JPH08504561A - 組換えヒトラクトフェリンの製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規プラスミド、トランスフェクションした真核細胞、およびこれらプラスミドおよびトランスフェクションした真核細胞の製造方法を提供する。該新規プラスミドは、ヒトラクトフェリンタンパク質をコードするｃＤＮＡを含有する。アスペルギルス・オリゼーにおけるヒトラクトフェリンタンパク質の製造方法も提供される。それゆえ、本発明は、組換えヒトラクトフェリンの効率的かつ経済的な製造方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 組換えヒトラクトフェリンの製造 発明の背景 発明の技術分野 本発明は一般に鉄結合性糖タンパク質の分野に関する。さらに詳しくは、本発 明はヒトラクトフェリンの組換え製造に関する。関連技術の記載 ヒトラクトフェリン（ＬＦ）は、鉄結合性モノマー糖タンパク質のトランスフ ェリンファミリーの一員である。ヒトラクトフェリンは最初に乳中で発見され、 初乳では７グラム／リットルのレベルまで達することがある。ＬＦは以来、涙、 唾液および粘膜分泌液などの他の外液中で検出されており、多形核白血球の二次 顆粒中でも検出されている。 ＬＦは、Ｃ末端半分とＮ末端半分とで高い相同性を有する２葉性構造を有する ７８ｋＤａの糖タンパク質であり、該相同性はアミノ酸および３次元構造の両レ ベルで明らかである。これら各葉状構造は一つの鉄（III）イオンと高い親和性 で可逆的に結合することができ、それと同時に重炭酸塩も結合する。ラクトフェ リンに対して提唱されている生物学的機能としては、微生物感染に対する防御、 幼児における腸内での鉄吸収の増進、細胞増殖の促進、骨髄造血の制御および炎 症応答の修飾が挙げられる。 細胞外糖タンパク質の工業的生産において、糸状菌は宿主として首尾よく使用 されている。ある種の工業的株は、これらタンパク質をグラム量で分泌すること ができる。加えて糸状菌は真核性タンパク質の翻訳後修飾を正確に行うことがで き、多くの株は米国食品医薬品局の認可を得ている。さらに、大スケールの発酵 技術および下流プロセシング経験（downstream processing experience）を利用 することができる。 現在のところ、ヒトＬＦを製造するための効率的かつ経済的な方法は存在しな い。従って、栄養学的および治療学的適用さらに作用メカニズムのさらなる探求 のためのヒトラクトフェリンの効率的製造方法の開発により、長い間の懸念であ っ た必要性と当該技術分野における記載が達成されるであろう。 発明の要約 一つの態様において、本発明は、ヒトラクトフェリンのｃＤＮＡを含む組換え プラスミドを提供する。本発明のプラスミドは、真核細胞中での発現用に適応さ れており、該真核細胞中でヒトラクトフェリンｃＤＮＡを発現するのに必要な制 御要素を含む。 他の態様において、本発明は、組換えプラスミドを包含する形質転換した真核 細胞を提供する。真核細胞は、アスペルギルス（Aspergillus）を含む一群の糸 状菌から選択される。プラスミドは、ヒトラクトフェリンタンパク質をコードす るポリデオキシリボヌクレオチド断片を挿入したプラスミドベクターを含む。 本発明のさらに他の態様において、組換えプラスミドを含む形質転換した真核 細胞を培養することを包含する、組換えヒトラクトフェリンの製造法が提供され る。プラスミドは、ヒトラクトフェリンタンパク質をコードするポリデオキシリ ボヌクレオチドを有するプラスミドベクターを含む。ヒトラクトフェリンタンパ ク質が生成されるまで適当な栄養培地中で培養した後、ヒトラクトフェリンタン パク質を単離する。 本発明のさらに別の態様において、組換え発現ベクターが提供される。このベ クターは、（１）遺伝子発現における制御的役割を有する１または複数の遺伝子 要素；（２）ヒトラクトフェリンをコードするｃＤＮＡ；（３）適当な転写およ び翻訳開始および停止配列；および（４）該ベクターで形質転換されたアスペル ギルス胞子の選択のための遺伝子要素の集合からなる転写単位を包含する。 本発明のさらに別の態様において、生物学的に活性な組換えラクトフェリンの 製造方法が提供される。該方法は、選択マーカー遺伝子を含む配列、プロモータ ーを含む配列、転写停止配列、およびリンカー配列を合成し、これら配列をクロ ーニングしてプラスミドを生成し、該プラスミドを制限エンドヌクレアーゼで消 化し、ラクトフェリンをコードするｃＤＮＡを制限部位に挿入し、ついでラクト フェリンｃＤＮＡを発現するプラスミドで真核細胞を形質転換することからなる 。 図面の簡単な記載 上記本発明の特徴、利点および目的並びにこれから明らかになるであろう他の 特徴、利点および目的が得られさらに詳細に理解され得るように、上記で簡単に 要約した発明の一層詳細な記載を、添付の図面で説明するある種の態様を参照し ながら行う。これら図面は本明細書の一部を構成する。しかしながら、添付の図 面は本発明の好ましい態様を説明するものであって、本発明の範囲を限定するも のでないことに注意すべきである。本発明は、他の同様に有効な等価な態様を包 含する。 図１は、アスペルギルス・オリゼー（aspergillus oryzae）発現プラスミド、 ｐＡｈ１ｆｇの模式図を示す。 図２は、形質転換したアスペルギルス・オリゼー株のサザーンブロット分析を 示す。 図３は、形質転換体とコントロールＡ０７とのＲＮＡ分析を示す。 図４は、組換えＬＦ分泌および精製の銀染色ＳＤＳ−アクリルアミドゲル分析 を示す。 図５は、ヒト組換えＬＦの特徴付けを示す。 図６は、ヒトラクトフェリンのｃＤＮＡ配列を示す。 発明の詳細な記載 定義 本出願の目的のため、「トランスフェリンファミリー」なる語は、血清トラン スフェリン、卵トランスフェリンおよびラクトフェリンを含む鉄輸送タンパク質 のファミリーを意味する。これらタンパク質はすべて構造的に関連している。 本出願の目的のため、「ベクター」なる語は、ラクトフェリンｃＤＮＡの挿入 、伝播および発現を可能とするプラスミドビヒクルを意味する。 本出願の目的のため、「宿主」なる語は、そのゲノム中にラクトフェリン発現 プラスミドの組み込みを可能とするすべての真核細胞を意味する。 本出願の目的のため、「プロモーター」なる語は、ラクトフェリンｃＤＮＡの 転写を制御する制御ＤＮＡ配列を意味する。 本出願の目的のため、「マルチプルクローニングカセット」なる語は、種々の ｃＤＮＡの挿入を可能とする種々の酵素のための制限酵素開裂部位を含むＤＮＡ 断片を意味する。 本出願の目的のため、「形質転換」なる語は、当該真核細胞によるプラスミド の取り込みを意味する。 本出願の目的のため、「鉄結合能」なる語は、⁵⁶Ｆｅに結合する能力を意味す る。完全に機能性のラクトフェリンは、１分子のＬＦ当たり２原子の鉄と結合す ることができる。 本出願の目的のため、「生物学的活性／生物学的に活性」なる語は、鉄への結 合能によって測定されるラクトフェリンの生物学的活性を意味する。ラクトフェ リンタンパク質は鉄の輸送タンパク質として機能し、生物学的に活性であるため には鉄に結合する必要がある。 本明細書において引用する文献はすべて、参照のため本明細書に引用する。 以下に挙げる実施例は本発明の種々の態様を説明するためのものであり、いか なる形であれ本発明を限定することを意図するものではない。 実施例１ 真菌株および形質転換 これら研究において使用するｐｙｒＧ変異株は、アスペルギルス・オリゼー（ Ａ０７ １１４８８）に由来するものであった。アスペルギルス・オリゼーから のｐｙｒＧ遺伝子を４−ニトロキノリン−１−オキシドで変異させた。このアス ペルギルスの形質転換は、オスマニ（Osmani）らの手順（J．Cell Biol．１０４ ：１４９５〜１５０４（１９８７））の修飾により行った。５ｍＭウラシルおよ び１０ｍＭウリジンを含有するＹＧ培地（０．５％酵母エキス、２％グルコース ）（５０ｍｌ）中に分生子（１×１０⁶／ｍｌ）を接種した。菌の管状物が目に 見えるようになるまで、３２℃にて１４〜１６時間増殖させた。発芽した分生子 を遠心分離により回収し、０．４Ｍ硫酸アンモニウム、５０ｍＭクエン酸カリウ ム（ｐＨ６．０）、０．５％酵母エキス、０．１２ｇノボザイム（novozyme）、 ０．１ｇドリセラーゼ（Driselase）、１００μｌ β−グルクロニダーゼ、０ ．５％ショ糖および１０ｍＭ ＭｇＳＯ₄を含有する溶解混合物（４０ｍｌ）中 に再懸 濁した。３２℃、１５０ｒｐｍにて２〜３時間、プロトプラスト化を行った。プ ロトプラスト化の後、未消化の菌糸体を除去するために、滅菌ミラクロス（mira cloth）を用いた濾過が必要であった。プロトプラストを遠心分離により回収し 、１０ｍｌの０．４Ｍ硫酸アンモニウム、１％ショ糖および５０ｍＭクエン酸カ リウム（ｐＨ６．０）で４℃にて２回洗浄し、１ｍｌの０．６Ｍ ＫＣｌ；５０ ｍＭ ＣａＣｌ；１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中に再懸濁し、氷上に 置いた。プロトプラスト調製の直後に形質転換を行った。プロトプラストのアリ コート（１００μｌ）を、３μｇのＤＮＡおよび５０μｌの４０％ポリエチレン グリコール（ＰＥＧ）６０００、５０ｍＭ ＣａＣｌ₂、０．６Ｍ ＫＣｌおよ び１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に加えた。試料を氷上で１５分間イン キュベートし、その後、ＰＥＧ溶液をさらに１ｍｌ加え、室温でのインキュベー ションを３０分間続けた。この混合物のアリコートを、０．４％硫酸アンモニウ ムを添加した０．７％最小培地（３ｍｌ）中、同じ成分を含有するが２％アガー で固化したプレート上にプレーティングした。その後の増殖はすべて３２℃で行 った。 実施例２ プラスミドの構築 発現プラスミドの模式図を図１に示す。ヒトＬＦをコードする完全ｃＤＮＡを ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を用いて修復し、ＡｃｃＩ消化し修復した ｐＧＥＭ４中にサブクローニングしてｐＧＥＭｈＬＦｃを得た。ＬＦシグナル配 列を除去しα−アミラーゼ配列とインフレームにある５’末端を生成させるため 、ｐＧＥＭｈＬＦｃプラスミドＤＮＡの複製連鎖反応（ＰＣＲ）増幅により、Ｈ ｉｎｄII／ＡｃｃＩ末端を含有する２５２塩基対のラクトフェリン断片（６９〜 ３２１番目）を得た。使用したオリゴプライマーは以下の通りであった。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１に示す５’末端オリゴヌクレオチド： (CTGGGTCGACGTAGGAGAAGGAGTGTTCAGTGGTGC) およびＳＥＱ ＩＤＮＯ２に示す３’末端オリゴヌクレオチド： (GCCGTAGACTTCCGCCGCTACAGG) このＰＣＲ断片をＨｉｎｄIIおよびＡｃｃＩで消化し、Ｈｉｎｄ１１／ＡｃｃＩ 消化したｐＧＥＭｈＬＦＣ中にサブクローニングしてｐＧＥＭｈＬＦを生成した 。プロモーター、シグナル配列および成熟α−アミラーゼII遺伝子の開始部から のアラニン残基をコードするＡｓｐ７１８／ＰｖｕII末端を有する６８１塩基対 のα−アミラーゼ断片を、アスペルギルス・オリゼーのゲノムＤＮＡのＰＣＲ増 幅により得た。オリゴプライマーは以下の通りであった。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３ に示す５’末端オリゴヌクレオチド： (GAGGTACCGAATTCATGGTGTTTTGATCATTTTAAATTTTTAT) およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４に示す３’末端オリゴヌクレオチド： (AGCAGCTGCAGCCAAAGCAGGTGCCGCGACCTGAAGGCCGTACAG) 増幅したＤＮＡをＡｓｐ７１８およびＰｖｕIIで消化し、Ａｓｐ７１８／Ｈｉｎ ｄ１１消化したｐＧＥＭｈＬＦ中にサブクローニングした。得られたプラスミド （ｐＧＥＭＡｈＬＦ）をＥｃｏＲＩで消化し、得られた２．８ｋｂα−アミラー ゼーラクトフェリン断片を、ｐＡｈＬＦ^*を生成するための方法に従ってｐＡＬ ３中の唯一のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングした。ｐＡｈＬＦ^*で失われた ラクトフェリンの最後の５つのカルボキシ末端コドン（２１３８〜２１５３番目 ）を提供するため、およびアスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ遺伝子か らの３’非翻訳配列の最初の１８０塩基対を提供するため、合成オリゴヌクレオ チドを用いた。得られたプラスミド（ｐＡｈＬＦＧ）を用いてアスペルギルス・ オリゼーｐｙｒＧ変異株を形質転換させた。 図１を参照すると、アスペルギルス・オリゼー発現プラスミドｐＡｈＬＦＧは 、アスペルギルス・オリゼーＡＭＹ１１遺伝子の５’−フランキング配列の６８ １塩基対（シグナル配列および成熟α−アミラーゼの最初のコドンを含む）を含 む。これら配列から下流にインフレームで成熟ヒトラクトフェリンをコードする ｃＤＮＡをサブクローニングして、増殖培地にデンプンを添加することによって 組換えタンパク質の産生を可能する。アスペルギルス・ニガーのグルコアミラー ゼ３’非翻訳領域は、転写ターミネーターおよびポリアデニル化シグナルを提供 する。このプラスミドはまた、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa ）ｐｙｒ４選択マーカーおよびアンピシリン耐性遺伝子をも含有する。 ヒトＬＦの発現に用いるプラスミド構築物（ｐＡｈＬＦＧ）は、アスペルギル ス・オリゼーα−アミラーゼII遺伝子（ＡＭＹ１１）のプロモーターおよび分泌 シグナルペプチドをコードする６８１塩基対断片を含有する。シグナル配列はま た、α−アミラーゼ成熟タンパク質の開始部からのアラニンのコドンを含み、エ ンドゲナーゼであるα−アミラーゼペプチダーゼにより認識され得るシグナル配 列開裂部位（Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ）を生成する。成熟タンパク質をコードす るヒトラクトフェリンｃＤＮＡ断片をＡＭＹ１１配列のすぐ下流にインフレーム でサブクローニングし、この高度に効率的なデンプン誘導性プロモーターの制御 下に置いた。転写されたヒトＬＦ ｍＲＮＡを安定化させるため、アスペルギル ス・ニガーからのグルコアミラーゼ遺伝子の３’非翻訳領域をコードする１８０ 塩基対断片を、ヒトＬＦ ｃＤＮＡのすぐ下流のマルチプルクローニングカセッ ト中の唯一のＢａｍＨＩ部位中にライゲートして、転写ターミネーターおよびポ リアデニル化シグナルを提供した。このプラスミドにはまた、アスペルギルス・ オリゼーのｐｙｒＧ栄養要求性変異を補償するニューロスポラ・クラッサＰｙｒ ４選択マーカーも含まれ、ウリジンの不在下で増殖させることによってプラスミ ドで形質転換された胞子の選択を可能としている。 実施例３ ゲノムＤＮＡの操作 アスペルギルス・オリゼーのＤＮＡの単離は、ラフムッセン（Rafmussen）ら のJ．Biol．Chem.、２６５；１３７６７〜１３７７５（１９９０）に記載された 方法に従い、凍結乾燥した菌糸体（２００ｍｇ）から行った。このＤＮＡをＥｃ ｏＲＩで消化し、０．８％アガロースゲル上でサイズ分画し、ニトロセルロース に移した。サザーン分析のためのニトロセルロースフィルターのプレハイブリダ イゼーションおよびハイブリダイゼーションを、６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳお よび０．５％粉乳中、６５℃で１６時間行った。ハイブリダイゼーション溶液に は１×１０⁷ｃｐｍの³²Ｐ−標識ラクトフェリンｃＤＮＡプローブ（２．１Ｋｂ ）が含まれていた。フィルターを２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中、室温にて３０ 分間洗浄し、ついで０．５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中、６８℃で３０分間、 ２回洗浄した。フィルターを乾燥させ、−７０℃で２時間感光させ、オートラジ オグラフィーにより現像した。 図２を参照すると、形質転換したアスペルギルス・オリゼー株に対してサザー ンブロット分析を行った。個々の形質転換体およびコントロールＡＯ７からのゲ ノムＤＮＡを放射性標識ｈＬＦ ｃＤＮＡプローブ（２．１ｋｂ）とハイブリダ イズさせた。矢印は、発現プラスミドのＥｃｏＲＩ消化によって生成する放射性 標識断片（２．８ｋｂ）を示し、これはすべての形質転換体（＃１〜９）には存 在するがコントロールの非形質転換ＡＯ７には存在しない。バクテリオファージ ラムダＨｉｎｄ111断片の分子量を左側に示す。 実施例４ ノーザン分析 市販のRNazolB（ビオキシテック・ラボトリーズ、ヒューストン、テキサス州 ）を用い、製造業者の指示に従ってＲＮＡを凍結乾燥菌糸体（２００ｍｇ）から 単離した。２．２Ｍホルムアルデヒドを含有する０．８％アガロースゲル中で全 ＲＮＡ（２０μｇ）を電気泳動にかけた。ＲＮＡをニトロセルロースに移し、２ ．１ｋｂのラクトフェリンｃＤＮＡかまたはα−アミラーゼ11遺伝子のコード領 域に対応する１．８ｋｂのゲノムα−アミラーゼ断片のいずれかとハイブリダイ ズさせた。プローブをニックトランスレーションにより³²Ｐ−標識した（比活性 ：２×１０⁸ｃｐｍ／μｇ）。ハイブリダイゼーションを、２×ＳＳＣ、０．０ ５％粉乳中、６５℃にて氷上、２×１０⁵ｃｐｍプローブ／ｍｌで行った。 洗浄はサザーン分析に用いたものと同じであった。フィルターを乾燥させ、− ７０℃にて２時間感光させ、オートラジオグラフィーにより現像した。ニトロセ ルロース膜およびマニホルド（manifold）ドットシステムを用いてＲＮＡドット ブロッティングを行った。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件はサザーン分 析に記載したものと同様であった。放射能をベタゴン（betagon）ブロットアナ ライザーを用いて定量した。 ラクトフェリンタンパク質の組換え産生をその好ましい態様において記載した 。しかしながら、サッカロミセス・セレビシエ（saccharomyces cerevisiae）や ピ キア・パストルシス（pichia pastorsis）などの真菌源またはＳＦ９などの昆虫 細胞などの他の多くの採取源で産生させることも可能である。 図３において、ＲＮＡ分析を形質転換体とコントロールＡＯ７を比較して行っ た。パネルＡでは、コントロールＡＯ７および形質転換体＃１からのＲＮＡ（２ ０μｇ）を放射性標識ヒトＬＦ ｃＤＮＡとハイブリダイズさせたノーザン分析 を示す。ヒトＬＦ ｍＲＮＡ（２．３ｋｂ）が形質転換体＃１では検出されたが 、コントロールの非形質転換ＡＯ７では検出されなかった。２８ｓおよび１８ｓ ｒＲＮＡバンドの位置を左側に示す。パネルＢでは、放射性標識α−アミラーゼ ゲノムＤＮＡプローブを用いた、コントロールＡＯ７および形質転換体＃１から のＲＮＡ（５および１０μｇ）のドットブロットを比較して示す。パネルＣで は、放射性標識ヒトＬＦ ｃＤＮＡプローブを用いた、コントロールＡＯ７およ び形質転換体＃１からのＲＮＡ（５および１０μｇ）のドットブロットを比較し て示す。 本発明の発現プラスミドの制御要素下でラクトフェリンｍＲＮＡがアスペルギ ルス・オリゼー中で正確かつ効率的に転写されるか否かを決定するためにノーザ ン分析を行った。形質転換体＃１からの胞子（１×１０⁶／ｍｌ）およびコント ロールの非形質転換胞子を、炭素源として１．５％グルコースを含有する真菌培 地中に接種し、小さなシェークフラスコ培地中、３０℃にて４８時間増殖させた 。培養液を洗浄し、３％デンプンを含有する真菌培地中に再接種してヒトＬＦｍ ＲＮＡの転写を誘導した。２４時間後、細胞を回収し、ＲＮＡを単離した。２． ２Ｍホルムアルデヒドを含有する１．０％アガロースゲル上で全ＲＮＡ（２０μ ｇ）をサイズ分画し、ニトロセルロース上にブロッティングした。 ヒトラクトフェリンｍＲＮＡの検出は³²Ｐ標識したヒトＬＦ ｃＤＮＡ（２． ０ｋｂ）プローブを用いて行った。ヒトＬＦ放射性標識ｃＤＮＡプローブとのハ イブリダイゼーションは、形質転換体においてラクトフェリンｍＲＮＡに対する 正確なサイズにて（２．３ｋｂ）特定の放射性標識バンドを検出したが、コント ロールの非形質転換株では検出されなかった（図３Ａ）。ドットアッセイによる ｍＲＮＡレベルの定量は、コントロールのＡＯ７と形質転換体＃１との間で匹敵 し得るレベルの内生α−アミラーゼｒＲＮＡの発現を示した（図３Ｂ）。加えて 、形質転換体＃１ではα−アミラーゼとヒトＬＦ ｍＲＮＡとで同様のレベルの 発現が認められた（図３Ｂおよび３Ｃ）。 実施例５ ヒト組換えＬＦの精製 増殖培地からのＬＦの精製は、実質的にストウェル（Stowell）らのBiochem． J．、２７６：３４９〜５９（１９９１）の記載に従い、ＣＭセファデックスＣ ５０を用いて行った。カラムを５００ｍｌの０．０２５ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７ ．５）、０．１Ｍ ＮａＣｌで前以て平衡化した。該前以て平衡化したカラムに 適用する前に培地のｐＨをｐＨ７．４に調節した。カラムを平衡緩衝液（５００ ｍｌ）で洗浄し、ついで０．１〜１．１Ｍ ＮａＣｌの直線塩勾配により洗浄し た。ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよび銀染色を用い、フラクション（全部で７ｍｌ）をラ クトフェリン含量および純度についてアッセイした。ＬＦを含有するフラクショ ンを０．０２５Ｍ トリスＨＣｌ、ｐＨ７．５／０．１ ＭＮａＣｌに対して透 析し、凍結乾燥させた。 実施例６ ヒトＬＦの定量 本質的にビルジャ（Vilja）らのJ．Immunol.Methods、７６：７３〜８３（１ ９８５）の記載に従い、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて組換えラクトフェリンを定 量した。非競合アビジン−ビオチンアッセイを用いて５ｎｇのラクトフェリン感 度が得られた。乳房乳から単離したヒトＬＦ（シグマ）を標準として用いた。ビ オチン化したヒトラクトフェリンＩｇＧはジャクソン・イムノリサーチ・ラボラ トリーズ（Jackson Immunoresearch Laboratories）、ウエストグローブ、ペン シルベニア州から得た。 実施例７ Ｎ末端の配列決定 製造業者の指示に従い（アプライド・バイオシステムズ）、精製ヒト組換えＬ Ｆ（５μｇ）をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離させ、プロブロット （Problott）（ポリビニリデンジフルオライド型の膜）に移した。ヒトＬＦをク マシーブリリアントブルー染色で検出し、脱染色した。このヒトＬＦのバンドを 切り出し、蒸留Ｈ₂Ｏで充分に洗浄し、空気乾燥させた。ヒトＬＦの最初の１０ アミノ酸のＮ末端アミノ酸配列を、アプライド・バイオシステムズのパルス（Pu lsed）−液相シークエンサー（モデル４７７Ａ）を用いて自動エドマン分解法に より決定した。 図４を参照すると、パネルＡは、組換えヒトＬＦ分泌および精製の銀染色ＳＤ Ｓ−ポリアクリルアミドゲル分析を示す。レーン１には乳房乳ヒトＬＦ標準（５ ００ｎｇ）が含まれる。レーン２および３には、それぞれ誘導コントロールＡＯ ７および形質転換体＃１からの増殖培地の試料（４０μｇ）が含まれる。レーン ４〜８には、形質転換体＃１の増殖培地からの組換えＬＦのＣＭ−セファデック ス精製により回収した溶出フラクション（それぞれ、＃２５、３０、３５、４０ および４５）の１００μ１アリコートが含まれる。分子量マーカー（バイオラド ・ラボラトリーズ、リッチモンド、カリフォルニア州）の位置を左側に示す。サ イズはキロダルトンにて示す。パネルＢは、ヒトＬＦに対して向けられた特異的 ポリクローナル抗体を用い¹²⁵Ｉ−プロテインＡで検出する、パネルＡの記載と 同じ２つの試料のウエスタンイムノブロット分析を示す。パネルＣは、組換えヒ トＬＦの＃６Ｎ末端アミノ酸配列を示す。組換えヒトＬＦをＮ末端から１０の残 基で配列決定したが、本発明の構築物においてアラニンが付加されてα−アミラ ーゼシグナル配列開裂部位を提供すること以外は乳房乳ヒトＬＦと同一である。 実施例８ 脱糖付加 Ｎ−グリコシダーゼＦ（ベーリンガー・マンハイム）を用いて脱糖付加を行っ た。ラクトフェリン（０．５μｇ）を含有するアスペルギルス・オリゼーの増殖 培地を０．０１％ＳＤＳの存在下、１００℃にて３分間変性させた。ヒト乳から の標準ＬＦも同様に処理した。その後、試料を氷上に５分間置いた。Ｎ−グリコ シダーゼＦ反応を０．４Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）；０．０８％トリト ン；０．１％β−メルカプトエタノールおよび１単位酵素中で行い、３７℃で１ ６時 間インキュベートした。ヒトラクトフェリンに対して特異的に向けられたＩｇＧ を用いてＰＡＧＥおよびウエスタン分析を行い、消化した試料の移動度の増加を 検出した。 図５にヒト組換えＬＦの特徴付けを行った。パネルＡはラクトフェリンの脱糖 付加を示す。パネルＡはラクトフェリンの脱糖付加を示す。ヒトラクトフェリン に対して向けられた特異的なポリクローナル抗体を用いて糖付加したラクトフェ リンおよび脱糖付加したラクトフェリンのウエスタン分析を行い、検出は¹²⁵Ｉ −プロテインＡで行った。第一のパネルには、ＮグリコシダーゼＦで処理してい ない（−）および処理した（＋）初乳ヒトＬＦ（５００ｎｇ）が含まれる。第二 のパネルには、ＮグリコシダーゼＦで処理していない（−）および処理した（＋ ）精製組換えヒトＬＦ（５００ｎｇ）が含まれる。糖付加したヒトＬＦのサイズ を矢印で示す。パネルＢは、鉄結合能に関する組換えラクトフェリンの機能分析 を示す。パネルＡおよびＢは、それぞれ、示した濃度における初乳ヒトＬＦおよ び精製組換えヒトＬＦの２つの試料の⁵⁶Ｆｅフィルター結合アッセイを示す。両 パネルにおける第一のレーンには、陰性コントロールとしてＢＳＡ（５μｇ）が 含まれる。 ラクトフェリンは、Ｎ−グリコシド結合により結合した２つのＮ−アセチルラ クトアミン型のグリカンを含む。組換えラクトフェリンが正確に糖付加されるか どうかを決定するため、該タンパク質をＮ−グリコシダーゼＦで処理し、ＳＤＳ −ポリアクリルアミド電気泳動上で分離し、ニトロセルロースに移し、ヒトラク トフェリンに対して向けられた特異的ＩｇＧを用いてプローブした（図５Ａ）。 Ｎ−グリコシダーゼＦはグリコシルアミン結合において加水分解して、分子量の 小さい炭水化物不含のペプチドを生成する。組換えＬＦをヒト乳から精製したＬ Ｆと比較すると、Ｎ−グリコシダーゼＦ消化によって両タンパク質とも一緒に移 動し、該組換えタンパク質が天然ＬＦと同じ糖付加パターンを有することが示唆 された。 ラクトフェリンは、各葉状部が一つのＦｅ³⁺イオンと堅固だが可逆的に結合す る能力を有する２葉性構造を有する。ラクトフェリンの鉄結合特性は、その機能 的役割にとって非常に重要である。アスペルギルス・オリゼーで発現され分泌さ れた組換えヒトＬＦが初乳ラクトフェリンと同様の鉄結合能を有するかどうかを 試験するため、⁵⁶Ｆｅマイクロフィルター結合アッセイを開発した。形質転換体 ＃１の増殖培地から単離した精製ヒトラクトフェリンを０．１Ｍクエン酸（ｐＨ ２．０）に対して透析してアポ−ヒトＬＦを生成した。ヒト乳からの天然ラクト フェリンも同様に処理した。等容量の１Ｍ重炭酸塩中のこれら試料に過剰の⁵⁶Ｆ ｅ（０．２ｍＣｉ）を加え、ついで３７℃にて３０分間インキュベートした。試 料をニトロセルロース膜に適用し、重炭酸塩で数回洗浄した。オートラジオグラ フィーによりフィルターを視覚化し、ベタゴンブロットアナライザーを用いてＦ ｅ−結合を定量した。図５Ｂに示すように、試験したすべての濃度において組換 えＬＦおよび天然ＬＦの両方とも同様の鉄結合レベルを示した。これら結果は、 鉄結合能において組換えヒトＬＦが天然ヒトＬＦと識別できないことを示してい る。 図６において、ヒトラクトフェリンタンパク質の全ｃＤＮＡ配列を示す。ラク トフェリンをコードするｃＤＮＡは、プラスミドを生成し、真核細胞を形質転換 し、ラクトフェリンタンパク質を製造するために用いる。 本発明において使用するアスペルギルスの株は、欠損ｐｒｙ４遺伝子を含むた めオロチジン５’リン酸（ＯＭＰ）デカルボキシラーゼを合成することができな い栄養要求変異株である。この酵素は、ウリジンの合成に必要である。この株は ウリジンを欠く培地で増殖できない。このプラスミドは、選択マーカー、すなわ ちＯＭＰデカルボキシラーゼの遺伝子をコードする配列を含む。それゆえ、アス ペルギルスによる該プラスミドの取り込みは、ウリジンを欠く培地上で増殖させ ることによって選択することができる。アスペルギルスは、ウリジン欠失培地上 で増殖できるように該プラスミドにより形質転換される。 本発明の一つの態様において、生物学的に活性な組換えラクトフェリンタンパ ク質が製造される。この方法は、選択マーカー遺伝子を含む配列、プロモーター を含む配列、転写停止配列およびリンカー配列を合成することを包含する。その 後、これら配列をクローニングしてプラスミドを生成させ、該プラスミドを制限 エンドヌクレアーゼで消化する。ラクトフェリンをコードするｃＤＮＡを制限部 位に挿入し、ついで真核細胞をラクトフェリンｃＤＮＡを発現する該プラスミド で形質転換する。 本発明の方法に使用する選択マーカー遺伝子は、ラクトフェリンｃＤＮＡプラ スミドで形質転換された細胞の単離を可能とするものであればいかなるものであ ってもよい。好ましくは、選択マーカー遺伝子は、ｐｙｒ４、ｐｙｒＧ、ａｒｇ Ｂ、ｔｒｐＣおよびａｎｄＳから選ばれる。 本発明において有用なプロモーターは、ラクトフェリンｃＤＮＡの転写を制御 することができるものであればいかなるものであってもよい。好ましくは、プロ モーターはアルコールデヒドロゲナーゼ、ａｒｇＢ、α−アミラーゼおよびグル コアミラーゼよりなる群から選ばれる。 本発明において有用な転写停止配列は、ラクトフェリンｍＲＮＡの安定化を可 能とするものであればいかなるものであってもよい。好ましくは、転写停止配列 はα−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼまたはｂｅ ｎＡに由来するものである。 本発明において有用なリンカー配列は、翻訳開始コドン、分泌シグナルおよび 制限酵素開裂部位を含むものであればいかなるものであってもよい。好ましくは 、リンカー要素はα−アミラーゼ、グルコアミラーゼまたはラクトフェリンに由 来するものである。 本発明において有用な真核細胞は、ラクトフェリンｃＤＮＡを含むプラスミド を組み込むことができ、ラクトフェリンｃＤＮＡを発現することができるもので あればいかなるものであってもよい。好ましくは、真核細胞は真菌細胞または昆 虫細胞である。ＳＦ９などの昆虫細胞が本発明の方法に有用である。さらに好ま しくは、真菌細胞は酵母細胞である。最も好ましくは、本発明において有用な真 核細胞は、アスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・ニガー、アスペルギル ス・ニデュランス（A．Nidulans）およびアスペルギルス・アワモリ（A．Awamor i）などのアスペルギルス株である。 本明細書には本発明の目的を達成するための具体例について開示しているが、 本発明の精神および範囲を逸脱しない範囲において方法および装置を若干改変し てもよい。またクレームに記載の各要素および工程は実質的に同じまたは均等の 結果をもたらすようなすべての要素および工程を含むものである。また本発明は 、その原理を利用する限りにおいていかなる態様も広く包含する。したがって、 本発明は、その目的を達成し、開示の目的物および利点ならびに潜在的な他のす べてのものを達成するために適合されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 15/09 //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） //(Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，Ｂ Ｒ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ， ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｅ，ＳＫ (72)発明者 オマリー、バート・ダブリュー アメリカ合衆国77079テキサス、ヒュース トン、ランブルウッド639番 (72)発明者 メイ、グレゴリー・エス アメリカ合衆国77025テキサス、ヒュース トン、ダーネス4119番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．選択マーカー遺伝子を含む配列、プロモーターを含む配列、転写停止配列 、およびリンカー配列を連結し、該配列をクローニングしてプラスミドを生成さ せ、該プラスミドを制限エンドヌクレアーゼで消化し、ラクトフェリンをコード するｃＤＮＡを制限部位に挿入し、ついでラクトフェリンｃＤＮＡを発現する該 プラスミドで真核細胞を形質転換することを特徴とする、生物学的に活性な組換 えラクトフェリンの製造方法。 ２．該選択マーカー遺伝子がｐｙｒ４、ｐｙｒＧ、ａｎｄＳ、ａｒｇＢおよび ｔｒｐＣよりなる群から選ばれたものである請求項１に記載の方法。 ３．該細胞がラクトフェリンを発現する請求項１に記載の方法。 ４．請求項２に記載の方法により製造されたラクトフェリン。 ５．該プロモーターがアルコールデヒドロゲナーゼ、ａｒｇＢ、α−アミラー ゼ、グルコアミラーゼおよびｂｅｎＡよりなる群から選ばれたものである請求項 １に記載の方法。 ６．該転写停止配列が、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、アルコールデヒ ドロゲナーゼおよびｂｅｎＡよりなる群から選ばれたものである請求項１に記載 の方法。 ７．該リンカー配列がα−アミラーゼ、グルコアミラーゼおよびラクトフェリ ンよりなる群から選ばれたものである請求項１に記載の方法。 ８．図６記載のｃＤＮＡおよび真核細胞中で該ｃＤＮＡを発現させるのに必要 な制御要素からなる、真核細胞中での発現に適合されたプラスミド。 ９．ｐＡｈＬＦＧであるプラスミド。 １０．請求項８に記載のプラスミドを含む真核細胞。 １１．該真核細胞が真菌細胞および昆虫細胞よりなる群から選ばれたものであ る請求項１０に記載の真核細胞。 １２．該昆虫細胞がＳＦ９である請求項１１に記載の真核細胞。 １３．該真菌細胞が酵母である請求項１１に記載の真核細胞。 １４．該酵母細胞がアスペルギルスである請求項１３に記載の真核細胞。 １５．該アスペルギルス株がアスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・ニ ガー、アスペルギルス・ニデュランスおよびアスペルギルス・アワモリよりなる 群から選ばれたものである請求項１４に記載の真核細胞。 １６．ラクトフェリンタンパク質をコードするポリデオキシリボヌクレオチド を有するプラスミドベクターを含む組換えプラスミドを含有する形質転換体真核 細胞を、ラクトフェリンタンパク質が生成されるまで適当な栄養培地中で培養し 、ついで該ヒトラクトフェリンを単離することを特徴とする、ラクトフェリンの 製造方法。 １７．（１）遺伝子発現において制御的役割を有する１または複数の遺伝子要 素、（２）ヒトラクトフェリンをコードするｃＤＮＡ、および（３）適当な転写 および翻訳開始および停止配列の集合からなる転写単位を有する組換え発現ベク ター。 １８．該遺伝子要素がプロモーターである請求項１７に記載のベクター。 １９．該プロモーターがアルコールデヒドロゲナーゼ、ａｒｇＢ、α−アミラ ーゼ、グルコアミラーゼおよびｂｅｎＡよりなる群から選ばれたものである請求 項１８に記載のベクター。 ２０．該転写停止配列がα−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、アルコールデヒ ドロゲナーゼおよびｂｅｎＡよりなる群から選ばれたものである請求項１７に記 載のベクター。 ２１．請求項１６に記載の方法によるタンパク質生成物。