎ末端ＡＴＰ結合ドメインとＣ末端ペプチド結合ドメインを有する。Ｈｓｐ７０タンパク質は、主として折り畳まれていないタンパク質のペプチド主鎖と相互作用する。ｈｓｐ７０タンパク質による結合およびペプチドの放出はＡＴＰ依存的なプロセスであり、ｈｓｐ７０のコンホメーション変化を伴う(Becker & Craig, 1994, 前掲)。

サイトゾルｈｓｐ７０タンパク質は、特に、タンパク質の合成、フォールディングおよび分泌に関与する(Becker & Craig, 1994, 前掲)。Ｓ．セレビシエでは、サイトゾルｈｓｐ７０タンパク質は、機能的に互いに異なるＳＳＡ（ＳＳＡ１〜４）とＳＳＢ（ＳＳＢ１および２）の２つの群に分けられている。ＳＳＡファミリーは、その群のタンパク質の少なくとも一つが細胞の生存力を維持するために活性でなければならないという意味で必須である(Becker & Craig, 1994, 前掲)。サイトゾルｈｓｐ７０タンパク質は、好ましくは、フォールディングされていない、非成熟タンパク質と結合する。このことは、それらが、サイトゾルにおいて高分子複合体へと組み立てられるまで、それらを非フォールディング状態に維持し、かつ／または種々のオルガネラへのそれらの輸送を促進することにより、前駆体タンパク質の凝集を防ぐということを示唆している(Becker & Craig, 1994, 前掲)。ＳＳＡタンパク質は特に、小胞体およびミトコンドリアへ輸送するための前駆体の翻訳後生合成および維持に関与する(Kim et al., 1998, Proe. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 12860-12865; Ngosuwan et al., 2003, J. Biol. Chem. 278(9), 7034-7042)。Ｓｓａ１ｐは損傷を受けたタンパク質に結合し、それらを部分的非フォールディング型で安定化させ、再フォールディングまたは分解を生じさせることが示されている(Becker & Craig, 1994, 前掲; Glover & Lindquist, 1998, Cell. 94, 73-82)。

ＳＳＡ１の変異体および断片も本発明に含まれる。ＳＳＡ１に関して「変異体」とは、アミノ酸挿入、欠失または置換（保存的または非保存的）を有している１以上の位置以外に関しては天然ＳＳＡ１の配列を有するタンパク質を意味する（ただし、このような変化は、塩基の特性、例えば、酵素活性（典型的活性および比活性）、熱安定性、あるｐＨ範囲における活性（ｐＨ安定性）が有意に変化していないタンパク質をもたらす）。ここで「有意に」とは、当業者が、その変異体の特性が異なり得るが、元のタンパク質と比べて不明瞭なものではないとする場合を意味する。

「保存的置換」とは、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｍｅｔ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐなどの組合せを意図する。好ましい保存的置換としては、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒが挙げられる。

ＳＳＡ１の「変異体」は、一般に、天然ＳＳＡ１の配列と少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％または少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、いっそうより好ましくはなくとも９５％、なおより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは少なくとも９９．５％の配列同一性を有する。

ＳＳＡ１に関して「断片」とは、欠失が存在している１以上の位置以外は天然ＳＳＡ１の配列を有するタンパク質を意味する。よって、断片は完全成熟ＳＳＡ１タンパク質の全配列の多くて５、１０、２０、３０、４０または５０％、一般に６０％まで、より一般には７０％まで、好ましくは８０％まで、より好ましくは９０％まで、いっそうより好ましくは９５％まで、なおより好ましくは９９％までを含み得る。ＳＳＡ１タンパク質の特に好ましい断片は目的のタンパク質の１以上のドメイン全体を含む。

ＳＳＡ１の断片または変異体は、Ｓ．セレビシエなどの宿主細胞において組換え発現させた場合に宿主細胞において内因的にコードされているＳＳＡ１遺伝子（またはそのホモログ）の欠失を補うことができるタンパク質であってもよく、例えば、別の生物、例えば、別の酵母もしくは他の真菌、または別の真核生物、例えば、ヒトもしくは他の脊椎動物、または動物により、あるいは植物によりコードされているホモログのようなＳＳＡ１の天然ホモログであってもよい。

別の好ましいシャペロンとしては、ＰＳＥ１または同等のシャペロン様活性を有するその断片もしくは変異体がある。

ＰＳＥＩはＫＡＰ１２１としても知られ、第XIII染色体上にある必須遺伝子である。

公開されているタンパク質ｐｓｅ１ｐのタンパク質配列は次の通りである。

公開されているＰＳＥ１のコード配列は次の通りであるが、この配列は、同一のタンパク質産物をコードする別のヌクレオチド配列を得るための縮重置換により改変することができると考えられる。

ＰＳＥ１遺伝子は３．２５ｋｂｐの大きさである。Ｐｓｅ１ｐは高分子の核−細胞質間輸送に関与する(Seedorf & Silver, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 8590-8595)。このプロセスは、核エンベロープに埋め込まれた核膜孔複合体（ＮＰＣ）を介して起こり、ヌクレオポリンからなる(Ryan & Wente, 2000, Curr. Opin. Cell Biol. 12, 361-371)。タンパク質は、核輸入、核局在配列（ＮＬＳ）および輸出、核輸出配列（ＮＥＳ）に必要な情報を含む特異的配列を有する(Pemberton et al., 1998, Cunr. Opin. Cell Biol. 10, 392-399)。Ｐｓｅ１ｐは一タンパク質群のカリオフェリン／インポルチンであり、αおよびβファミリーに分類されている。カリオフェリンは、ＮＬＳおよびＮＥＳを認識し、ＮＰＣと相互作用することで、核膜を通過する高分子の輸送を媒介する可溶性輸送因子である。(Seedorf & Silver, 1997, 前掲; Pemberton et al., 1998, 前掲; Ryan & Wente, 2000, 前掲)。核孔を経た輸送は、小ＧＴＰ結合タンパク質Ｒａｎによって触媒されるＧＴＰ加水分解により駆動される(Seedorf & Silver, 1997, 前掲)。Ｐｓｅ１Ｐはカリオフェリンβと同定されている。Ｓ．セレビシエでは１４のカリオフェリンβタンパク質が同定されているが、そのうち４つのみが必須である。これはおそらく、複数のカリオフェリンが単一の高分子の輸送を媒介する可能性があるためである(Isoyama et al., 2001, J. Biol. Chem. 276(24), 21863-21869)。Ｐｓｅ１ｐは核の核エンベロープおよび細胞質のある範囲に局在する。このことは、このタンパク質がその輸送機能の一部として核内外を移動することを示唆している(Seedorf & Silver, 1997, 前掲)。Ｐｓｅ１ｐは転写因子(Isoyama et al., 2001, 前掲; Ueta et al., 2003, J. Biol. Chem. 278(50), 50120-50127)、ヒストン(Mosammaparast et al., 2002, J. Biol. Chem. 277(1), 862-868)、およびリボソームへのアセンブリ前のリボゾームタンパク質(Pemberton et al., 1998, 前掲)の核輸入に関与している。また、それは核からｍＲＮＡの輸出を媒介する。カリオフェリンはＲＮＡ結合タンパク質に見られる異なるＮＥＳを認識し、それと結合し、それが核から輸出される前にＲＮＡをコーティングする(Seedorf & Silver, 1997, Pemberton et al., 1998, 前掲)。

高分子の核−細胞質間輸送は、細胞周期の適切な進行に必須なので、ｐｓｅ１ｐなどの核輸送因子は細胞増殖の新規な候補標的である(Seedorf & Silver, 1997, 前掲)。

Ｓ．セレビシエのマルチコピープラスミドにおけるＰｓｅ１ｐ（タンパク質分泌エンハンサー）の過剰発現もまた、生物活性タンパク質のレパートリーのタンパク質分泌レベルを増強することが示されている(Chow et al., 1992; J. Cell. Sci. 101(3), 709-719)。

ＰＳＥ１の変異体および断片も本発明に含まれる。ＰＳＥ１に関して「変異体」とは、アミノ酸挿入、欠失または置換（保存的または非保存的）を有している１以上の位置以外に関しては天然ＰＳＥ１の配列を有するタンパク質を意味する（ただし、このような変化は、塩基の特性、例えば、酵素活性（典型的活性および比活性）、熱安定性、あるｐＨ範囲における活性（ｐＨ安定性）が有意に変化していないタンパク質をもたらす）。ここで「有意に」とは、当業者が、その変異体の特性が異なり得るが、元のタンパク質と比べて不明瞭なものではないとする場合を意味する。

ＰＳＥ１の「変異体」は、一般に、天然ＰＳＥ１の配列と少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％または少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、いっそうより好ましくはなくとも９５％、なおより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは少なくとも９９．５％の配列同一性を有する。

ＰＳＥ１に関して「断片」とは、欠失が存在している１以上の位置以外は天然ＰＳＥ１の配列を有するタンパク質を意味する。よって、断片は完全成熟ＰＳＥ１タンパク質の全配列の多くて５、１０、２０、３０、４０または５０％、一般に６０％まで、より一般には７０％まで、好ましくは８０％まで、より好ましくは９０％まで、いっそうより好ましくは９５％まで、なおより好ましくは９９％までを含み得る。ＰＳＥ１タンパク質の特に好ましい断片は目的のタンパク質の１以上のドメイン全体を含む。

ＰＳＥ１の断片または変異体は、Ｓ．セレビシエなどの宿主細胞において組換え発現させた場合に宿主細胞において内因的なＰＳＥ１遺伝子の欠失を補うことができるタンパク質であってもよく、例えば、別の生物、例えば、別の酵母もしくは他の真菌、または別の真核生物、例えば、ヒトもしくは他の脊椎動物、または動物により、あるいは植物によりコードされているホモログのようなＰＳＥ１の天然ホモログであってもよい。

別の好ましいシャペロンとしては、ＯＲＭ２または同等のシャペロン様活性を有するその断片もしくは変異体がある。

ＯＲＭ２はＹＬＲ３５０Ｗとしても知られ、Ｓ．セレビシエゲノムの第XII染色体上にあり（８２８７２９〜８２９３７９番）、酵母タンパク質Ｏｒｍ１ｐと類似性を有する進化的に保存されているタンパク質をコードしている。Hjelmqvist et al, 2002, Genome Biology, 3(6), research 0027.1-0027.16は、ＯＲＭ２が３つのヒト遺伝子（ＯＲＭＤＬ１、ＯＲＭＤＬ２およびＯＲＭＤＬ３）ならびに微胞子虫、植物、ショウジョウバエ(Drosophila)、尾索類および脊椎動物におけるホモログを含む遺伝子ファミリーに属することを報告している。ＯＲＭＤＬ遺伝子は、タンパク質小胞体（ＥＲ）において固定されているトランスメンブランタンパク質をコードすることが報告されている。

タンパク質Ｏｒｍ２ｐは折り畳み異常タンパク質応答を誘導する薬剤に対する耐性に必要とされる。Hjelmqvist et al, 2002（前掲）は、２つのＳ．セレビシエＯＲＭＤＬホモログ（ＯＲＭ１およびＯＲＭ２）の二重ノックアウトが増殖速度の低下ならびにツニカマイシンおよびジチオトレイトールに対するより大きな感受性をもたらすことを報告している。

公開されているＯｒｍ２ｐ配列の１つは次の通りである。

上記のタンパク質はＳ．セレビシエにおいて以下のコードヌクレオチドによりコードされているが、この配列は、同一のタンパク質産物をコードする別のヌクレオチド配列を得るための縮重置換により改変することができると考えられる。

ＯＲＭ２の変異体および断片も本発明に含まれる。ＯＲＭ２に関して「変異体」とは、アミノ酸挿入、欠失または置換（保存的または非保存的）を有している１以上の位置以外に関しては天然ＯＲＭ２の配列を有するタンパク質を意味する（ただし、このような変化は、塩基の特性、例えば、酵素活性（典型的活性および比活性）、熱安定性、あるｐＨ範囲における活性（ｐＨ安定性）が有意に変化していないタンパク質をもたらす）。ここで「有意に」とは、当業者が、その変異体の特性が異なり得るが、元のタンパク質と比べて不明瞭なものではないとする場合を意味する。

ＯＲＭ２の「変異体」は、一般に、天然ＯＲＭ２の配列と少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％または少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、いっそうより好ましくはなくとも９５％、なおより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは少なくとも９９．５％の配列同一性を有する。

ＯＲＭ２に関して「断片」とは、欠失が存在している１以上の位置以外は天然ＯＲＭ２の配列を有するタンパク質を意味する。よって、断片は完全成熟ＯＲＭ２タンパク質の全配列の多くて５、１０、２０、３０、４０または５０％、一般に６０％まで、より一般には７０％まで、好ましくは８０％まで、より好ましくは９０％まで、いっそうより好ましくは９５％まで、なおより好ましくは９９％までを含み得る。ＯＲＭ２タンパク質の特に好ましい断片は目的のタンパク質の１以上のドメイン全体を含む。

ＯＲＭ２の断片または変異体は、Ｓ．セレビシエなどの宿主細胞において組換え発現させた場合に宿主細胞において内因的なＯＲＭ２遺伝子の欠失を補うことができるタンパク質であってもよく、例えば、別の生物、例えば、別の酵母もしくは他の真菌、または別の真核生物、例えば、ヒトもしくは他の脊椎動物、または動物により、あるいは植物によりコードされているホモログのようなＯＲＭ２の天然ホモログであってもよい。

本発明の第一、第二または第三の態様に従うプラスミドは、ポリヌクレオチド配列挿入内か、またはプラスミド上の他の場所に、アルブミンの配列またはその断片もしくは変異体を含むタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むことが特に好ましい。あるいは、プラスミドを形質転換させる宿主細胞はそのゲノム内に、アルブミンの配列またはその断片もしくは変異体を内在配列または異種配列のいずれかとして含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。

「アルブミン」とは、いずれの供給源から得られるアルブミンタンパク質配列を有するタンパク質も含む。一般に、この供給源は哺乳類である。１つの好ましい実施態様では、血清アルブミンはヒト血清アルブミン（「ＨＳＡ」）である。「ヒト血清アルブミン」とは、ヒトに天然に存在するアミノ酸配列を有する血清アルブミンおよびその変異体という意味を含む。好ましくは、このアルブミンはＷＯ９０／１３６５３またはその変異体に開示されているアミノ酸配列を有する。このＨＳＡコード配列は、ヒト遺伝子に対応するｃＤＮＡを単離するための既知の方法によって得ることができる、例えば、ＥＰ７３６４６およびＥＰ２８６４２４にも開示されている。

もう１つの好ましい実施態様では、「アルブミン」は、ウシ血清アルブミンの配列を有する。「ウシ血清アルブミン」としては、例えば、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６９から取得されるような、ウシに天然に存在するアミノ酸配列および下記に定義するようなその変異体を有する血清アルブミンという意味を含む。「ウシ血清アルブミン」とは、また、以下に定義するような全長ウシ血清アルブミンの断片またはその変異体という意味も含む。

もう１つの好ましい実施態様では、アルブミンは、イヌ（例えば、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｐ４９８２２参照）、ブタ（例えば、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｐ０８８３５参照）、ヤギ（例えば、Ｓｉｇｍａから製品番号Ａ２５１４またはＡ４１６４として入手できる）、シチメンチョウ（例えば、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号０７３８６０参照）、ヒヒ（例えば、Ｓｉｇｍａから製品番号Ａ１５１６として入手できる）、ネコ（例えば、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｐ４９０６４参照）、ニワトリ（例えば、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｐ１９１２１参照）、オボアルブミン（例えば、ニワトリアルブミン）（例えば、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｐ０１０１２参照）、ロバ（例えば、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｐ３９０９０参照）、モルモット（例えば、Ｓｉｇｍａから製品番号Ａ３０６０、Ａ２６３９、Ｏ５４８３またはＡ６５３９として入手できる）、ハムスター（例えば、Ｓｉｇｍａから製品番号Ａ５４０９として入手できる）、ウマ（例えば、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｐ３５７４７参照）、アカゲザル（例えば、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｑ２８５２２参照）、マウス（例えば、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｏ８９０２０参照）、ハト（例えば、Khan et al, 2002, Int. J. Biol. Macromol., 30(3-4), 171-8により定義されている）、ウサギ（例えば、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｐ４９０６５参照）、ラット（例えば、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｐ３６９５３参照）およびヒツジ（例えば、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｐ１４６３９参照）由来の血清アルブミンの１つに由来する（すなわち、その配列を有する）アルブミンであり、下記に定義するようなその変異体および断片を含む。

アルブミンの天然変異型としては多くのものが知られている。その多くはPeters (1996, All About Albumin: Biochemistry, Genetics and Medical Applications, Academic Press, Inc., SanDiego, California, p. 170-181)に記載されている。上記で定義したような変異体はこれらの天然変異体の１つであり得る。

「変異体アルブミン」とは、１以上の位置においてアミノ酸挿入、欠失または置換（保存的または非保存的）を持ったアルブミンタンパク質を意味し、ただしここで、このような変化は、基本的特性、例えば、酵素活性（典型的活性および比活性、例えば、ビリルビンとの結合）、浸透圧（膠質浸透圧、コロイド浸透圧）、あるｐＨ範囲における挙動（ｐＨ安定性）が有意に変化していないアルブミンタンパク質を生じる。ここで「有意に」とは、当業者が、その変異体の特性が異なり得るが、元のタンパク質と比べて不明瞭なものではないとする場合を意味する。

「保存的置換」とは、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ，Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒなどの組合せを意図する。このような変異体は、引用することにより本明細書の一部とされるStevensに対して１９８１年１１月２４日に発行された米国特許第４，３０２，３８６号に開示されているような部位特異的突然変異誘発によるなど、当技術分野で周知の技術によって作出することができる。

一般に、アルブミン変異体は、天然アルブミンと、４０％を超える、通常は少なくとも５０％、より典型的には少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％またはそれ以上の配列同一性を有する。２つのポリペプチド間の配列同一性％は好適なコンピュータープログラム、例えば、ウィスコンシン州立大学Genetic Computing GroupのＧＡＰプログラムを用いて判定することができ、同一性％は、その配列が最適にアラインされたポリペプチドに関して算出されると考えられる。あるいは、このアライメントはClustal Wプログラム(Thompson et al., 1994)を用いて行うこともできる。用いるパラメーターは次の通りである。

ＦＡＳＴペアワイズ・アライメント・パラメーター：Ｋ−タップル（ワード）サイズ；１、ウィンドウサイズ；５、ギャップ・ペナルティー；３、トップダイアゴナル数；５。スコアリング法；ｘ％。マルチプル・アライメント・パラメーター：ギャップ・オープン・ペナルティー；１０、ギャップ・エクステンション・ペナルティー；０．０５。スコアリング・マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ。

上記で用いる「断片」とは、少なくとも一つの基本特性、例えば、結合活性（典型的活性および比活性、例えば、ビリルビンに対する結合）、浸透圧（膠質浸透圧、コロイド浸透圧）、あるｐＨ範囲における挙動（ｐＨ安定性）が有意に変化していない限り、全長アルブミンのいずれの断片またはその変異体も含む。ここで「有意に」とは、当業者が、その変異体の特性が異なり得るが、元のタンパク質と比べて不明瞭なものではないとする場合を意味する。断片は一般に少なくとも５０アミノ酸の長さである。断片はアルブミンの少なくとも一つのサブドメイン全体を含み得る。ＨＳＡのドメインは組換えタンパク質として発現されている(Dockal, M. et al., 1999, J. Biol. Chem., 274, 29303-29310)、ここでは、ドメインＩはアミノ酸１〜１９７からなると定義され、ドメインIIはアミノ酸１８９〜３８５からなると定義され、組成物IIIはアミノ酸３８１〜５８５からなると定義されている。ドメインＩとIIの間、およびドメインIIの間に存在するα−ヘリックス構造の延長部（ｈ１０−ｈ１）のためにドメインの部分的重複が存在する(Peters, 1996, 前掲, 表２〜４)。ＨＳＡはまた、６つのサブドメイン（サブドメインＩＡ、ＩＢ、IIＡ、IIＢ、IIIＡおよびIIIＢ）を含む。サブドメインＩＡはアミノ酸６〜１０５を含み、サブドメインＩＢはアミノ酸１２０〜１７７を含み、サブドメインIIＡはアミノ酸２００〜２９１を含み、サブドメインIIＢはアミノ酸３１６〜３６９を含み、サブドメインIIIＡはアミノ酸３９２〜４９１を含み、サブドメインIIIＢはアミノ酸５１２−５８３を含む。断片は上記で定義したような１以上のドメインもしくはサブドメインの全体もしくは一部、またはそれらのドメインおよび／もしくはサブドメインの任意の組合せを含み得る。

よって、このポリヌクレオチド挿入は、アルブミンまたはその変異体もしくは断片をコードするオープンリーディングフレームを含み得る。

あるいは、本発明の第一、第二または第三の態様に従うプラスミドは、ポリヌクレオチド配列挿入内か、またはプラスミド上の他の場所に、トランスフェリンの配列またはその変異体もしくは断片を含むタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むことが好ましい。あるいは、プラスミドを形質転換させる宿主細胞はそのゲノム内に、トランスフェリンの配列またはその変異体もしくは断片を内在配列または異種配列のいずれかとして含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。

本明細書において「トランスフェリン」とは、トランスフェリンファミリーの総てのメンバー(Testa, Proteins of iron metabolism, CRC Press, 2002; Harris & Aisen, Iron carriers and iron proteins, Vol. 5, Physical Bioinorganic Chemistry, VCH, 1991)およびそれらの誘導体、例えば、トランスフェリン、変異株トランスフェリン(Mason et al, 1993, Biochemistry, 32, 5472; Mason et al, 1998, Biochem. J., 330(1), 35)、末端切断型トランスフェリン、トランスフェリンローブ(Mason et al, 1996, Protein Expr. Purif, 8, 119; Mason et al, 1991, Protein Expr. Purif., 2, 214)、ラクトフェリン、変異型ラクトフェリン、末端切断型ラクトフェリン、ラクトフェリンローブまたは上記のいずれかのものと他のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質との融合物を含む(Shin et al, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 2820; Ali et al, 1999, J Biol. Chem., 274, 24066; Mason et al, 2002, Biochemistry, 41, 9448)。

トランスフェリンはヒトトランスフェリンであってもよい。本発明では、「ヒトトランスフェリン」は、ヒト由来のトランスフェリンと識別できない材料、またはその変異体もしくは断片である材料を表すのに用いる。「変異体」には、挿入、欠失および置換（保存的または非保存的）を含み、ここで、このような変化はトランスフェリンの有用なリガンド結合または免疫原性を実質的に変化させない。

トランスフェリンの突然変異体も本発明に含まれる。このような突然変異体は免疫原性を変化させ得る。例えば、トランスフェリン突然変異体はグリコシル化の改変（例えば、低下）を示し得る。トランスフェリン分子のＮ結合グリコシル化パターンは、Ｎ、ＸまたはＳ／Ｔの位置のいずれか、または総てで、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔなどのアミノ酸グリコシル化コンセンサス配列を付加／除去することによって改変することができる。トランスフェリン突然変異体は、金属イオンおよび／またはトランスフェリン受容体などの他のタンパク質とのそれらの自然結合を変化させ得る。この様式で改変されたトランスフェリン突然変異体の例を下記に挙げる。

本発明者らは、また、ヒトトランスフェリンまたはヒトトランスフェリン類似体の天然多型変異体も含める。一般に、ヒトトランスフェリンの変異体または断片は少なくとも５０重量％（好ましくは少なくとも８０重量％、９０重量％または９５重量％）のヒトトランスフェリンのリガンド結合活性（例えば、鉄結合活性）を有する。トランスフェリンまたは試験サンプルの鉄結合活性は、それらの鉄不含状態および完全に鉄が付加した状態のタンパク質の４７０ｎｍ：２８０ｎｍ吸光度比によって分光光度的に測定することができる。特に断りのない限り、試薬は鉄不含でなければならない。鉄は、０．１Ｍクエン酸塩、０．１Ｍ酢酸塩、１０ｍＭＥＤＴＡｐＨ４．５に対する透析によってトランスフェリンまたは試験サンプルから除去することができる。タンパク質は、１００ｍＭＨＥＰＥＳ、１０ｍＭＮａＨＣＯ_３ｐＨ８．０中、約２０ｍｇ／ｍＬでなければならない。２８０ｎｍでの吸光度が分光光度的に正確に測定できるように水に希釈したアポトランスフェリン(Calbiochem, CN Biosciences, Nottingham, UK)の４７０ｎｍ：２８０ｎｍ吸光度比を測定する（０％鉄結合）。２ｍＬの１ＭＮａＯＨに１９１ｍｇのニトロ三酢酸を溶解した後、２ｍＬの０．５Ｍ塩化鉄（III）を加えることで、２０ｍＭ鉄−ニトリロトリアセテート（ＦｅＮＴＡ）溶液を作製する。脱イオン水で５０ｍＬに希釈する。新しく作製した２０ｍＭＦｅＮＴＡの十分な過剰量を加えた後、１００ｍＭＨＥＰＥＳ、１０ｍＭＮａＨＣＯ_３ｐＨ８．０に対してホロトランスフェリン調製物を完全に透析して残留するＦｅＮＴＡを除去することで、アポトランスフェリンに完全に鉄を付加し（１００％鉄結合）、その後、４７０ｎｍ：２８０ｎｍの吸光度比を測定する。この手順を、試験サンプルを用いて繰り返し、まず、鉄フリーとしなければならず、最終比を対照と比べる。

さらに、上記のいずれかのものを含む単一もしくは複数の異種融合物；またはアルブミン、トランスフェリンもしくは免疫グロビンまたはこれらのいずれかの変異体もしくは断片との単一もしくは複数の異種融合物が使用できる。このような融合物としては、ＷＯ０１／７９２７１で例示されるような、アルブミンＮ末端融合物、アルブミンＣ末端融合物およびコ−Ｎ末端およびＣ末端アルブミン融合物、ならびにトランスフェリンＮ末端融合物、トランスフェリンＣ末端融合物、およびコ−Ｎ末端およびＣ末端トランスフェリン融合物が挙げられる。

当業者ならば、また、本発明とともに用いるポリヌクレオチド配列挿入を形成する上で、オープンリーディングフレームの全部または一部を形成するために、他のいずれかの遺伝子もしくは変異体、または一部もしくはいずれかのオープンリーディングフレームが利用可能であることも分かるであろう。例えば、このオープンリーディングフレームは、天然タンパク質（チモーゲンを含む）、または天然タンパク質の変異体もしくは断片（例えば、一つのドメインであってもよい）；または完全に合成されたタンパク質；または種々のタンパク質（天然または合成）単一もしくは複数の融合物であるいずれかの配列を含むタンパク質をコードし得る。このようなタンパク質は、限定されるものではないが、ＷＯ０１／７９２５８、ＷＯ０１／７９２７１、ＷＯ０１／７９４４２、ＷＯ０１／７９４４３、ＷＯ０１／７９４４４およびＷＯ０１／７９４８０に示されているリスト、またはその変異体もしくは断片から入手することができ、これらの開示内容は引用することにより本明細書の一部とされる。これらの特許出願はアルブミンの融合相手に関してタンパク質のリストを示しているが、本発明はそれに限定されるものでなく、本発明の目的では、そこに挙げられているタンパク質のいずれのものを単独で供してもよいし、あるいはまた、アルブミン、免疫グロブリンのＦｃ領域、トランスフェリン、ラクトフェリンもしくは他のいずれかのタンパク質、または上記のうちいずれかの断片もしくは変異体の融合相手として供してもよい（目的ポリペプチドとして上記のうちいずれかを含む融合タンパク質を含む）。トランスフェリン融合物のさらなる例としては、米国特許出願ＵＳ２００３／０２２１２０１およびＵＳ２００３／０２２６１５５に示されている。

本発明による発現のために望ましいタンパク質の他の好ましい例としては、モノクローナル抗体、エトポシド、血清タンパク質（例えば、血液凝固因子）、アンチスタシン、ｔｉｃｋ抗凝固ペプチド、トランスフェリン、ラクトフェリン、エンドスタチン、アンギオスタチン、コラーゲン、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンに基づく分子またはいずれかの断片（例えば、Small Modular ImmunoPharmaceutical（商標）（「ＳＭＩＰ」）またはｄＡｂ、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＡｂ、ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ断片）、Ｋｕｎｉｔｚドメインタンパク質（例えば、ＷＯ０３／０６６８２４に記載のもの、アルブミン融合物を含む、または含まないもの）、インターフェロン、インターロイキン、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ２、インターフェロンα種および亜種、インターフェロンβ種および亜種、インターフェロンγ種および亜種、レプチン、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＦ_ＡＸ１５、ＩＬ１−受容体アンタゴニスト、エリスロポエチン（ＥＰＯ）およびＥＰＯ模倣体、トロンボポエチン（ＴＰＯ）およびＴＰＯ模倣体、プロサプチド、シアノビリン−Ｎ，５−ヘリックス、Ｔ２０ペプチド、Ｔ１２４９ペプチド、ＨＩＶｇｐ４１、ＨＩＶｇｐ１２０、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ｔＰＡ（組織プラスミノーゲン活性化因子）、ヒルディン、血小板由来増殖因子、副甲状腺ホルモン、プロインスリン、インスリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、インスリン様増殖因子、カルシトニン、成長ホルモン、トランスフォーミング増殖因子β、腫瘍壊死因子、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、プレ型および活性型双方の凝固因子（限定されるものではないが、プラスミノーゲン、フィブリノーゲン、トロンビン、プレトロンビン、プロトロンビン、フォン・ウィルブランド因子、α_１アンチトリプシン、プラスミノーゲンアクチベーター、因子VII、因子VIII、因子IX、因子Ｘおよび因子XIIIを含む）、神経増殖因子、ＬＡＣＩ（リポタンパク質会合血液凝固阻害剤、組織因子経路阻害剤または外因経路阻害剤としても知られる）、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、グルコースオキシダーゼ、血清コリンエステラーゼ、アプロチニン、アミロイド前駆体、インターαトリプシン阻害剤、抗トロンビンIII、アポリポタンパク質種、Ｃタンパク質、Ｓタンパク質の配列、または前記のいずれかの変異体もしくは断片もしくは融合タンパク質を含む配列が挙げられる。このタンパク質はヒルディンであってもなくてもよい。

上記のタンパク質に関して「変異体」とは、１以上の位置においてアミノ酸挿入、欠失または置換（保存的または非保存的）を持ったタンパク質を意味し、ただし、このような変化は、基本的特性、例えば、酵素活性または受容体結合（典型的活性および比活性）、熱安定性、あるｐＨ範囲における活性（ｐＨ安定性）が有意に変化していないタンパク質を生じる。ここで「有意に」とは、当業者が、その変異体の特性が異なり得るが、元のタンパク質と比べて不明瞭なものではないとする場合を意味する。

２つのポリペプチド間の配列同一性％は、例えば、ウィスコンシン州立大学Genetic Computing GroupのＧＡＰプログラムなどの好適なコンピュータープログラムを用いて判定することができ、同一性％は、配列が最適にアラインされたポリペプチドに関して算出されると考えられる。

あるいは、アライメントは、ＣｌｕｓｔａｌＷプログラム(Thompson et al., (1994) Nucleic Acids Res., 22(22), 4673-80)を用いて行ってもよい。これらのパラメーターは次のようなものであり得る。

・ＦＡＳＴペアワイズ・アライメント・パラメーター：Ｋ−タップル（ワード）サイズ；１、ウィンドウサイズ；５、ギャップ・ペナルティー；３、トップダイアゴナル数；５。スコアリング法；ｘ％。
・マルチプル・アライメント・パラメーター：ギャップ・オープン・ペナルティー；１０、ギャップ・エクステンション・ペナルティー；０．０５。
・スコアリング・マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ。

このような変異体は天然のものであっても、当技術分野で周知のようなタンパク質工学および部位特異的突然変異誘発の方法を用いて作出されたものであってもよい。

上記のタンパク質に関して「断片」とは、１以上の位置に欠失を有するタンパク質を意味する。よって、断片は完全成熟ポリペプチドの全配列の多くて５、１０、２０、３０、４０または５０％を含み得る。一般に、断片は、目的の完全タンパク質の全配列の６０％まで、より一般には７０％まで、好ましくは８０％まで、より好ましくは９０％まで、いっそうより好ましくは９５％まで、なおより好ましくは９９％までを含む。目的のタンパク質の特定の好ましい断片は、目的のタンパク質の１以上のドメイン全体を含む。

本発明の第一、第二または第三の態様に従うプラスミドは、ポリヌクレオチド配列挿入内、またはプラスミド上のいずれかの位置に、アルブミンの配列、またはその断片もしくは変異体、または上記の例から得られる他のいずれかのタンパク質（融合相手と融合したものまたは融合していないもの）および少なくとも一つの他の異種配列を含むタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、ここで、この少なくとも一つの他の異種配列は、オープンリーディングフレームなどの転写領域を含み得る。一つの実施態様では、このオープンリーディングフレームは酵母タンパク質の配列を含むタンパク質をコードしていてもよい。もう１つの実施態様では、このオープンリーディングフレームはタンパク質フォールディングに関与するか、またはシャペロン活性を有するか、または折り畳み異常タンパク質応答に関与するタンパク質、好ましくは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼの配列を含むタンパク質をコードしていてもよい。

得られるプラスミドは、ＵＳ領域とＵＬ領域の間で対称であってもなくてもよい。例えば、ＵＳ領域とＵＬ領域の間、またはＵＬ領域とＵＳ領域の間でサイズ比１：１、５：４、５：３、５：２、５：１または５：＜１を達成可能である。本発明の利点は対象性の維持に頼るものではない。

本発明によれば、本発明によるプラスミドを作製する方法も提供され、該方法は、
（ａ）ＲＥＰ２遺伝子またはＦＬＰ遺伝子および該遺伝子に隣接する逆方向反復を含む２μｍ系プラスミドを準備すること；
（ｂ）ポリヌクレオチド配列を準備し、そのポリヌクレオチド配列を、プラスミドの、本発明の第一、第二または第三の好ましい態様に従う位置に挿入すること；
（ｃ）工程（ｂ）に加えて、またはその代わりに、本発明の第一、第二または第三の好ましい態様に従う位置のヌクレオチド塩基の一部または総てを欠失させること；および／または
（ｄ）工程（ｂ）および（ｃ）のいずれかに加えて、またはその代わりに、本発明の第一、第二または第三の好ましい態様に従う位置のヌクレオチド塩基の一部または総てを別のヌクレオチド塩基で置換すること
を含む。

工程（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2001, 3rd edition（それらの内容は引用することにより本明細書の一部とされる）に記載されているものなど、クローニング技術、部位特異的突然変異誘発などをはじめとする当技術分野で周知の技術を用いて達成することができる。例えば、このような方法の１つは、付着末端による連結を含む。適合する付着末端は、好適な制限酵素により、挿入用のＤＮＡ断片およびプラスミド上に作製することができる。これらの末端は相補的塩基対の形成によってすぐにアニーリングし、残ったニックはＤＮＡリガーゼの作用によって閉じることができる。

さらなる方法では、合成二本鎖オリゴヌクレオチドリンカーおよびアダプターを用いる。平滑末端を有するＤＮＡ断片は、凸部３’末端を除去し、凹部３’末端を埋めるバクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼまたは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩによって作製される。所定の制限酵素に対する認識配列を含む合成リンカーおよび平滑末端化二本鎖ＤＮＡは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより平滑末端化ＤＮＡ断片に連結することができる。次に、それらを適当な制限酵素で消化して付着末端を作出し、適合する末端を有する発現ベクターに連結する。アダプターはまた、連結に用いられる平滑末端を１つ含むが、予め作製された付着末端も有する、化学的に合成されたＤＮＡ断片でもある。あるいは、ＤＮＡ断片は、１以上の合成二本鎖オリゴヌクレオチド（場合によって、付着末端を含んでもよい）の存在下または不在下でＤＮＡリガーゼの作用によりともに連結することができる。

多様な制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーが、Sigma-Genosys Ltd, London Road, Pampisford, Cambridge, United Kingdomをはじめとする多くの供給者から市販されている。

よって、本発明によれば、上記の方法によって得られるプラスミドも提供される。

本発明によれば、上記のようなプラスミドを含む宿主細胞も提供される。宿主細胞はいずれの細胞種でもよい。細菌および酵母宿主細胞が好ましい。細菌宿主細胞は、クローニング目的で有用であり得る。酵母宿主細胞は、プラスミドに存在する遺伝子の発現に有用であり得る。

一つの実施態様では、宿主細胞は、プラスミドがマルチコピープラスミドとして安定な細胞である。１つの酵母種から得られたプラスミドは、他の酵母種で維持可能である(Irie et al, 1991, Gene, 108(1), 139-144; Irie et al, 1991, Mol. Gen. Genet., 225(2), 257-265)。例えば、チゴサッカロミセス・ルクシー由来のｐＳＲ１は、サッカロミセス・セレビシエで維持可能である。プラスミドがｐＳＲ１、ｐＳＢ３またはｐＳＢ４に基づく場合、宿主細胞はチゴサッカロミセス・ルクシーであってよく、プラスミドがｐＳＢ１またはｐＳＢ２に基づく場合、宿主細胞はチゴサッカロミセス・バイリーであってよく、プラスミドがｐＰＭ１に基づく場合、宿主細胞はピキア・メンブラネファシエンスであってよく、プラスミドがｐＳＭ１に基づく場合、宿主細胞はチゴサッカロミセス・フェルメンタチであってよく、プラスミドがｐＫＤ１に基づく場合、宿主細胞はクルイベロミセス・ドロソフィラルムであってよく、プラスミドが２μｍプラスミドに基づく場合、宿主細胞はサッカロミセス・セレビシエまたはサッカロミセス・カルルスベルゲネシスであり得る。本発明による２μｍ系プラスミドは、それが天然プラスミドに由来する配列を有する遺伝子ＦＬＰ、ＲＥＰ１およびＲＥＰ２の１つ、２つまたは好ましくは３つを含んでいるならば、天然プラスミドに基づくと言える。

上記で定義したプラスミドは標準的な技術によって宿主に導入することができる。原核宿主細胞の形質転換に関しては、例えば、Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad Sci. USA 69, 2110およびSambrook et al (2001) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY参照。酵母細胞の形質転換は、Sherman et al (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NYに記載されている。Beggs (1978) Nature 275, 104-109の方法も有用である。Ｓ．セレビシエの形質転換方法は一般に、ＥＰ２５１７４４、ＥＰ２５８０６７およびＷＯ９０／０１０６３で教示されている（これらは総て、引用することにより本明細書の一部とされる）。脊椎動物細胞に関しては、このような細胞の形質転換に有用な試薬、例えば、リン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストランまたはリポソーム製剤がStratagene Cloning SystemsまたはLife Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, USAから入手できる。

細胞の形質転換にはまた、エレクトロポレーションも有用であり、エレクトロポレーションは酵母細胞、細菌細胞および脊椎動物細胞を形質転換するためのものとして当技術分野で周知のものである。エレクトロポレーションによる酵母の形質転換法は、Becker & Guarente (1990) Methods Eszymol. 194, 182に開示されている。

一般に、プラスミドは、全ての宿主を形質転換するわけではないので、形質転換された宿主細胞を選択する必要がある。よって、本発明の第一、第二または第三の態様のいずれか一つに従うプラスミドは、ポリヌクレオチド配列挿入内またはプラスミド上のいずれかの位置に、限定されるものではないが、細菌選択マーカーおよび／または酵母選択マーカーをはじめとする選択マーカーを含み得る。典型的な細菌選択マーカーはβ−ラクタマーゼ遺伝子であるが、その他多くのものが当技術分野で公知である。好適な酵母選択マーカーとしては、ＬＥＵ２（またはβ−ラクタマーゼマレイン酸デヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質をコードする等価の遺伝子）、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３、ＨＩＳ４、ＵＲＡ３、ＵＲＡ５、ＳＦＡ１、ＡＤＥ２、ＭＥＴ１５、ＬＹＳ５、ＬＹＳ２、ＩＬＶ２、ＦＢＡ１、ＰＳＥ１、ＰＤＩ１およびＰＧＫ１が挙げられる。利用可能な種々の選択肢に照らして、最も好適な選択マーカーが選択できる。所望であれば、ＵＲＡ３および／またはＬＥＵ２を避けることもできる。当業者ならば、ｐｇｋ１酵母株のＰＧＫ１で実証されているように(Piper and Curran, 1990, Curr. Genet. 17, 119)、プラスミド上に機能的遺伝子が提供されている場合には、その染色体欠失または不活性化が生存力のない宿主を作り出すいずれかの遺伝子、いわゆる必須遺伝子を選択マーカーとして使用できることが分かるであろう。好適な必須遺伝子はStanfordゲノムデータベース（ＳＧＤ）、http:://db.yeastgenome.orgに見出せる。

さらに、本発明の第一、第二または第三の態様のいずれか一つに従うプラスミドは、ポリヌクレオチド配列挿入内またはプラスミド上のいずれかの位置に１を超える選択マーカーを含み得る。

１つの選択技術としては、形質転換細胞において選択形質をコードするＤＮＡ配列マーカーを必要な制御エレメントとともに発現ベクターに組み込むことを含む。これらのマーカーとしては、真核細胞培養に関してはジヒドロ葉酸レダクターゼ、Ｇ４１８またはネオマイシン耐性、および大腸菌およびその他の細菌の培養に関してはテトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピシリン（すなわち、β−ラクタマーゼ）耐性遺伝子が挙げられる。あるいは、このような選択形質の遺伝子は、目的の宿主細胞と同時形質転換するのに用いる別のベクター上にあってもよい。

首尾よく形質転換した細胞を同定する別法としては、本発明によるプラスミドの導入から得られた細胞を増殖させ、場合によって、組換えポリペプチド（すなわち、プラスミド上のポリヌクレオチド配列によりコードされており、かつ、そのポリペプチドがその宿主により自然には産生されないという意味で、宿主細胞にとっては異種であるポリペプチド）を発現させる。細胞を採集し、溶解し、Southern (1975) J Mol. Biol. 98, 503またはBerent et al (1985) Biotech. 3, 208が記載しているものなどの方法、または当技術分野で一般的なＤＮＡおよびＲＮＡ分析の他の方法を用い、ＤＮＡまたはＲＮＡ内容物を組換え配列が存在しているかどうか調べることができる。あるいは、形質転換細胞の培養物の上清中のポリペプチドの存在を、抗体を用いて検出することもできる。

組換えＤＮＡの存在に関して直接アッセイすることに加え、形質転換の成功は、組換えＤＮＡがタンパク質の発現を命令し得る場合は、周知の免疫学的方法により確認することができる。例えば、発現ベクターで首尾よく形質転換した細胞は、適当な抗原性を示すタンパク質を産生する。形質転換されたと考えられる細胞のサンプルを採集し、好適な抗体を用いてそのタンパク質に関してアッセイする。

このように、形質転換宿主細胞それら自体に加え、本発明はまた、栄養培地中でのこれらの細胞の培養、好ましくは、モノクローナル（クローン的均一）培養、またはモノクローナル培養由来の培養物も包含する。あるいは、形質転換細胞はそれら自体、工業上／商業上または医薬上有用な産物であり得、培養培地から精製し、所望により、それらの意図する工業上／商業上または医薬上の使用に適当な様式で、担体または希釈剤とともに製剤化し、また、所望により、その使用に適した様式でパッケージングおよび提供することができる。例えば、全細胞を埋植するか、または細胞培養物を工程、作物またはその他の目的の標的上／中へ直接噴霧するのに使用できる。同様に、酵母細胞などの全細胞を、フラグランス、フレーバーおよび医薬など、極めて多様な適用でカプセルとして使用することもできる。

次に、形質転換宿主細胞を十分な時間、当業者に公知であり、また、本明細書に開示されている技術の点から適当な条件下で培養し、そのプラスミド内の１以上のポリヌクレオチド配列挿入中のＯＲＦを発現させることができる。

よって、本発明によれば、（ａ）上記で定義したような本発明の第一、第二または第三の態様に従うプラスミドを準備する工程；（ｂ）好適な宿主細胞を準備する工程；（ｃ）宿主細胞をそのプラスミドで形質転換する工程；および（ｄ）その形質転換宿主細胞を培養培地中で培養し、これによりタンパク質を生産する工程を含む、タンパク質の製造方法も提供される。

細菌（例えば、大腸菌および枯草菌(Bacillus subtilis)、酵母、繊維状真菌（例えば、アスペルギルス属(Aspergillus)）、植物細胞、完全植物体、動物細胞および昆虫細胞をはじめ、多くの発現系が知られている。

一つの実施態様では、好ましい宿主細胞は、プラスミドが安定なマルチコピープラスミドとして維持できる酵母である。このような酵母としては、サッカロミセス・セレビシエ、クルイベロミセス・ラクチス、ピキア・パストリス、チゴサッカロミセス・ルクシー、チゴサッカロミセス・バイリー、チゴサッカロミセス・フェルメンタチ、およびクルイベロミセス・ドロソフィラルムが挙げられる。

プラスミドが好適な（例えば、ＬＥＵ２）マーカーを含むか、または含むように改変されており、かつ、そのマーカーの欠損によって測定した際の安定性が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００世代またはそれ以上の後に、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％，２５％、３０％、４０％、５０％、６０％，７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または実質的に１００％である場合、宿主内で安定なマルチコピープラスミドとして維持可能である。マーカーの欠損は、Chinery & Hinchliffe (1989, Curr. Genet., 16, 21-25)を参照し、上記のようにして評価することができる。

例えば、遺伝子コード配列の分断により、タンパク質のＯ−グリコシル化に関与する１以上のタンパク質マンノシルトランスフェラーゼに欠損のある酵母を用いることが特に有利である。

組換え発現したタンパク質は、生産宿主細胞により望ましくない翻訳後修飾を受けることがある。例えば、アルブミンタンパク質配列はＮ結合型グリコシル化の部位を含まず、自然状態でＯ結合型グリコシル化により修飾されるとの報告はない。しかしながら、多くの酵母種で産生される組換えヒトアルブミン（「ｒＨＡ」）は、一般にマンノースを巻き込むＯ結合型グリコシル化により修飾可能であることが判明した。マンノシル化されたアルブミンはレクチンコンカナバリンＡと結合し得る。酵母により産生されたマンノシル化アルブミンの量は、１以上のＰＭＴ遺伝子を欠いた酵母株を用いて減少させることができる（ＷＯ９４／０４６８７）。これを達成する最も便宜な方法は、そのゲノムに、Ｐｍｔタンパク質のうちの１つを低レベルでしか産生しないような欠陥を有する酵母を作出することである。例えば、Ｐｍｔタンパク質をわずかしか、または全く産生しないような、コード配列または調節領域における（またはＰＭＴ遺伝子の１つの発現を調節する別の遺伝子における）欠失、挿入または転位があり得る。あるいは、この酵母は、抗Ｐｍｔ抗体などの抗Ｐｍｔ剤を産生するように形質転換させることもできる。

Ｓ．セレビシエ以外の酵母を用いる場合、例えば、ピキア・パストリスまたはクルイベロミセス・ラクチスにおいて、Ｓ．セレビシエのＰＭＴ遺伝子に相当する１以上の遺伝子を分断することも有益である。Ｓ．セレビシエから単離されたＰＭＴ１（または他のいずれかのＰＭＴ遺伝子）の配列を、他の真菌種における同等の酵素活性をコードする遺伝子の同定または分断に用いてもよい。クルイベロミセス・ラクチスのＰＭＴ１ホモログのクローニングはＷＯ９４／０４６８７に記載されている。

酵母は、それぞれＷＯ９５／３３８３３およびＷＯ９５／２３８５７に教示されているように、ＨＳＰ１５０および／またはＹＡＰ３遺伝子の欠失を有していることが有利である。

本発明によれば、本発明によるプラスミドを含む、上記で定義したような宿主細胞を準備する工程、およびその宿主細胞を培養培地中で培養し、それにより、タンパク質を生産する工程を含んでなる、タンパク質の製造方法も提供する。培養培地は非選択性であっても、またはプラスミドの安定なマルチコピー維持に対して選択圧をかけてもよい。

本発明によるプラスミドから発現するタンパク質の製造方法は、好ましくは、このようにして生産されたタンパク質を培養宿主細胞または培養培地から単離する工程をさらに含む。

このようにして生産されたタンパク質は細胞内に存在するか、または分泌される場合には、培養培地中および／または宿主細胞の原形質周辺の空間に存在し得る。このタンパク質は、当技術分野で公知の多くの方法により、細胞および／または培養培地から単離することができる。例えば、組換え発現したアルブミンの回収のための精製技術はＷＯ９２／０４３６７（マトリックス由来色素の除去）、ＥＰ４６４５９０（酵母由来着色物質の除去）、ＥＰ３１９０６７（アルカリ沈殿とそれに続く、親油相に対するアルブミンの適用）、ならびにＷＯ９６／３７５１５、米国特許第５７２８５５３号およびＷＯ００／４４７７２（完全精製工程を記載）に開示されており、これらは総て、引用することにより本明細書の一部とされる。アルブミン以外のタンパク質は、培養培地から、そのようなタンパク質を精製するのに有用であることが分かっているいずれかの技術によって精製することができる。

このような周知の方法としては、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿法、酸または溶媒抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、濃縮、希釈、ｐＨ調整、ダイアフィルトレーション、限外濾過、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）、逆相ＨＰＬＣ、伝導性調整などが挙げられる。

一つの実施態様では、上述の技術のうちいずれか１以上を用い、上記のようにして単離されたタンパク質を商業上許容されるレベルの純度にまでさらに精製してもよい。商業上許容されるレベルの純度とは、少なくとも０．０１ｇ．Ｌ^−１、０．０２ｇ．Ｌ^−１、０．０３ｇ．Ｌ^−１、０．０４ｇ．Ｌ^−１、０．０５ｇ．Ｌ^−１、０．０６ｇ．Ｌ^−１、０．０７ｇ．Ｌ^−１、０．０８ｇ．Ｌ^−１、０．０９ｇ．Ｌ^−１、０．１ｇ．Ｌ^−１、０．２ｇ．Ｌ^−１、０．３ｇ．Ｌ^−１、０．４ｇ．Ｌ^−１、０．５ｇ．Ｌ^−１、０．６ｇ．Ｌ^−１、０．７ｇ．Ｌ^−１、０．８ｇ．Ｌ^−１、０．９ｇ．Ｌ^−１、１ｇ．Ｌ^−１、２ｇ．Ｌ^−１、３ｇ．Ｌ^−１、４ｇ．Ｌ^−１、５ｇ．Ｌ^−１、６ｇ．Ｌ^−１、７ｇ．Ｌ^−１、８ｇ．Ｌ^−１、９ｇ．Ｌ^−１、１０ｇ．Ｌ^−１、１５ｇ．Ｌ^−１、２０ｇ．Ｌ^−１、２５ｇ．Ｌ^−１、３０ｇ．Ｌ^−１、４０ｇ．Ｌ^−１、５０ｇ．Ｌ^−１、６０ｇ．Ｌ^−１、７０ｇ．Ｌ^−１、７０ｇ．Ｌ^−１、９０ｇ．Ｌ^−１、１００ｇ．Ｌ^−１、１５０ｇ．Ｌ^−１、２００ｇ．Ｌ^−１、２５０ｇ．Ｌ^−１、３００ｇ．Ｌ^−１、３５０ｇ．Ｌ^−１、４００ｇ．Ｌ^−１、５００ｇ．Ｌ^−１、６００ｇ．Ｌ^−１、７００ｇ．Ｌ^−１、８００ｇ．Ｌ^−１、９００ｇ．Ｌ^−１、１０００ｇ．Ｌ^−１、またはそれ以上の濃度でのタンパク質の提供を含む。

このようにして精製されたタンパク質を凍結乾燥させてもよい。あるいは、担体または希釈剤とともに製剤化し、場合によっては、単位形で提供してもよい。

このタンパク質は医薬上許容されるレベルの純度を達成するために単離されるのが好ましい。タンパク質は、パイロジェンフリーであり、そのタンパク質の活性に関連のない医学的作用を引き起こさずに医薬上有効な量で投与可能であるならば、医薬上許容されるレベルの純度を有する。

得られたタンパク質は、その既知の有用性のいずれを目的に使用してもよく、アルブミンの場合には、火傷、ショックおよび血液損失を処置するための患者へのｉ．ｖ．投与、培養培地への補給、および他のタンパク質製剤における賦形剤としての使用が挙げられる。

本発明によるプロセスによって得られた治療上有用な目的のタンパク質は単独で投与することもできるが、１以上の許容される担体または希釈剤とともに医薬製剤として提供することが好ましい。担体または希釈剤は、目的のタンパク質と適合し、かつ、そのレシピエントに害がないという意味において「許容」されるものでなければならない。一般に、担体または希釈剤は、無菌かつパイロジェンフリーの水または生理食塩水である。

場合によっては、このようにして製剤化されたタンパク質を錠剤、カプセル剤、注射溶液などのような形態で単位投与形として提供する。

本発明者らはまた、「必須」タンパク質の配列を含むタンパク質をコードするプラスミド保持遺伝子が、プラスミドの不在下では必須タンパク質を産生しない宿主細胞内でプラスミドを安定維持するのに使用できることを実証した。好ましい必須タンパク質は必須シャペロンであり、これは、プラスミドの安定性を高めるために選択マーカーとして働くだけでなく、その発現は同時に宿主細胞内の組換え遺伝子によりコードされている異種タンパク質の発現を高めるというさらなる利点をもたらすことができる。この系は、使用者が、プラスミドが保持する必要のある組換え遺伝子の数を最小限とできることから有利である。例えば、典型的な先行技術のプラスミドは、宿主細胞培養工程中にプラスミドの安定維持を可能とするマーカー遺伝子（上記のものなど）を有する。このようなマーカー遺伝子は、目的の作用を達成するのに必要ないずれかのさらなる遺伝子に加えて、プラスミド上に保持される必要がある。しかしながら、外因的ＤＮＡ配列を組み込むプラスミドの能力には限りがあるので、目的の効果を達成するために必要な配列挿入の数を最小限とすることが有利である。さらに、いくつかのマーカー遺伝子（栄養要求性マーカー遺伝子など）は、そのマーカー遺伝子の効果を得るために、培養工程を特定の条件下で行う必要がある。このような特定条件は細胞増殖またはタンパク質産生にとっては最適なものでない場合もあり、あるいは非効率もしくは過度に費用のかかる増殖系が必要な場合もある。

よって、プラスミドの安定性を高めるため、プラスミド保持遺伝子として「必須タンパク質」の配列を含むタンパク質を組換え的にコードする遺伝子を使用することができ、この場合、このプラスミドは、プラスミドの不在下では「必須タンパク質」を産生できない細胞内に存在する。

この「必須タンパク質」は、宿主細胞内のそのコード遺伝子が欠失または不活性化されている場合に、栄養（生合成）要求性を発現する宿主細胞を生じないものであることが好ましい。「栄養（生合成）要求性」とは、増殖培地に対する添加または改変によって補償できる欠陥を含む。従って、本発明において、「必須タンパク質」をコードする「必須マーカー遺伝子」は、宿主細胞において欠失または不活性化されている場合に、増殖培地に対する添加または改変によって補償できない欠陥を生じるものである。この系の利点は、「必須マーカー遺伝子」が、細胞を特定の選択（例えば、選択栄養）条件下で培養する必要があるという不都合な点なく、プラスミドの安定性の増強を達成すべく、プラスミドの不在下では、その遺伝子産物を産生できない宿主細胞のプラスミド上で選択マーカーとして使用できることである。従って、この宿主細胞は、プラスミド安定性が失われることなく、いずれの特定のマーカー遺伝子に適合させる必要もない条件下で培養することができる。例えば、この系を用いて作製した宿主細胞は、複合培地または富栄養培地などの非選択培地で培養することができ、これは栄養要求性マーカー遺伝子にそれらの効果を与えるべく一般的に用いられる最小培地よりも経済的であると考えられる。

この細胞は、例えば、その内因性遺伝子が欠失しているか、またはそうでなければ不活性化されていてもよい。

「必須タンパク質」が「必須」シャペロンであれば、選択増殖条件を必要とせずにプラスミドの安定性を高められ、かつ、宿主細胞内で内因的にコードされているタンパク質または異種タンパク質などのタンパク質の産生を高めるという二重の利点を提供することができるので、特に好ましい。この系にはまた、宿主細胞によるタンパク質の産生を高めるために必須シャペロンの過剰発現を用いる選択をする場合に、プラスミドの保持する必要のある組換え遺伝子の数を最小限とするという利点がある。

本発明のこの態様で用いる好ましい「必須タンパク質」としては、「必須」シャペロンＰＤＩ１およびＰＳＥ１、ならびに宿主細胞においてこれらのタンパク質をコードする内因性遺伝子が欠失または不活性化されている場合に栄養（生合成）要求性を発現する宿主細胞を生じない、ＰＧＫ１またはＦＢＡ１などの他の「必須」遺伝子産物が挙げられる。

よって、本発明の第四の態様によれば、あるプラスミド（本発明の第一、第二または第三の態様のいずれかに従うプラスミドなど）を含む宿主細胞が提供され、このプラスミドは、このプラスミドの不在下では宿主細胞がシャペロンを産生できない必須シャペロンをコードする遺伝子を含む。好ましくは、プラスミドの不在下で、宿主細胞は生存力がない。この宿主細胞は、本発明の最初の態様に関して上記したものなどの異種（またはその組換え遺伝子が、宿主細胞によりコードされているタンパク質と配列が同一のタンパク質をコードしているという意味において相同な）タンパク質をコードする組換え遺伝子をさらに含んでもよい。

本発明の第五の態様によれば、単独の選択マーカーとして、必須シャペロンをコードする遺伝子を含むプラスミドも提供する。このプラスミドは、異種タンパク質をコードする遺伝子をさらに含んでいてもよい。このプラスミドは２μｍ系プラスミドであってもよく、好ましくは、本発明の第一、第二または第三の態様のいずれかに従うプラスミドである。

本発明の第六の態様によれば、あるプラスミドを含む宿主細胞を準備する工程（このプラスミドは、そのプラスミドの不在下では宿主細胞がシャペロンを産生できない、必須シャペロンをコードする遺伝子を含み、この宿主細胞は異種タンパク質をコードする組換え遺伝子さらに含んでもよい）；該宿主細胞を、培養培地中、必須シャペロンおよび異種タンパク質の発現を可能とする条件下で培養する工程；ならびに、所望により、このようにして発現した異種タンパク質を培養宿主細胞または培養培地から精製する工程；ならびに、所望により、このようにして精製されたタンパク質をさらに凍結乾燥する工程を含む、異種タンパク質の製造方法も提供される。

この方法は、精製された異種タンパク質を担体または希釈剤とともに製剤化する工程、および、所望により、このようにして製剤化されたタンパク質を上述の様式で単位投与形として提供する工程をさらに含んでもよい。好ましい一つの実施態様では、この方法は、宿主細胞を富栄養培地などの非選択培地で培養することを含む。

以下の実施例は、図２に示され、一般にｐＳＡＣ３５と呼ばれるタイプの２μｍ系プラスミド（β−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性の関するものであり、酵母に形質転換された後、プラスミドから消失する）、ＬＥＵ２選択マーカーおよびオリゴヌクレオチドリンカーを含み、最後の２つは２μｍ系非組込みベクターｐＳＡＣ３（ＥＰ０２８６４２４参照）のＵＬ領域内のユニークなＳｎａＢＩ部位に挿入されている）のＵＳ領域内の制限エンドヌクレアーゼ部位として定義されるいくつかの位置への付加的なＤＮＡ配列の挿入について記載する。選択されたこれらの部位はＲＥＰ２およびＦＬＰコード領域の３’末端に向かっているか、または下流逆方向反復配列内にあるものであった。各部位に短い合成ＤＮＡリンカーを挿入し、改変されたプラスミドの相対的安定性を非選択培地での増殖中に比較した。ＤＮＡ挿入に好ましい部位を同定した。「目的の遺伝子」を含むより大きなＤＮＡ断片の挿入は、ＰＤＩ１遺伝子を含むＤＮＡ断片うぇをＲＥＰ２の後のＸｃｍＩ部位に挿入することにより証明した。

実施例１
ｐＳＡＣ３５のスモールユニーク領域内のＸｃｍＩ部位への合成ＤＮＡリンカーの挿入
ｐＳＡＣ３５のＵＳ領域への付加的ＤＮＡの挿入に関してまず評価した部位は、５９９ｂｐの逆方向反復内のＸｃｍＩ部位であった。逆方向反復と重複するため、あるＸｃｍＩ部位はＲＥＰ２翻訳終結コドンの後の５１ｂｐを切断し、また他のＸｃｍＩ部位はＦＬＰコード配列の終末端の前の１２７ｂｐを切断する（図３参照）。挿入された配列は、オリゴヌクレオチドＣＦ８６とＣＦ８７の０．５ｍＭ溶液をアニーリングすることにより作製された５２ｂｐのリンカーであった。このＤＮＡリンカーは、ｐＳＡＣ３５には存在しない制限部位をコードするコア領域「ＳｎａＢＩ−ＰａｃＩ−ＦｓｅＩ／ＳｆｉＩ−ＳｍａＩ−ＳｎａＢＩ」を含んでいた。

プラスミドｐＳＡＣ３５をＸｃｍＩで部分的に消化し、線状１１ｋｂ断片を０．７％（ｗ／ｖ）アガロースゲルから単離し、ＣＦ８６／ＣＦ８７ＸｃＭＩリンカー（無希釈、１０^−１および１０^−２希釈）と連結し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。アンピシリン耐性形質転換体を選択し、ＳｍａＩ消化により線状化可能なプラスミドの存在に関してスクリーニングした。制限酵素分析により、ＲＥＰ２の後のＸｃｍＩ部位にリンカーがクローニングされているｐＤＢ２６８８（図４）が確認された。オリゴヌクレオチドプライマーＣＦ８８、ＣＦ９８およびＣＦ９９（表１）を用いたＤＮＡシーケンシングにより、正確なリンカー配列を含んでいる挿入が確認された。

また、制限酵素分析によっても、ＦＬＰ遺伝子のＸｃｍＩ部位にリンカーがクローニングされているｐＤＢ２６８９（図５）が確認された。しかしながら、このｐＤＢ２６８９のリンカーは、プライマーＣＦ９０およびＣＦ９１を用いたＤＮＡシーケンシングにより、ＦｓｅＩ／ＳｆｉＩ部位内にＧ：Ｃ塩基対の欠失を有することが示された（上記でＣＦ８６＋ＣＦ８７リンカーにおいて太字で表示）。これにより、翻訳終結コドンの前の３９のＣ末端アミノ酸残基が５６の異なるアミノ酸で置換された突然変異Ｆｌｐ−タンパク質のコード配列が作製された。

ｐＤＢ２６８９リンカー配列の欠失した塩基対を修正してｐＤＢ２７８６を作出した（図６）。これを達成するため、オリゴヌクレオチドＣＦ１０４およびＣＦ１０５から３１ｂｐの５’リン酸化ＳｎａＢＩ−リンカーを作製した。これを、ウシ腸管アルカリ性ホスファターゼで予め処理したｐＤＢ２６８９のＳｎａＢＩ部位に連結した。プライマーＣＦ９０、ＣＦ９１、ＣＦ１００およびＣＦ１０１を用いたＤＮＡシーケンシングにより、ｐＤＢ２７８６の正確なＤＮＡリンカー配列を確認した。これにより、翻訳終結部の前の３９のＣ末端残基が１４の異なる残基で置換された突然変異Ｆｌｐ−タンパク質のコード配列が作製された。

また、ＳｎａＢＩリンカーをｐＤＢ２７８６に反対方向に連結することでさらなるプラスミドｐＤＢ２７９８（図７）を作出した。このｐＤＢ２７９８のリンカー配列をＤＮＡシーケンシングにより確認した。プラスミドｐＤＢ２７９８は、翻訳終結部の前の３９のＣ末端残基が８個の異なる残基で置換された突然変異Ｆｌｐ−タンパク質のコード配列を含んでいた。

また、ＦＬＰ遺伝子のＸｃｍＩ部位にリンカーをクローニングして、その挿入部位においてＦｌｐタンパク質を末端切断した。用いたリンカーは、オリゴヌクレオチドＣＦ１２０およびＣＦ１２１からなる４５ｂｐの５’リン酸化ＸｃｍＩ−リンカーであった。

このＣＦ１２０／ＣＦ１２１ＸｃｍＩリンカーを、ＸｃｍＩで部分的に消化した後に、ウシ腸管アルカリ性ホスファターゼで処理することで作製した１１ｋｂのｐＳＡＣ３５断片と連結した。アンピシリン耐性大腸菌ＤＨ５α形質転換体の分析により、ｐＤＢ２８２３を含むクローンが確認された（図８）。プライマーＣＦ９０、ＣＦ９１、ＣＦ１００およびＣＦ１０１を用いたＤＮＡシーケンシングにより、ｐＤＢ２８２３におけるリンカー配列を確認した。挿入されたリンカー内の翻訳終結部は、４１個のＣ末端残基を欠いたＦｌｐ（１〜３８２）を産生した。

プラスミドの安定性に対する、ｐＳＡＣ３５のＵＳ領域内のＸｃｍＩ部位へのリンカー配列の挿入の影響を、ｐＤＢ２６８８およびｐＤＢ２６８９に関して評価した。プラスミドの安定性はＳ．セレビシエ株において、ＹＥＰＳ上での非選択的増殖中のＬＥＵ２マーカーの消失により判定した。構造的にはｐＳＡＣ３と類似しているが、ＬＥＵ２選択マーカーを含んだ、ＳｎａＢＩ部位に挿入された付加的ＤＮＡを含むｐＳＡＣ３５で形質転換した同じ酵母株を対照として用いた(Chinery & Hinchliffe, 1989, Curr. Genet., 16, 21)。

この酵母株を、改良型酢酸リチウム法(Sigma酵母形質転換キット、ＹＥＡＳＴ−１、プロトコール２; (Ito et al, 1983, J. Bacteriol., 153, 163; Elble, 1992, Biotechniques, 13, 18))を用いて形質転換し、ロイシン原栄養性とした。ＢＭＭＤ寒天プレート上で形質転換体を選択し、その後、ＢＭＭＤ寒天プレート上に貼付した。１０ｍＬＢＭＭＤ振盪フラスコ培養（２４時間、３０℃、２００ｒｐｍ）から低温保存トレハロース原液を調製した。

ＹＥＰＤおよびＢＭＭＤの組成は、Sleep et al., 2002, Yeast 18, 403により記載されている。ＹＥＰＳおよびＢＭＭＳの組成は、単独の初期炭素源として２％（ｗ／ｖ）グルコースの代わりに２％（ｗ／ｖ）スクロースを用いること以外はＹＥＰＤおよびＢＭＭＤと同じであった。

プラスミド安定性の判定に関しては、１ｍＬの低温保存原液を解凍し、２５０ｍＬ三角フラスコ中、１００ｍＬＹＥＰＳ（初期ＯＤ_６００≒０．０４〜０．０９）に接種し、回転振盪機（２００ｒｐｍ、Ｉｎｎｏｖａ４３００インキュベーターシェーカー, New Brunswick Scientific）にて３０℃で約７２時間（７０〜７４時間）増殖させた。

各フラスコからサンプルを取り出し、ＹＥＰＳ培養液で希釈し（１０^−２〜１０^−５希釈）、１００μｌアリコートをＹＥＰＳ寒天プレート上に二反復でプレーティングした。細胞を３０℃で３〜４日間増殖させ、単一のコロニーを発達させた。分析する各酵母原株につき、無作為な１００個のコロニーのレプリカをＢＭＭＳ寒天プレートに、次いで、ＹＥＰＳ寒天プレートに取った。３０℃で３〜４日間増殖させた後、プラスミド安定性の指標として、ＢＭＭＳ寒天プレートとＹＥＰＳ寒天プレートの双方で増殖するコロニーのパーセンテージを求めた。

形質転換体からのＬＥＵ２マーカーの欠損を調べるための上記分析では、ｐＳＡＣ３５およびｐＤＢ２６８８は１００％安定であることが分かり、一方、ｐＤＢ２６８９は７２％安定であった。ゆえに、ＲＥＰ２の後のＸｃｍＩ部位へのリンカーの挿入は、転写配列を変更し、５９９ｂｐ逆方向反復間の相同性を妨げるにもかかわらず、プラスミドの安定性に明らかな影響を示さなった。ＦＬＰ内のＸｃｍＩ部位におけるリンカーの挿入も、逆方向反復の妨害およびＦｌｐタンパク質の突然変異の双方があるにもかかわらず、驚くほど安定なプラスミドをもたらした。

実施例２
ｐＤＢ２６８８のＸｃｍＩリンカーへのＰＤＩ１遺伝子の挿入
２μｍ様ベクターのＵＳ領域への大きなＤＮＡ断片の挿入は、Ｓ．セレビシエＰＤＩ１遺伝子をｐＤＢ２６８８のＸｃｍＩリンカーにクローニングすることにより証明した。このＰＤＩ１遺伝子（図９）を、ＰＤＩ１遺伝子を含む大きなＳ．セレビシエＳＫＱ２ｎゲノムＤＮＡ断片（米国特許第６，２９１，２０５号に記載され、また、Crouzet & Tuite, 1987, Mol. Gen. Genet., 210, 581-583およびFarquhar et al, 1991, 前掲にもクローンＣ７として記載されているプラスミドｐＭＡ３ａ：Ｃ７において提供されているもの）（これは、ＹＩｐｌａｃ２１１(Gietz & Sugino, 1988, Gene, 74, 527-534)にクローニングされたものであり、ＰＤＩ１遺伝子の３’非翻訳領域内のユニークなＢｓｕ３６Ｉ部位に挿入されたＳａｃＩ制限部位を含む合成ＤＮＡリンカーを有していた）に由来の１．９ｋｂＳａｃＩ−ＳｐｅＩ断片にクローニングした。この１．９ｋｂＳａｃＩ−ＳｐｅＩ断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理してＳｐｅＩ５’−オーバーハングを埋め、ＳａｃＩ３’−オーバーハングを除去した。このＰＤＩ１断片は、翻訳開始コドンの上流に２１２ｂｐのＰＤＩ１プロモーターと、翻訳終結コドンの下流に１４８ｂｐを含んでいた。これを、ＳｍａＩ線状化／ウシ腸管アルカリ性ホスファターゼで処理したｐＤＢ２６８８に連結し、ＲＥＰ２と同じ方向で転写されるＰＤＩ１遺伝子を有するプラスミドｐＤＢ２６９０（図１０）を作出した。Ｓ．セレビシエ株をｐＤＢ２６９０で形質転換してロイシン原栄養性とした。

次に、ヒトトランスフェリン突然変異体（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ）の発現カセットをｐＤＢ２６９０のＮｏｔＩ部位にクローニングし、ｐＤＢ２７１１（図１１）を作出した。このｐＤＢ２７１１中の発現カセットはＳ．セレビシエＰＲＢ１プロモーター、ＨＳＡ／ＭＦα融合リーダー配列（ＥＰ３８７３１９； Sleep et al, 1990, Biotechnology (N.Y.), 8, 42）、その後にヒトトランスフェリン突然変異体（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ）のコード配列とＳ．セレビシエＡＤＨ１ターミネーターを含んでいる。プラスミドｐＤＢ２５３６（図３６）は、同じ発現カセットをｐＳＡＣ３５のＮｏｔＩ部位に挿入することにより構築した。

２μｍベクターのＵＳ領域に「目的の遺伝子」を挿入することの利点は、ｐＤＢ２７１１で形質転換した酵母の発酵中の、組換えトランスフェリンＮ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑの分泌が、ｐＤＢ２５３６で形質転換した同じ酵母に比べておよそ７倍高いことで証明された。振盪フラスコ培養では、組換えトランスフェリンＮ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ分泌におよそ１５倍の増加が見られた（データは示されていない）。

プラスミドｐＤＢ２６８８、ｐＤＢ２６９０、ｐＤＢ２７１１、ｐＤＢ２５３６およびｐＳＡＣ３５の相対的安定性を、上記の方法を用い、ＹＥＰＳ培地で増殖させた同じ酵母株判定した（表２）。

この分析では、ＰＤＩ１挿入のないｐＤＢ２６８８が１００％の安定性であるのに対し、ｐＤＢ２６９０は３２％安定であった。このプラスミド安定性における低下は、ｐＳＡＣ３５のラージユニーク領域内のＮｏｔＩ部位にｒＴＦ（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ）発現カセットが挿入されたために、ｐＤＢ２５３６で見られたプラスミド安定性の低下よりも小さかった（表２）。

さらに、ｐＤＢ２７１１で形質転換した同じ酵母から得られたｒＴＦ（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ）は、ｐＤＢ２５３６で形質転換した同じ酵母から達成されたものに比べて低下していなかったことから、高細胞密度発酵中の最小培地での選択的増殖は、ＹＥＰＳ培地で見られたＰＤＩ１挿入によるプラスミド不安定性の上昇を克服できた。

実施例３
ＲＥＰ２遺伝子およびｐＳＡＣ３５の逆方向反復内の下流配列へのＤＮＡリンカーの挿入
ＲＥＰ２遺伝子およびその下流の逆方向反復内の配列への付加的ＤＮＡの挿入に関して有用な制限を定義するため、さらなるリンカーをｐＳＡＣ３５に挿入した。図１２はこれらの挿入に用いた制限部位およびこれらの部位における翻訳終結のＲｅｐ２タンパク質に対する影響を示している。

ＲＥＰ２内のＸｍｎＩ部位に挿入したリンカーはオリゴヌクレオチドＣＦ１０８およびＣＦ１０９からなる４４ｂｐの配列であった。

ｐＳＡＣ３５内の他のＸｍｎＩ部位への挿入を避けるため、ＲＥＰ２およびＦＬＰ遺伝子を含んだｐＳＡＣ３５に由来する３，０７６ｂｐのＸｂａＩ断片をまず、大腸菌クローニングベクターｐＤＢ２６８５（図１３）にサブクローニングし、ｐＤＢ２７８３（図１４）を作出した。

プラスミドｐＤＢ２６８５は、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)由来のアプラマイシン耐性遺伝子ａａｃ（３）IV(Rao et al, 1983, Antimicrob. Agents Chemother., 24, 689)とｐＭＣＳ５由来の多重クローニング部位(Hoheisel, 1994, Biotechniques, 17, 456)を含むｐＣＦ１７に由来するｐＵＣ１８様クローニングベクターである。ｐＣＦ１７はｐＩＪ８６００(Sun et al., 1999, Micnobiology, 145(9), 2221-7)から、ＥｃｏＲＩ、ＮｈｅＩおよびＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片で消化し、自己連結した後、コンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞の形質転換による反応生成物から単離し、硫酸アプラマイシンで選択することにより作出したものである。プラスミドｐＤＢ２６８５は、ｐＭＣＳ５由来の４３９ｂｐＳｓｐＩ−ＳｗａＩ断片を、ＭｓｃＩで切断の上、ウシ腸管アルカリ性ホスファターゼで処理したｐＣＦ１７にクローニングすることにより構築した。青色／白色の選択はＩＰＴＧ誘導には依存しない。

プラスミドｐＤＢ２７８３をＸｍｎＩで線状化し、ＣＦ１０８／ＣＦ１０９ＸｍｎＩ−リンカーと連結し、ｐＤＢ２７９９（図１５）およびｐＤＢ２７８０（示されていない）を作出した。プラスミドｐＤＢ２７９９は、Ｒｅｐ２（１〜２４４）を産生するため挿入部位に翻訳終結にとって適正な方向でＣＦ１０８／ＣＦ１０９ＸｍｎＩリンカーを含んでいたが、ｐＤＢ２７８０のほうは逆向きにクローニングされたリンカーを含んでいた。プライマーＣＦ９８およびＣＦ９９を用いたＤＮＡシーケンシングにより、正確なリンカー配列を確認した。

次に、ｐＤＢ２７９９由来の３，１２０ｂｐのＸｂａＩ断片を、部分的ＸｂａＩ消化とウシ腸管アルカリ性ホスファターゼ処理によって作製した７，９６１ｂｐのｐＳＡＣ３５断片と連結し、プラスミドｐＤＢ２８１７（Ｂ型）およびｐＤＢ２８１８（Ａ型）非組込みベクター（それぞれ図１６および１７）を作出した。

ｐＳＡＣ３５内のＡｐａＩ部位におけるリンカーの挿入は、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによる３’−５’エキソヌクレアーゼを用いて、また、用いずに行った。これにより、翻訳終結の前にＲｅｐ２（１〜２７１）かＲｅｐ２（１〜２６９）かのいずれかのコード配列が作出された。次の図面において、斜線で示された配列ＧＧＣＣは、ＡｐａＩ消化後に生じた３’−オーバーハングから削除され、その結果、グリシン−１７０（ＧＧＣ）およびプロリン−１７１のコドン由来のヌクレオチドが除去されている。

エキソヌクレアーゼ消化せずにＡｐａＩ部位に挿入されたリンカーは、オリゴヌクレオチドＣＦ１１６およびＣＦ１１７からなる５０ｂｐの５’−リン酸化リンカーであった。

これを、ＡｐａＩで線状化し、ウシ腸管アルカリ性ホスファターゼで処理したｐＳＡＣ３５と連結し、ｐＤＢ２７８８（図１８）およびｐＤＢ２７８９（示されていない）を作出した。ｐＤＢ２７８８内では、リンカーはプロリン−２７１の後に翻訳終結に適正な方向で存在したが、ｐＤＢ２７８９では、リンカーは逆向きであった。

Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによるエンドヌクレアーゼ消化を用いてＡｐａＩ部位に挿入したリンカーは、オリゴヌクレオチドＣＦ１０６およびＣＦ１０７からなる４３ｂｐの５’リン酸化リンカーであり、これをコア終結リンカーと呼んだ。

このコア終結リンカーを、ＡｐａＩで線状化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで消化し、ウシ腸管アルカリ性ホスファターゼで処理したｐＳＡＣ３５と連結した。この連結により、グルタミン酸−２６９の後に翻訳終結に適正な方向でクローニングされたリンカーを有するｐＤＢ２７８７（図１９）が作出された。

適正なＤＮＡ配列を、オリゴヌクレオチドプライマーＣＦ９８およびＣＦ９９を用い、ＡｐａＩリンカーを含む総てのクローンにおいて確認した。

また、コア終結リンカー（ＣＦ１０６＋ＣＦ１０７）をｐＤＢ２７８３のＦｓｐＩ部位への挿入にも用いた（図１４）。このコア終結リンカー（ＣＦ１０６＋ＣＦ１０７）を、部分的ＦｓｐＩ消化により線状化し、ウシ腸管アルカリ性ホスファターゼで処理したｐＤＢ２７８３に連結した。アプラマイシン耐性大腸菌ＤＨ５α形質転換体から単離されたプラスミドをＦｓｐＩ消化によりスクリーニングし、選択されたクローンをＭ１３フォワードおよびリバースプライマーを用いて配列決定した。

プラスミドｐＤＢ２８０１（示されていない）は、適正な方向でクローニングされた２コピーのリンカーを含んでいる（ＲＥＰ２遺伝子に近接したＰａｃＩ部位を有する）ことが確認された。次に、このリンカーの余分なコピーを、まず、多重クローニング部位領域から、ＦｓｅＩ部位を含む１１６ｂｐのＮｒｕＩ−ＨｐａＩ断片を削除することで除去し、次に、ＦｓｅＩで消化し、再連結してｐＤＢ２８０２（図２０）を作出した。オリゴヌクレオチドＣＦ１２６を用いたＤＮＡシーケンシングにより、正確なリンカー配列を確認した。

次に、この３，１１９ｂｐのｐＤＢ２８０２ＸｂａＩ断片を、部分的ＸｂａＩ消化およびウシ腸管アルカリ性ホスファターゼ処理によって作出した７，９６１ｂｐのｐＳＡＣ３５断片と連結し、ｐＤＢ２８０５（Ｂ型）およびｐＤＢ２８０６（Ａ型）非組込みベクター（それぞれ図２１および２２）を作出した。

実施例４
ＦＬＰ遺伝子およびｐＳＡＣ３５の逆方向反復内の下流配列へのＤＮＡリンカーの挿入
ＦＬＰ遺伝子および逆方向反復内の下流配列への付加的ＤＮＡの挿入に関して有効な制限を定義するため、ＤＮＡリンカーをｐＳＡＣ３５へ挿入した。図３は、これらの挿入に用いた制限部位およびこれらの部位における翻訳終結のＦｌｐタンパク質に対する影響を示している。

ＢｃｌＩ部位に挿入されたリンカーは、オリゴヌクレオチドＣＦ１１８およびＣＦ１１９からなる４９ｂｐの５’−リン酸化リンカーであった。

ｐＳＡＣ３５内のＢｅｌＩ部位のＤａｍメチル化により、ＢｃｌＩリンカーを、大腸菌株ＥＴ１２５６７ｐＵＺ８００２(MacNeil et al, 1992, Gene, 111, 61; Kieser et al, 2000, Practical Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation, Norwich)から単離した非メチル化ｐＳＡＣ３５ＤＮＡにクローニングした。プラスミドｐＳＡＣ３５をＢｃｌＩで線状化し、ウシ腸管アルカリ性ホスファターゼで処理し、ＢｃｌＩリンカーと連結してｐＤＢ２８１６（図２３）を作出した。オリゴヌクレオチドプライマーＣＦ９１およびＣＦ１００を用いたＤＮＡシーケンシングにより、ｐＤＢ２８１６には３コピーのＢｃｌＩリンカーが存在し、それらは総て、ヒスチジン−３５３の後に、Ｆｌｐの翻訳終結の適正な方向にあることが示された。

ｐＤＢ２８１６のＰａｃＩ消化の後に自己連結を行い、それぞれ１コピーおよび２コピーのＢｃｌＩリンカーを含むｐＤＢ２８１４およびｐＤＢ２８１５（図２４および２５）を作出した。これらのリンカーのＤＮＡ配列を、プライマーＣＦ９１およびＣＦ１００を用いて確認した。Ｓ．セレビシエでは、ｐＤＢ２８１４、ｐＤＢ２８１５またはｐＤＢ２８１６で形質転換された酵母により末端切断型Ｆｌｐ（１〜３５３）タンパク質が産生される。

１コピーのＢｃｌＩリンカーを逆向きにｐＤＢ２８１４に連結することで、さらなるプラスミドｐＤＢ２８４６（データは示されていない）も作出された。これは、Ｆｌｐ由来の最初の３５２残基のコード配列とそれに続いて翻訳終結の前に１４の異なる残基を有する。

ＨｇａＩ部位に挿入されたリンカーは、オリゴヌクレオチドＣＦ１１４およびＣＦ１１５からなる４７ｂｐの５’−リン酸化リンカーであった。

ＨｇａＩリンカーを、部分的ＨｇａＩ消化により線状化し、ウシ腸管アルカリ性ホスファターゼで処理したｐＤＢ２７８３と連結し、ｐＤＢ２８１１（図２６）を作出した。オリゴヌクレオチドＣＦ９０、ＣＦ９１およびＣＦ１００を用いてＤＮＡシーケンシングにより、正確なリンカー挿入を確認した。

次に、ｐＤＢ２８１１由来の３，１２３ｂｐＸｂａＩ断片を、部分的ＸｂａＩ消化およびウシ腸管アルカリ性ホスファターゼ処理により作出した７，９６１ｂｐのｐＳＡＣ３５断片と連結し、ＨｇａＩ部位に挿入されたＤＮＡを含むｐＤＢ２８１２（Ｂ型）およびｐＤＢ２８１３（Ａ型）非組込みベクター（それぞれ図２７および２８）を作出した。

ＦＬＰの後のＦｓｐＩに挿入されたコア終結リンカー（ＣＦ１０６＋ＣＦ１０７）を有するプラスミドｐＤＢ２８０３およびｐＤＢ２８０４（それぞれ図２９および３０）を、ｐＤＢ２８０１を構築するために用いたものと同じ方法により単離した。適正なリンカー挿入をＤＮＡシーケンシングにより確認した。プラスミドｐＤＢ２８０４は適正な方向で挿入されたリンカーを含んでいたが（ＦＬＰ遺伝子に近接したＰａｃＩ部位を有する）、ｐＤＢ２８０３は逆向きのリンカーを含んでいた。

このｐＤＢ２８０４３，１１９ｂｐＸｂａＩ断片を、部分的ＸｂａＩ消化およびウシ腸管アルカリ性ホスファターゼ処置により作出した７，９６１ｂｐのｐＳＡＣ３５断片と連結し、ＦＬＰの後のＦｓｐＩ部位に挿入されたＤＮＡを含むｐＤＢ２８０７（Ｂ型）およびｐＤＢ２８０８（Ａ型）非組込みベクター（それぞれ図３１および３２）を作出した。

実施例５
スモールユニーク領域および逆方向反復中に挿入されたＤＮＡリンカーを含むｐＳＡＣ３５様プラスミドで形質転換した酵母におけるＬＥＵ２マーカーの相対的安定性
Ｓ．セレビシエ株を、ＵＳ領域および逆方向反復中に挿入されたＤＮＡリンカーを含むｐＳＡＣ３５様プラスミドで形質転換した。プラスミドの安定性を試験するため、低温保存トレハロース原液を調製した（表３）。プラスミド安定性は、ｐＳＡＣ３５内のＸｃｍＩ部位に挿入されたリンカーに関して上記したように分析した。分析する挿入部位につき二反復のフラスコを設定した。振盪フラスコ培養にて３日後の細胞から得られたコロニーの分析に加え、コロニーを増殖させ、さらに４日、振盪フラスコ培養した細胞からも分析した。このため、３日目の各フラスコから１００μＬのサンプルを取り出し、１００ｍＬＹＥＰＳ培養液中、回転振盪機にて、３０．０℃でおよそ９６時間（９４〜９８時間）、さらに継代培養し、その後、単一コロニーを得、ＬＥＵ２マーカーの欠損に関して分析した。この場合、分析は選択した株からの１本のフラスコに限定し、それにつき５０コロニーを採種した。全結果を表４にまとめる。

これらの改変ｐＳＡＣ３５プラスミドは総て、酵母を形質転換してロイシン原栄養性とすることができたが、このことは、２μｍＤＮＡの機能的に過密な領域内にさらなるＤＮＡが挿入されているにもかかわらず、総てがＳ．セレビシエ内で複製および分離可能であることを示唆している。これを、２μｍＵＳ領域内の総ての部位に挿入された４３〜５２塩基対のリンカー、ならびにＰＤＩｌ遺伝子を含むより大きなＤＮＡ挿入を有するプラスミドに適用した。

リンカー挿入部位に関して、データは両実験および反復間で再現性があった。ＲＥＰ２またはＦＬＰオープンリーディングフレームの外側であるが逆方向反復の内部にある総ての部位が、用いた試験条件下で１００％安定であることが分かった。プラスミド不安定性（すなわち、プラスミド欠損）は、ＲＥＰ２またはＦＬＰオープンリーディングフレーム内の部位に挿入されたリンカーで見られた。認められたＲＥＰ２挿入のプラスミド不安定性はＦＬＰ挿入の場合よりも大きかった。ＲＥＰ２挿入では、ＬＥＵ２マーカーの欠損は非選択培地での増殖期間が長くなるほど持続したが、ＦＬＰ挿入の場合にはあまり違いはなかった。

ＲＥＰ２遺伝子への挿入では、自己会合および２μｍのＳＴＢ遺伝子座との結合に働きを持つことが知られている領域内で末端切断されたＲｅｐ２ポリペプチドが生じた(Sengupta et al, 2001, J. Bacteriol., 183, 2306)。

ＦＬＰ遺伝子への挿入では、末端切断型Ｆｌｐタンパク質が生じた。挿入部位は総て、Ｆｌｐタンパク質の適正な機能に必須の(Prasad et al, 1987, Proc. Natl. Acad-Sci. U S.A., 84, 2189; Chen et al, 1992, Cell, 69, 647; Grainge et al., 2001, J. Mol. Biol., 314, 717)、Ｃ末端ドメイン内のチロシン−３４３の後であった。

ＦＬＰＸｃｍＩ部位への挿入（これもまた、Ｆｌｐタンパク質産物を末端切断した）以外に、プラスミド不安定性が検出された逆方向反復領域への挿入はなかった。逆方向反復領域内のＦｓｐＩ部位における挿入は、プラスミドの複製に重要なＦＲＴ（Ｆｌｐ認識標的）領域に近接していた。

ＲＥＰ２オープンリーディングフレーム、またはＦＬＰオープンリーディングフレームまたは逆方向反復配列に４３〜５２塩基対のＤＮＡリンカーが挿入されたｐＳＡＣ３５様プラスミドが構築されている。さらに、ＰＤＩ１遺伝子を含む１．９ｋｂのＤＮＡ断片をＤＮＡリンカーのＲＥＰ２の後のＸｃｍＩ部位に挿入した。

付加的ＤＮＡが挿入されたｐＳＡＣ３５様ベクターは総て、酵母を形質転換してロイシン原栄養性とすることができた。よって、２μｍプラスミドＤＮＡの機能的に過密な領域にＤＮＡを挿入するにもかかわらず、プラスミドの複製および分離機構は損なわれていなかった。

非選択培地での増殖中のＬＥＵ２選択マーカーの欠損を測定することによるプラスミド安定性の判定は、逆方向反復中へのＤＮＡリンカーの挿入がプラスミドを不安定にすることはなかったが、プラスミドの安定性はＲＥＰ２およびＦＬＰオープンリーディングフレーム中への挿入によって低下することを示した。しかし、ＲＥＰ２およびＦＬＰオープンリーディングフレーム中の本発明の第一および第二の態様で定義されたいくつかの位置に挿入が行われた場合、非選択培地増殖条件下でプラスミドの安定性が低下するにもかかわらず、生じるプラスミドはやはり、選択培地で増殖させる場合の酵母に用いるのに十分高い安定性を有している。

実施例６
ｐＳＡＣ３５のスモールユニーク領域内のＲＥＰ２遺伝子のすぐ後におけるＤＮＡ配列の挿入
ＲＥＰ２遺伝子およびその下流の逆方向反復内の配列への付加的ＤＮＡの挿入に関して有効な制限をさらに定義するため、合成ＤＮＡリンカーを、ｐＳＡＣ３５のＲＥＰ２翻訳終結コドン（ＴＧＡ）のすぐ後に挿入した。２μｍ（またはｐＳＡＣ３５）内のＲＥＰ２コード配列のすぐ後に都合よく存在する天然の制限エンドヌクレアーゼ部位がないので、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によりＦＬＰ遺伝子および逆方向反復内の下流配列への付加的ＤＮＡの挿入に関して有効な制限を定義するために、この位置にＳｎａＢＩ部位を導入した。ｒＲＥＰ２のすぐ下流にユニークなＳｎａＢＩ部位を有するｐＳＡＣ３５誘導体をｐＤＢ２９３８（図３７）と呼称した。ｐＤＢ２９３８では、ＳｎａＢＩ部位の挿入により、逆方向反復の末端が逆方向反復の残りの部分からはすれている。次に、ｐＤＢ２９３８のユニークなＳｎａＢＩ部位に、オリゴヌクレオチドＣＦ１０４およびＣＦ１０５（前掲）からなるＳｎａＢＩリンカーの同一の３１ｂｐの配列が挿入され、その結果、ＲＥＰ２のＴＧＡ翻訳終結コドンのすぐ後にある制限エンドヌクレアーゼ部位の順序がＳｎａＢＩ−ＰａｃＩ−ＦｓｅＩ／ＳｆｉＩ−ＳｍａＩ−ＳｎａＢＩとなったｐＤＢ２９５４（図３８）を構築した。

ｐＤＢ２９３８を構築するため、ｐＤＢ２７８３（図１４）由来の１，０８５ｂｐのＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ断片をまず、ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩおよびウシ腸管アルカリ性ホスファターゼで消化したｐＭＣＳ５(Hoheisel, 1994, Biotechniques, 17, 456)にサブクローニングした。これによってｐＤＢ２８０９（図３９）を得、次にこれを、オリゴヌクレオチドＣＦ１２７およびＣＦ１２８を用いて突然変異誘発し、ｐＤＢ２９２０（図４０）を作出した。

オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発は、Ｓｔａｔａｇｅｎｅのクイックチェンジ（商標）部位特異的突然変異誘発キットに従って行った。プラスミドＤＮＡのＳｎａＢＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限消化を用いて、ｐＤＢ２９２０を含んだアンピシリン耐性大腸菌形質転換体を同定した。ｐＤＢ２９２０において、挿入されたＳｎａＢＩ制限部位の６ｂｐ配列および１，０９１ｂｐのＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ断片全体の適正なＤＮＡ配列を、オリゴヌクレオチドプライマーＣＦ９８、ＣＦ９９、ＣＦ１２９、ＣＦ１３０、ＣＦ１３１およびＭ１３フォワードおよびリバースプライマー（表１）を用いたＤＮＡシーケンシングにより確認した。

ｐＤＢ２９２０由来の１，０９１ｂｐのＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ断片をアガロースゲル精製により単離し、ｐＤＢ２７８３由来のおよそ４．７ｋｂのＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ断片と連結してｐＤＢ２９３６（図４１）を作出した。このｐＤＢ２７８３の４．７ｌｋｂＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ断片を、まず、ＮｃｏＩによる部分的消化により線状化してアガロースゲル電気泳動により精製したｐＤＢ２７８３ＤＮＡの完全ＢａｍＨＩ消化により単離した。この連結産物により、大腸菌ＤＨ５α細胞を形質転換してアプラマイシン耐性とした。アプラマイシン耐性クローンから単離したプラスミドＤＮＡのＳｎａＢＩ消化によりｐＤＢ２９３６を同定した。

次に、ｐＤＢ２９３６由来の３，０８２ｂｐＸｂａＩ断片を、部分的ＸｂａＩ消化およびウシ腸管アルカリ性ホスファターゼ処理により作製した７，９６１ｂｐのｐＳＡＣ３５断片と連結し、非組込みベクターｐＤＢ２９３８（２μｍＢ型、図３７）を作出した。

ｐＤＢ２９３８をＳｎａＢＩおよびウシ腸管ホスファターゼで消化し、ｐＤＢ２９３９由来のおよそ２ｋｂのＳｎａＢＩ断片と連結した（図４２）。オリゴヌクレオチドプライマーＤＳ２４８およびＤＳ２５０（図４３）を用いてＳ．セレビシエＳ２８８ｃゲノムＤＮＡ由来のＰＤＩ１遺伝子をＰＣＲ増幅した後、そのＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、およそ１．９８ｋｂの断片を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断したＹＩｐｌａｃ２１１(Gietz & Sugino, 1988, Gene, 74, 527-534)にクローニングすることにより、ｐＤＢ２９３９を作出した。ｐＤＢ２９３９のＤＮＡシーケンシングにより、図４３において太字で示されているＤＳ２４８配列内からの「Ｇ」の欠失を確認した。次に、ｐＤＢ２９３９由来のおよそ２ｋｂのＳｎａＢＩ断片をｐＤＢ２９３８のユニークなＳｎａＢＩ部位にクローニングし、プラスミドｐＤＢ２９５０（図４４）を作出した。このｐＤＢ２９５０内のＰＤＩ１遺伝子はＲＥＰ２遺伝子と同じ方向に転写される。

次に、ｐＤＢ２９５０をＳｍａＩで消化し、このおよそ１１．１ｋｂのＤＮＡ断片を環化してＳ２８８ｃＰＤＩ１配列を削除する。これにより、ＲＥＰ２のＴＧＡ翻訳終結コドンのすぐ後にＳｎａＢＩ−ＰａｃＩ−ＦｓｅＩ／ＳｆｉＩ−ＳｍａＩ−ＳｎａＢＩリンカーが存在しているプラスミドｐＤＢ２９５４（図３８）を作出した。

Ｓ．セレビシエＳ２８８ｃＰＤＩ１遺伝子をｐＤＢ２９３８のユニークなＳｎａＢＩ部位にクローニングすることに加え、Ｓ．セレビシエＳＫＱ２ｎＰＤＩ１遺伝子を同様にこの部位に挿入した。このＳ．セレビシエＳＫＱ２ｎＰＤＩ１遺伝子配列を、クローンＣ７(Crouzet & Tuite, 1987, 前掲; Farquhar et al, 1991, 前掲)としても知られるｐＭＡ３ａ：Ｃ７（米国特許第６，２９１，２０５号）由来のＰＤＩ１遺伝子を含むプラスミドＤＮＡからＰＣＲ増幅した。ＳＫＱ２ｎＰＤＩ１遺伝子を、オリゴヌクレオチドプライマーＤＳ２４８およびＤＳ２５０（図４３）を用いて増幅した。このおよそ２ｋｂのＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断したＹＩｐｌａｃ２１１(Gietz & Sugino, 1988, Gene, 74, 527-534)に連結し、プラスミドｐＤＢ２９４３（図４５）を作出した。このＳＫＱ２ｎＰＤＩ１配列の５’末端は、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＳｎａＢＩ、ＰａｃＩ、ＦｓｅＩ、ＳｆｉＩおよびＳｍａＩ部位を含めるべく延長した平滑末端ＳｐｅＩ部位と類似しており、３’末端はＳｍａＩ、ＳｎａＢＩおよびＢａｍＨＩ部位を含めるべく延長した平滑末端Ｂｓｕ３６Ｉ部位と類似する部位までにわたる。このＰＤＩ１プロモーターの長さはおよそ２１０ｂｐである。このＰＤＩ１断片に関して全ＤＮＡ配列を決定したところ、１１４番にセリンを有する（アルギニン残基ではない）こと以外は、Ｓ．セレビシエ株ＳＫＱ２ｎ配列（ＮＣＢＩ受託番号ＣＡＡ３８４０２）のＰＤＩタンパク質をコードすることが示された。ｐＤＢ２９３９内のＳ．セレビシエＳ２８８ｃ配列と同様に、ｐＤＢ２９４３は、図４３において太字で示されているＤＳ２４８配列内から「Ｇ」が欠失している。次に、ｐＤＢ２９４３由来のおよそ１，９８９ｂｐのＳｎａＢＩ断片をｐＤＢ２９３８内のユニークなＳｎａＢＩ部位にクローニングした。これによりプラスミドｐＤＢ２９５２（図４６）が作出され、そこでは、ＳＫＱ２ｎＰＤＩ１遺伝子がＲＥＰ２と同じ方向で転写される。

実施例７
ＲＥＰ２遺伝子のすぐ後に挿入されたＤＮＡを含むｐＳＡＣ３５様プラスミドで形質転換した酵母におけるＬＥＵ２マーカーの相対的安定性
ｐＳＡＣ３５においてＲＥＰ２遺伝子の後に導入されたＳｎａＢＩ部位におけるリンカー配列の挿入からのプラスミド安定性に対する影響をｐＤＢ２９５４に関して評価した。これは最初の実施例で用いたものと同じＳ．セレビシエ株で、ＹＥＰＳ上での非選択的増殖中のＬＥＵ２マーカーの欠損により判定した。実施例１に記載した方法により、このｐＤＢ２９５４の安定性を、ｐＳＡＣ３５（対照プラスミド）、ｐＤＢ２６８８（ＸｃｍＩ−リンカー）およびｐＤＢ２８１７（ＸｍｎＩ−リンカー）の安定性と比較した。

この酵母株を、改良型の酢酸リチウム法(Sigma酵母形質転換キット、ＹＥＡＳＴ−１、プロトコール２; (Ito et al, 1983, J. Bacteriol., 153, 163; Elble, 1992, Biotechniques, 13, 18))を用いて形質転換し、ロイシン原栄養性とした。形質転換体をＢＭＭＤ寒天プレート上で選択した後、ＢＭＭＤ寒天プレートに貼付した。１０ｍＬＢＭＭＤ振盪フラスコ培養（２４時間、３０℃、２００ｒｐｍ）から、同量の無菌４０％（ｗ／ｖ）トレハロースと混合し、アリコートを−８０℃で冷凍することにより、低温保存トレハロース原液を調製した。

プラスミド安定性の判定に関しては、１ｍＬの低温保存原液を解凍し、２５０ｍＬ三角フラスコ中、１００ｍＬＹＥＰＳ（初期ＯＤ_６００≒０．０４〜０．０９）に接種し、回転振盪機（２００ｒｐｍ、Ｉｎｎｏｖａ４３００インキュベーターシェーカー, New Brunswick Scientific）にて３０℃で約７２時間（一般に７０から７４時間）増殖させた。各株を２回分析した。

各フラスコからサンプルを取り出し、ＹＥＰＳ培養液で希釈し（１０^−２〜１０^−５希釈）、１００μｌアリコートをＹＥＰＳ寒天プレート上に二反復でプレーティングした。細胞を３０℃で３〜４日間増殖させ、単一のコロニーを発達させた。分析した各酵母原株につき、無作為な１００個のコロニーのレプリカをＢＭＭＳ寒天プレートに、次いで、ＹＥＰＳ寒天プレートに取った。３０℃で３〜４日間増殖させた後、プラスミド安定性の指標として、ＢＭＭＳ寒天プレートとＹＥＰＳ寒天プレートの双方で増殖するコロニーのパーセンテージを求めた。

上記の分析の結果を下記の表５Ａに示す。これらの結果は、ｐＤＢ２９５４がｐＳＡＣ３５対照およびｐＤＢ２６８８と実質的に同等の安定性を示すことを示唆している。この種のアッセイでは、ｐＳＡＣ３５対照の場合であっても時々低レベルの安定性が検出されることがある（表４参照）。ゆえに、逆方向反復配列の、ＲＥＰ２の翻訳終結コドンのすぐ後に人工的に導入されたＳｎａＢＩ部位は、合成リンカー配列の挿入に関して、逆方向反復内のＸｃｍＩ部位と等価であるものと思われる。しかしながら、このＸｃｍＩ部位は、ＰＤＩ１遺伝子を含むおよそ２ｋｂのＤＮＡ断片の挿入に関してはＳｎａＢＩ部位よりも好ましいと思われる。

プラスミドｐＤＢ２９５２およびｐＤＢ２９５０に関するこのアッセイの「安定性０％」の結果は非選択培地で得られたものであり、相対的プラスミド安定性の指標となる。このアッセイを種々のリンカー挿入の相対的安定性を比較するために最適化した。選択培地では、ＳｎａＢＩ部位にＰＤＩ１を有するプラスミド（プラスミドをさらに不安定にすることが知られている、Ｎｏｔｌ部位に付加的トランスフェリン遺伝子を含む場合（下記のｐＤＢ２９５９およびｐＤＢ２９６０など）であっても）は、非選択性ＹＥＰＤ寒天プレートおよび抗トランスフェリン抗体を含む選択性ＢＭＭＤ寒天プレートの双方で、分泌されたトランスフェリンの「沈降素円(precipitin halos)」を形成した。分泌されたトランスフェリンの沈降素円は、ＳｎａＢＩ部位において挿入されたＰＤＩ１遺伝子なしでは、ｐＤＢ２９６１から得られなかった。これらの結果は、ＳｎａＢＩ部位は、異種タンパク質の分泌を増強することができるＰＤＩ１などの大きな遺伝子の挿入に有用であることを示す。これらの結果は総て、対照株において得られたものである。また、ｐＤＢ２９５９およびｐＤＢ２９６０を含むＡ株でも増強が見られたが、この場合には、ｐＤＢ２９６１で見られた低レベルの分泌も存在していた（Ａ株のゲノム中の余分なＰＤＩ１遺伝子のため）。対照株から得られた結果を下記の表５Ｂにまとめる。抗体プレートとしては、２５ｍＬＢＭＭＤ寒天またはＹＥＰＤ寒天当たりに１００μＬのヤギポリクローナル抗トランスフェリン抗血清(Calbiochem)を含んだものを用いた。株を抗体プレート上に貼付し、３０℃で４８〜７２時間増殖させたところ、その後、高レベルの組換えトランスフェリンを分泌するコロニーの周囲の寒天内に沈降素「円」が見られた。このアッセイでは極めて低レベルのトランスフェリン分泌は見られない。

プラスミドｐＤＢ２９５９、ｐＤＢ２９６０およびｐＤＢ２９６１をそれぞれｐＤＢ２９５０（図４４）、ｐＤＢ２９５２（図４６）およびｐＤＢ２９５４（図３８）から、ｐＤＢ２７１１（図１１）で見られるものと同じｒＴｆ（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ）に対する３．２７ｋｂのＮｏｔＩカセットを、ユニークなＮｏｔＩ部位に、ｐＤＢ２７１１と同じ方向に挿入することにより構築した。

実施例８
非選択条件下３０世代の増殖で判定した場合のｐＳＡＣ３５様プラスミドで形質転換した酵母におけるＬＥＵ２マーカーの安定性
ＵＳ領域にＤＮＡが挿入されたｐＳＡＣ３５様プラスミドの安定性を、Chinery & Hinchcliffe (1989, Curr. Genet., 16, 21-25)により定義されたものと類似の方法を用いて判定した。これを、これまでの実施例で用いたものと同じＳ．セレビシエ株で、所定の世代数にわたって非選択ＹＥＰＳ上での対数増殖中のＬＥＵ２マーカーの欠損により判定した。対照プラスミドｐＳＡＣ３５との間の違いを示す、または対照プラスミドとの比較安定性を示すには３０世代が好適である。このアッセイよる分析のために選択したプラスミドは、ｐＳＡＣ３５（対照）、ｐＤＢ２６８８（ＸｃｍＩ−リンカー）、ｐＤＢ２８１２（ＨｇａＩ−リンカー）、ｐＤＢ２８１７（ＸｍｎＩ−リンカー）、ｐＤＢ２９６０（ＰＤＩ１遺伝子がＲＥＰ２の後のＸｃｍＩ部位に挿入されている）およびｐＤＢ２７１１（ＰＤＩ１遺伝子がＲＥＰ２の後のＸｃｍＩ部位に挿入され、トランスフェリン発現カセットがＵＬ領域内のＮｏｔＩ部位に挿入されている）。

株を、選択（ＢＭＭＳ）培地で対数増殖期まで増殖させ、これを用いて、２５０ｍＬの三角フラスコ中、３０℃に予熱した１００ｍＬの非選択（ＹＥＰＳ）培地に、１．２５×１０^５〜５×１０^５細胞／ｍｌの間となるように接種した。各フラスコ中に接種した細胞の数を、血球計算盤を用いて培養サンプル中の細胞数を数えることで正確に求めた。また、アリコートを非選択（ＹＥＰＳ）寒天にプレーティングし、３０℃で３〜４日間インキュベートし、その後、分析する各フラスコにつき、無作為な１００個のコロニーのレプリカを選択（ＢＭＭＳ）寒天および非選択（ＹＥＰＳ）寒天に取り、プラスミドを保持した細胞集団を評価した。３０℃で３〜４日間増殖させた後、プラスミド安定性の指標として、ＢＭＭＳ寒天プレートとＹＥＰＳ寒天プレートの双方で増殖するコロニーのパーセンテージを求めた。

非選択液体培養物を、２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で２４時間インキュベートし、血球計算盤のカウント数により判定しておよそ１×１０^７細胞／ｍｌとした。次に、この培養物を予熱した非選択培地に、１．２５×１０^５〜５×１０^５細胞／ｍｌの間となるように再接種した。再びアリコートを非選択寒天にプレーティングし、その後、選択寒天および非選択寒天にレプリカを取り、プラスミドの保持を評価した。従って、非選択液体培地での細胞世代数を算出することができた。液体培養では指数関数的対数増殖が３０世代維持され、これはｐＳＡＣ３５などの対照プラスミドとの比較安定性を示すのに十分なものであった。プラスミドの安定性は、ＬＥＵ２選択マーカーを維持している細胞のパーセンテージとして定義した。

非選択培地での増殖によるプラスミドにコードされている表現型の保持を評価するための上記分析の結果を表６および図４７に示す。

図４７は、分析した各株について、非選択液体培養で世代数を高めるに伴うＬＥＵ２マーカーの欠損を示す。

対照プラスミドｐＳＡＣ３５は、このアッセイの全３０世代にわたって１００％の安定性を保持していた。プラスミドｐＢＤ２６８８およびｐＤＢ２８１２は両者とも、ｐＳＡＣ３５と同等の安定性であると思われた。よって、ＲＥＰ２の後のＸｍｎＩ部位への、またはＦＬＰの後のＨｇａＩ部位へのリンカーの挿入はそれぞれ、プラスミド安定性に対して明らかな影響を示さなかった。これに対し、ＲＥＰ２遺伝子内へのＸｃｍＩ−リンカーの挿入はプラスミド安定性を低下させると思われた。

ＲＥＰ２の後のＸｃｍＩ−リンカー内にＰＤＩ１遺伝子を含むプラスミドｐＤＢ２６９０は、３０世代の増殖後、およそ３３％の安定性であったが、このことは、２μｍ系ベクターのＵＳ領域へのこの大きなＤＮＡ断片の挿入がプラスミド安定性の低下を招いたことを示唆している。しかしながら、この安定性の低下はｐＤＢ２７１１（ここでの、ｐＳＡＣ３５のラージユニーク領域内のＮｏｔＩ部位への組換えトランスフェリン（Ｎ４１３Ｑ，Ｎ６１１Ｑ）発現カセットの挿入はプラスミドをさらに不安定にする働きをした）の場合に見られたものよりも小さかった。これらの所見は実施例２の結果と一致している（表２参照）。

プラスミドｐＤＢ２７１１の安定性を、上記の方法により、別のＳ．セレビシエ株で評価したところ、同じ結果が得られた（データは示されていない）。このことは、プラスミドの安定性が株に依存していないことを示す。

実施例９
ＰＤＩ１遺伝子分断を２μｍ系プラスミド上のＰＤＩ１遺伝子と組み合わせるとプラスミドの安定性を高めた
表７に挙げられている一本鎖オリゴヌクレオチドＤＮＡプライマーは、酵母ＰＤＩ１コード領域の上流の領域と酵母ＰＤＩ１コード領域の下流の別の領域を増幅するように設計されたものである。

プライマーＤＳ２９９およびＤＳ３００はＰＤＩ１の５’領域をＰＣＲ増幅し、プライマーＤＳ３０１およびＤＳ３０２は、ゲノムＤＮＡ由来のＳ２８８ｃを鋳型として用いてＰＤＩ１の３’領域を増幅した。ＰＣＲ条件は次の通りとした：１μＬＳ２８８ｃ鋳型ＤＮＡ（０．０１ｎｇ／μＬ、０．１ｎｇ／μＬ、１ｎｇ／μＬ、１０ｎｇ／μＬおよび１００ｎｇ／μＬ）、５μＬ１０×バッファー(Fast Start Taq+Mg, (Roche))、１μＬ１０ｍＭｄＮＴＰ、５μＬ各プライマー（２μＭ）、０．４μＬＦａｓｔＳｔａｒｔＴａｑをＨ_２Ｏで５０μＬとした。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ９７００を用いて行った。条件は、変性９５℃で４分［ＨＯＬＤ］、その後、［ＣＹＣＬＥ］変性９５℃で３０秒、アニーリング４５℃で３０秒、伸張７２℃で４５秒の２０サイクルの後、［ＨＯＬＤ］７２℃１０分、その後、［ＨＯＬＤ］４℃とした。０．２２ｋｂｐのＰＤＩ１５’ＰＣＲ産物はＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、０．３４１ｋｂｐのＰＤＩ１３’ＰＣＲ産物はＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩで切断した。

プラスミドｐＭＣＳ５(Hoheisel, 1994, Biotechniques 17, 456-460)（図４８）をＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰで平滑末端化し、再連結してｐＤＢ２９６４（図４９）を作出した。

プラスミドｐＤＢ２９６４をＨｉｎｄＩＩＩ消化し、ウシ腸管ホスファターゼで処理し、ＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した０．２ｋｂｐのＰＤＩ１５’ＰＣＲ産物ならびにＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩで消化した０．３４ｋｂｐのＰＤＩ１３’ＰＣＲ産物と連結してｐＤＢ３０６９（図５０）を作出し、これを、フォワードおよびリバース万能プライマーならびにＤＮＡシーケンシングプライマーＤＳ３０３、ＤＳ３０４、ＤＳ３０５およびＤＳ３０６（表７）を用いて配列決定した。

プライマーＤＳ２３４およびＤＳ２３５（表８）を用いて、ＹＩｐｌａｃ２０４(Gietz & Sugino, 1988, Gene, 74, 527-534)から、ＰＣＲ産物の各末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を組み込んだ改変ＴＲＰ１マーカー遺伝子を増幅した。ＰＣＲ条件は次の通りとした：１μＬ鋳型ＹＩｐｌａｃ２０４（０．０１ｎｇ／μＬ、０．１ｎｇ／μＬ、１ｎｇ／μＬ、１０ｎｇ／μＬおよび１００ｎｇ／μＬ）、５μＬ１０×バッファー(Fast Start Taq+Mg, (Roche))、１μＬ１０ｍＭｄＮＴＰ、５μＬ各プライマー（２μＭ）、０．４μＬＦａｓｔＳｔａｒｔＴａｑをＨ_２Ｏで５０μＬとした。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ９６００を用いて行った。条件は、変性９５℃で４分［ＨＯＬＤ］、その後、［ＣＹＣＬＥ］変性９５℃で３０秒、アニーリング４５℃で４５秒、伸張７２℃で９０秒の２０サイクルの後、［ＨＯＬＤ］７２℃１０分、その後、［ＨＯＬＤ］４℃とした。０．８６ｋｂｐのＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｐＭＣＳ５のＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングし、ｃｒｅａｔｅｐＤＢ２７７８（図５１）を作出した。制限酵素消化と、万能フォワードおよびリバースプライマーならびにＤＳ２３６、ＤＳ２３７、ＤＳ２３８およびＤＳ２３９（表８）を用いたシーケンシグにより、改変されたＴＲＰ１遺伝子の配列を確認した。

０．８６ｋｂｐのＴＲＰ１遺伝子をｐＤＢ２７７８から、ＨｉｎｄＩＩＩでの消化により単離し、ｐＤＢ３０６９のＨｉｎｄＩＩＩ部位へクローニングしてｐＤＢ３０７８（図５２）およびｐＤＢ３０７９（図５３）を作出した。１．４１ｋｂのｐｄｉ１：：ＴＲＰ１分断ＤＮＡ断片をｐＤＢ３０７８またはｐＤＢ３０７９から、ＮｏｔＩ／ＰｓｔＩでの消化により単離した。

ＴＲＰ１欠失（ｔｒｐ１Δ）を組み込んだ酵母株は、ひと度ｔｒｐ１Δが作出されたならばゲノム内にＴＲＰ１マーカー遺伝子（ｐＤＢ２７７８）との相同性が残らないように、すなわち、将来のＴＲＰ１を含む構築物とＴＲＰ１遺伝子座との間の相同組換えが起こらないように構築されたはずであった。選択された宿主株のゲノムから天然ＴＲＰ１配列の全体的な除去を達成するため、組込みベクターＹＩｐｌａｃ２０４(Gietz & Sugino, 1988, Gene, 74, 527-534)上に存在するＴＲＰＩマーカー遺伝子の外側のＴＲＰ１遺伝子の５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの領域を増幅するようにオリゴヌクレオチドを設計した。このＹＩｐｌａｃ２０４ＴＲＰ１マーカー遺伝子は、内部ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩおよびＸａＩ部位が部位特異的突然変異誘発により除去されているという点で天然／染色体ＴＲＰ１遺伝子とは異なる(Gietz & Sugino, 1988, Gene, 74, 527-534)。ＹＩｐｌａｃ２０４改変型ＴＲＰ１マーカー遺伝子を１．４５３ｋｂｐの平滑末端化ゲノム断片ＥｃｏＲＩ断片から構築し、これはＴＲＰ１遺伝子と１０２ｂｐのみのＴＲＰ１プロモーターを含んでいた(Gietz & Sugino, 1988, Gene, 74, 527-534)。これは比較的短いプロモーター配列であったが、ｔｒｐ１栄養要求性突然変異を補償するには明らかに十分なものであった(Gietz & Sugino, 1988, Gene, 74, 527-534)。５’〜ＴＲＰ１ＯＲＦの開始部までの１０２ｂｐに存在する、ＥｃｏＲＩ部位の上流のＤＮＡ配列のみを用いて５’ＴＥＰ１ＵＴＲを作出した。機能的に改変されたＴＲＰ１マーカーの３’末端の外側にある限り３’ＵＴＲの選択はあまり重要でなく、翻訳停止コドンの下流の８５ｂｐとなるように選択した。

ＰＣＲ増幅の際に制限酵素部位が、その後のクローニング工程で用いられるＰＣＲ産物の末端に付加されるように、ＴＲＰ１遺伝子の５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲ領域を増幅するために一本鎖オリゴヌクレオチドＤＮＡプライマーを設計および構築した。Ｓ２８８ｃゲノムＤＮＡを鋳型として用い、プライマーＤＳ２３０およびＤＳ２３１（表８）はＰＣＲによりＴＲＰ１の５’領域を増幅し、一方、プライマーＤＳ２３２およびＤＳ２３３（表８）はＴＲＰ１の３’を増幅した。ＰＣＲ条件は次の通りとした：１μＬ鋳型Ｓ２８８ｃゲノムＤＮＡ（０．０１ｎｇ／μＬ、０．１ｎｇ／μＬ、１ｎｇ／μＬ、１０ｎｇ／μＬおよび１００ｎｇ／μＬ）、５μＬ１０×バッファー(Fast Start Taq+Mg, (Roche))、１μＬ１０ｍＭｄＮＴＰ、５μＬ各プライマー（２μＭ）、０．４μＬＦａｓｔＳｔａｒｔＴａｑをＨ_２Ｏで５０μＬとした。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ９６００を用いて行った。条件は、変性９５℃で４分［ＨＯＬＤ］、その後、［ＣＹＣＬＥ］変性９５℃で３０秒、アニーリング４５℃で４５秒、伸張７２℃で９０秒の２０サイクルの後、［ＨＯＬＤ］７２℃１０分、その後、［ＨＯＬＤ］４℃とした。

この０．１９ｋｂｐのＴＲＰ１５’ＵＴＲＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、０．２ｋｂｐのＴＲＰ１３’ＵＴＲＰＣＲ産物のほうはＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで線状化したｐＡＹＥ５０５に連結し、プラスミドｐＤＢ２７７７（図５４）を作出した。ｐＡＹＥ５０５の構築についてはＷＯ９５／３３８３３に記載されている。プラスミド主鎖およびクローニングされた挿入部の配列からプライミングするように設計されたフォワードおよびリバースプライマーを用いたＤＮＡシーケンシングにより、両方の場合において、クローニングされたＴＲＰ１遺伝子の５’および３’ＵＴＲ配列が予測されるＤＮＡ配列を有することを確認した。プラスミドｐＤＢ２７７７は、ＴＲＰ１の５’および３’ＵＴＲに由来する配列の融合物を含んでなるＴＲＰ１分断断片を含んでいた。この０．３８３ｋｂｐのＴＲＰ１分断断片を、ＥｃｏＲＩでの完全消化により、ｐＤＢ２７７７から切り出した。

酵母株ＤＸＹ１(Kerry-Williams et al., 1998, 酵母, 14, 161-169)を、改良型の酢酸リチウム法(Sigma酵母形質転換キット、ＹＥＡＳＴ−１、プロトコール２; (Ito et al, 1983, J. Bacteriol., 153, 163; Elble, 1992, Biotechniques, 13, 18))を用い、アルブミン発現プラスミドｐＤＢ２２４４で形質転換してロイシン原栄養性とし、酵母株ＤＸＹ１［ｐＤＢ２２４４］を作出した。このアルブミン発現プラスミドｐＤＢ２２４４の構築についてはＷＯ００／４４７７２に記載されている。形質転換体をＢＭＭＤ寒天プレート上で選択した後、ＢＭＭＤ寒天プレート上に貼付した。１０ｍＬＢＭＭＤ振盪フラスコ培養（２４時間、３０℃、２００ｒｐｍ）から低温保存トレハロース原液を調製した。

ＤＸＹ１［ｐＤＢ２２４４］を、Toyn et al., (2000 Yeast 16, 553-560)が記載しているように、対選択トリプトファン類似体、５−フルオロアントラニル酸（５−ＦＡＡ）を配合した栄養寒天を用い、ｐＤＢ２７７７由来の０．３８３ｋｂｐのＥｃｏＲＩＴＲＰ１分断ＤＮＡ断片で形質転換し、トリプトファン独立栄養性とした。５−ＦＡＡの有毒作用に耐性のあるコロニーを採取し、もう一度５−ＦＡＡプレートに線条接種し、それらが本当に５−ＦＡＡ耐性であることを確認し、バックグラウンド増殖から選択した。次に、増殖させたコロニーをＢＭＭＤおよびＢＭＭＤ＋トリプトファンに再貼付し、どれがトリプトファン栄養要求株であるか確認した。

次に、トリプトファン栄養要求株であることが示されたコロニーを、単離物がｔｒｐ１であることを確認すべく、ＹＣｐｌａｃ２２(Gietz & Sugino, 1988, Gene, 74, 527-534)での形質転換によるさらなる分析のために選択した。

ＴＲＰ１遺伝子座にわたるＰＣＲ増幅を用い、ｔｒｐ⁻表現型はこの領域の欠損によるものであったことを確認した。５−ＦＡＡ耐性であって、トリプトファンの添加のない最小培地では増殖できないことが確認された単離物からゲノムＤＮＡを調製した。ゲノムＴＲＰ１遺伝子座の、プライマーＣＥＤ００５およびＣＥＤ００６（表８）を用いたＰＣＲ増幅を次のようにして行った：１μＬ鋳型ゲノムＤＮＡ、５μＬ１０×バッファー(Fast Start Taq+Mg, (Roche))、１μＬ１０ｍＭｄＮＴＰ、５μＬ各プライマー（２μＭ）、０．４μＬＦａｓｔＳｔａｒｔＴａｑをＨ_２Ｏで５０μＬとした。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ９６００を用いて行った。条件は、変性９４℃で１０分［ＨＯＬＤ］、その後、［ＣＹＣＬＥ］変性９４℃で３０秒、アニーリング５５℃で３０秒、伸張７２℃で１２０秒の４０サイクルの後、［ＨＯＬＤ］７２℃１０分、その後、［ＨＯＬＤ］４℃とした。野生型ＴＲＰ１遺伝子座のＰＣＲ増幅では、１．３４ｋｂｐの大きさのＰＣＲ産物が生じたが、欠失ＴＲＰ１領域にわたる増幅では、０．５０ｋｂｐ小さい０．８４ｋｂｐのＰＣＲ産物が生じた。ＰＣＲ分析により、ＤＸＹ１由来ｔｒｐ⁻株（ＤＸＹ１ｔｒｐ１Δ［ｐＤＢ２２４４］）が予測された欠失を有することを確認した。

Sleep et al., 1991, Bio/Technology, 9, 183-187が記載しているように、この酵母株ＤＸＹ１ｔｒｐ１Δ［ｐＤＢ２２４４］の発現プラスミドｐＤＢ２２４４は回復した。ＤＸＹ１ｔｒｐ１Δｃｉｒ^０を、改良型の酢酸リチウム法(Sigma酵母形質転換キット、ＹＥＡＳＴ−１、プロトコール２; (Ito et al, 1983, J. Bacteriol., 153, 163; Elble, 1992, Biotechniques, 13, 18))を用い、ｐＤＢ２２４４、ｐＤＢ２９７６、ｐＤＢ２９７７、ｐＤＢ２９７８、ｐＤＢ２９７９、ｐＤＢ２９８０またはｐＤＢ２９８１（ｐＤＢ２９７６、ｐＤＢ２９７７およびｐＤＢ２９８０またはｐＤＢ２９８１の作製については実施例１０でさらに述べる）のいずれかで形質転換し、ロイシン原栄養性とした。トリプトファンを添加したＢＭＭＤ寒天プレート上で形質転換体を選択した後、トリプトファンを添加したＢＭＭＤ寒天プレート上に貼付した。トリプトファンを添加した１０ｍＬＢＭＭＤ振盪フラスコ培養（２４時間、３０℃、２００ｒｐｍ）から低温保存トレハロース原液を調製した。

酵母株ＤＸＹ１ｔｒｐ１Δ ［ｐＤＢ２９７６］、ＤＸＹ１ｔｒｐ１Δ ［ｐＤＢ２９７７］、ＤＸＹ１ｔｒｐ１Δ ［ｐＤＢ３０７８］、ＤＸＹ１ｔｒｐ１Δ ［ｐＤＢ３０７９］、ＤＸＹ１ｔｒｐ１Δ ［ｐＤＢ２９８０］またはＤＸＹ１ｔｒｐ１Δ ［ｐＤＢ２９８１］を、改良型の酢酸リチウム法(Sigma酵母形質転換キット、ＹＥＡＳＴ−１、プロトコール２; (Ito et al, 1983, J. Bacteriol., 153, 163; Elble, 1992, Biotechniques, 13, 18))を用い、ｐＤＢ３０７８からＮｏｔＩ／ＰｓｔＩ消化により単離した１．４１ｋｂｐｄｉ１：：ＴＲＰ１分断ＤＮＡ断片で形質転換し、トリプトファン原栄養性とした。ＢＭＭＤ寒天プレート上で形質転換体を選択した後、ＢＭＭＤ寒天プレートに貼付した。

各株６個の形質転換体を、５０ｍＬ振盪フラスコ中、１０ｍＬのＹＥＰＤに接種し、回転振盪機にて３０℃、２００ｒｐｍで４日間インキュベートした。培養上清および細胞バイオマスを採集した。これらのトリプトファン原栄養株およびＤＸＹ１［ｐＤＢ２２４４］からゲノムＤＮＡを調製した(Lee, 1992, Biotechniques, 12, 677)。プライマーＤＳ２３６およびＤＳ３０３（表７および８）を用いたゲノムＰＤＩ１遺伝子座のＰＣＲ増幅は次のようにして行った：１μＬ鋳型ゲノムＤＮＡ、５μＬ１０×バッファー(Fast Start Taq+Mg, (Roche))、１μＬ１０ｍＭｄＮＴＰ、５μＬ各プライマー（２μＭ）、０．４μＬＦａｓｔＳｔａｒｔＴａｑをＨ_２Ｏで５０μＬとした。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ９７００を用いて行った。条件は、変性９４℃で４分［ＨＯＬＤ］、その後、［ＣＹＣＬＥ］変性９４℃で３０秒、アニーリング５０℃で３０秒、伸張７２℃で６０秒の３０サイクルの後、［ＨＯＬＤ］７２℃１０分、その後、［ＨＯＬＤ］４℃とした。野生型ＰＤＩ１遺伝子座のＰＣＲ増幅ではＰＣＲ産物は生じなかったが、欠失ＰＤＩ１領域にわたる増幅では、０．６５ｋｂｐのＰＣＲ産物が生じた。ＰＣＲ分析により、試験した３６の可能性のあるｐｄｉ１：：ＴＲＰ１株の総てが予測されたｄｐｄｉ１：：ＴＲＰ１欠失を有することを確認した。

これらの組換えアルブミンの力価をロケット免疫電気泳動により比較した（図５５）。各群の中で、ＤＸＹ１ｔｒｐ１Δ ［ｐＤＢ２９７６］、ＤＸＹ１ｔｒｐ１Δ ［ｐＤＢ２９７８］、ＤＸＹ１ｔｒｐ１Δ ［ｐＤＢ２９８０］、ＤＸＹ１ｔｒｐ１Δ ［ｐＤＢ２９７７］およびＤＸＹ１ｔｒｐ１Δ ［ｐＤＢ２９７９］の６つのｐｄｉ１：：ＴＲＰ１分断物は総て、極めて類似したｒＨＡ生産性を有していた。ＤＸＹ１ｔｒｐ１Δ ［ｐＤＢ２９８１］の６つのｐｄｉ１：：ＴＲＰ１分断物だけがｒＨＡ発現力価に変動を示した。図５５に示したこれら６つのｐｄｉ１：：ＴＲＰ１分断物をＹＥＰＤ寒天上に拡げ、単一コロニーを単離し、その後、ＢＭＭＤ寒天上に再貼付した。

３つの、単一細胞由来単離物ＤＸＹ１ｔｒｐ１Δ ｐｄｉ１：：ＴＲＰ１［ｐＤＢ２９７６］、ＤＸＹ１ｔｒｐ１Δ ｐｄｉ１：：ＴＲＰ１［ｐＤＢ２９７８］、ＤＸＹ１ｔｒｐ１Δ ｐｄｉ１：：ＴＲＰ１［ｐＤＢ２９８０］、ＤＸＹ１ｔｒｐ１Δ ｐｄｉ１：：ＴＵＰ１［ｐＤＢ２９７７］、ＤＸＹ１ｔｒｐ１Δ ｐｄｉ１：：ＴＲＰ１［ｐＤＢ２９７９］およびＤＸＹ１ｔｒｐ１Δ ｐｄｉ１：：ＴＲＰ１［ｐＤＢ２９８１］を、ＤＸＹ１［ｐＤＢ２２４４］、ＤＸＹ１［ｐＤＢ２９７６］、ＤＸＹ１［ｐＤＢ２９７８］、ＤＸＹ１［ｐＤＢ２９８０］、ＤＸＹ１［ｐＤＢ２９７７］、ＤＸＹ１［ｐＤＢ２９７９］およびＤＸＹ１［ｐＤＢ２９８１］とともに、５０ｍＬ振盪フラスコ中、１０ｍＬのＹＥＰＤに接種し、回転振盪機にて３０℃、２００ｒｐｍで４日間インキュベートした。培養上清を採集し、組換えアルブミン力価をロケット免疫電気泳動により比較した（図５６）。図５６で示されている１３の野生型ＰＤＩ１およびｐｄｉ１：：ＴＲＰ１分断物をＹＥＰＤ寒天上に拡げ、単一コロニーを単離した。次に、各株から１００の単一細胞由来コロニーをＢＭＭＤ寒天または組換えアルブミンの発現を検出するためのヤギ抗ＨＳＡ抗体(Sleep et al., 1991, Bio/Technology, 9, 183-187)を含むＹＥＰＤ寒天上に再貼付し、各コロニーのＬｅｕ＋／ｒＨＡ＋、Ｌｅｕ＋／ｒＨＡ−、Ｌｅｕ−／ｒＨＡ＋またはＬｅｕ−／ｒＨＡ−の表現型をスコアリングした（表９）。

これらのデータは、染色体にコードされているＰＤＩを持たない宿主株においてプラスミドに対する選択マーカーとしてＰＤＩ１遺伝子を用いる場合には、この富栄養培地などの非選択培地であってもプラスミドの保持が高まることを示す。これらは、「必須」シャペロン（例えば、ＰＤＩ１またはＰＳＥ１）、または、欠失または不活性化された場合に栄養（生合成）要求性が生じない他のいずれかの「必須」遺伝子産物（例えば、ＰＧＫ１またはＦＢＡ１）が、プラスミドの不在下ではその遺伝子産物を産生できない宿主細胞においてプラスミドの選択マーカーとして使用でき、特定の選択条件下で細胞を培養する必要があるという不都合なく、プラスミドの安定性の上昇が達成できることを示している。「栄養（生合成）要求性」とは、増殖培地に対する添加または改変によって補償できる欠陥を含む。従って、本発明において、「必須マーカー遺伝子」は、宿主細胞において欠失または不活性化されている場合に、増殖培地に対する添加または改変によって補償できない欠陥を生じるものである。

実施例１０
種々のＰＤＩ１遺伝子と、同じ２μｍ様プラスミド上の種々の異種タンパク質の発現カセットを含む発現ベクターの構築
ＰＤＩ１遺伝子のＰＣＲ増幅およびＹＩｐｌａｃ２１１へのクローニング
Ｓ．セレビシエＳ２８８ｃおよびＳ．セレビシエＳＫＱ２ｎ由来のＰＤＩ１遺伝子をＰＣＲ増幅し、プロモーター配列を含む５’非翻訳領域の長さが様々に異なるＤＮＡ断片を作製した。ＹＩｐｌａｃ２１１(Gietz & Sugino, 1988, Gene, 74, 527-534)のＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位へのＰＣＲ産物のクローニングが可能となるようにＰＣＲプライマーを設計した。後のクローニングを容易にするため、付加的な制限エンドヌクレアーゼ部位もＰＣＲプライマーに組み込んだ。表１０に構築されたプラスミドを記載し、表１１にＰＤＩ１遺伝子を増幅するために用いたＰＣＲプライマー配列を示す。これらのＹＩｐｌａｃ２１１系プラスミド内のＰＤＩ１プロモーターの長さの違いは表１０に記載されている。

オリゴヌクレオチドプライマーＤＳ２４８およびＤＳ２５０（表１１）を用いて、Ｓ．セレビシエＳ２８８ｃゲノムＤＮＡ由来のＰＤＩｌ遺伝子をＰＣＲ増幅した後、そのＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そのおよそ１．９８ｋｂの断片を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断したＹＩｐｌａｃ２１１(Gietz & Sugino, 1988, Gene, 74, 527-534)にクローニングすることによりｐＤＢ２９３９（図５７）を作出した。ｐＤＢ２９３９のＤＮＡシーケンシングにより、表５において太字で示されているＤＳ２４８内からの「Ｇ」の欠失を確認した。ＰＤＩ１遺伝子のシーケンシングに用いたオリゴヌクレオチドプライマーは表６に示すが、これらは公開されているＳ２８８ｃＰＤＩ１遺伝子配列（ＰＤＩ１／ＹＣＬ０４３Ｃ、第III染色体上の座標５０２２１〜４８６５３＋１０００塩基対の上流配列および１０００塩基対の下流配列(http://www.yeastgenome.org/Genebank Accession number NC001135)）から設計したものである。

同様に、プラスミドｐＤＢ２９４１（図５８）およびｐＤＢ２９４２（図５９）も表１０および１１に記載されているＰＣＲプライマーを用い、それぞれおよそ１．９０ｋｂおよび１．８５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片をＹＩｐｌａｃ２１１にクローニングすることにより構築した。ｐＤＢ２９４１およびｐＤＢ２９４２内のＰＤＩ１遺伝子に関して適正なＤＮＡ配列を確認した。

このＳ．セレビシエＳＫＱ２ｎＰＤＩ１遺伝子配列を、クローンＣ７(Crouzet & Tuite, 1987, 前掲; Farquhar et al., 1991, 前掲)としても知られるｐＭＡ３ａ：Ｃ７（米国特許第６，２９１，２０５号）由来のＰＤＩ１遺伝子を含むプラスミドＤＮＡから増幅した。ＳＫＱ２ｎＰＤＩ１遺伝子を、オリゴヌクレオチドプライマーＤＳ２４８およびＤＳ２５０（表１０および１１）を用いて増幅した。およそ２．０１ｋｂのＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断したＹＩｐｌａｃ２１１(Gietz & Sugino, 1988, Gene, 74, 527-534)に連結し、プラスミドｐＤＢ２９４３（図６０）を作出した。このＳＫＱ２ｎＰＤＩ１配列の５’末端は、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＳｎａＢＩ、ＰａｃＩ、ＦｓｅＩ、ＳｆｉＩおよびＳｍａＩ部位を含めるべく延長した平滑末端ＳｐｅＩ部位と類似しており、３’末端はＳｍａＩ、ＳｎａＢＩおよびＢａｍＨＩ部位を含めるべく延長した平滑末端Ｂｓｕ３６Ｉ部位と類似する部位までにわたる。このＰＤＩ１プロモーターの長さはおよそ２１０ｂｐである。このＰＤＩ１断片に関して、表１２に示されているオリゴヌクレオチドプライマーを用いて全ＤＮＡ配列を決定した。これにより、Ｓ．セレビシエ株ＳＫＱ２ｎ配列（ＮＣＢＩ受託番号ＣＡＡ３８４０２）のＰＤＩタンパク質のコード配列が存在するが、１１４番にセリン残基を有する（これまでに公開されているようなアルギニン残基ではない）ことが確認された。ｐＤＢ２９３９内のＳ．セレビシエＳ２８８ｃ配列と同様に、ｐＤＢ２９４３も、表５において太字で示されているＤＳ２４８配列内から「Ｇ」が欠失していた。

同様に、プラスミドｐＤＢ２９６３（図６１）およびｐＤＢ２９４５（図６２）も表１０および１１に記載されているＰＣＲプライマーを用い、それぞれおよそ１．９４ｋｂおよび１．８７ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片をＹＩｐｌａｃ２１１にクローニングすることにより構築した。１１４番のアミノ酸にセリンコドンを有するｐＤＢ２９６３およびｐＤＢ２９４５内のＰＤＩ１遺伝子に関して、予測されたＤＮＡ配列を確認した。

ＲＥＰ２の後のＸｃｍＩ部位に種々のＰＤＩ１遺伝子が挿入されたｐＳＡＣ３５系ｒＨＡ発現プラスミドの構築
ｒＨＡを種々のＰＤＩ１遺伝子と同時発現させるためのｐＳＡＣ３５系プラスミドを構築した（表１３）。

まず、ｐＤＢ２２４３（図６３、ＷＯ００／４４７７２に記載）由来のｒＨＡ発現カセットを２，９９２ｂｐのＮｏｔＩ断片上で単離し、次にこれをｐＤＢ２６８８（図４）のＮｏｔＩ部位にクローニングしてｐＤＢ２６９３（図６４）を作出した。ｐＤＢ２６９３をＳｎａＢＩで消化し、ウシ腸管アルカリ性ホスファターゼで処理し、ｐＤＢ２９４３、ｐＤＢ２９６３、ｐＤＢ２９４５、ｐＤＢ２９３９、ｐＤＢ２９４１およびｐＤＢ２９４２由来のＰＤＩ１遺伝子を含むＳｎａＢＩ断片と連結した。これによりプラスミドｐＤＢ２９７６〜ｐＤＢ２９８７（図６５〜７６）を作出した。ＲＥＰ２と同じ方向に転写されるＰＤＩ１を「方向Ａ」で示し、ＲＥＰ２と逆向きに転写されるＰＤＩ１を「方向Ｂ」で示した（表１３）。

２μｍプラスミドのプラスミドマップを示す。ｐＳＡＣ３５のプラスミドマップを示す。ＦＬＰ挿入部位を例としていくつか示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。ＰＤＩ１遺伝子を含むｐＤＢ２４２９由来のＤＮＡ断片を示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。ＲＥＰ２挿入部位を例としていくつか示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。実施例で言及される表３を示す。実施例で言及される表３を示す。実施例で言及される表３を示す。実施例で言及される表３を示す。配列番号１の配列を示す。配列番号２の配列を示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。ＰＣＲプライマーＤＳ２４８およびＤＳ２５０の配列を示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のｐＳＡＣ３５由来プラスミドを含むＳ．セレビシエの非選択液体培養における増殖世代数の増加に伴うプラスミドの安定性を示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。ＲＩＥの結果を示す。１０ｍＬＹＥＰＤ振盪フラスコに、ｐＤＢ３０７８から単離した１．４１ｋｂＮｏｔＩ／ＰｓｔＩｐｄｉ１：：ＴＲＰ１分断ＤＮＡ断片でトリプトファン原栄養型へと形質転換させたＤＸＹ１ｔｒｐ１Δ ［ｐＤＢ２９７６］、ＤＸＹ１ｔｒｐ１Δ ［ｐＤＢ２９７７］、ＤＸＹ１ｔｒｐ１Δ ［ｐＤＢ２９７８］、ＤＸＹ１ｔｒｐ１Δ ［ｐＤＢ２９７９］、ＤＸＹ１ｔｒｐ１Δ ［ｐＤＢ２９８０］またはＤＸＹ１ｔｒｐ１Δ ［ｐＤＢ２９８１］を接種した。形質転換体を３０℃、２００ｒｐｍで４日間増殖させた。ロケット免疫電気泳動ゲル(Weeke, B. 1976. Rocket immunoelectrophoresis. In N. H. Azelsen, J. Kroll、およびB. Weeke [eds.], A manual of quantitative immunoelectrophoresis. Methods and applications. Universitetsforlaget, Oslo, Norway)のウェル当たり４μｌの培養上清を添加した。ｒＨＡ標準濃度はμｇ／ｍＬである。７００μＬヤギ抗ＨＡ（５ｍＬの水に再懸濁させたＳｉｇｍａ製品Ａ−１１５１）／５０ｍＬアガロース。プレシピンをクーマシーブルーで染色した。さらなる分析のために選択した単離物を（^＊）で示している。ＲＩＥの結果を示す。１０ｍＬＹＥＰＤ振盪フラスコに、ＤＸＹ１［ｐＤＢ２２４４］、ＤＸＹ１［ｐＤＢ２９７６］、ＤＸＹ１ｔｒｐ１Δ ｐｄｉ１：：ＴＲＰ１［ｐＤＢ２９７６］、ＤＸＹ１［ｐＤＢ２９７８］、ＤＸＹ１ｔｒｐ１Δ ｐｄｉ１：：ＴＵＰ１［ｐＤＢ２９７８］、ＤＸＹ１［ｐＤＢ２９８０］、ＤＸＹ１ｔｒｐ１Δ ｐｄｉ１：：ＴＲＰ１［ｐＤＢ２９８０］、ＤＸＹ１［ｐＤＢ２９７７］、ＤＸＹ１ｔｒｐ１Δ ｐｄｉ１：：ＴＲＰ１［ｐＤＢ２９７７］、ＤＸＹ１［ｐＤＢ２９７９］ＤＸＹ１ｔｒｐ１Δ ｐｄｉ１：：ＴＲＰ１［ｐＤＢ２９７９］、ＤＸＹ１［ｐＤＢ２９８１］およびＤＸＹ１ｔｒｐ１Δ ｐｄｉ１：：ＴＲＰ１［ｐＤＢ２９８１］を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで４日間増殖させた。ロケット免疫電気泳動ゲルのウェル当たり４μｌの培養上清を添加した。ｒＨＡ標準濃度はμｇ／ｍＬである。８００μＬヤギ抗ＨＡ（５ｍＬの水に再懸濁させたＳｉｇｍａ製品Ａ−１１５１）／５０ｍＬアガロース。プレシピンをクーマシーブルーで染色した。さらなる分析のために選択した単離物を（^＊）で示している。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。種々のプラスミドのマップを示す。

Claims

ＲＥＰ２遺伝子またはＦＬＰ遺伝子の少なくともいずれか一方の最後の機能的コドンの１つ後の塩基と、該遺伝子に隣接する逆方向反復内のＦＲＴ部位の１つ前の塩基との間に、ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換を含んでなる、２μｍ系プラスミド。
前記ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換を除き、ＦＬＰ遺伝子および／またはＲＥＰ２遺伝子が、天然２μｍ系プラスミド由来のＦＬＰ遺伝子および／またはＲＥＰ２遺伝子の配列をそれぞれ有するものである、請求項１に記載の２μｍ系プラスミド。
天然２μｍ系プラスミドが、チゴサッカロミセス・ルクシーから得られるようなｐＳＲ１、ｐＳＢ３またはｐＳＢ４、双方ともチゴサッカロミセス・バイリーから得られるようなｐＳＢ１またはｐＳＢ２、チゴサッカロミセス・フェルメンタチから得られるようなｐＳＭ１、クルイベロミセス・ドロソフィラルムから得られるようなｐＫＤ１、ピキア・メンブラネファシエンスから得られるようなｐＰＭ１、およびサッカロミセス・セレビシエから得られるような２μｍプラスミドから選択される、請求項１に記載の２μｍ系プラスミド。
前記ＦＬＰおよび／またはＲＥＰ２遺伝子に隣接する逆方向反復の配列が、その遺伝子が由来する配列と同じ天然２μｍ系プラスミドの対応する逆方向反復の配列に由来するものである、請求項２または３に記載の２μｍ系プラスミド。
天然２μｍ系プラスミドがサッカロミセス・セレビシエから得られるような２μｍプラスミドである、請求項２〜４のいずれか一項に記載の２μｍ系プラスミド。
前記ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換が、ＲＥＰ２遺伝子のコドン５９の最初の塩基と、隣接する逆方向反復内のＦＲＴ部位の１つ前の塩基の間の位置に存在する、請求項５に記載の２μｍ系プラスミド。
前記ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換を除き、ＲＥＰ２遺伝子および隣接する逆方向反復の配列が、配列番号１で定義されたものまたはその変異体である、請求項５または６に記載の２μｍ系プラスミド。
前記ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換が、逆方向反復の最初の塩基とＦＲＴ部位の１つ前の塩基の間の位置に存在する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の２μｍ系プラスミド。
前記ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換が、ＲＥＰ２コード配列の終末端の１つ後の塩基とＦＲＴ部位の１つ前の塩基の間、例えば、ＲＥＰ２コード配列の終末端の１つ後の塩基に存在する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の２μｍ系プラスミド。
前記ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換を除き、ＲＥＰ２コード配列の後に続く逆方向反復が、サッカロミセス・セレビシエから得られるような２μｍプラスミドの対応する領域に由来する配列を有し、好ましくは、そのポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換が逆方向反復内のＸｃｍＩ部位またはＦｓｐＩ部位に存在する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の２μｍ系プラスミド。
前記ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換が、ＦＬＰ遺伝子のコドン３４４の最初の塩基と、隣接する逆方向反復内のＦＲＴ部位の１つ前の塩基の間の位置に存在する、請求項５に記載の２μｍ系プラスミド。
前記ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換を除き、ＦＬＰコード配列および隣接する逆方向反復の配列が、配列番号２で定義されたもの、またはその変異体である、請求項５または１１に記載の２μｍ系プラスミド。
前記ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換が、逆方向反復の最初の塩基とＦＲＴ部位の１つ前の塩基の間の位置に存在する、請求項１１または１２に記載の２μｍ系プラスミド。
前記ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換が、ＦＬＰコード配列の終末端の１つ後の塩基と、ＦＲＴ部位の１つ前の塩基の間の位置に存在する、請求項１３に記載の２μｍ系プラスミド。
前記ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換が、ＦＬＰコード配列の終末端の１つ後の塩基に存在する、請求項１４に記載の２μｍ系プラスミド。
前記ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換を除き、ＦＬＰ遺伝子の後に続く逆方向反復が、サッカロミセス・セレビシエから得られるような２μｍプラスミドの対応する領域に由来する配列を有し、好ましくは、前記ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換が逆方向反復内のＨｇａＩ部位またはＦｓｐＩ部位に存在する、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の２μｍ系プラスミド。
ＲＥＰ２遺伝子およびＦＬＰ遺伝子の双方の最後の機能的コドンの１つ後の塩基と、該遺伝子の各々に隣接する逆方向反復内のＦＲＴ部位の１つ前の塩基との間に、ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換を含んでなり、これらのポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換が同じであっても異なっていてもよい、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の２μｍ系プラスミド。
請求項１〜１７のいずれか一項で定義された位置にはない、ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換をさらに含んでなる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の２μｍ系プラスミド。
前記ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換が、ＡＲＳ配列の前後の非転写領域内に存在する、請求項１８に記載の２μｍ系プラスミド。
前記ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換、またはその少なくとも一つがポリヌクレオチド配列の挿入である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の２μｍ系プラスミド。
前記ポリヌクレオチド配列の挿入がオープンリーディングフレームをコードするものである、請求項２０に記載の２μｍ系プラスミド。
前記オープンリーディングフレームが非２μｍ系プラスミドタンパク質をコードするものである、請求項２１に記載の２μｍ系プラスミド。
前記非２μｍ系プラスミドタンパク質が、タンパク質フォールディングに関与する、またはシャペロン活性を有するか、もしくは折り畳み異常タンパク質応答に関与するタンパク質、アルブミン、モノクローナル抗体、エトポシド、血清タンパク質（例えば、血液凝固因子）、アンチスタシン、ｔｉｃｋ抗凝固ペプチド、トランスフェリン、ラクトフェリン、エンドスタチン、アンギオスタチン、コラーゲン、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンに基づく分子またはいずれかの断片（例えば、ｄＡｂ、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＡｂ、ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ断片）、Ｋｕｎｉｔｚドメインタンパク質、インターフェロン、インターロイキン、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ２、インターフェロンα種および亜種、インターフェロンβ種および亜種、インターフェロンγ種および亜種、レプチン、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＦ_ＡＸ１５、ＩＬ１−受容体アンタゴニスト、エリスロポエチン（ＥＰＯ）およびＥＰＯ模倣体、トロンボポエチン（ＴＰＯ）およびＴＰＯ模倣体、プロサプチド、シアノビリン−Ｎ，５−ヘリックス、Ｔ２０ペプチド、Ｔ１２４９ペプチド、ＨＩＶｇｐ４１、ＨＩＶｇｐ１２０、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ｔＰＡ、ヒルディン、血小板由来増殖因子、副甲状腺ホルモン、プロインスリン、インスリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、インスリン様増殖因子、カルシトニン、成長ホルモン、トランスフォーミング増殖因子β、腫瘍壊死因子、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、プレ型および活性型双方の凝固因子（限定されるものではないが、プラスミノーゲン、フィブリノーゲン、トロンビン、プレトロンビン、プロトロンビン、フォン・ウィルブランド因子、α_１アンチトリプシン、プラスミノーゲンアクチベーター、因子VII、因子VIII、因子IX、因子Ｘおよび因子XIIIを含む）、神経増殖因子、ＬＡＣＩ、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、グルコースオキシダーゼ、血清コリンエステラーゼ、アプロチニン、アミロイド前駆体タンパク質、インターαトリプシン阻害剤、抗トロンビンIII、アポリポタンパク質種、Ｃタンパク質、Ｓタンパク質、または前記のいずれかの変異体もしくは断片の配列を含むものである、請求項２２に記載の２μｍ系プラスミド。
前記非２μｍ系プラスミドタンパク質が、アルブミン、その変異体もしくは断片、またはこれらのいずれかの配列を含む融合タンパク質の配列を含むものである、請求項２３に記載の２μｍ系プラスミド。
前記非２μｍ系プラスミドタンパク質が、トランスフェリン、その変異体もしくは断片、またはこれらのいずれかの配列を含む融合タンパク質の配列を含むものである、請求項２３に記載の２μｍ系プラスミド。
前記非２μｍ系プラスミドタンパク質が、ラクトフェリン、その変異体もしくは断片、またはこれらのいずれかの配列を含む融合タンパク質の配列を含むものである、請求項２３に記載の２μｍ系プラスミド。
前記非２μｍ系プラスミドタンパク質が、Ｆｃ、その変異体もしくはその断片、またはこれらのいずれかの配列を含む融合タンパク質の配列を含むものである、請求項２３に記載の２μｍ系プラスミド。
前記非２μｍ系プラスミドタンパク質が、ＡＨＡ１、ＣＣＴ２、ＣＣＴ３、ＣＣＴ４、ＣＣＴ５、ＣＣＴ６、ＣＣＴ７、ＣＣＴ８、ＣＮＳ１、ＣＰＲ３、ＣＰＲ６、ＥＰＳ１、ＥＲＯ１、ＥＵＧ１、ＦＭＯ１、ＨＣＨ１、ＨＳＰ１０、ＨＳＰ１２、ＨＳＰ１０４、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ３０、ＨＳＰ４２、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７８、ＨＳＰ８２、ＪＥＭ１、ＭＤＪ１、ＭＤＪ２、ＭＰＤ１、ＭＰＤ２、ＰＤＩ１、ＰＦＤ１、ＡＢＣ１、ＡＰＪ１、ＡＴＰ１１、ＡＴＰ１２、ＢＴＴ１、ＣＤＣ３７、ＣＰＲ７、ＨＳＣ８２、ＫＡＲ２、ＬＨＳ１、ＭＧＥ１、ＭＲＳ１１、ＮＯＢ１、ＥＣＭ１０、ＳＳＡ１、ＳＳＡ２、ＳＳＡ３、ＳＳＡ４、ＳＳＣ１、ＳＳＥ２、ＳＩＬ１、ＳＬＳ１、ＵＢＩ４、ＯＲＭ１、ＯＲＭ２、ＰＥＲ１、ＰＴＣ２、ＰＳＥ１およびＨＡＣ１または末端切断型イントロンレスＨＡＣ１のいずれか一つによりコードされているような、タンパク質フォールディングに関与する、またはシャペロン活性を有するか、もしくは折り畳み異常タンパク質応答に関与するタンパク質の配列を含むものである、請求項２３に記載の２μｍ系プラスミド。
前記シャペロンが、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）であるか、またはＯＲＭ２、ＳＳＡ１もしくはＰＳＥ１によりコードされるタンパク質である、請求項２３または２８に記載の２μｍ系プラスミド。
前記非２μｍ系プラスミドタンパク質が分泌リーダー配列を含むものである、請求項２２〜２９のいずれか一項に記載の２μｍ系プラスミド。
前記非２μｍ系プラスミドタンパク質が細菌選択マーカーおよび／または酵母選択マーカーの配列を含むものである、請求項２２に記載の２μｍ系プラスミド。
前記細菌選択マーカーがβ−ラクタマーゼ遺伝子であり、かつ／または前記酵母選択マーカーがＬＥＵ２選択マーカーである、請求項３１に記載の２μｍ系プラスミド。
（ｉ）非２μｍ系プラスミドタンパク質をコードする異種配列；（ii）タンパク質フォールディングに関与するタンパク質、シャペロン、または折り畳み異常タンパク質応答に関与するタンパク質、好ましくはタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの配列を含むタンパク質をコードする異種配列；および（iii）選択マーカーの配列を含むタンパク質をコードする異種配列、を含んでなり、これらの異種配列のうち少なくとも一つが請求項１〜１６のいずれか一項で定義された位置に存在する、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の２μｍ系プラスミド。
請求項１〜３３のいずれか一項で定義されたプラスミドを作製する方法であって、
（ａ）ＲＥＰ２遺伝子とＲＥＰ２遺伝子の後に続く逆方向反復、またはＦＬＰ遺伝子とＦＬＰ遺伝子の後に続く逆方向反復の配列を含んでなり、それぞれの場合において、その逆方向反復がＦＲＴ部位を含むものである、プラスミドを準備すること、
（ｂ）ポリヌクレオチド配列を準備し、そのポリヌクレオチド配列を、プラスミドの請求項１〜１６のいずれか一項で定義された位置に挿入すること、および／または
（ｃ）請求項１〜１６のいずれか一項で定義された位置のヌクレオチド塩基の一部または総てを欠失させること、および／または
（ｄ）請求項１〜１６のいずれか一項で定義された位置のヌクレオチド塩基の一部または総てを別のヌクレオチド塩基で置換すること
を含んでなる、方法。
請求項３４に記載の方法によって得られる、プラスミド。
請求項１〜３３および３５のいずれか一項で定義されたプラスミドを含んでなる、宿主細胞。
酵母細胞である、請求項３６に記載の宿主細胞。
プラスミドがマルチコピープラスミドとして安定である、請求項３６または３７に記載の宿主細胞。
プラスミドがｐＳＲ１、ｐＳＢ３もしくはｐＳＢ４に基づくものであって、酵母細胞がチゴサッカロミセス・ルクシーであるか、プラスミドがｐＳＢ１もしくはｐＳＢ２に基づくものであって、酵母細胞がチゴサッカロミセス・バイリーであるか、プラスミドがｐＳＭ１に基づくものであって、酵母細胞がチゴサッカロミセス・フェルメンタチであるか、プラスミドがｐＫＤ１に基づくものであって、酵母細胞がクルイベロミセス・ドロソフィラルムであるか、プラスミドがｐＰＭ１に基づくものであって、酵母細胞がピキア・メンブラネファシエンスであるか、またはプラスミドが２μｍプラスミドに基づくものであって、酵母細胞がサッカロミセス・セレビシエもしくはサッカロミセス・カルルスベルゲネシスである、請求項３８に記載の宿主細胞。
プラスミドが選択マーカーを含むか、または含むように改変されている場合に、マーカーの欠損によって測定される安定性が、５世代後に、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または実質的に１００％である、請求項３８または３９に記載の宿主細胞。
タンパク質を製造する方法であって、
（ａ）請求項１〜３３または３５のいずれか一項で定義されたプラスミドを準備する工程、
（ｂ）好適な宿主細胞を準備する工程、
（ｃ）宿主細胞をそのプラスミドで形質転換する工程、および
（ｄ）その形質転換宿主細胞を培養培地中で培養する工程、
（ｅ）これによりタンパク質を生産する工程
を含んでなる、方法。
タンパク質を製造する方法であって、請求項１〜３３または３５のいずれか一項で定義されたプラスミドを含む、請求項３６〜４０のいずれか一項で定義された宿主細胞を準備する工程、およびその宿主細胞を培養培地中で培養することによってタンパク質を生産する工程を含んでなる、方法。
生産されたタンパク質を培養宿主細胞または培養培地から単離する工程をさらに含んでなる、請求項４１または４２に記載の方法。
単離されたタンパク質を商業上許容されるレベルの純度にまで精製する工程をさらに含んでなる、請求項４３に記載の方法。
精製されたタンパク質を担体または希釈剤とともに製剤化する工程、および、所望により、このようにして製剤化されたタンパク質を単位形で提供する工程をさらに含んでなる、請求項４４に記載の方法。
単離されたタンパク質を医薬上許容されるレベルの純度にまで精製する工程をさらに含んでなる、請求項４３に記載の方法。
精製されたタンパク質を医薬上許容される担体または希釈剤とともに製剤化する工程、および、所望により、このようにして製剤化されたタンパク質を単位投与形で提供する工程をさらに含んでなる、請求項４４に記載の方法。
宿主酵母細胞においてその必須タンパク質をコードする遺伝子が欠失または不活性化された場合に、その宿主細胞は培養系では生存できず、かつ、その欠陥が培養培地に対する付加または改変によっては補償できないという意味で、宿主酵母細胞の生存力に必須のタンパク質をコードする遺伝子を単独の酵母選択マーカーとして含んでなる、プラスミド。
前記必須タンパク質をコードする遺伝子が、プラスミドによりコードされる単独の選択マーカーである、請求項４８に記載のプラスミド。
前記必須タンパク質がシャペロンである、請求項４８または４９に記載のプラスミド。
前記シャペロンがタンパク質ジスルフィドイソメラーゼまたはＰｓｅ１ｐである、請求項５１に記載のプラスミド。
請求項２３〜２７のいずれか一項で定義されたタンパク質のような、非２μｍ系プラスミドタンパク質をコードする遺伝子をさらに含んでなる、請求項４８〜５１のいずれか一項に記載のプラスミド。
２μｍ系プラスミドである、請求項４８〜５２のいずれか一項に記載のプラスミド。
請求項１〜３３のいずれか一項で定義されたプラスミドである、請求項５３に記載のプラスミド。
その宿主細胞の生存力に必須のタンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミドを含んでなる宿主細胞であって、該プラスミドの不在下では宿主細胞は必須タンパク質が生産できず、かつ、培養培地に対する付加または改変によっては生存力が得られない、宿主細胞。
前記プラスミドが請求項１〜３３または４８〜５４のいずれか一項に記載のプラスミドである、請求項５５に記載の宿主細胞。
前記プラスミドの不在下では生存できない、請求項５５または５６に記載の宿主細胞。
請求項２３〜２７のいずれか一項で定義されたタンパク質のような、目的のタンパク質をコードする組換え遺伝子をさらに含んでなる、請求項５５〜５７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
目的のタンパク質が請求項２３〜２７のいずれか一項で定義された非２μｍ系プラスミドタンパク質である、請求項５８に記載の宿主細胞。
前記必須タンパク質が、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼまたはＰＳＥ１などのシャペロンである、請求項５９に記載の宿主細胞。
前記組換え遺伝子が、前記必須タンパク質をコードする遺伝子と同じプラスミド上に存在している、請求項５９または６０に記載の宿主細胞。
目的の組換えタンパク質を製造する方法であって、請求項５９〜６１のいずれか一項で定義された宿主細胞を準備する工程、該宿主細胞を、培養培地中、必須タンパク質および目的のタンパク質の発現を可能とする条件下で培養する工程、ならびに、所望により、このようにして発現した目的のタンパク質を培養宿主細胞または培養培地から単離する工程、ならびに、所望により、このようにして単離された目的のタンパク質を商業上許容されるレベルの純度にまで精製する工程、さらには、所望により、このようにして精製されたタンパク質を凍結乾燥するか、または精製された目的のタンパク質を担体または希釈剤（例えば、医薬上許容される担体または希釈剤）とともに製剤化する工程、ならびに、所望により、このようにして製剤化された目的のタンパク質を単位投与形で提供する工程を含んでなる、方法。
宿主細胞を培養する工程が、宿主細胞を複合培地または富栄養培地などの非選択培地で培養することを含む、請求項６２に記載の方法。