CN111285929A

CN111285929A - 一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人表皮细胞生长因子的方法

Info

Publication number: CN111285929A
Application number: CN201811505141.3A
Authority: CN
Inventors: 杨代常; 占全
Original assignee: Wuhan Healthgen Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Wuhan Healthgen Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-12-10
Filing date: 2018-12-10
Publication date: 2020-06-16
Anticipated expiration: 2038-12-10
Also published as: CN111285929B

Abstract

本发明公开了一种基因工程水稻种子中分离纯化重组人表皮细胞生长因子的层析方法。具体步骤以重组人表皮细胞生长因子基因工程水稻种子为原料，将稻米粉碎后提取，得到含重组人表皮细胞生长因子的粗提液；将获得的含重组人表皮细胞生长因子的粗提液经阳离子交换层析，获得含重组人表皮细胞生长因子的初级产物I；将初级产物I经过阴离子交换层析，获得含重组人表皮细胞生长因子的中级产物II；将中级产物II经过疏水层析或分子筛层析，获得纯化的重组人表皮细胞生长因子的目标物。本发明的提取纯化方法工艺简单，经济且高效，适宜工业生产应用。

Description

一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人表皮细胞生长因子的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分离纯化重组人表皮细胞生长因子的方法。

背景技术

人表皮生长因子(EGF)是由53个氨基酸组成的小肽。hEGF广泛分布于人体内，能刺激细胞增殖、分化和迁移，在伤口愈合和器官发生中扮演着重要角色。研究表明，hEGF在促进外科手术后伤口的愈合、反复鼻中隔糜烂黏膜的愈合、烧伤创面的愈合、进眼角膜创伤的愈合中发挥着重要的作用；在胃肠道溃烂、糖尿病引起的体表溃疡治疗中也具有重要作用。

最初的hEGF是利用亲和离子交换层析从人的尿液中提取出来的(Cohen，1975)，1000L原料能得到不足2mg的EGF，且包含氨基酸组成不完整的EGF。此外，害虫唾液、母乳、泪液和血浆中提取过，产量都很低，因此，目前已不再使用这种方法。hEGF同样利用化学合成法生产过，但由于其自身复杂的结构，化学合成法生产的hEGF活性和产量无法满足大规模应用的需求。随着基因工程技术的发展，人们更多希望借助基因工程手段获得高生物活性的EGF供临床和化妆品使用。

迄今为止，人们已经试图利用各种不同表达系统来大批量生产hEGF,例如利用原核生物如大肠杆菌(美国孟山都公司和康奈尔大学，中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所甘人宝等)、短芽孢杆菌(Yamagata等)，真核生物如酿酒酵母(Urdea等)、植物叶片(Higo等)、马铃薯块茎(Salmanian等)、烟草(Bai等)、家蚕杆状病毒(浙江大学赵玲秀等)等生产hEGF。但这些方法因表达水平较低或生产成本较高，不能用于工业化生产。而重组人表皮生长因子的分离和纯化工艺，对该产品的纯度和生产成本有着重要的影响，在hEGF的新生产工艺开发中具有举足轻重的作用。

发明内容

本发明在基因工程水稻生产hEGF技术的基础上，提供一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人表皮细胞生长因子的层析方法，依次包括以下步骤：

1)从含有重组人表皮细胞生长因子的基因工程水稻种子中提取含有重组人表皮细胞生长因子的粗提取物；

2)将含有重组人表皮细胞生长因子的粗提取物经阳离子交换层析，得到初级产物I；

3)将初级产物I经阴离子交换层析，得到含有重组人表皮细胞生长因子的中级产物II；

4)将中级产物II经疏水层析或浓缩后经分子筛层析，得到纯化的重组表皮细胞生长因子目标物；

其中阳离子交换层析的填料选自SP Bestarose FF、SP Bestarose HP、BestaroseDiomond MMC、Uniphere S、MacroPrep S、POROS XS、SP-6FF、SP-6HP、SP SepharoseTM FastFlow；阴离子交换层析的填料选自Q Bestarose FF、Q Sepharose FF、UNO Sphere Q、DEAEsepharose FF；疏水层析的填料选自Phenyl Bestarose HP、Phenyl sepharose HP、Phenylsepharose FF、macro-prep-butyl和macro-prep methyl；分子筛层析填料选自Chromdex75pg、Chromdex 200pg、Superdex 75pg、Superdex 200pg。

中级产物II在进行分子筛层析前的浓缩方法采用Phenyl疏水层析或者阴离子交换层析。

本发明的技术方案之一为采用：阳离子交换层析，阴离子交换层析，疏水层析三步层析串联。

本发明的另一技术方案为采用四步层析工艺：阳离子交换层析，阴离子交换层析，阴离子交换浓缩，分子筛层析串联(SP-Q-Q(浓缩)-Chromdex 75pg)；优选的可用PhenylBestarose HP疏水层析代替阴离子交换层析进行第三步的样品浓缩。

本发明还提供一种用于制备所述的基因工程水稻种子的植物表达载体，所述表达载体是将表达人表皮细胞生长因子的基因与水稻特异性启动子Gt13a及其信号肽导入质粒载体构建。优选的，所述表达人表皮细胞生长因子的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述质粒载体为pOsPMP620。

本发明提供了从基因工程水稻种子中分离提取重组人表皮细胞生长因子的方法。操作方法简单高效，适宜于工业放大生产。

附图说明

图1为质粒pOsPMP620结构示意图。

图2为质粒pOsPMP621结构示意图。

图3为质粒pOsPMP622结构示意图。

图4为基因工程品系EGF-1229后代中目的基因hEGF的阳性检测，其中M为DNA标准分子量Marker；-为水对照；1到10为EGF-1229后代随机挑取的10个单株；NC，阴性对照受体品种LGC-1；P为阳性对照质粒pOsPMP622。

图5为基因工程品系EGF-1229后代中标记基因hEGF的阳性检测，其中M为DNA标准分子量Marker；-为水对照；1到10为EGF-1229后代随机挑取的10个单株；NC，阴性对照受体品种LGC-1；P为阳性对照质粒pOsPMP622。

图6为SP Bestarose FF-Q Bestarose FF两步串联各步骤洗脱样品SDS-PAGE及Western blot检测，其中P为阳性参照，SP-Elu为SP Bestarose FF的洗脱液，Q–Elu为QBestarose FF洗脱液，M为标准分子量Marker；

图7为SP Bestarose FF-Q Bestarose FF-Phenyl Bestarose HP三步串联各步骤洗脱样品SDS-PAGE及Western blot检测，其中P为阳性参照，Phenyl HP-Elu-1为PhenylBestarose HP的洗脱液，M为标准分子量Marker；

图8为SP Bestarose FF-Q Bestarose FF-Chromdex 75pg三步串联各步骤洗脱样品SDS-PAGE检测，其中P为阳性参照，1为第一次串联层析的Chromdex 75pg洗脱液，2为第二次串联层析的Chromdex 75pg洗脱液，3为第三次串联层析的Chromdex 75pg洗脱液，M为标准分子量Marker；

图9为SP Bestarose FF-Q Bestarose FF-Chromdex 75pg三步串联各步骤洗脱样品WB检测，其中P为阳性参照，1为第一次串联层析的Chromdex 75pg洗脱液，2为第二次串联层析的Chromdex 75pg洗脱液，3为第三次串联层析的Chromdex 75pg洗脱液，M为标准分子量Marker；

图10为SP Bestarose FF-Q Bestarose FF-Phenyl Bestarose HP(浓缩)-Chromdex 75pg四步层析洗脱样品SDS-PAGE检测，其中P为阳性参照，S-Elu为Chromdex75pg洗脱液，M为标准分子量Marker。

具体实施方式

下文将通过实施例和附图以详细说明本发明的技术方案，从而更好地阐述本发明的特点和优势。所提供的实施例应被解释为对本发明方法的举例说明，而不以任何方式限制本发明揭示的技术方案。

以下实施例中使用的试剂和仪器，除特别说明以外，均为普通市售。其中本发明所用的稻米原料来源于表达重组人表皮细胞生长因子的基因工程水稻种子，利用水稻胚乳特异性表达的启动子和信号肽，介导EGF进入水稻胚乳细胞的内膜系统，并储存到水稻胚乳的蛋白体中，从而使EGF能在水稻种子内大量积累，最终达到较高的表达水平。

实施例1：重组人表皮细胞生长因子基因工程稻谷的制备

本实施例选用水稻特异性启动子Gt13a及其信号肽来介导重组人表皮细胞生长因子基因在水稻胚乳细胞中的表达，具体参考公开号为CN100540667中的方法来构建本发明的水稻特异性表达重组人表皮细胞生长因子载体以及筛选基因工程水稻植株，将其中所述的重组人血清白蛋白换成本发明的重组人表皮细胞生长因子。用如图1所示的质粒pOsPMP620来构建水稻胚乳特异性表达盒。将所述合成的经密码子优化的人EGF基因(SEQID NO.1)用MylI和XhoI酶切后克隆到pOsPMP02中构建成质粒pOsPMP621，如图2所示；然后用HindIII和EcoRI酶切pOsPMP621，将长度为1665bp的含Gt13a启动子及其信号肽序列还有经密码子优化的EGF基因以及Nos终止子的整个表达盒插入到双元表达载体1300，构建农杆介导菌质粒，命名为pOsPMP622，具体如图3所示。将所述pOsPMP622质粒转化根癌农杆菌EHA105(美国Invitrogen公司)，通过根癌农杆菌介导共转化将pOsPMP622转化到水稻品种TP309的愈伤再生组织中，经培养、筛选和诱导后形成完整的植株；然后，通过PCR扩增来鉴别阳性转化植株，用Gt13a启动子的正向引物Gt13a-F(SEQ ID No.2:5’-CACATCCATCATTATCCATCCACC-3’)和重组人表皮细胞生长因子基因的反向引物EGF-R(SEQID No.3:5’-GAGCTCCCACCACTTGAGG-3’)进行特异PCR扩增，产物大小为418bp。用Hpt特异引物进行PCR检测。引物分别为Hpt-F(SEQ ID No.4:5’-CGATTCCGGAAGTGCTTGAC-3’)和Hpt-R(SEQ ID No.5:5’-CGTCTGCTGCTCCATACAAG-3’)，产物大小为521bp。鉴别结果表明，基因工程水稻品系EGF-1229后代中均含目的基因hEGF。鉴定结果如图4和图5所示。

SEQ ID NO.1:

本实施例利用ELISA定量检测方法对多次选育后的EGF-1229杂交F3代单株进行表达量检测，筛选结果如下表1所示。对每单株随机10粒进行检测，EGF的表达量为27.1-127.8ug hEGF/g种子。

实施例2：重组人表皮细胞生长因子(hEGF)粗提取物的制备

将重组人表皮细胞生长因子基因工程稻谷脱壳成半精米，研磨成80-100目的米粉。将米粉与提取缓冲液以1：5(重量/体积，kg/L)的比例混合，于常温提取1小时。提取缓冲液的成分为：20mM无水醋酸钠(NaAC)，pH 4.0。

将上述得到的混合物经滤布式板框压滤机压滤，得到澄清的hEGF粗提液。

实施例3：从含有hEGF的粗提液中纯化hEGF

层析工艺为阳离子交换层析，阴离子交换层析，疏水层析三步层析串联，具体实施步骤如下：

提取：按照优化的提取条件，称取50g EGF米粉，按照W/V＝1：5的比例加入提取液室温提取1h；离心后上清用0.45μm滤膜过滤，过滤完成后用100KD超滤膜处理，收集滤出液。取超滤后的滤出液，加入乙酸调pH至4.0。

阳离子交换层析作为初级纯化：SP Bestarose FF层析柱以20mM NaAc，pH 4.0为平衡液，以20mM NaAc，1M NaCl，pH 4.0为洗脱液，设置洗脱梯度为9.5％B，25.5％B进行洗脱，收集25.5％B洗脱组分。

阴离子交换层析作为中级纯化：取SP Bestarose FF层析-25.5％B洗脱组分，加入超纯水调电导至3.95mS/cm，1M Tris调pH至7.98。Q Bestarose FF层析以20mM Tris-HCl，pH 8.0为平衡液，以20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH 8.0为洗脱液，设置洗脱梯度为7％B、11％B、21％B进行洗脱，收集21％B洗脱组分，电泳和免疫印迹图谱见图6。

疏水层析作为末级纯化：取Q Bestarose FF层析-21％B洗脱组分，向其中加入等体积的含有40mM PB,3M(NH₄)₂SO₄，pH为7.5的缓冲溶液稀释；Phenyl Bestarose HP疏水层析步骤以含有20mM PB,1.5M(NH₄)₂SO4，pH为7.5的缓冲液为平衡液，以20mM PB,pH 7.5的缓冲液为洗脱液，设置洗脱梯度为100％B，33.3min,10CV进行洗脱，分峰收集，电泳和免疫印迹杂交图谱见图7。

实施例4：从含有hEGF的粗提液中纯化hEGF

三步层析工艺在水稻种子表达量发生变化后不再适用或需要进一步优化，于是考虑四步层析工艺：阳离子交换层析，阴离子交换层析，阴离子交换浓缩，分子筛层析串联(SP-Q-Q(浓缩)-Chromdex 75pg)，其中用阴离子柱层析浓缩的方式替代超滤膜包或离心等浓缩方法。四步层析的纯化结果相对实施例2的三步层析工艺可以得到稳定的重复。具体实施步骤如下：

提取：称取1kg EGF米粉，按照W/V＝1：5的比例加入5L提取液I室温提取1h；加入2％助滤剂压滤得到4L压滤液，压滤液用0.22μm滤膜过滤，过滤完成后用100KD超滤膜处理，收集滤出液。

阳离子交换层析作为初级纯化：SP Bestarose FF层析柱以20mM NaAc，pH 4.0为平衡液，以组分为20mM NaAc，95mM NaCl，pH为4.0的缓冲溶液为洗脱液进行洗脱。

阴离子交换层析作为中级纯化：取SP层析洗脱组分，加入超纯水调电导至2.88mS/cm，1M Tris调pH至7.98。以组分为20mM Tris-HCl，145mM NaCl，pH为8.0的缓冲液，为洗杂液洗脱杂蛋白；采用组分为20mM Tris-HCl，210mM NaCl，pH为8.0的缓冲液为洗脱液进行洗脱。洗脱组分再次用1M Tris调pH至7.99，向其中加入超纯水稀释至电导为2.30mS/cm后上QFF柱，然后用20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH 8.0的缓冲溶液洗脱进行浓缩。

分子筛层析作为精纯步骤：取Q FF层析洗脱液上Chromdex 75pg 120ml层析柱，以1.5ml/min流速进行上样和洗脱，收集组分标记为S-Elu，以10-50mM PB，150mM NaCl，pH7.2缓冲液为层析过程中的平衡液和再平衡液。电泳和免疫印迹杂交图谱见图8和图9。

实施例5：Phenyl Bestarose HP替换Q Bestarose FF浓缩效果研究

SP-Q-Phenyl-Chromdex 75pg四步层析工艺总蛋白收率为28.9％，高于SP-Q-Q(浓缩)-Chromdex 75pg，对比结果见下表。由于Q FF层析洗脱样品盐浓度较高，若直接衔接QFF层析进行浓缩，需要加入大量缓冲液稀释后低盐上样，而Phenyl层析只需要加入少量高浓度硫酸铵母液进行调配后高盐直接上样，考虑放大生产各层析步骤更好的衔接，可用Phenyl HP替代Q FF进行中间过程浓缩。

保持其它层析步骤不变，将Q层析洗脱样品加入40mM PB，3M(NH₄)₂SO₄，pH 7.5的缓冲溶液稀释，调节样品硫酸铵浓度为1.5M。Phenyl Bestarose HP层析柱用20mM PB，1.5M(NH₄)₂SO₄，pH 7.5缓冲液平衡5个柱体积，以2ml/min流速上样，上样结束后，以20mM PB，1.5M(NH₄)₂SO₄，pH 7.5再平衡5个柱体积，最后以20mM PB，pH 7.5进行梯度洗脱，洗脱收集液即为浓缩样品。浓缩样品上Chromdex 75pg柱，收集样品标记为S-Elu，电泳图谱见图10。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉禾元生物科技股份有限公司

<120> 一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人表皮细胞生长因子的方法

<130> WH1190- 18P122206

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 162

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 密码子优化的人EGF基因

<400> 1

aacagcgaca gcgagtgccc gctcagccac gacggctact gcctccacga cggcgtgtgc 60

atgtacatcg aggccctcga caagtacgcc tgcaactgcg tggtgggcta catcggcgag 120

cgctgccagt accgcgacct caagtggtgg gagctccgct ga 162

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物

<400> 2

cacatccatc attatccatc cacc 24

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物

<400> 3

gagctcccac cacttgagg 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物

<400> 4

cgattccgga agtgcttgac 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物

<400> 5

cgtctgctgc tccatacaag 20

Claims

1.一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人表皮细胞生长因子的层析方法，依次包括以下步骤：

1)从重组人表皮细胞生长因子的基因工程水稻种子中提取含有重组人表皮细胞生长因子的粗提取液；

2)将含有重组人表皮细胞生长因子的粗提取液经阳离子交换层析，得到初级产物I；

3)将初级产物I经阴离子交换层析，收集含有重组人表皮细胞生长因子的中级产物II；

其中阳离子交换层析的填料选自SP Bestarose FF、SP Bestarose HP、BestaroseDiomond MMC、Uniphere S、MacroPrep S、POROS XS、SP-6FF、SP-6HP和SP Sepharose^TM FastFlow；

阴离子交换层析的填料选自Q Bestarose FF、Q Sepharose FF、UNO Sphere Q和DEAEsepharose FF；

疏水层析的填料选自Phenyl Bestarose HP、Phenyl sepharose HP、Phenylsepharose FF、macro-prep-butyl和macro-prep methyl；

分子筛层析填料选自Chromdex 75pg、Chromdex 200pg、Superdex 75pg和Superdex200pg。

2.根据权利要求1所述的方法，其中阳离子交换层析的填料为SP Bestarose FF。

3.根据权利要求1所述的方法，其中阴离子交换层析的填料为Q Sepharose FF。

4.根据权利要求1所述的方法，其中疏水层析的填料为Phenyl Bestarose HP。

5.根据权利要求1所述的方法，其中分子筛层析的填料为Chromdex 75pg。

6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤1)所述重组人表皮细胞生长因子粗提取液是通过下述方法制备，包括步骤：

6a)以含有重组人表皮细胞生长因子的基因工程水稻种子为原料，将稻谷脱壳成半精米并研磨成80-100目的米粉；

6b)将所述米粉与提取缓冲液以重量/体积比为1:5-1:10的比例混合，常温下提取0.5-2小时,获得混合物；所述提取缓冲液含有10-50mM Tris、10-50mM NaAC，10-50mM PB，0-250mM NaCl，pH为4.0-8.0；

6c)将混合物过滤，得到含重组人表皮细胞生长因子的粗提取液。

7.根据权利要求1所述的方法，步骤1)所述阳离子交换层析介质为SP Bestarose FF阳离子交换填料，层析步骤为：

7a)采用5-15倍柱体积的pH为3.9-4.5的10-50mM NaAc，0-95mM NaCl缓冲液，以50-200cm/小时的流速平衡层析柱；

7b)以步骤1)的粗提取液作为上样样品，其中样品电导为2-11ms/cm，pH为3.9-4.5；

7c)用pH为3.9-4.5的10-50mM NaAc，90-255mM NaCl缓冲液，以50-200cm/小时的流速洗脱样品，收集洗脱液即为初级产物I。

8.根据权利要求1所述的方法，步骤3)所述阴离子交换层析介质为Q Bestarose FF阴离子交换填料，层析步骤为：

8a)采用5-15倍柱体积的pH为7.5-8.0的10-50mM Tris，0-110mM NaCl缓冲液，以50-200cm/小时的流速平衡层析柱；

8b)以所述步骤2)的初级产物I作为上样样品，其中样品电导为2.0-11ms/cm，pH为7.5-8.0；

8c)用pH为7.5-8.0的10-50mM Tris，70-145mM NaCl缓冲液，以50-200cm/小时的流速洗脱杂蛋白；

8d)用pH为7.5-8.0的10-50mM Tris，100-210mM NaCl缓冲液，以50-200cm/小时的流速洗脱目标蛋白，收集洗脱液即为中级产物II。

9.根据权利要求1所述的方法，步骤4)所述疏水层析介质为Phenyl Bestarose HP，层析步骤为：

9a)采用5-15倍柱体积的pH为7.0-7.5，含有10-50mM PB，1-1.5M硫酸铵的缓冲液，以50-200cm/小时的流速平衡层析柱；

9b)以步骤3)的中级产物II作为上样样品，调节样品的硫酸铵浓度至1-1.5M，pH为7.0-7.5；

9c)用9a)中的平衡液5-15倍柱体积再平衡；

9d)用pH为7.0-7.5的10-50mM PB缓冲液，设置洗脱梯度为0-100％B，15min，以50-200cm/小时的流速洗脱目标蛋白，得到纯化的重组人表皮细胞生长因子的目标物。

10.根据权利要求1所述的方法，步骤4)所述分子筛层析介质为Chromdex 75pg，层析步骤为：

10a)采用5-15倍柱体积的pH为7.0-7.5的10-50mM PB，150-300mM NaCl缓冲液，以30-60cm/小时的流速平衡层析柱；

10b)以步骤3)的中级产物II经层析浓缩后作为上样样品进行上样，pH为7.0-7.5；

10c)采用pH为7.0-7.5的10-50mM PB，150-300mM NaCl缓冲液，以30-60cm/小时的流速再平衡层析柱，收集洗脱液得到纯化的重组人表皮细胞生长因子的目标物。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于步骤10b)中的浓缩方式选用Phenyl疏水层析或阴离子交换层析。

12.根据权利要求11所述要求，步骤10b)所述浓缩方式为阴离子交换层析，层析介质为Q Bestarose FF，浓缩步骤为：

12a)采用5-15倍柱体积的pH为7.5-8.0的10-50mM Tris缓冲液，以50-200cm/小时的流速平衡层析柱；

12b)将步骤3)所述的中级产物II，调节pH为7.5-8.0,加入超纯水稀释电导为2.0-5.0ms/cm，以50-200cm/小时的流速上样；

12c)用12a)中的平衡液5-15倍柱体积再平衡；

12d)用pH为7.5-8.0的10-50mM Tris，110-210mM NaCl缓冲液，以50-200cm/小时的流速洗脱目标蛋白，收集洗脱液即为浓缩样品。

13.根据权利要求11所述的方法，步骤10b)中所述浓缩方式选用疏水层析，层析介质为Phenyl Bestarose HP，浓缩步骤为：

13a)采用5-15倍柱体积的pH为7.0-7.5，含有10-50mM PB，1-1.5M硫酸铵的缓冲液，以50-200cm/小时的流速平衡层析柱；

13b)以步骤3)的中级产物II作为上样样品，调节样品的硫酸铵浓度至1-1.5M，pH为7.0-7.5；

13c)用13a)的平衡液5-15倍柱体积再平衡；

13d)用pH为7.0-7.5的10-50mM PB缓冲液，设置洗脱梯度为100％B,以50-200cm/小时的流速洗脱目标蛋白，收集洗脱液即为浓缩样品。

14.一种用于制备权利要求1所述的基因工程水稻种子的植物表达载体，其特征在于，所述表达载体是将表达人表皮细胞生长因子的基因与水稻特异性启动子Gt13a及其信号肽导入质粒载体构建。

15.根据权利要求14所述的植物表达载体，其特征在于所述表达人表皮细胞生长因子的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所示质粒载体为pOsPMP620。