JPH0622784A - ヒト血清アルブミンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 高レベルにＨＳＡを産生する上で重要な働き
を持つ新規なプロモーターを提供すること及びそれを取
得する方法を示すことであり、このプロモーターを担持
したプラスミドを用いて形質転換体を取得し、ＨＳＡを
産生する系を確立すること。 【構成】 （１）配列番号１のＤＮＡ配列を有するＡＯ
Ｘ１プロモーターおよびヒト血清アルブミン遺伝子を担
持してなるプラスミドを構築し、（２）そのプラスミド
を宿主に導入して、形質転換させ、（３）得られた形質
転換体を培養して、ヒト血清アルブミンを産生させるこ
と、からなるヒト血清アルブミンの製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なＡＯＸ１プロモ
ーターを担持するプラスミドを用いるヒト血清アルブミ
ン（以下、ＨＳＡという）の製造方法に関するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】メタノール資化性酵母はメタノールを炭
素源およびエネルギー源として増殖する。その際、メタ
ノール代謝経路において第１段階でアルコール酸化酵素
（ＡＯＸ、ＥＣ１．１．３．Ｂ）によりメタノールをホ
ルムアルデヒドに酸化する。メタノール資化性酵母の一
種であるピキア酵母（Pichia pastoris ）はゲノム中に
二種のＡＯＸ遺伝子（ＡＯＸ１遺伝子、ＡＯＸ２遺伝
子）を有する。

【０００３】この内ＡＯＸ１プロモーターとＡＯＸ２プ
ロモーターには活性に大きな差があり、通常ピキア酵母
で発現されているＡＯＸはほとんどＡＯＸ１プロモータ
ーによって転写されたものであることが示されている。
（Molecular and CellularBiology, vol.9, 1316(198
9)）。ＡＯＸはグルコース含有培地ではほとんど発現さ
れないのに対し、メタノール含有培地では細胞中の可溶
化蛋白質の３０％を示すといわれている。ＡＯＸをコー
ドする２種類のＡＯＸ遺伝子のうち、ＡＯＸ１遺伝子の
制御領域であるＡＯＸ１プロモーターは強い活性を持
ち、メタノール資化性酵母の異種蛋白質の発現に用いら
れ、高い産生量を示した。しかしながら、ＡＯＸ２プロ
モーターは活性が弱く、異種蛋白質の発現には適当では
なかった。メタノール資化性酵母の異種蛋白質の発現系
は大量に産物が得られるために、その発現系に強力なプ
ロモーターが求められていた。

【０００４】最近、そのＡＯＸ遺伝子の調節領域を用い
て異種蛋白質を産生する方法が研究されている（Yeast,
5, 167-177(1989) 、特開平1-128790号公報、同2-1042
90号公報、ヨーロッパ公開公報347928等）。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、高レ
ベルにＨＳＡを産生する上で重要な働きを持つ新規なプ
ロモーターを提供すること及びそれを取得する方法を示
すことである。このプロモーターを担持したプラスミド
を用いて形質転換体を取得し、ＨＳＡを産生する系を確
立することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、（１）配列番
号１のＤＮＡ配列を有するＡＯＸ１プロモーターおよび
ヒト血清アルブミン遺伝子を担持してなるプラスミドを
構築し、（２）そのプラスミドを宿主に導入して、形質
転換させ、（３）得られた形質転換体を培養して、ヒト
血清アルブミンを産生させること、からなるヒト血清ア
ルブミンの製造方法である。

【０００７】（ａ）ＡＯＸ１プロモーター 本発明のプロモーターを取得するための原料細胞として
は、ピキア酵母 ＩＦＯ−１０１３等が例示される。製
法としては、原料細胞から公知の方法（例えば、Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ Ｔ．等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉ
ｎｇ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ ＮＹ（１９８２）等）に準じて染色
体ＤＮＡを抽出し、これを適当な制限酵素（ＥｃｏＲＩ
等に）によって部分消化し、適当なファージベクター
（例えば、λｇｔ１０、ＥＭＢＬ３）に導入した後（図
１にＡＯＸ遺伝子をλｇｔ１０に組み込んだ制限酵素地
図を示す。）、適当な宿主（例えば、大腸菌ＬＥ３９２
株やＷＬ９５株など）を形質転換してヒトジェノミック
ライブラリーを得る。合成プローブによるスクリーニン
グによって陽性クローンを得、目的とするファージＤＮ
Ａを回収する。ファージＤＮＡを適当な制限酵素（Ｂａ
ｍＨＩ、ＨｉｎｄIII 等）によって消化し、適当なプラ
スミドベクター（例えば、ｐＵＣ１９など）に導入して
宿主（例えば大腸菌ＪＭ１０９株）を形質転換し、目的
とするクローンを得る。

【０００８】ＤＮＡの塩基配列は公知の方法（例えば、
キロシークエンス法、マキサム・ギルバート法、ダイデ
オキシ法）によって行われる。本発明のプロモーターを
含む塩基配列は、ＡＯＸ１遺伝子転写開始点の５′側上
流域に存在し、約２４０ｂｐを有している。その塩基配
列はキロシークエンス法によれば配列番号１に示す通り
である。

【０００９】尚、特開昭６１−１７３７８１号公報に開
示されたＡＯＸ１プロモーターとはＤＮＡ配列が異な
る。表１にその比較を示す。

【００１０】

【表１】

【００１１】（ｂ）プラスミド 本発明のプラスミドは（ａ）のＡＯＸ１プロモーターを
担持してなる。また、シグナル配列、ＨＳＡ遺伝子、タ
ーミネーター、相同領域、マーカー遺伝子、宿主中で複
製可能な自律性複製配列等を担持していてもよい。ＨＳ
Ａ遺伝子は公知のものであれば特に制限されない。同一
または相同でもよく、具体的には特開昭５８−５６６８
４号、同６２−２９９８５号の各公報等に開示されてい
る。

【００１２】シグナル遺伝子は、酵母インベルターゼ、
α−ファクター遺伝子のような酵母由来のもの、ＨＳＡ
のシグナル配列またはその誘導体（特開平２−１６７０
９５号）、人工的に創案したシグナル配列（特開平１−
２４０１９１号）等を用いることができる。ターミネー
ターとしてはＡＯＸ１ターミネーター等を用いることが
できる。

【００１３】相同領域はＨＩＳ４、ＵＲＡ３、ＬＥＵ
２、ＡＲＧ４等が例示される。マーカー遺伝子は抗生物
質耐性遺伝子や栄養要求性相補遺伝子等が用いられる。
抗生物質としてはシクロヘキシミド、Ｇ−４１８、クロ
ラムフェニコール、ブレオマイシン、ハイグロマイシン
等が例示される。栄養要求性相補遺伝子としては、ＨＩ
Ｓ４、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＡＲＧ４等が挙げられる。

【００１４】転写ユニットは５′側から３′側に向かっ
て、ＡＯＸ１プロモーター、シグナルペプチド遺伝子、
ＨＳＡ遺伝子、ターミネーターの順に配置される。本発
明のプラスミドは通常の遺伝子工学技術を用いて調製す
ることができる。 （ｃ）形質転換体 本発明の形質転換体は（ｂ）のプラスミドを導入してな
る。

【００１５】本発明の宿主は酵母が好ましく、より好ま
しくはピキア酵母（Pichia pastoris ）である。具体的
にはＧＴＳ１１５（ＮＲＲＬ寄託番号Ｙ−１５８５１）
等が例示される。宿主細胞（酵母）の形質転換は公知の
方法、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、プロトプラス
トポリエチレン融合法、エレクトロポレーション法など
が使用でき、必要な形質転換体を選択する。

【００１６】プラスミドの宿主細胞中での存在の様式
は、染色体中に挿入されて、あるいは置換されて組み込
まれる。または、プラスミド状態で存在していてもよ
い。宿主に導入される外来遺伝子のコピー数は１コピー
でも複数コピーでもよい。また、他のプロモーターでＨ
ＳＡを発現させるプラスミドと同じ菌株内に存在させて
も構わない。

【００１７】（ｄ）ＨＳＡの製造方法 （ｃ）で得られた形質転換株は、宿主細胞の自体公知の
培地で培養する。培地としては０．０１〜５％メタノー
ルを含有したＹＮＢ液体培地〔０．７％ YeastNitrogen
Base(Difco 社) 〕、および０．０１〜５％メタノール
を含有したＹＰ培地〔１％イーストエキストラクト（Di
fco 社) 、２％ポリペプトン（大五栄養社）〕などが例
示される。

【００１８】培養は、通常１５〜４３℃（好適には３０
℃程度）で２０〜３６０時間程度行い、必要により通気
や攪拌を加えることもできる。培養後、培養上清から、
自体公知の方法、例えば膜濾過、イオン交換法、疎水ク
ロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、
ゲル濾過分画法などによりＨＳＡを精製する。

【００１９】

【実施例】本発明をより詳細に説明するために実施例お
よび実験例を挙げるが、本発明はこれらにより何ら限定
されるものではない。なお、本発明において多くの技
法、反応および分析方法は当業界においてよく知られて
いる。特に断らない限り、全ての酵素は商業的供給源、
例えば、宝酒造等から入手することができる。

【００２０】酵素反応のための緩衝液及び反応条件は特
に断らない限り各酵素の製造元の推奨に従って使用し
た。プラスミドを用いた大腸菌の形質転換法、プラーク
ハイブリダイゼーション法、及び電気泳動法は「モレキ
ュラークローニング」コールドスプリングハーバーラボ
ラトリー〔「Moleculer Cloning 」Cold Spring Harbor
Laboratory(1982)〕に記載されている方法により行っ
た。

【００２１】実施例１−１ ピキア酵母ＡＯＸ１遺伝子
のクローニングとそのプロモーターを用いたＨＳＡの生
産 使用した酵母株 ピキア酵母ＩＦＯ−０９４８と同ＩＦＯ−１０１３と
は、（財）発酵研究所より入手した。ピキア酵母ＡＴＣ
Ｃ−２６０４とピキア酵母ＡＴＣＣ−２８４８５とはＡ
ＴＣＣより入手した。ピキア酵母ＧＴＳ１１５（ｈｉｓ
４）はピキア酵母における形質転換用宿主として使用し
た。

【００２２】ＡＯＸ１遺伝子のクローニング Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ等の方法（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，
Ｒ．Ｉｎ ”ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ”，３８，６７５
（１９７４））に従って、ピキア酵母ＩＦＯ−１０１３
より染色体ＤＮＡを抽出した。その他のＤＮＡの取り扱
いは、一般的な方法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．
等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）に従った。ＡＯＸ１遺
伝子のスクリーニングには、配列番号２及び３の２種類
のオリゴヌクレオチドプローブを使用した。

【００２３】ＡＯＸ１遺伝子欠損株の作製 ピキア酵母ＩＦＯ−１０１３よりクローニングしたＡＯ
Ｘ１遺伝子を用いて、ピキア酵母ＧＴＳ１１５内在性の
ＡＯＸ１遺伝子を破壊した。ＩＦＯ−１０１３由来ＡＯ
Ｘ１遺伝子を制限酵素ＰｓｔＩとＸｂａＩとで消化した
後、約３ｋｂのＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣ１９にサ
ブクローニングした。さらに、このプラスミドのＡＯＸ
１遺伝子上に存在するＳａｌＩ部位に３ｋｂのパン酵母
由来ＳＵＣ２遺伝子を挿入した。得られたプラスミドを
用いてピキア酵母ＧＴＳ１１５を形質転換した。形質転
換体の選択はシュークロース資化能の獲得により行っ
た。

【００２４】結果 （財）発酵研究所及びＡＴＣＣより入手した各ピキア酵
母、ＩＦＯ−０９４８、ＩＦＯ−１０１３、ＡＴＣＣ−
２６０４、ＡＴＣＣ−２８４８５の４株について、その
メタノール資化能をメタノールを単一炭素源とする最小
培地における増殖度を指標に比較した。これら４株の増
殖はグルコースやエタノールを炭素源とする培地では差
がなかったが、メタノール含有培地ではピキア酵母ＩＦ
Ｏ−１０１３が他の３株より増殖が速く、かつ最終菌体
濃度も最も高かった。この結果よりピキア酵母ＩＦＯ−
１０１３はメタノール資化能が高くアルコールオキシダ
ーゼ発現量が多い株であると判断した。

【００２５】ピキア酵母ＩＦＯ−１０１３よりＡＯＸ１
遺伝子をクローニングするため、この株より染色体ＤＮ
Ａを抽出した。抽出した染色体ＤＮＡを制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで消化後ファージベクターλｇｔ１０に導入し、ピ
キア酵母の染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。ライ
ブラリーの約５×１０⁵ クローンについてプラークハイ
ブリダイゼーションによるＡＯＸ１遺伝子のスクリーニ
ングを行った。ハイブリダイゼーションプローブとして
は、既に報告されているピキア酵母のアルコールオキシ
ダーゼのアミノ酸配列を基に、そのＮ末端領域とＣ末端
領域とにそれぞれ相補する２種類の合成オリゴヌクレオ
チドを使用した（配列番号２及び３）。ハイブリダイゼ
ーションの結果、４個のポジティブクローンが得られ
た。これら４クローンのうち最も大きなＤＮＡインサー
ト（５．７ｋｂ）を有するクローンλＭＲ１０１につい
てより詳細に検討した。上述のハイブリダイゼーション
プローブを用いたサザーンブロット解析とＤＮＡ塩基配
列の決定より、クローンλＭＲ１０１が完全長のＡＯＸ
１遺伝子を含むことが明らかとなった。このＡＯＸ１遺
伝子の塩基配列は配列番号１の３′末端に連結されてい
た。ＩＦＯ−１０１３株のＡＯＸ１遺伝子のＤＮＡ塩基
配列を配列番号２として示す。このＡＯＸ１遺伝子は１
９８９ｂｐのコード領域を有し、５′−非コード領域内
ＡＴＧ上流１５４〜１５９ｂｐの位置（配列番号１の８
５〜９０番目の塩基）にはＴＡＴＡ（ＴＡＴＡＡＡ）ボ
ックス配列が存在した。

【００２６】ピキア酵母でＨＳＡの分泌発現を試みるた
めに、ＡＯＸ１遺伝子のプロモーター領域を含む１．９
ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＡｓｕII断片をピキア酵母形質転換
用プラスミド上にサブクローニングし、さらにＨＳＡｃ
ＤＮＡをＡＯＸ１遺伝子のプロモーターの下流に挿入し
た。このＨＳＡ発現プラスミドを用いてピキア酵母ＧＴ
Ｓ１１５とその内在性ＡＯＸ１遺伝子の欠損株であるピ
キア酵母ＧＴＳ１２０とを形質転換した。形質転換体の
選択は、ＨＳＡ発現用プラスミド内に含まれるＨＩＳ４
遺伝子の導入によるヒスチジン要求性の消失により行っ
た。得られたピキア酵母形質転換体各１０株をメタノー
ル含有培地を用いて３０℃で２日間培養し、その培養上
清をＳＤＳゲル電気泳動分析と抗ＨＳＡ抗体を用いたウ
エスタンブロット分析にかけた。その結果、いずれの株
においても天然型ＨＳＡと同じ分子量である６７ｋＤａ
の大きさのところにメインバンドが観察され、これら形
質転換体であるＨＳＡが発現し、培地中に分泌されてい
ることが示された。一方、グルコースを含む培地で培養
した場合、いずれの形質転換体においてもＨＳＡは全く
検出されず、ＩＦＯ−１０１３株由来ＡＯＸ１プロモー
ター活性はグルコース存在下では抑制されることが判明
した。ピキア酵母ＧＴＳ１１５とＧＴＳ１２０との形質
転換体よりＨＳＡの生産量が最も多いクローンをそれぞ
れ選び、これをピキア酵母ＧＣＰ１０１及びＧＣＰ１０
４と命名した。両株のＨＳＡの生産量はフラスコ培養で
はともに８０ｍｇ／Ｌであり、差は認められなかった。

【００２７】実施例１−２（ピキア酵母を用いたＨＳＡ
の高密度菌体培養） 使用菌株 ピキア酵母ＧＣＰ１０４およびピキア酵母ＧＣＰ１０１
を使用した。両者ともＨＳＡ遺伝子のプロモーターとし
てピキア酵母ＩＦＯ−１０１３由来のＡＯＸ１プロモー
ターを使用した。

【００２８】培地組成 ＦＭ−２１（Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ，Ｋ．，ｅｔ ａ
ｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８，４１１７（１
９８９））培地を使用した。本培地の組成を表２及び表
３に示した。

【００２９】

【表２】

【００３０】

【表３】

【００３１】培養方法 凍結菌株を２％グルコースを炭素源とするＹＮＢ培地
（Ｄｉｆｃｏ社製）１００ｍＬに植菌後、３０℃にて２
４時間培養したものをＦＭ−２１培地１Ｌ（リットル）
を含む３Ｌ容のジャーファーメンター（バイオマスター
Ｄ型、エイブル社製）に植菌し、通気攪拌培養を行っ
た。培養温度は３０℃、通気量を２Ｌ／分に設定し、攪
拌速度の上限は１５００ｒｐｍとした。培養中のｐＨは
５．８５を保持するようアンモニア水にて定値制御し
た。消泡は消泡剤（Ａｄｅｃａｎｏｌ、旭電化工業社
製）を回分培養開始時に０．３０ｍＬ／Ｌ−ｂｒｏｔｈ
添加し、その後は必要に応じて少量添加することで実施
した。ＨＳＡの産生を誘導するため、ＦＭ−２１培地中
のグリセロールが消費された時点よりメタノールを主成
分とするフィード培地の添加を開始した。フィード培地
の添加量は培地中のメタノール濃度が１％を超えない範
囲に調節した。

【００３２】菌体濃度の測定 任意の培養時間で培養液をサンプリングし、蒸留水で適
当に希釈したのち、分光光度計（ＵＶ２４０、島津社
製）を用いて５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。吸
光度から乾燥菌体重量への変換は予め求めておいた較正
曲線により実施した。

【００３３】分泌されたＨＳＡの定量 任意の培養時間で培養液をサンプリングし、１５０００
ｒｐｍ、５分間遠心後、得られた上清を用いてマンシー
ニ法（ＬＣパルチゲン・アルブミン、ベーリングベルケ
社製）により測定した。 培地中のメタノール濃度の定量 任意の培養時間で培養液をサンプリングし、１５０００
ｒｐｍ、５分間遠心後、得られた上清をウルトラフリー
Ｃ３ＨＶにより清澄濾過後ＨＰＬＣによる定量分析を実
施した。

【００３４】 カラム：ＷＡＴＥＲＳ Ｓｕｇａｒ ｐａｋ−Ｃａ カラム温度：８０℃ 移動相：０．０２％ ＮａＮ₃ 検出：示差屈折計 結果 ＦＭ−２１培地を使用したピキア酵母ＧＣＰ１０４の培
養結果を図２に示した。○は、該培地におけるメタノー
ル濃度（ｖ／ｖ）を示し、□は、該培地中に分泌された
ＨＳＡ濃度であって、マンシーニ法により求めた値であ
る。●（ＤＣＷ）は、培地１Ｌ当たりの乾燥細胞重量を
示す。

【００３５】この時、ＨＳＡ産生量は約１．４ｇ／Ｌで
あった。同じ条件にてピキア酵母ＧＣＰ１０１を培養し
た結果を図３に示した。本菌株は、メタノール消費速度
が高いため、培地中へのメタノールの蓄積はほとんど認
められなかった。また、菌体増殖も極めて良好であり、
ＤＣＷが１１０ｇ／Ｌ以上の高密度培養が可能であっ
た。しかし、ＨＳＡ産生量は約１．２ｇ／Ｌにとどまっ
た。ＧＣＰ１０１の場合、ＧＣＰ１０４に比べて菌体濃
度は１．５倍に上昇しているにもかかわらず、ＨＳＡ産
生量は低迷した。

【００３６】そこで、ＧＣＰ１０１を使用し、グリセロ
ールが消費された以降の酸素供給速度を低下させること
で、培地中のメタノール濃度を１％程度に保持しながら
培養した。結果を図４に示した。ＧＣＰ１０１を使用し
ているにもかかわらず、菌体量は、ＤＣＷで７５ｇ／Ｌ
程度までしか増加しなかったが、ＨＳＡ産生量は１．４
ｇ／Ｌに上昇することが観察された。

【００３７】実施例１−３ 粗精製法のスケールアップ
検討 粗精製法に用いる培養液の規模は１００Ｌに相当する量
とした。検討を重ねた結果、以下に示した粗精製工程が
最適であると考えられた。 圧搾工程 圧搾工程に関しては培養液の圧入、圧搾時の圧力に注意
を払って培養上清をできるだけ多く回収し、なおかつ透
明性の良い濾過液を効率良く得られる条件を検討した。

【００３８】膜処理工程−１ ０．２２μｍのフィルターを用いた検討を行った。さら
にこの工程において同時に分画分子量が３０万の限外濾
過膜を用いた検討を行った。濾過方法はタンジェンシャ
ルフロー法を用い、処理容量の増加に応じて膜面積は平
膜を積み重ねることで１．８４ｍ² とした。濃縮は分画
分子量が１万の限外濾過膜を用いて膜面積２．３ｍ² の
タンジェンシャルフロー法で行った。

【００３９】加熱処理工程 培養上清中に６０℃、３時間の加熱処理を行った。加熱
処理時のボリュームは培養上清の約１０〜１５倍濃縮し
た値に相当する約５Ｌとした。 膜処理工程−２ 膜処理の条件は膜処理工程−１と同じとした。即ち、分
画分子量３０万の限外濾過膜を用いて高分子物質を除去
し、ダイヤフィルトレーションを行ってＨＳＡを回収し
た後、通過したＨＳＡを分画分子量１万の限外濾過膜を
用いて濃縮を行った。用いた限外濾過膜の膜面積も膜処
理工程−１と同じとした。

【００４０】陽イオン交換クロマトグラフィー ＨＳＡをゲルに吸着させ、洗浄して不純物を除去した
後、ＨＳＡを溶出する手法を用いた。そのため、ＨＳＡ
の等電点以下のかなり低いｐＨ領域（ｐＨ４〜４．６）
で処理する必要があり、Ｓタイプ（強酸系でイオン交換
基がスルフォ基であるもの）の交換体を用いて陽イオン
クロマトグラフィーの検討を行った。交換体のベッドボ
リュームは５Ｌとした。

【００４１】結果 圧搾工程 圧入は経時的に圧力を上昇させて最終的に２．０Ｋｇ／
ｍ² まで圧力を上昇させた。圧入後の圧搾は経時的に圧
力を上昇させて、最終的に５．０Ｋｇ／ｍ² の圧力で行
うことで良好な結果がえられた。圧搾された酵母のフィ
ルターケーキは含水率も低く、濾布からの剥がれも良好
であった。この条件下での圧搾により培養液の約６０〜
６５％が濾過液として回収できた。圧入に要する時間は
約１時間であり、圧搾に関しても約１〜２時間程度が良
かった。

【００４２】膜処理工程−１ ＨＰＬＣ分析の結果から、分画分子量が３０万の限外濾
過膜で高分子物質が大部分除去されており、また、分画
分子量が１万の限外濾過膜を用いて濃縮する過程で、大
部分の低分子物質も除去されていることが判った。 加熱処理工程 安定化剤（ＨＳＡの８倍量の長鎖脂肪酸、例えば、オレ
イン酸あるいはパルミチン酸等）を添加すること、およ
び設定温度（６０℃）への到達に要する時間をできるだ
け短時間とすることで（３０分以内）、ＨＳＡの回収率
に関しては良好な結果が得られた。また、プロテアーゼ
も完全に不活性化されることが確認され、ＨＰＬＣ分析
の結果を見ても以降の工程においてＨＳＡの分解物が増
加する傾向は認められず、ＨＳＡは加熱処理に対して安
定であった。

【００４３】膜処理工程−２ 再度分画分子量が３０万の限外濾過膜を用いた高分子物
質の除去を行った。この工程で高分子物質は大部分が除
去された。ダイヤフィルトレーションを行った後の溶液
の濃縮は、分画分子量が１万の限外濾過膜を用いて行っ
たが、最終的なＨＳＡ回収率もほぼ１００％と良好であ
った。

【００４４】陽イオン交換クロマトグラフィー 培養終了後の培養上清の分析結果から、培養上清中には
酵母が産生、分泌したと思われる糖質が含まれているこ
とが、判明した。酵母が産生する糖質の量は、産生され
るＨＳＡの量と同等かそれ以上であることも判明した。
この糖質の分析を行ったところ、大部分は多糖の形で存
在しており、さらに、多糖の大部分はマンナンまたはホ
スホマンナンであろうと推定される中性糖及び酸性糖で
あった。これらの多糖を分離する目的でＨＳＡの等電点
以下（ｐＨ４．０〜４．６）でクロマト処理を行った。
即ち、陽イオン交換体にＨＳＡを吸着させて、酸性糖お
よび中性糖は陽イオン交換体に吸着しないことを利用し
て多糖の洗浄除去を行った。

【００４５】以上の各工程の収率等の精製結果の一例を
表４に示した。

【００４６】

【表４】

【００４７】実施例１−４ 高度精製法の検討 １−３で検討した粗精製が終了した段階では、ＨＰＬＣ
分析からＨＳＡ以外の酵母由来不純物はかなり除去され
ていることが判るが、ＨＳＡのダイマーおよび分解物が
認められる。これらの中で、特にＨＳＡの分解物を除去
する目的で疎水結合クロマトグラフィー（フェニルセル
ロファインゲル使用）を検討した。

【００４８】ＨＳＡモノマーおよび分解物を一度ゲルに
吸着させて、溶出条件の差で分解物を除去する吸着法
と、ＨＳＡの分解物のみをゲルに吸着させてＨＳＡのモ
ノマーと分離させる方法（素通し法）を検討した。疎水
クロマトグラフィーの結果を表５に示した。条件は以下
によった。 素通し法(Pass-Throught Method) ゲルに通過させる試料をNaClで26mS(pH は6.7)に調整
し、ゲルを緩衝液(0.15MNaCl,0.05M 燐酸塩 pH6.3) で
平衡化した。ゲルに通過させた試料を保管した。

【００４９】吸着法 硫酸アンモニウムを添加し最終濃度を1.8M(pH を6.7 に
調整) とした。ゲルを緩衝液(1.8M 硫酸アンモニウム,
0.15M NaCl,0.05M 燐酸塩 pH6.3)で平衡化した。試料を
ゲルにかけて吸着させた。洗浄後、溶出液(0.15M NaCl,
0.05M 燐酸塩 pH6.3) でＨＳＡモノマーを溶出した。

【００５０】

【表５】

【００５１】実施例１−５ 不純物の高感度測定系の検
討 上記の方法で精製した高度精製ＨＳＡ溶液（素通し法に
よる疎水クロマトグラフィー終了後のもの）中に存在す
る酵母由来成分を検出するために、ＥＩＡ法による高感
度測定法を検討した。ＨＳＡ非産生酵母上清濃縮液をフ
ロイントのコンプリートアジュバンドと共にウサギに免
疫し、得られた抗血清を用いたＥＩＡ法を行った。測定
は競合反応によるインヒビション法で行った。

【００５２】結果 酵母成分の検出用に用いた標準品の組成は、蛋白質含量
として１７６μｇ／ｍＬ（ローリー法）、多糖含量とし
ては６８ｍｇ／ｍＬ（フェノール−硫酸法）であった。
これらの数値を基に酵母由来成分のＥＩＡ法による測定
用の標準線を作成した（図５）。その結果、不純物の検
出限界として蛋白質濃度で２１５ｐｇ／ｍＬ、糖濃度で
８３ｎｇ／ｍＬの高感度な測定系が開発できた。この測
定系を用いて、精製ＨＳＡ溶液（疎水クロマトグラフィ
ー処理液）中の酵母由来成分の含量を測定したところ、
２５％濃度まで濃縮した精製ＨＳＡ中に検出される酵母
由来成分の含量は、蛋白質濃度換算で４９．５ｎｇ／ｍ
Ｌ（純度９９．９９９９８％）、糖濃度換算で１９．１
μｇ／ｍＬ（純度９９．９９２％）であった（表６）。
コントロールとして、２５％血漿由来アルブミン溶液に
ついて測定したころ、酵母由来成分は検出されなかっ
た。

【００５３】

【表６】

【００５４】

【発明の効果】本発明は、ＡＯＸ１プロモーターの下流
にヒト血清アルブミン遺伝子を担持してなるプラスミド
を例えばピキア酵母に導入して、形質転換させると共に
これを培地におけるメタノール濃度を制御して培養する
ことにより、非常に高効率にヒト血清アルブミンを培地
中に分泌させることができ、この培養液を限外濾過膜、
加熱処理、陽イオン交換クロマトグラフィー及び疎水ク
ロマトグラフィー等を組み合わせることにより高度に精
製されたＨＳＡを提供することができる。

【００５５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２４３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 プラスミドＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：promoter 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 CCAGATTCTG GTGGGAATAC TGCTGATAGC CTAACGTTCA TGATCATAAT CTAACTGTTC 60 TAACCCCTAC TTGGACTGGC AATATATAAA CAGGAGGAAA CTGCCCAGTC GAAAACCTTC 120 TTCCTTATCA TCATTATTAG CTTACTTTCA TAATTGTGAC TGGTTCCAAT TGACAAGCTT 180 TTGATTCTAA CGACTTTTAA CGACAATTTG AGAAGATCAA AAAACAACTA ATTATTCGAA 240 ACG 243 配列番号：２ 配列の長さ：５０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 プローブＤＮＡ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATGCTTCCAA GATTCTGGTG GGAATACTGC TGATAGCCTA ACGTTCATGA 50 配列番号：３ 配列の長さ：４６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 プローブＤＮＡ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TCAAGAGGAT GTCAGAATGC CATTTGCCTG AGAGATGCAG GCTTCA 46 配列番号：４ 配列の長さ：２２６０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATG GCT ATC CCT GAA GAG TTT GAT ATC CTT GTT TTA GGT GGT GGA 45 TCC AGT GGA TCC TGT ATT GCC GGA AGA TTG GCC AAC TTG GAC CAC 90 TCC TTG AAA GTT GGT CTT ATC GAG GCA GGT GAG AAC AAC CTC AAC 135 AAC CCA TGG GTT TAC CTT CCA GGT ATT TAC CCA AGA AAC ATG AAG 180 TTG GAC TCC AAG ACT GCA TCC TTC TAC ACT TCT AAC CCT TCT CCT 225 CAC TTG AAC GGT AGA AGA GCT ATT GTT CCA TGT GCT AAC GTC TTG 270 GGT GGT GGT TCT TCC ATT AAC TTC ATG ATG TAG ACC AGA GGT TCT 315 GCT TCT GAT TAT GAC GAC TTC CAA GCC GAG GGC TGG AAA ACC AAG 360 GAC TTG CTT CCA TTG ATG AAA AAG ACC GAG ACC TAC CAA AGA GCT 405 TGC AAC AAC CCT GAC ATT CAC GGG TTC GAA GGT CCA ATC AAG GTT 450 TCT TTG GGT AAC TAC ACC TAC CCA GTT TGC CAG GAC TTC TTG AGA 495 GCT TCT GAA TCC CAA GGT ATT CCA TAC GTT GAC GAC TTG GAA GAC 540 TTG GTT ACT GCT CAC GGT GCT GAA CAC TGG CTG AAA TGG ATC AAC 585 AGA GAC ACT GGT CGT CGT TCC GAC TCC GCT CAT GCA TTT GTC CAC 630 TCT ACT ATG AGA AAC CAC GAC AAC TTG TAC TTG ATT TGT AAC ACA 675 AAG GTT GAC AAG ATA ATT GTC GAA GAC GGA AGA GCT GCT GCT GTT 720 AGA ACT GTT CCA AGC AAG CCT TTG AAC CCA AAG AAG CCA AGT CAC 765 AAG ATC TAC CGT GCT AGA AAG CAA ATC GTT TTG TCT TGT GGT ACC 810 ATC TCA TCT CCT TTG GTT CTG CAA AGA TCC GGT TTC GGT GAC CCA 855 ATC AAG TTG AGA GCC GCT GGT GTT AAG CCT TTG GTC AAC TTG CCT 900 GGT GTC GGA AGA AAC TTC CAA GAC CAC TAC TGT TTC TTC AGT CCT 945 TAC AGA ATC AAG CCT CAG TAC GAA TCT TTC GAT GAC TTC GTG CGT 990 GGT GAT GCT GAG ATC CAA AAG AGA CTT TTC GAC CAA TGG TAC GCC 1035 AAT GGT ACT GGT CCT CTT GCC ACT AAC GGT ATC GAA GCC GGT GTC 1080 AAG ATT AGA CCA ACA CCA GAG GAA CTG TCT CAA ATG GAC GAA TCT 1125 TTC CAA GAG GGT TAC AGA GAA TAC TTT GAG GAC AAG CCA GAC AAG 1170 CCA GTT ATG CAC TAC TCC ATT ATT GCT GGT TTC TTC GGT GAC CAC 1215 ACC AAG ATT CCT CCT GGA AAG TAC ATG ACC ATG TTC CAC TTT TTG 1260 GAA TAC CCA TTC TCC AGA GGT TCC ATT CAC ATT ACC TCT CCA GAT 1305 CCA TAC GCA GCT CCA GAC TTC GAC CCA GGT TTC ATG AAC GAT GAA 1350 AGA GAC ATG GCT CCT CTG GTC TGG GCC TAC AAG AAG TCT AGA GAG 1395 ACA GCT AGA AGA ATG GAC CAC TTT GCC GGT GAG GTT ACT TCT CAC 1440 CAC CCA TTG TTC CCA TAC TCA TCC GAG GCC AGA GCT TTG GAG ATG 1485 GAT TTG GAG ACC TCC AAT GCC TAC GGT GGA CCT TTG AAC TTG TCT 1530 GCT GGT CTT GCC CAC GGT TCT TGG ACT CAA CCT TTG AAG AAG CCA 1575 ACT GCA AAG AAC GAA GGC CAT GTT ACC TCC AAC CAA GTC GAG CTT 1620 CAT CCA GAC ATC GAG TAC GAC GAG GAG GAC GAC AAG GCC ATT GAA 1665 AAC TAC ATC CGT GAG CAC ACT GAG ACC ACA TGG CAC TGT CTG GGA 1710 ACC TGT TCC ATG GGT CCA AGA GAG GGT TCC AAC ATC GTC AAA TGG 1755 GGT GGT GTT TTG GAC CAC AGA TCC AAC GTT TAC GGA GTC AAG GGC 1800 CTG AAG GTT GGT GAC TTG TCT GTC TGT CCA GAC AAT GTT GGT TGT 1845 AAC ACC TAC ACC ACC GCT CTT TTG ATC GGT AGG AAG ACT GCC ACT 1890 TTG GTT GGA GAA GAC TTA GGA TAC ACC GGT GAA GCC TTA GAC ATG 1935 ACT GTT CCT CAG TTC AAG TTG GGC ACT TAC GAG AAG ACC GGT CTT 1980 GCT AGA TTC TAACCAATGA GGATGTCAAT GACATTTGTC TGAGAGATAGC 2029 AGGCTTCATA TTTTTGATAA TTTTTTATTT GTAACCTATA TAGTATAGGA GATTTTTTTT 2089 GTCATTTTGT TTCTTCTGCT ACGAGCTTGC TTCTGATCAA CCTATCTCTA AGCTGATGCA 2149 TATCTTGTGG TAGGGGTTTG GGAAAATCGT TTGAGTTGGA TGTTTTACTT GGTACATGCC 2209 ACCTTCTTCG AAGTACAGAA GATTAAGTGA GACACTCATT TGTGCAAGCT T 2260

【図面の簡単な説明】

【図１】ＡＯＸ遺伝子をλｇｔ１０に組み込んだ制限酵
素地図を示す。

【図２】ＦＭ−２１培地を使用したピキア酵母ＧＣＰ１
０４の培養結果を示す。

【図３】ＦＭ−２１培地を使用したピキア酵母ＧＣＰ１
０１の培養結果を示す。

【図４】ＦＭ−２１培地を使用したピキア酵母ＧＣＰ１
０１の他の培養結果を示す。

【図５】酵母由来成分のＥＩＡ法による測定用の標準線
を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:84） (72)発明者 川辺 晴英 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（１）配列番号１のＤＮＡ配列を有するＡ
   ＯＸ１プロモーターおよびヒト血清アルブミン遺伝子を
   担持してなるプラスミドを構築し、（２）そのプラスミ
   ドを宿主に導入して、形質転換させ、（３）得られた形
   質転換体を培養して、ヒト血清アルブミンを産生させる
   こと、からなるヒト血清アルブミンの製造方法。