KR20050065519A - 알부민-융합 섬모 신경영양 인자 - Google Patents

알부민-융합 섬모 신경영양 인자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 알부민, 또는 그 프레그먼트나 변이체 또는 유도체 및 섬모 신경영양 인자(CNTF) 수용체를 활성화하는 적어도 하나의 생물학적으로 활성적인 펩타이드나 단백질, 또는 그 프레그먼트나 변이체 또는 유도체를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.

Description

알부민-융합 섬모 신경영양 인자{Albumin-Fused Ciliary Neurotrophic Factor}
본 발명은 알부민, 또는 그 프레그먼트나 변이체 또는 유도체 및 섬모 신경영양 인자(CNTF) 수용체를 활성화하는 적어도 하나의 생물학적으로 활성적인 펩타이드나 단백질, 또는 그 프레그먼트나 변이체 또는 유도체를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.
매일 이루어지는 에너지 항상성 조절은 주로 기저 시상하부에서 몇몇 분리된 핵(배쪽내측핵(ventromedial nucleus), 등쪽내측핵(dorsomedial nucleus), 및 측 시상하부)의 중심적 조절하에 유지되지만[1], 또한 다른 중추 신경 구조(대뇌피질, 변연부, 뇌간, 뇌하수체, 자율 신경절 뉴우런, 등쪽 미주신경 복합체) 뿐만 아니라 말초 신경 구조(교감 신경절 뉴우런)가 관련된다[2].
중추 및 말초 신경 조절외에, 에너지 항상성의 균형에 관련되는 주변 기관은 소화기관(위, 장), 췌장, 지방 조직, 근육조직, 부신 및 갑상선이다.
조절 공정은 복잡하며 소화기관과 같은 주변 기관은 음식 섭취후 시상하부에서 식욕-증진 호르몬의 감소를 일으키는 호르몬(예, CCK(콜레시스토키닌)을 방출할 수 있다. 또한, 음식 섭취후 지방 조직에 의해 방출되는 렙틴은 주 중심적으로 활성적인 식욕-유도 호르몬중 하나인 예를들어, NPY(뉴로펩타이드 Y)에 음 조절적 영향을 미친다. 다른 한편, 중심적으로 방출되는 호르몬은 주변적 영향 뿐만 아니라 열발생을 증가시킨다(예, β3-아드레날린성 작동물질, 비결합 단백질(UCPs).
AXOKINE??(REGENERON, Terrytown, NY, USA)는 CNTF의 돌연변이 타입이다. AXOKINE??은 마지막 15C-말단 아미노산이 제거된 CNTF의 트렁케이티드 형태이다. 분자체의 안정성을 증가시키기위해, 글루타민은 포지션 63에서 아르기닌으로 대체되며 포지션 17에서 프리 시스테인은 알라닌으로 대체된다[7].
우연히 운동신경원 질환으로 고통받는 대상자에서 임상 시험도중 CNTF의 중량-감소 영향이 있음이 발견되었다[8]. 계속된 연구로 중량 감소를 유도하기위해 CNTF에 의해 제공되는 작용 메카니즘은 CNTF가 또한 다이어트-유도 비만에 작용하는 차이로 렙틴과 유사함이 발견되었다[7]. AXOKINE??을 이용한 동물에서의 연구는 이러한 CNTF-돌연변이에 의한 중량-감소 유도 능력은 CNTF-메카니즘과 유사함을 확인시켜주었다.
CNTF는 섭취를 자극하는 것으로 알려진 NPY, 아구티-관련 펩타이드(AGRP) 및 감마-아미노부티르산(GABA)의 합성에 음 조절적 영향을 준다.
CNTF는 본래 형태로 혈뇌 장벽(BBB)을 지나는 것으로 나타났다. 최근에 CNTF는 4.60(±0.78)×10-4mL/g min의 진입 속도 Ki으로 가포화 이송 시스템을 통해 이송되는 것으로 나타났다[11].
BBB는 혈액이 뇌 조직으로 들어가는 것을 저해하는 분자에 대하여 고 조절된 배리어이다[13]. 이는 뇌 모세관 내피세포에 의해 형성된다.
Lambert 등으로부터[7], AXOKINE??이 렙틴 결핍(ob/ob) 및 와일드-타입(다이어트-유도 비만, DIO) 마우스에 관여함을 알 수 있다. 가장 효과적인 투여량은 AXOKINE?? 300㎍/kg b.w.이었지만, 100㎍/kg b.w.으로도 효과가 관찰되었다. 달성된 중량 손실은 마른 체형의 손실을 제외하고 주로 지방 조직의 손실에 기인하였다.
또한, AXOKINE?? 으로 처리된 마우스에서 반발 효과는 없었으나 AXOKINE?? 으로 처리되지않은 경우 및 AXOKINE?? 처리 동물에 다이어트를 시킨 마우스(페어 페드 그룹)는 신속히 이들의 본 체중을 다시 얻었다.
단계 I 데이타는 Guler 등에 의해 International Journal of Obesity에 공개되었다[14]. AXOKINE?? 은 잘 허용되었으며, 낙오된 대상자는 없었으며 대부분의 모든 해로운 이벤트(AE)는 "경미"한 것으로 간주되었다. 독성을 제한하는 투여량은 파트 A에서 16㎍/kg b.w.에서 구토 및 메스꺼움이었으며 주입부 반응은 대부분 약물 처리된 대상자에서 감소된 식욕, 메스꺼움, 두통, 및 설사를 수반하는 AE가 보고되었다. 포진형 입 병소가 일부 대상자에서 보고되었다.
한 대상자는 1㎍/kg b.w./day로 AXOKINE?? 처리 마직막후 10일에, 일시적 안면신경마비(Bell's palsy)(제 7 두개 신경의 마비, 안면의 모조 근육이 마비되는 안면 신경의 마비)로 고통받았다. 보다 높은 투여량에서, 증가된 C-반응 단백질 및 적혈구 침전작용 속도(ESR), 및 감소된 혈청 Fe+가 기록되었다. 투여량-의존 형태로, 심장 속도는 증가하였으며 체온은 보다 높아지는 경향이 나타났다.
170명의 다수 혹은 병적 비만 환자를 포함하는 멀티센터, 무작위화, 이중-블라인드, 플라시보-조절된, 투여량-범위 단계 II 연구[15]는 12주 처리기간에 걸쳐 AXOKINE?? (1.0㎍/kg)의 최적 투여량을 받은 환자들은 플라시보 수용자(p<0.001)보다 평균 10-파운드 많은 중량 손실을 갖는 것으로 평가되었다[16].
8주 처리 그룹의 환자에서 AXOKINE?? 의 마지막 투여후 4개월간 중량 손실이 유지되었다[17,18]. 심각한 해로운 이벤트는 보고되지 않았다. 가장 빈번하게 보고된 해로운 이벤트는 투여량-의존성 경미한 주입부 반응(주입부 발적)이었으며 이는 플라시보 그룹을 포함하는 모든 환자에서 발생하였다. AXOKINE?? 의 투여는 기침 및 메스꺼움과 관련되었으며, 이는 종종 그 제제의 2.0㎍/kg b.w. 투여후 가장 빈번하게 발생하였다. 플라시보와 비교하여 AXOKINE?? 수용자에서 헤르페스 심플렉스 바이러스 감염의 증가는 관찰되지 않았다. 비교될만한 비율의 AXOKINE??, 및 (58-74%), 및 플라시보(61%) 수용자가 전체 12-주 시험을 마쳤다.
단계 III 플라시보-조절된 시험에서 1467 AXOKINE-처리 대상자 및 501 플라시보-처리 대상자는 다음과 같이 나타났다:
ㆍ플라시보와 비교시 AXOKINE??처리는 시험의 주요 종점 두가지 모두와 관련되어 통계적 유의성을 달성하였다.
보다 높은 비율의 AXOKINE??처리된 환자는 플라시보-처리 환자와 비교하여 이들의 초기 체중의 적어도 5%가 감소되었다(25.1% 대 17.6%, p<.001).
AXOKINE??을 받은 참가자들은 플라시보를 받은 참가자들보다 높은 평균 중량 감소를 경험하였다(6.2lbs 대 2.6lbs, p<.001)
ㆍAXOKINE??처리는 이들의 초기 체중의 적어도 10%가 감소하는 대상자의 비율과 같이 세가지의 제2 종점중 두가지에서 통계적으로 유의한 결과를 달성하였다(11.3% 대 4.2%, p<.001).
ㆍAXOKINE??처리는 일반적으로 잘-허용되었다. 해로운 이벤트는 일반적으로 무시될 정도로 경미한 것으로 특성화되었으며 심각하거나 격렬한 해로운 이벤트의 패턴은 나타나지 않았다. 플라시보와 비교하여 가장 주의할 만한 해로운 영향은 주입부 반응, 메스꺼움 및 기침이었으며 이는 경미한 것으로 특성화되었다.
ㆍAXOKINE??-관련 중량 손실은 약 3개월의 AXOKINE?? 처리후 시작하는 항체의 발달에 의해 제한되었다. 그러나, AXOKINE??으로 처리된 총 1467 대상자의 30%이상은 1년의 마지막에 항체의 발달이 일어나지 않았다.
발명의 요약
본 발명의 일견지로, 본 발명은 알부민, 특히 사람 혈청 알부민 또는 알부민 활성을 갖는 그 프레그먼트나 변이체 또는 유도체, 및 섬모 신경영양 인자(CNTF) 수용체를 활성화하는 적어도 하나의 생물학적으로 활성적인 펩타이드나 단백질, 또는 그 프레그먼트나 변이체 또는 유도체를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.
다른 구현으로, CNTF 또는 알부민은 프레그먼트 또는 유도체 또는 AXOKINE?? 의 경우에서와 같이 두가지 모두이거나 또는 변이체일 수 있다. 알부민 융합 단백질은 치료제일 수 있다.
다른 견지로, 본 발명은 포유류에서 CNTF의 반감기를 연장시키는 방법이다. 상기 방법은 CNTF에 알부민을 연결시켜 알부민-융합 CNTF를 형성하고 그 알부민-융합 CNTF를 포유류에 투여하는 것을 수반한다. 전형적으로, 상기 알부민-융합 CNTF의 반감기는 그 연결되는 알부민이 결핍된 CNTF의 반감기에 비하여 적어도 2-배 내지 적어도 50배로 연장된다.
CNTF용 이송 시스템 또는 예를들어, 트랜시토시스(transcytosis)와 같은 혈뇌 장벽(BBB)을 지나는 비특이적 이송 시스템을 이용하여, 알부민 융합 AXOKINE??의 뇌내 농도는 증가되는 것으로 예측된다. 비-융합 AXOKINE??에 비하여 BBB에서 시간경과시 알부민-융합 AXOKINE??의 증가된 플라즈마 농도에 기인하여, 알부민-융합 AXOKINE??의 보다 높은 유입이 트랜시토시스를 통해 일어날 것이다.
또한, 본 발명은 포유류에서 비만을 치료하는 방법을 수반한다. 상기 방법은 CNTF를 알부민과 연결하여 알부민-융합 CNTF를 형성하고 그 알부민-융합 CNTF를 포유류에 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 경미하게 보다 높은 농도로 CNTF로 포유류의 치료와 관련된 잠재적으로 부작용(예, 메스꺼움, 두통)을 최소화하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 CNTF를 알부민에 연결시켜 알부민-융합 CNTF를 형성하는 것과 그 알부민-융합 CNTF를 포유류에 투여하는 것을 포함한다.
도면의 간단한 설명
도 1. 토끼에서 비-융합 AXOKINE??의 약물 동력학(i.v.)
도 2. 토끼에서 C- 및 N-말단 융합된 AXOKINE??의 약물 동력학(i.v.)
도 3. 토끼에서 C- 및 N-말단 융합된 AXOKINE??의 약물 동력학(s.c.)
도 4. 비-융합 AXOKINE??으로 처리된 렙틴 결핍 마우스의 체중 감소 곡선
도 5. C-말단 융합된 AXOKINE??으로 처리된 렙틴 결핍 마우스의 체중 감소 곡선
도 6. 비-융합 AXOKINE??으로 처리된 와일드 타입 마우스의 체중 감소 곡선
도 7. C-말단 융합된 AXOKINE??으로 처리된 와일드 타입 마우스의 체중 감소 곡선
도 8. 성숙 C-말단 AXOKINE??(서열 ID: 1)의 아미노산 서열
도 9. 성숙 C-말단 rHA-3xFLAG-(분할가능) AXOKINE??(서열 ID: 2)의 아미노산 서열
도 10. 성숙 N-말단 AXOKINE??(서열 ID: 3)의 아미노산 서열
도 11. C-말단 융합 AXOKINE??의 맵
도 12. C-말단 rHA-3xFLAG-(분할가능) AXOKINE??의 맵
도 13. N-말단 융합 AXOKINE??의 맵
도 14. 3일마다 비-융합 AXOKINE?? 및 C-말단 융합 AXOKINE?? 으로 처리된 렙틴 결핍 마우스의 체중 감소 곡선
도 15. 매일 비-융합 AXOKINE?? 및 C-말단 융합 AXOKINE?? 으로 처리된 렙틴 결핍 마우스의 체중 감소 곡선
정의:
섬모 신경영양 인자(CNFF)는 자연적으로 발생하는 CNTF의 단일 생물학적 활성을 갖는 자연적으로 발생하는 CNTF의 유사체, 동족체, 프레그먼트, 또는 유도체인 어떠한 분자를 의미한다. 바람직한 CNTF는 AXOKINE?? 이다. 다른 CNTF 돌연변이(Ser166Asp/Gln167His)는 유럽 특허출원 WO 98/22128에 기술되어 있으며, 이는 포지션 159 -178이 다음과 같은 아미노산 서열을 갖는다:
Leu Lys Val Leu Gln Glu Leu Asp His Trp Thr Val Arg Ser Ile His Asp Leu Arg Phe (159-178; Seq. ID: 4)
AXOKINE?? 은 CNTF의 돌연변이 형태이다. AXOKINE?? 은 마직막 15 c-말단 아미노산이 제거된 CNTF의 트렁케이티드 형태이다. 상기 분자의 안정성을 증가시키기위해, 글루타민은 포지션 63에서 아르기닌으로 대체되며 포지션 17에서 프리 시스테인은 알라닌으로 대체된다[7].
N-말단-AXOKINE?? 은 AXOKINE?? 의 C-말단 끝과 실시예 1에 기술된 바와 같은 사람 혈청 알부민의 N-말단 끝의 융합체이다.
C-말단-AXOKINE?? 은 AXOKINE?? 의 N-말단 끝과 실시예 1에 기술된 바와 같은 사람 혈청 알부민의 C-말단 끝의 융합체이다.
실시예 1에 기술된 바와 같은 분할가능한 AXOKINE?? 은 AXOKINE?? 과 사람 혈청 알부민의 C-말단 융합체이며 이는 CNTF 부분과 알부민사이에 엔테로키나아제 분할 사이트를 가지며 이는 N- 및 C-말단 융합체에 대한 대조구로서 사용된 분리된 또는 비-융합 AXOKINE?? 을 생성하기위해 사용되었다.
알부민
용어, 사람 혈청 알부민(HSA) 및 사람 알부민(HA)은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 용어, "알부민" 및 "혈청 알부민"은 보다 광범위한 것이며, 사람 혈청 알부민 (및 이들의 프레그먼트 및 변이체) 뿐만 아니라 다른 종의 알부민 (및 이들의 프레그먼트 및 변이체)를 포함한다.
본 명세서에 사용된, "알부민"은 총괄하여 하나 또는 그 이상의 알부민 작용 활성(예, 생물학적 활성)을 갖는 알부민 단백질 또는 아미노산 서열, 또는 알부민 프레그먼트나 변이체를 칭한다. 특히, "알부민"은 사람 알부민 또는 이들의 프레그먼트(EP 201 239, EP 322 094 WO 97/2445, WO95/23857 참조), 특히 WO 01/79480의 도 15로 나타낸 사람 알부민의 성숙 형태(SEQ ID NO:18), 또는 다른 척추동물의 알부민 또는 이들의 프레그먼트, 또는 이들 분자의 유사체나 변이체 또는 이들의 프레그먼트를 칭한다.
WO 01/79480의 도 15의 서열은 본 출원에서 "WO '480 서열"로 칭한다.
본 발명의 알부민 융합 단백질에 사용되는 사람 혈청 알부민 단백질은 WO '480 서열을 참고로 하여 하기 세트의 점 돌연변이중 하나 또는 모두를 포함한다: Leu-407에서 Ala, Leu-408에서 Val, Val-409에서 Ala, 및 Arg-410에서 Ala; 또는 Arg-410에서 Ala, Lys-413에서 Gln, 및 Lys-414에서 Gln으로 변이(참조 예, 국제공개공보 제 WO95/23857). 다른 구현으로, 상기 세트의 점 돌연변이중 하나 또는 모두를 포함하는 본 발명의 알부민 융합 단백질은 효모 Yap3p 단백질 가수분해 분할에 대한 향상된 안정성/저항성을 가져 이에 따라 효모 숙주세포에서 발현되는 재조합 알부민 융합 단백질의 증가된 생산을 갖는다.
본 명세서에 사용된, CNTF의 생체내 반감기, 치료학적 활성 혹은 보존기간을 지연 혹은 연장시키기에 충분한 알부민의 부분은 비-융합 상태에서 CNTF의 생체내 반감기, 치료학적 활성, 또는 보존기간에 비하여 그 알부민 융합 단백질의 CNTF의 생체내 반감기, 치료학적 활성 또는 보존기간을 기간 혹은 구조에 있어서 안정화, 지연 혹은 연장하기에 충분한 알부민의 부분을 칭한다. 상기 알부민 융합 단백질의 알부민 부는 상기한 바와 같은 HA 서열의 전장을 포함하거나 그 치료학적 활성을 안정화 혹은 지연할 수 있는 이들의 하나 또는 그 이상의 프레그먼트를 포함할 수 있다. 이러한 프레그먼트는 HA 서열의 약 15, 20, 25, 30, 50 또는 그 이상의 인접 아미노산을 포함하거나 HA의 특정 도메인의 일부 또는 모두를 포함할 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질의 알부민 부는 정상 HA의 변이체일 수 있다. 본 발명의 알부민 융합 단백질의 CNTF 부는 또한 본 명세서에 기술된 바와 같은 치료 단백질의 변이체일 수 있다. 용어 "변이체"는 그러한 변화가 실질적으로 하나 또는 그 이상의 알부민의 온코틱(oncotic), 유용 리간드-바인딩 및 비-면역반응특성, 또는 치료 단백질의 치료 활성을 부여하는 활성부 혹은 활성 도메인을 변화시키지 않는 보존적 혹은 비 보존적인 삽입, 결실 및 치환을 포함한다.
특히, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 자연적으로 발생하는 사람 알부민의 다형 변이체 및 예를들어, EP 322 094(즉 HA(Pn), n은 369-419임)에 개시된 프레그먼트와 같은 사람 알부민의 프레그먼트를 포함할 수 있다. 상기 알부민은 어느 척추동물, 특히 예를들어, 사람, 소, 양 또는 돼지와 같은 어느 포유류로부터 유래될 수 있다. 비-포유류 알부민은 이에 한정하는 것은 아니나 닭 및 연어를 포함한다. 상기 알부민 융합 단백질의 알부민 부는 CNTF 부분과 다른 동물로 부터 형성될 수 있다.
일반적으로 말하자면, HA 프레그먼트나 변이체는 적어도 100아미노산 길이, 임의로 적어도 150 아미노산 길이일 수 있다. HA 변이체는 예를들어 도메인 1(WO '480 서열의 아미노산 1-194), 2(WO '480 서열의 아미노산 195-387), 3(WO '480 서열의 아미노산 388-585), 1 + 2(WO' 480 서열의 1-387), 2 + 3(WO '480 서열의 195-585) 또는 1 + 3(WO '480 서열의 아미노산 1-194 + WO '480 서열의 아미노산 388-585)과 같이 적어도 HA의 전체 도메인으로 구성되거나 혹은 택일적으로 이를 포함할 수 있다. 각 도메인은 두 상동성 서브도메인 즉 1-105, 120-194, 195-291, 316-387, 388-491 및 512-585와 잔기 Lys106-Glu119, Glu292-Val315 및 Glu492-Ala511을 포함하는 플렉시블 인터-서브도메인 연결기로 자체적으로 형성된다.
본 발명의 알부민 융합 단백질의 알부민 부는 적어도 하나의 HA의 서브도메인 또는 도메인이나 이들의 보존성 변형체를 포함할 수 있다. 만일 융합이 서브도메인에 기초하는 경우, 그 인접 연결기의 일부 혹은 모두는 임의로 CNTF 부에 연결하기위해 사용될 수 있다.
알부민 융합 단백질
본 발명은 일반적으로 알부민 융합 단백질 및 질병 혹은 질환을 치료, 예방 또는 개선하는 방법에 관한 것이다. 본 명세서에 사용된, "알부민 융합 단백질"은 적어도 하나의 알부민 분자(또는 이들의 프레그먼트나 변이체)와 적어도 하나의 CNTF 분자(또는 이들의 프레그먼트나 변이체)의 융합에 의해 형성된 단백질을 칭한다. 본 발명의 알부민 융합 단백질은 적어도 하나의 CNTF의 프레그먼트나 변이체 및 적어도 하나의 사람 혈청 알부민의 프레그먼트나 변이체를 포함하며, 이는 서로 유전적 융합에 의한 것과 같이 서로 연결된다(즉, CNTF의 전부 혹은 일부를 암호하는 폴리뉴클레오타이드가 알부민의 전부 혹은 일부를 암호하는 폴리뉴클레오타이드와 인-프래임으로 연결되는 핵산의 번역에 의해 알부민 융합 단백질이 생성된다). CNTF 및 알부민 단백질이 알부민 융합 단백질의 일부인 경우 이는 알부민 융합 단백질의 "부분", "리전" 또는 "부"로서 간주될 수 있다.
일 구현으로, 본 발명은 CNTF 및 혈청 알부민 단백질을 포함하거나 택일적으로 이로 구성된 알부민 융합 단백질을 제공한다. 다른 구현으로, 본 발명은 생물학적으로 활성적인 그리고/또는 치료적으로 활성적인 CNTF 및 혈청 알부민 단백질의 프레그먼트를 포함하거나 택일적으로 이로 구성된 알부민 융합 단백질을 제공한다. 다른 구현으로, 본 발명은 생물학적으로 활성적인 그리고/또는 치료적으로 활성적인 CNTF 및 혈청 알부민 단백질의 변이체를 포함하거나 택일적으로 이로 구성된 알부민 융합 단백질을 제공한다. 다른 구현으로, 상기 알부민 융합 단백질의 혈청 알부민 단백질 성분은 혈청 알부민의 성숙 부분이다.
다른 구현으로, 본 발명은 CNTF 및 셍물학적으로 활성적인 그리고/또는 치료적으로 활성적인 혈청 알부민의 프레그먼트를 포함하거나 택일적으로 이로 구성된 알부민 융합 단백질을 제공한다. 다른 구현으로, 본 발명은 CNTF 및 생물학적으로 활성적인 그리고/또는 치료적으로 활성적인 혈청 알부민의 변이체를 포함하거나 이로 구성된 알부민 융합 단백질을 제공한다. 일부 구현에서, 알부민 융합 단백질의 CNTF 부는 치료 단백질의 성숙부이다.
다른 구현으로, 본 발명은 생물학적으로 활성적인 그리고/또는 치료적으로 활성적인 CNTF의 프레그먼트나 변이체 및 생물학적으로 활성적인 그리고/또는 치료적으로 활성적인 혈청 알부민의 프레그먼트나 변이체를 포함하거나 이로 구성된 알부민 융합 단백질을 제공한다. 일부 구현에서, 본 발명은 CNTF의 성숙 부 및 혈청 알부민의 성숙 부를 포함하거나 이로 구성된 알부민 융합 단백질을 제공한다.
일 구현으로, 상기 알부민 융합 단백질은 N-말단 부로서 HA 및 C-말단 부로서 CNTF를 포함한다. 택일적으로, 또한 C-말단 부로서 HA를 포함하고 N-말단 부로서 CNTF를 포함하는 알부민 융합 단백질이 사용될 수 있다.
다른 구현으로, 상기 알부민 융합 단백질은 알부민의 N-말단 및 C-말단 모두와 융합된 CNTF를 갖는다. 일 구현으로, N- 및 C-말단에 융합된 CNTF는 동일한 CNTF 단백질이다. 다른 구현으로, N- 및 C-말단에 융합된 CNTF 단백질은 다른 CNTF 단백질이다. 다른 구현으로, N- 및 C-말단에 융합된 CNTF 단백질은 동일한 질병, 질환 또는 조건을 치료 혹은 예방하는데 사용될 수 있는 다른 CNTF 단백질이다. 다른 구현으로, N- 및 C-말단에 융합된 CNTF 단백질은 환자에서 동시에 일반적으로 일어나는 이 기술분야에 알려진 질병 혹은 질환을 치료 혹은 예방하는데 사용될 수 있는 다른 CNTF 단백질이다.
상기 알부민 부가 CNTF 부의 N-말단 및/또는 C-말단에 융합되는 알부민 융합 단백질에 부가적으로, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 또한 관심있는 CNTF 혹은 펩타이드를 HA의 내부 리전에 삽입하여 생성될 수 있다. 예를들어, HA 분자의 단백질 서열내에 다수의 루프 혹은 턴은 이황화 결합에 의해 안정화되는 알파-헬릭스의 끝과 시작 사이에 존재한다. 대부분의 부분에 대하여 HA의 결정구조(PDB 식별자 1AO6, 1BJ5, 1BKE, 1BM0, 1E7E - 1E7I 및 1HOR)로부터 검출되는 바와 같이 루프는 그 분자의 바디로부터 멀리 연장된다. 이러한 루프는 특정 생물학적 활성을 갖는 알부민 분자를 본질적으로 생성하기위해 특히 기능적인 제2 구조를 필요로하는 것들 또는 치료 단백질을 치료적으로 활성적인 펩타이드의 삽입 또는 내부 융합에 유용하다.
펩타이드 또는 폴리펩타이드가 본 발명의 알부민 융합 단백질을 생성하기위해 삽입될 수 있는 사람 알부민 구조의 루프는 Val54-Asn61, Thr76-Asp89, Ala92-Glu100, Gln170-Ala170-Ala176, His247-Glu252, Glu266-Glu277, Glu280-His288, Ala362-Glu368, Lys439-Pro447, Val462-Lys475, Thr478-Pro486 및 Lys560-Thr566을 포함한다. 다른 구현으로, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 성숙 사람 알부민(WO'480 서열)의 Val54-Asn61, Gln170-Ala176, 및/또는 Lys560-Thr566 루프내로 삽입된다.
삽입되어지는 펩타이드는 특정 생물학적 활성용으로 스크리닝되는 파아지 디스플래이 혹은 합성 펩타이드 라이브러리로부터 유래되거나 원하는 기능을 갖는 분자의 활성부로부터 유래될 수 있다. 또한, 랜덤 펩타이드 라이브러리가 특정 루프내에 생성되거나 무작위화된 펩타이드를 HA 분자의 특정 루프내로 삽입하여 생성될 수 있으며 그안에서 아미노산의 모든 가능한 조합이 나타내어진다.
이러한 라이브러리(들)은 하기 방법중 하나에 의해 HA에 혹은 HA의 도메인 프레그먼트에 생성될 수 있다:
(a) HA 또는 HA 도메인 프레그먼트의 하나 또는 그 이상의 펩타이드 루프내에 아미노산의 무작위화 돌연변이. 루프내 하나 또는 그 이상 또는 모든 잔기는 이러한 방식으로 돌연변이될 수 있다;
(b) 길이 Xn(X는 아미노산이며 n은 잔기의 수임)을 갖는 무작위화된 펩타이드(들)의 하나 또는 그 이상의 HA 또는 HA 도메인 프레그먼트내로 대체 또는 삽입(즉, 내부 융합);
(c) (a) 및/또는 (b)에 부가적인 N-, C- 또는 N- 및 C- 말단 펩타이드/단백질 융합.
HA 또는 HA 도메인 프레그먼트는 또한 다른 표적에 대하여 다른 루프의 다른 스크린으로부터 유도된 펩타이드를 동일한 HA 또는 HA 도메인 프레그먼트내로 그라프팅하여 다기능적으로 생성될 수 있다.
사람 혈청 알부민의 루프내로 삽입되는 펩타이드는 CNTF 펩타이드 또는 이들의 펩타이드 프레그먼트나 펩타이드 변이체이다. 보다 상세하게, 본 발명은 사람 혈청 알부민의 루프내로 삽입되는 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 또는 적어도 40 아미노산 길이의 프레그먼트 또는 펩타이드 변이체를 포함하는 알부민 융합 단백질을 포함한다. 본 발명은 또한 사람 혈청 알부민의 N-말단에 융합되는 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 또는 적어도 40 아미노산의 프레그먼트 또는 펩타이드 변이체를 포함하는 알부민 융합 단백질을 포함한다. 본 발명은 또한 사람 혈청 알부민에 융합되는 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 또는 적어도 40 아미노산의 프레그먼트 또는 펩타이드 변이체를 포함하는 알부민 융합 단백질을 포함한다.
일반적으로, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 하나의 HA-유래 리전 및 하나의 CNTF 단백질-유래 리전을 가질 수 있다. 그러나, 각 단백질의 다중 리전은 본 발명의 알부민 융합 단백질을 형성하는데 사용될 수 있다. 마찬가지로, 하나 이상의 CNTF가 본 발명의 알부민 융합 단백질을 형성하는데 사용될 수 있다. 예를들어, CNTF는 HA의 N- 및 C-말단 끝 모두에 융합될 수 있다. 이러한 구조에서, CNTF 부는 동일하거나 다른 CNTF 분자일 수 있다. 이작용성 알부민 융합 단백질의 구조는 X-HA-Y 또는 Y-HA-X 또는 X-Y-HA 또는 HA-X-Y 또는 HA-Y-X-HA 또는 HA-X-X-HA 또는 HA-Y-Y-HA 또는 HA-X-HA-Y 또는 X-HA-Y-HA 로 나타내어지거나 혹은 HA 서열내에 어느 위치에서의 다중 조합 및/또는 X 및/또는 Y의 삽입이 될 수 있다.
이작용성 혹은 다작용성 알부민 융합 단백질은 기능, 반감기 등에 따라 여러가지 비율로 제조될 수 있다.
이작용성 혹은 다작용성 알부민 융합 단백질은 또한 HA의 반대쪽 말단에서 단백질 또는 펩타이드를 통해 융합체의 CNTF 부를 표적 기관 혹은 세포 타입에 대해 표적하도록 제조될 수 있다.
알려진 치료 분자의 융합을 위한 선택적인 방안으로, 상기 펩타이드는 융합체로서 HA의 N-, C- 또는 N- 및 C-말단 또는 HA의 도메인 프레그먼트에 대하여 전형적으로 6, 8, 12, 20 또는 25 또는 Xn(X는 아미노산(aa)이며 n은 잔기의 수임) 무작위화된 아미노산으로 형성된 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻어질 수 있으며, 여기서 아미노산의 모든 가능한 조합이 나타내어진다. 이러한 방법의 특히 유용한 점은 그 펩타이드가 HA 분자상에서 원위치(in situ)로 선택될 수 있으며 상기 펩타이드의 특성은 이에 따라 다른 어떠한 방법에 의해 유도된 펩타이드와 같이 잠재적으로 변형되기 보다는 HA에 결합되도록 선택될 수 있다.
또한, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 그 부(moieties) 사이에 보다 큰 물리적 분리를 제공하여 이에 따라 예를들어, 그 인접 수용체와 바인딩하기위한 CNTF 부의 접근성을 최대화하기위해 융합부사이에 연결기 펩타이드를 포함할 수 있다. 상기 연결기 펩타이드는 유연하거나 보다 강직한 아미노산으로 구성될 수 있다.
따라서, 상기한 바와 같이, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 다음과 같은 식을 가질 수 있다: R2-R1; R1-R2; R2-R1-R2; R2-L-R1-L-R2; R1-L-R2-R2-L-R1; 또는 R1-L-R2-R1. 상기 식에서 R1은 적어도 하나의 치료 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열(이들의 프레그먼트나 변이체 포함)이며, 반드시 치료 단백질이 동일할 필요는 없으며, L은 연결기이며 그리고 R2는 혈청 알부민 서열(이들의 프레그먼트나 변이체 포함)이다. 예시적인 연결기는 (GGGGS)N(SEQ ID NO:8) 또는 (GGGS)N(SEQ ID NO:9) 또는 (GGS)N을 포함하며, 여기서 N은 1이상의 정수이며 G는 글리신을 나타내며 S는 세린을 나타낸다. R1이 둘 또는 그 이상의 치료 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열인 경우, 이러한 서열은 임의로 연결기에 의해 연결될 수 있다.
다른 구현예로, CNTF 단백질을 포함하는 본 발명의 알부민 융합 단백질은 알부민과 융합되지않은 동일한 CNTF의 보존기간 또는 생체내 반감기 또는 치료 활성에 비하여 연장된 보존기간 또는 생체내 반감기 또는 치료 활성을 갖는다. 보존기간은 전형적으로 용액내에서 혹은 일부 다른 저장 배합물에서 CNTF 단백질의 치료 활성이 치료 활성의 과도한 손실없이 안정한 기간을 칭한다. 대부분의 CNTF 단백질은 비-융합 상태에서 매우 불안정하다. 하기에 나타낸 바와 같이, 이러한 CNTF 단백질의 전형적인 보존기간은 본 발명의 알부민 융합 단백질내로 통합시 현저히 연장된다.
"지연된" 혹은 "연장된" 보존기간을 갖는 본 발명의 알부민 융합 단백질은 동일한 저장 및 취급 조건에 적용되는 스탠다드에 비해 상대적으로 우수한 치료 활성을 나타낸다. 스탠다드는 비융합 전장 CNTF 단백질일 수 있다. 상기 알부민 융합 단백질의 CNTF 부는 유사체, 변이체이거나 그렇치않으면 변경되거나 그 단백질의 전체 서열을 포함하지 않으며, 치료 활성의 연장은 택일적으로 그 유사체, 변이체, 변경된 펩타이드 또는 불완전 서열의 비융합된 등가물과 비교될 수 있다. 예를들어, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 약 100%의 치료 활성이상을 보유할 수 있으며 또는 동일한 저장 및 취급 조건에 적용되는 경우 주어진 시점에서 비교되는 스탠다드로서 스탠다드의 치료 활성의 약 105%, 110%, 120%, 130%, 150% 또는 200%이상 보유할 수 있다. 그러나, 치료 활성은 CNTF 단백질의 안정성에 따라 달라질 수 있으며 100%이하일 수 있다.
보존기간은 또한 저장 시작시 치료 활성에 대해 표준화된 저장후, 잔존하는 치료 활성으로 평가될 수 있다. 연장되거나 지연된 치료 활성으로 나타내어지는 연장된 혹은 지연된 보존기간을 갖는 본 발명의 알부민 융합 단백질은 동일한 조건에 적용시 그와 동등한 비-융합 CNTF의 치료활성의 약 50%이상, 약 60%이상, 70%이상, 80%이상 또는 90%이상의 치료 활성을 보유할 수 있다.
실시예 1
알부민 융합 AXOKINE??의 제조
CNTF는 엑손 1을 위한 프라이머 5'-CTCGGTACCCAGCTGACTTGTTTCCTGG-3' 및 5'-ATAGGATTCCGTAAGAGCAGTCAG-3' 및 엑손 2를 위한 프라이머 5'-GTGAAGCATCAGGGCCTGAAC-3' 및 5'-CTCTCTAGAAGCAAGGAAGAGAGAAGGGAC-3'을 이용하고 각각 표준 조건을 이용하여 두개의 엑손 증폭에 의해 클로닝되었다. 두 프레그먼트 모두 프라이머 5'-CTCGGTACCCAGCTGACTTGTTTCCTGG-3' 및 5'-CTCTCTAGAAGCAAGGAAGAGAGAAGGGAC-3'을 이용하여 PCR에 의해 재-증폭되기전에 표준조건하에서 라이게이션되고 벡터 pCR4(Invitrogen)내로 클로닝되었다. Lambert 등(PNAS 98:4652-4657; 2001)에 개시된 바와 같이 AXOKINE??을 생성하기위해 특정부위 돌연변이 유발이 사용되어 C17A(TGT->GCT) 및 Q63R(CAG->AGA) 돌연변이가 도입되었다. 또한 DNA 시퀀싱 결과 사일런트 T -> C 치환 V85V(GTT->GTC)이 존재하는 것으로 나타났다.
C-말단 rHA-GS-AXOKINE??융합체를 생성하기위해 AXOKINE??cDNA는 14 아미노산 GS(-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-) 펩타이드 스페이서가 도입되도록 단일 스트랜드 올리고뉴클레오타이드 프라이머 MH32 5'-TGCCAAGCTTATTACCCAGTCTGATGAGAAGAAATGAAACGAAGGTCATGG-3' 및 MH35 5'-TGGTGGATCCGGTGGTGCTTTCACAGAGCATTCACCGCTGACCCC-3'를 이용한 돌연변이 유발 PCR에 의해 사람 알부민을 암호하는 cDNA와 라이게이션되었다. 성숙 rHA-GS-AXOKINE??융합체의 아미노산 서열은 도 8에 주어진다.
C-말단 rHA-3xFLAG- AXOKINE??(분할가능한 AXOKINE?? 융합체)를 생성하기위해 알부민과 AXOKINE?? 서열 사이에 22 아미노산 3xFLAG (-Asp-Tyr-Lys-Asp-His-Asp-Gly-Asp-Tyr-Lys-Asp-Ile-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Lys-) 펩타이드 스페이서가 도입되도록 AXOKINE??cDNA는 단일 스트랜드 올리고뉴클레오타이드 프라이머 MH32 5'-TGCCAAGCTTATTACCCAGTCTGATGAGAAGAAATGAAACGAAGGTCATGG-3' 및 CF83 5'-TCATGATATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGGCTTTCACAGAGCATTCACCGCTGACCCCTCACCGTCGGGACCTCG-3'을 이용한 돌연변이 유발 PCR에 의해 사람 알부민을 암호하는 cDNA와 라이게이션되었다. 성숙 C-말단 rHA-3xFLAG- AXOKINE??융합체의 아미노산 서열은 도 9에 주어진다. 상기 융합 단백질의 분비를 확보하기위해 WO 90/01063에 개시된 HSA/MF -1 융합 분비 서열이 제공되었다.
N-말단 AXOKINE??-GS-rHA 융합체를 생성하기위해 AXOKINE?? 과 알부민 서열 사이에 14 아미노산 GS(-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-) 펩타이드 스페이서가 도입되도록 단일 스트랜드 올리고뉴클레오타이드 프라이머 MH33 5'-ATGCAGATCTTTGGATAAGAGAGCTTTCACAGAGCATTCACCGCTGACCCC-3' 및 MH36 5'-CACCGGATCCACCCCCAGTCTGATGAGAAGAAATGAAACGAAGGTCATGG-3'를 이용한 돌연변이 유발 PCR에 의해 사람 알부민을 암호하는 cDNA와 라이게이션되었다. 성숙 AXOKINE-GS-rHA 융합체의 아미노산 서열은 도 10에 주어진다.
rHA-GS-AXOKINE?? 서열, rHA-3xFLAG-AXOKINE??서열 및 AXOKINE?? -GS-rHA 서열의 맵은 각각 도 11, 12 및 13에 주어진다.
상기 효모 PRB1 프로모터 및 효모 ADH1 종결자는 각각 WO 00/44772에 앞서 개시되고 Sleep, D, 등(1991) Bio/Technology 9, 183-187에 기술되어 있는 바와 같이 적절한 전사 프로모터 및 전사 종결자를 제공하였다. 적절한 벡터 서열은 EP-A-286 424에 일반적으로 개시되고 Sleep, D, 등(1991) Bio/Technology 9, 183-187에 기술되어 있는 바와 같은 "디스인테그레이션" 플라스미드 pSAC35에 의해 제공되었다.
rHA 융합체는 발현되었으며 교반 플라스크 배양 발현 수준이 검출되었다.
실시예 2
정제
C-말단 AXOKINE??은 고수준의 클리핑된 물질을 함유하였다. 이는 스탠다드 rHA SP-FF 조건(미국 특허 제 6,034,221 참조)을 이용하여 네가티브 모드로 정제되어 이에 따라 그 융합체는 플로우드로우내에 존재하였다. 그 플로우드로우는 pH8 및 2.5mS.cm-1로 조절되었으며 15mM 포타슘 테트라보레이트에서 평형화된 스탠다드 rHA DE-FF에 적재되었다. SP-FF와 관련하여 DEFF는 네가티브 모드에서 수행되었다. DE-FF 플로우 드로우의 전도율은 15mS.cm-1로 증가되었으며 그 다음 그 물질은 스탠다드 rHA DBA 크로마토그래피를 이용하여 50mM 옥타노네이트의 엑스트라 용리로 정제되었다. 그 다음 그 용리액은 농축되고 5mM 포스페이트 pH8.3으로 디아필터(diafilter)되었다.
N-말단 AXOKINE??은 일부 클리핑된 물질을 함유하였다. 이는 스탠다드 rHA SP-FF 조건을 이용하여 네가티브 모드로 정제되어 이에 따라 그 융합체는 플로우드로우내에 존재하였다. 그 플로우드로우는 pH8 및 2.5mS.cm-1로 조절되었으며 15mM 포타슘 테트라보레이트에서 평형화된 스탠다드 rHA DE-FF에 적재되었다. 예를들어, 융합부가 결합되고 200mM NaCl을 함유하는 스탠다드 용리로 용리되었다. 용리액의 전도율은 15mS.cm-1로 감소되었으며 그 물질은 스탠다드 rHA DBA 크로마토그래피를 이용하여 50mM 옥타노네이트의 엑스트라 용리로 정제되었다. 그 다음 그 용리액은 농축되고 5mM 포스페이트 pH8.3으로 디아필터(diafilter)되었다.
분할가능한 AXOKINE??은 고수준의 클리핑된 물질을 함유하였다. 이는 스탠다드 rHA SP-FF 조건을 이용하여 네가티브 모드로 정제되어 이에 따라 그 융합체는 플로우드로우내에 존재하였다. 그 플로우드로우는 pH8 및 2.5mS.cm-1로 조절되었으며 15mM 포타슘 테트라보레이트에서 평형화된 스탠다드 rHA DE-FF에 적재되었다. SP-FF와 관련하여 이는 네가티브 모드에서 수행되었다. 그 플로우 드로우의 전도율은 15mS.cm-1로 증가되었으며 그 물질은 스탠다드 rHA DBA 크로마토그래피를 이용하여 50mM 옥타노네이트의 엑스트라 용리로 정제되었다. 그 다음 그 용리액은 농축되고 분리 버퍼내로 디아필터되었다. 분리는 실온에서 밤새 수행되었으며 엔테로키나아제는 Ekapture 겔을 이용하여 제거되었다. 상기 물질은 그 다음 농축되고 5mM 포스페이트 pH8.3으로 디아필터되었다.
실시예 3
약물동력학
N-말단 및 C-말단 알부민 융합 AXOKINE??과 비융합 AXOKINE??의 반감기 및 생체이용율 평가 및 N-말단 및 C-말단 알부민 융합 AXOKINE??과 비융합 AXOKINE??의 추가적인 약물동력학 파라미터 평가.
투여 방법:
시험 물질 1: 비융합 AXOKINE??
적용 부피: 0.33mL/kg
단일 투여량/경로: 10㎍/kg i.v. 또는 s.c.
빈도: 1x(t=0)
시험 물질 2: N-말단 알부민-융합 AXOKINE??
적용 부피: 0.33mL/kg
단일 투여량/경로: 40㎍/kg i.v. 또는 s.c.
빈도: 1x(t=0)
시험 물질 3: C-말단 알부민-융합 AXOKINE??
적용 부피: 0.33mL/kg
단일 투여량/경로: 40㎍/kg i.v. 또는 s.c.
빈도: 1x(t=0)
시험 디자인
표 1
처리그룹
No. 처리 투여량/스케쥴/경로 N(M/F)
1 분할가능한 AXOKINE?? 10㎍/kg/단일 주입/i.v. 2m+2f
2 C-말단 알부민-융합 AXOKINE?? 40㎍/kg/단일 주입/i.v. 2m+2f
3 N-말단 알부민-융합 AXOKINE?? 40㎍/kg/단일 주입/i.v. 2m+2f
4 분할가능한 AXOKINE?? 10㎍/kg/단일 주입/s.c. 2m+2f
5 C-말단 알부민-융합 AXOKINE?? 40㎍/kg/단일 주입/s.c. 2m+2f
6 N-말단 알부민-융합 AXOKI 40㎍/kg/단일 주입/s.c. 2m+2f
실험 동물
종/스트레인: 토끼
성/나이: 수컷 12, 암컷 12; 3-4개월
총 수: 24
공급자: Fa. Bauer(Neuenstein-Lohe, Germany)
동물 모델
그룹당 두마리 수컷 및 두마리 암컷 토끼에 분할가능한 AXOKINE??(1㎍/kg), C-말단 알부민-융합 AXOKINE??(40㎍/kg), 또는 N-말단 알부민-융합 AXOKINE??(40㎍/kg)을 0일에 단일 i.v. 또는 s.c. 주입으로 투여하였다. 기준선 및 각 시험 물질의 i.v. 투여후 5분, 10분, 20분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 24시간(1일), 48시간(2일), 72시간(3일), 5일, 7일, 9일, 11일 및 14일, 그리고 기준선 및 각 시험 물질의 s.c. 주입후 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 24시간(1일), 48시간(2일), 72시간(3일), 5일, 7일, 9일, 11일 및 14일에서 각 항원 수준의 검출을 위해 혈액 시료를 추출하였다. AXOKINE?? 및 알부민 융합 AXOKINE??의 플라즈마 수준은 ELISA에 의해 검출되었다.
약물동력학(PK) 변수:
소거 반감기, 최대 14일까지의 플라즈마 농축 시간 곡선하의 면적(AUC0-14), 최대 농도(Cmax). 무한대(AUC0-∞)로 추정되는 농축 시간 곡선하의 면적, 최대 농축 시간(tmax), 평균 체류 시간, 흡수 및 분포(적용가능한 경우)의 반감기, 분포 클리어런스 용적.
분석 방법
비융합 AXOKINE?? 플라즈마 농도의 ELISA 검출은 바이오티닐레이티드 폴리클로날 고트 항-hu CNTF 항체(R&D Systems, cat. no. BAF257)와 함께 모노클로날 마우스 항-hu CNTF-항체(R&D Systems, 클론 번호 21809.111)를 이용하여 수행되었다. 사람 CNTF는 ELISA 키트 설명에 따라 스탠다드로 사용되었다.
알부민-융합 AXOKINE?? 플라즈마 농도의 ELISA 검출은 바이오티닐레이티드 폴리클로날 고트 항-hu CNTF 항체(R&D Systems, cat. no. BAF257)와 함께 모노클로날 항-hu 알부민 항체(Aventis Behring GmbH, Laboratory)를 이용하여 수행되었다. 각 알부민-융합 AXOKINE?? 은 스탠다드 곡선의 생성을 위해 제공되었다.
상업적으로 이용가능한 사람 CNTF ELISA(R&D Systems)을 이용한 경우 알부민-융합 AXOKINE?? 을 검출하는 것은 불가능하였으며, 이는 아마도 항-CNTF 항체의 결합으로 알부민의 입체방해에 기인한 것으로 여겨진다.
해결방안으로 포획 항체로서 항-알부민 모노클로날 항체를 이용한 인터널 항-알부민 어세이가 수립되었으며 여기서 이 항체는 플레이트에 커플링되었다. 다음 단계로, R&D Systems으로부터 상업적으로 이용가능한 CNTF 항체는 알부민-융합 AXOKINE?? 에 대한 검출 항체로 사용되었다.
각 플라즈마 수준의 분석
C- 및 N-말단 알부민-융합 AXOKINE?? 및 비융합 AXOKINE??의 플라즈마 농도-시간 프로필은 비선형 회귀법의 수단으로 각 동물당 분석되었다. 지수 모델은 최소제곱법에 의해 데이타로 적합화되었다. i.v. 투여후 프로필에 대해, 오픈 투-컴파트먼트 모델이 사용되었다. s.c. 투여후 프로필에 대해 제1-순서 입력 및 지연 시간을 갖는 오픈 원 컴파트먼트 모델이 사용되었다. i.v. 모델에 대하여, 1/(예측 농도)2의 웨이팅 팩터가 적용되었다.
AUC는 a) 마지막 측정된 값(AUC0-14)까지 사다리꼴 법칙을 이용하여 그리고 b) 14과 무한대(AUC0-∞) 사이의 기간에 대한 추정에 의해 AUC0-14를 완결하여 계산되었다.
요약 및 비교 분석
각 PK 결과는 치료 및 적용 경로에 대해 서술적으로 요약되었다(최소, 중간, 최대, 평균, 표준편차).
이원배치 분산 분석법이 반감기, AUC 및 Cmax(모두 log-변형됨)를 소거하기위해 수행되었다. 고정된 팩터는 성 및 처리 그룹이었다. 처리 그룹사이의 적절한 대비가 평가되었다. 같지 않은 분산이 또한 계산에 포함되었다.
이러한 분석의 목적으로 ln(반감기), ln(AUC) 및 ln(Cmax)는 각각 정상 분포를 따르는 것으로 가정하였다.
소거 반감기는 물질사이에 비교되었으며, AUC 및 Cmax에서 생체이용률은 투-사이드 90%신뢰구간을 이용한 0.1의 알파 수준으로 알부민-융합 AXOKINE?? 그룹에 대한 투여경로 사이에 비교되었다.
결과
도 1에 i.v. 처리된 비융합 AXOKINE?? 그룹에 대해, 도 2에 i.v. 처리된 융합 AXOKINE?? 그룹에 대해, 그리고 도 3에 s.c. 처리된 알부민-융합 AXOKINE?? 그룹에 대해 매시간 AXOKINE?? 농도의 평균 및 표준편차를 나타내었다. s.c. 처리된 비-융합 AXOKINE?? 그룹에 대해서는 농도가 측정될 수 없었다.
비융합 AXOKINE?? 으로 정맥내주사 처리된 동물에서, 그 수준은 주입후 4시간에 1pg/mL이하로 저하되었다. 알부민-융합 AXOKINE??그룹에서, 그 수준은 7일동안 1ng/mL이상으로 유지되었다. 알부민-융합 AXOKINE?? 산물로 피하주사 처리된 동물에서, 그 수준은 약 1일후 피크에 이르렀으며 7일동안 1ng/mL이상으로 유지되었다. 그 약물동력학 결과는 i.v. 처리된 그룹에 대해 표 2에 그리고 s.c. 처리된 그룹에 대해 표 3에 나타내었다. 비-융합 AXOKINE??에 대한 결과 알부민-융합 AXOKINE?? 그룹과 동일한 유니트로 전환되었으나 반감기 및 평균 체류시간은 다른 평가 방법으로 인해 비교될 수 없었다.
표 2
i.v. 투여에 따른 약물동력학 결과
비융합 AXOKINE?? C-말단 알부민-융합 AXOKINE?? N-말단 알부민-융합 AXOKINE??
N 4 4 4
초기 반감기(hr) 평균표준편차중간값범위 0.110.020.110.09-0.13 2.321.142.380.88-3.66 7.081.846.555.50-9.74
말단 반감기(hr) 평균표준편차중간값범위 0.490.190.500.30-0.66 36.215.436.717.5-54.0 23.510.719.915.1-39.1
평균 체류시간(hr) 평균표준편차중간값범위 0.440.100.450.34-0.55 43.717.642.923.2-65.7 17.02.715.915.4-21.0
AUC0-14=AUC0-∞(hr·ng/mL) 평균표준편차중간값범위Geom.평균 SF* 0.970.540.930.44-1.590.851.84 4.6284134,6004,272-5,0394,6141.09 8,3891,6938,3946,475-10,2938,2591.23
Cmax(ng/mL) 평균표준편차중간값범위 2.771.452.681.35-4.35 36294356275-463 820178803632-1,041
총 클리어런스(mL/hr/kg) 평균표준편차중간값범위 11,7746,70910,7355,629-19,995 2.060.332.101.68-2.36 1.180.241.130.95-1.51
총 분포량(mL/kg) 평균표준편차중간값범위 4,7451,7284,5633,089-6,762 87.430.085.753.3-124.8 20.04.520.315.1-24.5
*SF = 분산 인자 = exp[표준편차(log-변형된 값)]
표 3
s.c. 투여에 따른 약물동력학 결과
C-말단 알부민-융합 AXOKINE?? N-말단 알부민-융합 AXOKINE??
N 4 4
래그 타임(hr) 평균표준편차중간값범위 1.750.751.541.11-2.80 3.473.783.420.00-7.05
흡수 반감기(hr) 평균표준편차중간값범위 13.35.510.99.9-21.4 6.015.525.031.35-12.64
종결 반감기(hr) 평균표준편차중간값범위 30.56.831.821.3-37.4 15.41.715.913.0-16.9
AUC0-14=AUC0-∞(hr·ng/mL) 평균표준편차중간값범위Geom.평균 SF* 3,5343833,5983,011-3,9313,5181.12 1,9866101,9161,323-2,7881,9171.36
Cmax(ng/mL) 평균표준편차중간값범위 44.65.545.637.3-50.1 45.514.245.228.5-63.0
tmax(hr) 평균표준편차중간값범위 2402424-24 208248-24
상대 총 클리어런스(mL/hr/kg) 평균표준편차중간값범위 2.750.332.682.42-3.22 5.231.664.933.54-7.50
상대 총 분포량(mL/kg) 평균표준편차중간값범위 118.814.0122.998.6-130.7 113.625.0115.283.4-140.5
*SF = 분산 인자 = exp[표준편차(log-변형된 값)]
표 4는 소거 반감기와 관련된 분산 분석의 결과를 나타낸다. i.v. 주입에 따른 비-융합 및 알부민-융합 AXOKINE?? 사이의 차이는 상당히 현저하였다. 동물의 성은 반감기에 현저한 영향을 주지 않았다.
표 4
물질간 소거 반감기(elimination half-lives)의 비교
경로 파라미터 소거 반감기
i.v. 추정 비율(C-말단 알부민 융합 AXOKINE??/분할가능 AXOKINE??)90% 신뢰성 한계 72.7 38.5-136.4
i.v. 추정 비율(N-말단 알부민 융합 AXOKINE??/분할가능 AXOKINE??)90% 신뢰성 한계 47.5 24.4-92.8
표 5는 절대 생체이용률과 관련된 분산 분석의 결과를 나타낸다. 알부민-융합 산물 모두에 대하여 두 적용 경로 사이의 차이는 소거 반감기와 관련하여 통계학적으로 유의하지 않았다. AUC 및 Cmax와 관련된 차이는 상당히 현저하였다.
표 5
적용 경로사이의 생체이용률 비교
물질 파라미터 소거 반감기 AUC0-14 Cmax
C-말단 알부민-융합 AXOKINE?? 추정 비율(s.c./i.v.)90% 신뢰성 한계 0.89 0.52-1.55 0.76 0.69-0.84 0.13 0.10-0.16
N-말단 알부민-융합 AXOKINE?? 추정 비율(s.c./i.v.)90% 신뢰성 한계 0.70 0.42-1.17 0.23 0.15-0.37 0.05 0.03-0.11
비융합 AXOKINE??의 곡선 및 최대 플라즈마 수준하의 면적에 대한 값은 N- 및 C-말단 알부민-융합 AXOKINE??과 직접 비교될 수 없다. 이와 반대로, 반감기의 비교는 유효하다.
알부민-융합 AXOKINE?? 제조물은 모두 비융합 AXOKINE??에 비하여 i.v. 적용후 플라즈마로부터 현저히 연장된 소거를 보였다. C-말단 알부민-융합 AXOKINE??은 비융합 AXOKINE??보다 72시간 더 긴 평균 소거 반감기를 보였다. N--말단 알부민-융합 AXOKINE??은 비융합 AXOKINE??보다 48시간 더 긴 평균 소거 반감기를 보였다.
AUC에 있어서, s.c. 주입후 절대 생체이용률은 C-말단 알부민-융합 AXOKINE??에 대해 76%이었으며 N-말단 알부민-융합 AXOKINE??에 대해 23%이었다. 비융합 AXOKINE??의 플라즈마 수준이 s.c. 적용후 검출 한계이하이었기 때문에, i.v. 적용과의 비교는 이루어지지 못했다.
실시예 4
약력학
본 실시예의 목적은 플라시보 또는 비융합 AXOKINE??에 비교하여 N- 및 C-말단 알부민-융합 AXOKINE??의 렙틴-결핍 또는 다이어트-유도 비만 마우스에서 체중 감소에 대한 효과를 평가하기위한 것이었다.
약력학 동물 시험의 시험 디자인, 파트 I
본 시험은 총 70마리 암컷 C57BL/6Jlepob(ob/ob), 및 41마리 수컷과 41마리 암컷 C57BL/6J 마우스를 포함하는 두 실험 세팅(렙틴-결핍 유도된 비만과 다이어트 유도된 비만)을 이용하여 무작위로 일부 숨겨진, 병렬식 13-강화 시험(parallel, 13-armed trial)으로 디자인되었다.
실험 동물
C57BL/6Jlepob(ob/ob) 마우스는 약 3개월간 표준 다이어트가 주어졌다. 이 시기도중, C57BL/6Jlepob(ob/ob) 마우스는 렙틴-결핍과 관련된 비조절 음식 섭취에 기인하여 중량이 매우 증가되었다. 와일드-타입 C57BL/6J 마우스에서, 지방 45%를 함유하는 고칼로리 음식을 공급하여 비만이 유도되었다. 체중은 치료적 처리에 앞서 이러한 비만 유도 단계도중 매주 기록되었다. 평균 중량이 기준선의 적어도 130%로 증가한 후, 시험 물질을 이용한 처리가 시작되었다. 시험 물질(비-융합 AXOKINE??, 알부민-융합 AXOKINE??, 플라시보)은 7일간에 걸쳐 매일 피하주사로 투여되었다. 처리 단계 도중 체중을 매일 측정하였다. 시험 물질의 상대적 효과를 평가하기위해 기준선 및 플라시보와 비교한 평균 중량 손실을 계산하였다.
투약 및 투여량 연구
시험 물질 1: 플라시보(5mM 포스페이트 버퍼 pH 8.3)
내독소 함량: 0.007 EU/mL
모액 농도: n.a.
적용량: 250㎕a
단일 투여/경로: n.a./s.c.
빈도: 7일간 매일 주사
시험 물질 2: 비-융합 AXOKINE??
내독소 함량: 14.9 EU/mL
모액 농도: 0.1mg/mL
적용량: 250㎕a
단일 투여/경로: 표 1 및 2에 따름/s.c.
빈도: 7일간 매일 주사
시험 물질 3: N-말단 알부민-융합 AXOKINE??
내독소 함량: 1.8 EU/mL
모액 농도: 5mg/mL
적용량: 250㎕a
단일 투여/경로: 표 1 및 2에 따름/s.c.
빈도: 7일간 매일 주사
시험 물질 4: C-말단 알부민-융합 AXOKINE??
내독소 함량: 64 EU/mL 및 32 EU/mL
모액 농도: 0.2mg/mL
적용량: 250㎕a
단일 투여/경로: 표 1 및 2에 따름/s.c.
빈도: 7일간 매일 주사
a모든 마우스는 치료 1일에 시험물질 250㎕을 투여받았으며, 그 다음 투여는 투여량의 조절로 체중 변화에 맞추어 이루어졌다. 그룹 13의 마우스(1200㎍/kg C-말단 AXOKINE??)는 83일에 약 390㎕을 투여받았다.
표 6 처리 그룹 C57BL/6Jlepob(ob/ob) 마우스
No. 처리 투여/부피/스케쥴/경로 N(m/f)
1 플라시보 -/250㎕/7일간 매일 주사/s.c. 10f
2 비융합 AXOKINE?? 10㎍/kg/250㎕/7일간 매일 주사/s.c. 5f
3 비융합 AXOKINE?? 100㎍/kg/250㎕/7일간 매일 주사/s.c. 5f
4 비융합 AXOKINE?? 1-2일에 300㎍/kg, 처리일 3-7일에 200㎍/kg/250㎕/7일간 매일 주사/s.c. 5f
5 N-알부민-융합 AXOKINE?? 40㎍/kg/250㎕/7일간 매일 주사/s.c. 5f
6 N-알부민-융합 AXOKINE?? 1-2일에 280㎍/kg, 처리일 3-7일에 200㎍/kg/250㎕/7일간 매일 주사/s.c. 5f
7 N-알부민-융합 AXOKINE?? 400㎍/kg/250㎕/7일간 매일 주사/s.c. 5f
8 N-알부민-융합 AXOKINE?? 1-2일에 1200㎍/kg, 처리일 3-7일에 800㎍/kg/250㎕/7일간 매일 주사/s.c. 5f
9 C-알부민-융합 AXOKINE?? 40㎍/kg/250㎕/7일간 매일 주사/s.c. 5f
10 C-알부민-융합 AXOKINE?? 1-2일에 280㎍/kg, 처리일 3-7일에 200㎍/kg/250㎕/7일간 매일 주사/s.c. 5f
11 C-알부민-융합 AXOKINE?? 400㎍/kg/250㎕/7일간 매일 주사/s.c. 5f
12 C-알부민-융합 AXOKINE?? 1-2일에 1200㎍/kg, 처리일 3-7일에 800㎍/kg/390-250㎕/7일간 매일 주사/s.c. 5f
표 7 처리 그룹 C57BL/6J 마우스
No. 처리 투여/부피/스케쥴/경로 N(m/f)
1 플라시보 -/250㎕/7일간 매일 주사/s.c. 5m/5f
2 비융합 AXOKINE?? 10㎍/kg/250㎕/7일간 매일 주사/s.c. 3m/3f
3 비융합 AXOKINE?? 100㎍/kg/250㎕/7일간 매일 주사/s.c. 3m/3f
4 비융합 AXOKINE?? 1-2일에 300㎍/kg, 처리일 3-7일에 200㎍/kg/250㎕/7일간 매일 주사/s.c. 3m/3f
5 N-알부민-융합 AXOKINE?? 40㎍/kg/250㎕/7일간 매일 주사/s.c. 3m/3f
6 N-알부민-융합 AXOKINE?? 1-2일에 280㎍/kg, 처리일 3-7일에 200㎍/kg/250㎕/7일간 매일 주사/s.c. 3m/3f
7 N-알부민-융합 AXOKINE?? 400㎍/kg/250㎕/7일간 매일 주사/s.c. 3m/3f
8 N-알부민-융합 AXOKINE?? 1-2일에 1200㎍/kg, 처리일 3-7일에 800㎍/kg/250㎕/7일간 매일 주사/s.c. 3m/3f
9 C-알부민-융합 AXOKINE?? 40㎍/kg/250㎕/7일간 매일 주사/s.c. 3m/3f
10 C-알부민-융합 AXOKINE?? 1-2일에 280㎍/kg, 처리일 3-7일에 200㎍/kg/250㎕/7일간 매일 주사/s.c. 3m/3f
11 C-알부민-융합 AXOKINE?? 400㎍/kg/250㎕/7일간 매일 주사/s.c. 3m/3f
12 C-알부민-융합 AXOKINE?? 1-2일에 1200㎍/kg, 처리일 3-7일에 800㎍/kg/390-250㎕/7일간 매일 주사/s.c. 3m/3f
투여에 따른 감소는 ob/ob 뿐만 아니라 와일드 타입 마우스에서도 이루어졌다.
Delta로 부터 얻어진 비융합 AXOKINE??: 1-2일에 300㎍/kg 에서 3-7일에 200㎍/kg
N,C-말단 AXOKINE??: 1-2일에 280㎍/kg 에서 3-7일에 200㎍/kg
N,C-말단 AXOKINE??: 1-2일에 1200㎍/kg 에서 3-7일에 800㎍/kg
무작위화는 C57BL/6Jlepob(ob/ob) 및 C57BL/6J 마우스에 대해 별도로 무작위화 리스트에 따라 수행되었다. 마우스는 케이지에 대해 무작위화되었으며 케이지들은 처리에 대해 무작위화되었다.
효능 변수: 체중(0-7일간 매일 측정됨)
분석방법
체중은 동물의 무게를 재어 기록하였다.
통계법
일차 효능 변수: 7일 및 0일 그리고 최대 102일 사이의 체중 차이. 비융합 AXOKINE??, N-말단 알부민-융합 AXOKINE??, 및 C-말단 알부민-융합 AXOKINE?? 에 대한 C57BL/6Jlepob(ob/ob) 및 C57BL/6J 마우스의 투여-반응 관계를 별도로 분산모델의 일 분석으로 분석하였다.
최소의 효과적인 투여량을 확인하기위해 대비(예, 헬머트 또는 역 헬머트 대비)를 이용하여 플라시보와의 차이 투여량의 연속 비교. 차이에 대하여 2-사이드 t-테스트 및 2-사이드 95% 신뢰구간을 이용한 등몰 투여량의 쌍 비교.
비융합 AXOKINE??과 관련된 N-말단 알부민-융합 AXOKINE?? 및 C-말단 알부민-융합 AXOKINE??의 전체적 평가는 log-변형된 투여량을 이용한 평행선 평가의 수단으로 수행되었다. 유도된 유효성은 95% 신뢰구간으로 지지되었다.
결과
일차 종점의 통계적 분석
종점: 82일부터 91, 92, 93, 94, 95, 96, 102일까지의 체중 변화
통계: 정연한 가설 패밀리로 ANOVA F-테스트. 92일에 시작하여 가설은 거절되었으며 단, 이에 상응하는 F-테스트는 유효하였으며 앞선 가설 또한 거절되었다.
참고문헌: Bauer P: Multiple tests in clinical trials. Statistics in Medicine, 10:871 890, 1991
ob/ob 마우스에서 중량 감소
도 4, 5, 6 및 7은 렙틴 결핍 마우스에서 비-융합 AXOKINE??과 알부민 융합 AXOKINE??의 등몰 투여량을 비교한 것이다.
요약하면, 약력학 데이타는 렙틴 결핍 마우스에서 알부민 융합 AXOKINE??은 투여 그룹 11, 12 및 13에 있어서 비융합 AXOKINE??보다 통계학적으로 유효한 우수성이 있음을 나타낸다. 와일드 타입 마우스에서, 알부민 융합 AXOKINE??은 그룹 12에서 비융합 AXOKINE??에 비하여 통계학적으로 우수하다.
약력학 동물 시험의 시험 디자인, 파트 II
본 시험은 총 82마리 암컷 B6.V-Lepob(ob/ob), 및 41마리 수컷과 41마리 암컷 C57BL/6J 마우스를 포함하는 두 실험 세팅(렙틴-결핍 유도된 비만과 다이어트 유도된 비만)을 이용하여 무작위로 일부 숨겨진, 병렬식 11-강화 시험(parallel, 11-armed trial)으로 디자인되었다. 비융합 AXOKINE??의 제한된 생체이용률때문에 렙틴-결핍 마우스의 선택된 처리 그룹만이 본 시험의 처리 단계에 포함되었다(표 8).
표 8: 처리 그룹
No. 처리 투여/부피/스케쥴/경로 N(m/f)
1 플라시보 -/5㎕/g/7일간 매일 주사/s.c. 10f
2 비융합 AXOKINE?? 100㎍/kg/5㎕/g/1, 4, 7일/s.c. 6f
3 비융합 AXOKINE?? 300㎍/kg/5㎕/g/1, 4, 7일/s.c. 6f
4 비융합 AXOKINE?? 100㎍/kg/5㎕/g/7일간 매일 주사/s.c. 6f
5 비융합 AXOKINE?? 300㎍/kg/50㎕/g/7일간 매일 주사/s.c. 6f
6 C-알부민-융합 AXOKINE?? 400㎍/kg/5㎕/g/1, 4, 7일/s.c. 6f
7 C-알부민-융합 AXOKINE?? 1200㎍/kg/5㎕/g/1, 4, 7일/s.c. 6f
8 C-알부민-융합 AXOKINE?? 3600㎍/kg/10㎕/g/1, 4, 7일/s.c. 6f
9 C-알부민-융합 AXOKINE?? 400㎍/kg/5㎕/g/7일간 매일 주사/s.c. 6f
10 C-알부민-융합 AXOKINE?? 1200㎍/kg/5㎕/7일간 매일 주사/s.c. 6f
11 AXOKINE??(안정성:실온에서 14일) 1200㎍/kg/5㎕/7일간 매일 주사/s.c. 6f
스케쥴
B6.V-Lepob마우스는 80일까지 표준 다이어트가 주어졌다. 비융합 AXOKINE?? 또는 C-알부민-융합 AXOKINE?? 을 이용한 처리는 81일에 시작하여 7일 연속으로(81, 82, 83, 84, 85, 86, 87일) 혹은 1, 4, 7일에만(81, 84, 87일) 처리하였다.
체중은 처리후 정지기 21일(108일)까지 측정되었다. 체중 변화 및 이와 관련된 분석은 81일의 체중과 관련된 것이다.
이에 상응하는 시점은 하기 표에 요약된다:
표 9 처리 스케쥴 B6.V-Lepob(ob/ob) 마우스
시험일 처리일
81일84일87일101일108일 1일4일7일21일28일
시험 물질의 투여
시험 물질 1: 플라시보(5mM 포스페이트 버퍼 pH8.3)
제조자: Aventis Behring(Laboratory Dr. H.Metzner)
뱃치 번호: -
내독소 함량: n.t.
모액 농도: n.a.
적용량: 5㎕/g
단일 투여/경로: n.a./s.c.
빈도: 7일간 매일 주사
시험 물질 2: 비-융합 AXOKINE??(엔테로키나아제-분할된 C-말단 알부민-융합 AXOKINE??)
제조자: Delta Biotechnology Ltd., Laboratory Dr. D.Sleep 1675#40)
뱃치 번호
내독소 함량: 18 EU/mL
모액 농도: 약 0.1mg/mL(스탠다드로서 CNTF와 비교하여 쿠마시 염색을 이용한 SDS-PAGE에 기초한 가정, 별첨 B)
적용량: 5㎕/g
단일 투여/경로: 표 1에 따름/s.c.
빈도: 1, 4, 7일에 단일 주사 또는 7일간 매일 주사
시험 물질 3: C-말단 알부민-융합 AXOKINE??
제조자: Delta Biotechnology Ltd., Laboratory Dr. D.Sleep/Aventis Behring GmbH, Laboratory Dr. H.Metzner 091002
뱃치 번호: 091002
내독소 함량 16 EU/mL
모액 농도: 약 0.4mg/mL(스탠다드로서 HSA와 비교하여 쿠마시 염색을 이용한 SDS-PAGE에 기초한 가정, 별첨 B)
적용량: 5㎕/ga
단일 투여/경로: 표 1에 따름/s.c.
빈도: 1, 4, 7일에 단일 주사 또는 7일간 매일 주사
시험 물질 4: 14일동안 실온에서 보관된 C-말단 알부민-융합 AXOKINE??
제조자: Delta Biotechnology Ltd., Laboratory Dr. D.Sleep/Aventis Behring GmbH, Laboratory Dr. H.Metzner 091002
뱃치 번호: 091002
내독소 함량 16 EU/mL
모액 농도: 약 0.4mg/mL(스탠다드로서 HSA와 비교하여 쿠마시 염색을 이용한 SDS-PAGE에 기초한 가정, 별첨 B)
적용량: 5㎕/ga
단일 투여/경로: 표 1에 따름/s.c.
빈도: 1, 4, 7일에 단일 주사 또는 7일간 매일 주사
a모든 마우스는 시험물질 5㎕/g을 투여받았다. 단, C-말단 AXOKINE??으로 처리된 마우스는 10㎕/g(3600㎍/kg)을 투여받았다.
동물 모델
B6.V-Lepob(ob/ob) 마우스는 12주간 표준 다이어트가 주어졌다. 이 시기도중, 마우스는 렙틴-결핍과 관련된 비조절 음식 섭취에 기인하여 중량이 매우 증가되었다. 체중은 치료적 처리에 앞서 이러한 비만 유도 단계도중 매주 기록되었다. 단, 49-66일에는 동물들의 무게를 재지 않았다. 시험 물질(AXOKINE??, C-말단 알부민-융합 AXOKINE??, 플라시보)은 7일간에 걸쳐 매일 피하주사로 투여되거나 처리일 1, 4, 7일에 3회 단일 주사로 투여되었다. 처리 단계 도중 체중을 매일 측정하였다. 그후, 14일동안 이틀에 한번(즉, 일주일에 3회) 측정하였으며 처리후 21일(처리 시작후 28일=시험 108일)에 한번 더 측정하였다. 시험 물질의 상대적 효과를 평가하기위해 기준선 및 플라시보와 비교한 평균 중량 손실을 계산하였다.
무작위화
무작위화는 상기 무작위화 리스트에 따라 수행되었다. 마우스를 케이지에 대해 무작위화한 후, 케이지들은 처리에 대해 무작위화되었다.
효능 변수
다수: 처리일 1일(시험 81일)에서부터 처리일 7일(시험 88, 87, 86, 85, 84, 83 및 82일)까지 체중 변화(g)
소수: 처리 시작후 28일(시험 108일)에서 체중. 시험일 81일에서부터 89, 91, 94, 96, 98, 101, 108일까지의 체중 변화.
분석방법
체중은 동물의 무게를 재어 기록하였다.
통계법
정연한 가설 패밀리로 ANOVA F-테스트. 88일에 시작하여 하향으로 진행된 경우, 가설은 거절되었으며 단, 이에 상응하는 F-테스트는 유효하였으며(p≤0.05) 앞선 가설 또한 거절되었다(p≤0.05). 89일에 시작하여 108일까지 상향으로 진행된 경우에 같은 방법을 적용하였다. 상기 방법은 멀티플 수준 0.05를 그 날과 관련된 7 가설로 구성된 한 세트의 비교로 관리한다.
4 블록의 분석이 수행되었다: 표 10 및 11은 플라시보에 대한 시험을 위한 시험 판결을 편성한다. 즉, 활성 처리 그룹(그룹 2-11)은 모델 유효성을 체크하기위해 플라시보(그룹 1)와 비교되었다. 등몰 투여량의 분석은 표 12 및 13으로 제공되며, 처리 스케쥴은 표 14 및 15로 비교된다. 최종적으로, 유효성 평가는 반응 기준으로서 제공되는 88일 체중변화와 함께 log-투여량에 대한 평행선 평가법을 이용하여 표 16에 요약된다. 시험 접근의 적합성(즉, 선형성, 평행도)에 대한 시험은 수행되지 않았다.
결과
체중에 대한 효과
시험 처리물은 81-87일에 투여되었다.
플라시보와의 비교
시험 물질을 투여받은 모든 그룹은 82일 및 101일 사이에 플라시보에 대해 현저한 차이를 보였다(표 10 및 11).
표 10: 플라시보와의 비교에 대한 시험 판결(모델의 유효성-82일)
비교 일
88 87 86 85 84 83 82
2와 1 * * * * * * *
3과 1 * * * * * * *
4와 1 * * * * * * *
5와 1 * * * * * * *
6과 1 * * * * * * *
7과 1 * * * * * * *
8과 1 * * * * * * *
9와 1 * * * * * * *
10과 1 * * * * * * *
11과 1 * * * * * * *
주:*(#)는 제1(2) 그룹이 비교시 제2(1) 그룹보다 현저히(p<0.05) 보다 많은 중량 감소를 나타냄을 표시한다.
"-"는 유의성이 없음을 표시한다.
표 11: 플라시보와의 비교에 대한 시험 판결(모델의 유효성)-[89-108]
비교 일
89 91 94 96 98 101 108
2와 1 * * * * * * -
3과 1 * * * * * * -
4와 1 * * * * * * *
5와 1 * * * * * * *
6과 1 * * * * * * -
7과 1 * * * * * * *
8과 1 * * * * * * *
9와 1 * * * * * * *
10과 1 * * * * * * *
11과 1 * * * * * * *
주:*(#)는 제1(2) 그룹이 비교시 제2(1) 그룹보다 현저히(p<0.05) 보다 많은 중량 감소를 나타냄을 표시한다.
"-"는 유의성이 없음을 표시한다.
등몰 투여의 비교
표 12: 등몰 투여에 대한 시험 판결 - 88-82일
비교 2. 일
88 87 86 85 84 83 82
1, 4, 7일 스케쥴
2와 6 # # # # # - -
3과 7 # # # # # # #
1-7일 스케쥴
4와 9 # # # # - - -
5와 10 # # # # # - -
5와 11 # # # # # # -
주:*(#)는 제1(2) 그룹이 비교시 제2(1) 그룹보다 현저히(p<0.05) 보다 많은 중량 감소를 나타냄을 표시한다.
"-"는 유의성이 없음을 표시한다.
표 13: 등몰 투여에 대한 시험 판결 - 89-108일
비교 2. 일
88 87 86 85 84 83 82
1, 4, 7일 스케쥴
2와 6 # # # # - - -
3과 7 # # # # # # #
1, 4, 7일 스케쥴
4와 9 # # # - - - -
5와 10 # # # # # - -
5와 11 # # # # # # #
주:*(#)는 제1(2) 그룹이 비교시 제2(1) 그룹보다 현저히(p<0.05) 보다 많은 중량 감소를 나타냄을 표시한다.
"-"는 유의성이 없음을 표시한다.
치료 스케쥴의 비교
표 14: 치료 스케쥴의 비교에 대한 시험 판결(1, 4, 7일과 88-82일)
비교 2. 일
88 87 86 85 84 83 82
비융합 AXOKINE??
2와 4 # # # # # # -
3과 5 # # # # # # -
C-알부민-융합 AXOKINE??
6과 9 # # # # # # -
7과 10 # # # # # - -
7과 11 # # # # # # #
주:*(#)는 제1(2) 그룹이 비교시 제2(1) 그룹보다 현저히(p<0.05) 보다 많은 중량 감소를 나타냄을 표시한다.
"-"는 유의성이 없음을 표시한다.
표 15: 치료 스케쥴의 비교에 대한 시험 판결(1, 4, 7일과 89-108일)
비교 2. 일
89 91 94 96 98 101 108
비융합 AXOKINE??
2와 4 # # # # # - -
3과 5 # # # # # # #
C-알부민-융합 AXOKINE??
6과 9 # # # # # # #
7과 10 # # # # # - -
7과 11 # # # # # # -
주:*(#)는 제1(2) 그룹이 비교시 제2(1) 그룹보다 현저히(p<0.05) 보다 많은 중량 감소를 나타냄을 표시한다.
"-"는 유의성이 없음을 표시한다.
효능 평가
표 16: 88일 체중변화를 이용한 효능#) 평가
비교 효능
7일간 매일 주사: 알부민-융합 AXOKINE??/AXOKINE?? 1.90
1, 4, 7일 주사: 알부민-융합 AXOKINE??/AXOKINE?? 2.33
알부민-융합 AXOKINE??: 7일간 매일/1, 4, 7일 9.13
비융합 AXOKINE??: 7일간 매일/1, 4, 7일 1.85
1, 4, 7일 주사 알부민-융합 AXOKINE??/7일간 매일 주사 비융합 AXOKINE?? 0.87
#) log-투여의 88일 체중변화에 대한 평행선 평가가 사용되었으며 그룹 1 및 11은 계산에 포함되지 않았다.
알부민-융합 AXOKINE의 플라즈마 반감기는 토끼에서 조사된 바와 같이 연장된 것으로 관찰되었으며(비융합 AXOKINE보다 72시간 더 연장됨) 한편 상기 융합 단백질을 s.c. 투여한 경우는 매우 놀라웠다. 첫째로, s.c. 투여는 감소된 흡수율을 나타내는 것으로 알려져 있으나 이 경우에는 그렇지 않았다. 두번째로, 사람 플라즈마 단백질의 플라즈마 반감기는 동물에서 종종 극적으로 감소되는 것으로 일반적으로알려져있기 때문에, 이러한 연장은 사람에서는 보다 두드러짐을 나타낸다. 이는 마우스에서 약력학 발견에 의해 확인된 것이며, 비융합 AXOKINE을 매일 적용한 경우와 비교하여 거의 대등한 효능으로 상기 융합 단백질을 3일 마다 투여하는 것이 가능하였다. 결론적으로, 본 발명자들은 사람에 매주 또는 그보다 더 긴 간격으로 상기 융합 단백질을 투여하는 것이 가능하리라 추측한다. 또한 CNTF에 대한 항체 생성의 비율이 감소될 수 있음에 따라 효능 및 안전성은 증가될 수 있을 것이다.
임상적 관찰
상기 처리 종료후 모두 6마리 동물이 시험으로부터 조속히 회수되었다.
84일에 그룹 8, 10 및 11의 모든 동물(매일 1200㎍/kg C-AFP 또는 3600㎍/kg C-AFP 3x 투여받음)은 둔감성, 피부의 주름진 코트, 전반적 발적 및 감소된 정상 상태를 보였다. 1200㎍을 투여받은 12마리 동물중 최고 10마리 및 3600㎍으로 처리된 모든 동물들은 이틀후 감소된 물 섭취를 동반한 유혈 설사가 일어났으며, 이는 심한 탈수를 일으켰다. 따라서 89일에 각 그룹 10, 11에서 한마리 동물, 91일에 그룹 8에서 3마리 동물은 임종시에 안락사되었다. 그룹 10의 한마리가 추가로 96일에 죽었다.
부검시 심한 비만, 탈수, 및 팽창된 장과 함께 간 및 콩팥의 지방 생성이 조사된 모든 동물에서 발견되었다.
결론
처리 시작(81일)전 총 70마리 동물이 이용가능하였다. 즉, 플라시보 그룹(그룹 1)의 10마리 동물, 및 10개의 활성적 처리 그룹에서 각 6마리씩이 이용가능하였다. 총 6마리 동물이 시험 코스도중 안락사되거나 죽었다. 즉, 처리 종료후 89일에 그룹 10, 11에서 각 한마리씩, 91일에 그룹 8에서 3마리 동물, 그리고 96일에 그룹 10에서 한마리가 안락사되거나 죽었다. 이러한 케이스 및 관찰된 임상적 증상은 최고 투여량 그룹에 국한되어 있었으며, 따라서 이는 처리와 관련성이 있는 것으로 간주된다.
플라시보 처리된 동물의 중량은 81-88일에서 거의 일정하였으나(88일에 평균 중량 변화: -0.4%), 계속된 시험 코스에서 108일까지의 중량 증가(108일에 평균 변화: 7.2%)는 주목할만한 것이었다. 활성 물질로 처리한 경우는(그룹 2-11) 플라시보와 비교하여 현저한 투여량-의존성 체중 감소를 나타내었다(표 10). 처리 종결후 21일에서조차 활성 물질로 처리된 동물은 플라시보 동물보다 현저히 높은 체중 감소를 보였다(표 11). 등몰 투여를 비교한 경우, 알부민-융합-AXOKINE??은 처리 스케쥴이 어떻게 적용되었든 체중 감소에 있어서 비-융합 AXOKINE??보다 상당히 우수하였다(표 12, 도 14). 처리 마지막후 이러한 효과는 108일까지에서도 그룹 7, 11에 대하여 투여량-의존성을 계속 보였다(표 13).
7일에 걸친 매일 주입은 1, 4, 7일에 주입한 경우보다 치료 기간 및 21일의 후속기간 모두에 있어 두드러진 효과를 나타내었다(표 7, 8). 이는 비-융합 AXOKINE?? 및 C-알부민 융합-AXOKINE과의 비교에도 이루어졌다.
효능 평가는 88일에서의 체중변화에 국한되었다. 알부민-융합-AXOKINE??은 각각 7일 처리 스케쥴 및 1, 4, 7일에서의 스케쥴에 있어서 비-융합 AXOKINE??보다 1.9배 및 2.3배 높은 효능을 나타내었다(표 16). 1-7일에서의 처리는 1, 4, 7일에서의 처리보다 더 효능이 있었다. 비-융합 AXOKINE??에 대해 1.85의 효능이 계산되었으며 알부민-융합 AXOKINE??에 대해서는 9.13의 효능이 계산되었다.
1, 4, 7일에 알부민-융합 AXOKINE??으로 주입한 경우의 효능은 비융합 AXOKINE??으로 7일 연속 매일 주입된 경우의 효능과 거의 같았다.
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Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285 Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415 Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430 Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val 565 570 575 Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 580 585 590 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr 595 600 605 Pro His Arg Arg Asp Leu Ala Ser Arg Ser Ile Trp Leu Ala Arg Lys 610 615 620 Ile Arg Ser Asp Leu Thr Ala Leu Thr Glu Ser Tyr Val Lys His Gln 625 630 635 640 Gly Leu Asn Lys Asn Ile Asn Leu Asp Ser Ala Asp Gly Met Pro Val 645 650 655 Ala Ser Thr Asp Arg Trp Ser Glu Leu Thr Glu Ala Glu Arg Leu Gln 660 665 670 Glu Asn Leu Gln Ala Tyr Arg Thr Phe His Val Leu Leu Ala Arg Leu 675 680 685 Leu Glu Asp Gln Gln Val His Phe Thr Pro Thr Glu Gly Asp Phe His 690 695 700 Gln Ala Ile His Thr Leu Leu Leu Gln Val Ala Ala Phe Ala Tyr Gln 705 710 715 720 Ile Glu Glu Leu Met Ile Leu Leu Glu Tyr Lys Ile Pro Arg Asn Glu 725 730 735 Ala Asp Gly Met Pro Ile Asn Val Gly Asp Gly Gly Leu Phe Glu Lys 740 745 750 Lys Leu Trp Gly Leu Lys Val Leu Gln Glu Leu Ser Gln Trp Thr Val 755 760 765 Arg Ser Ile His Asp Leu Arg Phe Ile Ser Ser His Gln Thr Gly 770 775 780 <210> 2 <211> 791 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the mature C-terminal rHA-3xFLAG-(cleavable)-AXOKINE(R) <220> <221> CHAIN <222> (1)..(791) <400> 2 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285 Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415 Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430 Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val 565 570 575 Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly 580 585 590 Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ala 595 600 605 Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Arg Asp Leu Ala Ser 610 615 620 Arg Ser Ile Trp Leu Ala Arg Lys Ile Arg Ser Asp Leu Thr Ala Leu 625 630 635 640 Thr Glu Ser Tyr Val Lys His Gln Gly Leu Asn Lys Asn Ile Asn Leu 645 650 655 Asp Ser Ala Asp Gly Met Pro Val Ala Ser Thr Asp Arg Trp Ser Glu 660 665 670 Leu Thr Glu Ala Glu Arg Leu Gln Glu Asn Leu Gln Ala Tyr Arg Thr 675 680 685 Phe His Val Leu Leu Ala Arg Leu Leu Glu Asp Gln Gln Val His Phe 690 695 700 Thr Pro Thr Glu Gly Asp Phe His Gln Ala Ile His Thr Leu Leu Leu 705 710 715 720 Gln Val Ala Ala Phe Ala Tyr Gln Ile Glu Glu Leu Met Ile Leu Leu 725 730 735 Glu Tyr Lys Ile Pro Arg Asn Glu Ala Asp Gly Met Pro Ile Asn Val 740 745 750 Gly Asp Gly Gly Leu Phe Glu Lys Lys Leu Trp Gly Leu Lys Val Leu 755 760 765 Gln Glu Leu Ser Gln Trp Thr Val Arg Ser Ile His Asp Leu Arg Phe 770 775 780 Ile Ser Ser His Gln Thr Gly 785 790 <210> 3 <211> 783 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the mature N-terminal AXOKINE(R) <400> 3 Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Arg Asp Leu Ala 1 5 10 15 Ser Arg Ser Ile Trp Leu Ala Arg Lys Ile Arg Ser Asp Leu Thr Ala 20 25 30 Leu Thr Glu Ser Tyr Val Lys His Gln Gly Leu Asn Lys Asn Ile Asn 35 40 45 Leu Asp Ser Ala Asp Gly Met Pro Val Ala Ser Thr Asp Arg Trp Ser 50 55 60 Glu Leu Thr Glu Ala Glu Arg Leu Gln Glu Asn Leu Gln Ala Tyr Arg 65 70 75 80 Thr Phe His Val Leu Leu Ala Arg Leu Leu Glu Asp Gln Gln Val His 85 90 95 Phe Thr Pro Thr Glu Gly Asp Phe His Gln Ala Ile His Thr Leu Leu 100 105 110 Leu Gln Val Ala Ala Phe Ala Tyr Gln Ile Glu Glu Leu Met Ile Leu 115 120 125 Leu Glu Tyr Lys Ile Pro Arg Asn Glu Ala Asp Gly Met Pro Ile Asn 130 135 140 Val Gly Asp Gly Gly Leu Phe Glu Lys Lys Leu Trp Gly Leu Lys Val 145 150 155 160 Leu Gln Glu Leu Ser Gln Trp Thr Val Arg Ser Ile His Asp Leu Arg 165 170 175 Phe Ile Ser Ser His Gln Thr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 180 185 190 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg 195 200 205 Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala 210 215 220 Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu 225 230 235 240 Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser 245 250 255 Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu 260 265 270 Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys 275 280 285 Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys 290 295 300 Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val 305 310 315 320 Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr 325 330 335 Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu 340 345 350 Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln 355 360 365 Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg 370 375 380 Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser 385 390 395 400 Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg 405 410 415 Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu 420 425 430 Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu 435 440 445 Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu 450 455 460 Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro 465 470 475 480 Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met 485 490 495 Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp 500 505 510 Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe 515 520 525 Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu 530 535 540 Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala 545 550 555 560 Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys 565 570 575 Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu 580 585 590 Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg 595 600 605 Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val 610 615 620 Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu 625 630 635 640 Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn 645 650 655 Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr 660 665 670 Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala 675 680 685 Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr 690 695 700 Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln 705 710 715 720 Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys 725 730 735 Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe 740 745 750 Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu 755 760 765 Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 770 775 780

Claims (32)

  1. 알부민, 또는 그 프레그먼트나 변이체 또는 유도체 및 섬모 신경영양 인자(CNTF) 수용체를 활성화하는 적어도 하나의 생물학적으로 활성적인 펩타이드나 단백질, 또는 그 프레그먼트나 변이체 또는 유도체를 포함하는 융합 단백질.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 섬모 신경영양 인자(CNTF) 수용체를 활성화하는 적어도 하나의 펩타이드나 단백질은 CNTF 또는 그 프레그먼트나 변이체 또는 유도체인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 CNTF는 AXOKINE??인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  4. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질의 생체내 반감기는 그 비융합된 생물학적으로 활성적인 펩타이드 또는 단백질의 생체내 반감기보다 우수한 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  5. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질의 보존기간은 그 비융합된 생물학적으로 활성적인 펩타이드 또는 단백질의 보존기간보다 우수한 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  6. 제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 효모에서 발현되는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  7. 제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 포유류 세포에서 발현되는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  8. 제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유류 세포는 사람 세포인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  9. 제 1항 내지 제 8항중 어느 한 항의 융합 단백질 유효량 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 의약 조성물.
  10. 비만 및 이와 관련된 질병 치료용 약제를 제조하는데 사용되는 제 1항 내지 제 8항중 어느 한 항의 융합 단백질.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 비만과 관련된 질병은 당뇨, 고혈당증 또는 고인슐린증인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  12. 섬모 신경영양 인자(CNTF) 수용체를 활성화하는 생물학적으로 활성적인 펩타이드 또는 단백질을 알부민과 결합시켜 알부민-융합된 생물학적으로 활성적인 펩타이드 또는 단백질을 형성하는 단계 및 상기 알부민-융합된 생물학적으로 활성적인 펩타이드 또는 단백질을 포유류에 투여하는 단계를 포함하며, 이에 따라 상기 알부민-융합된 생물학적으로 활성적인 펩타이드 또는 단백질의 반감기는 그 연결되는 알부민이 결핍된 생물학적으로 활성적인 펩타이드 또는 단백질의 반감기에 비해 적어도 2-배 연장되는 것을 특징으로 하는, 포유류에서 섬모 신경영양 인자(CNTF) 수용체를 활성화하는 생물학적으로 활성적인 펩타이드 또는 단백질, 또는 그 프레그먼트나 변이체 또는 유도체의 반감기를 연장시키는 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 생물학적으로 활성적인 펩타이드 또는 단백질은 CNTF 또는 그 프레그먼트나 변이체 또는 유도체인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 12항 내지 제 13항중 어느 한 항에 있어서, 상기 알부민-융합된 생물학적으로 활성적인 펩타이드 또는 단백질은 그 연결되는 알부민이 결핍된 생물학적으로 활성적인 펩타이드 또는 단백질의 반감기에 비해 적어도 5-배 연장되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 12항 내지 제 13항중 어느 한 항에 있어서, 상기 알부민-융합된 생물학적으로 활성적인 펩타이드 또는 단백질은 그 연결되는 알부민이 결핍된 생물학적으로 활성적인 펩타이드 또는 단백질의 반감기에 비해 적어도 10-배 연장되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 12항 내지 제 13항중 어느 한 항에 있어서, 상기 알부민-융합된 생물학적으로 활성적인 펩타이드 또는 단백질은 그 연결되는 알부민이 결핍된 생물학적으로 활성적인 펩타이드 또는 단백질의 반감기에 비해 적어도 50-배 연장되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 혈뇌 장벽(blood brain barrier)을 지나는 생물학적으로 활성적인 펩타이드 또는 단백질을 알부민과 결합시켜 알부민-융합된 생물학적으로 활성적인 펩타이드 또는 단백질을 형성하는 단계 및 상기 알부민-융합된 생물학적으로 활성적인 펩타이드 또는 단백질을 포유류에 투여하는 단계를 포함하며, 이에 따라 상기 알부민-융합된 생물학적으로 활성적인 펩타이드 또는 단백질의 농도는 그 연결되는 알부민이 결핍된 생물학적으로 활성적인 펩타이드 또는 단백질의 농도에 비해 증가되어 혈뇌 장벽을 지나는 것을 특징으로 하는, 혈뇌 장벽을 지나는 생물학적으로 활성적인 펩타이드 또는 단백질의 농도를 증가시키는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 생물학적으로 활성적인 펩타이드 또는 단백질은 섬모 신경영양 인자(CNTF) 수용체를 활성화하거나 또는 그 프레그먼트나 변이체 또는 유도체인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 17항에 있어서, 상기 생물학적으로 활성적인 펩타이드 또는 단백질은 CNTF이거나 그 프레그먼트나 변이체 또는 유도체인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 섬모 신경영양 인자(CNTF) 수용체를 활성화하는 생물학적으로 활성적인 펩타이드 또는 단백질, 또는 그 프레그먼트나 변이체 또는 유도체를 알부민과 결합시켜 알부민-융합된 생물학적으로 활성적인 펩타이드 또는 단백질을 형성하는 단계 및 상기 알부민-융합된 생물학적으로 활성적인 펩타이드 또는 단백질을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, 섬모 신경영양 인자(CNTF) 수용체를 활성화하는 생물학적으로 활성적인 펩타이드 또는 단백질, 또는 그 프레그먼트나 변이체 또는 유도체로 포유류의 치료와 관련된 부작용을 최소화하는 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 생물학적으로 활성적인 펩타이드 또는 단백질은 섬모 신경영양 인자(CNTF) 수용체를 활성화하거나 또는 그 프레그먼트나 변이체 또는 유도체인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 20항에 있어서, 상기 생물학적으로 활성적인 펩타이드 또는 단백질은 CNTF이거나 그 프레그먼트나 변이체 또는 유도체인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 20항 내지 제 22항중 어느 한 항에 있어서, 상기 부작용은 메스꺼움 및/또는 두통인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 1항 내지 제 8항중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 암호하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  25. 제 24항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  26. 제 24항의 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포.
  27. 세포를 유효 농도의 제 1항 내지 제 8항중 어느 한 항에 따른 융합 단백질과 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에서 CNTF-수용체를 활성화하는 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 상기 세포는 포유류 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 28항에 있어서, 상기 세포는 사람 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 24항에 따른 핵산 분자를 세포내로 도입하여 유효 농도의 제 1항 내지 제 8항중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 갖는 세포를 제공하고, 상기 세포가 치료 유효량의 제 1항 내지 제 8항중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 생성가능케 하는 단계를 포함하는, 세포에서 CNTF-수용체를 활성화하는 방법.
  31. 제 30항에 있어서, 상기 세포는 포유류 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 31항에 있어서, 상기 세포는 사람 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
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