CN100535007C - 胰高血糖素样肽的纯化 - Google Patents

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Abstract

通过反相高效液相色谱法纯化胰高血糖素样肽的方法。

Description

胰高血糖素样肽的纯化
发明领域
本发明涉及蛋白质纯化领域。特别是，本发明涉及通过反相高相液相色谱从包含胰高血糖素样肽和至少一种相关杂质的组合物中纯化胰高血糖素样肽的方法。
发明背景
对于蛋白质和肽(多肽)的纯化和分析，色谱是众所周知并广泛使用的方法。包括反相高效液相色谱(RP-HPLC)的这些色谱采用了许多不同的色谱原理。RP-HPLC分离的原理基于多肽溶质和疏水连接在色谱树脂表面的疏水缔合。RP-HPLC纯化通常由一个或多个下面的部分组成：平衡、上样、清洗、洗脱和再生。
RP-HPLC中最普通应用的溶剂系统基于水/乙腈/三氟乙酸(TFA)，通常通过增加应用于色谱柱的液体的溶剂即乙腈含量来完成溶质的洗脱。RP-HPLC中乙腈对于多肽溶质具有很强的选择和变性作用(Boysen，R.I.等人，J.Biol.Chem.277，23-31(2002))，与TFA联合(从而在低pH～2时)，这个系统在制药工业和其它工业中用作标准的分析工具(Snyder，L.R.等人，“实用性HPLC方法的发展”，“生化样品：蛋白质、核酸、碳水化合物以及相关化合物”第二版，第11章，John Wiley&Sons Inc.，New York，1997)。在生产规模低pH的乙腈也广泛地用于多肽的纯化，即用于人胰岛素的纯化(Kroeff，E.P.等人，J.Chromatogr.461，45-61(1989))。基于未取代的聚合物的反相树脂已经用于胰高血糖素从胰腺中的初步回收(US4,617,376)。在pH 2.8用乙腈作为有机溶剂以及甘氨酸作为缓冲成分操作色谱柱。这个步骤没有去除相关杂质的指示。用线性梯度在低pH的乙腈/TFA系统中在C18柱上纯化肽合成得到的各种胰高血糖素的类似物(Krstenansky，J.L.等人，J.Biochem.25，3839-3845(1986))。使用低pH的线性乙腈梯度采用TFA作为缓冲物质在C18柱上从板鳃鱼分离胰高血糖素(Conlon J.M.和Thim L.Gen.Comp.Endocrinol.60，398-405(1985))。在大肠杆菌中表达重组的鸡胰高血糖素，随后使用包括用线性梯度低pH的乙腈/TFA系统的RP-HPLC在内的各种步骤进行纯化(Kamisoyama H.等人Anim.Sci.J.71，428-431(2000))。
使用pH 7.65的线性乙腈梯度采用50mM乙酸铵作为缓冲系统在C18柱上从象鱼中分离胰岛素和胰高血糖素(Berks B.C.，等人，Biochem.J.263，261-266(1989))。
WO 99/52934公开了用于各种胰岛素衍生物的分离的RP-HPLC方法，其中通过钙离子的加入实现靶组分和糖基化相关杂质之间分离的改善。在22-25℃使用乙醇作为有机溶剂，Tris或Bis-Tris作为约7.0-7.2pH范围的缓冲成分进行纯化，所述pH在胰岛素的等电点之上。
胰岛素的纯化方法，包括用乙醇作为有机洗脱剂在pH低时(使用磷酸铵缓冲液)以及在接近中性的pH时(使用Tris缓冲液)在C18柱上的RP-HPLC步骤也有描述(Mollerup I.等人，“生物处理技术百科全书”中的“胰岛素的纯化”，编辑Flickinger M.C.和Drew S.W.，pp 1491-1498，John Wiley&Sons Inc.1999)。这些方法去除了胰岛素相关杂质。
使用始于40％甲醇的水溶液和pH 3.0的10mM磷酸盐和三乙胺缓冲液至终于50％的(乙腈/0.1M碳酸铵，pH9.0)或终于12.5％的(乙腈/0.1M Tris-HCl，pH 9.0)的多种梯度在C18柱分离上获得了碘化胰高血糖素产物(Rojas F.J.等人，Endo.113，711-719(1983))。(溶剂和pH)这个混合模式的RP-HPLC根据碘化的程度分离了胰高血糖素产物。另外，所述方法用于分离胰高血糖素和碘化胰高血糖素的酶消化。
对于许多其它的多肽是一样的，使用采用了线性梯度的乙腈和小量TFA作为缓冲物质在低于靶多肽成分等电点(pI)的低pH的RP-HPLC，广泛地纯化了包括类似物和衍生物在内的胰高血糖素样肽。从两个物种，即：猪和人的小肠分离了GLP-1(
Figure C20048002408900101
C.等人，J.Biol.Chem.264，12826-12829(1989))。使用线性梯度的乙醇/TFA系统获得了纯化，使用乙腈/TFA系统的等度洗脱获得了额外的纯化，两个都在低pH于C18柱上进行。两个方法都不能分离存在的两种相关的GLP-1形式(GLP-1和NH2-末端延伸的GLP-1)。
基于乙腈/TFA的RP-HPLC系统已经应用于狗回肠中GLP-1形式的研究(Namba M.等人，Biomedical Res.11(4)，247-254(1990))。有一些指示表明分开了各种形式，并且应用这个方法合成得到的GLP-1和脱-Gly37-GLP-1酰胺标准物有稍微不同的洗脱时间。低pH的基于乙腈/TFA的RP-HPLC系统中C4柱已经应用于GLP-1衍生物的融合蛋白和带有抗体片段的胰高血糖素延长蛋白-4(exendin-4)和人血清白蛋白的融合蛋白的纯化(WO 02/46227)。
用低pH的乙腈/TFA系统的梯度洗脱在C18柱上分离了多种前胰高血糖素原(preproglucagon)的切割产物(Noe B.D.和Andrews P.C.，Peptides 7，331-336(1986))。
低pH的基于乙腈/TFA的RP-HPLC系统中腈丙基(cyano propyl)柱已经用于由化学合成获得的多种GLP-1类似物的纯化(WO98/08871)。
已经将GLP-2从两个物种：猪和人的肠之其它的胰高血糖素原(proglucagon)相关肽中分离出来(Buhl T.等人，J.Biol.Chem.263，8621-8624(1988))。使用低pH的线性梯度乙腈/TFA系统获得了纯化，应用了使用乙醇/TFA系统等度洗脱的纯化，两个都在低pH下于C18柱上进行。通过后面的方法，将GLP-2与细胞色素C氧化酶分开，然而，存在的两种相关的GLP-2形式(GLP-2和NH2末端延伸的GLP-2)未分开。
WO 01/04156公开了合成和通过重组技术获得的胰高血糖素延长蛋白-4变体和GLP-1变体。应用低pH的乙腈/TFA系统的梯度洗脱在C18柱上纯化肽合成获得的变体，而应用线性梯度低pH的乙腈/TFA系统在C8柱上纯化重组肽。
WO 00/41548公开了C18柱的用途，应用低pH的乙腈/TFA系统的梯度洗脱以纯化肽合成获得的胰高血糖素延长蛋白-3和胰高血糖素延长蛋白-4。WO 99/25727公开了C18柱的用途，应用低pH的乙腈/TFA系统的梯度洗脱以纯化肽合成获得的多种胰高血糖素延长蛋白激动剂(胰高血糖素延长蛋白类似物和衍生物)。
使用线性梯度低pH的乙腈/TFA系统在C18柱上分离了来自人胰腺提取物的胰高血糖素、GLP-1和GLP-2(Suda K.等人，Biomedical Res.9，39-45(1988))。
对于获自重组技术的GLP-1类似物在C18柱上用乙醇作为有机洗脱剂而不控制色谱溶剂的pH之纯化，公开了流速和温度的作用(Schou O.，在生物制剂生产进展第六届Interlaken会议上报告，Interlaken，瑞士，三月号25-28，2003)。
EP 0708179公开了固相合成的用途以产生多种GLP-1类似物和衍生物。采用的一个纯化方案包括在45℃使用线性梯度低pH的乙腈/TFA系统在C18柱上的纯化。另一个纯化方案包括在室温下的两个RP-HPLC步骤：使用线性梯度低pH的乙腈/TFA系统在C4柱上的纯化之后是使用线性梯度pH 7.7的乙腈/碳酸铵系统在C18柱上的纯化。通过两步法去除了多种相关杂质和起始物质，得到了靶成分约99％的HPLC纯度和只有14.8％的总产率。
Senderoff等(J.Pharm.Sci.87，183-189(1998))使用了固相合成和使用酵母中表达的重组技术，以产生用于构象改变研究的天然人GLP-1。重组GLP-1的纯化方案尤其包括使用乙醇作为有机洗脱剂的两个RP-HPLC步骤。在pH 10.7用0.05M氢氧化铵作为缓冲液进行第一个RP-HPLC步骤，而在低pH(低于pH 3)用1％乙酸作为缓冲液进行第二个RP-HPLC。纯化方案得到了约98.5％的GLP-1纯度，然而，所述产物经历了显著的构象改变而导致产物再溶解的困难。另外，包括第一个RP-HPLC步骤的处理步骤中涉及的高pH诱导了碱催化的降解产物，它们比靶化合物的生物活性要低。作为一些步骤之一而采用了第三个RP-HPLC步骤(条件未特别说明)以再处理靶GLP-1并使其回到正确的构象结构。
本发明在应用包含醇作为有机洗脱剂之pH缓冲的溶剂用于胰高血糖素样肽和类似物及其衍生物在接近中性的pH下的RP-HPLC纯化方面是新的。与使用基于醇的溶剂系统的胰高血糖素样肽RP-HPLC纯化的现有技术领域相比，本发明推进了分离效率的增加和工业用途的应用。令人惊讶地，新的方法改善了靶胰高血糖素样肽化合物和相关杂质的分离并得到了更加稳定的胰高血糖素样肽产物。
RP-HPLC纯化过程中接近中性pH的使用有优势，就是避免了这些胰高血糖素样肽在柱上可能的聚集，这个将会在实施例中反映出来。这令人惊讶，因为如上面提出的胰岛素和胰高血糖素可以在低pH操作而不会在柱上的聚集，因而呈现了在一边胰岛素和胰高血糖素之间以及另一边胰高血糖素样肽之间本性的不同。
RP-HPLC纯化过程中醇的使用还有另外的优势，与更加常用的乙腈相比诱导了更好的肽的构象保持。而且，乙腈(和TFA)是毒性化学物质，由于环境和健康问题，它们不适合，应当在工业规模避免使用。醇一般毒性较小，更加适合工业使用。
附图简述
图1.使用C4取代的120
Figure C20048002408900121
硅胶和pH 3.5的洗脱，Arg34-GLP-1(7-37)从作为糖基化杂质的相关杂质制备分离的AU280对时间的色谱图。
图2.使用C4取代的120
Figure C20048002408900122
硅胶和pH 7.5的洗脱，Arg34-GLP-1(7-37)从作为糖基化杂质的相关杂质以及截短形式Arg34-GLP-1(9-37)制备分离的AU280对时间的色谱图。
图3.使用C18取代的200
Figure C20048002408900131
硅胶和pH 3.5的洗脱，Arg34-GLP-1(7-37)从作为糖基化杂质的相关杂质制备分离的AU280对时间的色谱图。
图4.使用C18取代的200
Figure C20048002408900132
硅胶和pH 7.5的洗脱，Arg34-GLP-1(7-37)从作为糖基化杂质的相关杂质以及截短形式Arg34-GLP-1(9-37)制备分离的AU280对时间的色谱图。
图5.使用C18取代的120
Figure C20048002408900133
硅胶和pH 7.5的洗脱，Arg34-GLP-1(7-37)从作为糖基化杂质的相关杂质以及截短形式Arg34-GLP-1(9-37)制备分离的AU280对时间的色谱图。
图6.使用C4取代的120
Figure C20048002408900134
硅胶和pH 7.5的洗脱，在没有pH缓冲剂的溶剂中，Arg34-GLP-1(7-37)从作为糖基化杂质的相关杂质制备分离的AU280对时间的色谱图。
定义
下面是本详述中使用的术语的详细定义。
术语从包含肽和一种或多种污染物的组合物中“纯化”肽指的是通过降低至少一种污染物在组合物中的含量，增加所述肽在组合物中的纯度。
如此处使用的术语“相关杂质”指的是与靶胰高血糖素样肽具有结构相似性的杂质。与靶胰高血糖素样肽相比，相关杂质具有不同的化学或物理结构，例如截短的形式、延伸的形式(额外的氨基酸、各种衍生物等)、脱酰胺基的形式、错误折叠形式、带有包括唾液酸化的非期望糖基化形式、氧化形式、消旋造成的形式、肽内链中缺失氨基酸的形式、肽内链中具有额外氨基酸的形式、酰化发生在另一个非期望残基上的形式，以及其它。
如此处使用的术语“缓冲剂”指的是降低色谱溶剂的pH随着时间变化的倾向的化合物，否则就会发生pH变化。缓冲剂包括但不限于如下化合物，例如乙酸钠、碳酸钠、柠檬酸钠、双甘氨肽、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、磷酸钠、硼酸盐、TRIS(Tris-羟甲基-氨基甲烷)、乙醇胺或它们的混合物。
如此处使用的术语“胰高血糖素样肽”指的是同源肽胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽2(GLP-2)和源自前胰高血糖素原基因的oxynthomodulin(OXM)、胰高血糖素延长蛋白以及它们的类似物和衍生物。毒蜥中(Gila monster)发现的胰高血糖素延长蛋白与GLP-1同源，也有促胰岛素的作用。胰高血糖素延长蛋白的实例是胰高血糖素延长蛋白-4和胰高血糖素延长蛋白-3。胰高血糖素样肽具有下面的序列(SEQ ID Nos 1-5)：
1     5     10    15    20    25    30    35
GLP-1 HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK EFIAW LVKGR G
GLP-2 HADGS FSDEM NTILD NLAAR DFINW LIQTK ITD
胰高血糖素延长蛋白-4HGEGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGGPSSGA PPPS-NH2
胰高血糖素延长蛋白-3HSDGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGGPSSGA PPPS-NH2
OXM HSQGT FTSDY SKYLD SRRAQ DFVQW LMDTK RNKNN IA
如此处使用的与肽相关的术语“类似物”指的是修饰的肽，其中所述肽的一个或多个氨基酸残基被其它的氨基酸残基替代，和/或其中一个或多个氨基酸残基被从所述肽上删除，和/或其中一个或多个氨基酸残基被从所述肽上删除，和/或其中一个或多个氨基酸残基被添加到所述肽上。氨基酸残基这样的添加或删除能够发生在肽的N末端和/或肽的C末端。常常使用两个不同的简单系统来描述类似物：例如Arg34-GLP-1(7-37)或K34R-GLP-1(7-37)指一种GLP-1类似物，其中在位置34的天然发生的赖氨酸被精氨酸替代(根据IUPAC-IUB命名法使用氨基酸的标准单个字母缩写)。
如此处使用的与亲本肽相关的术语“衍生物”指的是化学修饰的亲本蛋白质或其类似物，其中至少一种取代基不在亲本蛋白质或其类似物中，即被共价修饰的亲本蛋白质。一般的修饰是酰胺、碳水化合物、烷基基团、酰基基团、酯、聚乙二醇化等等。GLP-1(7-37)衍生物的实例是Arg34，Lys26(Nε-(γ-Glu(Nα-十六酰基)))-GLP-1(7-37).
如此处使用的与肽相关的术语“它的片段”指的是具有亲本肽氨基酸的至少20％之任何肽的片段。因而，对于人血清白蛋白，片段将包含至少117个氨基酸，因为人血清白蛋白具有585个氨基酸。在一个实施方案中，所述片段具有至少35％的亲本肽氨基酸。在另一个实施方案中，所述片段具有至少50％的亲本肽氨基酸。在另一个实施方案中，所述片段具有至少75％的亲本肽氨基酸。
如此处使用的与肽相关的术语“变体”指的是修饰肽，所述修饰肽是亲本肽类似物、亲本肽衍生物或亲本肽类似物的衍生物。
如此处使用的术语“GLP-1肽”指的是GLP-1(7-37)、GLP-1类似物、GLP-1衍生物或GLP-1类似物的衍生物。
如此处使用的术语“GLP-2肽”指的是GLP-2(1-33)、GLP-2类似物、GLP-2衍生物或GLP-2类似物的衍生物。
如此处使用的术语“胰高血糖素延长蛋白-4肽”指的是胰高血糖素延长蛋白(1-39)、胰高血糖素延长蛋白-4类似物、胰高血糖素延长蛋白-4衍生物或胰高血糖素延长蛋白-4类似物的衍生物。
如此处使用的术语“血浆稳定的胰高血糖素样肽”指的是化学修饰的胰高血糖素样肽，即如下面的方法测定地呈现了在人中至少10个小时的体内血浆清除半衰期的类似物或衍生物。人胰高血糖素样肽的血浆清除半衰期的测定方法是：化合物溶解于等渗缓冲液，pH 7.4、PBS或任何其它合适的缓冲液。外周注射给予，优选地在腹腔或臀上部。为了活性化合物的测定频繁间隔采集血样，持续时间足够覆盖最终清除部分(例如，剂量前、剂量后1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、24(第2天)、36(第2天)、48(第3天)、60(第3天)、72(第4天)和84(第4天)小时)。如Wilken等人，Diabetologia43(51)：A143，2000中描述地进行活性化合物浓度的测定。使用市售软件WinNonlin 2.1版(Pharsight，Cary，NC，USA)，通过非腔室方法的使用对每个个体研究对象从浓度-时间数据计算衍生的药代动力学参数。
如此处使用的术语“DDP-IV保护的胰高血糖素样肽”指的是化学修饰使得所述肽，与所述肽的天然形式相比，对血浆肽酶二肽基氨肽酶-4(DPP-IV)有抗性的胰高血糖素样肽。如此处使用的术语“免疫调节的胰高血糖素延长蛋白-4肽”指的是为胰高血糖素延长蛋白-4(1-39)的类似物或衍生物的胰高血糖素延长蛋白-4肽，在人类中，与胰高血糖素延长蛋白-4(1-39)相比，具有降低的免疫反应。评价免疫反应的方法是测量患者治疗4周后应答胰高血糖素延长蛋白-4肽的抗体浓度。
如此处使用的术语“胰高血糖素样肽产物”指的是纯化的肽产物，它将用于药物组合物的生产。因而，通常获得作为来自最终纯化、干燥或整理步骤的产物的胰高血糖素样肽产物。所述产物可以是晶体、沉淀物、溶液或悬浮液。胰高血糖素样肽产物作为药物即活性药物成分在本领域也是已知的。
如此处使用的术语“等电点”指的是例如多肽的大分子总静电荷是零时的pH值。多肽中可以有许多带电基团，在等电点所有这些电荷的总和是零。在高于等电点的pH时，多肽的总静电荷是负的，而在低于等电点的pH值时，多肽的总静电荷是正的。
如此处使用的关于组合物的术语“药物”指的是它用于治疗疾病或紊乱的组合物。
如此处使用的术语“制药可接受的”指的是适合通常的制药应用，即在患者不会引起副作用等等。
如此处使用的术语“有效量”指的是与不治疗相比对病人的治疗足够有效的剂量。
如此处使用的术语“药物组合物”指的是包含活性化合物或其盐以及药物赋形剂例如缓冲剂、防腐剂和可选地张力调节剂和/或稳定剂的产品。因而，药物组合物作为药物制剂在本领域也是已知的。
如此处使用的术语“赋形剂”指的是通常加入到药物组合物中的化学物质，例如缓冲剂、张力剂、防腐剂等等。
如此处使用的术语“疾病的治疗”指的是发生了疾病、病变或紊乱的患者的处理和照顾。治疗的目的是与疾病、病变或紊乱搏斗。治疗包括活性化合物的给予以消除或控制疾病、病变或紊乱以及减轻与疾病、病变或紊乱关联的症状或并发症。
发明描述
第一个方面本发明涉及从包含胰高血糖素样肽和至少一种相关杂质的组合物中纯化胰高血糖素样肽的方法，所述方法是反相高效液相色谱方法，其中用于洗脱的溶剂是pH缓冲的，范围从约pH 4到pH 10，所述溶剂包含浓度从约10％w/w至约80％w/w的醇。
洗脱靶GLP基团和杂质，并通过有机溶剂渐进的或线性改变的梯度或等梯度地或其联合进行一步分离。有机溶剂组分梯度将从较低到较高浓度。通过改变洗脱部分的pH和/或温度进行洗脱也是可能的。
平衡溶液和应用的样品可以含有或不含有有机溶剂。有机溶剂可以是但不限于任何单羟基脂肪醇(甲醇、乙醇、丙醇和丁醇)。色谱纯化的任何部分的可选盐组分可以是任何盐，包括但不限于：NaCl、KCl、NH4Cl、CaCl2、乙酸钠、乙酸钾、乙酸铵等等。能使用任何缓冲组分，包括但不限于：柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、TRIS缓冲剂、硼酸盐缓冲剂、碳酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、铵盐缓冲剂、甘氨酸缓冲剂等等。所述方法也可以应用于任何选择的色谱反相树脂，可选地有任何种类的取代，包括但不限于：基于硅胶的树脂例如Kromasil100 C18，基于多聚物的树脂例如来自Amersham Biosciences的Source，来自Applied Biosystems的Poros材料，例如Poros R1、R2和R3反相树脂，来自Ciphergen的基于陶瓷的树脂，基于金属氧化物的树脂以及其它。优选地，使用基于二氧化硅的树脂。
本发明的一个实施方案中，所述溶剂是pH缓冲的，范围从约pH5至约pH9。
本发明的另一个实施方案中，所述溶剂是在pH高于所述胰高血糖素样肽的等电点的pH处pH缓冲的。
本发明的另一个实施方案中，为了防止洗脱步骤过程中pH从设定点大于+/-1.0pH单位的漂移，所述溶剂是pH缓冲的。
本发明的另一个实施方案中，为了防止洗脱步骤过程中pH从设定点大于+/-0.5pH单位的漂移，所述溶剂是pH缓冲的。
本发明的另一个实施方案中，所述醇是乙醇。
本发明的另一个实施方案中，所述醇是2-丙醇。
本发明的另一个实施方案中，所述醇选自甲醇、1-丙醇和己二醇。
本发明的另一个实施方案中，使用基于二氧化硅的色谱树脂进行反相高效液相色谱方法。
本发明的另一个实施方案中，所述树脂是取代的硅胶，例如C4-、C6-、，C8-、C12-、C16-、C18-、C20-、苯基或苯取代的硅胶。
本发明的另一个实施方案中，使用为多聚基质材料的色谱树脂进行反相高效液相色谱方法。
对接近中性pH的胰高血糖素样肽具有增加的选择性的RP-HPLC方法优选的应用于去除与靶胰高血糖素样肽具有不同化学或物理结构的相关杂质，例如截短的形式，所有种类的延伸形式(额外的氨基酸、多种衍生物等等)、脱酰胺形式、不正确折叠形式、带有例如唾液酸化的非期望的糖基化形式、氧化形式、消旋造成的形式、肽内链内缺乏氨基酸的形式、肽内链内具有额外氨基酸的形式以及其它。
本发明的一个实施方案中，所述相关杂质是所述胰高血糖素样肽的截短形式。
本发明的另一个实施方案中，所述相关杂质是所述胰高血糖素样肽的糖基化形式。
本发明的另一个实施方案中，所述溶剂包含浓度从约20％w/w至约60％w/w的醇。
本发明的另一个实施方案中，所述溶剂包含浓度从约20％w/w至约40％w/w的醇。
本发明的另一个实施方案中，所述胰高血糖素样肽是GLP-1、GLP-1类似物、GLP-1衍生物或GLP-1类似物的衍生物。
本发明的另一个实施方案中，所述GLP-1类似物选自Arg34-GLP-1(7-37)，Gly8-GLP-1(7-36)-酰胺，Gly8-GLP-1(7-37)，Val8-GLP-1(7-36)-酰胺，Val8-GLP-1(7-37)，Val8Asp22-GLP-1(7-36)-酰胺，Val8Asp22-GLP-1(7-37)，Val8Glu22-GLP-1(7-36)-酰胺，Val8Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Lys22-GLP-1(7-36)-酰胺，Val8Lys22-GLP-1(7-37)，Val8Arg22-GLP-1(7-36)-酰胺，Val8Arg22-GLP-1(7-37)，Val8His22-GLP-1(7-36)-酰胺，Val8His22-GLP-1(7-37)，Val8Trp19G1u22-GLP-1(7-37)，Val8Glu22Val25-GLP-1(7-37)，Val8Tyr16Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Trp16Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Leu16Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Tyr18Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Glu22His37-GLP-1(7-37)，Val8Glu22Ile33-GLP-1(7-37)，Val8Trp16Glu22Val25Ile33-GLP-l(7-37)，Val8Trp16Glu22Ile33-GLP-1(7-37)，Val8Glu22Val25Ile33-GLP-1(7-37)，Val8Trp16Glu22Val25-GLP-1(7-37)，它们的类似物以及这些类似物任一项的衍生物。
本发明的另一个实施方案中，GLP-1衍生物或GLP-1类似物的衍生物具有赖氨酸残基，如一个赖氨酸，其中亲脂取代基可选地经由间隔基(spacer)附着于所述赖氨酸的ε氨基基团。
本发明的另一个实施方案中，所述亲脂取代基具有8至40个碳原子，优选地8至24个碳原子，例如12至18个碳原子。
本发明的另一个实施方案中，所述间隔基是存在的，并且选自例如β-Ala、L-Glu或氨基丁酰基的氨基酸。
本发明的另一个实施方案中，所述胰高血糖素样肽是DPPIV保护的胰高血糖素样肽。肽酶DPPIV水解胰高血糖素样肽，受DPPIV保护的天然形式胰高血糖素样肽的那些类似物，即在生理条件下具有DPPIV酶较低速率的水解的那些类似物，可以降低胰高血糖素样肽的清除率。本发明的另一个实施方案中，所述胰高血糖素样肽是血浆稳定的胰高血糖素样肽。
本发明的另一个实施方案中，所述胰高血糖素样肽是GLP-1类似物的衍生物，它们是Arg34，Lys26(Nε-(γ-Glu(Nα-十六烷酰基)))-GLP-1(7-37)。
本发明的另一个实施方案中，所述胰高血糖素样肽是具有25至37个氨基酸残基的GLP-1肽，优选地27至35个氨基酸残基，甚至更加优选地29至33个氨基酸残基。
本发明的一个实施方案中，所述胰高血糖素样肽是GLP-2、GLP-2类似物、GLP-2的衍生物或GLP-2类似物的衍生物。
本发明的另一个实施方案中，GLP-2的衍生物或GLP-2类似物的衍生物具有赖氨酸残基，如一个赖氨酸，其中亲脂替代基可选地经由间隔基附着于所述赖氨酸的ε氨基基团。
本发明的另一个实施方案中，所述亲脂取代基具有8至40个碳原子，优选地8至24个碳原子，例如12至18个碳原子。
本发明的另一个实施方案中，所述间隔基是存在的，选自例如β-Ala、L-Glu或氨基丁酰基(aminobutyroyl)的氨基酸。
本发明的另一个实施方案中，所述胰高血糖素样肽具有27至39个氨基酸残基，优选地29至37个氨基酸残基，甚至更加优选地31至35个氨基酸残基。
本发明的另一个实施方案中，所述胰高血糖素样肽是Gly2-GLP-2(1-33)。
本发明的一个实施方案中，所述胰高血糖素样肽是胰高血糖素延长蛋白-4、胰高血糖素延长蛋白-4类似物、胰高血糖素延长蛋白-4的衍生物或胰高血糖素延长蛋白-4类似物的衍生物。
本发明的另一个实施方案中，所述胰高血糖素样肽是胰高血糖素延长蛋白-4。
本发明的另一个实施方案中，所述胰高血糖素样肽是胰高血糖素延长蛋白-4的类似物ZP-10(HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK-NH2)。
本发明的另一实施方案中，胰高血糖素延长蛋白-4的衍生物或胰高血糖素延长蛋白-4类似物的衍生物是酰化或聚乙二醇化的。
本发明的另一个实施方案中，所述胰高血糖素样肽是稳定的胰高血糖素延长蛋白-4肽。
本发明的另一个实施方案中，所述胰高血糖素样肽是DPP-IV保护的胰高血糖素延长蛋白-4肽。
本发明的另一个实施方案中，所述胰高血糖素样肽是免疫调节的胰高血糖素延长蛋白-4肽。
本发明的另一个实施方案中，胰高血糖素延长蛋白-4的衍生物或胰高血糖素延长蛋白-4类似物的衍生物具有赖氨酸残基，如一个赖氨酸，其中亲脂取代基可选地经由间隔基附着于所述赖氨酸的ε氨基基团。
本发明的另一个实施方案中，所述亲脂取代基具有8至40个碳原子，优选地8至24个碳原子，例如12至18碳原子。
本发明的另一个实施方案中，所述间隔基是存在的，选自例如β-Ala、L-Glu或氨基丁酰基的氨基酸。
本发明的另一个实施方案中，所述胰高血糖素样肽是胰高血糖素延长蛋白-4肽，它具有30至48个氨基酸残基，33至45个氨基酸残基，优选地35至43个氨基酸残基，甚至更加优选地37至41个氨基酸残基。
本发明的一个实施方案中，所述GLP-2肽选自：
K30R-GLP-2(1-33)；  S5K-GLP-2(1-33)；  S7K-GLP-2(1-33)；
D8K-GLP-2(1-33)；   E9K-GLP-2(1-33)；  M10K-GLP-2(1-33)；
N11K-GLP-2(1-33)；  T12K-GLP-2(1-33)； I13K-GLP-2(1-33)；
L14K-GLP-2(1-33)；  D15K-GLP-2(1-33)； N16K-GLP-2(1-33)；
L17K-GLP-2(1-33)；  A18K-GLP-2(1-33)； D21K-GLP-2(1-33)；
N24K-GLP-2(1-33)；  Q28K-GLP-2(1-33)； S5K/K30R-GLP-2(1-33)；
S7K/K30R-GLP-2(1-33)；   D8K/K30R-GLP-2(1-33)；     E9K/K30R-GLP-2(1-33)；
M10K/K30R-GLP-2(1-33)；  N11K/K30R-GLP-2(1-33)；    T12K/K30R-GLP-2(1-33)；
I13K/K30R-GLP-2(1-33)；  L14K/K30R-GLP-2(1-33)；    D15K/K30R-GLP-2(1-33)；
N16K/K30R-GLP-2(1-33)；  L17K/K30R-GLP-2(1-33)；    A18K/K30R-GLP-2(1-33)；
D21K/K30R-GLP-2(1-33)；  N24K/K30R-GLP-2(1-33)；    Q28K/K30R-GLP-2(1-33)；
K30R/D33K-GLP-2(1-33)；  D3E/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/S5K/K30R/D33E-
GLP-2(1-33)；D3E/S7K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/D8K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/E9K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/M10K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/N11K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/T12K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/I13K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L14K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/D15K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/N16K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/A18K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/D21K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/N24K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/Q28K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；以及它们的衍生物。
本发明的一个实施方案中，所述GLP-2衍生物选自
S5K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
S7K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
D8K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
E9K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
M10K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
N11K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
T12K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
I13K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L14K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
D15K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
N16K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(辛烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(壬烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(癸烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十一烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十二烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十三烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十四烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十五烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十七烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十八烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十九烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(二十烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(辛烷酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(壬烷酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(癸烷酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十一烷酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十二烷酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十三烷酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十四烷酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十五烷酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十六烷酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十七烷酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十八烷酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十九烷酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(二十烷酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(辛烷酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(壬烷酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(癸烷酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十一烷酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十二烷酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十三烷酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十四烷酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十五烷酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十六烷酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十七烷酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十八烷酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十九烷酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(二十烷酰基氨基)丁酰基)-GLP-2(1-33)；
A18K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
D21K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
N24K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
Q28K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)-GLP-2(1-33)；
S5K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
S7K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
D8K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
E9K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
M10K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
N11K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
T12K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
I13K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L14K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
D15K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
N16K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(辛烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(壬烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(癸烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十一烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十二烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十三烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十四烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十五烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十七烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十八烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十九烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(二十烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(辛烷酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(壬烷酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(癸烷酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十一烷酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十二烷酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十三烷酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十四烷酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十五烷酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十六烷酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十七烷酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十八烷酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(十九烷酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(二十烷酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(辛烷酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(壬烷酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(癸烷酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十一烷酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十二烷酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十三烷酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十四烷酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十五烷酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十六烷酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十七烷酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十八烷酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十九烷酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(二十烷酰基氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
A18K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
D21K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
N24K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
Q28K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
D3E/S5K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/S7K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/D8K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/E9K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/M10K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/N11K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/T12K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/I13K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L14K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/D15K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/N16K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(辛烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(壬烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(癸烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(十一烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(十二烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(十三烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(十四烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(十五烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(十七烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(十八烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(十九烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(二十烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(辛烷酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(壬烷酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(癸烷酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十一烷酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-3LP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十二烷酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十三烷酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十四烷酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十五烷酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十六烷酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十七烷酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十八烷酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十九烷酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(二十烷酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(辛烷酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(壬烷酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(癸烷酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(十一烷酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(十二烷酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(十三烷酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(十四烷酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(十五烷酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(十六烷酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(十七烷酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(十八烷酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(十九烷酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(4-(二十烷酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/A18K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/D21K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/N24K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；and
D3E/Q28K(3-(十六烷酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33).
例如WO 99/43361和WO 00/55119中能够找到GLP-2、它的类似物以及GLP-2的衍生物的制备方法。
本发明进一步的实施方案中，所述胰高血糖素样肽是胰高血糖素延长蛋白-4(1-39)的促胰岛素类似物，例如Ser2Asp3-胰高血糖素延长蛋白-4(1-39)，其中位置2和3的氨基酸残基分别被丝氨酸和天冬氨酸替代(这个特别的类似物作为胰高血糖素延长蛋白-3在本领域也是已知的)。
本发明进一步的实施方案中，所述胰高血糖素样肽是胰高血糖素延长蛋白-4衍生物，其中引入的取代基选自酰胺、碳水化合物、烷基、酯和亲脂取代基。胰高血糖素延长蛋白-4(1-39)促胰岛素衍生物及其类似物的实例是Tyr31-胰高血糖素延长蛋白-4(1-31)-酰胺。
本发明的另一个实施方案中，所述胰高血糖素样肽是稳定的胰高血糖素延长蛋白-4肽。本发明的另一个实施方案中，所述胰高血糖素样肽是DPP-IV保护的胰高血糖素延长蛋白-4肽。本发明的另一个实施方案中，所述胰高血糖素样肽是免疫调节的胰高血糖素延长蛋白-4肽。
例如WO 99/43708、WO 00/41546和WO 00/55119中能找到胰高血糖素延长蛋白-4、它的类似物以及胰高血糖素延长蛋白-4衍生物的制备方法。
通过肽合成能够生产亲本胰高血糖素样肽，例如使用Boc或Fmoc化学的固相肽合成或其它已经很好建立的技术。也能够通过包含如下的方法生产亲本胰高血糖素样肽：培养含有编码所述多肽并能够在允许所述肽表达的条件下在合适的营养基中表达所述多肽的宿主细胞，之后从培养基中回收得到的肽。
用于培养细胞的培养基可以是适合生长宿主细胞的任何传统培养基，例如含有合适补充物的最低限度或复合培养基。适合的培养可以从商业供应商获得，或者根据发表的配方(例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)的目录中)进行制备。然后可以通过传统程序从培养基中回收细胞产生的肽，包括通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞，通过例如硫酸铵的盐沉淀上清或滤液中的蛋白质样组分，根据所讨论的肽的类型通过多种色谱纯化，例如离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱等等。
编码所述亲本肽的DNA序列合适地可以是基因组或cDNA来源，例如通过制备基因组或cDNA文库并且依照标准技术(见，例如Sambrook，J，Fritsch，EF和Maniatis，T，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室出版社，纽约，1989)通过使用合成寡核苷酸探针的杂交筛选编码所有或部分所述肽DNA序列。用已经建立的标准方法，例如Beaucage和Caruthers，Tetrabedron Letters 22(1981)，1859 1869描述的phosphoamidite方法或者Matthes等人，EMBO Journal 3(1984)，801-805描述的方法也合成性地制备编码所述肽的DNA序列。例如如US 4,683,202或Saiki等人，Science 239(1988)，487 491描述地也可以通过使用特异性引物的多聚酶链式反应制备所述DNA序列。
所述DNA序列可以插入任何载体，这可很方便地用于重组DNA程序，载体的选择将通常依赖它要引入的宿主细胞。因而，所述载体可以是自主复制的载体，即存在作为染色体外实体存在的载体，它的复制不依赖于染色体的复制，例如质粒。或者，所述载体可以是一个载体，当它引入宿主细胞时，它整合进宿主细胞基因组并与它已经整合进入的染色体一起复制。
所述载体优选地是表达载体，其中编码所述肽的DNA序列可操作性地连接于所述DNA的转录需要的额外片段，例如启动子。所述启动子可以是所选宿主细胞中显示转录活性并且可以来源于编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质之基因的任何DNA序列。指挥编码各种宿主细胞中本发明肽的DNA转录的合适启动子的实例在本领域是众所周知的，参考例如Sambrook等人，同上。
如果需要，编码所述肽的DNA序列可以操作性地连接于合适的终止子、聚腺苷酸化信号、转录增强子序列和翻译增强子序列。本发明的重组载体进一步地可以包含使得载体在正在讨论的宿主细胞中复制的DNA序列。
所述载体还包含选择性标记，例如其产物补足宿主细胞中缺陷的基因或者赋予例如氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、新霉素、潮霉素或氨甲蝶呤的药物耐药性的基因。
为了将本发明的亲本肽导向宿主细胞的分泌途径，重组载体中可以提供分泌信号序列(也已知为先导序列、前原序列或前序列)。所述分泌信号序列结合于编码正确阅读框的肽的DNA序列。分泌信号序列通常在编码所述肽的DNA序列的5’位置。所述分泌信号通常相联于所述肽或者来自编码另一个分泌蛋白质的基因。
用于连接编码本发明肽的DNA序列、启动子和可选地终止子和/或分泌信号序列以及将它们插入含有复制所需信息的合适载体中的步骤对于本领域技术人员都是众所周知的(参考，例如，Sambrook等，同上)。
将DNA序列或重组载体引入的宿主细胞可以是能够生产本发明肽的任何细胞，包括细菌、酵母、真菌和更高级的真核细胞。众所周知并用于本领域的合适宿主细胞的实例是而不限于大肠杆菌、啤酒酵母或哺乳动物BHK或CHO细胞系。
含有纯化的根据本发明的胰高血糖素样肽的药物组合物一般含有多种药物赋形剂，例如防腐剂、等张剂和表面活性剂。药物组合物的制备对于技术人员是众所周知的。为了方便，参考Remington：药学科学和实习，第19版，1995.
含有纯化的根据本发明的胰高血糖素样肽的药物组合物可以胃肠道外给予需要这样治疗的患者。胃肠道外给药可以通过注射器，可选地笔样注射器进行皮下注射、肌肉内注射或者静脉注射。或者，给药可以例如通过输注泵的输注进行。
本发明进一步由下面的实例说明，然而这并不被解释为限制所保护的范围。在前面的叙述中和下面的实例中公开的特性分开地或它们任何联合在一起都是实现各种形式的本发明的材料。
实施例
实施例1
分析RP-HPLC。在Waters对称RP-18，3.5μm，100
Figure C20048002408900331
4.6×150mm柱上进行收集峰的鉴别/验证的RP-HPLC分析。缓冲液A由7.8％(w/w)乙腈中0.15M(NH4)2SO4，pH 2.5组成，缓冲液B含有63.4％(w/w)乙腈。15分钟内37-44.1％B接着10分钟内44.1-100％B的线性梯度以1ml/min的速率进行。色谱温度保持在60℃，在214nm进行UV检测。
实施例2
通过例如如WO 98/08871中描述的传统重组DNA技术在酵母(啤酒酵母)中表达Arg34GLP-1(7-37)。通过传统反相色谱法纯化发酵肉汤培养基中的Arg34GLP-1(7-37)，随后是在所述肽等电点pH例如在pH 5.4沉淀。离心分离所述沉淀。
将含有Arg34GLP-1(7-37)和相关杂质的等电点沉淀包括截短的杂质Arg34GLP-1(9-37)溶于水中，pH调至3.5。15mL所述溶液(0.91mg/mL)上样于用40mL 0.15mol/kg硫酸铵、5mmol/kg柠檬酸、25％(w/w)乙醇pH 3.5平衡的20mL 120
Figure C20048002408900332
C4-取代(二甲基丁基二甲基甲硅烷基)的硅胶树脂(颗粒大小10μm，YMC)。用10mL平衡溶液清洗所述柱，在240mL过程中用线性梯度的35-45％乙醇(0.15mol/kg硫酸铵，5mmol/kg柠檬酸)进行洗脱。
图1中显示了制备性纯化的色谱图。从色谱图能够观察到糖基化杂质被分离，然而，没有得到截短形式和靶GLP-1基团之间截然不同的峰或两者的分离。RP-HPLC分析没有观察到Arg34GLP-1(7-37)和Arg34GLP-1(9-37)之间的任何分离。
实施例3
如实施例2描述地在酵母中表达Arg34GLP-1(7-37)，用RP-LC捕获并沉淀。
将含有Arg34GLP-1(7-37)和相关杂质的等电点沉淀包括截短的杂质Arg34GLP-1(9-37)溶于水中，pH调至7.5。15mL所述溶液(0.91mg/mL)上样于用40mL 5mmol/kg磷酸二氢钠、210mmol/kg乙酸钾、25％(w/w)乙醇pH 7.5平衡的20mL 120
Figure C20048002408900341
C4取代(二甲基丁基二甲基甲硅烷基)的硅胶(颗粒大小10μm，YMC)。用10mL平衡溶液清洗所述柱，在240mL过程中用线性梯度的30-40％乙醇(5mol/kg磷酸二氢钠，210mmol/kg乙酸钠)进行洗脱。
图2中显示了制备性纯化的色谱图。仅仅从色谱图能够观察到糖基化杂质被分离，而且，在缓冲液控制色谱溶剂为pH 7.5处得到了截短形式和靶GLP-1基团之间的分离。另外，表1中给出的分离部分的RP-HPLC分析结果显示主峰中截短形式Arg34GLP-1(9-37)的含量降低到了可以接受的水平。
表1.实施例3的RP-HPLC分析。如实施例1中描述地进行分析。
  Arg<sup>34</sup>GLP-1<sub>(7-37)</sub>含量   Arg<sup>34</sup>GLP-1<sub>(9-37)</sub>含量
  上样样品主峰杂质峰   55％92％10％   11％5％74％
通过比较实施例1和2的色谱图，注意到了中性pH的额外优点：得到了更高更窄的主峰因而得到了期望的更高的合并浓度。实施例1和2之间设置的非显著性差异是：控制各自色谱运行的pH的不同的缓冲系统以及不同的盐系统。而且，采用相同的梯度倾斜度，但有不同的乙醇起始浓度以获得相似的保留。
实施例3
通过例如WO 98/08871中描述的传统重组DNA技术在酵母(啤酒酵母)中表达Arg34GLP-1(7-37)。通过阳离子交换色谱法纯化无细胞的发酵肉汤培养基中的Arg34GLP-1(7-37)，将得到的含有Arg34GLP-1(7-37)合并物的pH调到9.0。
10mL含有Arg34GLP-1(7-37)(3.49mg/mL)和相关杂质的等电点沉淀包括截短杂质Arg34GLP-1(9-37)的合并物上样于用40mL含有0.15mol/kg硫酸铵、5mmol/kg柠檬酸、25％(w/w)乙醇pH 3.5的溶剂平衡的20mL 200
Figure C20048002408900351
C18-取代(十八烷酰基二甲基甲硅烷基)的硅胶(颗粒大小15μm)。用10mL平衡溶液清洗所述柱，在240mL过程中用线性梯度的35-45％乙醇(0.15mo1/kg硫酸铵，5mmol/kg柠檬酸)进行洗脱。整个运行过程中温度保持在23℃。
图3显示了制备性纯化的色谱图。糖基化杂质被分离，然而没有适当地洗脱靶GLP-1基团因为它纤维粘连在柱上，不可能全部收集。因而，不应当采用低pH结合高疏水性连接，例如C18。
实施例5
通过例如WO 98/08871中描述的传统重组DNA技术在酵母(啤酒酵母)中表达Arg34GLP-1(7-37)。通过如实施例4中描述的阳离子交换色谱法捕获Arg34GLP-1(7-37)。
10mL含有Arg34GLP-1(7-37)(3.49mg/mL)和相关杂质的合并物(室温下pH 8.9)包括截短的杂质Arg34GLP-1(9-37)上样于用40mL含有250mmol/kg氯化钾、5mmol/kg磷酸二氢钾、25％(w/w)乙醇pH 7.5的溶剂平衡的20mL 120
Figure C20048002408900361
C18取代(十八烷酰基二甲基甲硅烷基)的硅胶(颗粒大小15μm)。用10mL平衡溶液清洗所述柱，在240mL过程中用线性梯度的30-40％乙醇(250mmol/kg氯化钾，5mmol/kg磷酸二氢钾)进行洗脱。整个运行过程中温度保持在23℃。
图4显示了制备性纯化的色谱图。仅仅从色谱图能够观察到糖基化杂质被分离，而且在色谱溶剂缓冲控制的pH7.5得到了截短形式和靶GLP-1基团之间的分离。
比较实施例4和5的色谱图显示只有从中性pH的色谱运行收集到靶GLP-1基团。实施例4和5之间设置的非显著差别是：不同的缓冲系统以控制各自色谱运行的pH以及不同的盐系统。另外，采用相同的梯度倾斜度，但有不同的乙醇起始浓度以获得相似的保留。
实施例6
如实施例4中描述地在酵母中表达Arg34GLP-1(7-37)并通过阳离子交换色谱捕获。
51mL含有Arg34GLP-1(7-37)(0.7mg/mL)和相关杂质的合并物(在22.5℃ pH 7.45)包括截短的杂质Arg34GLP-1(9-37)上样于用40mL含有250mmol/kg氯化钾、5mmol/kg磷酸二氢钾、25％(w/w)乙醇pH 7.5的溶剂平衡的20mL 200
Figure C20048002408900362
C18取代(十八烷酰基二甲基甲硅烷基)的硅胶(颗粒大小15μm)。用10mL平衡溶液清洗所述柱，在240mL过程中用线性梯度的30-40％乙醇(250mmol/kg氯化钾，5mmol/kg磷酸二氢钾)进行洗脱。整个运行过程中温度保持在4℃。
与实施例5中呈现的相似，在这个温度下获得了Arg34GLP-1(7-37)、截短形式Arg34GLP-1(9-37)和所述肽糖基化形式之间的截然不同的峰和它们的分离。该实施例和实施例5之间设置非显著性差异是不同上样样品的使用。
实施例7
如实施例4中描述地在酵母中表达Arg34GLP-1(7-37)并通过阳离子交换色谱法捕获。
51mL含有Arg34GLP-1(7-37)(0.7mg/mL)和相关杂质的合并物(pH8.88于24.6℃)包括截短的杂质Arg34GLP-1(9-37)上样于用40mL含有250mmol/kg氯化钾、5mmol/kg磷酸二氢钾、25％(w/w)乙醇pH 7.5的溶剂平衡的20mL 200
Figure C20048002408900371
C18取代(十八烷酰基二甲基甲硅烷基)的硅胶(颗粒大小15μm)。用10mL平衡溶液清洗所述柱，在240mL过程中用线性梯度的25-35％乙醇(250mmol/kg氯化钾，5mmol/kg磷酸二氢钾)进行洗脱。整个运行过程中温度保持在50℃。
与实施例5中呈现的相似，在这个温度下获得了Arg34GLP-1(7-37)、截短形式Arg34GLP-1(9-37)和所述肽糖基化形式之间截然不同的峰和它们的分离。该实施例和实施例5之间设置的非显著性差异是不同上样样品的使用。
实施例8
如实施例4中描述地在酵母中表达Arg34GLP-1(7-37)并通过阳离子交换色谱法捕获。
51mL含有Arg34GLP-1(7-37)(0.7mg/mL)和相关杂质的合并物(pH8.89于20.9℃)包括截短的杂质Arg34GLP-1(9-37)上样于用40mL含有250mmol/kg氯化钾、5mmol/kg磷酸二氢钾、25％(w/w)乙醇pH 7.5的溶剂平衡的20mL 120
Figure C20048002408900372
C18取代(十八烷酰基二甲基甲硅烷基)的硅胶(颗粒大小15μm)。用10mL平衡溶液清洗所述柱，在240mL过程中用线性梯度的30-40％乙醇(250mmol/kg氯化钾，5mmol/kg磷酸二氢钾)进行洗脱。整个运行过程中温度保持在23℃。
图5显示了制备性纯化的色谱图。仅仅从色谱图能够观察到糖基化杂质被分离，而且缓冲液控制色谱溶剂的pH 7.5得到了截短形式和靶GLP-1基团之间的分离。实际上，用120
Figure C20048002408900381
材料比用如实施例5中描述的200
Figure C20048002408900382
材料得到了Arg34GLP-1(7-37)峰和包括Arg34GLP-1(9-37)的周围峰之间更高的分辨。该实施例和实施例5之间设置的非显著性差异是不同上样样品的使用。
实施例9
如实施例4中描述地在酵母中表达Arg34GLP-1(7-37)并通过阳离子交换色谱法捕获。
63mL含有Arg34GLP-1(7-37)(0.6mg/mL)和相关杂质的合并物包括截短的杂质Arg34GLP-1(9-37)(pH 8.84于22.1℃)上样于用40mL含有250mmol/kg氯化钾、5mmol/kg磷酸二氢钾、25％(w/w)乙醇pH 7.0的溶剂平衡的20mL 120
Figure C20048002408900383
C18取代(十八烷酰基二甲基甲硅烷基)的硅胶(颗粒大小15μm)。用10mL平衡溶液清洗所述柱，在240mL过程中用线性梯度的30-40％乙醇(250mmol/kg氯化钾，5mmol/kg磷酸二氢钾)进行洗脱。整个运行过程中温度保持在23℃。
与实施例8中呈现的相似，在这个pH下获得了Arg34GLP-1(7-37)、截短形式Arg34GLP-1(9-37)和所述肽糖基化形式之间截然不同的峰和它们的分离。该实施例和实施例8之间设置的非显著性差异是不同上样样品的使用。
实施例10
如实施例4中描述地在酵母中表达Arg34GLP-1(7-37)并通过阳离子交换色谱捕获。
如实施例9中描述的进行纯化，但是溶剂的pH是8.0。
与实施例8中呈现的相似，在这个pH下获得了Arg34GLP-1(7-37)、截短形式Arg34GLP-1(9-37)和所述肽糖基化形式之间截然不同的峰和它们的分离。该实施例和实施例8之间设置的非显著性差异是不同上样样品的使用。
实施例11
如实施例2中描述地在酵母中表达Arg34GLP-1(7-37)，通过RP-LC捕获并沉淀。
将含有Arg34GLP-1(7-37)和相关杂质的的等电点沉淀包括截短的杂质Arg34GLP-1(9-37)溶于水中，pH调到7.5。15mL所述溶液(0.91mg/mL)上样于用40mL 210mmol/kg乙酸钾、25％(w/w)乙醇pH 7.5的溶剂平衡的20mL 120
Figure C20048002408900391
C4-取代(二甲基丁基二甲基甲硅烷基)的硅胶(颗粒大小10μm，YMC)。用10mL平衡溶液清洗所述柱，在240mL过程中用线性梯度的30-40％乙醇(210mmol/kg乙酸钾)进行洗脱，就是说在没有所用pH下缓冲物质的系统中洗脱。
图6显示了制备性纯化的色谱图。仅仅从色谱图能够观察到糖基化杂质被分离，然而，没有获得截短形式和靶GLP-1基团之间截然不同的峰或它们的分离。
比较实施例3和11的色谱图显示如果缓冲物质控制了pH，那么在pH 7.5靶GLP-1基团可以与截短的杂质分开，因而，在没有缓冲物质控制pH的中性pH下进行分离降低了系统的分离效率。实施例3和11之间的设置中没有其它的不同。
实施例12
通过例如别处(WO 98/08871)描述的传统重组DNA技术在酵母(啤酒酵母)中表达Arg34GLP-1(7-37)。通过反相色谱用pH 9.0的甘氨酸缓冲液洗脱来纯化发酵肉汤培养基中的Arg34GLP-1(7-37)。
33mLpH 7.5的洗脱物(1.1mg/mL)上样于用40mL 25％乙醇、250mmol/kg氯化钾、5mmol/kg柠檬酸钠pH 6.75平衡的20mL Source 15RPC(Amersham Pharmacia Biotech)聚苯乙烯/二乙烯苯(颗粒大小15μm)柱。用10mL平衡溶液清洗所述柱，在240mL过程中用线性梯度的35-45％乙醇(250mmol/kg氯化钾，5mmol/kg柠檬酸钠)pH 6.75进行洗脱。整个运行过程中温度保持在23℃。
获得了Arg34GLP-1(7-37)和所述肽糖基化形式之间截然不同的峰和它们的分离。
实施例13
通过例如别处(WO 98/08871)描述的传统重组DNA技术在酵母(啤酒酵母)中表达Arg34GLP-1(7-37)。通过反相色谱用pH 9.0的甘氨酸缓冲液洗脱来纯化发酵肉汤培养基中的Arg34GLP-1(7-37)。
4.6mL所述溶液(1.1mg/mL)上样于用6mL 25％乙醇、250mmol/kg氯化钾、5mmol/kg NaH2PO4，pH 7.5平衡的3mL RPC PolyBio(BioSepra)(颗粒大小15μm)柱。用1.5mL平衡溶液清洗所述柱，在36mL过程中用线性梯度的35-45％乙醇(250mmol/kg氯化钾，5mmol/kg NaH2PO4)pH 7.5进行洗脱。整个运行过程中温度保持在23℃。
获得了Arg34GLP-1(7-37)和所述肽糖基化形式之间截然不同的峰和它们的分离。
实施例14
通过例如别处(WO 98/08871)描述的传统重组DNA技术在酵母(啤酒酵母)中表达Arg34GLP-1(7-37)。通过传统的反相色谱纯化发酵肉汤培养基中的Arg34GLP-1(7-37)，随后在所述肽的等电点pH，即在pH 5.4，沉淀。离心分离所述沉淀物。
30g等电点沉淀物溶于1.5L水中。pH调至8.37。220mL所述溶液的合并物调到约pH 3.5，上样到用45％(w/w)乙醇、20mmol/Kg柠檬酸、75mol/kg氯化钾pH 3.5平衡的78mL Source 30S(AmershamPharmacia Biotech)柱。用160mL 45％(w/w)乙醇、20mol/kg柠檬酸、87.5mol/kg氯化钾，pH 3.5清洗所述柱，用400mL 200mmol/kg甘氨酸，pH 9.0洗脱Arg34GLP-1(7-37)。合并洗脱物。
将160mL CIEC-合并物(1.8mg/mL)调到pH 7.5，上样于用160mL含有250mmol/kg氯化钠、5mmol/kg磷酸二氢钠、25％(w/w)乙醇pH 7.0的溶剂平衡的78mL 120
Figure C20048002408900411
C18取代(OdDMeSi)的硅胶(颗粒大小15μm)。用40mL平衡溶液清洗所述柱，在936mL过程中用线性梯度的28-38％乙醇(250mmol/kg氯化钠，5mmol/kg磷酸二氢钾)进行洗脱。整个运行过程中温度保持在23℃。
获得了Arg34GLP-1(7-37)和所述肽糖基化形式之间截然不同的峰和它们的分离。
实施例14和5之间设置的非显著性差异是：更高的上样量、不同的上样样品、不同的盐和缓冲系统以及更大的规模。
实施例15
如WO 00/55119中描述地通过酰化作用从亲本肽Arg34GLP-1(7-37)制备Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)。
Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)上样于用40mL25％ w/w乙醇平衡的20mL C18取代(十六烷酰基二甲基甲硅烷基)硅胶(颗粒大小15μm)。用10mL 25％ w/w乙醇、250mmol/kg氯化钾、20mmol/kg Bis-tris丙烷，pH 6.5清洗所述柱，在480mL过程中用线性梯度的37-47.5％乙醇(250mmol/kg氯化钾，5mmol/kg Bis-Tris丙烷，pH 6.5)洗脱Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基))GLP-1(7-37)。整个运行过程中温度保持在50℃。
获得了Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-十六烷酰基)GLP-1(7-37)和未酰化以及二酰化形式之间截然不同的峰和它们的分离，而且，未鉴定的相关杂质分离在后侧。
实施例16
通过例如WO 98/08871中描述的传统重组DNA技术在酵母(啤酒酵母)中表达Lys17Arg30GLP-2(1-33)。用RP-LC捕获Lys17Arg30GLP-2(1-33)，在Lys17Arg30GLP-2(1-33)等电点pH(pH 4.0)沉淀。羟磷灰石柱上进一步纯化所述肽，用100mmol/kg磷酸二氢钾，pH 7.8洗脱。通过阴离子交换色谱在pH 8纯化捕获合并物。
得自阴离子交换步骤的合并物上样于用25％(w/w)乙醇、10mmol/kg磷酸二氢钠、250mmol/kg氯化钠pH 7.5平衡的4L 100C18取代(十八烷酰基二甲基甲硅烷基)硅胶(颗粒大小15μm)。用7.8L 25％乙醇(10mmol/kg磷酸二氢钠、250mmol/kg氯化钾，pH 7.5)接着23.6L 34％乙醇(10mmol/kg磷酸二氢钠，250mmol/kg氯化钾，pH 7.5)清洗所述柱，在78.6L过程中用线性梯度的34-40％乙醇(10mmol/kg磷酸二氢钠，250mmol/kg氯化钾，pH 7.5)进行Lys17Arg30GLP-2(1-33)的洗脱。整个运行过程中温度保持在23℃。
获得了Lys17Arg30GLP-2(1-33)和所述肽中位氧化形式之间截然不同的峰和它们的分离。而且，Lys17Arg30GLP-2(1-33)与截短的杂质(去His-Ala Lys17Arg30GLP-2(1-33))分开。
实施例17
如WO 00/55119中描述地通过酰化作用从亲本肽Lys17Arg30GLP-2(1-33)制备Arg30Lys17Nε(β-Ala(Nα-十六烷酰基))GLP-2(1-33)。
Arg30Lys17Nε(β-Ala(Nα-十六烷酰基))GLP-2(1-33)上样于用12L40％w/w乙醇、10mmol/kg磷酸二氢钠、250mmol/kg氯化钾，pH 7.5平衡的4L 100C18取代(十八烷酰基二甲基甲硅烷基)硅胶(颗粒大小15μm)。用4L平衡溶剂和4L 43％ w/w乙醇、10mmol/kg磷酸二氢钠、227mmol/kg氯化钠，pH 7.5清洗所述柱。在120L过程中用线性梯度的45-60％w/w乙醇(211-94mmol/kg氯化钾、10mmol/kg磷酸二氢钠，pH 7.5)洗脱Arg30Lys17Nε(β-Ala(Nα-十六烷酰基))GLP-2(1-33)。整个运行过程中温度保持在23℃。
获得了Arg30Lys17Nε(β-Ala(Nα-十六烷酰基))GLP-2(1-33)和非酰化形式以及其它相关杂质之间截然不同的峰和它们的分离。
实施例18
通过使用Fmoc化学的标准固相合成法合成胰高血糖素延长蛋白-4(1-39)(带有氨基酸序列HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS)和胰高血糖素延长蛋白-4(2-39)(带有氨基酸序列GEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS)。
含有相关杂质胰高血糖素延长蛋白-4(2-39)的胰高血糖素延长蛋白-4(1-39)溶液溶于水中，总浓度1mg肽/mL。6mL所述溶液上样于用15.7mL含有25％w/w乙醇、0.069％w/w磷酸二氢钠一水合物、2.06％w/w乙酸钾，pH 4.02的溶剂平衡的含有120
Figure C20048002408900431
C18取代(十八烷酰基二甲基甲硅烷基)硅胶(颗粒大小15μm)的7.85mL柱。用3.9ml平衡溶液洗柱。用157mL(20CV)过程中等溶剂梯度的36％w/w乙醇接着23.6mL(3CV)0.069％w/w磷酸二氢钠一水合物、2.06％w/w乙酸钾，pH4.02中线性梯度的36％至39％乙醇进行洗脱。随后，通过7.85mL(1CV)都维持pH 4.02的0.069％w/w磷酸二氢钠一水合物、2.06％w/w乙酸钾中不连续梯度(step gradient)至59％乙醇进行洗脱。室温下进行实验。
获得了胰高血糖素延长蛋白-4(1-39)和胰高血糖素延长蛋白-4(2-39)之间截然不同的峰和它们的分离，胰高血糖素延长蛋白-4(1-39)洗脱在胰高血糖素延长蛋白-4(2-39)之前。
实施例19
通过使用Fmoc化学的标准固相合成法合成胰高血糖素延长蛋白-4(1-39)和胰高血糖素延长蛋白-4(2-39)。
将含有相关杂质胰高血糖素延长蛋白-4(2-39)的胰高血糖素延长蛋白-4(1-39)溶液溶于水中，总浓度1mg肽/mL。8mL所述溶液上样于用15.7mL含有25％w/w乙醇、0.069％w/w磷酸二氢钠一水合物、2.06％w/w乙酸钾，pH 3.5的溶剂平衡的含有120
Figure C20048002408900432
C18取代(十八烷酰基二甲基甲硅烷基)硅胶(颗粒大小15μm)的7.85mL柱。用3.9mL平衡溶液清洗所述柱。用110mL(14CV)过程中等溶剂梯度的37％w/w乙醇接着24mL(3CV)0.069％w/w磷酸二氢钠一水合物、2.06％w/w乙酸钾，pH 3.5中线性梯度的37％至39％乙醇进行洗脱。随后，通过71mL(9CV)过程中0.069％w/w磷酸二氢钠一水合物、2.06％w/w乙酸钾，pH 4.02中线性梯度至59％的乙醇进行洗脱。室温下进行实验。
获得了胰高血糖素延长蛋白-4(1-39)和胰高血糖素延长蛋白-4(2-39)之间截然不同的峰和它们的分离，胰高血糖素延长蛋白-4(1-39)洗脱在胰高血糖素延长蛋白-4(2-39)之前。
实施例20
通过使用Fmoc化学的标准固相合成法合成L-His1胰高血糖素延长蛋白-4(1-39)和D-His1胰高血糖素延长蛋白-4(1-39)(带有氨基酸序列HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS)。
将含有相关杂质D-His1胰高血糖素延长蛋白-4(1-39)的L-His1胰高血糖素延长蛋白-4(1-39)溶液溶于水中，总浓度1mg肽/mL。8mL所述溶液上样于用15.7mL含有25％w/w乙醇、0.069％w/w磷酸二氢钠一水合物、2.06％w/w乙酸钾，pH 3.5的溶剂平衡的含有120
Figure C20048002408900441
C18取代(十八烷酰基二甲基甲硅烷基)硅胶(颗粒大小15μm)的7.85mL柱。用63mL(8CV)过程中等溶剂梯度的37％乙醇接着24mL(3CV)0.069％w/w磷酸二氢钠一水合物、2.06％w/w乙酸钾，pH 3.5中线性梯度的37％至39％乙醇进行洗脱。随后，通过71mL(9CV)过程中0.069％w/w磷酸二氢钠一水合物、2.06％w/w乙酸钾，pH 3.5中线性梯度至59％乙醇进行洗脱。室温下进行实验。
获得了L-His1胰高血糖素延长蛋白-4(1-39)和D-His1胰高血糖素延长蛋白-4(1-39)之间的分离，并通过保留时间分析证实，D-His1胰高血糖素延长蛋白-4(1-39)洗脱在L-His1胰高血糖素延长蛋白-4(1-39)之前。
实施例21
通过使用Fmoc化学的标准固相合成法合成L-His1胰高血糖素延长蛋白-4(1-39)和D-His1胰高血糖素延长蛋白-4(1-39)。
将含有相关杂质D-His1胰高血糖素延长蛋白-4(1-39)的L-His1胰高血糖素延长蛋白-4(1-39)溶液溶于水中，总浓度1mg肽/mL。8mL所述溶液上样于用15.7mL含有25％w/w乙醇、0.13％w/w MES、2.06％w/w乙酸钾，pH 6.7的溶剂平衡的含有120
Figure C20048002408900451
C18取代(十八烷酰基二甲基甲硅烷基)硅胶(颗粒大小15μm)的7.85mL柱。用3.9mL平衡溶液清洗柱。用157mL(20CV)过程中等溶剂梯度的34％乙醇接着24mL(3CV)0.13％w/w MES、2.06％w/w乙酸钾，pH 6.7中线性梯度的34％至39％乙醇进行洗脱。随后，通过7.85mL(1CV)过程维持pH 6.7的0.13％w/w MES、2.06％w/w乙酸钾中不连续梯度至59％的乙醇进行洗脱。室温下进行实验。
获得了L-His1胰高血糖素延长蛋白-4(1-39)和D-His1胰高血糖素延长蛋白-4(1-39)之间的分离，并通过保留时间分析证实，D-His1胰高血糖素延长蛋白-4(1-39)洗脱在L-His1胰高血糖素延长蛋白-4(1-39)之前。
序列表
<110>Novo Nordisk A/S
<12o>胰高血糖素样肽的纯化
<130>6643.000-DK
<160>7
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>1
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1               5                   10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
<210>2
<211>33
<212>PRT
<213>人
<400>2
His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1               5                   10                  15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
            20                  25                  30
Asp
<210>3
<211>39
<212>PRT
<213>Glia monster
<220>
<221>MOD_RES
<222>(39)..(39)
<223>位置39的丝氨酸被酰胺化
<400>3
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
            20                  25                  30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
        35
<210>4
<211>39
<212>PRT
<213>Gila monster
<220>
<221>MOD_RES
<222>(39)..(39)
<223>位置39的丝氨酸被酰胺化
<400>4
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
            20                  25                  30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
        35
<210>5
<211>37
<212>PRT
<213>人
<400>5
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1               5                   10                  15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asp Thr Lys Arg Asn
            20                  25                  30
Lys Asn Asn Ile Ala
        35
<210>6
<211>44
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>MOD_RES
<222>(44)..(44)
<223>位置44的赖氨酸被酰胺化
<400>6
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
            20                  25                  30
Ser Gly Ala Pro Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys
        35                  40
<210>7
<211>33
<212>PRT
<213>合成构建体
<400>7
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1               5                   10                  15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
            20                  25                  30
Asp

Claims (50)

1.从包含胰高血糖素样肽和至少一种相关杂质的组合物中纯化所述胰高血糖素样肽的方法，所述方法是反相高效液相色谱方法，其中用于洗脱的溶剂pH范围从pH 4至pH 10，所述溶剂是pH缓冲的，从而防止洗脱步骤中pH从设置点大于+/-1.0 pH单位的pH漂移，所述溶剂包含浓度从10％w/w至80％w/w的醇。
2.根据权利要求1的方法，其中所述溶剂是pH缓冲的，范围从pH5至pH9。
3.根据权利要求1的方法，其中所述溶剂是在高于所述胰高血糖素样肽等电点的pH处pH缓冲的。
4.根据权利要求1-3任一项的方法，其中所述溶剂是pH缓冲的，从而防止洗脱步骤中pH从设置点大于+/-0.5 pH单位的pH漂移。
5.根据权利要求1-3任一项的方法，其中所述醇是乙醇。
6.根据权利要求1-3任一项的方法，其中所述醇是2-丙醇。
7.根据权利要求1-3任一项的方法，其中所述醇选自甲醇、1-丙醇和己二醇。
8.根据权利要求1-3任一项的方法，其中使用基于二氧化硅的色谱树脂进行所述反相高效液相色谱方法。
9.根据权利要求7的方法，其中所述树脂是取代的硅胶。
10.根据权利要求9的方法，其中所述取代的硅胶选自C4-、C6-、C8-、C12-、C16-、  C18-、C20-、苯基和苯取代的硅胶。
11.根据权利要求1-3任一项的方法，其中使用为多聚基质材料的色谱树脂进行所述反相高效液相色谱方法。
12.根据权利要求1-3任一项的方法，其中所述相关杂质是所述胰高血糖素样肽的截短形式。
13.根据权利要求1-3任一项的方法，其中所述相关杂质是所述胰高血糖素样肽的糖基化形式。
14.根据权利要求1-3任一项的方法，其中所述溶剂包含浓度从20％w/w至60％w/w的醇。
15.根据权利要求14的方法，其中所述溶剂包含浓度从20％w/w至40％w/w的醇。
16.根据权利要求1-3任一项的方法，其中所述胰高血糖素样肽是GLP-1、GLP-1类似物、GLP-1衍生物或GLP-1类似物的衍生物。
17.根据权利要求16的方法，其中所述GLP-1类似物选自Arg34-GLP-1(7-37)，Gly8-GLP-1(7-36)-酰胺，Gly8-GLP-1(7-37)，Val8-GLP-1(7-36)-酰胺，Val8-GLP-1(7-37)，Val8Asp22-GLP-1(7-36)-酰胺，Val8Asp22-GLP-1(7-37)，Val8Glu22-GLP-1(7-36)-酰胺，Val8Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Lys22-GLP-1(7-36)-酰胺，Val8Lys22-GLP-1(7-37)，Val8Arg22-GLP-1(7-36)-酰胺，Val8Arg22-GLP-1(7-37)，Val8His22-GLP-1(7-36)-酰胺，Val8His22-GLP-1(7-37)，Val8Trp19Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Glu22Val25-GLP-1(7-37)，Val8Tyr16Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Trp16Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Leu16Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Tyr18Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Glu22His37-GLP-1(7-37)，Val8Glu22Ile33-GLP-1(7-37)，Val8Trp16Glu22Val25Ile33-GLP-1(7-37)，Val8Trp16Glu22Ile33-GLP-1(7-37)，Val8Glu22Val25Ile33-GLP-1(7-37)和Val8Trp16Glu22Val25-GLP-1(7-37)。
18.根据权利要求16的方法，其中所述GLP-1的衍生物或GLP-1类似物的衍生物具有赖氨酸残基，其中亲脂取代基可选地经由间隔基连接于所述赖氨酸的ε-氨基基团。
19.根据权利要求18的方法，其中所述GLP-1的衍生物或GLP-1类似物的衍生物具有一个赖氨酸残基。
20.根据权利要求19的方法，其中所述亲脂取代基具有8至40个碳原子。
21.根据权利要求20的方法，其中所述亲脂取代基具有8至24个碳原子。
22.根据权利要求21的方法，其中所述亲脂取代基具有12至18个碳原子。
23.根据权利要求18的方法，其中存在所述间隔基，其选自β-Ala、L-Glu或氨基丁酰基的氨基酸。
24.根据权利要求1-3任一项的方法，其中所述胰高血糖素样肽是DPPIV保护的胰高血糖素样肽。
25.根据权利要求1-3任一项的方法，其中所述胰高血糖素样肽是血浆稳定的胰高血糖素样肽。
26.根据权利要求16的方法，其中所述GLP-1类似物的衍生物是Arg34，Lys26(Nε-(γ-Glu(Nα-十六烷酰基)))-GLP-1(7-37)。
27.根据权利要求16的方法，其中所述胰高血糖素样肽具有25至37个氨基酸残基。
28.根据权利要求27的方法，其中所述胰高血糖素样肽具有27至35个氨基酸残基。
29.根据权利要求28的方法，其中所述胰高血糖素样肽具有29至33个氨基酸残基。
30.根据权利要求1-3任一项的方法，其中所述胰高血糖素样肽是GLP-2、GLP-2类似物、GLP-2的衍生物或GLP-2类似物的衍生物。
31.根据权利要求30的方法，其中所述GLP-2的衍生物或GLP-2类似物的衍生物具有赖氨酸残基，其中亲脂取代基可选地经由间隔基连接于所述赖氨酸的ε-氨基基团。
32.根据权利要求31的方法，其中所述GLP-2的衍生物或GLP-2类似物的衍生物具有一个赖氨酸残基。
33.根据权利要求31的方法，其中所述亲脂取代基具有8至40个碳原子。
34.根据权利要求33的方法，其中所述亲脂取代基具有8至24个碳原子。
35.根据权利要求34的方法，其中所述亲脂取代基具有12至18个碳原子。
36.根据权利要求31的方法，其中存在所述间隔基，其选自β-Ala、L-Glu或氨基丁酰基的氨基酸。
37.根据权利要求30的方法，其中所述胰高血糖素样肽具有27至39个氨基酸残基。
38.根据权利要求37的方法，其中所述胰高血糖素样肽具有29至37个氨基酸残基。
39.根据权利要求38的方法，其中所述胰高血糖素样肽具有31至35个氨基酸残基。
40.根据权利要求30的方法，其中所述胰高血糖素样肽是Gly2-GLP-2(1-33)。
41.根据权利要求1-3任一项的方法，其中所述胰高血糖素样肽是胰高血糖素延长蛋白-4、胰高血糖素延长蛋白-4类似物、胰高血糖素延长蛋白-4的衍生物或胰高血糖素延长蛋白-4类似物的衍生物。
42.根据权利要求41的方法，其中所述胰高血糖素样肽是胰高血糖素延长蛋白-4。
43.根据权利要求41的方法，其中所述胰高血糖素样肽是ZP-10，即HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK-NH2。
44.根据权利要求41的方法，其中所述胰高血糖素延长蛋白-4的衍生物或胰高血糖素延长蛋白-4类似物的衍生物是酰化的或聚乙二醇化的。
45.根据权利要求41的方法，其中所述胰高血糖素延长蛋白-4衍生物或胰高血糖素延长蛋白-4类似物的衍生物具有赖氨酸残基，其中亲脂取代基可选地经由间隔基连接于所述赖氨酸的ε-氨基基团。
46.根据权利要求45的方法，其中所述胰高血糖素延长蛋白-4衍生物或胰高血糖素延长蛋白-4类似物的衍生物具有一个赖氨酸残基。
47.根据权利要求45的方法，其中所述亲脂取代基具有8至40个碳原子。
48.根据权利要求47的方法，其中所述亲脂取代基具有8至24个碳原子。
49.根据权利要求48的方法，其中所述亲脂取代基具有12至18个碳原子。
50.根据权利要求47的方法，其中存在所述间隔基，其选自β-Ala、L-Glu或氨基丁酰基的氨基酸。
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