WO2005113768A1 - ポリペプチドの製造方法 - Google Patents

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WO2005113768A1
WO2005113768A1 PCT/JP2005/009184 JP2005009184W WO2005113768A1 WO 2005113768 A1 WO2005113768 A1 WO 2005113768A1 JP 2005009184 W JP2005009184 W JP 2005009184W WO 2005113768 A1 WO2005113768 A1 WO 2005113768A1
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polypeptide
expression
chaperone
vector
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PCT/JP2005/009184
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French (fr)
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Toshihiro Shodai
Hiroshi Kobori
Takehiro Sagara
Hiroshi Endo
Hikaru Takakura
Jun Tomono
Hiroaki Sagawa
Hiroyuki Mukai
Ikunoshin Kato
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Takara Bio Inc.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1276—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. reverse transcriptase or telomerase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a target protein under low-temperature conditions by expressing a vector into which a gene encoding a target protein and a vector into which a chaperone gene has been inserted.
  • DnaK, DnaJ, and GrpE are chaperones that work in concert with protein folding.
  • ATP on DnaK is hydrolyzed to form the unfolded protein DnaJ-DnaK (ADP-bound) complex, and then GrpE ADPZATP exchange is thought to occur, and the substrate protein also releases the complex force (see, for example, Non-Patent Document 1).
  • Trigger Factor is one of the molecular chaperones involved in protein folding. Of the amino acids in the target protein that are folding in the cell, the cis-translation of the N-terminal peptide bond of the proline residue It has the activity of catalyzing the sexual reaction (PPIase activity).
  • examples in which the solubility of human growth hormone was improved by co-expression of DnaK see, for example, Non-patent Document 6
  • examples in which transdaltaminase was solubilized by co-expression of DnaJ see, for example, Patent Document 4
  • CspA (see, for example, Patent Document 5) has an expression level of up to 13% of the total bacterial protein 1.5 hours after a temperature shift from 37 ° C to 10 ° C (for example, see Non-Patent Document 5).
  • attempts have been made to use the cspA gene promoter for the production of recombinant proteins at low temperatures.
  • the recombinant protein expression system under low temperature conditions using the cspA gene exhibits the following effectiveness, in addition to the fact that the promoter of the gene initiates transcription efficiently at low temperatures as described above. Being done.
  • the translatable mRNA transcribed from the cspA gene does not encode a functional CspA protein, more specifically, it encodes only a part of the N-terminal sequence of the CspA protein.
  • such mRNAs inhibit the expression of other E. coli proteins, including cold shock proteins, for a long time, during which translation of the mRNAs takes precedence (see, for example, Non-Patent Document 7, Patent Reference 6). This phenomenon is called LACE (low temperature-dependent antioiotic effect of truncated cspA expression)! /.
  • the phenomenon (1) above suggests the possibility of specifically expressing only the target protein using the cspA gene, and is intended for the production of high-purity recombinant proteins and isotopic labeling for structural analysis. It is expected to be applied to the preparation of purified proteins.
  • the aforementioned recombinant protein expression system under low temperature conditions is not applicable to all recombinant proteins.
  • Each protein has a unique molecular weight, isoelectric point, and amino acid composition, and it is necessary to form a unique higher-order structure in order to express its function.
  • Some proteins cannot achieve a sufficient expression level even with the above-mentioned expression system, and some cannot obtain a protein having activity! /
  • Patent Document 1 JP-A-11 9274
  • Patent Document 2 JP-A-2000-255702
  • Patent Document 3 JP-A-2000-189163
  • Patent Document 4 JP-A-8-308564
  • Patent Document 5 International Publication No. 90Z09447 pamphlet
  • Patent Document 6 International Publication No. 98Z27220 pamphlet
  • Patent Document 7 International Publication No. 2004Z001041 pamphlet
  • Non-Patent Document l Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91, pp. 10345-10349 (1994)
  • Non-Patent Document 2 Cell Mol. Biol., Volume 40, 635-644 (1994)
  • Non-Patent Document 3 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 92, pp. 1048-1052 (1
  • Non-Patent Document 4 J. Biochem., Vol. 117, pp. 495-498 (1995)
  • Non-Patent Document 5 Protein. Eng., Volume 7, 925-931 (1994)
  • Non-Patent Document 6 Biotechnol., Vol. 10, pp. 301-304 (1992)
  • Non-Patent Document 7 J. Bacteriol., Vol. 178, pp. 4919-4925 (1996)
  • Non-Patent Document 8 J. Bacteriol., Vol. 178, pp. 2994-2997 (1996)
  • Non-Patent Document 9 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 87, pp. 283-287 (19 90)
  • the present invention has been made in view of the above conventional art, and an object of the present invention is to provide a method for producing a target polypeptide while maintaining its activity and efficiency. It is in.
  • the present inventors have conducted intensive studies and found that a host used when expressing a gene encoding a polypeptide or protein of interest in a recombinant protein expression system under low temperature conditions. It has been found that by enhancing the expression of the chaperone gene in E. coli, it is possible to express an active soluble protein, which was difficult to express a soluble protein by the conventional method.
  • the target polypeptide or protein when expressed as a fusion protein with a chaperone in the above-mentioned method, it is particularly effective for solubilizing the target protein.
  • the effect of solubilizing the target protein by this method has been known for some time.
  • the present invention provides, for example, a method for introducing a vector incorporating a target gene and a vector incorporating a chaperone gene into the same host and inducing the expression of both genes to efficiently express the target polypeptide.
  • the first invention of the present invention relates to a method for producing a polypeptide, comprising a step of inducing the expression of the polypeptide by exposing the host, into which the gene encoding the desired polypeptide has been introduced, to low-temperature conditions.
  • the present invention relates to a method for producing a polypeptide, further comprising enhancing the expression of a gene encoding a chaperone in the host.
  • means for enhancing the expression of the gene encoding the chaperone gene include inducing the expression of the host chaperone gene, modifying the chaperone gene on the host chromosome, introducing the chaperone gene into the host, and introducing the chaperone gene into the host. Inn with enhanced expression The main use is illustrated.
  • a gene encoding a chaperone selected from DnaK, DnaJ, GrpE, GroEL, GroES, and a trigger factor is preferably used.
  • the gene encoding the desired polypeptide can be introduced into the host by being connected downstream of the DNA encoding the 5 ′ untranslated region derived from the cold shock protein gene mRNA,
  • the cold shock protein gene is exemplified by the E. coli cspA gene.
  • a DNA encoding a desired polypeptide and a gene encoding a chaperone can be introduced into a host by a vector.
  • the DNA encoding the desired polypeptide and the gene encoding the chaperone may be connected so as to encode a fusion protein of the desired polypeptide and the chaperone.
  • the desired polypeptide include Rous-associated virus 2 (RAV-2) -derived reverse transcriptase ⁇ subunit, RAV-2 derived j8 subunit, DNase, and human-derived Dicer PAZ domain polypeptide.
  • Escherichia coli is exemplified as the host used in the first invention.
  • a second invention of the present invention is a set of plasmid vectors used for producing a desired polypeptide
  • a first vector which is located downstream of the DNA of (a) and has a restriction enzyme recognition sequence that can be used for insertion of a gene encoding a desired polypeptide
  • origin of replication of the vectors (1) and (2) is selected so as not to show incompatibility.
  • the first vector contains a DNA encoding a 5, untranslated region derived from Escherichia coli cspA gene mRNA, and the second vector is DnaK, DnaJ, GrpE, GroEL, GroES, Call the chaperone selected from the trigger factor. And those containing the gene to be loaded are exemplified.
  • a plasmid capable of replicating in E. coli can be used as the vector.
  • the third invention of the present invention relates to an expression vector
  • Examples of the expression vector of the third invention include a vector containing a DNA encoding a 5 'untranslated region derived from Escherichia coli cspA gene mRNA, a chaperone selected from DnaK, DnaJ, GrpE, GroEL, GroES, and a trigger factor. Those containing the encoding gene are exemplified.
  • a restriction enzyme recognition sequence that can be used for insertion of a gene encoding a desired polypeptide comprises a gene encoding the polypeptide such that the desired polypeptide is expressed as a fusion protein with a chaperone May be located at the site where the can be inserted.
  • the expression vector may be a plasmid capable of replicating in E. coli.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of an expression test of hDi-ASI by co-expression.
  • a and B show the results of CBB staining and antibody staining, respectively.
  • T indicates the cell extract fraction
  • S indicates the soluble fraction.
  • Fig. 2 is a view showing the results of an expression test of a fusion protein of RTase a and RTase ⁇ with a trigger factor.
  • ⁇ and ⁇ show the results of single expression and co-expression, respectively, and C and D show fusion expression and cold expression by T7 promoter expression system, respectively.
  • the results of fusion expression by the shock expression system are shown.
  • ⁇ indicates RAV-2 RTase a
  • T indicates the cell extract fraction
  • S indicates the soluble fraction
  • ⁇ indicates the insoluble fraction.
  • FIG. 3 is a view showing the results of an expression test of a fusion protein of DNase and a trigger factor.
  • A, B and C show the results of the single expression system, co-expression system and fusion expression system, respectively.
  • S indicates a soluble fraction
  • P indicates an insoluble fraction.
  • FIG. 4 is a view showing the results of DNase activity measurement.
  • M is the substrate only
  • 1 is the DNase activity measurement using the sonicated soluble fraction of the control
  • 2 is the DNase activity measurement using the sonicated soluble fraction of the fusion expression system. The results are shown below.
  • the vector used in the present invention and containing the gene encoding the desired polypeptide, the expression of the polypeptide is induced by a treatment that shifts the culture temperature of the host below the normal growth temperature, that is, cold shock. It is used as an expression vector in the present invention.
  • cold refers to a temperature below the normal growth temperature of the host.
  • the above vector may be referred to as a cold shock vector.
  • a system for expressing a desired polypeptide using the vector may be referred to as a cold shock expression system.
  • a vector which holds a DNA encoding a 5 ′ untranslated region derived from a cold shock protein gene mRNA and to which a gene encoding a desired polypeptide is connected downstream thereof can be used.
  • downstream refers to a position downstream with respect to the direction of transcription.
  • a vector containing a gene encoding a desired polypeptide is characterized by containing the following elements:
  • the promoter of the above (A) is not particularly limited as long as it has an activity of initiating RNA transcription in a host to be used. Specifically, by using an arbitrary promoter in combination with the region encoding the 5 'untranslated region derived from the cold shock protein gene mRNA of (C) above, it can be used as a low-temperature responsive promoter. A possible promoter.
  • the regulatory region (B) is not particularly limited as long as it can control the expression of a gene located downstream of the promoter (A).
  • a region that transcribes RNA (antisense RNA) complementary to mRNA transcribed from a promoter into a vector, translation of the target protein from a gene downstream of the promoter can be inhibited. it can.
  • the transcription of the antisense RNA under the control of an appropriate promoter different from the promoter of (A), the expression of the target polypeptide can be regulated.
  • operators present in the expression control regions of various genes may be used. For example, a lac operator derived from Escherichia coli ratatosupoperon can be used in the present invention.
  • the lac operator can release its function and activate the promoter by using a suitable inducer, such as ratatose or a structural analog thereof, particularly preferably isopropyl-1- ⁇ -D-thiogalataside (IPTG). It is.
  • a suitable inducer such as ratatose or a structural analog thereof, particularly preferably isopropyl-1- ⁇ -D-thiogalataside (IPTG). It is.
  • IPTG isopropyl-1- ⁇ -D-thiogalataside
  • the region encoding the 5 'untranslated region derived from the cold shock protein mRNA in (C) above is a region encoding a portion 5' of the mRNA from the start codon. ..
  • Cold-shock protein gene of E. coli cs pA, cspB, cspG, and csdA
  • this region force S characteristic Q [Bacteriol, 178 Certificates, Section 4919-4925 (1996); J. Bacteriol., Vol. 178, pp. 2994-2997 (1996)]
  • the 5 'untranslated region derived from the cold shock protein mRNA may be one in which one or more bases have been substituted, deleted, inserted, or added to the nucleotide sequence within a range that retains its function.
  • region refers to a certain range on a nucleic acid (DNA or RNA).
  • the term “5 ′ untranslated region of mRNA” described in the present specification refers to a region of the mRNA synthesized by the transcription of DNA force, which is present on the 5 ′ side and does not encode a protein. .
  • the region is referred to as “5, one UTR (5, one Untranslated Region)”.
  • 5′-UTR refers to the mRNA of the cspA gene of Escherichia coli, or the 5 ′ untranslated region of a modified version thereof.
  • the ability to use the 5′-UTR coding region derived from the cold shock protein gene listed above, particularly those derived from the Escherichia coli cspA gene, can be suitably used.
  • the nucleotide sequence may be partially modified within a range that can contribute to the expression of a low-temperature-specific polypeptide.
  • the nucleotide sequence of this region may be modified by introducing the operator shown in (B) above. May have been modified.
  • the 5, -UTR coding region of the cold shock protein gene is located between the promoter of (A) and the start codon of the gene coding for the polypeptide to be expressed. An operator may be introduced to the system.
  • the expression efficiency is increased by including a nucleotide sequence complementary to the anti-downstream box sequence of the ribosomal RNA of the host used 5, downstream of the untranslated region.
  • a nucleotide sequence complementary to the anti-downstream box sequence of the ribosomal RNA of the host used can be done.
  • an anti-downstream box sequence exists at positions 147-1481 of 16S ribosomal RNA, and encodes the N-terminal peptide of a cold shock protein containing a nucleotide sequence highly complementary to this sequence. Region to be used.
  • a vector in which a transcription termination sequence (terminator 1) is arranged downstream of the target protein gene improves the stability of the vector and is advantageous for high expression of the target protein.
  • the present vector may be a commonly used vector, for example, any of a plasmid, a phage, a virus, and the like, as long as the object as a vector can be achieved.
  • the region other than the above-mentioned components contained in the vector of the present invention includes, for example, It can have a production origin, a drug resistance gene used as a selection marker, a regulatory gene necessary for the function of the operator, such as the lacl q gene for the lac operator.
  • the vector of the present invention cannot be integrated into its genomic DNA after it has been introduced into a host.
  • ⁇ CspA '' the Escherichia coli CspA protein
  • ⁇ cspA gene '' the region on the gene involved in the expression of the protein
  • ⁇ cspA promoter '' the promoter region of the gene
  • base number 426 is the major ( major) transcription start point (+1)
  • base numbers 609 to 611 are SD sequences (ribosome binding sequences)
  • base numbers 621 to 623 and 832 to 834 are start and stop codons of CspA, respectively. Therefore, it is the portion of base numbers 462 to 620 that encodes 5'-UTR in the sequence.
  • Examples of the partially modified 5′-UTR include those described in WO99Z27117.
  • the 5′-UTR region possessed by the pCold08NC2 vector used in the examples of the present application is an example, and its base sequence is shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • a base sequence (downstream box sequence) having high and complementary to the anti-downstream box sequence present in 16S ribosomal RNA is included in this vector.
  • the downstream box sequence present in the region encoding the N-terminal part of Escherichia coli CspA should have only 67% complementarity to the above-mentioned anti-downstream box sequence.
  • the present vector is used to remove a nucleotide sequence encoding a tag sequence, which is a peptide for facilitating the purification of the expressed target gene product, and an extra peptide in the target gene product such as the tag sequence.
  • a nucleotide sequence encoding a protease-recognizing amino acid sequence used in the above can be introduced.
  • a histidine tag (His Tag) having several histidine residues, maltose binding protein, daltathione S transferase and the like can be used.
  • the histidine-tagged polypeptide can be easily purified using a chelating column, and by using a ligand having a specific affinity even for other tag sequences, It can be easily purified.
  • Factor Xa, thrombin, enterokinase, and the like can be used as proteases used for removing extra peptides, and the present vector contains a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence specifically cleaved by these proteases. You only need to introduce it.
  • the method for producing a polypeptide of the present invention is characterized by enhancing the expression of a gene encoding a chaperone when expressing a gene encoding a polypeptide of interest.
  • the chaperone may be any protein as long as it is a protein involved in protein folding. For example, Escherichia coli-derived DnaK, DnaJ, GrpE, GroEL, GroES, a trigger factor and the like can be mentioned.
  • a protein involved in isomerization of proline in the polypeptide such as a trigger factor [Peptidyl-prolyl cis- tarans isomerase (also called PPIase)].
  • the chaperone is not limited to those derived from Escherichia coli, but may be chaperones derived from archaebacteria, yeast, microorganisms, psychrophilic bacteria, and the like.
  • the above-mentioned enhancement of the expression of the chaperone gene is not only induced by expression of the gene encoding the chaperone on the chromosome, but also by modification of the chaperone gene on the chromosome (increase in copy number or insertion of a promoter), Can be achieved by a known method, such as introduction of E. coli into a host, or obtaining a strain with high expression of a chaperone gene by introducing a mutation into the host.
  • the induction of the expression of the chaperone gene on the chromosome can be carried out using the conditions under which, for example, the host is known to induce the expression of the chaperone.
  • Modification of the chaperone gene on the chromosome is performed using methods such as gene insertion and site-directed mutagenesis using homologous recombination in the host chromosome. be able to.
  • an inducible promoter can be inserted upstream of the gene encoding the chaperone to be induced on the host chromosome, and expression can be induced via this promoter.
  • another embodiment includes obtaining a mutant strain in which expression of a Sharp gene is enhanced in a host used for expression of a polypeptide and using the mutant strain as a host.
  • the mutant can be obtained by a known method, for example, by treating a host microorganism with a drug or a mutagen such as ultraviolet light, and then selecting a strain in which the expression of the chaperone gene is enhanced.
  • the enhancement of the expression of the gene encoding the chaperone means that the amount of the chaperone protein in the host is increased as compared to the normal amount.
  • Whether or not the expression of the chaperone gene has been enhanced by the above operation can be determined, for example, by measuring the chaperone protein using an antibody that recognizes the chaperone, or by measuring the amount of mRNA transcribed from the gene encoding the chaperone. Can be measured and confirmed by a known method, for example, RT-PCR, Northern hybridization, hybridization using a DNA array, or the like.
  • the chaperone gene downstream of a controllable promoter.
  • the controllable promoter used for the expression of the chaperone is preferably different from the promoter used for the expression of the target protein.
  • the expression of the chaperone gene can be enhanced by inserting the chaperone gene into a vector and introducing it into a host.
  • the vector may be a commonly used vector as long as the purpose of the vector can be achieved, for example, a plasmid, phage, virus or the like.
  • plasmid hereinafter sometimes referred to as a chaperone plasmid
  • a vector having a replicon that is not incompatible with the expression vector of the target protein may be used.
  • a vector having a ColE1 replicon such as pCold07 described in International Publication No. 99Z27117 pamphlet as an expression vector for the target protein is used. Can be.
  • a selection marker gene may be further included, if necessary, so that selection can be easily performed at the time of transformation with a vector containing the chaperone gene.
  • the mowing selectable marker genes include ampicillin resistance (Amp f) gene, kanamycin resistant (Km 1 gene, Kuroramufue - a selection marker gene call resistance (Cm 1 gene or the like is included in the force outside come protein expression vectors which may be mentioned Should be different
  • chaperone plasmids used in the present invention include plasmids pG-KJE8 expressing DnaKZDnajZ GrpE and GroELZGroES, plasmids pGro7 expressing GroELZGroES, plasmids pKJE7 expressing DnaKZDnajZGrpE, GroEL / GroES and trigger factors. Plasmid pG-Tf2 to be expressed, and plasmid pTf16 to express trigger fatter (the difference is also manufactured by Takara Bio Inc.).
  • the gene encoding the chaperone may be introduced into a host using a vector as described above, or may be used by being integrated into a host chromosome.
  • the foreign protein to be expressed may be any protein as long as it is a foreign protein which is destabilized and Z or insoluble in the host.
  • Such foreign proteins include interferon, interleukin, interleukin receptor, interleukin receptor antagonist, granulocyte colony stimulating factor, granulocyte macrophage colony stimulating factor, macrophage colony stimulating factor, erythropoietin, thrombopoietin, leukemia inhibitory factor , Stem cell growth factor, tumor necrosis factor, growth hormone, proinsulin, insulin-like growth factor, fibroblast growth factor, platelet-derived growth factor, transforming growth factor, hepatocyte growth factor, bone morphogenetic factor, nerve growth factor, Ciliary neurotrophic factor, brain-derived neurotrophic factor, glial cell-derived neurotrophic factor, neurotrophin, properokinase, tissue plasminogen activator, blood coagulation factor, protein c, dalcocerebrosidase, Over O sul
  • the expression vector of the present invention is introduced into a host and used for expression of the target protein.
  • the above-mentioned host is not particularly limited, and includes, for example, prokaryotes such as bacteria, yeast, fungi, plants, insect cells, mammalian cells, etc., but the host used and the characteristics of the expression vector must be compatible. Must.
  • the expression vector may be isolated from a mammalian cell genome, for example, a promoter such as the mouse metamouth thionein promoter, or from a virus that grows in these cells.
  • a promoter such as a baculo innoles promoter, a vaccinia innores 7.5K promoter and the like.
  • a prokaryote such as Escherichia coli is particularly preferably used.
  • the protein may be expressed in the cytoplasm or in the periplasmic region.
  • the method for introducing the chaperone vector and expression vector of the present invention into a host is not particularly limited, and various known methods can be used. For example, calcium phosphate precipitation, electroporation, ribosome as transfection, and the like can be used. Fusion, nuclear injection, viral or phage infection and the like.
  • a host containing the expression vector of the present invention is also one of the present invention. Even if the procedure for introducing into the host is a one-step method in which the chaperone vector and the expression vector are introduced simultaneously, the expression vector is introduced after the introduction of the chaperone vector, or the chaperone vector is introduced after the expression vector is introduced. It may be a two-stage method.
  • a screening method for co-transformed bacteria can be performed using an agent corresponding to the selectable marker gene. Expression of the foreign protein can be confirmed by, for example, Western blotting.
  • One embodiment of the present invention includes a vector set for expressing a polypeptide, which is a combination of the above-described cold shock vector and a vector containing a chaperone gene.
  • the cold shock vector is preferably a vector into which a gene encoding a polypeptide desired to be expressed according to the purpose can be inserted. a ) DNA for encoding a 5 'untranslated region derived from the cold shock protein gene mRNA, and (b) insertion of a gene encoding a desired polypeptide, which is located downstream of the DNA of (a) above.
  • Those having a possible restriction enzyme recognition sequence are exemplified.
  • another embodiment of the present invention includes a vector in which a gene encoding a chaperone is inserted into the above-mentioned cold shock vector.
  • a transformant that can use the desired polypeptide for expression can be produced.
  • the gene encoding the chaperone and the gene encoding the polypeptide of interest are linked in-frame, and the position of the polypeptide of interest is such that the fusion protein of the chaperone and the polypeptide of interest is expressed.
  • a restriction enzyme recognition sequence that can be used for insertion of a gene encoding a peptide may be provided.
  • the chaperone may be linked to the N-terminal side, the C-terminal side, or both of the target polypeptide.
  • the fusion protein may have an amino acid or a peptide serving as a linker between the chaperone and the target polypeptide.
  • the chain length of such a linker is preferably 1 to 50 amino acids, more preferably 3 to 40 amino acids, and most preferably 5 to 30 amino acids.
  • the amino acid sequence of the linker may be a protease recognition sequence or a plurality of protease recognition sequences inserted in parallel. Examples of such protease recognition sequences include Factor Xa ⁇ Thrombin, Enterokinase (both manufactured by Takara Bayo), Prescission Protease (manufactured by Amersham Bioscience), and!, The recognition sequences of various proteases.
  • a preferred example of the protease recognition sequence is a sequence having 4 to 8 amino acids.
  • a fusion polypeptide of the desired polypeptide and the chaperone can be obtained by inserting the gene encoding the desired polypeptide into the vector and introducing the gene into an appropriate host.
  • the fusion polypeptide has a linker containing a protease recognition sequence, the target polypeptide separated from the chaperone by protease digestion can be obtained.
  • the production of the polypeptide in the present invention is carried out, for example, in the following steps.
  • the gene encoding the polypeptide of interest is inserted into the cold shock vector downstream of the DNA encoding the 5 'untranslated region derived from the cold shock protein gene mRNA.
  • a transformant is prepared by introducing the recombinant expression vector thus prepared into an appropriate host.
  • the vector containing the gene encoding the chaperone is used in combination, the vector is further introduced into the transformant.
  • the host may be transformed only with the vector.
  • the above transformant is cultured under ordinary conditions.
  • Escherichia coli it should be cultured around 37 ° C.
  • the chaperone may be expressed in the host at all stages of the culture, or the expression may be induced at the same time as the expression of the target polypeptide. Induction of the expression of the chaperone gene may be carried out in accordance with the state of the chaperone gene in the host.For example, when it is desired to induce the expression of the chaperone gene originally possessed by the host, the host may be induced under suitable conditions. Just put it.
  • the gene encoding the chaperone is under the control of a heterologous promoter, for example, when the chaperone gene is inserted into a vector and introduced into a host, expression is performed by means appropriate for the promoter that controls the transcription. Guidance is performed. When a host is used in which the expression of the chaperone gene is constantly enhanced, the above-described induction operation is not necessary.
  • Induction of the expression of the target polypeptide is usually carried out after increasing the number of cells at a general culture temperature as described above.
  • a cold shock response is induced in the host, which results in preferential expression of the polypeptide of interest.
  • the culture temperature is not particularly limited to the present invention, for example, a cold shock response is induced by lowering the general culture temperature by 5 ° C or more, preferably 10 ° C or more.
  • the function of the operator may be released by an appropriate means to induce the promoter.
  • the culture of the transformant was continued at a lower temperature, and the polypeptide was cultured.
  • the polypeptide was cultured.
  • Purification of the polypeptide from the culture can be carried out from the transformant cells recovered from the culture, the culture supernatant, or both.
  • the polypeptide may be purified by a combination of known protein purification techniques such as ammonium sulfate fractionation, ultrafiltration, and various types of chromatography.
  • the expressed polypeptide by designing the expressed polypeptide to be bound to a carrier via an appropriate ligand, its purification can be facilitated. For example, if a vector is designed so that a tag of about 6 histidine residues is added to the N-terminal side of the polypeptide, the obtained fusion polypeptide will be transferred to a carrier chelating a metal such as nickel via a histidine residue. Can be combined. By using this carrier, the host-derived protein and the expressed polypeptide can be easily separated. The expressed polypeptide bound to the carrier can be easily released from the carrier only by cleaving the linker with a protease.
  • an expression vector was constructed as follows.
  • synthetic primers 5 and 6 having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 4 and 5 in the sequence listing were synthesized using a DNA synthesizer, and purified by a conventional method.
  • the synthetic primer 5 has a nucleotide sequence corresponding to the amino acid numbers 679 to 685 of the amino acid sequence of human-derived Dicer (SEQ ID NO: 3) at base numbers 16 to 36, and a recognition sequence of the restriction enzyme Kpnl at nucleotide numbers 9 to 14. It is a synthetic DNA with.
  • Synthetic primer 6 has base sequence 9-14 for the recognition sequence of the restriction enzyme Hindlll and base sequence 18 for the base sequence corresponding to amino acid sequence 1919-1924 of the amino acid sequence of human Dicer (SEQ ID NO: 3). With ⁇ 35.
  • PCR was performed using the above synthetic primers.
  • the reaction conditions for PCR are shown below.
  • type I DNA human cDNA library, Human Pancreas, manufactured by Takara Bio Inc. 21 and 51 10X LA PCR buffer (manufactured by Takara Bio Inc.), 5 ⁇ l dNTP mixed solution (manufactured by Takara Bio Inc.) , LOpmol synthetic primer 5 and lOpmol synthetic primer 6, 0.5 U of Takam LA Taq (manufactured by Takara Bio Inc.) were added, and sterilized water was added to bring the total amount to 501.
  • the reaction solution was set on a TaKaRa PCR Thermal Cycler SP (manufactured by Takara Bio Inc.), and 30 cycles of reaction were performed at 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 3 minutes.
  • Plasmid pCold08Nc2 is a plasmid having, in order from the upstream, a cspA promoter, a lac operator, a modified 5'-UTR derived from the Escherichia coli cspA gene, and a multicloning site.
  • the plasmid contains the lacl gene, a downstream box sequence that is completely complementary to the anti-downstream sequence present in Escherichia coli 16S ribosomal RNA, a histidine tag with six histidine residues, and recognition of factor Xa. And a base sequence encoding the amino acid sequence.
  • the nucleotide sequence of the 5′-UTR region of the pCold08NC2 vector is shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • This pCold08NC2 vector was cleaved with the same restriction enzymes used when preparing the above-mentioned KpnI-Hindm-digested DNA fragment, and the one obtained by dephosphorizing the end was prepared. They were mixed and ligated using a DNA ligation kit (manufactured by Takara Bio Inc.). Thereafter, Escherichia coli JM109 was transformed using the ligation reaction solution 201, and the transformant was grown on an LB medium containing 1.5% (wZv) agar (containing 50 ⁇ g Zml of ampicillin).
  • pCold08hDi-ASI The plasmid into which the target DNA fragment was inserted was confirmed by sequencing, and this recombinant plasmid was designated as pCold08hDi-ASI.
  • the plasmid is named and designated plasmid pCold08 hDi-ASI, and became independent from the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) on September 26, 2003 (Hara Deposit Date) Deposited as FERM BP-10076 at 1 No. 1 Central No. 6 (Zip Code 305-8566).
  • This pCold08 hDi—ASI has the amino acid sequence of human-derived Dicer (SEQ ID NO: 3).
  • the protein expressed from the plasmid has a Perfect DB sequence, a His tag sequence, and a Factor Xa sequence.
  • the amino acid sequence of the protein is shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing, and the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing.
  • E. coli BL21 was transformed using each lng of the chaperone plasmid and each lng of the above plasmid pCold08ZhDi-ASI. The transformation was carried out by the Shii-Dani calcium method.
  • Co-transformants carrying each of pGro7, pKJE7, pG-Tf2 and pTF16 and pCold08ZhDi-ASI are screened using plates containing chloramphenecol and ampicillin at concentrations of 20 gZml and 100 gZml, respectively. I got it. Clones that co-express each of the resulting chaperones and hDi-ASI were named Tl, T2, # 3, and # 4, respectively.
  • a transformant was prepared by transforming Escherichia coli BL21 (manufactured by Novagen) using only pCold08ZhDi-ASI and screening using a plate containing 100 ug / ml ampicillin. did.
  • the clone of the conventional expression system without introducing the chaperone was named C1.
  • Each transformant was cultured at 37 ° C.
  • L-arabinose final concentration 0.5 mg / ml
  • T2 T2 medium
  • tetracycline final concentration 5 ngZml
  • IPTG IPTG having a final concentration of 0.5 mM was added to the culture, and the culture was further performed at 15 ° C for 24 hours to induce the expression of hDi-ASI.
  • FIG. 1 shows the results of analysis by CBB staining (A) or Western blotting using an anti-His tag antibody (manufactured by QIAGEN) (B).
  • the target protein having a molecular weight of 144,000 was confirmed in the cell extract fraction, but was hardly detected in the soluble fraction.
  • the trigger factor when hDi-ASI and the trigger factor were co-expressed as seen in T4, it was observed that the cell extract fraction of hDi-ASI increased as compared to the control. In addition, most of them were detected in the soluble fraction.
  • Tl, T2, and T3 in which hDi-ASI was co-expressed with other chaperones the soluble fraction was almost undetectable.
  • Escherichia coli BL21 was transformed with pCold08 hDi-ASI and pTf16 prepared in (2) above, and the transformant was transformed into an LB medium (ampicillin 50 ⁇ g Zml) containing 1.5% (wZv) agar. ).
  • the grown colonies were mixed with 500 ml of TB liquid medium (batatotryptone 6 g, knotyl yeast extract 12 g, glycerol 2 ml, 17 mM KHPO,
  • the mixture was spiked to a concentration of 0.5 mg / ml, cultured at 37 ° C and 130 rpm until the exponential growth phase, and then cooled to 15 ° C. After cooling, IPTG was added to a final concentration of 1.OmM, and the cells were cultured at 130 rpm and 15 ° C for 24 hours to induce expression. Thereafter, the cells were collected by centrifugation to obtain 3.3 g of wet cells. Add 3.3 g of wet cells to 13.16 ml of binding buffer [5 OmM Tris-HCl buffer (pH 8.5), 100 mM sodium chloride, ImM magnesium chloride And a protease inhibitor (Complete, EDTA-free, manufactured by Boehringer Mannheim)]. The cells were disrupted by sonication and separated into a supernatant extract and a precipitate by centrifugation (12, OOOrpm for 20 minutes).
  • Ni-NTA agarose manufactured by QIAGEN
  • a resin volume of 10 ml was packed in a ⁇ 50 mm column and washed with 30 ml of distilled water. Then, it was washed with 100 ml of binding buffer, and the resin was recovered. About 13 ml of the supernatant prepared from the above cell lysate was added and gently mixed with a rotary shaker at 4 ° C for about 1 hour. Thereafter, the resin to which the target protein had been adsorbed was packed in a ⁇ 50 mm column, and washed twice with 50 ml of binding buffer.
  • the resin was washed with 50 ml of buffer A [20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5), 100 mM sodium chloride, ImM magnesium chloride, 10% glycerol, 20 mM imidazole], and then 50 ml of buffer B [20 mM Tris-HCl Buffer (pH 8.5), 800 mM sodium chloride, ImM magnesium chloride, 10% glycerol, 20 mM imidazole], followed by washing with 50 ml of buffer A to remove unnecessary proteins other than the target.
  • buffer A 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5), 100 mM sodium chloride, ImM magnesium chloride, 10% glycerol, 20 mM imidazole
  • buffer B [20 mM Tris-HCl Buffer (pH 8.5), 800 mM sodium chloride, ImM magnesium chloride, 10% glycerol, 20 mM imidazole]
  • buffer C 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5), 100 mM sodium chloride, ImM magnesium chloride, 10% glycerol, 100 mM imidazole.
  • the eluted sample was concentrated using Centricon YM-10 (manufactured by Amicon), and 10 ml of bufferD [50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5), 250 mM sodium chloride, ImM sodium chloride, ImM sodium chloride, and 0. ImM DTT, 0.1% Triton X-100, 10% glycerol] and concentrated. This operation was repeated twice.
  • the dsRNA degradation activity of the protein sample prepared in (4) was measured.
  • the activity was measured as follows.
  • dsRNA as a substrate used for activity measurement was synthesized using TurboScript T7 Transcription kit (manufactured by GTS) according to the attached protocol.
  • GFP Red-shift Green Fluorescent Protein
  • PQBI1125 Manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • SEQ ID NO: 10 in the sequence listing, whose base sequence is shown is expressed by a plasmid pDON-rsGFP inserted into pDON-AI (Takara Bio Inc.) was used as type I, and a synthetic primer 3 having a T7 promoter sequence described in SEQ ID NO: 11 in the sequence listing and a synthetic primer 4 described in SEQ ID NO: 12 in the sequence listing were prepared. PCR was carried out to obtain an amplification product.
  • GFP Red-shift Green Fluorescent Protein
  • dsRNA having a length of about 700 bp was prepared by using the obtained double-stranded DNA as type III and performing an RNA synthesis reaction using T7 RNA polymerase.
  • DsRNA l ⁇ g prepared by the above method, 1 ⁇ l of the protein sample prepared in the above (3), 5 ⁇ l reaction buffer (100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5), 750 mM sodium chloride, 12.
  • a reaction solution was prepared by adding nuclease-free water to 5 mM magnesium chloride (21) to make a total volume of 10 1.
  • the following procedures were used to compare expression of the target protein alone, co-expression of the target protein and the trigger factor, and comparison of expression of the fusion protein of the target protein and the trigger factor.
  • the expression of the fusion protein there are two expression systems: a system using a cold shock vector (cold shock expression system), and an expression system combining the T7 promoter and T7 RNA polymerase (T7 promoter expression system). Using.
  • the above-mentioned synthetic primer TFN has a nucleotide sequence encoding the first to ninth amino acids from the N-terminal of the amino acid sequence of the trigger factor derived from Escherichia coli, and further has a recognition sequence of the restriction enzyme Ndel at base numbers 4 to 9. It is.
  • the synthetic primer TFCP has a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence encoding the 1st to 9th amino acids from the C-terminus of the amino acid sequence of the Escherichia coli-derived trigger factor and a nucleotide sequence encoding the recognition sequence of protease Factor Xa.
  • a genomic DNA serving as a type II PCR was extracted from Escherichia coli HB101 (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • PCR was performed using the synthetic primers and genomic DNA.
  • the PCR reaction conditions are shown below. That is, the lO X Pyro best buffer II (manufactured by Takara Bio Inc.) of type II DNAs 11 and 101 prepared above, a dNTP mixture solution (manufactured by Takara Bio Inc.) of 8 ⁇ l, the synthetic primer TFN of 10 Opmol, and the lOOpmol of lOOpmol Synthetic primer TFCP, 2.5 U of Pyrobest DNA Polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) were added, and sterilized water was added to make the total amount 100 1.
  • the reaction solution was set on a PCR Thermal Cycler SP (manufactured by Takara Bio Inc.), and 30 cycles of reaction were performed at 94 ° C. for 30 seconds, 59 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 2 minutes.
  • the plasmid vector pColdll (manufactured by TAKARA BIO INC.) Was double-digested with restriction enzymes Ndel and Hindlll, and the one obtained by dephosphorizing the ends was prepared.
  • the DNA was ligated using a DNA ligation kit (manufactured by Takara Bio Inc.). Thereafter, Escherichia coli JM109 was transformed using the ligation reaction solution 101, and the transformed transformant was grown on an LB medium containing 1.5% (wZv) agar (containing 100 gZml of ampicillin).
  • the plasmid into which the target DNA fragment was inserted was confirmed by sequencing. Subsequently, in order to eliminate the restriction enzyme EcoRI recognition sequence (Genbank Acc. No.
  • the recombinant plasmid having the cold shock expression system thus obtained and containing the E. coli-derived trigger factor gene sequence was named pColdTF.
  • a plasmid vector for expressing a fusion protein of the target protein and Escherichia coli-derived trigger factor 1 using the T7 promoter expression system was also prepared as follows.
  • pColdTF was double-digested with restriction enzymes EcoRI (manufactured by Takara Bio) and restriction enzyme EcoO109I (manufactured by Takara Bio), and further dephosphorylated at its end to prepare a DNA digested with EcoRI-EcoO109I. A fragment was obtained.
  • pCold08NC2 was double-digested with restriction enzymes EcoRI and EcoO109I, and the EcoRI-EcoO109I digest was extracted and purified by 1% agarose gel electrophoresis. They were connected using a shilling kit (Takara Bio Inc.).
  • Escherichia coli JM109 was transformed using the ligation reaction solution 101, and the transformant was grown on an LB medium containing 1.5% (w / v) agar (containing 100 ⁇ g Zml of ampicillin). Grew up.
  • the recombinant plasmid obtained by modifying the multicloning site of pColdTF thus obtained was named pColdTF-II.
  • pColdTF-II was digested with a restriction enzyme Xbal (manufactured by Takara Bio Inc.), blunt-ended with T4 DNA Polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.), and then digested with a restriction enzyme Ndel to obtain an E. coli-derived trigger factor. An Ndel-blunt end fragment containing the gene was obtained.
  • the plasmid vector pET16b (manufactured by Novagen) was digested with the restriction enzyme BamHI (manufactured by Takara Bio) and blunt-ended with T4 DNA Polymerase. Furthermore, after digestion with the restriction enzyme Ndel, the one whose terminal is dephosphorylated is prepared, and mixed with the above-mentioned Ndel-blunt-end fragment DNA fragment containing the E. coli-derived trigger factor gene, and DNA ligation is performed. Using a kit. Thereafter, Escherichia coli JM109 was transformed using the ligation reaction solution 101, and the transformant was placed on an LB medium containing 1.5% (wZv) agar (containing ampicillin 100 ⁇ g / ml). Grew. The thus obtained recombinant plasmid having the T7 promoter expression system and containing the E. coli-derived trigger factor gene sequence was named pETTF.
  • the amino acid sequence of the reverse transcriptase ⁇ subunit (hereinafter, RAV-2 RTase ⁇ ) derived from Rous associated virus 2 (RAV-2) (Genbank Acc. No.
  • RAV-2 RTase ⁇ The amino acid sequence is changed based on the codon usage of Escherichia coli without changing the encoded amino acid sequence, and the recognition sequence of the restriction enzyme EcoRI and the recognition sequence of the restriction enzyme Xbal are each changed.
  • a double-stranded DNA having a sequence designed to have both ends of the sequence was synthesized.
  • RAV-2 RTase ⁇ derived from Rous associated virus 2 (RAV-2) (Genbank Acc. No. BAA22090) was also used.
  • RAV-2 RTase ⁇ Rous associated virus 2
  • EcoRI the recognition sequence of the restriction enzyme EcoRI
  • the recognition sequence of the restriction enzyme Xbal are respectively provided at both ends of the sequence.
  • a double-stranded DNA having the designed sequence was synthesized.
  • each of the above two types of synthetic double-stranded DNA was double-digested using restriction enzymes EcoRI (manufactured by Takara Bio Inc.) and Xbal (manufactured by Takara Bio Inc.), and subjected to 1% agarose gel electrophoresis. Provided.
  • the DNA fragment of the target size confirmed was recovered from the electrophoresis gel, purified and purified, and EcoRI containing the gene encoding RAV-2 RTase a-Xbal digested DNA fragment and EcoRI containing the gene encoding RAV-2 RTase ⁇ — Xbal digested DNA fragment was obtained.
  • pColdTF prepared in (1) was double-digested with restriction enzymes EcoRI and Xbal, followed by dephosphorylation of the ends to prepare the above two types of EcoRI-Xbal-digested DNA fragments. After mixing, each was ligated using a DNA ligation kit (Takara Bio Inc.). It was. Then, Escherichia coli JM109 was transformed using the ligation reaction solution 101, and the transformant was grown on an LB medium containing 1.5% (w / v) agar (containing 100 ⁇ g / ml ampicillin). I let it.
  • Plasmids that express these fusion proteins of trigger factor and RAV-2 RTase a and fusion proteins of trigger factor and RAV-2 RTase ⁇ in the cold shock expression system are named pColdTF-a and pColdTF- ⁇ , respectively.
  • pCold08Nc2 constructed in Example 1 was used instead of pColdTF.
  • the prepared plasmids were named pCold08-a and pCold08- ⁇ , respectively.
  • a plasmid that expresses a fusion protein of a trigger factor and RAV-2 RTase a and a fusion protein of a trigger protein and RAV-2 RTase ⁇ in a ⁇ 7 promoter expression system was prepared as follows. did.
  • the pETTF prepared in (1) was digested with a restriction enzyme Sail (manufactured by Takara Bio Inc.),
  • Plasmids that express a fusion protein of these trigger one factor with RAV-2 RTase a and a fusion protein of trigger factor with RAV-2 RTase ⁇ in a ⁇ 7 promoter expression system They were named pETTF-a and pETTF- ⁇ , respectively.
  • Escherichia coli BL21 was transformed using pColdTF- ⁇ , which expresses a fusion protein of a trigger factor and RAV-2 RTase a in a cold shock expression system.
  • the transformation was carried out by the Shii-Dani calcium method.
  • Transformants were obtained by screening using plates containing ampicillin at a concentration of 100 gZml.
  • a transformant expressing RAV-2 RTase a and RAV-2 RTase ⁇ in a single expression system and a transformant expressing RAV-2 RTase a in a co-expression system of RAV-2 RTase a and a trigger factor
  • a transformant expressing RAV-2 RTase ⁇ and a trigger factor in a co-expression system a transformant expressing a fusion protein of a trigger factor and RAV-2 RTase ⁇ in a ⁇ 7 promoter expression system, and a trigger factor.
  • a transformant expressing the fusion protein with RTase ⁇ in the ⁇ 7 promoter expression system was also prepared.
  • transformants expressed in the single expression system were plasmids pCold08-a and pCold08.
  • -A fusion protein was obtained in the same manner as in the method for preparing a transformant expressing the above fusion protein in a cold shock expression system, except that BL21 was transformed using ⁇ .
  • the transformant expressed in the co-expression system was prepared by the following method. First, Escherichia coli BL21 was transformed using plasmids pCold08- ⁇ and pCold08- ⁇ , respectively, and plasmid pTf16. The transformation was carried out by the Shii-Dani calcium method. Next, a conformal transformant carrying each of p Cold08- ⁇ and pCold08- ⁇ and the plasmid pTf16 was prepared using a plate containing chloramphenecol and ampicillin at a concentration of 100 ⁇ gZml and 20 ⁇ gZml, respectively. And obtained by screening.
  • a transformant expressing the fusion protein in the T7 promoter expression system was prepared using plasmid pETTF.
  • RTase a and RTase ⁇ were examined.
  • 5 ml of LB liquid medium (containing 50 ⁇ g / ml ampicillin) was used to culture the transformant expressing the fusion protein in the cold shock expression system and the transformant in the single expression system.
  • 5 ml of LB liquid medium (containing 50 g Zml ampicillin, 20 g / ml chloramphenecol, and 0.5 mg / ml arabinose) was used for culturing the transformants of the co-expression system.
  • the plasmid contains a nucleotide sequence encoding a DNase having a capacity of 254 amino acid residues, and a fusion protein of 271 amino acid residues in which His-Tag, Factor Xa recognition sequence, and linker sequence are added to the DNase is expressed. It is constructed as follows.
  • a plasmid for expressing a fusion protein of a trigger factor and DNase was constructed as follows.
  • the synthetic primer NUCN is a synthetic DNA having a nucleotide sequence encoding amino acids 1 to 7 from the N-terminus of DNase, and having a recognition sequence of the restriction enzyme EcoRI at nucleotide numbers 4 to 9.
  • the synthetic primer NUCC is a synthetic DNA having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence encoding amino acids 247 to 254 from the N-terminus of DNase, and having a recognition sequence for the restriction enzyme BamHI at nucleotide numbers 4 to 9. is there.
  • PCR was performed using the above synthetic primers.
  • the PCR reaction conditions are shown below. That is, type I DNA (pCold08-Endl) l1, 101 lOX Pyrobest buffer II (Takarabaio), 81 dNTP mixture (Takara Bio), lOOpmol synthetic primer NUCN, lOOpmol synthetic primer NUCC, 2.5U Pyrobest DNA
  • Polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) was cultivated, and sterilized water was cultivated to make the total amount 1001.
  • the reaction solution described above was set on a PCR Thermal Cycler SP (manufactured by Takara Bio Inc.), and 30 cycles of reaction were performed at 94 ° C for 30 seconds, 58 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute. After completion of the reaction, 100 ⁇ l of the reaction solution was subjected to 1% agarose gel electrophoresis. The confirmed approximately 0.8 kbp DNA fragment was recovered and purified from the electrophoresis gel, and ethanol precipitation was performed.
  • the recovered DNA after ethanol precipitation was suspended in 151 sterile water, double-digested with EcoRI (Takara Bio Inc.) and BamHI (Takara Bio Inc.), and subjected to 1% agarose gel electrophoresis.
  • the BamHI digest was extracted and purified to obtain an EcoRI-BamHI digested DNA fragment.
  • pColdTF prepared in Example 2 (2) was double-digested with restriction enzymes EcoRI and BamHI, and further dephosphorylated at its ends to prepare the two types of EcoRI-BamHI-digested D.
  • the DNA fragments were ligated using a DNA ligation kit (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • Escherichia coli JM109 was transformed using the ligation reaction solution 101, and the transformant was grown on LB medium containing 1.5% (wZv) agar (containing 100 ⁇ g / ml ampicillin). I let it.
  • a plasmid into which the desired DNA fragment was inserted was prepared.
  • the plasmid expressing the fusion protein of the trigger factor and DNase was named pColdTF — End 1.
  • Escherichia coli BL21 was transformed using pColdTF-Endl which expresses a fusion protein of a trigger factor and DNase. The transformation was carried out by the Shii-Dani calcium method. Transformants were obtained by screening using plates containing ampicillin at a concentration of 100 g / ml.
  • a transformant expressed in the single expression system was obtained in the same manner as in the above-described method for preparing a transformant, except that BL21 was transformed using plasmid pCold08-Endl.
  • Preparation of a transformant expressed in the co-expression system was performed by the following method. First, Escherichia coli BL21 was transformed using plasmid pCold08-Endl and plasmid pTfl6. The transformation was performed by the Shii-Dani calcium method. Next, co-transformants carrying pCold08-Endl and the plasmid pTfl6 were purified from chloramphenecol and ampicillin. It was obtained by screening using plates containing 100 gZml and 20 gZml, respectively.
  • each transformant obtained in (2) the expression of DNase was examined.
  • 5 ml of LB liquid medium containing 50 gZml of ampicillin
  • 5 ml of LB liquid medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin, 20 ⁇ g / ml chloramphene-col, and 0.5 mg / ml arabinose
  • OD600 about 0.8
  • FIG. 3 shows the results of analysis by CBB staining.
  • DNase activity was measured for the soluble fraction of the fusion expression system prepared in (3) by sonication.
  • As a control an ultrasonically crushed soluble fraction of Escherichia coli transformed using only the pColdTF vector into which no insert was introduced was also obtained, and the activity was measured at the same time.
  • the control ultrasonically soluble fraction was obtained in the same manner as in (2) and (3) except that pColdTF was used.
  • Eiichi Hindlll digest (manufactured by Takara Bio Inc.) was used as a substrate.
  • synthetic primers 1 and 2 having the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 19 and 20 in the sequence listing were synthesized using a DNA synthesizer and purified by a conventional method.
  • the synthetic primer 1 the nucleotide sequence corresponding to amino acids 892 to 898 of the amino acid sequence of human-derived Dicer (SEQ ID NO: 3) is represented by nucleotides 16 to 36. It has synthetic DNA.
  • synthetic primer 2 has a base sequence corresponding to amino acids 958 to 1464 of the amino acid sequence of human-derived Dicer (SEQ ID NO: 3) at base numbers 15 to 36, luggage.
  • PCR was performed using the above synthetic primers.
  • type I DNA pCold08ZhDi-ASI prepared in Example 1- (2) was used.
  • the reaction conditions for PCR are shown below.
  • type 1 DNA lng, 10 1 10X LA PCR buffer (Takara Bio), 81 dNTP mixture (Takara Bio), lOpmol synthetic primer 5, lOpmol Synthetic primer 6, 0.5U Takara Ex Taq (manufactured by Takara Bio Inc.) was prepared and sterilized water was added to make a total volume of 100 ⁇ l.
  • the reaction solution was set on a TaKaRa PCR Thermal Cycler MP (manufactured by Takara Bio Inc.), and 30 cycles of reaction were performed at 94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 2 minutes.
  • the pCold08NC2 vector was cleaved with the same restriction enzymes used when preparing the above Kpnl-Hindlll-digested DNA fragment, and further dephosphorylated at the end to prepare the above-mentioned Kpnl-Hindlll-digested DNA fragment. They were mixed and ligated using a DNA ligation kit (manufactured by Takara Noyo). Then, Escherichia coli JM109 was transformed using the ligation reaction solution 61, and the transformant was grown on an LB medium containing 1.5% (wZv) agar (containing 100 ⁇ g Zml of ampicillin). .
  • the plasmid into which the target DNA fragment was inserted was designated as pCold08ZhDi-PAZ.
  • This pCold08ZhDi-PAZ is a plasmid containing a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of amino acids 892 to 1064 of the amino acid sequence of human-derived Dicer (SEQ ID NO: 3).
  • the protein expressed from the plasmid has a Perfect DB sequence, a His-tag sequence, and a Factor Xa sequence.
  • Escherichia coli BL21 was transformed with pColdTFZhDi-PAZ, which expresses a fusion protein of trigger factor and hDi-PAZ.
  • the transformation was performed by the Shii-Dani calcium method. I got it.
  • Transformants were obtained by screening using plates containing ampicillin at a concentration of 100 g / ml.
  • the transformant expressed in the single expression system was obtained in the same manner as the method for preparing a transformant expressed in the fusion expression system described above, except that BL21 was transformed using the plasmid pCold08ZhDi-PAZ.
  • Preparation of a transformant to be expressed in the co-expression system was performed by the following method. First, Escherichia coli A19 was transformed using plasmid pCold08ZhDi-PAZ and plasmid pTfl6. The transformation was carried out by the Shii-Dani calcium method.
  • co-transformants carrying pCold08ZhDi-PAZ and plasmid pTfl6 were obtained by screening using plates containing chloramphenicol and ampicillin at concentrations of 50 ⁇ g Zml and 100 ⁇ g Zml, respectively.
  • each transformant obtained in (2) the expression of hDi-PAZ was examined.
  • 3 ml of LB liquid medium containing gZml ampicillin
  • 3 ml of LB liquid medium containing 50 ⁇ g Zml ampicillin, 20 ⁇ g Zml chloramfecol, and 0.5 mg Zml arabinose
  • the expression was further induced by culturing at 15 ° C. for 24 hours. After induction of expression for 24 hours, the cells were collected. The obtained cells are suspended in a cell lysate (50 mM Tris-HCl (pH 8.5), 100 mM NaCl, ImM MgC12, protease inhibitor (complete EDTA-free)), sonicated, and the cell extract is separated. The soluble and insoluble fractions were prepared by centrifugation at 15,000 ⁇ g. About 2.5 ⁇ 10 6 cells of each fraction were subjected to SDS-PAGE. Analyzed by CBB staining.
  • a cell lysate 50 mM Tris-HCl (pH 8.5), 100 mM NaCl, ImM MgC12, protease inhibitor (complete EDTA-free)
  • a target polypeptide can be produced in a significant amount, in an active state, and with high purity.
  • SEQ ID NO: 6 A gene encoding human dicer mutant
  • SEQ ID NO: 7 An amino acid sequence of human dicer mutant
  • SEQ ID NO: 8 An amino acid sequence of human dicer mutant
  • SEQ ID NO: 9 A gene encoding human dicer mutant
  • SEQ ID NO: 10 A gene encoding red-shift green fluorescent protein.

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Abstract

　目的とするタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだベクターとシャペロン遺伝子を組み込んだベクターとを発現させて、低温条件下で目的タンパク質を製造する方法。

Description

ポリペプチドの製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、 目的とするタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだベクターとシャ ペロン遺伝子を組み込んだベクターとを発現させて、低温条件下で目的タンパク質 を製造する方法に関する。
背景技術
[0002] 近年、種々の生物のゲノム解析が終了しつつあり、今後は遺伝子の発現産物であ るタンパク質の網羅的な機能解析へと進むと考えられている。個々のタンパク質の性 質を明らかにするとともに、タンパク質同士の相互作用を網羅的に解析することで、 生命現象解明の一助としょうとする研究が急速に増えつつある。一方、各種の生理 活性物質と特異的に結合し、その作用を伝達する細胞内受容体タンパク質も、その 受容体タンパク質と結合する活性物質が、新規医薬品の候補物質となり得ることから 、その 3次元構造決定に重大な関心が持たれ、新規医薬品のスクリーニングにおい て注目されている。このようなタンパク質の性質を決定しょうとする場合、該当する遺 伝子をベクター遺伝子上に組み込み、バクテリア、酵母、昆虫細胞等の宿主にトラン スフォーメーションし、発現させて得られる組み換えタンパク質の性質を調べる方法が 一般的である。
[0003] タンパク質の正し 、性質を評価する際、そのタンパク質が、正 U、立体構造に折り 畳まれているか否かが非常に重要となる。し力しながら、異種生物由来のタンパク質 を、上述の宿主発現系を用いたタンパク質発現法で作製しょうとする場合、しばしば タンパク質のフォールデイング異常により、立体構造の異なった異常型タンパク質し か得られないケースに遭遇する。このようなタンパク質は宿主内で封入体と呼ばれる ァグリゲートを形成する。封入体の形成は、発現タンパク質を宿主菌体内のタンパク 質分解酵素による分解から保護し、また遠心分離により菌体から容易に分離すること を可能ならしめるという利点を持つ力 目的である生物学的に活性なタンパク質をえ るためには、封入体を変性可溶化した後、再生（リフォールデリング)する必要がある 。この可溶化'再生の操作は、個々のタンパク質ごとに試行錯誤を繰り返し経験的に 行われているが、満足な回収率が得られないことが多いばかりか、必ずしも再生でき るとは限らない。また、大腸菌でプロテアーゼにより分解を受けて、高い発現量に達し な ヽ異種タンパク質も少なくな 、。このような発現産物の不溶化や分解に対する解決 手段はまだ十分に確立されたとは、言い難ぐ上述の宿主発現系で生物学的に活性 なタンパク質を大量に生産することには必ずしも成功して ヽな 、のが現状である。こ の問題を解決するために、シャペロン等を共発現させることが試みられており、いくつ 力の報告がなされている（例えば、特許文献 1〜3参照)。
[0004] DnaK、 DnaJおよび GrpEは、タンパク質の折り畳み（フォールデイング）に協調して 働くシャペロンである。まず、 DnaJが、基質である折り畳まれていないタンパク質に結 合すると、 DnaK上の ATPが加水分解され、折り畳まれていないタンパク質 DnaJ — DnaK (ADP結合型）複合体を形成し、次に、 GrpEによって、 ADPZATP交換 が起こり、基質タンパク質が複合体力も遊離すると考えられている (例えば、非特許文 献 1参照）。トリガーファクター（Trigger Factor)は、タンパク質のフォールディング に関与する分子シャペロンの 1つであり、細胞内でフォールデイング途上のターゲット タンパク質中のアミノ酸のうち、プロリン残基の N末端側ペプチド結合のシストランス異 性化反応 (PPIase活性)を触媒する活性を有するものである。
[0005] 大腸菌内で不溶ィ匕する外来タンパク質を可溶ィ匕するために、外来タンパク質を Gro ELおよび GroESと共発現させることにより、可溶化することに成功した例が多く知ら れている。例えば、チロシンキナーゼ (例えば、非特許文献 2、 3参照）、グルタミン酸 ラセマーゼ (例えば、非特許文献 4参照）、ジヒドロ葉酸還元酵素 (例えば、非特許文 献 5参照）等が挙げられる。さら〖こ、 DnaKの共発現でヒト成長ホルモンの溶解性が向 上した例（例えば、非特許文献 6参照）や DnaJの共発現でトランスダルタミナーゼが 可溶化した例（例えば、特許文献 4参照）、 DnaK、 DnaJおよび GrpEの共発現により チロシンキナーゼが可溶ィ匕した例 (例えば、非特許文献 2参照）が知られている。
[0006] また、大腸菌内で不溶ィ匕するタンパク質を、シャペロン等との融合タンパク質として 発現させることにより可溶ィ匕させる試みもなされている。例えば、マウス由来 anti—二 ヮトリリゾチーム Fab抗体フラグメントを、古細菌由来のシャペロンである TcFKBP 18 との融合タンパク質として発現させることによって可溶ィ匕させる事に成功した例が知ら れている (特許文献 7参照)。
[0007] し力し、すべてのタンパク質の発現やフォールデイング問題が上記の方法によって 解決できている訳ではない。そのため、タンパク質を効率的に生産する方法の確立 が強く望まれていた。
[0008] 一方、対数増殖期の大腸菌の培養温度を 37°C力も 10〜20°Cに低下させると大腸 菌の増殖は一時的に止まり、その間にコールドショックタンパク質と呼ばれる一群のタ ンパク質の発現が誘導される。該タンパク質はその誘導レベルに応じて第 I群（10倍 以上）と第 II群（10倍未満）に分けられ、第 I群のタンパク質としては、 CspA、 CspB、 CspG、及び CsdAなどが挙げられる（例えば、非特許文献 7、 8参照）。中でも CspA (例えば、特許文献 5参照）は、 37°Cから 10°Cへの温度シフトの 1.5時間後にその発 現量は全菌体タンパク質の 13%までに達することから (例えば、非特許文献 9参照） 、低温における組換えタンパク質の生産に cspA遺伝子のプロモーターを利用するこ とが試みられてきた。
cspA遺伝子を用いた低温条件下での組換体タンパク質発現系は、上述のように該 遺伝子のプロモーターが低温にぉ 、て高効率で転写を開始させること以外に、以下 のような有効性が示されて 、る。
(1) cspA遺伝子カゝら転写された翻訳可能な mRNAが機能を有する CspAタンパク 質をコードしていない場合、より具体的には、 CspAタンパク質の N末端配列の一部 のみをコードしている場合には、このような mRNAはコールドショックタンパク質も含 めた他の大腸菌タンパク質の発現を長時間阻害し、その間は該 mRNAの翻訳が優 先的に行われる（例えば、非特許文献 7、特許文献 6参照)。この現象は LACE (low temperature― dependent antioiotic effect of truncated cspA expre ssion)効果と呼ばれて!/、る。
(2) cspA遺伝子の開始コドンから 12塩基下流の位置には、 15塩基力 なるダウンス トリームボックス（downstream box)と呼ばれる配列があり、低温条件下での翻訳 効率を高いものにしている。
(3) cspA遺伝子 mRNAの転写開始点から開始コドンまでにある 159塩基力もなる 5 '非翻訳領域は、 CspAの発現に対して、 37°Cでは負の、低温条件下では正の影響 を与えている。
特に上記（1)の現象は、 cspA遺伝子を利用して目的のタンパク質のみを特異的に 発現させる可能性を示唆するものであり、高純度の組換えタンパク質生産、構造解析 のための同位体標識されたタンパク質の調製への応用が期待されている。
し力しながら、上記の低温条件下での組換体タンパク質発現系もすベての組換えタ ンパク質に適用可能なものではない。タンパク質はそれぞれ固有の分子量、等電点 、アミノ酸組成を有し、また、その機能の発現のためには特有の高次構造を形成する 必要がある。タンパク質の中には上記の発現系をもってしても十分な発現量が達成 できな 、もの、活性を有するタンパク質を取得できな 、ものが存在して！/、る。
特許文献 1 :特開平 11 9274号公報
特許文献 2：特開 2000— 255702号公報
特許文献 3 :特開 2000— 189163号公報
特許文献 4：特開平 8 - 308564号公報
特許文献 5：国際公開第 90Z09447号パンフレット
特許文献 6：国際公開第 98Z27220号パンフレット
特許文献 7：国際公開第 2004Z001041号パンフレット
非特許文献 l : Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第 91卷、 10345— 10349頁 (1994)
非特許文献 2 : Cell Mol. Biol.、第 40卷、 635— 644頁（1994)
非特許文献 3 : Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第 92卷、 1048— 1052頁（1
995)
非特許文献 4 :J. Biochem.、第 117卷、 495— 498頁（1995)
非特許文献 5 : Protein. Eng.、第 7卷、 925— 931頁（1994)
非特許文献 6 : Biotechnol.、第 10卷、 301— 304頁（1992)
非特許文献 7 :J. Bacteriol.、第 178卷、第 4919〜4925頁（1996)
非特許文献 8 :J. Bacteriol.、第 178卷、第 2994〜2997頁（1996)
非特許文献 9 : Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第 87卷、第 283〜287頁（19 90)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0010] 本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、目的とす るポリペプチドを効率よぐまた、活性を保持した状態で製造する方法を提供すること にある。
課題を解決するための手段
[0011] 本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、目的とするポリペプチド、タンパク質をコー ドする遺伝子を、低温条件下での組換体タンパク質発現系により発現させる際に、使 用する宿主中でのシャペロン遺伝子の発現を増強させておくことによって、従来の方 法では可溶性タンパク質を発現させることが困難であったものを、活性のある可溶性 タンパク質として発現できることを見出した。
さらに、上記の方法において、目的とするポリペプチド、タンパク質をシャペロンとの 融合タンパク質として発現させた場合、目的タンパク質の可溶ィ匕に特に有効であるこ とを見出した。この方法による目的タンパク質の可溶ィ匕の効果は、従来から知られて
V、たタンパク質とシャペロンとを融合タンパク質として発現させる方法や、低温条件下 での組換体タンパク質発現系を用いて目的タンパク質を発現させる方法によるそれ ぞれの効果からは、全く予想し得な 、驚くべきものであった。
本発明は、例えば、目的遺伝子を組み込んだベクターとシャペロン遺伝子を組み 込んだベクターを同一宿主内に導入し、両遺伝子の発現を誘導して効率よく目的ポ リペプチドを発現させる方法を提供する。
[0012] 本発明の第 1の発明は、所望のポリペプチドをコードする遺伝子が導入された宿主 を低温条件にさらすことによって前記ポリペプチドの発現を誘導する工程を包含する ポリペプチドの製造方法であって、前記宿主においてさらにシャペロンをコードする 遺伝子の発現を増強することを特徴とするポリペプチドの製造方法に関する。
第 1の発明においてシャペロン遺伝子をコードする遺伝子の発現を増強する手段と しては、宿主シャペロン遺伝子の発現の誘導、宿主染色体上のシャペロン遺伝子の 改変、宿主へのシャペロン遺伝子の導入、シャペロン遺伝子の発現が増強された宿 主の使用が例示される。
第 1の発明には、 DnaK、 DnaJ、 GrpE、 GroEL、 GroES、トリガーファクターから 選択されるシャペロンをコードする遺伝子が好適に使用される。
第 1の発明において、所望のポリペプチドをコードする遺伝子はコールドショックタ ンパク質遺伝子 mRNA由来の 5'非翻訳領域をコードする DNAの下流に接続され て宿主に導入されて 、ることができ、前記コールドショックタンパク質遺伝子としては 大腸菌 cspA遺伝子が例示される。
第 1の発明において、所望のポリペプチドをコードする DNAとシャペロンをコードす る遺伝子は、ベクターにより宿主に導入する事ができる。また、前記所望のポリぺプ チドをコードする DNAとシャペロンをコードする遺伝子は、所望のポリペプチドとシャ ペロンとの融合タンパク質をコードするように接続されて 、ても良 、。前記の所望のポ リペプチドとしては、ラウス関連ウィルス 2 (RAV— 2)由来逆転写酵素 αサブユニット 、 RAV— 2由来 j8サブユニット、 DNase、ヒト由来 Dicer PAZドメインポリペプチドが 例示される。
第 1の発明に使用される宿主としては、大腸菌が例示される。
本発明の第 2の発明は、所望のポリペプチドの製造に使用されるプラスミドベクター のセットであって、
(1)プロモーターの下流に
(a)コールドショックタンパク質遺伝子 mRNA由来の 5 '非翻訳領域をコードする DN A、
(b)前記 (a)の DNAの下流に位置する、所望のポリペプチドをコードする遺伝子の 挿入に使用可能な制限酵素認識配列、を有する第 1のベクター；および
(2)シャペロンをコードする遺伝子を有する第 2のベクター、
を含有し、前記（1)、（2)のベクターの複製起点が不和合性を示さないように選択さ れていることを特徴とする。
第 2の発明において、第 1のベクターとしては大腸菌 cspA遺伝子 mRNA由来の 5， 非翻訳領域をコードする DNAを含有するもの、また、第 2のベクターとしては DnaK、 DnaJ、 GrpE、 GroEL、 GroES、トリガーファクターから選択されるシャペロンをコー ドする遺伝子を含有して ヽるものがそれぞれ例示される。前記のベクターには大腸菌 で複製しうるプラスミドを使用することができる。
[0014] 本発明の第 3の発明は、発現ベクターに関し、プロモーターの下流に、
(a)コールドショックタンパク質遺伝子 mRNA由来の 5 '非翻訳領域をコードする DN A、
(b)前記 (a)の DNAの下流に位置する、所望のポリペプチドをコードする遺伝子の 挿入に使用可能な制限酵素認識配列、を有する DNA、および
(c)シャペロンをコードする遺伝子
を有することを特徴とする。
第 3の発明の発現ベクターとしては、大腸菌 cspA遺伝子 mRNA由来の 5 '非翻訳 領域をコードする DNAを含有するもの、 DnaK、 DnaJ、 GrpE、 GroEL、 GroES、ト リガ一ファクターから選択されるシャペロンをコードする遺伝子を含有するものが例示 される。
第 3の発明においては、所望のポリペプチドをコードする遺伝子の挿入に使用可能 な制限酵素認識配列が、所望のポリペプチドがシャペロンとの融合タンパク質として 発現されるように前記ポリペプチドをコードする遺伝子を挿入できる部位に位置して いてもよい。
前記の発現ベクターは大腸菌で複製しうるプラスミドであってもよい。
発明の効果
[0015] 本発明の方法により、従来は発現が困難であったポリペプチドを著量に、また、活 性を有する状態で取得することが可能になる。
図面の簡単な説明
[0016] [図 1]図 1は、共発現による hDi— ASIの発現試験結果を示す図である。 Aおよび Bは それぞれ CBB染色および抗体染色の結果を示す。図中、 Tは細胞抽出液画分、 Sは 可溶性画分を示す。
[図 2]図 2は、 RTase aおよび RTase βとトリガーファクターとの融合タンパク質の発 現試験結果を示す図である。 Αおよび Βはそれぞれ単独発現および共発現の結果を 示し、 Cおよび Dはそれぞれ T7プロモーター発現系による融合発現およびコールド ショック発現系による融合発現の結果を示す。図中、 αは RAV— 2 RTase a , は RAV- 2 RTase β、 Tは細胞抽出液画分、 Sは可溶性画分、 Ρは不溶性画分を示 す。
[図 3]図 3は、 DNaseとトリガーファクターとの融合タンパク質の発現試験結果を示す 図である。 A、 Bおよび Cはそれぞれ単独発現系、共発現系および融合発現系の結 果を示す。図中、 Sは可溶性画分、 Pは不溶性画分を示す。
[図 4]図 4は、 DNaseの活性測定結果を示す図である。図中、 Mは基質のみ、 1は対 照の超音波破砕可溶性画分を用いて DNase活性測定を行った結果、 2は融合発現 系の超音波破砕可溶性画分を用いて DNase活性測定を行った結果を示す。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明について説明する。
( 1)コーノレドショックベクター
本発明に使用される、所望のポリペプチドをコードする遺伝子を含有するベクター は、宿主の培養温度を通常の生育温度よりも低くシフトさせる処理、すなわちコール ドショックにより、前記ポリペプチドの発現が誘導されるものであり、本発明においては 発現ベクターとして使用される。本明細書において「低温」なる用語は、宿主の通常 の生育温度よりも低い温度をいう。以下、前記のベクターをコールドショックベクターと 記載することがある。また、当該ベクターを利用した所望のポリペプチドの発現系を、 コールドショック発現系と記載する事がある。当該ベクターとしては、コールドショック タンパク質遺伝子 mRNA由来の 5 '非翻訳領域をコードする DNAを保持し、その下 流に所望のポリペプチドをコードする遺伝子が接続されたものを使用することができ る。本明細書において「下流」なる用語は、転写の方向に関して下流の位置をいう。 特に本発明を限定するものではないが、好適な態様において、所望のポリペプチド をコードする遺伝子を含有するベクターは下記の各要素を含有することを特徴とする
(A)使用する宿主中でその作用を示すプロモーター、
(B) (A)のプロモーターの作用を調節するための調節領域、及び
(C)コールドショックタンパク質遺伝子 mRNA由来の 5 '非翻訳領域、あるいは該非 翻訳領域に少なくとも 1以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加が施された領域をコー ドする領域。
以下にその詳細を説明する。
上記 (A)のプロモーターは特に限定はなぐ使用する宿主中で RNAの転写を開始 する活性を有するものであればよい。詳しくは、任意のプロモーターを上記 (C)のコ 一ルドショックタンパク質遺伝子 mRNA由来の 5'非翻訳領域をコードする領域と組 み合わせて使用することにより、低温応答性のプロモーターとして利用することができ るプロモーターである。
また、上記 (B)の調節領域としては、（A)のプロモーターの下流に位置する遺伝子 の発現を制御可能なものであれば特に限定はない。例えば、プロモーターより転写さ れた mRNAに相補的な RNA (アンチセンス RNA)を転写するような領域をベクター に導入しておくことにより、プロモーター下流の遺伝子からの目的タンパク質の翻訳 を阻害することができる。アンチセンス RNAの転写を (A)のプロモーターとは異なる 適当なプロモーターの制御下に置くことにより、 目的ポリペプチドの発現を調節するこ とができる。また、種々の遺伝子の発現調節領域に存在するオペレーターを利用し てもよい。例えば、大腸菌ラタトースォペロン由来の lacオペレーターを本発明では使 用することができる。 lacオペレータ一は適当な誘導物質、例えばラタトースやその構 造類似体、特に好適にはイソプロピル一 β— D—チォガラタシド (IPTG)の使用によ つてその機能を解除し、プロモーターを作用させることが可能である。このようなオペ レーター配列は、通常、プロモーター下流の転写開始点付近に配置される。
上記（C)のコールドショックタンパク質 mRNA由来の 5'非翻訳領域をコードする領 域とは、 mRNAの開始コドンよりも 5'側の部分をコードしている領域である。大腸菌 のコールドショックタンパク質遺伝子（cspA、 cspB、 cspG、及び csdA)にはこの領域 力 S特徴的に見出されており Q[. Bacteriol.、第 178卷、第 4919〜4925項（1996 )； J. Bacteriol.、第 178卷、第 2994〜2997項（1996) ]、これらの遺伝子力ら転 写された mRNAのうちの 5'末端より 100塩基以上の部分がタンパク質に翻訳されて いない。この領域は遺伝子発現の低温応答性に重要であり、任意のタンパク質の m RNAの 5'末端にこの 5'非翻訳領域を付加することにより、該 mRNAからタンパク質 への翻訳が低温条件下で起こるようになる。このコールドショックタンパク質 mRNA由 来の 5'非翻訳領域は、その機能を保持する範囲においてその塩基配列に 1以上の 塩基の置換、欠失、挿入、付加が施されたものであってもよい。
[0019] 本明細書にぉ 、て「領域」とは核酸 (DNAまたは RNA)上のある範囲を指す。また 、本明細書に記載の「mRNAの 5'非翻訳領域」とは、 DNA力 の転写によって合成 される mRNAのうち、その 5'側に存在し、かつタンパク質をコードしていない領域を 言う。以降の本明細書においては該領域を「5，一 UTR (5，一 Untranslated Regi on)」と記載する。なお、特に断らない限り 5'— UTRは大腸菌 cspA遺伝子の mRN A、あるいはこれが改変されたものの 5'非翻訳領域をさす。
[0020] 本ベクターには上記に列記されたコールドショックタンパク質遺伝子由来の 5'— U TRをコードする領域を使用することができる力 特に大腸菌 cspA遺伝子由来のもの が好適に使用できる。さらに、低温特異的なポリペプチドの発現に寄与しうる範囲で その塩基配列を一部改変したものであってもよぐ例えば上記 (B)に示したオペレー ターの導入などによってこの領域の塩基配列が改変されたものであってもょ 、。また 、このコールドショックタンパク質遺伝子の 5，—UTRをコードする領域は（A)のプロ モーターと発現させようとするポリペプチドをコードする遺伝子の開始コドンとの間に 配置され、また、該領域上にオペレーターが導入されていてもよい。
[0021] また、上記構成要素に加えて、用いる宿主のリボソ一マル RNAのアンチダウンスト リームボックス配列と相補性を有する塩基配列を 5，非翻訳領域の下流に含有させる ことにより発現効率を上昇させることができる。例えば、大腸菌の場合、 16Sリボソ一 マル RNAの 1467— 1481の位置にアンチダウンストリームボックス配列が存在し、こ の配列と高い相補性を示す塩基配列を含有するコールドショックタンパク質の N末端 ペプチドをコードする領域を用いることができる。さらに、 目的タンパク質遺伝子の下 流に転写終結配列（ターミネータ一）が配置されたベクターはベクターの安定性が向 上し目的タンパク質の高発現に有利である。
[0022] 本ベクターは、ベクターとしての目的を達成できるものであれば一般的に用いられ るベクター、例えば、プラスミド、ファージ、ウィルスなどのいずれであってもよい。また 、本発明のベクターに含有される上記の構成要素以外の領域としては、例えば、複 製起点、選択マーカーとして使用される薬剤耐性遺伝子、オペレーターの機能に必 要な調節遺伝子、例えば、 lacオペレーターに対しては laclq遺伝子、などを有するこ とができる。また、本発明のベクターは宿主に導入された後にはそのゲノム DNA上に 組み込まれても力まわな 、。
[0023] 以下に、具体的なプラスミドベクターの構築をあげる。なお、本明細書においては 特に限らない限り、大腸菌 CspAタンパク質を「CspA」、該タンパク質の発現に関与 する遺伝子上の領域を「cspA遺伝子」、該遺伝子のプロモーター領域を「cspAプロ モーター」と記載する。また、 GeneBank遺伝子データベースに受託番号 M30139 として登録、公開されて!、る天然の cspA遺伝子の塩基配列（配列表の配列番号 1に 当該配列を示す）にお 、て、塩基番号 426が主要な (major)転写開始点（ + 1)、塩 基番号 609〜611が SD配列（リボソーム結合配列）、塩基番号 621〜623及び 832 〜834がそれぞれ CspAの開始コドン及び終止コドンである。したがって、該配列中 で 5'—UTRをコードするのは塩基番号 462〜620の部分である。また、前記の一部 改変された 5'— UTRとしては国際公開第 99Z27117号パンフレットに記載されたも のが例示される。本願実施例にお 、て使用された pCold08NC2ベクターが有して!/ヽ る 5'— UTR領域はその一例であり、その塩基配列を配列表の配列番号 2に示す。
[0024] また、 目的の遺伝子の発現効率を向上させるために、 16Sリボソ一マル RNA中に 存在するアンチダウンストリームボックス配列に高 、相補性を有する塩基配列 (ダウン ストリームボックス配列）を本ベクターに導入することができる。大腸菌 CspAの N末端 部分をコードする領域に存在するダウンストリームボックス配列は、上記のアンチダウ ンストリームボックス配列に対して 67%の相補性しか有して ヽな 、。これをより高 、相 補性、好ましくは 80%以上の相補性を有する塩基配列、特に好ましくは 100%の相 補性を有する塩基配列 (Perfect DB配列）とすることにより、その下流に接続された 遺伝子をより高い効率で発現させることが可能になる。
さらに、本ベクターは、発現された目的の遺伝子産物の精製を容易にするためのぺ プチドであるタグ配列をコードする塩基配列や、タグ配列のような目的の遺伝子産物 中の余分なペプチドの除去に利用されるプロテアーゼ認識アミノ酸配列をコードする 塩基配列を導入することができる。 精製用のタグの配列としては、数個のヒスチジン残基力もなるヒスチジンタグ (His Tag)やマルトース結合タンパク質、ダルタチオン S トランスフェラーゼなどが使用 できる。ヒスチジンタグを付加されたポリペプチドはキレーティングカラムを使用して容 易に精製することができ、他のタグ配列にっ 、てもこれらに特異的な親和性を有する リガンドを使用することにより、簡便に精製することができる。また、余分なペプチドの 除去に利用されるプロテアーゼとしては、ファクター Xa、トロンビン、ェンテロキナーゼ 等を使用することができ、本ベクターにこれらのプロテアーゼによって特異的に切断 されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を導入すればよい。
[0025] (2)シャペロンの発現の増強
本発明のポリペプチドの製造方法は、 目的とするポリペプチドをコードする遺伝子 の発現の際に、シャペロンをコードする遺伝子の発現を増強させることを特徴とする。 本発明において、シャペロンとは、タンパク質のフォールデイングに関与するタンパ ク質であればいかなるタンパク質でも構わない。例えば、大腸菌由来 DnaK、 DnaJ、 GrpE、 GroEL、 GroES、トリガーファクタ一等が挙げられる。
特に本発明を限定するものではないが、コールドショックベクターを用いたポリぺプ チドの発現においては、ポリペプチド内のプロリンの異性ィ匕に関与するタンパク、例 はトリガーファクター [Peptidyl— prolyl cis— tarans isomerase (PPIase)とも 呼ばれる]の使用が好ましい。前記のシャペロンは、大腸菌由来のものに限定されず 、例えば、古細菌、酵母、微生物、好冷菌由来などのシャペロンを利用することが出 来る。
[0026] 上記のシャペロン遺伝子の発現の増強は、染色体上のシャペロンをコードする遺伝 子の発現誘導の他、染色体上のシャペロン遺伝子の改変（コピー数の増加やプロモ 一ターの挿入）、シャペロン遺伝子の宿主への導入、宿主への変異導入によるシャ ペロン遺伝子高発現株の取得等、公知の手法により達成されうる。
染色体上のシャペロン遺伝子の発現誘導は、例えば宿主にお!、て前記シャペロン の発現が誘導される条件が知られているものであれば、当該条件を利用して実施す ることができる。染色体上のシャペロン遺伝子の改変は、宿主染色体について相同 組換えを利用した遺伝子の挿入や部位特異的変異導入の手法を使用して実施する ことができる。例えば、宿主染色体上の誘導したいシャペロンをコードする遺伝子の 上流に誘導可能なプロモーターを挿入しておき、このプロモーターを介して発現を誘 導することができる。
さらに、別の態様としては、ポリペプチドの発現に使用される宿主についてシャぺ口 ン遺伝子の発現が増強されている変異株を取得し、これを宿主として使用することが 挙げられる。変異株の取得は、公知の方法、例えば宿主微生物を薬剤や紫外線のよ うな変異原で処理した後にシャペロン遺伝子の発現が増強されている株を選抜する こと〖こよって実施できる。
ここで、シャペロンをコードする遺伝子の発現の増強とは、宿主中のシャペロンタン ノ ク質の量がその通常の量に比較して増加して 、ることを意味する。上記の操作によ りシャペロン遺伝子の発現が増強されているかどうかは、例えば当該シャペロンを認 識する抗体を利用してシャペロンタンパク質を測定するか、あるいは当該シャペロン をコードする遺伝子より転写される mRNA量を公知の方法、例えば RT— PCR法や ノーザンハイブリダィゼーシヨン、 DNAアレイを使用するハイブリダィゼーシヨン等に よって測定し、確認することができる。
目的タンパク質の発現レベルを低下させず、前記シャペロンの発現量や発現時期 を最適化するために、シャペロンの発現と目的タンパク質の発現は独立して制御でき る方が有利である。このためにはシャペロン遺伝子を制御可能なプロモーターの下 流に置くことが好ましい。さらに、シャペロンの発現に用いる制御可能なプロモーター としては、 目的タンパク質の発現に用いられるプロモーターと異なるものが好ましい。 前記のシャペロン遺伝子の発現の増強は、当該シャペロン遺伝子をベクターに揷 入して宿主に導入し、実施することもできる。ベクターには、ベクターとしての目的を 達成できるものであれば一般的に用いられるベクター、例えば、プラスミド、ファージ、 ウィルスなどの 、ずれであってもよ 、。
通常、同一宿主に近縁の 2種のプラスミドは安定に共存できない。この現象を不和 合性という。本発明において、シャペロン遺伝子を含有するベクターとしてプラスミド（ 以下シャペロンプラスミドと記載することがある）を使用する場合は、 目的タンパク質の 発現ベクターと不和合性を示さないレブリコンを有するものを使用可することが好まし い。例えば、 目的タンパク質の発現ベクターとして国際公開第 99Z27117号パンフ レットに記載の pCold07等 ColE 1レプリコンをもつものを用 、る場合、シャペロンプラ スミドには、 pACYCベクターに存在する pl5Aレプリコン等を使用することができる。
[0028] 本発明において、シャペロン遺伝子を含有するベクターによる形質転換の際に選 択が容易に行われるように、必要に応じて選択マーカー遺伝子をさらに含んでもょ ヽ 。カゝかる選択マーカー遺伝子としては、アンピシリン耐性 (Ampf)遺伝子、カナマイシ ン耐性 (Km1 遺伝子、クロラムフエ-コール耐性 (Cm1 遺伝子等が挙げられる力 外 来タンパク質発現ベクターに含まれる選択マーカー遺伝子とは異なることが望ましい
[0029] 本発明において使用するシャペロンプラスミドの具体例としては、 DnaKZDnajZ GrpEおよび GroELZGroESを発現するプラスミド pG—KJE8、 GroELZGroESを 発現するプラスミド pGro7、 DnaKZDnajZGrpEを発現するプラスミド pKJE7、 Gro EL/GroESおよびトリガーファクターを発現するプラスミド pG— Tf2、トリガーファタ ターを発現するプラスミド pTf 16 ( 、ずれもタカラバイオ社製）が挙げられる。
[0030] シャペロンをコードする遺伝子は、上記のようにベクターを使用して宿主に導入する 他、宿主染色体に組み込んで使用することもできる。
[0031] 本発明にお 、て、発現させる外来タンパク質としては、宿主内で不安定化及び Zま たは不溶ィ匕する外来タンパク質であれば、いかなるタンパク質でも構わない。かかる 外来タンパク質としては、インターフェロン、インターロイキン、インターロイキン受容体 、インターロイキン受容体拮抗物質、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファー ジコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチン、トロンボポ ェチン、白血病抑制因子、幹細胞成長因子、腫瘍壊死因子、成長ホルモン、プロイ ンスリン、インスリン様成長因子、繊維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、トラン スフォーミング成長因子、肝細胞成長因子、骨形成因子、神経成長因子、毛様体神 経栄養因子、脳由来神経栄養因子、グリア細胞由来神経栄養因子、ニューロトロフィ ン、プロゥロキナーゼ、組織プラスミノーゲンァクチべ一ター、血液凝固因子、プロテ イン c、ダルコセレブロシダーゼ、スーパーォキシドデイスムターゼ、レニン、リゾチ一 ム、 P450、プロキモシン、トリプシンインヒビター、エラスターゼインヒビター、リポコノレ チン、レブチン、免疫グロブリン、 1本鎖抗体、補体成分、血液アルブミン、スギ花粉 抗原、低酸素誘導性ストレスタンパク質、プロテインキナーゼ、プロトオンコジーン産 物、転写調節因子及びウィルス構成タンパク質があげられる。
[0032] 本発明の発現ベクターは宿主に導入されて目的タンパク質の発現に供される。上 記宿主としては特に限定されず、例えば、細菌等の原核生物、酵母、真菌、植物、昆 虫細胞、ほ乳類細胞等が挙げられるが、使用される宿主と発現ベクターの特性は適 合しなければならない。例えば、ほ乳類細胞系においてタンパク質を発現する場合、 発現ベクターは、ほ乳類細胞のゲノムから単離された、例えばマウスメタ口チォネイン プロモーター等のプロモーターや、これらの細胞で増殖するウィルスから単離された
、例えばバキュロウイノレスプロモーター、ワクシニアウイノレス 7. 5Kプロモーター等の プロモーターを用いることが好まし 、。
[0033] 上記宿主としては、なかでも大腸菌等の原核生物が好適に用いられる。グラム陰性 細菌を宿主として用いる場合、タンパク質の発現は、細胞質であっても、ペリブラズム 領域への発現であっても良い。
[0034] 本発明のシャペロンベクター及び発現ベクターを宿主に導入する方法としては特に 限定されず、公知の種々の方法を用いることができ、例えば、トランスフエクシヨンとし てリン酸カルシウム沈殿法、電気穿孔、リボソーム融合、核注入、ウィルス又はファー ジ感染等が挙げられる。本発明の発現ベクターを内包する宿主もまた、本発明の 1つ である。宿主に導入する手順としてはシャペロンベクターと発現ベクターを同時に導 入する一段階方式であっても、シャペロンベクターを導入した後に発現ベクターを導 入するまたは、発現ベクターを導入した後にシャペロンベクターを導入する二段階方 式であってもよい。共形質転換菌のスクリーニング法としては、選択マーカー遺伝子 に応じた薬剤により行うことができる。外来タンパク質の発現は、例えば、ウェスタンブ ロッテイングなどにより確認することができる。
[0035] 本発明の 1つの態様として、前記のコールドショックベクター、シャペロン遺伝子を 含有するベクターを組み合わせた、ポリペプチド発現用のベクターセットが挙げられ る。この態様において、コールドショックベクターとしては、 目的に応じて発現させるこ とが望まれるポリペプチドをコードする遺伝子を挿入可能なものが好ましぐ例えば、（ a)コールドショックタンパク質遺伝子 mRNA由来の 5'非翻訳領域をコードする DNA 、ならびに、（b)前記（a)の DN Aの下流に位置する、所望のポリペプチドをコードす る遺伝子の挿入に使用可能な制限酵素認識配列、を有するものが例示される。
[0036] さらに、本発明の別の態様として、前記のコールドショックベクターにシャペロンをコ ードする遺伝子を挿入したベクターが挙げられる。この場合、単一のベクターで宿主 を形質転換することにより、 目的のポリペプチドを発現に使用できる形質転換体が作 製できる。
この態様においては、シャペロンをコードする遺伝子と目的のポリペプチドをコード する遺伝子とがイン'フレームで結合され、シャペロンと目的のポリペプチドとの融合 タンパク質が発現されるような位置に、 目的のポリペプチドをコードする遺伝子の挿入 に使用可能な制限酵素認識配列を配してもよい。シャペロンと目的のポリペプチドと の融合タンパク質は、シャペロンが目的のポリペプチドの N末端側に連結されても、 C 末端側に連結されても、その両方に連結されてもよい。また、前記融合タンパク質は 、シャペロンと目的のポリペプチドとの間にリンカ一となるアミノ酸、又はペプチドを有 していても良い。このようなリンカ一の鎖長は、 1〜50アミノ酸である事が好ましぐ更 に好ましくは 3〜40アミノ酸であり、最も好ましくは 5〜30アミノ酸である。また、リンカ 一のアミノ酸配列は、プロテアーゼの認識配列であっても良ぐ複数のプロテアーゼ 認識配列が並列に挿入されたものであっても良 ヽ。このようなプロテアーゼ認識配列 としては、 Factor Xaゝ Thrombin, Enterokinase (いずれもタカラバィォ社製）、 P rescission Protease (アマシャムバイオサイエンス社製）と!、つた各種プロテア一 ゼの認識配列が例示される。前記のプロテアーゼの認識配列は、好適には 4〜8アミ ノ酸力 なる配列が例示される。
[0037] 前記のベクターに目的のポリペプチドをコードする遺伝子を挿入して適当な宿主に 導入する事により、 目的のポリペプチドとシャペロンとの融合ポリペプチドを取得する 事ができる。該融合ポリペプチドがプロテアーゼの認識配列を含むリンカ一を有して いる場合には、プロテアーゼ消化によってシャペロンと分離された目的のポリべプチ ドを得る事がでさる。
[0038] (3)ポリペプチドの製造方法 本発明におけるポリペプチドの製造は、例えば以下のような工程で実施される。 目的とするポリペプチドをコードする遺伝子をコールドショックベクターの、コールド ショックタンパク質遺伝子 mRNA由来の 5'非翻訳領域をコードする DNAの下流に 挿入する。こうして作製された組換え発現ベクターを適切な宿主に導入して形質転 換体を作製する。
[0039] 前記の、シャペロンをコードする遺伝子を含有するベクターを併用する場合には、さ らに該ベクターを前記の形質転換体に導入する。また、コールドショックベクターがシ ャペロンをコードする遺伝子を保持するものである場合には、当該ベクターのみで宿 主を形質転換すればよい。
[0040] 前記の形質転換体を通常の条件で培養する。例えば、大腸菌の場合には 37°C前 後で培養すればょ 、。シャペロンにつ!/、ては培養のすべての工程で宿主中に発現さ せていてもよぐまた、 目的のポリペプチドの発現と同時期に発現を誘導してもよい。 シャペロン遺伝子の発現の誘導は宿主中のシャペロン遺伝子の存在状態に応じて 行えばよぐ例えば、宿主が本来有しているシャペロン遺伝子の発現を誘導したい場 合には、それに適した条件に宿主を置けばよい。シャペロンをコードする遺伝子が異 種のプロモーターの制御下にある場合、例えばシャペロン遺伝子がベクターに挿入 されて宿主に導入されている場合には、その転写を制御しているプロモーターに適し た手段で発現の誘導が実施される。なお、定常的にシャペロン遺伝子の発現が増強 されて 、る宿主を使用する場合、前記のような誘導操作は必要ではな 、。
[0041] 目的のポリペプチドの発現の誘導は、通常、前記のように一般的な培養温度で細 胞数を増加させた後に実施される。この状態力 培養温度を低下させることによって 宿主にコールドショック応答が誘導され、この結果として目的のポリペプチドの発現が 優先的に行われるようになる。培養温度は、特に本発明を限定するものではないが、 例えば一般的な培養温度から 5°C以上、好ましくは 10°C以上低下させてコールドショ ック応答が誘導される。この際、プロモーターの下流にオペレーターを保持するコー ルドショックベクターが使用されている場合には、適切な手段で当該オペレーターの 機能を解除し、プロモーターを誘導してもよい。
前記のコールドショックの後、さらに低温で形質転換体の培養を継続し、ポリべプチ ドを発現させる。こうして得られる培養物より目的のポリペプチドを回収することにより 、該ポリペプチドを製造することができる。培養物からのポリペプチドの精製は、前記 培養物より回収された形質転換体細胞、培養液上清、もしくはその両方から実施する ことができる。ポリペプチドの精製は、硫安分画、限外ろ過、各種クロマトグラフィーな どの公知のタンパク精製手法を組み合わせて実施すればよい。
[0042] さらに、発現されたポリペプチドを適当なリガンドを介して担体に結合する形態に設 計することにより、その精製を容易にすることができる。例えば、前記ポリペプチドの N 末端側に、ヒスチジン 6残基程度のタグ付加されるようベクターを設計すると、得られ た融合ポリペプチドは、ニッケル等の金属をキレートした担体に、ヒスチジン残基を介 して結合することができる。この担体を用いれば、宿主由来のタンパク質と発現された ポリペプチドとを簡単に分離できる。担体に結合した発現されたポリペプチドは、プロ テアーゼでリンカ一を切断することにより、 目的ポリペプチドのみを簡単に担体力 遊 離させることができる。もちろん、切断することなぐ発現されたポリペプチドのまま担 体力も遊離させることも、イミダゾールで溶出すれば可能である。上記ヒスチジンタグ 以外にも、ダルタチオン一 S—トランスフェラーゼ又はその一部分をタグとし、グルタ チオン樹脂によるァフィ二ティーにより精製する方法や、マルトース結合タンパク質又 はその一部をタグとし、マルトース榭脂により精製する方法等を適用しても力まわない その他、抗体とのァフィユティーを用いても力まわない。上記の精製タグは、発現タ ンパク質の N末端側に設計しても、 C末端側に設計してもいずれであっても力ゝまわな い。これらの遺伝子操作や、ァフィユティー精製方法は、当業者には一般的に理解さ れているものである。
[0043] 前記のようにコールドショックベクターを使用したポリペプチドの発現系では、 目的 のポリペプチド以外のポリペプチドの発現は抑制されることから、本願発明の方法は 高純度のポリペプチドの製造において有利である。
実施例
[0044] 以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する力 本発明は以下の実施 例のみに限定されるものではない。 また、本明細書に記載の操作のうち、プラスミドの調製、制限酵素消化などの基本 的な操作については 2001年、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行、 J. サムブルック (J. Sambrook)ら編集、モレキュラー クローユング：ァ ラボラトリー マ 二ユアノレ第 3版 (Molecular Cloning ： A Laboratory Manual 3rd ed. )に 記載の方法によった。
[0045] 実施例 1 シャペロン共発現による hDi— ASIの発現検討
(1)発現ベクターの構築
ヒト由来 Dicerの PAZ+RNaseinドメインよりなるポリペプチド（ヒト由来 Dicer のァ ミノ酸配列の N末端側より 679〜1924番目）を発現させるため、以下のようにして発 現ベクターを構築した。
まず、 Genbank Acc. No. AB028449で公開されている塩基配列より、配列 表の配列番号 4及び 5記載の塩基配列を有する合成プライマー 5及び 6を DNA合成 機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマー 5は、制限酵素 Kpnlの認識 配列を塩基番号 9〜14に、さらにヒト由来 Dicerのアミノ酸配列（配列番号 3)のァミノ 酸番号 679〜685に相当する塩基配列を塩基番号 16〜36にもつ合成 DNAである 。また、合成プライマー 6は、制限酵素 Hindlllの認識配列を塩基番号 9〜14に、さら にヒト由来 Dicerのアミノ酸配列（配列番号 3)のアミノ酸番号 1919-1924に相当す る塩基配列を塩基番号 18〜35にもつ。
[0046] 上記合成プライマーを用いて、 PCRを行った。 PCRの反応条件を以下に示す。
すなわち、铸型 DNA (ヒト cDNAライブラリー、 Human Pancreas,タカラバイオ 社製） 2 1、 5 1の 10 X LA PCR buffer (タカラバイオ社製）、 5 μ 1の dNTP混合 液（タカラバイオ社製）、 lOpmolの合成プライマー 5、 lOpmolの合成プライマー 6、 0 . 5Uの Takam LA Taq (タカラバイオ社製）を加え、滅菌水を加えて全量を 50 1 とした。前記反応液を TaKaRa PCR Thermal Cycler SP (タカラバイオ社製） にセットし、 94°C 1分、 55°C 1分、 72°C 3分を 1サイクルとする 30サイクルの反応 を行なった。
[0047] 反応終了後、該反応液 5 μ 1を 1. 0%ァガロースゲル電気泳動に供した。確認され た目的の約 2. 7kbpの DNAフラグメントを電気泳動ゲルより回収'精製し、エタノー ル沈殿を行なった。エタノール沈殿後の回収 DNAを 5 1の滅菌水に懸濁し、制限 酵素 Kpnl (タカラバイオ社製)及び制限酵素 Hindm (タカラバイオ社製)で 2重消化 し、 1. 0%ァガロースゲル電気泳動によりその Kpnl— Hindm消化物を抽出精製し 、 Kpnl— Hindm消化 DNA断片を得た。
[0048] 次に国際公開第 99Z27117号パンフレットの記載に基づき、 Escherichia coli JM109/pMM047 (FERM BP— 6523) (平成 9年（1997年） 10月 31曰（原寄託 日）〖こ日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6 (郵便番号 305 -8566)、独 立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託）に保持されたブラ スミド PMM047を出発材料として pCold08NC2を構築した。プラスミド pCold08Nc 2は、上流側より順番に cspAプロモーター、 lacオペレーター、改変された大腸菌 csp A遺伝子由来 5'—UTR、マルチクローユングサイトを有するプラスミドである。また、 当該プラスミドは、 lacl遺伝子、大腸菌 16Sリボソ一マル RNA中に存在するアンチダ ゥンストリーム配列に完全に相補的なダウンストリームボックス配列、 6個のヒスチジン 残基力 なるヒスチジンタグおよびファクター Xaの認識するアミノ酸配列をコードする 塩基配列、をそれぞれ有している。 pCold08NC2ベクターが有している 5'— UTR 領域の塩基配列を配列表の配列番号 2に示す。
[0049] この pCold08NC2ベクターを上記 KpnI—Hindm消化DNA断片を調製した時に 用いたのと同じ制限酵素で切断し、末端を脱リン酸処理したものを調製し、上記 Kpn I— Hindlll消化 DNA断片と混合し、 DNAライゲーシヨンキット (タカラバイオ社製)を 用いて連結した。その後、ライゲーシヨン反応液 20 1を用いて大腸菌 JM109を形質 転換し、その形質転換体を 1. 5% (wZv)濃度の寒天を含む LB培地 (アンピシリン 5 0 μ gZml含む）上で生育させた。
[0050] 目的の DNA断片が挿入されたプラスミドは、シークェンシングすることにより確認し 、この組み換えプラスミドを pCold08 hDi— ASIとした。当該プラスミドは、 plasmid pCold08 hDi— ASIと命名、表示され、平成 15年 9月 26日（原寄託日）より独立 行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター (日本国茨城県つくば巿東 1 丁目 1番地 1中央第 6 (郵便番号 305— 8566) )に FERM BP— 10076として寄託 されている。この pCold08 hDi— ASIは、ヒト由来 Dicer アミノ酸配列（配列番号 3) のアミノ酸番号 679〜1924のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列表の配列番 号 6記載の塩基配列、配列番号 7記載のアミノ酸配列）を含むプラスミドである。前記 プラスミドから発現させたタンパク質は、 Perfect DB配列、 His tag配列、並びに F actor Xa配列を有している。当該タンパク質のアミノ酸配列を配列表の配列番号 8 に、塩基配列を配列表の配列番号 9に示す。
[0051] (2)共形質転換体の調製
GroELおよび GroESを発現する pGro7、 DnaKおよび DnaJならびに GrpEを発現 する pKJE7, GroELおよび GroESならびにトリガーファクターを発現する pG—Tf 2 、トリガーファクターを発現する pTF 16 (V、ずれもタカラバイオ社製)それぞれのシャ ペロンプラスミド各 lngと、上記のプラスミド pCold08ZhDi— ASI各 lngとを用いて、 大腸菌 BL21を形質転換した。なお、形質転換は塩ィ匕カルシウム法により行った。
[0052] pGro7、 pKJE7, pG— Tf2、 pTF16のそれぞれと pCold08ZhDi— ASIを保持 する共形質転換体は、クロラムフエ-コールおよびアンピシリンをそれぞれ 20 gZ mlおよび 100 gZmlの濃度で含むプレートを用いてスクリーニングすることにより得 た。得られた各シャペロンと hDi—ASIとを共発現するクローンをそれぞれ Tl, T2、 Τ3, Τ4と命名した。
[0053] また対照として、 pCold08ZhDi— ASIのみを用いて大腸菌 BL21 (Novagen社 製)を形質転換し、アンピシリン 100ug/mlの濃度で含むプレートを用いてスクリー ユングすることにより得た形質転換体を作製した。このシャペロンを導入しな 、従来の 発現系のクローンを C1と命名した。
[0054] (3) hDi— ASIの発現
(1)で得られた各形質転換体を用いて、 hDi— ASIの発現を調べた。培養には、 5 mlの LB液体培地（組成： 1%バタトトリプトン、 0. 5%酵母エキス、 0. 5%NaCl、 20 g/mlクロラムフエ-コール、 50 g/mlアンピシリン）を使用した。ただし、対照で ある C 1の培養にはクロラムフエ-コールを含まな!/、培地を用 、た。
[0055] 各形質転換体は 37°Cで培養した。培養開始する際に、 Tl, T2, T4の培地には L —ァラビノース（終濃度 0. 5mg/ml)を添加し、また T3の培地にはテトラサイクリン（ 終濃度 5ngZml)を添加してシャペロンを発現誘導した。濁度が OD600 = 0. 4程度 に達した時点で、 15°Cで 15分間培養後、培養液に終濃度 0. 5mMの IPTGをカロえ 、更に 15°Cで 24時間培養を行うことで hDi— ASIの発現を誘導した。
[0056] hDi— ASIの発現誘導を 24時間行ったのち、菌体を回収した。得られた菌体を超 音波破砕し、細胞抽出液画分を調製、ついで 15、 000 X gの遠心分離により可溶性 画分と不溶性画分に分けた。それぞれの画分について、約 3. 75 X 106個の菌数分 を SDS— PAGEに供した。 CBB染色（A)、あるいは抗 Hisタグ抗体（QIAGEN社製 )を用いたウェスタンブロッテイングにより解析した結果 (B)を図 1に示す。
[0057] 図 1に示したように従来の発現系である対照の C1では、細胞抽出液画分に分子量 144000の目的タンパク質が確認された力 可溶性画分にはほとんど検出されなか つた。一方で、 T4にみられるように hDi— ASIとトリガーファクターを共発現した場合 には、対照と比較して hDi— ASIの細胞抽出液画分が増加していることが観察された 。さらに、その大部分が可溶性画分に検出された。 hDi— ASIと他のシャペロンとの 共発現を行った Tl, T2, T3では、可溶性画分にはほとんど検出されな力つた。
[0058] 以上のように、シャペロンを導入しない従来の発現系、あるいは GroELおよび Gro ES、 DnaKおよび DnaJならびに GrpE, GroELおよび GroESならびにトリガーファタ ターを発現するシャペロン共発現に比べ、トリガーファクターとの共発現により hDi— ASIの発現量、可溶性度の増大効果が得られることが示された。
[0059] (4)発現、精製
上記（2)で調製した pCold08 hDi— ASIと pTf 16を用いて、大腸菌 BL21を形質 転換し、その形質転換体を 1. 5% (wZv)濃度の寒天を含む LB培地 (アンピシリン 5 0 μ gZml含む）上で生育させた。生育したコロニーを 500mlの TB液体培地（バタトト リプトン 6g、ノ ク卜一イースト エキス 12g、グリセローノレ 2ml、 17mM KH PO、 7
2 4
2mM K HPO、アンピシリン 25mg) 2本に植菌した。植菌後にァラビノースを終濃
2 4
度 0. 5mg/mlになるように添カ卩し、 37°C、 130rpmの条件で対数増殖期まで培養 し、その後 15°Cに冷却した。冷却後に IPTGを終濃度 1. OmMになるように添加し、 130rpm、 15°Cの条件で 24時間培養して発現誘導させた。その後菌体を遠心分離 により集め、 3. 3gの湿菌体を得た。湿菌体 3. 3gを 13. 16mlの binding buffer [5 OmM トリス—塩酸緩衝液（pH8. 5)、 lOOmM 塩化ナトリウム、 ImM塩化マグネ シゥム、プロテアーゼインヒビター（Complete, EDTA— free、ベーリンガーマンハイ ム社製) ]に再懸濁した。超音波破砕により菌体を破砕し、遠心分離（12, OOOrpm 20分)により上清の抽出液と沈殿とに分離した。
上記上清の抽出液 約 13mlを用いてさらにニッケルカラムによる精製を以下のよう に行なった。
すなわち、榭脂容積にして 10ml分の Ni— NTA agarose (キアゲン社製）を φ 50 mmのカラムに充填し蒸留水 30mlで洗浄した。その後 binding buffer 100mlで 洗浄し、榭脂を回収した。上記の菌体破砕液より調製した約 13mlの上清を添加し、 4°Cで約 1時間、ロータリーシエイカーで穏やかに混和した。その後、この目的タンパ ク質の吸着した榭脂を Φ 50mmのカラムに充填し、 50mlの binding bufferで 2回 洗浄した。次に 50mlの bufferA[20mM トリス—塩酸緩衝液（pH8. 5)、 lOOmM 塩化ナトリウム、 ImM 塩化マグネシウム、 10% グリセロール、 20mM イミダゾ ール]で榭脂を洗浄後、 50mlの bufferB[20mM トリス—塩酸緩衝液（pH8. 5)、 8 OOmM 塩化ナトリウム、 ImM 塩化マグネシウム、 10% グリセロール、 20mM ィ ミダゾール]、続いて 50mlの bufferAで洗浄を行い目的以外の不要タンパク質の除 去を行った。
洗浄後、 30mlの bufferC[20mM トリス—塩酸緩衝液（pH8. 5)、 lOOmM 塩 ィ匕ナトリウム、 ImM 塩化マグネシウム、 10% グリセロール、 lOOmM イミダゾール ]で溶出操作を行った。溶出サンプルについて Centricon YM— 10 (アミコン社製） を用いて濃縮を行ない、 10mlのbufferD[50mM トリス—塩酸緩衝液（pH8. 5)、 250mM 塩ィ匕ナトリウム、 ImM 塩ィ匕マグネシウム、 0. ImM DTT、 0. 1% Tri ton X— 100、 10% グリセロール]を加え濃縮を行った。この操作を 2回繰り返した 。次に、 500mlの bufferE[50mM トリスー塩酸緩衝液（pH8. 5)、 250mM 塩ィ匕 ナトリウム、 ImM 塩化マグネシウム、 0. ImM DTT、 0. 1% Triton X— 100、 50% グリセロール]に対して透析を行な!/、、約 220 μ 1のタンパク質サンプルを得た 。その一部について 10%SDSポリアクリルアミド電気泳動に供したところ、分子量約 144, 000の位置に目的タンパク質のバンドが確認され、これを以下の活性の確認に 使用した。 [0060] (5) dsRNA分解活性の測定
(4)で調製したタンパク質サンプルについて、 dsRNA分解活性を測定した。活性 測定は以下のようにして行った。
先ず、活性測定に用いた基質となる dsRNAを、 TurboScript T7 Transcriptio n kit (GTS社製）を用いて、その添付プロトコールに従って合成した。
すなわち、プラスミド PQBI1125 (和光純薬社製）に挿入されている Red— shift G reen Fluorescent Protein (以下 GFPと略称する）をコードする遺伝子（配列表の 配列番号 10にその塩基配列を示す)をプラスミド pDON— AI (タカラバイオ社製）に 挿入した pDON—rsGFPを铸型とし、配列表の配列番号 11記載の T7プロモーター 配列をもった合成プライマー 3と配列表の配列番号 12記載の合成プライマー 4を用 いて PCRを行い、増幅産物を得た。次に得られた 2本鎖 DNAを铸型として、 T7 R NA polymeraseによる RNA合成反応により約 700bpの長さの dsRNAを調製した 。上記方法で調製した dsRNA l ^ g,上記（3)で調製したタンパク質サンプル 1 μ 1、 5 Χ反応緩衝液（lOOmM トリス—塩酸緩衝液 (pH8. 5)、 750mM 塩ィ匕ナトリウ ム、 12. 5mM 塩化マグネシウム） 2 1、これに nuclease free水をカ卩えて、全量 を 10 1としたものを反応液とした。 37°Cで 18時間反応後、反応液の 10 1を 15% ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、泳動後のゲルをェチジゥムブロマイドで染色 して切断産物の確認を行なった。その結果、約 21塩基対の分解産物が確認され、 ds RNA分解活性が確認された。
以上のように、本発明の方法によって dsRNA分解活性を保持したタンパク質が発 現されることが示された。
[0061] 実施例 2 RTase αおよび RTase j8の発現検討
下記の操作により、 目的タンパク質単独での発現、 目的タンパク質とトリガーファクタ 一の共発現、 目的タンパクとトリガーファクターとの融合タンパク質の発現の比較を行 つた。また、融合タンパク質の発現に関しては、発現システムとして、コールドショック ベクターを使用する系（コールドショック発現系）、 T7プロモーターと T7RNAポリメラ 一ゼとを組み合わせた発現系（T7プロモーター発現系）の 2通りを用いた。
(1)プラスミドベクターの構築 大腸菌由来のトリガーファクター遺伝子配列（Genbank Acc. No. NC— 0009 13、 454357番目〜 455655番目）より、配列表の配列番号 13及び 14記載の塩基 配列を有する合成プライマー TFN及び TFCPを DNA合成機で合成し、常法により 精製した。
上記合成プライマー TFNは、大腸菌由来トリガーファクターのアミノ酸配列の N末 端より 1〜9番目のアミノ酸をコードする塩基配列を持ち、さらに塩基番号 4〜9に制 限酵素 Ndelの認識配列を持つ合成 DNAである。また、合成プライマー TFCPは、 大腸菌由来トリガーファクターのアミノ酸配列の C末端より 1〜9番目のアミノ酸をコー ドする塩基配列に相補的な塩基配列、プロテアーゼ Factor Xaの認識配列をコード する塩基配列に相補的な塩基配列、制限酵素 EcoRIの認識配列、制限酵素 BamH Iの認識配列、及び制限酵素 Hindlllの認識配列を持つ合成 DNAである。次に、大 腸菌 HB101 (タカラバイオ社製)より、 PCRの铸型となるゲノム DNAを抽出した。
[0062] その後、上記合成プライマー及びゲノム DNAを用いて、 PCRを行った。 PCR反応 条件を以下に示す。すなわち、上記で調製した铸型 DNA1 1、 10 1の lO X Pyro best buffer II (タカラバイオ社製）、 8 μ 1の dNTP混合液（タカラバイオ社製）、 10 Opmolの合成プライマー TFN、 lOOpmolの合成プライマー TFCP、 2. 5Uの Pyrob est DNA Polymerase (タカラバイオ社製）を加え、滅菌水を加えて全量を 100 1 とした。前記反応液を PCR Thermal Cycler SP (タカラバイオ社製）にセットし、 9 4°C30秒、 59°C30秒、 72°C2分を 1サイクルとする 30サイクルの反応を行なった。
[0063] 反応終了後、該反応液 100 μ 1を 1%ァガロースゲル電気泳動に供した。確認され た目的の約 1. 5kbpの DNAフラグメントを電気泳動ゲルより回収'精製し、エタノー ル沈殿を行なった。エタノール沈殿後の回収 DNAを 15 1の滅菌水に懸濁し、制限 酵素 Ndel (タカラバイオ社製)及び制限酵素 Hindlll (タカラバイオ社製)で 2重消化 し、 1%ァガロースゲル電気泳動によりその Ndel— Hindlll消化物を抽出精製し、 N del— Hindlll消化 DNA断片を得た。
[0064] 次にプラスミドベクター pColdll (タカラバイオ社製）を制限酵素 Ndel、 Hindlllで二 重消化し、さらに末端を脱リン酸処理したものを調製し、上記 Ndel— Hindlll消化 D NA断片と混合し、 DNAライゲーシヨンキット (タカラバイオ社製)を用いて連結した。 その後、ライゲーシヨン反応液 10 1を用いて大腸菌 JM109を形質転換し、その形 質転換体を 1. 5% (wZv)濃度の寒天を含む LB培地 (アンピシリン 100 gZmlを 含む）上で生育させた。 目的の DNA断片が挿入されたプラスミドは、シークェンシン グにより確認した。続いて、得られたプラスミドのトリガーファクター遺伝子配列中の制 限酵素 EcoRI認識配列（Genbank Acc. No. NC— 000913、 455107番目〜 4 55112番目）を消失させる為、該部位にサイレント変異を導入した。こうして得られた コールドショック発現系を持ち、大腸菌由来トリガーファクター遺伝子配列を含む組 換えプラスミドを pColdTFと命名した。
[0065] また、 T7プロモーター発現系によって目的タンパク質と大腸菌由来トリガーファクタ 一との融合タンパク質を発現させる為のプラスミドベクターについても、以下のように 作製した。
[0066] まず、 pColdTFを制限酵素 EcoRI (タカラバイオ社製)及び制限酵素 EcoO109I ( タカラバィォ社製)で 2重消化し、さらに末端を脱リン酸処理したものを調製し、 EcoR I— EcoO109I消化 DNA断片を得た。次に、 pCold08NC2を制限酵素 EcoRI及び 制限酵素 EcoO109Iで 2重消化し、 1%ァガロースゲル電気泳動によりその EcoRI — EcoO109I消化物を抽出精製し、上記 EcoRI— EcoO109I消化DNA断片と混 合し、 DNAライゲーシヨンキット (タカラバイオ社製)を用いて連結した。その後、ライ ゲーシヨン反応液 10 1を用いて大腸菌 JM109を形質転換し、その形質転換体を 1 . 5% (w/v)濃度の寒天を含む LB培地（アンピシリン 100 μ gZmlを含む）上で生 育させた。こうして得られた pColdTFのマルチクローユングサイトを改変した組換えプ ラスミドを pColdTF— IIと命名した。
[0067] さらに、 pColdTF— IIを制限酵素 Xbal (タカラバイオ社製）で消化し、 T4 DNA Polymerase (タカラバイオ社製）により平滑末端ィ匕した後、制限酵素 Ndelで消化し 、大腸菌由来トリガーファクター遺伝子を含む Ndel -平滑末端断片を得た。
[0068] 次に、プラスミドベクター pETl 6b (Novagen社製）を制限酵素 BamHI (タカラバイ ォ社製)で消化し、 T4 DNA Polymeraseにより平滑末端ィ匕した。さらに、制限酵 素 Ndelで消化後、末端を脱リン酸処理したものを調製し、上記大腸菌由来トリガーフ アクター遺伝子を含む Ndel—平滑末端断片 DNA断片と混合し、 DNAライゲーショ ンキットを用いて連結した。その後、ライゲーシヨン反応液 10 1を用いて大腸菌 JM1 09を形質転換し、その形質転換体を 1. 5% (wZv)濃度の寒天を含む LB培地 (アン ピシリン 100 μ g/mlを含む）上で生育させた。こうして得られた T7プロモーター発現 系を持ち、大腸菌由来トリガーファクター遺伝子配列を含む組換えプラスミドを pETT Fと命名した。
[0069] (2) RTase aおよび RTase β発現ベクターの構築
ラウス関連ウィルス 2 (Rous associated virus 2、 RAV— 2)由来の逆転写酵素 αサブユニット（以下、 RAV— 2 RTase α )のアミノ酸配列（Genbank Acc. No . BAA22090のうち、 N末端より 1〜572番目のアミノ酸）をもとに、コードされるァミノ 酸配列を変化させる事なく大腸菌のコドン使用頻度にあわせて塩基配列を変更し、 さらに制限酵素 EcoRIの認識配列及び制限酵素 Xbalの認識配列をそれぞれ前記 配列の両端に持つよう設計した配列 (配列表の配列番号 15)を持った二本鎖 DNA を合成した。
[0070] また、ラウス関連ウィルス 2 (Rous associated virus 2、 RAV— 2)由来の逆転 写酵素 /3サブユニット（以下、 RAV— 2 RTase β )のアミノ酸配列（Genbank Acc . No. BAA22090)をもとに、コードされるアミノ酸配列を変化させる事なく大腸菌 のコドン使用頻度にあわせて塩基配列を変更し、さらに制限酵素 EcoRIの認識配列 及び制限酵素 Xbalの認識配列をそれぞれ前記配列の両端に持つよう設計した配列 (配列表の配列番号 16)を持った二本鎖 DNAを合成した。
[0071] 次に、制限酵素 EcoRI (タカラバイオ社製） ,および Xbal (タカラバイオ社製)を用い て、上記 2種類の合成二本鎖 DNAをそれぞれ二重消化し、 1 %ァガロースゲル電気 泳動に供した。確認された目的のサイズの DNA断片を電気泳動ゲルより回収 '精製 し、 RAV— 2 RTase aをコードする遺伝子を含む EcoRI— Xbal消化 DNA断片、 及び RAV— 2 RTase βをコードする遺伝子を含む EcoRI— Xbal消化 DNA断片 を得た。
[0072] 続、て、（1)で調製した pColdTFを制限酵素 EcoRI、 Xbalで二重消化し、さらに 末端を脱リン酸処理したものを調製し、上記 2種類の EcoRI— Xbal消化 DNA断片と それぞれ混合した後、 DNAライゲーシヨンキット (タカラバイオ社製)を用いて連結し た。その後、ライゲーシヨン反応液 10 1を用いて大腸菌 JM109を形質転換し、その 形質転換体を 1. 5% (w/v)濃度の寒天を含む LB培地 (アンピシリン 100 μ g/ml 含む）上で生育させた。これらのトリガーファクターと RAV— 2 RTase aとの融合蛋 白質、及びトリガーファクターと RAV— 2 RTase βとの融合蛋白質をコールドショッ ク発現系で発現するプラスミドをそれぞれ pColdTF— a、 pColdTF - βと命名した
[0073] また、 RAV—2 RTase αを単独で発現するプラスミド、及び RAV— 2 RTase β を単独で発現するプラスミドにつ 、て、 pColdTFに換えて実施例 1で構築した pCold 08Nc2を用いる点以外は、それぞれ pColdTF— a、 pColdTF— βと同様の方法で 調製した。調製したプラスミドは、それぞれ pCold08— a、 pCold08 - βと命名した
[0074] 一方、トリガーファクターと RAV— 2 RTase aとの融合蛋白質、及びトリガーファタ ターと RAV— 2 RTase βとの融合蛋白質を Τ7プロモーター発現系で発現するプラ スミドについては、以下のように作製した。
[0075] 前記の pColdTF— aおよび pColdTF— βを制限酵素 Xbal (タカラバイオ社製）で 消化し、 T4 DNA Polymerase (タカラバイオ社製）により平滑末端ィ匕した。さらに 、制限酵素 EcoRIで消化し、 1 %ァガロースゲル電気泳動に供した。確認された目的 のサイズの DNA断片を電気泳動ゲルより回収 ·精製し、 RAV- 2 RTase αをコー ドする遺伝子を含む EcoRI 平滑末端 DNA断片、及び RAV— 2 RTase βをコー ドする遺伝子を含む EcoRI -平滑末端 DNA断片を得た。
[0076] 次に、 ( 1)で調製した pETTFを制限酵素 Sail (タカラバイオ社製)で消化し、 T4
DNA Polymeraseにより平滑末端ィ匕した。さらに、制限酵素 EcoRIで消化後、末端 を脱リン酸処理したものを調製し、上記 2種類の EcoRI 平滑末端 DNA断片と混合 し、 DNAライゲーシヨンキットを用いて連結した。その後、ライゲーシヨン反応液 10 1 を用いて大腸菌 JM109を形質転換し、その形質転換体を 1. 5% (wZv)濃度の寒 天を含む LB培地（アンピシリン 100 μ g/mlを含む）上で生育させた。これらのトリガ 一ファクターと RAV— 2 RTase aとの融合蛋白質、及びトリガーファクターと RAV 2 RTase βとの融合蛋白質を Τ7プロモーター発現系で発現するプラスミドをそれ ぞれ pETTF— a、 pETTF - βと命名した。
[0077] (3)形質転換体の調製
トリガーファクターと RAV— 2 RTase aの融合蛋白質をコールドショック発現系で 発現する pColdTF— αを用いて、大腸菌 BL21を形質転換した。なお、形質転換は 塩ィ匕カルシウム法により行った。形質転換体は、アンピシリンを 100 gZmlの濃度 で含むプレートを用いてスクリーニングすることにより得た。
[0078] また、トリガーファクターと RAV— 2 RTase βの融合蛋白質をコールドショック発現 系で発現する pColdTF— |8で大腸菌 BL21を形質転換した形質転換体も、同様の 方法で調製した。
上記の融合発現系の比較例として、 RAV- 2 RTase a、 RAV— 2 RTase βを 単独発現系で発現する形質転換体、 RAV- 2 RTase aとトリガーファクターとの共 発現系で発現する形質転換体、 RAV- 2 RTase βとトリガーファクターとの共発現 系で発現する形質転換体、トリガーファクターと RAV— 2 RTase αとの融合蛋白質 を Τ7プロモーター発現系で発現する形質転換体、及びトリガーファクターと RAV— 2
RTase βとの融合蛋白質を Τ7プロモーター発現系で発現する形質転換体につい ても調製した。
[0079] 単独発現系で発現する形質転換体は、プラスミド pCold08 - a、および pCold08
- βを用いて BL21を形質転換する点以外は、前記の融合蛋白質をコールドショック 発現系で発現する形質転換体の調製方法と同様の方法で得た。
[0080] 共発現系で発現する形質転換体の調製は以下の方法により行った。まず、プラスミ ド pCold08— αおよび pCold08— βのそれぞれと、プラスミド pTf 16とを用いて大腸 菌 BL21を形質転換した。なお、形質転換は塩ィ匕カルシウム法により行った。次に、 p Cold08— αおよび pCold08— βのそれぞれと、プラスミド pTf 16とを保持する共形 質転換体は、クロラムフエ-コールおよびアンピシリンをそれぞれ 100 μ gZmlおよび 20 μ gZmlの濃度で含むプレートを用いてスクリーニングする事により得た。
[0081] 融合蛋白質を T7プロモーター発現系で発現する形質転換体は、プラスミド pETTF
- a、および pETTF— βを用いる点、および BL21 (DE3) (Novagen社製）を形質 転換する点以外は、前記の融合蛋白質をコールドショック発現系で発現する形質転 換体の調製方法と同様の方法で得た。
(4) RTase aおよび RTase βの発現
(3)で得られた各形質転換体を用いて、 RTase aおよび RTase βの発現を調べた。 コールドショック発現系で融合蛋白質を発現する形質転換体、および単独発現系の 形質転換体の培養には、 5mlの LB液体培地（50 μ g/mlアンピシリンを含む）を用 いた。また、共発現系の形質転換体の培養には、 5mlの LB液体培地（50 gZmlァ ンピシリン、 20 g/mlクロラムフエ-コール、 0. 5mg/mlのァラビノースを含む）を 用いた。それぞれの形質転換体は 37°Cで培養し、濁度が OD600 = 0. 4程度に達 した時点で 15°C、 15分間培養後、培養液に終濃度 ImMの IPTGをカ卩え、更に 15 °Cで 24時間培養を行うことで発現を誘導した。発現誘導を 24時間行ったのち、菌体 を回収した。
[0082] また、 T7プロモーター発現系で融合蛋白質を発現する形質転換体の培養には、 5m 1の LB液体培地（50 μ gZmlアンピシリンを含む）を用い、形質転換体は 37°Cで培 養した後、濁度が OD600 = 0. 4程度に達した時点で培養液に終濃度 ImMの IPT Gを加え、更に 37°Cで 3時間培養を行うことで発現を誘導した。発現誘導を 3時間行 つたのち、菌体を回収した。
[0083] 上記により得られた各菌体を PBSで懸濁、超音波破砕し、細胞抽出液画分を調製 、ついで 15、 000 X gの遠心分離により可溶性画分と不溶性画分に分けた。それぞ れの画分について、約 3. 75 X 106個の菌体分を SDS— PAGEに供した。 CBB染 色により解析した結果を図 2に示した。
[0084] 図 2に示したように、 pCold08— a又は pCold08— で目的蛋白質を単独発現さ せた場合 (Α)、および pCold08— aと pTf 16又は pCold08— βと pTfl6を用いて 目的タンパク質とトリガーファクターを共発現させた場合 (B)には、細胞抽出液画分 に RAV— 2 RTase a、 RAV— 2 RTase βそれぞれの分子量 63000Da、 98000 Daに対応する発現産物が確認されたが、可溶性画分にはほとんど検出されなかつ た。また、 pETTF— a又は pETTF— βを用いて目的タンパク質とトリガーファクター との融合蛋白質を Τ7プロモーター発現系で発現した場合 (C)には、細胞抽出液画 分に検出された目的タンパク質の大部分が不溶性画分に検出された。一方、 pCold TF— a又は pColdTF— |8を用いて目的タンパク質とトリガーファクターを融合発現 した場合 (D)には、細胞抽出液画分に検出された目的タンパク質の大部分を可溶性 画分に検出することができた。
[0085] 実施例 3 DNaseの発現
(1) DNase発現ベクターの構築
DNaseを単独で発現するプラスミドとして、 pCold08— Endl (FERM BP— 103 13) (平成 17年 2月 16日（原寄託日）に日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央 第 6 (郵便番号 305— 8566)、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セ ンターに寄託）を用いた。当該プラスミドは、 254アミノ酸残基力もなる DNaseをコード する塩基配列を含み、該 DNaseに His— Tag、 Factor Xa認識配列、並びにリンカ 一配列が付加された 271アミノ酸残基の融合タンパク質が発現されるように構築され ている。
[0086] 次に、トリガーファクターと DNaseとの融合タンパク質を発現するプラスミドの構築を 以下のように行った。
まず、上記 pCold08— Endlの塩基配列より、配列表の配列番号 17及び 18記載 の塩基配列を有する合成プライマー NUCN及び NUCCを DNA合成機で合成し、 常法により精製した。合成プライマー NUCNは、 DNaseの N末端より 1〜7番目のァ ミノ酸をコードする塩基配列を持ち、さらに塩基番号 4〜9に制限酵素 EcoRIの認識 配列を持つ合成 DNAである。また、合成プライマー NUCCは、 DNaseの N末端より 247〜254番目のアミノ酸をコードする塩基配列に相補的な塩基配列を持ち、さらに 塩基番号 4〜9に制限酵素 BamHIの認識配列を持つ合成 DNAである。
[0087] 次に、上記合成プライマーを用いて、 PCRを行った。 PCR反応条件を以下に示す 。すなわち、铸型 DNA(pCold08— Endl) l 1、 10 1の lO X Pyrobest buffer II (タカラバィォ社製）、 8 1の dNTP混合液 (タカラバイオ社製）、 lOOpmolの合成 プライマー NUCN、 lOOpmolの合成プライマー NUCC、 2. 5Uの Pyrobest DNA
Polymerase (タカラバイオ社製）をカ卩え、滅菌水をカ卩えて全量を 100 1とした。前 記反応液を PCR Thermal Cycler SP (タカラバイオ社製）にセットし、 94°C30秒 、 58°C30秒、 72°C1分を 1サイクルとする 30サイクルの反応を行った。 [0088] 反応終了後、該反応液 100 μ 1を 1%ァガロースゲル電気泳動に供した。確認され た目的の約 0. 8kbpの DNAフラグメントを電気泳動ゲルより回収'精製し、エタノー ル沈殿を行なった。エタノール沈殿後の回収 DNAを 15 1の滅菌水に懸濁し、制限 酵素 EcoRI (タカラバイオ社製)及び制限酵素 BamHI (タカラバイオ社製)で 2重消 化し、 1 %ァガロースゲル電気泳動によりその EcoRI - BamHI消化物を抽出精製し 、 EcoRI— BamHI消化 DNA断片を得た。
[0089] 次に、実施例 2 (2)で調製した pColdTFを制限酵素 EcoRI、 BamHIで二重消化し 、さらに末端を脱リン酸処理したものを調製し、上記 2種類の EcoRI— BamHI消化 D NA断片とそれぞれ混合した後、 DNAライゲーシヨンキット (タカラバイオ社製)を用 いて連結した。その後、ライゲーシヨン反応液 10 1を用いて大腸菌 JM109を形質転 換し、その形質転換体を 1. 5% (wZv)濃度の寒天を含む LB培地（アンピシリン 100 μ g/mlを含む)上で生育させた。 目的の DNA断片が挿入されたプラスミドを調製し た。トリガーファクターと DNaseとの融合タンパク質を発現するプラスミドを pColdTF — End 1と命名した。
[0090] (2)形質転換体の調製
トリガーファクターと DNaseの融合蛋白質を発現する pColdTF—Endlを用いて、 大腸菌 BL21を形質転換した。なお、形質転換は塩ィ匕カルシウム法により行った。形 質転換体は、アンピシリンを 100 g/mlの濃度で含むプレートを用いてスクリーニン グすることにより得た。
[0091] また、上記の融合発現系の比較例として、 DNaseを単独発現系で発現する形質転 換体、 DNaseとトリガーファクターとの共発現系で発現する形質転換体にっ 、ても調 製した。
[0092] 単独発現系で発現する形質転換体は、プラスミド pCold08— Endlを用いて BL21 を形質転換する点以外は、前記の形質転換体の調製方法と同様の方法で得た。 共発現系で発現する形質転換体の調製は以下の方法により行った。まず、プラスミ ド pCold08— Endlと、プラスミド pTfl6とを用いて大腸菌 BL21を形質転換した。な お、形質転換は塩ィ匕カルシウム法により行った。次に、 pCold08— Endlと、プラスミ ド pTfl6とを保持する共形質転換体は、クロラムフエ-コールおよびアンピシリンをそ れぞれ 100 gZmlおよび 20 gZmlの濃度で含むプレートを用いてスクリーニン グする事により得た。
[0093] (3) DNaseの発現
(2)で得られた各形質転換体を用いて、 DNaseの発現を調べた。融合発現系およ び単独発現系の形質転換体の培養には、 5mlの LB液体培地（50 gZmlアンピシ リンを含む）を用いた。また、共発現系の形質転換体の培養には、 5mlの LB液体培 地（50 μ g/mlアンピシリン、 20 μ g/mlクロラムフエ-コール、 0. 5mg/mlのァラ ビノースを含む）を用いた。それぞれの形質転換体は 37°Cで培養し、濁度が OD600 =0. 8程度に達した時点で 15°C、 15分間培養後、培養液に終濃度 ImMの IPTG を加え、更に 15°Cで 24時間培養を行うことで発現を誘導した。発現誘導を 24時間行 つたのち、菌体を回収した。得られた菌体を PBSで懸濁、超音波破砕し、細胞抽出 液画分を調製、ついで 15、 000 X gの遠心分離により可溶性画分と不溶性画分に分 けた。それぞれの画分の 0. 05OD分（OD600)について SDS— PAGE (5— 20% ゲル）に供した。 CBB染色により解析した結果を図 3に示した。
[0094] 図 3に示したように、 pCold08— Endlを用いて、目的蛋白質を単独発現させた場 合 (A)、および pCold08— Endlと pTf 16を用いて目的タンパク質とトリガーファクタ 一を共発現させた場合 (B)には、可溶性画分および不溶性画分に発現産物である 分子量 31000Daの DNaseに対応する明確なバンドは、 CBB染色レベルでは検出 されなかった。一方、 pColdTF— Endlを用いて DNaseとトリガーファクターを融合 発現した場合 (C)には、目的タンパク質に由来するバンドを可溶性画分に検出する ことができた。
[0095] (4) DNase活性の測定
(3)で調製した融合発現系の超音波破砕可溶性画分につ!ヽて、 DNase活性を測 定した。対照として、インサートを導入していない pColdTFベクターのみを用いて形 質転換した大腸菌の超音波破砕可溶性画分にっ 、ても取得し、同時に活性測定を 行った。対照の超音波破砕可溶性画分は、 pColdTFを用いる点以外は、前記（2)、 (3)と同様の方法で得た。
活性測定にはえ一 Hindlll digest (タカラバイオ社製)を基質として用いた。 λ— Hindlll digest 1 g、超音波破砕可溶'性画分 0. 025OD分（OD600)、 10 X反 応緩衝液 (400mM トリス—塩酸緩衝液 (pH7. 5)、 lOOmM 塩化ナトリウム、 60m M 塩化マグネシウム、 10mM 塩化カルシウム） 5 1、これに nuclease free水を カロえて、全量を 50 1としたものを反応液とし、 20°Cで 2時間反応後、反応液の 10 1 を 1%ァガロースゲル電気泳動に供し、切断産物の解析を行った。結果を図 4に示す 図 4より、対照の超音波破砕可溶性画分を用いた場合 (レーン 1)は基質の分解が ほとんど確認できないのに対し、 DNaseとトリガーファクターの融合発現系の超音波 破砕可溶性画分を用いた場合 (レーン 2)は基質が分解され、 DNaseの活性が確認 された。
[0096] 実施例 4 hDi— PAZの発現検討
(1)発現ベクターの構築
ヒト由来 Dicerの PAZドメイン（ヒト由来 Dicerのアミノ酸配列の N末端側より 895〜1 064番目 )を含むポリペプチド（ヒト由来 Dicerのアミノ酸配列の N末端側より 892〜1 064番目、以下 PAZと称する事がある）を発現させるため、以下のようにして発現べク ターを構築した。
まず、 Genbank Acc. No. AB028449で公開されている塩基配列より、配列 表の配列番号 19及び 20記載の塩基配列を有する合成プライマー 1及び 2を DNA 合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマー 1は、制限酵素 Kpnlの 認識配列を塩基番号 9〜14に、さらにヒト由来 Dicerのアミノ酸配列（配列番号 3)の アミノ酸番号 892〜898に相当する塩基配列を塩基番号 16〜36にもつ合成 DNA である。また、合成プライマー 2は、制限酵素 Hindlllの認識配列を塩基番号 9〜14 に、さらにヒト由来 Dicerのアミノ酸配列（配列番号 3)のアミノ酸番号 1058〜1064に 相当する塩基配列を塩基番号 15〜36にもつ。
[0097] 上記合成プライマーを用いて PCRを行った。铸型 DNAとしては、実施例 1— (2)で 調製した pCold08ZhDi— ASIを用 、た。 PCRの反応条件を以下に示す。
すなわち、铸型 DNAlng、 10 1の 10 X LA PCR buff er (タカラバイオ社製）、 8 1の dNTP混合液（タカラバイオ社製）、 lOpmolの合成プライマー 5、 lOpmolの 合成プライマー 6、 0. 5Uの Takara Ex Taq (タカラバイオ社製）をカ卩え、滅菌水を 加えて全量を 100 μ 1とした。前記反応液を TaKaRa PCR Thermal Cycler M P (タカラバイオ社製）にセットし、 94°C 30秒、 55°C 30秒、 72°C 2分を 1サイクル とする 30サイクルの反応を行なった。
[0098] 反応終了後、該反応液 95 μ 1を 1. 0%ァガロースゲル電気泳動に供した。確認さ れた目的の約 530bpの DNAフラグメントを電気泳動ゲルより回収'精製し、エタノー ル沈殿を行なった。エタノール沈殿後の回収 DNAを 5 1の滅菌水に懸濁し、制限 酵素 Kpnl (タカラバイオ社製)及び制限酵素 Hindlll (タカラバイオ社製)で 2重消化 し、 1. 0%ァガロースゲル電気泳動によりその Kpnl— Hindlll消化物を抽出精製し 、 Kpnl— Hindlll消化 DNA断片を得た。
[0099] pCold08NC2ベクターを上記 Kpnl— Hindlll消化 DNA断片を調製した時に用い たのと同じ制限酵素で切断し、さらに末端を脱リン酸処理したものを調製し、上記 Kp nl— Hindlll消化 DNA断片と混合し、 DNAライゲーシヨンキット（タカラノィォ社製） を用いて連結した。その後、ライゲーシヨン反応液 6 1を用いて大腸菌 JM109を形 質転換し、その形質転換体を 1. 5% (wZv)濃度の寒天を含む LB培地 (アンピシリ ン 100 μ gZml含む）上で生育させた。
[0100] 目的の DNA断片が挿入されたプラスミドを pCold08ZhDi— PAZとした。この pCo ld08ZhDi— PAZは、ヒト由来 Dicerのアミノ酸配列（配列番号 3)のアミノ酸番号 89 2〜 1064のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むプラスミドである。前記プラスミ ドから発現させたタンパク質は、 Perfect DB配列、 His— tag配列、並びに Factor Xa配列を有している。
[0101] また、トリガーファクターと PAZとの融合蛋白質を発現するプラスミドを、ベクターとし て実施例 2—（1)で調製した pColdTF—Πを用いる点以外は、上記の pCold08Zh Di - PAZの調整方法と同様の方法で調製し、このプラスミドを pColdTFZhDi - P AZと命名した。
[0102] (2)形質転換体の調製
トリガーファクターと hDi—PAZの融合蛋白質を発現する pColdTFZhDi—PAZを 用いて、大腸菌 BL21を形質転換した。なお、形質転換は塩ィ匕カルシウム法により行 つた。形質転換体は、アンピシリンを 100 g/mlの濃度で含むプレートを用いてス クリーニングすることにより得た。
[0103] 上記の融合発現系の比較例として、 hDi— PAZを単独発現系で発現する形質転 換体、 hDi— PAZとトリガーファクターとの共発現系で発現する形質転換体について も調製した。
[0104] 単独発現系で発現する形質転換体は、プラスミド pCold08ZhDi— PAZを用いて BL21を形質転換する点以外は、前記の融合発現系で発現する形質転換体の調製 方法と同様の方法で得た。共発現系で発現する形質転換体の調製は以下の方法に より行った。まず、プラスミド pCold08ZhDi— PAZとプラスミド pTfl6とを用いて大腸 菌 A19を形質転換した。なお、形質転換は塩ィ匕カルシウム法により行った。次に、 pC old08ZhDi— PAZとプラスミド pTfl6とを保持する共形質転換体は、クロラムフエ- コールおよびアンピシリンをそれぞれ 50 μ gZmlおよび 100 μ gZmlの濃度で含む プレートを用いてスクリーニングする事により得た。
[0105] (3) 1101—？八2の発現
(2)で得られた各形質転換体を用いて、 hDi— PAZの発現を調べた。融合発現系お よび単独発現系の形質転換体の培養には、 3mlの LB液体培地 gZmlアンピ シリンを含む）を用いた。また、共発現系の形質転換体の培養には、 3mlの LB液体 培地（50 μ gZmlアンピシリン、 20 μ gZmlクロラムフエ-コール、 0. 5mgZmlのァ ラビノースを含む）を用いた。それぞれの形質転換体は 37°Cで培養し、濁度が OD6 00 = 0. 4程度に達した時点で 15°C、 15分間培養後、培養液に終濃度 0. 5mMの I PTGを加え、更に 15°Cで 24時間培養を行うことで発現を誘導した。発現誘導を 24 時間行ったのち、菌体を回収した。得られた菌体を菌体破砕液（50mM Tris—HCl (pH8. 5)、 100mM NaCl、 ImM MgC12、 protease inhibitor (complete E DTA— free) )で懸濁、超音波破砕し、細胞抽出液画分を調製、ついで 15、 000 X gの遠心分離により可溶性画分と不溶性画分に分けた。それぞれの画分について、 約 2. 5 X 106個の菌体分を SDS— PAGEに供した。 CBB染色により解析した。
[0106] その結果、 pCold08ZhDi— PAZで目的蛋白質を単独発現させた場合、および p Cold08ZhDi— PAZと pTf 16を用いて目的タンパク質とトリガーファクターを共発現 37 させ Gた場合には、細胞抽出液画分に目的タンパク質の分子量 24000Daに対応する 発現産物が確認された力 可溶性画分にはほとんど検出されな力つた。一方、 pCol dTFZhDi— PAZを用いて目的タンパク質とトリガーファクターを融合発現した場合 には、対照と比較して胞抽出液画分の目的タンパク質量が増加していた。さらに、そ の大部分を可溶性画分に検出することができた。
産業上の利用可能性
[0107] 本発明の方法により、目的のポリペプチドを著量に、活性を有する状態で、かつ高 純度に製造することができる。
配列表フリーテキスト
Figure imgf000038_0001
ID NO: :2; A gene encoding mutated 5し UTR of Escherichia coli cspA gene
SEQ ID NO: :4; Synthetic primer 5 to amplify a gene encoding human dicer mutant
SEQ ID NO: :5; Synthetic primer 6 to amplify a gene encoding human dicer mutant
SEQ ID NO: :6; A gene encoding human dicer mutant
SEQ ID NO: :7; An amino acid sequence of human dicer mutant
SEQ ID NO: :8; An amino acid sequence of human dicer mutant
SEQ ID NO: :9; A gene encoding human dicer mutant
SEQ ID NO: :10; A gene encoding red-shift green fluorescent protein.
SEQ ID NO: :11; Synthetic primer 3 to amplify a gene encoding red-shift green fluorescent protein
SEQ ID NO: 12; Synthetic primer 4 to amplify a gene encoding red-shift green fluorescent protein
SEQ ID NO: 13; Synthetic primer TFN to amplify a gene encoding Trigger Factor SEQ ID NO :14; Synthetic primer TFCP to amplify a gene encoding Trigger Factor SEQ ID NO: 15; A gene encoding RAV— 2 reverse transcriptase alpha subunit SEQ ID N〇：16; A gene encoding RAV— 2 reverse transcriptase beta subunit SEQ ID NO :17; Synthetic primer NUCN to amplify a gene encoding DNase
SEQ ID NO:18; Synthetic primer NUCC to amplify a gene encoding DNase
SEQ ID NO:19; Synthetic primer 1 to amplify a gene encoding human dicer PAZ domain
SEQ ID NO :20; Synthetic primer 2 to amplify a gene encoding human dicer PAZ domain

Claims

請求の範囲
[1] 所望のポリペプチドをコードする遺伝子が導入された宿主を低温条件にさらすこと によって前記ポリペプチドの発現を誘導する工程を包含するポリペプチドの製造方 法であって、前記宿主においてさらにシャペロンをコードする遺伝子の発現を増強す ることを特徴とするポリペプチドの製造方法。
[2] シャペロンをコードする遺伝子の発現の増強力 宿主シャペロン遺伝子の発現の誘 導、宿主染色体上のシャペロン遺伝子の改変、宿主へのシャペロン遺伝子の導入、 シャペロン遺伝子の発現が増強された宿主の使用、力 選択されるものである請求 項 1記載の方法。
[3] シャペロンが、 DnaK、 DnaJ、 GrpE、 GroEL、 GroES、トリガーファクターから選択 されるものである請求項 1記載のポリペプチドの製造方法。
[4] 所望のポリペプチドをコードする遺伝子がコールドショックタンパク質遺伝子 mRNA 由来の 5'非翻訳領域をコードする DNAの下流に接続されて宿主に導入されている ことを特徴とする請求項 1記載のポリペプチドの製造方法。
[5] 所望のポリペプチドをコードする遺伝子が大腸菌 cspA遺伝子 mRNA由来の 5'非 翻訳領域をコ一ドする DNAの下流に接続されて宿主に導入されていることを特徴と する請求項 4記載のポリペプチドの製造方法。
[6] 所望のポリペプチドをコードする遺伝子とシャペロンをコードする遺伝子がベクター により宿主に導入されている請求項 1記載のポリペプチドの製造方法。
[7] 所望のポリペプチドをコードする遺伝子とシャペロンをコードする遺伝子力 所望の ポリペプチドとシャペロンとの融合タンパク質をコードするように接続されている、請求 項 6記載のポリペプチドの製造方法。
[8] 所望のポリペプチドが RAV— 2由来逆転写酵素 αサブユニット、 RAV— 2由来逆 転写酵素 βサブユニット、 DNase、ヒト由来 Dicer PAZドメインポリペプチドから選 択されるものである、請求項 7記載のポリペプチドの製造方法。
[9] 宿主が大腸菌である請求項 1記載のポリペプチドの製造方法。
[10] 所望のポリペプチドの製造に使用されるプラスミドベクターのセットであって、
(1)プロモーターの下流に (a)コールドショックタンパク質遺伝子 mRNA由来の 5 '非翻訳領域をコードする DN A、
(b)前記 (a)の DNAの下流に位置する、所望のポリペプチドをコードする遺伝子の 挿入に使用可能な制限酵素認識配列、を有する第 1のベクター；および
(2)シャペロンをコードする遺伝子を有する第 2のベクター、
を含有し、前記（1)、（2)のベクターの複製起点が不和合性を示さないように選択さ れて 、ることを特徴とするベクターのセット。
[11] 第 1のベクターが大腸菌 cspA遺伝子 mRNA由来の 5'非翻訳領域をコードする D
NAを含有するものである請求項 10記載のベクターのセット。
[12] 第 2のベクターが DnaK、 DnaJ、 GrpE、 GroEL、 GroES、トリガーファクターから選 択されるシャペロンをコードする遺伝子を含有していることを特徴とするものである請 求項 10記載のベクターのセット。
[13] 大腸菌で複製しうるプラスミドからなる請求項 10記載のベクターのセット。
[14] プロモーターの下流に、
(a)コールドショックタンパク質遺伝子 mRNA由来の 5 '非翻訳領域をコードする DN A、
(b)前記 (a)の DNAの下流に位置する、所望のポリペプチドをコードする遺伝子の 挿入に使用可能な制限酵素認識配列、を有する DNA、および
(c)シャペロンをコードする遺伝子
を有する発現ベクター。
[15] 大腸菌 cspA遺伝子 mRNA由来の 5'非翻訳領域をコードする DNAを含有する請 求項 14記載の発現ベクター。
[16] DnaK、 DnaJ、 GrpE、 GroEL、 GroES、トリガーファクターから選択されるシャぺ口 ンをコードする遺伝子を含有していることを特徴とする請求項 14記載のプラスミドの 発現ベクター。
[17] 所望のポリペプチドをコードする遺伝子の挿入に使用可能な制限酵素認識配列が 、所望のポリペプチドがシャペロンとの融合タンパク質として発現されるように前記ポリ ペプチドをコードする遺伝子を挿入できる部位に位置することを特徴とする請求項 14 記載の発現ベクター。
大腸菌で複製しうるプラスミドである請求項 14記載の発現べクタ
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