JP2824332B2 - 組換えヒトラクトフェリンの製造 - Google Patents
組換えヒトラクトフェリンの製造Info
- Publication number
- JP2824332B2 JP2824332B2 JP5519314A JP51931493A JP2824332B2 JP 2824332 B2 JP2824332 B2 JP 2824332B2 JP 5519314 A JP5519314 A JP 5519314A JP 51931493 A JP51931493 A JP 51931493A JP 2824332 B2 JP2824332 B2 JP 2824332B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- aspergillus
- plasmid
- human lactoferrin
- amylase
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/79—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の技術分野 本発明は一般に鉄結合性糖タンパク質の分野に関す
る。さらに詳しくは、本発明はヒトラクトフェリンの組
換え製造に関する。
る。さらに詳しくは、本発明はヒトラクトフェリンの組
換え製造に関する。
関連技術の記載 ヒトラクトフェリン（LF）は、鉄結合性モノマー糖タ
ンパク質のトランスフェリンファミリーの一員である。
ヒトラクトフェリンは最初に乳中で発見され、初乳では
７グラム／リットルのレベルまで達することがある。LF
は以来、涙、睡液および粘膜分泌液などの他の外液中で
検出されており、外形核白血球の二次顆粒中でも検出さ
れている。
ンパク質のトランスフェリンファミリーの一員である。
ヒトラクトフェリンは最初に乳中で発見され、初乳では
７グラム／リットルのレベルまで達することがある。LF
は以来、涙、睡液および粘膜分泌液などの他の外液中で
検出されており、外形核白血球の二次顆粒中でも検出さ
れている。
LFは、Ｃ末端半分とＮ末端半分とで高い相同性を有す
る２葉性構造を有する78kDaの糖タンパク質であり、該
相同性はアミノ酸および３次元構造の両レベルで明らか
である。これら核葉状構造は一つの鉄（III）イオンと
高い親和性で可逆的に結合することができ、それと同時
に重炭酸塩も結合する。ラクトフェリンに対して提唱さ
れている生物学的機能としては、微生物感染に対する防
御、幼児における腸内での鉄吸収の増進、細胞増殖の促
進、骨髄造血の制御および炎症応答の修飾が挙げられ
る。
る２葉性構造を有する78kDaの糖タンパク質であり、該
相同性はアミノ酸および３次元構造の両レベルで明らか
である。これら核葉状構造は一つの鉄（III）イオンと
高い親和性で可逆的に結合することができ、それと同時
に重炭酸塩も結合する。ラクトフェリンに対して提唱さ
れている生物学的機能としては、微生物感染に対する防
御、幼児における腸内での鉄吸収の増進、細胞増殖の促
進、骨髄造血の制御および炎症応答の修飾が挙げられ
る。
細胞外糖タンパク質の工業的生産において、糸状菌は
宿主として首尾よく使用されている。ある種の工業的株
は、これらタンパク質をグラム量で分泌することができ
る。加えて糸状菌は真核性タンパク質の翻訳後修飾を正
確に行うことができ、多くの株は米国食品医薬品局の認
可を得ている。さらに、大スケールの発酵技術および下
流プロセシング経験（downstream processing experien
ce）を利用することができる。
宿主として首尾よく使用されている。ある種の工業的株
は、これらタンパク質をグラム量で分泌することができ
る。加えて糸状菌は真核性タンパク質の翻訳後修飾を正
確に行うことができ、多くの株は米国食品医薬品局の認
可を得ている。さらに、大スケールの発酵技術および下
流プロセシング経験（downstream processing experien
ce）を利用することができる。
現在のところ、ヒトLFを製造するための効率的かつ経
済的な方法は存在しない。従って、栄養学的および治療
学的適用さらに作用メカニズムのさらなる探求のための
ヒトラクトフェリンの効率的製造方法の開発により、長
い間の懸念であった必要性と当該技術分野における記載
が達成されるであろう。
済的な方法は存在しない。従って、栄養学的および治療
学的適用さらに作用メカニズムのさらなる探求のための
ヒトラクトフェリンの効率的製造方法の開発により、長
い間の懸念であった必要性と当該技術分野における記載
が達成されるであろう。
発明の要約 一つの態様において、本発明は、ヒトラクトフェリン
のcDNAを含む組換えプラスミドを提供する。本発明のプ
ラスミドは、真核細胞中での発現用に適応されており、
該真核細胞中でヒトラクトフェリンcDNAを発現するのに
必要な制御要素を含む。
のcDNAを含む組換えプラスミドを提供する。本発明のプ
ラスミドは、真核細胞中での発現用に適応されており、
該真核細胞中でヒトラクトフェリンcDNAを発現するのに
必要な制御要素を含む。
他の態様において、本発明は、組換えプラスミドを包
含する形質転換した真核細胞を提供する。真核細胞は、
アスペルギルス（Aspergillus）を含む一群の糸状菌か
ら選択される。プラスミドは、ヒトラクトフェリンタン
パク質をコードするポリデオキシリボヌクレオチド断片
を挿入したプラスミドベクターを含む。
含する形質転換した真核細胞を提供する。真核細胞は、
アスペルギルス（Aspergillus）を含む一群の糸状菌か
ら選択される。プラスミドは、ヒトラクトフェリンタン
パク質をコードするポリデオキシリボヌクレオチド断片
を挿入したプラスミドベクターを含む。
本発明のさらに他の態様において、組換えプラスミド
を含む形質転換した真核細胞を培養することを包含す
る、組換えヒトラクトフェリンの製造法が提供される。
プラスミドは、ヒトラクトフェリンタンパク質をコード
するポリデオキシリボヌクレオチドを有するプラスミド
ベクターを含む。ヒトラクトフェリンタンパク質が生成
されるまで適当な栄養培地中で培養した後、ヒトラクト
フェリンタンパク質を単離する。
を含む形質転換した真核細胞を培養することを包含す
る、組換えヒトラクトフェリンの製造法が提供される。
プラスミドは、ヒトラクトフェリンタンパク質をコード
するポリデオキシリボヌクレオチドを有するプラスミド
ベクターを含む。ヒトラクトフェリンタンパク質が生成
されるまで適当な栄養培地中で培養した後、ヒトラクト
フェリンタンパク質を単離する。
本発明のさらに別の態様において、組換え発現ベクタ
ーが提供される。このベクターは、（１）遺伝子発現に
おける制御的役割を有する１または複数の遺伝子要素；
（２）ヒトラクトフェリンをコードするcDNA;（３）適
当な転写および翻訳開始および停止配列；および（４）
該ベクターで形質転換されたアスペルギルス胞子の選択
のための遺伝子要素の集合からなる転写単位を包含す
る。
ーが提供される。このベクターは、（１）遺伝子発現に
おける制御的役割を有する１または複数の遺伝子要素；
（２）ヒトラクトフェリンをコードするcDNA;（３）適
当な転写および翻訳開始および停止配列；および（４）
該ベクターで形質転換されたアスペルギルス胞子の選択
のための遺伝子要素の集合からなる転写単位を包含す
る。
本発明のさらに別の態様において、生物学的な活性な
組換えヒトラクトフェリンの製造方法が提供される。該
方法は、選択マーカー遺伝子を含む配列、プロモーター
を含む配列、転写停止配列、およびリンカー配列を合成
し、これら配列をクローニングしてプラスミドを生成
し、該プラスミドを制限エンドヌクレアーゼで消化し、
ヒトラクトフェリンをコードするcDNAを制御部位に挿入
し、ついでヒトラクトフェリンcDNAを発現するプラスミ
ドで真核細胞を形質転換することからなる。
組換えヒトラクトフェリンの製造方法が提供される。該
方法は、選択マーカー遺伝子を含む配列、プロモーター
を含む配列、転写停止配列、およびリンカー配列を合成
し、これら配列をクローニングしてプラスミドを生成
し、該プラスミドを制限エンドヌクレアーゼで消化し、
ヒトラクトフェリンをコードするcDNAを制御部位に挿入
し、ついでヒトラクトフェリンcDNAを発現するプラスミ
ドで真核細胞を形質転換することからなる。
図面の簡単な記載 上記本発明の特徴、利点および目的並びにこれから明
らかになるであろう他の特徴、利点および目的が得られ
さらに詳細に理解され得るように、上記で簡単に要約し
た発明の一層詳細な記載を、添付の図面で説明するある
種の態様を参照しながら行う。これら図面は本明細書の
一部を構成する。しかしながら、添付の図面は本発明の
好ましい態様を説明するものであって、本発明の範囲を
限定するものでないことに注意すべきである。本発明
は、他の同様に有効な等価な態様を包含する。
らかになるであろう他の特徴、利点および目的が得られ
さらに詳細に理解され得るように、上記で簡単に要約し
た発明の一層詳細な記載を、添付の図面で説明するある
種の態様を参照しながら行う。これら図面は本明細書の
一部を構成する。しかしながら、添付の図面は本発明の
好ましい態様を説明するものであって、本発明の範囲を
限定するものでないことに注意すべきである。本発明
は、他の同様に有効な等価な態様を包含する。
図１は、アスペルギルス・オリゼー（aspergillus or
yzae）発現プラスミド、pAhlfgの模式図を示す。
yzae）発現プラスミド、pAhlfgの模式図を示す。
図２は、形質転換したアスペルギルス・オリゼー株の
サザーンブロット分析を示す。
サザーンブロット分析を示す。
図３は、形質転換体とコントロールAO7とRNA分析を示
す。
す。
図４は、組換えLF分泌および精製の銀染色SDS−アク
リルアミドゲル分析を示す。
リルアミドゲル分析を示す。
図５は、ヒト組換えLFの特徴付けを示す。
図６は、ヒトラクトフェリンのcDNA配列を示す。
発明の詳細な記載 定義 本出願の目的のため、「トランスフェリンファミリ
ー」なる語は、血清トランスフェリン、卵トランスフェ
リンおよびラクトフェリンを含む鉄輸送タンパク質のフ
ァミリーを意味する。これらタンパク質はすべて構造的
に関連している。
ー」なる語は、血清トランスフェリン、卵トランスフェ
リンおよびラクトフェリンを含む鉄輸送タンパク質のフ
ァミリーを意味する。これらタンパク質はすべて構造的
に関連している。
本出願の目的のため、「ベクター」なる語は、ラクト
フェリンcDNAの挿入、伝播および発現を可能とするプラ
スミドビヒクルを意味する。
フェリンcDNAの挿入、伝播および発現を可能とするプラ
スミドビヒクルを意味する。
本出願の目的のため、「宿主」となる語は、そのゲノ
ム中にラクトフェリン発現プラスミドの組み込みを可能
とするすべての真核細胞を意味する。
ム中にラクトフェリン発現プラスミドの組み込みを可能
とするすべての真核細胞を意味する。
本出願の目的のため、「プロモーター」なる語は、ラ
クトフェリンのcDNAの転写を制御する制御DNA配列を意
味する。
クトフェリンのcDNAの転写を制御する制御DNA配列を意
味する。
本出願の目的のため、「マルチプルクローニングカセ
ット」なる語は、種々のcDNAの挿入を可能とする種々の
酵素のための制御酵素開裂部位を含むDNA断片を意味す
る。
ット」なる語は、種々のcDNAの挿入を可能とする種々の
酵素のための制御酵素開裂部位を含むDNA断片を意味す
る。
本出願の目的のため、「形質転換」なる語は、当該真
核細胞によるプラスミドの取り込みを意味する。
核細胞によるプラスミドの取り込みを意味する。
本出願の目的のため、「鉄結合能」なる語は、56Feに
結合する能力を意味する。完全に機能性のラクトフェリ
ンは、１分子のLF当たり２原子の鉄と係合することがで
きる。
結合する能力を意味する。完全に機能性のラクトフェリ
ンは、１分子のLF当たり２原子の鉄と係合することがで
きる。
本出願の目的のため、「生物学的活性／生物学的に活
性」なる語は、鉄への結合能によって測定されるラクト
フェリンの生物学的活性を意味する。ラクトフェリンタ
ンパク質は鉄の輸送タンパク質として機能し、生物学的
に活性であるためには鉄に結合する必要がある。
性」なる語は、鉄への結合能によって測定されるラクト
フェリンの生物学的活性を意味する。ラクトフェリンタ
ンパク質は鉄の輸送タンパク質として機能し、生物学的
に活性であるためには鉄に結合する必要がある。
本明細書において引用する文献はすべて、参照のため
本明細書に引用する。
本明細書に引用する。
以下に挙げる実施例は本発明の種々の態様を説明する
ためのものであり、いかなる形であれ本発明を限定する
ことを意図するものではない。
ためのものであり、いかなる形であれ本発明を限定する
ことを意図するものではない。
実施例１ 真菌株および形質転換 これら研究において使用するpyrG変異株は、アスペル
ギルス・オリゼー（A07 11488）に由来するものであっ
た。アスペルギルス・オリゼーからのpyrG遺伝子を４−
ニトロキノリン−１−オキシドで変異させた。このアス
ペルギルスの形質転換は、オスマニ（Osmani）らの手順
（J.Cell Biol.104:1495〜1504（1987））の修飾により
行った。5mMウラシルおよび10mMウリジンを含有するYG
培地（0.5％酵母エキス、２％グルコース）（5ml）中に
分生子（１×106/ml）を接種した。菌の管状物が目に見
えるようになるまで、32℃にて14〜16時間増殖させた。
発芽した分生子を遠心分離により回収し、0.4M硫酸アン
モニウム、50mMクエン酸カリウム（pH6.0）、0.5％酵母
エキス、0.12gノボザイム（novozyme）、0.1gドリセラ
ーゼ（Driselase）、100μl β−グルクロニダーゼ、0.
5％ショ糖および10mM MgSO4を含有する溶解混合物（40m
l）中に再懸濁した。32℃、150rpmにて２〜３時間、プ
ロトプラスト化を行った。プロトプラスト化の後、未消
化の菌糸体を除去するために、滅菌ミラクロス（miracl
oth）を用いた濾過が必要であった。プロトプラストを
遠心分離により回収し、10mlの0.4M硫酸アンモニウム、
１％ショ糖および50mMクエン酸カリウム（pH6.0）で４
℃にて２回洗浄し、1mlの0.6M KCl;50mM CaCl;10mMトリ
ス−HCl（pH7.5）中に再懸濁し、氷上に置いた。プロト
プラスト調製の直後に形質転換を行った。プロトプラス
トのアリコート（100μｌ）を、３μｇのDNAおよび50μ
ｌの40％ポリエチレングリコール（PEG）6000、50mM Ca
Cl2、0.6M KClおよび10mMトリス−HCl（pH7.5）に加え
た。試料を氷上で15分間インキュベートし、その後、PE
G溶液をさらに1ml加え、室温でのインキュベーションを
30分間続けた。この混合物のアリコートを、0.4％硫酸
アンモニウムを添加した0.7％最小培地（3ml）中、同じ
成分を含有するが２％アガーで固化したプレート上にプ
レーティングした。その後の増殖はすべて32℃で行っ
た。
ギルス・オリゼー（A07 11488）に由来するものであっ
た。アスペルギルス・オリゼーからのpyrG遺伝子を４−
ニトロキノリン−１−オキシドで変異させた。このアス
ペルギルスの形質転換は、オスマニ（Osmani）らの手順
（J.Cell Biol.104:1495〜1504（1987））の修飾により
行った。5mMウラシルおよび10mMウリジンを含有するYG
培地（0.5％酵母エキス、２％グルコース）（5ml）中に
分生子（１×106/ml）を接種した。菌の管状物が目に見
えるようになるまで、32℃にて14〜16時間増殖させた。
発芽した分生子を遠心分離により回収し、0.4M硫酸アン
モニウム、50mMクエン酸カリウム（pH6.0）、0.5％酵母
エキス、0.12gノボザイム（novozyme）、0.1gドリセラ
ーゼ（Driselase）、100μl β−グルクロニダーゼ、0.
5％ショ糖および10mM MgSO4を含有する溶解混合物（40m
l）中に再懸濁した。32℃、150rpmにて２〜３時間、プ
ロトプラスト化を行った。プロトプラスト化の後、未消
化の菌糸体を除去するために、滅菌ミラクロス（miracl
oth）を用いた濾過が必要であった。プロトプラストを
遠心分離により回収し、10mlの0.4M硫酸アンモニウム、
１％ショ糖および50mMクエン酸カリウム（pH6.0）で４
℃にて２回洗浄し、1mlの0.6M KCl;50mM CaCl;10mMトリ
ス−HCl（pH7.5）中に再懸濁し、氷上に置いた。プロト
プラスト調製の直後に形質転換を行った。プロトプラス
トのアリコート（100μｌ）を、３μｇのDNAおよび50μ
ｌの40％ポリエチレングリコール（PEG）6000、50mM Ca
Cl2、0.6M KClおよび10mMトリス−HCl（pH7.5）に加え
た。試料を氷上で15分間インキュベートし、その後、PE
G溶液をさらに1ml加え、室温でのインキュベーションを
30分間続けた。この混合物のアリコートを、0.4％硫酸
アンモニウムを添加した0.7％最小培地（3ml）中、同じ
成分を含有するが２％アガーで固化したプレート上にプ
レーティングした。その後の増殖はすべて32℃で行っ
た。
実施例２ プラスミドの構築 発現プラスミドの模式図を図１に示す。ヒトLFをコー
ドする完全cDNAをDNAポリメラーゼＩのクレノウ断片を
用いて修復し、Acc I消化した修復したpGEM4中にサブク
ローニングしてpGEMhLFcを得た。LFシグナル配列を除去
しα−アミラーゼ配列とインフレームにある５′末端を
生成させるため、pGEMhLFcプラスミドDNAの複製連鎖反
応（PCR）増幅により、Hind II/Acc I末端を含有する25
2塩基対のラクトフェリン断片（69〜321番目）を得た。
使用したオリゴプライマーは以下の通りであった。SEQI
D NO1に示す５′末端オリゴヌクレオチド： およびSEQ ID NO2に示す３′末端オリゴヌクレオチド： このPCR断片をHind IIおよびAcc Iで消化し、Hind11/Ac
c I消化したpGEMhLFC中にサブクローニングしてpGEMhLF
を生成した。プロモーター、シグナル配列および成熟α
−アミラーゼII遺伝子の開始部からのアラニン残基をコ
ードするAsp718/Pvu II末端を有する681塩基対のα−ア
ミラーゼ断片を、アルペルギルス・オリゼーのゲノムDN
AのPCR増幅により得た。オリゴプライマーは以下の通り
であった。SEQ ID NO3に示す５′末端オリゴヌクレオチ
ド： およびSEQ ID NO4に示す３′末端オリゴヌクレオチド： 増進したDNAをAsp718およびPvu IIで消化し、Asp718/Hi
nd11消化したpGEMhLF中にサブクローニングした。得ら
れたプラスミド（pGEMhLF）をEcoR Iで消化し、得られ
た2.8kb α−アミラーゼ−ラクトフェリン断片を、pAhL
F＊を生成するための方法に従ってpAL3中の唯一のEcoR
I部位にサブクローニングした。pAhLF＊で失われたラク
トフェリンの最後の５つのカルボキシ末端コドン（2138
〜2153番目）を提供するため、およびアスペルギルス・
ニガーのグルコアミラーゼ遺伝子からの３′非翻訳配列
の最初の180塩基対を提供するため、合成オリゴヌクレ
オチドを用いた。得られたプラスミド（pAhLFG）を用い
てアスペルギルス・オリゼーpyrG変異株を形質転換させ
た。
ドする完全cDNAをDNAポリメラーゼＩのクレノウ断片を
用いて修復し、Acc I消化した修復したpGEM4中にサブク
ローニングしてpGEMhLFcを得た。LFシグナル配列を除去
しα−アミラーゼ配列とインフレームにある５′末端を
生成させるため、pGEMhLFcプラスミドDNAの複製連鎖反
応（PCR）増幅により、Hind II/Acc I末端を含有する25
2塩基対のラクトフェリン断片（69〜321番目）を得た。
使用したオリゴプライマーは以下の通りであった。SEQI
D NO1に示す５′末端オリゴヌクレオチド： およびSEQ ID NO2に示す３′末端オリゴヌクレオチド： このPCR断片をHind IIおよびAcc Iで消化し、Hind11/Ac
c I消化したpGEMhLFC中にサブクローニングしてpGEMhLF
を生成した。プロモーター、シグナル配列および成熟α
−アミラーゼII遺伝子の開始部からのアラニン残基をコ
ードするAsp718/Pvu II末端を有する681塩基対のα−ア
ミラーゼ断片を、アルペルギルス・オリゼーのゲノムDN
AのPCR増幅により得た。オリゴプライマーは以下の通り
であった。SEQ ID NO3に示す５′末端オリゴヌクレオチ
ド： およびSEQ ID NO4に示す３′末端オリゴヌクレオチド： 増進したDNAをAsp718およびPvu IIで消化し、Asp718/Hi
nd11消化したpGEMhLF中にサブクローニングした。得ら
れたプラスミド（pGEMhLF）をEcoR Iで消化し、得られ
た2.8kb α−アミラーゼ−ラクトフェリン断片を、pAhL
F＊を生成するための方法に従ってpAL3中の唯一のEcoR
I部位にサブクローニングした。pAhLF＊で失われたラク
トフェリンの最後の５つのカルボキシ末端コドン（2138
〜2153番目）を提供するため、およびアスペルギルス・
ニガーのグルコアミラーゼ遺伝子からの３′非翻訳配列
の最初の180塩基対を提供するため、合成オリゴヌクレ
オチドを用いた。得られたプラスミド（pAhLFG）を用い
てアスペルギルス・オリゼーpyrG変異株を形質転換させ
た。
図１を参照すると、アスペルギルス・オリゼー発現プ
ラスミドpAhLFGは、アスペルギルス・オリゼーAMY11遺
伝子の５′フランキンズ配列の681塩基対（シグナル配
列および成熟α−アミラーゼの最初のコドンを含む）を
含む。これら配列から下流にインフレームで成熟ヒトラ
クトフェリンをコードするcDNAをサブクローニングし
て、増殖培地にデンプンを添加することによって組換え
タンパク質の産生を可能する。アスペルギルス・ニガー
のグルコアミラーゼ３′非翻訳領域、転写ターミネータ
ーおよポリアデニル化シグナルを提供する。このプラス
ミドはまた、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora c
rassa）pyr4選択マーカーおよびアンピシリン耐性遺伝
子をも含有する。
ラスミドpAhLFGは、アスペルギルス・オリゼーAMY11遺
伝子の５′フランキンズ配列の681塩基対（シグナル配
列および成熟α−アミラーゼの最初のコドンを含む）を
含む。これら配列から下流にインフレームで成熟ヒトラ
クトフェリンをコードするcDNAをサブクローニングし
て、増殖培地にデンプンを添加することによって組換え
タンパク質の産生を可能する。アスペルギルス・ニガー
のグルコアミラーゼ３′非翻訳領域、転写ターミネータ
ーおよポリアデニル化シグナルを提供する。このプラス
ミドはまた、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora c
rassa）pyr4選択マーカーおよびアンピシリン耐性遺伝
子をも含有する。
ヒトLFの発現に用いるプラスミド構築物（pAhLFG）
は、アスペルギルス・オリゼーα−アミラーゼII遺伝子
（AMY11）のプロモーターおよび分泌シグナルペプチド
をコードする681塩基対断片を含有する。シグナル配列
はまた、α−アミラーゼ成熟タンパク質の開始部からの
アラニンのコドンを含み、エンドゲナーゼであるα−ア
ミラーゼペプチダーゼにより認識され得るシグナル配列
開裂部位（Leu Ala Ala）を生成する。成熟タンパク質
をコードするヒトラクトフェリンcDNA断片をAMY11配列
のすぐ下流にインフレームでサブクローニングし、この
高度に効率的なデンプン誘導性プロモーターの制御下に
置いた。転写されたヒトLF mRNAを安定化させるため、
アルペルギルス・オニガーからのグルコアミラーゼ遺伝
子の３′非翻訳領域をコードする180塩基対断片を、ヒ
トLF cDNAのすぐ下流のマルチプルクローニングカセッ
ト中の唯一のBamH I部位中にライゲートして、転写ター
ミネーターおよびポリアデニル化シグナルを提供した。
このプラスミドにはまた、アスペルギルス・オリゼーの
pyrG栄養要求性変異を補償するニューロスポラ・クラッ
サPyr4選択マーカーも含まれ、ウリジンの不在下で増殖
させることによってプラスミドで形質転換された胞子の
選択を可能としている。
は、アスペルギルス・オリゼーα−アミラーゼII遺伝子
（AMY11）のプロモーターおよび分泌シグナルペプチド
をコードする681塩基対断片を含有する。シグナル配列
はまた、α−アミラーゼ成熟タンパク質の開始部からの
アラニンのコドンを含み、エンドゲナーゼであるα−ア
ミラーゼペプチダーゼにより認識され得るシグナル配列
開裂部位（Leu Ala Ala）を生成する。成熟タンパク質
をコードするヒトラクトフェリンcDNA断片をAMY11配列
のすぐ下流にインフレームでサブクローニングし、この
高度に効率的なデンプン誘導性プロモーターの制御下に
置いた。転写されたヒトLF mRNAを安定化させるため、
アルペルギルス・オニガーからのグルコアミラーゼ遺伝
子の３′非翻訳領域をコードする180塩基対断片を、ヒ
トLF cDNAのすぐ下流のマルチプルクローニングカセッ
ト中の唯一のBamH I部位中にライゲートして、転写ター
ミネーターおよびポリアデニル化シグナルを提供した。
このプラスミドにはまた、アスペルギルス・オリゼーの
pyrG栄養要求性変異を補償するニューロスポラ・クラッ
サPyr4選択マーカーも含まれ、ウリジンの不在下で増殖
させることによってプラスミドで形質転換された胞子の
選択を可能としている。
実施例３ ゲノムDNAの操作 アスペルギルス・オリゼーのDNAの単離は、ラフムッ
セン（Rafmussen）らのJ.Biol.Chem.、265;13767〜1377
5（1990）に記載された方法に従い、凍結乾燥した菌糸
体（200mg）から行った。このDNAをEcoR Iで消化し、0.
8％アガロースゲル上でサイズ分画し、ニトロセルロー
スに移した。サザーン分析のためのニトロセルロースフ
ィルターのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリ
ダイゼーションを、６×SSC、0.1％SDSおよび0.5％粉乳
中、65℃で16時間行った。ハイブリダイゼーション溶液
には１×107cpmの32P−標識ラクトフェリンcDNAプロー
ブ（2.1Kb）が含まれていた。フィルターを２×SSC、0.
5％SDS中、室温にて30分間洗浄し、ついで0.5×SSC、0.
5％SDS中、68℃で30分間、２回洗浄した。フィルターを
乾燥させ、−70℃で２時間感光させ、オートラジオグラ
フィーにより現像した。
セン（Rafmussen）らのJ.Biol.Chem.、265;13767〜1377
5（1990）に記載された方法に従い、凍結乾燥した菌糸
体（200mg）から行った。このDNAをEcoR Iで消化し、0.
8％アガロースゲル上でサイズ分画し、ニトロセルロー
スに移した。サザーン分析のためのニトロセルロースフ
ィルターのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリ
ダイゼーションを、６×SSC、0.1％SDSおよび0.5％粉乳
中、65℃で16時間行った。ハイブリダイゼーション溶液
には１×107cpmの32P−標識ラクトフェリンcDNAプロー
ブ（2.1Kb）が含まれていた。フィルターを２×SSC、0.
5％SDS中、室温にて30分間洗浄し、ついで0.5×SSC、0.
5％SDS中、68℃で30分間、２回洗浄した。フィルターを
乾燥させ、−70℃で２時間感光させ、オートラジオグラ
フィーにより現像した。
図２を参照すると、形質転換したアスペルギルス・オ
リゼー株に対してサザーンブロット分析を行った。個々
の形質転換体およびコントロールAO7からのゲノムDNAを
放射性標識hLF cDNAプローブ（2.1kb）とハイブリダイ
ズさせた。矢印は、発現プラスミドのEcoR I消化によっ
て生成する放射性標識断片（2.8kb）を示し、これはす
べての形質転換体（＃１〜９）には存在するがコントロ
ールの非形質転換AO7には存在しない。バクテリオファ
ージラムダHind111断片の分子量を左側に示す。
リゼー株に対してサザーンブロット分析を行った。個々
の形質転換体およびコントロールAO7からのゲノムDNAを
放射性標識hLF cDNAプローブ（2.1kb）とハイブリダイ
ズさせた。矢印は、発現プラスミドのEcoR I消化によっ
て生成する放射性標識断片（2.8kb）を示し、これはす
べての形質転換体（＃１〜９）には存在するがコントロ
ールの非形質転換AO7には存在しない。バクテリオファ
ージラムダHind111断片の分子量を左側に示す。
実施例４ ノーザン分析 市販のRNazo1B（ビオキシテック・ラボトリーズ、ヒ
ューストン、テキサス州）を用い、製造業者の指示に従
ってRNAを凍結乾燥菌糸体（200mg）から単離した。2.2M
ホルムアルデヒドを含有する0.8％アガロースゲル中で
全RNA（20μｇ）を電気泳動にかけた。RNAをニトロセル
ロースに移し、2.1kbのラクトフェリンcDNAかまたはα
−アミラーゼ11遺伝子のコード領域に対する1.8kbのゲ
ノムα−アミラーゼ断片のいずかとハイブリダイズさせ
た。プローブをニックトランスレーションにより32P−
標識した（比活性:2×108cpm/μｇ）。ハイブリダイゼ
ーションを、２×SSC、0.05％粉乳中、65℃にて氷上、
２×105cpmプローブ/mlで行った。
ューストン、テキサス州）を用い、製造業者の指示に従
ってRNAを凍結乾燥菌糸体（200mg）から単離した。2.2M
ホルムアルデヒドを含有する0.8％アガロースゲル中で
全RNA（20μｇ）を電気泳動にかけた。RNAをニトロセル
ロースに移し、2.1kbのラクトフェリンcDNAかまたはα
−アミラーゼ11遺伝子のコード領域に対する1.8kbのゲ
ノムα−アミラーゼ断片のいずかとハイブリダイズさせ
た。プローブをニックトランスレーションにより32P−
標識した（比活性:2×108cpm/μｇ）。ハイブリダイゼ
ーションを、２×SSC、0.05％粉乳中、65℃にて氷上、
２×105cpmプローブ/mlで行った。
洗浄はサザーン分析に用いたものと同じであった。フ
ィルターを乾燥させ、−70℃にて２時間感光させ、オー
トラジオグラフィーより現像した。ニトロセルロース膜
およびマニホルド（manifold）ドットシステムを用いて
RNAドットブロッティングを行った。バイブリダイゼー
ションおよび洗浄条件はサザーン分析に記載したものと
同様であった。放射能ベタゴン（betagon）ブロットア
ナライザーを用いて定量した。
ィルターを乾燥させ、−70℃にて２時間感光させ、オー
トラジオグラフィーより現像した。ニトロセルロース膜
およびマニホルド（manifold）ドットシステムを用いて
RNAドットブロッティングを行った。バイブリダイゼー
ションおよび洗浄条件はサザーン分析に記載したものと
同様であった。放射能ベタゴン（betagon）ブロットア
ナライザーを用いて定量した。
ラクトフェリンタンパク質の組換え産生をその好まし
い態様において記載した。しかしなら、サッカロミセス
・セレビシエ（seccharomyces cerevisiae）やピキヤ・
パストルシス（pichia pastorsis）などの真菌源または
SF9などの昆虫細胞などの他の多くの採取源で産生させ
ることも可能である。
い態様において記載した。しかしなら、サッカロミセス
・セレビシエ（seccharomyces cerevisiae）やピキヤ・
パストルシス（pichia pastorsis）などの真菌源または
SF9などの昆虫細胞などの他の多くの採取源で産生させ
ることも可能である。
図３において、RNA分析を形質転換体とコントロールA
O7を比較して行った。パネルＡでは、コントロールAO7
および形質転換体＃１からのRNA（20μｇ）を放射性標
識ヒトLF cDNAとハイブリダイズさせたノーザン分析を
示す。ヒトLF mRNA（2.3kb）が形質転換体＃１では検出
されたが、コントロールの非形質転換AO7では検出され
なかった。28sおよび18srRNAバンドの位置を左側に示
す。パネルＢでは、放射性標識α−アミラーゼゲノムDN
Aプローブを用いた、コントロールAO7および形質転換体
＃１からのRNA（５および10μｇ）のドットブロットを
比較して示す。パネルＣでは、放射性標識ヒトLF cDNA
プローブを用いた、コントロールAO7および形質転換体
＃１からのRNA（５および10μｇ）のドットブロットを
比較して示す。
O7を比較して行った。パネルＡでは、コントロールAO7
および形質転換体＃１からのRNA（20μｇ）を放射性標
識ヒトLF cDNAとハイブリダイズさせたノーザン分析を
示す。ヒトLF mRNA（2.3kb）が形質転換体＃１では検出
されたが、コントロールの非形質転換AO7では検出され
なかった。28sおよび18srRNAバンドの位置を左側に示
す。パネルＢでは、放射性標識α−アミラーゼゲノムDN
Aプローブを用いた、コントロールAO7および形質転換体
＃１からのRNA（５および10μｇ）のドットブロットを
比較して示す。パネルＣでは、放射性標識ヒトLF cDNA
プローブを用いた、コントロールAO7および形質転換体
＃１からのRNA（５および10μｇ）のドットブロットを
比較して示す。
本発明の発現プラスミドの制御要素下でラクトフェリ
ンmRNAがアスペルギルス・オリゼー中で正確かつ効率的
に転写されるか否かを決定するためにノーザン分析を行
った。形質転換体＃１からの胞子（１×106/ml）および
コントロールの非形質転換胞子を、炭素源として1.5％
グルコースを含有する真菌培地中に接種し、小さなシェ
ークフラスコ培地中、30℃にて48時間増殖させた。培養
液を洗浄し、３％デンプンを含有する真菌培地中に再接
種してヒトLF mRNAの転写を誘導した。24時間後、細胞
を回収し、RNAを単離した。2.2Mホルムアルデヒドを含
有する1.0％アガロースゲル上で全RNA（20μｇ）をサイ
ズ分画し、ニトロセルロース上にブロッティングした。
ンmRNAがアスペルギルス・オリゼー中で正確かつ効率的
に転写されるか否かを決定するためにノーザン分析を行
った。形質転換体＃１からの胞子（１×106/ml）および
コントロールの非形質転換胞子を、炭素源として1.5％
グルコースを含有する真菌培地中に接種し、小さなシェ
ークフラスコ培地中、30℃にて48時間増殖させた。培養
液を洗浄し、３％デンプンを含有する真菌培地中に再接
種してヒトLF mRNAの転写を誘導した。24時間後、細胞
を回収し、RNAを単離した。2.2Mホルムアルデヒドを含
有する1.0％アガロースゲル上で全RNA（20μｇ）をサイ
ズ分画し、ニトロセルロース上にブロッティングした。
ヒトラクトフェリンmRNAの検出は32P標識したヒトLF
cDNA（2.0kb）プローブを用いて行った。ヒトLF放射性
標識cDNAプローブとのハイブリダイゼーションは、形質
転換体においてラクトフェリンmRNAに対する正確なサイ
ズにて（2.3kb）特定の放射性標識バンドを検出した
が、コントロール非形質転換株では検出されなかった
（図3A）。ドットアッセイによるmRNAレベルの定量は、
コントロールAO7と形質転換体＃１との間で匹敵し得る
レベルの内生α−アミラーゼrRNAの発現を示した（図3
B）。加えて、形質転換体＃１ではα−アミラーゼとヒ
トLF mRNAとで同様のレベルの発現が認められた（図3B
および3C）。
cDNA（2.0kb）プローブを用いて行った。ヒトLF放射性
標識cDNAプローブとのハイブリダイゼーションは、形質
転換体においてラクトフェリンmRNAに対する正確なサイ
ズにて（2.3kb）特定の放射性標識バンドを検出した
が、コントロール非形質転換株では検出されなかった
（図3A）。ドットアッセイによるmRNAレベルの定量は、
コントロールAO7と形質転換体＃１との間で匹敵し得る
レベルの内生α−アミラーゼrRNAの発現を示した（図3
B）。加えて、形質転換体＃１ではα−アミラーゼとヒ
トLF mRNAとで同様のレベルの発現が認められた（図3B
および3C）。
実施例５ ヒト組換えLFの精製 増殖培地からのLFの精製は、実質的にストウェル（St
owell）らのBiochem.J.、276:349〜59（1991）の記載に
従い、CMセファデックスC50を用いて行った。カラムを5
00mlの0.025MトリスHCl（pH7.5）、0.1M NaClで前以て
平衡化した。該前以て平衡化したカラムに適用する前に
培地のpHをpH7.4に調節した。カラムを平衡緩衝液（500
ml）で洗浄し、ついで0.1〜1.1M NaClの直線塩勾配によ
り洗浄した。SDS/PAGEおよび銀染色を用い、フラクショ
ン（全部で7ml）をラクトフェリン含量および純度につ
いてアッセイした。LFを含有するフラクションを0.025M
トリスHCl、pH7.5/0.1M NaClに対して透析し、凍結乾
燥させた。
owell）らのBiochem.J.、276:349〜59（1991）の記載に
従い、CMセファデックスC50を用いて行った。カラムを5
00mlの0.025MトリスHCl（pH7.5）、0.1M NaClで前以て
平衡化した。該前以て平衡化したカラムに適用する前に
培地のpHをpH7.4に調節した。カラムを平衡緩衝液（500
ml）で洗浄し、ついで0.1〜1.1M NaClの直線塩勾配によ
り洗浄した。SDS/PAGEおよび銀染色を用い、フラクショ
ン（全部で7ml）をラクトフェリン含量および純度につ
いてアッセイした。LFを含有するフラクションを0.025M
トリスHCl、pH7.5/0.1M NaClに対して透析し、凍結乾
燥させた。
実施例６ ヒトLFの定量 本質的にビルジャ（Vilja）らのJ.Immunol.Methods、
76:73〜83（1985）の記載に従い、ELISAアッセイを用い
て組換えラクトフェリンを定量した。非競合アビジン−
ビオチンアッセイを用いて5ngのラクトフェリン感度が
得られた。乳房乳から単離したヒトLF（シグマ）を標準
として用いた。ビオチン化したヒトラクトフェリンIgG
はジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ（Jack
son Immunoresearch Laboratories）、ウエストグロー
ブ、ペンジルベニア州から得た。
76:73〜83（1985）の記載に従い、ELISAアッセイを用い
て組換えラクトフェリンを定量した。非競合アビジン−
ビオチンアッセイを用いて5ngのラクトフェリン感度が
得られた。乳房乳から単離したヒトLF（シグマ）を標準
として用いた。ビオチン化したヒトラクトフェリンIgG
はジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ（Jack
son Immunoresearch Laboratories）、ウエストグロー
ブ、ペンジルベニア州から得た。
実施例７ Ｎ末端の配列決定 製造業者の指示に従い（アプライド・バイオシステム
ズ）、精製ヒト組換えLF（５μｇ）をSDS−ポリアクリ
ルアミドゲル上で分離させ、プロブロット（Problott）
（ポリビニリデンジフルオライド型の膜）に移した。ヒ
トLFをクマシーブリリアントブルー染色で検出し、脱染
色した。このヒトLFのバンドを切り出し、蒸留H2Oで充
分に洗浄し、空気乾燥させた。ヒトLFの最初の10アミノ
酸のＮ末端アミノ酸配列を、アプライド・バイオシステ
ムズのパルス（Pulsed）液相シークエンサー（モデル47
7A）を用いて自動エドマン分解法により決定した。
ズ）、精製ヒト組換えLF（５μｇ）をSDS−ポリアクリ
ルアミドゲル上で分離させ、プロブロット（Problott）
（ポリビニリデンジフルオライド型の膜）に移した。ヒ
トLFをクマシーブリリアントブルー染色で検出し、脱染
色した。このヒトLFのバンドを切り出し、蒸留H2Oで充
分に洗浄し、空気乾燥させた。ヒトLFの最初の10アミノ
酸のＮ末端アミノ酸配列を、アプライド・バイオシステ
ムズのパルス（Pulsed）液相シークエンサー（モデル47
7A）を用いて自動エドマン分解法により決定した。
図４を参照すると、パネルＡは、組換えヒトLF分泌お
よび精製の銀染色SDS−ポリアクリルアミドゲル分析を
示す。レーン１には乳房乳ヒトLF標準（500ng）が含ま
れる。レーン２および３には、それぞれ誘導コントロー
ルAO7および形質転換体＃１からの増殖培地の試料（40
μｇ）が含まれる。レーン４〜８には、形質転換体＃１
の増殖培地からの組換えLFのCM−セファデックス精製に
より回収した溶出フラクション（それぞれ、＃25、30、
35、40および45）の100μｌアリコートが含まれる。分
子量マーカー（バイオラド・ラボラトリーズ、リッチモ
ンド、カリフォルニア州）の位置を左側に示す。サイズ
はキロダルトンにて示す。パネルＢは、ヒトLFに対して
向けられた特異的ポリクローナル抗体を用い125I−プロ
テインＡで検出する、パネルＡの記載と同じ２つの試料
のウエスタンイムノブッロット分析を示す。パネルＣ
は、組換えヒトLFの＃6N末端アミノ酸配列を示す。組換
えヒトLFをＮ末端から10の残基で配列決定したが、本発
明の構築物においてアラニンが付加されてα−アミラー
ゼシグナル配列開裂部位を提供すること以外は乳房乳ヒ
トLFと同一である。
よび精製の銀染色SDS−ポリアクリルアミドゲル分析を
示す。レーン１には乳房乳ヒトLF標準（500ng）が含ま
れる。レーン２および３には、それぞれ誘導コントロー
ルAO7および形質転換体＃１からの増殖培地の試料（40
μｇ）が含まれる。レーン４〜８には、形質転換体＃１
の増殖培地からの組換えLFのCM−セファデックス精製に
より回収した溶出フラクション（それぞれ、＃25、30、
35、40および45）の100μｌアリコートが含まれる。分
子量マーカー（バイオラド・ラボラトリーズ、リッチモ
ンド、カリフォルニア州）の位置を左側に示す。サイズ
はキロダルトンにて示す。パネルＢは、ヒトLFに対して
向けられた特異的ポリクローナル抗体を用い125I−プロ
テインＡで検出する、パネルＡの記載と同じ２つの試料
のウエスタンイムノブッロット分析を示す。パネルＣ
は、組換えヒトLFの＃6N末端アミノ酸配列を示す。組換
えヒトLFをＮ末端から10の残基で配列決定したが、本発
明の構築物においてアラニンが付加されてα−アミラー
ゼシグナル配列開裂部位を提供すること以外は乳房乳ヒ
トLFと同一である。
実施例８ 脱グリコシル化 Ｎ−グリコシダーゼＦ（ベーリンガー・マンハイム）
を用いて脱グリコシル化を行った。ラクトフェリン（0.
5μｇ）を含有するアスペルギルス・オリゼーの増殖培
地を0.01％SDSの存在下、100℃にて３分間変性させた。
ヒト乳からの標準LFも同様に処理した。その後、試料を
氷上に５分間置いた。Ｎ−グリコシダーゼＦ反応を0.4M
リン酸ナトリウム（pH6.8）;0.8％トリトン;0.1％β−
メルカプトエタノールおよび１単位酵素中で行い、37℃
で16時間インキュベートした。ヒトラクトフェリンに対
して特異的に向けられたIgGを用いてPAGEおよびウエス
タン分析を行い、消化した試料の移動度の増加を検出し
た。
を用いて脱グリコシル化を行った。ラクトフェリン（0.
5μｇ）を含有するアスペルギルス・オリゼーの増殖培
地を0.01％SDSの存在下、100℃にて３分間変性させた。
ヒト乳からの標準LFも同様に処理した。その後、試料を
氷上に５分間置いた。Ｎ−グリコシダーゼＦ反応を0.4M
リン酸ナトリウム（pH6.8）;0.8％トリトン;0.1％β−
メルカプトエタノールおよび１単位酵素中で行い、37℃
で16時間インキュベートした。ヒトラクトフェリンに対
して特異的に向けられたIgGを用いてPAGEおよびウエス
タン分析を行い、消化した試料の移動度の増加を検出し
た。
図５にヒト組換えLFの特徴付けを行った。パネルＡは
ヒトラクトフェリンの脱グリコシル化脱糖を示す。ヒト
ラクトフェリンに対して向けられた特異的なポリクロー
ナル抗体を用いてグリコシル化したヒトラクトフェリン
および脱グリコシル化したヒトラクトフェリンのウエス
タン分析を行い、検出は125I−プロテインＡで行った。
第一のパネルには、Ｎ−グリコシダーゼＦで処理してい
ない（−）および処理した（＋）初乳ヒトLF（500ng）
が含まれる。第二のパネルには、Ｎ−グリコシダーゼＦ
で処理していない（−）および処理した（＋）精製組換
えヒトLF（500ng）が含まれる。グリコシル化したヒトL
Fのサイズを矢印で示す。パネルＢは、鉄結合能に関す
る組換えヒトラクトフェリンの機能分析を示す。パネル
ＡおよびＢは、それぞれ、示した濃度における初乳ヒト
LFおよび精製組換えヒトLFの２つの試料の56Feフィルタ
ー結合アッセイを示す。両パネルにおける第一のレーン
には、陰性コントロールとしてBSA（５μｇ）が含まれ
る。
ヒトラクトフェリンの脱グリコシル化脱糖を示す。ヒト
ラクトフェリンに対して向けられた特異的なポリクロー
ナル抗体を用いてグリコシル化したヒトラクトフェリン
および脱グリコシル化したヒトラクトフェリンのウエス
タン分析を行い、検出は125I−プロテインＡで行った。
第一のパネルには、Ｎ−グリコシダーゼＦで処理してい
ない（−）および処理した（＋）初乳ヒトLF（500ng）
が含まれる。第二のパネルには、Ｎ−グリコシダーゼＦ
で処理していない（−）および処理した（＋）精製組換
えヒトLF（500ng）が含まれる。グリコシル化したヒトL
Fのサイズを矢印で示す。パネルＢは、鉄結合能に関す
る組換えヒトラクトフェリンの機能分析を示す。パネル
ＡおよびＢは、それぞれ、示した濃度における初乳ヒト
LFおよび精製組換えヒトLFの２つの試料の56Feフィルタ
ー結合アッセイを示す。両パネルにおける第一のレーン
には、陰性コントロールとしてBSA（５μｇ）が含まれ
る。
ヒトラクトフェリンは、Ｎ−グリコシド結合により結
合した２つのＮ−アセチルラクトアミン型のグリカンを
含む、組換えヒトラクトフェリンが正確にグリコシル化
されるかどうかを決定するため、該タンパク質をＮ−グ
リコシダーゼＦで処理し、SDSポリアクリルアミド電気
泳動上で分離し、ニトロセルロースに移し、ヒトラクト
フェリンに対して向けられた特異的IgGを用いてプロー
ブした（図5A）。Ｎ−グリコシダーゼＦはグリコシルア
ミン結合において加水分解して、分子量の小さい炭水化
物不含のペプチドを生成する。組換えヒトLFをヒト乳か
ら精製したLFと比較すると、Ｎ−グリコシダーゼＦ消化
によって両タンパク質とも一緒に移動し、該組換えタン
パク質が天然ヒトLFと同じ糖付加パターンを有すること
が示唆された。
合した２つのＮ−アセチルラクトアミン型のグリカンを
含む、組換えヒトラクトフェリンが正確にグリコシル化
されるかどうかを決定するため、該タンパク質をＮ−グ
リコシダーゼＦで処理し、SDSポリアクリルアミド電気
泳動上で分離し、ニトロセルロースに移し、ヒトラクト
フェリンに対して向けられた特異的IgGを用いてプロー
ブした（図5A）。Ｎ−グリコシダーゼＦはグリコシルア
ミン結合において加水分解して、分子量の小さい炭水化
物不含のペプチドを生成する。組換えヒトLFをヒト乳か
ら精製したLFと比較すると、Ｎ−グリコシダーゼＦ消化
によって両タンパク質とも一緒に移動し、該組換えタン
パク質が天然ヒトLFと同じ糖付加パターンを有すること
が示唆された。
ヒトラクトフェリンは、各葉状部が一つのFe3+イオン
と堅固だが可逆的に結合する能力を有する２葉性構造を
有する。ヒトラクトフェリンの鉄結合特性は、その機能
的役割にとって非常に重要である。アスペルギルス・オ
リゼーで発現され分泌された組換えヒトLFが初乳ラクト
フェリンと同様の鉄結合能を有するかどうかを試験する
ため、56Feマイクロフィルター結合アッセイを開発し
た。形質転換体＃１の増殖培地から単離した精製ヒトラ
クトフェリンを0.1Mクエン酸（pH2.0）に対して透析し
てアポ−ヒトLFを生成した。ヒト乳からの天然ラクトフ
ェリンも同様に処理した。等容量の1M重炭酸塩中のこれ
ら試料に過剰の56Fe（0.2mCi）を加え、ついで37℃にて
30分間インキュベートした。試料をニトロセルロース膜
に適用し、重炭酸塩で数回洗浄した。オートラジオグラ
フィーによりフィルターを視覚化し、ベタゴンブロット
アナライザーを用いてFe−結合を定量した。図5Bに示す
ように、試験したすべての濃度において組換えヒトLFお
よび天然ヒトLFの両方とも同様の鉄結合レベルを示し
た。これら結果は、鉄結合能において組換えヒトLFが天
然ヒトLFと識別できないことを示している。
と堅固だが可逆的に結合する能力を有する２葉性構造を
有する。ヒトラクトフェリンの鉄結合特性は、その機能
的役割にとって非常に重要である。アスペルギルス・オ
リゼーで発現され分泌された組換えヒトLFが初乳ラクト
フェリンと同様の鉄結合能を有するかどうかを試験する
ため、56Feマイクロフィルター結合アッセイを開発し
た。形質転換体＃１の増殖培地から単離した精製ヒトラ
クトフェリンを0.1Mクエン酸（pH2.0）に対して透析し
てアポ−ヒトLFを生成した。ヒト乳からの天然ラクトフ
ェリンも同様に処理した。等容量の1M重炭酸塩中のこれ
ら試料に過剰の56Fe（0.2mCi）を加え、ついで37℃にて
30分間インキュベートした。試料をニトロセルロース膜
に適用し、重炭酸塩で数回洗浄した。オートラジオグラ
フィーによりフィルターを視覚化し、ベタゴンブロット
アナライザーを用いてFe−結合を定量した。図5Bに示す
ように、試験したすべての濃度において組換えヒトLFお
よび天然ヒトLFの両方とも同様の鉄結合レベルを示し
た。これら結果は、鉄結合能において組換えヒトLFが天
然ヒトLFと識別できないことを示している。
図６において、ヒロラクトフェリンタンパク質の全cD
NA配列を示す。ヒトラクトフェリンをコードするcDNA
は、プラスミドを生成し、真核細胞を形質転換し、ヒト
ラクトフェリンタンパク質を製造するために用いる。
NA配列を示す。ヒトラクトフェリンをコードするcDNA
は、プラスミドを生成し、真核細胞を形質転換し、ヒト
ラクトフェリンタンパク質を製造するために用いる。
本発明において使用するアスペルギルスの株は、欠損
pry4遺伝子を含むためオロチジン５′リン酸（OMP）デ
カルボキシラーゼを合成することができない栄養要求変
異株である。この酵素は、ウリジンの合成に必要であ
る。この株はウリジンを欠く培地で増殖できない。この
プラスミドは、選択マーカー、すなわちOMPデカルボキ
シラーゼの遺伝子をコードする配列を含む。それゆえ、
アスペルギルスによる該プラスミドの取り込みは、ウリ
ジンを欠く培地上で増殖させることによって選択するこ
とができる。アスペルギルスは、ウリジン欠失培地上で
増殖できるように該プラスミドにより形質転換される。
pry4遺伝子を含むためオロチジン５′リン酸（OMP）デ
カルボキシラーゼを合成することができない栄養要求変
異株である。この酵素は、ウリジンの合成に必要であ
る。この株はウリジンを欠く培地で増殖できない。この
プラスミドは、選択マーカー、すなわちOMPデカルボキ
シラーゼの遺伝子をコードする配列を含む。それゆえ、
アスペルギルスによる該プラスミドの取り込みは、ウリ
ジンを欠く培地上で増殖させることによって選択するこ
とができる。アスペルギルスは、ウリジン欠失培地上で
増殖できるように該プラスミドにより形質転換される。
本発明の一つの態様において、生物学的に活性な組換
えヒトラクトフェリンタンパク質が製造される。この方
法は、選択マーカー遺伝子を含む配列、プロモーターを
含む配列、転写停止配列およびリンカー配列を合成する
ことが包含する。その後、これら配列をクローニングし
てプラスミドを生成させ、該プラスミドを制限エンドヌ
クレアーゼで消化する。ヒトラクトフェリンをコードす
るcDNAを制限部位に挿入し、ついで真核細胞をヒトラク
トフェリンcDNAを発現する該プラスミドで形質転換す
る。
えヒトラクトフェリンタンパク質が製造される。この方
法は、選択マーカー遺伝子を含む配列、プロモーターを
含む配列、転写停止配列およびリンカー配列を合成する
ことが包含する。その後、これら配列をクローニングし
てプラスミドを生成させ、該プラスミドを制限エンドヌ
クレアーゼで消化する。ヒトラクトフェリンをコードす
るcDNAを制限部位に挿入し、ついで真核細胞をヒトラク
トフェリンcDNAを発現する該プラスミドで形質転換す
る。
本発明の方法に使用する選択マーカー遺伝子は、ヒト
ラクトフェリンcDNAプラスミドで形質転換された細胞の
単離を可能とするものであればいかなるものであっても
よい。好ましくは、選択マーカー遺伝子は、pyr4、pyr
G、argB、trpCおよびandSから選ばれる。
ラクトフェリンcDNAプラスミドで形質転換された細胞の
単離を可能とするものであればいかなるものであっても
よい。好ましくは、選択マーカー遺伝子は、pyr4、pyr
G、argB、trpCおよびandSから選ばれる。
本発明において有用なプロモーターは、ヒトラクトフ
ェリンcDNAの転写を制御することができるものであれば
いかなるものであってもよい。好ましくは、プロモータ
ーはアルコールデヒドロゲナーゼ、argB、α−アミラー
ゼおよびグルコアミラーゼよりなる群から選ばれる。
ェリンcDNAの転写を制御することができるものであれば
いかなるものであってもよい。好ましくは、プロモータ
ーはアルコールデヒドロゲナーゼ、argB、α−アミラー
ゼおよびグルコアミラーゼよりなる群から選ばれる。
本発明において有用な転写停止配列は、ヒトラクトフ
ェリンmRNAの安定化を可能とするものであればいかなる
ものであってもよい。好ましくは、転写停止配列はα−
アミラーゼ、グルコアミラーゼ、アルコールデヒドロゲ
ナーゼまたはbenAに由来するものである。
ェリンmRNAの安定化を可能とするものであればいかなる
ものであってもよい。好ましくは、転写停止配列はα−
アミラーゼ、グルコアミラーゼ、アルコールデヒドロゲ
ナーゼまたはbenAに由来するものである。
本発明において有用なリンカー配列は、翻訳開始コド
ン、分泌シグナルおよび制限酵素開裂部位を含むもので
あればいかなるものであってもよい。好ましくは、リン
カー要素はα−アミラーゼ、グルコアミラーゼまたはラ
クトフェリンに由来するものである。
ン、分泌シグナルおよび制限酵素開裂部位を含むもので
あればいかなるものであってもよい。好ましくは、リン
カー要素はα−アミラーゼ、グルコアミラーゼまたはラ
クトフェリンに由来するものである。
本発明において有用な宿主細胞は、ヒトラクトェリン
cDNAを含むプラスミドを組み込むことができ、ヒトラク
トフェリンcDNAを発現することができるものであればい
かなるものであってもよい。好ましくは、宿主細胞はア
スペルギルス属真菌細胞である。さらに好ましくは、真
菌細胞は酵母細胞である。最も好ましくは、本発明にお
いて有用なアスペルギルス属真菌細胞としては、アスペ
ルギルス・オリゼー、アスペルギルス・ニガー、アスペ
ルギルス・ニデュランス（A.Nidulans）およびアスペル
ギルス・アワモリ（A.Awamori）などが挙げられる。
cDNAを含むプラスミドを組み込むことができ、ヒトラク
トフェリンcDNAを発現することができるものであればい
かなるものであってもよい。好ましくは、宿主細胞はア
スペルギルス属真菌細胞である。さらに好ましくは、真
菌細胞は酵母細胞である。最も好ましくは、本発明にお
いて有用なアスペルギルス属真菌細胞としては、アスペ
ルギルス・オリゼー、アスペルギルス・ニガー、アスペ
ルギルス・ニデュランス（A.Nidulans）およびアスペル
ギルス・アワモリ（A.Awamori）などが挙げられる。
本明細書には本発明の目的を達成するための具体例に
ついて開示しているが、本発明の精神および範囲を逸脱
しない範囲において方法および装置を若干改変してもよ
い。またクレームに記載の各要素および工程は実質的に
同じまたは均等の結果をもたらすようなすべての要素お
よび工程を含むものである。また本発明は、その原理を
利用する限りにおいていかなる態様も広く包含する。し
たがって、本発明は、その目的を達成し、開示の目的物
および利点ならびに潜在的な他のすべてのものを達成す
るために適合されるものである。
ついて開示しているが、本発明の精神および範囲を逸脱
しない範囲において方法および装置を若干改変してもよ
い。またクレームに記載の各要素および工程は実質的に
同じまたは均等の結果をもたらすようなすべての要素お
よび工程を含むものである。また本発明は、その原理を
利用する限りにおいていかなる態様も広く包含する。し
たがって、本発明は、その目的を達成し、開示の目的物
および利点ならびに潜在的な他のすべてのものを達成す
るために適合されるものである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:69） (72)発明者 オマリー、バート・ダブリュー アメリカ合衆国77079テキサス、ヒュー ストン、ランブルウッド639番 (72)発明者 メイ、グレゴリー・エス アメリカ合衆国77025テキサス、ヒュー ストン、ダーネス4119番 (56)参考文献 特開 昭62−272988（ＪＰ，Ａ) Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ． 276（1991) ｐ．349−355 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ 18（1990） ｐ．5288 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/12 - 15/86 C12P 21/02 C12N 1/15 C07K 14/79 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (26)
- 【請求項１】選択マーカー遺伝子を含む配列、プロモー
ターを含む配列、転写停止配列、およびリンカー配列を
連結し、該配列をクローニングしてプラスミドを生成さ
せ、該プラスミドを制限エンドヌクレアーゼで消化し、
ヒトラクトフェリンをコードするcDNAを制限部位に挿入
し、ついでヒトラクトフェリンcDNAを発現する該プラス
ミドでアスペルギルス属真菌細胞を形質転換することを
特徴とする、 生物学的に活性な組換えヒトラクトフェリンの製造方
法。 - 【請求項２】該選択マーカー遺伝子がpyr4、pyrG、and
S、argBおよびtrpCよりなる群から選ばれたものである
請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】該細胞がヒトラクトフェリンを発現する請
求項１に記載の方法。 - 【請求項４】請求項２に記載の方法により製造されたヒ
トラクトフェリン。 - 【請求項５】該プロモーターがアルコールデヒドロゲナ
ーゼ、argB、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼおよび
benAよりなる群から選ばれたものである請求項１に記載
の方法。 - 【請求項６】該転写停止配列が、α−アミラーゼ、グル
コアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼおよびbenA
よりなる群から選ばれたものである請求項１に記載の方
法。 - 【請求項７】該リンカー配列がα−アミラーゼ、グルコ
アミラーゼおよびラクトフェリンよりなる群から選ばれ
たものである請求項１に記載の方法。 - 【請求項８】図６記載のcDNAおよびアスペルギルス属真
菌細胞中で該cDNAを発現させるのに必要な制御要素から
なる、アスペルギルス属真菌細胞中での発現に適合され
たプラスミド。 - 【請求項９】pAhLFGである請求項８に記載のプラスミ
ド。 - 【請求項１０】請求項８に記載のプラスミドを含むアス
ペルギルス属真菌細胞。 - 【請求項１１】アスペルギルス・オリゼー、アスペルギ
ルス・ニガー、アスペルギルス・ニデュランスおよびア
スペルギルス・アワモリよりなる群から選ばれたもので
ある請求項10に記載のアスペルギルス属真菌細胞。 - 【請求項１２】ヒトラクトフェリンタンパク質をコード
するポリデオキシリボヌクレオチドを有するプラスミド
ベクターを含む組換えプラスミドを含有する形質転換体
アスペルギルス属真菌細胞を、ヒトラクトフェリンタン
パク質が生成されるまで適当な栄養培地中で培養し、つ
いで該ヒトラクトフェリンを単離することを特徴とす
る、ヒトラクトフェリンの製造方法。 - 【請求項１３】該アスペルギルス属真菌細胞がアスペル
ギルス・オリゼー、アスペルギルス・ニガー、アスペル
ギルス・ニデュランスおよびアスペルギルス・アワモリ
よりなる群から選ばれたものである請求項12に記載の方
法。 - 【請求項１４】該プラスミドベクターがさらに選択マー
カー遺伝子、プロモーター、転写停止配列、およびリン
カー配列を含む、請求項12に記載の方法。 - 【請求項１５】該選択マーカー遺伝子がpyr4、pyrG、an
dS、argBおよびtrpCよりなる群から選ばれたものである
請求項14に記載の方法。 - 【請求項１６】該プロモーターがアルコールデヒドロゲ
ナーゼ、argB、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼおよ
びbenAよりなる群から選ばれたものである請求項14に記
載の方法。 - 【請求項１７】該転写停止配列が、α−アミラーゼ、グ
ルコアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼおよびbe
nAよりなる群から選ばれたものである請求項14に記載の
方法。 - 【請求項１８】該リンカー配列がα−アミラーゼ、グル
コアミラーゼおよびラクトフェリンよりなる群から選ば
れたものである請求項14に記載の方法。 - 【請求項１９】該ポリデオキシリボヌクレオチド配列が
図６記載のcDNA配列である請求項12に記載の方法。 - 【請求項２０】請求項12に記載の方法によって製造され
たヒトラクトフェリン。 - 【請求項２１】（１）アスペルギルス属真菌細胞中での
遺伝子発現において制御的役割を有する１または複数の
遺伝子要素、（２）ヒトラクトフェリンをコードするcD
NA、および（３）適当な転写および翻訳開始および停止
配列の集合からなる転写単位を有する組換え発現ベクタ
ー。 - 【請求項２２】該遺伝子要素が、アルコールデヒドロゲ
ナーゼ、argB、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼおよ
びbenAよりなる群から選ばれるプロモーターである請求
項21に記載のベクター。 - 【請求項２３】該転写停止配列がα−アミラーゼ、グル
コアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼおよびbenA
よりなる群から選ばれたものである請求項21に記載のベ
クター。 - 【請求項２４】組換えプラスミドを含む形質転換したア
スペルギルス・オリゼー真菌細胞を培養することからな
る方法によって製造されたヒトラクトフェリンタンパク
質生成物であって、その際、該プラスミドは、図６記載
のcDNA、pyr4選択マーカー遺伝子、α−アミラーゼ遺伝
子からのプロモーター、グルコアミラーゼ遺伝子からの
転写停止配列、およびα−アミラーゼ遺伝子からのリン
カー配列を含むプラスミドベクターを含み、該形質転換
したアスペルギルス・オリゼー真菌細胞を適当な栄養培
地中でヒトラクトフェリンが生成するまで培養し、ヒト
ラクトフェリンを該栄養培地中に分泌させて該培地から
単離することを特徴とするヒトラクトフェリンタンパク
質生成物。 - 【請求項２５】組換えプラスミドを含む形質転換したア
スペルギルス・オリゼー真菌細胞を培養することからな
る、真菌栄養培地からヒトラクトフェリンを単離する方
法であって、その際、該プラスミドは、図６記載のcDN
A、選択マーカー遺伝子、プロモーター、転写停止配
列、およびリンカー配列を含むプラスミドベクターを含
み、該形質転換したアスペルギルス・オリゼー真菌細胞
を適当な栄養培地中でヒトラクトフェリンが生成するま
で培養し、ヒトラクトフェリンを該栄養培地中に分泌さ
せて該培地から単離することを特徴とする方法。 - 【請求項２６】該プラスミドベクターがpyr4選択マーカ
ー遺伝子、α−アミラーゼ遺伝子からのプロモーター、
グルコアミラーゼ遺伝子からの転写停止配列、およびα
−アミラーゼ遺伝子からのリンカー配列を含む、請求項
25に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US87330492A | 1992-04-24 | 1992-04-24 | |
| US873,304 | 1992-04-24 | ||
| US07/873,304 | 1992-04-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08504561A JPH08504561A (ja) | 1996-05-21 |
| JP2824332B2 true JP2824332B2 (ja) | 1998-11-11 |
Family
ID=25361366
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5519314A Expired - Lifetime JP2824332B2 (ja) | 1992-04-24 | 1993-04-16 | 組換えヒトラクトフェリンの製造 |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5571896A (ja) |
| EP (1) | EP0644899B1 (ja) |
| JP (1) | JP2824332B2 (ja) |
| KR (2) | KR0184693B1 (ja) |
| CN (2) | CN1047204C (ja) |
| AT (1) | ATE177473T1 (ja) |
| AU (1) | AU681583B2 (ja) |
| BR (1) | BR9306289A (ja) |
| CA (1) | CA2134094C (ja) |
| DE (1) | DE69323879T2 (ja) |
| DK (1) | DK0644899T3 (ja) |
| ES (1) | ES2132232T3 (ja) |
| GR (1) | GR3029942T3 (ja) |
| HK (1) | HK1027360A1 (ja) |
| IL (1) | IL105400A (ja) |
| NZ (1) | NZ252844A (ja) |
| SG (1) | SG47605A1 (ja) |
| WO (1) | WO1993022348A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA932568B (ja) |
Families Citing this family (49)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL94183A (en) * | 1989-05-05 | 2003-09-17 | Baylor College Medicine | cDNA SEQUENCE CODING FOR HUMAN LACTOFERRIN PROTEIN OR PORTION THEREOF AND LACTOFERRIN PROTEIN PRODUCED FROM SAID SEQUENCE |
| US5571697A (en) * | 1989-05-05 | 1996-11-05 | Baylor College Of Medicine Texas Medical Center | Expression of processed recombinant lactoferrin and lactoferrin polypeptide fragments from a fusion product in Aspergillus |
| US5633076A (en) * | 1989-12-01 | 1997-05-27 | Pharming Bv | Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo |
| US6066469A (en) | 1990-03-08 | 2000-05-23 | Ferro Dynamics, Inc. | Cloning, expression, and uses of human lactoferrin |
| JP3529423B2 (ja) * | 1994-04-01 | 2004-05-24 | 森永乳業株式会社 | 抗菌性ペプチドの製造方法 |
| FR2735983B1 (fr) | 1995-06-29 | 1997-12-05 | Centre Nat Rech Scient | Peptide permettant de modifier l'activite du systeme immunitaire humain ou animal |
| DE19540233B4 (de) * | 1995-10-19 | 2005-08-25 | Schering Ag | Sulfamat-Derivate von 1,3,5(10)-Estratrien-Derivaten, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen |
| US6111081A (en) * | 1996-05-31 | 2000-08-29 | Baylor College Of Medicine | Lactoferrin variants and uses thereof |
| AU6307698A (en) | 1997-02-03 | 1998-08-25 | Pharming Bv | Useful properties of human lactoferrin and variants thereof |
| AU4656999A (en) * | 1998-07-15 | 2000-02-07 | Samyang Genex Corporation | Mass production method of lactoferrin polypeptide from yeast and useful microorganism thereof |
| US6423509B1 (en) | 1998-07-15 | 2002-07-23 | Samyang Genex Corporation | Pichia pastoris strain for producing lactoferrin and methods of use |
| US6399570B1 (en) | 1999-02-05 | 2002-06-04 | Agennix, Inc. | Antimicrobial/endotoxin neutralizing polypeptide |
| WO2001032895A1 (en) * | 1999-10-19 | 2001-05-10 | Easy Bio System, Inc. | Recombinant yeast strain for expressing human lactoferrin, n-lobe lactoferrin, c-lobe lactoferrin and process for preparation recombinant human lactoferrin, n-lobe lactoferrin, c-lobe lactoferrin using the same |
| US20080050503A1 (en) * | 2000-05-02 | 2008-02-28 | Ning Huang | Expression of human milk proteins in transgenic plants |
| US7417178B2 (en) * | 2000-05-02 | 2008-08-26 | Ventria Bioscience | Expression of human milk proteins in transgenic plants |
| US7138150B2 (en) * | 2000-05-02 | 2006-11-21 | Ventria Bioscience | Method of making an anti-infective composition for treating oral infections |
| IL160289A0 (en) * | 2001-08-30 | 2004-07-25 | Biorexis Pharmaceutical Corp | Modified transferrin fusion proteins |
| US7176278B2 (en) * | 2001-08-30 | 2007-02-13 | Biorexis Technology, Inc. | Modified transferrin fusion proteins |
| US20070031440A1 (en) * | 2001-08-30 | 2007-02-08 | Prior Christopher P | Modified transferin-antibody fusion proteins |
| US8129504B2 (en) | 2001-08-30 | 2012-03-06 | Biorexis Technology, Inc. | Oral delivery of modified transferrin fusion proteins |
| US20030226155A1 (en) * | 2001-08-30 | 2003-12-04 | Biorexis Pharmaceutical Corporation | Modified transferrin-antibody fusion proteins |
| EP1478379A4 (en) * | 2001-12-28 | 2005-12-21 | Campina Bv | HUMANIZED LACTOFERRIN AND ITS APPLICATIONS |
| ATE519499T1 (de) * | 2002-05-10 | 2011-08-15 | Agennix Inc | Lactoferrin bei der behandlung maligner neoplasien und anderer hyperproliferativer erkrankungen |
| WO2003099207A2 (en) * | 2002-05-24 | 2003-12-04 | Agennix Incorporated | Oral lactoferrin in the treatment of respiratory disorders |
| DE60333306D1 (de) * | 2002-08-30 | 2010-08-19 | Biorexis Pharmaceutical Corp | Modifizierte transferrin-fusionsproteine mit doppelten transferrin-amino- oder carboxy-terminalen domänen |
| US20060105387A1 (en) * | 2002-08-30 | 2006-05-18 | Prior Christopher P | Transferrin fusion proteins libraries |
| CA2499014A1 (en) | 2002-09-16 | 2004-03-25 | Agennix Incorporated | Lactoferrin compositions and methods of wound treatment |
| EP1581243A4 (en) * | 2002-12-06 | 2008-01-02 | Agennix Inc | ORAL LACTOFERRINE FOR THE TREATMENT OF SEPSIES |
| US7592306B2 (en) | 2002-12-10 | 2009-09-22 | Agennix, Inc. | Lactoferrin as an agent in the prevention of organ transplant rejection and graft-versus-host-disease |
| US20070060512A1 (en) * | 2003-03-04 | 2007-03-15 | Homayoun Sadeghi | Dipeptidyl-peptidase protected protein |
| KR100468596B1 (ko) * | 2003-04-04 | 2005-01-27 | (주) 디지탈바이오텍 | 메탄올자화효모인 피치아 패스토리스를 이용하여 인간락토페린을 생산하는 방법, 이 방법에 의해 제조된 인간락토페린 및 피치아 패스토리스 균주 |
| US7379700B2 (en) * | 2003-05-06 | 2008-05-27 | Canon Kabushiki Kaisha | Image reading apparatus with rotatable internal and external guides |
| EP1635766A4 (en) * | 2003-06-06 | 2009-09-30 | Agennix Inc | LACTOFERRIN AS ADJUVANS IN CANCER VACCINES |
| US20040259770A1 (en) * | 2003-06-19 | 2004-12-23 | Rush University Medical Center | Method for determining leukocyte activation |
| US20050075277A1 (en) * | 2003-07-10 | 2005-04-07 | Agennix Incorporated | Use of lactoferrin in prophylaxis against infection and/or inflammation in immunosuppressed subjects |
| JP2007512001A (ja) * | 2003-08-28 | 2007-05-17 | バイオレクシス ファーマシューティカル コーポレイション | Ｅｐｏミメティックペプチドおよび融合タンパク質 |
| US20060205037A1 (en) * | 2003-08-28 | 2006-09-14 | Homayoun Sadeghi | Modified transferrin fusion proteins |
| GB0329722D0 (en) * | 2003-12-23 | 2004-01-28 | Delta Biotechnology Ltd | Modified plasmid and use thereof |
| WO2005085287A1 (en) * | 2004-03-03 | 2005-09-15 | En-N-Tech, Inc. | Treatments for contaminant reduction in lactoferrin preparations and lactoferrin-containing compositions |
| WO2006047744A2 (en) * | 2004-10-26 | 2006-05-04 | Agennix Incorporated | Compositions of lactoferrin related peptides and uses thereof |
| DK2330200T3 (en) | 2004-12-23 | 2017-07-24 | Albumedix As | GENE EXPRESSION TECHNIQUE |
| EP2049135A4 (en) | 2006-06-22 | 2009-12-30 | Agennix Inc | LACTOFERRINE AS RADIOPROTECTIVE AGENT |
| ATE524493T1 (de) | 2006-07-24 | 2011-09-15 | Biorexis Pharmaceutical Corp | Exendin-fusionsproteine |
| NZ555163A (en) | 2007-05-14 | 2010-05-28 | Fonterra Co Operative Group | Methods of immune or hematological enhancement, inhibiting tumour formation or growth, and treating or preventing cancer, cancer symptoms, or the symptoms of cancer treatments |
| NZ583234A (en) | 2007-07-10 | 2012-06-29 | Glanbia Nutritionals | Method for removing endotoxin from proteins |
| US20130225477A1 (en) | 2010-02-25 | 2013-08-29 | Agennix Ag | Oral Lactoferrin in the Treatment of Severe Sepsis |
| WO2014007273A1 (ja) | 2012-07-03 | 2014-01-09 | 株式会社ジナリス | 有用微生物および目的物質の製造方法 |
| WO2020094731A1 (en) * | 2018-11-06 | 2020-05-14 | Arhel Projektiranje In Inzeniring D.O.O. | Method for manufacturing highly purified lactoferrin and lactoperoxidase from milk, colostrum and acid or sweet whey |
| KR200494603Y1 (ko) | 2019-12-09 | 2021-11-12 | 한국청소년활동진흥원 | 타워형 구조를 이루는 기술 융합형 조립 교구 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62272988A (ja) * | 1986-03-17 | 1987-11-27 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | アスペルギルス オリザにおけるタンパク生成物の製造法 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4652639A (en) * | 1982-05-06 | 1987-03-24 | Amgen | Manufacture and expression of structural genes |
| US4740461A (en) * | 1983-12-27 | 1988-04-26 | Genetics Institute, Inc. | Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells |
| US4935349A (en) * | 1986-01-17 | 1990-06-19 | Zymogenetics, Inc. | Expression of higher eucaryotic genes in aspergillus |
| EP0365525B1 (en) * | 1987-01-30 | 1995-08-09 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Lymphocyte inhibition by hla peptides |
| EP0383779B2 (en) * | 1987-09-04 | 2000-05-31 | Novo Nordisk A/S | PROCESS FOR THE PRODUCTION OF PROTEIN PRODUCTS IN $i(ASPERGILLUS) AND PROMOTERS FOR USE IN $i(ASPERGILLUS) |
| IL94183A (en) * | 1989-05-05 | 2003-09-17 | Baylor College Medicine | cDNA SEQUENCE CODING FOR HUMAN LACTOFERRIN PROTEIN OR PORTION THEREOF AND LACTOFERRIN PROTEIN PRODUCED FROM SAID SEQUENCE |
| US5155037A (en) * | 1989-08-04 | 1992-10-13 | The Texas A&M University System | Insect signal sequences useful to improve the efficiency of processing and secretion of foreign genes in insect systems |
| AU7453391A (en) * | 1990-03-08 | 1991-10-10 | Ferrodynamics, Inc. | Genetically engineered human lactoferrin |
| JP2818056B2 (ja) * | 1990-09-07 | 1998-10-30 | 森永乳業株式会社 | 抗菌性ペプチドおよび抗菌剤 |
-
1993
- 1993-04-13 ZA ZA932568A patent/ZA932568B/xx unknown
- 1993-04-15 IL IL10540093A patent/IL105400A/xx not_active IP Right Cessation
- 1993-04-16 CA CA002134094A patent/CA2134094C/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-04-16 KR KR1019940703776A patent/KR0184693B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1993-04-16 DK DK93912287T patent/DK0644899T3/da active
- 1993-04-16 NZ NZ252844A patent/NZ252844A/en not_active IP Right Cessation
- 1993-04-16 JP JP5519314A patent/JP2824332B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1993-04-16 SG SG1996003100A patent/SG47605A1/en unknown
- 1993-04-16 DE DE69323879T patent/DE69323879T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-04-16 EP EP93912287A patent/EP0644899B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-04-16 AU AU42892/93A patent/AU681583B2/en not_active Expired
- 1993-04-16 WO PCT/US1993/003614 patent/WO1993022348A1/en active IP Right Grant
- 1993-04-16 BR BR9306289A patent/BR9306289A/pt not_active Application Discontinuation
- 1993-04-16 AT AT93912287T patent/ATE177473T1/de active
- 1993-04-16 ES ES93912287T patent/ES2132232T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-04-24 CN CN93105290A patent/CN1047204C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1993-04-24 CN CNB991086597A patent/CN1161382C/zh not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-05-27 US US08/250,308 patent/US5571896A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-09-10 KR KR1019980707113A patent/KR100221404B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-04-13 GR GR990401031T patent/GR3029942T3/el unknown
-
2000
- 2000-10-11 HK HK00106450A patent/HK1027360A1/xx not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62272988A (ja) * | 1986-03-17 | 1987-11-27 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | アスペルギルス オリザにおけるタンパク生成物の製造法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ． ２７６（１９９１） ｐ．３４９−３５５ |
| Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １８（１９９０） ｐ．５２８８ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK0644899T3 (da) | 1999-09-27 |
| EP0644899B1 (en) | 1999-03-10 |
| US5571896A (en) | 1996-11-05 |
| BR9306289A (pt) | 1998-06-30 |
| CN1250055A (zh) | 2000-04-12 |
| ZA932568B (en) | 1993-11-12 |
| AU681583B2 (en) | 1997-09-04 |
| CA2134094A1 (en) | 1993-11-11 |
| CN1161382C (zh) | 2004-08-11 |
| CA2134094C (en) | 2004-01-06 |
| NZ252844A (en) | 1996-05-28 |
| WO1993022348A1 (en) | 1993-11-11 |
| KR100221404B1 (en) | 1999-10-01 |
| EP0644899A4 (en) | 1996-06-26 |
| CN1079780A (zh) | 1993-12-22 |
| EP0644899A1 (en) | 1995-03-29 |
| AU4289293A (en) | 1993-11-29 |
| ATE177473T1 (de) | 1999-03-15 |
| ES2132232T3 (es) | 1999-08-16 |
| SG47605A1 (en) | 1998-04-17 |
| KR0184693B1 (ko) | 1999-04-01 |
| JPH08504561A (ja) | 1996-05-21 |
| GR3029942T3 (en) | 1999-07-30 |
| IL105400A0 (en) | 1993-08-18 |
| DE69323879T2 (de) | 1999-11-04 |
| KR950701348A (ko) | 1995-03-23 |
| DE69323879D1 (de) | 1999-04-15 |
| IL105400A (en) | 2003-03-12 |
| CN1047204C (zh) | 1999-12-08 |
| HK1027360A1 (en) | 2001-01-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2824332B2 (ja) | 組換えヒトラクトフェリンの製造 | |
| US5571691A (en) | Production of recombinant lactoferrin and lactoferrin polypeptides using CDNA sequences in various organisms | |
| CA1283373C (en) | Use of the gal 1 yeast promoter | |
| US6635447B1 (en) | Production of recombinant lactoferrin and lactoferrin polypeptides using cDNA sequences in various organisms | |
| JP3072993B2 (ja) | Ｄｎａ分子 | |
| JPH02163074A (ja) | 組換体サッカロミセス | |
| Ward et al. | An inducible expression system for the production of human lactoferrin in Aspergillus nidulans | |
| JPH0829111B2 (ja) | 酵母菌による異種構造のタンパク質の発現、プロセシングおよび分泌 | |
| US5849881A (en) | Production of recombinant lactoferrin and lactoferrin polypeptides using cDNA sequences in various organisms | |
| US6100054A (en) | Production for recombinant lactoferrin and lactoferrin polypeptides using DNA sequences in various organisms | |
| US5766939A (en) | Production of recombinant lactoferrin and lactoferrin polypeptides using CDNA sequences in various organisms | |
| EP0307472B1 (en) | Immunogenic recombinant yeast expression product and method for purifying it | |
| JP2002512529A (ja) | 改良されたタンパク質発現菌株 | |
| JPH0646873A (ja) | ヒト血清アルブミンの高度精製方法 | |
| US4997647A (en) | Vaccine against the sporozoite stage of malaria | |
| JP3269504B2 (ja) | ヒト血清アルブミンの製造方法 | |
| AU1593688A (en) | Immunogenic polypeptide and method for purifying it | |
| EP0547171A1 (en) | Production of human lysozyme in methylotrophic yeast cells and efficient secretion therefrom | |
| JPH08256770A (ja) | ピキア属酵母由来のプロテアーゼ | |
| US5171843A (en) | Immunogenic polypeptide and method for purifying it | |
| CA1273883A (en) | Recombinant dna material comprising bovine growth hormone nucleotide sequence | |
| CN101748145A (zh) | 表达抗体或抗体类似物的重组酵母菌及其构建方法与应用 | |
| Calderón-Cacia et al. | Incomplete process of recombinant human platelet-derived growth factor produced in yeast and its effect on the biological activity | |
| JPH10327870A (ja) | 新規組換えヒトキマーゼおよび酵母を用いたその製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080904 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080904 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090904 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100904 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100904 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110904 Year of fee payment: 13 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120904 Year of fee payment: 14 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130904 Year of fee payment: 15 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |